説明

植物材料からの薬学的に活性な成分の抽出の改良

本発明は植物材料からの薬学的に活性な成分の抽出に関するものであり、より具体的には、薬物に組み入れるための植物性原薬(BDS)の調製に関するものである。また、本発明は医薬製剤に使用するための所与の純度のBDSに関するものである。特に、本発明はカンナビスからの抽出によって得られるカンナビノイドを含むBDSに関するものである。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は植物材料からの薬学的に活性な成分の抽出に関するものであり、より具体的には、薬物に組み入れるための植物性原薬(BDS)の調製に関するものである。また、本発明は医薬製剤に使用するための所与の純度のBDSに関するものである。特に、本発明はカンナビスからの抽出によって得られるカンナビノイドを含むBDSに関するものである。
【0002】
PCT/GB02/00620において、出願人は、薬用カンナビス(大麻)由来の生薬抽出物(植物性原薬)を調製する方法を開示している。プロセスは、
1.酸型のカンナビノイドを脱炭酸して中性型にするための加熱ステップ、
2.6〜8時間の、規定容積の液体二酸化炭素による第1の抽出、および
3.winterisationと呼ばれるろうを沈殿させるステップである、非標的材料の割合を下げるためのステップを含む。
【0003】
より具体的に、PCT/GB02/00620は、
ステップ1が、脱炭酸を可能にするのに十分な時間、100〜150℃において刻んだカンナビス(2〜3mm)を加熱することを含み、
ステップ2が、
a)粗い粉末(粒子を3mmのメッシュに通す)、
b)充填密度0.3、および
c)4時間、35℃、600バールの超臨界条件(10〜35℃および60〜600バールの範囲の温度と圧力の他の組合せ(超臨界条件と亜臨界条件双方)が使用できることが知られているが)を用いるCO抽出、および
ステップ3が、24時間、−20℃においてエタノール沈殿を行い、濾過によってろう状物質を除去することを含むプロセスについて記載している。
【0004】
PCT/GB02/00620に開示されている超臨界法は、
a)テトラヒドロカンナビノール(THC)60%
カンナビジオール(CBD)1〜2%
CBNを含む他の微量カンナビノイド4〜5%
(量的収率は、薬用大麻の乾燥重量に基づいて9%wt/wtであった)
を含有する高THC抽出物、および
b)CBD60%
THC4%
他のカンナビノイド2%
(量的収率は、薬用大麻の乾燥重量に基づいて9%wt/wtであった)
を含有する高CBD抽出物を生じた。
【0005】
得られるBDSを医薬品において使用する場合、このプロセスが安全で、GMPに拡張でき、高度な製品の一貫性と、好ましくは好収率も与えることが不可欠であることは明らかである。
【0006】
超臨界流体抽出(SFE)の原理は、ある種の物質を密閉ガラス容器中で加熱することによりその物質の温度を上昇させた場合、気液境界が消失することが指摘された1822年のカニャール・ド・ラ・トゥール男爵の研究以来知られてきた。この初期の仕事から、物質の臨界点というものが初めて発見された。臨界点は、それを超えると、物質が気相、液相および固相で共存することができるようになる温度である。後に、物質をその臨界温度および臨界圧以上に上げることにより、複雑な混合物を抽出および分画するための高性能な溶媒として使用できることが判明した。
【0007】
この技法は、燃料油加工業において広く用いられ、例えば、植物油および魚油の精製および分離に応用されてきた。
【0008】
従来の溶媒の使用法を上回るSFEの魅力的特徴は、臨界点を超える温度および圧力の操作によって、溶解力(E°)を変えられることである。
【0009】
物質の典型的な圧力−温度図には、相のうちの2相間の平衡を規定する3本の線が存在する。これらの線は、三重点において交わる。線は、気体、液体および固体状態間の境界を規定し、線に沿った点は、一組の相間の平衡を規定する。例えば、蒸気圧(沸点)曲線は、三重点から始まり、臨界点で終わる。臨界領域は、この点から始まり、超臨界流体は、その臨界温度(Tc)および臨界圧(Pc)を超える任意の物質である。したがって、臨界温度は、圧力の増加によって気体を液体に変換することができる最高温度であり、臨界圧は、温度を上げることによって液体を伝統的な気体に変換することができる最高圧力である。いわゆる臨界領域では、1つの相のみが存在し、気体と液体双方の特性のいくつかを有する。
【0010】
植物材料から活性物質を抽出するために使用することができる多くの溶媒が存在し、表1には、それらの溶媒の一部について臨界温度および臨界圧を示している。
【0011】
【表1】

【0012】
出願人は、臨界温度31.1℃および臨界圧73.8バールを有する二酸化炭素を好ましい溶媒として選択した。
【0013】
二酸化炭素は、豊富な供給量で利用でき、低コストであり、必要ならばリサイクルすることができるため、特に有利である。COの喪失も生態学的に中性である。さらに、CO抽出は、保存的な調製方法であり、極めて壊れやすい分子を的確に抽出することができる。
【0014】
カンナビス薬草の強力な規格化された抽出物を製造するための溶媒として液体COを最初に選択する際に考慮した重要な事柄は、高度な選択性が得られることであった。CO系において、溶媒和力は、主に密度および温度の関数であると見なされ、溶媒密度がより重要な要素であると判断されている。
【0015】
予想とは逆に、出願人は、カンナビノイドが超臨界条件下より、むしろ亜臨界条件下で最も良く得られると判断した。
【0016】
超臨界の温度および圧力未満に温度および圧力を注意深く制御することにより、出願人は、比較的容易に分離することができる他の成分と共にカンナビノイドに富んだ特定の親油性または親水性分画を分離し、薬学的に許容できる形態で望ましい成分を含有する植物性原薬(BDS)を得ることができた。したがって、活性物質であることが知られている化合物を、植物性原材料中に存在する複雑な混合物から分離することができる。
【0017】
さらに、極めて良好なバッチ間再現性がバッチ間で得られ、植物性原材料中に様々な程度で存在する可能性のある重金属などの望ましくない成分を廃棄物質中に残すことができる。
【0018】
抽出条件を変更し、原材料中に存在する可能性のある残留農薬を排除することもできる。
【0019】
亜臨界条件を用いる利点には、抽出の選択性が含まれる。対照的に、出願人は、SFEについて、溶媒ならびに望ましいカンナビノイドの可溶化は、その後の精製ステップにおいて分離することが困難であることが分かっている他の非標的材料を不都合なほどに可溶化することを見いだした。
【0020】
説明すると、亜臨界COの密度は低く、系の臨界点に達するまで圧力を上げてもなお低い。したがって、亜臨界COの溶媒和力は低下するものの、最も可溶性の成分(この場合にはカンナビノイド分画)のみがCOによって効率的に溶かされるため、高度な選択性を得ることができる。その結果は、カンナビノイドはもちろんのこと、多くを簡単なステップにおいて比較的容易に除去することができる限られた数に過ぎない非標的化合物を含有する比較的単純な抽出物の生成である。さらに、比較的低い圧力および温度で操作することによって行われる費用節減はさらなる利点である。
【0021】
対照的に、31℃の臨界温度を超えると、超臨界流体状態で存在するため、COの密度が有意に増加する。このことは、溶媒の溶媒和力を大きく増加させる効果を有し、より多くのカンナビノイドが可溶化されて高収率を与える点で一般には有利であるものの、より強力な溶媒の選択性の低下は、得られる抽出物の精製を困難にする一連の非標的化合物の溶解性を増す結果になるという理由で実際には不都合であると分かっている。言い換えれば、標的化合物の濃度が著しく希釈されている(すなわち、抽出物の効力が低下する)可能性のあるより複雑な抽出物の生成をもたらす。
【0022】
第1の態様において、本発明は、脱炭酸ステップ、液体二酸化炭素(CO)による抽出、および抽出物中の非標的材料の割合を減らすステップを含む、植物材料からカンナビノイドを抽出する方法であって、液体COによる抽出が5〜15℃の温度および50〜70バールの圧力下の亜臨界条件下で行われることを特徴とする方法を提供する。
【0023】
本発明の方法を用い、カンナビス植物材料からカンナビノイドに富んだ抽出物を調製することができる。好ましい実施形態では、この方法を用い、植物性原薬であるカンナビス抽出物を製造することができる。
【0024】
本出願との関連において、「植物性原薬」は、カンナビス植物材料に由来する抽出物であり、Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance、August 2000、米国保健省食品医薬品局医薬品評価研究センターに示されている「植物性原薬」の定義「1種または複数の植物、藻類、または肉眼で見える真菌に由来する原薬。微粉化、煮沸、発現、水抽出、エタノール抽出、または他の類似したプロセスのうち1種または複数のプロセスにより植物性原材料から調製される」を満たす抽出物である。
【0025】
「植物材料」は、植物または植物部分(例えば、樹皮、木、葉、茎、根、花、果実、種子、液果またはそれらの部分)ならびに浸出物として定義され、Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance、August 2000、米国保健省食品医薬品局医薬品評価研究センターにおける「植物性原材料」の定義の範囲に入る材料が含まれる。
【0026】
本発明の方法を用い、このようなカンナビノイドを含有することが知られている任意の植物材料からカンナビノイドを抽出することができる。最も典型的には、しかし必ずではないが、「植物材料」は、1種または複数のカンナビス植物に由来する「植物材料」または「植物性原材料」であろう。
【0027】
用語「カンナビス植物」は、野性型カンナビス・サティバ(Cannabis sativa)およびその変異体も包含し、様々な量の個々のカンナビノイドを自然に含有するカンナビス化学型、変異体の変種インディカ(indica)および変種カフィリスタニカ(kafiristanica)を含むカンナビス・サティバ、亜種インディカ、カンナビス・インディカおよびそれらの遺伝的交雑、自家交雑またはハイブリッドの結果である植物も含まれる。したがって、用語「カンナビス植物材料」は、1種または複数のカンナビス植物に由来する植物材料を包含すると解釈するべきである。疑いを回避するため、本明細書では、「カンナビス植物材料」には乾燥カンナビスバイオマスが含まれることを明記する。
【0028】
液体COによる抽出は8〜12℃の温度で行うことが好ましく、約10℃の温度で行うことが最も好ましい。
【0029】
液体COによる抽出は55〜65バールの圧力で行うことが好ましく、実質的に60バールの圧力で行うことが最も好ましい。
【0030】
COは、1000〜1500Kg/hのマスフローを有することが最も好ましく、実質的に1250Kg/hのマスフローを有することがより好ましい。
【0031】
液体CO抽出は最長10時間実行することが好ましく、約8時間実行することが最も好ましい。
【0032】
好ましい実施形態において、液体COは減圧によって除去され、回収された抽出物は−15℃〜−20℃の範囲の温度に保たれる。
【0033】
植物性原薬中の非標的材料の割合を減らすステップは、基本的に、最終の植物性原薬生成物中に存在する望ましくない成分の量が減少するように、望ましくない成分(カンナビノイドとは反対に)の選択的除去をもたらす任意の処理であってよい。「非標的」材料は、最終植物性原薬中に存在することが望ましくない出発植物材料に由来する任意の材料である。好ましい実施形態において、このステップは、C1〜C5アルコールによる沈殿を含み、アルコール沈殿ステップにおいて処理される材料は、C1〜C5アルコールが添加される前に室温より高温に温められる。通常、植物性原薬中の非標的材料の比率を減らすステップは、液体COによる抽出後に行われ、その場合、アルコール沈殿中の「処理される材料」は、液体CO抽出の生成物である。この抽出物は、それ自体が上記で示した定義内の「植物性原薬」である。
【0034】
C1〜C5アルコールは、エタノールであることが好ましい。抽出物は、36℃〜44℃の範囲の温度まで温められることが好ましく、約40℃まで温められることが最も好ましい。C1〜C5アルコールの添加に先立って処理される材料を温めることは、この材料とC1〜C5アルコールの混合を改善する効果を有するため、アルコール沈殿ステップの成果を改善する。
【0035】
C1〜C5アルコールは、処理される材料の重量に対して3:1〜1:1のC1〜C5アルコール容積の量で添加されることが好ましく、処理される材料の重量に対して約2:1のC1〜C5アルコール容積の量で添加されることがより好ましい。
【0036】
処理される材料にC1〜C5アルコールを添加して得られる溶液を冷却し、不溶物を沈殿させる。溶液を−15℃〜−25℃の範囲の温度まで冷却することが好ましく、溶液を52時間までの間冷却することが好ましい。
【0037】
次いで、不溶物の沈殿を、通常は濾過によって除去する。濾過は、20μmの膜により行うことが好ましい。
【0038】
他の好ましい実施形態において、方法は、減圧下の多段階蒸発をさらに含むことができる。これは、回転蒸発または他の知られている技法によることができる。
【0039】
通常、多段階蒸発は、すべてのC1〜C5アルコールおよび水を実質的に除去するため、C1〜C5アルコール沈殿ステップの生成物に対して行う。C1〜C5アルコールを初めに除去し、次いで水を除去することが好ましい。
【0040】
好ましくは、C1〜C5アルコールの除去は、58〜62℃の範囲の温度まで加熱し、168〜172ミリバールの範囲の真空下で38〜42℃の範囲の蒸気温度とし、目に見える凝縮物がほとんどあるいは全く認められなくなるまで行う。
【0041】
次いで、水を、好ましくは約50ミリバールまで段階的に真空を段階的に引き下げることによりさらに除去する。
【0042】
脱炭酸ステップは、液体COによる抽出に先立って、またはその後に行うことができる。
【0043】
好ましい実施形態において、脱炭酸ステップは、液体COによる抽出に先立って行い、THCのCBNへの熱分解が10%未満であることを確保しながら、酸性カンナビノイドの酸型から中性型への少なくとも95%の変換を確保する温度および時間、植物材料を加熱することによって行う。
【0044】
カンナビノイド酸の脱炭酸は、時間および温度の関数であることから、より高温では、所与の量のカンナビノイド酸を完全に脱炭酸するのに要する時間はより短くなる。しかしながら、脱炭酸の適切な条件を選択する際には、望ましい薬理学的カンナビノイドの望ましくない分解生成物への熱分解、特にTHCのカンナビノール(CBN)への熱分解を最小限に抑えることを考慮しなければならない。
【0045】
脱炭酸は、植物材料を、
i)第1の(比較的短い)時間、第1の温度まで加熱することにより、保有水を蒸発させ、植物材料の均一な加熱を可能にし、
ii)酸性カンナビノイドの中性型への少なくとも95%の変換が起きるまで、第2の時間(通常は、第1の時間よりも長い)、温度を第2の温度まで上昇させる
多段階加熱プロセスで行われることが好ましい。
【0046】
第1ステップは、10〜20分間、100℃〜110℃の範囲の温度で行われることが好ましい。第1の温度は約105℃であり、第1の時間は約15分であることがより好ましい。
【0047】
植物材料が、高いCBD含量を有する(全カンナビノイド含量の中の割合として>90%CBDとして定義される)カンナビス植物由来である場合、第2の温度は115℃〜125℃の範囲であることが好ましく、約120℃であることが好ましく、第2の時間は45〜75分の範囲であり、約60分であることが好ましい。第2の温度は135℃〜145℃の範囲であることがより好ましく、約140℃であることが好ましく、第2の時間は15〜45分の範囲であり、約30分であることが好ましい。別の実施形態において、4kgを超える植物材料の質量に対し、第2の温度は140℃〜150℃の範囲、好ましくは145℃であり、第2の時間は55〜90分の範囲であることが最も好ましい。後者の条件は、例えば、4〜6kgの出発植物材料の量を処理するのに好ましく、正確な数字、特に時間は、質量の増加によってわずかに変化することがある。
【0048】
植物材料が、高いTHC含量を有する(全カンナビノイド含量の中の割合として>90%THCとして定義される)カンナビス植物由来である場合、第2の温度は115℃〜125℃の範囲であることが好ましく、通常は120℃であり、第2の時間は45分〜75分の範囲であることが好ましく、通常は約60分である。第2の温度は100℃〜110℃の範囲であることがより好ましく、通常は105℃であり、第2の時間は60〜120分の範囲である。別の実施形態において、4kgを超える植物材料の質量に対し、第2の温度は140℃〜150℃の範囲、好ましくは145℃であり、第2の時間は45〜55分の範囲であることが最も好ましい。
【0049】
脱炭酸ステップは、THCのCBNへの熱分解が5%未満であることを確保しながら、酸性カンナビノイドの中性型への少なくとも97%の変換を確保する温度および時間、行うことが最も好ましい。
【0050】
カンナビノイドアッセイの標準条件、およびカンナビノイド含量(%として)を算出する方法は、添付の実施例に示す。
【0051】
抽出プロセスの出発材料として使用する植物材料は、好ましくは磨砕、粉砕、または他の処理で、2mm未満の粒径とするが、好ましくは1mmを超える。一般に、このような処理は、充填密度が改善されるため、植物材料からのカンナビノイドの抽出の改善をもたらす。
【0052】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、植物材料に由来する抽出物(すなわち、植物性原薬材料)を活性炭で処理するステップをさらに含む。
【0053】
通常、このステップは、C1〜C5アルコールによる沈殿の生成物に対し、通常は沈殿を除去するための濾過直後に行うものとする。アルコール沈殿の液体生成物は、上記に示す定義に従い、「植物性原薬」として分類される。好都合には、処理される液体材料を活性炭カラム中に流下させることによって、活性炭による処理を行うことができる。
【0054】
添付の実施例に示すように、活性炭による処理は、カンナビス植物材料に由来する植物性原薬の安定性を有意に改善し、活性カンナビノイドの熱分解に対する抵抗性を有意に改善する。
【0055】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、以下のステップを含み、カンナビス植物材料から出発し、
i)脱炭酸、
ii)粗製の植物性原薬を製造するための液体COによる抽出、
iii)非標的材料の比率を減らすためのC1〜C5アルコールによる沈殿、
iv)沈殿を除去するための濾過、
v)C1〜C5アルコールおよび水を除去し、最終の植物性原薬(BDS)を製造するための蒸発という定められた順序で行われることが好ましい。
【0056】
活性炭による処理のステップは、ステップiv)とステップv)の間に入れることができ、最終BDSの安定性の改善をもたらす。
【0057】
さらに、出願人は、ある比率の調整剤または極性溶媒、例えば、エタノールなどのC1〜C5アルコールを液体二酸化炭素溶媒に添加することが、抽出プロセスの選択性をさらに高めると判断した。
【0058】
したがって、本発明は、液体COによる抽出を含む植物材料からカンナビノイドを抽出する方法であって、二酸化炭素に有機調整剤または極性溶媒を添加することを特徴とする方法をさらに提供する。
【0059】
調整剤または極性溶媒を10重量%までの量で添加することが好ましい。
【0060】
調整剤は、C1〜C5アルコールであることが好ましく、エタノールであることが最も好ましい。
【0061】
他の態様において、さらに、本発明は、カンナビス植物材料に由来する植物性原薬に関する。したがって、本発明は、全カンナビノイド含量の少なくとも90%w/wのTHC含量を有する高THC含有カンナビス植物由来の植物性原材料から得られる植物性原薬であって、前記植物性原薬は、抽出物の少なくとも50%w/wのTHC、THC含量の5%w/w以下のCBD、およびTHC含量の5%w/w以下のTHCおよびCBD以外のカンナビノイドを含む高THCカンナビス植物由来の抽出物である、植物性原薬を提供する。
【0062】
抽出物のTHCの%wt/wtは、少なくとも55%であることが好ましく、少なくとも60%であることがより好ましい。他のカンナビノイドおよび量を測定するためのアッセイ方法は後で示す。
【0063】
また、本発明は、全カンナビノイド含量の少なくとも90%w/wのCBD含量を有する高CBD含有カンナビス植物由来の植物性原材料から得られる植物性原薬であって、前記植物性原薬は、抽出物の少なくとも50%w/wのCBD、CBD含量の7.5%w/w以下のTHC、およびCBD含量の%w/wで表してCBDおよびTHC以外のカンナビノイド5%以下を含む高CBDカンナビス植物由来の抽出物である、植物性原薬を提供する。
【0064】
自然選択により、あるいはカンナビジオレート合成酵素およびTHC合成酵素の遺伝子が同定された(JP2001029082およびJP2000078979を参照)ので遺伝子操作により、他のカンナビノイド、例えばCBDに富んだ植物を開発するために、同様に使用できる従来の各育種技法を用いて、娯楽のためではあるが、例えば「Skunk」などの高THC植物が育種されてきたことを、当業者であれば理解されよう。CPRO921018Land系統であるTurkeyは、高CBD植物の例である。
【0065】
本発明による抽出方法を用い、カンナビス植物材料(植物性原材料)から出発して植物性原薬を得ることができる。
【0066】
好ましい実施形態において、植物性原薬は、4ppb以下のアフラトキシンを含む。
【0067】
他の好ましい実施形態において、植物性原薬は、20ppm以下の全重金属を含む。
【0068】
他の好ましい実施形態において、植物性原薬は、15%w/w以下の残留溶媒、より具体的には15%w/w以下のエタノールを含む。
【0069】
他の好ましい実施形態において、植物性原薬は、10cfu/g以下のTVC(全生菌数;Total Viable Count)、10cfu/g以下の真菌、10cfu/g以下の腸内細菌および他の非グラム陰性菌を含み、大腸菌、サルモネラ菌および黄色ブドウ球菌は検出されなかった。
【0070】
上に列挙したパラメータは、植物性原薬の純度に関し、植物性原薬を医薬品に組み入れる場合に好ましい純度のレベルを規定している。必要な純度のレベルを有する植物性原薬は、本発明による抽出プロセス、特に添付の実施例に記載の操作条件および品質管理手順を用いて得ることができる。植物性原薬中のアフラトキシン、重金属、残留溶媒および汚染菌のレベルを測定する際に使用するための標準的アッセイ技法は、当技術分野において知られており(例えば、欧州薬局方(Ph.Eur.)標準手順)、さらなる詳細を添付の実施例に示す。
【0071】
本発明の方法に従ってカンナビス植物材料から調製される植物性原薬は、薬学的に活性な物質としてカンナビノイドを含有する医薬製剤を製造するため、1種または複数の薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と一緒に製剤化するか、蒸発のために薬学的に許容できる表面上に沈着させることができる。
【0072】
したがって、他の態様において、本発明は、少なくとも1種のカンナビス植物変種由来の抽出物である植物性原薬を活性物質として含む医薬組成物を製造する方法であって、本発明による抽出方法を用いて少なくとも1種のカンナビス植物変種由来のカンナビノイドを含有する植物性原薬を調製すること、および医薬品組成物を製造するために1種または複数の薬学的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤と一緒に植物性原薬を製剤化するか、薬学的に許容できる蒸発用表面上に植物性原薬を沈着させることを含む方法を提供する。
【0073】
個々の植物性原薬を、異なるカンナビノイド含量を有する単一のカンナビス植物変種(例えば、高THCおよび高CBD植物)から調製し、次いで、製剤化に先立って混合または混和し、最終医薬組成物を製造することができる。この手法は、例えば、最終製剤中に個々のカンナビノイドについて所定の重量比を得ることが望ましい場合には好ましい。あるいは、所定のカンナビノイド含量の1種または複数のカンナビス植物変種由来の植物性原材料を、望ましいカンナビノイド含量を有する単一の植物性原薬の抽出に先立って一緒に混ぜ、次いで、最終医薬組成物に製剤化することができる。
【0074】
植物性原薬を、任意の好都合な薬学的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤と一緒に製剤化し、医薬組成物を製造することができる。希釈剤、担体または賦形剤の選択は、望ましい剤形に左右され、望ましい剤形は、患者への意図した投与経路に左右される。好ましい剤形には、とりわけ、ポンプ式またはエアロゾルのスプレーを介する投与のための液体剤形、錠剤、トローチ剤、ゲル剤、カプセル剤、坐剤、散剤など、および気化器が含まれる。このような剤形は、当業者に知られている医薬製剤化の標準原理に従って調製することができる。好ましい剤形、およびそのような剤形を調製する方法は、出願人による同時に係属している国際出願PCT/GB02/00620(WO02/064103)に記載されている。
【0075】
液体製剤が特に好ましい。本発明を限定することを意図してはいないが、カンナビノイドの投与に特に好ましい製剤は、植物性原薬、エタノールおよびプロピレングリコール、ならびに場合によりハッカ油などの香料を含む液体製剤である。この製剤は、ポンプ式スプレーを介して頬側または舌下粘膜へ好都合に投与することができ、活性カンナビノイドの効率的吸収をもたらす。
【0076】
添付の図と一緒に以下の実施例により、例示だけのために、本発明の様々な態様をさらに説明する。
【0077】
略語
主なカンナビノイドについて一般に受け入れられている略語は以下の通りである:
テトラヒドロカンナビノール(THC)、Δ−テトラヒドロカンナビノール(THCまたはΔ−THC)、Δ−テトラヒドロカンナビノール(Δ−THC)、Δ−テトラヒドロカンナビノール プロピル類似体(THCV)、カンナビジオール(CBD)、カンナビジオール プロピル類似体(CBDV)、カンナビノール(CBN)、カンナビクロメン(CBC)、カンナビクロメン プロピル類似体(CBCV)およびカンナビゲロール(CBG)。
【0078】
(実施例1)カンナビス植物からカンナビノイドを抽出するためのプロセスの開発
大麻化学型の選択
GW Pharma社は、特定の化学成分であるカンナビノイドの生産量を最大限に高めるため、カンナビス属植物雑種の異なる変種を開発した。2つのタイプの植物を用い、1つの化学型はTHCを主に産生し、別の化学型はCBDを主に産生する。しかしながら、代わりの変種を入手し(例えば、Common cannabinoids phenotypes in 350 stocks of cannabis、SmallおよびBeckstead、LLoydia vol 36b、1973 p144−156を参照)、当業者に知られている技法を用いて栽培し、カンナビノイド含量を最大限に高めることができる。
【0079】
THCとCBDの間には、化学的および構造的類似性が存在する。出発材料の植物起源に加えてこれらの類似性のため、カンナビノイドを抽出するためのプロセスの開発に関しては、各々が互換的であると見なすことができる。
【0080】
各カンナビス属化学型は、2つの異なるBDSを得るため別々に処理され制御されることが好ましい。しかしながら、2種以上の化学型由来の植物材料を混ぜるか、抽出に先立って望ましい比の所与のカンナビノイドを産生する変種を用い、単一BDSを調製することが可能である。
【0081】
植物性原材料の製造
BDSは、カンナビス・サティバ・エル(Cannabis sativa L.)(Cannabidaceae科)の抽出物から調製する。カンナビス・サティバは、1934年の英国薬局方に記載された。カンナビスは、イギリスのGW Pharma社の管理下、イギリス内務省の許可を受けて栽培されている。栽培施設は、ほぼ同一の育成条件で1年に何回かの作物を生産し、供給の連続性を確保することができるように、日よけおよび完全な環境制御(温度、湿度、および高輝度照明)を備えている。
【0082】
栽培:
カンナビス植物は、単一の種子源に由来する母木から採取した挿木から繁殖させる。したがって、作物は、植物がすべて雌である無性繁殖により生産される。挿木を用いる繁殖は、遺伝子型の一貫性を制御する。
【0083】
農薬非含有として供給される堆肥中で挿木を根付かせる。植物に水をやり、育成サイクル中に徐放性肥料を施す。制御された育成条件により、植物が成熟に達するのに約12週間を要する。
【0084】
育成サイクルを通じ、植物に飲料水を注ぐ。
【0085】
カンナビス植物の栽培には合成除草剤と農薬は一切使用しない。
【0086】
堆肥:
カンナビスの効率的栽培には、確実に均一な育成培地の供給が必要である。
【0087】
堆肥は、軟らかい感触、高い空隙率、早い湿潤性、低伝導率およびバランスのとれた栄養供給を提供する。堆肥は、ピートおよびカンナビス植物の育成サイクル中に堆肥のpH制御を提供するための石灰(炭酸マグネシウムおよび炭酸カルシウム)を含む添加天然ミネラルからなる。
【0088】
堆肥は、十分な供給の必須ミネラルおよび植物に対して知られている有害作用のある最低限のミネラルを含有する。マンガンを含むいくつかのミネラルは、堆肥中に不溶形で存在し、時間とともに易溶形で放出することができる。堆肥のpHを制御し、水浸しを避けるために注水をモニターすることは、可溶性マンガンレベルを制御することになる。堆肥のpHは、5.5より高く維持される。
【0089】
堆肥は、農薬および除草剤は一切添加されていないため、農薬非含有と宣言される。
【0090】
肥料:
堆肥は、2つの別個の形、基肥と徐放性肥料とに識別可能な肥料を含有する。徐放性肥料は、育成中の植物に追加して施す。
【0091】
病害対策および害虫駆除:
栽培中は人工除草剤と農薬を一切使用しない。厳密な衛生状態は、害虫および病害の進入を減らす。
【0092】
育成条件を制御することにより、乾燥、不十分な光および好ましくない温度などの環境ストレスは、病害の危険を軽減する。
【0093】
育成サイクル中に植物を定期的に検査すると、任意の変異植物および害虫を検出することができる。変異雄株が生じることがあるが、制御された育成条件および培地により、雑草は存在しないはずである。頻繁な検査および生物学的制御方法を用い、生じる可能性のある任意の害虫および病害を管理する。
【0094】
植物採集:
育成条件の厳重な管理により、カンナビス植物は、約12週で成熟に達する。育成の最後の数週に、密集した樹脂性の花が開く。約11週目の末までに、カンナビノイドの生合成は著しく遅くなり、植物は収穫の準備ができている。
【0095】
植物全体を切り、温度と湿度が制御された環境で乾燥する。
・約21℃。
・約38〜45%RH。
乾燥植物の終点を物理的に確かめる。
【0096】
THCおよびCBDは、BDSにおける主要な生理活性成分である。しかしながら、これらの成分は、BRM中で生物学的に不活性なカルボン酸として存在する。
・THCA
・CBDA
酸型は、乾燥中、時間とともにゆっくりと脱炭酸する。大きな茎から葉および花を取り、植物性原材料(BRM)を得る。
【0097】
BRMの貯蔵:
貯蔵条件下で、乾燥減量は、約10%の平衡に達する。乾燥BRMの貯蔵条件は、BRMの物理的状態に左右される。
【0098】
BRMの一般的貯蔵条件:
・遮光。
・約15〜25℃または−20℃
・約38〜42%RH。
【0099】
概要−BRMの製造:
植物の収穫

乾燥
(光排除)

BRM
(THCA+CBDAを含有)

2000μm未満に粉砕し粒径を小さくする

中性カンナビノイド(THC+CBD)を製造するための酸型カンナビノイド(THCA+CBDA)の脱炭酸
【0100】
高CBD変種に由来する典型的なBRMの規格を表2に示す:
【0101】
【表2】

【0102】
分析方法:
視覚による同定:
巨視的特性は、カンナビス植物の特徴を潜在的な混和物および代用物と区別することを可能にする。それは、写真による標準品に対する視覚的同定である。
【0103】
TLCによる同定:
TLCは、カンナビスの変種を効率的に同定するための保持時間と特徴的なスポット発色の双方を使用する。乾燥した薬草を抽出することにより、TLC分析のために試験サンプルを調製する。THCおよびCBDの基準サンプルと並べて、一定分量をTLCプレート上にスポットする。Fast Blue B試薬に曝露すると、THCおよびTHCAはピンク色のスポットとして現れ、CBDおよびCBDAはオレンジ色である。中性成分は、Rf値を標準品について得られたRf値と比較することにより酸と区別することができる。サンプルスポットのRfおよび色を適切な標準品について得られたRfおよび色と比較することにより同一性を確認する。
【0104】
HPLCによる同定:
HPLCは、カンナビスの変種を効率的に同定するためのカンナビノイドの保持時間比較を使用する。逆相HPLC法は、CBDおよびCBDAに特異的であることから、同一性テストとして使用することができる。バイオマスのサンプルを抽出し、遠心分離する。全分析物の検出は、220nmにおいて行い、酸性分析物は310nmにおいてさらに確認する。
【0105】
アッセイ(CBD+CBDA):
このアッセイを用い、植物中のCBDおよびCBDA含量をモニターする。CBDおよびCBDAアッセイは、HPLC法を用いて測定する。
【0106】
脱炭酸プロセスの効率は、CBDのw/w換算の含量%を全CBD+CBDA含量で除することにより決定する。
【0107】
乾燥減量:
乾燥減量は、欧州薬局方の試験法を用いて評価する。
【0108】
アフラトキシン:
アフラトキシンは、英国認定機関(UKAS)の認定方法を用いて分析する。
【0109】
微生物:
微生物学的品質は、欧州薬局方の方法を用いて判定する。
【0110】
異物:
異物は、欧州薬局方の試験法を用いて評価する。花、葉および側茎を、きれいな実験室表面上に薄い層に広げる。できる限り完全に、手によって異物を分離し、秤量する。結果は、薬草バイオマスサンプル中の異物の%w/wとして表す。異物は、バイオマスの2%以下を構成することがある。
【0111】
残留除草剤および農薬:
カンナビス植物は、十分に制御された環境で育成される。栽培中は、人工的な除草剤や農薬を使用せず必要ともしない。
【0112】
BRM相当規格(表2と比較)が高THC変種について得られ、THC/THCAをCBD/CBDAに置き換える以外は同一の分析方法を用いた。
【0113】
脱炭酸
THCおよびCBDは、カンナビスにおける主要な生理活性成分である。しかしながら、これらの成分は、カンナビス属植物中で生物学的に不活性なカルボン酸として存在する。カンナビス植物材料からTHCおよびCBDを抽出するためには、貯蔵前駆体化合物のTHCAおよびCBDAを、より容易に抽出できて薬学的に活性な形に変換する必要がある。THC酸およびCBD酸は、時間とともに自然にゆっくりと脱炭酸する。脱炭酸速度を高めるための伝統的方法は、熱をかけるものである。しかしながら、THCAは、THCばかりでなく、別のカンナビノイドであるカンナビノール(CBN)にも変換される。
【0114】
【化1】

【0115】
一般に、脱炭酸手順は、抽出プロセスの開始に先立って、出発材料すなわち植物性原材料(BRM)を調製する間に行われる。
【0116】
実験室での研究−脱炭酸
粉砕した乾燥植物材料の一部を加熱した(粒径1〜2mm、約0.25g)。THCAまたはCBDAをそれぞれTHCおよびCBDへ最適に変換するためのパラメータを決定する目的で、得られるそのような化合物の熱分解生成物への変換、THCの場合はCBNの生成を、同時に最小限に抑えながら、パイロットスケールの実験系を設定した。
【0117】
材料および方法の簡単な説明:
粉砕した(粒径約1〜2mm)THCAとCBDA双方の薬草材料の一部(0.25g)を20mlのガラス製ヘッドスペースバイアルに入れ、バイアルを、クリンプキャップ付きのテフロン表面処理ブチルゴムシールでしっかりと密閉した。密封したバイアルを、以下の通り4時間まで、3温度のうち一つで加熱した。
105℃、120℃、140℃で0.5、1.0、2.0および4.0時間。
【0118】
加熱は、強制的に空気を循環させるオーブン内で行った。オーブン条件は、使用した3温度において0.5〜1.0度以内で正確であることが分かった。
【0119】
加熱プロセスが完了した後、脱炭酸された薬草の代表的サンプルをHPLC、GCおよびTLC技法を用いてアッセイした。THC、CBDおよびCBNの標準品を、HPLCおよびGCの分析手順に含めた。
【0120】
結果および考察:
溶媒抽出物のHPLC分析は、2つの低い方の温度における時間の関数としてのCBDAあるいはTHCAの消失を立証することができた。140℃では、0.5時間における最も早い時点のサンプルが、CBDAまたはTHCAの保持時間において溶出する極めて少ないレベルのピークのみを含んでいた。
【0121】
表3および4は、CBDAまたはTHCAの遊離化合物への変換を定量化するHPLCデータを示しており、CBDまたはTHCの含量およびCBD/CBDA+CBDまたはTHC/THCA+THCの比を示すデータも示している。カルボン酸体の対応する脱炭酸体への変換は、脱炭酸/脱炭酸+非脱炭酸の比を脱炭酸化合物の絶対含量と比較することによりモニターすることができる。したがって、その比が最大値(>0.95)に達した場合、THCまたはCBDの含量も最大となる最も早い時間/温度の点が、変換プロセスにとって最適のはずである。
【0122】
したがって、CBD含有薬草の場合、120℃で1時間または140℃で0.5時間が適切であった。
【0123】
このことは、溶媒抽出物のTLCクロマトグラムの検討によって裏付けられ、120℃で1時間後に、または140℃ではいかなる時点でもCBDAは存在しない。
【0124】
THCについては3番目の基準、CBNの生成が存在し、熱的脱炭酸プロセス中のこの化合物の生成を最小限に抑えることが望ましい。表5は、CBN/THC比を導き出すことができるガスクロマトグラフィー(GC)データを提供している。THC/THCA+THCの比および最高THC含量を考慮すると、最小のCBN生成は、120℃で0.5または1時間後に起きる。140℃では、0.5時間でさえ、2つのより低い時間/温度のどちらよりも高いCBNの含量を与える。
【0125】
したがって、実験室での研究は、脱炭酸の最適条件が以下の通りであることを示している。
・主にCBDを生産する化学型では、120℃で1時間または140℃で0.5時間である。
・主にTHCを生産する化学型では、CBN生成を最小限に抑えるため、105℃で1〜2時間または120℃で1時間であることを示している。
【0126】
薄層クロマトグラフィーは、事実上すべてのTHCAが105℃で4時間後、および120℃で1時間後には消失したことを示している。薬草を140℃で加熱した場合、いかなる時点においてもTHCAは見られない。TLC上のこの保持値における少量の残留染色およびHPLC分析におけるTHCAに一致する低レベルのピークの存在は、残留THCAよりむしろ微量カンナビノイドの存在を示している可能性がある。
【0127】
【表3】

【0128】
【表4】

【0129】
【表5】

【0130】
植物性原材料(BRM)約4kgのバッチスケールに関する脱炭酸条件は以下の通りである:
粉砕した脱炭酸されるBRM(THCAあるいはCBDA)約4kgを、初めは105℃まで加熱し、この温度で約15分間保って保有水を蒸発させ、BRMの均一な加熱を可能にした。次いで、バッチをさらに145℃まで加熱し、その温度に45分間保って、95%の効率を超えるまで脱炭酸を完了させる。
【0131】
CBDAは、THCAよりも脱炭酸に対して抵抗性がやや高いことが結果から明らかになったため、CBDA BRMの加熱時間は145℃で55分まで延ばした。CBDとTHC間のこの差異は、商業的規模のバッチではさらに顕著となろう。THC BRMの加熱時間は145℃で45分間に保った。
【0132】
パイロットスケールで使用する条件は、実験室研究から最適と判断された条件を忠実に反映している。その差異は、パイロットスケールのバッチサイズが大きいために、容器を介し、BRMを通る熱伝導の速さと効率が低下することによって説明することができる。
【0133】
表6および7は、生物学的に活性なカンナビノイド、THCまたはCBDの含量について測定した脱炭酸の効率を示すデータを提供している。
【0134】
【表6】

【0135】
約4kgから6kgまでCBD BRMのバッチサイズを増加させた結果、脱炭酸時間を増やすことが必要になった。145℃における脱炭酸時間を55分から90分まで増やした。
【0136】
【表7】

【0137】
抽出プロセスの概要:
BDSは、液体二酸化炭素法を用いて脱炭酸BRMから抽出される。これは、高圧力容器に入っている刻んだバイオマスに液化二酸化炭素を連続的に通すものである。粗製抽出物をエタノールに溶かし、低温まで冷却して濾過し、ろうなどの沈殿成分を除去する。真空中でエタノールおよび水を除去することは、使用するバイオマスにもよるが、高濃度のCBDあるいはTHCを含有するBDSを生じる。
【0138】
典型的な抽出プロセスの流れ図:
約105℃まで15分間と、続いて約145℃までTHCAの場合は最低55分間、CBDAの場合は最低90分間加熱することによってBRMを脱炭酸する。

最長10時間の液体二酸化炭素(CO)[食品グレード]による抽出
条件:約60バール±10バールの圧力および10℃±5℃

粗製抽出物を回収するための減圧によるCOの除去

「winterisation」−粗製抽出物をエタノールに溶解後、不要のろうを沈殿させるために溶液を冷却すること(−20℃±5℃/52時間まで)

冷間濾過による不要のろう状材料の除去
(20μmフィルター)

減圧下の薄膜蒸発による濾液からのエタノールおよび水の除去
(60℃±2℃、40℃±2℃の蒸気/172ミリバールおよび72ミリバール±4ミリバール)

BDS
(−20℃±5℃で貯蔵)
【0139】
抽出番号1
製造プロセスにおける第1段階は、亜臨界条件下で液体COを用いる抽出である。
【0140】
実験は、THCとCBDの双方が、約60バール±10バールの圧力を用い、約10℃±5℃の低温において亜臨界COを用いて高い効率でカンナビス植物材料から抽出できることを示した。
【0141】
以下の表8は、THCに富むBDSについて作成された比較データを示している。
【0142】
【表8】

【0143】
この結果から、超臨界条件下での高含量のろうによって示されるように、選択性が失われることが見て取れる。winterisationは、ろうの除去量を増やすことができるとはいえ、例えばフィルターが詰まるので処理は困難である。
【0144】
CBDについても同様の結果が得られた。
【0145】
液体CO抽出の好ましい条件は以下の通りである:
脱炭酸した植物性原材料を1本のカラムに詰め込み、加圧下で液体COに曝露する。
・バッチサイズ:約60kg
・圧力:60バール±10バール
・温度:10℃±5℃
・時間:約8時間
・COマスフロー 1250kg/hr±20%。
【0146】
BDSの製造に好ましい製法パラメータは、抽出時間>10時間、CO圧力50〜70バール、抽出温度5〜15℃、COマス167kg/kg BRMである。
【0147】
減圧およびCOの放出後、粗製BDS抽出物を密封容器中に集める。元のBRMは、粗製BDS抽出物の約10%w/wまで減少する。粗製BDS抽出物は、−20℃±5℃に保つ。
【0148】
粗製BDS抽出物は、ろうおよび長鎖分子を含有する。除去は「winterisation」手順(抽出2)により、粗製BDS抽出物を、例えば40℃±4℃まで暖めて材料を液化する。粗製BDS抽出物の重量に対して2:1の比のエタノール容積でエタノールを加える。次いで、エタノール溶液を−20℃±5℃まで冷却し、この温度で約48時間保つ。
【0149】
winterisationが完了したら、20μmフィルターによる冷間濾過により沈殿を除去する。
【0150】
抽出番号2
製造プロセスにおける第2段階は、エタノールを用いる「winterisation」と呼ばれる抽出番号2である。粗製BDS抽出物は、ろうなどの成分を含有する抽出番号1から製造される。エタノールは、粗製抽出物から長鎖分子を効率的に抽出する。
【0151】
研究:
粗製BDS抽出物を約40℃まで温めることにより、粗製抽出物を溶媒と混ぜる能力が改善されることが判明した。
【0152】
「winterisation」溶液を−20℃まで約48時間冷却することが好ましかった。
【0153】
BDSの製造に好ましい製法パラメータは、抽出温度36〜44℃、エタノール:生成物比約2:1、フリーザー温度−25℃〜−15℃、時間48〜54時間である。
【0154】
濾過
第2抽出段階において製造されるエタノール溶液は、得られる沈殿を除去するための濾過を必要とする。フィルタサイズは、20μmであることが好ましい。
【0155】
BDSの製造に好ましい製法パラメータは、総濾過時間>6時間である。
【0156】
蒸発
製造プロセスの最終段階は、エタノールおよび存在する可能性のある水の除去である。これは、172ミリバール±4ミリバールの真空中で40℃±2℃の蒸気温度を得るために60℃±2℃に加熱することによって行われることが好ましい。これらの条件下の蒸留は、目に見える凝縮物がほとんどあるいは全く認められなくなるまで続く。約50ミリバールまで段階的にさらに真空を下げると、水除去が完了する。完了したら、密封したステンレス容器にBDSを移し、−20℃±5℃でフリーザーに貯蔵する。
【0157】
BDSの製造に好ましい製法パラメータは、蒸発蒸気温度38〜42℃、エタノールの除去真空圧力167〜177ミリバール、水の除去真空圧力70〜75ミリバール、62〜58ミリバール、52〜48ミリバール、時間<8時間である。
【0158】
BDSの特性決定
THC BDSは、少なくとも60%のカンナビノイド成分からなる褐色で粘稠な半固体抽出物である。カンナビノイド成分には、少なくとも90%のTHC、約1.5%のCBDが含まれ、残りは、他の微量カンナビノイドで構成されている。
【0159】
カンナビスの化学組成は、同定されている400種を超える化合物について徹底的に研究されている(Hendricks他、1975;Turner他、1980)。60種を超えるカンナビノイドが同定されており、CBDAおよびTHCA(CBDおよびTHC前駆体)が最も豊富に含まれている。一般に、非カンナビノイド成分は、抽出プロセスにもよるが、抽出物の50%までを構成する。同定されている化学種には、アルカン(25〜30個の炭素鎖)、窒素化合物、アミノ酸、糖、アルデヒド、アルコールおよびケトン、フラバノイド、グリコシド、ビタミン、色素およびテルペンが含まれる。カンナビスでは約95種のモノテルペンおよびセスキテルペンが同定されており、特徴的な臭いの原因である。
【0160】
CBDとTHC双方の構造を完全に解明するためにかなりの仕事が行われ(上記論文に要約されている)、双方とも合成的に調製されている。純粋なTHCは、同定および定量用の基準材料として使用できるほど十分な量でBDSから単離することに成功している。
【0161】
不純物:
BDS物質は、カンナビス・サティバのうち特定の化学型の、乾燥され脱炭酸された葉および花頭からの選択的抽出物である。60種を超えるカンナビノイドを含む400種を超える様々な化合物がカンナビス植物に見いだされている(Turner 1980)。これらが天然に存在することから、これらの成分のいずれも不純物と見なす必要はないと考えられる。したがって、主要な不純物は、4つの領域、すなわち育成プロセス中に導入される農薬、アフラトキシン、脱炭酸によって生成する新たな生成物およびBDSを構成するカンナビノイド以外の材料で生じる。
【0162】
育成プロセスは、GAPガイドラインを用いて厳密に制御され、気候の制御された屋内育成環境で行われる。育成中は作物に一切農薬を使用せず、すべての害虫駆除は、生物学的手段によって行う。育成培地には一切農薬を組み入れない。生成物中に農薬残留物が導入されないことを保証するため、育成培地供給業者によって使用されることが知られている農薬について育成培地を定期的に検査する。
【0163】
植物材料を収穫および乾燥したら、作物の汚染が起きていないことを保証するための一般的な農薬スクリーンを用い、他のサンプルを定期的に検査する。可能性のある不純物は、BRM段階において十分に制御される。
【0164】
これを防ぐために育成条件が注意深く制御されているにもかかわらず、原材料は、微生物で汚染され、生成物中にアフラトキシンをもたらす可能性がある。したがって、BRMおよびBDSは、アフラトキシン含量について定期的に検査される。
【0165】
新しく育成された植物中で天然に存在するTHCの形態は酸THCAであるが、少量の中性THCが存在する。抽出前に加熱によってTHCAを脱炭酸すると、中性THCが得られる。このプロセスは効率的であるが、少量のTHCAが残り、BDSの最終試験中にそれをモニターする。脱炭酸プロセス中のTHCAおよびTHCの熱分解により、CBNAおよびCBNが生成する可能性がある。これらをBDSでモニターする。
【0166】
BDSのバラスト部分を構成する非カンナビノイド成分には、炭化水素およびトリグリセリドろう、植物色素およびテルペンが含まれる。これらは、薬用植物の多くの他の抽出物の共通成分であり、毒性上も薬理上もほとんど意味がないと考えられている。存在する他の成分の範囲は広いが、通常は少量存在するに過ぎない。
【0167】
バラストの量は、ろうを沈殿させるwinterisationプロセスによって減少する。バラスト材料は、活性成分の希釈剤と見なされ、アッセイも制御もしない。
【0168】
【表9】

【0169】
分析手順
同定、アッセイおよび関連カンナビノイド:
BRMおよびBDS中のTHC、CBDおよびカンナビノール(CBN)の含量は、メタノールまたはメタノール/クロロホルム(9:1)による抽出によって定量する。220nmにおけるUV検出による逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が定量の方法である。すべての分析は、当該化合物が光に敏感であるため、暗室灯下で行わなければならない。
【0170】
クロマトグラフィー機器および条件:
機器 可変波長UV検出器またはダイオードアレイ検出器付きAgilent(HP)1100HPLCシステム
HPLCカラム Discovery C8 5μm 15cm×0.46cm
プレカラム Kingsorb C18 5μm 3cm×0.46cm
移動相 アセトニトリル:メタノール:0.25%w/v酢酸(容積で16:7:6)
カラム温度 25℃
流速 1.0ml min−1
検出 220nm 600mA f.s.d. 第2波長310nm
注入量 10μl
実行時間 20〜25分(遅れて溶出するピークを少量含むサンプルの場合に延長してもよい)
溶出順序 CBD、CBDA、ΔTHCV、CBN、ΔTHC、CBC、ΔTHCA
【0171】
標準品調製:
約1mg ml−1のCBD、CBNおよびΔTHCの保存メタノール標準溶液は、−20℃で保存する。
【0172】
希釈使用標準品(ΔTHCおよびCBDについては0.1mg/mlであり、CBNについては0.01mg/ml)を保存標準品からメタノール中で調製し、−20℃で保存する(初期調製後最大12カ月)。調製後、標準溶液をバイアルに等分し、室温に曝される標準品の量を軽減する。HPLCサンプルアッセイで使用するのに先立って、必要数の標準バイアルを取り出し、室温まで平衡化する。
【0173】
サンプル調製:
すべての調製において、重量あるいは容積を用い、同一の最終希釈液を得る。
【0174】
植物性原材料
・刻んで乾燥した均一な材料約100mgを10mlのメスフラスコに正確に秤量する。
・材料をメタノール:クロロホルム(9:1 v/v)に分散させ、同一溶媒で定容量にする。
・超音波浴で15分間、サンプルを抽出する。
・一定量を3000rpmで約2分間、遠心分離する。
・適当なHPLCサンプルバイアル中でメタノールにより上清100μlを1mlまで希釈する。(主要なカンナビノイド濃度が線形使用範囲の外側にある場合には、さらなる希釈が必要なことがある)。
【0175】
脱炭酸植物性原材料:
植物性原材料に関して。
【0176】
植物性原薬
・BDS約80mgを50mlのメスフラスコに正確に秤量する。
・BDSをメタノールで溶かして定容量にする。
・適当なHPLCオートサンプラーバイアル中でメタノールにより調製された上清100μlを1mlまで希釈する。
【0177】
クロマトグラフィー手順:
Agilentケムステーション上の配列リストに入れられた順序で、オートサンプラーラックにサンプルを入れる。標準溶液を用い、定量および保持時間データを得る。通常、これらを任意のサンプル溶液の注入に先立って2回または3回、次いで実行中に適切な間隔で1回注入することができ、標準品間では最大10個の試験サンプルとする。
【0178】
クロマトグラフィー合否基準:
【0179】
【表10】

【0180】
【表11】

【0181】
計算:
植物性原材料:
下記の式を用い、バッチ中の現在のところアッセイ可能なカンナビノイド(CBD、CBDA、CBN、ΔTHCおよびΔTHCA)の%として主要なカンナビノイドの純度に関する結果を得る:
【0182】
高ΔTHC材料の場合:
【0183】
【数1】

【0184】
高CBD材料の場合、CBDおよびCBDAが、式のトップラインにおけるTHCおよびTHCAと置き換わる。
【0185】
脱炭酸植物性原材料:
下記の式を用い、脱炭酸プロセスの効率を算出する:
【0186】
高ΔTHC材料の場合:
【0187】
【数2】

【0188】
高CBD材料の場合、CBDおよびCBDAが、式中のTHCおよびTHCAと置き換わる。
【0189】
植物性原薬:
下記の式を用い、原薬サンプルの濃度、個々のサンプルカンナビノイド濃度、原薬中のアッセイ可能なカンナビノイドの含量%、現在のところアッセイ可能なカンナビノイドの%としての主要なカンナビノイドの量および抽出原薬の全重量における主要なカンナビノイドの量を算出する。
【0190】
高ΔTHC材料の場合:
【0191】
【数3】


ここで、希釈係数=50×10=500
【0192】
【数4】

【0193】
【数5】

【0194】
ΔTHCに代えてこれらの式のすべてにCBDおよびCBNを代入し、両方の量的結果を得ることができる。また、ΔTHCAおよびCBDAも、それら自体の具体的な基準標準品なしにΔTHCまたはCBDの標準品濃度を用いて算出することができる。
【0195】
関連物質は、CBN、ΔTHCAおよびCBDAの平均%w/w値の和として定義される。
【0196】
【数6】

【0197】
全原薬抽出物中に存在するΔTHCの全量が得られる。
【0198】
(実施例2)活性炭を用いる部分的精製による植物性原薬(BDS)の安定性の検討
THC製剤に関する安定性試験の結果は、BDSの形態では、5℃という低い貯蔵温度でさえTHCが不安定であることを示している。これは、冷たい周囲温度で2年の貯蔵期間が認められているMarinolソフトゲルカプセル剤中の精製THC(Dronabinol USP)の挙動とは対照的である。また、注目すべきことに、Sigma−Aldrichにより供給されるTHCのメタノール標準溶液の貯蔵期間は、冷蔵保存され、遮光された場合に4年であると言われている。
【0199】
このBDS(THC)と精製THC間の安定性の明らかな差異は、BDSのある成分が主要なカンナビノイドを不安定化しているという推測を促した。
【0200】
この問題の解決法は、BDS(THC)を精製し、高純度、好ましくは結晶性のカンナビノイドを得ることであろう。しかしながら、BDSの純粋なカンナビノイドへの変換に掛かる余分な処理コストのために、カンナビノイドを組み入れる最終医薬品のコストが実質的に増大しよう。
【0201】
したがって、出願人は、安定性を増したBDSを生成するが、処理コストを法外に増大させない簡単な精製ステップを開発しようとした。
【0202】
出願人は、活性炭精製ステップを、「winterisation」プロセスと密接に結び付けて、エタノール性winterisation溶液をフィルタベッドに通し、沈殿したろうを除去し、次いで活性炭カラムに直接通すことにより単一ステップで行うことができ、活性炭の使用で貯蔵期間を有意に改善すると判断した。
【0203】
実験の詳細
濃度100mg/mlのBDS(THC)あるいはBDS(CBD)の無水エタノールBP溶液を、活性炭を詰めたカラムに通し、溶出液を集めた。次いで、それらを無水エタノールでさらに希釈し、約25mg/mlのカンナビノイド濃度を得た。次いで、10mlのAX1型(すなわち、琥珀色ガラス)バイアルに溶液を移し、クリンプシールをした。これらのサンプルを活性炭精製BDSと名付けた。
【0204】
活性炭カラムに通さなかったBDS(THC)およびBDS(CBD)溶液のサンプルを同様に希釈して25mg/mlのカンナビノイド濃度とし、同型の琥珀色ガラスバイアル中に密封した。これらのサンプルは、「標準BDS」と名付け、安定性試験の対照として用いた。
【0205】
各タイプの標準BDSおよび活性炭精製BDSを含むバイアルを40℃において安定性インキュベータ中に保存し、次いで、カンナビノイド含量HPLCの分析およびTLCプロファイリングのために1〜12カ月間にわたって定期的にサンプルを採取した。
【0206】
順相TLC分析は、以下の条件を用いた:
固定相:Silica Gel G
移動相:80:20 ヘキサン/アセトン
展開:2×8cmすなわち二重展開
可視化:0.1%w/vFast Blue B(水溶液)に浸漬する
【0207】
逆相TLC分析は、以下の条件を用いた:
固定相:C18被覆Silica Gel
移動相:6:7:16 0.25%v/v酢酸(水溶液)/メタノール/アセトニトリル
展開:2×8cmすなわち二重展開
可視化:0.1%w/vFast Blue B(水溶液)に浸漬する
【0208】
各サンプルについて、約5μgの全カンナビノイドを含有する容積の溶液をTLCプレートにアプライした。
【0209】
結果および考察
標準BDS(THC)および標準BDS(CBD)のエタノール溶液は、かなり濃い黄色である。BDS溶液を活性炭に通すと、おそらく液体CO抽出による大麻薬草からのBDSの調製中にカンナビノイドと同時に抽出される植物色素が吸着されることにより、効果的に溶液が脱色された。
【0210】
様々なBDS溶液のHPLC分析結果を表12として以下に示し、グラフとしても示す(図1〜3)。全データをt0アッセイの%として報告する。CBNの値は、以前の安定性試験においてTHCの熱分解の目印としてこの化合物が同定されているため、BDS(THC)溶液に含まれる。
【0211】
【表12】

【0212】
上記のデータから、活性炭により除去することができ、カンナビノイドを不安定化しているバラストのある成分がBDS(THC)とBDS(CBD)の双方に存在することは極めて明白である。
【0213】
標準BDSおよび対応する活性炭精製BDSについて40℃において12カ月後に到達する分解のレベルを比較すると、THCとCBD抽出物の双方にとって、活性炭精製は、熱分解に対する抵抗性を50%より大きく増大させることを示している。
【0214】
BDS(THC)の場合、CBNのレベルは、失われた主要なカンナビノイドの関数として増加するように見える(図3)。THCを含有する他の製剤について観察されるように、CBNのレベルは、熱分解の目印となることが確認される。
【0215】
40℃において12カ月後の標準BDS(CBD)と精製BDS(CBD)サンプルそれぞれのHPLCクロマトグラムのカンナビノイド領域の比較(データ省略)は、有意な情報を示さなかった。しかしながら、分解後の標準と精製BDS(THC)のHPLCクロマトグラムの同様の比較は参考になった。
【0216】
CBNは、より高度に分解された未精製標準BDSではより高いレベルにあったが、第2の有意な分解生成物も観察され、その生成物はこの場合にも両サンプルに存在するがより分解されたサンプルでより多かった。この場合も、この分解生成物のスペクトルは、CBNのスペクトルと基本的に一致し、このことと保持時間に基づき、CBN類似体の一つであるように見えた。
【0217】
結論
簡単な活性炭処理により、耐熱分解性の有意な改善が得られる。
【0218】
(実施例3) カンナビス植物材料のCO抽出に対する有機調整剤の添加の影響
下記の実施例は、液体CO抽出を用いてカンナビス植物材料(G5化学型)から製造される抽出物の特性に対する極性共溶媒の添加の影響に対する検討について記載し、超臨界CO抽出と対比して亜臨界CO抽出を用いて得られる選択性の差異について説明する。
【0219】
実験の詳細
抽出実験は、1リットル容量のCO抽出装置を用いて行った。食品グレードのCOおよびBPグレードの無水エタノールを溶媒として用いた。
【0220】
G5カンナビス(高CBD化学型)のバッチを使用した。CBD含量は、脱炭酸後に7.3%w/wであった。抽出物のカンナビノイド含量の分析は、HPLCにより行った。
【0221】
結果および考察
特定の条件下で4時間の抽出時間後に得られる最終抽出物の組成に関するデータを以下の表13に示す:
【0222】
【表13】

【0223】
回収効率は、各抽出について容器に充填された脱炭酸植物材料において利用可能なCBDに基づいている。
【0224】
結果は、亜臨界から超臨界への抽出条件の変更がCOの溶媒和力を高め、利用可能なCBDの高い回収率をもたらすことを示している。しかしながら、超臨界COは、より広範囲の化合物を可溶化することがあり、これらの付加的化合物の抽出は、亜臨界抽出の場合に得られるよりも低くなるまで抽出物中のCBDの濃度を希釈する効果を有する。その結果、原材料からの利用可能なCBDのわずかな上乗せ回収は、この不利益を上回ることはなく、超臨界条件の使用が望ましくないことを示している。
【0225】
超臨界COに調整剤として2%w/wの無水エタノールを添加すると、利用可能なCBDの回収率は90%を超えるまで上昇する。おそらく、比較的極性のカンナビノイドは、抽出物の極性が高いほどその中の溶解量が増す。
【0226】
興味深いことに、抽出物中のCBDの濃度は、極性調整剤の添加によりわずかに増加した。このことは、植物材料中に存在する同時抽出可能な非カンナビノイド材料が、標的カンナビノイドより極性が低いため、極性を高めた場合、この材料(「バラスト」)の抽出が選択解除されることを示しているように見える。したがって、超臨界CO+2%w/wエタノールによる大麻植物材料の抽出は、選択性を失うという不利益を伴わずに、標的活性の回収量を増加させる。
【0227】
要約すれば:
1.亜臨界条件から超臨界条件への変更は、原材料からのカンナビノイドの総回収率という点でほとんど利点を生じないが、抽出物の活性含量を減らすという不利益をもたらす。
【0228】
2.超臨界COへの2%無水エタノール調整剤の添加は、同時抽出される材料による活性含量の希釈という不利益もなく、原材料からのカンナビノイドの回収率に有意な改善をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【0229】
【図1】標準THC植物性原薬(BDS)および活性炭処理THC BDS(精製BDS)の40℃における経時的なTHCの消失を示す図である。Y軸:THCの量(t0値に対する割合として表される)、X軸:時間(月)。
【図2】標準CBD植物性原薬(BDS)および活性炭処理CBD BDS(精製BDS)の40℃における経時的なCBDの消失を示す図である。Y軸:CBDの量(t0値に対する割合として表される)、X軸:時間(月)。
【図3】標準THC植物性原薬(BDS)および活性炭処理THC BDS(精製BDS)の40℃における経時的なカンナビノール(CBN)の生成を示す図である。Y軸:CBNの量(t0値に対する割合として表される)、X軸:時間(月)。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
脱炭酸ステップ、液体二酸化炭素(CO)による抽出、および抽出物中の非標的材料の比率を減らすステップを含む、植物材料からカンナビノイドを抽出する方法であって、液体COによる抽出が、5〜15℃の範囲の温度および50〜70バールの範囲の圧力の亜臨界条件下で行われることを特徴とする方法。
【請求項2】
脱炭酸ステップが液体COによる抽出後に行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
脱炭酸ステップが液体COによる抽出前に行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項4】
温度が8〜12℃の範囲である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
温度が実質的に10℃である、請求項4に記載の方法。
【請求項6】
圧力が55〜65バールの範囲である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
圧力が実質的に60バールである、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
COが1000〜1500Kg/hの範囲のマスフローを有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
COが実質的に1250Kg/hのマスフローを有する、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
抽出が最長10時間実行される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
抽出が約8時間実行される、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
COが減圧によって除去され、回収された抽出物が−15℃〜−20℃の範囲の温度に保持される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
抽出物中の非標的材料の比率を減らすステップは、C1〜C5アルコールにより沈殿させることであり、処理される材料がC1〜C5アルコールの添加前に室温を超えて温められる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
C1〜C5アルコールがエタノールである、請求項13に記載の方法。
【請求項15】
抽出物が36℃〜44℃の範囲の温度まで温められる、請求項13または14に記載の方法。
【請求項16】
抽出物が約40℃まで温められる、請求項15に記載の方法。
【請求項17】
C1〜C5アルコールが処理される材料の重量に対して3:1〜1:1のC1〜C5アルコール容積の量で添加される、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
C1〜C5アルコールが処理される材料の重量に対して約2:1のC1〜C5アルコール容積の量で添加される、請求項17に記載の方法。
【請求項19】
処理される材料にC1〜C5アルコールを添加して得られる溶液を冷却し、不溶物を沈殿させる、請求項13〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
処理される材料にC1〜C5アルコールを添加して得られる溶液が−15℃〜−25℃の範囲の温度まで冷却される、請求項19に記載の方法。
【請求項21】
処理される材料にC1〜C5アルコールを添加して得られる溶液が最長52時間冷却される、請求項19または20に記載の方法。
【請求項22】
不溶物の沈殿が濾過によって除去される、請求項19〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
濾過が20μmの膜による、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
減圧下の多段階蒸発をさらに含む、請求項13〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
最初にC1〜C5アルコールが除去され、次いで水が除去される、請求項24に記載の方法。
【請求項26】
168〜172ミリバールの範囲の真空下で38〜42℃の範囲の蒸気温度を生じるように、C1〜C5アルコールを58〜62℃の範囲の温度に加熱して除去し、目に見える凝縮物がほとんどまたは全く認められなくなるまで行う、請求項25に記載の方法。
【請求項27】
水が約50ミリバールまで段階的に真空を下げることによりさらに除去される、請求項25または26に記載の方法。
【請求項28】
脱炭酸ステップが液体COによる抽出に先立って行われ、THCのCBNへの熱分解が10%未満であることを確保しながら、酸性カンナビノイドの中性型への少なくとも95%の変換を確保する温度および時間、植物材料を加熱することによって行われる、請求項3から27のいずれかに記載の方法。
【請求項29】
植物材料が
i)保有水を蒸発させ、植物材料の均一な加熱を可能にするため、第1の時間、第1の温度まで加熱し、
ii)酸性カンナビノイドの中性型への少なくとも95%の変換が起きるまで、第2の時間、第2の温度まで温度を上昇させる、
多段階加熱プロセスを行う、請求項28に記載の方法。
【請求項30】
第1ステップが10〜20分間、100℃〜110℃の範囲の温度で行われる、請求項29に記載の方法。
【請求項31】
第1の温度が約105℃であり、第1の時間が約15分である、請求項30に記載の方法。
【請求項32】
植物材料が高いCBD含量を有し、第2の温度が115℃〜125℃の範囲、好ましくは120℃であり、第2の時間が45分〜75分の範囲、好ましくは約60分である、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
植物材料が高いCBD含量を有し、第2の温度が135℃〜145℃の範囲、好ましくは140℃であり、第2の時間が15分〜45分の範囲、好ましくは約30分である、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
植物材料が高いCBD含量を有し、第2の温度が140℃〜150℃の範囲、好ましくは約145℃であり、第2の時間が55分〜90分の範囲である、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
植物材料が高いTHC含量を有し、第2の温度が115℃〜125℃の範囲、好ましくは約120℃であり、第2の時間が45分〜75分の範囲、好ましくは約60分である、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
植物材料が高いTHC含量を有し、第2の温度が100℃〜110℃の範囲、好ましくは約105℃であり、第2の時間が60分〜120分の範囲である、請求項28から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
植物材料が高いTHC含量を有し、第2の温度が140℃〜150℃の範囲、好ましくは約145℃であり、第2の時間が45〜55分の範囲である、請求項28から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
脱炭酸ステップが、THCのCBNへの熱分解が5%未満であることを確保しながら、酸性カンナビノイドの中性型への少なくとも97%の変換を確保する温度および時間、行われる、請求項28〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
植物材料が磨砕、粉砕、または他の処理で2mm未満とされる、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
粒径が1mmを超える、請求項39に記載の方法。
【請求項41】
植物材料に由来する抽出物を活性炭で処理するステップをさらに含む、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
植物材料に由来する抽出物をアルコール溶液に溶かす、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
アルコール溶液がエタノール溶液である、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
活性炭による処理がエタノール沈殿ステップの後に続く、請求項43に記載の方法。
【請求項45】
液体COによる抽出を含む植物材料からカンナビノイドを抽出する方法であって、有機調整剤または極性溶媒を二酸化炭素に添加することを特徴とする方法。
【請求項46】
調整剤または極性溶媒が最大10重量%の量で添加される、請求項45に記載の方法。
【請求項47】
調整剤または極性溶媒がエタノールである、請求項45または46に記載の方法。
【請求項48】
植物材料が撹拌される、請求項3〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
植物材料が8〜12%の含水量を有する、請求項3〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
あるTHC含量を有する高THC含有カンナビス植物由来の植物性原材料から得られる植物性原薬であって、前記植物性原薬が、抽出物の少なくとも50%w/wのTHC、THC含量の%w/wとしてCBDを5%以下、およびTHC含量の%w/wとしてTHCおよびCBD以外のカンナビノイドを5%以下含む、高THCカンナビス植物由来の抽出物である、植物性原薬。
【請求項51】
あるCBD含量を有する高CBD含有カンナビス植物由来の植物性原材料から得られる植物性原薬であって、前記植物性原薬が、抽出物の50%w/wのCBD、CBD含量の%w/wとしてTHCを7.5%以下、およびCBD含量の%w/wとしてCBDおよびTHC以外のカンナビノイドを5%以下含む、高CBDカンナビス植物由来の抽出物である、植物性原薬。
【請求項52】
アフラトキシンを4ppb以下含む、請求項50または51に記載の植物性原薬。
【請求項53】
全重金属を20ppm以下含む、請求項50または51に記載の植物性原薬。
【請求項54】
残留溶媒を15%w/w以下含む、請求項50または51に記載の植物性原薬。
【請求項55】
残留溶媒がエタノールである、請求項54に記載の植物性原薬。
【請求項56】
10cfu/g以下のTVC、10cfu/g以下の真菌、10cfu/g以下の腸内細菌および他の非グラム陰性微生物を含み、大腸菌、サルモネラ菌および黄色ブドウ球菌は検出されない、請求項50または51に記載の植物性原薬。
【請求項57】
少なくとも60%のカンナビノイドを含み、その少なくとも90%はTHCであり、約1.5%はCBDであり、残りは他の微量カンナビノイドを含む、カンナビスから得られる植物性原薬。
【請求項58】
少なくとも60%のカンナビノイドを含み、その少なくとも85%はCBDであり、約3%はTHCであり、残りは他の微量カンナビノイドを含む、カンナビスから得られる植物性原薬。
【請求項59】
請求項57および58に記載の植物性原薬を混ぜることによって得られる植物性原薬。
【請求項60】
少なくとも1種のカンナビス植物由来の抽出物である植物性原薬を活性物質として含む医薬組成物を製造する方法であって、請求項1〜48のいずれか一項に記載の抽出方法を用いて少なくとも1種のカンナビス植物からカンナビノイドを含有する植物性原薬を調製すること、および医薬組成物を製造するための1種または複数の薬学的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤と一緒に植物性原薬を製剤化することを含む方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【公表番号】特表2006−511456(P2006−511456A)
【公表日】平成18年4月6日(2006.4.6)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2004−528675(P2004−528675)
【出願日】平成15年8月14日(2003.8.14)
【国際出願番号】PCT/GB2003/003566
【国際公開番号】WO2004/016277
【国際公開日】平成16年2月26日(2004.2.26)
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
テフロン
【出願人】(502327779)ジーダブリュー ファーマ リミテッド (5)
【Fターム(参考)】