標本の疾病および生理学的状態の検出のためのストークスシフト放射分光法
ストークスシフト放射スペクトルを、トリプトファン、エラスチン、コラーゲン、ＮＡＤＨおよびフラビンなどの光活性生体分子を含む組織を含有する各種試料について測定した。この新規な手法は新たな情報を引き出すことができ、新たな情報は簡単に引き出して得られるものではなく、同じ試料の励起および／または蛍光発光スペクトルから簡単に得られるものではない。例えば、組織試料のストークスシフト分光法は、ヒトおよび動物の疾病状態を診断できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年２月５日に出願された米国特許仮出願シリアル番号６０／４４４，８６９からの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に化学分析および生物医学的診断の分野に関し、特に分子成分を決定するストークスシフトに関連した蛍光発光および吸収の利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々なホストでの有機分子の放射および吸収は、色彩と分散についてのＮｅｗｔｏｎの研究以来、研究されてきた。物質状態の情報は、放射スペクトルおよび吸収スペクトルを測定することにより得られてきた。４０年以上の間、分光学は、生物学、化学、および固体物理学で生じる基本的な過程を理解する上で重要な役割を演じてきた。生物学に関連して、動物およびヒト組織でのトリプトファン、コラーゲン、エラスチン、ＮＡＤＨ、およびフラビンなどの固有の蛍光物質の存在により、ＣＷおよび時間分解蛍光発光分光学を用いて疾病組織に生じる形態変化を探る潜在的機会が提供される。
【０００４】
１９８４年以来、蛍光発光分光学は癌、良性及び周囲組織部位を分離して診断する道具として使われてきた。典型的には、組織は与えられた波長で励起して様々な波長の光を放射し、それは組織を特徴付ける。ＵＶから青色域（２８０〜５２０ｎｍ）の波長は、構造の変化および分子濃度に関連した、組織内のタンパク質を励起し、スペクトルのフィンガープリントを与える。組織内の粒子は、トリプトファン、コラーゲン、エラスチン、およびＮＡＤＨを含む。
【０００５】
有機生体分子の基礎的な動力学は、エネルギー配位座標（Ｅ−Ｑ）ダイアグラム上に生じる。ここで、Ｅ＝エネルギーおよびＱ＝正規化された無次元の格子変位座標である。生体分子の基底状態および励起状態に関連した電子状態、振動状態および回転状態は、Ｅ−Ｑダイアグラムで表される。吸収および放射遷移は、Ｅ−Ｑダイアグラムでの状態間の垂直遷移として生じる（図１参照）。この過程の時間展開は、無放射格子緩和および励起の間、Ｅ−Ｑダイアグラムに従う。基底状態および励起状態は、電子−格子結合の差により様々な平衡Ｑ座標値で示される。電子−格子結合の差は、Ｈｕａｎｇ−Ｒｈｙｓパラメータ、Ｓで表される。
【０００６】
典型的には、吸収と放射のピークは、様々な波長で起る。放射帯域は励起帯域より低いエネルギーを生じる。放射ピークおよび励起ピークのシフトは、α２Ｓｈωで与えられるストークスシフトとして知られている。ストークスシフトは、放射する有機分子周囲のホスト環境の分極化に依存する。大きなシフトは、極性環境、例えば水で観察される。遷移の双極子モーメントと、励起および放射の間のホスト分子の環境との間のこの相互作用に関連したエネルギー状態の位置づけにおける動力学的変化が存在する。
【特許文献１】B. B. Dans, Feng Liu,およびR. R. Alfano. “Time-resolved fluorescence and photon migration studies in biomedical and model random media.” Rep. Prog. Phys. (1997) 60, 227-292. 英国で出版
【特許文献２】Alfano R. R., D. B. Tata, J. Cordero, P. Tomashefsky, E. W. LongoおよびM. A. Alfano, “Laser induced fluorescence spectroscopy from native cancerous and normal tissues” IEEE J. Quantum Electron, (1984) QE-20, 1507-11.
【特許文献３】Alfano R. R., Das Bidyut B., Joseph Cleary, Romulo Prudente, Edward J. Celmer, “Light sheds light on cancer-distinguishing malignant tumor from benign tissue and tumors”, The Bulletin of the New York Academy of Medicine (1991). 67. 143-150.
【特許文献４】Alfano R. R., G. C. Tang, A. Pradhan, W. Lam, “Fluorescence spectra from cancerous and normal human breast and lung tissues.” IEEE J. Quantum Electron, (1987) QE-23. 1806-11.
【特許文献５】Yuanlong Yang, Edward J. Celmer, Margret Zurawska-Szczepaniak, R. R. Alfano, “Fundamental differences between malignant and benign breast tissues using an optical biopsy.” Photochemistry and Photobiology. 1997, 66, (4): 518-522.
【特許文献６】B. K. Ridley: “Quantum processes in semiconductors”, p237, Clarendon Press Oxford (1982).
【特許文献７】B. HendersonおよびG. F. Imbusch, “Optical spectroscopy of Inorganic Solids”, p. 197, Clarendon Press Oxford (1989).
【特許文献８】R. R. AlfanoおよびS. L. Shapiro, “Ultrafast phenomena in liquids and solids”, Scientific American (1973) 228, 42-55.
【非特許文献１】米国特許No. 4,930,516
【非特許文献２】米国特許 5,042,494
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的の一つは、蛍光発光と吸収を合わせた、ストークスシフトに関連した新規な分光学的方法を開発することである。この方法はストークスシフト分光法（ＳＳＳ）と呼ばれる。
【０００８】
本発明の他の目的は、癌、前癌、正常またはアテローム性動脈硬化症などの疾病状態を特徴付ける生物学的組織および細胞内の天然生体マーカーと関連した変化を、より高感度で検出する可能性を有する新規な分光学的方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施形態によれば、試料の検査方法は、ａ．励起光で試料を励起し、それによって放射光を発生させる工程；ｂ．励起光の波長と周波数からなる群から選択されるパラメータを調整して励起光を変化させる工程；およびｃ．励起光と放射光を同期走査してスペクトルを発生させる工程を含み、励起光の調整したパラメータと放射光の調整したパラメータの間の一定間隔を同期走査の間維持し、かつ一定間隔を、本質的に試料の少なくとも一つの構成成分のストークスシフトであるように維持するものである。
【００１０】
本発明の他の一実施形態によれば、試料の検査方法は、ａ．励起光で試料を励起し、それによって放射光を発生させる工程；ｂ．波長と周波数からなる群から選択されるパラメータを調整して励起光を変化させる工程；ｃ．励起光の調整したパラメータと放射光の調整したパラメータの間の一定間隔を同期走査の間維持しながら、励起光と放射光を同期走査して第１のスペクトルを発生させる工程；ｄ．一定間隔を調整し、ａ）からｃ）の工程を少なくとも一回繰り返して少なくとも第２のスペクトルを発生させる工程を含み、かつ一定間隔を、本質的に試料の少なくとも一つの構成成分のストークスシフトであるように維持するまたは調整するものである。
【００１１】
ストークスシフト放射は、吸収波長と放射波長の間の固定した波長シフト、吸収スペクトルプロファイルと放射スペクトルプロファイルのコンボリューションを与えるΔλ＝λＥ−λＡで測定される。放射強度は固定したΔλ＝λＥ−λＡの波長で測定され走査される。ストークスシフトΔλ＝λＥ−λＡは、周波数領域ではΔν＝νＡ−νＥで表すことができ、Ｈｚ、ＴＨｚまたはｃｍ−１単位で表すことができる。このようにして、組織などの物質中に含まれる重要な分子が強調されるであろう。
【００１２】
ストークスシフト放射スペクトルでは、励起波長および放射波長は、励起波長と放射波長の間の固定値Δλと同期して走査される。放射強度はλＥで測定される。試料中の様々な分子を、励起して明らかにすることができ、固定波長で励起された蛍光発光スペクトルとは全く異なる。ストークスシフト放射強度は、試料中に存在する各分子成分に対するΔλ値に依存する。最大強度は、Δλが励起した特定分子型のストークスシフトにほぼ等しい場合に生じる。組織中の重要分子の蛍光発光ピークは、ストークスシフト放射スペクトルを用いることにより、一回の走査で得ることができる。ピーク位置は、ＳＳスペクトルに対する複数のピークのフィットを用いて決定することができる。ＳＳスペクトルは、癌やアテローム性動脈硬化症の検出などの疾病感知で重要な役割を演ずるであろう。
【００１３】
好適な一実施形態では、少なくとも一つの光ファイバを、試料に励起光を伝播するのに、または試料からビデオシステムに走査のため励起光を伝播するのに、あるいはこれら両方に用いる。光ファイバは、内視鏡系の一部品として用いられる。
【００１４】
本発明を特徴付ける新規性の各種特徴点は、添付した請求項の特徴と開示した一部の形態で指摘される。本発明、その機能の利点、およびその使用により達成される特定の目的をより理解するために、例証および記載した本発明の好適な実施形態にある図および記述事項を援用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明によれば、検査される組織は胸部、尿、結腸、胃、脳、前立腺、または婦人科系組織であってもよい。組織または細胞は、正常、癌、前癌、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される状態であってもよい。励起波長は２００ｎｍから８００ｎｍの範囲で変化させてもよい。
【００１６】
トリプトファン、ＮＡＤＨ、およびフラビンの生体分子を検査するため、これらの分子の試料をSigma Companyから得た。組織はIRB（アイルランド）のNational Disease Research Interchange （ＮＤＲＩ）から提供された。新鮮で、分光測定以前に化学的処理も冷凍もされていなかった。
【００１７】
トリプトファン、ＮＡＤＨおよびフラビンを含む混合溶液を、試験測定のため調製した。この混合溶液中の各成分の濃度は、各成分の蛍光発光強度が同等となるように調整した。
【００１８】
ストークスシフト放射スペクトルは、同期走査モードを選択して、自動二元ランプ系分光光度計（Mediciscience Technology Corp. CD scanner）を用いて行った。励起モノクロメータと放射モノクロメータの間の波長間隔は、Δλ＝λＥ−λＡ＝１０，２０，３０，．．．２００ｎｍまたはΔν＝νＡ−νＥで調整した。対応するΔλ値またはΔν値にしたがって値を計算する。
【００１９】
波長シフトΔλ（ｎｍ）、周波数シフトΔν（ＴＨｚ）および周波数シフトΔν（ｃｍ−１）の間の関係を、表１に示す。（１ＴＨｚ）＝３３．３５６４ｃｍ−１
【００２０】
【表１】
【００２１】
トリプトファン、ＮＡＤＨおよびフラビンの生体分子溶液の放射および吸収スペクトルを合わせて測定し、図２に示す。各分子に関連した吸収ピークおよび放射ピークの曲線は異なる。この違いをストークスシフト（ＳＳ）と呼ぶ。周波数領域でのＳＳ分光学（図１０参照）では、吸収Ａ（ν）スペクトルと放射ＩＥ（ν）スペクトルの重なり領域を測定する（図１０参照）。
【００２２】
【数１】
【００２３】
Δλの範囲は、重なり分解の測定と２つのスペクトルの相関を与える。様々な分子についての測定したストークスシフト値Δλ＝λＥ−λＡを以下の表２に示す。
【００２４】
表２．蛍光発光スペクトルおよび吸収スペクトルによる重要な生体分子の吸収ピーク、放射ピークおよびストークスシフト
【００２５】
【表２】
【００２６】
注：便宜上Δλ空間のストークスシフトを測定するのが一般的なやり方である。しかしながら、周波数シフトの方が正確なＳＳスペクトルを与える。
【００２７】
本発明に係る調整したパラメータが波長であるならば、維持または調整された一定間隔は、約４０ｎｍから１４５ｎｍの範囲内、好ましくは約４０ｎｍから１２０ｎｍである。調整されたパラメータが周波数の場合、一定間隔は約５ＴＨｚから５００ＴＨｚまたは１５０ｃｍ−１から１５，０００ｃｍ−１の範囲内、好ましくは１０ＴＨｚから５００ＴＨｚまたは３００ｃｍ−１から１５，０００ｃｍ−１である。
【００２８】
図３に、１０ｎｍから１００ｎｍの様々なΔλ値を有するトリプトファン溶液のストークスシフト放射スペクトルを示す。放射強度はΔλで変化する。Δλがストークスシフトに等しい場合、放射強度は最大となる。図３では、最大放射強度は（ＳＳ）Δλ＝７０ｎｍであり、これは波長空間で測定した表２に示した結果と一致する。本発明によれば、Δλ値は、Δλ値は、５〜５０ｎｍ、５〜１００ＴＨｚ、または５０〜３０００ｃｍ−１の範囲内で漸増するように調整してもよい。
【００２９】
図４に、様々なΔλ値を有する水中のトリプトファン、ＮＡＤＨとフラビンからなる混合溶液のストークスシフト放射スペクトルを示す。各分子成分についての放射ピークが、放射スペクトルのストークスシフトに見られた。Δλ値を有する各種分子についてのピーク振幅は、各分子成分に関連する。最大強度は、（ＳＳ）Δλが励起した特定の分子のストークスシフトにほぼ等しい場合に生じる。この混合溶液については、ストークスシフトは、トリプトファンおよびＮＡＤＨに対してそれぞれほぼ８０ｎｍと１２０ｎｍであり、フラビンに対して１４０、８０ｎｍである。混合溶液からのこれらの結果は、表２に示した各分子成分単独を含む溶液からの結果よりもやや大きい。
【００３０】
図５に、様々な波長で励起した正常な胸部組織の検査用蛍光発光スペクトルを示す。蛍光発光ピーク位置から、様々な励起波長に関連したトリプトファン、コラーゲン、およびＮＡＤＨが認められる。
【００３１】
様々なΔλ値を有する正常な胸部組織のストークスシフト放射スペクトルを、図６に示す。放射ピーク強度はΔλ値で変化し、最大強度のΔλ値は、様々な分子成分の存在のため異なる。図６のスペクトル曲線は、図５に示した一般的な蛍光発光曲線よりも組織内の分子に対してより高感度である。
【００３２】
図７に、胸部組織についてΔλ〜５０ｎｍを有するストークスシフトスペクトルの計算した複数曲線フィットを示す。フィットさせたピーク位置を以下の表３に示す。
【００３３】
表３．Ｓ．Ｓから胸部ストークスシフトスペクトルの複数曲線フィットに用いたパラメータ（Δλ＝５０ｎｍ）
【００３４】
【表３】
【００３５】
放射波長＝励起波長＋５０ｎｍ
【００３６】
様々なΔλ値を有するスペクトルについては、ストークスシフトは分子成分の存在（トリプトファン、ＮＡＤＨ、コラーゲン、フラビンおよびポルフィリン）に依存するため、曲線ピークフィットはほぼ等しい。
【００３７】
図８に、正常組織および癌組織のＳＳ曲線を示す。図８に示したように、組織試料が癌か、前癌か、または正常であるかを決定するのに、組織試料のスペクトルの少なくとも二つの波長または周波数での強度間の比と既知条件の別の組織試料の同様の強度間の比とを比較してもよい。さらに、組織試料のスペクトルの少なくとも一つの波長または周波数でのピーク位置と既知条件の別の組織試料のピーク位置を比較してもよい。例えば、Ｉ２９０／Ｉ３４０のピーク振幅の比またはこれら２つの曲線の第１ピークのピーク位置のいずれかの差は、in vivoでの組織の正常部位から顕著な癌を診断する方法を与える。通常、癌はＩ２９０／Ｉ３４０値の比が高く、一方、正常組織はＩ２９０／Ｉ３４０値の比が小さい。さらに、ＳＳスペクトルの正常組織の第１ピークの位置は２８８．０８±０．８０であり、癌については２９１．４９±１．６０にシフトする。正常組織と異常組織（例えば癌組織）の第１ピークの位置の波長差（Δλ）は、典型的には１ｎｍより大きい。この差はタンパク質の変化を反映する。ＳＳスペクトル（図８）は、一般的な蛍光発光スペクトル（図１２参照）よりも成分を強調している。
【００３８】
図９に、コラーゲンのＳＳスペクトルを示す。
【００３９】
図１０に、（Δν）average＝７４ＴＨｚでのＴＨｚのＳＳスペクトルを示す。
【００４０】
図１１に、数組のＬＥＤを用いて、様々な励起波長で組織を励起し、例えばＣＣＤまたはＣＭＯＳなどのビデオシステムを用いて、励起光と放射光の波長間の一定間隔を有する様々な波長での放射を検出するのを示す。複数のスペクトル通過帯域フィルタが、同期走査工程で励起光を濾波するのに用いられる。同期走査工程で励起光と放射光を記録するビデオシステムは、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＰＭＴ、光検出器およびアバランシュダイオードであってもよく、ＰＭＴが好ましい。
【００４１】
ＣＣＤまたはＣＭＯＳビデオシステムは、同期走査工程で励起光と放射光を記録するのに用いられる。
【００４２】
図１２に、３００ｎｍで励起した正常胸部組織および癌胸部組織の蛍光発光スペクトルを示す。Ｉ３４０ｎｍ／Ｉ４４０ｎｍ値の比は、癌組織および正常組織について２７．９２および５．４９である。ＳＳと蛍光発光方法とは一致する。図１２から、蛍光発光のプロファイル構造は少ない。コラーゲンやＮＡＤＨなどの一部の成分の蛍光発光ピークは明らかに現われていなかった。図８および図１０を図１２と比較すると、ＳＳスペクトルは、たとえ５０ｎｍの固定Δλ値で走査したとしても、成分のより多くの構造を有している。
【００４３】
一般的な蛍光発光スペクトルでは、励起波長は走査中固定される。試料が一分子成分以上を含む場合、蛍光発光スペクトルは図５や図１２に示したように一回の走査ですべてのピークを示すことができない。組織の様々な蛍光発光ピークを励起するのに様々な励起波長が必要となる。固定波長で励起した蛍光発光スペクトルとは異なり、ストークスシフトスペクトルの励起波長および放射波長は、励起波長（周波数）と放射波長（周波数）の間の固定値Δλまたは（Δν）で同期走査される。この方法によれば、一回の走査後、組織中に存在する様々な分子からの最も強い蛍光発光ピークを得ることができる（図８参照）。走査中、励起波長と放射波長が変化するので、Δλ値が特定分子のストークスシフトに等しい場合、励起波長と放射波長は、存在する特定分子の吸収ピークと放射ピークで示される。最大ストークスシフト振幅は、組織および細胞内の様々なおのおのの光活性生体分子に達する。
【００４４】
本発明は、実施例のみに示される上記実施形態に限定されるものでなく、添付した特許請求の範囲で規定された保護の範囲内で各種方法に変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】吸収遷移および放射遷移と緩和過程を示す有機分子のエネルギー配位座標ダイアグラムである。
【図２】トリプトファン、ＮＡＤＨおよびフラビンの吸収スペクトル、放射スペクトルおよびストークスシフト（ＳＳ）を示す。
【図３】様々なΔλ値についてのトリプトファンのストークスシフト放射スペクトルを示す。
【図４】様々なΔλ値を有するトリプトファン、ＮＡＤＨとフラビンを含む混合溶液のストークスシフト放射スペクトルを示す。
【図５】様々な励起波長で励起した正常な胸部組織の蛍光発光スペクトルを示す。
【図６】プロファイルのそれぞれに記したように様々なΔλ値を有する正常な胸部組織のストークスシフト放射スペクトルを示す。
【図７】マイクロソフトオフィスの“Origin”ソフトウエアを用いて正常な胸部組織のストークスシフト放射の曲線をフィットさせたものを示す。
【図８】癌組織および正常組織のストークスシフト（“ＳＳ”）スペクトルを示す。
【図９】コラーゲンのＳＳスペクトルを示す。
【図１０ａ】正常組織および癌組織に対する（Δν）average＝７４ＴＨｚでのＴＨｚの周波数領域における吸収Ａ（ν）スペクトルと放射ＩＥ（ν）スペクトルの重なりを例示しているＳＳスペクトルである。
【図１０ｂ】正常組織および癌組織に対する周波数領域（ν）におけるＳＳスペクトルである。
【図１１】数組のＬＥＤ（λＩおよび光検出器）を用いて、組織を励起し、固定したΔλ＝λＩ−λｊ（Ｉ＝１，２，．．．ｎ）で配置した（λｊ’）の放射を検出するフィルタを示す。
【図１２】３００ｎｍで励起した正常胸部組織および癌胸部組織（図８で使用したのと同じ組織）の蛍光発光スペクトルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年２月５日に出願された米国特許仮出願シリアル番号６０／４４４，８６９からの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に化学分析および生物医学的診断の分野に関し、特に分子成分を決定するストークスシフトに関連した蛍光発光および吸収の利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々なホストでの有機分子の放射および吸収は、色彩と分散についてのＮｅｗｔｏｎの研究以来、研究されてきた。物質状態の情報は、放射スペクトルおよび吸収スペクトルを測定することにより得られてきた。４０年以上の間、分光学は、生物学、化学、および固体物理学で生じる基本的な過程を理解する上で重要な役割を演じてきた。生物学に関連して、動物およびヒト組織でのトリプトファン、コラーゲン、エラスチン、ＮＡＤＨ、およびフラビンなどの固有の蛍光物質の存在により、ＣＷおよび時間分解蛍光発光分光学を用いて疾病組織に生じる形態変化を探る潜在的機会が提供される。
【０００４】
１９８４年以来、蛍光発光分光学は癌、良性及び周囲組織部位を分離して診断する道具として使われてきた。典型的には、組織は与えられた波長で励起して様々な波長の光を放射し、それは組織を特徴付ける。ＵＶから青色域（２８０〜５２０ｎｍ）の波長は、構造の変化および分子濃度に関連した、組織内のタンパク質を励起し、スペクトルのフィンガープリントを与える。組織内の粒子は、トリプトファン、コラーゲン、エラスチン、およびＮＡＤＨを含む。
【０００５】
有機生体分子の基礎的な動力学は、エネルギー配位座標（Ｅ−Ｑ）ダイアグラム上に生じる。ここで、Ｅ＝エネルギーおよびＱ＝正規化された無次元の格子変位座標である。生体分子の基底状態および励起状態に関連した電子状態、振動状態および回転状態は、Ｅ−Ｑダイアグラムで表される。吸収および放射遷移は、Ｅ−Ｑダイアグラムでの状態間の垂直遷移として生じる（図１参照）。この過程の時間展開は、無放射格子緩和および励起の間、Ｅ−Ｑダイアグラムに従う。基底状態および励起状態は、電子−格子結合の差により様々な平衡Ｑ座標値で示される。電子−格子結合の差は、Ｈｕａｎｇ−Ｒｈｙｓパラメータ、Ｓで表される。
【０００６】
典型的には、吸収と放射のピークは、様々な波長で起る。放射帯域は励起帯域より低いエネルギーを生じる。放射ピークおよび励起ピークのシフトは、α２Ｓｈωで与えられるストークスシフトとして知られている。ストークスシフトは、放射する有機分子周囲のホスト環境の分極化に依存する。大きなシフトは、極性環境、例えば水で観察される。遷移の双極子モーメントと、励起および放射の間のホスト分子の環境との間のこの相互作用に関連したエネルギー状態の位置づけにおける動力学的変化が存在する。
【特許文献１】B. B. Dans, Feng Liu,およびR. R. Alfano. “Time-resolved fluorescence and photon migration studies in biomedical and model random media.” Rep. Prog. Phys. (1997) 60, 227-292. 英国で出版
【特許文献２】Alfano R. R., D. B. Tata, J. Cordero, P. Tomashefsky, E. W. LongoおよびM. A. Alfano, “Laser induced fluorescence spectroscopy from native cancerous and normal tissues” IEEE J. Quantum Electron, (1984) QE-20, 1507-11.
【特許文献３】Alfano R. R., Das Bidyut B., Joseph Cleary, Romulo Prudente, Edward J. Celmer, “Light sheds light on cancer-distinguishing malignant tumor from benign tissue and tumors”, The Bulletin of the New York Academy of Medicine (1991). 67. 143-150.
【特許文献４】Alfano R. R., G. C. Tang, A. Pradhan, W. Lam, “Fluorescence spectra from cancerous and normal human breast and lung tissues.” IEEE J. Quantum Electron, (1987) QE-23. 1806-11.
【特許文献５】Yuanlong Yang, Edward J. Celmer, Margret Zurawska-Szczepaniak, R. R. Alfano, “Fundamental differences between malignant and benign breast tissues using an optical biopsy.” Photochemistry and Photobiology. 1997, 66, (4): 518-522.
【特許文献６】B. K. Ridley: “Quantum processes in semiconductors”, p237, Clarendon Press Oxford (1982).
【特許文献７】B. HendersonおよびG. F. Imbusch, “Optical spectroscopy of Inorganic Solids”, p. 197, Clarendon Press Oxford (1989).
【特許文献８】R. R. AlfanoおよびS. L. Shapiro, “Ultrafast phenomena in liquids and solids”, Scientific American (1973) 228, 42-55.
【非特許文献１】米国特許No. 4,930,516
【非特許文献２】米国特許 5,042,494
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的の一つは、蛍光発光と吸収を合わせた、ストークスシフトに関連した新規な分光学的方法を開発することである。この方法はストークスシフト分光法（ＳＳＳ）と呼ばれる。
【０００８】
本発明の他の目的は、癌、前癌、正常またはアテローム性動脈硬化症などの疾病状態を特徴付ける生物学的組織および細胞内の天然生体マーカーと関連した変化を、より高感度で検出する可能性を有する新規な分光学的方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施形態によれば、試料の検査方法は、ａ．励起光で試料を励起し、それによって放射光を発生させる工程；ｂ．励起光の波長と周波数からなる群から選択されるパラメータを調整して励起光を変化させる工程；およびｃ．励起光と放射光を同期走査してスペクトルを発生させる工程を含み、励起光の調整したパラメータと放射光の調整したパラメータの間の一定間隔を同期走査の間維持し、かつ一定間隔を、本質的に試料の少なくとも一つの構成成分のストークスシフトであるように維持するものである。
【００１０】
本発明の他の一実施形態によれば、試料の検査方法は、ａ．励起光で試料を励起し、それによって放射光を発生させる工程；ｂ．波長と周波数からなる群から選択されるパラメータを調整して励起光を変化させる工程；ｃ．励起光の調整したパラメータと放射光の調整したパラメータの間の一定間隔を同期走査の間維持しながら、励起光と放射光を同期走査して第１のスペクトルを発生させる工程；ｄ．一定間隔を調整し、ａ）からｃ）の工程を少なくとも一回繰り返して少なくとも第２のスペクトルを発生させる工程を含み、かつ一定間隔を、本質的に試料の少なくとも一つの構成成分のストークスシフトであるように維持するまたは調整するものである。
【００１１】
ストークスシフト放射は、吸収波長と放射波長の間の固定した波長シフト、吸収スペクトルプロファイルと放射スペクトルプロファイルのコンボリューションを与えるΔλ＝λＥ−λＡで測定される。放射強度は固定したΔλ＝λＥ−λＡの波長で測定され走査される。ストークスシフトΔλ＝λＥ−λＡは、周波数領域ではΔν＝νＡ−νＥで表すことができ、Ｈｚ、ＴＨｚまたはｃｍ−１単位で表すことができる。このようにして、組織などの物質中に含まれる重要な分子が強調されるであろう。
【００１２】
ストークスシフト放射スペクトルでは、励起波長および放射波長は、励起波長と放射波長の間の固定値Δλと同期して走査される。放射強度はλＥで測定される。試料中の様々な分子を、励起して明らかにすることができ、固定波長で励起された蛍光発光スペクトルとは全く異なる。ストークスシフト放射強度は、試料中に存在する各分子成分に対するΔλ値に依存する。最大強度は、Δλが励起した特定分子型のストークスシフトにほぼ等しい場合に生じる。組織中の重要分子の蛍光発光ピークは、ストークスシフト放射スペクトルを用いることにより、一回の走査で得ることができる。ピーク位置は、ＳＳスペクトルに対する複数のピークのフィットを用いて決定することができる。ＳＳスペクトルは、癌やアテローム性動脈硬化症の検出などの疾病感知で重要な役割を演ずるであろう。
【００１３】
好適な一実施形態では、少なくとも一つの光ファイバを、試料に励起光を伝播するのに、または試料からビデオシステムに走査のため励起光を伝播するのに、あるいはこれら両方に用いる。光ファイバは、内視鏡系の一部品として用いられる。
【００１４】
本発明を特徴付ける新規性の各種特徴点は、添付した請求項の特徴と開示した一部の形態で指摘される。本発明、その機能の利点、およびその使用により達成される特定の目的をより理解するために、例証および記載した本発明の好適な実施形態にある図および記述事項を援用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明によれば、検査される組織は胸部、尿、結腸、胃、脳、前立腺、または婦人科系組織であってもよい。組織または細胞は、正常、癌、前癌、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される状態であってもよい。励起波長は２００ｎｍから８００ｎｍの範囲で変化させてもよい。
【００１６】
トリプトファン、ＮＡＤＨ、およびフラビンの生体分子を検査するため、これらの分子の試料をSigma Companyから得た。組織はIRB（アイルランド）のNational Disease Research Interchange （ＮＤＲＩ）から提供された。新鮮で、分光測定以前に化学的処理も冷凍もされていなかった。
【００１７】
トリプトファン、ＮＡＤＨおよびフラビンを含む混合溶液を、試験測定のため調製した。この混合溶液中の各成分の濃度は、各成分の蛍光発光強度が同等となるように調整した。
【００１８】
ストークスシフト放射スペクトルは、同期走査モードを選択して、自動二元ランプ系分光光度計（Mediciscience Technology Corp. CD scanner）を用いて行った。励起モノクロメータと放射モノクロメータの間の波長間隔は、Δλ＝λＥ−λＡ＝１０，２０，３０，．．．２００ｎｍまたはΔν＝νＡ−νＥで調整した。対応するΔλ値またはΔν値にしたがって値を計算する。
【００１９】
波長シフトΔλ（ｎｍ）、周波数シフトΔν（ＴＨｚ）および周波数シフトΔν（ｃｍ−１）の間の関係を、表１に示す。（１ＴＨｚ）＝３３．３５６４ｃｍ−１
【００２０】
【表１】
【００２１】
トリプトファン、ＮＡＤＨおよびフラビンの生体分子溶液の放射および吸収スペクトルを合わせて測定し、図２に示す。各分子に関連した吸収ピークおよび放射ピークの曲線は異なる。この違いをストークスシフト（ＳＳ）と呼ぶ。周波数領域でのＳＳ分光学（図１０参照）では、吸収Ａ（ν）スペクトルと放射ＩＥ（ν）スペクトルの重なり領域を測定する（図１０参照）。
【００２２】
【数１】
【００２３】
Δλの範囲は、重なり分解の測定と２つのスペクトルの相関を与える。様々な分子についての測定したストークスシフト値Δλ＝λＥ−λＡを以下の表２に示す。
【００２４】
表２．蛍光発光スペクトルおよび吸収スペクトルによる重要な生体分子の吸収ピーク、放射ピークおよびストークスシフト
【００２５】
【表２】
【００２６】
注：便宜上Δλ空間のストークスシフトを測定するのが一般的なやり方である。しかしながら、周波数シフトの方が正確なＳＳスペクトルを与える。
【００２７】
本発明に係る調整したパラメータが波長であるならば、維持または調整された一定間隔は、約４０ｎｍから１４５ｎｍの範囲内、好ましくは約４０ｎｍから１２０ｎｍである。調整されたパラメータが周波数の場合、一定間隔は約５ＴＨｚから５００ＴＨｚまたは１５０ｃｍ−１から１５，０００ｃｍ−１の範囲内、好ましくは１０ＴＨｚから５００ＴＨｚまたは３００ｃｍ−１から１５，０００ｃｍ−１である。
【００２８】
図３に、１０ｎｍから１００ｎｍの様々なΔλ値を有するトリプトファン溶液のストークスシフト放射スペクトルを示す。放射強度はΔλで変化する。Δλがストークスシフトに等しい場合、放射強度は最大となる。図３では、最大放射強度は（ＳＳ）Δλ＝７０ｎｍであり、これは波長空間で測定した表２に示した結果と一致する。本発明によれば、Δλ値は、Δλ値は、５〜５０ｎｍ、５〜１００ＴＨｚ、または５０〜３０００ｃｍ−１の範囲内で漸増するように調整してもよい。
【００２９】
図４に、様々なΔλ値を有する水中のトリプトファン、ＮＡＤＨとフラビンからなる混合溶液のストークスシフト放射スペクトルを示す。各分子成分についての放射ピークが、放射スペクトルのストークスシフトに見られた。Δλ値を有する各種分子についてのピーク振幅は、各分子成分に関連する。最大強度は、（ＳＳ）Δλが励起した特定の分子のストークスシフトにほぼ等しい場合に生じる。この混合溶液については、ストークスシフトは、トリプトファンおよびＮＡＤＨに対してそれぞれほぼ８０ｎｍと１２０ｎｍであり、フラビンに対して１４０、８０ｎｍである。混合溶液からのこれらの結果は、表２に示した各分子成分単独を含む溶液からの結果よりもやや大きい。
【００３０】
図５に、様々な波長で励起した正常な胸部組織の検査用蛍光発光スペクトルを示す。蛍光発光ピーク位置から、様々な励起波長に関連したトリプトファン、コラーゲン、およびＮＡＤＨが認められる。
【００３１】
様々なΔλ値を有する正常な胸部組織のストークスシフト放射スペクトルを、図６に示す。放射ピーク強度はΔλ値で変化し、最大強度のΔλ値は、様々な分子成分の存在のため異なる。図６のスペクトル曲線は、図５に示した一般的な蛍光発光曲線よりも組織内の分子に対してより高感度である。
【００３２】
図７に、胸部組織についてΔλ〜５０ｎｍを有するストークスシフトスペクトルの計算した複数曲線フィットを示す。フィットさせたピーク位置を以下の表３に示す。
【００３３】
表３．Ｓ．Ｓから胸部ストークスシフトスペクトルの複数曲線フィットに用いたパラメータ（Δλ＝５０ｎｍ）
【００３４】
【表３】
【００３５】
放射波長＝励起波長＋５０ｎｍ
【００３６】
様々なΔλ値を有するスペクトルについては、ストークスシフトは分子成分の存在（トリプトファン、ＮＡＤＨ、コラーゲン、フラビンおよびポルフィリン）に依存するため、曲線ピークフィットはほぼ等しい。
【００３７】
図８に、正常組織および癌組織のＳＳ曲線を示す。図８に示したように、組織試料が癌か、前癌か、または正常であるかを決定するのに、組織試料のスペクトルの少なくとも二つの波長または周波数での強度間の比と既知条件の別の組織試料の同様の強度間の比とを比較してもよい。さらに、組織試料のスペクトルの少なくとも一つの波長または周波数でのピーク位置と既知条件の別の組織試料のピーク位置を比較してもよい。例えば、Ｉ２９０／Ｉ３４０のピーク振幅の比またはこれら２つの曲線の第１ピークのピーク位置のいずれかの差は、in vivoでの組織の正常部位から顕著な癌を診断する方法を与える。通常、癌はＩ２９０／Ｉ３４０値の比が高く、一方、正常組織はＩ２９０／Ｉ３４０値の比が小さい。さらに、ＳＳスペクトルの正常組織の第１ピークの位置は２８８．０８±０．８０であり、癌については２９１．４９±１．６０にシフトする。正常組織と異常組織（例えば癌組織）の第１ピークの位置の波長差（Δλ）は、典型的には１ｎｍより大きい。この差はタンパク質の変化を反映する。ＳＳスペクトル（図８）は、一般的な蛍光発光スペクトル（図１２参照）よりも成分を強調している。
【００３８】
図９に、コラーゲンのＳＳスペクトルを示す。
【００３９】
図１０に、（Δν）average＝７４ＴＨｚでのＴＨｚのＳＳスペクトルを示す。
【００４０】
図１１に、数組のＬＥＤを用いて、様々な励起波長で組織を励起し、例えばＣＣＤまたはＣＭＯＳなどのビデオシステムを用いて、励起光と放射光の波長間の一定間隔を有する様々な波長での放射を検出するのを示す。複数のスペクトル通過帯域フィルタが、同期走査工程で励起光を濾波するのに用いられる。同期走査工程で励起光と放射光を記録するビデオシステムは、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＰＭＴ、光検出器およびアバランシュダイオードであってもよく、ＰＭＴが好ましい。
【００４１】
ＣＣＤまたはＣＭＯＳビデオシステムは、同期走査工程で励起光と放射光を記録するのに用いられる。
【００４２】
図１２に、３００ｎｍで励起した正常胸部組織および癌胸部組織の蛍光発光スペクトルを示す。Ｉ３４０ｎｍ／Ｉ４４０ｎｍ値の比は、癌組織および正常組織について２７．９２および５．４９である。ＳＳと蛍光発光方法とは一致する。図１２から、蛍光発光のプロファイル構造は少ない。コラーゲンやＮＡＤＨなどの一部の成分の蛍光発光ピークは明らかに現われていなかった。図８および図１０を図１２と比較すると、ＳＳスペクトルは、たとえ５０ｎｍの固定Δλ値で走査したとしても、成分のより多くの構造を有している。
【００４３】
一般的な蛍光発光スペクトルでは、励起波長は走査中固定される。試料が一分子成分以上を含む場合、蛍光発光スペクトルは図５や図１２に示したように一回の走査ですべてのピークを示すことができない。組織の様々な蛍光発光ピークを励起するのに様々な励起波長が必要となる。固定波長で励起した蛍光発光スペクトルとは異なり、ストークスシフトスペクトルの励起波長および放射波長は、励起波長（周波数）と放射波長（周波数）の間の固定値Δλまたは（Δν）で同期走査される。この方法によれば、一回の走査後、組織中に存在する様々な分子からの最も強い蛍光発光ピークを得ることができる（図８参照）。走査中、励起波長と放射波長が変化するので、Δλ値が特定分子のストークスシフトに等しい場合、励起波長と放射波長は、存在する特定分子の吸収ピークと放射ピークで示される。最大ストークスシフト振幅は、組織および細胞内の様々なおのおのの光活性生体分子に達する。
【００４４】
本発明は、実施例のみに示される上記実施形態に限定されるものでなく、添付した特許請求の範囲で規定された保護の範囲内で各種方法に変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】吸収遷移および放射遷移と緩和過程を示す有機分子のエネルギー配位座標ダイアグラムである。
【図２】トリプトファン、ＮＡＤＨおよびフラビンの吸収スペクトル、放射スペクトルおよびストークスシフト（ＳＳ）を示す。
【図３】様々なΔλ値についてのトリプトファンのストークスシフト放射スペクトルを示す。
【図４】様々なΔλ値を有するトリプトファン、ＮＡＤＨとフラビンを含む混合溶液のストークスシフト放射スペクトルを示す。
【図５】様々な励起波長で励起した正常な胸部組織の蛍光発光スペクトルを示す。
【図６】プロファイルのそれぞれに記したように様々なΔλ値を有する正常な胸部組織のストークスシフト放射スペクトルを示す。
【図７】マイクロソフトオフィスの“Origin”ソフトウエアを用いて正常な胸部組織のストークスシフト放射の曲線をフィットさせたものを示す。
【図８】癌組織および正常組織のストークスシフト（“ＳＳ”）スペクトルを示す。
【図９】コラーゲンのＳＳスペクトルを示す。
【図１０ａ】正常組織および癌組織に対する（Δν）average＝７４ＴＨｚでのＴＨｚの周波数領域における吸収Ａ（ν）スペクトルと放射ＩＥ（ν）スペクトルの重なりを例示しているＳＳスペクトルである。
【図１０ｂ】正常組織および癌組織に対する周波数領域（ν）におけるＳＳスペクトルである。
【図１１】数組のＬＥＤ（λＩおよび光検出器）を用いて、組織を励起し、固定したΔλ＝λＩ−λｊ（Ｉ＝１，２，．．．ｎ）で配置した（λｊ’）の放射を検出するフィルタを示す。
【図１２】３００ｎｍで励起した正常胸部組織および癌胸部組織（図８で使用したのと同じ組織）の蛍光発光スペクトルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．励起光で試料を励起し、それによって放射光を発生させる工程；
ｂ．励起光の波長と周波数からなる群から選択されるパラメータを調整して励起光を変化させる工程；および
ｃ．励起光と放射光を同期走査してスペクトルを発生させる工程を含み、
励起光の調整したパラメータと放射光の調整したパラメータの間の一定間隔を同期走査の間維持し、かつ
前記一定間隔を、本質的に試料の少なくとも一つの構成成分のストークスシフトであるように維持することを特徴とする試料の検査方法。
【請求項２】
前記試料のスペクトルと既知条件の別の試料のスペクトルを比較する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、組織と細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が組織であって、かつ前記方法が、前記組織試料のスペクトルの少なくとも二つの波長または周波数での強度間の比と既知条件の別の組織試料の同様の強度間の比とを比較し、それによって前記組織試料が癌、前癌、または正常であるかを決定する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも二つの波長または周波数での強度間比が、約２９０ｎｍと約３４０ｎｍの波長での強度間比であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
癌組織試料に対する約２９０ｎｍと約３４０ｎｍの波長での強度間比が、正常組織試料に対するそれらの強度間比より高いことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が組織であって、かつ前記方法が、前記組織試料のスペクトルの少なくとも一つの波長または周波数でのピーク位置と既知条件の別の組織試料のピーク位置を比較し、それによって前記組織試料が癌、前癌、または正常であるかを決定する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも一つの波長が約２９０ｎｍであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記調整したパラメータが波長であって、かつ前記一定間隔が約４０ｎｍから１４５ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一定間隔が約４０ｎｍから１２０ｎｍであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記一定間隔が約５０ｎｍであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記一定間隔が約５ＴＨｚから５００ＴＨｚであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一定間隔が約１０ＴＨｚから５００ＴＨｚであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記一定間隔が約１５０ｃｍ−１から１５，０００ｃｍ−１であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記一定間隔が約３００ｃｍ−１から１５，０００ｃｍ−１であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織が、胸部、尿、結腸、胃、脳、前立腺、腎臓、肝臓、および婦人科系組織からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織が、トリプトファン、ＮＡＤＨ、フラビンおよびコラーゲンの少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料が、正常、癌、前癌およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される状態にあることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が、細菌、ウイルスおよび他の生物学的複合種からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記励起光の波長が、２００ｎｍから８００ｎｍの範囲で変化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
スペクトル通過帯域フィルタを、同期走査工程で前記励起光を濾波するのに用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
光検出器、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、およびアバランシュダイオードからなる群から選択されるビデオシステムを、同期走査工程で前記励起光と前記放射光を記録するのに用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ビデオシステムがＣＣＤであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数のＬＥＤを、前記励起光を発生するのに用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記励起光の少なくとも一部が、前記試料を励起する前に、少なくとも一つの光ファイバを通って伝播することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記光ファイバが内視鏡の部品であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記放射光の少なくとも一部が、前記放射光を走査する前に、少なくとも一つの光ファイバを通って伝播することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記光ファイバが内視鏡の部品であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ａ．励起光で試料を励起し、それによって放射光を発生させる工程；
ｂ．波長と周波数からなる群から選択されるパラメータを調整して励起光を変化させる工程；
ｃ．励起光の調整したパラメータと放射光の調整したパラメータの間の一定間隔を同期走査の間維持しながら、励起光と放射光を同期走査して第１のスペクトルを発生させる工程；
ｄ．前記一定間隔を調整し、前記ａ）からｃ）の工程を少なくとも一回繰り返して少なくとも第２のスペクトルを発生させる工程を含み、かつ
前記一定間隔を、本質的に試料の少なくとも一つの構成成分のストークスシフトであるように維持するまたは調整することを特徴とする試料の検査方法。
【請求項３０】
前記試料のスペクトルと既知条件の別の試料のスペクトルを比較する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が、組織と細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組織が、胸部、尿、結腸、胃および婦人科系組織からなる群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組織が、トリプトファン、ＮＡＤＨ、フラビンおよびコラーゲンの少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が、正常、癌、前癌およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される状態にあることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記調整したパラメータが波長であって、前記励起光の波長が、２００ｎｍから８００ｎｍの範囲で変化することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記調整したパラメータが波長であって、かつ前記一定間隔が１０〜１４５ｎｍの範囲内で維持または調整されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記調整したパラメータが波長であって、かつ前記ｄ）の調整工程での一定間隔の変化が、５〜５０ｎｍの範囲内で漸増することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記一定間隔がΔν＝５〜５００ＴＨｚの範囲内で維持または調整されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記ｄ）の調整工程での一定間隔の変化が、５〜１００ＴＨｚの範囲内で漸増することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記一定間隔がΔν＝１５０ｃｍ−１〜１５，０００ｃｍ−１の範囲内で維持または調整されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記ｄ）の調整工程での一定間隔の変化が、５０〜３０００ｃｍ−１の範囲内で漸増することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
スペクトル通過帯域フィルタを、同期走査工程で前記励起光を濾波するのに用いることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＰＭＴ、および光検出器からなる群から選択されるビデオシステムを、同期走査工程で前記励起光と前記放射光を記録するのに用いることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
複数のＬＥＤを、前記励起光を発生するのに用いることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記励起光の少なくとも一部が、前記試料を励起する前に、少なくとも一つの光ファイバを通って伝播することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記光ファイバが内視鏡の部品であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記放射光の少なくとも一部が、前記放射光を走査する前に、少なくとも一つの光ファイバを通って伝播することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
前記光ファイバが内視鏡の部品であることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項１】
ａ．励起光で試料を励起し、それによって放射光を発生させる工程；
ｂ．励起光の波長と周波数からなる群から選択されるパラメータを調整して励起光を変化させる工程；および
ｃ．励起光と放射光を同期走査してスペクトルを発生させる工程を含み、
励起光の調整したパラメータと放射光の調整したパラメータの間の一定間隔を同期走査の間維持し、かつ
前記一定間隔を、本質的に試料の少なくとも一つの構成成分のストークスシフトであるように維持することを特徴とする試料の検査方法。
【請求項２】
前記試料のスペクトルと既知条件の別の試料のスペクトルを比較する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、組織と細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が組織であって、かつ前記方法が、前記組織試料のスペクトルの少なくとも二つの波長または周波数での強度間の比と既知条件の別の組織試料の同様の強度間の比とを比較し、それによって前記組織試料が癌、前癌、または正常であるかを決定する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも二つの波長または周波数での強度間比が、約２９０ｎｍと約３４０ｎｍの波長での強度間比であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
癌組織試料に対する約２９０ｎｍと約３４０ｎｍの波長での強度間比が、正常組織試料に対するそれらの強度間比より高いことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が組織であって、かつ前記方法が、前記組織試料のスペクトルの少なくとも一つの波長または周波数でのピーク位置と既知条件の別の組織試料のピーク位置を比較し、それによって前記組織試料が癌、前癌、または正常であるかを決定する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも一つの波長が約２９０ｎｍであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記調整したパラメータが波長であって、かつ前記一定間隔が約４０ｎｍから１４５ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一定間隔が約４０ｎｍから１２０ｎｍであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記一定間隔が約５０ｎｍであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記一定間隔が約５ＴＨｚから５００ＴＨｚであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一定間隔が約１０ＴＨｚから５００ＴＨｚであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記一定間隔が約１５０ｃｍ−１から１５，０００ｃｍ−１であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記一定間隔が約３００ｃｍ−１から１５，０００ｃｍ−１であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織が、胸部、尿、結腸、胃、脳、前立腺、腎臓、肝臓、および婦人科系組織からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織が、トリプトファン、ＮＡＤＨ、フラビンおよびコラーゲンの少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料が、正常、癌、前癌およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される状態にあることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が、細菌、ウイルスおよび他の生物学的複合種からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記励起光の波長が、２００ｎｍから８００ｎｍの範囲で変化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
スペクトル通過帯域フィルタを、同期走査工程で前記励起光を濾波するのに用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
光検出器、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、およびアバランシュダイオードからなる群から選択されるビデオシステムを、同期走査工程で前記励起光と前記放射光を記録するのに用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ビデオシステムがＣＣＤであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数のＬＥＤを、前記励起光を発生するのに用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記励起光の少なくとも一部が、前記試料を励起する前に、少なくとも一つの光ファイバを通って伝播することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記光ファイバが内視鏡の部品であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記放射光の少なくとも一部が、前記放射光を走査する前に、少なくとも一つの光ファイバを通って伝播することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記光ファイバが内視鏡の部品であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ａ．励起光で試料を励起し、それによって放射光を発生させる工程；
ｂ．波長と周波数からなる群から選択されるパラメータを調整して励起光を変化させる工程；
ｃ．励起光の調整したパラメータと放射光の調整したパラメータの間の一定間隔を同期走査の間維持しながら、励起光と放射光を同期走査して第１のスペクトルを発生させる工程；
ｄ．前記一定間隔を調整し、前記ａ）からｃ）の工程を少なくとも一回繰り返して少なくとも第２のスペクトルを発生させる工程を含み、かつ
前記一定間隔を、本質的に試料の少なくとも一つの構成成分のストークスシフトであるように維持するまたは調整することを特徴とする試料の検査方法。
【請求項３０】
前記試料のスペクトルと既知条件の別の試料のスペクトルを比較する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が、組織と細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組織が、胸部、尿、結腸、胃および婦人科系組織からなる群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組織が、トリプトファン、ＮＡＤＨ、フラビンおよびコラーゲンの少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が、正常、癌、前癌およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される状態にあることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記調整したパラメータが波長であって、前記励起光の波長が、２００ｎｍから８００ｎｍの範囲で変化することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記調整したパラメータが波長であって、かつ前記一定間隔が１０〜１４５ｎｍの範囲内で維持または調整されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記調整したパラメータが波長であって、かつ前記ｄ）の調整工程での一定間隔の変化が、５〜５０ｎｍの範囲内で漸増することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記一定間隔がΔν＝５〜５００ＴＨｚの範囲内で維持または調整されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記ｄ）の調整工程での一定間隔の変化が、５〜１００ＴＨｚの範囲内で漸増することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記一定間隔がΔν＝１５０ｃｍ−１〜１５，０００ｃｍ−１の範囲内で維持または調整されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記調整したパラメータが周波数であって、かつ前記ｄ）の調整工程での一定間隔の変化が、５０〜３０００ｃｍ−１の範囲内で漸増することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
スペクトル通過帯域フィルタを、同期走査工程で前記励起光を濾波するのに用いることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＰＭＴ、および光検出器からなる群から選択されるビデオシステムを、同期走査工程で前記励起光と前記放射光を記録するのに用いることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
複数のＬＥＤを、前記励起光を発生するのに用いることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記励起光の少なくとも一部が、前記試料を励起する前に、少なくとも一つの光ファイバを通って伝播することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記光ファイバが内視鏡の部品であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記放射光の少なくとも一部が、前記放射光を走査する前に、少なくとも一つの光ファイバを通って伝播することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
前記光ファイバが内視鏡の部品であることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００７−５２１４７３（Ｐ２００７−５２１４７３Ａ）
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２９８７（Ｐ２００６−５０２９８７）
【出願日】平成１６年１月２３日（２００４．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１９９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７２２９５
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（５０３１６１６２６）リサーチ ファウンデーション オブ シティ ユニバーシティ オブ ニューヨーク (4)
【出願人】（５９１０１９７０４）
【出願人】（５０５２９４４９２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月２３日（２００４．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００１９９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７２２９５
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（５０３１６１６２６）リサーチ ファウンデーション オブ シティ ユニバーシティ オブ ニューヨーク (4)
【出願人】（５９１０１９７０４）
【出願人】（５０５２９４４９２）
【Ｆターム（参考）】
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