植物細胞における高効率ペプチド生産
本発明は、組換えペプチドの生産のための改善された方法を提供する。特に、本発明は、植物細胞懸濁培養においてインビボで集合され得るウイルスカプシド融合タンパク質の形態の組換えペプチドの生産のための改善された方法を提供する。本発明はまた、非感染性ウイルスカプシド融合ペプチド生産を可能にするプラスミド、配列及び植物細胞を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、「植物細胞における高効率ペプチド生産」と題する、２００４年２月２７日出願の米国特許仮出願第６０／５４８，７４４号の優先権を主張する。
【０００２】
（政府権益の言明）
本出願は、国立衛生研究所、国立アレルギー及び感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、共同契約第１−Ｕ０１−ＡＩ０５４６４１−０１号との米国政府契約下にある。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、組換えペプチドの生産のための改善された方法を提供する。特に、本発明は、植物細胞懸濁培養においてインビボで集合され得るウイルスカプシド融合タンパク質の形態の組換えペプチドの生産のための改善された方法を提供する。本発明はまた、非感染性ウイルスカプシド融合ペプチド生産を可能にするプラスミド、配列及び植物細胞を含む。
【背景技術】
【０００４】
細菌、酵母、植物、昆虫及び哺乳動物細胞発現系が、組換えペプチドを生産するために現在使用されており、成功の程度は様々である。異種ペプチドの生産のための発現系を創造する上での１つのゴールは、商業、治療及びワクチン適用において利用できる、広範囲で、柔軟性があり、効率的、経済的及び実用的なプラットフォームと方法を提供することである。例えばある種のペプチドの生産のためには、下流の再構築(reassembly)コストを取り除く又は軽減するために、インビボで効率良く且つ安価に大量の所望の最終産物を生産することができる発現系を得ることが理想である。
【０００５】
現在、細菌は、豊富な量の組換えペプチドを生産するそれらの潜在能力の故に、組換えペプチドの生産のために最も広く使用されている発現系である。細菌は一般に、真核生物タンパク質をグリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化又はγ−カルボキシル化せず、それ故、翻訳後修飾を必要とするある種の異種真核生物ペプチドをインビボで生産するそれらの能力には限界がある。細菌によって生産される真核生物ペプチドを修飾する付加的な工程は、所要時間を増大し、ペプチド生産の全体的収率を低下させると考えられ、細菌宿主発現系の利点の多くを色褪せさせる。それ故、細菌発現系の固有の限界を克服するために代替的な非細菌発現系が利用されてきた。
【０００６】
異種ペプチドを生産する能力に関して分析された１つの特定宿主発現系は、全植物体及び植物細胞懸濁培養であった。植物の安全で安価な培養物は、ある種のペプチドのコスト効果的生産のための改善された代替的宿主を提供する。この代替物は、タンパク質が複雑で、グリコシル化を必要とし、ヒト又は動物感染性ウイルス及び細菌毒素不含である必要がある場合に特に魅力的である。
【０００７】
全植物体は、比較的安価に膨大な量で成長するという利点を提供し、収集されたトランスジェニック又はウイルス感染植物の大量のバイオマスからの、所望組換えタンパク質の大きな収量の潜在的可能性を有する。その結果として、全植物体は、ヒト又は動物への投与を意図する生物薬剤タンパク質の商業生産のための発現系として開発されてきた。
【０００８】
これらの系の固有の能力を利用するために、非細菌系における異種タンパク質の生産コストと収率を改善する試みに多大の時間と資源が費やされてきた。これらの領域の両方で進歩があったが、非細菌発現系における異種ペプチドの生産のためのさらなる方法とプラットフォームは有益であろう。
【０００９】
ウイルス及びウイルス様粒子
宿主細胞発現系におけるペプチド生産を改善するための１つのアプローチは、対象組換えペプチドを生産するために感染性組換えウイルスの性質を利用することである。植物宿主系における感染性ウイルスの使用は特に周知である。例えばPorta & Lomonossoff, (2002) “Viruses as vectors for the expression of foreign sequences in plants, “Biotechnology and Genetic Enginering Reviews 19:245-291参照。
【００１０】
最近の戦略は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）構造における異種ペプチドの生産に集中している。一般に、カプシド形成ウイルスは、ウイルス核酸を含有するように集合されたタンパク質コート又は「カプシド」を含む。多くのウイルスは、個別に発現されたカプシドから「自己集合(self-assembly)」することができるカプシドを有し、カプシドは細胞内部で（「インビボ集合(in vivo assembly)」）及び単離と精製後に細胞の外側で（「インビトロ集合(in vitro assembly)」）発現される。理想的には、標的組換えペプチドを含むようにカプシドを改変し、組換えウイルスカプシド−ペプチド融合物を生成する。次に融合ペプチドを細胞において発現させ、理想的には、組換えウイルス又はウイルス様粒子を形成するようにインビボで構築させることができる。
【００１１】
植物においてＶＬＰに集合されたウイルスカプシド融合タンパク質による異種タンパク質の生産は、様々な程度の成功を収めている。例えば C Marusic et al., J Virol. 75 (18): 8434-39 (Sep 2001)（組換えウイルス粒子のインビボ形成を伴う、末端で抗原性６アミノ酸ＨＩＶペプチドに融合されたウイルスカプシドを発現する全ニコチアナ・ベンタミアナにおける感染性螺旋ジャガイモＸウイルスの使用）; FR Brennan et al., Vaccine 17 (15-16): 1846-57 (09 Apr 1999) （カウピー（ササゲ）全植物体(ビグナ・ユニキクラータ）における組換えウイルス粒子発現のインビボ形成を伴う、末端で抗原性黄色ブドウ球菌ペプチドに融合された感染性カウピーモザイクウイルス又は螺旋ジャガイモＸウイルスの使用）; C Porta et al.,Intervirology 39 (1-2): 79-84 (1996) （全植物体において抗原性ＨＩＶ配列を含むキメラコートタンパク質を発現する感染性カウピーモザイクウイルス）参照。
【００１２】
Lomonossoff & Johnsonへの米国特許第５，８７４，０８７号は、ウイルスカプシドが生物活性ペプチド、例えばホルモン、成長因子又は抗原性ペプチドを含むように工作されている、植物細胞又は全植物体における感染性植物ウイルスの生産を述べている。コモウイルス、トンブスウイルス、ソベモウイルス及びネポウイルス属から選択されるウイルスを、外来性ペプチドをコードする配列を含むように工作し、組換えウイルスを生産するために工作したウイルスのゲノム全体を発現させる。前記明細書は、改変ウイルスの増殖が発明の中心部分であることを強調する。
【００１３】
チャップマン（Chapman）らへの米国特許第６，２３２，０９９号は、全植物体においてウイルスカプシドサブユニットに結合した異種タンパク質を生産するための感染性桿状ウイルスの使用を述べる。螺旋ウイルスとしても分類される桿状ウイルス、例えばジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）は、組換えウイルスカプシド−ペプチド融合物を創造するために対象組換えペプチドがウイルスのゲノムに挿入されている。次に、組換え感染性ウイルスを使用して全植物体の植物細胞に感染させ、ウイルスは植物細胞において活発に複製して、さらに他の細胞に感染し、最終的に宿主植物全体に感染する。最後に、組換えウイルスカプシド−ペプチド融合物を植物から精製する。
【００１４】
チャップマン（Chapman）らはまた、限られた挿入物サイズが二十面体ウイルスによって許容されることを教示する。チャップマン（Chapman）らは、自らの主張を裏付けるのに、植物宿主細胞における発現のための二十面体ウイルス内の組換えペプチドの大きさを２６アミノ酸の長さに限定する、国際公開公報第ＷＯ９２／１８６１８号を引用している。チャップマン（Chapman）らは、二十面体ウイルスのカプシドの内部挿入部位に存在するより大きなペプチドは、キメラウイルスの集合の失敗を導く、タンパク質の形状及び／又は他のカプシドと成功裏に相互作用するその能力の破壊をもたらし得ると理論付ける。
【００１５】
カプロウスキー（Koprowski）らへの米国特許第６，０４２，８３２号は、抗原性ポリペプチドに融合した植物ウイルスカプシドタンパク質を含む融合カプシドタンパク質を述べる。生じる粒子は全植物体において生産される。
【００１６】
カプシド融合タンパク質において異種タンパク質を生産するための感染性組換えウイルスの使用は、しかしながら、欠点がないわけではない。１つの特に厄介な面は、対象とする融合異種タンパク質を含まない基本的に野生型の復帰変異株、又は突然変異した望ましくない組換えカプシド融合タンパク質産物であるカプシドタンパク質を生じる、インビボで突然変異するこれらのウイルスの能力である。例えばPorta & Lomonossoff (1996) “Use of viral replicons for the expression of genes in plants, “ Molecular Biotechnology 5: 209- 221;Dolja et al. (1993) “Spontaneous mutagenesis of a plant potyvirus genome after insertion of a foreign gene,” J. Virol. 67 (10): 5968-5975; Dawson et al. (2001)”Assessment of recombinants that arise from the use of a TMV-based transient expression vector, “Virol. 284 (2): 182-189（接種した全植物体における異種挿入遺伝子の欠失を述べる）参照。全植物体におけるこれらのウイルスベクターの安定性の欠如は、全体的タンパク質産物の収率を潜在的に低下させ、カプシド−融合産物の不一致や不規則性を導き得る。そのような不規則性は、タンパク質産物の完全性がペプチドの特定所望物理化学的性質にとって必須である場合に特に厄介であり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
植物における感染性組換えウイルスの固有の不安定性の結果として、商業的組換えタンパク質生産の分野において植物系型の利益を提供する効率的なペプチド生産系に対する需要がまだ存在する。
【００１８】
加えて、組換えペプチドの生産のための全植物体の使用はまた、潜在的な問題を提示する。例えば長い発現時間、バッチごとの生成物収率の変動、封じ込めの問題、生産の初期段階に製造管理規則(Good Manufacturing Practice, GMP)を適用することの難しさ、農薬及び肥料による汚染の可能性、並びに害虫、病害及び微気候や土壌の相違による一定しない栽培条件は全て、組換えペプチドの生産のための潜在的に一貫しない宿主系を生じさせる。
【００１９】
それ故、カプシド融合タンパク質を含むウイルス様粒子の生産のための安定で一貫した植物細胞発現系を提供することが本発明の１つの目的である。
【００２０】
カプシド融合タンパク質を含むウイルス様粒子の生産のための安定な発現系における宿主細胞として使用のための植物細胞を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００２１】
植物細胞懸濁培養を含む、植物細胞におけるカプシド融合タンパク質を含むウイルス様粒子の改善された生産のための方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００２２】
カプシド融合タンパク質を含むウイルス様粒子の生産のための植物細胞発現系において使用するための新規構築物及び核酸を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、ウイルスカプシドと対象組換えペプチドを含む融合ペプチドをコードする非感染性プラスミドが宿主植物細胞のゲノムに安定に挿入され、懸濁植物細胞培養において発現される、組換えペプチドの生産のための方法を提供する。ウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物は、インビボでウイルス様粒子として発現され得る。本発明は、感染性ウイルス因子の使用を必要としない；というよりもむしろ、カプシド−異種ペプチド融合産物をコードする非感染性核酸が植物細胞のゲノムに安定に挿入され、それを、発酵工程において培養して対象ペプチドを生産することができる。そのような工程は、異種ペプチドを含むカプシド融合タンパク質の発現のためにより変動が少なく、より安定な宿主系を生じさせる。
【００２４】
全植物体において対象異種ペプチドを発現するために使用される、カプシド−異種ペプチド融合タンパク質を含む感染性ウイルスは、組換えカプシドタンパク質核酸における突然変異を生じさせる、全植物体での遺伝的不安定性を示し、発現される突然変異型カプシドは、ウイルス粒子へと集合することができないか又は突然変異した標的ペプチドを含むことが見出された。本発明は、増殖条件に対する厳密な制御、バッチごとの一貫性、高いレベルの封じ込め、及び製造管理規則(GMP)に従って組換えタンパク質を生産する能力という付加的な利益と共に、生じる異種ペプチドの高い安定性を提供する。
【００２５】
カプシド−融合タンパク質産物は細胞内でウイルス様粒子を形成し得る。ウイルス様粒子は、回収されるペプチドの高純度を達成する改善された効率をもたらし得る。細胞において生産されるウイルス様粒子は、典型的には植物細胞に感染することができない。ウイルスカプシド配列は、栄養性及び非栄養性ウイルスに両方に由来することができ、栄養機能は発現宿主として使用される特定植物細胞によって決定される。１つの実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、融合産物を発現するために使用される植物細胞に対して天然又は自然の栄養機能を示すウイルスに由来する。１つの実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、融合産物を発現するために使用される植物細胞に対して天然又は自然の栄養機能を示さないウイルスに由来する。１つの実施形態では、細胞は、融合産物を生産するために使用される所望カプシドタンパク質配列以外の人工的に導入されたウイルスタンパク質を含まない。もう１つの実施形態では、細胞は、融合産物を生産するために使用される所望カプシドタンパク質配列以外の人工的に導入されたウイルスタンパク質又は核酸を含み、前記の付加的なウイルスタンパク質又は核酸は、核酸配列に感染性を付与しない。１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、植物細胞発現宿主とは異なる科の生物に対して栄養機能を有するウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、植物細胞発現宿主とは異なる属の生物に対して栄養機能を有するウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、融合産物を発現するために使用される細胞とは異なる種の生物に対して親和性を有するウイルスに由来する。本発明の１つの実施形態では、カプシドは桿状植物ウイルスに由来する。特定実施形態では、カプシドは、タバコモザイクウイルス及びジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）から選択される群に由来する桿状ウイルスカプシドである。本発明の１つの実施形態では、カプシドタンパク質は二十面体ウイルスに由来する。特定実施形態では、カプシドは植物二十面体二十面体ウイルスに由来する。より特定の実施形態では、二十面体カプシドは、カウピーモザイクウイルス（ササゲモザイクウイルス）(Cowpea Mosaic Virus)、カウピークロロティックモトルウイルス（ササゲ退緑斑紋ウイルス）(Cowpea Clorotic Mottle Virus)及びアルファルファモザイクウイルスから選択される群に由来する。
【００２６】
本発明はまた、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合タンパク質をコードする発現カセットを含む非感染性核酸構築物を含む植物細胞を提供する。ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドは、植物細胞において機能するプロモーター及びターミネーターに作動可能に連結されている。１つの詳細な実施形態では、核酸は植物細胞のゲノムに組み込まれ、この組込みは、カプシド融合タンパク質をコードする核酸の世代から世代への安定な遺伝と発現をもたらす。本発明の１つの詳細な実施形態では、カプシドタンパク質は二十面体ウイルスに由来する。１つの実施形態では、細胞はウイルス様粒子又は可溶性ケージ構造を生産する。１つの実施形態では、植物細胞は単子葉植物又は双子葉植物である。特定実施形態では、植物細胞はニコチアナ・タバカム（タバコ）である。代替的実施形態では、植物細胞はオリザ・サティバ（イネ科イネ）である。本発明の１つの実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質に融合した組換えペプチドは、ヒト又は動物の治療のために有用な治療ペプチドである。１つの特定実施形態では、組換えペプチドは抗原性ペプチドである。特定実施形態では、抗原性ペプチドはグリコシル化抗原性ペプチドである。１つの実施形態では、抗原性ペプチドを含むカプシド−組換えペプチドウイルス様粒子を含有する植物細胞又は抽出物は、ワクチンとしてヒト又は動物に投与することができる。代替的実施形態では、抗原性ペプチドを含む精製カプシド−組換えペプチドウイルス様粒子は、ワクチンとしてヒト又は動物に投与することができる。１つの実施形態では、異種ペプチドは抗菌ペプチドである。もう１つの特定実施形態では、組換えペプチドは、遊離単量体形態であるとき植物宿主細胞に対して毒性であるペプチドである。１つの実施形態では、カプシドに融合した組換えペプチドは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも８５、少なくとも９５、少なくとも９９又は少なくとも１００アミノ酸の長さである。
【００２７】
本発明の１つの実施形態では、カプシドに融合した組換えペプチドは、所望標的ペプチドの少なくとも１個の単量体を含む。代替的実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの２個以上の単量体を含む。ある実施形態では、前記ペプチドは、コンカテマーペプチドとしてカプシドに作動可能に連結された少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個又は少なくとも２０個の別個の単量体から成る。もう１つの実施形態では、コンカテマーペプチド内の個々の単量体は、切断可能なリンカー領域によって連結される。さらにもう１つの実施形態では、組換えペプチドをウイルスカプシドの少なくとも１つの表面ループに挿入する。１つの実施形態では、組換えペプチドを二十面体ウイルスカプシドの少なくとも１つの表面ループに挿入する。１つの実施形態では、少なくとも１個の単量体をウイルスカプシドタンパク質の２つ以上の表面ループに挿入する。さらにもう１つの実施形態では、組換えペプチドをウイルスカプシドの少なくとも１つの外側表面ループに挿入する。代替的実施形態では、組換えペプチドをウイルスカプシドの少なくとも１つの内側表面ループに挿入する。
【００２８】
ウイルス様粒子の２つ以上のループを修飾することができる。１つの特定実施形態では、組換えペプチドをウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループ上で発現する。もう１つの実施形態では、少なくとも２個の異なるペプチドをウイルスカプシド、ケージ又はウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループに挿入する。もう１つの実施形態では、少なくとも３個の組換えペプチドをウイルス様粒子の少なくとも３つの表面ループに挿入する。表面ループ内の組換えペプチドは同じアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態では、表面ループ内の組換えペプチドのアミノ酸配列は異なる。
【００２９】
さらにもう１つの実施形態では、前記細胞は、野生型カプシド又は異なるカプシド−組換えペプチド融合ペプチドのいずれかをコードする少なくとも１個の付加的な核酸を含み、多数のカプシドは、インビボでキメラウイルス様粒子を生成するように集合され得る。
【００３０】
本発明の１つの態様では、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合タンパク質を含む植物細胞が提供される。本発明の１つの詳細な実施形態では、植物細胞は単子葉植物である。代替的実施形態では、植物細胞は双子葉植物である。１つの実施形態では、カプシド−組換えペプチド融合タンパク質は、インビボでウイルス様粒子を形成するように集合する。
【００３１】
本発明の１つの実施形態では、カプシドタンパク質−組換えペプチド融合ペプチドをコードする核酸構築物を含む植物細胞は、核形質転換によって得られる。１つの実施形態では、前記植物細胞は色素体（プラスチド(plastid)）形質転換によって得られる。さらにもう１つの実施形態では、前記植物細胞は葉緑体形質転換によって得られる。
【００３２】
本発明はさらに、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合タンパク質をコードする発現カセットを含む非感染性核酸構築物を提供する。本発明の１つの実施形態では、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合タンパク質をコードする発現カセットは、プロモーター及びターミネーターに作動可能に連結されている。本発明の１つの実施形態では、カプシドは植物ウイルスに由来する。本発明の１つの実施形態では、カプシドは二十面体植物ウイルスに由来する。特定実施形態では、カプシドは、カウピーモザイクウイルス、カウピークロロティックモトルウイルス及びアルファルファモザイクウイルスから選択される群に由来する二十面体ウイルスカプシドである。
【００３３】
本発明の１つの実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの少なくとも１個の単量体を含む。代替的実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの２個以上の単量体を含む。さらにもう１つの実施形態では、組換えペプチドは、二十面体ウイルスカプシドの少なくとも１つの表面ループに挿入される。
【００３４】
もう１つの実施形態では、前記核酸構築物は、植物細胞において機能する少なくとも１個のプロモーターを含む付加的な核酸配列を含む。もう１つの実施形態では、前記核酸構築物は、植物細胞において機能する少なくとも１個のプロモーター及び植物細胞において機能する少なくとも１個のターミネーターを含む付加的な核酸配列を含む。１つの実施形態では、プロモーター及びターミネーター配列に作動可能に連結された選択マーカーをコードする核酸配列が、前記核酸構築物に含まれる。代替的実施形態では、プロモーター及びターミネーター配列に作動可能に連結された選択マーカーは、別個の核酸構築物上で提供される。もう１つの実施形態では、前記核酸構築物は、ウイルスＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に由来する付加的な核酸配列を含む。さらにもう１つの実施形態では、核酸構築物は、ウイルスＲＮＡに由来する少なくとも１つのカプシド形成シグナルを含む。さらにもう１つの実施形態では、非感染性核酸構築物は、ウイルス核酸に感染性を付与しない、ウイルスＲＮＡに由来する付加的な核酸配列を含む。
【００３５】
１つの態様では、本発明は、
ａ）植物細胞を提供すること；
ｂ）少なくとも１個の異種ペプチドと少なくとも１個のウイルスカプシドタンパク質から成る融合ペプチドをコードする非感染性核酸を提供すること；
ｃ）前記植物細胞を形質転換し、前記核酸がその後植物細胞のゲノムに組み込まれること；
ｄ）前記植物細胞を発酵工程において懸濁植物細胞培養中で増殖させ、前記植物細胞において前記核酸を発現させること；
ｅ）前記植物細胞における発現が、前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること；及び
ｄ）前記ウイルス様粒子を単離すること
を含む、組換えペプチドを生産するための方法を提供する。
【００３６】
１つの実施形態では、前記方法は、ｅ）ウイルスカプシドタンパク質から組換えペプチドを分離するために融合産物を切断すること、をさらに含む。さらにもう１つの実施形態では、前記方法は、ｆ）工程（ｅ）の後に、組換えペプチドを単離すること、をさらに提供する。例えば図１参照。本発明の１つの実施形態では、植物細胞は、オリザ・サティバ及びニコチアナ・タバカムから成る群より選択される。
【００３７】
組換えペプチドとウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸は、プロモーター配列及びターミネーター配列に作動可能に連結される。
【００３８】
１つの実施形態では、前記方法は、野生型カプシド又は異なるカプシド−組換えペプチド融合ペプチドをコードするもう１つ別の核酸を同時発現することを含み、前記カプシドは、インビボでキメラウイルス様粒子を生成するように集合される。
【００３９】
本発明のもう１つの態様では、
ａ）植物細胞培地中で増殖することができる植物細胞；
ｂ）少なくとも１個の組換えペプチドと少なくとも１個のウイルスカプシドを含む融合ペプチドをコードし、植物細胞においてゲノムに組み込まれて発現することができる、非感染性核酸；及び
ｃ）増殖培地
を含む、組換えペプチドの生産のための発現系が提供される。
【００４０】
融合ペプチドをコードする核酸は、プロモーター配列及びターミネーター配列に作動可能に連結され得る。発現されたとき、融合ペプチドは、細胞内でウイルス様粒子に集合することができる。１つの実施形態では、前記プロモーターは植物プロモーターである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、ウイルスカプシドと対象組換えペプチドを含む融合ペプチドをコードする非感染性プラスミドが宿主植物細胞のゲノム内に安定に挿入され、懸濁植物細胞培養中で発現される、組換えペプチドの生産のための方法を提供する。ウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物は、インビボでウイルス様粒子として発現され得る。本発明はさらに、前記方法における使用のための植物細胞及び核酸構築物を提供する。詳細には、本発明は、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードする発現カセットを含む核酸構築物と共に、懸濁植物細胞培養中で増殖することができる植物細胞を提供する。前記融合ペプチドは、プロモーター配列及び終結配列に作動可能に連結され得る。１つの実施形態では、融合ペプチドの植物細胞における発現は、ウイルス様粒子又は可溶性ケージ構造を生成する。本発明はまた、植物細胞のゲノムに組み込むことができ、１つの実施形態では、ヒト及び動物の治療のために有用な治療ペプチドであり得る、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードすることができる核酸構築物を提供する。
【００４２】
本発明はまた、プロモーター及び終結配列に作動可能に連結された組換えペプチドとウイルスカプシドの融合ペプチドをコードする発現カセットを含む植物細胞のゲノムに組み込むことができる核酸；懸濁植物細胞培養中で前記植物細胞において核酸を発現させ、前記植物細胞における発現が前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること；及び前記ウイルス様粒子を単離すること、を提供することによって懸濁植物細胞培養において組換えペプチドを生産するための方法を提供する。
【００４３】
ここで使用する「感染性」という用語は、ウイルス粒子がその核酸を宿主に転移する能力又は宿主へのウイルス核酸の導入を意味し、その場合ウイルス核酸が複製され、ウイルスタンパク質が翻訳されて、核酸を宿主にさらに転移することができる新しいウイルス粒子が集合される。ここで使用する「非感染性」という用語は、宿主への導入後にウイルス由来核酸が宿主において複製できないことを意味し、その場合ウイルスタンパク質が翻訳され、宿主においてウイルス感染過程を開始することができない新しいウイルス様粒子が構築される。ここで使用する「ペプチド」という用語は、特定分子量に限定されず、タンパク質又はポリペプチドも包含し得る。
（Ｉ．組換え植物細胞）
【００４４】
本発明は、ゲノム組込みが可能であり、プロモーター配列及び終結配列に作動可能に連結されたウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードする非感染性核酸構築物を含む植物細胞を提供する。前記細胞は組換えペプチドを生産するための方法において使用することができる。
【００４５】
植物細胞は、プロモーター及び終結配列に作動可能に連結されたウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードする発現カセットを含み、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれる核酸構築物で天然植物細胞を形質転換することによって誘導できる。安定な形質転換は、ゲノム内への異種ＤＮＡの組込みに依存する。異種ＤＮＡは植物の核又は色素体に組み込まれ得る。核酸構築物は、植物のゲノムにランダムに挿入され得るか又は相同的組換えを通してゲノムの特定領域を指向し得る。前記植物細胞は、核形質転換、色素体形質転換及び葉緑体形質転換を含む、当技術分野において公知の何らかの手段によって入手できる。例えば米国特許第６，２１８，１４５号；欧州特許第０１２３４５１４９号；国際公開公報第ＷＯ０１２１７８２号；米国特許第６，５１５，２０６号；国際公開公報第ＷＯ９９／１０５１３号；米国特許第５，６９３，５０７号；国際公開公報第ＷＯ０２０５５６５１号；国際公開公報第ＷＯ０１７０９３９号；米国特許第６，４７２，５８６号；国際公開公報第ＷＯ０２０５７４６６号；米国特許第５，０５７，４２２号；国際公開公報第ＷＯ０１２０９７４号； Staub, J. M. and Maliga, P, (1992) “Long regions of homologous DNA are incorporated into the tobacco plastid genome by transformation,”
Plant Cell 4: 39-45 参照。
【００４６】
ウイルスカプシド
１つの実施形態では、本発明は、宿主ゲノムに安定に組み込まれた非感染性プラスミドからのウイルスカプシドに融合したペプチドの発現によってペプチドを生産するための方法における使用のための植物細胞を提供する。前記発現は、細胞内で少なくとも１個のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成を生じさせ得る。
【００４７】
ウイルスは、螺旋対称又は二十面体対称を有するものに分類できる。一般に認識されているカプシド形態は、二十面体（正二十面体（icosahedral proper）、等軸晶系、準等軸晶系、及び双生又は「双晶（twinned）」を含む）、多面体（球状、卵形及びレモン形を含む）、杆状（棒状又は弾丸状、及び紡錘状又は葉巻形を含む）、及び螺旋状（桿状、円柱状及びひも状を含む）を含み、いずれも尾部を有していてもよく及び／又は表面突起、例えば棘又はこぶを含んでいてもよい。
【００４８】
（形態）
本発明の１つの実施形態では、カプシドのアミノ酸配列は、何らかの形態を有すると分類されるウイルスのカプシドから選択される。１つの実施形態では、カプシドは桿状ウイルスに由来する。特定実施形態では、カプシドは桿状植物ウイルスに由来する。より特定の実施形態では、カプシドは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）から選択される群に由来する桿状植物ウイルスカプシドである。ＴＭＶは、桿状粒子（３００ｎｍ）を生じさせる独自のコードタンパク質（１７．５ｋＤａ）でカプシド形成された単一プラス−センスゲノムＲＮＡ（６．５ｋｂ）から成る。ジャガイモＸウイルスは、５１５ｎｍの明瞭なモード長と１３ｎｍの幅を有するひも状で被包されていない、通常は屈曲性のウイルスである（Brands, 1964）。カプシド構造は３．４ｎｍのピッチで基本螺旋を形成する（Verma et al., 1968）。
【００４９】
１つの実施形態では、カプシドは二十面体形態を有する。１つの実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、正二十面体である実在のカプシドから選択される。もう１つの特定実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、二十面体ウイルスのカプシドから選択される。１つの特定実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、二十面体植物ウイルスのカプシドから選択される。しかし、もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、植物に対して感染性でない二十面体ウイルスに由来する。例えば１つの実施形態では、ウイルスは、哺乳動物に対して感染性のウイルスである。
【００５０】
一般に、二十面体ウイルスのウイルスカプシドは、二十面体（立方）対称に配列された多数のタンパク質サブユニットから成る。天然二十面体カプシドは、例えばカプシドの各々の三角形の面を形成し、３個のサブユニットで構築することができ、完全なカプシドを形成する６０個のサブユニットを生じさせ得る。この小さなウイルス構造の典型は、例えばバクテリオファージφＸ１７４である。多くの二十面体ウイルスカプシドは６０個以上のサブユニットを含む。二十面体ウイルスの多くのカプシドは、逆平行の８本鎖β−バレル型折りたたみモチーフを含む。このモチーフは、一方の側に４本のβ鎖（ＢＩＤＧと称される）及び他方の側に４本のβ鎖（ＣＨＥＦと称される）を備えるくさび形ブロックを有する。また２つの保存されたα−ヘリックス（Ａ及びＢと称される）も存在し、１つはβＣとβＤの間、他方はβＥとβＦの間にある。
【００５１】
エンベロープを持つウイルスは、膜を通して粒子が突出（出芽）することにより、その全面的な破壊を伴わずに感染細胞を出て行くことができ、その間に粒子は、細胞膜に由来する脂質エンベロープ内に被包される（例えばAJ Cann (ed. ) (2001) Principles of Molecular Virology (Academic Press); A Granoff and RG Webster (eds.) (1999) Encyclopedia of Virology (Academic Press); DLD Caspar (1980) Biophys. J. 32: 103; DLD Caspar and A Klug (1962) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 27: 1; J Grimes et al. (1988) Nature 395: 470; JE Johnson (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93: 27; and J Johnson and J Speir (1997) J. Mol. Biol. 269: 665参照）。
【００５２】
（ウイルス）
ウイルス分類学は、以下の分類群のカプシド形成粒子実体を承認する：
・グループIウイルス、すなわちｄｓＤＮＡウイルス；
・グループＩＩウイルス、すなわちｓｓＤＮＡウイルス；
・グループＩＩＩウイルス、すなわちｄｓＲＮＡウイルス；
・グループＩＶウイルス、すなわちＤＮＡ段階を持たないｓｓＲＮＡ（＋）鎖ウイルス；
・グループＶウイルス、すなわちｓｓＲＮＡ（−）鎖ウイルス；
・グループＶＩウイルス、すなわちｓｓＲＮＡ逆転写ウイルスである、ＲＮＡレトロイドウイルス；
・グループＶＩＩウイルス、すなわちｄｓＤＮＡ逆転写ウイルスである、ＤＮＡレトロイドウイルス；
・デルタウイルス；
・ウイロイド；及び
・サテライト核酸及びプリオンを除く、サテライトファージ及びサテライトウイルス。
【００５３】
これらの分類群の成員は当業者に周知であり、H. V. Van Regenmortel et al. (eds.), Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2000) (Academic Press/Elsevier, Burlington Mass., USA); レスター大学微生物・免疫学部のウイルス分類学ウエブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｍｉｃｒｏ．ｍｓｂ．ｌｅ．ａｃ．ｕｋ／３０３５／ Ｖｉｒｕｓｇｒｏｕｐｓ．ｈｔｍｌ;及び米国保健社会福祉省の国立衛生研究所・国立医学図書館・国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）(Washington, D. C. , USA)の分類学ブラウザのオンライン「ウイルス」及び「ウイロイド」部門ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／ｔａｘ．ｈｔｍｌ．において総説されている。
【００５４】
カプシドのアミノ酸配列は、これらの分類群のいずれかの成員のカプシドから選択され得る。これらの分類群の成員のカプシドについてのアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩによって提供されるＰｕｂＭｅｄオンライン検索機能の「ヌクレオチド」（Ｇｅｎｂａｎｋ）、「タンパク質」及び「構造」部門ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ．を含むがこれらに限定されないソースから入手し得る。
【００５５】
１つの実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、以下の宿主の少なくとも１つに特異的な分類群成員から選択される：酵母を含む真菌、植物、藻類を含む原生生物、無脊椎動物、脊椎動物、及びヒト。１つの実施形態では、カプシドアミノ酸配列は以下の分類群のいずれかの成員から選択される：グループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩ、グループＩＶ、グループＶ、グループＶＩＩ、ウイロイド、及びサテライトウイルス。１つの実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、上述した６つの宿主型の少なくとも１つに特異的なこれら７つの分類群のいずれかの成員から選択される。より詳細な実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、グループＩＩ、グループＩＩＩ、グループＩＶ、グループＶＩＩ、及びサテライトウイルスのいずれかの成員から；又はグループＩＩ、グループＩＶ、グループＶＩＩ、及びサテライトウイルスのいずれかから選択される。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドはグループＩＶ又はグループＶＩＩから選択される。
【００５６】
ウイルスカプシド配列は、当該細胞に対して親和性でないウイルスに由来し得る。１つの実施形態では、当該細胞は、所望二十面体カプシド以外の特定選択ウイルスからのウイルスタンパク質を含まない。１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、当該細胞とは異なる科の生物に対して親和性を有するウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、当該細胞とは異なる属の生物に対して親和性を有するウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、当該細胞とは異なる種の生物に対して親和性を有するウイルスに由来する。
【００５７】
詳細な実施形態では、ウイルスカプシドはグループＩＶのウイルスから選択される。
【００５８】
１つの実施形態では、ウイルスカプシドは桿状植物ウイルスから選択される。より特定の実施形態では、ウイルスカプシドは、タバコモザイクウイルス及びジャガイモＸウイルスから成る群より選択される。
【００５９】
１つの実施形態では、ウイルスカプシドは二十面体ウイルスから選択される。二十面体ウイルスは、乳頭腫ウイルス科、トティウイルス科、ジシストロウイルス科、ヘパドナウイルス科、トガウイルス科、ポリオーマウイルス科、ノダウイルス科、テクティウイルス科、レヴィウイルス科、ミクロウイルス科、サイフォウイルス科、ノダウイルス科、ピコルナウイルス科、パルボウイルス科、カルシウイルス科、テトラウイルス科、及びサテライトウイルスのいずれかの成員から選択され得る。
【００６０】
特定実施形態では、前記配列は、少なくとも１つの植物宿主に特異的な分類群のいずれかの成員から選択される。１つの実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、ブンヤウイルス科、レオウイルス科、ラブドウイルス科、ルテオウイルス科、ナノウイルス科、パルティティウイルス科、セキウイルス科、ティモウイルス科、ウルミアウイルス属、タバコ壊死サテライトウイルス、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トンブスウイルス科、又はブロモウイルス科分類群のいずれかであるか又はそのいずれかの成員である、植物感染性ウイルス種である。１つの実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、ルテオウイルス科、ナノウイルス科、パルティティウイルス科、セキウイルス科、ティモウイルス科、ウルミアウイルス属、タバコ壊死サテライトウイルス、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トンブスウイルス科、又はブロモウイルス科分類群のいずれかであるか又はそのいずれかの成員である、植物感染性ウイルス種である。詳細な実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トンブスウイルス科、又はブロモウイルス科のいずれかであるか又はそのいずれかの成員である、植物感染性ウイルス種である。より特定の実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トンブスウイルス科、又はブロモウイルス科のいずれかであるか又はそのいずれかの成員である、植物感染性ウイルス種である。より特定の実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、コモウイルス科又はブロモウイルス科の成員である植物感染性ウイルス種である。特定実施形態では、ウイルスカプシドは、カウピーモザイクウイルス又はカウピークロロティックモトルウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、ブロモウイルス科分類群の種に由来する。詳細な実施形態では、カプシドは、イラルウイルス属又はアルファモウイルス属に由来する。より詳細な実施形態では、カプシドは、タバコ条斑病ウイルス又はアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）（ＡＭＶ１又はＡＭＶ２を含む）に由来する。
【００６１】
（ＶＬＰ）
本発明のウイルスカプシドは、ここで述べる宿主細胞において非感染性である。１つの実施形態では、ウイルス科の発現の間又は発現後に宿主細胞においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）又はケージ構造が形成される。１つの実施形態では、ＶＬＰ又はケージ構造はまた、対象とするペプチドも含み、特定実施形態では、対象ペプチドがＶＬＰの表面に発現される。前記発現系は、典型的にはウイルスの感染性を可能にする付加的なウイルスタンパク質を含まない。典型的実施形態では、発現系は、宿主細胞、及び１又はそれ以上のウイルスカプシド及び作動可能に連結された対象ペプチドをコードするベクターを含む。前記ベクターは、典型的には付加的なウイルスタンパク質を含まない。本発明は、ウイルスカプシドがある種の宿主細胞においてより大きな度合で形成され、組換えペプチドのより効率的な回収を可能にするという発見に由来する。
【００６２】
１つの実施形態では、ＶＬＰ又はケージ構造は、３から約１，０００カプシドを含む、カプシドの多量体集合物である。１つの実施形態では、ＶＬＰ又はケージ構造は、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも９０又は少なくとも１２０カプシドを含む。もう１つの実施形態では、各々のＶＬＰ又はケージ構造は、少なくとも１５０カプシド、少なくとも１６０、少なくとも１７０又は少なくとも１８０カプシドを含む。
【００６３】
１つの実施形態では、ＶＬＰは二十面体構造として発現される。もう１つの実施形態では、ＶＬＰは、そのカプシド配列が由来する天然ウイルスと同じ形状で発現される。別の実施形態では、しかしながら、ＶＬＰは天然ウイルスと同じ形状を持たない。ある実施形態では、例えば、多数のカプシドで形成されるが天然型ＶＬＰを形成しない粒子中で構造が生成される。例えばわずか３個のウイルスカプシドのケージ構造が形成され得る。別の実施形態では、約６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７又は６０カプシドのケージ構造が形成され得る。
【００６４】
１つの実施形態では、カプシドの少なくとも１個は、少なくとも１個の対象ペプチドを含む。１つの実施形態では、ペプチドは、ＶＬＰの少なくとも１つの内部ループ内で又は少なくとも１つの外側表面ループにおいて発現される。
【００６５】
ウイルスカプシドの２つ以上のループを修飾することができる。１つの特定実施形態では、組換えペプチドは、ウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループ上で発現される。もう１つの実施形態では、少なくとも２個の異なるペプチドをウイルスカプシド、ケージ又はウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループに挿入する。もう１つの実施形態では、少なくとも３個の組換えペプチドをウイルス様粒子の少なくとも３つの表面ループに挿入する。表面ループ内の組換えペプチドは同じアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態では、表面ループ内の組換えペプチドのアミノ酸配列は異なる。
【００６６】
ある実施形態では、ＶＬＰの集合を改善するために宿主細胞を修飾することができる。宿主細胞を、例えば、発現されたウイルスカプシドからのＶＬＰの形成を促進するシャペロンタンパク質を含むように改変することができる。もう１つの実施形態では、宿主細胞を、ＶＬＰの調節された形成を促進するためにカプシドの発現をより効率的に調節するリプレッサータンパク質を含むように改変する。
【００６７】
ウイルスカプシド又はタンパク質をコードする核酸配列はまた、ＶＬＰの形成を変化させるように付加的に修飾することができる（例えばBrumfield, et al. (2004) J. Gen. Virol. 85: 1049-1053参照）。例えばこれらの修飾は、集合されたタンパク質ケージ内の隣接サブユニットの内部、外部又はその間の界面を変化させるように設計される。これを実現するために、突然変異誘発プライマーを使用して、（ｉ）Ｎ末端の塩基性残基（例えばＫ、Ｒ）を酸性グルタミン酸に置き換えることによってウイルス核酸結合領域の内表面電荷を変化させる（Douglas et al., 2002b）；（ｉｉ）Ｎ末端から内部残基を欠失させる（ＣＣＭＶにおいて、通常は残基４−３７）；（ｉｉｉ）１１アミノ酸ペプチド細胞標的配列をコードするｃＤＮＡ（Graf et al., 1987）を表面露出ループに挿入する；及び（ｉｖ）金属結合部位を変化させることによってウイルスサブユニットの間の相互作用を修飾する（ＣＣＭＶにおいて、残基８１／１４８突然変異体）ことができる。
【００６８】
組換えペプチドの大きさ
１つの実施形態では、ウイルスカプシド配列に作動可能に連結されたペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含む。もう１つの実施形態では、前記ペプチドは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５又は少なくとも６アミノ酸の長さである。別の実施形態では、ペプチドは少なくとも７アミノ酸の長さである。ペプチドはまた、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４５、５０、６０、６５、７５、８５、９５、９６、９９又はそれ以上のアミノ酸の長さである。１つの実施形態では、コードされるペプチドは少なくとも２５ｋＤである。
【００６９】
１つの実施形態では、ペプチドは、２から約３００アミノ酸、又は約５から約２５０アミノ酸、又は約５から約２００アミノ酸、又は約５から約１５０アミノ酸、又は約５から約１００アミノ酸を含む。もう１つの実施形態では、ペプチドは、約１０から約１４０アミノ酸、又は約１０から約１２０アミノ酸、又は約１０から約１００アミノ酸を含む。
【００７０】
１つの実施形態では、ウイルスカプシド配列に作動可能に連結されたペプチド又はタンパク質は、約５００個のアミノ酸を含む。１つの実施形態では、ペプチドは５００個未満のアミノ酸を含む。もう１つの実施形態では、ペプチドは、約３００個までのアミノ酸、又は約２５０個まで、又は約２００個まで、又は約１８０個まで、又は約１６０個まで、又は約１５０個まで、又は約１４０個まで、又は約１２０個まで、又は約１１０個まで、又は約１００個まで、又は約９０個まで、又は約８０個まで、又は約７０個まで、又は約６０個まで、又は約５０個まで、又は約４０個まで、又は約３０個までのアミノ酸を含む。
【００７１】
１つの実施形態では、カプシドに融合した組換えペプチドは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも８５、少なくとも９５、少なくとも９９、又は少なくとも１００アミノ酸である。
【００７２】
本発明の１つの実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの少なくとも１個の単量体を含む。代替的実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの２個以上の単量体を含む。ある実施形態では、ペプチドは、コンカテマーペプチドとしてカプシドに作動可能に連結された、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個又は少なくとも２０個の別個の単量体から成る。もう１つの実施形態では、コンカテマーペプチド内の個々の単量体は、切断可能なリンカー領域によって連結される。さらにもう１つの実施形態では、組換えペプチドを、二十面体ウイルス様粒子の少なくとも１つの表面ループに挿入する。１つの実施形態では、少なくとも１個の単量体をウイルス様粒子の表面ループに挿入する。
【００７３】
（分類）
ウイルスカプシドに融合する対象ペプチドは、ウイルスに由来しない、及び場合により、当該細胞と同じ種に由来しない、異種タンパク質であり得る。
【００７４】
ウイルスカプシドに融合する対象ペプチドは、機能性ペプチド：構造ペプチド；抗原性ペプチド；毒性ペプチド、抗菌ペプチド、それらのフラグメント；それらの前駆体；前記のいずれかの組合せ；及び／又は前記のいずれかのコンカテマーであり得る。本発明の１つの実施形態では、組換えペプチドは、ワクチン戦略において使用される抗原性ペプチドを含む、ヒト及び動物の治療のために有用な治療ペプチドである。特定実施形態では、抗原性ペプチドは、インビボでグリコシル化される。
【００７５】
機能性ペプチドは、例えば：生物活性ペプチド（すなわち生物学的実体、例えば生物、細胞、培養物、組織、器官又は細胞小器官、における又はその生物学的機能又は活性の開始、増強、延長、減衰、終結又は防止を及ぼす、惹起する又はさもなければ生じさせるペプチド）；触媒ペプチド；ミクロ構造及びナノ構造活性ペプチド（すなわちその中で又はそれに関連して、作用、例えば運動、エネルギー変換、を実施する工作されたミクロ又はナノ構造の一部を形成するペプチド）；及び刺激剤ペプチド（例えばペプチド着香料、着色料、着臭剤、フェロモン、誘引物質、抑制物質及び忌避物質）を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
生物活性ペプチドは、例えば：免疫活性ペプチド（例えば抗原性ペプチド、アレルゲンペプチド、ペプチド免疫調節剤（immunoregulator）、ペプチド免疫調節剤（immunomodulator）：シグナル伝達ペプチド(signaling and signal transduction peptides)（例えばペプチドホルモン、サイトカイン及び神経伝達物質；受容体；アゴニスト及びアンタゴニストペプチド；ペプチドターゲティング及び分泌シグナルペプチド）；及び生物阻害性ペプチド（例えば毒性、生物致死性又は生物抑制性ペプチド、例えばペプチド毒素及び抗菌ペプチド）を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
構造ペプチドは、例えば：ペプチドアプタマー、折りたたみペプチド（例えばもう１つ別の分子の物理的立体配座の形成又は維持を促進する又は誘導するペプチド）；接着促進ペプチド（例えば接着ペプチド、細胞接着促進ペプチド）；界面ペプチド（例えばペプチド界面活性剤及び乳化剤）；ミクロ構造及びナノ構造構築ペプチド（すなわち工作されたミクロ又はナノ構造の一部を形成する構造ペプチド）；及びプレ活性化ペプチド（例えばプレ、プロ及びプレ−プロタンパク質及びペプチドのリーダーペプチド；インテイン）を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
触媒ペプチドは、例えばアポB ＲＮＡ編集シチジンデアミナーゼペプチド；グルタミニル−ｔＲＮＡシンテターゼの触媒ペプチド：アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼの触媒ペプチド；植物１型リボソーム不活性化ペプチド；ウイルス触媒ペプチド、例えば口蹄疫ウイルス［ＦＭＤＶ−２Ａ］触媒ペプチド；マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド；及び触媒メタロオリゴペプチドを含む。
【００７９】
ペプチドはまた、ペプチドエピトープ、ハプテン又は関連ペプチド（例えば抗原性ウイルスペプチド；ウイルス関連ペプチド、例えばＨＩＶ関連ペプチド、肝炎関連ペプチド；抗体イディオタイプドメイン；細胞表面ペプチド；抗原性ヒト、動物、原生生物、植物、真菌、細菌及び／又は古細菌ペプチド；アレルゲンペプチド及びアレルゲン脱感作ペプチド）であり得る。
【００８０】
ペプチドはまた、ペプチド免疫調節剤(peptide immunoregulators or immunomodulators)（例えばインターフェロン、インターロイキン、ペプチド免疫抑制剤及び免疫増強剤）；抗体ペプチド（例えば一本鎖抗体；一本鎖抗体フラグメント及び構築物、例えば一本鎖Ｆｖ分子；抗体軽鎖分子、抗体重鎖分子、ドメイン欠失抗体軽鎖又は重鎖分子；一本鎖抗体ドメイン及び分子、例えばＣＨ１、ＣＨ１−３、ＣＨ３、ＣＨ１−４、ＣＨ４、ＶＨＣＨ１、ＣＬ、ＣＤＲ１又はＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２ドメイン；パラトープペプチド；ミクロ抗体）；別の結合ペプチド（例えばペプチドアプタマー、細胞内及び細胞表面受容体タンパク質、受容体フラグメント；抗腫瘍壊死因子ペプチド）であり得る。
【００８１】
ペプチドはまた、酵素基質ペプチド又は酵素阻害剤ペプチド（例えばカスパーゼ基質及び阻害剤、プロテインキナーゼ基質及び阻害剤、蛍光共鳴エネルギー転移ペプチド酵素基質）であり得る。
【００８２】
ペプチドはまた、細胞表面受容体ペプチドリガンド、アゴニスト及びアンタゴニスト（例えばセルレイン、ダイノルフィン、オレキシン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、腫瘍壊死因子ペプチド；合成ペプチドリガンド、アゴニスト及びアンタゴニスト）；ペプチドホルモン（例えば内分泌、パラ分泌及び自己分泌ホルモン、例えばアミリン、アンギオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、心臓興奮性神経ペプチド、カゾモルフィン、コレシストキニン、コルチコトロピン及びコルチコトロピン関連ペプチド、分化因子、エンドルフィン、エンドセリン、エンケファリン、エリスロポエチン、エキセンディン、卵胞刺激ホルモン、ガラニン、ガストリン、グルカゴン及びグルカゴン様ペプチド、ゴナドトロピン、成長ホルモン及び成長因子、インスリン、カリジン、キニン、レプチン、脂肪親和性ホルモン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、ナトリウム排泄増加性ペプチド、ニューロキニン、ニューロメジン、ノシセプチン、オステオカルシン、オキシトシン（すなわちオシトシン）、副甲状腺ホルモン、プレイオトロフィン、プロラクチン、レラキシン、セクレチン、セロトニン、睡眠誘発ペプチド、ソマトメジン、サイモポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン、ウロテンシン、血管作用性小腸ペプチド、バソプレシン）；ペプチドサイトカイン、ケモカイン、ウイロカイン（virokine）及びウイロセプター（viroceptor）ホルモン放出及び放出抑制ペプチド（例えばコルチコトロピン放出ホルモン、コルチスタチン、卵胞刺激ホルモン放出因子、胃抑制性ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メラノトロピン放出ホルモン、メラノトロピン放出抑制因子；ノシスタチン、パンクリアスタチン、プロラクチン放出ペプチド、プロラクチン放出抑制因子；ソマトスタチン；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）；ペプチド神経伝達物質又はチャネルブロッカー（例えばボンベシン、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、サブスタンスＰ）；ペプチド毒素、毒素前駆体ペプチド又は毒素ペプチド部分であり得る。ある実施形態では、ペプチド毒素はＤ−アミノ酸を含まない。毒素前駆体ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含まないもの及び／又は翻訳後修飾によって、例えばアミノ酸にＤ−立体配置を導入することができるＤ立体配置誘導剤（例えばペプチドイソメラーゼ又はエピメラーゼ又はラセマーゼ又はトランスアミノアーゼ）の作用によって、及び／又は環状ペプチド構造を形成することができる環化剤（例えばペプチドチオエステラーゼ又はペプチドリガーゼ、例えばトランススプライシングタンパク質又はインテイン）の作用によって、天然毒素構造に変換されていないものであり得る。
【００８３】
毒素ペプチド部分は、ペプチド含有毒素の線状又は前環化オリゴ及びポリペプチド部分であり得る。ペプチド毒素の例は、例えばアガトキシン、アマトキシン、カリブドトキシン、クロロトキシン、コノトキシン、デンドロトキシン、インセクトトキシン、マルガトキシン、マスト細胞脱顆粒ペプチド、サポリン、サラフォトキシン；及び細菌体外毒素、例えば炭疽毒素、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素及び破傷風毒素を含む。
【００８４】
ペプチドはまた、代謝及び消化関連ペプチド（例えばコレシストキニン−パンクレオザイミンペプチド、ペプチドｙｙ、膵ペプチド、モチリン）；細胞接着調節又は仲介ペプチド、細胞外マトリックスペプチド（例えば付着因子、セレクチン、ラミニン）；神経保護又は髄鞘形成促進ペプチド；凝集阻害ペプチド（例えば細胞又は血小板凝集阻害剤ペプチド、アミロイド形成又は沈着阻害剤ペプチド）；連結ペプチド（例えば心臓血管連結神経ペプチド、ｉｇａ連結ペプチド）；又はその他のペプチド（例えばアグーチ関連ペプチド、アミロイドペプチド、骨関連ペプチド、細胞透過性ペプチド、コナントキシン、コントリファン、コンチュラキン、ミエリン塩基性タンパク質等）であり得る。
【００８５】
ペプチドはまた、インビボで翻訳後修飾され得る。特定実施形態では、ペプチドは、単独で又は組合せとして、グリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化又はγ−カルボキシル化され得る。
【００８６】
ある実施形態では、対象ペプチドは、選択されるウイルスカプシドに対して外因性である。ペプチドは、天然又は合成配列のいずれでもよい（及びそれらのコード配列は天然又は合成ヌクレオチド配列のいずれでもよい）。それ故、例えばアミノ酸の天然、修飾天然及び完全人工配列が包含される。これらのアミノ酸配列をコードする核酸分子の配列は、同様に、天然、修飾天然及び完全人工核酸配列であり得、例えばその核酸分子を得るために使用される（すなわち人為作用によって適用される）１又はそれ以上の合理的又はランダム突然変異及び／又は組換え及び／又は合成及び／又は選択工程の結果であり得る。
【００８７】
コード配列は、使用可能な場合は、標的ペプチドについての天然コード配列であり得るが、より典型的には、例えば宿主の種のコドン使用頻度を反映する遺伝子を合成することによって、選択発現宿主細胞における使用のために選択された、改善された又は最適化されたコード配列である。本発明の１つの実施形態では、宿主の種はニコチアナ・タバカムであり、シグナル配列及びペプチド配列の両方を設計するときにはニコチアナ・タバカムのコドン使用頻度を考慮する。本発明の代替的実施形態では、宿主の種はオリザ・サティバであり、シグナル配列及びペプチド配列の両方を設計するときにはオリザ・サティバのコドン使用頻度を考慮する。
【００８８】
（抗原性ペプチド（ペプチドエピトープ））
１つの実施形態では、抗原性ペプチドはウイルスカプシドによる発現を通して生産される。抗原性ペプチドは、感染因子、寄生生物、癌細胞及び他の病原因子を含む、ヒト又は動物病原因子の抗原性ペプチドであるものから選択することができる。そのような病原因子はまた、ビルレンス因子及び病原因子、例えばそれらの因子の体外毒素、内毒素等を含む。病原因子は何らかのレベルのビルレンスを示し得る、すなわちそれらは、例えば毒性、無毒性、偽毒性、半毒性等であり得る。１つの実施形態では、抗原性ペプチドは、病原因子からのエピトープアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、エピトープアミノ酸配列は、少なくとも１個のそのような因子の表面ペプチドの少なくとも一部であるものを含む。１つの実施形態では、カプシド−組換えペプチドウイルス様粒子は、ヒト又は動物適用におけるワクチンとして使用することができる。
【００８９】
２個以上の抗原性ペプチドを選択してもよく、その場合、生じるウイルス様粒子は多数の異なる抗原性ペプチドを提示し得る。多抗原性ペプチド様式の特定実施形態では、様々な抗原性ペプチドは全て同じ病原因子からの複数のエピトープから選択される。多抗原性ペプチド様式の特定実施形態では、様々な抗原性ペプチドは全て、密接に関連する病原因子、例えば同じ種又は同じ属の異なる種の異なる株、亜種、次亜種、病原型、血清型又は遺伝子型（genovar）から選択される。
【００９０】
１つの実施形態では、病原因子は以下の群の少なくとも１つに属する：病原性：バチルス属種、例えば炭疽菌；バルトネラ属種、例えばＢ．クインタナ；ブルセラ属種；ブルクホルデリア属種、例えばＢ．シュードマレイ（類鼻疽菌）；カンピロバクター種；クロストリジウム属種、例えば破傷風菌、ボツリヌス菌；コクシエラ属種、例えばＣ．バーネティー；エドワードシエラ属種、例えばＥ．ターダ；エンテロバクター属種、例えばＥ．クロアカ；エンテロコッカス属種、例えばＥ．フェカリス、Ｅ．フェシウム；エシェリキア属種、例えば大腸菌；フランシセラ属種、例えば野兎病菌（F. tularensis）；ヘモフィルス属種、例えばインフルエンザ菌；クレブシエラ属種、例えば肺炎杆菌；レジオネラ属種；リステリア属種、例えばリステリア菌（L. monocytogenes）；髄膜炎菌及び淋菌、例えばナイセリア属種；モラクセラ属種；ミコバクテリウム属種、例えばらい菌、ヒト型結核菌；肺炎球菌、例えば肺炎双球菌；シュードモナス属種、例えば緑膿菌；リケッチア属種、例えば発疹チフスリケッチア、斑点熱リケッチア、発疹熱リケッチア；サルモネラ属菌、例えば腸チフス菌；ブドウ球菌属種、例えば黄色ブドウ球菌；Ａ型連鎖球菌属及び溶血連鎖球菌属を含む、連鎖球菌属種、例えば肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌；ストレプトミセス属種；赤痢菌属種；ビブリオ属種、例えばコレラ菌；及びエルジニア属種、例えばペスト菌、エルジニア小腸結腸炎菌（E.enterocolitica）を含むが、これらに限定されない細菌及びマイコプラスマ因子。病原性：アルテルナリア属種；アスペルギルス属種；ブラストミセス属種、例えばＢ．デルマチチジス；カンジダ属種、例えばカンジダアルビカンス；クラドスポリウム属種；コクシジオイデス属種、例えばＣ．イミチス；クリプトコッカス属種、例えばＣ．ネオフォルマンス；ヒストプラスマ属種、例えばＨ．カプスラーツム；及びスポロトリクス属種、例えばＳ．シェンキイ、を含むが、これらに限定されない真菌及び酵母因子。
【００９１】
１つの実施形態では、病原因子は、病原性：アカントアメーバ属種、アメーバ属種、ネグレリア属種、エントアメーバ属種、例えば赤痢アメーバを含むアメーバ；クリプトスポリジウム属種、例えばＣ．パルブム；シクロスポラ属種；エンセファリトゾーン属種、例えばＥ．インテスティナリス；エンテロシトゾーン属種；ジアルジア属種、例えばランブル鞭毛虫；イソスポラ属種；ミクロスポリジウム属種；プラスモディウム属種、例えば熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫；トキソプラスマ属種、例えばトキソプラスマ原虫；及びトリパノソーマ属種、例えばトリパノソーマブルセイ、を含むが、これらに限定されない原生生物因子由来である。
【００９２】
１つの実施形態では、病原因子は、病原性：回虫属種、例えば回虫；ドラクンクルス属種、例えばメジナ虫；オンコセルカ属種、例えば回旋糸状虫；住血吸虫属種；旋毛虫属種、例えば旋毛虫；及び鞭虫属種、例えばヒト鞭虫、を含むが、これらに限定されない寄生生物因子（例えば蠕虫寄生生物）由来である。
【００９３】
もう１つの実施形態では、病原因子は、病原性：アデノウイルス；アレナウイルス、例えばラッサ熱ウイルス；アストロウイルス；ブンヤウイルス、例えばハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス；コロナウイルス、デルタウイルス；サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ウイルス；フィロウイルス、例えばエボラウイルス、マルブルクウイルス；フラビウイルス、例えばデング熱ウイルス、西ナイル熱ウイルス、黄熱病ウイルス；肝炎ウイルス；インフルエンザウイルス；レンチウイルス、Ｔ細胞リンパ球向性ウイルス、他の白血病ウイルス；ノーウォークウイルス；パピローマウイルス、他の腫瘍ウイルス；パラミクソウイルス、例えば麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、肺炎ウイルス、センダイウイルス；パルボウイルス；ピコルナウイルス、例えばカルジオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、他のエンテロウイルス；ポックスウイルス、例えば痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、パラポックスウイルス；レオウイルス、例えばコルティウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス；ラブドウイルス、例えばリッサウイルス、水泡性口内炎ウイルス；及びトガウイルス、例えば風疹ウイルス、シンドビスウイルス、西部脳炎ウイルス、を含むが、これらに限定されないウイルス因子由来である。
【００９４】
１つの実施形態では、抗原性ペプチドは、イヌパルボウイルスペプチド、炭疽菌防御抗原（ＰＡ）抗原性ペプチド及び東部ウマ脳炎ウイルス抗原性ペプチドから成る群より選択される。特定実施形態では、抗原性ペプチドは、ＰＡ１（配列番号１）、ＰＡ２（配列番号２）、ＰＡ３（配列番号３）又はＰＡ４（配列番号４）から選択されるアミノ酸配列を有する炭疽菌由来ペプチドである。
【００９５】
（宿主細胞毒性ペプチド）
もう１つの特定実施形態では、組換えペプチドは、遊離単量体形態であるとき宿主細胞に対して毒性であるペプチドである。ある実施形態では、ウイルスカプシドと共に発現される対象ペプチドは宿主細胞毒性ペプチドである。宿主細胞毒性ペプチドは、それが発現される宿主細胞に対して、又は宿主細胞がその成員である細胞培養中又は生物中の他の細胞に対して、又は宿主細胞を提供する生物又は種の細胞に対して、生物抑制性、生物致死性又は毒性である生物阻害性ペプチドを指示する。１つの実施形態では、宿主細胞毒性ペプチドは、それが発現される宿主細胞に対して生物抑制性、生物致死性又は毒性である生物阻害性ペプチドである。宿主細胞毒性ペプチドの一部の例は、ペプチド毒素、抗菌ペプチド及び他の抗生物質ペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
（抗菌ペプチド）
もう１つの特定実施形態では、組換えペプチドは、抗菌性ペプチドであるペプチドである。抗菌ペプチドは、例えば抗細菌ペプチド、例えばマガイニン、βデフェンシン、一部のαデフェンシン；カテリシジン；ヒスタチン；抗真菌ペプチド；抗原生動物ペプチド；合成ＡＭＰ；ペプチド抗生物質又はその線状又は前環化オリゴ又はポリペプチド部分；他の抗生物質ペプチド（例えば駆虫性ペプチド、溶血ペプチド、殺腫瘍性ペプチド）；及び抗ウイルスペプチド（例えば一部のαデフェンシン；殺ウイルス性ペプチド；ウイルス感染を阻害するペプチド）を含む。１つの特定実施形態では、抗菌ペプチドは、Ｄ２Ａ２１抗菌ペプチドから成る群より選択される。
【００９７】
（ＶＬＰを発現するときに使用するための細胞）
本発明のウイルスカプシド又はウイルスカプシド融合ペプチドの発現のための宿主として使用する細胞（「宿主細胞」とも称する）は、ウイルスカプシドが細胞の複製又は感染を許容しないものである。１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、宿主細胞が由来する細胞の特定種に感染しないウイルスに由来する。例えば、１つの実施形態では、ウイルスカプシドは二十面体植物ウイルスに由来し、ウイルスの天然栄養宿主ではない植物種の宿主細胞において発現される。もう１つの実施形態では、ウイルス種は哺乳動物に感染し、発現系は植物宿主細胞を含む。代替的実施形態では、ウイルスは、カプシド−組換えペプチド融合物を発現するための宿主細胞として使用される特定植物種の栄養ウイルスである。
【００９８】
植物宿主細胞は、維管束植物門、ユーフィロフィタ（Euphyllophyta）、種子植物門又は被子植物門からの植物細胞であり得る。特定実施形態では、植物細胞は、例えば：ヤシ科、例えばココヤシ属、アラブヤシ属；ヤマオイモ科、例えばヤムイモ属；イネ科（Gramineae（Poaceae））、例えばカラスムギ属、オオムギ属、イネ属、キビ属、コムギ属、トウモロコシ属；及びバショウ科、例えばバナナ、の成員を含むが、これらに限定されない単子葉植物である。
【００９９】
代替的実施形態では、植物細胞は、例えば：ヒユ科、例えばアマランサス属、ベタ属、アカザ属；セリ科(Umbelliferae)、例えばダウクス属、パスティナカ属；アブラナ科(Cruciferae)、例えばアラビドプシス属、アブラナ属；キク科、例えばヒマワリ属；ヒルガオ科、例えばイポメア属；ウリ科、例えばスイカ属、キュウリ属、カボチャ属；トウダイグサ科；マメ科(Fabaceae)、例えばダイズ属、ヒラマメ属、ウマゴヤシ属、インゲンマメ属、エンドウ属、シャジクソウ属、ソラマメ属、ササゲ属；アマ科、例えばアマ属；及びナス科、例えばトウガラシ属、トマト属、タバコ属、ナス属を含むが、これらに限定されない双子葉植物の成員である。
【０１００】
特定実施形態では、宿主細胞は、アラディポシス・タリアナ（Aradiposis thaliana）、日本産イチイ（タクスス・クスビダータ）、ニチニチソウ（カサランツス・ロセウス）、ニコチアナ・タバカム、オリザ・サティバ、リコペルシカム・エスキュレンタム、及びダイズ（グリシン・マックス）から成る群より選択される。
【０１０１】
（ＩＩ．核酸構築物）
本発明はさらに、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれることができ、カプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードする非感染性核酸構築物を提供する。融合ペプチドはプロモーター配列と終結配列に作動可能に連結され得る。１つの実施形態では、ａ）組換えペプチドをコードする核酸配列、及びｂ）ウイルスカプシドをコードする核酸配列、を含む植物宿主細胞を形質転換するときに使用するための核酸構築物が提供され、ａ）の核酸とｂ）の核酸は融合タンパク質を形成するように作動可能に連結されており、前記核酸構築物は植物宿主細胞のゲノムに安定に挿入され、植物細胞において発現される。
【０１０２】
ある実施形態では、ベクターは、多数のカプシド又は多数の対象ペプチドについての配列を含み得る。１つの実施形態では、ベクターは、少なくとも２個の異なるカプシド−ペプチドコード配列を含み得る。１つの実施形態では、コード配列は同じプロモーターに連結される。ある実施形態では、コード配列は、内部リボソーム結合部位によって分離される。他の実施形態では、コード配列は、細胞内でのウイルス様粒子の形成を可能にするリンカー配列によって連結される。もう１つの実施形態では、コード配列は異なるプロモーターに連結される。これらのプロモーターは、構成的であるか、又は同じか又は異なる誘導条件によって駆動され得る。もう１つの実施形態では、ゲノム内に挿入されることができ、異なるカプシド−ペプチドの組合せをコードする多数のベクターが提供される。多数のベクターは、構成的であるか又は同じ誘導条件によって駆動されるか又は異なる誘導条件によって駆動されるプロモーターを含み得る。１つの実施形態では、ウイルスカプシドは二十面体ウイルスカプシドに由来する。
【０１０３】
対象ペプチドについてのコード配列は、あらかじめ定められた部位でウイルスカプシド又はカプシドのコード配列に挿入することができる。前記ペプチドはまた、あらかじめ定められていない部位に挿入し、細胞をＶＬＰの生産に関してスクリーニングすることができる。１つの実施形態では、ＶＬＰの形成の間にループとして発現されるように、ペプチドをカプシドコード配列に挿入する。１つの実施形態では、１個のペプチドコード配列をベクター内に含めるが、また別の実施形態では、多数の配列を含める。多数の配列は、コンカテマーの形態、例えば切断可能なリンカー配列によって連結されたコンカテマーの形態であり得る。
【０１０４】
ペプチドは、カプシド内の２つ以上の挿入部位に挿入し得る。それ故、ペプチドは、カプシドの２個以上の表面ループモチーフに挿入し得る；ペプチドはまた、所与のループモチーフ内の多数の部位に挿入し得る。挿入物の個々の機能性及び／又は構造ペプチド、及び／又はペプチド挿入物全体は、切断部位、すなわちタンパク質を切断する又は加水分解する因子がカプシド構造又は集合物の残りの部分からペプチドを分離するように作用し得る部位によって分離され得る。
【０１０５】
ペプチドは、外側に面したループ及び／又は内側に面したループ、すなわちそれぞれカプシドの中心から遠ざかる方向又は中心に向かう方向に面したカプシドのループ内に挿入され得る。カプシドの表面ループ内のいかなるアミノ酸又はペプチド結合も、ペプチドのための挿入部位として役立ち得る。典型的には、挿入部位は、ループのほぼ中央、すなわち折りたたまれたカプシドペプチドの三次構造の中心からほぼ最も遠位の位置で選択される。ペプチドコード配列は、選択されたループのこのほぼ中央に対応するカプシドコード配列の位置に作動可能に挿入され得る。これは、ペプチド挿入部位から下流で合成されるカプシドのペプチド配列のその部分についての読み枠の維持を含む。
【０１０６】
もう１つの実施形態では、ペプチドをカプシドのアミノ末端に挿入することができる。ペプチドは、上述した切断可能リンカーを含む、１又はそれ以上のリンカー配列を通してカプシドに連結することができる。さらにもう１つの実施形態では、ペプチドをカプシドのカルボキシ末端に挿入することができる。ペプチドを、化学的又は酵素的加水分解によって切断され得る１又はそれ以上のリンカー配列を通してカルボキシ末端に連結することができる。１つの実施形態では、ペプチド配列は、アミノ末端とカルボキシ末端の両方で、又は１つの末端と少なくとも１つの内部位置で、例えばその三次元立体配座においてカプシドの表面に発現される位置で、連結される。
【０１０７】
１つの実施形態では、ペプチドは、カウピークロロティックモザイクウイルスからのカプシドに挿入することができる。１つの特定実施形態では、ペプチドは、ＣＣＭＶコートタンパク質のアミノ酸１２９で挿入できる。１つの実施形態では、ペプチド配列は、ＣＣＭＶコートタンパク質のアミノ酸６３、１０２、１１４、１２９又は１６０で挿入することができる。もう１つの実施形態では、ペプチド配列は、ＣＣＭＶコートタンパク質のアミノ酸６０、６１、６２又は６３で挿入することができる。さらにもう１つの実施形態では、ペプチドは、ＣＣＭＶタンパク質のアミノ酸１２９及びアミノ酸６０−６３の両方で挿入できる。
【０１０８】
特定実施形態では、本発明は、ａ）抗原性ペプチドをコードする核酸及びｂ）ウイルスカプシドをコードする核酸を含み、ａ）の核酸とｂ）の核酸が、細胞において発現されたとき融合タンパク質を形成するように作動可能に連結されている、核酸構築物を提供する。核酸構築物を構築する上で有用な他のカプシド及び組換えペプチドは上記に開示されている。
【０１０９】
（プロモーター）
１つの実施形態では、核酸構築物は、カプシド−組換えペプチド融合ペプチドをコードする核酸配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含む。作動可能な結合又は連結は、転写及び何らかの翻訳調節エレメントが、宿主細胞の作用により、調節エレメントが対象配列の発現を指令することができるように前記配列に共有結合している立体配置を指す。代替的実施形態では、カプシド融合タンパク質をコードする核酸構築物は、遺伝子捕獲戦略を利用して宿主細胞天然プロモーターとインフレームで挿入することができる。
【０１１０】
発酵工程では、ひとたび発酵が始まれば、発現系の効率を最大化するために高レベルの生産を得ることが理想的である。プロモーターは転写を開始させ、一般に転写開始部位の１−１００ヌクレオチド上流に位置する。理想的には、プロモーターは大量の組換えペプチド蓄積を可能にするのに十分なほど強力である。
【０１１１】
本発明に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーター又は調節を受けるプロモーターであり得る。当技術分野で使用される有用な調節を受けるプロモーターの一般的な例は、エタノール誘導性プロモーター；鉄欠乏誘導性プロモーター；創傷誘導性プロモーター；及びホルモン誘導性、例えばオーキシン誘導性プロモーターを含む。有用な構成的プロモーターの一般的な例は、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター及びキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターを含む。本発明において有用な他の種類のプロモーターは、組織特異的プロモーター、例えばトウモロコシスクロースシンテターゼ１(Yang el al., 1990)、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１(Vogel et al., 1989)、トウモロコシ光捕集複合体 (Simpson, 1986)、トウモロコシ熱ショックタンパク質 (Odell et al., 1985)、エンドウマメ小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983)、Ｔｉプラスミドマンノピンシンターゼ (Langridge et al., 1989)、Ｔｉプラスミドノパリンシンターゼ (Langridge et al., 1989)、ペチュニアカルコンイソメラーゼ (Van Tunen et al., 1988)、インゲンマメグリシンリッチタンパク質１(Keller et al., 1989)、ＣａＭＶ ３５ｓ転写産物 (Odell et al., 1985) 及びジャガイモパタチン(Wenzler et al., 1989)を含む。好ましいプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓ)プロモーター、イネα−アミラーゼＲＡｍｙ３Ｄプロモーター、及びＳ−Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモーターである。加えて、環境、ホルモン、化学物質及び／又は発生シグナルに応答して調節される多様な植物遺伝子プロモーターが、植物細胞における作動可能に連結された遺伝子の発現のために使用でき、（１）熱(Callis et al., Plant Physiol. 88:965, 1988)、（２）光（例えばエンドウマメｒｂｃＳ−３Ａプロモーター、Kuhlemeier et al., Plant Cell 1:471, 1989;トウモロコシｒｂｃＳプロモーター、 Schaffher and Sheen, Plant Cell 3:997, 1991;又はクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質プロモーター、Simpson et al., EMBO J. 4:2723, 1985)、（３）ホルモン、例えばアブシジン酸 (Marcotte et al., Plant Cell 1:969, 1989)、（４）創傷（例えばｗｕｎＩ、Siebertz et al., Plant Cell 1:961, 1989); 又は（５）化学物質、例えばジャスモン酸メチル、サリチル酸又は薬害軽減剤、によって調節されるプロモーターを含む。また、（６）器官特異的プロモーター（例えば Roshal et al., EMBO J. 6:1155, 1987; Schernthaner et al., EMBO J. 7:1249, 1988; Bustos et al., Plant Cell 1:839, 1989)を使用することも有益である。本発明において有用なさらなるプロモーターは、国際公開公報第ＷＯ９７／４８８１９号に述べられているもの;米国特許第 ５，５９１，６０５号に述べられているファゼオリンプロモーター; 米国特許第５，６４１，８７６号に述べられているイネアクチンプロモーター;国際公開公報第ＷＯ９８／５６９２１号に述べられているｐｅｒ５プロモーター;国際公開公報第ＷＯ００／１２６８１号に述べられているγ−ゼインプロモーター;及び米国特許第６，８２５，００６号、同第６，６６０,９１１号に述べられている他のプロモーター、及びShahmuradov et al. (2003) “PlantProm: a database of plant promoter sequences,” Nucleic Acid Res. 31(1): 114-117の中で述べられており、ｈｔｔｐ：／／ｍｅｎｄｅｌ．ｃｓ．ｒｈｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｍｅｎｄｅｌ．ｐｈｐ？ｔｏｐｉｃ＝ｐｌａｎｔｐｒｏｍにおいて入手可能な、植物プロモーター配列データベースＰｌａｎｔＰｒｏｍに述べられている植物プロモーターを含む。さらなるプロモーターはまた、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター又はその強化型、ハイブリッド（ｏｃｓ）3ｍａｓプロモーター、及びトウモロコシ又はＡ．タリアナからのユビキチンプロモーターを含み得る。
【０１１２】
選択植物宿主細胞にネイティブなプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーターも、標的ペプチドをコードする導入遺伝子の発現を制御するために使用できる。２個以上のプロモーターが、同じか又は異なる配列の、もう１つ別のプロモーターに共有結合している縦列（タンデム）プロモーターも使用し得る。
【０１１３】
ウイルスに由来するヌクレオチド配列を有するプロモーターも、標的ペプチドをコードする導入遺伝子の発現を指令するために使用できる。
【０１１４】
調節を受けるプロモーターは、プロモーターがその一部である遺伝子の転写を制御するためにプロモーター調節タンパク質を利用することができる。調節されるプロモーターをここで使用する場合は、対応するプロモーター調節タンパク質も、本発明に従った発現系の一部である。多くの調節されるプロモーター／プロモーター調節タンパク質の対が当技術分野において公知である。
【０１１５】
（他のエレメント）
他の調節エレメントを発現構築物に含めることができる。そのようなエレメントは、例えば転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、アクチベーター、翻訳開始及び終結シグナル、転写ターミネーター、シストロニック調節因子、ポリシストロニック調節因子、発現されるペプチドの特定、分離、精製又は単離を容易にするタグ配列、例えばヌクレオチド配列「タグ」及び「タグ」ペプチドコード配列、例えばＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、Ｂタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ポリアスパラギン酸、（Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）ｎ、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルコノトランスフェラーゼ、ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネートシチジルトランスフェラーゼ、ｔｒｐＥ又はｔｒｐＬＥ、アビジン、ストレプトアビジン、Ｔ７遺伝子１０、Ｔ４ｇｐ５５、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、ＧＳＴ、ＤＨＦＲ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ガラクトース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、ＧＦＰ、ＫＳＩ、ｃ−ｍｙｃ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ＮｕｓＡ、ユビキチン及びヘモシリンＡ、を含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
１つの実施形態では、核酸構築物は、対象組換えペプチドについてのコード配列に隣接する、又はウイルスカプシドについてのコード配列に連結された、タグ配列をさらに含む。１つの実施形態では、タグ配列はタンパク質の精製を可能にする。タグ配列は、アフィニティータグ、例えばヘキサヒスチジンアフィニティータグであり得る。もう１つの実施形態では、アフィニティータグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ分子であり得る。タグはまた、蛍光分子、例えばＹＦＰ又はＧＦＰ、又はそのような蛍光タンパク質の類似体であり得る。タグはまた、抗体分子の一部、又は精製のために有用な公知の結合パートナーについての公知の抗原又はリガンドであり得る。
【０１１７】
本発明は、カプシド−組換えペプチドコード配列に加えて、それに作動可能に連結された以下の調節エレメント：プロモーター、転写ターミネーター、翻訳開始及び終結シグナルを含み得る。
【０１１８】
翻訳及び転写エレメント、及び本発明において有用な他のエレメントのさらなる例は、JD Watson et al. (eds. ), Recombinant DNA, pp. 273-92 (1992) (Scientific American Books, W. H. Freeman and Co. , New York, NY, USA); and I Mitsuhara et al.,”Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants,”Plant Cell Physiol. 37(1) : 49-59 (1996)に述べられている。
【０１１９】
１つの特定実施形態では、核酸構築物は、ウイルスカプシドタンパク質を導くために使用されるウイルスゲノム核酸配列の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に由来する付加的な核酸配列を含む。１つの特定実施形態では、３’ＵＴＲは、野生型ウイルスにおける翻訳の調節又はカプシド形成において役割を果たす配列を含む。１つの実施形態では、３’ＵＴＲ配列は上流シュードノットドメイン（ＵＰＤ）である。例えばLeathers et al.(1993)”A phylogenetically conserved sequence within viral 3' untranslated RNA pseudolmots regulate stranslation,”Mol. Cell Biol. 13 (9): 5331-5347参照。特定実施形態では、３’ＵＴＲは、ウイルスゲノムのウイルスカプシドコード領域の３’ＵＴＲに由来する。より特定の実施形態では、３’ＵＴＲは、カウピークロロティックモザイクウイルスＲＮＡ３ ３’非翻訳領域に由来する。１つの実施形態では、３’ＵＴＲ配列はカプシド形成シグナルを含む。
【０１２０】
代替的実施形態では、核酸構築物は、ウイルス核酸配列に由来する少なくとも１個のカプシド形成シグナルを含む。カプシド形成シグナルは、ウイルスゲノム配列の５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ又は内部配列に由来し得る。１つの実施形態では、核酸構築物はＶＬＰにおいてカプシド形成される。
【０１２１】
１つの実施形態では、非感染性核酸構築物はまた、ウイルスカプシドタンパク質配列以外のウイルス又は非ウイルス核酸配列に由来する他の配列も含む。
【０１２２】
（ベクター）
宿主細胞ゲノムに安定に組込み、カプシド−組換えペプチド融合ペプチドを発現するとき植物細胞において使用するための有用な発現ベクターは、機能的プロモーターを有する作動可能な読み枠内に、適切な翻訳開始及び終結シグナルと共にカプシドペプチドに融合した所望標的ペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。ベクターはまた、宿主細胞の選択を可能にする１又はそれ以上の表現型選択マーカー又はスクリーニングマーカーを含み得る。あるいは、選択又はスクリーニングマーカーは別のプラスミド上で提供され得る。
【０１２３】
極めて多様なベクター及び／又は担体が、発現のために組換えカプシドをコードする核酸で標的植物宿主細胞を形質転換するために有用であることが当技術分野において公知であり、これらのいずれもが本発明に従った遺伝子を発現するために使用し得る。例えばIJ Goderis IJ et al.,”A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units,”Plant Mol. Biol. 50(1): 17-27 (2002); AH Christensen & PH Quail,”Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonousplants,”Transgenic Res. 5 (3): 213-18 (1996); JD Jones et al., “Effective vectors for transformation, expression of heterologous genes, and assaying transposon excision in transgenic plants,”Transgenic Res. 1 (6): 285-97 (1992); AP Gleave AP,”A versatile binary vector system with a T-DNA organisational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome,”Plant Mol. Biol. 20 (6): 1203-07 (1992)参照。
【０１２４】
それ故、プラスミド、トランスポゾン、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、植物人工染色体及び他の核酸ベクターが使用し得る。使用し得る一部のベクターの例は、ｐＲＴ１０１、ｐＲＴ１０１−ＭＣＳ、ｐＲＴ１０４、ｐＲＴ１０４．２４ＬＳ、ｐＲＴ１０４．Ｎ−ｍｙｃ、ｐＲＴ１０４．Ｃ−ｍｙｃ、ｐＲＴ１０４．Ｎ−３ＨＡ、ｐＲＴ１０４−Ｎ３ＨＡｄＡｓｐ、ｐＲＴ１０４．Ｎ−６ＨＡ、ｐＲＴ１０４−Ｎ６ＨＡｄＡｓｐ、ｐＲＴ１０４．Ｃ−３ＨＡ、ｐＲＴ１０４−ＧＳＴ、ｐＲＴ１０４ ＮＥＳ（Ａ２）、ｐＲＴ１０３−３ＨＡ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−Ｌｕｃｉ（−）、ｐＲＴｄ３５Ｓ−Ｌｕｃｉ−ＮＥＳ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−ＧＦＰ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−ＧＦＰ．ＳａｃＩ、ｐＲＴｄＳ ＧＦＰ．ＢｇｌＩＩ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−Ｄｓ−Ｒｅｄ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−プロフィリン、ｐＢＩＧａｌ４ＤＢＤ、ｐＲＴ−３ＨＡｘＨｓｆＡ２ＤＢＤ、ｐＲＴ−３ＨＡｘＧａｌ４ＤＢＤ、ｐＵＣ、ｐＩＬ−ＴＡＢ、ｐＥＴ、ｐＭＥ、ｐＢＢＲ及びｐＲＯＫＩＩを含む。ベクターを細胞に導入するためにパーティクルガンを使用するときは、いかなるＤＮＡプラスミド又はＤＮＡ分子も本発明において使用し得る。
【０１２５】
特定実施形態では、ベクターはｐＩＬ−Ｔａｂである。より特定の実施形態では、ベクターは、カウピークロロティックモザイクウイルス（ＣＣＭＶ）からのコートタンパク質をコードするｐＩＬ−Ｔａｂである。特定実施形態では、ベクターはｐＩＬ−Ｔａｂであり、異種ペプチドは、ＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４から成る群より選択される。さらなる実施形態では、ベクターは、ｐＤＯＷ２１６０（配列番号５）、ｐＤＯＷ２１６１（配列番号６）、ｐＤＯＷ２１６２（配列番号７）、ｐＤＯＷ２１６３（配列番号８）、ｐＤＯＷ２１６９（配列番号９）、ｐＤＯＷ２１７０（配列番号１０）、ｐＤＯＷ２１７１（配列番号１１）及びｐＤＯＷ２１７２（配列番号１２）から成る群より選択される。
【０１２６】
あるいは又はその上に、担体、例えばリポソーム、デンドリマー、カチオン性ポリマー及びカチオン性ポリマー−脂質複合体が使用でき、前記全てが細胞又はプロトプラストへの核酸の送達のために広く公表されている方法において使用されている。あるいは、裸のＤＮＡ又は裸のＲＮＡも植物宿主に送達され得る。
【０１２７】
ベクター、担体又は裸の核酸は、そのために有効であることが当技術分野で公知の何らかの方法によって植物細胞又はプロトプラストに直接形質転換され得る。例えば、組換えカプシドをコードする核酸で植物標的宿主を形質転換するために以下の方法のいずれかを使用し得る：アグロバクテリウム属；V. Vasil et al., Bio/Technology 9, 743 (1991)によって述べられているようなマイクロパーティクルガン法；例えばMC Chupeau et al., Bio/Technology 7,503 (1989)によってレタスに関して述べられているようなプロトプラストの電気穿孔法；例えば炭化ケイ素ウィスカー、ガラス又はカーボランダムを使用する表面研磨法；例えばA. Deshayes et al., EMBO J. 4, p.2731-2737 (1985)によって述べられているようなプロトプラストとのリポソーム融合；細胞−細胞（プロトプラスト−プロトプラスト）融合；及び内因性植物ウイルス感染、すなわち選択植物標的宿主がその天然宿主であるタイプのウイルスであり、ウイルスが組換えカプシド−タンパク質をコードする核酸を含むように工作されている（組換え体が作られるカプシド−タンパク質−核酸が、植物標的宿主がその天然宿主ではないウイルスから選択される）、工作されたベクターによる植物標的宿主の形質転換；例えば I.Potrykus et al., Mol. Gen. Genetics, 197, 183-188 によって述べられているようなポリエチレングリコールを介した形質転換；及び例えばR Griesbach, Biotechnology 3, p. 348-350およびCK Shewmaker Mol. Gen. Genetics, 202 p. 179-185 (1986)によって述べられているような微量注入法。
【０１２８】
（ＩＩＩ．植物細胞におけるカプシド融合産物の発現）
本発明はまた、組換えペプチドを生産するための方法を提供する。その方法は、
ａ）植物細胞を提供すること；
ｂ）組換えペプチドと二十面体カプシドの融合ペプチドをコードする発現カセットを含む非感染性核酸を提供すること；
ｃ）前記植物において前記核酸を発現し、前記細胞における発現が前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること；及び
ｄ）前記ウイルス様粒子を単離すること
を含む。
【０１２９】
融合ペプチドは、プロモーター配列及びターミネーターに作動可能に連結される。１つの実施形態では、前記方法は、ｅ）ウイルスカプシドタンパク質から組換えペプチドを切断すること、をさらに含む。さらにもう１つの実施形態では、前記方法は、ｆ）工程ｅから組換えペプチドを単離すること、をさらに含む。例えば図１参照。
【０１３０】
ペプチドは、カプシドペプチド内で１コピーペプチド挿入物として発現され得る（すなわちペプチドに関してモノシストロニックである組換えカプシドペプチドコード配列から個別挿入物として発現される）か、又は２、３又は多コピーペプチド挿入物として発現され得る（すなわちペプチドに関してポリシストロニックである組換えカプシドペプチドコード配列からコンカテマー挿入物として発現される；コンカテマー挿入物は、同じ外来性対象ペプチドの多数のコピーを含み得るか又は異なる外来性対象ペプチドのコピーを含み得る）。コンカテマーは、ホモ又はヘテロコンカテマーであり得る。
【０１３１】
１つの実施形態では、単離されたウイルス様粒子をワクチン戦略においてヒト又は動物に投与することができる。
【０１３２】
もう１つの実施形態では、核酸構築物を、野生型カプシドをコードするもう１つ別の核酸と共発現することができる。特定実施形態では、共発現されたカプシド／カプシド−組換えペプチド融合粒子は、キメラウイルス様粒子を形成するようにインビボで集合する。キメラＶＬＰは、少なくとも２個の異なる核酸構築物によってコードされるカプシド又はカプシド−ペプチド融合物を含むウイルス様粒子である。
【０１３３】
さらにもう１つの実施形態では、核酸構築物を、異なるカプシド−組換えペプチド融合粒子をコードするもう１つ別の核酸と共発現することができる。特定実施形態では、共発現されたカプシド融合粒子は、キメラウイルス様粒子を形成するようにインビボで集合する。
【０１３４】
さらにもう１つの実施形態では、異なるペプチド、例えばシャペロンタンパク質を発現するように設計された第二核酸を、融合ペプチドをコードする核酸と同時に発現することができる。
【０１３５】
本発明のために有用な植物細胞、カプシド及び組換えペプチドは上記に述べられている。
【０１３６】
１つの実施形態では、発現されるウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物は、細胞において可溶性形態で発現される。
【０１３７】
１つの実施形態では、発現されるウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物は、細胞内でＶＬＰに構築される。
【０１３８】
別の実施形態では、発現される対象ウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物の一部は、細胞において不溶性凝集物として形成される。１つの実施形態では、対象ペプチドを不溶性凝集物から復元することができる。
【０１３９】
（対象ペプチドの切断）
１つの実施形態では、前記方法は、ｅ）カプシドから組換えペプチドを分離するために前記融合産物を切断すること、をさらに提供する。
【０１４０】
切断可能な連結配列は、ウイルスタンパク質と組換えペプチドの間に含まれ得る。そのような配列を切断することができる物質の例は、化学試薬、例えば酸（塩酸、ギ酸）、ＣＮＢｒ、ヒドロキシルアミン（アスパラギン−グリシンに関して）、２−ニトロ−５−チオシアノベンゾエート、Ｏ−ヨードソベンゾエート、及び酵素物質、例えばエンドペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、トリプシン、クロストリパイン及びブドウ球菌プロテアーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
切断可能な連結配列は当技術分野において周知である。本発明では、Ａｓｐ−Ｐｒｏなどのジペプチド切断配列を含む、切断物質によって認識されるいかなる切断可能連結配列も使用できる。
【０１４２】
（発現）
本発明の方法は、最適には、所望配列及び立体配座での、宿主植物細胞における所望カプシド−融合産物の生産上昇を導く。生産上昇は、選択的に、生産されるタンパク質のグラム当り又は宿主タンパク質のグラム当り又は生産される総組換えペプチドのパーセンテージとしての、所望ペプチドのレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、組換え体のグラム当り又は宿主細胞タンパク質のグラム当りで生産される回収可能なペプチド、例えば可溶性タンパク質のレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、タンパク質の総レベル上昇と活性又は可溶性レベル上昇の何らかの組合せであり得る。
【０１４３】
組換えタンパク質の改善された発現は、カプシド融合タンパク質としてのタンパク質の発現を通してであり得、その後ＶＬＰに挿入することができる。ある実施形態では、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、又は少なくとも１８０コピーの対象ペプチドが各々のＶＬＰにおいて発現される。ＶＬＰを生産し、宿主細胞の細胞質、ペリプラズム又は細胞外液から回収することができる。
【０１４４】
もう１つの実施形態では、ペプチドは細胞において不溶性であり得る。ある実施形態では、可溶性又は不溶性ペプチドは、多数のカプシドから形成されるが天然型ＶＬＰを形成しない粒子において生産される。例えばわずか３個のウイルスカプシドのケージ構造が形成され得る。ある実施形態では、カプシド構造は２コピー以上の対象ペプチドを含み、ある実施形態では、少なくとも１０、少なくとも２０又は少なくとも３０コピーを含む。ある実施形態では、ペプチドは植物細胞の液胞において形成される。
【０１４５】
ペプチド又はウイルスカプシド配列はまた、１又はそれ以上のターゲティング配列又は精製を助けるための配列を含み得る。これらはアフィニティータグであり得る。これらはまた、カプシドのＶＬＰへの構築を指令するターゲティング配列であり得る。
【０１４６】
（細胞増殖）
ベクターによる植物宿主細胞の形質転換は、当技術分野で公知のいかなる形質転換法を用いて実施してもよく、植物宿主細胞を無傷細胞(intact cells)として又はプロトプラストとして形質転換し得る。例示的な形質転換法は上記に述べられている。
【０１４７】
ここで使用する、「発酵」という用語は、文字通りの発酵を用いる実施形態と、他の非発酵培養法を用いる実施形態の両方を包含する。発酵はいかなる規模で実施してもよい。当技術分野で一般的に知られるいかなる方法も発酵において使用し得る。例えばHellwig et al. (2004) “Plant cell cultures for the production of recombinant proteins, “Nature Biotech 22 (11): 1415-1422; Sajc et al. (2000) “Bioreactors for plant engineering : an outlook for further research, ”Biochem Engin. J. 4: 89-99参照。１つの実施形態では、発酵培地は、何らかの生育可能植物細胞培地から選択され得る。場合により、培地への添加物は、例えばＰＶＰ、ＢＳＡ、ＮａＣｌ、ブレフェルジンＡ、還元マンガン、プルロニック消泡剤、ポリエチレングリコール、ゼラチン、プロテアーゼ阻害剤、酸化還元補因子及びジメチルスルホキシドを含み得る。
【０１４８】
本発明に従った発現系は、いかなる発酵方式でも培養することができる。例えばバッチ、フェドバッチ、半連続、及び連続発酵方式がここで使用し得る。
【０１４９】
本発明に従った発現系は、いかなる規模（すなわち容量）の発酵においても導入遺伝子発現のために有用である。それ故、例えばマイクロリットル規模、センチリットル規模及びデシリットル規模の発酵容量を使用し得る；及び１リットル又はそれ以上の規模の発酵容量が使用できる。１つの実施形態では、発酵容量は１リットル又はそれ以上である。もう１つの実施形態では、発酵容量は、５リットル又はそれ以上、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１，０００リットル、２，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットル又は５０，０００リットルである。
【０１５０】
本発明では、形質転換宿主細胞の増殖、培養及び／又は発酵は、宿主細胞の生存を許容する温度範囲内、好ましくは約４℃から約５５℃（両端を含む）の範囲内の温度で実施される。
【０１５１】
（細胞密度）（充填湿細胞（Packed wet cell））
本発明に従った植物細胞発現系は、約２０ｇ／Ｌ（２％充填細胞量）から５５０ｇ／Ｌ（５５％充填細胞量）より多くまでの細胞密度又は匹敵する充填湿細胞密度を提供することができる。１つの実施形態では、充填細胞量は２％−約６０％である。もう１つの実施形態では、充填細胞量は、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、７０％又は８５％である。
【０１５２】
（ＶＬＰ又は対象ペプチドの単離）
ある実施形態では、本発明は、ウイルスカプシドとの連結及び共発現を通して発現の間ペプチドを保護することにより、対象ペプチドの回収率を改善するための方法を提供する。ある実施形態では、ウイルスカプシド融合は、細胞溶解産物から容易に分離することができるＶＬＰを形成する。
【０１５３】
本発明のタンパク質は、ＰＥＧ沈殿、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィーのような物質による選択的沈殿、免疫精製法等を含むが、これらに限定されない、当技術分野において周知の標準手法によって単離し、実質的純度に精製し得る。例えば確立された分子接着特性を有するタンパク質は、リガンドに可逆的に融合することができる。適切なリガンドを用いて、タンパク質を選択的に精製カラムに吸着させ、その後比較的純粋な形態でカラムから遊離することができる。次に、酵素又は他の作用によって融合タンパク質を取り出すことができる。加えて、免疫アフィニティーカラム又はＮｉ−ＮＴＡカラムを用いてタンパク質を精製することができる。一般的な手法は、例えばR. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: N. Y. (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990);米国特許第４，５１１，５０３号; S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al., Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18 (2): p/182-92 (2000);およびR. Mukhija, et al., Gene 165 (2): p. 303-6 (1995)において詳述されている。また、例えばAusubel, et al.(1987 and periodic supplements); Deutscher (1990) “Guide to Protein Purification, “Methods in Enzymology vol.182及びこのシリーズの他の巻; Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY ;及びタンパク質精製産物の使用に関する製造者の文献、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．又はＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．も参照のこと。組換え手法の併用は、適切なセグメント、例えばＦＬＡＧ配列又はプロテアーゼ−除去可能配列によって融合できる等価物、への融合を可能にする。また、例えばHochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) “Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent”in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenum Press, NY;およびCrowe, et al.(1992) QIAexpress : The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.も参照のこと。
【０１５４】
同様に、ウイルス様粒子又はケージ様構造も、当技術分野で周知の標準手法によって単離し、実質的純度に精製することができる。ＶＬＰの単離のための手法は、上述したものに加えて、沈殿法、例えばポリエチレングリコール又は塩沈殿法を含む。分離手法は、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、免疫精製法、遠心分離、超遠心分離、密度勾配遠心分離（例えばスクロース又は塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配で）、サイズ排除フィルターを通しての限外ろ過、及び当技術分野で公知の何らかの他のタンパク質単離法を含む。
【０１５５】
本発明はまた、活性組換えペプチドの回収率を改善することができる。活性タンパク質のレベルは、例えば特定されたペプチドと親ペプチド、ペプチド変異体、セグメント置換ペプチド及び／又は残基置換ペプチドの間の相互作用を従来の何らかのインビトロ又はインビボアッセイで測定することによって測定できる。そこで、インビトロアッセイは、特定されたタンパク質と対象ペプチドの間、例えば酵素と基質の間、ホルモンとホルモン受容体の間、抗体と抗原の間等の、何らかの検出可能な相互作用を測定するために使用できる。そのような検出は、比色変化、放射能の変化、溶解度の変化、ゲル電気泳動及び／又はゲル排除法によって測定したときの分子量の変化等の測定を含み得る。インビボアッセイは、生理的作用、例えば体重増加、電解質バランスの変化、血液凝固時間の変化、血餅溶解の変化及び抗原応答の誘導を検出するアッセイを含むが、これらに限定されない。一般に、特定されたペプチドと対象ペプチドの間の相互作用の変化を検出するための可変パラメータが存在する限り、いかなるインビボアッセイも使用することができる。例えば米国特許第５，８３４，２５０号参照。
【０１５６】
発現されたタンパク質の検出は、当技術分野で公知の方法によって達成され、例えば放射免疫測定法、ウエスタンブロット法又は免疫沈降法を含む。
【０１５７】
初期塩分画は、望ましくない宿主細胞タンパク質（又は細胞培養培地に由来するタンパク質）の多くを対象組換えタンパク質から分離することができる。１つのそのような例は硫酸アンモニウムであり得る。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水分量を有効に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。タンパク質はその後、それらの溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質がより疎水性であるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的なプロトコールは、生じる硫酸アンモニウム濃度が２０−３０％になるように飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することを含む。この濃度は最も疎水性のタンパク質を沈殿させる。次に沈殿物を廃棄し（対象タンパク質が疎水性でない限り）、対象タンパク質を沈殿させることが既知である濃度まで硫酸アンモニウムを上清に添加する。次に沈殿物を緩衝液に溶解し、必要に応じて、透析又はダイアフィルトレーションのいずれかを通して過剰の塩を除去する。タンパク質の溶解度に基づく他の方法、例えば低温エタノール沈殿は当業者に周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用できる。
【０１５８】
組換えタンパク質の分子量を利用して、異なる細孔径の膜（例えばアミコン又はミリポア膜）を通す限外ろ過を用いてより大きい及びより小さいサイズのタンパク質から単離することができる。第一段階として、タンパク質混合物を、対象タンパク質の分子量よりも低い分子量カットオフ値を有する細孔径の膜を通して限外ろ過することができる。限外ろ過の保持物質を、次に、対象タンパク質の分子量よりも大きい分子量カットオフ値を有する膜に対して限外ろ過することができる。組換えタンパク質は膜を通過してろ液中に入る。その後ろ液をクロマトグラフィーに供することができる。
【０１５９】
組換えタンパク質はまた、その大きさ、正味表面電荷、疎水性、及びリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することができる。加えて、タンパク質に対して惹起される抗体をカラムマトリックスに結合（固定化）し、タンパク質を免疫精製することができる。これらの方法は全て当技術分野において周知である。クロマトグラフィー手法が、いかなる規模でも及び多くの異なる製造者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの装置を使用して実施できることは当業者には明白である。
【０１６０】
（復元及びリフォールディング）
二次及び三次タンパク質構造立体配座を生成するために不溶性タンパク質を復元又はリフォールディングすることができる。タンパク質リフォールディング工程は、必要に応じて、組換え産物の立体配置を完成させるときに使用できる。リフォールディング及び復元は、タンパク質の解離／会合を促進する当技術分野で公知の物質を用いて実施することができる。例えばタンパク質をジチオトレイトールと共にインキュベートし、次に酸化グルタチオンニナトリウム塩と共にインキュベートして、さらにその後リフォールディング剤、例えば尿素を含む緩衝液と共にインキュベートすることができる。
【０１６１】
組換えタンパク質はまた、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することによっても復元できる。あるいは、タンパク質を、カラム、例えばＮｉ ＮＴＡカラムに固定化して、プロテアーゼ阻害因子を含有する、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール及び２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の６Ｍ−１Ｍ 尿素直線勾配を使用することによって再生できる。復元は１．５時間又はそれ以上の期間で実施できる。復元後、２５０ｍＭ イミダゾールの添加によってタンパク質を溶出することができる。イミダゾールは、ＰＢＳ又は５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終透析工程によって除去することができる。精製タンパク質は、室温、４℃で保存するか又は−２０℃から−８０℃で凍結して保存することができる。
【０１６２】
他の方法は、例えばMH Lee et al., Protein Expr. Purif., 25(1) : p. 166-73 (2002), W. K. Cho et al. , J. Biotechnology, 77 (2-3): p. 169-78 (2000), Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements), Deutscher (1990) “Guide to Protein Purification, “Methods in Enzymology vol. 182, and other volumes in this series, Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY, S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al. , Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996)に述べられているものを含む。
【０１６３】
（活性ペプチド分析）
活性タンパク質は、その配列が由来する天然ペプチドの活性の少なくとも２０%、３０％又は４０%、好ましくは少なくとも５０%、６０％又は７０%、最も好ましくは少なくとも８０%、９０％又は９５%の比活性を有し得る。さらに、基質特異性（Ｋcat／Ｋm）は、場合により天然ペプチドと実質的に同様である。典型的には、Ｋcat／Ｋmは、天然ペプチドの少なくとも３０%、４０％又は５０%、より好ましくは少なくとも６０%、７０％、８０％又は９０%である。タンパク質及びペプチドの活性及び基質特異性（Ｋcat／Ｋm）を検定する方法及び定量手段は当業者に周知である。
【０１６４】
本発明に従って生産される組換えペプチドの活性は、当技術分野で公知の何らかのタンパク質特異的な慣例的又は標準的インビトロ又はインビボアッセイによって測定することができる。組換えタンパク質が、同じ又は類似の生理的条件下で天然ペプチドにおいて一般に認められる活性と実質的に類似又は同等の活性を示すかどうかを判定するために、植物細胞宿主が生産する組換えペプチドの活性を、対応する天然タンパク質の活性と比較することができる。
【０１６５】
組換えペプチドの活性を、これまでに確立された天然ペプチド標準活性と比較することができる。あるいは、組換えペプチドの活性を、天然ペプチドと同時又は実質的に同時の比較アッセイにおいて測定することができる。例えばインビトロアッセイを使用して、組換えペプチドと標的の間、例えば発現される酵素と基質の間、発現されるホルモンとホルモン受容体の間、発現される抗体と抗原の間等の、検出可能な相互作用を測定することができる。そのような検出は、比色変化、増殖変化、細胞死、細胞反発、放射能の変化、溶解度の変化、ゲル電気泳動及び／又はゲル排除法によって測定したときの分子量の変化、リン酸化能、抗体特異性アッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイ等の測定を含み得る。加えて、インビボアッセイは、天然ペプチドの生理的作用、例えば抗原応答の誘導と比較して、植物宿主細胞が生産するペプチドの生理的作用を検出するアッセイを含むが、これらに限定されない。一般に、いかなるインビトロ又はインビボアッセイも、そのような活性が検定可能である限り、天然ペプチドとの比較分析を可能にする組換えペプチドの活性を測定するために使用できる。あるいは、本発明において生産されるペプチドは、ペプチドと、通常そのペプチドと相互作用する分子、例えば基質又は天然タンパク質が通常相互作用するシグナル経路の成分、との間の相互作用を刺激する又は阻害する能力に関して検定することができる。そのようなアッセイは、典型的には、ペプチドが標的分子と相互作用することを許容する条件下でタンパク質と基質分子を組み合わせる工程を含み、タンパク質と標的分子の相互作用の生化学的結果を検出することができる。
【０１６６】
ペプチド活性を測定するために使用できるアッセイは、例えばRalph, P. J., et al. (1984) J. Immunol. 132:1858 or Saiki et al. (1981) J. Immunol. 127: 1044, Steward, W. E.II (1980) The Interferon Systems. Springer-Verlag, Vienna and New York, Broxmeyer, H. E., et al. (1982) Blood 60: 595, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds. , 1989, and “Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques”, Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987, AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18 (2):p/182-92 (2000), Kodama et al., J. Biochem. 99: 1465-1472 (1986); Stewart et al., Proc.Nat'1 Acad. Sci. USA 90: 5209- 5213 (1993); (Lombillo et al., J. Cell Biol. 128: 107-115 (1995); (Vale et al., Cell 42: 39-50 (1985) に述べられている。
【実施例】
【０１６７】
コートタンパク質をコードする核酸のウイルスソース
以下の実施例では、カウピークロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）を所望組換えペプチドの発現のためのコートタンパク質のソースとして使用した。ＣＣＭＶは、ブロモウイルス科ブロモウイルス群の成員である。ブロモウイルスは、４成分のプラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する直径２５−２８ｎｍの二十面体ウイルスである。ＲＮＡ１及びＲＮＡ２はレプリカーゼ酵素をコードする。ＲＮＡ３は、植物宿主内のウイルス運動に関与するタンパク質をコードする。ＲＮＡ４（ＲＮＡ３に由来するサブゲノムＲＮＡ）、すなわちｓｇＲＮＡ４は、２０ｋＤａのコートタンパク質（ＣＰ）（配列番号１３）（表１）をコードする。各々のＣＣＭＶ粒子は、１８０コピーのＣＣＭＶ ＣＰを含む。ＣＣＭＶ ＣＰをコードする例示的ＤＮＡ配列を配列番号１４（表２）に示す。
【表１】
【表２】
【０１６８】
ＣＣＭＶの結晶構造を解明した。この構造は、粒子の溶解度と動力学にとって決定的に重要であると思われるコートタンパク質相互作用のより明瞭な像を提供し、挿入部位の合理的設計を導くのに有用であった。これまでの試験は、ＣＣＭＶコートタンパク質を、粒子を形成するそれらの能力を妨げることなく異種ペプチドを担持するように遺伝的に修飾できることを明らかにした。多くの適切な挿入部位が特定されている。合計約１８０コピーまでの異種ペプチド単位（個々のペプチド単位として又はコンカテマー単位内で）を、ＣＣＭＶ ＣＰ内の単一挿入部位でＣＣＭＶ粒子に挿入することができる。現在までにＣＣＭＶ ＣＰ内で特定された挿入部位は、様々な長さのペプチドを収容することができる。
【０１６９】
実験材料及び方法
異なる記載がない限り、分子生物学の分野において公知の標準手法、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントを、核酸操作、形質転換及び発現のために使用する。そのような標準手法、ベクター及びエレメントは、例えばAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) ; Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques(1987) (Academic Press); and Bukhari et al. (eds. ), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)に見出すことができる。
【０１７０】
異なる記載がない限り、ＰＣＲ反応は、以下のプロトコールに従ってＰＴＣ２２５サーモサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した：
【表３】
【０１７１】
（実施例１）ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２及びキメラＲＮＡ３を接種したカウピー全植物体におけるＣＣＭＶウイルス粒子内での抗原性ペプチドの生産
カウピークロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）を、４個の異なる抗原性ペプチドの１個を含むように工作したカプシドタンパク質（ＣＰ）と共に使用して、炭疽菌抗原性ペプチドの発現を全植物体において実施した。
【０１７２】
ＣＣＭＶ ＲＮＡ１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ及びＣＣＭＶ ＲＮＡ２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、Ｔ７プロモーターの下流でその制御下に、及びユニークＸｂａＩ部位の上流で、クローニングベクターｐＵＣ１９に各々別々にサブクローニングした。これはプラスミドｐＤＯＷ２１２２（ＣＣＭＶ ＲＮＡ１）及びｐＤＯＷ２１２３（ＣＣＭＶ ＲＮＡ２）を生産した。
【０１７３】
５つのＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を含むように工作した、ＣＣＭＶ ＲＮＡ３のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、組換えカプシドタンパク質をコードする核酸の生産のためにさらに工作した。各々が、４個の外来性ペプチド（炭疽菌防御抗原ＰＡからの４個の異なる抗原性ペプチド）の異なる１個をコードする４個のＤＮＡ分子を、各々合成オリゴヌクレオチドのＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）（splicing-by-overlap-extension）によって合成した。生じた核酸はＢａｍＨＩ認識部位末端を含んだ。各々のＰＡ ＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩ制限酵素で制限し、ＣＣＭＶコートタンパク質コード配列内の５つの異なる工作制限工切断部位の１つでコートタンパク質に独立して挿入した：コドン６３のＢａｍＨＩ、コドン１０２のＢａｍＨＩ、コドン１１４のＢａｍＨＩ、コドン１２９のＢａｍＨＩ、コドン１６０のＢａｍＨＩ。
【０１７４】
４個の異なるペプチドは、ＰＡ１（配列番号１５によってコードされる配列番号１）、ＰＡ２（配列番号１６によってコードされる配列番号２）、ＰＡ３（配列番号１７によってコードされる配列番号３）及びＰＡ４（配列番号１８によってコードされる配列番号４）であった。
【表４】
【０１７５】
これらの各々を、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化して、その後脱リン酸化しておいた５個のプラスミド：ｐＤＯＷ２１２５（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ６３ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２６（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−１０２ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２７（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１１４ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２８（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ）及びｐＤＯＷ２１２９（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１６０ＢａｍＨＩ）、の各々に挿入した。
【０１７６】
これは、「キメラＲＮＡ３」についての合計２０の異なる型のＤＮＡを生産した。プラスミドｐＤＯＷ２１３５（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ６３ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）、ｐＤＯＷ２１３９（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−１０２ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）、ｐＤＯＷ２１４３（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１１４ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）、ｐＤＯＷ２１４７（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）及びｐＤＯＷ２１５１（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１６０ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）は、６３、１０２、１１４、１２９及び１６０の位置にＰＡ１挿入物を有するキメラＲＮＡ３の例である。野生型ＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＲＮＡ３及びＢａｍＨＩ制限部位を含むが挿入物を含まない工作したＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＲＮＡを対照として使用した。各々の修飾ＲＮＡ３構築物を、Ｔ７プロモーターの下流でその制御下に、及びユニークＸｂａＩ部位の上流で、クローニングベクターｐＵＣ１９に別々にサブクローニングした。
【０１７７】
３つのクラスのプラスミドの各々を大腸菌にクローニングした。プラスミドを単離し、ＸＢａＩ制限酵素消化によって線状化して、次にＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｋｉｔ（ＲＮＡ転写キット、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡより）を用いて各々１μｇをインビトロでＲＮＡに転写した。これは２４個の異なるＲＮＡ種：ＲＮＡ１について１個、ＲＮＡ２について１個、キメラＲＮＡ３について２０個、及びＲＮＡ３対照について２個、を生産した。
【０１７８】
カウピー植物に感染させるためにＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３又はＰＡ挿入物を含むキメラＲＮＡ３のカクテル混合物を使用した。カウピー植物を、カウピーカリフォルニアブラックアイＮｏ．５種子(Ｆｅｒｒｙ−Ｍｏｒｓｅ Ｓｅｅｄ Ｃｏ．ＫＹ)から発芽させた。新芽を、Ｍｉｒａｃｌｅ−Ｇｒｏ鉢植え混合物（Ｍｉｒａｃｌｅ−Ｇｒｏ Ｌａｗｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＯＨ）と共に１つずつ６インチの鉢に移植した。２葉期（発芽後約７日目）にカウピー植物を感染させた。各々の植物の１枚の葉にカーボランダム（Carborundum）粉末４００粗粒（ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０９−２１−２）の散粉を実施した。カーボランダム層にＲＮＡカクテル混合物を適用した。手袋をはめた指で静かにこすって葉を削り取った。接種後７−１４日で感染が確認された。
【０１７９】
意外にも、この全植物体系では、天然宿主植物を使用したにもかかわらず、キメラコートタンパク質は野生型に復帰するか、又は一部の場合は、所望外来性抗原ペプチドが部分的に欠失した。これはウイルス子孫の配列決定によって確認された。ＲＮＡを抽出し、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１１４６−０２４）及びＣＣＭＶＲＮＡ４．Ｒ遺伝子特異的プライマー（配列番号１９） （５’−ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＣＧＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＧ−３’）を用いてＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを、プライマーＣＣＭＶＲＮＡ４．Ｆ（配列番号２０）（５’−ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＣＡ ＧＴＣ ＧＧＡ ＡＣＡ ＧＧ−３’）及びＣＣＭＶＲＮＡ４．Ｒを使用するＰＣＲによってさらに増幅した。反応物を精製し、ＣＣＭＶ−ＣＰ−Ｆ１プライマー（配列番号２１）（５’−ＡＡＣ ＣＣＡ ＴＣＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＡ−３’）で配列決定した。配列をシーケンサーソフトウエアバージョン４．０．５（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で分析した。例えばＰＡ１挿入物を含むｐＤＯＷ２１２８に由来するＲＮＡ３子孫を配列決定すると、 コートタンパク質は、ＰＡ１挿入物アミノ酸配列の代わりにＲＩＳＤＰＬとして翻訳された、小さな認識されないヌクレオチド挿入物（５’−ＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＣＴＣ−３’）を含んだ。挿入したヌクレオチド配列はコートタンパク質の残りの部分をインフレームで保持した。工作ＣＣＭＶ ＲＮＡ３は、全植物における発現時に不安定であり、容易に組換えを受け、全植物体系はキメラＣＣＭＶウイルス粒子上のエピトープの生産のために有用ではないと判定された。
【０１８０】
（実施例２）ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２及びキメラＲＮＡ３を接種したタバコ懸濁培養中のＣＣＭＶウイルス粒子における抗原性ペプチドの生産
同じＣＣＭＶ−ペプチドをコードする構築物の発現を植物細胞懸濁培養において実施した。ニコチアナ・タバカムＮＴ１細胞を、キメラＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＣＣＭＶ ＲＮＡ３及びレプリカーゼ遺伝子をコードするＣＣＭＶ ＲＮＡ１及び２のＲＮＡ転写産物での電気穿孔によってトランスフェクトした。野生型ＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＲＮＡ３及び適切なＢａｍＨＩ制限部位を含むが挿入物を含まない工作したＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＲＮＡ３を対照として使用した。
【０１８１】
２４個の異なるＲＮＡ種：ＲＮＡ１について１個、ＲＮＡ２について１個、キメラＲＮＡ３について２０個、及びＲＮＡ３対照について２個を、実施例１で述べたようなインビトロＲＮＡ転写によって得た。２２個の異なる群において、３個の生じたＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及びＲＮＡ３の１個）の各々２μｇを電気穿孔法によってタバコ細胞に形質転換した。
【０１８２】
以下のプロトコールを植物細胞トランスフェクションのために使用した：
１）培地の調製：
ＮＴＩ培地（１リットル）：
ムラシゲ＆スクーグ基礎塩４．３３ｇ（Ｐｈｙｔｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＫＳカタログ番号Ｍ５２４）ミオ−イノシトール１００ｍｇ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｉ−３０１１）、塩酸チアミンの１ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ−３９０２）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）１８０ｍｇ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−８４１６）、スクロース３０ｇ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ−５３９０）、及び１０ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ溶液２００μｌ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ−７２９９）を少量の水中で混合した。精製水を前記溶液に添加して容量を１リットルにした。ｐＨを５．８に調整し、溶液を加圧滅菌した。
【０１８３】
マンニトール洗浄液０．４Ｍ：
マンニトール３６．４３ｇ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ−１９０２）を少量の精製水に添加した。精製水を添加して容量を５００ｍｌにし、ｐＨを５．５に調整した。滅菌するために溶液をオートクレーブに入れた。
【０１８４】
酵素溶液：
０．４Ｍ マンニトール及び０．０２Ｍ ＭＥＳを少量の水中で混合した。精製水を添加して容量を５００ｍｌにし、ｐＨを５．５に調整した。滅菌するために溶液をオートクレーブに入れ、溶液を４℃で保存した。使用前に、１％セルライシン（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号２１９４６６）及び０．３％マセラーゼペクチナーゼ（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号４４１２０１）を溶液に添加し、セルライシンとマセラーゼペクチナーゼが溶解するまで溶液を振とうした。
【０１８５】
電気穿孔緩衝液：
０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣ１、０．０２％ＫＨ2ＰＯ4及び０．１１％Ｎａ2ＨＰＯ4を少量の精製水に添加した。精製水を添加して溶液を１００ｍｌにし、ｐＨを６．５に調整した。緩衝液を加圧滅菌し、４℃で保存した。
【０１８６】
２）タバコ細胞部分消化プロトコール：
タバコ細胞系ＮＴ１を電気穿孔の前に以下のように部分消化した。週に１回継代培養することによって強固な細胞系を維持し、細胞を、静かに振とうしながらＮＴ１培地において２４℃又は２８℃で増殖させ、消化の３日前に、細胞懸濁液５ｍｌをＮＴ１培地５０ｍｌに継代培養して２８℃でインキュベートした。細胞を５０ｍｌチューブにおいて８００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させた。酵素溶液を調製し、細胞をマンニトール洗浄液（約４０ｍｌ）で洗った。細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心し、３容の酵素溶液を細胞に添加した。倒置して細胞を再懸濁し、１０ｃｍペトリ皿に注ぎ入れて移し、皿をアルミニウム箔に包んで６０−１２０分間、室温で非常に緩やかに振とうした。次に細胞を５０ｍｌプラスチックチューブに戻し、８００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞をマンニトール洗浄液４０ｍｌで洗い、再び遠心して、電気穿孔緩衝液で洗浄し、遠心した。３容の電気穿孔緩衝液（総容量は通常２０ｍｌである）を細胞に添加した；細胞をアルミニウム箔に包んで４℃で保存した。
【０１８７】
部分消化した細胞の電気穿孔プロトコール：
消化した細胞１ｍｌをアリコートに分けて電気穿孔キュベットに入れた（４ｍｍ間隔）。各々のＲＮＡ転写産物２μｇ−ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２及びキメラＲＮＡ３−をキュベットに添加し、５分間氷上に置いた。ＮＴ１平板培養培地１０ｍｌ（ＮＴ１＋０．４Ｍ マンニトール）を各々のペトリ皿に添加した。細胞を５００μＦ、２５０Ｖで電気穿孔し、キュベットを氷上に戻した。次に細胞をペトリ皿に移し、暗所で振とうせずに室温でインキュベートした。トランスフェクション後４８時間目に分析のために細胞を収集した。
【０１８８】
結果
キメラコートタンパク質の発現を、抗ＣＣＭＶコートタンパク質ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によって分析した。また、各々の培養物からＲＮＡを抽出し、キメラＣＣＭＶ ＲＮＡ４をｃＤＮＡに逆転写して、それをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を実施例１で述べたように配列決定した。ＲＮＡ１及び２だけでトランスフェクトした陰性対照を除いて、全ての試料がウエスタンブロット法で陽性であった。
【０１８９】
対照ＣＣＭＶカプシドタンパク質と比較して、キメラコートタンパク質はより大きなサイズとゲル上でのより緩慢な運動性を有しており、キメラコートタンパク質がＰＡ挿入物を含むことを示した。これは、ウイルスＲＮＡ子孫の配列決定によって確認された。結果は、２０個のキメラ構築物のうち１９個が、所望抗原ペプチド内に突然変異を含むことなく正しくキメラＣＣＭＶコートタンパク質を発現したことを明らかにした。この結果は、懸濁細胞において発現されたキメラＣＣＭＶ ＲＮＡ３が安定であることを示す。
【０１９０】
図２は、ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及びｐＤＯＷ２１２５（ＣＣＭＶ６３ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２６（ＣＣＭＶ１０２ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２７（ＣＣＭＶ−１１４ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２８（ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ）及びｐＤＯＷ２１２９（ＣＣＭＶ１６０ＢａｍＨＩ）から転写されたＲＮＡ３でトランスフェクトした細胞におけるＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。結果は、ＣＰ内の異なる位置に工作ＢａｍＨＩ部位を有する全てのＲＮＡ３からＣＣＭＶ ＣＰが発現されることを明らかにする。
【０１９１】
６３、１０２、１１４、１２９及び１６０ＢａｍＨＩ部位でＣＣＭＶコートタンパク質に融合した全てのＰＡペプチド（ＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３及びＰＡ４）が、タバコ細胞において成功裏に生産された。図３及び図４は、ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及び６３、１０２、１１４、１２９及び１６０位に４個のＰＡペプチド挿入物を有するＣＰを含むキメラＲＮＡ３でトランスフェクトした細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。図３は、あらかじめ６３、１０２又は１１４位に挿入されたＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４ペプチドを有するＣＣＭＶ ＣＰの融合タンパク質が、６３位でＣＣＭＶ ＣＰに挿入されたＰＡ２ペプチドを除き、タバコ植物細胞において発現されることを明らかにする。図４は、１２９又は１６０位に挿入されたＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４ペプチドを有するＣＣＭＶ ＣＰの融合タンパク質がタバコ植物細胞において発現されることを示す。
【０１９２】
（実施例３）キメラＣＣＭＶ ＣＰをコードする植物発現プラスミドでトランスフェクトしたタバコ懸濁培養中のＣＣＭＶウイルス様粒子における４つの抗原性ペプチドの生産
【０１９３】
１）ベクターの構築：
プラスミドｐＩＬ−Ｔａｂ３５８を植物発現ベクターとして使用した。ＣＣＭＶ ＣＰ挿入のために選択した制限部位はＸｂａＩとＥｃｏＲＩであった。このプラスミドは、ＸｂａＩ部位の上流にキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター及びＥｃｏＲＩ部位の下流にＮｏｓターミネーターを含む。前記ベクターは、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化した後、挿入物と連結することによって作製した。
【０１９４】
２）挿入物の構築：
ＣＣＭＶ ＣＰ−ＰＡ融合物を、プライマーＣＣＭＶ−ＣＰ−ＸｂａＩ（配列番号２２）及びＣＣＭＶ−ＣＰ−ＥｃｏＲＩ（配列番号２３）を使用してｐＤＯＷ２１４７（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）、ｐＤＯＷ２１４８（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ２）、ｐＤＯＷ２１４９（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ３）、ｐＤＯＷ２１５０（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ４）からＰＣＲによって増幅し、ｐＤＯＷ２１６０（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）（配列番号５）、ｐＤＯＷ２１６１（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ２）（配列番号６）、ｐＤＯＷ２１６２（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ３）（配列番号７）及びｐＤＯＷ２１６３（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ４）（配列番号８）を作製した。ｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３についてのプラスミド地図を図５、６、７及び８に示す。
【０１９５】
３）植物細胞トランスフェクション：
植物細胞をプラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３ １０μｇでトランスフェクトした。植物細胞トランスフェクションは実施例２におけるように実施した。
【０１９６】
結果
１２９ＢａｍＨＩ部位の４つのＰＡペプチド−ＣＣＭＶ ＣＰ融合物全てがタバコ細胞において成功裏に発現された。図９は、ｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３でトランスフェクトした細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。対照（挿入物を含まないＣＣＭＶコートタンパク質）と比較して、４つのキメラコートタンパク質全てが、ＰＡ挿入物を有することを表すより緩慢な運動性を示した。
【０１９７】
（実施例４）キメラＣＣＭＶ ＣＰ及び３’ＵＴＲ（ＣＣＭＶ ＲＮＡ３ ３’非翻訳領域）をコードする植物発現プラスミドでトランスフェクトしたタバコ懸濁培養中のウイルス様粒子におけるＣＣＭＶ ＣＰ融合物としての４つの抗原性ペプチドの生産
１）ベクターの構築：
プラスミドｐＩＬ−Ｔａｂ３５８を植物発現ベクターとして使用した。ＣＣＭＶ ＣＰ挿入のために選択した制限部位はＸｂａＩとＥｃｏＲＩであった。このプラスミドは、ＸｂａＩ部位の上流にキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター及びＥｃｏＲＩ部位の下流にＮｏｓターミネーターを含む。前記ベクターは、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化した後、挿入物と連結することによって作製した。
【０１９８】
２）挿入物の構築：
ＲＮＡ３の３’ＵＴＲを含むＣＣＭＶ ＣＰ−ＰＡ融合物を、プライマーＣＣＭＶ−ＣＰ−ＸｂａＩ及びＣＣＭＶ−ＣＰ−ＥｃｏＲＩ−３’ＵＴＲ（配列番号２４）を使用してｐＤＯＷ２１４７、ｐＤＯＷ２１４８、ｐＤＯＷ２１４９及びｐＤＯＷ２１５０からＰＣＲによって増幅し、ｐＤＯＷ２１６９（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ１−３’ＵＴＲ）（配列番号９）、ｐＤＯＷ２１７０（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ２−３’ＵＴＲ）（配列番号１０）ｐＤＯＷ２１７１（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ３−３’ＵＴＲ）（配列番号１１）及びｐＤＯＷ２１７２（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ４−３’ＵＴＲ）（配列番号１２）を作製した。
【０１９９】
３）植物細胞トランスフェクション：
植物細胞をプラスミドｐＤＯＷ２１６９、ｐＤＯＷ２１７０、ｐＤＯＷ２１７１及びｐＤＯＷ２１７２ １０μｇでトランスフェクトした。植物細胞トランスフェクションは実施例２におけるように実施した。
【０２００】
結果
３’ＵＴＲを含む１２９ＢａｍＨＩ部位の４つのＰＡペプチド−ＣＣＭＶ ＣＰ融合物全てがタバコ細胞において成功裏に発現された。図１０は、ｐＤＯＷ２１６９、ｐＤＯＷ２１７０、ｐＤＯＷ２１７１及びｐＤＯＷ２１７２でトランスフェクトした細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。対照（挿入物を含まないＣＣＭＶコートタンパク質）と比較して、４つのキメラコートタンパク質全てが、ＰＡ挿入物を有することを表すより緩慢な運動性を示した。
【０２０１】
（実施例５）キメラＣＣＭＶ ＣＰをコードする植物発現プラスミドでトランスフェクトしたトランスジェニックタバコ懸濁培養中のウイルス様粒子におけるＣＣＭＶ ＣＰ融合物としての４つの抗原性ペプチドの生産
タバコ細胞系ＮＴ１を、週に１回継代培養することによって維持した。細胞を、静かに振とうしながらＮＴ１培地において２４℃又は２８℃で増殖させた。トランスフェクションの３日前に、細胞懸濁液５ｍｌをＮＴ１培地５０ｍｌに継代培養して２８℃でインキュベートした。
【０２０２】
１）パーティクルガンによる植物細胞形質転換：
プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２、ｐＤＯＷ２１６３及びキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターによって駆動される植物選択マーカーＰａｔを含む植物発現プラスミドｐＢＢＶ（ｐＢＢＶ）を、マイクロパーティクルガン法によるＮＴ１タバコ細胞形質転換のために使用した。使用したプラスミド比は、１：６ ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６０、ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６１、ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６２又はｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６３であった。合計５μｇのプラスミドＤＮＡは、６回のパーティクルガン法のために十分であった。Chen, L et al. Plant Cell Reports (1998) 18: 25-31 に述べられているＢｉｏｒａｄパーティクルガンプロトコールを形質転換のために使用した。
【０２０３】
２）プレーティング
パーティクルガンを打ち込んだ細胞を、非選択的ＮＴ１培地寒天プレートに４時間移した後、２５μｇ／ｍｌのグルフォシネート−アンモニウム（Ｓｉｇｍａカタログ番号４５５２０）を含むＮＴ１培地寒天プレートに移した。
【０２０４】
３）トランスジェニックカルスの選択
２１日後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、ＣＰ融合物の発現を調べるためのウエスタンブロット法及びプロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットの植物ゲノムへの組込みを調べるためのＰＣＲによる分析のために選択した。キメラＣＣＭＶ ＣＰを発現するトランスジェニックカルスをＮＴ１液体培地に移した。細胞を、静かに振とうしながらＮＴ１培地において２４℃又は２８℃で増殖させ、週に１回継代培養した。
【０２０５】
結果
図１１は、ｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で安定に形質転換された細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。ＣＣＭＶに対するポリクローナル抗体によってＣＰ融合物を検出した。４つのキメラコートタンパク質導入遺伝子全ての発現が検出された。
【０２０６】
（実施例６）キメラＣＣＭＶ ＣＰをコードする植物発現プラスミドでトランスフェクトしたトランスジェニックイネ懸濁培養中のＣＣＭＶウイルス様粒子におけるＣＣＭＶ ＣＰ融合物としての４つの抗原性ペプチドの生産
イネ細胞系を、週に１回継代培養することによって維持した。細胞を、静かに振とうしながらＮＢ培地(Li, L et al. Plant Cell Reports. (1993) 12: 250-255)において２８℃で増殖させた。トランスフェクションの３日前に、細胞懸濁液５ｍｌをＮＢ培地５０ｍｌに継代培養して２８℃でインキュベートした。
【０２０７】
１）パーティクルガンによる植物細胞形質転換：
プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３、及びキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターによって駆動される植物選択マーカーＰａｔを含む植物発現プラスミドｐＢＢＶを、マイクロパーティクルガン法によるイネ細胞形質転換のために使用した。使用したプラスミド比は、１：６ ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６０、ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６１、ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６２又はｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６３であった。合計５μｇのプラスミドＤＮＡは、６回のパーティクルガン法のために十分であった。Chen, L et al. Plant Cell Reports (1998) 18: 25-31 に述べられているＢｉｏｒａｄパーティクルガンプロトコールを形質転換のために使用した。
【０２０８】
２）プレーティング
パーティクルガンを打ち込んだ細胞を、選択のために２５μｇ／ｍｌのグルフォシネート−アンモニウム（Ｓｉｇｍａカタログ番号４５５２０）を含むＮＢ培地寒天プレートに移した。
【０２０９】
３）トランスジェニックカルスの選択
２１日後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、ＣＰ融合物の発現を調べるためのウエスタンブロット法及びプロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットの植物ゲノムへの組込みを調べるためのＰＣＲによる分析のために選択した。
【０２１０】
結果
図１２は、ＣＣＭＶに対するポリクローナル抗体によって検出したときの、ｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で安定に形質転換された細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。４つのキメラコートタンパク質導入遺伝子全ての発現が検出された。
【０２１１】
ゲノムＤＮＡを抽出し、プロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットの植物ゲノムへの組込みをＰＣＲによって調べるために以下のプロトコールを使用した。ゲノムＤＮＡを抽出するためにＱｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉを製造者の指示に従って使用した。
【０２１２】
新鮮イネカルス約５０−１００ｍｇを１．５ｍｌチューブに入れた。即時ＤＮＡ抽出のために組織を液体窒素中で凍結するか又は保存のために−８０℃の冷凍庫に入れた。ＤＮＡ抽出の前に、組織をミクロ乳鉢（micropestle）で摩砕することによって手動で破壊した。試料を氷上に置き、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔに述べられているようにゲノムＤＮＡを抽出した。Ａｃｃｅｓｓ Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ａ１７２０）を使用してＰＣＲ反応を以下のように設定した：
Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ２５μｌ
ＣＣＭＶ−Ｆ（１０ｍＭ）プライマー、配列番号２５ １μｌ
Ｎｏｓ−ｔｅｒｍ−Ｒ（１０ｍＭ）プライマー、配列番号２６ １μｌ
ゲノムＤＮＡ １μｌ
水 ２２μｌ
合計 ５５μｌ
【０２１３】
ゲノムＤＮＡからプロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットを増幅するために以下のＰＣＲサイクルを使用した：
１サイクル ９５℃ ２分間
３５サイクル ９５℃ ３０秒間
５５℃ ３０秒間
７０℃ ２分間
１サイクル ７０℃ ５分間
４℃ 維持
【０２１４】
ＰＣＲ反応物１０μｌを、ＥｔＢｒで染色した１．２％アガロースゲル上で泳動させた。図１３は、選択した個別イネカルスから増幅したＰＣＲ産物を示す。予測された大きさのＰＣＲ産物を含む試料を、安定形質転換及びキメラＣＰ導入遺伝子の植物ゲノムへの組込みに関して陽性と評価した。
【０２１５】
キメラＣＣＭＶ ＣＰを発現するトランスジェニックカルスを、スケールアップ発酵に適した細胞懸濁培養を作製するために液体ＮＢ培地に移した。細胞を、静かに振とうしながらＮＢ培地において２８℃で増殖させ、週に１回継代培養した。
【０２１６】
ＶＬＰ抽出：
以下のプロトコールに従って、振とうフラスコ培養試料を溶解し、生じた細胞溶解産物をＰＥＧ（ポリエチレングリコール）処理して、限外ろ過することにより、キメラＶＬＰを沈殿させた：
【０２１７】
各々の振とうフラスコ培養物の５０ｍＬアリコートを遠心分離して細胞をペレット化した。ペレット化した細胞をウイルス緩衝液（０．２Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２；１０ｍＭ ＥＤＴＡ．０）中に緩衝液２容：ペレット１容の比率で再懸濁した。次に６０秒間ずつ何度も混合し、混合と混合の間に２分間氷上で休ませることによって細胞を破壊した。生じたホモジネートを３層のチーズクロス(cheese cloth)を通してしぼり、その後４℃、１５，０００×Ｇで１５分間遠心分離した。生じた上清を採取し、それらの容量を測定した。各々の上清に、１０％の最終濃度までＰＥＧ８０００を添加し、その溶液を氷上で１時間又は４℃で一晩インキュベートした。次に、溶液を４℃、１５，０００×Ｇで１０分間遠心分離した。沈殿したペレットをウイルス緩衝液の１／１０初期上清容量に再懸濁し、４℃で保存して、ポリクローナル抗ＣＣＭＶ抗体でのウエスタンブロット法によって分析した。
【０２１８】
図１４は、キメラＣＣＭＶ ＶＬＰが、ｐＤＯＷ２１６０で安定に形質転換した細胞から回収されたことを示す。キメラＣＰ−ＰＡ１融合タンパク質は、再懸濁したＰＥＣペレット中で検出されたが、上清では検出されず、キメラＣＰがＶＬＰに集合されたことを指示した。
【０２１９】
あるいは、再懸濁した試料を４℃、１５，０００×Ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収して、２回目のＰＥＣ沈殿に供した。ＰＥＧ８０００を１５％の最終濃度まで添加し、４℃で２時間攪拌した。その溶液を１５，０００×Ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを少量のウイルス緩衝液に再懸濁した。再懸濁したＶＬＰ溶液を、カットオフ値が３００Ｋ分子量のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０に負荷し、４，０００×Ｇで５分間遠心した。濃縮したＶＬＰ試料をポリクローナル抗ＣＣＭＶ抗体でのウエスタンブロット法によって分析した（図１４参照）。キメラＣＰ−ＰＡ１融合タンパク質は、再懸濁してサイズろ過した２回目のＰＥＣペレット中で検出されたが、上清では検出されず、キメラＣＰがＶＬＰに構築されたことを示した。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】図１は、植物細胞内のウイルス様粒子（ＶＬＰ）におけるペプチド単量体の生産についての概要図を示す。所望標的ペプチド（「Ｉ」）をコードする配列を、ウイルスコートタンパク質（「ＣＰ」）をコードする配列に挿入して、組換えウイルスコートタンパク質（「ｒＣＰ」）をコードする遺伝子を構築し、それを、ベクターの一部として、植物細胞に形質転換し、組換えコートタンパク質（「ｒＣＰ」）を形成するように発現させる。任意の切断部位（「*」）も示す。植物細胞を、ｒＣＰ遺伝子についての植物発現プラスミドでトランスフェクト又は形質転換する。ｒＣＰは植物細胞においてＶＬＰに集合することができる。ペプチド挿入物はＶＬＰ表面に提示される。キメラＶＬＰを植物細胞から精製することができ、場合により、所望標的ペプチドを精製ＶＬＰから切断分離して、精製することができる。
【図２】図２は、感染性ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及びｐＤＯＷ２１２４（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ）、ｐＤＯＷ２１２５（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ６３ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２６（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１０２ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２７（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１１４ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２８（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ）及びｐＤＯＷ２１２９（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１６０ＢａｍＨＩ）から転写されたＲＮＡ３の１個でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１は緩衝液のみを示し、レーン２はＲＮＡ１及びＲＮＡ２のみを示し、レーン３は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２４から転写される野生型ＲＮＡ３を示し、レーン４は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２５から転写されるＲＮＡ３を示し、レーン５は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２６から転写されるＲＮＡ３を示し、レーン６は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２７から転写されるＲＮＡ３を示し、レーン７は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２８から転写されるＲＮＡ３を示し、レーン８は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２９から転写されるＲＮＡ３を示す。
【図３】図３は、感染性ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及び６３、１０２又は１１４位に抗原性ペプチドＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４とのＣＣＭＶ ＣＰ融合物を含む工作されたＲＮＡ３の１個でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１はサイズマーカーを示し、レーン２は緩衝液のみを示し、レーン３は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の６３位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン４は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の６３位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン５は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の６３位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン６は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の６３位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン７は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１０２位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン８は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１０２位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン９は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１０２位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１０は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１０２位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１１は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１１４位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１２は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１１４位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１３は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１１４位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、及びレーン１４は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１１４位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示す。
【図４】図４は、感染性ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及び１２９又は１６０位に抗原性ペプチドＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４とのＣＣＭＶ ＣＰ融合物を含む工作されたＲＮＡ３の１個でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１はサイズマーカーを示し、レーン２は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１２９位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン３は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１２９位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン４は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１２９位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン５は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１２９位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン６は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１６０位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン７は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１６０位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン８は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１６０位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン９は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１６０位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１０は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋野生型ＲＮＡ３を示し、及びレーン１１は緩衝液のみを示す。
【図５】図５は、ｐＤＯＷ２１６０のプラスミド地図を示す。
【図６】図６は、ｐＤＯＷ２１６１のプラスミド地図を示す。
【図７】図７は、ｐＤＯＷ２１６２のプラスミド地図を示す。
【図８】図８は、ｐＤＯＷ２１６３のプラスミド地図を示す。
【図９】図９は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１は緩衝液のみを示し、レーン２−６は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋野生型ＲＮＡ３（対照）を示し、レーン７はｐＤＯＷ２１６０を示し、レーン８はｐＤＯＷ２１６１を示し、レーン９はｐＤＯＷ２１６２を示し、及びレーン１０はｐＤＯＷ２１６３を示す。
【図１０】図１０は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６９、ｐＤＯＷ２１７０、ｐＤＯＷ２１７１及びｐＤＯＷ２１７２でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１はＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＲＮＡ３（対照）を示し、レーン２は緩衝液を示し、レーン３はｐＤＯＷ２１６９を示し、レーン４はｐＤＯＷ２１７０を示し、レーン５はｐＤＯＷ２１７１を示し、及びレーン６はｐＤＯＷ２１７２を示す。
【図１１】図１１は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で安定に形質転換したタバコＮＴ１細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。２１日間の選択後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、ＣＰ発現を調べるためのウエスタンブロット法による分析のために選択した。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１は、非形質転換タバコ細胞（陰性対照）を示し、レーン２は、ｐＤＯＷ２１６０で形質転換したトランスジェニックタバコ細胞を示し、レーン３は、ｐＤＯＷ２１６１で形質転換したトランスジェニックタバコ細胞を示し、レーン４は、ｐＤＯＷ２１６２で形質転換したトランスジェニックタバコ細胞を示し、及びレーン５は、ｐＤＯＷ２１６３で形質転換したトランスジェニックタバコ細胞を示す。
【図１２】図１２は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で安定に形質転換したイネ細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。２１日間の選択後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、ＣＰ発現を調べるためのウエスタンブロット法による分析のために選択した。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１は野生型ＣＣＭＶ ＣＰ（陽性対照）を示し、レーン２はサイズラダーを示し、レーン３は非トランスジェニックイネ細胞（陰性対照）を示し、レーン４は、ｐＤＯＷ２１６０で形質転換したトランスジェニックイネ細胞を示し、レーン５は野生型ＣＣＭＶ ＣＰ（陽性対照）を示し、レーン６はサイズラダーを示し、レーン７は非トランスジェニックイネ細胞を示し、レーン８は、ｐＤＯＷ２１６１で形質転換したトランスジェニックイネ細胞を示し、レーン９は野生型ＣＣＭＶ ＣＰ（陽性対照）を示し、レーン１０はサイズラダーを示し、レーン１１は非トランスジェニックイネ細胞（陰性対照）を示し、レーン１２は、ｐＤＯＷ２１６２で形質転換したトランスジェニックイネ細胞を示し、レーン１３は野生型ＣＣＭＶ ＣＰ（陽性対照）を示し、レーン１４はサイズラダーを示し、レーン１５は非トランスジェニックイネ細胞（陰性対照）を示し、及びレーン１６は、ｐＤＯＷ２１６３で形質転換したトランスジェニックイネ細胞を示す。
【図１３】図１３は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で形質転換した選択個別イネカルスから増幅したＰＣＲ産物の検出を示す。選択個別イネカルスから増幅されたＰＣＲ産物を示す、ＥｔＢｒで染色した１．２％アガロースゲル。２１日間の選択後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、植物ゲノムへのプロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットの組込みを調べるためのＰＣＲによる分析のために選択した。レーン１はイネカルス４６−５を示し、レーン２はイネカルス４６−１１を示し、レーン３はイネカルス４６−１７を示し、レーン４はサイズラダーを示し、レーン５はイネカルス４７−６を示し、レーン６はイネカルス４８−１２を示し、レーン７はイネカルス４８−１８を示し、レーン８はイネカルス４８−２０を示し、レーン９はイネカルス４９−１１を示し、レーン１０はイネカルス４９−１８を示し、及びレーン１１は陰性対照（非トランスジェニックイネ細胞）を示す。
【図１４】図１４は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０で安定に形質転換したイネ細胞からＰＥＧ沈殿及び限外ろ過によって精製したキメラＣＣＭＶ ＶＬＰのウエスタンブロット分析及び精製ＶＬＰ試料におけるキメラＣＰ−ＰＡ１融合タンパク質の検出を示す。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１はサイズラダーを示し、レーン２は、ＣＣＭＶ−ＣＰ１融合に関してトランスジェニックのイネ懸濁細胞からの全細胞溶解産物を示し、レーン３は第一ＰＥＧ上清を示し、レーン４は第一ＰＥＧペレットを示し、レーン５は第二ＰＥＧペレットを示し、レーン６は第二ＰＥＧ上清を示す。
【図１５】図１５は、発酵による植物懸濁細胞でのキメラＶＬＰの生産工程の一覧図を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、「植物細胞における高効率ペプチド生産」と題する、２００４年２月２７日出願の米国特許仮出願第６０／５４８，７４４号の優先権を主張する。
【０００２】
（政府権益の言明）
本出願は、国立衛生研究所、国立アレルギー及び感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、共同契約第１−Ｕ０１−ＡＩ０５４６４１−０１号との米国政府契約下にある。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、組換えペプチドの生産のための改善された方法を提供する。特に、本発明は、植物細胞懸濁培養においてインビボで集合され得るウイルスカプシド融合タンパク質の形態の組換えペプチドの生産のための改善された方法を提供する。本発明はまた、非感染性ウイルスカプシド融合ペプチド生産を可能にするプラスミド、配列及び植物細胞を含む。
【背景技術】
【０００４】
細菌、酵母、植物、昆虫及び哺乳動物細胞発現系が、組換えペプチドを生産するために現在使用されており、成功の程度は様々である。異種ペプチドの生産のための発現系を創造する上での１つのゴールは、商業、治療及びワクチン適用において利用できる、広範囲で、柔軟性があり、効率的、経済的及び実用的なプラットフォームと方法を提供することである。例えばある種のペプチドの生産のためには、下流の再構築(reassembly)コストを取り除く又は軽減するために、インビボで効率良く且つ安価に大量の所望の最終産物を生産することができる発現系を得ることが理想である。
【０００５】
現在、細菌は、豊富な量の組換えペプチドを生産するそれらの潜在能力の故に、組換えペプチドの生産のために最も広く使用されている発現系である。細菌は一般に、真核生物タンパク質をグリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化又はγ−カルボキシル化せず、それ故、翻訳後修飾を必要とするある種の異種真核生物ペプチドをインビボで生産するそれらの能力には限界がある。細菌によって生産される真核生物ペプチドを修飾する付加的な工程は、所要時間を増大し、ペプチド生産の全体的収率を低下させると考えられ、細菌宿主発現系の利点の多くを色褪せさせる。それ故、細菌発現系の固有の限界を克服するために代替的な非細菌発現系が利用されてきた。
【０００６】
異種ペプチドを生産する能力に関して分析された１つの特定宿主発現系は、全植物体及び植物細胞懸濁培養であった。植物の安全で安価な培養物は、ある種のペプチドのコスト効果的生産のための改善された代替的宿主を提供する。この代替物は、タンパク質が複雑で、グリコシル化を必要とし、ヒト又は動物感染性ウイルス及び細菌毒素不含である必要がある場合に特に魅力的である。
【０００７】
全植物体は、比較的安価に膨大な量で成長するという利点を提供し、収集されたトランスジェニック又はウイルス感染植物の大量のバイオマスからの、所望組換えタンパク質の大きな収量の潜在的可能性を有する。その結果として、全植物体は、ヒト又は動物への投与を意図する生物薬剤タンパク質の商業生産のための発現系として開発されてきた。
【０００８】
これらの系の固有の能力を利用するために、非細菌系における異種タンパク質の生産コストと収率を改善する試みに多大の時間と資源が費やされてきた。これらの領域の両方で進歩があったが、非細菌発現系における異種ペプチドの生産のためのさらなる方法とプラットフォームは有益であろう。
【０００９】
ウイルス及びウイルス様粒子
宿主細胞発現系におけるペプチド生産を改善するための１つのアプローチは、対象組換えペプチドを生産するために感染性組換えウイルスの性質を利用することである。植物宿主系における感染性ウイルスの使用は特に周知である。例えばPorta & Lomonossoff, (2002) “Viruses as vectors for the expression of foreign sequences in plants, “Biotechnology and Genetic Enginering Reviews 19:245-291参照。
【００１０】
最近の戦略は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）構造における異種ペプチドの生産に集中している。一般に、カプシド形成ウイルスは、ウイルス核酸を含有するように集合されたタンパク質コート又は「カプシド」を含む。多くのウイルスは、個別に発現されたカプシドから「自己集合(self-assembly)」することができるカプシドを有し、カプシドは細胞内部で（「インビボ集合(in vivo assembly)」）及び単離と精製後に細胞の外側で（「インビトロ集合(in vitro assembly)」）発現される。理想的には、標的組換えペプチドを含むようにカプシドを改変し、組換えウイルスカプシド−ペプチド融合物を生成する。次に融合ペプチドを細胞において発現させ、理想的には、組換えウイルス又はウイルス様粒子を形成するようにインビボで構築させることができる。
【００１１】
植物においてＶＬＰに集合されたウイルスカプシド融合タンパク質による異種タンパク質の生産は、様々な程度の成功を収めている。例えば C Marusic et al., J Virol. 75 (18): 8434-39 (Sep 2001)（組換えウイルス粒子のインビボ形成を伴う、末端で抗原性６アミノ酸ＨＩＶペプチドに融合されたウイルスカプシドを発現する全ニコチアナ・ベンタミアナにおける感染性螺旋ジャガイモＸウイルスの使用）; FR Brennan et al., Vaccine 17 (15-16): 1846-57 (09 Apr 1999) （カウピー（ササゲ）全植物体(ビグナ・ユニキクラータ）における組換えウイルス粒子発現のインビボ形成を伴う、末端で抗原性黄色ブドウ球菌ペプチドに融合された感染性カウピーモザイクウイルス又は螺旋ジャガイモＸウイルスの使用）; C Porta et al.,Intervirology 39 (1-2): 79-84 (1996) （全植物体において抗原性ＨＩＶ配列を含むキメラコートタンパク質を発現する感染性カウピーモザイクウイルス）参照。
【００１２】
Lomonossoff & Johnsonへの米国特許第５，８７４，０８７号は、ウイルスカプシドが生物活性ペプチド、例えばホルモン、成長因子又は抗原性ペプチドを含むように工作されている、植物細胞又は全植物体における感染性植物ウイルスの生産を述べている。コモウイルス、トンブスウイルス、ソベモウイルス及びネポウイルス属から選択されるウイルスを、外来性ペプチドをコードする配列を含むように工作し、組換えウイルスを生産するために工作したウイルスのゲノム全体を発現させる。前記明細書は、改変ウイルスの増殖が発明の中心部分であることを強調する。
【００１３】
チャップマン（Chapman）らへの米国特許第６，２３２，０９９号は、全植物体においてウイルスカプシドサブユニットに結合した異種タンパク質を生産するための感染性桿状ウイルスの使用を述べる。螺旋ウイルスとしても分類される桿状ウイルス、例えばジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）は、組換えウイルスカプシド−ペプチド融合物を創造するために対象組換えペプチドがウイルスのゲノムに挿入されている。次に、組換え感染性ウイルスを使用して全植物体の植物細胞に感染させ、ウイルスは植物細胞において活発に複製して、さらに他の細胞に感染し、最終的に宿主植物全体に感染する。最後に、組換えウイルスカプシド−ペプチド融合物を植物から精製する。
【００１４】
チャップマン（Chapman）らはまた、限られた挿入物サイズが二十面体ウイルスによって許容されることを教示する。チャップマン（Chapman）らは、自らの主張を裏付けるのに、植物宿主細胞における発現のための二十面体ウイルス内の組換えペプチドの大きさを２６アミノ酸の長さに限定する、国際公開公報第ＷＯ９２／１８６１８号を引用している。チャップマン（Chapman）らは、二十面体ウイルスのカプシドの内部挿入部位に存在するより大きなペプチドは、キメラウイルスの集合の失敗を導く、タンパク質の形状及び／又は他のカプシドと成功裏に相互作用するその能力の破壊をもたらし得ると理論付ける。
【００１５】
カプロウスキー（Koprowski）らへの米国特許第６，０４２，８３２号は、抗原性ポリペプチドに融合した植物ウイルスカプシドタンパク質を含む融合カプシドタンパク質を述べる。生じる粒子は全植物体において生産される。
【００１６】
カプシド融合タンパク質において異種タンパク質を生産するための感染性組換えウイルスの使用は、しかしながら、欠点がないわけではない。１つの特に厄介な面は、対象とする融合異種タンパク質を含まない基本的に野生型の復帰変異株、又は突然変異した望ましくない組換えカプシド融合タンパク質産物であるカプシドタンパク質を生じる、インビボで突然変異するこれらのウイルスの能力である。例えばPorta & Lomonossoff (1996) “Use of viral replicons for the expression of genes in plants, “ Molecular Biotechnology 5: 209- 221;Dolja et al. (1993) “Spontaneous mutagenesis of a plant potyvirus genome after insertion of a foreign gene,” J. Virol. 67 (10): 5968-5975; Dawson et al. (2001)”Assessment of recombinants that arise from the use of a TMV-based transient expression vector, “Virol. 284 (2): 182-189（接種した全植物体における異種挿入遺伝子の欠失を述べる）参照。全植物体におけるこれらのウイルスベクターの安定性の欠如は、全体的タンパク質産物の収率を潜在的に低下させ、カプシド−融合産物の不一致や不規則性を導き得る。そのような不規則性は、タンパク質産物の完全性がペプチドの特定所望物理化学的性質にとって必須である場合に特に厄介であり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
植物における感染性組換えウイルスの固有の不安定性の結果として、商業的組換えタンパク質生産の分野において植物系型の利益を提供する効率的なペプチド生産系に対する需要がまだ存在する。
【００１８】
加えて、組換えペプチドの生産のための全植物体の使用はまた、潜在的な問題を提示する。例えば長い発現時間、バッチごとの生成物収率の変動、封じ込めの問題、生産の初期段階に製造管理規則(Good Manufacturing Practice, GMP)を適用することの難しさ、農薬及び肥料による汚染の可能性、並びに害虫、病害及び微気候や土壌の相違による一定しない栽培条件は全て、組換えペプチドの生産のための潜在的に一貫しない宿主系を生じさせる。
【００１９】
それ故、カプシド融合タンパク質を含むウイルス様粒子の生産のための安定で一貫した植物細胞発現系を提供することが本発明の１つの目的である。
【００２０】
カプシド融合タンパク質を含むウイルス様粒子の生産のための安定な発現系における宿主細胞として使用のための植物細胞を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００２１】
植物細胞懸濁培養を含む、植物細胞におけるカプシド融合タンパク質を含むウイルス様粒子の改善された生産のための方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００２２】
カプシド融合タンパク質を含むウイルス様粒子の生産のための植物細胞発現系において使用するための新規構築物及び核酸を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、ウイルスカプシドと対象組換えペプチドを含む融合ペプチドをコードする非感染性プラスミドが宿主植物細胞のゲノムに安定に挿入され、懸濁植物細胞培養において発現される、組換えペプチドの生産のための方法を提供する。ウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物は、インビボでウイルス様粒子として発現され得る。本発明は、感染性ウイルス因子の使用を必要としない；というよりもむしろ、カプシド−異種ペプチド融合産物をコードする非感染性核酸が植物細胞のゲノムに安定に挿入され、それを、発酵工程において培養して対象ペプチドを生産することができる。そのような工程は、異種ペプチドを含むカプシド融合タンパク質の発現のためにより変動が少なく、より安定な宿主系を生じさせる。
【００２４】
全植物体において対象異種ペプチドを発現するために使用される、カプシド−異種ペプチド融合タンパク質を含む感染性ウイルスは、組換えカプシドタンパク質核酸における突然変異を生じさせる、全植物体での遺伝的不安定性を示し、発現される突然変異型カプシドは、ウイルス粒子へと集合することができないか又は突然変異した標的ペプチドを含むことが見出された。本発明は、増殖条件に対する厳密な制御、バッチごとの一貫性、高いレベルの封じ込め、及び製造管理規則(GMP)に従って組換えタンパク質を生産する能力という付加的な利益と共に、生じる異種ペプチドの高い安定性を提供する。
【００２５】
カプシド−融合タンパク質産物は細胞内でウイルス様粒子を形成し得る。ウイルス様粒子は、回収されるペプチドの高純度を達成する改善された効率をもたらし得る。細胞において生産されるウイルス様粒子は、典型的には植物細胞に感染することができない。ウイルスカプシド配列は、栄養性及び非栄養性ウイルスに両方に由来することができ、栄養機能は発現宿主として使用される特定植物細胞によって決定される。１つの実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、融合産物を発現するために使用される植物細胞に対して天然又は自然の栄養機能を示すウイルスに由来する。１つの実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、融合産物を発現するために使用される植物細胞に対して天然又は自然の栄養機能を示さないウイルスに由来する。１つの実施形態では、細胞は、融合産物を生産するために使用される所望カプシドタンパク質配列以外の人工的に導入されたウイルスタンパク質を含まない。もう１つの実施形態では、細胞は、融合産物を生産するために使用される所望カプシドタンパク質配列以外の人工的に導入されたウイルスタンパク質又は核酸を含み、前記の付加的なウイルスタンパク質又は核酸は、核酸配列に感染性を付与しない。１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、植物細胞発現宿主とは異なる科の生物に対して栄養機能を有するウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、植物細胞発現宿主とは異なる属の生物に対して栄養機能を有するウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、融合産物を発現するために使用される細胞とは異なる種の生物に対して親和性を有するウイルスに由来する。本発明の１つの実施形態では、カプシドは桿状植物ウイルスに由来する。特定実施形態では、カプシドは、タバコモザイクウイルス及びジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）から選択される群に由来する桿状ウイルスカプシドである。本発明の１つの実施形態では、カプシドタンパク質は二十面体ウイルスに由来する。特定実施形態では、カプシドは植物二十面体二十面体ウイルスに由来する。より特定の実施形態では、二十面体カプシドは、カウピーモザイクウイルス（ササゲモザイクウイルス）(Cowpea Mosaic Virus)、カウピークロロティックモトルウイルス（ササゲ退緑斑紋ウイルス）(Cowpea Clorotic Mottle Virus)及びアルファルファモザイクウイルスから選択される群に由来する。
【００２６】
本発明はまた、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合タンパク質をコードする発現カセットを含む非感染性核酸構築物を含む植物細胞を提供する。ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドは、植物細胞において機能するプロモーター及びターミネーターに作動可能に連結されている。１つの詳細な実施形態では、核酸は植物細胞のゲノムに組み込まれ、この組込みは、カプシド融合タンパク質をコードする核酸の世代から世代への安定な遺伝と発現をもたらす。本発明の１つの詳細な実施形態では、カプシドタンパク質は二十面体ウイルスに由来する。１つの実施形態では、細胞はウイルス様粒子又は可溶性ケージ構造を生産する。１つの実施形態では、植物細胞は単子葉植物又は双子葉植物である。特定実施形態では、植物細胞はニコチアナ・タバカム（タバコ）である。代替的実施形態では、植物細胞はオリザ・サティバ（イネ科イネ）である。本発明の１つの実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質に融合した組換えペプチドは、ヒト又は動物の治療のために有用な治療ペプチドである。１つの特定実施形態では、組換えペプチドは抗原性ペプチドである。特定実施形態では、抗原性ペプチドはグリコシル化抗原性ペプチドである。１つの実施形態では、抗原性ペプチドを含むカプシド−組換えペプチドウイルス様粒子を含有する植物細胞又は抽出物は、ワクチンとしてヒト又は動物に投与することができる。代替的実施形態では、抗原性ペプチドを含む精製カプシド−組換えペプチドウイルス様粒子は、ワクチンとしてヒト又は動物に投与することができる。１つの実施形態では、異種ペプチドは抗菌ペプチドである。もう１つの特定実施形態では、組換えペプチドは、遊離単量体形態であるとき植物宿主細胞に対して毒性であるペプチドである。１つの実施形態では、カプシドに融合した組換えペプチドは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも８５、少なくとも９５、少なくとも９９又は少なくとも１００アミノ酸の長さである。
【００２７】
本発明の１つの実施形態では、カプシドに融合した組換えペプチドは、所望標的ペプチドの少なくとも１個の単量体を含む。代替的実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの２個以上の単量体を含む。ある実施形態では、前記ペプチドは、コンカテマーペプチドとしてカプシドに作動可能に連結された少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個又は少なくとも２０個の別個の単量体から成る。もう１つの実施形態では、コンカテマーペプチド内の個々の単量体は、切断可能なリンカー領域によって連結される。さらにもう１つの実施形態では、組換えペプチドをウイルスカプシドの少なくとも１つの表面ループに挿入する。１つの実施形態では、組換えペプチドを二十面体ウイルスカプシドの少なくとも１つの表面ループに挿入する。１つの実施形態では、少なくとも１個の単量体をウイルスカプシドタンパク質の２つ以上の表面ループに挿入する。さらにもう１つの実施形態では、組換えペプチドをウイルスカプシドの少なくとも１つの外側表面ループに挿入する。代替的実施形態では、組換えペプチドをウイルスカプシドの少なくとも１つの内側表面ループに挿入する。
【００２８】
ウイルス様粒子の２つ以上のループを修飾することができる。１つの特定実施形態では、組換えペプチドをウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループ上で発現する。もう１つの実施形態では、少なくとも２個の異なるペプチドをウイルスカプシド、ケージ又はウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループに挿入する。もう１つの実施形態では、少なくとも３個の組換えペプチドをウイルス様粒子の少なくとも３つの表面ループに挿入する。表面ループ内の組換えペプチドは同じアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態では、表面ループ内の組換えペプチドのアミノ酸配列は異なる。
【００２９】
さらにもう１つの実施形態では、前記細胞は、野生型カプシド又は異なるカプシド−組換えペプチド融合ペプチドのいずれかをコードする少なくとも１個の付加的な核酸を含み、多数のカプシドは、インビボでキメラウイルス様粒子を生成するように集合され得る。
【００３０】
本発明の１つの態様では、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合タンパク質を含む植物細胞が提供される。本発明の１つの詳細な実施形態では、植物細胞は単子葉植物である。代替的実施形態では、植物細胞は双子葉植物である。１つの実施形態では、カプシド−組換えペプチド融合タンパク質は、インビボでウイルス様粒子を形成するように集合する。
【００３１】
本発明の１つの実施形態では、カプシドタンパク質−組換えペプチド融合ペプチドをコードする核酸構築物を含む植物細胞は、核形質転換によって得られる。１つの実施形態では、前記植物細胞は色素体（プラスチド(plastid)）形質転換によって得られる。さらにもう１つの実施形態では、前記植物細胞は葉緑体形質転換によって得られる。
【００３２】
本発明はさらに、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合タンパク質をコードする発現カセットを含む非感染性核酸構築物を提供する。本発明の１つの実施形態では、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合タンパク質をコードする発現カセットは、プロモーター及びターミネーターに作動可能に連結されている。本発明の１つの実施形態では、カプシドは植物ウイルスに由来する。本発明の１つの実施形態では、カプシドは二十面体植物ウイルスに由来する。特定実施形態では、カプシドは、カウピーモザイクウイルス、カウピークロロティックモトルウイルス及びアルファルファモザイクウイルスから選択される群に由来する二十面体ウイルスカプシドである。
【００３３】
本発明の１つの実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの少なくとも１個の単量体を含む。代替的実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの２個以上の単量体を含む。さらにもう１つの実施形態では、組換えペプチドは、二十面体ウイルスカプシドの少なくとも１つの表面ループに挿入される。
【００３４】
もう１つの実施形態では、前記核酸構築物は、植物細胞において機能する少なくとも１個のプロモーターを含む付加的な核酸配列を含む。もう１つの実施形態では、前記核酸構築物は、植物細胞において機能する少なくとも１個のプロモーター及び植物細胞において機能する少なくとも１個のターミネーターを含む付加的な核酸配列を含む。１つの実施形態では、プロモーター及びターミネーター配列に作動可能に連結された選択マーカーをコードする核酸配列が、前記核酸構築物に含まれる。代替的実施形態では、プロモーター及びターミネーター配列に作動可能に連結された選択マーカーは、別個の核酸構築物上で提供される。もう１つの実施形態では、前記核酸構築物は、ウイルスＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に由来する付加的な核酸配列を含む。さらにもう１つの実施形態では、核酸構築物は、ウイルスＲＮＡに由来する少なくとも１つのカプシド形成シグナルを含む。さらにもう１つの実施形態では、非感染性核酸構築物は、ウイルス核酸に感染性を付与しない、ウイルスＲＮＡに由来する付加的な核酸配列を含む。
【００３５】
１つの態様では、本発明は、
ａ）植物細胞を提供すること；
ｂ）少なくとも１個の異種ペプチドと少なくとも１個のウイルスカプシドタンパク質から成る融合ペプチドをコードする非感染性核酸を提供すること；
ｃ）前記植物細胞を形質転換し、前記核酸がその後植物細胞のゲノムに組み込まれること；
ｄ）前記植物細胞を発酵工程において懸濁植物細胞培養中で増殖させ、前記植物細胞において前記核酸を発現させること；
ｅ）前記植物細胞における発現が、前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること；及び
ｄ）前記ウイルス様粒子を単離すること
を含む、組換えペプチドを生産するための方法を提供する。
【００３６】
１つの実施形態では、前記方法は、ｅ）ウイルスカプシドタンパク質から組換えペプチドを分離するために融合産物を切断すること、をさらに含む。さらにもう１つの実施形態では、前記方法は、ｆ）工程（ｅ）の後に、組換えペプチドを単離すること、をさらに提供する。例えば図１参照。本発明の１つの実施形態では、植物細胞は、オリザ・サティバ及びニコチアナ・タバカムから成る群より選択される。
【００３７】
組換えペプチドとウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸は、プロモーター配列及びターミネーター配列に作動可能に連結される。
【００３８】
１つの実施形態では、前記方法は、野生型カプシド又は異なるカプシド−組換えペプチド融合ペプチドをコードするもう１つ別の核酸を同時発現することを含み、前記カプシドは、インビボでキメラウイルス様粒子を生成するように集合される。
【００３９】
本発明のもう１つの態様では、
ａ）植物細胞培地中で増殖することができる植物細胞；
ｂ）少なくとも１個の組換えペプチドと少なくとも１個のウイルスカプシドを含む融合ペプチドをコードし、植物細胞においてゲノムに組み込まれて発現することができる、非感染性核酸；及び
ｃ）増殖培地
を含む、組換えペプチドの生産のための発現系が提供される。
【００４０】
融合ペプチドをコードする核酸は、プロモーター配列及びターミネーター配列に作動可能に連結され得る。発現されたとき、融合ペプチドは、細胞内でウイルス様粒子に集合することができる。１つの実施形態では、前記プロモーターは植物プロモーターである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、ウイルスカプシドと対象組換えペプチドを含む融合ペプチドをコードする非感染性プラスミドが宿主植物細胞のゲノム内に安定に挿入され、懸濁植物細胞培養中で発現される、組換えペプチドの生産のための方法を提供する。ウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物は、インビボでウイルス様粒子として発現され得る。本発明はさらに、前記方法における使用のための植物細胞及び核酸構築物を提供する。詳細には、本発明は、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードする発現カセットを含む核酸構築物と共に、懸濁植物細胞培養中で増殖することができる植物細胞を提供する。前記融合ペプチドは、プロモーター配列及び終結配列に作動可能に連結され得る。１つの実施形態では、融合ペプチドの植物細胞における発現は、ウイルス様粒子又は可溶性ケージ構造を生成する。本発明はまた、植物細胞のゲノムに組み込むことができ、１つの実施形態では、ヒト及び動物の治療のために有用な治療ペプチドであり得る、ウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードすることができる核酸構築物を提供する。
【００４２】
本発明はまた、プロモーター及び終結配列に作動可能に連結された組換えペプチドとウイルスカプシドの融合ペプチドをコードする発現カセットを含む植物細胞のゲノムに組み込むことができる核酸；懸濁植物細胞培養中で前記植物細胞において核酸を発現させ、前記植物細胞における発現が前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること；及び前記ウイルス様粒子を単離すること、を提供することによって懸濁植物細胞培養において組換えペプチドを生産するための方法を提供する。
【００４３】
ここで使用する「感染性」という用語は、ウイルス粒子がその核酸を宿主に転移する能力又は宿主へのウイルス核酸の導入を意味し、その場合ウイルス核酸が複製され、ウイルスタンパク質が翻訳されて、核酸を宿主にさらに転移することができる新しいウイルス粒子が集合される。ここで使用する「非感染性」という用語は、宿主への導入後にウイルス由来核酸が宿主において複製できないことを意味し、その場合ウイルスタンパク質が翻訳され、宿主においてウイルス感染過程を開始することができない新しいウイルス様粒子が構築される。ここで使用する「ペプチド」という用語は、特定分子量に限定されず、タンパク質又はポリペプチドも包含し得る。
（Ｉ．組換え植物細胞）
【００４４】
本発明は、ゲノム組込みが可能であり、プロモーター配列及び終結配列に作動可能に連結されたウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードする非感染性核酸構築物を含む植物細胞を提供する。前記細胞は組換えペプチドを生産するための方法において使用することができる。
【００４５】
植物細胞は、プロモーター及び終結配列に作動可能に連結されたウイルスカプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードする発現カセットを含み、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれる核酸構築物で天然植物細胞を形質転換することによって誘導できる。安定な形質転換は、ゲノム内への異種ＤＮＡの組込みに依存する。異種ＤＮＡは植物の核又は色素体に組み込まれ得る。核酸構築物は、植物のゲノムにランダムに挿入され得るか又は相同的組換えを通してゲノムの特定領域を指向し得る。前記植物細胞は、核形質転換、色素体形質転換及び葉緑体形質転換を含む、当技術分野において公知の何らかの手段によって入手できる。例えば米国特許第６，２１８，１４５号；欧州特許第０１２３４５１４９号；国際公開公報第ＷＯ０１２１７８２号；米国特許第６，５１５，２０６号；国際公開公報第ＷＯ９９／１０５１３号；米国特許第５，６９３，５０７号；国際公開公報第ＷＯ０２０５５６５１号；国際公開公報第ＷＯ０１７０９３９号；米国特許第６，４７２，５８６号；国際公開公報第ＷＯ０２０５７４６６号；米国特許第５，０５７，４２２号；国際公開公報第ＷＯ０１２０９７４号； Staub, J. M. and Maliga, P, (1992) “Long regions of homologous DNA are incorporated into the tobacco plastid genome by transformation,”
Plant Cell 4: 39-45 参照。
【００４６】
ウイルスカプシド
１つの実施形態では、本発明は、宿主ゲノムに安定に組み込まれた非感染性プラスミドからのウイルスカプシドに融合したペプチドの発現によってペプチドを生産するための方法における使用のための植物細胞を提供する。前記発現は、細胞内で少なくとも１個のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成を生じさせ得る。
【００４７】
ウイルスは、螺旋対称又は二十面体対称を有するものに分類できる。一般に認識されているカプシド形態は、二十面体（正二十面体（icosahedral proper）、等軸晶系、準等軸晶系、及び双生又は「双晶（twinned）」を含む）、多面体（球状、卵形及びレモン形を含む）、杆状（棒状又は弾丸状、及び紡錘状又は葉巻形を含む）、及び螺旋状（桿状、円柱状及びひも状を含む）を含み、いずれも尾部を有していてもよく及び／又は表面突起、例えば棘又はこぶを含んでいてもよい。
【００４８】
（形態）
本発明の１つの実施形態では、カプシドのアミノ酸配列は、何らかの形態を有すると分類されるウイルスのカプシドから選択される。１つの実施形態では、カプシドは桿状ウイルスに由来する。特定実施形態では、カプシドは桿状植物ウイルスに由来する。より特定の実施形態では、カプシドは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）から選択される群に由来する桿状植物ウイルスカプシドである。ＴＭＶは、桿状粒子（３００ｎｍ）を生じさせる独自のコードタンパク質（１７．５ｋＤａ）でカプシド形成された単一プラス−センスゲノムＲＮＡ（６．５ｋｂ）から成る。ジャガイモＸウイルスは、５１５ｎｍの明瞭なモード長と１３ｎｍの幅を有するひも状で被包されていない、通常は屈曲性のウイルスである（Brands, 1964）。カプシド構造は３．４ｎｍのピッチで基本螺旋を形成する（Verma et al., 1968）。
【００４９】
１つの実施形態では、カプシドは二十面体形態を有する。１つの実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、正二十面体である実在のカプシドから選択される。もう１つの特定実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、二十面体ウイルスのカプシドから選択される。１つの特定実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、二十面体植物ウイルスのカプシドから選択される。しかし、もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、植物に対して感染性でない二十面体ウイルスに由来する。例えば１つの実施形態では、ウイルスは、哺乳動物に対して感染性のウイルスである。
【００５０】
一般に、二十面体ウイルスのウイルスカプシドは、二十面体（立方）対称に配列された多数のタンパク質サブユニットから成る。天然二十面体カプシドは、例えばカプシドの各々の三角形の面を形成し、３個のサブユニットで構築することができ、完全なカプシドを形成する６０個のサブユニットを生じさせ得る。この小さなウイルス構造の典型は、例えばバクテリオファージφＸ１７４である。多くの二十面体ウイルスカプシドは６０個以上のサブユニットを含む。二十面体ウイルスの多くのカプシドは、逆平行の８本鎖β−バレル型折りたたみモチーフを含む。このモチーフは、一方の側に４本のβ鎖（ＢＩＤＧと称される）及び他方の側に４本のβ鎖（ＣＨＥＦと称される）を備えるくさび形ブロックを有する。また２つの保存されたα−ヘリックス（Ａ及びＢと称される）も存在し、１つはβＣとβＤの間、他方はβＥとβＦの間にある。
【００５１】
エンベロープを持つウイルスは、膜を通して粒子が突出（出芽）することにより、その全面的な破壊を伴わずに感染細胞を出て行くことができ、その間に粒子は、細胞膜に由来する脂質エンベロープ内に被包される（例えばAJ Cann (ed. ) (2001) Principles of Molecular Virology (Academic Press); A Granoff and RG Webster (eds.) (1999) Encyclopedia of Virology (Academic Press); DLD Caspar (1980) Biophys. J. 32: 103; DLD Caspar and A Klug (1962) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 27: 1; J Grimes et al. (1988) Nature 395: 470; JE Johnson (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93: 27; and J Johnson and J Speir (1997) J. Mol. Biol. 269: 665参照）。
【００５２】
（ウイルス）
ウイルス分類学は、以下の分類群のカプシド形成粒子実体を承認する：
・グループIウイルス、すなわちｄｓＤＮＡウイルス；
・グループＩＩウイルス、すなわちｓｓＤＮＡウイルス；
・グループＩＩＩウイルス、すなわちｄｓＲＮＡウイルス；
・グループＩＶウイルス、すなわちＤＮＡ段階を持たないｓｓＲＮＡ（＋）鎖ウイルス；
・グループＶウイルス、すなわちｓｓＲＮＡ（−）鎖ウイルス；
・グループＶＩウイルス、すなわちｓｓＲＮＡ逆転写ウイルスである、ＲＮＡレトロイドウイルス；
・グループＶＩＩウイルス、すなわちｄｓＤＮＡ逆転写ウイルスである、ＤＮＡレトロイドウイルス；
・デルタウイルス；
・ウイロイド；及び
・サテライト核酸及びプリオンを除く、サテライトファージ及びサテライトウイルス。
【００５３】
これらの分類群の成員は当業者に周知であり、H. V. Van Regenmortel et al. (eds.), Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2000) (Academic Press/Elsevier, Burlington Mass., USA); レスター大学微生物・免疫学部のウイルス分類学ウエブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｍｉｃｒｏ．ｍｓｂ．ｌｅ．ａｃ．ｕｋ／３０３５／ Ｖｉｒｕｓｇｒｏｕｐｓ．ｈｔｍｌ;及び米国保健社会福祉省の国立衛生研究所・国立医学図書館・国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）(Washington, D. C. , USA)の分類学ブラウザのオンライン「ウイルス」及び「ウイロイド」部門ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／ｔａｘ．ｈｔｍｌ．において総説されている。
【００５４】
カプシドのアミノ酸配列は、これらの分類群のいずれかの成員のカプシドから選択され得る。これらの分類群の成員のカプシドについてのアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩによって提供されるＰｕｂＭｅｄオンライン検索機能の「ヌクレオチド」（Ｇｅｎｂａｎｋ）、「タンパク質」及び「構造」部門ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ．を含むがこれらに限定されないソースから入手し得る。
【００５５】
１つの実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、以下の宿主の少なくとも１つに特異的な分類群成員から選択される：酵母を含む真菌、植物、藻類を含む原生生物、無脊椎動物、脊椎動物、及びヒト。１つの実施形態では、カプシドアミノ酸配列は以下の分類群のいずれかの成員から選択される：グループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩ、グループＩＶ、グループＶ、グループＶＩＩ、ウイロイド、及びサテライトウイルス。１つの実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、上述した６つの宿主型の少なくとも１つに特異的なこれら７つの分類群のいずれかの成員から選択される。より詳細な実施形態では、カプシドアミノ酸配列は、グループＩＩ、グループＩＩＩ、グループＩＶ、グループＶＩＩ、及びサテライトウイルスのいずれかの成員から；又はグループＩＩ、グループＩＶ、グループＶＩＩ、及びサテライトウイルスのいずれかから選択される。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドはグループＩＶ又はグループＶＩＩから選択される。
【００５６】
ウイルスカプシド配列は、当該細胞に対して親和性でないウイルスに由来し得る。１つの実施形態では、当該細胞は、所望二十面体カプシド以外の特定選択ウイルスからのウイルスタンパク質を含まない。１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、当該細胞とは異なる科の生物に対して親和性を有するウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、当該細胞とは異なる属の生物に対して親和性を有するウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、当該細胞とは異なる種の生物に対して親和性を有するウイルスに由来する。
【００５７】
詳細な実施形態では、ウイルスカプシドはグループＩＶのウイルスから選択される。
【００５８】
１つの実施形態では、ウイルスカプシドは桿状植物ウイルスから選択される。より特定の実施形態では、ウイルスカプシドは、タバコモザイクウイルス及びジャガイモＸウイルスから成る群より選択される。
【００５９】
１つの実施形態では、ウイルスカプシドは二十面体ウイルスから選択される。二十面体ウイルスは、乳頭腫ウイルス科、トティウイルス科、ジシストロウイルス科、ヘパドナウイルス科、トガウイルス科、ポリオーマウイルス科、ノダウイルス科、テクティウイルス科、レヴィウイルス科、ミクロウイルス科、サイフォウイルス科、ノダウイルス科、ピコルナウイルス科、パルボウイルス科、カルシウイルス科、テトラウイルス科、及びサテライトウイルスのいずれかの成員から選択され得る。
【００６０】
特定実施形態では、前記配列は、少なくとも１つの植物宿主に特異的な分類群のいずれかの成員から選択される。１つの実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、ブンヤウイルス科、レオウイルス科、ラブドウイルス科、ルテオウイルス科、ナノウイルス科、パルティティウイルス科、セキウイルス科、ティモウイルス科、ウルミアウイルス属、タバコ壊死サテライトウイルス、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トンブスウイルス科、又はブロモウイルス科分類群のいずれかであるか又はそのいずれかの成員である、植物感染性ウイルス種である。１つの実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、ルテオウイルス科、ナノウイルス科、パルティティウイルス科、セキウイルス科、ティモウイルス科、ウルミアウイルス属、タバコ壊死サテライトウイルス、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トンブスウイルス科、又はブロモウイルス科分類群のいずれかであるか又はそのいずれかの成員である、植物感染性ウイルス種である。詳細な実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トンブスウイルス科、又はブロモウイルス科のいずれかであるか又はそのいずれかの成員である、植物感染性ウイルス種である。より特定の実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トンブスウイルス科、又はブロモウイルス科のいずれかであるか又はそのいずれかの成員である、植物感染性ウイルス種である。より特定の実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、コモウイルス科又はブロモウイルス科の成員である植物感染性ウイルス種である。特定実施形態では、ウイルスカプシドは、カウピーモザイクウイルス又はカウピークロロティックモトルウイルスに由来する。もう１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、ブロモウイルス科分類群の種に由来する。詳細な実施形態では、カプシドは、イラルウイルス属又はアルファモウイルス属に由来する。より詳細な実施形態では、カプシドは、タバコ条斑病ウイルス又はアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）（ＡＭＶ１又はＡＭＶ２を含む）に由来する。
【００６１】
（ＶＬＰ）
本発明のウイルスカプシドは、ここで述べる宿主細胞において非感染性である。１つの実施形態では、ウイルス科の発現の間又は発現後に宿主細胞においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）又はケージ構造が形成される。１つの実施形態では、ＶＬＰ又はケージ構造はまた、対象とするペプチドも含み、特定実施形態では、対象ペプチドがＶＬＰの表面に発現される。前記発現系は、典型的にはウイルスの感染性を可能にする付加的なウイルスタンパク質を含まない。典型的実施形態では、発現系は、宿主細胞、及び１又はそれ以上のウイルスカプシド及び作動可能に連結された対象ペプチドをコードするベクターを含む。前記ベクターは、典型的には付加的なウイルスタンパク質を含まない。本発明は、ウイルスカプシドがある種の宿主細胞においてより大きな度合で形成され、組換えペプチドのより効率的な回収を可能にするという発見に由来する。
【００６２】
１つの実施形態では、ＶＬＰ又はケージ構造は、３から約１，０００カプシドを含む、カプシドの多量体集合物である。１つの実施形態では、ＶＬＰ又はケージ構造は、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも９０又は少なくとも１２０カプシドを含む。もう１つの実施形態では、各々のＶＬＰ又はケージ構造は、少なくとも１５０カプシド、少なくとも１６０、少なくとも１７０又は少なくとも１８０カプシドを含む。
【００６３】
１つの実施形態では、ＶＬＰは二十面体構造として発現される。もう１つの実施形態では、ＶＬＰは、そのカプシド配列が由来する天然ウイルスと同じ形状で発現される。別の実施形態では、しかしながら、ＶＬＰは天然ウイルスと同じ形状を持たない。ある実施形態では、例えば、多数のカプシドで形成されるが天然型ＶＬＰを形成しない粒子中で構造が生成される。例えばわずか３個のウイルスカプシドのケージ構造が形成され得る。別の実施形態では、約６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７又は６０カプシドのケージ構造が形成され得る。
【００６４】
１つの実施形態では、カプシドの少なくとも１個は、少なくとも１個の対象ペプチドを含む。１つの実施形態では、ペプチドは、ＶＬＰの少なくとも１つの内部ループ内で又は少なくとも１つの外側表面ループにおいて発現される。
【００６５】
ウイルスカプシドの２つ以上のループを修飾することができる。１つの特定実施形態では、組換えペプチドは、ウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループ上で発現される。もう１つの実施形態では、少なくとも２個の異なるペプチドをウイルスカプシド、ケージ又はウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループに挿入する。もう１つの実施形態では、少なくとも３個の組換えペプチドをウイルス様粒子の少なくとも３つの表面ループに挿入する。表面ループ内の組換えペプチドは同じアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態では、表面ループ内の組換えペプチドのアミノ酸配列は異なる。
【００６６】
ある実施形態では、ＶＬＰの集合を改善するために宿主細胞を修飾することができる。宿主細胞を、例えば、発現されたウイルスカプシドからのＶＬＰの形成を促進するシャペロンタンパク質を含むように改変することができる。もう１つの実施形態では、宿主細胞を、ＶＬＰの調節された形成を促進するためにカプシドの発現をより効率的に調節するリプレッサータンパク質を含むように改変する。
【００６７】
ウイルスカプシド又はタンパク質をコードする核酸配列はまた、ＶＬＰの形成を変化させるように付加的に修飾することができる（例えばBrumfield, et al. (2004) J. Gen. Virol. 85: 1049-1053参照）。例えばこれらの修飾は、集合されたタンパク質ケージ内の隣接サブユニットの内部、外部又はその間の界面を変化させるように設計される。これを実現するために、突然変異誘発プライマーを使用して、（ｉ）Ｎ末端の塩基性残基（例えばＫ、Ｒ）を酸性グルタミン酸に置き換えることによってウイルス核酸結合領域の内表面電荷を変化させる（Douglas et al., 2002b）；（ｉｉ）Ｎ末端から内部残基を欠失させる（ＣＣＭＶにおいて、通常は残基４−３７）；（ｉｉｉ）１１アミノ酸ペプチド細胞標的配列をコードするｃＤＮＡ（Graf et al., 1987）を表面露出ループに挿入する；及び（ｉｖ）金属結合部位を変化させることによってウイルスサブユニットの間の相互作用を修飾する（ＣＣＭＶにおいて、残基８１／１４８突然変異体）ことができる。
【００６８】
組換えペプチドの大きさ
１つの実施形態では、ウイルスカプシド配列に作動可能に連結されたペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含む。もう１つの実施形態では、前記ペプチドは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５又は少なくとも６アミノ酸の長さである。別の実施形態では、ペプチドは少なくとも７アミノ酸の長さである。ペプチドはまた、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４５、５０、６０、６５、７５、８５、９５、９６、９９又はそれ以上のアミノ酸の長さである。１つの実施形態では、コードされるペプチドは少なくとも２５ｋＤである。
【００６９】
１つの実施形態では、ペプチドは、２から約３００アミノ酸、又は約５から約２５０アミノ酸、又は約５から約２００アミノ酸、又は約５から約１５０アミノ酸、又は約５から約１００アミノ酸を含む。もう１つの実施形態では、ペプチドは、約１０から約１４０アミノ酸、又は約１０から約１２０アミノ酸、又は約１０から約１００アミノ酸を含む。
【００７０】
１つの実施形態では、ウイルスカプシド配列に作動可能に連結されたペプチド又はタンパク質は、約５００個のアミノ酸を含む。１つの実施形態では、ペプチドは５００個未満のアミノ酸を含む。もう１つの実施形態では、ペプチドは、約３００個までのアミノ酸、又は約２５０個まで、又は約２００個まで、又は約１８０個まで、又は約１６０個まで、又は約１５０個まで、又は約１４０個まで、又は約１２０個まで、又は約１１０個まで、又は約１００個まで、又は約９０個まで、又は約８０個まで、又は約７０個まで、又は約６０個まで、又は約５０個まで、又は約４０個まで、又は約３０個までのアミノ酸を含む。
【００７１】
１つの実施形態では、カプシドに融合した組換えペプチドは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも８５、少なくとも９５、少なくとも９９、又は少なくとも１００アミノ酸である。
【００７２】
本発明の１つの実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの少なくとも１個の単量体を含む。代替的実施形態では、組換えペプチドは、所望標的ペプチドの２個以上の単量体を含む。ある実施形態では、ペプチドは、コンカテマーペプチドとしてカプシドに作動可能に連結された、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個又は少なくとも２０個の別個の単量体から成る。もう１つの実施形態では、コンカテマーペプチド内の個々の単量体は、切断可能なリンカー領域によって連結される。さらにもう１つの実施形態では、組換えペプチドを、二十面体ウイルス様粒子の少なくとも１つの表面ループに挿入する。１つの実施形態では、少なくとも１個の単量体をウイルス様粒子の表面ループに挿入する。
【００７３】
（分類）
ウイルスカプシドに融合する対象ペプチドは、ウイルスに由来しない、及び場合により、当該細胞と同じ種に由来しない、異種タンパク質であり得る。
【００７４】
ウイルスカプシドに融合する対象ペプチドは、機能性ペプチド：構造ペプチド；抗原性ペプチド；毒性ペプチド、抗菌ペプチド、それらのフラグメント；それらの前駆体；前記のいずれかの組合せ；及び／又は前記のいずれかのコンカテマーであり得る。本発明の１つの実施形態では、組換えペプチドは、ワクチン戦略において使用される抗原性ペプチドを含む、ヒト及び動物の治療のために有用な治療ペプチドである。特定実施形態では、抗原性ペプチドは、インビボでグリコシル化される。
【００７５】
機能性ペプチドは、例えば：生物活性ペプチド（すなわち生物学的実体、例えば生物、細胞、培養物、組織、器官又は細胞小器官、における又はその生物学的機能又は活性の開始、増強、延長、減衰、終結又は防止を及ぼす、惹起する又はさもなければ生じさせるペプチド）；触媒ペプチド；ミクロ構造及びナノ構造活性ペプチド（すなわちその中で又はそれに関連して、作用、例えば運動、エネルギー変換、を実施する工作されたミクロ又はナノ構造の一部を形成するペプチド）；及び刺激剤ペプチド（例えばペプチド着香料、着色料、着臭剤、フェロモン、誘引物質、抑制物質及び忌避物質）を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
生物活性ペプチドは、例えば：免疫活性ペプチド（例えば抗原性ペプチド、アレルゲンペプチド、ペプチド免疫調節剤（immunoregulator）、ペプチド免疫調節剤（immunomodulator）：シグナル伝達ペプチド(signaling and signal transduction peptides)（例えばペプチドホルモン、サイトカイン及び神経伝達物質；受容体；アゴニスト及びアンタゴニストペプチド；ペプチドターゲティング及び分泌シグナルペプチド）；及び生物阻害性ペプチド（例えば毒性、生物致死性又は生物抑制性ペプチド、例えばペプチド毒素及び抗菌ペプチド）を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
構造ペプチドは、例えば：ペプチドアプタマー、折りたたみペプチド（例えばもう１つ別の分子の物理的立体配座の形成又は維持を促進する又は誘導するペプチド）；接着促進ペプチド（例えば接着ペプチド、細胞接着促進ペプチド）；界面ペプチド（例えばペプチド界面活性剤及び乳化剤）；ミクロ構造及びナノ構造構築ペプチド（すなわち工作されたミクロ又はナノ構造の一部を形成する構造ペプチド）；及びプレ活性化ペプチド（例えばプレ、プロ及びプレ−プロタンパク質及びペプチドのリーダーペプチド；インテイン）を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
触媒ペプチドは、例えばアポB ＲＮＡ編集シチジンデアミナーゼペプチド；グルタミニル−ｔＲＮＡシンテターゼの触媒ペプチド：アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼの触媒ペプチド；植物１型リボソーム不活性化ペプチド；ウイルス触媒ペプチド、例えば口蹄疫ウイルス［ＦＭＤＶ−２Ａ］触媒ペプチド；マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド；及び触媒メタロオリゴペプチドを含む。
【００７９】
ペプチドはまた、ペプチドエピトープ、ハプテン又は関連ペプチド（例えば抗原性ウイルスペプチド；ウイルス関連ペプチド、例えばＨＩＶ関連ペプチド、肝炎関連ペプチド；抗体イディオタイプドメイン；細胞表面ペプチド；抗原性ヒト、動物、原生生物、植物、真菌、細菌及び／又は古細菌ペプチド；アレルゲンペプチド及びアレルゲン脱感作ペプチド）であり得る。
【００８０】
ペプチドはまた、ペプチド免疫調節剤(peptide immunoregulators or immunomodulators)（例えばインターフェロン、インターロイキン、ペプチド免疫抑制剤及び免疫増強剤）；抗体ペプチド（例えば一本鎖抗体；一本鎖抗体フラグメント及び構築物、例えば一本鎖Ｆｖ分子；抗体軽鎖分子、抗体重鎖分子、ドメイン欠失抗体軽鎖又は重鎖分子；一本鎖抗体ドメイン及び分子、例えばＣＨ１、ＣＨ１−３、ＣＨ３、ＣＨ１−４、ＣＨ４、ＶＨＣＨ１、ＣＬ、ＣＤＲ１又はＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２ドメイン；パラトープペプチド；ミクロ抗体）；別の結合ペプチド（例えばペプチドアプタマー、細胞内及び細胞表面受容体タンパク質、受容体フラグメント；抗腫瘍壊死因子ペプチド）であり得る。
【００８１】
ペプチドはまた、酵素基質ペプチド又は酵素阻害剤ペプチド（例えばカスパーゼ基質及び阻害剤、プロテインキナーゼ基質及び阻害剤、蛍光共鳴エネルギー転移ペプチド酵素基質）であり得る。
【００８２】
ペプチドはまた、細胞表面受容体ペプチドリガンド、アゴニスト及びアンタゴニスト（例えばセルレイン、ダイノルフィン、オレキシン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、腫瘍壊死因子ペプチド；合成ペプチドリガンド、アゴニスト及びアンタゴニスト）；ペプチドホルモン（例えば内分泌、パラ分泌及び自己分泌ホルモン、例えばアミリン、アンギオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、心臓興奮性神経ペプチド、カゾモルフィン、コレシストキニン、コルチコトロピン及びコルチコトロピン関連ペプチド、分化因子、エンドルフィン、エンドセリン、エンケファリン、エリスロポエチン、エキセンディン、卵胞刺激ホルモン、ガラニン、ガストリン、グルカゴン及びグルカゴン様ペプチド、ゴナドトロピン、成長ホルモン及び成長因子、インスリン、カリジン、キニン、レプチン、脂肪親和性ホルモン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、ナトリウム排泄増加性ペプチド、ニューロキニン、ニューロメジン、ノシセプチン、オステオカルシン、オキシトシン（すなわちオシトシン）、副甲状腺ホルモン、プレイオトロフィン、プロラクチン、レラキシン、セクレチン、セロトニン、睡眠誘発ペプチド、ソマトメジン、サイモポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン、ウロテンシン、血管作用性小腸ペプチド、バソプレシン）；ペプチドサイトカイン、ケモカイン、ウイロカイン（virokine）及びウイロセプター（viroceptor）ホルモン放出及び放出抑制ペプチド（例えばコルチコトロピン放出ホルモン、コルチスタチン、卵胞刺激ホルモン放出因子、胃抑制性ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メラノトロピン放出ホルモン、メラノトロピン放出抑制因子；ノシスタチン、パンクリアスタチン、プロラクチン放出ペプチド、プロラクチン放出抑制因子；ソマトスタチン；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）；ペプチド神経伝達物質又はチャネルブロッカー（例えばボンベシン、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、サブスタンスＰ）；ペプチド毒素、毒素前駆体ペプチド又は毒素ペプチド部分であり得る。ある実施形態では、ペプチド毒素はＤ−アミノ酸を含まない。毒素前駆体ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含まないもの及び／又は翻訳後修飾によって、例えばアミノ酸にＤ−立体配置を導入することができるＤ立体配置誘導剤（例えばペプチドイソメラーゼ又はエピメラーゼ又はラセマーゼ又はトランスアミノアーゼ）の作用によって、及び／又は環状ペプチド構造を形成することができる環化剤（例えばペプチドチオエステラーゼ又はペプチドリガーゼ、例えばトランススプライシングタンパク質又はインテイン）の作用によって、天然毒素構造に変換されていないものであり得る。
【００８３】
毒素ペプチド部分は、ペプチド含有毒素の線状又は前環化オリゴ及びポリペプチド部分であり得る。ペプチド毒素の例は、例えばアガトキシン、アマトキシン、カリブドトキシン、クロロトキシン、コノトキシン、デンドロトキシン、インセクトトキシン、マルガトキシン、マスト細胞脱顆粒ペプチド、サポリン、サラフォトキシン；及び細菌体外毒素、例えば炭疽毒素、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素及び破傷風毒素を含む。
【００８４】
ペプチドはまた、代謝及び消化関連ペプチド（例えばコレシストキニン−パンクレオザイミンペプチド、ペプチドｙｙ、膵ペプチド、モチリン）；細胞接着調節又は仲介ペプチド、細胞外マトリックスペプチド（例えば付着因子、セレクチン、ラミニン）；神経保護又は髄鞘形成促進ペプチド；凝集阻害ペプチド（例えば細胞又は血小板凝集阻害剤ペプチド、アミロイド形成又は沈着阻害剤ペプチド）；連結ペプチド（例えば心臓血管連結神経ペプチド、ｉｇａ連結ペプチド）；又はその他のペプチド（例えばアグーチ関連ペプチド、アミロイドペプチド、骨関連ペプチド、細胞透過性ペプチド、コナントキシン、コントリファン、コンチュラキン、ミエリン塩基性タンパク質等）であり得る。
【００８５】
ペプチドはまた、インビボで翻訳後修飾され得る。特定実施形態では、ペプチドは、単独で又は組合せとして、グリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化又はγ−カルボキシル化され得る。
【００８６】
ある実施形態では、対象ペプチドは、選択されるウイルスカプシドに対して外因性である。ペプチドは、天然又は合成配列のいずれでもよい（及びそれらのコード配列は天然又は合成ヌクレオチド配列のいずれでもよい）。それ故、例えばアミノ酸の天然、修飾天然及び完全人工配列が包含される。これらのアミノ酸配列をコードする核酸分子の配列は、同様に、天然、修飾天然及び完全人工核酸配列であり得、例えばその核酸分子を得るために使用される（すなわち人為作用によって適用される）１又はそれ以上の合理的又はランダム突然変異及び／又は組換え及び／又は合成及び／又は選択工程の結果であり得る。
【００８７】
コード配列は、使用可能な場合は、標的ペプチドについての天然コード配列であり得るが、より典型的には、例えば宿主の種のコドン使用頻度を反映する遺伝子を合成することによって、選択発現宿主細胞における使用のために選択された、改善された又は最適化されたコード配列である。本発明の１つの実施形態では、宿主の種はニコチアナ・タバカムであり、シグナル配列及びペプチド配列の両方を設計するときにはニコチアナ・タバカムのコドン使用頻度を考慮する。本発明の代替的実施形態では、宿主の種はオリザ・サティバであり、シグナル配列及びペプチド配列の両方を設計するときにはオリザ・サティバのコドン使用頻度を考慮する。
【００８８】
（抗原性ペプチド（ペプチドエピトープ））
１つの実施形態では、抗原性ペプチドはウイルスカプシドによる発現を通して生産される。抗原性ペプチドは、感染因子、寄生生物、癌細胞及び他の病原因子を含む、ヒト又は動物病原因子の抗原性ペプチドであるものから選択することができる。そのような病原因子はまた、ビルレンス因子及び病原因子、例えばそれらの因子の体外毒素、内毒素等を含む。病原因子は何らかのレベルのビルレンスを示し得る、すなわちそれらは、例えば毒性、無毒性、偽毒性、半毒性等であり得る。１つの実施形態では、抗原性ペプチドは、病原因子からのエピトープアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、エピトープアミノ酸配列は、少なくとも１個のそのような因子の表面ペプチドの少なくとも一部であるものを含む。１つの実施形態では、カプシド−組換えペプチドウイルス様粒子は、ヒト又は動物適用におけるワクチンとして使用することができる。
【００８９】
２個以上の抗原性ペプチドを選択してもよく、その場合、生じるウイルス様粒子は多数の異なる抗原性ペプチドを提示し得る。多抗原性ペプチド様式の特定実施形態では、様々な抗原性ペプチドは全て同じ病原因子からの複数のエピトープから選択される。多抗原性ペプチド様式の特定実施形態では、様々な抗原性ペプチドは全て、密接に関連する病原因子、例えば同じ種又は同じ属の異なる種の異なる株、亜種、次亜種、病原型、血清型又は遺伝子型（genovar）から選択される。
【００９０】
１つの実施形態では、病原因子は以下の群の少なくとも１つに属する：病原性：バチルス属種、例えば炭疽菌；バルトネラ属種、例えばＢ．クインタナ；ブルセラ属種；ブルクホルデリア属種、例えばＢ．シュードマレイ（類鼻疽菌）；カンピロバクター種；クロストリジウム属種、例えば破傷風菌、ボツリヌス菌；コクシエラ属種、例えばＣ．バーネティー；エドワードシエラ属種、例えばＥ．ターダ；エンテロバクター属種、例えばＥ．クロアカ；エンテロコッカス属種、例えばＥ．フェカリス、Ｅ．フェシウム；エシェリキア属種、例えば大腸菌；フランシセラ属種、例えば野兎病菌（F. tularensis）；ヘモフィルス属種、例えばインフルエンザ菌；クレブシエラ属種、例えば肺炎杆菌；レジオネラ属種；リステリア属種、例えばリステリア菌（L. monocytogenes）；髄膜炎菌及び淋菌、例えばナイセリア属種；モラクセラ属種；ミコバクテリウム属種、例えばらい菌、ヒト型結核菌；肺炎球菌、例えば肺炎双球菌；シュードモナス属種、例えば緑膿菌；リケッチア属種、例えば発疹チフスリケッチア、斑点熱リケッチア、発疹熱リケッチア；サルモネラ属菌、例えば腸チフス菌；ブドウ球菌属種、例えば黄色ブドウ球菌；Ａ型連鎖球菌属及び溶血連鎖球菌属を含む、連鎖球菌属種、例えば肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌；ストレプトミセス属種；赤痢菌属種；ビブリオ属種、例えばコレラ菌；及びエルジニア属種、例えばペスト菌、エルジニア小腸結腸炎菌（E.enterocolitica）を含むが、これらに限定されない細菌及びマイコプラスマ因子。病原性：アルテルナリア属種；アスペルギルス属種；ブラストミセス属種、例えばＢ．デルマチチジス；カンジダ属種、例えばカンジダアルビカンス；クラドスポリウム属種；コクシジオイデス属種、例えばＣ．イミチス；クリプトコッカス属種、例えばＣ．ネオフォルマンス；ヒストプラスマ属種、例えばＨ．カプスラーツム；及びスポロトリクス属種、例えばＳ．シェンキイ、を含むが、これらに限定されない真菌及び酵母因子。
【００９１】
１つの実施形態では、病原因子は、病原性：アカントアメーバ属種、アメーバ属種、ネグレリア属種、エントアメーバ属種、例えば赤痢アメーバを含むアメーバ；クリプトスポリジウム属種、例えばＣ．パルブム；シクロスポラ属種；エンセファリトゾーン属種、例えばＥ．インテスティナリス；エンテロシトゾーン属種；ジアルジア属種、例えばランブル鞭毛虫；イソスポラ属種；ミクロスポリジウム属種；プラスモディウム属種、例えば熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫；トキソプラスマ属種、例えばトキソプラスマ原虫；及びトリパノソーマ属種、例えばトリパノソーマブルセイ、を含むが、これらに限定されない原生生物因子由来である。
【００９２】
１つの実施形態では、病原因子は、病原性：回虫属種、例えば回虫；ドラクンクルス属種、例えばメジナ虫；オンコセルカ属種、例えば回旋糸状虫；住血吸虫属種；旋毛虫属種、例えば旋毛虫；及び鞭虫属種、例えばヒト鞭虫、を含むが、これらに限定されない寄生生物因子（例えば蠕虫寄生生物）由来である。
【００９３】
もう１つの実施形態では、病原因子は、病原性：アデノウイルス；アレナウイルス、例えばラッサ熱ウイルス；アストロウイルス；ブンヤウイルス、例えばハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス；コロナウイルス、デルタウイルス；サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ウイルス；フィロウイルス、例えばエボラウイルス、マルブルクウイルス；フラビウイルス、例えばデング熱ウイルス、西ナイル熱ウイルス、黄熱病ウイルス；肝炎ウイルス；インフルエンザウイルス；レンチウイルス、Ｔ細胞リンパ球向性ウイルス、他の白血病ウイルス；ノーウォークウイルス；パピローマウイルス、他の腫瘍ウイルス；パラミクソウイルス、例えば麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、肺炎ウイルス、センダイウイルス；パルボウイルス；ピコルナウイルス、例えばカルジオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、他のエンテロウイルス；ポックスウイルス、例えば痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、パラポックスウイルス；レオウイルス、例えばコルティウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス；ラブドウイルス、例えばリッサウイルス、水泡性口内炎ウイルス；及びトガウイルス、例えば風疹ウイルス、シンドビスウイルス、西部脳炎ウイルス、を含むが、これらに限定されないウイルス因子由来である。
【００９４】
１つの実施形態では、抗原性ペプチドは、イヌパルボウイルスペプチド、炭疽菌防御抗原（ＰＡ）抗原性ペプチド及び東部ウマ脳炎ウイルス抗原性ペプチドから成る群より選択される。特定実施形態では、抗原性ペプチドは、ＰＡ１（配列番号１）、ＰＡ２（配列番号２）、ＰＡ３（配列番号３）又はＰＡ４（配列番号４）から選択されるアミノ酸配列を有する炭疽菌由来ペプチドである。
【００９５】
（宿主細胞毒性ペプチド）
もう１つの特定実施形態では、組換えペプチドは、遊離単量体形態であるとき宿主細胞に対して毒性であるペプチドである。ある実施形態では、ウイルスカプシドと共に発現される対象ペプチドは宿主細胞毒性ペプチドである。宿主細胞毒性ペプチドは、それが発現される宿主細胞に対して、又は宿主細胞がその成員である細胞培養中又は生物中の他の細胞に対して、又は宿主細胞を提供する生物又は種の細胞に対して、生物抑制性、生物致死性又は毒性である生物阻害性ペプチドを指示する。１つの実施形態では、宿主細胞毒性ペプチドは、それが発現される宿主細胞に対して生物抑制性、生物致死性又は毒性である生物阻害性ペプチドである。宿主細胞毒性ペプチドの一部の例は、ペプチド毒素、抗菌ペプチド及び他の抗生物質ペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
（抗菌ペプチド）
もう１つの特定実施形態では、組換えペプチドは、抗菌性ペプチドであるペプチドである。抗菌ペプチドは、例えば抗細菌ペプチド、例えばマガイニン、βデフェンシン、一部のαデフェンシン；カテリシジン；ヒスタチン；抗真菌ペプチド；抗原生動物ペプチド；合成ＡＭＰ；ペプチド抗生物質又はその線状又は前環化オリゴ又はポリペプチド部分；他の抗生物質ペプチド（例えば駆虫性ペプチド、溶血ペプチド、殺腫瘍性ペプチド）；及び抗ウイルスペプチド（例えば一部のαデフェンシン；殺ウイルス性ペプチド；ウイルス感染を阻害するペプチド）を含む。１つの特定実施形態では、抗菌ペプチドは、Ｄ２Ａ２１抗菌ペプチドから成る群より選択される。
【００９７】
（ＶＬＰを発現するときに使用するための細胞）
本発明のウイルスカプシド又はウイルスカプシド融合ペプチドの発現のための宿主として使用する細胞（「宿主細胞」とも称する）は、ウイルスカプシドが細胞の複製又は感染を許容しないものである。１つの実施形態では、ウイルスカプシドは、宿主細胞が由来する細胞の特定種に感染しないウイルスに由来する。例えば、１つの実施形態では、ウイルスカプシドは二十面体植物ウイルスに由来し、ウイルスの天然栄養宿主ではない植物種の宿主細胞において発現される。もう１つの実施形態では、ウイルス種は哺乳動物に感染し、発現系は植物宿主細胞を含む。代替的実施形態では、ウイルスは、カプシド−組換えペプチド融合物を発現するための宿主細胞として使用される特定植物種の栄養ウイルスである。
【００９８】
植物宿主細胞は、維管束植物門、ユーフィロフィタ（Euphyllophyta）、種子植物門又は被子植物門からの植物細胞であり得る。特定実施形態では、植物細胞は、例えば：ヤシ科、例えばココヤシ属、アラブヤシ属；ヤマオイモ科、例えばヤムイモ属；イネ科（Gramineae（Poaceae））、例えばカラスムギ属、オオムギ属、イネ属、キビ属、コムギ属、トウモロコシ属；及びバショウ科、例えばバナナ、の成員を含むが、これらに限定されない単子葉植物である。
【００９９】
代替的実施形態では、植物細胞は、例えば：ヒユ科、例えばアマランサス属、ベタ属、アカザ属；セリ科(Umbelliferae)、例えばダウクス属、パスティナカ属；アブラナ科(Cruciferae)、例えばアラビドプシス属、アブラナ属；キク科、例えばヒマワリ属；ヒルガオ科、例えばイポメア属；ウリ科、例えばスイカ属、キュウリ属、カボチャ属；トウダイグサ科；マメ科(Fabaceae)、例えばダイズ属、ヒラマメ属、ウマゴヤシ属、インゲンマメ属、エンドウ属、シャジクソウ属、ソラマメ属、ササゲ属；アマ科、例えばアマ属；及びナス科、例えばトウガラシ属、トマト属、タバコ属、ナス属を含むが、これらに限定されない双子葉植物の成員である。
【０１００】
特定実施形態では、宿主細胞は、アラディポシス・タリアナ（Aradiposis thaliana）、日本産イチイ（タクスス・クスビダータ）、ニチニチソウ（カサランツス・ロセウス）、ニコチアナ・タバカム、オリザ・サティバ、リコペルシカム・エスキュレンタム、及びダイズ（グリシン・マックス）から成る群より選択される。
【０１０１】
（ＩＩ．核酸構築物）
本発明はさらに、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれることができ、カプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードする非感染性核酸構築物を提供する。融合ペプチドはプロモーター配列と終結配列に作動可能に連結され得る。１つの実施形態では、ａ）組換えペプチドをコードする核酸配列、及びｂ）ウイルスカプシドをコードする核酸配列、を含む植物宿主細胞を形質転換するときに使用するための核酸構築物が提供され、ａ）の核酸とｂ）の核酸は融合タンパク質を形成するように作動可能に連結されており、前記核酸構築物は植物宿主細胞のゲノムに安定に挿入され、植物細胞において発現される。
【０１０２】
ある実施形態では、ベクターは、多数のカプシド又は多数の対象ペプチドについての配列を含み得る。１つの実施形態では、ベクターは、少なくとも２個の異なるカプシド−ペプチドコード配列を含み得る。１つの実施形態では、コード配列は同じプロモーターに連結される。ある実施形態では、コード配列は、内部リボソーム結合部位によって分離される。他の実施形態では、コード配列は、細胞内でのウイルス様粒子の形成を可能にするリンカー配列によって連結される。もう１つの実施形態では、コード配列は異なるプロモーターに連結される。これらのプロモーターは、構成的であるか、又は同じか又は異なる誘導条件によって駆動され得る。もう１つの実施形態では、ゲノム内に挿入されることができ、異なるカプシド−ペプチドの組合せをコードする多数のベクターが提供される。多数のベクターは、構成的であるか又は同じ誘導条件によって駆動されるか又は異なる誘導条件によって駆動されるプロモーターを含み得る。１つの実施形態では、ウイルスカプシドは二十面体ウイルスカプシドに由来する。
【０１０３】
対象ペプチドについてのコード配列は、あらかじめ定められた部位でウイルスカプシド又はカプシドのコード配列に挿入することができる。前記ペプチドはまた、あらかじめ定められていない部位に挿入し、細胞をＶＬＰの生産に関してスクリーニングすることができる。１つの実施形態では、ＶＬＰの形成の間にループとして発現されるように、ペプチドをカプシドコード配列に挿入する。１つの実施形態では、１個のペプチドコード配列をベクター内に含めるが、また別の実施形態では、多数の配列を含める。多数の配列は、コンカテマーの形態、例えば切断可能なリンカー配列によって連結されたコンカテマーの形態であり得る。
【０１０４】
ペプチドは、カプシド内の２つ以上の挿入部位に挿入し得る。それ故、ペプチドは、カプシドの２個以上の表面ループモチーフに挿入し得る；ペプチドはまた、所与のループモチーフ内の多数の部位に挿入し得る。挿入物の個々の機能性及び／又は構造ペプチド、及び／又はペプチド挿入物全体は、切断部位、すなわちタンパク質を切断する又は加水分解する因子がカプシド構造又は集合物の残りの部分からペプチドを分離するように作用し得る部位によって分離され得る。
【０１０５】
ペプチドは、外側に面したループ及び／又は内側に面したループ、すなわちそれぞれカプシドの中心から遠ざかる方向又は中心に向かう方向に面したカプシドのループ内に挿入され得る。カプシドの表面ループ内のいかなるアミノ酸又はペプチド結合も、ペプチドのための挿入部位として役立ち得る。典型的には、挿入部位は、ループのほぼ中央、すなわち折りたたまれたカプシドペプチドの三次構造の中心からほぼ最も遠位の位置で選択される。ペプチドコード配列は、選択されたループのこのほぼ中央に対応するカプシドコード配列の位置に作動可能に挿入され得る。これは、ペプチド挿入部位から下流で合成されるカプシドのペプチド配列のその部分についての読み枠の維持を含む。
【０１０６】
もう１つの実施形態では、ペプチドをカプシドのアミノ末端に挿入することができる。ペプチドは、上述した切断可能リンカーを含む、１又はそれ以上のリンカー配列を通してカプシドに連結することができる。さらにもう１つの実施形態では、ペプチドをカプシドのカルボキシ末端に挿入することができる。ペプチドを、化学的又は酵素的加水分解によって切断され得る１又はそれ以上のリンカー配列を通してカルボキシ末端に連結することができる。１つの実施形態では、ペプチド配列は、アミノ末端とカルボキシ末端の両方で、又は１つの末端と少なくとも１つの内部位置で、例えばその三次元立体配座においてカプシドの表面に発現される位置で、連結される。
【０１０７】
１つの実施形態では、ペプチドは、カウピークロロティックモザイクウイルスからのカプシドに挿入することができる。１つの特定実施形態では、ペプチドは、ＣＣＭＶコートタンパク質のアミノ酸１２９で挿入できる。１つの実施形態では、ペプチド配列は、ＣＣＭＶコートタンパク質のアミノ酸６３、１０２、１１４、１２９又は１６０で挿入することができる。もう１つの実施形態では、ペプチド配列は、ＣＣＭＶコートタンパク質のアミノ酸６０、６１、６２又は６３で挿入することができる。さらにもう１つの実施形態では、ペプチドは、ＣＣＭＶタンパク質のアミノ酸１２９及びアミノ酸６０−６３の両方で挿入できる。
【０１０８】
特定実施形態では、本発明は、ａ）抗原性ペプチドをコードする核酸及びｂ）ウイルスカプシドをコードする核酸を含み、ａ）の核酸とｂ）の核酸が、細胞において発現されたとき融合タンパク質を形成するように作動可能に連結されている、核酸構築物を提供する。核酸構築物を構築する上で有用な他のカプシド及び組換えペプチドは上記に開示されている。
【０１０９】
（プロモーター）
１つの実施形態では、核酸構築物は、カプシド−組換えペプチド融合ペプチドをコードする核酸配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含む。作動可能な結合又は連結は、転写及び何らかの翻訳調節エレメントが、宿主細胞の作用により、調節エレメントが対象配列の発現を指令することができるように前記配列に共有結合している立体配置を指す。代替的実施形態では、カプシド融合タンパク質をコードする核酸構築物は、遺伝子捕獲戦略を利用して宿主細胞天然プロモーターとインフレームで挿入することができる。
【０１１０】
発酵工程では、ひとたび発酵が始まれば、発現系の効率を最大化するために高レベルの生産を得ることが理想的である。プロモーターは転写を開始させ、一般に転写開始部位の１−１００ヌクレオチド上流に位置する。理想的には、プロモーターは大量の組換えペプチド蓄積を可能にするのに十分なほど強力である。
【０１１１】
本発明に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーター又は調節を受けるプロモーターであり得る。当技術分野で使用される有用な調節を受けるプロモーターの一般的な例は、エタノール誘導性プロモーター；鉄欠乏誘導性プロモーター；創傷誘導性プロモーター；及びホルモン誘導性、例えばオーキシン誘導性プロモーターを含む。有用な構成的プロモーターの一般的な例は、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター及びキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターを含む。本発明において有用な他の種類のプロモーターは、組織特異的プロモーター、例えばトウモロコシスクロースシンテターゼ１(Yang el al., 1990)、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１(Vogel et al., 1989)、トウモロコシ光捕集複合体 (Simpson, 1986)、トウモロコシ熱ショックタンパク質 (Odell et al., 1985)、エンドウマメ小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983)、Ｔｉプラスミドマンノピンシンターゼ (Langridge et al., 1989)、Ｔｉプラスミドノパリンシンターゼ (Langridge et al., 1989)、ペチュニアカルコンイソメラーゼ (Van Tunen et al., 1988)、インゲンマメグリシンリッチタンパク質１(Keller et al., 1989)、ＣａＭＶ ３５ｓ転写産物 (Odell et al., 1985) 及びジャガイモパタチン(Wenzler et al., 1989)を含む。好ましいプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓ)プロモーター、イネα−アミラーゼＲＡｍｙ３Ｄプロモーター、及びＳ−Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモーターである。加えて、環境、ホルモン、化学物質及び／又は発生シグナルに応答して調節される多様な植物遺伝子プロモーターが、植物細胞における作動可能に連結された遺伝子の発現のために使用でき、（１）熱(Callis et al., Plant Physiol. 88:965, 1988)、（２）光（例えばエンドウマメｒｂｃＳ−３Ａプロモーター、Kuhlemeier et al., Plant Cell 1:471, 1989;トウモロコシｒｂｃＳプロモーター、 Schaffher and Sheen, Plant Cell 3:997, 1991;又はクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質プロモーター、Simpson et al., EMBO J. 4:2723, 1985)、（３）ホルモン、例えばアブシジン酸 (Marcotte et al., Plant Cell 1:969, 1989)、（４）創傷（例えばｗｕｎＩ、Siebertz et al., Plant Cell 1:961, 1989); 又は（５）化学物質、例えばジャスモン酸メチル、サリチル酸又は薬害軽減剤、によって調節されるプロモーターを含む。また、（６）器官特異的プロモーター（例えば Roshal et al., EMBO J. 6:1155, 1987; Schernthaner et al., EMBO J. 7:1249, 1988; Bustos et al., Plant Cell 1:839, 1989)を使用することも有益である。本発明において有用なさらなるプロモーターは、国際公開公報第ＷＯ９７／４８８１９号に述べられているもの;米国特許第 ５，５９１，６０５号に述べられているファゼオリンプロモーター; 米国特許第５，６４１，８７６号に述べられているイネアクチンプロモーター;国際公開公報第ＷＯ９８／５６９２１号に述べられているｐｅｒ５プロモーター;国際公開公報第ＷＯ００／１２６８１号に述べられているγ−ゼインプロモーター;及び米国特許第６，８２５，００６号、同第６，６６０,９１１号に述べられている他のプロモーター、及びShahmuradov et al. (2003) “PlantProm: a database of plant promoter sequences,” Nucleic Acid Res. 31(1): 114-117の中で述べられており、ｈｔｔｐ：／／ｍｅｎｄｅｌ．ｃｓ．ｒｈｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｍｅｎｄｅｌ．ｐｈｐ？ｔｏｐｉｃ＝ｐｌａｎｔｐｒｏｍにおいて入手可能な、植物プロモーター配列データベースＰｌａｎｔＰｒｏｍに述べられている植物プロモーターを含む。さらなるプロモーターはまた、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター又はその強化型、ハイブリッド（ｏｃｓ）3ｍａｓプロモーター、及びトウモロコシ又はＡ．タリアナからのユビキチンプロモーターを含み得る。
【０１１２】
選択植物宿主細胞にネイティブなプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーターも、標的ペプチドをコードする導入遺伝子の発現を制御するために使用できる。２個以上のプロモーターが、同じか又は異なる配列の、もう１つ別のプロモーターに共有結合している縦列（タンデム）プロモーターも使用し得る。
【０１１３】
ウイルスに由来するヌクレオチド配列を有するプロモーターも、標的ペプチドをコードする導入遺伝子の発現を指令するために使用できる。
【０１１４】
調節を受けるプロモーターは、プロモーターがその一部である遺伝子の転写を制御するためにプロモーター調節タンパク質を利用することができる。調節されるプロモーターをここで使用する場合は、対応するプロモーター調節タンパク質も、本発明に従った発現系の一部である。多くの調節されるプロモーター／プロモーター調節タンパク質の対が当技術分野において公知である。
【０１１５】
（他のエレメント）
他の調節エレメントを発現構築物に含めることができる。そのようなエレメントは、例えば転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、アクチベーター、翻訳開始及び終結シグナル、転写ターミネーター、シストロニック調節因子、ポリシストロニック調節因子、発現されるペプチドの特定、分離、精製又は単離を容易にするタグ配列、例えばヌクレオチド配列「タグ」及び「タグ」ペプチドコード配列、例えばＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、Ｂタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ポリアスパラギン酸、（Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）ｎ、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルコノトランスフェラーゼ、ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネートシチジルトランスフェラーゼ、ｔｒｐＥ又はｔｒｐＬＥ、アビジン、ストレプトアビジン、Ｔ７遺伝子１０、Ｔ４ｇｐ５５、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、ＧＳＴ、ＤＨＦＲ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ガラクトース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、ＧＦＰ、ＫＳＩ、ｃ−ｍｙｃ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ＮｕｓＡ、ユビキチン及びヘモシリンＡ、を含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
１つの実施形態では、核酸構築物は、対象組換えペプチドについてのコード配列に隣接する、又はウイルスカプシドについてのコード配列に連結された、タグ配列をさらに含む。１つの実施形態では、タグ配列はタンパク質の精製を可能にする。タグ配列は、アフィニティータグ、例えばヘキサヒスチジンアフィニティータグであり得る。もう１つの実施形態では、アフィニティータグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ分子であり得る。タグはまた、蛍光分子、例えばＹＦＰ又はＧＦＰ、又はそのような蛍光タンパク質の類似体であり得る。タグはまた、抗体分子の一部、又は精製のために有用な公知の結合パートナーについての公知の抗原又はリガンドであり得る。
【０１１７】
本発明は、カプシド−組換えペプチドコード配列に加えて、それに作動可能に連結された以下の調節エレメント：プロモーター、転写ターミネーター、翻訳開始及び終結シグナルを含み得る。
【０１１８】
翻訳及び転写エレメント、及び本発明において有用な他のエレメントのさらなる例は、JD Watson et al. (eds. ), Recombinant DNA, pp. 273-92 (1992) (Scientific American Books, W. H. Freeman and Co. , New York, NY, USA); and I Mitsuhara et al.,”Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants,”Plant Cell Physiol. 37(1) : 49-59 (1996)に述べられている。
【０１１９】
１つの特定実施形態では、核酸構築物は、ウイルスカプシドタンパク質を導くために使用されるウイルスゲノム核酸配列の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に由来する付加的な核酸配列を含む。１つの特定実施形態では、３’ＵＴＲは、野生型ウイルスにおける翻訳の調節又はカプシド形成において役割を果たす配列を含む。１つの実施形態では、３’ＵＴＲ配列は上流シュードノットドメイン（ＵＰＤ）である。例えばLeathers et al.(1993)”A phylogenetically conserved sequence within viral 3' untranslated RNA pseudolmots regulate stranslation,”Mol. Cell Biol. 13 (9): 5331-5347参照。特定実施形態では、３’ＵＴＲは、ウイルスゲノムのウイルスカプシドコード領域の３’ＵＴＲに由来する。より特定の実施形態では、３’ＵＴＲは、カウピークロロティックモザイクウイルスＲＮＡ３ ３’非翻訳領域に由来する。１つの実施形態では、３’ＵＴＲ配列はカプシド形成シグナルを含む。
【０１２０】
代替的実施形態では、核酸構築物は、ウイルス核酸配列に由来する少なくとも１個のカプシド形成シグナルを含む。カプシド形成シグナルは、ウイルスゲノム配列の５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ又は内部配列に由来し得る。１つの実施形態では、核酸構築物はＶＬＰにおいてカプシド形成される。
【０１２１】
１つの実施形態では、非感染性核酸構築物はまた、ウイルスカプシドタンパク質配列以外のウイルス又は非ウイルス核酸配列に由来する他の配列も含む。
【０１２２】
（ベクター）
宿主細胞ゲノムに安定に組込み、カプシド−組換えペプチド融合ペプチドを発現するとき植物細胞において使用するための有用な発現ベクターは、機能的プロモーターを有する作動可能な読み枠内に、適切な翻訳開始及び終結シグナルと共にカプシドペプチドに融合した所望標的ペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。ベクターはまた、宿主細胞の選択を可能にする１又はそれ以上の表現型選択マーカー又はスクリーニングマーカーを含み得る。あるいは、選択又はスクリーニングマーカーは別のプラスミド上で提供され得る。
【０１２３】
極めて多様なベクター及び／又は担体が、発現のために組換えカプシドをコードする核酸で標的植物宿主細胞を形質転換するために有用であることが当技術分野において公知であり、これらのいずれもが本発明に従った遺伝子を発現するために使用し得る。例えばIJ Goderis IJ et al.,”A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units,”Plant Mol. Biol. 50(1): 17-27 (2002); AH Christensen & PH Quail,”Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonousplants,”Transgenic Res. 5 (3): 213-18 (1996); JD Jones et al., “Effective vectors for transformation, expression of heterologous genes, and assaying transposon excision in transgenic plants,”Transgenic Res. 1 (6): 285-97 (1992); AP Gleave AP,”A versatile binary vector system with a T-DNA organisational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome,”Plant Mol. Biol. 20 (6): 1203-07 (1992)参照。
【０１２４】
それ故、プラスミド、トランスポゾン、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、植物人工染色体及び他の核酸ベクターが使用し得る。使用し得る一部のベクターの例は、ｐＲＴ１０１、ｐＲＴ１０１−ＭＣＳ、ｐＲＴ１０４、ｐＲＴ１０４．２４ＬＳ、ｐＲＴ１０４．Ｎ−ｍｙｃ、ｐＲＴ１０４．Ｃ−ｍｙｃ、ｐＲＴ１０４．Ｎ−３ＨＡ、ｐＲＴ１０４−Ｎ３ＨＡｄＡｓｐ、ｐＲＴ１０４．Ｎ−６ＨＡ、ｐＲＴ１０４−Ｎ６ＨＡｄＡｓｐ、ｐＲＴ１０４．Ｃ−３ＨＡ、ｐＲＴ１０４−ＧＳＴ、ｐＲＴ１０４ ＮＥＳ（Ａ２）、ｐＲＴ１０３−３ＨＡ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−Ｌｕｃｉ（−）、ｐＲＴｄ３５Ｓ−Ｌｕｃｉ−ＮＥＳ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−ＧＦＰ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−ＧＦＰ．ＳａｃＩ、ｐＲＴｄＳ ＧＦＰ．ＢｇｌＩＩ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−Ｄｓ−Ｒｅｄ、ｐＲＴｄ３５Ｓ−プロフィリン、ｐＢＩＧａｌ４ＤＢＤ、ｐＲＴ−３ＨＡｘＨｓｆＡ２ＤＢＤ、ｐＲＴ−３ＨＡｘＧａｌ４ＤＢＤ、ｐＵＣ、ｐＩＬ−ＴＡＢ、ｐＥＴ、ｐＭＥ、ｐＢＢＲ及びｐＲＯＫＩＩを含む。ベクターを細胞に導入するためにパーティクルガンを使用するときは、いかなるＤＮＡプラスミド又はＤＮＡ分子も本発明において使用し得る。
【０１２５】
特定実施形態では、ベクターはｐＩＬ−Ｔａｂである。より特定の実施形態では、ベクターは、カウピークロロティックモザイクウイルス（ＣＣＭＶ）からのコートタンパク質をコードするｐＩＬ−Ｔａｂである。特定実施形態では、ベクターはｐＩＬ−Ｔａｂであり、異種ペプチドは、ＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４から成る群より選択される。さらなる実施形態では、ベクターは、ｐＤＯＷ２１６０（配列番号５）、ｐＤＯＷ２１６１（配列番号６）、ｐＤＯＷ２１６２（配列番号７）、ｐＤＯＷ２１６３（配列番号８）、ｐＤＯＷ２１６９（配列番号９）、ｐＤＯＷ２１７０（配列番号１０）、ｐＤＯＷ２１７１（配列番号１１）及びｐＤＯＷ２１７２（配列番号１２）から成る群より選択される。
【０１２６】
あるいは又はその上に、担体、例えばリポソーム、デンドリマー、カチオン性ポリマー及びカチオン性ポリマー−脂質複合体が使用でき、前記全てが細胞又はプロトプラストへの核酸の送達のために広く公表されている方法において使用されている。あるいは、裸のＤＮＡ又は裸のＲＮＡも植物宿主に送達され得る。
【０１２７】
ベクター、担体又は裸の核酸は、そのために有効であることが当技術分野で公知の何らかの方法によって植物細胞又はプロトプラストに直接形質転換され得る。例えば、組換えカプシドをコードする核酸で植物標的宿主を形質転換するために以下の方法のいずれかを使用し得る：アグロバクテリウム属；V. Vasil et al., Bio/Technology 9, 743 (1991)によって述べられているようなマイクロパーティクルガン法；例えばMC Chupeau et al., Bio/Technology 7,503 (1989)によってレタスに関して述べられているようなプロトプラストの電気穿孔法；例えば炭化ケイ素ウィスカー、ガラス又はカーボランダムを使用する表面研磨法；例えばA. Deshayes et al., EMBO J. 4, p.2731-2737 (1985)によって述べられているようなプロトプラストとのリポソーム融合；細胞−細胞（プロトプラスト−プロトプラスト）融合；及び内因性植物ウイルス感染、すなわち選択植物標的宿主がその天然宿主であるタイプのウイルスであり、ウイルスが組換えカプシド−タンパク質をコードする核酸を含むように工作されている（組換え体が作られるカプシド−タンパク質−核酸が、植物標的宿主がその天然宿主ではないウイルスから選択される）、工作されたベクターによる植物標的宿主の形質転換；例えば I.Potrykus et al., Mol. Gen. Genetics, 197, 183-188 によって述べられているようなポリエチレングリコールを介した形質転換；及び例えばR Griesbach, Biotechnology 3, p. 348-350およびCK Shewmaker Mol. Gen. Genetics, 202 p. 179-185 (1986)によって述べられているような微量注入法。
【０１２８】
（ＩＩＩ．植物細胞におけるカプシド融合産物の発現）
本発明はまた、組換えペプチドを生産するための方法を提供する。その方法は、
ａ）植物細胞を提供すること；
ｂ）組換えペプチドと二十面体カプシドの融合ペプチドをコードする発現カセットを含む非感染性核酸を提供すること；
ｃ）前記植物において前記核酸を発現し、前記細胞における発現が前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること；及び
ｄ）前記ウイルス様粒子を単離すること
を含む。
【０１２９】
融合ペプチドは、プロモーター配列及びターミネーターに作動可能に連結される。１つの実施形態では、前記方法は、ｅ）ウイルスカプシドタンパク質から組換えペプチドを切断すること、をさらに含む。さらにもう１つの実施形態では、前記方法は、ｆ）工程ｅから組換えペプチドを単離すること、をさらに含む。例えば図１参照。
【０１３０】
ペプチドは、カプシドペプチド内で１コピーペプチド挿入物として発現され得る（すなわちペプチドに関してモノシストロニックである組換えカプシドペプチドコード配列から個別挿入物として発現される）か、又は２、３又は多コピーペプチド挿入物として発現され得る（すなわちペプチドに関してポリシストロニックである組換えカプシドペプチドコード配列からコンカテマー挿入物として発現される；コンカテマー挿入物は、同じ外来性対象ペプチドの多数のコピーを含み得るか又は異なる外来性対象ペプチドのコピーを含み得る）。コンカテマーは、ホモ又はヘテロコンカテマーであり得る。
【０１３１】
１つの実施形態では、単離されたウイルス様粒子をワクチン戦略においてヒト又は動物に投与することができる。
【０１３２】
もう１つの実施形態では、核酸構築物を、野生型カプシドをコードするもう１つ別の核酸と共発現することができる。特定実施形態では、共発現されたカプシド／カプシド−組換えペプチド融合粒子は、キメラウイルス様粒子を形成するようにインビボで集合する。キメラＶＬＰは、少なくとも２個の異なる核酸構築物によってコードされるカプシド又はカプシド−ペプチド融合物を含むウイルス様粒子である。
【０１３３】
さらにもう１つの実施形態では、核酸構築物を、異なるカプシド−組換えペプチド融合粒子をコードするもう１つ別の核酸と共発現することができる。特定実施形態では、共発現されたカプシド融合粒子は、キメラウイルス様粒子を形成するようにインビボで集合する。
【０１３４】
さらにもう１つの実施形態では、異なるペプチド、例えばシャペロンタンパク質を発現するように設計された第二核酸を、融合ペプチドをコードする核酸と同時に発現することができる。
【０１３５】
本発明のために有用な植物細胞、カプシド及び組換えペプチドは上記に述べられている。
【０１３６】
１つの実施形態では、発現されるウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物は、細胞において可溶性形態で発現される。
【０１３７】
１つの実施形態では、発現されるウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物は、細胞内でＶＬＰに構築される。
【０１３８】
別の実施形態では、発現される対象ウイルスカプシド−異種ペプチド融合産物の一部は、細胞において不溶性凝集物として形成される。１つの実施形態では、対象ペプチドを不溶性凝集物から復元することができる。
【０１３９】
（対象ペプチドの切断）
１つの実施形態では、前記方法は、ｅ）カプシドから組換えペプチドを分離するために前記融合産物を切断すること、をさらに提供する。
【０１４０】
切断可能な連結配列は、ウイルスタンパク質と組換えペプチドの間に含まれ得る。そのような配列を切断することができる物質の例は、化学試薬、例えば酸（塩酸、ギ酸）、ＣＮＢｒ、ヒドロキシルアミン（アスパラギン−グリシンに関して）、２−ニトロ−５−チオシアノベンゾエート、Ｏ−ヨードソベンゾエート、及び酵素物質、例えばエンドペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、トリプシン、クロストリパイン及びブドウ球菌プロテアーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
切断可能な連結配列は当技術分野において周知である。本発明では、Ａｓｐ−Ｐｒｏなどのジペプチド切断配列を含む、切断物質によって認識されるいかなる切断可能連結配列も使用できる。
【０１４２】
（発現）
本発明の方法は、最適には、所望配列及び立体配座での、宿主植物細胞における所望カプシド−融合産物の生産上昇を導く。生産上昇は、選択的に、生産されるタンパク質のグラム当り又は宿主タンパク質のグラム当り又は生産される総組換えペプチドのパーセンテージとしての、所望ペプチドのレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、組換え体のグラム当り又は宿主細胞タンパク質のグラム当りで生産される回収可能なペプチド、例えば可溶性タンパク質のレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、タンパク質の総レベル上昇と活性又は可溶性レベル上昇の何らかの組合せであり得る。
【０１４３】
組換えタンパク質の改善された発現は、カプシド融合タンパク質としてのタンパク質の発現を通してであり得、その後ＶＬＰに挿入することができる。ある実施形態では、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、又は少なくとも１８０コピーの対象ペプチドが各々のＶＬＰにおいて発現される。ＶＬＰを生産し、宿主細胞の細胞質、ペリプラズム又は細胞外液から回収することができる。
【０１４４】
もう１つの実施形態では、ペプチドは細胞において不溶性であり得る。ある実施形態では、可溶性又は不溶性ペプチドは、多数のカプシドから形成されるが天然型ＶＬＰを形成しない粒子において生産される。例えばわずか３個のウイルスカプシドのケージ構造が形成され得る。ある実施形態では、カプシド構造は２コピー以上の対象ペプチドを含み、ある実施形態では、少なくとも１０、少なくとも２０又は少なくとも３０コピーを含む。ある実施形態では、ペプチドは植物細胞の液胞において形成される。
【０１４５】
ペプチド又はウイルスカプシド配列はまた、１又はそれ以上のターゲティング配列又は精製を助けるための配列を含み得る。これらはアフィニティータグであり得る。これらはまた、カプシドのＶＬＰへの構築を指令するターゲティング配列であり得る。
【０１４６】
（細胞増殖）
ベクターによる植物宿主細胞の形質転換は、当技術分野で公知のいかなる形質転換法を用いて実施してもよく、植物宿主細胞を無傷細胞(intact cells)として又はプロトプラストとして形質転換し得る。例示的な形質転換法は上記に述べられている。
【０１４７】
ここで使用する、「発酵」という用語は、文字通りの発酵を用いる実施形態と、他の非発酵培養法を用いる実施形態の両方を包含する。発酵はいかなる規模で実施してもよい。当技術分野で一般的に知られるいかなる方法も発酵において使用し得る。例えばHellwig et al. (2004) “Plant cell cultures for the production of recombinant proteins, “Nature Biotech 22 (11): 1415-1422; Sajc et al. (2000) “Bioreactors for plant engineering : an outlook for further research, ”Biochem Engin. J. 4: 89-99参照。１つの実施形態では、発酵培地は、何らかの生育可能植物細胞培地から選択され得る。場合により、培地への添加物は、例えばＰＶＰ、ＢＳＡ、ＮａＣｌ、ブレフェルジンＡ、還元マンガン、プルロニック消泡剤、ポリエチレングリコール、ゼラチン、プロテアーゼ阻害剤、酸化還元補因子及びジメチルスルホキシドを含み得る。
【０１４８】
本発明に従った発現系は、いかなる発酵方式でも培養することができる。例えばバッチ、フェドバッチ、半連続、及び連続発酵方式がここで使用し得る。
【０１４９】
本発明に従った発現系は、いかなる規模（すなわち容量）の発酵においても導入遺伝子発現のために有用である。それ故、例えばマイクロリットル規模、センチリットル規模及びデシリットル規模の発酵容量を使用し得る；及び１リットル又はそれ以上の規模の発酵容量が使用できる。１つの実施形態では、発酵容量は１リットル又はそれ以上である。もう１つの実施形態では、発酵容量は、５リットル又はそれ以上、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１，０００リットル、２，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットル又は５０，０００リットルである。
【０１５０】
本発明では、形質転換宿主細胞の増殖、培養及び／又は発酵は、宿主細胞の生存を許容する温度範囲内、好ましくは約４℃から約５５℃（両端を含む）の範囲内の温度で実施される。
【０１５１】
（細胞密度）（充填湿細胞（Packed wet cell））
本発明に従った植物細胞発現系は、約２０ｇ／Ｌ（２％充填細胞量）から５５０ｇ／Ｌ（５５％充填細胞量）より多くまでの細胞密度又は匹敵する充填湿細胞密度を提供することができる。１つの実施形態では、充填細胞量は２％−約６０％である。もう１つの実施形態では、充填細胞量は、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、７０％又は８５％である。
【０１５２】
（ＶＬＰ又は対象ペプチドの単離）
ある実施形態では、本発明は、ウイルスカプシドとの連結及び共発現を通して発現の間ペプチドを保護することにより、対象ペプチドの回収率を改善するための方法を提供する。ある実施形態では、ウイルスカプシド融合は、細胞溶解産物から容易に分離することができるＶＬＰを形成する。
【０１５３】
本発明のタンパク質は、ＰＥＧ沈殿、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィーのような物質による選択的沈殿、免疫精製法等を含むが、これらに限定されない、当技術分野において周知の標準手法によって単離し、実質的純度に精製し得る。例えば確立された分子接着特性を有するタンパク質は、リガンドに可逆的に融合することができる。適切なリガンドを用いて、タンパク質を選択的に精製カラムに吸着させ、その後比較的純粋な形態でカラムから遊離することができる。次に、酵素又は他の作用によって融合タンパク質を取り出すことができる。加えて、免疫アフィニティーカラム又はＮｉ−ＮＴＡカラムを用いてタンパク質を精製することができる。一般的な手法は、例えばR. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: N. Y. (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990);米国特許第４，５１１，５０３号; S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al., Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18 (2): p/182-92 (2000);およびR. Mukhija, et al., Gene 165 (2): p. 303-6 (1995)において詳述されている。また、例えばAusubel, et al.(1987 and periodic supplements); Deutscher (1990) “Guide to Protein Purification, “Methods in Enzymology vol.182及びこのシリーズの他の巻; Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY ;及びタンパク質精製産物の使用に関する製造者の文献、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．又はＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．も参照のこと。組換え手法の併用は、適切なセグメント、例えばＦＬＡＧ配列又はプロテアーゼ−除去可能配列によって融合できる等価物、への融合を可能にする。また、例えばHochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) “Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent”in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenum Press, NY;およびCrowe, et al.(1992) QIAexpress : The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.も参照のこと。
【０１５４】
同様に、ウイルス様粒子又はケージ様構造も、当技術分野で周知の標準手法によって単離し、実質的純度に精製することができる。ＶＬＰの単離のための手法は、上述したものに加えて、沈殿法、例えばポリエチレングリコール又は塩沈殿法を含む。分離手法は、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、免疫精製法、遠心分離、超遠心分離、密度勾配遠心分離（例えばスクロース又は塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配で）、サイズ排除フィルターを通しての限外ろ過、及び当技術分野で公知の何らかの他のタンパク質単離法を含む。
【０１５５】
本発明はまた、活性組換えペプチドの回収率を改善することができる。活性タンパク質のレベルは、例えば特定されたペプチドと親ペプチド、ペプチド変異体、セグメント置換ペプチド及び／又は残基置換ペプチドの間の相互作用を従来の何らかのインビトロ又はインビボアッセイで測定することによって測定できる。そこで、インビトロアッセイは、特定されたタンパク質と対象ペプチドの間、例えば酵素と基質の間、ホルモンとホルモン受容体の間、抗体と抗原の間等の、何らかの検出可能な相互作用を測定するために使用できる。そのような検出は、比色変化、放射能の変化、溶解度の変化、ゲル電気泳動及び／又はゲル排除法によって測定したときの分子量の変化等の測定を含み得る。インビボアッセイは、生理的作用、例えば体重増加、電解質バランスの変化、血液凝固時間の変化、血餅溶解の変化及び抗原応答の誘導を検出するアッセイを含むが、これらに限定されない。一般に、特定されたペプチドと対象ペプチドの間の相互作用の変化を検出するための可変パラメータが存在する限り、いかなるインビボアッセイも使用することができる。例えば米国特許第５，８３４，２５０号参照。
【０１５６】
発現されたタンパク質の検出は、当技術分野で公知の方法によって達成され、例えば放射免疫測定法、ウエスタンブロット法又は免疫沈降法を含む。
【０１５７】
初期塩分画は、望ましくない宿主細胞タンパク質（又は細胞培養培地に由来するタンパク質）の多くを対象組換えタンパク質から分離することができる。１つのそのような例は硫酸アンモニウムであり得る。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水分量を有効に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。タンパク質はその後、それらの溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質がより疎水性であるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的なプロトコールは、生じる硫酸アンモニウム濃度が２０−３０％になるように飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することを含む。この濃度は最も疎水性のタンパク質を沈殿させる。次に沈殿物を廃棄し（対象タンパク質が疎水性でない限り）、対象タンパク質を沈殿させることが既知である濃度まで硫酸アンモニウムを上清に添加する。次に沈殿物を緩衝液に溶解し、必要に応じて、透析又はダイアフィルトレーションのいずれかを通して過剰の塩を除去する。タンパク質の溶解度に基づく他の方法、例えば低温エタノール沈殿は当業者に周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用できる。
【０１５８】
組換えタンパク質の分子量を利用して、異なる細孔径の膜（例えばアミコン又はミリポア膜）を通す限外ろ過を用いてより大きい及びより小さいサイズのタンパク質から単離することができる。第一段階として、タンパク質混合物を、対象タンパク質の分子量よりも低い分子量カットオフ値を有する細孔径の膜を通して限外ろ過することができる。限外ろ過の保持物質を、次に、対象タンパク質の分子量よりも大きい分子量カットオフ値を有する膜に対して限外ろ過することができる。組換えタンパク質は膜を通過してろ液中に入る。その後ろ液をクロマトグラフィーに供することができる。
【０１５９】
組換えタンパク質はまた、その大きさ、正味表面電荷、疎水性、及びリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することができる。加えて、タンパク質に対して惹起される抗体をカラムマトリックスに結合（固定化）し、タンパク質を免疫精製することができる。これらの方法は全て当技術分野において周知である。クロマトグラフィー手法が、いかなる規模でも及び多くの異なる製造者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの装置を使用して実施できることは当業者には明白である。
【０１６０】
（復元及びリフォールディング）
二次及び三次タンパク質構造立体配座を生成するために不溶性タンパク質を復元又はリフォールディングすることができる。タンパク質リフォールディング工程は、必要に応じて、組換え産物の立体配置を完成させるときに使用できる。リフォールディング及び復元は、タンパク質の解離／会合を促進する当技術分野で公知の物質を用いて実施することができる。例えばタンパク質をジチオトレイトールと共にインキュベートし、次に酸化グルタチオンニナトリウム塩と共にインキュベートして、さらにその後リフォールディング剤、例えば尿素を含む緩衝液と共にインキュベートすることができる。
【０１６１】
組換えタンパク質はまた、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することによっても復元できる。あるいは、タンパク質を、カラム、例えばＮｉ ＮＴＡカラムに固定化して、プロテアーゼ阻害因子を含有する、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール及び２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の６Ｍ−１Ｍ 尿素直線勾配を使用することによって再生できる。復元は１．５時間又はそれ以上の期間で実施できる。復元後、２５０ｍＭ イミダゾールの添加によってタンパク質を溶出することができる。イミダゾールは、ＰＢＳ又は５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終透析工程によって除去することができる。精製タンパク質は、室温、４℃で保存するか又は−２０℃から−８０℃で凍結して保存することができる。
【０１６２】
他の方法は、例えばMH Lee et al., Protein Expr. Purif., 25(1) : p. 166-73 (2002), W. K. Cho et al. , J. Biotechnology, 77 (2-3): p. 169-78 (2000), Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements), Deutscher (1990) “Guide to Protein Purification, “Methods in Enzymology vol. 182, and other volumes in this series, Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY, S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al. , Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996)に述べられているものを含む。
【０１６３】
（活性ペプチド分析）
活性タンパク質は、その配列が由来する天然ペプチドの活性の少なくとも２０%、３０％又は４０%、好ましくは少なくとも５０%、６０％又は７０%、最も好ましくは少なくとも８０%、９０％又は９５%の比活性を有し得る。さらに、基質特異性（Ｋcat／Ｋm）は、場合により天然ペプチドと実質的に同様である。典型的には、Ｋcat／Ｋmは、天然ペプチドの少なくとも３０%、４０％又は５０%、より好ましくは少なくとも６０%、７０％、８０％又は９０%である。タンパク質及びペプチドの活性及び基質特異性（Ｋcat／Ｋm）を検定する方法及び定量手段は当業者に周知である。
【０１６４】
本発明に従って生産される組換えペプチドの活性は、当技術分野で公知の何らかのタンパク質特異的な慣例的又は標準的インビトロ又はインビボアッセイによって測定することができる。組換えタンパク質が、同じ又は類似の生理的条件下で天然ペプチドにおいて一般に認められる活性と実質的に類似又は同等の活性を示すかどうかを判定するために、植物細胞宿主が生産する組換えペプチドの活性を、対応する天然タンパク質の活性と比較することができる。
【０１６５】
組換えペプチドの活性を、これまでに確立された天然ペプチド標準活性と比較することができる。あるいは、組換えペプチドの活性を、天然ペプチドと同時又は実質的に同時の比較アッセイにおいて測定することができる。例えばインビトロアッセイを使用して、組換えペプチドと標的の間、例えば発現される酵素と基質の間、発現されるホルモンとホルモン受容体の間、発現される抗体と抗原の間等の、検出可能な相互作用を測定することができる。そのような検出は、比色変化、増殖変化、細胞死、細胞反発、放射能の変化、溶解度の変化、ゲル電気泳動及び／又はゲル排除法によって測定したときの分子量の変化、リン酸化能、抗体特異性アッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイ等の測定を含み得る。加えて、インビボアッセイは、天然ペプチドの生理的作用、例えば抗原応答の誘導と比較して、植物宿主細胞が生産するペプチドの生理的作用を検出するアッセイを含むが、これらに限定されない。一般に、いかなるインビトロ又はインビボアッセイも、そのような活性が検定可能である限り、天然ペプチドとの比較分析を可能にする組換えペプチドの活性を測定するために使用できる。あるいは、本発明において生産されるペプチドは、ペプチドと、通常そのペプチドと相互作用する分子、例えば基質又は天然タンパク質が通常相互作用するシグナル経路の成分、との間の相互作用を刺激する又は阻害する能力に関して検定することができる。そのようなアッセイは、典型的には、ペプチドが標的分子と相互作用することを許容する条件下でタンパク質と基質分子を組み合わせる工程を含み、タンパク質と標的分子の相互作用の生化学的結果を検出することができる。
【０１６６】
ペプチド活性を測定するために使用できるアッセイは、例えばRalph, P. J., et al. (1984) J. Immunol. 132:1858 or Saiki et al. (1981) J. Immunol. 127: 1044, Steward, W. E.II (1980) The Interferon Systems. Springer-Verlag, Vienna and New York, Broxmeyer, H. E., et al. (1982) Blood 60: 595, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds. , 1989, and “Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques”, Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987, AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18 (2):p/182-92 (2000), Kodama et al., J. Biochem. 99: 1465-1472 (1986); Stewart et al., Proc.Nat'1 Acad. Sci. USA 90: 5209- 5213 (1993); (Lombillo et al., J. Cell Biol. 128: 107-115 (1995); (Vale et al., Cell 42: 39-50 (1985) に述べられている。
【実施例】
【０１６７】
コートタンパク質をコードする核酸のウイルスソース
以下の実施例では、カウピークロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）を所望組換えペプチドの発現のためのコートタンパク質のソースとして使用した。ＣＣＭＶは、ブロモウイルス科ブロモウイルス群の成員である。ブロモウイルスは、４成分のプラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する直径２５−２８ｎｍの二十面体ウイルスである。ＲＮＡ１及びＲＮＡ２はレプリカーゼ酵素をコードする。ＲＮＡ３は、植物宿主内のウイルス運動に関与するタンパク質をコードする。ＲＮＡ４（ＲＮＡ３に由来するサブゲノムＲＮＡ）、すなわちｓｇＲＮＡ４は、２０ｋＤａのコートタンパク質（ＣＰ）（配列番号１３）（表１）をコードする。各々のＣＣＭＶ粒子は、１８０コピーのＣＣＭＶ ＣＰを含む。ＣＣＭＶ ＣＰをコードする例示的ＤＮＡ配列を配列番号１４（表２）に示す。
【表１】
【表２】
【０１６８】
ＣＣＭＶの結晶構造を解明した。この構造は、粒子の溶解度と動力学にとって決定的に重要であると思われるコートタンパク質相互作用のより明瞭な像を提供し、挿入部位の合理的設計を導くのに有用であった。これまでの試験は、ＣＣＭＶコートタンパク質を、粒子を形成するそれらの能力を妨げることなく異種ペプチドを担持するように遺伝的に修飾できることを明らかにした。多くの適切な挿入部位が特定されている。合計約１８０コピーまでの異種ペプチド単位（個々のペプチド単位として又はコンカテマー単位内で）を、ＣＣＭＶ ＣＰ内の単一挿入部位でＣＣＭＶ粒子に挿入することができる。現在までにＣＣＭＶ ＣＰ内で特定された挿入部位は、様々な長さのペプチドを収容することができる。
【０１６９】
実験材料及び方法
異なる記載がない限り、分子生物学の分野において公知の標準手法、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントを、核酸操作、形質転換及び発現のために使用する。そのような標準手法、ベクター及びエレメントは、例えばAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) ; Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques(1987) (Academic Press); and Bukhari et al. (eds. ), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)に見出すことができる。
【０１７０】
異なる記載がない限り、ＰＣＲ反応は、以下のプロトコールに従ってＰＴＣ２２５サーモサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した：
【表３】
【０１７１】
（実施例１）ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２及びキメラＲＮＡ３を接種したカウピー全植物体におけるＣＣＭＶウイルス粒子内での抗原性ペプチドの生産
カウピークロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）を、４個の異なる抗原性ペプチドの１個を含むように工作したカプシドタンパク質（ＣＰ）と共に使用して、炭疽菌抗原性ペプチドの発現を全植物体において実施した。
【０１７２】
ＣＣＭＶ ＲＮＡ１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ及びＣＣＭＶ ＲＮＡ２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、Ｔ７プロモーターの下流でその制御下に、及びユニークＸｂａＩ部位の上流で、クローニングベクターｐＵＣ１９に各々別々にサブクローニングした。これはプラスミドｐＤＯＷ２１２２（ＣＣＭＶ ＲＮＡ１）及びｐＤＯＷ２１２３（ＣＣＭＶ ＲＮＡ２）を生産した。
【０１７３】
５つのＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を含むように工作した、ＣＣＭＶ ＲＮＡ３のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、組換えカプシドタンパク質をコードする核酸の生産のためにさらに工作した。各々が、４個の外来性ペプチド（炭疽菌防御抗原ＰＡからの４個の異なる抗原性ペプチド）の異なる１個をコードする４個のＤＮＡ分子を、各々合成オリゴヌクレオチドのＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）（splicing-by-overlap-extension）によって合成した。生じた核酸はＢａｍＨＩ認識部位末端を含んだ。各々のＰＡ ＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩ制限酵素で制限し、ＣＣＭＶコートタンパク質コード配列内の５つの異なる工作制限工切断部位の１つでコートタンパク質に独立して挿入した：コドン６３のＢａｍＨＩ、コドン１０２のＢａｍＨＩ、コドン１１４のＢａｍＨＩ、コドン１２９のＢａｍＨＩ、コドン１６０のＢａｍＨＩ。
【０１７４】
４個の異なるペプチドは、ＰＡ１（配列番号１５によってコードされる配列番号１）、ＰＡ２（配列番号１６によってコードされる配列番号２）、ＰＡ３（配列番号１７によってコードされる配列番号３）及びＰＡ４（配列番号１８によってコードされる配列番号４）であった。
【表４】
【０１７５】
これらの各々を、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化して、その後脱リン酸化しておいた５個のプラスミド：ｐＤＯＷ２１２５（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ６３ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２６（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−１０２ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２７（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１１４ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２８（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ）及びｐＤＯＷ２１２９（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１６０ＢａｍＨＩ）、の各々に挿入した。
【０１７６】
これは、「キメラＲＮＡ３」についての合計２０の異なる型のＤＮＡを生産した。プラスミドｐＤＯＷ２１３５（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ６３ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）、ｐＤＯＷ２１３９（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−１０２ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）、ｐＤＯＷ２１４３（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１１４ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）、ｐＤＯＷ２１４７（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）及びｐＤＯＷ２１５１（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１６０ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）は、６３、１０２、１１４、１２９及び１６０の位置にＰＡ１挿入物を有するキメラＲＮＡ３の例である。野生型ＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＲＮＡ３及びＢａｍＨＩ制限部位を含むが挿入物を含まない工作したＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＲＮＡを対照として使用した。各々の修飾ＲＮＡ３構築物を、Ｔ７プロモーターの下流でその制御下に、及びユニークＸｂａＩ部位の上流で、クローニングベクターｐＵＣ１９に別々にサブクローニングした。
【０１７７】
３つのクラスのプラスミドの各々を大腸菌にクローニングした。プラスミドを単離し、ＸＢａＩ制限酵素消化によって線状化して、次にＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｋｉｔ（ＲＮＡ転写キット、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡより）を用いて各々１μｇをインビトロでＲＮＡに転写した。これは２４個の異なるＲＮＡ種：ＲＮＡ１について１個、ＲＮＡ２について１個、キメラＲＮＡ３について２０個、及びＲＮＡ３対照について２個、を生産した。
【０１７８】
カウピー植物に感染させるためにＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３又はＰＡ挿入物を含むキメラＲＮＡ３のカクテル混合物を使用した。カウピー植物を、カウピーカリフォルニアブラックアイＮｏ．５種子(Ｆｅｒｒｙ−Ｍｏｒｓｅ Ｓｅｅｄ Ｃｏ．ＫＹ)から発芽させた。新芽を、Ｍｉｒａｃｌｅ−Ｇｒｏ鉢植え混合物（Ｍｉｒａｃｌｅ−Ｇｒｏ Ｌａｗｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＯＨ）と共に１つずつ６インチの鉢に移植した。２葉期（発芽後約７日目）にカウピー植物を感染させた。各々の植物の１枚の葉にカーボランダム（Carborundum）粉末４００粗粒（ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４０９−２１−２）の散粉を実施した。カーボランダム層にＲＮＡカクテル混合物を適用した。手袋をはめた指で静かにこすって葉を削り取った。接種後７−１４日で感染が確認された。
【０１７９】
意外にも、この全植物体系では、天然宿主植物を使用したにもかかわらず、キメラコートタンパク質は野生型に復帰するか、又は一部の場合は、所望外来性抗原ペプチドが部分的に欠失した。これはウイルス子孫の配列決定によって確認された。ＲＮＡを抽出し、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１１４６−０２４）及びＣＣＭＶＲＮＡ４．Ｒ遺伝子特異的プライマー（配列番号１９） （５’−ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＣＧＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＧ−３’）を用いてＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを、プライマーＣＣＭＶＲＮＡ４．Ｆ（配列番号２０）（５’−ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＣＡ ＧＴＣ ＧＧＡ ＡＣＡ ＧＧ−３’）及びＣＣＭＶＲＮＡ４．Ｒを使用するＰＣＲによってさらに増幅した。反応物を精製し、ＣＣＭＶ−ＣＰ−Ｆ１プライマー（配列番号２１）（５’−ＡＡＣ ＣＣＡ ＴＣＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＡ−３’）で配列決定した。配列をシーケンサーソフトウエアバージョン４．０．５（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で分析した。例えばＰＡ１挿入物を含むｐＤＯＷ２１２８に由来するＲＮＡ３子孫を配列決定すると、 コートタンパク質は、ＰＡ１挿入物アミノ酸配列の代わりにＲＩＳＤＰＬとして翻訳された、小さな認識されないヌクレオチド挿入物（５’−ＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＣＴＣ−３’）を含んだ。挿入したヌクレオチド配列はコートタンパク質の残りの部分をインフレームで保持した。工作ＣＣＭＶ ＲＮＡ３は、全植物における発現時に不安定であり、容易に組換えを受け、全植物体系はキメラＣＣＭＶウイルス粒子上のエピトープの生産のために有用ではないと判定された。
【０１８０】
（実施例２）ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２及びキメラＲＮＡ３を接種したタバコ懸濁培養中のＣＣＭＶウイルス粒子における抗原性ペプチドの生産
同じＣＣＭＶ−ペプチドをコードする構築物の発現を植物細胞懸濁培養において実施した。ニコチアナ・タバカムＮＴ１細胞を、キメラＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＣＣＭＶ ＲＮＡ３及びレプリカーゼ遺伝子をコードするＣＣＭＶ ＲＮＡ１及び２のＲＮＡ転写産物での電気穿孔によってトランスフェクトした。野生型ＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＲＮＡ３及び適切なＢａｍＨＩ制限部位を含むが挿入物を含まない工作したＣＣＭＶコートタンパク質をコードするＲＮＡ３を対照として使用した。
【０１８１】
２４個の異なるＲＮＡ種：ＲＮＡ１について１個、ＲＮＡ２について１個、キメラＲＮＡ３について２０個、及びＲＮＡ３対照について２個を、実施例１で述べたようなインビトロＲＮＡ転写によって得た。２２個の異なる群において、３個の生じたＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及びＲＮＡ３の１個）の各々２μｇを電気穿孔法によってタバコ細胞に形質転換した。
【０１８２】
以下のプロトコールを植物細胞トランスフェクションのために使用した：
１）培地の調製：
ＮＴＩ培地（１リットル）：
ムラシゲ＆スクーグ基礎塩４．３３ｇ（Ｐｈｙｔｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＫＳカタログ番号Ｍ５２４）ミオ−イノシトール１００ｍｇ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｉ−３０１１）、塩酸チアミンの１ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ−３９０２）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）１８０ｍｇ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−８４１６）、スクロース３０ｇ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ−５３９０）、及び１０ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ溶液２００μｌ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ−７２９９）を少量の水中で混合した。精製水を前記溶液に添加して容量を１リットルにした。ｐＨを５．８に調整し、溶液を加圧滅菌した。
【０１８３】
マンニトール洗浄液０．４Ｍ：
マンニトール３６．４３ｇ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ−１９０２）を少量の精製水に添加した。精製水を添加して容量を５００ｍｌにし、ｐＨを５．５に調整した。滅菌するために溶液をオートクレーブに入れた。
【０１８４】
酵素溶液：
０．４Ｍ マンニトール及び０．０２Ｍ ＭＥＳを少量の水中で混合した。精製水を添加して容量を５００ｍｌにし、ｐＨを５．５に調整した。滅菌するために溶液をオートクレーブに入れ、溶液を４℃で保存した。使用前に、１％セルライシン（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号２１９４６６）及び０．３％マセラーゼペクチナーゼ（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号４４１２０１）を溶液に添加し、セルライシンとマセラーゼペクチナーゼが溶解するまで溶液を振とうした。
【０１８５】
電気穿孔緩衝液：
０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣ１、０．０２％ＫＨ2ＰＯ4及び０．１１％Ｎａ2ＨＰＯ4を少量の精製水に添加した。精製水を添加して溶液を１００ｍｌにし、ｐＨを６．５に調整した。緩衝液を加圧滅菌し、４℃で保存した。
【０１８６】
２）タバコ細胞部分消化プロトコール：
タバコ細胞系ＮＴ１を電気穿孔の前に以下のように部分消化した。週に１回継代培養することによって強固な細胞系を維持し、細胞を、静かに振とうしながらＮＴ１培地において２４℃又は２８℃で増殖させ、消化の３日前に、細胞懸濁液５ｍｌをＮＴ１培地５０ｍｌに継代培養して２８℃でインキュベートした。細胞を５０ｍｌチューブにおいて８００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させた。酵素溶液を調製し、細胞をマンニトール洗浄液（約４０ｍｌ）で洗った。細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心し、３容の酵素溶液を細胞に添加した。倒置して細胞を再懸濁し、１０ｃｍペトリ皿に注ぎ入れて移し、皿をアルミニウム箔に包んで６０−１２０分間、室温で非常に緩やかに振とうした。次に細胞を５０ｍｌプラスチックチューブに戻し、８００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞をマンニトール洗浄液４０ｍｌで洗い、再び遠心して、電気穿孔緩衝液で洗浄し、遠心した。３容の電気穿孔緩衝液（総容量は通常２０ｍｌである）を細胞に添加した；細胞をアルミニウム箔に包んで４℃で保存した。
【０１８７】
部分消化した細胞の電気穿孔プロトコール：
消化した細胞１ｍｌをアリコートに分けて電気穿孔キュベットに入れた（４ｍｍ間隔）。各々のＲＮＡ転写産物２μｇ−ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２及びキメラＲＮＡ３−をキュベットに添加し、５分間氷上に置いた。ＮＴ１平板培養培地１０ｍｌ（ＮＴ１＋０．４Ｍ マンニトール）を各々のペトリ皿に添加した。細胞を５００μＦ、２５０Ｖで電気穿孔し、キュベットを氷上に戻した。次に細胞をペトリ皿に移し、暗所で振とうせずに室温でインキュベートした。トランスフェクション後４８時間目に分析のために細胞を収集した。
【０１８８】
結果
キメラコートタンパク質の発現を、抗ＣＣＭＶコートタンパク質ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によって分析した。また、各々の培養物からＲＮＡを抽出し、キメラＣＣＭＶ ＲＮＡ４をｃＤＮＡに逆転写して、それをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を実施例１で述べたように配列決定した。ＲＮＡ１及び２だけでトランスフェクトした陰性対照を除いて、全ての試料がウエスタンブロット法で陽性であった。
【０１８９】
対照ＣＣＭＶカプシドタンパク質と比較して、キメラコートタンパク質はより大きなサイズとゲル上でのより緩慢な運動性を有しており、キメラコートタンパク質がＰＡ挿入物を含むことを示した。これは、ウイルスＲＮＡ子孫の配列決定によって確認された。結果は、２０個のキメラ構築物のうち１９個が、所望抗原ペプチド内に突然変異を含むことなく正しくキメラＣＣＭＶコートタンパク質を発現したことを明らかにした。この結果は、懸濁細胞において発現されたキメラＣＣＭＶ ＲＮＡ３が安定であることを示す。
【０１９０】
図２は、ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及びｐＤＯＷ２１２５（ＣＣＭＶ６３ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２６（ＣＣＭＶ１０２ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２７（ＣＣＭＶ−１１４ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２８（ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ）及びｐＤＯＷ２１２９（ＣＣＭＶ１６０ＢａｍＨＩ）から転写されたＲＮＡ３でトランスフェクトした細胞におけるＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。結果は、ＣＰ内の異なる位置に工作ＢａｍＨＩ部位を有する全てのＲＮＡ３からＣＣＭＶ ＣＰが発現されることを明らかにする。
【０１９１】
６３、１０２、１１４、１２９及び１６０ＢａｍＨＩ部位でＣＣＭＶコートタンパク質に融合した全てのＰＡペプチド（ＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３及びＰＡ４）が、タバコ細胞において成功裏に生産された。図３及び図４は、ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及び６３、１０２、１１４、１２９及び１６０位に４個のＰＡペプチド挿入物を有するＣＰを含むキメラＲＮＡ３でトランスフェクトした細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。図３は、あらかじめ６３、１０２又は１１４位に挿入されたＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４ペプチドを有するＣＣＭＶ ＣＰの融合タンパク質が、６３位でＣＣＭＶ ＣＰに挿入されたＰＡ２ペプチドを除き、タバコ植物細胞において発現されることを明らかにする。図４は、１２９又は１６０位に挿入されたＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４ペプチドを有するＣＣＭＶ ＣＰの融合タンパク質がタバコ植物細胞において発現されることを示す。
【０１９２】
（実施例３）キメラＣＣＭＶ ＣＰをコードする植物発現プラスミドでトランスフェクトしたタバコ懸濁培養中のＣＣＭＶウイルス様粒子における４つの抗原性ペプチドの生産
【０１９３】
１）ベクターの構築：
プラスミドｐＩＬ−Ｔａｂ３５８を植物発現ベクターとして使用した。ＣＣＭＶ ＣＰ挿入のために選択した制限部位はＸｂａＩとＥｃｏＲＩであった。このプラスミドは、ＸｂａＩ部位の上流にキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター及びＥｃｏＲＩ部位の下流にＮｏｓターミネーターを含む。前記ベクターは、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化した後、挿入物と連結することによって作製した。
【０１９４】
２）挿入物の構築：
ＣＣＭＶ ＣＰ−ＰＡ融合物を、プライマーＣＣＭＶ−ＣＰ−ＸｂａＩ（配列番号２２）及びＣＣＭＶ−ＣＰ−ＥｃｏＲＩ（配列番号２３）を使用してｐＤＯＷ２１４７（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）、ｐＤＯＷ２１４８（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ２）、ｐＤＯＷ２１４９（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ３）、ｐＤＯＷ２１５０（ｐＵＣ−ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ４）からＰＣＲによって増幅し、ｐＤＯＷ２１６０（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ１）（配列番号５）、ｐＤＯＷ２１６１（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ２）（配列番号６）、ｐＤＯＷ２１６２（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ３）（配列番号７）及びｐＤＯＷ２１６３（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＣＭＶ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ４）（配列番号８）を作製した。ｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３についてのプラスミド地図を図５、６、７及び８に示す。
【０１９５】
３）植物細胞トランスフェクション：
植物細胞をプラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３ １０μｇでトランスフェクトした。植物細胞トランスフェクションは実施例２におけるように実施した。
【０１９６】
結果
１２９ＢａｍＨＩ部位の４つのＰＡペプチド−ＣＣＭＶ ＣＰ融合物全てがタバコ細胞において成功裏に発現された。図９は、ｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３でトランスフェクトした細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。対照（挿入物を含まないＣＣＭＶコートタンパク質）と比較して、４つのキメラコートタンパク質全てが、ＰＡ挿入物を有することを表すより緩慢な運動性を示した。
【０１９７】
（実施例４）キメラＣＣＭＶ ＣＰ及び３’ＵＴＲ（ＣＣＭＶ ＲＮＡ３ ３’非翻訳領域）をコードする植物発現プラスミドでトランスフェクトしたタバコ懸濁培養中のウイルス様粒子におけるＣＣＭＶ ＣＰ融合物としての４つの抗原性ペプチドの生産
１）ベクターの構築：
プラスミドｐＩＬ−Ｔａｂ３５８を植物発現ベクターとして使用した。ＣＣＭＶ ＣＰ挿入のために選択した制限部位はＸｂａＩとＥｃｏＲＩであった。このプラスミドは、ＸｂａＩ部位の上流にキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター及びＥｃｏＲＩ部位の下流にＮｏｓターミネーターを含む。前記ベクターは、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化した後、挿入物と連結することによって作製した。
【０１９８】
２）挿入物の構築：
ＲＮＡ３の３’ＵＴＲを含むＣＣＭＶ ＣＰ−ＰＡ融合物を、プライマーＣＣＭＶ−ＣＰ−ＸｂａＩ及びＣＣＭＶ−ＣＰ−ＥｃｏＲＩ−３’ＵＴＲ（配列番号２４）を使用してｐＤＯＷ２１４７、ｐＤＯＷ２１４８、ｐＤＯＷ２１４９及びｐＤＯＷ２１５０からＰＣＲによって増幅し、ｐＤＯＷ２１６９（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ１−３’ＵＴＲ）（配列番号９）、ｐＤＯＷ２１７０（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ２−３’ＵＴＲ）（配列番号１０）ｐＤＯＷ２１７１（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ３−３’ＵＴＲ）（配列番号１１）及びｐＤＯＷ２１７２（ｐＩＬ−Ｔａｂ−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ−ＰＡ４−３’ＵＴＲ）（配列番号１２）を作製した。
【０１９９】
３）植物細胞トランスフェクション：
植物細胞をプラスミドｐＤＯＷ２１６９、ｐＤＯＷ２１７０、ｐＤＯＷ２１７１及びｐＤＯＷ２１７２ １０μｇでトランスフェクトした。植物細胞トランスフェクションは実施例２におけるように実施した。
【０２００】
結果
３’ＵＴＲを含む１２９ＢａｍＨＩ部位の４つのＰＡペプチド−ＣＣＭＶ ＣＰ融合物全てがタバコ細胞において成功裏に発現された。図１０は、ｐＤＯＷ２１６９、ｐＤＯＷ２１７０、ｐＤＯＷ２１７１及びｐＤＯＷ２１７２でトランスフェクトした細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。対照（挿入物を含まないＣＣＭＶコートタンパク質）と比較して、４つのキメラコートタンパク質全てが、ＰＡ挿入物を有することを表すより緩慢な運動性を示した。
【０２０１】
（実施例５）キメラＣＣＭＶ ＣＰをコードする植物発現プラスミドでトランスフェクトしたトランスジェニックタバコ懸濁培養中のウイルス様粒子におけるＣＣＭＶ ＣＰ融合物としての４つの抗原性ペプチドの生産
タバコ細胞系ＮＴ１を、週に１回継代培養することによって維持した。細胞を、静かに振とうしながらＮＴ１培地において２４℃又は２８℃で増殖させた。トランスフェクションの３日前に、細胞懸濁液５ｍｌをＮＴ１培地５０ｍｌに継代培養して２８℃でインキュベートした。
【０２０２】
１）パーティクルガンによる植物細胞形質転換：
プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２、ｐＤＯＷ２１６３及びキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターによって駆動される植物選択マーカーＰａｔを含む植物発現プラスミドｐＢＢＶ（ｐＢＢＶ）を、マイクロパーティクルガン法によるＮＴ１タバコ細胞形質転換のために使用した。使用したプラスミド比は、１：６ ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６０、ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６１、ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６２又はｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６３であった。合計５μｇのプラスミドＤＮＡは、６回のパーティクルガン法のために十分であった。Chen, L et al. Plant Cell Reports (1998) 18: 25-31 に述べられているＢｉｏｒａｄパーティクルガンプロトコールを形質転換のために使用した。
【０２０３】
２）プレーティング
パーティクルガンを打ち込んだ細胞を、非選択的ＮＴ１培地寒天プレートに４時間移した後、２５μｇ／ｍｌのグルフォシネート−アンモニウム（Ｓｉｇｍａカタログ番号４５５２０）を含むＮＴ１培地寒天プレートに移した。
【０２０４】
３）トランスジェニックカルスの選択
２１日後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、ＣＰ融合物の発現を調べるためのウエスタンブロット法及びプロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットの植物ゲノムへの組込みを調べるためのＰＣＲによる分析のために選択した。キメラＣＣＭＶ ＣＰを発現するトランスジェニックカルスをＮＴ１液体培地に移した。細胞を、静かに振とうしながらＮＴ１培地において２４℃又は２８℃で増殖させ、週に１回継代培養した。
【０２０５】
結果
図１１は、ｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で安定に形質転換された細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。ＣＣＭＶに対するポリクローナル抗体によってＣＰ融合物を検出した。４つのキメラコートタンパク質導入遺伝子全ての発現が検出された。
【０２０６】
（実施例６）キメラＣＣＭＶ ＣＰをコードする植物発現プラスミドでトランスフェクトしたトランスジェニックイネ懸濁培養中のＣＣＭＶウイルス様粒子におけるＣＣＭＶ ＣＰ融合物としての４つの抗原性ペプチドの生産
イネ細胞系を、週に１回継代培養することによって維持した。細胞を、静かに振とうしながらＮＢ培地(Li, L et al. Plant Cell Reports. (1993) 12: 250-255)において２８℃で増殖させた。トランスフェクションの３日前に、細胞懸濁液５ｍｌをＮＢ培地５０ｍｌに継代培養して２８℃でインキュベートした。
【０２０７】
１）パーティクルガンによる植物細胞形質転換：
プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３、及びキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターによって駆動される植物選択マーカーＰａｔを含む植物発現プラスミドｐＢＢＶを、マイクロパーティクルガン法によるイネ細胞形質転換のために使用した。使用したプラスミド比は、１：６ ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６０、ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６１、ｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６２又はｐＢＢＶ：ｐＤＯＷ２１６３であった。合計５μｇのプラスミドＤＮＡは、６回のパーティクルガン法のために十分であった。Chen, L et al. Plant Cell Reports (1998) 18: 25-31 に述べられているＢｉｏｒａｄパーティクルガンプロトコールを形質転換のために使用した。
【０２０８】
２）プレーティング
パーティクルガンを打ち込んだ細胞を、選択のために２５μｇ／ｍｌのグルフォシネート−アンモニウム（Ｓｉｇｍａカタログ番号４５５２０）を含むＮＢ培地寒天プレートに移した。
【０２０９】
３）トランスジェニックカルスの選択
２１日後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、ＣＰ融合物の発現を調べるためのウエスタンブロット法及びプロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットの植物ゲノムへの組込みを調べるためのＰＣＲによる分析のために選択した。
【０２１０】
結果
図１２は、ＣＣＭＶに対するポリクローナル抗体によって検出したときの、ｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で安定に形質転換された細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。４つのキメラコートタンパク質導入遺伝子全ての発現が検出された。
【０２１１】
ゲノムＤＮＡを抽出し、プロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットの植物ゲノムへの組込みをＰＣＲによって調べるために以下のプロトコールを使用した。ゲノムＤＮＡを抽出するためにＱｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉを製造者の指示に従って使用した。
【０２１２】
新鮮イネカルス約５０−１００ｍｇを１．５ｍｌチューブに入れた。即時ＤＮＡ抽出のために組織を液体窒素中で凍結するか又は保存のために−８０℃の冷凍庫に入れた。ＤＮＡ抽出の前に、組織をミクロ乳鉢（micropestle）で摩砕することによって手動で破壊した。試料を氷上に置き、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔに述べられているようにゲノムＤＮＡを抽出した。Ａｃｃｅｓｓ Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ａ１７２０）を使用してＰＣＲ反応を以下のように設定した：
Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ２５μｌ
ＣＣＭＶ−Ｆ（１０ｍＭ）プライマー、配列番号２５ １μｌ
Ｎｏｓ−ｔｅｒｍ−Ｒ（１０ｍＭ）プライマー、配列番号２６ １μｌ
ゲノムＤＮＡ １μｌ
水 ２２μｌ
合計 ５５μｌ
【０２１３】
ゲノムＤＮＡからプロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットを増幅するために以下のＰＣＲサイクルを使用した：
１サイクル ９５℃ ２分間
３５サイクル ９５℃ ３０秒間
５５℃ ３０秒間
７０℃ ２分間
１サイクル ７０℃ ５分間
４℃ 維持
【０２１４】
ＰＣＲ反応物１０μｌを、ＥｔＢｒで染色した１．２％アガロースゲル上で泳動させた。図１３は、選択した個別イネカルスから増幅したＰＣＲ産物を示す。予測された大きさのＰＣＲ産物を含む試料を、安定形質転換及びキメラＣＰ導入遺伝子の植物ゲノムへの組込みに関して陽性と評価した。
【０２１５】
キメラＣＣＭＶ ＣＰを発現するトランスジェニックカルスを、スケールアップ発酵に適した細胞懸濁培養を作製するために液体ＮＢ培地に移した。細胞を、静かに振とうしながらＮＢ培地において２８℃で増殖させ、週に１回継代培養した。
【０２１６】
ＶＬＰ抽出：
以下のプロトコールに従って、振とうフラスコ培養試料を溶解し、生じた細胞溶解産物をＰＥＧ（ポリエチレングリコール）処理して、限外ろ過することにより、キメラＶＬＰを沈殿させた：
【０２１７】
各々の振とうフラスコ培養物の５０ｍＬアリコートを遠心分離して細胞をペレット化した。ペレット化した細胞をウイルス緩衝液（０．２Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２；１０ｍＭ ＥＤＴＡ．０）中に緩衝液２容：ペレット１容の比率で再懸濁した。次に６０秒間ずつ何度も混合し、混合と混合の間に２分間氷上で休ませることによって細胞を破壊した。生じたホモジネートを３層のチーズクロス(cheese cloth)を通してしぼり、その後４℃、１５，０００×Ｇで１５分間遠心分離した。生じた上清を採取し、それらの容量を測定した。各々の上清に、１０％の最終濃度までＰＥＧ８０００を添加し、その溶液を氷上で１時間又は４℃で一晩インキュベートした。次に、溶液を４℃、１５，０００×Ｇで１０分間遠心分離した。沈殿したペレットをウイルス緩衝液の１／１０初期上清容量に再懸濁し、４℃で保存して、ポリクローナル抗ＣＣＭＶ抗体でのウエスタンブロット法によって分析した。
【０２１８】
図１４は、キメラＣＣＭＶ ＶＬＰが、ｐＤＯＷ２１６０で安定に形質転換した細胞から回収されたことを示す。キメラＣＰ−ＰＡ１融合タンパク質は、再懸濁したＰＥＣペレット中で検出されたが、上清では検出されず、キメラＣＰがＶＬＰに集合されたことを指示した。
【０２１９】
あるいは、再懸濁した試料を４℃、１５，０００×Ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収して、２回目のＰＥＣ沈殿に供した。ＰＥＧ８０００を１５％の最終濃度まで添加し、４℃で２時間攪拌した。その溶液を１５，０００×Ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを少量のウイルス緩衝液に再懸濁した。再懸濁したＶＬＰ溶液を、カットオフ値が３００Ｋ分子量のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０に負荷し、４，０００×Ｇで５分間遠心した。濃縮したＶＬＰ試料をポリクローナル抗ＣＣＭＶ抗体でのウエスタンブロット法によって分析した（図１４参照）。キメラＣＰ−ＰＡ１融合タンパク質は、再懸濁してサイズろ過した２回目のＰＥＣペレット中で検出されたが、上清では検出されず、キメラＣＰがＶＬＰに構築されたことを示した。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】図１は、植物細胞内のウイルス様粒子（ＶＬＰ）におけるペプチド単量体の生産についての概要図を示す。所望標的ペプチド（「Ｉ」）をコードする配列を、ウイルスコートタンパク質（「ＣＰ」）をコードする配列に挿入して、組換えウイルスコートタンパク質（「ｒＣＰ」）をコードする遺伝子を構築し、それを、ベクターの一部として、植物細胞に形質転換し、組換えコートタンパク質（「ｒＣＰ」）を形成するように発現させる。任意の切断部位（「*」）も示す。植物細胞を、ｒＣＰ遺伝子についての植物発現プラスミドでトランスフェクト又は形質転換する。ｒＣＰは植物細胞においてＶＬＰに集合することができる。ペプチド挿入物はＶＬＰ表面に提示される。キメラＶＬＰを植物細胞から精製することができ、場合により、所望標的ペプチドを精製ＶＬＰから切断分離して、精製することができる。
【図２】図２は、感染性ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及びｐＤＯＷ２１２４（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ）、ｐＤＯＷ２１２５（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ６３ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２６（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１０２ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２７（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１１４ＢａｍＨＩ）、ｐＤＯＷ２１２８（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１２９ＢａｍＨＩ）及びｐＤＯＷ２１２９（ＣＣＭＶ−ＲＮＡ３−ＣＰ１６０ＢａｍＨＩ）から転写されたＲＮＡ３の１個でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１は緩衝液のみを示し、レーン２はＲＮＡ１及びＲＮＡ２のみを示し、レーン３は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２４から転写される野生型ＲＮＡ３を示し、レーン４は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２５から転写されるＲＮＡ３を示し、レーン５は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２６から転写されるＲＮＡ３を示し、レーン６は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２７から転写されるＲＮＡ３を示し、レーン７は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２８から転写されるＲＮＡ３を示し、レーン８は、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２＋ｐＤＯＷ２１２９から転写されるＲＮＡ３を示す。
【図３】図３は、感染性ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及び６３、１０２又は１１４位に抗原性ペプチドＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４とのＣＣＭＶ ＣＰ融合物を含む工作されたＲＮＡ３の１個でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１はサイズマーカーを示し、レーン２は緩衝液のみを示し、レーン３は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の６３位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン４は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の６３位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン５は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の６３位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン６は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の６３位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン７は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１０２位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン８は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１０２位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン９は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１０２位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１０は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１０２位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１１は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１１４位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１２は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１１４位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１３は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１１４位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、及びレーン１４は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１１４位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示す。
【図４】図４は、感染性ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、及び１２９又は１６０位に抗原性ペプチドＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３又はＰＡ４とのＣＣＭＶ ＣＰ融合物を含む工作されたＲＮＡ３の１個でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１はサイズマーカーを示し、レーン２は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１２９位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン３は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１２９位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン４は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１２９位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン５は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１２９位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン６は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１６０位にＰＡ１を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン７は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１６０位にＰＡ２を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン８は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１６０位にＰＡ３を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン９は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＣＰ内の１６０位にＰＡ４を有するキメラＲＮＡ３を示し、レーン１０は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋野生型ＲＮＡ３を示し、及びレーン１１は緩衝液のみを示す。
【図５】図５は、ｐＤＯＷ２１６０のプラスミド地図を示す。
【図６】図６は、ｐＤＯＷ２１６１のプラスミド地図を示す。
【図７】図７は、ｐＤＯＷ２１６２のプラスミド地図を示す。
【図８】図８は、ｐＤＯＷ２１６３のプラスミド地図を示す。
【図９】図９は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１は緩衝液のみを示し、レーン２−６は、ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋野生型ＲＮＡ３（対照）を示し、レーン７はｐＤＯＷ２１６０を示し、レーン８はｐＤＯＷ２１６１を示し、レーン９はｐＤＯＷ２１６２を示し、及びレーン１０はｐＤＯＷ２１６３を示す。
【図１０】図１０は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６９、ｐＤＯＷ２１７０、ｐＤＯＷ２１７１及びｐＤＯＷ２１７２でトランスフェクトしたタバコＮＴ１細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１はＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＲＮＡ３（対照）を示し、レーン２は緩衝液を示し、レーン３はｐＤＯＷ２１６９を示し、レーン４はｐＤＯＷ２１７０を示し、レーン５はｐＤＯＷ２１７１を示し、及びレーン６はｐＤＯＷ２１７２を示す。
【図１１】図１１は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で安定に形質転換したタバコＮＴ１細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。２１日間の選択後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、ＣＰ発現を調べるためのウエスタンブロット法による分析のために選択した。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１は、非形質転換タバコ細胞（陰性対照）を示し、レーン２は、ｐＤＯＷ２１６０で形質転換したトランスジェニックタバコ細胞を示し、レーン３は、ｐＤＯＷ２１６１で形質転換したトランスジェニックタバコ細胞を示し、レーン４は、ｐＤＯＷ２１６２で形質転換したトランスジェニックタバコ細胞を示し、及びレーン５は、ｐＤＯＷ２１６３で形質転換したトランスジェニックタバコ細胞を示す。
【図１２】図１２は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で安定に形質転換したイネ細胞におけるキメラＣＣＭＶ ＣＰの発現を示す。２１日間の選択後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、ＣＰ発現を調べるためのウエスタンブロット法による分析のために選択した。植物細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１は野生型ＣＣＭＶ ＣＰ（陽性対照）を示し、レーン２はサイズラダーを示し、レーン３は非トランスジェニックイネ細胞（陰性対照）を示し、レーン４は、ｐＤＯＷ２１６０で形質転換したトランスジェニックイネ細胞を示し、レーン５は野生型ＣＣＭＶ ＣＰ（陽性対照）を示し、レーン６はサイズラダーを示し、レーン７は非トランスジェニックイネ細胞を示し、レーン８は、ｐＤＯＷ２１６１で形質転換したトランスジェニックイネ細胞を示し、レーン９は野生型ＣＣＭＶ ＣＰ（陽性対照）を示し、レーン１０はサイズラダーを示し、レーン１１は非トランスジェニックイネ細胞（陰性対照）を示し、レーン１２は、ｐＤＯＷ２１６２で形質転換したトランスジェニックイネ細胞を示し、レーン１３は野生型ＣＣＭＶ ＣＰ（陽性対照）を示し、レーン１４はサイズラダーを示し、レーン１５は非トランスジェニックイネ細胞（陰性対照）を示し、及びレーン１６は、ｐＤＯＷ２１６３で形質転換したトランスジェニックイネ細胞を示す。
【図１３】図１３は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０、ｐＤＯＷ２１６１、ｐＤＯＷ２１６２及びｐＤＯＷ２１６３で形質転換した選択個別イネカルスから増幅したＰＣＲ産物の検出を示す。選択個別イネカルスから増幅されたＰＣＲ産物を示す、ＥｔＢｒで染色した１．２％アガロースゲル。２１日間の選択後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、植物ゲノムへのプロモーター−ＣＰ融合物遺伝子−ターミネーターカセットの組込みを調べるためのＰＣＲによる分析のために選択した。レーン１はイネカルス４６−５を示し、レーン２はイネカルス４６−１１を示し、レーン３はイネカルス４６−１７を示し、レーン４はサイズラダーを示し、レーン５はイネカルス４７−６を示し、レーン６はイネカルス４８−１２を示し、レーン７はイネカルス４８−１８を示し、レーン８はイネカルス４８−２０を示し、レーン９はイネカルス４９−１１を示し、レーン１０はイネカルス４９−１８を示し、及びレーン１１は陰性対照（非トランスジェニックイネ細胞）を示す。
【図１４】図１４は、非感染性プラスミドｐＤＯＷ２１６０で安定に形質転換したイネ細胞からＰＥＧ沈殿及び限外ろ過によって精製したキメラＣＣＭＶ ＶＬＰのウエスタンブロット分析及び精製ＶＬＰ試料におけるキメラＣＰ−ＰＡ１融合タンパク質の検出を示す。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、抗ＣＣＭＶポリクローナル抗体でプローブした。レーン１はサイズラダーを示し、レーン２は、ＣＣＭＶ−ＣＰ１融合に関してトランスジェニックのイネ懸濁細胞からの全細胞溶解産物を示し、レーン３は第一ＰＥＧ上清を示し、レーン４は第一ＰＥＧペレットを示し、レーン５は第二ＰＥＧペレットを示し、レーン６は第二ＰＥＧ上清を示す。
【図１５】図１５は、発酵による植物懸濁細胞でのキメラＶＬＰの生産工程の一覧図を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）融合ペプチドをコードする核酸配列を含む非感染性核酸で植物細胞を形質転換すること、但し前記融合ペプチドは少なくとも１個の対象異種ペプチドと少なくとも１個のウイルスカプシドタンパク質から成り、前記核酸は前記植物細胞ゲノムに組み込まれている；
ｂ）前記植物細胞を発酵工程において懸濁植物細胞培養中で増殖させ、前記植物細胞において前記核酸を発現させること；
ｃ）前記植物細胞における発現が、前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること；及び
ｄ）前記ウイルス様粒子を単離すること
を含む、異種ペプチドを生産するための方法。
【請求項２】
前記融合ペプチドをコードする前記核酸が、プロモーター配列及びターミネーター配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がウイルス３’ＵＴＲをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記３’ＵＴＲがカプシド形成シグナルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸がカプシド形成シグナルをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示さないウイルスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示すウイルスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスカプシドタンパク質が二十面体植物ウイルスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記二十面体ウイルスが、カウピーモザイクウイルス（Cowpea Mosaic Virus）、カウピークロロティックモトルウイルス（Cowpea Chlorotic Mottle Virus）及びアルファルファモザイクウイルス（Alfalfa Mosaic Virus）から成るウイルスの群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種ペプチドが抗原性ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原性ペプチドが炭疽菌（Bacillus anthracis）ペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原性ペプチドが、配列番号１−４から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸が、配列番号５−１２から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルス様粒子をワクチンとして動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物細胞が双子葉植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物細胞がニコチアナ・タバカム（タバコ）（Nicotiana tabacum）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物細胞が単子葉植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記植物細胞がオリザ・サティバ（イネ科イネ）（Oryza sativa）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、前記カプシドタンパク質以外のウイルスタンパク質をコードするウイルス配列を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
融合ペプチドをコードする核酸配列を含む非感染性核酸を含む植物細胞であって、前記融合ペプチドは少なくとも１個の対象異種ペプチドと少なくとも１個のウイルスカプシドタンパク質から成り、前記核酸は前記植物細胞ゲノムに組み込まれている、前記植物細胞。
【請求項２１】
前記植物細胞が前記融合ペプチドを発現する、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２２】
前記融合ペプチドがインビボでウイルス様粒子に集合される、請求項２１に記載の植物細胞。
【請求項２３】
前記抗原性ペプチドが、配列番号１−４から成る群より選択される、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２４】
前記核酸が、配列番号５−１２から成る群より選択される、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２５】
前記植物細胞がニコチアナ・タバカムである、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２６】
前記植物細胞がオリザ・サティバである、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２７】
前記核酸が３’ＵＴＲをさらに含む、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２８】
前記核酸がウイルス３’ＵＴＲをさらに含む、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２９】
前記３’ＵＴＲがカプシド形成シグナルを含む、請求項２８に記載の植物細胞。
【請求項３０】
前記核酸がカプシド形成シグナルをさらに含む、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項３１】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示さないウイルスに由来する、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項３２】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示すウイルスに由来する、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項３３】
前記ウイルスカプシドタンパク質が二十面体植物ウイルスに由来する、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項３４】
前記二十面体ウイルスが、カウピーモザイクウイルス、カウピークロロティックモトルウイルス及びアルファルファモザイクウイルスから成るウイルスの群より選択される、請求項３３に記載の植物細胞。
【請求項３５】
配列番号５−１２から成る群より選択される配列を含む核酸構築物。
【請求項１】
ａ）融合ペプチドをコードする核酸配列を含む非感染性核酸で植物細胞を形質転換すること、但し前記融合ペプチドは少なくとも１個の対象異種ペプチドと少なくとも１個のウイルスカプシドタンパク質から成り、前記核酸は前記植物細胞ゲノムに組み込まれている；
ｂ）前記植物細胞を発酵工程において懸濁植物細胞培養中で増殖させ、前記植物細胞において前記核酸を発現させること；
ｃ）前記植物細胞における発現が、前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること；及び
ｄ）前記ウイルス様粒子を単離すること
を含む、異種ペプチドを生産するための方法。
【請求項２】
前記融合ペプチドをコードする前記核酸が、プロモーター配列及びターミネーター配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がウイルス３’ＵＴＲをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記３’ＵＴＲがカプシド形成シグナルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸がカプシド形成シグナルをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示さないウイルスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示すウイルスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスカプシドタンパク質が二十面体植物ウイルスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記二十面体ウイルスが、カウピーモザイクウイルス（Cowpea Mosaic Virus）、カウピークロロティックモトルウイルス（Cowpea Chlorotic Mottle Virus）及びアルファルファモザイクウイルス（Alfalfa Mosaic Virus）から成るウイルスの群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種ペプチドが抗原性ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原性ペプチドが炭疽菌（Bacillus anthracis）ペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原性ペプチドが、配列番号１−４から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸が、配列番号５−１２から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルス様粒子をワクチンとして動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物細胞が双子葉植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物細胞がニコチアナ・タバカム（タバコ）（Nicotiana tabacum）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物細胞が単子葉植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記植物細胞がオリザ・サティバ（イネ科イネ）（Oryza sativa）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、前記カプシドタンパク質以外のウイルスタンパク質をコードするウイルス配列を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
融合ペプチドをコードする核酸配列を含む非感染性核酸を含む植物細胞であって、前記融合ペプチドは少なくとも１個の対象異種ペプチドと少なくとも１個のウイルスカプシドタンパク質から成り、前記核酸は前記植物細胞ゲノムに組み込まれている、前記植物細胞。
【請求項２１】
前記植物細胞が前記融合ペプチドを発現する、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２２】
前記融合ペプチドがインビボでウイルス様粒子に集合される、請求項２１に記載の植物細胞。
【請求項２３】
前記抗原性ペプチドが、配列番号１−４から成る群より選択される、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２４】
前記核酸が、配列番号５−１２から成る群より選択される、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２５】
前記植物細胞がニコチアナ・タバカムである、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２６】
前記植物細胞がオリザ・サティバである、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２７】
前記核酸が３’ＵＴＲをさらに含む、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２８】
前記核酸がウイルス３’ＵＴＲをさらに含む、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項２９】
前記３’ＵＴＲがカプシド形成シグナルを含む、請求項２８に記載の植物細胞。
【請求項３０】
前記核酸がカプシド形成シグナルをさらに含む、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項３１】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示さないウイルスに由来する、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項３２】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示すウイルスに由来する、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項３３】
前記ウイルスカプシドタンパク質が二十面体植物ウイルスに由来する、請求項２０に記載の植物細胞。
【請求項３４】
前記二十面体ウイルスが、カウピーモザイクウイルス、カウピークロロティックモトルウイルス及びアルファルファモザイクウイルスから成るウイルスの群より選択される、請求項３３に記載の植物細胞。
【請求項３５】
配列番号５−１２から成る群より選択される配列を含む核酸構築物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００７−５２８７２７（Ｐ２００７−５２８７２７Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００７８４（Ｐ２００７−５００７８４）
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００６３４２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８６６６７
【国際公開日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（５９０００００２０）ザ ダウ ケミカル カンパニー (24)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＤＯＷ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００６３４２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８６６６７
【国際公開日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（５９０００００２０）ザ ダウ ケミカル カンパニー (24)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＤＯＷ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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