検出アッセイ
本発明は、特に飼料における動物組織、例えば加工動物タンパク質(ＰＡＰ)又は肉骨粉(ＭＢＭ)を検出するのに関与する方法、キット、及び核酸に関する。１の方法では、ＤＮＡなどの拡散は、インキュベート緩衝液中でサンプルをインキュベートし、インキュベートされたサンプルをオートクレーブに書け、そしてサンプルを金属キレート財と混合することを含む。この方法で抽出されたＤＮＡを、例えば配列番号１〜２１に記載されるプライマー及びプローブ配列を用いてＰＣＲ又はリアルーＰＣＲを用いて増幅にかけた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に飼料における動物組織のタイプ、例えば、加工動物タンパク質(ＰＡＰ)又は肉骨粉(ＭＢＭ)の検出及び識別に関わる方法、キット、及び核酸に関する。
【０００２】
感染性海綿状脳症は、ヒトにおけるクル及びクロイツフェルトヤコブ病(ＣＪＤ)、ヒツジにおけるスクレイピー、ミュールジカ及びヘラジカにおける伝染性ミンク脳症及び慢性消耗病を含む稀で致死的かつ伝染性の神経変性疾患の群である。ウシ海綿状脳症は、１９８６年にイギリス(ＵＫ)で認知され、そして世界中の少なくとも２６の国において現在見つかっている。これは、世界的な農業の問題であるばかりでなく、ヒトの健康に対する潜在的な脅威として考えられている。
【０００３】
高温で処理され、そして肉骨粉(ＭＢＭ)として知られている加工された動物組織は、家畜動物の栄養補助飼料、特に泌乳動物及び成長の早い動物に必須アミノ酸を供給するタンパク質補助飼料として使用されてきた。肉骨粉は飼料として直接使用されるか、又は動物飼料の成分として使用することができた。さらに、事故による暴露は、取り扱いの様々な段階での相互汚染のため生じ得た。ＢＳＥは、過度の飼育習慣、つまり反芻動物の動物タンパク質のリサイクル、の結果として伝染病に発達し、そしておそらく１９７０年代の始めにおける新たな原因、おそらくは遺伝子突然変異の結果として疾患を発達させたウシ又は他の動物に由来する。ＢＳＥの症例は、ＢＳＥに感染したウシのリサイクルの結果であった。ＢＳＥの病原物質は、ＭＢＭに広がった。
【０００４】
反芻動物の食物連鎖にＭＢＭが混入することを避けるために、反芻動物原材料(例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、又はシカ由来のもの)を他の反芻動物に与えることについての禁止令が英国で導入された(ウシ海綿状脳症令 1988年[SI 1988/1039]。この禁止令は、後に全ての家畜(魚及びウマを除く)に与える全ての哺乳動物タンパク質を含めるように、英国において拡張された(ウシ海綿状脳症(改正)令 1996年[SI 1996/962]))。反芻動物の飼料中に哺乳動物タンパク質を使用することを禁止する禁止令は、１９９４年に欧州連合(EU)に導入され、そして１９９７年に米国(USA)に導入された。２０００年から、欧州の禁止令は、食品生産に使用される全ての養殖された動物に与える哺乳動物、鳥類、及び魚由来のタンパク質を含めるように拡張された。
【０００５】
現在の法律を施行するために、動物飼料、特に反芻動物飼料において禁止タンパク質を検出することを可能とすることが必要とされる。飼料材料における骨断片の形態的同定に本質的に関する顕微鏡分析は、動物飼料における動物起源の構成成分を検出するために、現在ＥＵにおいて公式に認められた唯一の方法である。承認された顕微鏡分析試験(ＭＡＴ)プロトコルについての「飼料の公的制御についての動物起源の構成成分の決定のための分析方法」についての２００３年１２月２３日のＥＵ委員会命令２００３/１２６/ＥＣを参照のこと。顕微鏡分析は、動物構成物質の同定を可能にし、そして魚と陸棲生物、並びに哺乳動物と非哺乳動物物質との間の識別を可能にする。しかしながら、顕微鏡分析は経験を積んだ分析者を必要とし、液体サンプル上で使用できず、軟部組織を検出できず、そしてウシフラグメントの沈渣のために有機溶媒の使用を必要とする時間及び費用のかかる方法である。
【０００６】
動物組織を試験するために開発された他の方法は、酵素連結免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、近赤外分光法(ＮＩＲＳ)、近赤外顕微鏡法(ＮＩＲＭ)、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)及びリアルタイムＰＣＲを含んだ(Gizziら、2003、Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 22: 311-331の概説を参照のこと)。ＥＬＩＳＡは、抗体に基づく検出システムを介して種特異的抗原を同定することを目的としたものであり、骨の発見を必要とすることはない。ＥＬＩＳＡ法の欠点として、反芻動物生成物、例えば乳汁からの干渉、ゼラチンによる抑制、及び植物タンパク質などの他のタンパク質との相互反応性が挙げられる。ＮＩＲＳ及びＮＩＲＭは、大きな比較データベースの開発、及び高価な装置を必要とする。特に、ＮＩＲＳでは正確性が問題であった。ＮＩＲＳ、ＮＩＲＭ、及びＥＬＩＳＡ法は、最適範囲を超えた条件下で加工された原材料については、通常適切ではない。
【０００７】
ＰＣＲ技術は、理論上、分類群及び/又は種に特異的な核酸、特にデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)の同定を可能にする。初期の例は、Ｗａｎｇら(2000, Mol. Cell. Probes 14: 1-5)に提供され、当該文献は、未加工牛肉又はウシＭＢＭを入れたマウス飼料サンプルからの全ＤＮＡを抽出することを含む方法を記載する。０.２ｇの量のサンプルを、１％の界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を入れた２０％Ｃｈｅｌｅｘ１００(BioRad、Hercules、CA、USAから購入したキレートレジン、ＰＣＲ阻害剤として作用しうる金属イオンのコンタミを取り除くために使用された)の溶液中でインキュベートし、加熱し、冷却し、そして遠心し、そして上清を、ｔＲＮＡLysの３'部分、ＡＴＰａｓｅサブユニット８、及びＡＴＰａｓｅサブユニット６のアミノ末端部分をコードするウシミトコンドリアＤＮＡの２７１塩基対のＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅に用いた。筆者は、当該方法がより迅速、簡便、かつ一貫性であると述べた。
【０００８】
３７０塩基対のアンプリコンサイズを有する反芻動物特異的ミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子プローブ及びプライマーに関するリアルタイムＰＣＲアッセイの例は、Ｒｅｎｓｅｎら(2005, Foodborne Pathogenes Dis. 2: 152-159; WO 2005/074522を参照のこと)により報告された。ウシ飼料からＤＮＡを抽出するためのサンプル前処理技術は、ウシ飼料において高レベルのＰＣＲ阻害剤の問題を解決するために開発された。当該技術は、１０ｇの混入飼料サンプルを細胞溶解緩衝液中でインキュベートし、細胞ライセートをWhatman FTA（登録商標）カードに適用し、続いて当該カードをＲＮＡｓｅで処理し、次にＢｉｏＲａｄ(Hercules, CA, USA)から販売されたＣｈｅｌｅｘ１００抽出キット(Instageneキット)を用いてＤＮＡを精製した。当該アッセイにより、市販のウシ飼料に混入された市販の加工済みＭＢＭコンタミ物質(０.０５％)を検出できたということが報告された。
【０００９】
１１７塩基対のミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ遺伝子断片の増幅に基づく他のリアルタイムＰＣＲアッセイは、Chiappiniらにより開発された(2005, J.AOAC Int. 88: 1399-1403)。Ｐｒｏｍｅｇａ(Madion, WI, USA)から販売された食品用のＷｉｚａｒｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ精製システムを用いて、１００ｍｇの加工ＭＢＭサンプルから全ＤＮＡを抽出した。これらのアッセイの特異性を、ウマ、トリ、七面鳥、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンチョビ、メカジキ、及びウシ原材料に由来するゲノムＤＮＡについて試験したが、リアルタイムＰＣＲシグナルは、ヤギ、ヒツジ、及びウシサンプルからのみ得られた。さらに、この筆者らは、このリアルタイムＰＣＲアッセイの性能が、試験されたＭＢＭを生産するために使用される処理条件により、及び組成の点におけるＭＢＭの変動性によりかなり影響を受け、そして適切な標準物質の製造を妨げ、そして飼料中のＭＢＭ含量の信頼の置ける定量を妨げた。
【００１０】
ＰＣＲ技術における幾つかの改善にかかわらず、ＥＵ「intercomparison study for the determination of processed animal proteins including meat and bone meal in animal study」(Gizziら、2004, J. AOAC Int. 87: 1334-1441)は、１７のＥＵに参画する研究所において行なわれたＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ試験から得られた多くの偽陽性及び偽陰性の結果により示されるように、全加工動物タンパク質(ＰＡＰ、ＭＢＭを含むもの)の決定、並びに哺乳動物、反芻動物、及びブタからのＰＡＰの識別に失敗したということを発見した。一般的なＰＣＲ技術の全ては、参加者により網羅され、例えばアガロースゲル電気泳動を伴った従来のＰＣＲ、ＰＣＲ-ＥＬＩＳＡ、及びリアルタイムＰＣＲを含んだ。サンプル調製は、オーダーメイド又はキット抽出との間で変更され、場合により推奨の粉砕ステップを含み、使用されたサンプルの量は５０ｍｇ〜８ｇで変えられた。ＰＣＲ法の全体の評価は、性能の点で「かなり悪く」、そして、任意のＰＣＲに基づく技術がＰＡＰ又はＭＢＭに対する信頼のおける堅牢な試験として使用される前に、既知のプロトコルの主要な改良が必要とされるということが結論付けられる。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、ＰＡＰ又はＭＢＭにおける動物組織についてのＰＣＲに基づく試験に関連する問題に取り組み、そして代替となるＤＮＡ抽出法、及びＰＣＲに基づく同定技術を提供する。
【００１２】
本発明の第一の態様では、以下のステップ：
(ｉ)インキュベート緩衝液中に約３０〜２５０ｇ、例えば約３５〜４５ｇ、又は約４０ｇのサンプルをインキュベートし；
(ｉｉ)ステップ(ｉ)でインキュベートされたサンプルをオートクレーブし；そして
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)でオートクレーブされたサンプル又はサンプルの一部を、金属キレート剤と混合する
を含むサンプルからの核酸(例えばＤＮＡ)を抽出する方法が提供される。金属キレート剤は、例えば、金属キレートイオン交換レジンでありうる。
【００１３】
本方法は、以下のステップ：
(ｉｖ)金属キレートイオン交換レジンなどの金属キレート剤を、上記ステップ(ｉｉｉ)のサンプル又はその一部から沈渣して、抽出された核酸を含む上清を生成する
をさらに含み得る。
【００１４】
本発明に従った抽出方法は、例えばＰＣＲ及び/又はリアルタイムＰＣＲなどの反応における増幅のためにテンプレートとして機能するために十分な質及び量の核酸を提供する。本発明は、このような増幅反応の再現性及び正確性がかなり優れているということを発見した(以下を参照のこと)。他の従来の抽出技術と比べて、本方法は、簡便かつ効果的な方法である。
【００１５】
本方法において使用するサンプルの適切な量は、約３０〜約２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、又は５０ｇである。
【００１６】
１の実施態様では、インキュベート緩衝液は、約０.０５〜０.２Ｍ又は約０.１Ｍの濃度のリン酸緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液でありうる。
【００１７】
インキュベート緩衝液は、サンプルの重量の約５００〜１５００％(ｖ/ｗ)、例えばサンプル重量の約９００％(ｖ/ｗ)で使用されてもよい。
【００１８】
インキュベート緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液は、約６.５〜７.５、又は約７.２のｐＨを有しうる。
【００１９】
インキュベートは、約５〜６０分、又は約１０〜３０分、例えば約１５分行なわれうる。
【００２０】
サンプルはステップ(ｉｉ)において、約８５℃〜１２０℃、又は１２１℃、又は約９０℃〜１００℃、例えば約９５℃でオートクレーブされうる。オートクレーブステップは、１分を超えて、例えば約５〜６０分、又は約１０〜３０分、例えば約１５分間続けられることもある。
【００２１】
オートクレーブステップは、(滅菌に使用される高圧ではなくむしろ)大気圧で又は大気圧付近で行なわれ得る。大気圧又はその付近でのオートクレーブは、抽出されたＤＮＡなどの核酸の破壊を低減するであろう。
【００２２】
本明細書に使用される場合、「大気圧付近」は、大気圧の約５０〜１５０％の圧力、例えば、大気圧の約８０〜１２０％、又は９５〜１０５％を意味する。
【００２３】
１の実施態様では、オートクレーブステップは、大気圧で１５分間９５℃で行なわれる。
【００２４】
特に、動物サンプルが使用される場合、オートクレーブステップは、サンプルのペレットを崩し、及び/又は脂肪を破壊し(つまり、飼料ペレットを結合させるために一般的に使用される脂肪及び獣脂を可溶化し)、そして核酸を遊離させるように機能する。
【００２５】
イオン交換レジンなどの金属キレート剤は、多価金属イオンをキレートすることもある。レジンは、対となるイミノジアセテートイオンを含むスチレンジビニルベンゼンコポリマー、例えばＣｈｅｌｅｘ１００であってもよい。
【００２６】
金属キレートイオン交換レジンなどの金属キレート剤は、本方法のステップ(ｉｖ)において遠心、例えば約１０,０００〜１２,０００×ｇ、又は約１１,０００×ｇでの遠心、により沈渣されうる。
【００２７】
サンプルは、動物飼料、例えば反芻動物飼料に由来することもある。
【００２８】
当該サンプルは、加工された動物原材料、例えば加工動物タンパク質(ＰＡＰ)又は肉骨粉(ＭＢＭ)を含むか、又はその存在について試験されうる。
【００２９】
サンプルは、動物又は反芻動物ミトコンドリアＤＮＡ、例えば１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアＤＮＡを含み得る。
【００３０】
１の態様では、サンプルは、動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚からなる群の１以上からのＤＮＡを含む。
【００３１】
本明細書に使用される動物という語句は、任意の脊椎動物を指す。動物は、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、トリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ネコ及びイヌ)並びに非家畜動物(例えば、エルク、シカ、トナカイ及びキリン)を含む。動物は、魚などの水棲生物も含む。
【００３２】
本発明のさらなる態様では、サンプルが動物飼料である上に記載される方法は、以下のステップ：
(ｉ)約７.１〜７.３のｐＨの０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で、約３５〜４５ｇのサンプルを約１０〜２０分、例えば約１５分、場合により室温でインキュベートし；
(ｉｉ)ステップ(ｉ)でインキュベートされたサンプルを、大気圧で、又はその付近で、約９０〜１００℃で約１０〜３０分間、例えば約１５分間オートクレーブし；そして
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)でオートクレーブされたサンプルの一部を、金属キレートイオン交換レジン、例えばＣｈｅｌｅｘ１００と混合する
を含みうる。
【００３３】
上記方法はさらなるステップ：
(ｉｖ)ステップ(ｉｉｉ)のサンプルの一部から、約１００００〜１２０００×ｇ、又は約１１０００×ｇで遠心することにより、レジンを沈渣する
を含みうる。
【００３４】
本発明の方法のステップ(ｉｖ)から得た上清又はその一定量を、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、又は以下に言及される別の増幅反応などの増幅反応において使用されうる。
【００３５】
本発明の方法は、以下のステップ：
(ｖ)核酸、例えばミトコンドリアＤＮＡなどのＤＮＡの有無を検出する
をさらに含み得る。
【００３６】
核酸は、加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭに由来する可能性がある。
【００３７】
核酸は、増幅反応(例えばＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ)を用いて、ステップ(ｖ)において検出されることもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本明細書に使用される「増幅反応」という語句は、テンプレート核酸のコピーの増加をもたらす酵素反応を指す。本発明の範囲内の増幅反応としては、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ(ＲＲＴ-ＰＣＲ)、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)、ストランド置換増幅(ＳＤＡ)、転写媒介性増幅、核酸配列に基づく増幅(ＮＡＳＢＡ)、ローリングサイクル増幅(ＲＣＡ)、及び分岐ＤＮＡシグナル増幅(ｂＤＮＡ)が挙げられる。
【００３９】
１の態様では、シグナルシステムは、増幅反応の後に残っているサンプル又はサンプルの一部において増幅されたＤＮＡを検出するために使用される。このようなシグナルシステムは、様々な性質に基づいていてもよいが、特に、蛍光、化学発光、又は生物発光である化学的シグナルを生成する。シグナルシステムは、増幅が行なわれるか又は行なわれた反応容器を開けることなく、均一に検出することができるシステムであってもよい。
【００４０】
このようなシグナルシステムは、例えば、溶液中で遊離状態で存在した場合に比べて、二本鎖ＤＮＡに結合された場合に異なりかつ区別される可視光を放出するＤＮＡ結合剤などの可視的シグナル試薬を含んでもよい。このような色素の例は、周知であり、そしてエチジウムブロマイド、並びにＳＹＢＲの商標名で売られている試薬、例えばＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ又はＳＹＢＲＧｏｌｄ、又は他の色素、例えばＹＯＰＲＯ-１などが挙げられる。このような試薬からのシグナルによって示される有意又は多量のＤＮＡの存在は、増幅反応が進行したことを指し示すことができる。
【００４１】
或いは、又はさらに、シグナルシステムは、増幅産物に特異的に結合する標識プローブを含んでもよい。標識は、適切に蛍光標識されており、適切な波長の光を照射した後に検出でき、それに続き当該標識からの結果として生じる発光を検出することができる。様々な蛍光ラベル、例えばローダミン色素、フルオレセイン、及びシアニン色素が市販されている。フルオロフォアのさらなる例として、非限定的に、フルオレセイン、イソチオシアン酸塩、フルオレセイン・アミン、エオシン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン(umbelliferone)、５-カルボキシフルオレセイン、６-カルボキシフルオレセイン(ＦＡＭ)、２',４',１,４,-テトラクロロフルオレセイン(ＴＥＴ)、２',４Ｉ,５',７',１,４-ヘキサクロロフルオレセイン(ＨＥＸ)、２７'ジメトキシ-４'５'-ジクロロ-６-カルボキシフルオレセイン(ＪＯＥ)、ローダミン、６カルボキシローダミン(Ｒ６Ｇ)、Ｎ,Ｎ,Ｎ'Ｎ'-テトラメチル-６-カルボキシローダミン(ＴＡＭＲＡ)、６-カルボキシ-Ｘ-ローダミン(ＲＯＸ)、４-(４'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(ＤＡＢＣＹＬ)、５-(２'-アミノエチル)アミノナフタレン-１-スルホン酸(ＥＤＡＮＳ)、４-アセトアミド-４'-イソチオシアナトスチルベン-２,２'ジスルホン酸、アクリジン、アクリジン・イソチオシアネート、ｒ-アミノ-Ｎ-＞３-ビニルスルホニル)フェニル！ナフタルイミド-３,５,ジスルホネート(Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ)、Ｎ-(４-アニリノ-１-ナフチル)マレイミド、アンスラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、７-アミノ-４-メチルクマリン、７-アミノ-４-トリフルオロメチルコウルアリン(7-amino-4-trifluoromethylcouluarin)(Coumaran 151)、シアノシン、４',６-ジアミニジノ-２-フェニルインドール (ＤＡＰＩ)、５',５''-ジアミニジノ-２-フェニルインドール(ＤＡＰＩ)、５',５''-ジブロモピロガロール-スルホネフタリン(Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ)、７-ジエチルアミノ-３-(４'-イソチオシアナトフェニル)-４-メチルクマリン・ジエチレントリアミン・ペンタアセテート、４,４'-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン-２,２'-ジスルホン酸、４,４'-ジイソチオシアナトスチルベン-２,２'-ジスルホン酸、４-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-４'-イソチオシアネート(ＤＡＢＩＴＣ)、エオシン・イソチオシアネート、エリスロシンＢ、エリスロシン・イソチオシアナート、エチジウム、５-(４,６-ジクロロトリアジン-２-イル)アミノフルオレセイン(ＤＴＡＦ)、ＱＦＩＴＣ(ＸＲＩＴＣ)、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４-メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラロサニリン、フェノールレッド、Ｂ-フィコエリトリン、ｏ-フタルジアルデヒド、ピレン、ピレンブチレート、サクシニミジル１-ピレンブチレート、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ４(Ｃｉｂａｃｒｏｎ.ＲＴＭ.ブリリアントレッド３Ｂ-Ａ)、リッサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体、(テキサスレッド)、テトラメチル ローダミン、テトラメチル ローダミンイソチオシアネート(ＴＲＩＴＣ)、リボフラビン、ロソリン酸、テルビウムキレート誘導体、Ｃｙ５及びＣｙ５.５が挙げられる。
【００４２】
１の態様では、シグナルシステムは、レポーターとクエンチャー標識の組み合わせを含む。本発明において使用されうるドナー/クエンチャー対の例は、それぞれＦＡＭとＴＡＭＲＡ、ＶＩＣとＴＡＭＲＡ、ＦＡＭとＪＯＥ、ＦＡＭとＲＯＸ、ＦＡＭとＤＡＢＣＹＬ、フルオレセインとテトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳとフルオレセイン、ＥＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬ、フルオレセインとフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＢＰＤＩＰＹ ＦＬ、ＦＡＭとＱＳＹ９と組み合わせたＱＳＹ７色素である。他の適切なドナー/クエンチャー対と、プローブの組み合わせは、当業者により理解され、また通常の方法を用いて決定することができる。生成したシグナルは、任意の慣用検出装置、例えば蛍光分光計などの光学システムを用いて読み取ることができる。
【００４３】
当業者により理解されるように、増幅反応は、標的核酸の増幅に必須である試薬を含む。このような試薬として、オリゴヌクレオチドプライマー、緩衝液、核酸ポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、及びでオキシヌクレオチドトリホスフェート(ｄＮＴＰ)が挙げられ得る。
【００４４】
一般的なＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ技術については、例えば「PCR primer: A Laboratory Manual」(2003, Dieffenbach & Dveksler, Eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)を参照のこと。当該文献は本明細書に援用される。
【００４５】
本発明の別の態様では、サンプル中でＤＮＡを増幅する方法であって、以下のステップ：
(ｉ)本明細書に規定される本発明の方法に従ってサンプルからＤＮＡを抽出し；そして
(ｉｉ)ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲなどの増幅反応を用いて、抽出されたＤＮＡを増幅する
を含む、前記方法が提供される。
【００４６】
上記ステップ(ｉｉ)で増幅されたＤＮＡは、加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭに由来してもよい。
【００４７】
ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲは、プライマー対を使用し、そしてリアルタイムＰＣＲの場合、さらにプローブを使用し、ここで当該プライマー及びプローブは、以下の：動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚組織のうちの１以上に特異的である。
【００４８】
プライマー及びプローブの対は、動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚組織からなる群の１以上に由来するミトコンドリアＤＮＡ、例えば１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアＤＮＡに特異的でありうる。
【００４９】
プライマー及びプローブの対は、それぞれ、以下の：配列番号１、２、及び３(動物特異的)、配列番号４、５、及び６(ウシ特異的)、配列番号７、８、及び９(ヒツジ特異的)、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれうる。
【００５０】
プライマー及びプローブの対は、ブタ、トリ、及び魚組織からなる群の１以上に由来するミトコンドリアＤＮＡであって、１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子に特異的であるＤＮＡであってもよい。例えば、プライマーとプローブの対は、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれてもよい。
【００５１】
ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲは、さらにプライマーセットを使用してもよく、リアルタイム-ＰＣＲの場合、さらにプローブを使用してもよい。ここで当該プライマーセットとプローブは、サンプルに外因性であるＤＮＡに特異的であり、例えば配列番号１９、２０、及び２１に記載される配列である。
【００５２】
本発明に記載されたリアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブを用いて行なわれてもよい。リアルタイムＰＣＲ及び他の増幅反応においてしようするための追加の標識は以下に記載される。
【００５３】
１の態様における本発明の方法は、Ｐｒｏｍｅｇａ(Madison, WI, USA)から得られた磁性ＤＮＡ精製、例えばＷｉｚａｒｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ精製システムの使用を排除する。
【００５４】
１の態様では、本発明の方法は、ＲＮＡｓｅの使用を排除する。
【００５５】
１の態様では、本発明の方法は、Ｗｈａｔｍａｎ ＦＴＡ（登録商標）カードの使用を排除する。
【００５６】
１の態様では、本発明の方法は、インキュベート緩衝液におけるＴｒｉｔｏｎＸ-１００の使用を排除する。
【００５７】
本発明の別の態様では、ＰＣＲを用いてサンプルからＤＮＡを増幅するキットであって、配列番号１及び２(動物特異的)、配列番号４及び５(ウシ特異的)、配列番号７及び８(ヒツジ特異的)、配列番号１０及び１１(ブタ特異的)、配列番号１３及び１４(トリ特異的)、及び配列番号１６及び１７(魚特異的)からなる配列の群から選ばれるプライマー対を含み、そして場合によりさらに当該サンプルに外来性のＤＮＡに特異的なプライマーセット、例えば配列番号１９及び２０に記載される配列をさらに含む、前記キットが提供される。
【００５８】
本発明に記載されるキットは、加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭを、飼料サンプルから増幅させるために使用されてもよい。
【００５９】
本発明の別の態様では、配列番号１〜２１に記載される配列、例えば配列番号１０〜１８に記載される配列のうちの１以上を含む単離された核酸が提供される。配列番号１〜２１に記載される配列のうちの任意の１以上に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する単離核酸が本発明に包含される。
【００６０】
ヌクレオチド配列の間における配列同一性は、配列のアライメントを比較することにより決定されうる。比較された配列において対応する位置が、同一の塩基により占められている場合、分子は、この位置で同一である。同一性の割合としてアライメントをスコアリングすることは、比較された配列により共有される位置において、同一のアミノ酸又は塩基の数の関数である。
【００６１】
配列を比較する場合、最適アライメントは、この配列に起こり得る挿入及び欠失を考慮するために、当該配列の１以上にギャップを導入することを必要とする場合がある。配列比較法は、ギャップペナルティーを使用することもあり、その結果、比較される配列において同数の同一な分子では、できる限り少ないギャップでの配列アライメントが、２個の比較される配列の間の高い関連性を反映し、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するであろう。同一性の最大割合の計算は、ギャップペナルティーを考慮して最適アライメントを得ることに関与する。
【００６２】
配列比較を行なう適切なコンピュータープログラムは、商業部門及び公共部門において広く利用できる。例として、Ｇａｐプログラム(Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)及びＦＡＳＴＡプログラム(Altschulら、1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)が挙げられる。Ｇａｐ及びＦＡＳＴＡは、以前はＧＣＧ Wisconsinパッケージとして知られていたAccelry GCGパッケージバージョン１１.１(Accelrys, Cambridge, UK)の一部として利用できる。ＦＡＳＴＡプログラムは、欧州バイオインフォマティクス研究所(http://www.ebi.ac.uk/fasta)及びバージニア大学(http://fasta.biotech.virginia.edu/fasta_www/cgi)から公的にアクセス可能である。ＦＡＳＴＡは、所定の配列を有する配列データーベースをサーチするために使用されてもよく、又は２つの所定の配列を比較するために使用されてもよい(http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www/cgi/search_frm2.cgi)。一般的に、配列を比較する場合、コンピュータープログラムのデフォルトのパラメーターセットを使用すべきである。デフォルトパラメーターは、比較される配列のタイプ及び長さに依存して変化させてもよい。ＦＡＳＴＡプログラムを用いた配列比較は、Ｋｔｕｐ＝２、ＳｃｏｒｉｎｇＭａｔｒｉｘ＝Ｂｌｏｓｕｍ５０、ｇａｐ＝-１０及びｅｘｔ＝-２を使用してもよい。
【００６３】
当該方法において、本発明に記載されたキット及び単離核酸、存在する場合プローブは、任意の適切な検出手段で標識され得る。こうして、例えば、配列番号３、６、９、１２、１５、及び１８の配列を含むプローブは、必ずしもＦＡＭ及びＴＭＲＡで標識される必要はなく、そして配列番号２１の配列を含むプローブは、必ずしもＶＩＣ及びＴＡＭＲＡで標識される必要はないが、各々は、上に詳述されるように他の手段で標識され得る。
【００６４】
本発明は、本明細書に記載される方法に従って得られる抽出核酸を包含する。このような抽出核酸は、抽出方法に由来する新規の性質を有するであろう。
【００６５】
本発明は、以下の非限定的な例によってより詳細に記載される。
【実施例】
【００６６】
実施例１
この例では、動物飼料中への加工動物原材料の汚染の同定を支援するための動物特異的プライマー及びプローブを用いたスクリーニングアッセイを開発し、評価し、そして立証した。使用された遺伝子は、ミトコンドリアゲノムに存在する１６ｓｒＲＮＡ遺伝子であった。
【００６７】
方法と材料
リアルタイムＰＣＲ：
リアルタイムＰＣＲは、ミトコンドリアゲノム中の１６ｓ ｒＲＮＡの保存領域又は種特異敵領域の同定に特異的な蛍光プローブを含む。ＰＣＲの間に標的が増幅され、ＴａｑＭａｎ技術(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)に基づく５'レポーター色素(ＦＡＭ)及び３'クエンチャー色素(ＴＡＭＲＡ)で標識されたプローブは、フランキングプライマーとの間で標的に結合する。Ｔａｑポリメラーゼ(AmpliTaq Gold（登録商標）)の５'-３'核酸分解活性は、プローブを加水分解して、クエンチャー色素の活性からレポーター色素を放出する。得られた蛍光を次に計測し、そして当該蛍光は産生されたアンプリコンの量に正比例した。蛍光シグナルの増加は、標的配列がプローブに相補的でり、かつＰＣＲの間に増幅された場合にのみ見られる。これらの要件は、いずれかの非特異的増幅の検出を制限する。
【００６８】
プライマー及びプローブ：
ＧｅｎＢａｎｋデーターベースから得た以下の配列：トリ(Ｘ５２３９２)、ウシ(ＪＯ１３８４０)、ヒツジ(ＡＦ１０４０６)、魚(ＮＣ００２０８)、及びブタ(ＡＪ００２１８９)を用いて、標的に対するプライマー及びプローブが設計された。
【００６９】
Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)の使用により、アッセイのデザインを補助した。スクリーニングアッセイでは、プライマー及びプローブは、コンセンサス領域に基づいた。分化領域は、可能である場合、動物特異的アッセイ用に選択された。表１は、スクリーニングアッセイ及び動物特異的アッセイ用のプライマー及びプローブ配列を、予期されるアンプリコンサイズと供に示す。Ｓｉｇｍａ-Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｌｔｄがフォワード及びリバースプライマーを製造し、一方Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが当該プローブプライマーを製造した。プローブを、ＦＡＭ(５'末端)及びＴＡＭＲＡ(３'末端)で標識した。
【００７０】
【表１】
【００７１】
内部の陽性対照：
内部陽性対照(ＩＰＣ)は、市販の核酸ベクター(ｐＵＣ１８)に一般的に発見されるが、動物又は植物ゲノムにおいて天然に見られないアンピシリン抵抗性遺伝子の領域の増幅に関した。アンピシリン抵抗性遺伝子は、非競合的外来性対照であり、そしてサンプル物質中に存在する抑制性の因子の結果として、又はサンプル抽出手順の結果として生じ得る誤判定を検出するために、アッセイの検証に含まれた。ＩＰＣテンプレート、プライマー、及びプローブをＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒミックスに加えて、マルチ検出にかけた。プライマーを限られた濃度(０.０３μＭ)で使用して、ＰＣＲ試薬を利用するＩＰＣ生成物が、１６ｓＲＮＡ増幅効率の決定要因になることを妨げた。多重アッセイにおいて標的の増幅を検出するために、プローブを５'末端においてレポーター色素としてＶＩＣで標識し、そして３'末端においてクエンチャーとしてＴＡＭＲＡで標識した。プライマー及びプローブを、ｐＵＣ１８の配列に基づき設計し、そして表２に示す。
【００７２】
【表２】
【００７３】
開発及び評価において用いられるＰＣＲ及びサイクル条件
１２.５μｌのＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒミックス(Applied Biosystems)、０.３μＭの両プライマー、及び０.１μＭの蛍光性プローブ(Applied Biosystems)を含む合計体積２５μｌで、７７００Sequence Detector(Applied Biosystems)上でリアルタイムＰＣＲを行い、そして検出した。サイクル条件は以下のとおりであった：５０℃で２分、次に９５℃で１０分、９５℃で１４分、５３.６℃で１分を４０サイクル。各サンプルは二回アッセイした。
【００７４】
検証に用いられるＰＣＲ及びサイクル条件
リアルタイムＰＣＲを行い、そして１２.５μｌＴａｑＭａｎマスターミックス(Applied Biosystems)、１６ｓ ｒＲＮＡアッセイに対する０.３μＭの両プライマー、及び０.１μＭの蛍光プローブを含む２５μｌの合計体積中で、７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ(Applied Biosystems)上で検出した。検証アッセイでは、IPCについての両プライマー(０.０３μM)及び蛍光プローブ(０.１５μM(Applied Biosystems)は、内部陽性対照テンプレートとのマスターミックスに加えられた(０.１６６ｎｇ ｐＵＣ１８)。サイクル条件は、７７００ Sequence Detector Systemについての条件と同じであった。
【００７５】
開発及び検証において使用されるサンプル
熱処理組織
ＤＮＡについてのサンプル処理の効果を生成させるために、熱処理された組織を調製した。ウシ、ヒツジ、ブタ、及びトリ筋肉組織のスライスを、０.１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７.２(１０％ｗ/ｖ)にホモジェナイズした。ホモジェネートを９０℃〜１３３℃の範囲の温度、３ｂａｒの圧力で２０分間加熱した。Ｓａｍｂｒｏｏｋら(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 3, Appendex E: Commonly used techniques in molecular cloning, purification of nucleic acids E3)に記載されるフェノール/クロロホルム法を用いて、プロテイナーゼＫで消化し、そして溶解された組織からＤＮＡを抽出した。当該文献は、その全てを本明細書に援用する。
【００７６】
加工原材料及び定量的標準
ウシ、ヒツジ、及びブタ加工原材料を、模擬加工オートクレーブ中で１２８℃で２０分間加熱し、次に凍結乾燥されたホモジェナイズされた筋肉から調製した。(プタスダラに基づく)魚粉は、United Fish Products(UK)から供給され、そして市販されている。細かく製粉されたトリ加工原材料は利用できなかったので、粗製トリ加工原材料を異なる組織から調製した。英国農業供給貿易協会(UKASTA)の推奨に基づいて、BOCM Pauls Ltd.(UK)から購入した生の食材を用いて、陰性である植物性飼料を製造した。表３は、加工原材料標準を作るために使用された陰性植物性飼料の組成を示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
サンプル原材料を、陰性の植物飼料(鳥用５０％)中の２０％加工原材料から製造した。トリ飼料ミックスを除いて、これらはRetch Ultraミルを用いて製粉し、１ｍｍ未満の微粒子サイズを与えた。(０.５％〜２０％ウシ、ヒツジ、魚、及びブタ、１％〜５０％トリ)の範囲の定量的標準を、２０％〜５０％のミックスを用いた陰性の飼料を含んで２ｇにした。
【００７９】
１００のコード化されたサンプル
レンダリング施設において生産されProsper De Mulder(UK加工業者)により供給されたトリ(鶏)、ウシ、ヒツジ、及びブタ加工原材料を用いてコードされたサンプルを製造した。大きな骨断片を取り除くために、肉骨粉を２ｃｍ2の開口シーブを用いて前もって篩にかけ、そして０.００１％〜１０％の範囲に分配した。これらのうち、０.１％、１％、５％、及び１０％の量を用いて、上記の陰性の植物飼料を用いて、さまざまな組み合わせの混合種サンプルを製造した。
【００８０】
６０の陰性の動物飼料
アッセイ開発の過程で、６０の異なる動物飼料を用いて、陰性の対象のベースラインレベルを測定した。たとえば、UKには多くの加工植物及び動物飼料製造業者が存在する。様々な供給業者の動物飼料の組成は、現在の規制の下で許容される様々な成分を含む。その結果、正確かつ維持可能な基準を決定する努力において、様々な複合飼料を試験することが必須であると考えられている。ＥＬＩＳＡ技術(Ansfieldら、2000, Food Agric. Immunol. 12: 285-297, 当該文献は、その全てを本明細書に援用される)は、サンプルが動物原材料について陰性であるか否かを確認するために用いられた。
【００８１】
検証に用いられたサンプル
様々な市販の動物飼料、例えばＭｅｎｄｉｐ ｅｗｅペレット及びＲａｐｉｄ ｌａｍｂペレットを、スクリーニング及び動物特異的アッセイの検証のために用いた。全てのサンプルを分析して、ＥＬＩＳＡ及びＭＡＴ(顕微鏡分析試験；上の記載を参照のこと)により動物原材料について陰性であるか否かを確認した。さらに、これらの動物飼料のいくつかに、様々な量(０.２、１.０、及び２.０％)の前に記載された様に製造されたウシ、ヒツジ、ブタ、トリ(鶏)または魚の加工原材料が加えられた。単一種及び混合種サンプルの両方を製造した。
【００８２】
開発及び評価の間に用いられた加工原材料、定量的標準、１００のコード化されたサンプル、及び６０の陰性の動物飼料から得たＤＮＡの抽出
動物飼料からのＤＮＡ抽出法は以下のとおりである：１ｍｌのＣｈｅｌｅｘ溶液(２０％Ｃｈｅｌｅｘ-１００[Bio-Rad Laboratories, UK,分析品質]＋１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０) を、０.１ｇの飼料ミックスに加える。サンプルを激しく混合し、そして９５℃で１５分間加熱した。次にサンプルを氷上に１分間配置して、その後サンプルを１００００ｒｐｍで(約７３００×ｇ)で１０分間スピンさせた。上清を注意深く取り出して新たなチューブにいれ、そして-２０℃で貯蔵した。
【００８３】
検証において用いられたサンプルからのＤＮＡ抽出
この方法を、大規模抽出に適用した。開始重量の増加により、サンプル飼料中に見られる構成要素のさらに多くの表示を可能にする。４０ｇのサンプルを３６０ｍｌの０.１Ｍリン酸緩衝液に加え、そして１５分間浸し、ゆっくり揺らした後に、９５℃で１５分間スチームオートクレーブにかけた。サンプルの液面の下１ｃｍから採取した１ｍｌの上清を０.２ｇのＣｈｅｌｅｘ１００(Bio-Rad Laboratories)に加えた。サンプルを２０秒間ボルテックスにかけ、そして次に１３０００ｒｐｍ(１１０００×ｇ)で遠心した。４００μｌの上清を次に、きれいなチューブに移し、そして試験に必要とされるまで４℃で貯蔵した。
【００８４】
結果と考察
動物飼料調製品の効果を決定するために、３ｂａｒの圧力で２０分間、９０℃、１００℃、１１０℃、１２０℃、及び１３３℃で処理された(加工過程を模倣した)組織から抽出されたＤＮＡを、スクリーニングアッセイで用いた。トリ(鶏)、ウシ、ヒツジ、魚、及びブタのミトコンドリアＤＮＡ(１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子)を検出するためにこのアッセイを設計した。リアルタイム蛍光ＰＣＲにおいて、Ｃｔ値は、ΔＲｎの統計的に有意な増加が最初に検出されるサイクルである。ΔＲｎは、リアルタイムＰＣＲにおいて生成されたシグナルの程度についての信頼の置ける指標である。
【００８５】
加熱処理されたヒツジの組織では、このスクリーニングアッセイを用いて、加熱処理の温度が増加するにつれ、Ｃｔ値が増加した。９０℃では、Ｃｔ値は、１６.８０であり、１００℃では、１７.７６であり、１１０℃では１８.７６であり、１２０℃では１９.０３であり、そして１３３℃ではＣｔ値は２０.３９であった。対照のヒツジＤＮＡでは、Ｃｔ値は１８.７０であり、１１０℃超では、ＤＮＡは変性し、ＰＣＲが標的を増幅する能力に影響を与えるということが示された。これは、豚肉を３０分間８０℃で加熱した場合にほとんどＤＮＡ変性が起こらないが、加熱温度を１２０℃に上げた場合有意な変性が生じるということを示すEbbehoj 及びThomson(1991, Meat Sci. 30: 221-234)の発見に一致した。これらの結果により、模倣された加工過程により変性されるが、スクリーニングアッセイは、最大１３３℃、３ｂａｒで２０分間処理されたサンプルについての適切な検出方法であるということが示された。これは、加熱処理されたトリ(鶏)、ウシ、魚及びブタ原材料から抽出されたＤＮＡでも観察された。
【００８６】
このスクリーニング及び動物特異的アッセイを評価するために、１００のコード化されたサンプルを用いた。各動物種についての既知の組成、定量標準のサンプルをこのアッセイに含めた。スクリーニングアッセイの結果を表４に要約して載せた。０.００１％で含められたサンプルの全ては検出されず、そして０.０１％レベルで含められたサンプルは、いくつかの場合において陽性の結果を与えた。０.１％レベルで含まれたサンプルは、全ての場合で検出された。標準についての結果とともに、これらの結果に基づいて、当該アッセイの感受性が、０．１％であることが決定された。同様に、加工サンプルが、対で混合されるか、又はグループで混合される場合、各々及び全ての場合で検出された。このコード化された研究により、本アッセイが、スクリーニングアッセイの機能を実行できるということが示された。このアッセイを完全に検証するために、多くのサンプルがスクリーニングされた。
【００８７】
【表４】
【００８８】
５種の個々の動物特異的アッセイの全ては、０.００１％及び０.０１％レベルで含まれた肉骨粉サンプルを検出することができないが、０.１％で含まれた場合に肉骨粉サンプルを検出することができた。このコード化された試験は、動物特異的アッセイの各々の正確性を確立した。存在する種と、各動物特異的アッセイにより検出された種との間のかなり良好な相関が存在した。しかしながら、ウシ及びブタアッセイの両方が、１の偽陽性の結果をもたらした。つまり、このアッセイは、ヒツジ及びトリ原材料のみを含むサンプルを陽性として同定してしまった。この試験において確認される検出限界は、他のＰＣＲ法を用いて他の発見に一致した(Kusamaら、2004, J. Food Protection 67: 1289-1292; Toyodaら、2004, J. Food Protection 67:2819-2832)。０.０５％のレベルは、リアルタイムＰＣＲを用いて、ウシＭＢＭ中で、ウシ特異的原材料の検出できることが確認された(Rensenら、2005、上記)。出願人は、単一の混合物においてのみならず、加工原材料を含むサンプルの混合物(ＤＮＡテンプレートに比べて飼料汚染の実際の状況を示す状況(例えば、Lahiffら、2002, J. Food Protection 65: 1158-1165; Dalmassoら、2004, Mol. Cell Probes 18: 81 - 87))においても特異的原材料について０.１％の検出限界を示した。さらにこのコード化試験により、動物特異的アッセイが、同定の機能を実行することができるということを示した。これらのアッセイを完全に検証するために、多くのサンプルを用いた。
【００８９】
ＵＫにおいて多くの植物及び動物飼料製造業者が存在するが、様々な供給業者の動物飼料の組成は、現在の規制の下許容される様々な成分を含む。その結果、正確かつ持続可能な基準を決定するための努力において、様々なこれらの複合飼料を試験することが必須であると考えられている。サンプルが陰性であると決定するためにＥＬＩＳＡ技術が使用された(上の記載を参照のこと)。６０の陰性動物飼料を、スクリーニングアッセイを用いて試験した。動物飼料の圧倒的大部分(５２)は、出願人のスクリーニングアッセイを用いて陰性であった(Ｃｔ＞３５及び／又はΔＲｎ＜０.５)。しかしながら、リアルタイムＰＣＲを用いて陽性となるサンプルが幾つか存在した。ＥＬＩＳＡ法が最大１３０℃に加熱されたサンプルにおいてうまく機能するということが知られている。加工温度がこの値を超えて増加するにつれ、ＥＬＩＳＡの感度が低下する。それゆえ、これらのサンプルの幾つかが１３０℃を超えた温度に加熱されたという可能性がある。２つの方法のあいだにおける相違についてのほかの可能な説明は、感度の差異である。ＥＬＩＳＡは、０.５％の包含レベルで加工された動物原材料を検出することが測定されている一方、本願のリアルタイムアッセイは、０.１％の包含レベルでサンプルを検出する。
【００９０】
当該スクリーニングアッセイにより陽性であるサンプルを、ＥＬＩＳＡを用いて陰性である幾つかのサンプルとともに顕微鏡分析(ＥＵにおいて認められた動物飼料中の動物原材料を検出するための唯一の技術)を用いたさらなる分析にかけることによりさらに調査した。顕微鏡分析の結果は表５に示される。
【００９１】
【表５】
【００９２】
顕微鏡分析結果は、３つのカテゴリー：陰性、陰性＊、及び筋繊維に分類された。陰性とマークされたサンプルは、完全に陰性である。陰性＊とマークされたサンプルは、加工原材料については陰性であるが、ミルク粉末、つまり許容される製品を含む。最後のカテゴリーは、これらのサンプルにおける筋繊維の存在を示すが、その繊維の起源、つまり種は不明である。
【００９３】
顕微鏡分析に供された１２のサンプルのうち、スクリーニングアッセイは４つのサンプルが陰性であると示した一方、顕微鏡分析は５つのサンプルが陰性であると示した。サンプル１３、２２、及び３６では、顕微鏡分析及びスクリーニング法は、同じ結果を与えた。サンプル２は、スクリーニングアッセイでは陰性であったが、顕微鏡分析において筋繊維が観察された。この場合、繊維は異なる種、トリ(鶏)、ウシ、ヒツジ、魚及びブタ由来であり、スクリーニングアッセイによって認識されるものと知られている。サンプル９と１５は、スクリーニングアッセイでは陽性であったが、顕微鏡分析では陰性であったが、ミルク粉末の存在が観察された。ミルク粉末は、認可された添加物であり、そして出願人のスクリーニングアッセイでは陽性として検出された。
【００９４】
残りのサンプル１４、３３、３４、４２、４９、及び５７は、本スクリーニングアッセイでは陽性であり、顕微鏡分析により筋繊維の存在が確認された。これらの筋繊維の由来元の種についての疑問を解決する試みにおいて、出願人は、個別の動物特異的アッセイ、つまり検査された各々の種を検出するように設計されたアッセイを用いることにより、これらのサンプルをさらなる分析にかけた。これらのサンプルのうち４つが、ヒツジ、ウシ、トリ(鶏)、及びブタに対して陰性であったが、魚に対して陽性であることがこの結果から確認された。その結果、これらの筋繊維が、魚に由来する可能性が極めて高い。残りのサンプルは、ヒツジ、ブタ、トリ(鶏)及び魚について陰性であるが、ウシ原材料に対して陽性であった。本スクリーニングアッセイは、ミルク粉末及び筋繊維を検出し、そして個別の動物特異的アッセイは、原材料の由来元を同定した。魚肉を反芻動物に与えることは、２０００年からＥＵにおいて禁止されたので、種特異的同定は重要である。現存のスクリーニング技術(ＥＬＩＳＡ)は、これらのサンプルの幾つかの検出に失敗した。
【００９５】
このアッセイを完全に検証するために、大規模ＤＮＡ抽出法を用いて多くのサンプルを試験した。開始物質の量の増加は、サンプルに見られた構成物質のよりよい提示を可能にする。スクリーニング及び動物特異的アッセイは、スクリーニング及び動物特異的アッセイにおいて標的遺伝子(１６ｓ ｒＲＮＡ)の検出に影響を与えないことが示された内部陽性対照を含んで、検証された(結果は示されていない)。全部で８７２のサンプルを、スクリーニングアッセイを用いて分析した。陰性飼料は、５の異なる市販動物飼料から得られた２８６のサンプルで構成される。サンプルはＥＬＩＳＡ及びＭＡＴにより前もってスクリーニングされて、禁止された動物原材料を含まないということが確認された。市販の陰性飼料に既知量の特定の動物原材料を加えることにより、陽性サンプルを作成した。
【００９６】
２８６の陰性飼料サンプルのうち、２７２は陰性であると正しく同定され、そして１４の偽陽性結果が得られた。これは、９５.１％の特異性であった。スクリーニングアッセイにより同定された偽陽性は、動物特異的アッセイで同定される可能性がある。０.２％及び１％動物原材料を陽性に添加された全てのサンプルは、正しく予測され、１００％の感受性を与えた。２％原材料を添加された陰性サンプルのうち、１つは、陰性であると誤って予測され、９９.６３％の特異性を与えた。この結果を表６に要約して示す。
【００９７】
【表６】
【００９８】
スクリーニングアッセイにより試験された８７２のサンプルのうち、２７３は、陰性と同定され、全部で５９９のサンプルが陽性とみなされた。これらの５９９の陽性サンプルは、動物特異的アッセイを用いてさらに分析された。これらの結果は、表７に要約される。
【００９９】
【表７】
【０１００】
本スクリーニングアッセイを用いて分析された８７２のサンプルのうち、８５７は正しく予測され、これは全体として９８.２％の正確性を与えた。添加サンプル５８６のうち５８５は、陽性であると同定された。０.２％レベルで添加された全てのサンプルは、動物特異的アッセイを用いて正しく同定された。この０.２％レベルでの１００％の特異性は、このレベルの汚染原材料を含むサンプルが同定されるという強力な証拠を提供する。スクリーニングアッセイは、現在使用される現存のスクリーニングＥＬＩＳＡに比べて信頼が置け、より感受性が高く、堅牢かつ安価な代替を提供し、そして場合により動物特異的アッセイと合わせて、動物同定の価値ある方法であると証明されうる。
【０１０１】
実施例２
実施例１の結果に基づき、出願人は、動物飼料中の加工された動物原材料から得たＤＮＡの検出のための以下の操作手順(ＯＰ)を提案する。
【０１０２】
導入
ＯＰの目的／範囲
このＯＰは、感受性リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて加工された動物飼料からのＤＮＡの存在について動物飼料を試験する詳細な研究室プロトコルを提供する。本試験は、４つの主要な段階：ａ)ＤＮＡ抽出のためのサンプル調製、ｂ)プレート調製、ｃ)ＰＣＲ反応、ｄ)データ処理及び結果の解釈を有する。
【０１０３】
背景情報
欧州共同体広域飼料制御(ＴＳＥ規則(イングランド)を通して実施されている)は、食品生産のために維持され、肥育され、又は飼育される動物に加工動物タンパク質を与えることを禁止した。ＢＳＥを根絶し、そしてヒト型のＣＪＤを予防するために、動物飼料における動物タンパク質の使用の禁止が施行されている。現在の法律を実行するために、動物飼料、特に反芻動物飼料中に禁止タンパク質を検出することができることが必須である。形態に基づき温度に安定な固体構造の分析を通した動物原材料の同定に関する顕微鏡分析は、現在、動物飼料中の動物起源の構成物質を検出するための欧州共同体に認められた唯一の公的方法である。
【０１０４】
ＰＣＲに基づく技術における標的として動物ＤＮＡを使用することは、現在の試験にサポートを提供する。なぜなら、ＤＮＡはタンパク質よりも加工温度に対してより抵抗性であるからである。この技術は、１６ｓ ｒＲＮＡミトコンドリアＤＮＡ標的配列の一部を増幅するためにリアルタイムＰＣＲを使用し、生成された任意のアンプリコンを分析する。
【０１０５】
方法に関与する原理
ＤＮＡは、４０ｇの飼料サンプルから抽出される。飼料サンプルは、加熱ステップを用いてリン酸緩衝液中で脱ペレット化され、そして次に、サブサンプルは、Ｃｈｅｌｅｘレジンで処理される。混合物をボルテックスし、遠心し、そしてＤＮＡを含む上清の一定量を試験に用いた。サンプルＤＮＡを、試験プレート中に緩衝液、プライマー、プローブ、ｐＵＣ１８及びポリメラーゼ酵素を含むマスターミックスに入れた。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ７９００配列検出器で行った。システムは、標的がＰＣＲ反応の間に増幅されるならば蛍光をもたらす。蛍光は、ＰＣＲプレート中で直接検出され、そして結果を、蛍光シグナルの強度に基づいて計算される。特異的プライマー及び異なる蛍光プローブを有する内部対照ＤＮＡを用いて、増幅の抑制が存在するかを評価するために用いる。Ｃｔ(閾値)は、その反応の間で各サンプルについて計算し、そして対照サンプルのＣｔ値に基づきプレート毎に定めたカットオフレベルに比べられる。
【０１０６】
材料
説明とソフトウェア
ＡＢＩ ＳＤＳ ソフトウェア、バージョン２.０又はそれ以降。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイシート(製品説明書を参照こと)。
【０１０７】
化学物質及び試薬
リン酸緩衝液、ｐＨ７.２＋０.１(０.１Ｍ)、
溶液Ａ：１リットルの蒸留水に溶解された１４.２ｇのオルトリン酸水素二ナトリウム(無水)、
溶液Ｂ：１リットルの蒸留水に溶解された１５.６ｇのオルトリン酸水素ナトリウム(二水和物)、
７２０ｍｌの溶液Ａを２８０ｍｌの溶液Ｂと混合し、ｐＨが７.２＋０.１であることをチェックする(ハイスループット用に、さらに多くの量を調製できるが、７日を超えて貯蔵すべきではない)。
特性がバッチ間で、及び製造業者間で変化することがあるので、各新たなＴａｑＭａｎ試薬を評価すべきである。新たなバッチのＰＣＲマスターミックス成分(試薬、プローブ、又はプライマー)は、一回で導入すべきであり、そして目的についての適合を測定するために試験される。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスが現在使用されている。他の供給業者からの同等の試薬であって、この目的に適合することが示された試薬が使用されてもよい。
ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ(Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ４１５４)、
ＤＮＡ及びＲＮＡフリーと保障された分子生物学品質の水(Sigmaカタログ番号Ｗ４５０２)、
ＨＰＬＣ精製された特異的及び対照プライマー、上記表１及び２を参照のこと。
【０１０８】
対照サンプル
陰性対照：等量の菜種、大豆、ひまわり及びとうもろこしを含む陰性飼料ストック。成分がＧＡＦＴＡにより供給される。
陽性対照：Prosper de Mulder により供されるウシ、ヒツジ、ブタ、及びトリ組織。英国水産業会により供される魚組織。
【０１０９】
装置
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ １９００ＨＴ配列検出装置及びＰＣ、
４０ｇ±５ｇのあいだで計測可能な電子天秤(０〜３ｋｇ)、
０.２ｇ±０.０２ｇのあいだで計測可能な電子天秤(０〜１００ｇ)、
マイクロチューブを１３０００ｒｐｍ(１１０００×ｇ)でスピンさせることができる固定ローターを備える遠心機、
９６ウェルプレートをスピンさせるための遠心機(２０００ｒｐｍ[７００×ｇ])、
０.１〜１０００μｌの体積を正確に文中することができる調節可能な一連の単一チャネルピペット、
１〜１０μｌの範囲のマルチチャネルピペット、
層流キャビネット又はクラスＩＩ安全キャビネット、
大気圧で９５℃±４℃で実行可能なオートクレーブ、
-１８℃未満のフリーザー、
ボルテックスミキサー。
【０１１０】
消耗品
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ光学カバー圧縮パッド(Applied Biosystems)、
ＡＢＩ 粘着カバー(Applied Biosystems)
光学９６ウェル反応プレート(Applied Biosystems)
ピペッター用のフィルタ-バリアーチップ(ＶＷＲ)
滅菌遠心管、０.６〜１.７ｍｌ(Ａｌｐｈａ Ｌａｂｓ又は他の評判のよい供給業者)
滅菌プラスチック製ビジョー(bijoux)(ＶＷＲ)
オートクレーブ可能なコンテナ(１ｌ体積)
適切なサイズの計測シリンダー
【０１１１】
方法
サンプル同定及び取り扱い
参照番号と受託日の固有の組み合わせにより各提出を同定する。サンプルの取り扱いは、関連の安全のための手順に従うべきである。
【０１１２】
サンプル調製
４０±５ｇのサンプルに、３６０ｍｌの０.１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７.２±０.１を加えた。オートクレーブに適した容器内にて室温で１５分間浸漬した。９５±５℃で１５分間オートクレーブした。０.２±０.０２ｇのＣｈｅｌｅｘを計量して１.７ｍｌマイクロ遠心チューブに入れた。オートクレーブからサンプルを取り出し、そして液面の下約１ｃｍのところから１ｍｌの上清を抽出した。Ｃｈｅｌｅｘを含む遠心チューブに移した。
【０１１３】
最大速度で２０秒間ボルテックスした。サンプルを１３０００ｒｐｍ(１１０００×ｇ)で１０分±６０秒間サンプルを遠心した。１０μｌの上清を取り除き、そして９０μｌの分子実験品質の蒸留水を加えた。抽出物をすぐに用いるか、又は試験前において-１８℃未満に保持した。
【０１１４】
ワーキング溶液の調製
プライマー：オリゴヌクレオチド(オリゴ)プライマーを、一定量のストック溶液を形成し、そして貯蔵するため、再構成及び希釈を必要とする凍結乾燥ペレットとして提供する。
【０１１５】
生物学的品質の水中にオリゴペレットを溶解して、１００μＭの溶液を与えた。ボルテックスによりよく混合し、そして室温で２分間静置し、再び混合した。
【０１１６】
０.６ｍｌマイクロ遠心チューブに５０μｌ又はそれ未満の量に100μＭのプライマーを分注した。プライマーにラベルを付し、そして-１８℃未満で貯蔵した。
【０１１７】
プローブ：プローブを１ｍｌ生物学的品質の水に再懸濁した。５０μｌの一定量を０.６ｍｌのマイクロチューブに分注し、ラベルを付し、そして-１８℃未満で貯蔵した。
【０１１８】
ｐＵＣ１８：ｐＵＣ１８ストックを１／１５０００に希釈した。５０μｌの一定量を０.６ｍｌマイクロ遠心チューブに分注し、ラベルを付し、そして-１８℃で貯蔵した。
【０１１９】
水：２５ｍｌのユニバーサルに分注し、そして室温で貯蔵した。
【０１２０】
陰性及び陽性対照の調製
陰性対照：４０ｇ±５ｇの陰性飼料ストックを上に記載されるように処理し、そしてＣｈｅｌｅｘ抽出物を回収する。この陰性対照は、すぐに使用できるか、又は-１８℃で１年間貯蔵されうる。陰性対照物質の新たなバッチは、目的に対する適合を確立するため古いバッチと平行して試験されるべきである。
【０１２１】
陽性対照(０.２％)：４０ｇ±５ｇの陰性飼料ストックを０.０８ｇのウシ／ブタ／ヒツジ／トリ／魚肉骨粉を個別に添加し、そして上に記載されるように処理し、そしてＣｈｅｌｅｘ抽出物を回収した。陽性対照は、すぐに使用できるか、又は-１８℃で１年間貯蔵されてもよい。新たな陽性対照原材料のバッチは、目的に対する適合を確立するために、古いバッチと平行して試験されるべきである。
【０１２２】
ＰＣＲマスターミックスの調製
アッセイに依って、必要とされるプライマーとプローブ濃度を計算し、そして使用される試験の数(ウェル)依存した合計体積を調節する。一定量のプライマー、プローブ、ｐＵＣ１８及びＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックスを冷蔵庫／冷凍庫からとり、そして室温に達しさせた。軽くチューブをタップして内容物をチューブの底に落とした。クリーンルーム安全キャビネット内で作業し、各試薬の必要とされる体積を７ｍｌのＢｉｊｏｕｘにピペットで移した。この時点でｐＵＣ１８を加えてはならない。研究室に戻り、そして必要とされる量ｐＵＣ１８を加える。全ての試薬が加えられたら、マスターミックスを５〜１０秒間ボルテックスした。
【０１２３】
ＴａｑＭａｎプレートのセットアップ
一般的スクリーニングアッセイでは、１以上のプレートを幾つかのテンプレートを含まない対照(ＮＴＣ'ｓ)、トリ組織を除いた各組織タイプについて少なくとも１の陽性対照についての反応液を含むように１以上のプレートを設定し、当該プレートは、少なくとも６の反応液、陰性対照、及び試験されるサンプルを有すべきである。種特異的アッセイでは、上と同じレイアウトを使用すべきであるが、標的種についての少なくとも６の陽性対照反応液は、Ｃｔカットオフ値を計算するために含められる。
【０１２４】
２３μｌのマスターミックス(上を参照のこと)を、９６ウェルの光学反応プレートの各ウェルに加えた。２μｌの適切なサンプルＤＮＡ又は対照ＤＮＡを９６ウェルプレートに加える。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ光学粘着カバー及びシールでプレートを覆った。プレートを２０００ｒｐｍ(７００×ｇ)で３秒間遠心して、ウェルの内容物を落とし、そして空気の泡を取り除いた。空気の泡が存在する場合、遠心を繰り返した。
【０１２５】
ＴａｑＭａｎアッセイの実施
ＰＣＲプレートをＡＢＩプリズム７９００に配置し、そしてサイクルを実行する。サイクル条件は以下のとおりである：５０℃で２分間、続いて９５℃で１０分間、（９５℃で１５秒間及び５３.６℃で１分間）を４０サイクル。製品説明書及び研究室の手順にしたがってデータを分析した。
【０１２６】
分析結果
習熟した技師のみが、結果を分析しそして解釈すべきである。データを観察及び分析するために利用できる多くのソフトウェアオプションが存在する。
【０１２７】
内部対照ｐＵＣ１８のＣｔ値は、反応が成功したか又はポリメラーゼ阻害剤の存在により阻害されたかを指し示す。許容される範囲(２４.５サイクル〜１１.９サイクル)からはずれたＣｔ値は、阻害を示し、そして問題のサンプルを再テストすべきである。続いて生じる試験が、許容される範囲からはずれた内部対照値を生成するならば、結果は決定的ではないものとして記録されるべきである。ＮＴＣ増幅が、３９〜４０の間のＣｔ値を有するべきである。蛍光が生じる場合、蛍光はプローブの熱変性のため生じ、そして試験は繰り返されるべきである。
【０１２８】
一般的なスクリーニングアッセイでは、ウシ、ヒツジ、及びブタＤＮＡに比べた場合に、トリＤＮＡは最も高い閾値サイクルを有し、その結果６個のトリ陽性対照Ｃｔ値は、このアッセイについてのカットオフ値を生成するために使用される。６ウェルの平均±３の標準偏差(ＳＤ)が、カットオフ値を計算するために使用される。この値未満又はこの値に等しいＣｔ値を生成するサンプルが陽性であると記録される。このカットオフ値よりも高いＣｔ値を有するサンプルは、陰性と記録される。
【０１２９】
特異的アッセイでは、種得意適用性対象について使用された６ウェルのＣｔ値が、カットオフ値を決定するために使用される。６ウェルの平均±３の標準偏差(ＳＤ)が、カットオフ地を計算するために使用される。この値より低いか又はこの値に等しいＣｔ値を生成するサンプルは、陽性であると記録される。このカットオフよりも高いＣｔ値を有するサンプルは陰性であると記録される。
【０１３０】
本発明が好ましい又は例示的な実施態様を参照して記載されたが、当該態様に様々な主食及び変更が、本発明の本質及び範囲から逸脱することなくなされうるということが当業者により認識され、そしてこのような変更は、明らかに本明細書において考慮されている。本明細書に開示され、そして添付の特許請求の範囲に記載された具体的実施態様に関して制限がないことが意図されるか、又は推測されるべきである。
【０１３１】
本明細書に引用された全ての文書は、本明細書が各参考文献について具体的に言及されているか否かにかかわらず、その全てが本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に飼料における動物組織のタイプ、例えば、加工動物タンパク質(ＰＡＰ)又は肉骨粉(ＭＢＭ)の検出及び識別に関わる方法、キット、及び核酸に関する。
【０００２】
感染性海綿状脳症は、ヒトにおけるクル及びクロイツフェルトヤコブ病(ＣＪＤ)、ヒツジにおけるスクレイピー、ミュールジカ及びヘラジカにおける伝染性ミンク脳症及び慢性消耗病を含む稀で致死的かつ伝染性の神経変性疾患の群である。ウシ海綿状脳症は、１９８６年にイギリス(ＵＫ)で認知され、そして世界中の少なくとも２６の国において現在見つかっている。これは、世界的な農業の問題であるばかりでなく、ヒトの健康に対する潜在的な脅威として考えられている。
【０００３】
高温で処理され、そして肉骨粉(ＭＢＭ)として知られている加工された動物組織は、家畜動物の栄養補助飼料、特に泌乳動物及び成長の早い動物に必須アミノ酸を供給するタンパク質補助飼料として使用されてきた。肉骨粉は飼料として直接使用されるか、又は動物飼料の成分として使用することができた。さらに、事故による暴露は、取り扱いの様々な段階での相互汚染のため生じ得た。ＢＳＥは、過度の飼育習慣、つまり反芻動物の動物タンパク質のリサイクル、の結果として伝染病に発達し、そしておそらく１９７０年代の始めにおける新たな原因、おそらくは遺伝子突然変異の結果として疾患を発達させたウシ又は他の動物に由来する。ＢＳＥの症例は、ＢＳＥに感染したウシのリサイクルの結果であった。ＢＳＥの病原物質は、ＭＢＭに広がった。
【０００４】
反芻動物の食物連鎖にＭＢＭが混入することを避けるために、反芻動物原材料(例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、又はシカ由来のもの)を他の反芻動物に与えることについての禁止令が英国で導入された(ウシ海綿状脳症令 1988年[SI 1988/1039]。この禁止令は、後に全ての家畜(魚及びウマを除く)に与える全ての哺乳動物タンパク質を含めるように、英国において拡張された(ウシ海綿状脳症(改正)令 1996年[SI 1996/962]))。反芻動物の飼料中に哺乳動物タンパク質を使用することを禁止する禁止令は、１９９４年に欧州連合(EU)に導入され、そして１９９７年に米国(USA)に導入された。２０００年から、欧州の禁止令は、食品生産に使用される全ての養殖された動物に与える哺乳動物、鳥類、及び魚由来のタンパク質を含めるように拡張された。
【０００５】
現在の法律を施行するために、動物飼料、特に反芻動物飼料において禁止タンパク質を検出することを可能とすることが必要とされる。飼料材料における骨断片の形態的同定に本質的に関する顕微鏡分析は、動物飼料における動物起源の構成成分を検出するために、現在ＥＵにおいて公式に認められた唯一の方法である。承認された顕微鏡分析試験(ＭＡＴ)プロトコルについての「飼料の公的制御についての動物起源の構成成分の決定のための分析方法」についての２００３年１２月２３日のＥＵ委員会命令２００３/１２６/ＥＣを参照のこと。顕微鏡分析は、動物構成物質の同定を可能にし、そして魚と陸棲生物、並びに哺乳動物と非哺乳動物物質との間の識別を可能にする。しかしながら、顕微鏡分析は経験を積んだ分析者を必要とし、液体サンプル上で使用できず、軟部組織を検出できず、そしてウシフラグメントの沈渣のために有機溶媒の使用を必要とする時間及び費用のかかる方法である。
【０００６】
動物組織を試験するために開発された他の方法は、酵素連結免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、近赤外分光法(ＮＩＲＳ)、近赤外顕微鏡法(ＮＩＲＭ)、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)及びリアルタイムＰＣＲを含んだ(Gizziら、2003、Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 22: 311-331の概説を参照のこと)。ＥＬＩＳＡは、抗体に基づく検出システムを介して種特異的抗原を同定することを目的としたものであり、骨の発見を必要とすることはない。ＥＬＩＳＡ法の欠点として、反芻動物生成物、例えば乳汁からの干渉、ゼラチンによる抑制、及び植物タンパク質などの他のタンパク質との相互反応性が挙げられる。ＮＩＲＳ及びＮＩＲＭは、大きな比較データベースの開発、及び高価な装置を必要とする。特に、ＮＩＲＳでは正確性が問題であった。ＮＩＲＳ、ＮＩＲＭ、及びＥＬＩＳＡ法は、最適範囲を超えた条件下で加工された原材料については、通常適切ではない。
【０００７】
ＰＣＲ技術は、理論上、分類群及び/又は種に特異的な核酸、特にデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)の同定を可能にする。初期の例は、Ｗａｎｇら(2000, Mol. Cell. Probes 14: 1-5)に提供され、当該文献は、未加工牛肉又はウシＭＢＭを入れたマウス飼料サンプルからの全ＤＮＡを抽出することを含む方法を記載する。０.２ｇの量のサンプルを、１％の界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を入れた２０％Ｃｈｅｌｅｘ１００(BioRad、Hercules、CA、USAから購入したキレートレジン、ＰＣＲ阻害剤として作用しうる金属イオンのコンタミを取り除くために使用された)の溶液中でインキュベートし、加熱し、冷却し、そして遠心し、そして上清を、ｔＲＮＡLysの３'部分、ＡＴＰａｓｅサブユニット８、及びＡＴＰａｓｅサブユニット６のアミノ末端部分をコードするウシミトコンドリアＤＮＡの２７１塩基対のＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅に用いた。筆者は、当該方法がより迅速、簡便、かつ一貫性であると述べた。
【０００８】
３７０塩基対のアンプリコンサイズを有する反芻動物特異的ミトコンドリアシトクロムｂ遺伝子プローブ及びプライマーに関するリアルタイムＰＣＲアッセイの例は、Ｒｅｎｓｅｎら(2005, Foodborne Pathogenes Dis. 2: 152-159; WO 2005/074522を参照のこと)により報告された。ウシ飼料からＤＮＡを抽出するためのサンプル前処理技術は、ウシ飼料において高レベルのＰＣＲ阻害剤の問題を解決するために開発された。当該技術は、１０ｇの混入飼料サンプルを細胞溶解緩衝液中でインキュベートし、細胞ライセートをWhatman FTA（登録商標）カードに適用し、続いて当該カードをＲＮＡｓｅで処理し、次にＢｉｏＲａｄ(Hercules, CA, USA)から販売されたＣｈｅｌｅｘ１００抽出キット(Instageneキット)を用いてＤＮＡを精製した。当該アッセイにより、市販のウシ飼料に混入された市販の加工済みＭＢＭコンタミ物質(０.０５％)を検出できたということが報告された。
【０００９】
１１７塩基対のミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ遺伝子断片の増幅に基づく他のリアルタイムＰＣＲアッセイは、Chiappiniらにより開発された(2005, J.AOAC Int. 88: 1399-1403)。Ｐｒｏｍｅｇａ(Madion, WI, USA)から販売された食品用のＷｉｚａｒｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ精製システムを用いて、１００ｍｇの加工ＭＢＭサンプルから全ＤＮＡを抽出した。これらのアッセイの特異性を、ウマ、トリ、七面鳥、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンチョビ、メカジキ、及びウシ原材料に由来するゲノムＤＮＡについて試験したが、リアルタイムＰＣＲシグナルは、ヤギ、ヒツジ、及びウシサンプルからのみ得られた。さらに、この筆者らは、このリアルタイムＰＣＲアッセイの性能が、試験されたＭＢＭを生産するために使用される処理条件により、及び組成の点におけるＭＢＭの変動性によりかなり影響を受け、そして適切な標準物質の製造を妨げ、そして飼料中のＭＢＭ含量の信頼の置ける定量を妨げた。
【００１０】
ＰＣＲ技術における幾つかの改善にかかわらず、ＥＵ「intercomparison study for the determination of processed animal proteins including meat and bone meal in animal study」(Gizziら、2004, J. AOAC Int. 87: 1334-1441)は、１７のＥＵに参画する研究所において行なわれたＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ試験から得られた多くの偽陽性及び偽陰性の結果により示されるように、全加工動物タンパク質(ＰＡＰ、ＭＢＭを含むもの)の決定、並びに哺乳動物、反芻動物、及びブタからのＰＡＰの識別に失敗したということを発見した。一般的なＰＣＲ技術の全ては、参加者により網羅され、例えばアガロースゲル電気泳動を伴った従来のＰＣＲ、ＰＣＲ-ＥＬＩＳＡ、及びリアルタイムＰＣＲを含んだ。サンプル調製は、オーダーメイド又はキット抽出との間で変更され、場合により推奨の粉砕ステップを含み、使用されたサンプルの量は５０ｍｇ〜８ｇで変えられた。ＰＣＲ法の全体の評価は、性能の点で「かなり悪く」、そして、任意のＰＣＲに基づく技術がＰＡＰ又はＭＢＭに対する信頼のおける堅牢な試験として使用される前に、既知のプロトコルの主要な改良が必要とされるということが結論付けられる。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、ＰＡＰ又はＭＢＭにおける動物組織についてのＰＣＲに基づく試験に関連する問題に取り組み、そして代替となるＤＮＡ抽出法、及びＰＣＲに基づく同定技術を提供する。
【００１２】
本発明の第一の態様では、以下のステップ：
(ｉ)インキュベート緩衝液中に約３０〜２５０ｇ、例えば約３５〜４５ｇ、又は約４０ｇのサンプルをインキュベートし；
(ｉｉ)ステップ(ｉ)でインキュベートされたサンプルをオートクレーブし；そして
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)でオートクレーブされたサンプル又はサンプルの一部を、金属キレート剤と混合する
を含むサンプルからの核酸(例えばＤＮＡ)を抽出する方法が提供される。金属キレート剤は、例えば、金属キレートイオン交換レジンでありうる。
【００１３】
本方法は、以下のステップ：
(ｉｖ)金属キレートイオン交換レジンなどの金属キレート剤を、上記ステップ(ｉｉｉ)のサンプル又はその一部から沈渣して、抽出された核酸を含む上清を生成する
をさらに含み得る。
【００１４】
本発明に従った抽出方法は、例えばＰＣＲ及び/又はリアルタイムＰＣＲなどの反応における増幅のためにテンプレートとして機能するために十分な質及び量の核酸を提供する。本発明は、このような増幅反応の再現性及び正確性がかなり優れているということを発見した(以下を参照のこと)。他の従来の抽出技術と比べて、本方法は、簡便かつ効果的な方法である。
【００１５】
本方法において使用するサンプルの適切な量は、約３０〜約２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、又は５０ｇである。
【００１６】
１の実施態様では、インキュベート緩衝液は、約０.０５〜０.２Ｍ又は約０.１Ｍの濃度のリン酸緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液でありうる。
【００１７】
インキュベート緩衝液は、サンプルの重量の約５００〜１５００％(ｖ/ｗ)、例えばサンプル重量の約９００％(ｖ/ｗ)で使用されてもよい。
【００１８】
インキュベート緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液は、約６.５〜７.５、又は約７.２のｐＨを有しうる。
【００１９】
インキュベートは、約５〜６０分、又は約１０〜３０分、例えば約１５分行なわれうる。
【００２０】
サンプルはステップ(ｉｉ)において、約８５℃〜１２０℃、又は１２１℃、又は約９０℃〜１００℃、例えば約９５℃でオートクレーブされうる。オートクレーブステップは、１分を超えて、例えば約５〜６０分、又は約１０〜３０分、例えば約１５分間続けられることもある。
【００２１】
オートクレーブステップは、(滅菌に使用される高圧ではなくむしろ)大気圧で又は大気圧付近で行なわれ得る。大気圧又はその付近でのオートクレーブは、抽出されたＤＮＡなどの核酸の破壊を低減するであろう。
【００２２】
本明細書に使用される場合、「大気圧付近」は、大気圧の約５０〜１５０％の圧力、例えば、大気圧の約８０〜１２０％、又は９５〜１０５％を意味する。
【００２３】
１の実施態様では、オートクレーブステップは、大気圧で１５分間９５℃で行なわれる。
【００２４】
特に、動物サンプルが使用される場合、オートクレーブステップは、サンプルのペレットを崩し、及び/又は脂肪を破壊し(つまり、飼料ペレットを結合させるために一般的に使用される脂肪及び獣脂を可溶化し)、そして核酸を遊離させるように機能する。
【００２５】
イオン交換レジンなどの金属キレート剤は、多価金属イオンをキレートすることもある。レジンは、対となるイミノジアセテートイオンを含むスチレンジビニルベンゼンコポリマー、例えばＣｈｅｌｅｘ１００であってもよい。
【００２６】
金属キレートイオン交換レジンなどの金属キレート剤は、本方法のステップ(ｉｖ)において遠心、例えば約１０,０００〜１２,０００×ｇ、又は約１１,０００×ｇでの遠心、により沈渣されうる。
【００２７】
サンプルは、動物飼料、例えば反芻動物飼料に由来することもある。
【００２８】
当該サンプルは、加工された動物原材料、例えば加工動物タンパク質(ＰＡＰ)又は肉骨粉(ＭＢＭ)を含むか、又はその存在について試験されうる。
【００２９】
サンプルは、動物又は反芻動物ミトコンドリアＤＮＡ、例えば１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアＤＮＡを含み得る。
【００３０】
１の態様では、サンプルは、動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚からなる群の１以上からのＤＮＡを含む。
【００３１】
本明細書に使用される動物という語句は、任意の脊椎動物を指す。動物は、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、トリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ネコ及びイヌ)並びに非家畜動物(例えば、エルク、シカ、トナカイ及びキリン)を含む。動物は、魚などの水棲生物も含む。
【００３２】
本発明のさらなる態様では、サンプルが動物飼料である上に記載される方法は、以下のステップ：
(ｉ)約７.１〜７.３のｐＨの０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で、約３５〜４５ｇのサンプルを約１０〜２０分、例えば約１５分、場合により室温でインキュベートし；
(ｉｉ)ステップ(ｉ)でインキュベートされたサンプルを、大気圧で、又はその付近で、約９０〜１００℃で約１０〜３０分間、例えば約１５分間オートクレーブし；そして
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)でオートクレーブされたサンプルの一部を、金属キレートイオン交換レジン、例えばＣｈｅｌｅｘ１００と混合する
を含みうる。
【００３３】
上記方法はさらなるステップ：
(ｉｖ)ステップ(ｉｉｉ)のサンプルの一部から、約１００００〜１２０００×ｇ、又は約１１０００×ｇで遠心することにより、レジンを沈渣する
を含みうる。
【００３４】
本発明の方法のステップ(ｉｖ)から得た上清又はその一定量を、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、又は以下に言及される別の増幅反応などの増幅反応において使用されうる。
【００３５】
本発明の方法は、以下のステップ：
(ｖ)核酸、例えばミトコンドリアＤＮＡなどのＤＮＡの有無を検出する
をさらに含み得る。
【００３６】
核酸は、加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭに由来する可能性がある。
【００３７】
核酸は、増幅反応(例えばＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ)を用いて、ステップ(ｖ)において検出されることもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本明細書に使用される「増幅反応」という語句は、テンプレート核酸のコピーの増加をもたらす酵素反応を指す。本発明の範囲内の増幅反応としては、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ(ＲＲＴ-ＰＣＲ)、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)、ストランド置換増幅(ＳＤＡ)、転写媒介性増幅、核酸配列に基づく増幅(ＮＡＳＢＡ)、ローリングサイクル増幅(ＲＣＡ)、及び分岐ＤＮＡシグナル増幅(ｂＤＮＡ)が挙げられる。
【００３９】
１の態様では、シグナルシステムは、増幅反応の後に残っているサンプル又はサンプルの一部において増幅されたＤＮＡを検出するために使用される。このようなシグナルシステムは、様々な性質に基づいていてもよいが、特に、蛍光、化学発光、又は生物発光である化学的シグナルを生成する。シグナルシステムは、増幅が行なわれるか又は行なわれた反応容器を開けることなく、均一に検出することができるシステムであってもよい。
【００４０】
このようなシグナルシステムは、例えば、溶液中で遊離状態で存在した場合に比べて、二本鎖ＤＮＡに結合された場合に異なりかつ区別される可視光を放出するＤＮＡ結合剤などの可視的シグナル試薬を含んでもよい。このような色素の例は、周知であり、そしてエチジウムブロマイド、並びにＳＹＢＲの商標名で売られている試薬、例えばＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ又はＳＹＢＲＧｏｌｄ、又は他の色素、例えばＹＯＰＲＯ-１などが挙げられる。このような試薬からのシグナルによって示される有意又は多量のＤＮＡの存在は、増幅反応が進行したことを指し示すことができる。
【００４１】
或いは、又はさらに、シグナルシステムは、増幅産物に特異的に結合する標識プローブを含んでもよい。標識は、適切に蛍光標識されており、適切な波長の光を照射した後に検出でき、それに続き当該標識からの結果として生じる発光を検出することができる。様々な蛍光ラベル、例えばローダミン色素、フルオレセイン、及びシアニン色素が市販されている。フルオロフォアのさらなる例として、非限定的に、フルオレセイン、イソチオシアン酸塩、フルオレセイン・アミン、エオシン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン(umbelliferone)、５-カルボキシフルオレセイン、６-カルボキシフルオレセイン(ＦＡＭ)、２',４',１,４,-テトラクロロフルオレセイン(ＴＥＴ)、２',４Ｉ,５',７',１,４-ヘキサクロロフルオレセイン(ＨＥＸ)、２７'ジメトキシ-４'５'-ジクロロ-６-カルボキシフルオレセイン(ＪＯＥ)、ローダミン、６カルボキシローダミン(Ｒ６Ｇ)、Ｎ,Ｎ,Ｎ'Ｎ'-テトラメチル-６-カルボキシローダミン(ＴＡＭＲＡ)、６-カルボキシ-Ｘ-ローダミン(ＲＯＸ)、４-(４'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(ＤＡＢＣＹＬ)、５-(２'-アミノエチル)アミノナフタレン-１-スルホン酸(ＥＤＡＮＳ)、４-アセトアミド-４'-イソチオシアナトスチルベン-２,２'ジスルホン酸、アクリジン、アクリジン・イソチオシアネート、ｒ-アミノ-Ｎ-＞３-ビニルスルホニル)フェニル！ナフタルイミド-３,５,ジスルホネート(Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ)、Ｎ-(４-アニリノ-１-ナフチル)マレイミド、アンスラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、７-アミノ-４-メチルクマリン、７-アミノ-４-トリフルオロメチルコウルアリン(7-amino-4-trifluoromethylcouluarin)(Coumaran 151)、シアノシン、４',６-ジアミニジノ-２-フェニルインドール (ＤＡＰＩ)、５',５''-ジアミニジノ-２-フェニルインドール(ＤＡＰＩ)、５',５''-ジブロモピロガロール-スルホネフタリン(Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ)、７-ジエチルアミノ-３-(４'-イソチオシアナトフェニル)-４-メチルクマリン・ジエチレントリアミン・ペンタアセテート、４,４'-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン-２,２'-ジスルホン酸、４,４'-ジイソチオシアナトスチルベン-２,２'-ジスルホン酸、４-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-４'-イソチオシアネート(ＤＡＢＩＴＣ)、エオシン・イソチオシアネート、エリスロシンＢ、エリスロシン・イソチオシアナート、エチジウム、５-(４,６-ジクロロトリアジン-２-イル)アミノフルオレセイン(ＤＴＡＦ)、ＱＦＩＴＣ(ＸＲＩＴＣ)、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４-メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラロサニリン、フェノールレッド、Ｂ-フィコエリトリン、ｏ-フタルジアルデヒド、ピレン、ピレンブチレート、サクシニミジル１-ピレンブチレート、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ４(Ｃｉｂａｃｒｏｎ.ＲＴＭ.ブリリアントレッド３Ｂ-Ａ)、リッサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体、(テキサスレッド)、テトラメチル ローダミン、テトラメチル ローダミンイソチオシアネート(ＴＲＩＴＣ)、リボフラビン、ロソリン酸、テルビウムキレート誘導体、Ｃｙ５及びＣｙ５.５が挙げられる。
【００４２】
１の態様では、シグナルシステムは、レポーターとクエンチャー標識の組み合わせを含む。本発明において使用されうるドナー/クエンチャー対の例は、それぞれＦＡＭとＴＡＭＲＡ、ＶＩＣとＴＡＭＲＡ、ＦＡＭとＪＯＥ、ＦＡＭとＲＯＸ、ＦＡＭとＤＡＢＣＹＬ、フルオレセインとテトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳとフルオレセイン、ＥＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬ、フルオレセインとフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬとＢＰＤＩＰＹ ＦＬ、ＦＡＭとＱＳＹ９と組み合わせたＱＳＹ７色素である。他の適切なドナー/クエンチャー対と、プローブの組み合わせは、当業者により理解され、また通常の方法を用いて決定することができる。生成したシグナルは、任意の慣用検出装置、例えば蛍光分光計などの光学システムを用いて読み取ることができる。
【００４３】
当業者により理解されるように、増幅反応は、標的核酸の増幅に必須である試薬を含む。このような試薬として、オリゴヌクレオチドプライマー、緩衝液、核酸ポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、及びでオキシヌクレオチドトリホスフェート(ｄＮＴＰ)が挙げられ得る。
【００４４】
一般的なＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ技術については、例えば「PCR primer: A Laboratory Manual」(2003, Dieffenbach & Dveksler, Eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)を参照のこと。当該文献は本明細書に援用される。
【００４５】
本発明の別の態様では、サンプル中でＤＮＡを増幅する方法であって、以下のステップ：
(ｉ)本明細書に規定される本発明の方法に従ってサンプルからＤＮＡを抽出し；そして
(ｉｉ)ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲなどの増幅反応を用いて、抽出されたＤＮＡを増幅する
を含む、前記方法が提供される。
【００４６】
上記ステップ(ｉｉ)で増幅されたＤＮＡは、加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭに由来してもよい。
【００４７】
ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲは、プライマー対を使用し、そしてリアルタイムＰＣＲの場合、さらにプローブを使用し、ここで当該プライマー及びプローブは、以下の：動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚組織のうちの１以上に特異的である。
【００４８】
プライマー及びプローブの対は、動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚組織からなる群の１以上に由来するミトコンドリアＤＮＡ、例えば１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアＤＮＡに特異的でありうる。
【００４９】
プライマー及びプローブの対は、それぞれ、以下の：配列番号１、２、及び３(動物特異的)、配列番号４、５、及び６(ウシ特異的)、配列番号７、８、及び９(ヒツジ特異的)、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれうる。
【００５０】
プライマー及びプローブの対は、ブタ、トリ、及び魚組織からなる群の１以上に由来するミトコンドリアＤＮＡであって、１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子に特異的であるＤＮＡであってもよい。例えば、プライマーとプローブの対は、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれてもよい。
【００５１】
ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲは、さらにプライマーセットを使用してもよく、リアルタイム-ＰＣＲの場合、さらにプローブを使用してもよい。ここで当該プライマーセットとプローブは、サンプルに外因性であるＤＮＡに特異的であり、例えば配列番号１９、２０、及び２１に記載される配列である。
【００５２】
本発明に記載されたリアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブを用いて行なわれてもよい。リアルタイムＰＣＲ及び他の増幅反応においてしようするための追加の標識は以下に記載される。
【００５３】
１の態様における本発明の方法は、Ｐｒｏｍｅｇａ(Madison, WI, USA)から得られた磁性ＤＮＡ精製、例えばＷｉｚａｒｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ精製システムの使用を排除する。
【００５４】
１の態様では、本発明の方法は、ＲＮＡｓｅの使用を排除する。
【００５５】
１の態様では、本発明の方法は、Ｗｈａｔｍａｎ ＦＴＡ（登録商標）カードの使用を排除する。
【００５６】
１の態様では、本発明の方法は、インキュベート緩衝液におけるＴｒｉｔｏｎＸ-１００の使用を排除する。
【００５７】
本発明の別の態様では、ＰＣＲを用いてサンプルからＤＮＡを増幅するキットであって、配列番号１及び２(動物特異的)、配列番号４及び５(ウシ特異的)、配列番号７及び８(ヒツジ特異的)、配列番号１０及び１１(ブタ特異的)、配列番号１３及び１４(トリ特異的)、及び配列番号１６及び１７(魚特異的)からなる配列の群から選ばれるプライマー対を含み、そして場合によりさらに当該サンプルに外来性のＤＮＡに特異的なプライマーセット、例えば配列番号１９及び２０に記載される配列をさらに含む、前記キットが提供される。
【００５８】
本発明に記載されるキットは、加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭを、飼料サンプルから増幅させるために使用されてもよい。
【００５９】
本発明の別の態様では、配列番号１〜２１に記載される配列、例えば配列番号１０〜１８に記載される配列のうちの１以上を含む単離された核酸が提供される。配列番号１〜２１に記載される配列のうちの任意の１以上に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する単離核酸が本発明に包含される。
【００６０】
ヌクレオチド配列の間における配列同一性は、配列のアライメントを比較することにより決定されうる。比較された配列において対応する位置が、同一の塩基により占められている場合、分子は、この位置で同一である。同一性の割合としてアライメントをスコアリングすることは、比較された配列により共有される位置において、同一のアミノ酸又は塩基の数の関数である。
【００６１】
配列を比較する場合、最適アライメントは、この配列に起こり得る挿入及び欠失を考慮するために、当該配列の１以上にギャップを導入することを必要とする場合がある。配列比較法は、ギャップペナルティーを使用することもあり、その結果、比較される配列において同数の同一な分子では、できる限り少ないギャップでの配列アライメントが、２個の比較される配列の間の高い関連性を反映し、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するであろう。同一性の最大割合の計算は、ギャップペナルティーを考慮して最適アライメントを得ることに関与する。
【００６２】
配列比較を行なう適切なコンピュータープログラムは、商業部門及び公共部門において広く利用できる。例として、Ｇａｐプログラム(Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)及びＦＡＳＴＡプログラム(Altschulら、1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)が挙げられる。Ｇａｐ及びＦＡＳＴＡは、以前はＧＣＧ Wisconsinパッケージとして知られていたAccelry GCGパッケージバージョン１１.１(Accelrys, Cambridge, UK)の一部として利用できる。ＦＡＳＴＡプログラムは、欧州バイオインフォマティクス研究所(http://www.ebi.ac.uk/fasta)及びバージニア大学(http://fasta.biotech.virginia.edu/fasta_www/cgi)から公的にアクセス可能である。ＦＡＳＴＡは、所定の配列を有する配列データーベースをサーチするために使用されてもよく、又は２つの所定の配列を比較するために使用されてもよい(http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www/cgi/search_frm2.cgi)。一般的に、配列を比較する場合、コンピュータープログラムのデフォルトのパラメーターセットを使用すべきである。デフォルトパラメーターは、比較される配列のタイプ及び長さに依存して変化させてもよい。ＦＡＳＴＡプログラムを用いた配列比較は、Ｋｔｕｐ＝２、ＳｃｏｒｉｎｇＭａｔｒｉｘ＝Ｂｌｏｓｕｍ５０、ｇａｐ＝-１０及びｅｘｔ＝-２を使用してもよい。
【００６３】
当該方法において、本発明に記載されたキット及び単離核酸、存在する場合プローブは、任意の適切な検出手段で標識され得る。こうして、例えば、配列番号３、６、９、１２、１５、及び１８の配列を含むプローブは、必ずしもＦＡＭ及びＴＭＲＡで標識される必要はなく、そして配列番号２１の配列を含むプローブは、必ずしもＶＩＣ及びＴＡＭＲＡで標識される必要はないが、各々は、上に詳述されるように他の手段で標識され得る。
【００６４】
本発明は、本明細書に記載される方法に従って得られる抽出核酸を包含する。このような抽出核酸は、抽出方法に由来する新規の性質を有するであろう。
【００６５】
本発明は、以下の非限定的な例によってより詳細に記載される。
【実施例】
【００６６】
実施例１
この例では、動物飼料中への加工動物原材料の汚染の同定を支援するための動物特異的プライマー及びプローブを用いたスクリーニングアッセイを開発し、評価し、そして立証した。使用された遺伝子は、ミトコンドリアゲノムに存在する１６ｓｒＲＮＡ遺伝子であった。
【００６７】
方法と材料
リアルタイムＰＣＲ：
リアルタイムＰＣＲは、ミトコンドリアゲノム中の１６ｓ ｒＲＮＡの保存領域又は種特異敵領域の同定に特異的な蛍光プローブを含む。ＰＣＲの間に標的が増幅され、ＴａｑＭａｎ技術(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)に基づく５'レポーター色素(ＦＡＭ)及び３'クエンチャー色素(ＴＡＭＲＡ)で標識されたプローブは、フランキングプライマーとの間で標的に結合する。Ｔａｑポリメラーゼ(AmpliTaq Gold（登録商標）)の５'-３'核酸分解活性は、プローブを加水分解して、クエンチャー色素の活性からレポーター色素を放出する。得られた蛍光を次に計測し、そして当該蛍光は産生されたアンプリコンの量に正比例した。蛍光シグナルの増加は、標的配列がプローブに相補的でり、かつＰＣＲの間に増幅された場合にのみ見られる。これらの要件は、いずれかの非特異的増幅の検出を制限する。
【００６８】
プライマー及びプローブ：
ＧｅｎＢａｎｋデーターベースから得た以下の配列：トリ(Ｘ５２３９２)、ウシ(ＪＯ１３８４０)、ヒツジ(ＡＦ１０４０６)、魚(ＮＣ００２０８)、及びブタ(ＡＪ００２１８９)を用いて、標的に対するプライマー及びプローブが設計された。
【００６９】
Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)の使用により、アッセイのデザインを補助した。スクリーニングアッセイでは、プライマー及びプローブは、コンセンサス領域に基づいた。分化領域は、可能である場合、動物特異的アッセイ用に選択された。表１は、スクリーニングアッセイ及び動物特異的アッセイ用のプライマー及びプローブ配列を、予期されるアンプリコンサイズと供に示す。Ｓｉｇｍａ-Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｌｔｄがフォワード及びリバースプライマーを製造し、一方Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが当該プローブプライマーを製造した。プローブを、ＦＡＭ(５'末端)及びＴＡＭＲＡ(３'末端)で標識した。
【００７０】
【表１】
【００７１】
内部の陽性対照：
内部陽性対照(ＩＰＣ)は、市販の核酸ベクター(ｐＵＣ１８)に一般的に発見されるが、動物又は植物ゲノムにおいて天然に見られないアンピシリン抵抗性遺伝子の領域の増幅に関した。アンピシリン抵抗性遺伝子は、非競合的外来性対照であり、そしてサンプル物質中に存在する抑制性の因子の結果として、又はサンプル抽出手順の結果として生じ得る誤判定を検出するために、アッセイの検証に含まれた。ＩＰＣテンプレート、プライマー、及びプローブをＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒミックスに加えて、マルチ検出にかけた。プライマーを限られた濃度(０.０３μＭ)で使用して、ＰＣＲ試薬を利用するＩＰＣ生成物が、１６ｓＲＮＡ増幅効率の決定要因になることを妨げた。多重アッセイにおいて標的の増幅を検出するために、プローブを５'末端においてレポーター色素としてＶＩＣで標識し、そして３'末端においてクエンチャーとしてＴＡＭＲＡで標識した。プライマー及びプローブを、ｐＵＣ１８の配列に基づき設計し、そして表２に示す。
【００７２】
【表２】
【００７３】
開発及び評価において用いられるＰＣＲ及びサイクル条件
１２.５μｌのＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒミックス(Applied Biosystems)、０.３μＭの両プライマー、及び０.１μＭの蛍光性プローブ(Applied Biosystems)を含む合計体積２５μｌで、７７００Sequence Detector(Applied Biosystems)上でリアルタイムＰＣＲを行い、そして検出した。サイクル条件は以下のとおりであった：５０℃で２分、次に９５℃で１０分、９５℃で１４分、５３.６℃で１分を４０サイクル。各サンプルは二回アッセイした。
【００７４】
検証に用いられるＰＣＲ及びサイクル条件
リアルタイムＰＣＲを行い、そして１２.５μｌＴａｑＭａｎマスターミックス(Applied Biosystems)、１６ｓ ｒＲＮＡアッセイに対する０.３μＭの両プライマー、及び０.１μＭの蛍光プローブを含む２５μｌの合計体積中で、７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ(Applied Biosystems)上で検出した。検証アッセイでは、IPCについての両プライマー(０.０３μM)及び蛍光プローブ(０.１５μM(Applied Biosystems)は、内部陽性対照テンプレートとのマスターミックスに加えられた(０.１６６ｎｇ ｐＵＣ１８)。サイクル条件は、７７００ Sequence Detector Systemについての条件と同じであった。
【００７５】
開発及び検証において使用されるサンプル
熱処理組織
ＤＮＡについてのサンプル処理の効果を生成させるために、熱処理された組織を調製した。ウシ、ヒツジ、ブタ、及びトリ筋肉組織のスライスを、０.１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７.２(１０％ｗ/ｖ)にホモジェナイズした。ホモジェネートを９０℃〜１３３℃の範囲の温度、３ｂａｒの圧力で２０分間加熱した。Ｓａｍｂｒｏｏｋら(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 3, Appendex E: Commonly used techniques in molecular cloning, purification of nucleic acids E3)に記載されるフェノール/クロロホルム法を用いて、プロテイナーゼＫで消化し、そして溶解された組織からＤＮＡを抽出した。当該文献は、その全てを本明細書に援用する。
【００７６】
加工原材料及び定量的標準
ウシ、ヒツジ、及びブタ加工原材料を、模擬加工オートクレーブ中で１２８℃で２０分間加熱し、次に凍結乾燥されたホモジェナイズされた筋肉から調製した。(プタスダラに基づく)魚粉は、United Fish Products(UK)から供給され、そして市販されている。細かく製粉されたトリ加工原材料は利用できなかったので、粗製トリ加工原材料を異なる組織から調製した。英国農業供給貿易協会(UKASTA)の推奨に基づいて、BOCM Pauls Ltd.(UK)から購入した生の食材を用いて、陰性である植物性飼料を製造した。表３は、加工原材料標準を作るために使用された陰性植物性飼料の組成を示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
サンプル原材料を、陰性の植物飼料(鳥用５０％)中の２０％加工原材料から製造した。トリ飼料ミックスを除いて、これらはRetch Ultraミルを用いて製粉し、１ｍｍ未満の微粒子サイズを与えた。(０.５％〜２０％ウシ、ヒツジ、魚、及びブタ、１％〜５０％トリ)の範囲の定量的標準を、２０％〜５０％のミックスを用いた陰性の飼料を含んで２ｇにした。
【００７９】
１００のコード化されたサンプル
レンダリング施設において生産されProsper De Mulder(UK加工業者)により供給されたトリ(鶏)、ウシ、ヒツジ、及びブタ加工原材料を用いてコードされたサンプルを製造した。大きな骨断片を取り除くために、肉骨粉を２ｃｍ2の開口シーブを用いて前もって篩にかけ、そして０.００１％〜１０％の範囲に分配した。これらのうち、０.１％、１％、５％、及び１０％の量を用いて、上記の陰性の植物飼料を用いて、さまざまな組み合わせの混合種サンプルを製造した。
【００８０】
６０の陰性の動物飼料
アッセイ開発の過程で、６０の異なる動物飼料を用いて、陰性の対象のベースラインレベルを測定した。たとえば、UKには多くの加工植物及び動物飼料製造業者が存在する。様々な供給業者の動物飼料の組成は、現在の規制の下で許容される様々な成分を含む。その結果、正確かつ維持可能な基準を決定する努力において、様々な複合飼料を試験することが必須であると考えられている。ＥＬＩＳＡ技術(Ansfieldら、2000, Food Agric. Immunol. 12: 285-297, 当該文献は、その全てを本明細書に援用される)は、サンプルが動物原材料について陰性であるか否かを確認するために用いられた。
【００８１】
検証に用いられたサンプル
様々な市販の動物飼料、例えばＭｅｎｄｉｐ ｅｗｅペレット及びＲａｐｉｄ ｌａｍｂペレットを、スクリーニング及び動物特異的アッセイの検証のために用いた。全てのサンプルを分析して、ＥＬＩＳＡ及びＭＡＴ(顕微鏡分析試験；上の記載を参照のこと)により動物原材料について陰性であるか否かを確認した。さらに、これらの動物飼料のいくつかに、様々な量(０.２、１.０、及び２.０％)の前に記載された様に製造されたウシ、ヒツジ、ブタ、トリ(鶏)または魚の加工原材料が加えられた。単一種及び混合種サンプルの両方を製造した。
【００８２】
開発及び評価の間に用いられた加工原材料、定量的標準、１００のコード化されたサンプル、及び６０の陰性の動物飼料から得たＤＮＡの抽出
動物飼料からのＤＮＡ抽出法は以下のとおりである：１ｍｌのＣｈｅｌｅｘ溶液(２０％Ｃｈｅｌｅｘ-１００[Bio-Rad Laboratories, UK,分析品質]＋１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０) を、０.１ｇの飼料ミックスに加える。サンプルを激しく混合し、そして９５℃で１５分間加熱した。次にサンプルを氷上に１分間配置して、その後サンプルを１００００ｒｐｍで(約７３００×ｇ)で１０分間スピンさせた。上清を注意深く取り出して新たなチューブにいれ、そして-２０℃で貯蔵した。
【００８３】
検証において用いられたサンプルからのＤＮＡ抽出
この方法を、大規模抽出に適用した。開始重量の増加により、サンプル飼料中に見られる構成要素のさらに多くの表示を可能にする。４０ｇのサンプルを３６０ｍｌの０.１Ｍリン酸緩衝液に加え、そして１５分間浸し、ゆっくり揺らした後に、９５℃で１５分間スチームオートクレーブにかけた。サンプルの液面の下１ｃｍから採取した１ｍｌの上清を０.２ｇのＣｈｅｌｅｘ１００(Bio-Rad Laboratories)に加えた。サンプルを２０秒間ボルテックスにかけ、そして次に１３０００ｒｐｍ(１１０００×ｇ)で遠心した。４００μｌの上清を次に、きれいなチューブに移し、そして試験に必要とされるまで４℃で貯蔵した。
【００８４】
結果と考察
動物飼料調製品の効果を決定するために、３ｂａｒの圧力で２０分間、９０℃、１００℃、１１０℃、１２０℃、及び１３３℃で処理された(加工過程を模倣した)組織から抽出されたＤＮＡを、スクリーニングアッセイで用いた。トリ(鶏)、ウシ、ヒツジ、魚、及びブタのミトコンドリアＤＮＡ(１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子)を検出するためにこのアッセイを設計した。リアルタイム蛍光ＰＣＲにおいて、Ｃｔ値は、ΔＲｎの統計的に有意な増加が最初に検出されるサイクルである。ΔＲｎは、リアルタイムＰＣＲにおいて生成されたシグナルの程度についての信頼の置ける指標である。
【００８５】
加熱処理されたヒツジの組織では、このスクリーニングアッセイを用いて、加熱処理の温度が増加するにつれ、Ｃｔ値が増加した。９０℃では、Ｃｔ値は、１６.８０であり、１００℃では、１７.７６であり、１１０℃では１８.７６であり、１２０℃では１９.０３であり、そして１３３℃ではＣｔ値は２０.３９であった。対照のヒツジＤＮＡでは、Ｃｔ値は１８.７０であり、１１０℃超では、ＤＮＡは変性し、ＰＣＲが標的を増幅する能力に影響を与えるということが示された。これは、豚肉を３０分間８０℃で加熱した場合にほとんどＤＮＡ変性が起こらないが、加熱温度を１２０℃に上げた場合有意な変性が生じるということを示すEbbehoj 及びThomson(1991, Meat Sci. 30: 221-234)の発見に一致した。これらの結果により、模倣された加工過程により変性されるが、スクリーニングアッセイは、最大１３３℃、３ｂａｒで２０分間処理されたサンプルについての適切な検出方法であるということが示された。これは、加熱処理されたトリ(鶏)、ウシ、魚及びブタ原材料から抽出されたＤＮＡでも観察された。
【００８６】
このスクリーニング及び動物特異的アッセイを評価するために、１００のコード化されたサンプルを用いた。各動物種についての既知の組成、定量標準のサンプルをこのアッセイに含めた。スクリーニングアッセイの結果を表４に要約して載せた。０.００１％で含められたサンプルの全ては検出されず、そして０.０１％レベルで含められたサンプルは、いくつかの場合において陽性の結果を与えた。０.１％レベルで含まれたサンプルは、全ての場合で検出された。標準についての結果とともに、これらの結果に基づいて、当該アッセイの感受性が、０．１％であることが決定された。同様に、加工サンプルが、対で混合されるか、又はグループで混合される場合、各々及び全ての場合で検出された。このコード化された研究により、本アッセイが、スクリーニングアッセイの機能を実行できるということが示された。このアッセイを完全に検証するために、多くのサンプルがスクリーニングされた。
【００８７】
【表４】
【００８８】
５種の個々の動物特異的アッセイの全ては、０.００１％及び０.０１％レベルで含まれた肉骨粉サンプルを検出することができないが、０.１％で含まれた場合に肉骨粉サンプルを検出することができた。このコード化された試験は、動物特異的アッセイの各々の正確性を確立した。存在する種と、各動物特異的アッセイにより検出された種との間のかなり良好な相関が存在した。しかしながら、ウシ及びブタアッセイの両方が、１の偽陽性の結果をもたらした。つまり、このアッセイは、ヒツジ及びトリ原材料のみを含むサンプルを陽性として同定してしまった。この試験において確認される検出限界は、他のＰＣＲ法を用いて他の発見に一致した(Kusamaら、2004, J. Food Protection 67: 1289-1292; Toyodaら、2004, J. Food Protection 67:2819-2832)。０.０５％のレベルは、リアルタイムＰＣＲを用いて、ウシＭＢＭ中で、ウシ特異的原材料の検出できることが確認された(Rensenら、2005、上記)。出願人は、単一の混合物においてのみならず、加工原材料を含むサンプルの混合物(ＤＮＡテンプレートに比べて飼料汚染の実際の状況を示す状況(例えば、Lahiffら、2002, J. Food Protection 65: 1158-1165; Dalmassoら、2004, Mol. Cell Probes 18: 81 - 87))においても特異的原材料について０.１％の検出限界を示した。さらにこのコード化試験により、動物特異的アッセイが、同定の機能を実行することができるということを示した。これらのアッセイを完全に検証するために、多くのサンプルを用いた。
【００８９】
ＵＫにおいて多くの植物及び動物飼料製造業者が存在するが、様々な供給業者の動物飼料の組成は、現在の規制の下許容される様々な成分を含む。その結果、正確かつ持続可能な基準を決定するための努力において、様々なこれらの複合飼料を試験することが必須であると考えられている。サンプルが陰性であると決定するためにＥＬＩＳＡ技術が使用された(上の記載を参照のこと)。６０の陰性動物飼料を、スクリーニングアッセイを用いて試験した。動物飼料の圧倒的大部分(５２)は、出願人のスクリーニングアッセイを用いて陰性であった(Ｃｔ＞３５及び／又はΔＲｎ＜０.５)。しかしながら、リアルタイムＰＣＲを用いて陽性となるサンプルが幾つか存在した。ＥＬＩＳＡ法が最大１３０℃に加熱されたサンプルにおいてうまく機能するということが知られている。加工温度がこの値を超えて増加するにつれ、ＥＬＩＳＡの感度が低下する。それゆえ、これらのサンプルの幾つかが１３０℃を超えた温度に加熱されたという可能性がある。２つの方法のあいだにおける相違についてのほかの可能な説明は、感度の差異である。ＥＬＩＳＡは、０.５％の包含レベルで加工された動物原材料を検出することが測定されている一方、本願のリアルタイムアッセイは、０.１％の包含レベルでサンプルを検出する。
【００９０】
当該スクリーニングアッセイにより陽性であるサンプルを、ＥＬＩＳＡを用いて陰性である幾つかのサンプルとともに顕微鏡分析(ＥＵにおいて認められた動物飼料中の動物原材料を検出するための唯一の技術)を用いたさらなる分析にかけることによりさらに調査した。顕微鏡分析の結果は表５に示される。
【００９１】
【表５】
【００９２】
顕微鏡分析結果は、３つのカテゴリー：陰性、陰性＊、及び筋繊維に分類された。陰性とマークされたサンプルは、完全に陰性である。陰性＊とマークされたサンプルは、加工原材料については陰性であるが、ミルク粉末、つまり許容される製品を含む。最後のカテゴリーは、これらのサンプルにおける筋繊維の存在を示すが、その繊維の起源、つまり種は不明である。
【００９３】
顕微鏡分析に供された１２のサンプルのうち、スクリーニングアッセイは４つのサンプルが陰性であると示した一方、顕微鏡分析は５つのサンプルが陰性であると示した。サンプル１３、２２、及び３６では、顕微鏡分析及びスクリーニング法は、同じ結果を与えた。サンプル２は、スクリーニングアッセイでは陰性であったが、顕微鏡分析において筋繊維が観察された。この場合、繊維は異なる種、トリ(鶏)、ウシ、ヒツジ、魚及びブタ由来であり、スクリーニングアッセイによって認識されるものと知られている。サンプル９と１５は、スクリーニングアッセイでは陽性であったが、顕微鏡分析では陰性であったが、ミルク粉末の存在が観察された。ミルク粉末は、認可された添加物であり、そして出願人のスクリーニングアッセイでは陽性として検出された。
【００９４】
残りのサンプル１４、３３、３４、４２、４９、及び５７は、本スクリーニングアッセイでは陽性であり、顕微鏡分析により筋繊維の存在が確認された。これらの筋繊維の由来元の種についての疑問を解決する試みにおいて、出願人は、個別の動物特異的アッセイ、つまり検査された各々の種を検出するように設計されたアッセイを用いることにより、これらのサンプルをさらなる分析にかけた。これらのサンプルのうち４つが、ヒツジ、ウシ、トリ(鶏)、及びブタに対して陰性であったが、魚に対して陽性であることがこの結果から確認された。その結果、これらの筋繊維が、魚に由来する可能性が極めて高い。残りのサンプルは、ヒツジ、ブタ、トリ(鶏)及び魚について陰性であるが、ウシ原材料に対して陽性であった。本スクリーニングアッセイは、ミルク粉末及び筋繊維を検出し、そして個別の動物特異的アッセイは、原材料の由来元を同定した。魚肉を反芻動物に与えることは、２０００年からＥＵにおいて禁止されたので、種特異的同定は重要である。現存のスクリーニング技術(ＥＬＩＳＡ)は、これらのサンプルの幾つかの検出に失敗した。
【００９５】
このアッセイを完全に検証するために、大規模ＤＮＡ抽出法を用いて多くのサンプルを試験した。開始物質の量の増加は、サンプルに見られた構成物質のよりよい提示を可能にする。スクリーニング及び動物特異的アッセイは、スクリーニング及び動物特異的アッセイにおいて標的遺伝子(１６ｓ ｒＲＮＡ)の検出に影響を与えないことが示された内部陽性対照を含んで、検証された(結果は示されていない)。全部で８７２のサンプルを、スクリーニングアッセイを用いて分析した。陰性飼料は、５の異なる市販動物飼料から得られた２８６のサンプルで構成される。サンプルはＥＬＩＳＡ及びＭＡＴにより前もってスクリーニングされて、禁止された動物原材料を含まないということが確認された。市販の陰性飼料に既知量の特定の動物原材料を加えることにより、陽性サンプルを作成した。
【００９６】
２８６の陰性飼料サンプルのうち、２７２は陰性であると正しく同定され、そして１４の偽陽性結果が得られた。これは、９５.１％の特異性であった。スクリーニングアッセイにより同定された偽陽性は、動物特異的アッセイで同定される可能性がある。０.２％及び１％動物原材料を陽性に添加された全てのサンプルは、正しく予測され、１００％の感受性を与えた。２％原材料を添加された陰性サンプルのうち、１つは、陰性であると誤って予測され、９９.６３％の特異性を与えた。この結果を表６に要約して示す。
【００９７】
【表６】
【００９８】
スクリーニングアッセイにより試験された８７２のサンプルのうち、２７３は、陰性と同定され、全部で５９９のサンプルが陽性とみなされた。これらの５９９の陽性サンプルは、動物特異的アッセイを用いてさらに分析された。これらの結果は、表７に要約される。
【００９９】
【表７】
【０１００】
本スクリーニングアッセイを用いて分析された８７２のサンプルのうち、８５７は正しく予測され、これは全体として９８.２％の正確性を与えた。添加サンプル５８６のうち５８５は、陽性であると同定された。０.２％レベルで添加された全てのサンプルは、動物特異的アッセイを用いて正しく同定された。この０.２％レベルでの１００％の特異性は、このレベルの汚染原材料を含むサンプルが同定されるという強力な証拠を提供する。スクリーニングアッセイは、現在使用される現存のスクリーニングＥＬＩＳＡに比べて信頼が置け、より感受性が高く、堅牢かつ安価な代替を提供し、そして場合により動物特異的アッセイと合わせて、動物同定の価値ある方法であると証明されうる。
【０１０１】
実施例２
実施例１の結果に基づき、出願人は、動物飼料中の加工された動物原材料から得たＤＮＡの検出のための以下の操作手順(ＯＰ)を提案する。
【０１０２】
導入
ＯＰの目的／範囲
このＯＰは、感受性リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて加工された動物飼料からのＤＮＡの存在について動物飼料を試験する詳細な研究室プロトコルを提供する。本試験は、４つの主要な段階：ａ)ＤＮＡ抽出のためのサンプル調製、ｂ)プレート調製、ｃ)ＰＣＲ反応、ｄ)データ処理及び結果の解釈を有する。
【０１０３】
背景情報
欧州共同体広域飼料制御(ＴＳＥ規則(イングランド)を通して実施されている)は、食品生産のために維持され、肥育され、又は飼育される動物に加工動物タンパク質を与えることを禁止した。ＢＳＥを根絶し、そしてヒト型のＣＪＤを予防するために、動物飼料における動物タンパク質の使用の禁止が施行されている。現在の法律を実行するために、動物飼料、特に反芻動物飼料中に禁止タンパク質を検出することができることが必須である。形態に基づき温度に安定な固体構造の分析を通した動物原材料の同定に関する顕微鏡分析は、現在、動物飼料中の動物起源の構成物質を検出するための欧州共同体に認められた唯一の公的方法である。
【０１０４】
ＰＣＲに基づく技術における標的として動物ＤＮＡを使用することは、現在の試験にサポートを提供する。なぜなら、ＤＮＡはタンパク質よりも加工温度に対してより抵抗性であるからである。この技術は、１６ｓ ｒＲＮＡミトコンドリアＤＮＡ標的配列の一部を増幅するためにリアルタイムＰＣＲを使用し、生成された任意のアンプリコンを分析する。
【０１０５】
方法に関与する原理
ＤＮＡは、４０ｇの飼料サンプルから抽出される。飼料サンプルは、加熱ステップを用いてリン酸緩衝液中で脱ペレット化され、そして次に、サブサンプルは、Ｃｈｅｌｅｘレジンで処理される。混合物をボルテックスし、遠心し、そしてＤＮＡを含む上清の一定量を試験に用いた。サンプルＤＮＡを、試験プレート中に緩衝液、プライマー、プローブ、ｐＵＣ１８及びポリメラーゼ酵素を含むマスターミックスに入れた。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ７９００配列検出器で行った。システムは、標的がＰＣＲ反応の間に増幅されるならば蛍光をもたらす。蛍光は、ＰＣＲプレート中で直接検出され、そして結果を、蛍光シグナルの強度に基づいて計算される。特異的プライマー及び異なる蛍光プローブを有する内部対照ＤＮＡを用いて、増幅の抑制が存在するかを評価するために用いる。Ｃｔ(閾値)は、その反応の間で各サンプルについて計算し、そして対照サンプルのＣｔ値に基づきプレート毎に定めたカットオフレベルに比べられる。
【０１０６】
材料
説明とソフトウェア
ＡＢＩ ＳＤＳ ソフトウェア、バージョン２.０又はそれ以降。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイシート(製品説明書を参照こと)。
【０１０７】
化学物質及び試薬
リン酸緩衝液、ｐＨ７.２＋０.１(０.１Ｍ)、
溶液Ａ：１リットルの蒸留水に溶解された１４.２ｇのオルトリン酸水素二ナトリウム(無水)、
溶液Ｂ：１リットルの蒸留水に溶解された１５.６ｇのオルトリン酸水素ナトリウム(二水和物)、
７２０ｍｌの溶液Ａを２８０ｍｌの溶液Ｂと混合し、ｐＨが７.２＋０.１であることをチェックする(ハイスループット用に、さらに多くの量を調製できるが、７日を超えて貯蔵すべきではない)。
特性がバッチ間で、及び製造業者間で変化することがあるので、各新たなＴａｑＭａｎ試薬を評価すべきである。新たなバッチのＰＣＲマスターミックス成分(試薬、プローブ、又はプライマー)は、一回で導入すべきであり、そして目的についての適合を測定するために試験される。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスが現在使用されている。他の供給業者からの同等の試薬であって、この目的に適合することが示された試薬が使用されてもよい。
ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ(Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ４１５４)、
ＤＮＡ及びＲＮＡフリーと保障された分子生物学品質の水(Sigmaカタログ番号Ｗ４５０２)、
ＨＰＬＣ精製された特異的及び対照プライマー、上記表１及び２を参照のこと。
【０１０８】
対照サンプル
陰性対照：等量の菜種、大豆、ひまわり及びとうもろこしを含む陰性飼料ストック。成分がＧＡＦＴＡにより供給される。
陽性対照：Prosper de Mulder により供されるウシ、ヒツジ、ブタ、及びトリ組織。英国水産業会により供される魚組織。
【０１０９】
装置
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ １９００ＨＴ配列検出装置及びＰＣ、
４０ｇ±５ｇのあいだで計測可能な電子天秤(０〜３ｋｇ)、
０.２ｇ±０.０２ｇのあいだで計測可能な電子天秤(０〜１００ｇ)、
マイクロチューブを１３０００ｒｐｍ(１１０００×ｇ)でスピンさせることができる固定ローターを備える遠心機、
９６ウェルプレートをスピンさせるための遠心機(２０００ｒｐｍ[７００×ｇ])、
０.１〜１０００μｌの体積を正確に文中することができる調節可能な一連の単一チャネルピペット、
１〜１０μｌの範囲のマルチチャネルピペット、
層流キャビネット又はクラスＩＩ安全キャビネット、
大気圧で９５℃±４℃で実行可能なオートクレーブ、
-１８℃未満のフリーザー、
ボルテックスミキサー。
【０１１０】
消耗品
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ光学カバー圧縮パッド(Applied Biosystems)、
ＡＢＩ 粘着カバー(Applied Biosystems)
光学９６ウェル反応プレート(Applied Biosystems)
ピペッター用のフィルタ-バリアーチップ(ＶＷＲ)
滅菌遠心管、０.６〜１.７ｍｌ(Ａｌｐｈａ Ｌａｂｓ又は他の評判のよい供給業者)
滅菌プラスチック製ビジョー(bijoux)(ＶＷＲ)
オートクレーブ可能なコンテナ(１ｌ体積)
適切なサイズの計測シリンダー
【０１１１】
方法
サンプル同定及び取り扱い
参照番号と受託日の固有の組み合わせにより各提出を同定する。サンプルの取り扱いは、関連の安全のための手順に従うべきである。
【０１１２】
サンプル調製
４０±５ｇのサンプルに、３６０ｍｌの０.１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７.２±０.１を加えた。オートクレーブに適した容器内にて室温で１５分間浸漬した。９５±５℃で１５分間オートクレーブした。０.２±０.０２ｇのＣｈｅｌｅｘを計量して１.７ｍｌマイクロ遠心チューブに入れた。オートクレーブからサンプルを取り出し、そして液面の下約１ｃｍのところから１ｍｌの上清を抽出した。Ｃｈｅｌｅｘを含む遠心チューブに移した。
【０１１３】
最大速度で２０秒間ボルテックスした。サンプルを１３０００ｒｐｍ(１１０００×ｇ)で１０分±６０秒間サンプルを遠心した。１０μｌの上清を取り除き、そして９０μｌの分子実験品質の蒸留水を加えた。抽出物をすぐに用いるか、又は試験前において-１８℃未満に保持した。
【０１１４】
ワーキング溶液の調製
プライマー：オリゴヌクレオチド(オリゴ)プライマーを、一定量のストック溶液を形成し、そして貯蔵するため、再構成及び希釈を必要とする凍結乾燥ペレットとして提供する。
【０１１５】
生物学的品質の水中にオリゴペレットを溶解して、１００μＭの溶液を与えた。ボルテックスによりよく混合し、そして室温で２分間静置し、再び混合した。
【０１１６】
０.６ｍｌマイクロ遠心チューブに５０μｌ又はそれ未満の量に100μＭのプライマーを分注した。プライマーにラベルを付し、そして-１８℃未満で貯蔵した。
【０１１７】
プローブ：プローブを１ｍｌ生物学的品質の水に再懸濁した。５０μｌの一定量を０.６ｍｌのマイクロチューブに分注し、ラベルを付し、そして-１８℃未満で貯蔵した。
【０１１８】
ｐＵＣ１８：ｐＵＣ１８ストックを１／１５０００に希釈した。５０μｌの一定量を０.６ｍｌマイクロ遠心チューブに分注し、ラベルを付し、そして-１８℃で貯蔵した。
【０１１９】
水：２５ｍｌのユニバーサルに分注し、そして室温で貯蔵した。
【０１２０】
陰性及び陽性対照の調製
陰性対照：４０ｇ±５ｇの陰性飼料ストックを上に記載されるように処理し、そしてＣｈｅｌｅｘ抽出物を回収する。この陰性対照は、すぐに使用できるか、又は-１８℃で１年間貯蔵されうる。陰性対照物質の新たなバッチは、目的に対する適合を確立するため古いバッチと平行して試験されるべきである。
【０１２１】
陽性対照(０.２％)：４０ｇ±５ｇの陰性飼料ストックを０.０８ｇのウシ／ブタ／ヒツジ／トリ／魚肉骨粉を個別に添加し、そして上に記載されるように処理し、そしてＣｈｅｌｅｘ抽出物を回収した。陽性対照は、すぐに使用できるか、又は-１８℃で１年間貯蔵されてもよい。新たな陽性対照原材料のバッチは、目的に対する適合を確立するために、古いバッチと平行して試験されるべきである。
【０１２２】
ＰＣＲマスターミックスの調製
アッセイに依って、必要とされるプライマーとプローブ濃度を計算し、そして使用される試験の数(ウェル)依存した合計体積を調節する。一定量のプライマー、プローブ、ｐＵＣ１８及びＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックスを冷蔵庫／冷凍庫からとり、そして室温に達しさせた。軽くチューブをタップして内容物をチューブの底に落とした。クリーンルーム安全キャビネット内で作業し、各試薬の必要とされる体積を７ｍｌのＢｉｊｏｕｘにピペットで移した。この時点でｐＵＣ１８を加えてはならない。研究室に戻り、そして必要とされる量ｐＵＣ１８を加える。全ての試薬が加えられたら、マスターミックスを５〜１０秒間ボルテックスした。
【０１２３】
ＴａｑＭａｎプレートのセットアップ
一般的スクリーニングアッセイでは、１以上のプレートを幾つかのテンプレートを含まない対照(ＮＴＣ'ｓ)、トリ組織を除いた各組織タイプについて少なくとも１の陽性対照についての反応液を含むように１以上のプレートを設定し、当該プレートは、少なくとも６の反応液、陰性対照、及び試験されるサンプルを有すべきである。種特異的アッセイでは、上と同じレイアウトを使用すべきであるが、標的種についての少なくとも６の陽性対照反応液は、Ｃｔカットオフ値を計算するために含められる。
【０１２４】
２３μｌのマスターミックス(上を参照のこと)を、９６ウェルの光学反応プレートの各ウェルに加えた。２μｌの適切なサンプルＤＮＡ又は対照ＤＮＡを９６ウェルプレートに加える。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ光学粘着カバー及びシールでプレートを覆った。プレートを２０００ｒｐｍ(７００×ｇ)で３秒間遠心して、ウェルの内容物を落とし、そして空気の泡を取り除いた。空気の泡が存在する場合、遠心を繰り返した。
【０１２５】
ＴａｑＭａｎアッセイの実施
ＰＣＲプレートをＡＢＩプリズム７９００に配置し、そしてサイクルを実行する。サイクル条件は以下のとおりである：５０℃で２分間、続いて９５℃で１０分間、（９５℃で１５秒間及び５３.６℃で１分間）を４０サイクル。製品説明書及び研究室の手順にしたがってデータを分析した。
【０１２６】
分析結果
習熟した技師のみが、結果を分析しそして解釈すべきである。データを観察及び分析するために利用できる多くのソフトウェアオプションが存在する。
【０１２７】
内部対照ｐＵＣ１８のＣｔ値は、反応が成功したか又はポリメラーゼ阻害剤の存在により阻害されたかを指し示す。許容される範囲(２４.５サイクル〜１１.９サイクル)からはずれたＣｔ値は、阻害を示し、そして問題のサンプルを再テストすべきである。続いて生じる試験が、許容される範囲からはずれた内部対照値を生成するならば、結果は決定的ではないものとして記録されるべきである。ＮＴＣ増幅が、３９〜４０の間のＣｔ値を有するべきである。蛍光が生じる場合、蛍光はプローブの熱変性のため生じ、そして試験は繰り返されるべきである。
【０１２８】
一般的なスクリーニングアッセイでは、ウシ、ヒツジ、及びブタＤＮＡに比べた場合に、トリＤＮＡは最も高い閾値サイクルを有し、その結果６個のトリ陽性対照Ｃｔ値は、このアッセイについてのカットオフ値を生成するために使用される。６ウェルの平均±３の標準偏差(ＳＤ)が、カットオフ値を計算するために使用される。この値未満又はこの値に等しいＣｔ値を生成するサンプルが陽性であると記録される。このカットオフ値よりも高いＣｔ値を有するサンプルは、陰性と記録される。
【０１２９】
特異的アッセイでは、種得意適用性対象について使用された６ウェルのＣｔ値が、カットオフ値を決定するために使用される。６ウェルの平均±３の標準偏差(ＳＤ)が、カットオフ地を計算するために使用される。この値より低いか又はこの値に等しいＣｔ値を生成するサンプルは、陽性であると記録される。このカットオフよりも高いＣｔ値を有するサンプルは陰性であると記録される。
【０１３０】
本発明が好ましい又は例示的な実施態様を参照して記載されたが、当該態様に様々な主食及び変更が、本発明の本質及び範囲から逸脱することなくなされうるということが当業者により認識され、そしてこのような変更は、明らかに本明細書において考慮されている。本明細書に開示され、そして添付の特許請求の範囲に記載された具体的実施態様に関して制限がないことが意図されるか、又は推測されるべきである。
【０１３１】
本明細書に引用された全ての文書は、本明細書が各参考文献について具体的に言及されているか否かにかかわらず、その全てが本明細書に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルから核酸を抽出する方法であって、以下のステップ：
(ｉ)インキュベート緩衝液中に約３０〜２５０ｇ、例えば約３５〜４５ｇ、又は約４０ｇのサンプルをインキュベートし；
(ｉｉ)ステップ(ｉ)でインキュベートされたサンプルをオートクレーブし；そして
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)でオートクレーブされたサンプル又はサンプルの一部を、金属キレート剤、例えば金属キレートイオン交換レジンと混合する
を含む、前記方法。
【請求項２】
以下のステップ：
(ｉｖ)ステップ(ｉｉｉ)のサンプル又はその一部から金属キレート剤を沈渣させて、抽出された核酸を含む上清を生成する、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベート緩衝液が、リン酸緩衝液、例えば約０.０５〜０.２Ｍ又は約０.１Ｍの濃度のリン酸緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベート緩衝液が、サンプルの重量の約５００〜１５００％(ｖ/ｗ)、サンプル重量の例えば約９００％(ｖ/ｗ)である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベート緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液が、約６.５〜７.５、又は約７.２のｐＨを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(ｉ)におけるインキュベートが、約５〜６０分、又は約１０〜３０分、例えば約１５分間行なわれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、ステップ(ｉｉ)において、約８５〜１２０℃、又は約９０〜１００℃、例えば約９５℃で、そして場合により約５〜６０分、又は約１０〜３０分、例えば約１５分間オートクレーブされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが、ステップ(ｉｉ)において大気圧で又はその付近でオートクレーブされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記金属キレート剤、例えば対となったイミノジアセテートイオンを含むスチレンジビニルベンゼン・コポリマーであるレジン、例えばＣｈｌｅｘ１００、が、多価金属イオンをキレートする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ(ｉｖ)において、例えば約１００００〜１２０００×ｇ、又は約１１０００×ｇで遠心することにより、前記金属キレート剤、例えば金属キレートイオン交換レジンを沈渣させる、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、動物飼料、例えば反芻動物飼料に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、加工された動物原材料、例えば加工動物タンパク質(ＰＡＰ)又は肉骨粉(ＭＢＭ)を含み、又はこれらの存在について試験される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、動物又は反芻動物ミトコンドリアＤＮＡ、例えば１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアＤＮＡを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚からなる群のうちの１以上に由来するＤＮＡを含む、請求項１〜１３のいずれか一向に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが動物飼料であり、そして当該方法が以下のステップ：
(ｉ)約３５〜４５ｇのサンプルを、約７.１〜７.３のｐＨの０.１Ｍリン酸ナトリウム中に約１０〜２０分間、例えば約１５分間、場合により室温でインキュベートし、
(ｉｉ)ステップ(ｉ)でインキュベートされたサンプルを、約９０〜１００℃で、約１０〜３０分間、例えば約１５分間、大気圧又は大気圧付近でオートクレーブし；そして
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)でオートクレーブされたサンプルの一部を、金属キレートイオン交換レジン、例えばＣｈｅｌｅｘ１００と混合させる
を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
約１００００〜１２０００×ｇ、又は約１１０００×ｇで遠心することにより、ステップ(ｉｉｉ)のサンプルの一部からレジンを沈積させるさらなるステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記上清又はステップ(ｉｖ)からのその一定量が、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)又はリアルタイムＰＣＲアッセイなどの増幅反応において使用される、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
(ｖ) 核酸、例えばミトコンドリアＤＮＡなどのＤＮＡの有無を検出するステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭに由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸が、ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲを用いてステップ(ｖ)で検出される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
以下のステップ：
(ｉ)請求項１〜１７に定義される方法に従ってサンプルからＤＮＡを抽出し；そして
(ｉｉ)ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲなどの増幅反応を用いて、抽出されたＤＮＡを増幅する
を含む、サンプル中のＤＮＡを増幅する方法。
【請求項２２】
ステップ(ｉｉ)で増幅されたＤＮＡが、加工された動物材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭに由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲが、プライマー対を使用し、そしてリアルタイムＰＣＲの場合さらにプローブを使用し、ここで当該プライマー及びプローブが、以下の：動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚組織のうちの１以上に特異的である、請求項２１又は請求項２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記プライマー対及びプローブが、動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚組織からなる群の１以上に由来するミトコンドリアＤＮＡ、例えば１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアＤＮＡに特異的である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プライマー対及びプローブのそれぞれが、配列番号１、２、及び３(動物特異的)、配列番号４、５、及び６(ウシ特異的)、配列番号７、８、及び９(ヒツジ特異的)、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライマー対及びプローブが、ブタ、トリ、及び魚組織からなる群の１以上に由来する１６Ｓ ＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡに特異的である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマー対及びプローブがそれぞれ、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲが、プライマーセットをさらに使用し、そしてリアルタイムＰＣＲの場合さらに、プローブを使用し、ここで当該プライマーセット及びプローブが、当該サンプルに外因性なＤＮＡ、例えば配列番号１９、２０、及び２１に記載される配列に特異的である、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記リアルタイムＰＣＲが、ＴａｑＭａｎプローブを用いて行なわれる、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
磁石によるＤＮＡ増幅、例えばPromega(Madison, WI, USA)から販売された食品ついてのＷｉｚａｒｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ精製システムの使用を排除する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＮＡｓｅの使用を排除する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＷｈａｔｍａｎＦＴＡ（登録商標）カードの使用を排除する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記インキュベート緩衝液が、ＴｒｉｔｏｎＸ-１００などの界面活性剤を排除する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
配列番号１及び２(動物特異的)、配列番号４及び５(ウシ特異的)、配列番号７及び８(ヒツジ特異的)、配列番号１０及び１１(ブタ特異的)、配列番号１３及び１４(トリ特異的)、及び配列番号１６及び１７(魚特異的)からなる配列の群から選ばれ、そして場合により、当該サンプルに外因性のＤＮＡ、例えば配列番号１９及び２０に記載される配列に特異的なプライマーセットを場合によりさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
リアルタイムＰＣＲを用いてサンプル由来のＤＮＡを増幅するキットであって、それぞれ、配列番号１、２、及び３(動物特異的)、配列番号４、５、及び６(ウシ特異的)、配列番号７、８、及び９(ヒツジ特異的)、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれ、そして場合により、当該サンプルに外因性であるＤＮＡ、例えば配列番号１９、２０及び２１に記載される配列に外因性のＤＮＡに特異的なプライマーセット及びプローブをさらに含む、前記キット。
【請求項３６】
加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭ、を飼料サンプルから増幅するための、請求項３４又は３５に記載のキット。
【請求項３７】
配列番号１〜２１、例えば配列番号１０〜１８に記載される配列に記載される１以上の配列を含む単離核酸。
【請求項３８】
請求項１〜３３に記載の方法に従って得ることができる抽出核酸。
【請求項３９】
実質的に明細書に記載されるサンプルに由来する核酸を抽出する方法。
【請求項４０】
実質的に明細書に記載されるサンプル中のＤＮＡの増幅方法。
【請求項４１】
実質的に明細書に記載されるサンプルに由来するＤＮＡの増幅するためのキット。
【請求項１】
サンプルから核酸を抽出する方法であって、以下のステップ：
(ｉ)インキュベート緩衝液中に約３０〜２５０ｇ、例えば約３５〜４５ｇ、又は約４０ｇのサンプルをインキュベートし；
(ｉｉ)ステップ(ｉ)でインキュベートされたサンプルをオートクレーブし；そして
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)でオートクレーブされたサンプル又はサンプルの一部を、金属キレート剤、例えば金属キレートイオン交換レジンと混合する
を含む、前記方法。
【請求項２】
以下のステップ：
(ｉｖ)ステップ(ｉｉｉ)のサンプル又はその一部から金属キレート剤を沈渣させて、抽出された核酸を含む上清を生成する、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベート緩衝液が、リン酸緩衝液、例えば約０.０５〜０.２Ｍ又は約０.１Ｍの濃度のリン酸緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベート緩衝液が、サンプルの重量の約５００〜１５００％(ｖ/ｗ)、サンプル重量の例えば約９００％(ｖ/ｗ)である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベート緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液が、約６.５〜７.５、又は約７.２のｐＨを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(ｉ)におけるインキュベートが、約５〜６０分、又は約１０〜３０分、例えば約１５分間行なわれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、ステップ(ｉｉ)において、約８５〜１２０℃、又は約９０〜１００℃、例えば約９５℃で、そして場合により約５〜６０分、又は約１０〜３０分、例えば約１５分間オートクレーブされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが、ステップ(ｉｉ)において大気圧で又はその付近でオートクレーブされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記金属キレート剤、例えば対となったイミノジアセテートイオンを含むスチレンジビニルベンゼン・コポリマーであるレジン、例えばＣｈｌｅｘ１００、が、多価金属イオンをキレートする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ(ｉｖ)において、例えば約１００００〜１２０００×ｇ、又は約１１０００×ｇで遠心することにより、前記金属キレート剤、例えば金属キレートイオン交換レジンを沈渣させる、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、動物飼料、例えば反芻動物飼料に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、加工された動物原材料、例えば加工動物タンパク質(ＰＡＰ)又は肉骨粉(ＭＢＭ)を含み、又はこれらの存在について試験される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、動物又は反芻動物ミトコンドリアＤＮＡ、例えば１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアＤＮＡを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚からなる群のうちの１以上に由来するＤＮＡを含む、請求項１〜１３のいずれか一向に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが動物飼料であり、そして当該方法が以下のステップ：
(ｉ)約３５〜４５ｇのサンプルを、約７.１〜７.３のｐＨの０.１Ｍリン酸ナトリウム中に約１０〜２０分間、例えば約１５分間、場合により室温でインキュベートし、
(ｉｉ)ステップ(ｉ)でインキュベートされたサンプルを、約９０〜１００℃で、約１０〜３０分間、例えば約１５分間、大気圧又は大気圧付近でオートクレーブし；そして
(ｉｉｉ)ステップ(ｉｉ)でオートクレーブされたサンプルの一部を、金属キレートイオン交換レジン、例えばＣｈｅｌｅｘ１００と混合させる
を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
約１００００〜１２０００×ｇ、又は約１１０００×ｇで遠心することにより、ステップ(ｉｉｉ)のサンプルの一部からレジンを沈積させるさらなるステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記上清又はステップ(ｉｖ)からのその一定量が、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)又はリアルタイムＰＣＲアッセイなどの増幅反応において使用される、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
(ｖ) 核酸、例えばミトコンドリアＤＮＡなどのＤＮＡの有無を検出するステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭに由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸が、ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲを用いてステップ(ｖ)で検出される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
以下のステップ：
(ｉ)請求項１〜１７に定義される方法に従ってサンプルからＤＮＡを抽出し；そして
(ｉｉ)ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲなどの増幅反応を用いて、抽出されたＤＮＡを増幅する
を含む、サンプル中のＤＮＡを増幅する方法。
【請求項２２】
ステップ(ｉｉ)で増幅されたＤＮＡが、加工された動物材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭに由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲが、プライマー対を使用し、そしてリアルタイムＰＣＲの場合さらにプローブを使用し、ここで当該プライマー及びプローブが、以下の：動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚組織のうちの１以上に特異的である、請求項２１又は請求項２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記プライマー対及びプローブが、動物、反芻動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、及び魚組織からなる群の１以上に由来するミトコンドリアＤＮＡ、例えば１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子をコードするミトコンドリアＤＮＡに特異的である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プライマー対及びプローブのそれぞれが、配列番号１、２、及び３(動物特異的)、配列番号４、５、及び６(ウシ特異的)、配列番号７、８、及び９(ヒツジ特異的)、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライマー対及びプローブが、ブタ、トリ、及び魚組織からなる群の１以上に由来する１６Ｓ ＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡに特異的である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマー対及びプローブがそれぞれ、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲが、プライマーセットをさらに使用し、そしてリアルタイムＰＣＲの場合さらに、プローブを使用し、ここで当該プライマーセット及びプローブが、当該サンプルに外因性なＤＮＡ、例えば配列番号１９、２０、及び２１に記載される配列に特異的である、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記リアルタイムＰＣＲが、ＴａｑＭａｎプローブを用いて行なわれる、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
磁石によるＤＮＡ増幅、例えばPromega(Madison, WI, USA)から販売された食品ついてのＷｉｚａｒｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＤＮＡ精製システムの使用を排除する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＮＡｓｅの使用を排除する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＷｈａｔｍａｎＦＴＡ（登録商標）カードの使用を排除する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記インキュベート緩衝液が、ＴｒｉｔｏｎＸ-１００などの界面活性剤を排除する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
配列番号１及び２(動物特異的)、配列番号４及び５(ウシ特異的)、配列番号７及び８(ヒツジ特異的)、配列番号１０及び１１(ブタ特異的)、配列番号１３及び１４(トリ特異的)、及び配列番号１６及び１７(魚特異的)からなる配列の群から選ばれ、そして場合により、当該サンプルに外因性のＤＮＡ、例えば配列番号１９及び２０に記載される配列に特異的なプライマーセットを場合によりさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
リアルタイムＰＣＲを用いてサンプル由来のＤＮＡを増幅するキットであって、それぞれ、配列番号１、２、及び３(動物特異的)、配列番号４、５、及び６(ウシ特異的)、配列番号７、８、及び９(ヒツジ特異的)、配列番号１０、１１、及び１２(ブタ特異的)、配列番号１３、１４、及び１５(トリ特異的)、及び配列番号１６、１７、及び１８(魚特異的)からなる配列の群から選ばれ、そして場合により、当該サンプルに外因性であるＤＮＡ、例えば配列番号１９、２０及び２１に記載される配列に外因性のＤＮＡに特異的なプライマーセット及びプローブをさらに含む、前記キット。
【請求項３６】
加工された動物原材料、例えばＰＡＰ又はＭＢＭ、を飼料サンプルから増幅するための、請求項３４又は３５に記載のキット。
【請求項３７】
配列番号１〜２１、例えば配列番号１０〜１８に記載される配列に記載される１以上の配列を含む単離核酸。
【請求項３８】
請求項１〜３３に記載の方法に従って得ることができる抽出核酸。
【請求項３９】
実質的に明細書に記載されるサンプルに由来する核酸を抽出する方法。
【請求項４０】
実質的に明細書に記載されるサンプル中のＤＮＡの増幅方法。
【請求項４１】
実質的に明細書に記載されるサンプルに由来するＤＮＡの増幅するためのキット。
【公表番号】特表２００９−５３４０２５（Ｐ２００９−５３４０２５Ａ）
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０５９５３（Ｐ２００９−５０５９５３）
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１４１３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１９０６６
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５０３４４０３１４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１４１３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１９０６６
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５０３４４０３１４）
【Ｆターム（参考）】
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