検体の前処理方法
【課題】糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する際に、正確に測定を行うために必要な糞便検体前処理液、並びにこの検体前処理液を用いた糞便に含まれる成分測定用キット及び成分測定方法を提供すること。
【解決手段】糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
【解決手段】糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体の前処理方法、前処理液、並びにこの検体前処理液を用いた糞便に含まれる成分測定用キット及び成分測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する方法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−２３５４７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、上記方法により糞便検体を測定した場合、測定項目に関係なく異常値が高率で発生する現象があることを見出した。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する際に、正確に測定を行うために必要な糞便検体前処理液、並びにこの検体前処理液を用いた糞便に含まれる成分測定用キット及び成分測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らが測定データを解析した結果、異常値の発生は、検出を化学発光法で行った場合に多いことが明らかになった。次いで、本発明者らは、検出系に影響を与える要因に着目して異常値が発生する原因を検討したところ、原因は、糞便に含まれるアルカリホスファターゼによるものであることがわかった。
【０００６】
そこで、本発明者らは、該アルカリホスファターゼの影響を排除する方法について検討し、前処理においてｐＨを０．５〜２．９の間で処理することによりアルカリホスファターゼの影響をなくして、測定の正確性を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は以下の構成からなる。
［項１］
糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
［項２］
前記前処理方法が、免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法のために用いられる、項１に記載の前処理方法。
［項３］
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、項２に記載の検体前処理方法。
［項４］
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、項２または３に記載の検体前処理方法。
［項５］
前記の目的成分が、Ｒｏｔａウイルスである、項２〜４のいずれかに記載の検体前処理方法。
［項６］
項１に記載の前処理方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
（１）前記検体を検体抽出液に懸濁し懸濁液とする工程
（２）前記懸濁液のｐＨを０．５〜２．９の間になるよう調整する工程
（３）（２）で処理した懸濁液のｐＨを６．０〜８．０の間になるよう調整する工程
［項７］
糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法であって、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする目的成分測定法。
（１）糞便に由来する検体を、項１〜６のいずれかに記載の検体前処理方法で、処理する工程
（２）免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する工程
［項８］
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、項７に記載の目的成分測定法。
［項９］
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、項７または８に記載の目的成分測定法。
［項１０］
前記の酵素免疫測定法が、以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法である、項９に記載の目的成分測定法。
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
［項１１］
項１〜６のいずれかに記載の糞便に由来する検体の前処理方法に用いるためのセットであって、ｐＨ２．９未満の酸性水溶液、または、ｐＨ０．５〜２．９の間の緩衝液を含むことを特徴とする検体前処理用セット。
［項１２］
項７〜１０のいずれかに記載の糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法に用いるためのキットであって、以下の（１）〜（３）の構成を含むことを特徴とするキット。
（１）項１１に記載の検体前処理用セット
（２）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第一の抗体
（３）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第二の抗体
（４）未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液
（５）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、測定するための発光基質
【発明の効果】
【０００８】
糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する場合において、本発明の検体前処理液を用いて糞便検体を前処理することにより、正確性の高い測定が可能になる。
本発明の検体前処理方法によれば、ｐＨを０．５〜２．９の間で処理することにより、糞便検体に含まれるアルカリホスファターゼが不可逆的に活性を失い、発光測定系で用いている発光基質に非特異的に反応することを防ぐことができ、これにより、その測定における正確性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】糞便に由来する検体を酸処理したときのｐＨと測定結果との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳述するが、これに限定されるものではない。
【００１１】
本発明の実施形態の一つは、糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法である。
【００１２】
本発明の前処理方法に適用される検体は、特に限定されない。糞便に由来するものとして、糞便そのものや、糞便を緩衝液などの水溶液で懸濁したもの、あるいは、それらを濾過などの手段で清澄化したものなどが例示される。また、生体から採取できるものに限らず、糞便を種々の方法で処理したものや、糞便由来の成分が含まれる可能性のあるものも糞便に由来する検体として、本発明の前処理方法を適用できる。
検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒、糞便採取器具などを用いて採取することができる。
【００１３】
本発明の前処理方法における懸濁操作は特に限定されないが、例えば、検体採取に用いた綿棒を用いて懸濁液を攪拌することにより行うことが出来る。
【００１４】
本発明の前処理方法において、糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁するための手段は、特に限定されない。
例えば、糞便に由来する検体を懸濁することが出来る溶液であって、前記検体との混合時にそのような範囲のｐＨになるような溶液（本明細書ではこのような溶液を「前処理液」ともよぶ。）を用いればよい。例えば、ｐＨが０．５〜２．９の範囲で調整された前処理液で前記検体を懸濁させることにより行うことができる。
【００１５】
また、上記工程は必要に応じて、ｐHが２．９を越える範囲で調整された溶液（本明細書ではこのような溶液を「検体抽出液」ともよぶ。）に糞便に由来する検体を懸濁する工程と、前記懸濁液のｐHを０．５〜２．９の範囲になるよう調整する工程とに分けても良い。
前記懸濁液のｐHを調整する手段としては、例えば、「ｐＨが０．５〜２．９の範囲で調整された前処理液」を添加すればよい。
工程を分ける場合、検体抽出液と前処理液とを混合するときの液量比は特に限定されないが、検体抽出液：前処理液＝３：２の割合が好ましい。
【００１６】
前処理液としては、ｐＨが０．５〜２．９の範囲で調整されたものであれば特に限定されないが、種々の無機酸や有機酸などの酸類、または、酸性に調整された緩衝液が例示できる。
さらに具体的には、塩酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、リン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、セリン塩酸緩衝液、アラニン塩酸緩衝液が例示でき、中でもグリシン塩酸緩衝液、セリン塩酸緩衝液、アラニン塩酸緩衝液が好ましい。
酸類など実質的に緩衝能を持たない場合は、濃度は限定されないが０．５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは０．５〜２．９であれば特に限定されないが、２．０以下が好ましい。
酸性に調整された緩衝液の場合、濃度は限定されないが０．５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは０．５〜２．９であれば特に限定されないが、２．５以下が好ましい。
【００１７】
糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程においては、前処理した検体の目的成分を測定する際における非特異的発光の防止効果を上げるために、また、当該測定において免疫学的反応を使用する場合は免疫反応の感度を上げるために、界面活性剤を含んでもよい。
界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃなどが挙げられる。
界面活性剤の濃度は０．１０重量％から０．２５重量％が好ましい。中でも０．２５重量％が好ましい。
界面活性剤は、前処理液に添加されていても良いし、検体抽出液に添加されていてもよい。
【００１８】
糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程においては、前処理した検体の目的成分を測定する際において免疫学的反応を使用する場合は、前記検体を懸濁する際に、抗原が該懸濁液を入れる容器の表面へ吸着することを防止するために、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含んでも良い。また、防腐のためにアジ化ナトリウムなどの各種防腐剤を含んでも良い。
これらの試薬は、前処理液に添加されていても良いし、検体抽出液に添加されていてもよい。
【００１９】
上記工程の処理時間は特に限定されないが、３０秒から５分の間が好ましい。
【００２０】
糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程の後には、必要に応じて、懸濁液のｐHを６．０から８．０の間に調整する工程を含んでも良い。
ｐＨを６．０〜８．０の間に調整する方法は、混合時にそのようなｐＨになるように溶液（本明細書ではこのような溶液を「中和液」ともよぶ。）を添加するのであれば、特に限定されない。例えば検体抽出液にｐＨが６．０を越える溶液を含有させることにより行うことができる。
【００２１】
中和液としては、ｐＨが６．０を越える範囲で調整されたものであれば特に限定されない。アルカリ溶液類、または、アルカリ性に調整された緩衝液が例示できる。
さらに具体的には、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液、トリシン‐ＮａＯＨ緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液が例示でき、中でもトリシン‐ＮａＯＨ緩衝液が好ましい。
アルカリ溶液類など実質的に緩衝能を持たない場合は、濃度は限定されないが０．０５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは６．０以上であれば特に限定されないが、１２．０以上が好ましい。
アルカリ性に調整された緩衝液の場合、濃度は限定されないが０．５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは６．０以上であれば特に限定されないが、７．０〜９．０の塩基性の範囲の溶液が好ましく、７．０〜８．０が更に好ましい。
先の工程でｐHを０．５〜２．９の範囲になるよう調整した溶液と、上記ｐＨが６．０を越える溶液との液量比は特に限定されないが、２：１の割合が好ましい。
【００２２】
上記工程の処理時間は特に限定されないが、３０秒から５分の間が好ましい。
【００２３】
本発明の前処理方法で処理された検体は、特に限定されることなく種々の測定方法に適用することができる。
例えば、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の目的成分を測定する方法が例示できる。
免疫学的方法としては、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、免疫比濁測定法、免疫凝集測定法などが例示できる。
遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用した方法としては、ＬＡＭＰ法、Ｑプローブ法などが例示できる。
本発明の検体前処理方法が適用される測定項目は、特に限定されるものではないが、例えば、糞便に含まれるＲｏｔａウイルスの検出に利用することができる。
【００２４】
本発明の前処理方法は、中でも、検出系に化学発光反応を用いる目的成分測定方法に好ましく適用できる。
化学発光反応を用いる検出系としては、特に限定されるものではないが、ウエスタンブロッティング法、免疫共沈降法、酵素免疫測定法などが挙げられる。
【００２５】
本発明の実施形態の一つは、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法であって、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする目的成分測定法である。
（１）糞便に由来する検体を、上述の検体前処理方法で、処理する工程
（２）免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する工程
【００２６】
当該実施形態における検体前処理方法については、上記で詳しく説明したとおりである。
また、当該実施形態における目的成分測定方法としては、特に限定されないが、例えば、以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む酵素免疫測定法が例示できる。この測定法は、特開２００１−２３５４７１号公報（特許文献１）などで公知である。
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
【００２７】
本発明の実施形態の一つは、上記で説明した糞便に由来する検体の前処理方法に用いるためのセットであって、ｐＨ２．９未満の酸性水溶液、もしくは、ｐＨ０．５〜２．９の間の酸性緩衝液を含むことを特徴とする検体前処理用セットである。
【００２８】
セットの各構成については、本発明の前処理方法の項で説明したとおりである。
【００２９】
本発明の実施形態の一つは、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法に用いるためのキットであって、上記で説明した検体前処理用のセットに加え、さらに、目的成分を測定するために必要な試薬構成を含むものである。
検体に含まれる目的成分を測定するために必要な試薬構成部分については、特に限定されない。例えば、下記の全てを含む一式が例示される。
・前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第一の抗体、
・前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第二の抗体、
・未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液、および、
・多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定するための発光基質
【００３０】
（実施例）
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
（実験１）ビオチン標識抗ロタウイルス抗体の調製
抗ロタウイルスマウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）１ ｍｇとビオチンアミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを２５℃で４時間反応させ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ミリポア社製）を用いて分画し、第１抗体液を調製した。
（実験２）ＡＬＰ標識抗ロタウイルス抗体の調製
抗ロタウイルスマウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）０．１ ｍｇをＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ - ＳＨ（同人化学社製）を用いて、第２抗体液を調製した。
（実験３）ロタウイルス抗原測定の実施
症状から明らかにロタウイルス感染症でない人より糞便を採取し、そのうちイムノクロマト法を原理とする市販のロタウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社 商品名ＢＤ Ｒｏｔａ／Ａｄｅｎｏ エグザマンＴＭ スティック）でロタウイルス感染症陰性であることを確認できた糞便を使用し（５４例）、ロタウイルス抗原を測定した。
検体抽出液としては、０．１５重量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライテスク社製）、１重量％ ＢＳＡを含む溶液を用い、糞便を前記検体抽出液に懸濁したものを検体とした。
検体７５μｌに第１抗体液２０μｌを添加し、混合後、４０℃でインキュベーションした（検体・第１抗体液混合液）。１０秒後に、検体・第１抗体液混合液７０μｌをあらかじめ５０μｌの蒸留水を添加したＰＯＣｕｂｅ（東洋紡績社製）専用反応容器（第１抗体に結合したリガンドを特異的に認識するリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタ（抗ビオチン抗体を結合させたガラスフィルター固相）を含む容器。）に添加し、さらに、第２抗体液を２０μｌ添加し、４０℃でインキュベーションした。１５０秒後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む蒸留水を８０μｌずつ２回添加し、さらに発色基質としてＬｕｍｉｇｅｎＴＭ ＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）を３０μｌ添加し、発光強度を測定した。発光強度で１００００以上を示す検体をロタウイルス感染症陽性と判定した。
その結果、５４例中、すべての検体で非特異的な発光が検出され、擬陽性を示した。
【実施例２】
【００３２】
実験３に用いた発光基質であるＬｕｍｉｇｅｎＴＭ ＡＰＳ−５はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）依存的であり、非特異的な発光は糞便に含まれるＡＬＰであると推測される。そこで実験３で用いた糞便のうち３例を用いてＡＬＰ活性を調べた。また、ネガティブコントロールとして検体抽出液も測定した。
（実験４）ＡＬＰ測定試薬の調製
９．６６ｍｌのジエタノールアミン（ナカライテスク社製）を蒸留水６０ｍｌで希釈後、０．１Ｍ 塩化マグネシウム水溶液 ０．２５ｍｌを添加した。さらに、２．０Ｍ ＨＣｌでｐＨを１０．１に調整し、最終液量を１００ｍｌとして、試薬Ａとした。また、３７１ｍｇのｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（ナカライテスク社製）を１０ｍｌの試薬Ａに溶解して、試薬Ｂとした。
（実験５）ＡＬＰ活性測定の実施
試薬Ａ ２．６ｍｌと試薬Ｂ ０．３ｍｌとを混合し、３７℃で５分間予備加温した。続いて（実験３）で用いた検体０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対象に、３７℃に制御された分光光度計で４０５ｎｍの吸光度変化を３から４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化量を測定した。得られた結果を（実験３）で得られた発光強度のデータと合わせて表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
表１の結果から、糞便では、ＡＬＰ活性を示す吸光度変化量がネガティブコントロールである検体抽出液に比べて有意に高いことが確認できた。このことから、糞便が高い発光強度を示す原因は糞便中のＡＬＰの影響であると言える。
【実施例３】
【００３５】
ＡＬＰはアルカリ性条件下で有意に働く酵素であり、強酸性にすることで失活させることができると考え、前処理液として数種の酸性溶液を用いて、糞便中のＡＬＰを失活させようと考えた。
（実験６）酸処理後の糞便中のＡＬＰ活性測定の実施
７種類の酸性溶液を用いてロタウイルス感染症陰性である糞便中のＡＬＰ活性測定を測定した。糞便を（実験３）で用いた検体抽出液に懸濁し、そのうち３０μｌに前処理液として酸性溶液２０μｌを加えて４０℃、１分間処理後、中和液として、１．０Ｍ，ｐＨ８．０のＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液 ５０μｌでｐＨ７に中和した。酸処理後、中和した検体を用いて、（実験５）と同様の方法でＡＬＰ活性測定を実施した。得られた結果を酸処理後のｐＨのデータと合わせて表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
表２の結果から、酢酸以外の酸では有意にＡＬＰ活性を低減させる効果があることが確認できた。
【実施例４】
【００３８】
（実験７）ロタウイルス抗原測定の実施
（実験６）で用いた７種類の酸性溶液で処理し、中和した陰性検体を用いてロタウイルス抗原量測定を行った。測定方法は（実験３）と同様の方法で行った。得られた結果を酸処理後のｐＨのデータと合わせて表３に示す。
【００３９】
【表３】
【実施例５】
【００４０】
（実験８）処理に用いる酸のｐＨと、ＡＬＰ活性、ＰＯＣｕｂｅ測定値の関係の検証
（実験６）で用いた酸のうち、Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、ｐＨ ０．５から４．０に調整した１５種類の溶液を準備し、それぞれの溶液を用いて陰性検体に対して酸処理を行い、ＡＬＰ活性測定とＰＯＣｕｂｅ測定値との関係を調べた。得られた結果を表４に示す。また、ＡＬＰ活性とＰＯＣｕｂｅ測定値との相関を図１に示す。
【００４１】
【表４】
【００４２】
表４、図１の結果から、ＡＬＰ活性とＰＯＣｕｂｅ測定値とは良好な相関を示した。また、ＰＯＣｕｂｅ測定では、１００００ＲＬＵ（ＲＬＵは、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（相対発光量）の略。）を上回ると陽性判定となることから、処理に用いる酸性溶液はｐＨ０．５から２．９までの間であれば、偽陽性判定を防ぐことができることがわかった。
【実施例６】
【００４３】
（実験９）ロタウイルス抗原測定の実施
（実験７）の方法と同様にして、効果が確認できなかった酢酸を除く６種類の酸性溶液を用いて、ロタウイルス抗原測定を行った。糞便は（実験３）で用いた５４例のうち２０例を用いた。得られた結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
【００４５】
表５の結果から、６種類の酸性溶液いずれも市販のロタウイルス検出キットとの一致率は１００％であった。
以上の結果から、糞便中のロタウイルス抗原検出の際に、ｐＨが２．９以下になるように酸性溶液で処理することで、擬陽性判定を防ぐことができると確認できた。本発明の糞便処理方法は、化学発光法を測定原理とした免疫測定法において十分利用可能であると言える。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する場合において、本発明の検体前処理液を用いて糞便検体を前処理することにより、正確性の高い測定が可能になる。種々の診断システムに適用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体の前処理方法、前処理液、並びにこの検体前処理液を用いた糞便に含まれる成分測定用キット及び成分測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する方法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−２３５４７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、上記方法により糞便検体を測定した場合、測定項目に関係なく異常値が高率で発生する現象があることを見出した。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する際に、正確に測定を行うために必要な糞便検体前処理液、並びにこの検体前処理液を用いた糞便に含まれる成分測定用キット及び成分測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らが測定データを解析した結果、異常値の発生は、検出を化学発光法で行った場合に多いことが明らかになった。次いで、本発明者らは、検出系に影響を与える要因に着目して異常値が発生する原因を検討したところ、原因は、糞便に含まれるアルカリホスファターゼによるものであることがわかった。
【０００６】
そこで、本発明者らは、該アルカリホスファターゼの影響を排除する方法について検討し、前処理においてｐＨを０．５〜２．９の間で処理することによりアルカリホスファターゼの影響をなくして、測定の正確性を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は以下の構成からなる。
［項１］
糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
［項２］
前記前処理方法が、免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法のために用いられる、項１に記載の前処理方法。
［項３］
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、項２に記載の検体前処理方法。
［項４］
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、項２または３に記載の検体前処理方法。
［項５］
前記の目的成分が、Ｒｏｔａウイルスである、項２〜４のいずれかに記載の検体前処理方法。
［項６］
項１に記載の前処理方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
（１）前記検体を検体抽出液に懸濁し懸濁液とする工程
（２）前記懸濁液のｐＨを０．５〜２．９の間になるよう調整する工程
（３）（２）で処理した懸濁液のｐＨを６．０〜８．０の間になるよう調整する工程
［項７］
糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法であって、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする目的成分測定法。
（１）糞便に由来する検体を、項１〜６のいずれかに記載の検体前処理方法で、処理する工程
（２）免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する工程
［項８］
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、項７に記載の目的成分測定法。
［項９］
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、項７または８に記載の目的成分測定法。
［項１０］
前記の酵素免疫測定法が、以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法である、項９に記載の目的成分測定法。
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
［項１１］
項１〜６のいずれかに記載の糞便に由来する検体の前処理方法に用いるためのセットであって、ｐＨ２．９未満の酸性水溶液、または、ｐＨ０．５〜２．９の間の緩衝液を含むことを特徴とする検体前処理用セット。
［項１２］
項７〜１０のいずれかに記載の糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法に用いるためのキットであって、以下の（１）〜（３）の構成を含むことを特徴とするキット。
（１）項１１に記載の検体前処理用セット
（２）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第一の抗体
（３）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第二の抗体
（４）未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液
（５）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、測定するための発光基質
【発明の効果】
【０００８】
糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する場合において、本発明の検体前処理液を用いて糞便検体を前処理することにより、正確性の高い測定が可能になる。
本発明の検体前処理方法によれば、ｐＨを０．５〜２．９の間で処理することにより、糞便検体に含まれるアルカリホスファターゼが不可逆的に活性を失い、発光測定系で用いている発光基質に非特異的に反応することを防ぐことができ、これにより、その測定における正確性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】糞便に由来する検体を酸処理したときのｐＨと測定結果との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳述するが、これに限定されるものではない。
【００１１】
本発明の実施形態の一つは、糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法である。
【００１２】
本発明の前処理方法に適用される検体は、特に限定されない。糞便に由来するものとして、糞便そのものや、糞便を緩衝液などの水溶液で懸濁したもの、あるいは、それらを濾過などの手段で清澄化したものなどが例示される。また、生体から採取できるものに限らず、糞便を種々の方法で処理したものや、糞便由来の成分が含まれる可能性のあるものも糞便に由来する検体として、本発明の前処理方法を適用できる。
検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒、糞便採取器具などを用いて採取することができる。
【００１３】
本発明の前処理方法における懸濁操作は特に限定されないが、例えば、検体採取に用いた綿棒を用いて懸濁液を攪拌することにより行うことが出来る。
【００１４】
本発明の前処理方法において、糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁するための手段は、特に限定されない。
例えば、糞便に由来する検体を懸濁することが出来る溶液であって、前記検体との混合時にそのような範囲のｐＨになるような溶液（本明細書ではこのような溶液を「前処理液」ともよぶ。）を用いればよい。例えば、ｐＨが０．５〜２．９の範囲で調整された前処理液で前記検体を懸濁させることにより行うことができる。
【００１５】
また、上記工程は必要に応じて、ｐHが２．９を越える範囲で調整された溶液（本明細書ではこのような溶液を「検体抽出液」ともよぶ。）に糞便に由来する検体を懸濁する工程と、前記懸濁液のｐHを０．５〜２．９の範囲になるよう調整する工程とに分けても良い。
前記懸濁液のｐHを調整する手段としては、例えば、「ｐＨが０．５〜２．９の範囲で調整された前処理液」を添加すればよい。
工程を分ける場合、検体抽出液と前処理液とを混合するときの液量比は特に限定されないが、検体抽出液：前処理液＝３：２の割合が好ましい。
【００１６】
前処理液としては、ｐＨが０．５〜２．９の範囲で調整されたものであれば特に限定されないが、種々の無機酸や有機酸などの酸類、または、酸性に調整された緩衝液が例示できる。
さらに具体的には、塩酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、リン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、セリン塩酸緩衝液、アラニン塩酸緩衝液が例示でき、中でもグリシン塩酸緩衝液、セリン塩酸緩衝液、アラニン塩酸緩衝液が好ましい。
酸類など実質的に緩衝能を持たない場合は、濃度は限定されないが０．５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは０．５〜２．９であれば特に限定されないが、２．０以下が好ましい。
酸性に調整された緩衝液の場合、濃度は限定されないが０．５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは０．５〜２．９であれば特に限定されないが、２．５以下が好ましい。
【００１７】
糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程においては、前処理した検体の目的成分を測定する際における非特異的発光の防止効果を上げるために、また、当該測定において免疫学的反応を使用する場合は免疫反応の感度を上げるために、界面活性剤を含んでもよい。
界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃなどが挙げられる。
界面活性剤の濃度は０．１０重量％から０．２５重量％が好ましい。中でも０．２５重量％が好ましい。
界面活性剤は、前処理液に添加されていても良いし、検体抽出液に添加されていてもよい。
【００１８】
糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程においては、前処理した検体の目的成分を測定する際において免疫学的反応を使用する場合は、前記検体を懸濁する際に、抗原が該懸濁液を入れる容器の表面へ吸着することを防止するために、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含んでも良い。また、防腐のためにアジ化ナトリウムなどの各種防腐剤を含んでも良い。
これらの試薬は、前処理液に添加されていても良いし、検体抽出液に添加されていてもよい。
【００１９】
上記工程の処理時間は特に限定されないが、３０秒から５分の間が好ましい。
【００２０】
糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程の後には、必要に応じて、懸濁液のｐHを６．０から８．０の間に調整する工程を含んでも良い。
ｐＨを６．０〜８．０の間に調整する方法は、混合時にそのようなｐＨになるように溶液（本明細書ではこのような溶液を「中和液」ともよぶ。）を添加するのであれば、特に限定されない。例えば検体抽出液にｐＨが６．０を越える溶液を含有させることにより行うことができる。
【００２１】
中和液としては、ｐＨが６．０を越える範囲で調整されたものであれば特に限定されない。アルカリ溶液類、または、アルカリ性に調整された緩衝液が例示できる。
さらに具体的には、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液、トリシン‐ＮａＯＨ緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液が例示でき、中でもトリシン‐ＮａＯＨ緩衝液が好ましい。
アルカリ溶液類など実質的に緩衝能を持たない場合は、濃度は限定されないが０．０５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは６．０以上であれば特に限定されないが、１２．０以上が好ましい。
アルカリ性に調整された緩衝液の場合、濃度は限定されないが０．５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは６．０以上であれば特に限定されないが、７．０〜９．０の塩基性の範囲の溶液が好ましく、７．０〜８．０が更に好ましい。
先の工程でｐHを０．５〜２．９の範囲になるよう調整した溶液と、上記ｐＨが６．０を越える溶液との液量比は特に限定されないが、２：１の割合が好ましい。
【００２２】
上記工程の処理時間は特に限定されないが、３０秒から５分の間が好ましい。
【００２３】
本発明の前処理方法で処理された検体は、特に限定されることなく種々の測定方法に適用することができる。
例えば、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の目的成分を測定する方法が例示できる。
免疫学的方法としては、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、免疫比濁測定法、免疫凝集測定法などが例示できる。
遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用した方法としては、ＬＡＭＰ法、Ｑプローブ法などが例示できる。
本発明の検体前処理方法が適用される測定項目は、特に限定されるものではないが、例えば、糞便に含まれるＲｏｔａウイルスの検出に利用することができる。
【００２４】
本発明の前処理方法は、中でも、検出系に化学発光反応を用いる目的成分測定方法に好ましく適用できる。
化学発光反応を用いる検出系としては、特に限定されるものではないが、ウエスタンブロッティング法、免疫共沈降法、酵素免疫測定法などが挙げられる。
【００２５】
本発明の実施形態の一つは、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法であって、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする目的成分測定法である。
（１）糞便に由来する検体を、上述の検体前処理方法で、処理する工程
（２）免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する工程
【００２６】
当該実施形態における検体前処理方法については、上記で詳しく説明したとおりである。
また、当該実施形態における目的成分測定方法としては、特に限定されないが、例えば、以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む酵素免疫測定法が例示できる。この測定法は、特開２００１−２３５４７１号公報（特許文献１）などで公知である。
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
【００２７】
本発明の実施形態の一つは、上記で説明した糞便に由来する検体の前処理方法に用いるためのセットであって、ｐＨ２．９未満の酸性水溶液、もしくは、ｐＨ０．５〜２．９の間の酸性緩衝液を含むことを特徴とする検体前処理用セットである。
【００２８】
セットの各構成については、本発明の前処理方法の項で説明したとおりである。
【００２９】
本発明の実施形態の一つは、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法に用いるためのキットであって、上記で説明した検体前処理用のセットに加え、さらに、目的成分を測定するために必要な試薬構成を含むものである。
検体に含まれる目的成分を測定するために必要な試薬構成部分については、特に限定されない。例えば、下記の全てを含む一式が例示される。
・前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第一の抗体、
・前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第二の抗体、
・未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液、および、
・多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定するための発光基質
【００３０】
（実施例）
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
（実験１）ビオチン標識抗ロタウイルス抗体の調製
抗ロタウイルスマウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）１ ｍｇとビオチンアミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを２５℃で４時間反応させ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ミリポア社製）を用いて分画し、第１抗体液を調製した。
（実験２）ＡＬＰ標識抗ロタウイルス抗体の調製
抗ロタウイルスマウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）０．１ ｍｇをＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ - ＳＨ（同人化学社製）を用いて、第２抗体液を調製した。
（実験３）ロタウイルス抗原測定の実施
症状から明らかにロタウイルス感染症でない人より糞便を採取し、そのうちイムノクロマト法を原理とする市販のロタウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社 商品名ＢＤ Ｒｏｔａ／Ａｄｅｎｏ エグザマンＴＭ スティック）でロタウイルス感染症陰性であることを確認できた糞便を使用し（５４例）、ロタウイルス抗原を測定した。
検体抽出液としては、０．１５重量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライテスク社製）、１重量％ ＢＳＡを含む溶液を用い、糞便を前記検体抽出液に懸濁したものを検体とした。
検体７５μｌに第１抗体液２０μｌを添加し、混合後、４０℃でインキュベーションした（検体・第１抗体液混合液）。１０秒後に、検体・第１抗体液混合液７０μｌをあらかじめ５０μｌの蒸留水を添加したＰＯＣｕｂｅ（東洋紡績社製）専用反応容器（第１抗体に結合したリガンドを特異的に認識するリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタ（抗ビオチン抗体を結合させたガラスフィルター固相）を含む容器。）に添加し、さらに、第２抗体液を２０μｌ添加し、４０℃でインキュベーションした。１５０秒後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む蒸留水を８０μｌずつ２回添加し、さらに発色基質としてＬｕｍｉｇｅｎＴＭ ＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）を３０μｌ添加し、発光強度を測定した。発光強度で１００００以上を示す検体をロタウイルス感染症陽性と判定した。
その結果、５４例中、すべての検体で非特異的な発光が検出され、擬陽性を示した。
【実施例２】
【００３２】
実験３に用いた発光基質であるＬｕｍｉｇｅｎＴＭ ＡＰＳ−５はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）依存的であり、非特異的な発光は糞便に含まれるＡＬＰであると推測される。そこで実験３で用いた糞便のうち３例を用いてＡＬＰ活性を調べた。また、ネガティブコントロールとして検体抽出液も測定した。
（実験４）ＡＬＰ測定試薬の調製
９．６６ｍｌのジエタノールアミン（ナカライテスク社製）を蒸留水６０ｍｌで希釈後、０．１Ｍ 塩化マグネシウム水溶液 ０．２５ｍｌを添加した。さらに、２．０Ｍ ＨＣｌでｐＨを１０．１に調整し、最終液量を１００ｍｌとして、試薬Ａとした。また、３７１ｍｇのｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（ナカライテスク社製）を１０ｍｌの試薬Ａに溶解して、試薬Ｂとした。
（実験５）ＡＬＰ活性測定の実施
試薬Ａ ２．６ｍｌと試薬Ｂ ０．３ｍｌとを混合し、３７℃で５分間予備加温した。続いて（実験３）で用いた検体０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対象に、３７℃に制御された分光光度計で４０５ｎｍの吸光度変化を３から４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化量を測定した。得られた結果を（実験３）で得られた発光強度のデータと合わせて表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
表１の結果から、糞便では、ＡＬＰ活性を示す吸光度変化量がネガティブコントロールである検体抽出液に比べて有意に高いことが確認できた。このことから、糞便が高い発光強度を示す原因は糞便中のＡＬＰの影響であると言える。
【実施例３】
【００３５】
ＡＬＰはアルカリ性条件下で有意に働く酵素であり、強酸性にすることで失活させることができると考え、前処理液として数種の酸性溶液を用いて、糞便中のＡＬＰを失活させようと考えた。
（実験６）酸処理後の糞便中のＡＬＰ活性測定の実施
７種類の酸性溶液を用いてロタウイルス感染症陰性である糞便中のＡＬＰ活性測定を測定した。糞便を（実験３）で用いた検体抽出液に懸濁し、そのうち３０μｌに前処理液として酸性溶液２０μｌを加えて４０℃、１分間処理後、中和液として、１．０Ｍ，ｐＨ８．０のＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液 ５０μｌでｐＨ７に中和した。酸処理後、中和した検体を用いて、（実験５）と同様の方法でＡＬＰ活性測定を実施した。得られた結果を酸処理後のｐＨのデータと合わせて表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
表２の結果から、酢酸以外の酸では有意にＡＬＰ活性を低減させる効果があることが確認できた。
【実施例４】
【００３８】
（実験７）ロタウイルス抗原測定の実施
（実験６）で用いた７種類の酸性溶液で処理し、中和した陰性検体を用いてロタウイルス抗原量測定を行った。測定方法は（実験３）と同様の方法で行った。得られた結果を酸処理後のｐＨのデータと合わせて表３に示す。
【００３９】
【表３】
【実施例５】
【００４０】
（実験８）処理に用いる酸のｐＨと、ＡＬＰ活性、ＰＯＣｕｂｅ測定値の関係の検証
（実験６）で用いた酸のうち、Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、ｐＨ ０．５から４．０に調整した１５種類の溶液を準備し、それぞれの溶液を用いて陰性検体に対して酸処理を行い、ＡＬＰ活性測定とＰＯＣｕｂｅ測定値との関係を調べた。得られた結果を表４に示す。また、ＡＬＰ活性とＰＯＣｕｂｅ測定値との相関を図１に示す。
【００４１】
【表４】
【００４２】
表４、図１の結果から、ＡＬＰ活性とＰＯＣｕｂｅ測定値とは良好な相関を示した。また、ＰＯＣｕｂｅ測定では、１００００ＲＬＵ（ＲＬＵは、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（相対発光量）の略。）を上回ると陽性判定となることから、処理に用いる酸性溶液はｐＨ０．５から２．９までの間であれば、偽陽性判定を防ぐことができることがわかった。
【実施例６】
【００４３】
（実験９）ロタウイルス抗原測定の実施
（実験７）の方法と同様にして、効果が確認できなかった酢酸を除く６種類の酸性溶液を用いて、ロタウイルス抗原測定を行った。糞便は（実験３）で用いた５４例のうち２０例を用いた。得られた結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
【００４５】
表５の結果から、６種類の酸性溶液いずれも市販のロタウイルス検出キットとの一致率は１００％であった。
以上の結果から、糞便中のロタウイルス抗原検出の際に、ｐＨが２．９以下になるように酸性溶液で処理することで、擬陽性判定を防ぐことができると確認できた。本発明の糞便処理方法は、化学発光法を測定原理とした免疫測定法において十分利用可能であると言える。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する場合において、本発明の検体前処理液を用いて糞便検体を前処理することにより、正確性の高い測定が可能になる。種々の診断システムに適用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
【請求項２】
前記前処理方法が、免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法のために用いられる、請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、請求項２に記載の検体前処理方法。
【請求項４】
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、請求項２または３に記載の検体前処理方法。
【請求項５】
前記の目的成分が、Ｒｏｔａウイルスである、請求項２〜４のいずれかに記載の検体前処理方法。
【請求項６】
請求項１に記載の前処理方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
（１）前記検体を検体抽出液に懸濁し懸濁液とする工程
（２）前記懸濁液のｐＨを０．５〜２．９の間になるよう調整する工程
（３）（２）で処理した懸濁液のｐＨを６．０〜８．０の間になるよう調整する工程
【請求項７】
糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法であって、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする目的成分測定法。
（１）糞便に由来する検体を、請求項１〜６のいずれかに記載の検体前処理方法で、処理する工程
（２）免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する工程
【請求項８】
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、請求項７に記載の目的成分測定法。
【請求項９】
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、請求項７または８に記載の目的成分測定法。
【請求項１０】
前記の酵素免疫測定法が、以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法である、請求項９に記載の目的成分測定法。
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の糞便に由来する検体の前処理方法に用いるためのセットであって、ｐＨ２．９未満の酸性水溶液、または、ｐＨ０．５〜２．９の間の緩衝液を含むことを特徴とする検体前処理用セット。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれかに記載の糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法に用いるためのキットであって、以下の（１）〜（３）の構成を含むことを特徴とするキット。
（１）請求項１１に記載の検体前処理用セット
（２）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第一の抗体
（３）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第二の抗体
（４）未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液
（５）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、測定するための発光基質
【請求項１】
糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
【請求項２】
前記前処理方法が、免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法のために用いられる、請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、請求項２に記載の検体前処理方法。
【請求項４】
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、請求項２または３に記載の検体前処理方法。
【請求項５】
前記の目的成分が、Ｒｏｔａウイルスである、請求項２〜４のいずれかに記載の検体前処理方法。
【請求項６】
請求項１に記載の前処理方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
（１）前記検体を検体抽出液に懸濁し懸濁液とする工程
（２）前記懸濁液のｐＨを０．５〜２．９の間になるよう調整する工程
（３）（２）で処理した懸濁液のｐＨを６．０〜８．０の間になるよう調整する工程
【請求項７】
糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法であって、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする目的成分測定法。
（１）糞便に由来する検体を、請求項１〜６のいずれかに記載の検体前処理方法で、処理する工程
（２）免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する工程
【請求項８】
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、請求項７に記載の目的成分測定法。
【請求項９】
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、請求項７または８に記載の目的成分測定法。
【請求項１０】
前記の酵素免疫測定法が、以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法である、請求項９に記載の目的成分測定法。
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の糞便に由来する検体の前処理方法に用いるためのセットであって、ｐＨ２．９未満の酸性水溶液、または、ｐＨ０．５〜２．９の間の緩衝液を含むことを特徴とする検体前処理用セット。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれかに記載の糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法に用いるためのキットであって、以下の（１）〜（３）の構成を含むことを特徴とするキット。
（１）請求項１１に記載の検体前処理用セット
（２）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第一の抗体
（３）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第二の抗体
（４）未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液
（５）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、測定するための発光基質
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２２０１９５（Ｐ２０１２−２２０１９５Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８２６１０（Ｐ２０１１−８２６１０）
【出願日】平成２３年４月４日（２０１１．４．４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月４日（２０１１．４．４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]