植物細胞培養における抗体製造のシステムおよび方法
高レベルの発現効率とともに製造される非常に機能的な抗体をもたらす、抗体を植物細胞培養において製造するためのシステムおよび方法。本発明はまた、原寸の組み立てられた免疫グロブリンを大量製造するための宿主細胞、ベクターおよび方法を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を植物細胞培養において製造するためのシステムおよび方法に関し、さらにその製造された抗体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は現在開発中の治療薬物の大きな集団を代表する。抗体は、大きな特異性を有する標的抗原を認識し、結合する複雑な糖タンパク質である。この特異的な結合活性により、抗体を、疾患の診断、防止および治療を含めて、様々な適用のために使用することが可能である（２０）。典型的な原寸の抗体は、２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖との四量体である。原寸の免疫グロブリンの他に、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、二重特異的Ｆｖ、ジアボディー、ミニボディー、単一可変ドメインおよび抗体融合タンパク質などを含めて、治療的価値を有する他の様々な抗体誘導体が植物において発現されている（４）。
【０００３】
ＩｇＧ抗体分子のグリコシル化は、エフェクターリガンドＦｃＲおよび補体を認識するために重要である翻訳後修飾である。複雑な二分岐オリゴ糖成分がそれぞれの重鎖のＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ−２９７において結合する。糖残基の結合における不均一性が機能的調節に関連する（２１〜２６）。さらに、様々な研究により、ＩｇＧ１抗体のインビボ運命が、ＣＨ２における変化した構造の炭水化物の存在によって劇的に影響されることが示される（２７）。
【０００４】
医薬品として使用されるタンパク質は従来、哺乳動物または細菌の発現システムで製造されている。ほとんどの場合において、そのようなタンパク質は哺乳動物細胞株（主にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ））またはトランスジェニック動物において遺伝子組換えにより製造される。これは、これらがタンパク質の正しい折り畳みおよび組み立てをもたらし、かつ、類似したグリコシル化パターンを生じさせることが示されているからである。しかしながら、そのような発現システムは高価であり、また、高レベルの製造に拡大することが困難である。さらに、病原性生物または発ガン性ＤＮＡ配列による潜在的な混入に起因する安全性の問題が存在する。また、このような哺乳動物システムにおける特定のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４）の製造収率および安定性は極めて低く、そのため、製造は非常に非効率である。
【０００５】
正確な原因は不明ではあるが、組換えＩｇＧ４の安定性は低く、これは、収率が低い原因であり、それにより、非効率的な大規模製造をもたらしている。
【０００６】
従って、抗体および他の治療タンパク質を製造するための非哺乳動物システムは明らかに好都合である。そのようなシステムは、非免疫原性のタンパク質には有効であることが示されているが、抗体はより敏感であり、また、哺乳動物以外の細胞培養システムにおいて製造することがより困難である。例えば、抗体をバキュロウイルス発現システムおよび安定的にトランスフェクションされた昆虫細胞株において発現させることができるが、得られる物質は必要な性質を有しない場合がある。昆虫細胞発現システムは抗体を産生するが、下記のようないくつかの欠点を有する：非効率的なプロセシング、ならびに、折り畳み能および分泌能障害、部分的にバキュロウイルスによりコードされる大きなプロテアーゼ活性、翻訳後修飾パターン（これは免疫原的に作用し得る）の不十分な強度およびずれ（例えば、下記の参考文献を参照のこと：Ｇｕｔｔｉｅｒｉ ＭＣ、Ｌｉａｎｇ Ｍ．、２００４、昆虫細胞発現システムを使用するヒト抗体の製造、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２４８：２６９〜９９；Ｇｕｔｔｉｅｒｉ ＭＣ、Ｓｉｎｈａ Ｔ、Ｂｏｏｋｗａｌｔｅｒ Ｃ、Ｌｉａｎｇ Ｍ．Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ ＣＳ、２００３、安定的に形質転換された昆虫細胞における発現による全長ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体へのＦａｂフラグメントの変換のためのカセットベクター、Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、２２（３）：１３５〜４５；Ｐｏｔｔｅｒ ＫＮ、Ｌｉ Ｙ、Ｃａｐｒａ ＪＤ、１９９３、バキュロウイルス発現システムにおける抗体製造、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０（２−３）：１０３〜１２）。好適な翻訳後修飾が存在しないため、抗体を大腸菌において製造することができない。
【０００７】
過去１０年間において、新しい発現システムが植物において開発されている。この方法論では、アグロバクテリウム（一本鎖ＤＮＡ分子（Ｔ−ＤＮＡ）を植物のゲノムに挿入することができる細菌）が利用される（１）。遺伝子をタンパク質およびペプチドの大量製造のために導入することが比較的簡便であるために、この方法論は植物における代替的なタンパク質発現システムとしてますます一般的になりつつある（２〜４）（５）。
【０００８】
植物に基づくシステムは、組換え抗体を製造するための安価で、効率的で、かつ、安全な代替法である。植物細胞における原寸の抗体の製造が、１つだけのガンマ免疫グロブリン鎖またはカッパ免疫グロブリン鎖を発現する植物の有性交配によってタバコ植物の完全体において初めて明らかにされた（６）。タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）および他の植物におけるＩｇＧ（主にＩｇＧ１）抗体およびＩｇＡ抗体の組み立てが報告されている（３、７〜１０）。
【０００９】
最近１０年間にわたる研究では、植物細胞は、植物体に含有されているとき、様々な機能的な抗体を産生できることが示されており、今や、強い関心が、製造を商業的レベルに拡大することにある（１１〜１３）、（１４、１５）、（５、１６〜１８）。
【００１０】
しかしながら、組換えタンパク質を製造するためにトランスジェニック野外作物を使用するとき、残留殺虫剤、残留除草剤および毒性の植物代謝産物による汚染をはじめとする様々な潜在的な安全性問題に関する関心が生じている（１９）。一般に遺伝子改変植物に反対するグループは、導入遺伝子およびそのコードされるタンパク質が環境に広がるか、または、食物連鎖の中に広がるという潜在的な危険性を心配しており、また、規制機関の厳しい制限が、トランスジェニック植物技術をタンパク質発現のために利用する企業には障害となっている。従って、明らかに、完全な、全てを備える植物体の使用は不都合である。
【００１１】
植物の懸濁細胞は、注意深く制御されている証明された条件のもとでの組換えタンパク質製造のために使用することができるインビトロシステムである。植物細胞の懸濁物を、組換えタンパク質を製造するために振とうフラスコまたはバイオリアクターにおいて増殖させることができる。本発明者らは、野外での植物成長の潜在的な危険性を伴うことなく、植物細胞での発現の利点を利用して組換えタンパク質（例えば、抗体など）の安全な製造を可能にするバイオリアクターシステムについての対応する特許出願を出願している（米国特許第６３９１６３８号および米国特許出願第１０／７８４２９５号（２００４年２月２４日出願）を参照のこと。これらはともに、本明細書中に示されたかのように参考として本明細書により組み込まれる）。
【００１２】
例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ Ｈａｖａｎａ ＳＲ１の懸濁培養物（Ｐ９ｓ）におけるＴＭＶ特異的な原寸のマウスＩｇＧ−２ｂ／Ｋ抗体の発現が報告されている（１８）。Ｎ末端のマウスのリーダーペプチドの組み込みにより、組み立てられた免疫グロブリンが分泌させられた。しかしながら、懸濁培養では、原寸の組換え抗体は植物細胞壁によって保持された。ＥＬＩＳＡ法では、組換えタンパク質の特異性および親和性がそのマウス対応体と区別できなかったことが明らかにされ、これは、組換え抗体を製造するためのバイオリアクターとしての植物細胞懸濁培養物の潜在的可能性を示している（１８）。
【００１３】
植物における抗体の製造では、分子が、その同族抗原を認識するために正しく折り畳まれ、かつ、組み立てられなければならないので、特別な課題が示される。一方で、植物由来の発現システムは、例えば、細菌の発現システムとは異なり、タンパク質の発現および活性のために非常に重要であることが知られている翻訳後修飾を容易にする。しかしながら、哺乳動物細胞培養システムと、植物細胞培養システムとの間には翻訳後修飾における大きな違いが存在しており、これは、発現タンパク質の潜在的な低下した機能性または除去された機能性さえも回避するために検討する必要がある。
【００１４】
哺乳動物のタンパク質発現システムと、植物のタンパク質発現システムとの間での大きな違いの１つは、生合成経路における違いによって引き起こされるタンパク質の糖側鎖の変化である。グリコシル化は、タンパク質の活性、折り畳み、安定性、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、血中クリアランス速度および抗原性能力に対する顕著な影響を有することが示されていた。従って、植物におけるタンパク質製造はいずれも、植物のグリコシル化の潜在的な分枝化を考慮に入れなければならない。
【００１５】
タンパク質のグリコシル化は、Ｎ結合型修飾およびＯ結合型修飾の２つのカテゴリーに分けられる（２８、２９）（３０）。これら２つのタイプは、グリカン成分が結合するアミノ酸が異なる。すなわち、Ｎ結合型はＡｓｎ残基に結合し、一方、Ｏ結合型はＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基に結合する。加えて、それぞれのタイプのグリカン配列は特有の特徴的な特徴を有する。これら２つのタイプのうち、Ｎ結合型グリコシル化の方が多く存在しており、タンパク質機能に対するその影響が広範囲に研究されている。一方で、Ｏ結合型グリカンは比較的希であり、タンパク質に対するその影響に関する情報はほとんど得られていない。
【００１６】
いくつかの方法が、植物におけるタンパク質のグリコシル化を制御し、かつ、目的に合わせて調節するために議論されている（３１）（３２）。全体的な修飾、例えば、グリコシル化の完全な阻害またはペプチド鎖からのグリコシル化部位の除去などが、１つの方針として実行される場合がある。しかしながら、この方法は構造的欠陥をもたらし得る。さらなる方法では、いくつかの特定の炭水化物プロセシング酵素のノックアウトおよび導入が伴う。これらの酵素は、潜在的に免疫原性である糖が翻訳後修飾時に付加されることを防止するために「ノックアウト」される。例えば、キシロシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のノックアウトにより、グリカン構造におけるキシロースの非存在がもたらされる。キシロースは、植物においてだけ見出される糖残基であり、潜在的に免疫原性であると考えられている。ヒトの炭水化物プロセシング酵素遺伝子、例えば、シアリルトランスフェラーゼなどを植物に導入することにより、植物には存在しないシアル酸の付加がもたらされる（例えば、Ｒａｇｏｎ Ｃ、Ｌｅｒｏｕｇｅ Ｐ、Ｆａｙｅ Ｌ．、１９９８、植物におけるタンパク質のＮ−グリコシル化、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ Ｖｏｌ．４９（３２６）、１４６３〜１４７２を参照のこと）。
【００１７】
第３の方法では、発現を細胞内の特定の区画に局在化することが試みられる。例えば、タンパク質をＥＲに保持することは、植物特異的な修飾がゴルジ装置において行われることを妨げる（３３）（３４、３５）。それぞれの細胞区画は異なる炭水化物プロセシング酵素を有する。分泌経路に入るか、または、分泌経路に標的化されるタンパク質はＥＲからゴルジ装置に移され、次いで液胞またはアポプラストに移される。アポプラストは植物細胞膜と植物細胞壁との間の空間である。分泌に標的化されるタンパク質、すなわち、より具体的には、特定の細胞区画に標的化されず、従って、分泌されるタンパク質は、アポプラストに到達する。一部のタンパク質はアポプラストに留まるが、一部のタンパク質は細胞壁を通過し、増殖培地中に分泌される。異なる炭水化物プロセシングがそれぞれの区画において存在するので、タンパク質を１つの区画に保持することは、グリカン構造のさらなるプロセシングを阻害することができ、または、タンパク質を特定の区画に導くことによって、タンパク質が所望のプロセシング経路に入ることを確実にすることが可能である。
【発明の開示】
【００１８】
背景技術は、非常に機能的なＩｇＧ４抗体を製造するためのシステムまたは方法を教示または示唆していない。
【００１９】
本発明は、高レベルの発現効率とともに製造される非常に機能的な抗体をもたらす植物細胞培養での抗体の製造のためのシステムおよび方法を提供することによって、背景技術のこれらの欠点を克服する。本発明はまた、原寸の組み立てられた免疫グロブリンを大量製造するための宿主細胞、ベクターおよび方法を包含する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態によれば、懸濁状態において増殖する遺伝子改変された（例えば、トランスジェニック）植物細胞に基づく植物発現システムが提供される。この発現システムは、（組み立てられた）無傷の抗体または抗体フラグメントを製造するために特に設計される。
【００２１】
これらの抗体は好ましくは機能的な抗体である（すなわち、標的抗原と特異的に結合することができるか、または、エフェクター機能［例えば、補体機能の活性化］を有し得る抗体、例えば、ＩｇＧ４など）。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、実質的に無傷の抗体分子を示す。
【００２３】
本明細書中で使用される表現「抗体フラグメント」は、抗原に結合することができる、抗体の機能的なフラグメントを示す。
【００２４】
本発明を実施するための好適な抗体フラグメントには、なかでも、免疫グロブリン軽鎖（これは本明細書中では「軽鎖」として示される）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、免疫グロブリン重鎖（これは本明細書中では「重鎖」として示される）のＣＤＲ、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄフラグメント、ならびに、軽鎖および重鎖の両方の本質的に全可変領域を含む抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２など）が含まれる。
【００２５】
軽鎖および重鎖の両方の全可変領域または本質的に全可変領域を含む機能的な抗体フラグメントは下記のように定義される：
（ｉ）Ｆｖ、これは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域からなる遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；
（ｉｉ）単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、これは、好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された単鎖分子である；
（ｉｉｉ）Ｆａｂ、これは、完全な抗体を酵素パパインで処理して、無傷の軽鎖と、重鎖のＦｄフラグメント（これはその可変ドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）とを生じさせることによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子のフラグメントである；
（ｉｖ）Ｆａｂ’、これは、完全な抗体を酵素ペプシンで処理し、その後、還元することによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子のフラグメントである（２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子について得られる）；および
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、これは、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子のフラグメントである（すなわち、２つのジスルフィド結合によって一緒に結ばれたＦａｂ’フラグメントのダイマー）。
【００２６】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製する様々な方法が当該分野では広く知られている。抗体をいくつかの既知の方法のいずれか１つによって作製することができ、そのような方法では、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．他（１９８９）、ポリメラーゼ連鎖反応による発現のための免疫グロブリン可変ドメインのクローニング、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６、３８３３〜３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１）、人工抗体、Ｎａｔｕｒｅ、３４９、２９３〜２９９）、または、培養での連続した細胞株によるモノクローナル抗体分子の作製を用いることができる。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）、所定の特異性を有する抗体を分泌する融合細胞の連続培養、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９７；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．他（１９８５）、ヒトハイブリドーマの腹水増殖の後での特異的な免疫グロブリンの製造および強化された腫瘍形成性、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、８１、３１〜４２；Ｃｏｔｅ ＲＪ他（１９８３）、細胞抗原との反応性を有するヒトモノクローナル抗体の作製、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８０、２０２６〜２０３０；Ｃｏｌｅ、Ｓ．Ｐ．他（１９８４）、ヒトモノクローナル抗体、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、６２、１０９〜１２０）。
【００２７】
抗体をインビボで生じさせるとき、標的抗原が非常に小さく、十分な免疫原性応答を誘発することができない場合、そのような抗原（これは「ハプテン」と呼ばれる）を、抗原性に関して中性のキャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）キャリア）または血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））キャリアなど）にカップリングすることができる（例えば、米国特許第５１８９１７８号および同第５２３９０７８号を参照のこと）。ハプテンをキャリアにカップリングすることを、当該分野で周知の方法を使用して行うことができる。例えば、アミノ基への直接的なカップリングを行うことができ、また、場合により、続いて、形成されたイミノ連結を還元することができる。あるいは、キャリアを、縮合剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド系脱水剤など）を使用してカップリングすることができる。リンカー化合物もまた、カップリングを行うために使用することができる；ホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーの両方をＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｈｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、米国）から入手することができる。その後、得られる免疫原性複合体を好適な哺乳動物被験体（例えば、マウス、ウサギなど）に注射することができる。好適なプロトコルでは、血清中における抗体の産生を高めるために設計されたスケジュールに従ったアジュバントの存在下での免疫原の繰り返される注射が伴う。免疫血清の力価を、当該分野で周知の免疫アッセイ手法を使用して容易に測定することができる。
【００２８】
本明細書中上記で記載されたように、得られた抗血清をそのまま使用することができ、または、モノクローナル抗体を得ることができる。
【００２９】
抗体フラグメントを、当該分野で周知の方法を使用して得ることができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。例えば、本発明による抗体フラグメントを、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養システムまたは他のタンパク質発現システム）での発現によって調製することができる。
【００３０】
あるいは、抗体フラグメントを従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。本明細書中上記で記載されたように、（Ｆａｂ’）２抗体フラグメントを、５Ｓフラグメントをもたらすために抗体をペプシンで酵素切断することによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを生じさせるために、チオール還元剤、および、場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基のための保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断は、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントと、Ｆｃフラグメントとを直接に生じさせる。そのような方法を実施するための十分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびに、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．（１９５９）、結晶パパインによるウサギγ−グロブリンおよび抗体の加水分解、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、７３、１１９〜１２６を参照のこと）。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または、他の酵素的技術、化学的技術もしくは遺伝的技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する能力を保持する限り、使用することができる。
【００３１】
本明細書中上記で記載されたように、Ｆｖは、対形成した重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成される。この会合は非共有結合性であり得る（例えば、Ｉｎｂａｒ，Ｄ．他（１９７２）、重鎖および軽鎖の可変部分の内部における抗体合体部位の位置決定、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、６９、２６５９〜２６６２を参照のこと）。あるいは、本明細書中上記で記載されたように、可変ドメインを、分子間ジスルフィド結合によって単鎖Ｆｖを作製するために連結することができ、あるいは、そのような鎖を化学試薬（例えば、グルタルアルデヒドなど）によって架橋することができる。
【００３２】
好ましくは、Ｆｖは単鎖Ｆｖである。単鎖Ｆｖは、ペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによってつながれた、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子が発現ベクターに挿入され、続いて、発現ベクターが宿主細胞（例えば、大腸菌など）に導入される。組換え宿主細胞により、２つの可変ドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。単鎖Ｆｖを製造するための充分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．およびＦｉｌｐｕｌａ，Ｄ．（１９９１）、単鎖Ｆｖタンパク質およびその融合タンパク質、ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２（２）、９７〜１０５；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．他（１９８８）、単鎖の抗原結合性タンパク質、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３〜４２６；Ｐａｃｋ，Ｐ．他（１９９３）、大腸菌の高細胞密度発酵によって製造された、完全な抗体と同一の結合活性を有する改善された二価ミニ抗体、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）、１１（１１）、１２７１〜１２７７；および米国特許第４９４６７７８号を参照のこと）。
【００３３】
単離された相補性決定領域ペプチドを、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって調製することができる。そのような方法を実施するための充分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．およびＦｒｙ，Ｋ．Ｅ．（１９９１）、抗体遺伝子のＰＣＲ増幅、ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２（２）、１０６〜１１０）。
【００３４】
ヒトの治療または診断のためにはヒト化抗体が好ましくは使用されることが理解される。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体に由来する部分（好ましくは、最小限の部分）を有する遺伝子操作されたキメラな抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）のＣＤＲが、所望の機能性を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）のＣＤＲからの残基によって置換される抗体が含まれる。いくつかの場合において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは、移入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、かつ、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが関連のヒトコンセンサス配列のフレームワーク領域に対応する少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は最適には、典型的にはヒト抗体に由来する抗体定常領域（例えば、Ｆｃ領域など）の少なくとも一部もまた含む（例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．他（１９８６）、マウス由来の相補性決定領域によるヒト抗体における相補性決定領域の置換、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．他（１９８８）、治療のためのヒト抗体の再形成、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２７；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．（１９９２ｂ）、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、２、５９３〜５９６；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．（１９９２ａ）、抗体工学、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３（４）、３９４〜３９８を参照のこと）。
【００３５】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該分野では広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸残基が、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入されている。これらの非ヒト由来のアミノ酸残基は移入残基と呼ばれることが多く、典型的には、移入されている可変ドメインから取られる。ヒト化を、ヒトＣＤＲを対応する齧歯類ＣＤＲによって置換することにより、本質的には記載されるように行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ他（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．他（１９８８）、ヒト抗体の再形成：抗リゾチーム活性の継ぎ足し、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３６；および米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。従って、ヒト化抗体は、無傷のヒト可変ドメインの実質的に一部が、非ヒト種に由来する対応の配列によって置換されているキメラな抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、一部のＣＤＲ残基と、可能であれば、一部のフレームワーク残基とが、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換されるヒト抗体である。
【００３６】
ヒト抗体はまた、当該分野で既知の様々なさらなる技術を使用して製造することができ、そのような技術には、ファージディスプレーライブラリーが含まれる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９１）、免疫化の迂回：インビトロで再配置された生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントの合成レパートリーに由来するヒト抗体、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２２７、３８１〜３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．他（１９９１）、ファージ表面に呈示されたＶ遺伝子ライブラリーに由来するヒト抗体、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２２２、５８１〜５９７；Ｃｏｌｅ他（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７頁〜９６頁；Ｂｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．他（１９９１）、インビトロで初回抗原刺激されたヒト脾細胞からの抗原特異的なヒトモノクローナル抗体の製造、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７、８６〜９５）。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をコードする配列をトランスジェニック動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウス）に導入することによって作製することができる。抗原による攻撃を受けたとき、遺伝子再配置、鎖の組み立ておよび抗体レパートリーを含めて、すべての点でヒトにおいて認められる抗体と非常に類似するヒト抗体の産生がそのような動物において観測される。そのような方法を実施するための充分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号および同第５６６１０１６号；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．他（１９９２）、免疫化の迂回：鎖シャッフリングによる高親和性のヒト抗体の構築、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）、１０（７）、７７９〜７８３；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９４）、ニュースおよび見解：特異化における成功、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、８１２〜８１３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．他（１９９６）、ミニ遺伝子座のトランスジェニックマウスの新規系統に由来する高結合活性のヒトＩｇＧカッパ型モノクローナル抗体、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４、８４５〜８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．（１９９６）、マウスにおける高結合活性のヒトＭａｂの作製、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４、８２６；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）、トランスジェニックマウス由来のヒト抗体、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３、６５〜９３を参照のこと）。
【００３７】
抗体が得られた後、抗体は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、活性について試験することができる。
【００３８】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、機能的なＩｇＧ４抗体を植物細胞培養（好ましくは、場合により懸濁状態において増殖し、また、より好ましくは懸濁状態において増殖する根の植物細胞培養）において製造するためのシステムおよび方法が提供される。場合により、また、最も好ましくは、植物細胞培養はニンジンの根細胞を含む。
【００３９】
本発明のなおさらに他の好ましい実施形態によれば、抗体を植物細胞培養（好ましくは、場合により懸濁状態において増殖し、また、より好ましくは懸濁状態において増殖する根の植物細胞培養）において製造するためのシステムおよび方法が提供され、この場合、この抗体は、哺乳動物細胞培養において増殖する対応する抗体よりも大きい結合親和性を標的抗原について有する。
【００４０】
本発明のなおさらに他の好ましい実施形態によれば、配列番号１および配列番号５に対する相同性がそれぞれ少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）である重鎖配列および軽鎖配列を有する抗体が提供される。場合により、配列番号１および配列番号５による配列から本質的になる配列を有する抗体が提供される。この抗体はＩｇＧ１サブタイプである。
【００４１】
本発明のさらに他の好ましい実施形態によれば、遺伝子１〜４（重鎖；配列番号１〜４）からなる群から選択される配列に対する相同性、および、遺伝子９〜１２（軽鎖；配列番号５〜８）からなる群から選択される配列に対する相同性がそれぞれ少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）である重鎖配列および軽鎖配列を有する抗体が提供される。場合により、遺伝子１〜４（重鎖；配列番号１〜４）からなる群から選択される重鎖配列と、遺伝子９〜１２（軽鎖；配列番号５〜８）からなる群から選択される軽鎖配列とを有する抗体が提供される。この抗体はＩｇＧ１サブタイプである。本発明のさらに他の好ましい実施形態によれば、遺伝子５〜８（重鎖；配列番号９〜１２）からなる群から選択される配列に対する相同性、および、遺伝子９〜１２（軽鎖；配列番号５〜８）からなる群から選択される配列に対する相同性がそれぞれ少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）である重鎖配列および軽鎖配列を有する抗体が提供される。場合により、遺伝子５〜８（重鎖；配列番号９〜１２）からなる群から選択される重鎖配列と、遺伝子９〜１２（軽鎖；配列番号５〜８）からなる群から選択される軽鎖配列とを有する抗体が提供される。この抗体はＩｇＧ４サブタイプである。
【００４２】
本発明のなおさらに他の好ましい実施形態によれば、植物のシグナルペプチドを含む抗体が提供される。好ましくは、この抗体はＩｇＧ４サブタイプである。場合により、また、好ましくは、植物のシグナルペプチドは、抗体を、Ａｐｏ（アポプラスト）、ＥＲ（小胞体）および液胞からなる群から選択されるオルガネラに標的化する。より好ましくは、植物のシグナルペプチドは、抗体が場合により、また、最も好ましくは、ＥＲによって保持され、ゴルジ体に移動しないように、抗体をＥＲに標的化する。場合により、停止コドンが、ＥＲ保持シグナルとの融合を容易にするために、抗体の配列に存在しない。また、場合により、液胞への標的化が、液胞選別シグナルＧＬＬＶＤＴＭ（配列番号１３）をコードする配列を停止コドンの前に組み込むことによって達成される。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「植物」は、遺伝子改変することができる任意の植物、例えば、単子葉植物または双子葉植物、ならびに他の植物（例えば、針葉樹植物、コケまたは藻類など）などを示す。現在既知の実施形態によれば、植物はニンジン植物である。別の実施形態によれば、植物はタバコ属の植物であり、これには、限定されないが、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌａｕｃａ（野生タバコ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）が含まれる。
【００４４】
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書中では交換可能に使用される用語である。そのような用語は、特定の対象とする細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫を示すことが理解される。いくつかの変化が、変異または環境的影響のいずれかにより次世代において生じ得るので、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でないことがあり、しかし、本明細書中で使用される用語の範囲には依然として含まれる。本明細書中で使用される「宿主細胞」は、ネイクドＤＮＡ、または、組換えＤＮＡ技術を使用して構築された発現ベクターで組換え的に形質転換され得る細胞を示す。本明細書中で使用される用語「トランスフェクション」は、核酸（例えば、ネイクドＤＮＡまたは発現ベクター）をレシピエント細胞に核酸媒介遺伝子移入によって導入することを意味する。本明細書中で使用される「形質転換」は、細胞の表現型が、外因性のＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取り込みの結果として変化させられるプロセスを示し、例えば、形質転換された細胞は、所望されるタンパク質の組換え形態を発現する。
【００４５】
薬物抵抗性または他の選択マーカーが、部分的には、形質転換体の選択を容易にするために意図されることを理解しなければならない。また、選択マーカー（例えば、薬物抵抗性マーカーなど）の存在は、混入微生物を培養培地で増殖させないことにおいて有用であり得る。形質転換された宿主細胞のそのような純粋培養は、誘導された表現型の生存のために要求される条件のもとで細胞を培養することによって得られる。
【００４６】
上記で示されたように、本発明の宿主細胞は核酸分子でトランスフェクションまたは形質転換することができる。本明細書中で使用される用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、適する場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを示す。これらの用語はまた、均等物として、ヌクレオチドのアナログから作製される、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、ならびに、記載されている実施形態に対して適用可能であるように、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを含むことを理解しなければならない。
【００４７】
なお別の実施形態において、本発明の宿主細胞は、組換え核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換することができる。本明細書中で使用される「発現ベクター」は、プラスミドなどのベクター、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および、宿主のゲノムへのＤＮＡフラグメントの組込みを可能にする他のビヒクルを包含する。発現ベクターは、典型的には、所望される遺伝子またはそのフラグメントと、好適な宿主細胞において認識される機能的に連結された遺伝的制御エレメントとを含有する自己複製性のＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物であり、所望される遺伝子の発現をもたらす。これらの制御エレメントは、好適な宿主における発現をもたらすことができる。一般に、遺伝的制御エレメントは原核生物プロモーターシステムまたは真核生物プロモーター発現制御システムを含むことができる。そのようなシステムは、典型的には、転写プロモーター、転写の開始を制御するための必要に応じて使用されるオペレーター、ＲＮＡ発現のレベルを上昇させるための転写エンハンサー、好適なリボソーム結合部位をコードする配列、ＲＮＡスプライス接合部、転写および翻訳を終結させる配列などを含む。発現ベクターは、通常、ベクターが宿主細胞とは無関係に複製することを可能にする複製起点を含有する。
【００４８】
プラスミドはベクターの最も一般的に使用されている形態であるが、同等の機能を果たし、かつ、この分野で知られているか、または、この分野で知られるようになる他の形態のベクターが本発明における使用のために好適である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ他、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８５年および増刊）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｄｒｉｑｕｅｚ他（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ（１９８８）を参照のこと（これらは参照により本明細書中に組み込まれる）。
【００４９】
一般に、そのようなベクターはまた、形質転換された細胞における表現型選択を提供することができる特定の遺伝子を含有する。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を発現させるための原核生物性および真核生物性のウイルス発現ベクターの使用もまた意図される。
【００５０】
場合により、ベクターは、（下記の実施例に関して記載されるように）一般的な植物ベクターであり得る。あるいは、ベクターは、場合により、根細胞に対して特異的であり得る。
【００５１】
１つの好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は真核生物細胞または原核生物細胞であり得る。
【００５２】
具体的な実施形態において、本発明の宿主細胞は原核生物細胞であり、好ましくは細菌細胞であり、最も好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞である。これらの細胞は、下記で記載される好ましい植物宿主細胞に感染させるために使用させる。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は真核生物細胞であってもよく、好ましくは植物細胞（例えば、根細胞、葉細胞、茎細胞、葉柄細胞、分裂組織細胞、および果実細胞（例えば、ブドウの実））である。好ましい実施形態によると、植物根細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスで形質転換された植物根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される。
【００５４】
好ましい実施形態において、植物根細胞はニンジン細胞である。本発明の形質転換されたニンジン細胞は懸濁状態で増殖することに留意しなければならない。上記で言及され、また、実施例において記載されるように、これらの細胞は本発明のアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞で形質転換される。
【００５５】
述べられたように、本発明の核酸構築物（プラスミド、これは本明細書中上記で記載される）は、植物細胞を安定的または一過性に形質転換するために利用することができる。安定的な形質転換では、本発明の核酸分子は植物のゲノムに組み込まれ、そのため、安定で、かつ、受け継がれる形質を表す。一過性の形質転換では、核酸分子が、形質転換された細胞によって発現されるが、ゲノムには組み込まれず、そのため、一過性の形質を表す。
【００５６】
単子葉植物および双子葉植物の両方に外来遺伝子を導入する様々な方法が存在している（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．（１９９１）．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２，２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ．ら（１９８９）．Ｆｅｒｔｉｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）．３３８：２７４−２７６）。
【００５７】
外因性ＤＮＡの植物のゲノムＤＮＡへの安定した組み込みの原則的な方法としては、２つの主なアプローチが挙げられる：
（ｉ）アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子導入：Ｋｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．ら（１９８７）．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８，４６７−４８６；Ｋｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．およびＲｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９８９）．Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，第６巻，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ，ｐｐ．２−２５，Ｊ．ＳｃｈｅｌｌおよびＬ．Ｋ．Ｖａｓｉｌ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ．；およびＧａｔｅｎｂｙ，Ａ．Ａ．（１９８９）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｐｐ．９３−１１２，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ｋｕｎｇ，およびＣ．Ｊ．Ａｒｎｔｚｅｎ編，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．を参照のこと。
（ｉｉ）直接ＤＮＡ取り込み 例えば：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．ら，（１９８９）．Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，第６巻，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ，ｐｐ．５２−６８，Ｊ．Ｓｃｈｅｌｌ，およびＬ．Ｋ．Ｖａｓｉｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ，；およびＴｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら，（１９８８）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ６，１０７２−１０７４（プロトプラストにＤＮＡを直接取り込むための方法）を参照のこと。また、Ｚｈａｎｇら，（１９８８）．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ７，３７９−３８４；およびＦｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．ら．，（１９８６）．Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３１９，７９１−７９３（植物細胞の短時間の電気的ショックによって誘導されるＤＮＡの取り込み）を参照のこと。また、Ｋｌｅｉｎら，（１９８８）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３；ＭｃＣａｂｅ，Ｄ．Ｅ．ら．（１９８８）．Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ） ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，９２３−９２６；およびＳａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．（１９９０）．Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｔａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ７９，２０６−２０９（粒子衝突による植物細胞または組織へのＤＮＡの注入）を参照のこと。また、Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９８７）．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ７５，３０−３６；およびＮｅｕｈａｕｓ，Ｊ．Ｍ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｃ．（１９９０）．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ７９，２１３−２１７（マイクロピペットシステムの使用）を参照のこと。米国特許第５４６４７６５号（細胞培養物、胚、またはカルス組織の、ガラス繊維または炭化シリコンウィスカー形質転換）を参照のこと。あるいは、ＤｅＷｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．ら，（１９８５）．「Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ） ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｏｌｌｅｎ，」Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ，Ｇ．Ｐ．Ｃｈａｐｍａｎら編，Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．１９７−２０９；およびＯｈｔａ，Ｙ．（１９８６）．Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｉｚｅ ｂｙ ａ Ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｏｌｌｅｎ ａｎｄ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７１５−７１９（発芽花粉とのＤＮＡの直接のインキュベーション）を参照のこと。
【００５８】
アグロバクテリウムによって媒介されるシステムには、植物のゲノムＤＮＡに組み込まれる定義されたＤＮＡセグメントを含むプラスミドベクターの使用が含まれる。植物組織の接種方法は、植物種、およびアグロバクテリウム送達システムに応じて様々である。広く使用されているアプローチは、リーフディスク手順であり、これは、全植物の分化の開始のための良好な供給源を提供する任意の組織外植片を用いて行うことができる（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．ら，（１９８８）．「Ｌｅａｆ ｄｉｓｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５，１−９，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）。補助的なアプローチでは、減圧浸透と組み合わせてアグロバクテリウム送達システムが使用される。アグロバクテリウムシステムは、トランスジェニック双子葉植物の作成において特に有用である。
【００５９】
植物細胞への直接のＤＮＡの導入については、種々の方法が存在している。エレクトロポレーションにおいては、プロトプラストは強い電場に短時間さらされ、ＤＮＡを中に入れるように小孔を開く。マイクロインジェクションでは、マイクロピペットを使用してＤＮＡが細胞に直接機械的に注入される。マイクロ粒子衝突では、ＤＮＡは、硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子のようなマイクロプロジェクタイル上に吸着させられ、マイクロプロジェクタイルは、細胞または植物組織の中に入るように物理的に加速される。
【００６０】
安定的な形質転換の後、植物の増殖が生じる。植物を増殖させる最も一般的な方法は種子による。しかしながら、種子増殖による再生の欠点は、種子が、メンデル則によって支配される遺伝分散に従って植物によって作製されるので、ヘテロ接合性のために作物において均一性がないことである。すなわち、それぞれの種子が遺伝子的に異なり、また、それぞれがそれ自身の特定の形質を伴って成長する。従って、再生された植物が親のトランスジェニック植物の形質および特徴と同一の形質および特徴を有するように、再生が行われることが好ましい。形質転換された植物を再生させる好ましい方法は、形質転換された植物の迅速かつ一貫した繁殖をもたらす大量増殖による方法である。
【００６１】
大量増殖は、選抜された親植物または栽培品種から切り出された１つだけの組織サンプルから第二世代の植物を成長させるプロセスである。このプロセスは、好ましい組織を有し、かつ、融合タンパク質を発現する植物の大量繁殖を可能にする。新しく作製された植物は元の植物と遺伝子的に同一であり、かつ、元の植物の特徴のすべてを有する。大量増殖では、短い期間での高品質の植物材料の大量生産が可能であり、かつ、元のトランスジェニック植物または形質転換された植物の特徴を保持する選抜された栽培品種の迅速な増殖が提供される。植物クローニングのこの方法の利点には、植物増殖の速度、ならびに、作製された植物の品質および均一性が含まれる。
【００６２】
大量増殖は、段階間での培養培地または成長条件を変化させることを必要とする多段階の手法である。大量増殖プロセスでは、下記の４つの基本的な段階が伴う。第１段階、最初の組織培養；第２段階、組織培養増殖；第３段階、分化および植物形成；および第４段階、温室培養およびハードニング。第１段階の期間中に、組織培養物が確立され、混入物がないことが確認される。第２段階の期間中に、十分な数の組織サンプルが、製造目標を満たすために作製されるまで、最初の組織培養物が増殖させられる。第３段階の期間中に、新しく成長した組織サンプルが分割され、個々の幼植物体に成長させられる。第４段階において、形質転換された幼植物体がハードニングのために温室に移され、温室において、光に対する植物の寛容性が徐々に増大させられ、その結果、植物は自然の環境で成長し続けることができる。
【００６３】
本発明の現在既知の好ましい実施形態によれば、組換えタンパク質を、米国特許第６３９１６３８号（２００２年５月２１日発行、これは、全体が本明細書中に示されているかのように参考として本明細書に組み込まれる）に関して記載されるデバイスにおいて培養することにより本発明による植物細胞によって製造することができる。植物細胞をこのデバイスとともに懸濁状態で培養するための条件が、本発明者らの１人による「細胞／組織培養デバイス、システムおよび方法」と題される米国特許出願で、本出願と同様に所有される米国特許出願（これは、全体が本明細書中に示されているかのように参考として本明細書に組み込まれる）に関して記載される。
【００６４】
安定的な形質転換が現在好ましいが、例えば、葉細胞、分裂組織細胞または植物体全体の一過性の形質転換もまた本発明によって想定される。
【００６５】
一過性の形質転換を、上記で記載された直接的なＤＮＡ移動方法のいずれかによって、または、改変された植物ウイルスを使用するウイルス感染によって行うことができる。
【００６６】
植物宿主の形質転換のために有用であることが示されているウイルスには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびバキュロウイルス（ＢＶ）が含まれる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換が、例えば、米国特許第４８５５２３７号（ビーンゴールデンモザイクウイルス、ＢＧＭＶ）；欧州特許ＥＰＡ６７５５３（ＴＭＶ）；特開昭６３−１４６９３（ＴＭＶ）；欧州特許ＥＰＡ１９４８０９（ＢＶ）；欧州特許ＥＰＡ２７８６６７（ＢＶ）；およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．他（１９８８）、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７２頁〜１８９頁）に記載される。外来ＤＮＡを、植物を含む多くの宿主において発現させることにおける偽ウイルス粒子の使用が国際特許出願公開ＷＯ８７／０６２６１に記載される。
【００６７】
非ウイルス性の外因性核酸配列の植物における導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築が上記の参考文献によって記載され、また同様に、Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．他（１９８９）、タバコモザイクウイルスハイブリッドは付加遺伝子を発現および喪失する、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７２、２８５〜２９２；Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．他（１９８６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３１、１２９４〜１２９７；および、Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．他（１９９０）、タバコモザイクウイルスＲＮＡベクターを使用するタバコプロトプラストにおけるエンケファリンの産生、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、２６９、７３〜７６によって記載される。
【００６８】
形質転換用ウイルスがＤＮＡウイルスであるならば、当業者は、ウイルス自体に対する好適な改変を行うことができる。あるいは、ウイルスを、外来ＤＮＡを伴う所望のウイルスベクターを構築することの容易さのために、最初に細菌プラスミドにクローン化することができる。その後、ウイルスをプラスミドから切り出すことができる。ウイルスがＤＮＡウイルスであるならば、細菌の複製起点をウイルスＤＮＡに付け加えることができ、その場合、ウイルスＤＮＡが細菌によって複製される。ＤＮＡの転写および翻訳により、ウイルスＤＮＡをカプシド形成によって包むコートタンパク質が産生される。ウイルスがＲＮＡウイルスであるならば、ウイルスは一般にはｃＤＮＡとしてクローン化され、プラスミドに挿入される。その後、このプラスミドを使用して、植物の遺伝子構築物のすべてが作製される。その場合、ＲＮＡウイルスはプラスミドのウイルス配列から転写され、続いて、ウイルス遺伝子の翻訳により、ウイルスＲＮＡをカプシド形成によって包むコートタンパク質が産生される。
【００６９】
非ウイルス性の外因性核酸配列（例えば、本発明の構築物に含まれる核酸配列など）の植物における導入および翻訳のための植物ＲＮＡウイルスの構築が上記の参考文献ならびに米国特許第５３１６９３１号において明らかにされる。
【００７０】
１つの実施形態において、ウイルス核酸に由来する生来的なコートタンパク質をコードする配列の欠失（非生来的（外来）植物ウイルスコートタンパク質コード配列）と、非生来的なプロモーター（好ましくは、非生来的コートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーター）とを含み、かつ、植物宿主における発現、組換え植物ウイルス核酸のパッケージング、および、組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身的感染を確実にすることを可能にする植物ウイルス核酸が挿入のために提供される。あるいは、生来的なコートタンパク質コード配列は、非生来的なタンパク質が産生されるように、非生来的な核酸配列をその中に挿入することによって非転写性にすることができる。組換え植物ウイルス核酸構築物は１つ以上のさらなる非生来的なサブゲノムプロモーターを含有することができる。それぞれの非生来的なサブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子または核酸配列を植物宿主において転写または発現させることができ、かつ、相互の組換え、および、生来的なサブゲノムプロモーターとの組換えができない。加えて、組換え植物ウイルス核酸構築物は、トランス作用する調節因子と結合し、その下流側に位置するコード配列の転写を調節する１つ以上のシス作用調節エレメント（例えば、エンハンサーなど）を含有することができる。２つ以上の核酸配列が含まれるならば、非生来的な核酸配列を、生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して、または、生来的および非生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入することができる。非生来的な核酸配列はサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写または発現されて、所望の生成物を産生する。
【００７１】
第２の実施形態では、生来的なコートタンパク質コード配列が、非生来的なコートタンパク質コード配列に隣接する代わりに、非生来的なコートタンパク質サブゲノムプロモーターの１つに隣接して設置されることを除いて、組換え植物ウイルス核酸構築物が第１の実施形態でのように提供される。
【００７２】
第３の実施形態では、そのサブゲノムプロモーターに隣接して設置された生来的なコートタンパク質遺伝子と、ウイルス核酸構築物に挿入された１つ以上の非生来的なサブゲノムプロモーターとを含む組換え植物ウイルス核酸構築物が提供される。挿入された非生来的なサブゲノムプロモーターは隣接遺伝子を植物宿主において転写または発現させることができ、かつ、相互の組換え、および、生来的なサブゲノムプロモーターとの組換えができない。非生来的な核酸配列を非生来的なサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入することができ、その結果、前記配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写または翻訳されて、所望の生成物を産生させるようにすることができる。
【００７３】
第４の実施形態では、生来的なコートタンパク質コード配列が非生来的なコートタンパク質コード配列によって置き換えられることを除いて、組換え植物ウイルス核酸構築物が第３の実施形態でのように提供される。
【００７４】
ウイルスベクターは、本明細書中上記で記載されるような組換え植物ウイルス核酸構築物によってコードされる発現したコートタンパク質によってカプシド形成して、組換え植物ウイルスを生じさせる。組換え植物ウイルス核酸構築物または組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物に感染させるために使用される。組換え植物ウイルス核酸構築物は、宿主における複製、宿主内での全身的な拡大、および、所望のタンパク質を産生させるための宿主における１つ以上の外来遺伝子（単離された核酸）の転写または発現が可能である。
【００７５】
上記に加えて、本発明の核酸分子はまた、葉緑体ゲノムに導入することができ、それによって、葉緑体での発現を可能にすることができる。
【００７６】
外因性核酸配列を葉緑体のゲノムに導入するための技術が知られている。この技術は下記の手順を伴う。第１に、植物細胞を、細胞あたりの葉緑体の数を約１個に減らすように化学的に処理される。その後、外因性核酸が、少なくとも１つの外因性核酸分子を葉緑体に導入することを目指して、好ましくは粒子衝撃によって細胞に導入される。外因性核酸は、相同的組換え（これは葉緑体に固有の酵素によって容易に行われる）による葉緑体ゲノムへの組込みを可能にするように当業者によって選択される。この目的のために、外因性核酸は、目的とする遺伝子に加えて、葉緑体ゲノムに由来する少なくとも１つの核酸配列を含む。加えて、外因性核酸は選択マーカーを含み、そのような選択マーカーは、逐次的な選抜手法によって、そのような選抜の後の葉緑体ゲノムのすべてまたは実質的にすべてのコピー体が外因性核酸を含むことを確認することを当業者に可能するために役立つ。この技術に関するさらなる詳細が、米国特許第４９４５０５０号および同第５６９３５０７号に見出される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。従って、ポリペプチドを葉緑体のタンパク質発現系によって産生させることができ、かつ、葉緑体の内膜に一体化させることができる。
図面の簡単な記述
【００７７】
添付されている図面は本発明の特定の局面を例示しているが、いかなる点でも限定であることは意図されない。
図１は、Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す；軽鎖および重鎖の両方のエキソン配列が赤色で強調される。配列は下記の通りである：ｐＧ１ＫＤ２１０．ＢＡＴ−ＲＨｃＲＫｄ−ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖；およびｐＧ４ＫＤ１１０−ＢＡＲＨｃＲＫｄ−ＩｇＧ４の重鎖および軽鎖。
【００７８】
図２は、抗体のための合成遺伝子の配列を示す。推定されるアミノ酸配列が核酸配列の上に示される。主要な制限部位が核酸配列の下に示される。サブクローニングのために使用された制限部位が太字で示される。配列は下記の通りである（名称の後に、存在する制限部位が続く；クローニングのために使用された制限部位が太字で示される）：
【００７９】
図３は、発現カセットおよびバイナリーベクターへの合成遺伝子のクローニングを示す。図３Ａは、植物の標的化シグナルを伴う合成遺伝子の構築を示す：合成遺伝子は下記の１つを含有する−制限部位前の停止コドン（その結果、アポプラストに標的化される）（構築物２、構築物６、構築物１０）、液胞標的化ペプチドをコードし、その後に停止コドンが続く配列（液胞に標的化される；構築物４、構築物８、構築物１２）、または、シグナル配列が存在せず、ＥＲ保持シグナルに融合される（ＥＲに標的化される；構築物３、構築物７、構築物１１）。図３Ｂは、ヒトのシグナルペプチド配列を伴う合成遺伝子の構築を示す。この合成遺伝子はヒト天然抗体のシグナルとともに始まり、停止コドンで終了する。
【００８０】
図４は、ウエスタンブロット分析によって検出されたときのＩｇＧ１の重鎖および軽鎖（図４Ａ）ならびにＩｇＧ４の重鎖および軽鎖（図４Ｂ）の発現を示す。形質転換されたニンジンカルスを抗体の重鎖および軽鎖の産生についてスクリーニングした。１ｇのカルスを抽出緩衝液とともにホモジネートし、１５ｍｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。重鎖および軽鎖を特異的な抗ＦＣ抗体および抗カッパ抗体により検出した。図４Ａは、ＩｇＧ１（１＋９）を発現する形質転換カルスを示す。標準品（Ｓｔ．）ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖が示される。各レーンは、スクリーニングされた異なるカルスを表す。図４Ｂは、ＩｇＧ４（５＋９）を発現する形質転換カルスを示す。標準品（Ｓｔ．）ＩｇＧ４の重鎖および軽鎖が示される。各レーンは、スクリーニングされた異なるカルスを表す。
【００８１】
図５は、組み立てられたＩｇＧ１（Ａ）およびＩｇＧ４（Ｂ）との、本発明による産生性細胞株により産生された抗体のウエスタンブロット分析を示す。選択されたカルスの細胞懸濁物を、組み立てられたＩｇＧ１またはＩｇＧ４の産生および分泌について分析した。１ｇのカルスを抽出緩衝液とともにホモジネートし、１５ｍｇの可溶性抽出物および２０ｍｌの培地を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。組み立てられたＩｇＧ１鎖およびＩｇＧ４鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。数字は、単離された異なるカルスを表し、また、標準のＩｇＧ４が示される。
【００８２】
図６は、Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカチオン交換カラムでのＩｇＧ１発現細胞抽出物の分離を示す。ＩｇＧ１精製における最初の工程をクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った：清澄化された抽出物を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）において平衡化された強カチオン交換カラム（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に負荷した。ＩｇＧ１の溶出を、１ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液を用いて行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。図６Ａはカチオン交換カラムでの細胞抽出物の標準的な処理を示す。青色は２８０ｎｍでの吸光度を表し、緑色は電気伝導率を表す。分画物番号が示される。図６Ｂは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動され、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写された、処理期間中に集められた分画物を示す。組み立てられたＩｇＧ１鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。総タンパク質負荷および素通り（ＦＴ）が示される。数字は溶出分画物を表し、標準のＩｇＧ１が示される。
【００８３】
図７は、Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカチオン交換カラムでのＩｇＧ４発現細胞抽出物の分離を示す。ＩｇＧ４精製における最初の工程をクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った：清澄化された抽出物を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）において平衡化された強カチオン交換カラム（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に負荷した。ＩｇＧ４の溶出を、１ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液を用いて行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。図７Ａはカチオン交換カラムでの細胞抽出物の標準的な処理を示す。青色は２８０ｎｍでの吸光度を表し、赤色は塩勾配を表す。分画物番号が示される。図７Ｂ。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。組み立てられたＩｇＧ４鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。総タンパク質負荷および素通り（ＦＴ１、ＦＴ２）が示され、数字は溶出分画物を表し、標準のＩｇＧ４が示される。
【００８４】
図８ａ〜図８ｂおよび図９ａ〜図９ｂは、ＩｇＧ１（図８Ａ）およびＩｇＧ４（図９Ａ）のプロテインＡでの典型的な処理を、選択された分画物のウエスタンブロット分析（図８Ｂおよび図９Ｂ）と一緒に表す。
【００８５】
図８は、プロテインＡセファロースで分離された、カチオン交換溶出からのＩｇＧ１含有分画物を示す。ＩｇＧ１精製における第２の工程をプロテインＡクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った。カチオン交換カラムからのＩｇＧ４含有分画物をプールし、プロテインＡセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ）で分離した。ＩｇＧ１の溶出をクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）により行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。図８ＡはプロテインＡセファロースカラムでの標準的な処理を示す。図８Ｂ。処理期間中に集められた分画物を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。組み立てられたＩｇＧ１鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。総タンパク質負荷が示される。数字は溶出分画物を表し、標準のＩｇＧ１が示される。
【００８６】
図９は、プロテインＡセファロースで分離された、カチオン交換溶出からのＩｇＧ４含有分画物を示す。ＩｇＧ４精製における第２の工程をプロテインＡクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った。カチオン交換カラムからのＩｇＧ４含有分画物をプールし、プロテインＡセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ）で分離した。ＩｇＧ４の溶出をクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）により行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。図９ＡはプロテインＡセファロースカラムでの標準的な処理を示す。図９Ｂ。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。組み立てられたＩｇＧ４鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。総タンパク質負荷が示される。数字は溶出分画物を表し、標準のＩｇＧ４が示される。
【００８７】
図１０ａ〜図１０ｂおよび図１１ａ〜図１１ｂは、精製されたＩｇＧ１タンパク質およびＩｇＧ４タンパク質のウエスタンブロットおよびクーマシー染色をそれぞれ示す。
【００８８】
図１０は、精製されたＩｇＧ１のウエスタンブロットおよびクーマシー染色を示す。精製されたＰｒｏｔａｌｉｘ−ＩｇＧ１および市販（標準）のＩｇＧ１を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、抗ＦＣ抗体とのウエスタンブロット（Ａ）によって、また、クーマシー染色（Ｂ）によって分析した。図１０Ａは、ＩｇＧ１標準物の５０ｎｇ（１）、Ｐｒｏｔａｌｉｘ ＩｇＧ１の１：５希釈物（２）を示す。図１０Ｂは、ＩｇＧ１標準物の１ｍｇ（１）、０．５ｍｇ（２）、ＭＷマーカー（３）、Ｐｒｏｔａｌｉｘ ＩｇＧ１（４〜７）を示す。ＭＷマーカーのサイズが示される。
【００８９】
図１１は、精製されたＩｇＧ４のウエスタンブロットおよびクーマシー染色を示す。精製されたＰｒｏｔａｌｉｘ−ＩｇＧ４および市販（標準）のＩｇＧ４を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、抗ＦＣ抗体とのウエスタンブロット（Ａ）によって、また、クーマシー染色（Ｂ）によって分析した。図１１Ａは、ＩｇＧ４標準物の１００ｎｇ（１）、５０ｎｇ（２）、２５ｎｇ（３）、Ｐｒｏｔａｌｉｘ ＩｇＧ４の１：５希釈物（４）を示す。図１１Ｂは、ＩｇＧ４標準物の１ｍｇ（１）、０．５ｍｇ（２）、０．２５ｍｇ（３）、０．１２５ｍｇ（４）、Ｐｒｏｔａｌｉｘ ＩｇＧ４（５）を示す。ＭＷマーカーのサイズが示される。
【００９０】
図１２は、ＰｒｏｔａｌｉｘのＩｇＧ１、ＩｇＧ４、および、ＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１とインキュベーションされた細胞の、ＦＡＣＳ分析により測定されたときの蛍光強度における変化を示す。特異的な表面抗原を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を０．１ｍｌの精製された抗体と５０ｍｇ／ｍｌでインキュベーションした。結合した抗体を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体、その後、ＰＥ−コンジュゲート化ストレプトアビジンを使用して検出した。非標識の細胞をコントロールとして使用した。Ａ：異なる抗体（凡例を参照）により染色された細胞のＦＡＣＳ分析、Ｂ：分析されたサンプルの平均蛍光。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９１】
本発明は、抗体を植物細胞培養において製造するシステムおよび方法に関する。本発明はまた、（本明細書中における例示的な抗体であり、かつ、本発明（およびその最良の実施）を例示するために提供されるＣｕｒｅｔｅｃｈ抗体を除き、また、いかなる点でも限定であることは何ら意図されることなく）そのようなシステムおよびその方法に従って製造される抗体を包含し、また、同様に宿主細胞およびそのベクターを包含する。
【００９２】
驚くべきことに、また、背景の教示に反して、本発明者らは、本発明による抗体が、哺乳動物細胞の培養で産生された抗体と比較して、より大きい結合効率を有することを見出している。さらに、本発明者らはまた、植物細胞の培養では以前に明らかにされていなかった、安定で、かつ、非常に機能的なＩｇＧ４タイプの抗体を製造することができた。実際、ＩｇＧ４の発現は植物細胞の培養（または植物細胞のいずれかのタイプ）ではこれまで一度も明らかにされてない。
【００９３】
１つだけの仮説によって限定されることを望まないが、本発明に従って製造された抗体のより大きい結合親和性は、哺乳動物細胞の培養で製造された抗体と対照的ではあるが、示差的なグリコシル化に関連づけられ得ることが考えられる。抗体は、異なった影響を抗体自身のグリコシル化パターンによって受ける少なくとも２つの重要な生物学的機能を有する。抗体は、一方では、抗原と結合することができる必要があるが、免疫系を活性化するために、エフェクターリガンドを活性化することができる必要もある。
【００９４】
有効な抗体は免疫系を下記のように活性化する。抗体がその抗原に結合すると、抗体は免疫系を補強し、その抗原を特徴とする標的（例えば、悪性細胞）を破壊する。抗体のＦＣ領域が、免疫系を活性化し、かつ、マクロファージ細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞の動員を引き起こす因子と相互作用することができる。抗体はまた、免疫系の細胞に加えて、血液中に見出されるタンパク質を含む補体系を活性化する。活性化されると、補体系は様々な応答を生じさせることができる。このような補体系は、（１）細胞表面への抗体結合、（２）免疫複合体の形成、および（３）異物細胞膜の炭水化物成分の３つの別個の活性化誘因からなる。エフェクターリガンドを活性化する能力は、以前に記載されたように、グリコシル化の具体的なタイプおよび程度によって影響を受ける。
【００９５】
しかしながら、抗原に対する抗体の結合はグリコシル化によって影響を受けない（例えば、参考文献２７および参考文献３２を参照のこと）。本発明による植物細胞培養システムで製造された例示的な抗体は、哺乳動物のＣＨＯ細胞で製造されたＩｇＧ１抗体よりも大きい親和性を抗原について有し、かつ、強く抗原に結合することが示されている。また、この例示的な抗体はＩｇＧ４サブタイプの機能的な例として安定に産生された。これが植物細胞培養システムにおいて可能であるとは以前には明らかにされていなかった。
【００９６】
植物細胞は、現行の「医薬品安全性試験実施基準」（ｃＧＬＰ）および「医薬品の製造および品質管理に関する基準」（ｃＧＭＰ）を使用して、固体培地での脱分化した細胞の集塊物（カルス）として、または、細胞懸濁物としてインビトロで培養することができる（４４）。哺乳動物細胞の培養と比較して、植物細胞の培養は比較的安価であり、また、細胞は一般に、動物細胞の培養物よりも丈夫である。重要なことに、植物細胞は、免疫グロブリンの正しい組み立て、折り畳みおよび可能な分泌のために要求される内因性の膜システムおよび補助的なタンパク質装置を有する。最初のタンパク質グリコシル化は、哺乳動物のシステムにおいて観測されるパターンにかなり匹敵しているが、様々な違いが組換えタンパク質の末端糖残基の中に観測されている（４５）（１８）。
【００９７】
高マンノースＮ−結合型グリカンおよび複合Ｎ−結合型グリカンの基本的な生合成経路は、植物を含むすべての真核生物の間で非常に保存されている。異なるシグナルペプチドの使用、従って、異なる細胞内輸送は、他の発現システムと比較して、グリコシル化パターンを変化させることができ、かつ、タンパク質の活性および安定性を改善することができる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９６９７８を参照のこと）。
【００９８】
トランスジェニックタバコ植物において製造されたモノクローナル抗体Ｇｕｙ’ｓ１３（プランティボディー（ｐｌａｎｔｉｂｏｄｙ）Ｇｕｙ’ｓ１３）の重鎖に結合したＮ−結合型グリカンの構造が特定され、マウス起源の対応するＩｇＧ１に見出される構造と比較された（２９）。プランティボディーＧｕｙ’ｓ１３の重鎖に位置する２つのＮ−グリコシル化部位はともにマウスでのようにＮ−グリコシル化される。しかしながら、Ｇｕｙ’ｓ１３の糖型の数は、植物での方が哺乳動物発現システムの場合よりも大きい。プランティボディーのＮ−グリカンの構造的多様性が大きいにもかかわらず、グルコシル化は、可溶性で、かつ、生物学的に活性なＩｇＧを植物システムにおいて製造するために充分であるようである。植物の糖タンパク質は、哺乳動物の糖タンパク質によって示されるグリコシル化パターンに対して様々な異なるグリコシル化パターンを示すので、望ましくない免疫応答を哺乳動物において誘導するこれらの植物組換え抗体の可能性を調べた。様々な分析により、植物組換え抗体のタンパク質部分およびグリカン部分の両方に向けられた抗体は検出できないレベルであることが示された。これらの結果は、ヒトにおける治療剤およびワクチンとしての植物組換えタンパク質の適用についての直接的な関連性を有している（４７）。
【００９９】
述べられたように、植物はヒトのタンパク質をその正しい位置においてグリコシル化するが、完全にプロセシングされた複雑な植物グリカンの組成は哺乳動物のＮ−結合型グリカンとは異なる。植物のグリカンは、動物のグリカンでは共通する末端シアル酸残基またはガラクトース残基を有しておらず、また、多くの場合、哺乳動物では一般に見出されない結合を伴うキシロース残基またはフコース残基を含有する（Ｊｅｎｋｉｎｓ他、１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、９７５〜９８１（１９９６）；ＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓおよびＦａｙｅ、ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ、９９頁〜１１４頁（Ｏｗｅｎ，Ｍ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９６）；Ｒｕｓｓｅｌｌ ２４０ Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９））。具体的には、植物は、哺乳動物では見出されないさらなるβ１−２結合したキシロシル残基およびα１−３結合したフコシル残基を含む。逆に、植物は、哺乳動物において存在するフコシル−１−６−残基を含まない。従って、本発明は、植物のグリコシル化パターンを有する抗体（好ましくは、ＩｇＧ４イソタイプ）を教示する。
【０１００】
本明細書中で使用されるように、植物のグリコシル化パターンは、少なくとも１つのβ１−２結合したキシロシル残基または少なくとも１つのα１−３結合したフコシル残基を含む。グリコシル化パターンはまた、ヒトのグリコシル化パターン（例えば、ガラクトース残基またはシアル酸残基）を部分的に含むことができる。
【０１０１】
シアル酸残基は、ヒト受容者における関連ポリペプチドのインビボ半減期を延ばす薬物動態学的理由のために要求されることが理解される。従って、本発明では、例えば、植物において合成された抗体製造物のグリカンの「ヒト化」の問題に対処し、その結果、抗体製造物が、好ましくは、部分的な植物グリコシル化パターンおよび部分的なヒトグリコシル化パターンを含むようにするための様々な戦略の使用が意図される（これは本明細書中上記で詳細に記載される）。
【０１０２】
ＩｇＧ４抗体の発現がトランスジェニックヤギの乳汁およびマウス骨髄腫細胞株ＮＳＯにおいて記載されている（４８、４９）。ＮＳＯ細胞において発現された抗ＴＧＦｂｅｔａ２ ＩｇＧ４はＴＧＦｂｅｔａ２に対する大きい親和性を有し、かつ、ＴＧＦｂｅｔａ２の抗増殖作用を中和し、従って、ＴＧＦｂｅｔａ２によって媒介される線維性疾患の治療において提案されている。しかしながら、ＮＳＯ細胞で産生されたタンパク質のグリコシル化パターンはヒトにおけるグリコシル化パターンとは異なる。例えば、グリコシド構造は、免疫原性エピトープを表すさらなるガラクトースα（１−３）構造を含む。循環ＩｇＧの１％がこのエピトープに対する特異的な抗体であることが推定される。従って、そのようなエピトープを有する組換え抗体の注入は、免疫複合体の形成を生じさせ、全身的な炎症性応答を引き起こすことが考えられる（４９）（５０）。
【０１０３】
開示および記載される場合、本発明は、本明細書中に開示される特定の例、プロセス工程および材料に限定されないことを理解しなければならない。これは、そのようなプロセス工程および材料は幾分異なり得るからである。本発明の範囲は、添付された請求項およびその均等物によってのみ限定されるので、本明細書中で使用されている用語法は、特定の実施形態を記載する目的のために使用されるだけであり、限定であることを意図していないこともまた理解しなければならない。
以下は、本願全体を通して使用される用語の非限定的な説明である。
【０１０４】
本明細書および下記の請求項を通して、文脈がそうでないことを要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および変化形（例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」など）は、言及された完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）もしくは工程または完全体もしくは工程の群を包含するが、任意の他の完全体もしくは工程または完全体もしくは工程の群を排除しないことを意味することが理解される。
【０１０５】
本明細書および添付された請求項において使用されるように、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の参照物を含むことに留意しなければならない。
【０１０６】
下記の実施例は、本発明の様々な局面を実施する際に本発明者らによって用いられた様々な技術を表している。これらの技術は本発明の実施のための好ましい実施形態を例示しているが、当業者は、本開示に照らして、数多くの改変が、本発明の精神および意図された範囲から逸脱することなく行われ得ることを認識することを理解しなければならない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
本発明のシステムにおける抗体の製造
本実施例では、本発明によるシステムにおける例示的な抗体の製造が記載される。
【０１０８】
材料および方法：
合成遺伝子
組換えヒトＩｇＧの配列をＣｕｒｅＴｅｃｈから受け取った。この配列を図１に関して示す。ｐＧ１ＫＤ２１０およびｐＧ４ＫＤ１１０と名付けられたベクターは重鎖配列および軽鎖配列の両方を含有する。ｐＧ１ＫＤ２１０は重鎖γ１をコードし、ｐＧ４ＫＤ１１０は重鎖γ４をコードする（図１を参照のこと）。すべての遺伝子はイントロンを含有した。公開されているデータベースおよび分子生物学プログラムを使用して、抗体遺伝子の重鎖および軽鎖のコード領域ならびにスプライス部位を位置づけた。
【０１０９】
スプライス部位の予測を、ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／において見出されるＮｅｔＧｅｎｅ２プログラムを使用することによって行った（下記の参考文献もまた参照のこと：Ｓ．Ｍ．Ｈｅｂｓｇａａｒｄ、Ｐ．Ｇ．Ｋｏｒｎｉｎｇ、Ｎ．Ｔｏｌｓｔｒｕｐ、Ｊ．Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ、Ｐ．Ｒｏｕｚｅ、Ｓ．Ｂｒｕｎａｋ、局所的および全体的な配列情報を組み合わせることによるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＤＮＡにおけるスプライス部位予測、１９９６、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４：３４３９〜３４５２；Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．およびＫｎｕｄｓｅｎ，Ｓ．、ＤＮＡ配列からのヒトｍＲＮＡのドナー部位およびアクセプター部位の予測、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２０：４９〜６５）。
【０１１０】
これは、ヒトのイントロンは植物では正しく認識されないかもしれないので、元のヒト抗体のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするイントロン非含有の合成遺伝子を調製するために必要であった。
【０１１１】
タンパク質配列をＣｕｒｅｔｅｃｈ（本ヒト抗体の最初の作製者）により確認した後、配列を、ニンジンの最適なコドン使用を使用して逆翻訳した。ＤＮＡ配列を、タンパク質配列を改変することなく、制限部位、および、高レベルの発現を妨害するかもしれない配列を避けるために改変した。
【０１１２】
生物毎のコドン使用をＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）において見出すことができる。通常、コドン使用の頻度はそれらの同族ｔＲＮＡの存在量を反映する。従って、標的タンパク質のコドン使用が発現宿主の平均的なコドン使用から著しく異なるとき、これは様々な問題を発現時に引き起こし得る。多くの場合、下記の問題に遭遇する：
＊（翻訳を低下させることによる）低下したｍＲＮＡ安定性。
＊転写および／または翻訳の早期停止、これは様々な短縮化されたタンパク質産物を生じさせる。
＊フレームシフト、欠失および誤った取り込み（例えば、アルギニンに代わるリシン）。
＊タンパク質合成および細胞増殖の阻害。
【０１１３】
結果として、観測される発現レベルは低いことが多いか、あるいは、希なコドンがｍＲＮＡの５’末端に存在するか、またはクラスターで存在するときには特に、発現が全く認められない。これは発現レベルを低下させ、また、短縮化されたタンパク質産物が見出される。
【０１１４】
発現レベルを、高発現のニンジン遺伝子において希にしか見出されないコドンを、遺伝子全体を通して、より有利な（ニンジン細胞において頻繁に使用される）コドンで置換することによって改善することができる。
【０１１５】
制限部位を、図２に関して示されるように、容易なクローニングを促進するために、３つの抗体鎖（γ１、γ４およびκ）をコードする配列の前後に導入した。配列の種々の改変を、最大の発現レベルおよび代替のグリコシル化パターンがどこで達成され得るかを調べるために、組換え抗体が植物細胞における異なるオルガネラに標的化されることを可能にするように行った（３３〜３６）。この目的のために、さらなる構築物を調製した（この場合、制限部位が、シグナルペプチドを植物のシグナルペプチドのための配列で置換するために、元の生来的なヒトのシグナルペプチドをコードする配列の代わりに導入された）。抗体をＥＲに対して標的化するために、停止コドンを、ＥＲ保持シグナルとの融合を容易にするために除いた。液胞に対する標的化を、液胞選別シグナルＧＬＬＶＤＴＭ（配列番号１３）をコードする配列を停止コドンの前に組み込むことによって達成した。これらの構築物がＴｈｅｒｍｏ Ｈｙｂａｉｄ ＧｍｂＨ（Ｕｌｍ、ドイツ）によって合成された。
【０１１６】
プラスミドベクター
ＣＥ−Ｋ。これを、Ｇａｌｉｌｉ教授から得たプラスミドＣＥ［米国特許第５３６７１１０号（１９９４年１１月２２日）］から構築した。プラスミドＣＥをＳａｌＩで消化した。
【０１１７】
ＳａｌＩ付着性末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメントを使用して平滑末端にした。その後、プラスミドをＰｓｔＩで消化し、塩基性エンドキチナーゼ遺伝子［シロイヌナズナ］由来のＥＲ標的化シグナルをコードするＤＮＡフラグメントＡＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＡＡＴＴＣ（配列番号１４）に、また、ＳｍａｌおよびＰｓｔＩで消化されたＥＲ保持シグナルＫＤＥＬ（３７）に連結した。
【０１１８】
ｐＧＲＥＥＮＩＩ。これをＰ．Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ博士から得た（３８）。ｐＧＲＥＥＮＩＩベクターからの発現は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）のΩ翻訳エンハンサーエレメント、および、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のオクトピンシンターゼのターミネーター配列によって制御される。
【０１１９】
発現プラスミドの構築
合成遺伝子をエンドヌクレアーゼのＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、例外として、遺伝子１１の軽鎖ＥＲをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した（合成遺伝子において下線が引かれた制限配列を参照のこと）。重鎖をコードする遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化された発現カセットを有するバイナリーベクターｐＧＲＥＥＮＩＩに連結した。軽鎖をコードする遺伝子を、発現カセットを有し、かつ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化された中間ベクター（ＣＥＫ）に連結した。合成軽鎖遺伝子を伴う発現カセットを中間ベクターから切断および溶出し、対応する重鎖を有するバイナリーベクターに連結し、最終的な発現ベクターを形成した（図３）。カナマイシン耐性が、ｐＧＲＥＥＮベクターと一緒に得られたｎｏｓプロモーターにより駆動されるＮＰＴＩＩ遺伝子によって付与される（図３）。得られた発現カセットを図３に示す。
【０１２０】
表１には、種々の構築物およびそれらの呼称がまとめられる。
【０１２１】
ニンジンカルスの確立および細胞懸濁培養
ニンジンカルスの確立およびニンジン細胞懸濁培養は、Ｔｏｒｒｅｓ Ｋ．Ｃ．によって以前に記載された通りに行われた（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｈｏｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｒｏｐｓ、１１１頁、１６９）。
【０１２２】
ニンジン細胞の形質転換および形質転換された細胞の単離
ニンジン細胞の形質転換を、以前に記載された方法（３９）（４０）の適合化によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換を使用して行った。液体培地で増殖する細胞を、カルスの代わりに、プロセスを通して使用した。インキュベーション時間および増殖時間を、液体培養における細胞の形質転換のために適合させた。簡単に記載すると、アグロバクテリウム細菌をエレクトロポレーションによりｐＧＲＥＥＮ ＩＩベクターシステムで形質転換し、その後、３０ｍｇ／ｍｌのパロモマイシン抗生物質を使用して選択した。ニンジン細胞をアグロバクテリウム細菌で形質転換し、液体培地において６０ｍｇ／ｍｌのパロモマイシン抗生物質を使用して選択した。
【０１２３】
高レベルのＩｇＧ１およびＩｇＧ４を発現するカルスを単離するための形質転換ニンジン細胞のスクリーニング
形質転換後１４日目に、培養から得られた細胞を、個々の細胞クラスターからカルスを形成させるために３％充填細胞体積の希釈度で固体培地に置床した。個々のカルスが１ｃｍ〜２ｃｍの直径に達したとき、細胞を抽出緩衝液においてホモジネートし、得られたタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースメンブラン（ｈｙｂｏｎｄＣニトロセルロース、０．４５ミクロン、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に転写した。重鎖および軽鎖の検出のためのウエスタンブロットを、抗ＦＣ（Ｓｉｇｍａ Ａ−０１７０）および抗Ｋａｐｐａ（Ｓｉｇｍａ Ａ−７１６４）抗体を使用して行った。市販のｈＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ Ｉ５１５４）およびｈＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ Ｉ４６３９）抗体を、標準物として使用した。有意なレベルのＩｇＧ１またはＩｇＧ４を発現するカルスを拡大して、スケールアップ、タンパク質精製および分析のために液体培地での増殖に移した。
【０１２４】
Ｐｒｏｔａｌｉｘのバイオリアクターにおけるスケールアップされた培養での増殖
ＩｇＧ４またはＩｇＧ１を発現する遺伝子改変されたニンジン細胞の１ｃｍ〜２ｃｍの直径の個々のカルスを、４．４ｇｒ／ｌのＭＳＤ培地（Ｄｕｃｈｅｆａ）、９．９ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ（Ｄｕｃｈｅｆａ）、０．５ｍｇ／ｌの葉酸（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｌのビオチン（Ｄｕｃｈｅｆａ）、３０ｇ／ｌの糖、および０．２ｍｇ／ｌの２−４Ｄ（Ｓｉｇｍａ）を含有する、直径９ｃｍのムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）寒天培地平板に置床した。カルスを２〜３週間毎に継代培養し、２５℃で増殖させた。
【０１２５】
懸濁細胞培養を、形質転換されたカルスをＭＳＤ液体培地で継代培養することによって調製した。懸濁細胞を、２５０ｍｌ三角フラスコにおいて、２５℃で、１２０ＲＰＭの振とう速度で培養した（操作体積を２５ｍｌで開始し、７日後に５０ｍｌまで新しい培地を加えた）。その後、細胞を新しい培地で７日間毎に継代培養した。４ＬのＭＳＤ培地を含有する小型バイオリアクター（１０Ｌ）の接種物を、７日間の細胞培養物から得られた４００ｍｌの懸濁細胞を加えることによって得た。１Ｌｐｍの空気流を用いて２５℃で１週間の培養の後、ＭＳＤ培地を１０Ｌにまで加え、培養を同じ条件のもとで継続した。さらに７日間の培養の後、細胞を、細胞培地を１００メッシュの網に通すことによって集め、回収した。過剰な培地を絞り出し、充填細胞ケークを−７０℃で保存した。
【０１２６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析およびクーマシー染色
タンパク質サンプルを還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した（４１）。ゲルをクーマシーブルー染色溶液（Ｂｉｏ Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｃａｔ．１６１−０７８６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により染色したか、または、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ）に転写した。
【０１２７】
ニトロセルロース膜に転写した後、ニトロセルロース上の結合していない結合部位を、リン酸塩緩衝液（Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅＨａｅｎ、カタログ番号３０４３５）により希釈された１％の粉乳（Ｄａｉｒｙ Ａｍｅｒｉｃａ）および０．１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ Ｐ１３７９）を含有するブロッキング緩衝液により４℃で一晩飽和させた。ブロットを、上記のように１％の粉乳および０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）におけるＨＰＲコンジュゲート化抗体（抗ＦＣ（Ｓｉｇｍａ Ａ−０１７０）および／または抗κ（Ｓｉｇｍａ Ａ−７１６４）、１：６５００の希釈）と２５℃で１．５時間インキュベーションした。
【０１２８】
抗体とのインキュベーションの後、ブロットを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにより３回（それぞれの場合において１０分間）洗浄し、次いでＰＢＳにより３回洗浄した。ブロット片をＥＣＬ発色剤試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＲＰＮ２２０９）により染色した。ブロットをＥＣＬ試薬に浸けた後、ブロットをＸ線フィルムＦＵＪＩ Ｓｕｐｅｒ ＲＸ １８ｘ２４に感光させ、ＦＵＪＩ−ＡＮＡＴＯＭＩＸ現像液および固定液（ＦＵＪＩ−Ｘ固定液 ｃａｔ＃ ＦＩＸＲＴＵ １／２）により現像した。抗体が結合したタンパク質を特徴づけるバンドがこの処理の後で視認された。
【０１２９】
タンパク質精製
精製手順はＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方について同様であった。ＩｇＧ精製のために、約１ｋｇの湿重量の細胞を含有する凍結細胞ケークを解凍し、ＩｇＧを、細胞を１Ｌの抽出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、２０ｍＭアスコルビン酸、０．１ｍＭ ＤＴＴ）においてホモジネートすることによって抽出した。ホモジネートを１７０００ｇでの２０分間の４℃における遠心分離によって清澄化した。ペレットを捨て、上清を３０ＫのＭＷＣＯ膜による限外ろ過によって濃縮した。３０Ｋ保持液のｐＨを濃クエン酸の添加によってｐＨ５．５に調節した。ｐＨ調節後に生じた濁りを上記の同じ条件のもとでの遠心分離によって清澄化した。
【０１３０】
さらなる精製をクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った：１２５０ｍｌの清澄化された抽出液を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）において平衡化された、ＸＫカラム（２．６ｘ２０ｃｍ）に充填されている１３５ｍｌの強カチオン交換樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に負荷した。カラムを、電気伝導率、ｐＨおよび２８０ｎｍでの吸光度のモニターリングを可能にするＡＫＴＡプライムシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一体化した。サンプルを４５ｍｌ／分で負荷し、その後、カラムを、ＵＶ吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液（２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）により４５ｍｌ／分の流速で洗浄した。ＩｇＧ４の溶出を、１ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液により行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロット分析によって分析した。ＩｇＧを含有する分画物をプールした。プールしたサンプルのｐＨをＮａＯＨにより７．５に調節した。
【０１３１】
ＩｇＧを含有するサンプルを１０ｍｌのプロテインＡセファロースカラムに加えた。サンプルを１０ｍｌ／分で負荷し、その後、ＵＶ吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液（１００ｍＭクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ＝７．５）により洗浄した。精製されたＩｇＧ組み立て物を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ＝３．４）により溶出し、ＩｇＧを含有する分画物をプールした。プールしたサンプルのｐＨを１ＭのＴｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ Ｔ−６０６６）（ｐＨ８）により７．５に調節し、−２０℃で保存した。
【０１３２】
タンパク質濃度の測定
細胞抽出物および分画物におけるタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン標準品（ＢＳＡ 第Ｖ画分、Ｓｉｇｍａ Ａ−２１５３）を使用してＬｏｗｒｙ／Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｉｏ Ｒａｄタンパク質アッセイ Ｃａｔ．５０００−０００６）（４２）によってアッセイした。あるいは、均質なタンパク質サンプルの濃度は２８０ｎｍにおける吸収によって決定された（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４Ｏ．Ｄ２８０）。純度は２８０／２６０ｎｍ比によって決定された。
【０１３３】
哺乳動物細胞の培養
Ｊｕｒｋａｔ細胞のクローンＥ６−１（ＡＴＣＣカタログ番号ＴＩＢ−１５２）を、１０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０４−１２１−１Ａ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０２０−１Ｂ）、１ｍＭのピルビン酸Ｎａ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０４２−１Ｂ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０２５−１Ｃ）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｎｙｓ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３２−１Ｂ）が補充されたＲＰＭＩ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０１−１０４−１Ａ）において増殖させた。細胞を５％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーターにおいて増殖させた。この細胞は明らかにこれらの抗体の抗原を細胞表面に発現するので、この細胞を選んだ。
【０１３４】
蛍光染色およびＦＡＣＳ分析によるＪｕｒｋａｔ細胞に対するＩｇＧ１結合およびＩｇＧ４結合の測定
特定の表面抗原（これは、以前に記載された抗体によって認識される）を発現する５ｘ１０５個〜１ｘ１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞を１５００ｒｐｍで７分間遠心分離し、培地を除き、細胞を０．５ｍｌの洗浄緩衝液（５％のＦＣＳおよび０．０５％のアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ−２００２）を伴うＰＢＳ）により３回洗浄し、０．１ｍｌの精製された抗体と５０μｇ／ｍｌでインキュベーションした。氷上で４５分間インキュベーションした後、細胞を洗浄緩衝液により２回洗浄した。結合した抗体を、洗浄緩衝液で１：１００希釈されたビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体（ＳＢＡ Ｃａｔ．２０４０−０８）を使用して検出した（１００μｌ／サンプル、氷上で４５分間）。その後、細胞を洗浄緩衝液により２回洗浄し、続いて、１：１００希釈されたＰＥコンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲート化ストレプトアビジン、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｃａｔ．０１６−１１０−０８４）（１００μｌ／サンプル）と氷上で暗所において３０分間インキュベーションした。非標識の細胞、および、ＰＥコンジュゲート化ストレプトアビジンだけで染色された細胞をコントロールとして使用した。その後、細胞を洗浄緩衝液により２回洗浄し、１ｍｌの洗浄緩衝液に懸濁した。ＦＡＣＳ分析を、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアを伴うＢｅｃｋｅｎｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｅｒ装置で行った。
【０１３５】
結果：
異なるオルガネラ標的化による形質転換ニンジン細胞におけるＩｇＧ１およびＩｇＧ４の重鎖および軽鎖の発現
組換え抗体を、最大発現レベルおよび代替のグリコシル化パターンを達成するために異なるオルガネラに対して標的化した。この目的のために、元の生来的なヒトのシグナルペプチドが植物のシグナルペプチドによって置換されたさらなる構築物を調製した。ＥＲ保持シグナルを有する抗体、液胞選別シグナル有する抗体、および、組換えタンパク質を分泌（アポプラスト）のために標的化するＣ末端の標的化配列を有しない構築物を有する抗体をすべて調製した。
【０１３６】
アグロバクテリウム形質転換によるニンジン細胞の形質転換の後、重鎖および軽鎖の発現を調べた。興味深いことに、これらの異なる構築物により形質転換された細胞のスクリーニングでは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方のヒトの天然の抗体シグナル配列を有する構築物（遺伝子１および遺伝子９ならびに遺伝子５および遺伝子９［それぞれ、配列番号３および配列番号７ならびに配列番号１１および配列番号７］の構築物に対応する）が最も強力な構築物であり、その一方で、それ以外は検出可能なレベルのＩｇＧを示さなかったことが明らかにされた（データは示され；１つだけの仮説によって限定されることを望まないが、発現レベルは非常に低いものであり得、および／または、生じるタンパク質が不安定であり、従って、分解され得る）。
【０１３７】
ウエスタンブロット分析によるＩｇＧ１（図４Ａ）およびＩｇＧ４（図４Ｂ）の重鎖および軽鎖の発現を図４に示す。図４はカルスのランダムスクリーニングを表す（約１００個のカルスをそれぞれの構築物についてスクリーニングした）。
【０１３８】
さらに、重鎖および軽鎖の発現レベルが異なることが図４から明らかである。さらなるスクリーニングを、発現したＩｇＧ組み立て物の量および培地への分泌レベルを評価するために行った。調べられた様々なカルスのうち、それぞれの系統からの１つを拡大増殖およびタンパク質精製のために選択した。
【０１３９】
図５は、本発明による産生性細胞株により産生された抗体のウエスタンブロット分析を示す。最初のスクリーニング（図４）から得られる選択されたカルスを増殖および拡大のために液体培地に移した。選択されたカルスの細胞懸濁物を、組み立てられたＩｇＧ１またはＩｇＧ４の産生および増殖培地への分泌について分析した。図５Ａ（ＩｇＧ１）は、若干のタンパク質が培地に見出されたが、より多くのタンパク質が抽出分画物に見出されたことを示している。図５Ｂ（ＩｇＧ４）は、タンパク質が培地にほとんどなく、少量が抽出分画物に存在することを示している。
【０１４０】
形質転換されたニンジン細胞からのＩｇＧ１およびＩｇＧ４の精製
精製手順はＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方について同様であった。ホモジネート化後、可溶性ＩｇＧを、材料および方法において記載されたように、カチオン交換カラムおよびプロテインＡアフィニティーカラムを含むクロマトグラフィー技術を使用して精製した。
【０１４１】
図６Ａおよび図７Ａは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の清澄化されたタンパク質抽出物のカチオン交換カラムでの典型的な処理の結果を示す。処理期間中に集められた分画物を、図６Ｂおよび図７Ｂに見られるように、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。
【０１４２】
カチオン交換カラムからのＩｇＧ溶出プールをプロテインＡアフィニティーカラムで精製した。図８および図９は、ＩｇＧ１（図８Ａ）およびＩｇＧ４（図９Ａ）のプロテインＡでの典型的な処理を、選択された分画物のウエスタンブロット分析（図８Ａおよび図９Ｂ）と一緒に表す。
【０１４３】
図１０および図１１に示される精製されたＩｇＧ１タンパク質およびＩｇＧ４タンパク質のウエスタンブロットおよびクーマシー染色は、植物細胞で産生されたＩｇＧが数個の主要なタンパク質バンドを示すことを明らかにしている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元条件下で処理されたＩｇＧの予想サイズは、市販の標準物のヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４によって明らかにされるように１７５ｋＤａを超えるが、植物細胞により発現されたＩｇＧ１はもう１つの主要なバンドを１５０ｋＤａにおいて示し、ＩｇＧ４は２つのさらなるバンドを１５０ｋＤａおよび５０ｋＤａにおいて示す。これらのさらなるバンドは、１つだけの仮説によって限定されることは望まないが、分解した結果だけでなく、不十分な組み立てまたは誤った組み立ての結果である場合がある。
【０１４４】
組み立てられた抗体は２つの重鎖および２つの軽鎖からなり、それらはジスルフィド架橋および他のタンパク質−タンパク質相互作用によって結び付けられている。しかしながら、場合により、結合が壊れ、再び形成し、これにより、異なるサイズを有し、かつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析において異なるバンドを示す、重鎖−重鎖、重鎖または軽鎖の種々の組合せをもたらし得る。
【０１４５】
分解は可能性がほとんどない。このようなバンドは、プロテインＡカラムから直接に溶出される調製物においてさえ現れ、組み立てられたＩｇＧに対して特異的であるからである。鎖内ジスルフィド架橋および鎖間ジスルフィド架橋の間での交換に起因する、ＩｇＧ４の中でのＩｇＧ半分子（１つの重鎖および１つの軽鎖）のインビボ交換の証拠（４３）。重鎖および軽鎖がジスルフィド結合によって結び付けられ（これは鎖間と呼ばれる）、しかし、重鎖自身および軽鎖自身の内部での結合（鎖内）もまた存在する。
【０１４６】
蛍光染色およびＦＡＣＳ分析によるＪｕｒｋａｔ細胞に対するＩｇＧ１結合およびＩｇＧ４結合の測定
ＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１はＢ細胞白血病（Ｄａｕｄｉ細胞）由来の膜に対して惹起された。その報告された標的および活性はＴ細胞に対してである。本発明による細胞培養システムで製造されたＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ４抗体が、元のＩｇＧ抗体が結合したＪｕｒｋａｔ細胞（急性Ｔ細胞白血病）に存在する特異的な抗原と結合することができることが明らかにされた。図１２に示されるＦＡＣＳ分析の結果は、ＰｒｏｔａｌｉｘのＩｇＧ１、ＩｇＧ４およびＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１とインキュベーションされた細胞の蛍光強度における変化を示す。図１２Ｂに示されるＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１と比較して、ＰｒｏｔａｌｉｘのＩｇＧの平均蛍光における増大は、植物細胞により発現されたＩｇＧ１およびＩｇＧ４の、標的に対する結合が、哺乳動物のＣＨＯ細胞により発現されたＩｇＧ１よりも大きい親和性であることを示している。
【０１４７】
考察：
組換え抗体が、最大の発現レベルおよび代替のグリコシル化パターンを達成するために本発明に従って異なるオルガネラに標的化された。興味深いことに、異なる構築物により形質転換された細胞のスクリーニングでは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方の生来的なＥＲシグナルを含有する構築物が量に関して最も強力な構築物であったことが明らかにされた。これは、植物細胞は、ヒト抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の一部分である「内蔵の」標的化シグナルを利用することができることを意味する。
【０１４８】
細胞内輸送（および、従って、得られるグリコシル化）を操作することによって同じタンパク質における異なるグリコシル化パターンを獲得するという可能性は、タンパク質の機能における炭水化物の役割に関する情報、および、炭水化物構造における変化がタンパク質の立体配座にどのように影響するかの洞察を提供する、異なるグリコシル化構造を有するタンパク質を製造するためのツールとして役立ち得る。
【０１４９】
本発明は、生来的なヒトのリーダーペプチドを使用して、抗体が細胞に蓄積され、同様にまた、培地に分泌されることを明らかにしている（データは示されず）。植物細胞材料からの抗体の精製では、植物細胞の宿主タンパク質の特異な挙動がこれらの方法論では使用される最先端の抽出技術およびクロマトグラフィー技術が利用された。例えば、特定の条件のもとでは、ニンジン宿主細胞のタンパク質のほとんどはイオン交換クロマトグラフィーカラムには結合せず、一方で、ＩｇＧはそのカラムに結合した。このことにより、植物細胞タンパク質からの抗体の迅速な精製が可能となり、その後、組み立てられた抗体がプロテインＡでさらに精製された。植物細胞において発現されたこれらの抗体のグリコシル化パターンが、おそらくは抗体の安定性および機能的挙動のためではあるが、生来的なタンパク質のグリコシル化パターンと類似しているかどうかは今後、明らかにされなければならない。
【０１５０】
植物細胞により発現された抗体が、哺乳動物細胞により発現された抗体と匹敵するレベルでその抗原に結合することができることが明らかにされている（１８、４６）。精製された植物細胞発現抗体Ｃ５−１の、その抗原についての親和性が、平衡時の解離定数を測定することによってハイブリドーマ発現抗体Ｃ５−１の親和性と比較され、結果はそれぞれ４．７ｘ１０−１０Ｍおよび４．６ｘ１０−１０Ｍであった。安定性および血中クリアランス速度もまた比較され、植物細胞発現抗体および哺乳動物細胞発現抗体の両方について類似していることが見出された（４６）。
【０１５１】
それに反して、本発明によるシステムおよび方法を用いた結果は、驚くべきことに、植物細胞により発現されたＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ４抗体の、それらの抗原に対する結合が、ＣＨＯ細胞において発現されたＩｇＧ１と比較して、より大きい親和性を伴って生じたことを示す。抗原に対するＩｇＧ４の結合はＩｇＧ１よりもさらに一層強く、これはこの抗体サブクラスのより大きい親和性を示している。植物に基づくこのシステムにおけるＩｇＧ４の発現レベルは、哺乳動物細胞発現システムにおいて認められる発現レベルよりもはるかに大きい（データは示されず）。これは植物細胞システムの特異な能力をさらに強めている。
【０１５２】
正しく組み立てられ、かつ、それらのエピトープを認識することができる組換えヒトＩｇＧ１分子およびヒトＩｇＧ４分子の植物細胞懸濁状態での製造は、Ｐｒｏｔａｌｉｘ所有のバイオリアクター形態と組み合わされた新しい技術を導入し、また、異なるイソタイプの組換えヒト抗体の商業的規模での製造を可能にする。
【０１５３】
従って、本発明は、懸濁状態でのトランスジェニック植物細胞（例えば、遺伝子組換えニンジン細胞など）において製造される組換えヒト抗体のための新規で、製造規模変更可能で、費用効果的な製造プロセスおよび精製プロセスを提供する。
【０１５４】
実施例２
本発明による治療
本発明に従って製造される組換えタンパク質は、好ましくは、植物細胞培養物によって製造される抗体（これは好ましくはＩｇＧ４であり、しかし、場合により、ＩｇＧ１である場合がある）を含む。
【０１５５】
本明細書中における好ましい実施形態によれば、本発明に従って製造される抗体は、そのような抗体による治療を受け入れることができる疾患の治療に好適である。
【０１５６】
処置方法は、場合により、そして好ましくは、（ａ）形質転換された植物根細胞から精製され、かつ、抗原を効率的に標的化することができる組換え産生された生物学的に活性な抗体を提供することを含む。好ましい実施形態において、本発明の方法によって使用される組換え産生された抗体は、本発明の宿主細胞によって産生され得る。好ましくは、この宿主細胞はニンジン細胞である。
【０１５７】
「哺乳動物対象」または「哺乳動物患者」により、治療が所望される任意の哺乳動物（これには、ヒト、ウシ、ウマ、イヌおよびネコの対象が含まれる）が意味され、最も好ましくは、ヒト対象が意味される。
【０１５８】
用語「処置」はまた、病理学的状態および／またはその１つ以上の症状を改善または緩和すること、そのような状態を治療すること、あるいは、そのような状態を発生を予防することを包含することに留意しなければならない。
【０１５９】
別の好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物細胞培養で産生される等価なＩｇＧ４よりも、抗原に対してより強い結合能力を有するＩｇＧ４である。従って、各用量は、治療効果を達成するために類似する様式で投与される抗体の用量よりも場合により少なくすることができる。あるいは、抗体はより高い治療効果を達成するために類似する用量で投与されてもよい。
【０１６０】
本発明のタンパク質（抗体）は、医薬組成物を製造するために使用することができる。従って、本発明の別の局面によれば、その有効成分として、タンパク質と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数（例えば、組換えタンパク質）を、他の化学的成分（例えば、従来の薬物、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）とともに有する調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対するタンパク質または細胞の投与を容易にすることである。本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１６１】
好ましい実施形態において、用語「医薬的に許容され得る」は、動物（より具体的にはヒト）における使用について、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、あるいは、米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方に収載されていることを意味する。以降、表現「生理学的に好適なキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は交換可能に使用され、著しい刺激を生物に対して生じさせず、かつ、投与されたコンジュゲートの生物学的な活性および性質を阻害しない承認されたキャリアまたは希釈剤を示す。
【０１６２】
用語「キャリア」は、治療剤が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルを示す。そのような医薬用キャリアは、無菌の液体、例えば、水およびオイル（石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のものを含む）など、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与されるときの好ましいキャリアである。生理的食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液もまた、特に注射用溶液の場合、液体キャリアとして用いることができる。好適な医薬用賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望される場合、微量の湿潤化剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁物、エマルション、錠剤、ピル、カプセル、粉末剤、持続放出配合物などの形態を取ることができる。組成物は、従来の結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリドなど）を用いて、座薬として配合することができる。経口用配合物は標準的なキャリア（例えば、医薬規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含むことができる。好適な医薬用キャリアの様々な例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。そのような組成物は、治療効果的な量のタンパク質（好ましくは、精製された形態である）を、患者に対する適正な投与のための形態を提供するように好適な量のキャリアと一緒に含有する。配合は投与様式のために適しなければならない。
【０１６３】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の加工および投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが含まれる。
【０１６４】
有効成分を配合および投与するためのさらなる技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは、本明細書中に詳しく示されているかのように本明細書中に参考として組み込まれる）。
【０１６５】
本明細書中に記載される医薬組成物はまた、好適な固体または固相のキャリアまたは賦形剤を含むことができる。そのようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６６】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、経皮送達、腸管送達または非経口送達（筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、くも膜下注射、直接的な心室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む）が含まれ得る。
【０１６７】
従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬的に使用することができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つ以上の医薬的に許容され得るキャリアを使用して、従来の様式で配合することができる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１６８】
注射の場合、本発明の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的な生理的食塩水緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１６９】
経口投与の場合、有効成分は、場合により、本発明による抗体を産生する細胞全体の投与によって処方され得る。有効成分はまた、有効成分および／または細胞を、この分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって処方され得る。そのようなキャリアは、本発明の有効成分が、患者により経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして処方されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１７０】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、有効成分の量を明らかにするために、または有効成分の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１７１】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１７２】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１７３】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用される有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器において使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、有効成分および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【０１７４】
本明細書中に記載される有効成分は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために処方することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、そして、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１７５】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性な調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性または水系の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１７６】
好ましい実施形態において、組成物は、ヒトに対する静脈内投与のために適合化された医薬組成物として、日常的な手法に従って配合される。典型的には、静脈内投与される医薬組成物は、無菌の等張性の水性緩衝液における溶液である。一般に、成分は別々に提供されるか、または、単位投薬形態で一緒に混合されて、例えば、活性な薬剤の量を示す気密容器（例えば、アンプルまたは小袋など）における乾燥した凍結乾燥粉末または無水高濃度物として提供される。組成物が注入によって投与されることになる場合、組成物は、無菌の医薬規格の水または生理的食塩水を含有する注入ボトルとともに分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用無菌水または生理的食塩水のアンプルが提供される。
【０１７７】
本発明の医薬組成物は中性形態または塩形態として配合することができる。医薬的に許容され得る塩には、アニオンとともに形成される塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩など、および、カチオンとともに形成される塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄（ＩＩＩ）、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩などが含まれる。
【０１７８】
本発明の有効成分はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１７９】
本明細書中に記載される医薬組成物はまた、ゲル相キャリアまたはゲル相賦形剤の好適な固体を含むことができる。そのようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
局所経路が、場合により行われ、局所用キャリアによって支援される。局所用キャリアは、局所的な有効成分投与のために一般には好適であるキャリアであり、これには、この分野で知られている任意のそのような物質が含まれる。局所用キャリアは、組成物を、所望される形態で、例えば、液体または非液体のキャリア、ローション、クリーム、ペースト、ゲル、粉末、軟膏、溶媒、液体希釈剤および滴剤などとして提供するように選択され、そして、天然に存在する起源または合成起源の物質から構成され得る。明らかなことではあるが、選択されたキャリアは、局所用配合物の活性な薬剤または他の構成成分に悪影響を及ぼさないこと、そして、局所用配合物のすべての構成成分に関して安定であることが不可欠である。本発明において使用される好適な局所用キャリアの例には、水、アルコールおよび他の非毒性の有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン類およびワックスなどが含まれる。本発明における好ましい配合物は、無色無臭の軟膏、液体、ローション、クリームおよびゲルである。
【０１８１】
軟膏は、典型的にはペトラタムまたは他のペトラタム誘導体に基づく半固体の調製物である。使用される具体的な軟膏基剤は、当業者によって理解されるように、最適な有効成分送達をもたらし、好ましくは、他の所望される特徴（例えば、皮膚軟化性など）もまた提供するものである。他のキャリアまたはビヒクルの場合と同様に、軟膏基剤は、不活性で、安定で、非刺激性で、かつ非感作性でなければならない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９９５）において１３９９頁〜１４０４頁で説明されるように、軟膏基剤は、油性基剤、乳化可能な基剤、乳化基剤および水溶性基剤の４つのクラスに類別することができる。油性の軟膏基剤には、例えば、植物油、動物から得られる脂肪、および、石油から得られる半固体の炭化水素が含まれる。乳化可能な軟膏基剤は、吸収性軟膏基剤としてもまた知られており、水をほとんど含有せず、これには、例えば、ヒドロキシステアリンスルファート、無水ラノリンおよび親水性ペトラタムが含まれる。乳化軟膏基剤は油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルションまたは水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションのいずれかであり、これには、例えば、セチルアルコール、グリセリルモノステアラート、ラノリンおよびステアリン酸が含まれる。好ましい水溶性軟膏基剤は、様々な分子量のエチレングリコールから調製される。再度ではあるが、さらなる情報については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙを参照することができる。
【０１８２】
ローションは、摩擦を伴うことなく皮膚表面に塗布されるための調製物であり、典型的には、固体粒子（活性な薬剤を含む）が水またはアルコールの基剤に存在する液体または半液体の調製物である。ローションは、通常、固体の懸濁物であり、水中油型タイプの液体油性エマルションを含むことができる。ローションは、より多くの液体組成物を塗布することが容易であるので、大きな身体面積を処置するための本発明における好ましい配合物である。ローション中の不溶物は細かく分割されていることが一般に必要である。ローションは、典型的には、より良好な分散を提供するための懸濁化剤、ならびに、活性な薬剤を局在化させ、皮膚との接触状態で保つために有用な有効成分（例えば、メチルセルロースまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースなど）を含有する。
【０１８３】
選択された有効成分を含有するクリームは、この分野では知られているように、水中油型または油中水型のいずれかであっても、粘性の液体エマルションまたは半固体エマルションである。クリーム基剤は水洗性であり、油相、乳化剤および水相を含有する。油相は、ときには「内部」相とも呼ばれることがあるが、一般には、ペトラタムおよび脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールまたはステアリルアルコールなど）から構成される；水相は、通常、体積が油相を超えており、だが、必ずしも超える必要はなく、また、一般には保湿剤を含有する。クリーム配合物における乳化剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（上掲）において説明されるように、一般には、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、または両性界面活性剤である。
【０１８４】
ゲル配合物は、頭皮への適用のために好ましい。局所用有効成分配合物の分野での当業者によって理解されるように、ゲルは半固体の懸濁物型の系である。単相ゲルは、キャリア液体全体に実質的に一様に分布させられた有機高分子を含有し、この場合、キャリア液体は、典型的には水性であるが、また、アルコールおよび場合によりオイルを好ましくは含有する。
【０１８５】
当業者に知られている様々な添加剤を本発明の局所用配合物に含めることができる。例えば、溶媒を、ある種の有効成分物質を可溶化するために使用することができる。必要に応じて使用される他の添加剤には、皮膚浸透増強剤、乳白剤、抗酸化剤、ゲル化剤、増粘剤および安定化剤などが含まれる。
【０１８６】
本発明の局所用組成物はまた、従来の皮膚型のパッチまたは物品を使用して皮膚に送達することができ、この場合、有効成分組成物は、皮膚に貼り付けられる薬物送達デバイスとして役立つ積層化された構造体の中に含有される。そのような構造体において、有効成分の組成物は、上部支持層の下に存在する層、すなわち、「リザーバー」に含有される。積層化された構造体は１つだけのリザーバーを含有することができ、または、複数のリザーバーを含有することができる。１つの実施形態において、リザーバーは、有効成分送達時にシステムを皮膚に貼り付けるために役立つ医薬的に許容され得る接触接着性物質のポリマーマトリックスを含む。好適な皮膚接触接着性物質の例には、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリラートおよびポリウレタンなどが含まれるが、これらに限定されない。選択される特定のポリマー接着剤は、特定の有効成分、ビヒクルなどに依存する。すなわち、接着剤は、有効成分を含有する組成物のすべての構成成分との適合性を有しなければならない。あるいは、有効成分含有リザーバーおよび皮膚接触接着剤は別個の異なる層として存在し、この場合、接着剤はリザーバーの下に位置し、リザーバーは、この場合、上記のようなポリマーマトリックスであり得るか、または、液体もしくはヒドロゲルのリザーバーであり得るか、または、何らかの他の形態をとることができる。
【０１８７】
これらの積層体における支持層は、デバイスの上部表面として役立っており、積層化された構造体の主要な構造エレメントとして機能し、かつ、デバイスにその柔軟性の多くを提供する。支持物質のために選択される物質は、有効成分含有組成物の有効成分および任意の他の構成成分に対して実質的に不浸透性であるように、従って、デバイスの上部表面からの何らかの構成成分の喪失を妨げるように選択されなければならない。支持層は、皮膚が有効成分送達時に水和されることが所望されるかどうかに依存して、閉鎖性または非閉鎖性のいずれかであり得る。支持材は、好ましくは、柔軟性のエラストマー材料であることが好ましいシートまたはフィルムから作製される。支持層のために好適なポリマーの例には、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエステルが含まれる。
【０１８８】
貯蔵時または使用前には、積層化された構造体は剥離ライナーを含む。使用直前に、この層はデバイスから除かれて、その基層表面（有効成分リザーバーまたは別個の接触接着剤層のいずれか）が露出させられ、その結果、システムを皮膚に貼り付けることができるようにされる。剥離ライナーは、有効成分／ビヒクル不浸透性の材料から作製されなければならない。
【０１８９】
そのようなデバイスは、この分野で知られている従来の技術を使用して、例えば、接着剤、有効成分およびビヒクルの液状混合物を支持層に注入成型し、その後、剥離ライナーを積層化することによって製造することができる。同様に、接着剤混合物を剥離ライナー上に注入成型し、その後、支持層を積層化することができる。あるいは、有効成分リザーバーを有効成分または賦形剤の非存在下で調製し、その後、有効成分／賦形剤の混合物に「浸す」ことによって負荷することができる。
【０１９０】
本発明の局所用配合物の場合のように、これらの積層化システムの有効成分リザーバーに含有される有効成分組成物は数多くの構成成分を含有することができる。場合により、有効成分は、「そのまま（ｎｅａｔ）」、すなわち、さらなる液体の非存在下で送達することができる。しかしながら、ほとんどの場合、有効成分は、好適な医薬的に許容され得るビヒクル（典型的には溶媒またはゲル）に溶解または分散または懸濁される。存在させることができる他の構成成分には、保存剤、安定化剤および界面活性剤などが含まれる。
【０１９１】
本発明の抗体は、好ましくは、必要としている患者に効果的な量で投与されることに留意しなければならない。本明細書中で使用される「効果的な量」は、選択された結果を達成するために必要な量を意味する。例えば、本発明の組成物の効果的な量は、癌を処置することについて有用であるために選択され得る。
【０１９２】
本発明に関連して使用される好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、処置されている対象の疾患の症状を予防または緩和または改善するために効果的であるか、あるいは、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分の量を意味する。
【０１９３】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９４】
本発明の方法において使用される任意の有効成分について、治療効果的な量または用量は、動物における活性アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量を、活性アッセイによって決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定めることができる。
【０１９５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば、対象とする有効成分についてＩＣ５０およびＬＤ５０（処置された動物の５０％において死を生じさせる致死量）を決定することによって明らかにすることができる。これらの活性アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量範囲を定める際に使用することができる。
【０１９６】
投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１章、１頁を参照のこと）。
【０１９７】
投薬量および投薬間隔は、調節作用を維持するために十分な、活性成分の血漿レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）をもたらすために個々に調節することができる。ＭＥＣは、それぞれの調製物について変化するが、場合により、動物データ全体から推定することができる。
【０１９８】
投薬間隔はまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。調製物は、場合により、期間の１０％〜９０％について、好ましくは３０％〜９０％の間、最も好ましくは５０％〜９０％の間、ＭＥＣを超えて血漿レベルを維持する治療方法を使用して投与することができる。
【０１９９】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬はまた、本明細書中上記で記載された徐放性組成物の単回投与であり得る。この場合、処置の経過は、数日から数週間まで、または、治癒が達成されるまで、もしくは、疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０２００】
本発明の組成物は、所望される場合には、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーデバイスにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物に対する米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の有効成分を含む組成物はまた、適応状態を処置するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。
【０２０１】
本明細書中で使用される用語「調節する」は、疾患の進行を実質的に阻害し、遅くし、もしくは後戻りさせること、または、疾患もしくは状態の臨床的症状を実質的に改善すること、または、疾患もしくは状態の臨床的症状の出現を実質的に妨げることを包含する。従って、「調節剤」には、疾患もしくは状態を調節することができる薬剤が含まれる。
【０２０２】
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１−１】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−２】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−３】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−４】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−５】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−６】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図２−１】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−２】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−３】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−４】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−５】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−６】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−７】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−８】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−９】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１０】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１１】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１２】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１３】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１４】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１５】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１６】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図３ａ】発現カセットおよびバイナリーベクターへの合成遺伝子のクローニングを示す。図３Ａは、植物の標的化シグナルを伴う合成遺伝子の構築を示す。
【図３ｂ】発現カセットおよびバイナリーベクターへの合成遺伝子のクローニングを示す。図３Ｂは、ヒトのシグナルペプチド配列を伴う合成遺伝子の構築を示す。
【図４】ウエスタンブロット分析によって検出されたときのＩｇＧ１の重鎖および軽鎖（図４Ａ）ならびにＩｇＧ４の重鎖および軽鎖（図４Ｂ）の発現を示す。
【図５】組み立てられたＩｇＧ１（Ａ）およびＩｇＧ４（Ｂ）との、本発明による産生性細胞株により産生された抗体のウエスタンブロット分析を示す。
【図６】Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカチオン交換カラムでのＩｇＧ１発現細胞抽出物の分離を示す。
【図７】Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカチオン交換カラムでのＩｇＧ４発現細胞抽出物の分離を示す。
【図８】プロテインＡセファロースで分離された、カチオン交換溶出からのＩｇＧ１含有分画物を示す。
【図９】プロテインＡセファロースで分離された、カチオン交換溶出からのＩｇＧ４含有分画物を示す。
【図１０】精製されたＩｇＧ１のウエスタンブロットおよびクーマシー染色を示す。
【図１１】精製されたＩｇＧ４のウエスタンブロットおよびクーマシー染色を示す。
【図１２】ＰｒｏｔａｌｉｘのＩｇＧ１、ＩｇＧ４、および、ＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１とインキュベーションされた細胞の、ＦＡＣＳ分析により測定されたときの蛍光強度における変化を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２０４】
配列番号１および９は、Ａｂ重鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号２および１０は、Ａｐｏシグナルに融合したＡｂ重鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号３および１１は、ＥＲシグナルに融合したＡｂ重鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号４および１２は、Ｖａｃシグナルに融合したＡｂ重鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号５は、Ａｂ軽鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号６は、Ａｐｏシグナルに融合したＡｂ軽鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号７は、ＥＲシグナルに融合したＡｂ軽鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号８は、Ｖａｃシグナルに融合したＡｂ軽鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号１３は、液胞選別シグナルペプチドの配列である。
配列番号１４は、エンドキチナーゼからのＥＲ標的化配列およびＥＲ保持シグナルをコードする核酸配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を植物細胞培養において製造するためのシステムおよび方法に関し、さらにその製造された抗体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は現在開発中の治療薬物の大きな集団を代表する。抗体は、大きな特異性を有する標的抗原を認識し、結合する複雑な糖タンパク質である。この特異的な結合活性により、抗体を、疾患の診断、防止および治療を含めて、様々な適用のために使用することが可能である（２０）。典型的な原寸の抗体は、２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖との四量体である。原寸の免疫グロブリンの他に、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、二重特異的Ｆｖ、ジアボディー、ミニボディー、単一可変ドメインおよび抗体融合タンパク質などを含めて、治療的価値を有する他の様々な抗体誘導体が植物において発現されている（４）。
【０００３】
ＩｇＧ抗体分子のグリコシル化は、エフェクターリガンドＦｃＲおよび補体を認識するために重要である翻訳後修飾である。複雑な二分岐オリゴ糖成分がそれぞれの重鎖のＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ−２９７において結合する。糖残基の結合における不均一性が機能的調節に関連する（２１〜２６）。さらに、様々な研究により、ＩｇＧ１抗体のインビボ運命が、ＣＨ２における変化した構造の炭水化物の存在によって劇的に影響されることが示される（２７）。
【０００４】
医薬品として使用されるタンパク質は従来、哺乳動物または細菌の発現システムで製造されている。ほとんどの場合において、そのようなタンパク質は哺乳動物細胞株（主にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ））またはトランスジェニック動物において遺伝子組換えにより製造される。これは、これらがタンパク質の正しい折り畳みおよび組み立てをもたらし、かつ、類似したグリコシル化パターンを生じさせることが示されているからである。しかしながら、そのような発現システムは高価であり、また、高レベルの製造に拡大することが困難である。さらに、病原性生物または発ガン性ＤＮＡ配列による潜在的な混入に起因する安全性の問題が存在する。また、このような哺乳動物システムにおける特定のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４）の製造収率および安定性は極めて低く、そのため、製造は非常に非効率である。
【０００５】
正確な原因は不明ではあるが、組換えＩｇＧ４の安定性は低く、これは、収率が低い原因であり、それにより、非効率的な大規模製造をもたらしている。
【０００６】
従って、抗体および他の治療タンパク質を製造するための非哺乳動物システムは明らかに好都合である。そのようなシステムは、非免疫原性のタンパク質には有効であることが示されているが、抗体はより敏感であり、また、哺乳動物以外の細胞培養システムにおいて製造することがより困難である。例えば、抗体をバキュロウイルス発現システムおよび安定的にトランスフェクションされた昆虫細胞株において発現させることができるが、得られる物質は必要な性質を有しない場合がある。昆虫細胞発現システムは抗体を産生するが、下記のようないくつかの欠点を有する：非効率的なプロセシング、ならびに、折り畳み能および分泌能障害、部分的にバキュロウイルスによりコードされる大きなプロテアーゼ活性、翻訳後修飾パターン（これは免疫原的に作用し得る）の不十分な強度およびずれ（例えば、下記の参考文献を参照のこと：Ｇｕｔｔｉｅｒｉ ＭＣ、Ｌｉａｎｇ Ｍ．、２００４、昆虫細胞発現システムを使用するヒト抗体の製造、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２４８：２６９〜９９；Ｇｕｔｔｉｅｒｉ ＭＣ、Ｓｉｎｈａ Ｔ、Ｂｏｏｋｗａｌｔｅｒ Ｃ、Ｌｉａｎｇ Ｍ．Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ ＣＳ、２００３、安定的に形質転換された昆虫細胞における発現による全長ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体へのＦａｂフラグメントの変換のためのカセットベクター、Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ、２２（３）：１３５〜４５；Ｐｏｔｔｅｒ ＫＮ、Ｌｉ Ｙ、Ｃａｐｒａ ＪＤ、１９９３、バキュロウイルス発現システムにおける抗体製造、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０（２−３）：１０３〜１２）。好適な翻訳後修飾が存在しないため、抗体を大腸菌において製造することができない。
【０００７】
過去１０年間において、新しい発現システムが植物において開発されている。この方法論では、アグロバクテリウム（一本鎖ＤＮＡ分子（Ｔ−ＤＮＡ）を植物のゲノムに挿入することができる細菌）が利用される（１）。遺伝子をタンパク質およびペプチドの大量製造のために導入することが比較的簡便であるために、この方法論は植物における代替的なタンパク質発現システムとしてますます一般的になりつつある（２〜４）（５）。
【０００８】
植物に基づくシステムは、組換え抗体を製造するための安価で、効率的で、かつ、安全な代替法である。植物細胞における原寸の抗体の製造が、１つだけのガンマ免疫グロブリン鎖またはカッパ免疫グロブリン鎖を発現する植物の有性交配によってタバコ植物の完全体において初めて明らかにされた（６）。タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）および他の植物におけるＩｇＧ（主にＩｇＧ１）抗体およびＩｇＡ抗体の組み立てが報告されている（３、７〜１０）。
【０００９】
最近１０年間にわたる研究では、植物細胞は、植物体に含有されているとき、様々な機能的な抗体を産生できることが示されており、今や、強い関心が、製造を商業的レベルに拡大することにある（１１〜１３）、（１４、１５）、（５、１６〜１８）。
【００１０】
しかしながら、組換えタンパク質を製造するためにトランスジェニック野外作物を使用するとき、残留殺虫剤、残留除草剤および毒性の植物代謝産物による汚染をはじめとする様々な潜在的な安全性問題に関する関心が生じている（１９）。一般に遺伝子改変植物に反対するグループは、導入遺伝子およびそのコードされるタンパク質が環境に広がるか、または、食物連鎖の中に広がるという潜在的な危険性を心配しており、また、規制機関の厳しい制限が、トランスジェニック植物技術をタンパク質発現のために利用する企業には障害となっている。従って、明らかに、完全な、全てを備える植物体の使用は不都合である。
【００１１】
植物の懸濁細胞は、注意深く制御されている証明された条件のもとでの組換えタンパク質製造のために使用することができるインビトロシステムである。植物細胞の懸濁物を、組換えタンパク質を製造するために振とうフラスコまたはバイオリアクターにおいて増殖させることができる。本発明者らは、野外での植物成長の潜在的な危険性を伴うことなく、植物細胞での発現の利点を利用して組換えタンパク質（例えば、抗体など）の安全な製造を可能にするバイオリアクターシステムについての対応する特許出願を出願している（米国特許第６３９１６３８号および米国特許出願第１０／７８４２９５号（２００４年２月２４日出願）を参照のこと。これらはともに、本明細書中に示されたかのように参考として本明細書により組み込まれる）。
【００１２】
例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ Ｈａｖａｎａ ＳＲ１の懸濁培養物（Ｐ９ｓ）におけるＴＭＶ特異的な原寸のマウスＩｇＧ−２ｂ／Ｋ抗体の発現が報告されている（１８）。Ｎ末端のマウスのリーダーペプチドの組み込みにより、組み立てられた免疫グロブリンが分泌させられた。しかしながら、懸濁培養では、原寸の組換え抗体は植物細胞壁によって保持された。ＥＬＩＳＡ法では、組換えタンパク質の特異性および親和性がそのマウス対応体と区別できなかったことが明らかにされ、これは、組換え抗体を製造するためのバイオリアクターとしての植物細胞懸濁培養物の潜在的可能性を示している（１８）。
【００１３】
植物における抗体の製造では、分子が、その同族抗原を認識するために正しく折り畳まれ、かつ、組み立てられなければならないので、特別な課題が示される。一方で、植物由来の発現システムは、例えば、細菌の発現システムとは異なり、タンパク質の発現および活性のために非常に重要であることが知られている翻訳後修飾を容易にする。しかしながら、哺乳動物細胞培養システムと、植物細胞培養システムとの間には翻訳後修飾における大きな違いが存在しており、これは、発現タンパク質の潜在的な低下した機能性または除去された機能性さえも回避するために検討する必要がある。
【００１４】
哺乳動物のタンパク質発現システムと、植物のタンパク質発現システムとの間での大きな違いの１つは、生合成経路における違いによって引き起こされるタンパク質の糖側鎖の変化である。グリコシル化は、タンパク質の活性、折り畳み、安定性、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、血中クリアランス速度および抗原性能力に対する顕著な影響を有することが示されていた。従って、植物におけるタンパク質製造はいずれも、植物のグリコシル化の潜在的な分枝化を考慮に入れなければならない。
【００１５】
タンパク質のグリコシル化は、Ｎ結合型修飾およびＯ結合型修飾の２つのカテゴリーに分けられる（２８、２９）（３０）。これら２つのタイプは、グリカン成分が結合するアミノ酸が異なる。すなわち、Ｎ結合型はＡｓｎ残基に結合し、一方、Ｏ結合型はＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基に結合する。加えて、それぞれのタイプのグリカン配列は特有の特徴的な特徴を有する。これら２つのタイプのうち、Ｎ結合型グリコシル化の方が多く存在しており、タンパク質機能に対するその影響が広範囲に研究されている。一方で、Ｏ結合型グリカンは比較的希であり、タンパク質に対するその影響に関する情報はほとんど得られていない。
【００１６】
いくつかの方法が、植物におけるタンパク質のグリコシル化を制御し、かつ、目的に合わせて調節するために議論されている（３１）（３２）。全体的な修飾、例えば、グリコシル化の完全な阻害またはペプチド鎖からのグリコシル化部位の除去などが、１つの方針として実行される場合がある。しかしながら、この方法は構造的欠陥をもたらし得る。さらなる方法では、いくつかの特定の炭水化物プロセシング酵素のノックアウトおよび導入が伴う。これらの酵素は、潜在的に免疫原性である糖が翻訳後修飾時に付加されることを防止するために「ノックアウト」される。例えば、キシロシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のノックアウトにより、グリカン構造におけるキシロースの非存在がもたらされる。キシロースは、植物においてだけ見出される糖残基であり、潜在的に免疫原性であると考えられている。ヒトの炭水化物プロセシング酵素遺伝子、例えば、シアリルトランスフェラーゼなどを植物に導入することにより、植物には存在しないシアル酸の付加がもたらされる（例えば、Ｒａｇｏｎ Ｃ、Ｌｅｒｏｕｇｅ Ｐ、Ｆａｙｅ Ｌ．、１９９８、植物におけるタンパク質のＮ−グリコシル化、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ Ｖｏｌ．４９（３２６）、１４６３〜１４７２を参照のこと）。
【００１７】
第３の方法では、発現を細胞内の特定の区画に局在化することが試みられる。例えば、タンパク質をＥＲに保持することは、植物特異的な修飾がゴルジ装置において行われることを妨げる（３３）（３４、３５）。それぞれの細胞区画は異なる炭水化物プロセシング酵素を有する。分泌経路に入るか、または、分泌経路に標的化されるタンパク質はＥＲからゴルジ装置に移され、次いで液胞またはアポプラストに移される。アポプラストは植物細胞膜と植物細胞壁との間の空間である。分泌に標的化されるタンパク質、すなわち、より具体的には、特定の細胞区画に標的化されず、従って、分泌されるタンパク質は、アポプラストに到達する。一部のタンパク質はアポプラストに留まるが、一部のタンパク質は細胞壁を通過し、増殖培地中に分泌される。異なる炭水化物プロセシングがそれぞれの区画において存在するので、タンパク質を１つの区画に保持することは、グリカン構造のさらなるプロセシングを阻害することができ、または、タンパク質を特定の区画に導くことによって、タンパク質が所望のプロセシング経路に入ることを確実にすることが可能である。
【発明の開示】
【００１８】
背景技術は、非常に機能的なＩｇＧ４抗体を製造するためのシステムまたは方法を教示または示唆していない。
【００１９】
本発明は、高レベルの発現効率とともに製造される非常に機能的な抗体をもたらす植物細胞培養での抗体の製造のためのシステムおよび方法を提供することによって、背景技術のこれらの欠点を克服する。本発明はまた、原寸の組み立てられた免疫グロブリンを大量製造するための宿主細胞、ベクターおよび方法を包含する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態によれば、懸濁状態において増殖する遺伝子改変された（例えば、トランスジェニック）植物細胞に基づく植物発現システムが提供される。この発現システムは、（組み立てられた）無傷の抗体または抗体フラグメントを製造するために特に設計される。
【００２１】
これらの抗体は好ましくは機能的な抗体である（すなわち、標的抗原と特異的に結合することができるか、または、エフェクター機能［例えば、補体機能の活性化］を有し得る抗体、例えば、ＩｇＧ４など）。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、実質的に無傷の抗体分子を示す。
【００２３】
本明細書中で使用される表現「抗体フラグメント」は、抗原に結合することができる、抗体の機能的なフラグメントを示す。
【００２４】
本発明を実施するための好適な抗体フラグメントには、なかでも、免疫グロブリン軽鎖（これは本明細書中では「軽鎖」として示される）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、免疫グロブリン重鎖（これは本明細書中では「重鎖」として示される）のＣＤＲ、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄフラグメント、ならびに、軽鎖および重鎖の両方の本質的に全可変領域を含む抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２など）が含まれる。
【００２５】
軽鎖および重鎖の両方の全可変領域または本質的に全可変領域を含む機能的な抗体フラグメントは下記のように定義される：
（ｉ）Ｆｖ、これは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域からなる遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；
（ｉｉ）単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、これは、好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された単鎖分子である；
（ｉｉｉ）Ｆａｂ、これは、完全な抗体を酵素パパインで処理して、無傷の軽鎖と、重鎖のＦｄフラグメント（これはその可変ドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）とを生じさせることによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子のフラグメントである；
（ｉｖ）Ｆａｂ’、これは、完全な抗体を酵素ペプシンで処理し、その後、還元することによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子のフラグメントである（２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子について得られる）；および
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、これは、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子のフラグメントである（すなわち、２つのジスルフィド結合によって一緒に結ばれたＦａｂ’フラグメントのダイマー）。
【００２６】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製する様々な方法が当該分野では広く知られている。抗体をいくつかの既知の方法のいずれか１つによって作製することができ、そのような方法では、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．他（１９８９）、ポリメラーゼ連鎖反応による発現のための免疫グロブリン可変ドメインのクローニング、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６、３８３３〜３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１）、人工抗体、Ｎａｔｕｒｅ、３４９、２９３〜２９９）、または、培養での連続した細胞株によるモノクローナル抗体分子の作製を用いることができる。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）、所定の特異性を有する抗体を分泌する融合細胞の連続培養、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９７；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．他（１９８５）、ヒトハイブリドーマの腹水増殖の後での特異的な免疫グロブリンの製造および強化された腫瘍形成性、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、８１、３１〜４２；Ｃｏｔｅ ＲＪ他（１９８３）、細胞抗原との反応性を有するヒトモノクローナル抗体の作製、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８０、２０２６〜２０３０；Ｃｏｌｅ、Ｓ．Ｐ．他（１９８４）、ヒトモノクローナル抗体、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、６２、１０９〜１２０）。
【００２７】
抗体をインビボで生じさせるとき、標的抗原が非常に小さく、十分な免疫原性応答を誘発することができない場合、そのような抗原（これは「ハプテン」と呼ばれる）を、抗原性に関して中性のキャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）キャリア）または血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））キャリアなど）にカップリングすることができる（例えば、米国特許第５１８９１７８号および同第５２３９０７８号を参照のこと）。ハプテンをキャリアにカップリングすることを、当該分野で周知の方法を使用して行うことができる。例えば、アミノ基への直接的なカップリングを行うことができ、また、場合により、続いて、形成されたイミノ連結を還元することができる。あるいは、キャリアを、縮合剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド系脱水剤など）を使用してカップリングすることができる。リンカー化合物もまた、カップリングを行うために使用することができる；ホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーの両方をＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｈｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、米国）から入手することができる。その後、得られる免疫原性複合体を好適な哺乳動物被験体（例えば、マウス、ウサギなど）に注射することができる。好適なプロトコルでは、血清中における抗体の産生を高めるために設計されたスケジュールに従ったアジュバントの存在下での免疫原の繰り返される注射が伴う。免疫血清の力価を、当該分野で周知の免疫アッセイ手法を使用して容易に測定することができる。
【００２８】
本明細書中上記で記載されたように、得られた抗血清をそのまま使用することができ、または、モノクローナル抗体を得ることができる。
【００２９】
抗体フラグメントを、当該分野で周知の方法を使用して得ることができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。例えば、本発明による抗体フラグメントを、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養システムまたは他のタンパク質発現システム）での発現によって調製することができる。
【００３０】
あるいは、抗体フラグメントを従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。本明細書中上記で記載されたように、（Ｆａｂ’）２抗体フラグメントを、５Ｓフラグメントをもたらすために抗体をペプシンで酵素切断することによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを生じさせるために、チオール還元剤、および、場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基のための保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断は、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントと、Ｆｃフラグメントとを直接に生じさせる。そのような方法を実施するための十分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびに、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．（１９５９）、結晶パパインによるウサギγ−グロブリンおよび抗体の加水分解、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、７３、１１９〜１２６を参照のこと）。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または、他の酵素的技術、化学的技術もしくは遺伝的技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する能力を保持する限り、使用することができる。
【００３１】
本明細書中上記で記載されたように、Ｆｖは、対形成した重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成される。この会合は非共有結合性であり得る（例えば、Ｉｎｂａｒ，Ｄ．他（１９７２）、重鎖および軽鎖の可変部分の内部における抗体合体部位の位置決定、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、６９、２６５９〜２６６２を参照のこと）。あるいは、本明細書中上記で記載されたように、可変ドメインを、分子間ジスルフィド結合によって単鎖Ｆｖを作製するために連結することができ、あるいは、そのような鎖を化学試薬（例えば、グルタルアルデヒドなど）によって架橋することができる。
【００３２】
好ましくは、Ｆｖは単鎖Ｆｖである。単鎖Ｆｖは、ペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによってつながれた、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子が発現ベクターに挿入され、続いて、発現ベクターが宿主細胞（例えば、大腸菌など）に導入される。組換え宿主細胞により、２つの可変ドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。単鎖Ｆｖを製造するための充分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．およびＦｉｌｐｕｌａ，Ｄ．（１９９１）、単鎖Ｆｖタンパク質およびその融合タンパク質、ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２（２）、９７〜１０５；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．他（１９８８）、単鎖の抗原結合性タンパク質、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３〜４２６；Ｐａｃｋ，Ｐ．他（１９９３）、大腸菌の高細胞密度発酵によって製造された、完全な抗体と同一の結合活性を有する改善された二価ミニ抗体、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）、１１（１１）、１２７１〜１２７７；および米国特許第４９４６７７８号を参照のこと）。
【００３３】
単離された相補性決定領域ペプチドを、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって調製することができる。そのような方法を実施するための充分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．およびＦｒｙ，Ｋ．Ｅ．（１９９１）、抗体遺伝子のＰＣＲ増幅、ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２（２）、１０６〜１１０）。
【００３４】
ヒトの治療または診断のためにはヒト化抗体が好ましくは使用されることが理解される。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体に由来する部分（好ましくは、最小限の部分）を有する遺伝子操作されたキメラな抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）のＣＤＲが、所望の機能性を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）のＣＤＲからの残基によって置換される抗体が含まれる。いくつかの場合において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは、移入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、かつ、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが関連のヒトコンセンサス配列のフレームワーク領域に対応する少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は最適には、典型的にはヒト抗体に由来する抗体定常領域（例えば、Ｆｃ領域など）の少なくとも一部もまた含む（例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．他（１９８６）、マウス由来の相補性決定領域によるヒト抗体における相補性決定領域の置換、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．他（１９８８）、治療のためのヒト抗体の再形成、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２７；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．（１９９２ｂ）、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、２、５９３〜５９６；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．（１９９２ａ）、抗体工学、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３（４）、３９４〜３９８を参照のこと）。
【００３５】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該分野では広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸残基が、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入されている。これらの非ヒト由来のアミノ酸残基は移入残基と呼ばれることが多く、典型的には、移入されている可変ドメインから取られる。ヒト化を、ヒトＣＤＲを対応する齧歯類ＣＤＲによって置換することにより、本質的には記載されるように行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ他（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．他（１９８８）、ヒト抗体の再形成：抗リゾチーム活性の継ぎ足し、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３６；および米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。従って、ヒト化抗体は、無傷のヒト可変ドメインの実質的に一部が、非ヒト種に由来する対応の配列によって置換されているキメラな抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、一部のＣＤＲ残基と、可能であれば、一部のフレームワーク残基とが、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換されるヒト抗体である。
【００３６】
ヒト抗体はまた、当該分野で既知の様々なさらなる技術を使用して製造することができ、そのような技術には、ファージディスプレーライブラリーが含まれる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９１）、免疫化の迂回：インビトロで再配置された生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントの合成レパートリーに由来するヒト抗体、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２２７、３８１〜３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．他（１９９１）、ファージ表面に呈示されたＶ遺伝子ライブラリーに由来するヒト抗体、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２２２、５８１〜５９７；Ｃｏｌｅ他（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７頁〜９６頁；Ｂｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．他（１９９１）、インビトロで初回抗原刺激されたヒト脾細胞からの抗原特異的なヒトモノクローナル抗体の製造、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７、８６〜９５）。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をコードする配列をトランスジェニック動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウス）に導入することによって作製することができる。抗原による攻撃を受けたとき、遺伝子再配置、鎖の組み立ておよび抗体レパートリーを含めて、すべての点でヒトにおいて認められる抗体と非常に類似するヒト抗体の産生がそのような動物において観測される。そのような方法を実施するための充分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号および同第５６６１０１６号；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．他（１９９２）、免疫化の迂回：鎖シャッフリングによる高親和性のヒト抗体の構築、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）、１０（７）、７７９〜７８３；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９４）、ニュースおよび見解：特異化における成功、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、８１２〜８１３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．他（１９９６）、ミニ遺伝子座のトランスジェニックマウスの新規系統に由来する高結合活性のヒトＩｇＧカッパ型モノクローナル抗体、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４、８４５〜８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．（１９９６）、マウスにおける高結合活性のヒトＭａｂの作製、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４、８２６；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）、トランスジェニックマウス由来のヒト抗体、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３、６５〜９３を参照のこと）。
【００３７】
抗体が得られた後、抗体は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、活性について試験することができる。
【００３８】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、機能的なＩｇＧ４抗体を植物細胞培養（好ましくは、場合により懸濁状態において増殖し、また、より好ましくは懸濁状態において増殖する根の植物細胞培養）において製造するためのシステムおよび方法が提供される。場合により、また、最も好ましくは、植物細胞培養はニンジンの根細胞を含む。
【００３９】
本発明のなおさらに他の好ましい実施形態によれば、抗体を植物細胞培養（好ましくは、場合により懸濁状態において増殖し、また、より好ましくは懸濁状態において増殖する根の植物細胞培養）において製造するためのシステムおよび方法が提供され、この場合、この抗体は、哺乳動物細胞培養において増殖する対応する抗体よりも大きい結合親和性を標的抗原について有する。
【００４０】
本発明のなおさらに他の好ましい実施形態によれば、配列番号１および配列番号５に対する相同性がそれぞれ少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）である重鎖配列および軽鎖配列を有する抗体が提供される。場合により、配列番号１および配列番号５による配列から本質的になる配列を有する抗体が提供される。この抗体はＩｇＧ１サブタイプである。
【００４１】
本発明のさらに他の好ましい実施形態によれば、遺伝子１〜４（重鎖；配列番号１〜４）からなる群から選択される配列に対する相同性、および、遺伝子９〜１２（軽鎖；配列番号５〜８）からなる群から選択される配列に対する相同性がそれぞれ少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）である重鎖配列および軽鎖配列を有する抗体が提供される。場合により、遺伝子１〜４（重鎖；配列番号１〜４）からなる群から選択される重鎖配列と、遺伝子９〜１２（軽鎖；配列番号５〜８）からなる群から選択される軽鎖配列とを有する抗体が提供される。この抗体はＩｇＧ１サブタイプである。本発明のさらに他の好ましい実施形態によれば、遺伝子５〜８（重鎖；配列番号９〜１２）からなる群から選択される配列に対する相同性、および、遺伝子９〜１２（軽鎖；配列番号５〜８）からなる群から選択される配列に対する相同性がそれぞれ少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）である重鎖配列および軽鎖配列を有する抗体が提供される。場合により、遺伝子５〜８（重鎖；配列番号９〜１２）からなる群から選択される重鎖配列と、遺伝子９〜１２（軽鎖；配列番号５〜８）からなる群から選択される軽鎖配列とを有する抗体が提供される。この抗体はＩｇＧ４サブタイプである。
【００４２】
本発明のなおさらに他の好ましい実施形態によれば、植物のシグナルペプチドを含む抗体が提供される。好ましくは、この抗体はＩｇＧ４サブタイプである。場合により、また、好ましくは、植物のシグナルペプチドは、抗体を、Ａｐｏ（アポプラスト）、ＥＲ（小胞体）および液胞からなる群から選択されるオルガネラに標的化する。より好ましくは、植物のシグナルペプチドは、抗体が場合により、また、最も好ましくは、ＥＲによって保持され、ゴルジ体に移動しないように、抗体をＥＲに標的化する。場合により、停止コドンが、ＥＲ保持シグナルとの融合を容易にするために、抗体の配列に存在しない。また、場合により、液胞への標的化が、液胞選別シグナルＧＬＬＶＤＴＭ（配列番号１３）をコードする配列を停止コドンの前に組み込むことによって達成される。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「植物」は、遺伝子改変することができる任意の植物、例えば、単子葉植物または双子葉植物、ならびに他の植物（例えば、針葉樹植物、コケまたは藻類など）などを示す。現在既知の実施形態によれば、植物はニンジン植物である。別の実施形態によれば、植物はタバコ属の植物であり、これには、限定されないが、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌａｕｃａ（野生タバコ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）が含まれる。
【００４４】
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書中では交換可能に使用される用語である。そのような用語は、特定の対象とする細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫を示すことが理解される。いくつかの変化が、変異または環境的影響のいずれかにより次世代において生じ得るので、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でないことがあり、しかし、本明細書中で使用される用語の範囲には依然として含まれる。本明細書中で使用される「宿主細胞」は、ネイクドＤＮＡ、または、組換えＤＮＡ技術を使用して構築された発現ベクターで組換え的に形質転換され得る細胞を示す。本明細書中で使用される用語「トランスフェクション」は、核酸（例えば、ネイクドＤＮＡまたは発現ベクター）をレシピエント細胞に核酸媒介遺伝子移入によって導入することを意味する。本明細書中で使用される「形質転換」は、細胞の表現型が、外因性のＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取り込みの結果として変化させられるプロセスを示し、例えば、形質転換された細胞は、所望されるタンパク質の組換え形態を発現する。
【００４５】
薬物抵抗性または他の選択マーカーが、部分的には、形質転換体の選択を容易にするために意図されることを理解しなければならない。また、選択マーカー（例えば、薬物抵抗性マーカーなど）の存在は、混入微生物を培養培地で増殖させないことにおいて有用であり得る。形質転換された宿主細胞のそのような純粋培養は、誘導された表現型の生存のために要求される条件のもとで細胞を培養することによって得られる。
【００４６】
上記で示されたように、本発明の宿主細胞は核酸分子でトランスフェクションまたは形質転換することができる。本明細書中で使用される用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、適する場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを示す。これらの用語はまた、均等物として、ヌクレオチドのアナログから作製される、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、ならびに、記載されている実施形態に対して適用可能であるように、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを含むことを理解しなければならない。
【００４７】
なお別の実施形態において、本発明の宿主細胞は、組換え核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換することができる。本明細書中で使用される「発現ベクター」は、プラスミドなどのベクター、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および、宿主のゲノムへのＤＮＡフラグメントの組込みを可能にする他のビヒクルを包含する。発現ベクターは、典型的には、所望される遺伝子またはそのフラグメントと、好適な宿主細胞において認識される機能的に連結された遺伝的制御エレメントとを含有する自己複製性のＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物であり、所望される遺伝子の発現をもたらす。これらの制御エレメントは、好適な宿主における発現をもたらすことができる。一般に、遺伝的制御エレメントは原核生物プロモーターシステムまたは真核生物プロモーター発現制御システムを含むことができる。そのようなシステムは、典型的には、転写プロモーター、転写の開始を制御するための必要に応じて使用されるオペレーター、ＲＮＡ発現のレベルを上昇させるための転写エンハンサー、好適なリボソーム結合部位をコードする配列、ＲＮＡスプライス接合部、転写および翻訳を終結させる配列などを含む。発現ベクターは、通常、ベクターが宿主細胞とは無関係に複製することを可能にする複製起点を含有する。
【００４８】
プラスミドはベクターの最も一般的に使用されている形態であるが、同等の機能を果たし、かつ、この分野で知られているか、または、この分野で知られるようになる他の形態のベクターが本発明における使用のために好適である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ他、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８５年および増刊）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｄｒｉｑｕｅｚ他（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ（１９８８）を参照のこと（これらは参照により本明細書中に組み込まれる）。
【００４９】
一般に、そのようなベクターはまた、形質転換された細胞における表現型選択を提供することができる特定の遺伝子を含有する。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を発現させるための原核生物性および真核生物性のウイルス発現ベクターの使用もまた意図される。
【００５０】
場合により、ベクターは、（下記の実施例に関して記載されるように）一般的な植物ベクターであり得る。あるいは、ベクターは、場合により、根細胞に対して特異的であり得る。
【００５１】
１つの好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は真核生物細胞または原核生物細胞であり得る。
【００５２】
具体的な実施形態において、本発明の宿主細胞は原核生物細胞であり、好ましくは細菌細胞であり、最も好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞である。これらの細胞は、下記で記載される好ましい植物宿主細胞に感染させるために使用させる。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は真核生物細胞であってもよく、好ましくは植物細胞（例えば、根細胞、葉細胞、茎細胞、葉柄細胞、分裂組織細胞、および果実細胞（例えば、ブドウの実））である。好ましい実施形態によると、植物根細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスで形質転換された植物根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される。
【００５４】
好ましい実施形態において、植物根細胞はニンジン細胞である。本発明の形質転換されたニンジン細胞は懸濁状態で増殖することに留意しなければならない。上記で言及され、また、実施例において記載されるように、これらの細胞は本発明のアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞で形質転換される。
【００５５】
述べられたように、本発明の核酸構築物（プラスミド、これは本明細書中上記で記載される）は、植物細胞を安定的または一過性に形質転換するために利用することができる。安定的な形質転換では、本発明の核酸分子は植物のゲノムに組み込まれ、そのため、安定で、かつ、受け継がれる形質を表す。一過性の形質転換では、核酸分子が、形質転換された細胞によって発現されるが、ゲノムには組み込まれず、そのため、一過性の形質を表す。
【００５６】
単子葉植物および双子葉植物の両方に外来遺伝子を導入する様々な方法が存在している（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．（１９９１）．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２，２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ．ら（１９８９）．Ｆｅｒｔｉｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）．３３８：２７４−２７６）。
【００５７】
外因性ＤＮＡの植物のゲノムＤＮＡへの安定した組み込みの原則的な方法としては、２つの主なアプローチが挙げられる：
（ｉ）アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子導入：Ｋｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．ら（１９８７）．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８，４６７−４８６；Ｋｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．およびＲｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９８９）．Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，第６巻，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ，ｐｐ．２−２５，Ｊ．ＳｃｈｅｌｌおよびＬ．Ｋ．Ｖａｓｉｌ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ．；およびＧａｔｅｎｂｙ，Ａ．Ａ．（１９８９）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｐｐ．９３−１１２，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ｋｕｎｇ，およびＣ．Ｊ．Ａｒｎｔｚｅｎ編，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．を参照のこと。
（ｉｉ）直接ＤＮＡ取り込み 例えば：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．ら，（１９８９）．Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，第６巻，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ，ｐｐ．５２−６８，Ｊ．Ｓｃｈｅｌｌ，およびＬ．Ｋ．Ｖａｓｉｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ，；およびＴｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら，（１９８８）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ６，１０７２−１０７４（プロトプラストにＤＮＡを直接取り込むための方法）を参照のこと。また、Ｚｈａｎｇら，（１９８８）．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ７，３７９−３８４；およびＦｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．ら．，（１９８６）．Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３１９，７９１−７９３（植物細胞の短時間の電気的ショックによって誘導されるＤＮＡの取り込み）を参照のこと。また、Ｋｌｅｉｎら，（１９８８）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３；ＭｃＣａｂｅ，Ｄ．Ｅ．ら．（１９８８）．Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ） ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，９２３−９２６；およびＳａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．（１９９０）．Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｔａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ７９，２０６−２０９（粒子衝突による植物細胞または組織へのＤＮＡの注入）を参照のこと。また、Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９８７）．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ７５，３０−３６；およびＮｅｕｈａｕｓ，Ｊ．Ｍ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｃ．（１９９０）．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ７９，２１３−２１７（マイクロピペットシステムの使用）を参照のこと。米国特許第５４６４７６５号（細胞培養物、胚、またはカルス組織の、ガラス繊維または炭化シリコンウィスカー形質転換）を参照のこと。あるいは、ＤｅＷｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．ら，（１９８５）．「Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ） ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｏｌｌｅｎ，」Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ，Ｇ．Ｐ．Ｃｈａｐｍａｎら編，Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．１９７−２０９；およびＯｈｔａ，Ｙ．（１９８６）．Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｉｚｅ ｂｙ ａ Ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｏｌｌｅｎ ａｎｄ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７１５−７１９（発芽花粉とのＤＮＡの直接のインキュベーション）を参照のこと。
【００５８】
アグロバクテリウムによって媒介されるシステムには、植物のゲノムＤＮＡに組み込まれる定義されたＤＮＡセグメントを含むプラスミドベクターの使用が含まれる。植物組織の接種方法は、植物種、およびアグロバクテリウム送達システムに応じて様々である。広く使用されているアプローチは、リーフディスク手順であり、これは、全植物の分化の開始のための良好な供給源を提供する任意の組織外植片を用いて行うことができる（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．ら，（１９８８）．「Ｌｅａｆ ｄｉｓｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５，１−９，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）。補助的なアプローチでは、減圧浸透と組み合わせてアグロバクテリウム送達システムが使用される。アグロバクテリウムシステムは、トランスジェニック双子葉植物の作成において特に有用である。
【００５９】
植物細胞への直接のＤＮＡの導入については、種々の方法が存在している。エレクトロポレーションにおいては、プロトプラストは強い電場に短時間さらされ、ＤＮＡを中に入れるように小孔を開く。マイクロインジェクションでは、マイクロピペットを使用してＤＮＡが細胞に直接機械的に注入される。マイクロ粒子衝突では、ＤＮＡは、硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子のようなマイクロプロジェクタイル上に吸着させられ、マイクロプロジェクタイルは、細胞または植物組織の中に入るように物理的に加速される。
【００６０】
安定的な形質転換の後、植物の増殖が生じる。植物を増殖させる最も一般的な方法は種子による。しかしながら、種子増殖による再生の欠点は、種子が、メンデル則によって支配される遺伝分散に従って植物によって作製されるので、ヘテロ接合性のために作物において均一性がないことである。すなわち、それぞれの種子が遺伝子的に異なり、また、それぞれがそれ自身の特定の形質を伴って成長する。従って、再生された植物が親のトランスジェニック植物の形質および特徴と同一の形質および特徴を有するように、再生が行われることが好ましい。形質転換された植物を再生させる好ましい方法は、形質転換された植物の迅速かつ一貫した繁殖をもたらす大量増殖による方法である。
【００６１】
大量増殖は、選抜された親植物または栽培品種から切り出された１つだけの組織サンプルから第二世代の植物を成長させるプロセスである。このプロセスは、好ましい組織を有し、かつ、融合タンパク質を発現する植物の大量繁殖を可能にする。新しく作製された植物は元の植物と遺伝子的に同一であり、かつ、元の植物の特徴のすべてを有する。大量増殖では、短い期間での高品質の植物材料の大量生産が可能であり、かつ、元のトランスジェニック植物または形質転換された植物の特徴を保持する選抜された栽培品種の迅速な増殖が提供される。植物クローニングのこの方法の利点には、植物増殖の速度、ならびに、作製された植物の品質および均一性が含まれる。
【００６２】
大量増殖は、段階間での培養培地または成長条件を変化させることを必要とする多段階の手法である。大量増殖プロセスでは、下記の４つの基本的な段階が伴う。第１段階、最初の組織培養；第２段階、組織培養増殖；第３段階、分化および植物形成；および第４段階、温室培養およびハードニング。第１段階の期間中に、組織培養物が確立され、混入物がないことが確認される。第２段階の期間中に、十分な数の組織サンプルが、製造目標を満たすために作製されるまで、最初の組織培養物が増殖させられる。第３段階の期間中に、新しく成長した組織サンプルが分割され、個々の幼植物体に成長させられる。第４段階において、形質転換された幼植物体がハードニングのために温室に移され、温室において、光に対する植物の寛容性が徐々に増大させられ、その結果、植物は自然の環境で成長し続けることができる。
【００６３】
本発明の現在既知の好ましい実施形態によれば、組換えタンパク質を、米国特許第６３９１６３８号（２００２年５月２１日発行、これは、全体が本明細書中に示されているかのように参考として本明細書に組み込まれる）に関して記載されるデバイスにおいて培養することにより本発明による植物細胞によって製造することができる。植物細胞をこのデバイスとともに懸濁状態で培養するための条件が、本発明者らの１人による「細胞／組織培養デバイス、システムおよび方法」と題される米国特許出願で、本出願と同様に所有される米国特許出願（これは、全体が本明細書中に示されているかのように参考として本明細書に組み込まれる）に関して記載される。
【００６４】
安定的な形質転換が現在好ましいが、例えば、葉細胞、分裂組織細胞または植物体全体の一過性の形質転換もまた本発明によって想定される。
【００６５】
一過性の形質転換を、上記で記載された直接的なＤＮＡ移動方法のいずれかによって、または、改変された植物ウイルスを使用するウイルス感染によって行うことができる。
【００６６】
植物宿主の形質転換のために有用であることが示されているウイルスには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびバキュロウイルス（ＢＶ）が含まれる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換が、例えば、米国特許第４８５５２３７号（ビーンゴールデンモザイクウイルス、ＢＧＭＶ）；欧州特許ＥＰＡ６７５５３（ＴＭＶ）；特開昭６３−１４６９３（ＴＭＶ）；欧州特許ＥＰＡ１９４８０９（ＢＶ）；欧州特許ＥＰＡ２７８６６７（ＢＶ）；およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．他（１９８８）、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７２頁〜１８９頁）に記載される。外来ＤＮＡを、植物を含む多くの宿主において発現させることにおける偽ウイルス粒子の使用が国際特許出願公開ＷＯ８７／０６２６１に記載される。
【００６７】
非ウイルス性の外因性核酸配列の植物における導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築が上記の参考文献によって記載され、また同様に、Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．他（１９８９）、タバコモザイクウイルスハイブリッドは付加遺伝子を発現および喪失する、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７２、２８５〜２９２；Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．他（１９８６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３１、１２９４〜１２９７；および、Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．他（１９９０）、タバコモザイクウイルスＲＮＡベクターを使用するタバコプロトプラストにおけるエンケファリンの産生、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、２６９、７３〜７６によって記載される。
【００６８】
形質転換用ウイルスがＤＮＡウイルスであるならば、当業者は、ウイルス自体に対する好適な改変を行うことができる。あるいは、ウイルスを、外来ＤＮＡを伴う所望のウイルスベクターを構築することの容易さのために、最初に細菌プラスミドにクローン化することができる。その後、ウイルスをプラスミドから切り出すことができる。ウイルスがＤＮＡウイルスであるならば、細菌の複製起点をウイルスＤＮＡに付け加えることができ、その場合、ウイルスＤＮＡが細菌によって複製される。ＤＮＡの転写および翻訳により、ウイルスＤＮＡをカプシド形成によって包むコートタンパク質が産生される。ウイルスがＲＮＡウイルスであるならば、ウイルスは一般にはｃＤＮＡとしてクローン化され、プラスミドに挿入される。その後、このプラスミドを使用して、植物の遺伝子構築物のすべてが作製される。その場合、ＲＮＡウイルスはプラスミドのウイルス配列から転写され、続いて、ウイルス遺伝子の翻訳により、ウイルスＲＮＡをカプシド形成によって包むコートタンパク質が産生される。
【００６９】
非ウイルス性の外因性核酸配列（例えば、本発明の構築物に含まれる核酸配列など）の植物における導入および翻訳のための植物ＲＮＡウイルスの構築が上記の参考文献ならびに米国特許第５３１６９３１号において明らかにされる。
【００７０】
１つの実施形態において、ウイルス核酸に由来する生来的なコートタンパク質をコードする配列の欠失（非生来的（外来）植物ウイルスコートタンパク質コード配列）と、非生来的なプロモーター（好ましくは、非生来的コートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーター）とを含み、かつ、植物宿主における発現、組換え植物ウイルス核酸のパッケージング、および、組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身的感染を確実にすることを可能にする植物ウイルス核酸が挿入のために提供される。あるいは、生来的なコートタンパク質コード配列は、非生来的なタンパク質が産生されるように、非生来的な核酸配列をその中に挿入することによって非転写性にすることができる。組換え植物ウイルス核酸構築物は１つ以上のさらなる非生来的なサブゲノムプロモーターを含有することができる。それぞれの非生来的なサブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子または核酸配列を植物宿主において転写または発現させることができ、かつ、相互の組換え、および、生来的なサブゲノムプロモーターとの組換えができない。加えて、組換え植物ウイルス核酸構築物は、トランス作用する調節因子と結合し、その下流側に位置するコード配列の転写を調節する１つ以上のシス作用調節エレメント（例えば、エンハンサーなど）を含有することができる。２つ以上の核酸配列が含まれるならば、非生来的な核酸配列を、生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して、または、生来的および非生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入することができる。非生来的な核酸配列はサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写または発現されて、所望の生成物を産生する。
【００７１】
第２の実施形態では、生来的なコートタンパク質コード配列が、非生来的なコートタンパク質コード配列に隣接する代わりに、非生来的なコートタンパク質サブゲノムプロモーターの１つに隣接して設置されることを除いて、組換え植物ウイルス核酸構築物が第１の実施形態でのように提供される。
【００７２】
第３の実施形態では、そのサブゲノムプロモーターに隣接して設置された生来的なコートタンパク質遺伝子と、ウイルス核酸構築物に挿入された１つ以上の非生来的なサブゲノムプロモーターとを含む組換え植物ウイルス核酸構築物が提供される。挿入された非生来的なサブゲノムプロモーターは隣接遺伝子を植物宿主において転写または発現させることができ、かつ、相互の組換え、および、生来的なサブゲノムプロモーターとの組換えができない。非生来的な核酸配列を非生来的なサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入することができ、その結果、前記配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写または翻訳されて、所望の生成物を産生させるようにすることができる。
【００７３】
第４の実施形態では、生来的なコートタンパク質コード配列が非生来的なコートタンパク質コード配列によって置き換えられることを除いて、組換え植物ウイルス核酸構築物が第３の実施形態でのように提供される。
【００７４】
ウイルスベクターは、本明細書中上記で記載されるような組換え植物ウイルス核酸構築物によってコードされる発現したコートタンパク質によってカプシド形成して、組換え植物ウイルスを生じさせる。組換え植物ウイルス核酸構築物または組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物に感染させるために使用される。組換え植物ウイルス核酸構築物は、宿主における複製、宿主内での全身的な拡大、および、所望のタンパク質を産生させるための宿主における１つ以上の外来遺伝子（単離された核酸）の転写または発現が可能である。
【００７５】
上記に加えて、本発明の核酸分子はまた、葉緑体ゲノムに導入することができ、それによって、葉緑体での発現を可能にすることができる。
【００７６】
外因性核酸配列を葉緑体のゲノムに導入するための技術が知られている。この技術は下記の手順を伴う。第１に、植物細胞を、細胞あたりの葉緑体の数を約１個に減らすように化学的に処理される。その後、外因性核酸が、少なくとも１つの外因性核酸分子を葉緑体に導入することを目指して、好ましくは粒子衝撃によって細胞に導入される。外因性核酸は、相同的組換え（これは葉緑体に固有の酵素によって容易に行われる）による葉緑体ゲノムへの組込みを可能にするように当業者によって選択される。この目的のために、外因性核酸は、目的とする遺伝子に加えて、葉緑体ゲノムに由来する少なくとも１つの核酸配列を含む。加えて、外因性核酸は選択マーカーを含み、そのような選択マーカーは、逐次的な選抜手法によって、そのような選抜の後の葉緑体ゲノムのすべてまたは実質的にすべてのコピー体が外因性核酸を含むことを確認することを当業者に可能するために役立つ。この技術に関するさらなる詳細が、米国特許第４９４５０５０号および同第５６９３５０７号に見出される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。従って、ポリペプチドを葉緑体のタンパク質発現系によって産生させることができ、かつ、葉緑体の内膜に一体化させることができる。
図面の簡単な記述
【００７７】
添付されている図面は本発明の特定の局面を例示しているが、いかなる点でも限定であることは意図されない。
図１は、Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す；軽鎖および重鎖の両方のエキソン配列が赤色で強調される。配列は下記の通りである：ｐＧ１ＫＤ２１０．ＢＡＴ−ＲＨｃＲＫｄ−ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖；およびｐＧ４ＫＤ１１０−ＢＡＲＨｃＲＫｄ−ＩｇＧ４の重鎖および軽鎖。
【００７８】
図２は、抗体のための合成遺伝子の配列を示す。推定されるアミノ酸配列が核酸配列の上に示される。主要な制限部位が核酸配列の下に示される。サブクローニングのために使用された制限部位が太字で示される。配列は下記の通りである（名称の後に、存在する制限部位が続く；クローニングのために使用された制限部位が太字で示される）：
【００７９】
図３は、発現カセットおよびバイナリーベクターへの合成遺伝子のクローニングを示す。図３Ａは、植物の標的化シグナルを伴う合成遺伝子の構築を示す：合成遺伝子は下記の１つを含有する−制限部位前の停止コドン（その結果、アポプラストに標的化される）（構築物２、構築物６、構築物１０）、液胞標的化ペプチドをコードし、その後に停止コドンが続く配列（液胞に標的化される；構築物４、構築物８、構築物１２）、または、シグナル配列が存在せず、ＥＲ保持シグナルに融合される（ＥＲに標的化される；構築物３、構築物７、構築物１１）。図３Ｂは、ヒトのシグナルペプチド配列を伴う合成遺伝子の構築を示す。この合成遺伝子はヒト天然抗体のシグナルとともに始まり、停止コドンで終了する。
【００８０】
図４は、ウエスタンブロット分析によって検出されたときのＩｇＧ１の重鎖および軽鎖（図４Ａ）ならびにＩｇＧ４の重鎖および軽鎖（図４Ｂ）の発現を示す。形質転換されたニンジンカルスを抗体の重鎖および軽鎖の産生についてスクリーニングした。１ｇのカルスを抽出緩衝液とともにホモジネートし、１５ｍｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。重鎖および軽鎖を特異的な抗ＦＣ抗体および抗カッパ抗体により検出した。図４Ａは、ＩｇＧ１（１＋９）を発現する形質転換カルスを示す。標準品（Ｓｔ．）ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖が示される。各レーンは、スクリーニングされた異なるカルスを表す。図４Ｂは、ＩｇＧ４（５＋９）を発現する形質転換カルスを示す。標準品（Ｓｔ．）ＩｇＧ４の重鎖および軽鎖が示される。各レーンは、スクリーニングされた異なるカルスを表す。
【００８１】
図５は、組み立てられたＩｇＧ１（Ａ）およびＩｇＧ４（Ｂ）との、本発明による産生性細胞株により産生された抗体のウエスタンブロット分析を示す。選択されたカルスの細胞懸濁物を、組み立てられたＩｇＧ１またはＩｇＧ４の産生および分泌について分析した。１ｇのカルスを抽出緩衝液とともにホモジネートし、１５ｍｇの可溶性抽出物および２０ｍｌの培地を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。組み立てられたＩｇＧ１鎖およびＩｇＧ４鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。数字は、単離された異なるカルスを表し、また、標準のＩｇＧ４が示される。
【００８２】
図６は、Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカチオン交換カラムでのＩｇＧ１発現細胞抽出物の分離を示す。ＩｇＧ１精製における最初の工程をクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った：清澄化された抽出物を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）において平衡化された強カチオン交換カラム（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に負荷した。ＩｇＧ１の溶出を、１ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液を用いて行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。図６Ａはカチオン交換カラムでの細胞抽出物の標準的な処理を示す。青色は２８０ｎｍでの吸光度を表し、緑色は電気伝導率を表す。分画物番号が示される。図６Ｂは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動され、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写された、処理期間中に集められた分画物を示す。組み立てられたＩｇＧ１鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。総タンパク質負荷および素通り（ＦＴ）が示される。数字は溶出分画物を表し、標準のＩｇＧ１が示される。
【００８３】
図７は、Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカチオン交換カラムでのＩｇＧ４発現細胞抽出物の分離を示す。ＩｇＧ４精製における最初の工程をクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った：清澄化された抽出物を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）において平衡化された強カチオン交換カラム（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に負荷した。ＩｇＧ４の溶出を、１ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液を用いて行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。図７Ａはカチオン交換カラムでの細胞抽出物の標準的な処理を示す。青色は２８０ｎｍでの吸光度を表し、赤色は塩勾配を表す。分画物番号が示される。図７Ｂ。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。組み立てられたＩｇＧ４鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。総タンパク質負荷および素通り（ＦＴ１、ＦＴ２）が示され、数字は溶出分画物を表し、標準のＩｇＧ４が示される。
【００８４】
図８ａ〜図８ｂおよび図９ａ〜図９ｂは、ＩｇＧ１（図８Ａ）およびＩｇＧ４（図９Ａ）のプロテインＡでの典型的な処理を、選択された分画物のウエスタンブロット分析（図８Ｂおよび図９Ｂ）と一緒に表す。
【００８５】
図８は、プロテインＡセファロースで分離された、カチオン交換溶出からのＩｇＧ１含有分画物を示す。ＩｇＧ１精製における第２の工程をプロテインＡクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った。カチオン交換カラムからのＩｇＧ４含有分画物をプールし、プロテインＡセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ）で分離した。ＩｇＧ１の溶出をクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）により行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。図８ＡはプロテインＡセファロースカラムでの標準的な処理を示す。図８Ｂ。処理期間中に集められた分画物を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。組み立てられたＩｇＧ１鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。総タンパク質負荷が示される。数字は溶出分画物を表し、標準のＩｇＧ１が示される。
【００８６】
図９は、プロテインＡセファロースで分離された、カチオン交換溶出からのＩｇＧ４含有分画物を示す。ＩｇＧ４精製における第２の工程をプロテインＡクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った。カチオン交換カラムからのＩｇＧ４含有分画物をプールし、プロテインＡセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ）で分離した。ＩｇＧ４の溶出をクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）により行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。図９ＡはプロテインＡセファロースカラムでの標準的な処理を示す。図９Ｂ。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに転写した。組み立てられたＩｇＧ４鎖を抗ＦＣ抗体により検出した。総タンパク質負荷が示される。数字は溶出分画物を表し、標準のＩｇＧ４が示される。
【００８７】
図１０ａ〜図１０ｂおよび図１１ａ〜図１１ｂは、精製されたＩｇＧ１タンパク質およびＩｇＧ４タンパク質のウエスタンブロットおよびクーマシー染色をそれぞれ示す。
【００８８】
図１０は、精製されたＩｇＧ１のウエスタンブロットおよびクーマシー染色を示す。精製されたＰｒｏｔａｌｉｘ−ＩｇＧ１および市販（標準）のＩｇＧ１を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、抗ＦＣ抗体とのウエスタンブロット（Ａ）によって、また、クーマシー染色（Ｂ）によって分析した。図１０Ａは、ＩｇＧ１標準物の５０ｎｇ（１）、Ｐｒｏｔａｌｉｘ ＩｇＧ１の１：５希釈物（２）を示す。図１０Ｂは、ＩｇＧ１標準物の１ｍｇ（１）、０．５ｍｇ（２）、ＭＷマーカー（３）、Ｐｒｏｔａｌｉｘ ＩｇＧ１（４〜７）を示す。ＭＷマーカーのサイズが示される。
【００８９】
図１１は、精製されたＩｇＧ４のウエスタンブロットおよびクーマシー染色を示す。精製されたＰｒｏｔａｌｉｘ−ＩｇＧ４および市販（標準）のＩｇＧ４を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、抗ＦＣ抗体とのウエスタンブロット（Ａ）によって、また、クーマシー染色（Ｂ）によって分析した。図１１Ａは、ＩｇＧ４標準物の１００ｎｇ（１）、５０ｎｇ（２）、２５ｎｇ（３）、Ｐｒｏｔａｌｉｘ ＩｇＧ４の１：５希釈物（４）を示す。図１１Ｂは、ＩｇＧ４標準物の１ｍｇ（１）、０．５ｍｇ（２）、０．２５ｍｇ（３）、０．１２５ｍｇ（４）、Ｐｒｏｔａｌｉｘ ＩｇＧ４（５）を示す。ＭＷマーカーのサイズが示される。
【００９０】
図１２は、ＰｒｏｔａｌｉｘのＩｇＧ１、ＩｇＧ４、および、ＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１とインキュベーションされた細胞の、ＦＡＣＳ分析により測定されたときの蛍光強度における変化を示す。特異的な表面抗原を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を０．１ｍｌの精製された抗体と５０ｍｇ／ｍｌでインキュベーションした。結合した抗体を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体、その後、ＰＥ−コンジュゲート化ストレプトアビジンを使用して検出した。非標識の細胞をコントロールとして使用した。Ａ：異なる抗体（凡例を参照）により染色された細胞のＦＡＣＳ分析、Ｂ：分析されたサンプルの平均蛍光。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９１】
本発明は、抗体を植物細胞培養において製造するシステムおよび方法に関する。本発明はまた、（本明細書中における例示的な抗体であり、かつ、本発明（およびその最良の実施）を例示するために提供されるＣｕｒｅｔｅｃｈ抗体を除き、また、いかなる点でも限定であることは何ら意図されることなく）そのようなシステムおよびその方法に従って製造される抗体を包含し、また、同様に宿主細胞およびそのベクターを包含する。
【００９２】
驚くべきことに、また、背景の教示に反して、本発明者らは、本発明による抗体が、哺乳動物細胞の培養で産生された抗体と比較して、より大きい結合効率を有することを見出している。さらに、本発明者らはまた、植物細胞の培養では以前に明らかにされていなかった、安定で、かつ、非常に機能的なＩｇＧ４タイプの抗体を製造することができた。実際、ＩｇＧ４の発現は植物細胞の培養（または植物細胞のいずれかのタイプ）ではこれまで一度も明らかにされてない。
【００９３】
１つだけの仮説によって限定されることを望まないが、本発明に従って製造された抗体のより大きい結合親和性は、哺乳動物細胞の培養で製造された抗体と対照的ではあるが、示差的なグリコシル化に関連づけられ得ることが考えられる。抗体は、異なった影響を抗体自身のグリコシル化パターンによって受ける少なくとも２つの重要な生物学的機能を有する。抗体は、一方では、抗原と結合することができる必要があるが、免疫系を活性化するために、エフェクターリガンドを活性化することができる必要もある。
【００９４】
有効な抗体は免疫系を下記のように活性化する。抗体がその抗原に結合すると、抗体は免疫系を補強し、その抗原を特徴とする標的（例えば、悪性細胞）を破壊する。抗体のＦＣ領域が、免疫系を活性化し、かつ、マクロファージ細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞の動員を引き起こす因子と相互作用することができる。抗体はまた、免疫系の細胞に加えて、血液中に見出されるタンパク質を含む補体系を活性化する。活性化されると、補体系は様々な応答を生じさせることができる。このような補体系は、（１）細胞表面への抗体結合、（２）免疫複合体の形成、および（３）異物細胞膜の炭水化物成分の３つの別個の活性化誘因からなる。エフェクターリガンドを活性化する能力は、以前に記載されたように、グリコシル化の具体的なタイプおよび程度によって影響を受ける。
【００９５】
しかしながら、抗原に対する抗体の結合はグリコシル化によって影響を受けない（例えば、参考文献２７および参考文献３２を参照のこと）。本発明による植物細胞培養システムで製造された例示的な抗体は、哺乳動物のＣＨＯ細胞で製造されたＩｇＧ１抗体よりも大きい親和性を抗原について有し、かつ、強く抗原に結合することが示されている。また、この例示的な抗体はＩｇＧ４サブタイプの機能的な例として安定に産生された。これが植物細胞培養システムにおいて可能であるとは以前には明らかにされていなかった。
【００９６】
植物細胞は、現行の「医薬品安全性試験実施基準」（ｃＧＬＰ）および「医薬品の製造および品質管理に関する基準」（ｃＧＭＰ）を使用して、固体培地での脱分化した細胞の集塊物（カルス）として、または、細胞懸濁物としてインビトロで培養することができる（４４）。哺乳動物細胞の培養と比較して、植物細胞の培養は比較的安価であり、また、細胞は一般に、動物細胞の培養物よりも丈夫である。重要なことに、植物細胞は、免疫グロブリンの正しい組み立て、折り畳みおよび可能な分泌のために要求される内因性の膜システムおよび補助的なタンパク質装置を有する。最初のタンパク質グリコシル化は、哺乳動物のシステムにおいて観測されるパターンにかなり匹敵しているが、様々な違いが組換えタンパク質の末端糖残基の中に観測されている（４５）（１８）。
【００９７】
高マンノースＮ−結合型グリカンおよび複合Ｎ−結合型グリカンの基本的な生合成経路は、植物を含むすべての真核生物の間で非常に保存されている。異なるシグナルペプチドの使用、従って、異なる細胞内輸送は、他の発現システムと比較して、グリコシル化パターンを変化させることができ、かつ、タンパク質の活性および安定性を改善することができる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９６９７８を参照のこと）。
【００９８】
トランスジェニックタバコ植物において製造されたモノクローナル抗体Ｇｕｙ’ｓ１３（プランティボディー（ｐｌａｎｔｉｂｏｄｙ）Ｇｕｙ’ｓ１３）の重鎖に結合したＮ−結合型グリカンの構造が特定され、マウス起源の対応するＩｇＧ１に見出される構造と比較された（２９）。プランティボディーＧｕｙ’ｓ１３の重鎖に位置する２つのＮ−グリコシル化部位はともにマウスでのようにＮ−グリコシル化される。しかしながら、Ｇｕｙ’ｓ１３の糖型の数は、植物での方が哺乳動物発現システムの場合よりも大きい。プランティボディーのＮ−グリカンの構造的多様性が大きいにもかかわらず、グルコシル化は、可溶性で、かつ、生物学的に活性なＩｇＧを植物システムにおいて製造するために充分であるようである。植物の糖タンパク質は、哺乳動物の糖タンパク質によって示されるグリコシル化パターンに対して様々な異なるグリコシル化パターンを示すので、望ましくない免疫応答を哺乳動物において誘導するこれらの植物組換え抗体の可能性を調べた。様々な分析により、植物組換え抗体のタンパク質部分およびグリカン部分の両方に向けられた抗体は検出できないレベルであることが示された。これらの結果は、ヒトにおける治療剤およびワクチンとしての植物組換えタンパク質の適用についての直接的な関連性を有している（４７）。
【００９９】
述べられたように、植物はヒトのタンパク質をその正しい位置においてグリコシル化するが、完全にプロセシングされた複雑な植物グリカンの組成は哺乳動物のＮ−結合型グリカンとは異なる。植物のグリカンは、動物のグリカンでは共通する末端シアル酸残基またはガラクトース残基を有しておらず、また、多くの場合、哺乳動物では一般に見出されない結合を伴うキシロース残基またはフコース残基を含有する（Ｊｅｎｋｉｎｓ他、１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、９７５〜９８１（１９９６）；ＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓおよびＦａｙｅ、ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ、９９頁〜１１４頁（Ｏｗｅｎ，Ｍ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９６）；Ｒｕｓｓｅｌｌ ２４０ Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９））。具体的には、植物は、哺乳動物では見出されないさらなるβ１−２結合したキシロシル残基およびα１−３結合したフコシル残基を含む。逆に、植物は、哺乳動物において存在するフコシル−１−６−残基を含まない。従って、本発明は、植物のグリコシル化パターンを有する抗体（好ましくは、ＩｇＧ４イソタイプ）を教示する。
【０１００】
本明細書中で使用されるように、植物のグリコシル化パターンは、少なくとも１つのβ１−２結合したキシロシル残基または少なくとも１つのα１−３結合したフコシル残基を含む。グリコシル化パターンはまた、ヒトのグリコシル化パターン（例えば、ガラクトース残基またはシアル酸残基）を部分的に含むことができる。
【０１０１】
シアル酸残基は、ヒト受容者における関連ポリペプチドのインビボ半減期を延ばす薬物動態学的理由のために要求されることが理解される。従って、本発明では、例えば、植物において合成された抗体製造物のグリカンの「ヒト化」の問題に対処し、その結果、抗体製造物が、好ましくは、部分的な植物グリコシル化パターンおよび部分的なヒトグリコシル化パターンを含むようにするための様々な戦略の使用が意図される（これは本明細書中上記で詳細に記載される）。
【０１０２】
ＩｇＧ４抗体の発現がトランスジェニックヤギの乳汁およびマウス骨髄腫細胞株ＮＳＯにおいて記載されている（４８、４９）。ＮＳＯ細胞において発現された抗ＴＧＦｂｅｔａ２ ＩｇＧ４はＴＧＦｂｅｔａ２に対する大きい親和性を有し、かつ、ＴＧＦｂｅｔａ２の抗増殖作用を中和し、従って、ＴＧＦｂｅｔａ２によって媒介される線維性疾患の治療において提案されている。しかしながら、ＮＳＯ細胞で産生されたタンパク質のグリコシル化パターンはヒトにおけるグリコシル化パターンとは異なる。例えば、グリコシド構造は、免疫原性エピトープを表すさらなるガラクトースα（１−３）構造を含む。循環ＩｇＧの１％がこのエピトープに対する特異的な抗体であることが推定される。従って、そのようなエピトープを有する組換え抗体の注入は、免疫複合体の形成を生じさせ、全身的な炎症性応答を引き起こすことが考えられる（４９）（５０）。
【０１０３】
開示および記載される場合、本発明は、本明細書中に開示される特定の例、プロセス工程および材料に限定されないことを理解しなければならない。これは、そのようなプロセス工程および材料は幾分異なり得るからである。本発明の範囲は、添付された請求項およびその均等物によってのみ限定されるので、本明細書中で使用されている用語法は、特定の実施形態を記載する目的のために使用されるだけであり、限定であることを意図していないこともまた理解しなければならない。
以下は、本願全体を通して使用される用語の非限定的な説明である。
【０１０４】
本明細書および下記の請求項を通して、文脈がそうでないことを要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および変化形（例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」など）は、言及された完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）もしくは工程または完全体もしくは工程の群を包含するが、任意の他の完全体もしくは工程または完全体もしくは工程の群を排除しないことを意味することが理解される。
【０１０５】
本明細書および添付された請求項において使用されるように、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の参照物を含むことに留意しなければならない。
【０１０６】
下記の実施例は、本発明の様々な局面を実施する際に本発明者らによって用いられた様々な技術を表している。これらの技術は本発明の実施のための好ましい実施形態を例示しているが、当業者は、本開示に照らして、数多くの改変が、本発明の精神および意図された範囲から逸脱することなく行われ得ることを認識することを理解しなければならない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
本発明のシステムにおける抗体の製造
本実施例では、本発明によるシステムにおける例示的な抗体の製造が記載される。
【０１０８】
材料および方法：
合成遺伝子
組換えヒトＩｇＧの配列をＣｕｒｅＴｅｃｈから受け取った。この配列を図１に関して示す。ｐＧ１ＫＤ２１０およびｐＧ４ＫＤ１１０と名付けられたベクターは重鎖配列および軽鎖配列の両方を含有する。ｐＧ１ＫＤ２１０は重鎖γ１をコードし、ｐＧ４ＫＤ１１０は重鎖γ４をコードする（図１を参照のこと）。すべての遺伝子はイントロンを含有した。公開されているデータベースおよび分子生物学プログラムを使用して、抗体遺伝子の重鎖および軽鎖のコード領域ならびにスプライス部位を位置づけた。
【０１０９】
スプライス部位の予測を、ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／において見出されるＮｅｔＧｅｎｅ２プログラムを使用することによって行った（下記の参考文献もまた参照のこと：Ｓ．Ｍ．Ｈｅｂｓｇａａｒｄ、Ｐ．Ｇ．Ｋｏｒｎｉｎｇ、Ｎ．Ｔｏｌｓｔｒｕｐ、Ｊ．Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ、Ｐ．Ｒｏｕｚｅ、Ｓ．Ｂｒｕｎａｋ、局所的および全体的な配列情報を組み合わせることによるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＤＮＡにおけるスプライス部位予測、１９９６、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４：３４３９〜３４５２；Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．およびＫｎｕｄｓｅｎ，Ｓ．、ＤＮＡ配列からのヒトｍＲＮＡのドナー部位およびアクセプター部位の予測、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２０：４９〜６５）。
【０１１０】
これは、ヒトのイントロンは植物では正しく認識されないかもしれないので、元のヒト抗体のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするイントロン非含有の合成遺伝子を調製するために必要であった。
【０１１１】
タンパク質配列をＣｕｒｅｔｅｃｈ（本ヒト抗体の最初の作製者）により確認した後、配列を、ニンジンの最適なコドン使用を使用して逆翻訳した。ＤＮＡ配列を、タンパク質配列を改変することなく、制限部位、および、高レベルの発現を妨害するかもしれない配列を避けるために改変した。
【０１１２】
生物毎のコドン使用をＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）において見出すことができる。通常、コドン使用の頻度はそれらの同族ｔＲＮＡの存在量を反映する。従って、標的タンパク質のコドン使用が発現宿主の平均的なコドン使用から著しく異なるとき、これは様々な問題を発現時に引き起こし得る。多くの場合、下記の問題に遭遇する：
＊（翻訳を低下させることによる）低下したｍＲＮＡ安定性。
＊転写および／または翻訳の早期停止、これは様々な短縮化されたタンパク質産物を生じさせる。
＊フレームシフト、欠失および誤った取り込み（例えば、アルギニンに代わるリシン）。
＊タンパク質合成および細胞増殖の阻害。
【０１１３】
結果として、観測される発現レベルは低いことが多いか、あるいは、希なコドンがｍＲＮＡの５’末端に存在するか、またはクラスターで存在するときには特に、発現が全く認められない。これは発現レベルを低下させ、また、短縮化されたタンパク質産物が見出される。
【０１１４】
発現レベルを、高発現のニンジン遺伝子において希にしか見出されないコドンを、遺伝子全体を通して、より有利な（ニンジン細胞において頻繁に使用される）コドンで置換することによって改善することができる。
【０１１５】
制限部位を、図２に関して示されるように、容易なクローニングを促進するために、３つの抗体鎖（γ１、γ４およびκ）をコードする配列の前後に導入した。配列の種々の改変を、最大の発現レベルおよび代替のグリコシル化パターンがどこで達成され得るかを調べるために、組換え抗体が植物細胞における異なるオルガネラに標的化されることを可能にするように行った（３３〜３６）。この目的のために、さらなる構築物を調製した（この場合、制限部位が、シグナルペプチドを植物のシグナルペプチドのための配列で置換するために、元の生来的なヒトのシグナルペプチドをコードする配列の代わりに導入された）。抗体をＥＲに対して標的化するために、停止コドンを、ＥＲ保持シグナルとの融合を容易にするために除いた。液胞に対する標的化を、液胞選別シグナルＧＬＬＶＤＴＭ（配列番号１３）をコードする配列を停止コドンの前に組み込むことによって達成した。これらの構築物がＴｈｅｒｍｏ Ｈｙｂａｉｄ ＧｍｂＨ（Ｕｌｍ、ドイツ）によって合成された。
【０１１６】
プラスミドベクター
ＣＥ−Ｋ。これを、Ｇａｌｉｌｉ教授から得たプラスミドＣＥ［米国特許第５３６７１１０号（１９９４年１１月２２日）］から構築した。プラスミドＣＥをＳａｌＩで消化した。
【０１１７】
ＳａｌＩ付着性末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメントを使用して平滑末端にした。その後、プラスミドをＰｓｔＩで消化し、塩基性エンドキチナーゼ遺伝子［シロイヌナズナ］由来のＥＲ標的化シグナルをコードするＤＮＡフラグメントＡＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＡＡＴＴＣ（配列番号１４）に、また、ＳｍａｌおよびＰｓｔＩで消化されたＥＲ保持シグナルＫＤＥＬ（３７）に連結した。
【０１１８】
ｐＧＲＥＥＮＩＩ。これをＰ．Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ博士から得た（３８）。ｐＧＲＥＥＮＩＩベクターからの発現は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）のΩ翻訳エンハンサーエレメント、および、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のオクトピンシンターゼのターミネーター配列によって制御される。
【０１１９】
発現プラスミドの構築
合成遺伝子をエンドヌクレアーゼのＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、例外として、遺伝子１１の軽鎖ＥＲをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した（合成遺伝子において下線が引かれた制限配列を参照のこと）。重鎖をコードする遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化された発現カセットを有するバイナリーベクターｐＧＲＥＥＮＩＩに連結した。軽鎖をコードする遺伝子を、発現カセットを有し、かつ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化された中間ベクター（ＣＥＫ）に連結した。合成軽鎖遺伝子を伴う発現カセットを中間ベクターから切断および溶出し、対応する重鎖を有するバイナリーベクターに連結し、最終的な発現ベクターを形成した（図３）。カナマイシン耐性が、ｐＧＲＥＥＮベクターと一緒に得られたｎｏｓプロモーターにより駆動されるＮＰＴＩＩ遺伝子によって付与される（図３）。得られた発現カセットを図３に示す。
【０１２０】
表１には、種々の構築物およびそれらの呼称がまとめられる。
【０１２１】
ニンジンカルスの確立および細胞懸濁培養
ニンジンカルスの確立およびニンジン細胞懸濁培養は、Ｔｏｒｒｅｓ Ｋ．Ｃ．によって以前に記載された通りに行われた（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｈｏｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｒｏｐｓ、１１１頁、１６９）。
【０１２２】
ニンジン細胞の形質転換および形質転換された細胞の単離
ニンジン細胞の形質転換を、以前に記載された方法（３９）（４０）の適合化によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換を使用して行った。液体培地で増殖する細胞を、カルスの代わりに、プロセスを通して使用した。インキュベーション時間および増殖時間を、液体培養における細胞の形質転換のために適合させた。簡単に記載すると、アグロバクテリウム細菌をエレクトロポレーションによりｐＧＲＥＥＮ ＩＩベクターシステムで形質転換し、その後、３０ｍｇ／ｍｌのパロモマイシン抗生物質を使用して選択した。ニンジン細胞をアグロバクテリウム細菌で形質転換し、液体培地において６０ｍｇ／ｍｌのパロモマイシン抗生物質を使用して選択した。
【０１２３】
高レベルのＩｇＧ１およびＩｇＧ４を発現するカルスを単離するための形質転換ニンジン細胞のスクリーニング
形質転換後１４日目に、培養から得られた細胞を、個々の細胞クラスターからカルスを形成させるために３％充填細胞体積の希釈度で固体培地に置床した。個々のカルスが１ｃｍ〜２ｃｍの直径に達したとき、細胞を抽出緩衝液においてホモジネートし、得られたタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースメンブラン（ｈｙｂｏｎｄＣニトロセルロース、０．４５ミクロン、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に転写した。重鎖および軽鎖の検出のためのウエスタンブロットを、抗ＦＣ（Ｓｉｇｍａ Ａ−０１７０）および抗Ｋａｐｐａ（Ｓｉｇｍａ Ａ−７１６４）抗体を使用して行った。市販のｈＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ Ｉ５１５４）およびｈＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ Ｉ４６３９）抗体を、標準物として使用した。有意なレベルのＩｇＧ１またはＩｇＧ４を発現するカルスを拡大して、スケールアップ、タンパク質精製および分析のために液体培地での増殖に移した。
【０１２４】
Ｐｒｏｔａｌｉｘのバイオリアクターにおけるスケールアップされた培養での増殖
ＩｇＧ４またはＩｇＧ１を発現する遺伝子改変されたニンジン細胞の１ｃｍ〜２ｃｍの直径の個々のカルスを、４．４ｇｒ／ｌのＭＳＤ培地（Ｄｕｃｈｅｆａ）、９．９ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ（Ｄｕｃｈｅｆａ）、０．５ｍｇ／ｌの葉酸（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｌのビオチン（Ｄｕｃｈｅｆａ）、３０ｇ／ｌの糖、および０．２ｍｇ／ｌの２−４Ｄ（Ｓｉｇｍａ）を含有する、直径９ｃｍのムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）寒天培地平板に置床した。カルスを２〜３週間毎に継代培養し、２５℃で増殖させた。
【０１２５】
懸濁細胞培養を、形質転換されたカルスをＭＳＤ液体培地で継代培養することによって調製した。懸濁細胞を、２５０ｍｌ三角フラスコにおいて、２５℃で、１２０ＲＰＭの振とう速度で培養した（操作体積を２５ｍｌで開始し、７日後に５０ｍｌまで新しい培地を加えた）。その後、細胞を新しい培地で７日間毎に継代培養した。４ＬのＭＳＤ培地を含有する小型バイオリアクター（１０Ｌ）の接種物を、７日間の細胞培養物から得られた４００ｍｌの懸濁細胞を加えることによって得た。１Ｌｐｍの空気流を用いて２５℃で１週間の培養の後、ＭＳＤ培地を１０Ｌにまで加え、培養を同じ条件のもとで継続した。さらに７日間の培養の後、細胞を、細胞培地を１００メッシュの網に通すことによって集め、回収した。過剰な培地を絞り出し、充填細胞ケークを−７０℃で保存した。
【０１２６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析およびクーマシー染色
タンパク質サンプルを還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した（４１）。ゲルをクーマシーブルー染色溶液（Ｂｉｏ Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｃａｔ．１６１−０７８６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により染色したか、または、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ）に転写した。
【０１２７】
ニトロセルロース膜に転写した後、ニトロセルロース上の結合していない結合部位を、リン酸塩緩衝液（Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅＨａｅｎ、カタログ番号３０４３５）により希釈された１％の粉乳（Ｄａｉｒｙ Ａｍｅｒｉｃａ）および０．１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ Ｐ１３７９）を含有するブロッキング緩衝液により４℃で一晩飽和させた。ブロットを、上記のように１％の粉乳および０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）におけるＨＰＲコンジュゲート化抗体（抗ＦＣ（Ｓｉｇｍａ Ａ−０１７０）および／または抗κ（Ｓｉｇｍａ Ａ−７１６４）、１：６５００の希釈）と２５℃で１．５時間インキュベーションした。
【０１２８】
抗体とのインキュベーションの後、ブロットを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにより３回（それぞれの場合において１０分間）洗浄し、次いでＰＢＳにより３回洗浄した。ブロット片をＥＣＬ発色剤試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＲＰＮ２２０９）により染色した。ブロットをＥＣＬ試薬に浸けた後、ブロットをＸ線フィルムＦＵＪＩ Ｓｕｐｅｒ ＲＸ １８ｘ２４に感光させ、ＦＵＪＩ−ＡＮＡＴＯＭＩＸ現像液および固定液（ＦＵＪＩ−Ｘ固定液 ｃａｔ＃ ＦＩＸＲＴＵ １／２）により現像した。抗体が結合したタンパク質を特徴づけるバンドがこの処理の後で視認された。
【０１２９】
タンパク質精製
精製手順はＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方について同様であった。ＩｇＧ精製のために、約１ｋｇの湿重量の細胞を含有する凍結細胞ケークを解凍し、ＩｇＧを、細胞を１Ｌの抽出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、２０ｍＭアスコルビン酸、０．１ｍＭ ＤＴＴ）においてホモジネートすることによって抽出した。ホモジネートを１７０００ｇでの２０分間の４℃における遠心分離によって清澄化した。ペレットを捨て、上清を３０ＫのＭＷＣＯ膜による限外ろ過によって濃縮した。３０Ｋ保持液のｐＨを濃クエン酸の添加によってｐＨ５．５に調節した。ｐＨ調節後に生じた濁りを上記の同じ条件のもとでの遠心分離によって清澄化した。
【０１３０】
さらなる精製をクロマトグラフィーカラムによって下記のように行った：１２５０ｍｌの清澄化された抽出液を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）において平衡化された、ＸＫカラム（２．６ｘ２０ｃｍ）に充填されている１３５ｍｌの強カチオン交換樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に負荷した。カラムを、電気伝導率、ｐＨおよび２８０ｎｍでの吸光度のモニターリングを可能にするＡＫＴＡプライムシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一体化した。サンプルを４５ｍｌ／分で負荷し、その後、カラムを、ＵＶ吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液（２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）により４５ｍｌ／分の流速で洗浄した。ＩｇＧ４の溶出を、１ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液により行った。処理期間中に集められた分画物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロット分析によって分析した。ＩｇＧを含有する分画物をプールした。プールしたサンプルのｐＨをＮａＯＨにより７．５に調節した。
【０１３１】
ＩｇＧを含有するサンプルを１０ｍｌのプロテインＡセファロースカラムに加えた。サンプルを１０ｍｌ／分で負荷し、その後、ＵＶ吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液（１００ｍＭクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ＝７．５）により洗浄した。精製されたＩｇＧ組み立て物を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ＝３．４）により溶出し、ＩｇＧを含有する分画物をプールした。プールしたサンプルのｐＨを１ＭのＴｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ Ｔ−６０６６）（ｐＨ８）により７．５に調節し、−２０℃で保存した。
【０１３２】
タンパク質濃度の測定
細胞抽出物および分画物におけるタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン標準品（ＢＳＡ 第Ｖ画分、Ｓｉｇｍａ Ａ−２１５３）を使用してＬｏｗｒｙ／Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｉｏ Ｒａｄタンパク質アッセイ Ｃａｔ．５０００−０００６）（４２）によってアッセイした。あるいは、均質なタンパク質サンプルの濃度は２８０ｎｍにおける吸収によって決定された（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４Ｏ．Ｄ２８０）。純度は２８０／２６０ｎｍ比によって決定された。
【０１３３】
哺乳動物細胞の培養
Ｊｕｒｋａｔ細胞のクローンＥ６−１（ＡＴＣＣカタログ番号ＴＩＢ−１５２）を、１０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０４−１２１−１Ａ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０２０−１Ｂ）、１ｍＭのピルビン酸Ｎａ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０４２−１Ｂ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０２５−１Ｃ）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｎｙｓ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３２−１Ｂ）が補充されたＲＰＭＩ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０１−１０４−１Ａ）において増殖させた。細胞を５％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーターにおいて増殖させた。この細胞は明らかにこれらの抗体の抗原を細胞表面に発現するので、この細胞を選んだ。
【０１３４】
蛍光染色およびＦＡＣＳ分析によるＪｕｒｋａｔ細胞に対するＩｇＧ１結合およびＩｇＧ４結合の測定
特定の表面抗原（これは、以前に記載された抗体によって認識される）を発現する５ｘ１０５個〜１ｘ１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞を１５００ｒｐｍで７分間遠心分離し、培地を除き、細胞を０．５ｍｌの洗浄緩衝液（５％のＦＣＳおよび０．０５％のアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ−２００２）を伴うＰＢＳ）により３回洗浄し、０．１ｍｌの精製された抗体と５０μｇ／ｍｌでインキュベーションした。氷上で４５分間インキュベーションした後、細胞を洗浄緩衝液により２回洗浄した。結合した抗体を、洗浄緩衝液で１：１００希釈されたビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体（ＳＢＡ Ｃａｔ．２０４０−０８）を使用して検出した（１００μｌ／サンプル、氷上で４５分間）。その後、細胞を洗浄緩衝液により２回洗浄し、続いて、１：１００希釈されたＰＥコンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲート化ストレプトアビジン、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｃａｔ．０１６−１１０−０８４）（１００μｌ／サンプル）と氷上で暗所において３０分間インキュベーションした。非標識の細胞、および、ＰＥコンジュゲート化ストレプトアビジンだけで染色された細胞をコントロールとして使用した。その後、細胞を洗浄緩衝液により２回洗浄し、１ｍｌの洗浄緩衝液に懸濁した。ＦＡＣＳ分析を、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアを伴うＢｅｃｋｅｎｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｅｒ装置で行った。
【０１３５】
結果：
異なるオルガネラ標的化による形質転換ニンジン細胞におけるＩｇＧ１およびＩｇＧ４の重鎖および軽鎖の発現
組換え抗体を、最大発現レベルおよび代替のグリコシル化パターンを達成するために異なるオルガネラに対して標的化した。この目的のために、元の生来的なヒトのシグナルペプチドが植物のシグナルペプチドによって置換されたさらなる構築物を調製した。ＥＲ保持シグナルを有する抗体、液胞選別シグナル有する抗体、および、組換えタンパク質を分泌（アポプラスト）のために標的化するＣ末端の標的化配列を有しない構築物を有する抗体をすべて調製した。
【０１３６】
アグロバクテリウム形質転換によるニンジン細胞の形質転換の後、重鎖および軽鎖の発現を調べた。興味深いことに、これらの異なる構築物により形質転換された細胞のスクリーニングでは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方のヒトの天然の抗体シグナル配列を有する構築物（遺伝子１および遺伝子９ならびに遺伝子５および遺伝子９［それぞれ、配列番号３および配列番号７ならびに配列番号１１および配列番号７］の構築物に対応する）が最も強力な構築物であり、その一方で、それ以外は検出可能なレベルのＩｇＧを示さなかったことが明らかにされた（データは示され；１つだけの仮説によって限定されることを望まないが、発現レベルは非常に低いものであり得、および／または、生じるタンパク質が不安定であり、従って、分解され得る）。
【０１３７】
ウエスタンブロット分析によるＩｇＧ１（図４Ａ）およびＩｇＧ４（図４Ｂ）の重鎖および軽鎖の発現を図４に示す。図４はカルスのランダムスクリーニングを表す（約１００個のカルスをそれぞれの構築物についてスクリーニングした）。
【０１３８】
さらに、重鎖および軽鎖の発現レベルが異なることが図４から明らかである。さらなるスクリーニングを、発現したＩｇＧ組み立て物の量および培地への分泌レベルを評価するために行った。調べられた様々なカルスのうち、それぞれの系統からの１つを拡大増殖およびタンパク質精製のために選択した。
【０１３９】
図５は、本発明による産生性細胞株により産生された抗体のウエスタンブロット分析を示す。最初のスクリーニング（図４）から得られる選択されたカルスを増殖および拡大のために液体培地に移した。選択されたカルスの細胞懸濁物を、組み立てられたＩｇＧ１またはＩｇＧ４の産生および増殖培地への分泌について分析した。図５Ａ（ＩｇＧ１）は、若干のタンパク質が培地に見出されたが、より多くのタンパク質が抽出分画物に見出されたことを示している。図５Ｂ（ＩｇＧ４）は、タンパク質が培地にほとんどなく、少量が抽出分画物に存在することを示している。
【０１４０】
形質転換されたニンジン細胞からのＩｇＧ１およびＩｇＧ４の精製
精製手順はＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方について同様であった。ホモジネート化後、可溶性ＩｇＧを、材料および方法において記載されたように、カチオン交換カラムおよびプロテインＡアフィニティーカラムを含むクロマトグラフィー技術を使用して精製した。
【０１４１】
図６Ａおよび図７Ａは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の清澄化されたタンパク質抽出物のカチオン交換カラムでの典型的な処理の結果を示す。処理期間中に集められた分画物を、図６Ｂおよび図７Ｂに見られるように、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット分析によって分析した。
【０１４２】
カチオン交換カラムからのＩｇＧ溶出プールをプロテインＡアフィニティーカラムで精製した。図８および図９は、ＩｇＧ１（図８Ａ）およびＩｇＧ４（図９Ａ）のプロテインＡでの典型的な処理を、選択された分画物のウエスタンブロット分析（図８Ａおよび図９Ｂ）と一緒に表す。
【０１４３】
図１０および図１１に示される精製されたＩｇＧ１タンパク質およびＩｇＧ４タンパク質のウエスタンブロットおよびクーマシー染色は、植物細胞で産生されたＩｇＧが数個の主要なタンパク質バンドを示すことを明らかにしている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元条件下で処理されたＩｇＧの予想サイズは、市販の標準物のヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４によって明らかにされるように１７５ｋＤａを超えるが、植物細胞により発現されたＩｇＧ１はもう１つの主要なバンドを１５０ｋＤａにおいて示し、ＩｇＧ４は２つのさらなるバンドを１５０ｋＤａおよび５０ｋＤａにおいて示す。これらのさらなるバンドは、１つだけの仮説によって限定されることは望まないが、分解した結果だけでなく、不十分な組み立てまたは誤った組み立ての結果である場合がある。
【０１４４】
組み立てられた抗体は２つの重鎖および２つの軽鎖からなり、それらはジスルフィド架橋および他のタンパク質−タンパク質相互作用によって結び付けられている。しかしながら、場合により、結合が壊れ、再び形成し、これにより、異なるサイズを有し、かつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析において異なるバンドを示す、重鎖−重鎖、重鎖または軽鎖の種々の組合せをもたらし得る。
【０１４５】
分解は可能性がほとんどない。このようなバンドは、プロテインＡカラムから直接に溶出される調製物においてさえ現れ、組み立てられたＩｇＧに対して特異的であるからである。鎖内ジスルフィド架橋および鎖間ジスルフィド架橋の間での交換に起因する、ＩｇＧ４の中でのＩｇＧ半分子（１つの重鎖および１つの軽鎖）のインビボ交換の証拠（４３）。重鎖および軽鎖がジスルフィド結合によって結び付けられ（これは鎖間と呼ばれる）、しかし、重鎖自身および軽鎖自身の内部での結合（鎖内）もまた存在する。
【０１４６】
蛍光染色およびＦＡＣＳ分析によるＪｕｒｋａｔ細胞に対するＩｇＧ１結合およびＩｇＧ４結合の測定
ＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１はＢ細胞白血病（Ｄａｕｄｉ細胞）由来の膜に対して惹起された。その報告された標的および活性はＴ細胞に対してである。本発明による細胞培養システムで製造されたＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ４抗体が、元のＩｇＧ抗体が結合したＪｕｒｋａｔ細胞（急性Ｔ細胞白血病）に存在する特異的な抗原と結合することができることが明らかにされた。図１２に示されるＦＡＣＳ分析の結果は、ＰｒｏｔａｌｉｘのＩｇＧ１、ＩｇＧ４およびＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１とインキュベーションされた細胞の蛍光強度における変化を示す。図１２Ｂに示されるＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１と比較して、ＰｒｏｔａｌｉｘのＩｇＧの平均蛍光における増大は、植物細胞により発現されたＩｇＧ１およびＩｇＧ４の、標的に対する結合が、哺乳動物のＣＨＯ細胞により発現されたＩｇＧ１よりも大きい親和性であることを示している。
【０１４７】
考察：
組換え抗体が、最大の発現レベルおよび代替のグリコシル化パターンを達成するために本発明に従って異なるオルガネラに標的化された。興味深いことに、異なる構築物により形質転換された細胞のスクリーニングでは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方の生来的なＥＲシグナルを含有する構築物が量に関して最も強力な構築物であったことが明らかにされた。これは、植物細胞は、ヒト抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の一部分である「内蔵の」標的化シグナルを利用することができることを意味する。
【０１４８】
細胞内輸送（および、従って、得られるグリコシル化）を操作することによって同じタンパク質における異なるグリコシル化パターンを獲得するという可能性は、タンパク質の機能における炭水化物の役割に関する情報、および、炭水化物構造における変化がタンパク質の立体配座にどのように影響するかの洞察を提供する、異なるグリコシル化構造を有するタンパク質を製造するためのツールとして役立ち得る。
【０１４９】
本発明は、生来的なヒトのリーダーペプチドを使用して、抗体が細胞に蓄積され、同様にまた、培地に分泌されることを明らかにしている（データは示されず）。植物細胞材料からの抗体の精製では、植物細胞の宿主タンパク質の特異な挙動がこれらの方法論では使用される最先端の抽出技術およびクロマトグラフィー技術が利用された。例えば、特定の条件のもとでは、ニンジン宿主細胞のタンパク質のほとんどはイオン交換クロマトグラフィーカラムには結合せず、一方で、ＩｇＧはそのカラムに結合した。このことにより、植物細胞タンパク質からの抗体の迅速な精製が可能となり、その後、組み立てられた抗体がプロテインＡでさらに精製された。植物細胞において発現されたこれらの抗体のグリコシル化パターンが、おそらくは抗体の安定性および機能的挙動のためではあるが、生来的なタンパク質のグリコシル化パターンと類似しているかどうかは今後、明らかにされなければならない。
【０１５０】
植物細胞により発現された抗体が、哺乳動物細胞により発現された抗体と匹敵するレベルでその抗原に結合することができることが明らかにされている（１８、４６）。精製された植物細胞発現抗体Ｃ５−１の、その抗原についての親和性が、平衡時の解離定数を測定することによってハイブリドーマ発現抗体Ｃ５−１の親和性と比較され、結果はそれぞれ４．７ｘ１０−１０Ｍおよび４．６ｘ１０−１０Ｍであった。安定性および血中クリアランス速度もまた比較され、植物細胞発現抗体および哺乳動物細胞発現抗体の両方について類似していることが見出された（４６）。
【０１５１】
それに反して、本発明によるシステムおよび方法を用いた結果は、驚くべきことに、植物細胞により発現されたＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ４抗体の、それらの抗原に対する結合が、ＣＨＯ細胞において発現されたＩｇＧ１と比較して、より大きい親和性を伴って生じたことを示す。抗原に対するＩｇＧ４の結合はＩｇＧ１よりもさらに一層強く、これはこの抗体サブクラスのより大きい親和性を示している。植物に基づくこのシステムにおけるＩｇＧ４の発現レベルは、哺乳動物細胞発現システムにおいて認められる発現レベルよりもはるかに大きい（データは示されず）。これは植物細胞システムの特異な能力をさらに強めている。
【０１５２】
正しく組み立てられ、かつ、それらのエピトープを認識することができる組換えヒトＩｇＧ１分子およびヒトＩｇＧ４分子の植物細胞懸濁状態での製造は、Ｐｒｏｔａｌｉｘ所有のバイオリアクター形態と組み合わされた新しい技術を導入し、また、異なるイソタイプの組換えヒト抗体の商業的規模での製造を可能にする。
【０１５３】
従って、本発明は、懸濁状態でのトランスジェニック植物細胞（例えば、遺伝子組換えニンジン細胞など）において製造される組換えヒト抗体のための新規で、製造規模変更可能で、費用効果的な製造プロセスおよび精製プロセスを提供する。
【０１５４】
実施例２
本発明による治療
本発明に従って製造される組換えタンパク質は、好ましくは、植物細胞培養物によって製造される抗体（これは好ましくはＩｇＧ４であり、しかし、場合により、ＩｇＧ１である場合がある）を含む。
【０１５５】
本明細書中における好ましい実施形態によれば、本発明に従って製造される抗体は、そのような抗体による治療を受け入れることができる疾患の治療に好適である。
【０１５６】
処置方法は、場合により、そして好ましくは、（ａ）形質転換された植物根細胞から精製され、かつ、抗原を効率的に標的化することができる組換え産生された生物学的に活性な抗体を提供することを含む。好ましい実施形態において、本発明の方法によって使用される組換え産生された抗体は、本発明の宿主細胞によって産生され得る。好ましくは、この宿主細胞はニンジン細胞である。
【０１５７】
「哺乳動物対象」または「哺乳動物患者」により、治療が所望される任意の哺乳動物（これには、ヒト、ウシ、ウマ、イヌおよびネコの対象が含まれる）が意味され、最も好ましくは、ヒト対象が意味される。
【０１５８】
用語「処置」はまた、病理学的状態および／またはその１つ以上の症状を改善または緩和すること、そのような状態を治療すること、あるいは、そのような状態を発生を予防することを包含することに留意しなければならない。
【０１５９】
別の好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物細胞培養で産生される等価なＩｇＧ４よりも、抗原に対してより強い結合能力を有するＩｇＧ４である。従って、各用量は、治療効果を達成するために類似する様式で投与される抗体の用量よりも場合により少なくすることができる。あるいは、抗体はより高い治療効果を達成するために類似する用量で投与されてもよい。
【０１６０】
本発明のタンパク質（抗体）は、医薬組成物を製造するために使用することができる。従って、本発明の別の局面によれば、その有効成分として、タンパク質と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数（例えば、組換えタンパク質）を、他の化学的成分（例えば、従来の薬物、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）とともに有する調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対するタンパク質または細胞の投与を容易にすることである。本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１６１】
好ましい実施形態において、用語「医薬的に許容され得る」は、動物（より具体的にはヒト）における使用について、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、あるいは、米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方に収載されていることを意味する。以降、表現「生理学的に好適なキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は交換可能に使用され、著しい刺激を生物に対して生じさせず、かつ、投与されたコンジュゲートの生物学的な活性および性質を阻害しない承認されたキャリアまたは希釈剤を示す。
【０１６２】
用語「キャリア」は、治療剤が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルを示す。そのような医薬用キャリアは、無菌の液体、例えば、水およびオイル（石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のものを含む）など、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与されるときの好ましいキャリアである。生理的食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液もまた、特に注射用溶液の場合、液体キャリアとして用いることができる。好適な医薬用賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望される場合、微量の湿潤化剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁物、エマルション、錠剤、ピル、カプセル、粉末剤、持続放出配合物などの形態を取ることができる。組成物は、従来の結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリドなど）を用いて、座薬として配合することができる。経口用配合物は標準的なキャリア（例えば、医薬規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含むことができる。好適な医薬用キャリアの様々な例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。そのような組成物は、治療効果的な量のタンパク質（好ましくは、精製された形態である）を、患者に対する適正な投与のための形態を提供するように好適な量のキャリアと一緒に含有する。配合は投与様式のために適しなければならない。
【０１６３】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の加工および投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが含まれる。
【０１６４】
有効成分を配合および投与するためのさらなる技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは、本明細書中に詳しく示されているかのように本明細書中に参考として組み込まれる）。
【０１６５】
本明細書中に記載される医薬組成物はまた、好適な固体または固相のキャリアまたは賦形剤を含むことができる。そのようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６６】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、経皮送達、腸管送達または非経口送達（筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、くも膜下注射、直接的な心室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む）が含まれ得る。
【０１６７】
従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬的に使用することができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つ以上の医薬的に許容され得るキャリアを使用して、従来の様式で配合することができる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１６８】
注射の場合、本発明の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的な生理的食塩水緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１６９】
経口投与の場合、有効成分は、場合により、本発明による抗体を産生する細胞全体の投与によって処方され得る。有効成分はまた、有効成分および／または細胞を、この分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって処方され得る。そのようなキャリアは、本発明の有効成分が、患者により経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして処方されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１７０】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、有効成分の量を明らかにするために、または有効成分の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１７１】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１７２】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１７３】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用される有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器において使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、有効成分および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【０１７４】
本明細書中に記載される有効成分は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために処方することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、そして、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１７５】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性な調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性または水系の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１７６】
好ましい実施形態において、組成物は、ヒトに対する静脈内投与のために適合化された医薬組成物として、日常的な手法に従って配合される。典型的には、静脈内投与される医薬組成物は、無菌の等張性の水性緩衝液における溶液である。一般に、成分は別々に提供されるか、または、単位投薬形態で一緒に混合されて、例えば、活性な薬剤の量を示す気密容器（例えば、アンプルまたは小袋など）における乾燥した凍結乾燥粉末または無水高濃度物として提供される。組成物が注入によって投与されることになる場合、組成物は、無菌の医薬規格の水または生理的食塩水を含有する注入ボトルとともに分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用無菌水または生理的食塩水のアンプルが提供される。
【０１７７】
本発明の医薬組成物は中性形態または塩形態として配合することができる。医薬的に許容され得る塩には、アニオンとともに形成される塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩など、および、カチオンとともに形成される塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄（ＩＩＩ）、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩などが含まれる。
【０１７８】
本発明の有効成分はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１７９】
本明細書中に記載される医薬組成物はまた、ゲル相キャリアまたはゲル相賦形剤の好適な固体を含むことができる。そのようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
局所経路が、場合により行われ、局所用キャリアによって支援される。局所用キャリアは、局所的な有効成分投与のために一般には好適であるキャリアであり、これには、この分野で知られている任意のそのような物質が含まれる。局所用キャリアは、組成物を、所望される形態で、例えば、液体または非液体のキャリア、ローション、クリーム、ペースト、ゲル、粉末、軟膏、溶媒、液体希釈剤および滴剤などとして提供するように選択され、そして、天然に存在する起源または合成起源の物質から構成され得る。明らかなことではあるが、選択されたキャリアは、局所用配合物の活性な薬剤または他の構成成分に悪影響を及ぼさないこと、そして、局所用配合物のすべての構成成分に関して安定であることが不可欠である。本発明において使用される好適な局所用キャリアの例には、水、アルコールおよび他の非毒性の有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン類およびワックスなどが含まれる。本発明における好ましい配合物は、無色無臭の軟膏、液体、ローション、クリームおよびゲルである。
【０１８１】
軟膏は、典型的にはペトラタムまたは他のペトラタム誘導体に基づく半固体の調製物である。使用される具体的な軟膏基剤は、当業者によって理解されるように、最適な有効成分送達をもたらし、好ましくは、他の所望される特徴（例えば、皮膚軟化性など）もまた提供するものである。他のキャリアまたはビヒクルの場合と同様に、軟膏基剤は、不活性で、安定で、非刺激性で、かつ非感作性でなければならない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９９５）において１３９９頁〜１４０４頁で説明されるように、軟膏基剤は、油性基剤、乳化可能な基剤、乳化基剤および水溶性基剤の４つのクラスに類別することができる。油性の軟膏基剤には、例えば、植物油、動物から得られる脂肪、および、石油から得られる半固体の炭化水素が含まれる。乳化可能な軟膏基剤は、吸収性軟膏基剤としてもまた知られており、水をほとんど含有せず、これには、例えば、ヒドロキシステアリンスルファート、無水ラノリンおよび親水性ペトラタムが含まれる。乳化軟膏基剤は油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルションまたは水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションのいずれかであり、これには、例えば、セチルアルコール、グリセリルモノステアラート、ラノリンおよびステアリン酸が含まれる。好ましい水溶性軟膏基剤は、様々な分子量のエチレングリコールから調製される。再度ではあるが、さらなる情報については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙを参照することができる。
【０１８２】
ローションは、摩擦を伴うことなく皮膚表面に塗布されるための調製物であり、典型的には、固体粒子（活性な薬剤を含む）が水またはアルコールの基剤に存在する液体または半液体の調製物である。ローションは、通常、固体の懸濁物であり、水中油型タイプの液体油性エマルションを含むことができる。ローションは、より多くの液体組成物を塗布することが容易であるので、大きな身体面積を処置するための本発明における好ましい配合物である。ローション中の不溶物は細かく分割されていることが一般に必要である。ローションは、典型的には、より良好な分散を提供するための懸濁化剤、ならびに、活性な薬剤を局在化させ、皮膚との接触状態で保つために有用な有効成分（例えば、メチルセルロースまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースなど）を含有する。
【０１８３】
選択された有効成分を含有するクリームは、この分野では知られているように、水中油型または油中水型のいずれかであっても、粘性の液体エマルションまたは半固体エマルションである。クリーム基剤は水洗性であり、油相、乳化剤および水相を含有する。油相は、ときには「内部」相とも呼ばれることがあるが、一般には、ペトラタムおよび脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールまたはステアリルアルコールなど）から構成される；水相は、通常、体積が油相を超えており、だが、必ずしも超える必要はなく、また、一般には保湿剤を含有する。クリーム配合物における乳化剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（上掲）において説明されるように、一般には、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、または両性界面活性剤である。
【０１８４】
ゲル配合物は、頭皮への適用のために好ましい。局所用有効成分配合物の分野での当業者によって理解されるように、ゲルは半固体の懸濁物型の系である。単相ゲルは、キャリア液体全体に実質的に一様に分布させられた有機高分子を含有し、この場合、キャリア液体は、典型的には水性であるが、また、アルコールおよび場合によりオイルを好ましくは含有する。
【０１８５】
当業者に知られている様々な添加剤を本発明の局所用配合物に含めることができる。例えば、溶媒を、ある種の有効成分物質を可溶化するために使用することができる。必要に応じて使用される他の添加剤には、皮膚浸透増強剤、乳白剤、抗酸化剤、ゲル化剤、増粘剤および安定化剤などが含まれる。
【０１８６】
本発明の局所用組成物はまた、従来の皮膚型のパッチまたは物品を使用して皮膚に送達することができ、この場合、有効成分組成物は、皮膚に貼り付けられる薬物送達デバイスとして役立つ積層化された構造体の中に含有される。そのような構造体において、有効成分の組成物は、上部支持層の下に存在する層、すなわち、「リザーバー」に含有される。積層化された構造体は１つだけのリザーバーを含有することができ、または、複数のリザーバーを含有することができる。１つの実施形態において、リザーバーは、有効成分送達時にシステムを皮膚に貼り付けるために役立つ医薬的に許容され得る接触接着性物質のポリマーマトリックスを含む。好適な皮膚接触接着性物質の例には、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリラートおよびポリウレタンなどが含まれるが、これらに限定されない。選択される特定のポリマー接着剤は、特定の有効成分、ビヒクルなどに依存する。すなわち、接着剤は、有効成分を含有する組成物のすべての構成成分との適合性を有しなければならない。あるいは、有効成分含有リザーバーおよび皮膚接触接着剤は別個の異なる層として存在し、この場合、接着剤はリザーバーの下に位置し、リザーバーは、この場合、上記のようなポリマーマトリックスであり得るか、または、液体もしくはヒドロゲルのリザーバーであり得るか、または、何らかの他の形態をとることができる。
【０１８７】
これらの積層体における支持層は、デバイスの上部表面として役立っており、積層化された構造体の主要な構造エレメントとして機能し、かつ、デバイスにその柔軟性の多くを提供する。支持物質のために選択される物質は、有効成分含有組成物の有効成分および任意の他の構成成分に対して実質的に不浸透性であるように、従って、デバイスの上部表面からの何らかの構成成分の喪失を妨げるように選択されなければならない。支持層は、皮膚が有効成分送達時に水和されることが所望されるかどうかに依存して、閉鎖性または非閉鎖性のいずれかであり得る。支持材は、好ましくは、柔軟性のエラストマー材料であることが好ましいシートまたはフィルムから作製される。支持層のために好適なポリマーの例には、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエステルが含まれる。
【０１８８】
貯蔵時または使用前には、積層化された構造体は剥離ライナーを含む。使用直前に、この層はデバイスから除かれて、その基層表面（有効成分リザーバーまたは別個の接触接着剤層のいずれか）が露出させられ、その結果、システムを皮膚に貼り付けることができるようにされる。剥離ライナーは、有効成分／ビヒクル不浸透性の材料から作製されなければならない。
【０１８９】
そのようなデバイスは、この分野で知られている従来の技術を使用して、例えば、接着剤、有効成分およびビヒクルの液状混合物を支持層に注入成型し、その後、剥離ライナーを積層化することによって製造することができる。同様に、接着剤混合物を剥離ライナー上に注入成型し、その後、支持層を積層化することができる。あるいは、有効成分リザーバーを有効成分または賦形剤の非存在下で調製し、その後、有効成分／賦形剤の混合物に「浸す」ことによって負荷することができる。
【０１９０】
本発明の局所用配合物の場合のように、これらの積層化システムの有効成分リザーバーに含有される有効成分組成物は数多くの構成成分を含有することができる。場合により、有効成分は、「そのまま（ｎｅａｔ）」、すなわち、さらなる液体の非存在下で送達することができる。しかしながら、ほとんどの場合、有効成分は、好適な医薬的に許容され得るビヒクル（典型的には溶媒またはゲル）に溶解または分散または懸濁される。存在させることができる他の構成成分には、保存剤、安定化剤および界面活性剤などが含まれる。
【０１９１】
本発明の抗体は、好ましくは、必要としている患者に効果的な量で投与されることに留意しなければならない。本明細書中で使用される「効果的な量」は、選択された結果を達成するために必要な量を意味する。例えば、本発明の組成物の効果的な量は、癌を処置することについて有用であるために選択され得る。
【０１９２】
本発明に関連して使用される好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、処置されている対象の疾患の症状を予防または緩和または改善するために効果的であるか、あるいは、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分の量を意味する。
【０１９３】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９４】
本発明の方法において使用される任意の有効成分について、治療効果的な量または用量は、動物における活性アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量を、活性アッセイによって決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定めることができる。
【０１９５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば、対象とする有効成分についてＩＣ５０およびＬＤ５０（処置された動物の５０％において死を生じさせる致死量）を決定することによって明らかにすることができる。これらの活性アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量範囲を定める際に使用することができる。
【０１９６】
投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１章、１頁を参照のこと）。
【０１９７】
投薬量および投薬間隔は、調節作用を維持するために十分な、活性成分の血漿レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）をもたらすために個々に調節することができる。ＭＥＣは、それぞれの調製物について変化するが、場合により、動物データ全体から推定することができる。
【０１９８】
投薬間隔はまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。調製物は、場合により、期間の１０％〜９０％について、好ましくは３０％〜９０％の間、最も好ましくは５０％〜９０％の間、ＭＥＣを超えて血漿レベルを維持する治療方法を使用して投与することができる。
【０１９９】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬はまた、本明細書中上記で記載された徐放性組成物の単回投与であり得る。この場合、処置の経過は、数日から数週間まで、または、治癒が達成されるまで、もしくは、疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０２００】
本発明の組成物は、所望される場合には、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーデバイスにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物に対する米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の有効成分を含む組成物はまた、適応状態を処置するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。
【０２０１】
本明細書中で使用される用語「調節する」は、疾患の進行を実質的に阻害し、遅くし、もしくは後戻りさせること、または、疾患もしくは状態の臨床的症状を実質的に改善すること、または、疾患もしくは状態の臨床的症状の出現を実質的に妨げることを包含する。従って、「調節剤」には、疾患もしくは状態を調節することができる薬剤が含まれる。
【０２０２】
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１−１】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−２】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−３】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−４】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−５】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図１−６】Ｓｕｐｅｒベクター配列において、本発明による植物細胞培養システムで製造される例示的な抗体のアミノ酸配列を示す。
【図２−１】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−２】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−３】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−４】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−５】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−６】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−７】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−８】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−９】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１０】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１１】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１２】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１３】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１４】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１５】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図２−１６】抗体のための合成遺伝子の配列を示す。
【図３ａ】発現カセットおよびバイナリーベクターへの合成遺伝子のクローニングを示す。図３Ａは、植物の標的化シグナルを伴う合成遺伝子の構築を示す。
【図３ｂ】発現カセットおよびバイナリーベクターへの合成遺伝子のクローニングを示す。図３Ｂは、ヒトのシグナルペプチド配列を伴う合成遺伝子の構築を示す。
【図４】ウエスタンブロット分析によって検出されたときのＩｇＧ１の重鎖および軽鎖（図４Ａ）ならびにＩｇＧ４の重鎖および軽鎖（図４Ｂ）の発現を示す。
【図５】組み立てられたＩｇＧ１（Ａ）およびＩｇＧ４（Ｂ）との、本発明による産生性細胞株により産生された抗体のウエスタンブロット分析を示す。
【図６】Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカチオン交換カラムでのＩｇＧ１発現細胞抽出物の分離を示す。
【図７】Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカチオン交換カラムでのＩｇＧ４発現細胞抽出物の分離を示す。
【図８】プロテインＡセファロースで分離された、カチオン交換溶出からのＩｇＧ１含有分画物を示す。
【図９】プロテインＡセファロースで分離された、カチオン交換溶出からのＩｇＧ４含有分画物を示す。
【図１０】精製されたＩｇＧ１のウエスタンブロットおよびクーマシー染色を示す。
【図１１】精製されたＩｇＧ４のウエスタンブロットおよびクーマシー染色を示す。
【図１２】ＰｒｏｔａｌｉｘのＩｇＧ１、ＩｇＧ４、および、ＣｕｒｅＴｅｃｈのＩｇＧ１とインキュベーションされた細胞の、ＦＡＣＳ分析により測定されたときの蛍光強度における変化を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２０４】
配列番号１および９は、Ａｂ重鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号２および１０は、Ａｐｏシグナルに融合したＡｂ重鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号３および１１は、ＥＲシグナルに融合したＡｂ重鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号４および１２は、Ｖａｃシグナルに融合したＡｂ重鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号５は、Ａｂ軽鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号６は、Ａｐｏシグナルに融合したＡｂ軽鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号７は、ＥＲシグナルに融合したＡｂ軽鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号８は、Ｖａｃシグナルに融合したＡｂ軽鎖をコードする合成遺伝子である。
配列番号１３は、液胞選別シグナルペプチドの配列である。
配列番号１４は、エンドキチナーゼからのＥＲ標的化配列およびＥＲ保持シグナルをコードする核酸配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を製造するように遺伝子改変されている、懸濁状態において増殖する植物細胞
を含む、植物細胞培養において抗体を製造するためのシステム。
【請求項２】
前記遺伝子改変された植物細胞は、安定的に改変された植物細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記遺伝子改変された植物細胞は、一時的に改変された植物細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記抗体は機能的な抗体である、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記抗体は組み立てられた抗体を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記抗体は抗体フラグメントを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記抗体フラグメントは、単鎖抗体または単一ドメイン抗体を含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記抗体はＩｇＧ４抗体を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記植物細胞は、根細胞、葉細胞、茎細胞、葉柄細胞、分裂組織細胞、および果実細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記抗体は、哺乳動物細胞培養において製造される対応する抗体よりも抗原に対する高レベルの結合親和性を有する抗体を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記抗体は、ヒト抗体天然シグナルペプチド配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記抗体は、前記抗体を植物細胞オルガネラに送るための植物のシグナルペプチドを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記オルガネラは、ＥＲ、アポプラスト、葉緑体、細胞質ゾル、および液胞からなる群から選択される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記植物根細胞は、ニンジン細胞を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１５】
前記植物細胞は、タバコ属の葉細胞を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１６】
前記抗体を請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステムにおいて発現させることを含む、抗体を製造するための方法。
【請求項１７】
前記抗体をコードする組換えポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクションされた組換え植物宿主細胞の懸濁培養物を調製すること；および
前記宿主細胞培養物を前記抗体の発現を可能にする条件下で培養すること
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
培養後に前記抗体を精製すること
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム、または請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法によって製造される抗体。
【請求項２０】
ＩｇＧ４抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ＩｇＧ４抗体を製造する宿主細胞。
【請求項２１】
ＩｇＧ４抗体を製造させるためのシグナルをさらに含む、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記シグナルは、ヒト抗体天然シグナル配列を含む、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする第２の核酸配列に操作可能に連結された前記抗体をコードする第１の核酸配列を含む、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドは、前記シグナルペプチドをコードするための核酸セグメントを含む、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞は、原核生物細胞でトランスフェクションまたは形質転換される、請求項２０の記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記原核生物細胞は、細菌細胞、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記植物細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスで形質転換された、根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞、タバコ細胞、およびブドウ細胞からなる群から選択される植物細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記植物細胞はニンジン根細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記組換えポリヌクレオチドは、植物細胞において機能的なプロモーターをさらに含み、前記プロモーターは前記組換え分子に操作可能に連結される、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記組換えポリヌクレオチドは、植物細胞において機能的なターミネーターをさらに含み、前記ターミネーターは前記組換え分子に操作可能に連結される、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記組換えポリヌクレオチドは場合により、追加の制御、増進および調節エレメント、および／または選択マーカーをさらに含み、前記調節エレメントは前記組換え分子に操作可能に連結される、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の宿主細胞において製造される抗体。
【請求項３３】
抗体および末端マンノースを含む分子。
【請求項３４】
ＩｇＧ４抗体および前記ＩｇＧ４抗体に結合された少なくとも１つの炭水化物成分を含む分子であって、前記炭水化物成分は、キシロースおよびフコース１〜３からなる群から選択される分子。
【請求項３５】
下記工程を含む、組換え抗体を製造する方法：
（ａ）組換え抗体を発現するために遺伝子改変されている植物細胞を含む懸濁培養物を生成すること；および場合により、
（ｂ）組換え抗体を前記懸濁培養物から回収し、それにより組換え抗体を製造すること。
【請求項１】
抗体を製造するように遺伝子改変されている、懸濁状態において増殖する植物細胞
を含む、植物細胞培養において抗体を製造するためのシステム。
【請求項２】
前記遺伝子改変された植物細胞は、安定的に改変された植物細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記遺伝子改変された植物細胞は、一時的に改変された植物細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記抗体は機能的な抗体である、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記抗体は組み立てられた抗体を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記抗体は抗体フラグメントを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記抗体フラグメントは、単鎖抗体または単一ドメイン抗体を含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記抗体はＩｇＧ４抗体を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記植物細胞は、根細胞、葉細胞、茎細胞、葉柄細胞、分裂組織細胞、および果実細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記抗体は、哺乳動物細胞培養において製造される対応する抗体よりも抗原に対する高レベルの結合親和性を有する抗体を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記抗体は、ヒト抗体天然シグナルペプチド配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記抗体は、前記抗体を植物細胞オルガネラに送るための植物のシグナルペプチドを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記オルガネラは、ＥＲ、アポプラスト、葉緑体、細胞質ゾル、および液胞からなる群から選択される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記植物根細胞は、ニンジン細胞を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１５】
前記植物細胞は、タバコ属の葉細胞を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１６】
前記抗体を請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステムにおいて発現させることを含む、抗体を製造するための方法。
【請求項１７】
前記抗体をコードする組換えポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクションされた組換え植物宿主細胞の懸濁培養物を調製すること；および
前記宿主細胞培養物を前記抗体の発現を可能にする条件下で培養すること
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
培養後に前記抗体を精製すること
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム、または請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法によって製造される抗体。
【請求項２０】
ＩｇＧ４抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ＩｇＧ４抗体を製造する宿主細胞。
【請求項２１】
ＩｇＧ４抗体を製造させるためのシグナルをさらに含む、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記シグナルは、ヒト抗体天然シグナル配列を含む、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする第２の核酸配列に操作可能に連結された前記抗体をコードする第１の核酸配列を含む、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドは、前記シグナルペプチドをコードするための核酸セグメントを含む、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞は、原核生物細胞でトランスフェクションまたは形質転換される、請求項２０の記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記原核生物細胞は、細菌細胞、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記植物細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスで形質転換された、根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞、タバコ細胞、およびブドウ細胞からなる群から選択される植物細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記植物細胞はニンジン根細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記組換えポリヌクレオチドは、植物細胞において機能的なプロモーターをさらに含み、前記プロモーターは前記組換え分子に操作可能に連結される、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記組換えポリヌクレオチドは、植物細胞において機能的なターミネーターをさらに含み、前記ターミネーターは前記組換え分子に操作可能に連結される、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記組換えポリヌクレオチドは場合により、追加の制御、増進および調節エレメント、および／または選択マーカーをさらに含み、前記調節エレメントは前記組換え分子に操作可能に連結される、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の宿主細胞において製造される抗体。
【請求項３３】
抗体および末端マンノースを含む分子。
【請求項３４】
ＩｇＧ４抗体および前記ＩｇＧ４抗体に結合された少なくとも１つの炭水化物成分を含む分子であって、前記炭水化物成分は、キシロースおよびフコース１〜３からなる群から選択される分子。
【請求項３５】
下記工程を含む、組換え抗体を製造する方法：
（ａ）組換え抗体を発現するために遺伝子改変されている植物細胞を含む懸濁培養物を生成すること；および場合により、
（ｂ）組換え抗体を前記懸濁培養物から回収し、それにより組換え抗体を製造すること。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図２−９】
【図２−１０】
【図２−１１】
【図２−１２】
【図２−１３】
【図２−１４】
【図２−１５】
【図２−１６】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図２−９】
【図２−１０】
【図２−１１】
【図２−１２】
【図２−１３】
【図２−１４】
【図２−１５】
【図２−１６】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００８−５１５４５４（Ｐ２００８−５１５４５４Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３６３４５（Ｐ２００７−５３６３４５）
【出願日】平成１７年１０月１１日（２００５．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／００１０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４０７６４
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５０５１６１９１０）プロタリクス リミテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１１日（２００５．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／００１０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４０７６４
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５０５１６１９１０）プロタリクス リミテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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