標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法
【課題】医薬リード化合物の設計などにおいて重要な、標的分子と相互作用するファーマコフォアを明らかにするための、ポリペプチドを効率良く取得する方法を提供する。
【解決手段】変異を導入した構造モチーフ、あるいは変異を導入した構造モチーフとランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択する。
【解決手段】変異を導入した構造モチーフ、あるいは変異を導入した構造モチーフとランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分子と相互作用するポリペプチドの選択方法、および目的蛋白質のファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の医薬品は各種抗生物質のような天然物、あるいはステロイドやカテコールアミンのようなヒト内在性物質から誘導された低分子化合物をベースに開発されているものが多い。一方で人工的に合成されたベンゼン置換体、複素環化合物誘導体など比較的シンプルな化合物についても医薬品としての成功例がしばしば見られる。これら従来の医薬品の開発においては限られた数の候補化合物を合成し、活性の確認を経たのち実用性の向上を目指した誘導体の合成展開が行なわれるのが一般的であり、合成と活性測定の対象となる化合物の数は限られていた。しかし医薬品開発の初期段階における合理性が追求された結果、多数の化合物に対して並行して活性試験を行なうハイスループットスクリーニングシステム（ＨＴＳ）がリード化合物取得のために用いられるようになり、特に９０年代初期に進展したコンビナトリアルケミストリーの技術は多検体アッセイ系の進歩とあいまって数百から数十万の低分子化合物ライブラリーを短期間でスクリーニングすることを可能にしている。こうしたシステムは天然の化合物に依存しないリード化合物開発の成功確率を高める一方、アッセイ系でヒットした化合物が医薬として不適である場合が少なくないという問題も生み出している。
【０００３】
しばしば医薬リードとして重要視される生理活性ペプチドはアミノ酸重合体としてコンビナトリアルケミストリーの概念が適用されやすい対象であり、天然のペプチド性リガンドの活性増強のみならず、新規なリガンドの開発も数多く試みられている。化学合成の手法においては非天然型アミノ酸も導入可能な固相合成法がアレイ技術などとともに用いられることが多い。遺伝子工学的な手法も応用可能であり、特に８０年代後半に実用化されたファージディスプレー法はペプチドなどの発現物を増幅可能な遺伝子と対応付けさせることで数百万から数億の多様性を有するライブラリーをスクリーニング対象とすることを可能にした。
【０００４】
ペプチドあるいはその類縁体に属する従来の医薬品はアンギオテンシン、エンドセリン、ソマトスタチン、バソプレッシンなどヒトに内在する生理活性ペプチドリガンドに由来するアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいはプロテアーゼの活性を抑えるための基質配列に由来する阻害剤であることが多い。こうした内在性のリガンドや基質に由来する医薬品の有用性は明らかであるが、創薬リードに成り得るそれらのペプチドの数には限界があり、疾患に対して理想的な創薬を可能にするには新たな相互作用の組合せを開拓する必要がある。ファージディスプレー法のように人工的なライブラリーを提示してスクリーニングをする技術はそれに適していると考えられ、蛋白質―蛋白質相互作用を阻害するペプチドの取得などが実際に試みられている。
【０００５】
しかし医薬のリードとなるペプチドがこの方法により取得される可能性は極めて限られていると予想される。その理由の第一は、ペプチドによる蛋白質―蛋白質相互作用阻害といった人工的な作用機序が受容体へのリガンド結合による応答という自然な機序と同等な薬理活性を生み出し得る場合が限られること、第二は受容体などの相互作用対象と共進化の結果生まれた内在性アゴニストと同じような高い親和性を標的蛋白質と人工的ペプチドの間に持たせることが原理的に難しい場合が多いこと、第三は化学的手法に比べて多様性が高いとは言えファージディスプレー法でスクリーニング可能なライブラリーにも限界が見られること、であり、技術的な解決が期待できる第三の問題において改善を試みない限り人工的な相互作用の同定に基づく医薬リードの創製は効率の悪い方法となる。
【０００６】
ファージディスプレー法において１度のスクリーニングにより探索可能な多様性の範囲は１０の６乗から９乗程度であり、これは２０種類のアミノ酸の組合せの数として５残基から７残基分に相当する。構造活性相関研究により標的分子との相互作用において特に重要な役割を果たしているとされるアミノ酸の数は一般に３から８程度であることが多いが、これは標的分子と直接相互作用しているアミノ酸に注目した場合の数であり、標的分子側が連続した数残基を特異的にリガンドとして認識するような深いキャビティを有していない限り安定な主鎖構造を持たない数残基のペプチドが高い親和性と特異性をもって標的分子に結合することはほとんど起こらない。
【０００７】
ペプチドと標的分子の相互作用の強さは両者の結合に伴う自由エネルギーの変化により決まるものであり、深いキャビティを持たない標的分子に対して強い相互作用がはたらくためには、結合に適した主鎖構造や側鎖の空間配置をペプチド側が持つことにより結合に伴うエントロピー的な不利が少なくなること、あるいは広い結合界面により局所的な相互作用の足し合わせがエネルギー的に有利であることが求められる。前者の条件に関しては、ジスルフィド結合で環状化しているような場合を除いて１０残基以下のペプチドが特定の安定した構造をとることは少なく、後者についても広い結合界面を形成するには１０残基以上が必要となり、いずれにしてもファージディスプレー法で網羅できる多様性の範囲を超えている。
【０００８】
医薬開発におけるペプチドスクリーニングは相互作用様式の解明による低分子化を目的として行なわれることが多い。ペプチドが内在性リガンドである場合、それが得られていることは標的分子の機能解明とリード化合物のスクリーニングに貢献するだけでなく、低分子リガンド設計にも直接的な情報を与える。人工的な相互作用様式の創出を伴うランダムペプチドライブラリーからのスクリーニングもファーマコフォアの同定による低分子化を目的の一つとして行われることが多い。この場合、特定の構造を持たずに標的分子と広い結合界面を形成することによって全体の親和性を獲得している比較的大きなペプチドは低分子でそれを再現することが原理的に困難である。したがって低分子化を目的として行なわれる人工的ペプチドリガンドのスクリーニングにおいては比較的限られた空間内において相互作用界面を抽出すること、そしてその成功確率を高めるためにはペプチド全体から生み出される構造の安定性が結合に伴うエントロピー的な不利を少なくするようなライブラリーを用いること、が重要となる。
【０００９】
独立して安定に存在できる蛋白質の３次構造は一般に百残基以上によって形成され、しばしば機能の単位と重複する。一方で比較的独立した小さな構造が蛋白質の中に含まれていることもあり、核内受容体のＤＮＡ結合ドメインに含まれるジンクフィンガーモチーフ、カルモジュリンなどにおいてカルシウム結合部位となるＥＦハンドモチーフなどはその代表例である。さらに十数残基から５０残基程度の大きさで３次構造を形成するペプチド・小型蛋白質も存在し、その中で複数のジスルフィド結合が構造形成の中心になっているものは特にシスチンノットモチーフと呼ばれる。これらの構造モチーフは構造の安定性を持ったペプチドライブラリーの土台として有用であり、ファージディスプレー法において応用されているものも多い（例えば、非特許文献１および２を参照）。
【００１０】
しかしファージディスプレー法でスクリーニング可能なペプチドの数を考えた場合、こうした構造モチーフの導入はむしろライブラリーの多様性を自ら限定することにつながり易いだけでなく、構造維持に耐えられない変異が導入されたものやフォールディングの問題からファージ上で提示不可能なものなどが想定の範囲を超えて含まれているという理由により目的の質を持ったライブラリーの多様性が期待したスケールよりも低いという問題ももたらす。限られた空間内においてファーマコフォアを抽出し、医薬開発に有益な情報を効率良く得るためには投入できるライブラリーのスケールにおいてファージディスプレー法を上回るスクリーニング技術が求められ、さらにそのスケールの大きなライブラリーは質の点においても優れていることが望まれる。
【００１１】
スクリーニング可能なライブラリーのスケールがファージディスプレー法を上回り、遺伝子工学的手法に特有な問題点に対してもある程度解決が期待できる方法としてリボソームディスプレー法と無細胞蛋白質ディスプレー法（例えば、特許文献１を参照）がある。いずれも細胞を介さずに遺伝情報と発現物を対応付けさせる技術であるが、前者は対応付け分子複合体の作製が容易である反面、その安定性維持のためスクリーニング条件に制約があり柔軟性に乏しい。後者は遺伝情報（ｍＲＮＡ）と発現物（蛋白質あるいはポリペプチド）をピューロマイシンリンカーを介して共有結合させることにより対応付けする技術であり、様々な条件下でスクリーニングできるだけでなく対応付け分子として前者よりはるかに小さいという利点も持つ（例えば、特許文献１あるいは非特許文献３を参照）。
【００１２】
しかしｍＲＮＡが溶媒中に露出しているというリボソームディスプレー法と共通した特徴がリボヌクレアーゼなどの混入する系での安定性という面で問題となるだけでなく、発現物と同等あるいはそれ以上の多様性を有するｍＲＮＡがアプタマーとして標的分子その他と無視できない親和性で結合するという問題も生じさせ、特にランダムペプチドライブラリーのような多様性が大きい系ではそれが無視できなくなることが推測されていた。我々は新たなピューロマイシンリンカーの開発などにより、遺伝情報側を効率良く２本鎖核酸とすることでｍＲＮＡのアプタマーとしての性質を抑える実用的なスクリーニング系の開発に成功し、無細胞蛋白質ディスプレー法によってファージディスプレー法では対処できない多様性の大きさを持ったライブラリーから有用ペプチド・蛋白質をスクリーニングすることを可能にしていた（例えば、特許文献２を参照）。
【００１３】
これらの技術の応用としてはこれまでのところ、天然に得られる遺伝子からライブラリー化されたポリペプチドから標的分子と相互作用する配列を選抜取得するスクリーニングのみしか行われておらず、取得される標的分子と相互作用するポリペプチドの機能にも限界があった。
【特許文献１】ＷＯ９８／１６６３６号公報
【特許文献２】特願２００３−３１５３８５号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，６７１−６７３（１９９４）
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７７，３１７−３３２（１９９８）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ，４１０，７１５−７１８（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ポリペプチドあるいは蛋白質が持ち得る多様性の大きさと比較した場合に、実際の溶液中において行なわれる従来のペプチドあるいは蛋白質のスクリーニング系が、網羅性に著しく欠けていた点を改善し、医薬リード化合物の設計などにおいて重要な標的分子とのファーマコフォアを明らかにするポリペプチドを効率良く取得する方法を提供するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、比較的安定な２次ないし３次の構造を有する天然に由来する構造モチーフあるいはそれらの構造を持つことが期待される人工的な構造モチーフを複数選び出し、それぞれに４ヶ所以上の変異を導入したライブラリーを構築し、さらに通常のランダムペプチドライブラリーもこれに加えて、無細胞蛋白質ディスプレー法を用いて標的蛋白質と接触させ、該蛋白質と相互作用するポリペプチドを選択する工程を繰り返すことにより、より特異的に、また高い親和性で標的蛋白質と相互作用をするポリペプチドを取得することに成功した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
【００１６】
すなわち、本発明によれば、
（１）変異を導入した構造モチーフを標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法、
（２）変異を導入した構造モチーフおよびランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法、
（３）標的分子と相互作用するポリペプチドを選択する方法が、無細胞蛋白質ディスプレー法である上記（１）または（２）に記載の方法、
（４）変異を導入した構造モチーフを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択することを特徴とするファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法、
（５）変異を導入した構造モチーフおよびランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択することを特徴とするファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法、
（６）標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択する方法が無細胞蛋白質ディスプレー法である上記（５）に記載の方法、
（７）上記（４）〜（６）のいずれかに記載の方法により得られたポリペプチドのアミノ酸配列からアミノ酸の存在頻度および／または出現頻度を指標として共通配列を選択する工程を含むことを特徴とする医薬的活性を有するポリペプチドの取得方法、
（８）上記（４）〜（７）のいずれかに記載の方法により得られたポリペプチドを化学的に改変して医薬的活性を向上させることを特徴とするペプチド誘導体の取得方法、
（９）上記（４）〜（８）のいずれかに記載の方法により得られたポリペプチドあるいはペプチド誘導体と標的分子との複合体を作製する工程、該複合体の立体構造解析を行い、標的分子と該ポリペプチドあるいは該ペプチド誘導体との結合部位を特定する工程、同定された結合部位から標的分子のファーマコフォアを明らかにして、該ファーマコフォアに合う低分子化合物を設計する工程を含むことを特徴とする標的分子と相互作用する化合物の分子設計方法、
が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、従来の高次構造解析の結果からは予測が困難な標的蛋白質のファーマコフォアを明らかにするポリペプチド、サブタイプなど類似の標的分子を選択的に認識するポリペプチド等を溶液中での実際のスクリーニングにより効率良く取得する方法が提供される。該方法は非天然型アミノ酸を変異部位に導入するスクリーニングにも対応しやすく、得られたポリペプチドのＣ末端にＰＥＧなどの高分子を導入して安定化を図ることにも適する。該方法により得られたポリペプチドは標的分子と複合体を形成した状態での構造解析、低分子医薬の設計、ペプチド誘導体あるいは蛋白性医薬の開発、医薬リードスクリーニング系におけるコントロール用リガンドの取得、標的分子の検出あるいはイメージング、等において有用である。さらに、安定な構造を土台に持つポリペプチドライブラリーを複数使用してファーマコフォア同定のためにスクリーニングするという方法は実際の溶液中でのスクリーニングのみならず、コンピューターを用いた仮想結合実験においても応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を更に詳細に説明するが、以下の構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらの内容のみに特定されるものではない。
（１）ライブラリーの設計と構築
本発明の１つは、変異構造モチーフ、あるいは変異構造モチーフとランダムペプチドからなるライブラリー（以下、これを「ライブラリー」と称することがある）を標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法である。また、標的分子が蛋白質である場合、上記ライブラリーと標的蛋白質とを接触させ、標的分子と高い親和性を示すポリペプチドを選択することで得られるポリペプチド（本明細書中ではこれを「ファーマコフォアを明らかにするポリペプチド」と称する）は該蛋白質のファーマコフォアを明らかにするものであり、医薬として実用化が可能な低分子化合物あるいはポリペプチド誘導体の開発において有用である。
【００１９】
そこで、本発明の方法に適したポリペプチドのライブラリーを考えると、高い親和性と特異性をもたらすファーマコフォアが選択されるポリペプチドと標的分子との間の比較的限られた空間に存在することが望ましい。そのようなファーマコフォアを効率良く同定するためのポリペプチドを選択するためには限られた空間におけるポリペプチドの多様性を可能な限り大きくすることが必要であり、標的分子と直接相互作用するアミノ酸残基のみならず、それらの配向や揺らぎを規定する他の残基においても多様性が求められる。
【００２０】
ペプチド鎖は側鎖だけでなくアルファ炭素の両側においても比較的高い回転の自由度を持つために仮想的には一定の空間内で様々な構造をとり得るが、実際の標的分子との相互作用においては結合に伴う内部エネルギー的な有利性がエントロピー的な不利を相殺できないような主鎖構造は生じ得ない。選択されるポリペプチドと標的分子との高い親和性は、標的分子側が選択されるポリペプチドの主鎖構造を安定化させるような明確なキャビティを持っていること、あるいは選択されるポリペプチド側が標的分子との結合に適した主鎖構造をとり易いこと、のいずれかによって可能になっていることがほとんどであり、特に２０残基を超えるようなポリペプチドに関しては後者の例が多い。したがって、深いキャビティを持たない標的分子に対してファーマコフォアを特定するためには、主鎖構造が二次ないし三次構造のレベルで安定になりやすいポリペプチドをライブラリー化してスクリーニング対象とすることが合理的と考えられる。
【００２１】
直接的に医薬リード化合物となるようなポリペプチドをスクリーニングにより効率良く得る技術を提供することも本方法の目的の一つであるが、安定な構造をとり易いポリペプチドはペプチダーゼやプロテアーゼに対する感受性が一般に低くなることが期待でき、血中での安定性という点で有利になりやすいと予想される。本発明において使用されるライブラリーは以上のことを踏まえて選定と構築がなされる。
【００２２】
ここで、「ポリペプチド」とは、残基数において６残基から１０残基程度の一般にオリゴペプチドと呼ばれるものから、構造安定性の高い１２０残基程度の大きさを持った蛋白質までを含むものとする。また、「相互作用する」とは、標的分子に結合して該物質の機能を制御することを意味する。さらに、「ファーマコフォア」とは、標的分子と相互作用する分子と標的分子の結合界面に存在して、親和性と特異性の獲得に寄与しているアミノ酸残基や官能基などの複数の部分構造の空間配置を意味する。また、本発明の方法で用いる「標的分子」とは、蛋白質、ポリペプチド、核酸、糖質、脂質、低分子化合物等のいずれのものでもよいが、特定の疾患と関連し、該分子の機能の制御が、該疾患の治療に有用であることがわかっている物質が特に好ましく用いられる。
【００２３】
本発明において、用いられる「構造モチーフ」とは、天然の蛋白質あるいはポリペプチドの全体ないし一部であってもよく、天然の構造からの類推または論理的設計によって得られた人工的なものでもよい。天然のポリペプチドの例としては、コノトキシン、アガトキシン、デンドロトキシン、チャリブドトキシン、アパミンなどのイオンチャネル阻害ペプチド、テッポウウリ由来トリプシンインヒビターやアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害ペプチド、ディフェンシンやヘプシジンなどの抗菌ペプチド、エンドセリンやインシュリンなどのペプチド性ホルモンが挙げられ、これらの多くにおいては二次以上の高次構造が複数のジスルフィド結合によって安定化されている。バソプレッシン、ウロテンシン、オキシトシン、ソマトスタチンのように一つのジスルフィド結合を有する重要な生理活性ペプチドもあり、二つのシステインの間に４残基から１２残基のアミノ酸を含むライブラリーも主鎖構造がある程度制限されたライブラリーとして利用される。
【００２４】
蛋白質の一部ないし全体に由来するものとしては、ジンクフィンガーモチーフ、ＥＦハンドモチーフ、アンキリンリピート、４本ヘリックスバンドル、免疫グロブリンフォールドのように多くの蛋白質に共通して現れる構造が有用である。人工的に設計される構造としては、ヘリックスターンヘリックスのようなアルファヘリックス構造を中心とした配列のライブラリー化が比較的容易である。構造モチーフという言葉は、βターン構造のような定義が明確なものを除けば、二次構造が連結して生じる部分構造や金属イオンへの配位結合で生じる小さな構造など十数残基から数十残基程度の特徴的な構造を意味することが多いが、ここでは一つのジスルフィド結合で生じる数残基から成るループ構造や、一般的な蛋白質のドメイン構造に近い大きさを持つ三次構造、あるいは標的分子との相互作用により初めて安定化される柔軟な構造も含めて「構造モチーフ」と定義する。
【００２５】
このような構造モチーフの中で、本発明の方法に用いるライブラリーとしての配列の選定は、選定された構造モチーフの組合わせによって一次構造上の多様性だけでなくファーマコフォアを探索する空間におけるライブラリーの多様性が大きくなることを目的として行なわれる。例えば一本のαヘリックス、βストランド、あるいはループ上において空間的に近い数残基はその組合せが同じであっても異なるものと見なすことができ、特にループ部分はその配列や周辺の構造によって異なる主鎖構造をとり易い。さらに三次構造的にはそれらの残基が一定の空間内で組合されることになり、主鎖構造及び側鎖の配向と種類が生み出す多様性が著しく大きくなる。
【００２６】
このような多様性を確保するには異なる構造モチーフライブラリーを多種類併用することが望ましいが、実際に用いるスクリーニング系が扱うことの可能なライブラリーのスケールには限界があるため、併用する構造モチーフライブラリーの数と種類、各ライブラリーにおける変異導入箇所の選択は制約の下で有効な多様性を生み出すように行なわれる必要がある。具体的には、用いる構造モチーフのもととなるポリペプチドはその構造が比較的複雑である場合に、立体構造がＸ線結晶構造解析などにより解明され実験的な証明が得られていることが望ましい。立体構造上の情報は相互作用クラスターとして複数の変異を導入する空間を決定する目的で求められるだけでなく、構造維持に著しく不利な変異の導入を避けるためにも重要となる。
【００２７】
例えばβターン構造上に存在するグリシン残基の変異はしばしば分子全体のフォールディングを著しく阻害することが知られており、あるいはプロリン残基は立体構造の中心となる二次構造の形成に不利になることが多い。立体構造が既知であればフォールディングにおいて脱落するポリペプチドを少なくしながら構造モチーフライブラリーの多様性の維持を図ることが比較的容易になる。
【００２８】
変異の導入がフォールディングに著しく不利にならない範囲では、二つ以上の相互作用クラスターを一つの分子に導入することも可能である。無細胞蛋白質ディスプレー法をスクリーニングに用いる場合、４〜２５の変異部位を導入した構造モチーフ、および完全ランダムライブラリーとともに４〜５０種類まとめてスクリーニングすることが好ましい。
スクリーニング技術に由来する制約もいくつか存在し、中でもフォールディングに関する問題はライブラリーの選択に大きな影響を与える。酵母ツーハイブリッド法、ファージディスプレー法、リボソームディスプレー法、無細胞蛋白質ディスプレー法は、フォールディングも含めた発現の効率において一長一短を持ち、翻訳される蛋白質あるいはポリペプチドごとに適不適がある。生物系に依存しない上に比較的安定な対応付け分子を形成する無細胞蛋白質ディスプレー法は翻訳後の巻き戻し操作などにおいて有利な点を持っていると考えられ、複数のジスルフィド結合を持つシスチンノットモチーフ等に対しては特にこの利点を応用しやすいが、すべての構造モチーフのフォールディングに適した条件を確立することは困難であり、さらに提示されるポリペプチドのＣ末端がピューロマイシンを介したｍＲＮＡとの連結のために塞がれているということも時として問題になると予想される。このため構造モチーフの選択に際しては、化学合成物や組換発現物などにおいてフォールディングの容易さが確認されているものを優先することが望ましく、さらにそれらの中ではＣ末端が溶液中に露出してリンカー配列等の付加によるフォールディングの阻害が予想されないものが望ましい。
【００２９】
ライブラリーの変異箇所に導入されるアミノ酸残基の出現確率は、構造モチーフに合わせて可能な範囲で変えることが必要となる。例えば、ジスルフィド結合によって形成される構造モチーフをライブラリーとして用い、あるいは標的分子が細胞外の蛋白質でジスルフィド結合が形成され易い条件でスクリーニングを行なう場合、ランダム部位に出現したシステインは期待した構造モチーフの形成を阻害し、あるいは他の分子との間で架橋される可能性があるため、ランダム化した部位のシステイン出現頻度は低いことが望まれる。さらにαヘリックスやβストランドの変異による不安定化が構造維持を阻害する可能性が高いと考えられる部位においては、それらの二次構造に不利にならないセミランダム化を行なうなどの対応も必要となる。加えて、トリプトファンやチロシンなど一分子に数多く出現した場合に非特異結合が増えるような残基は出現頻度を高くしないこと、最初に選択するライブラリーのスケールを落とすことになる終止コドンの出現頻度も制限すること、なども望まれる。これらのアミノ酸残基出現頻度の制御は、主にＤＮＡ化学合成の段階で塩基の混合比を設定することにより行なわれる。
【００３０】
ライブラリーの構築は、主に化学的に合成した複数のＤＮＡのオーバーラップ伸長法により行なわれる。オーバーラップさせる末端の相補鎖形成配列は、ランダム化部位を含まないほうが望ましい。ライブラリーの多様性の維持と各分子のコピー数格差抑制のため、オーバーラップ伸長反応のサイクルは１〜１０回程度に抑え、増幅のためのＰＣＲ反応は行なわないことが望ましい。
【００３１】
（２） ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドおよびそれをコードする核酸の選抜取得方法
本発明のファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいは後述するドメインポリペプチドの選抜取得方法として、酵母ツーハイブリッド法、ファージディスプレー法、リボソームディスプレー法、無細胞蛋白質ディスプレー法などが用いられるが、より大きなスケールのライブラリーの中からポリペプチドを柔軟な条件で選択できる無細胞蛋白質ディスプレー法が特に好ましく用いられる。
【００３２】
無細胞蛋白質ディスプレー法によるポリペプチドの選抜取得方法は、 （１）ポリペプチド部とそれをコードする核酸部が、核酸部の３’末端に結合した核酸構築物を介して直接結合したポリペプチド−核酸連結体群と標的分子とを接触させる工程、（２）標的分子に特異的に結合した該ポリペプチド−核酸連結体を取得し、該連結体の核酸部を増幅し、これを鋳型の一部として用いてポリペプチド部とそれをコードする核酸部が、核酸部の３’末端に結合した核酸構築物を介して直接結合したポリペプチド−核酸連結体群を調製する工程、（３）上記（１）および（２）の工程を、標的分子と相互作用させたポリペプチド−核酸連結体の核酸部が、標的分子に特異的に結合するポリペプチドをコードすることが確認されるまで繰り返す工程を含むことを特徴とするものである。具体的には、以下のとおりである。
【００３３】
（ｉ）ポリペプチド−核酸連結体および該連結体と標的分子を接触させる工程
本発明の方法で用いられる「ポリペプチド−核酸連結体」は、例えば、ＷＯ９８／１６６３６号公報に記載のもの等のように、ポリペプチド部とそれをコードする核酸部が、核酸部の３’末端に結合した核酸構築物を介して直接結合したものであり、蛋白質の相互作用解析等の強力なツールとなり得る分子である。
【００３４】
ここで、「ポリペプチド部」とは、核酸部に含まれるコーディング配列によりコードされるポリペプチドを含み、ポリペプチドは上記ライブラリーである。また、ポリペプチド−核酸連結体を精製するためのタグと上記蛋白質との融合ポリペプチドも含まれる。「核酸部」とは、ポリペプチド部のポリペプチドをコードするコーディング配列を含む核酸であり、さらに、用いるポリペプチド合成系においてポリペプチドの翻訳が開始されるための配列も含むことが多い。核酸部は一般にｍＲＮＡであり、その鋳型となるＤＮＡを「核酸部前駆体」とする。
【００３５】
核酸部前駆体は、具体的には、コーディング領域と発現制御領域を含むものである。発現制御配列とは、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識される配列等が挙げられる。プロモーター配列の種類は、適用する発現系に適したものを適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、大腸菌ウイルスＴ７のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＴ７プロモーター配列、SP6 RNAポリメラーゼにより認識されるＳＰ６プロモーター配列などが挙げられる。また、翻訳の際にリボソームによって認識される配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＲＮＡ配列（Kozak配列）に対応するＤＮＡ配列や、原核細胞のリボソームによって認識されるシャイン・ダルガノ配列（Shine-Dalgarno）、５’キャップ構造（Ｓｈａｔｋｉｎ，Ｃｅｌｌ，９，６４５−（１９７６））、オメガ配列等のｔａｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓのリボソームによって認識される配列、ＷＯ０３／５６００９号公報に記載の配列、ｒａｂｂｉｔβ−ｇｌｏｂｌｉｎ、Ｘｅｎｏｐｕｓβ−ｇｌｏｂｌｉｎ あるいはｂｒｏｍｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓのリボゾーム認識領域などが挙げられる。また、ポリペプチド−核酸連結体の核酸部を増幅するのに、PCRを用いる場合、PCRプライマー用配列を含むものも挙げられる。また、核酸部前駆体を増幅するためにPCRを用いる場合には、PCRプライマー結合用の共通配列を含むものも挙げられる。
【００３６】
コーディング配列とは、ポリペプチド−核酸連結体の蛋白質部に含まれるポリペプチドをコードする配列であり、この種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。また、該核酸部の３’末端に結合した「核酸構築物」とは、その末端に「核酸誘導体」を結合しており、該核酸部を鋳型として無細胞蛋白質翻訳系又は生細胞中で蛋白質（ポリペプチド）の翻訳を行った場合、ｍＲＮＡの末端付近まで翻訳が進んだ後、該核酸誘導体（例えば、ピューロマイシンなど）がリボソームのＡサイトに入ることにより蛋白質（ポリペプチド）と結合させる機能を有するものを意味する。具体的には、スペーサー、該ポリペプチド−核酸連結体を標識する標識部、また該連結体を固相に結合するための構造、核酸部を逆転写するためのプライマー部等を含むものが好ましい。
【００３７】
「核酸誘導体」としては、無細胞蛋白質翻訳系又は生細胞中で蛋白質（ポリペプチド）の翻訳が行われた時に、合成された蛋白質（ポリペプチド）のＣ末端に結合する能力を有する化合物である限り限定されないが、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、ピューロマイシン（Puromycin）と３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycinaminonucleoside 、 PANS-アミノ酸）、すなわち、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。
【００３８】
また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、すなわち、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。また、核酸あるいは核酸とアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべて本発明で用いられる核酸誘導体に含まれる。核酸誘導体としては、ピューロマイシン、ＰＡＮＳ−アミノ酸もしくはＡＡＮＳ−アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルデオキシシチジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。
【００３９】
このような核酸誘導体は、それ自体既知の化学結合方法によって製造することができる。具体的には、リン酸ジエステル結合で合成ユニットを結合させる場合は、ＤＮＡ合成機に一般的に用いられているホスホアミダイド法などにより固相合成で合成することが可能である。ペプチド結合を導入する場合は、活性エステル法などにより合成ユニットを結合させるが、ＤＮＡとの複合体を合成する場合は、両方の合成法に対応が可能な保護基が必要になる。
【００４０】
「スペーサー」は、ポリエチレン又はポリエチレングリコールあるいはその誘導体などの高分子物質や、オリゴヌクレオチドやペプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質等が用いられ、好ましくはポリエチレングリコールが用いられる。スペーサーの長さは特に限定されないが、好ましくは、分子量１５０〜６０００であるか、または主鎖の原子数は１０原子から４００原子であり、さらに好ましくは、分子量６００〜３０００であるか、または主鎖の原子数が４０原子から２００原子である。また、標識部を有しててもよい。
【００４１】
「標識部」は、親和性物質、共有結合性物質、蛍光物質、分解性物質等が挙げられる。これらは、「該連結物を固相に結合するための構造」としても用いられるし、また「該連結物を精製するための構造」としても用いられる。親和性物質としては、ポリＡ配列、ポリＴ配列、ビオチン、ＦＬＡＧ等の各種抗原又は抗体、Ｈｉｓタグ、ＮＴＡ等の配位子、受容体リガンド等が挙げられる。また、共有結合性物質としては、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド等の核酸末端部分、ヒドラジド、ケトン、チオエステル等の官能基、ソラレン等の架橋性物質が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセイン、オレゴングリーン、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ４８８等が挙げられる。分解性物質としては、光反応で分解する1-(2-ニトロフェニル)-エチル基を有する誘導体や、プロテアーゼやペプチダーゼに認識されるアミノ酸配列等が挙げられる。これらの標識物質は、それ自体既知の通常用いられるものであり、容易に入手可能であり、また常法により核酸等に結合して標識することができる。
【００４２】
好ましい核酸部とその３’末端側に結合した核酸構築物、核酸誘導体（以下、これを「ポリペプチド−核酸連結体鋳型」と称することがある）の好ましい構造としては、核酸部であるＲＮＡと、核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合している１本鎖核酸（以下、これを「スペーサー鎖」と称することがある）がアニーリングした構造を有し、さらに該スペーサー鎖と標識部を含む1本鎖核酸と核酸部がそれぞれ結合しているものが挙げられる。具体的には、PCT/JP2004/０１３３９９号明細書に記載のもので、製造法も該明細書に記載された方法が好ましく用いられる。このような構造を有することにより、核酸部と核酸構築物のRNAリガーセ等による結合効率が高く、またポリペプチド−核酸連結体を標識部により精製でき、核酸部のRNAを逆転写することができ、さらに核酸部を2本鎖DNAとすることもできる。
【００４３】
かくして構築されたポリペプチド−核酸連結体鋳型を蛋白質翻訳系に導入することによりポリペプチド−核酸連結体を製造することができる。核酸からそれがコードする蛋白質を人工的に生成させるための翻訳系は当業者に公知である。具体的には、適当な細胞より蛋白質合成能を有する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を合成させる無細胞蛋白質合成系が挙げられる。このような無細胞蛋白質合成系には、リボゾーム、開始因子、伸長因子及びｔＲＮＡ等の翻訳に必要な要素が含まれている。
【００４４】
このような無細胞蛋白質合成系としては、例えば、真核生物の無細胞蛋白質合成系が用いられ、より具体的には、ウサギ網状赤血球抽出液やコムギ胚芽抽出液などが挙げられるが、これらに限られるものではない。無細胞蛋白質合成系は、キットとして市販されているものを使用することができる。例えば、ウサギ網状赤血球抽出液のキットとしては、Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（Promega社製）等が用いられ、またコムギ胚芽抽出液としては、ゾイジーン無細胞蛋白質合成システム（ゾイジーン社製）や、ＰＲＯＴＥＩＯＳTM Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ（TOYOBO社製）等が挙げられる。蛋白質翻訳系としては、生細胞を使用してもよく、具体的には、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞等を用いることができる。無細胞蛋白質翻訳系又は生細胞などは、その中に蛋白質をコードする核酸を添加するか又は導入することによって蛋白質合成が行われるものである限り特に制限はない。本発明の核酸構築物を無細胞蛋白質合成系に導入する直前に、６０〜９０℃で加熱した後急冷する工程を行うと、蛋白質−核酸連結体の合成効率が高くなるため好ましい。
【００４５】
上記翻訳反応液から、ポリペプチド−核酸連結体を精製する場合、標識鎖に親和性物質あるいは共有結合物質が結合している場合には、該親和性物質あるいは共有結合物質を介して精製を行うことができる。精製の方法は、用いる親和性物質および共有結合物質に応じて適宜選択してそれ自体既知の定法を用いることができる。
上記で製造されたポリペプチド−核酸連結体は、上記標的分子と接触させ、該物質と相互作用する連結体を選択取得する工程に供する。この選択方法は、ポリペプチド−核酸連結体中のポリペプチドが有する機能（生物活性）を用いて標的分子と相互作用するポリペプチドを該連結体として選択することを意味する。このような相互作用の解析方法としては、例えばＷＯ98/16636号公報に記載の方法を用いることができる。また、標的分子と接触させるポリペプチド−核酸連結体は、上記ライブラリーを有する複数の連結体群である。
【００４６】
また、本発明のポリペプチド−核酸連結体および標的分子は、固相（支持体）に結合させて用いることもできる。ポリペプチド−核酸連結体の固相への結合は、上記標識部に親和性物質や共有結合性物質が結合している場合には、これらを用いて行うことができる。具体的には、親和性物質又は共有結合性物質が親和性を有するまたは結合する物質を予め固定化した固相に、上記ポリペプチド−核酸連結体を接触させることにより、当該ポリペプチド−核酸連結体を固相に容易に固定化することができる。固相への標的分子の結合は、例えば、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．＆Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，４０４−４０６；Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９０２２−９０２６等に記載されている方法等により行うことができる。
【００４７】
固相（支持体）としては、通常の核酸、ポリペプチド、糖質、脂質、化合物等の固定化に用いることができる支持体であれば特に限定されない。支持体としては、親和性物質や共有結合性物質どうしの結合形成、あるいは標的分子の結合に悪影響を及ぼさないものであればその形状は特に限定されず、例えば、平板、マイクロウェル、ビーズ等の任意の形態をとることができる。支持体の材質としては、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、アガロース、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー類、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブランフィルター等の多孔質物質を挙げることができる。
【００４８】
上記選択方法に付するポリペプチド−核酸連結体は、核酸部がRNAのものでもよいし、ｍＲＮＡ鎖をＤＮＡに逆転写したポリペプチド−逆転写核酸連結体でもよい。逆転写反応に必要な試薬及び反応条件は当業者に周知であり、必要に応じて適宜選択することができる。さらに得られたポリペプチド−逆転写核酸連結体のＲＮＡをＲＮＡ分解酵素などを用いて分解し、ＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ反応をすることにより２本鎖ＤＮＡ−蛋白質連結体を作製して用いることもできる。このような、ポリペプチド−逆転写核酸連結体、あるいは２本鎖ＤＮＡ−ポリペプチド連結体を用いれば、核酸部分の安定性がよいこと、また１本鎖ＲＮＡの非特異的吸着がないため好ましい。
【００４９】
（ii）標的分子に特異的に結合したポリペプチド−核酸連結体の取得、核酸部の増幅、該核酸部を鋳型の一部としたポリペプチド−核酸連結体の調製工程
上記選択方法で選択されたポリペプチド−核酸連結体は、これを再度標的分子との相互作用に基づいて選択する工程に供する。一度選択されたポリペプチド−核酸連結体の核酸部を増幅して、さらにポリペプチド−核酸連結体とするためには、（ａ）選択取得されたポリペプチド−核酸連結体の１本鎖ＲＮＡ部分を必要に応じて分解する等した後に、これをＰＣＲなどで増幅し（増幅工程）、（ｂ）増幅されたＤＮＡ鎖をもとにｍＲＮＡ鎖を製造し、さらに上記のポリペプチド−核酸連結体鋳型を製造し、これを翻訳してポリペプチド−核酸連結体を調製することにより行なうことができる。
【００５０】
（ａ）増幅工程は、ＰＣＲを用いて例えば以下のように行うことも好ましい。ポリペプチド−核酸連結体の核酸中、増幅するのは少なくともコーディング配列を含む領域である。このように増幅されたＤＮＡについて、それ自体既知の定法により塩基配列を解析することにより、上記選択方法で選択された蛋白質をコードするＤＮＡ配列を同定できるので、該配列をもとにＤＮＡまたはＲＮＡも取得することができる。該領域を増幅するのに用いられるＰＣＲプライマーとしては、特に制限はないが、全てのポリペプチド−核酸連結体に共通に用いられる配列として、５’側のプライマーは、コーディング配列の５’上流側に連結されている配列が好ましく用いられる。具体的には、上記したポリペプチド−核酸連結体の場合、５’側のプライマーは、翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列などが好ましく用いられ、３’側のプライマーは、タグ配列や共通配列が好ましく用いられる。
かくして調製されたポリペプチド−核酸連結体鋳型は、上記（i）に記載の方法により翻訳され、ポリペプチド−核酸連結体が調製される。
【００５１】
（iii）濃縮操作
本発明の方法では、上記（i）および（ii）に記載の工程を、標的分子に特異的に結合したポリペプチド−核酸連結体が全体として標的分子に対して高い親和性と特異性を示すまで繰り返す（本明細書では、これを「濃縮操作」と称することがある）。求められる親和性は目的により異なるが、高い親和性を有するポリペプチドの取得を目的とする場合はライブラリーと接触させる標的分子の濃度を低くすることが必要であり、期待する解離定数の近辺でその値を設定する。
【００５２】
本発明の方法では、一般にこの濃縮操作を２〜１５回行なうことによって、ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドと、それをコードする核酸の連結体が取得される。取得された連結体の核酸部を上記方法により増幅して常法により塩基配列を解析することにより、該ポリペプチドをコードする塩基配列を同定することができる。また、該塩基配列を有する核酸を常法により合成すればポリペプチドをコードする核酸を取得することができ、またこの核酸を公知の、例えば、上記した蛋白質合成方法等により翻訳合成することにより、ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドを取得することができる。
【００５３】
さらには、多様性の大きなライブラリーから濃縮操作の結果として同定される上記塩基配列は、一般に複数であるので、上記の標的分子への親和性に基づいて選択されたポリペプチドが、ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドであることを確認するためには、標的分子に作用してその機能に影響するかどうかを調べることが好ましい。具体的方法としては、まず上記で取得された塩基配列がコードするポリペプチドを常法により化学合成し、あるいは該塩基配列を有する核酸を常法により合成して、大腸菌あるいは無細胞翻訳系で翻訳合成する等の方法により、活性測定用のポリペプチドを調製する。生体内で標的分子と相互作用する蛋白質等と標的分子の結合に該ペプチドが与える影響、あるいは標的分子の機能を測定可能な細胞実験系における該ペプチドの薬理作用等を調べることにより、ファーマコフォアの解明に有用なポリペプチドを選択することができる。
【００５４】
また、上記のようにして取得したポリペプチドのアミノ酸配列からアミノ酸の存在頻度および／または出現頻度を指標として共通配列を選択する工程を含むことを特徴とする医薬的活性を有するポリペプチド（本明細書中では、これを「ドメインポリペプチド」と称することがある）を取得することもできる。具体的には、上記で取得されたポリペプチドをコードする核酸からドメインポリペプチドをコードするクラスターを取得することにより行う。「ドメインポリペプチドをコードするクラスター」（以下、「クラスター」と称することがある）とは、上記ドメインポリペプチドをコードする核酸を共通配列として含むほぼ同じ長さの核酸のかたまりを意味する。共通配列を含むほぼ同じ長さのかたまりとは、上記で取得されるポリペプチド−核酸連結体群の５０％以上が該共通配列を含み、その鎖長が最も短い核酸と長い核酸が１倍〜１０倍の範囲に入ってくることを意味する。このようなクラスターが形成されたことは、形成を確認し得る方法であれば特に制限はないが、例えば、標的分子と相互作用することで選択取得されたポリペプチド−核酸連結体の核酸部を、ＲＮＡのまま、又はＤＮＡとしてアガロースゲルまたはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中を電気泳動等で分離した場合にバンドが観察されることにより確認することができる。
【００５５】
（３）ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドを用いた医薬開発
本発明に従ったライブラリーのスクリーニングで取得されたポリペプチドに対して解析実験を行なうことにより、医薬リード開発に必要な情報がもたらされる。相同性の高い配列が複数得られている場合にはそのアライメントから構造活性相関についての情報が少なからず得られることがある。配列のアライメントから必要な情報が充分得られない場合は、取得された配列をもとにそれをコードするＤＮＡの再ランダム化を行い、無細胞蛋白質ディスプレー法またはその他の方法でスクリーニングするか、あるいは置換した部位を有するポリペプチドを無細胞翻訳、大腸菌発現、化学合成などにより１つないし数百種合成して活性測定をすることで構造活性相関についての情報を得ることができる。
【００５６】
得られたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドが明確に区別され得る複数の立体構造あるいはジスルフィド架橋をとる場合には、実際に該ポリペプチドを合成して活性に必要な立体構造あるいはジスルフィド架橋を確認する必要があり、立体構造の確認方法としてはＸ線結晶構造解析、ＮＭＲによる構造解析、円偏光二色性解析などが挙げられ、ジスルフィド架橋の確認方法としては酵素による限定加水分解法と質量分析法を合わせた方法がある。
【００５７】
得られたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドと標的分子の間でファーマコフォアを抽出する方法としては、両者が結合した共結晶を形成させ、Ｘ線結晶構造解析により両者の座標を得ることがもっとも望ましい。得られた空間座標をもとに上記ポリペプチド側を改変する、低分子をドッキングさせる、あるいは新規に原子を発生させてde novoで分子を形成する等の手法により上記ポリペプチドと同様の活性を持った低分子化合物を開発することが可能となる。共結晶が得られない時でも、上記ポリペプチド側の立体構造が土台となる構造モチーフ等から推測できる場合、あるいはＭＤ等の手法により限られた主鎖構造が候補となる場合には標的分子側の立体構造情報の有無に関わらず上記ポリペプチドの低分子化合物への改変ができることもある。さらに一般的に、上記ポリペプチド側についての詳細な構造情報はＮＭＲによる溶液中での立体構造解析により取得することが比較的容易である。上記ポリペプチド側あるいは標的分子側において相互作用に関わっている部位についての情報が著しく不明である場合にはＨＳＱＣ（Heteronuclear single quantum correlation）等の手法が有用である。これらの構造情報とペプチドミメティクスの手法の組み合わせによっても新たな低分子化合物が創出される。
【００５８】
かくして設計された低分子化合物は、標的分子が疾病に関連するものである場合、該疾病治療薬として用いることができる。この場合、上記工程により医薬組成物を製造する方法も本発明に含まれる。
取得されたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドをそのまま、あるいは改変を加えてペプチド医薬として応用することも可能である。親和性と選択性の向上を目的とした改変には通常のアミノ酸あるいは非天然型アミノ酸による置換等が有効である。また、ヒトに対する抗原性を低下させることを目的とした改変が行なわれる場合もある。安定性を目的とした改変においては、該ポリペプチドの主鎖あるいは側鎖の置換の他にＰＥＧなどの高分子との融合が行なわれることもあり、上述した無細胞蛋白質ディスプレー法で選択されたポリペプチドは特にＣ末端とその周辺への導入に対して許容性が高いと予想される。
【００５９】
取得されたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドはそれ自体あるいはその構造情報から医薬リードを開発する目的以外にも応用でき、例えば蛍光プローブをポリペプチドに導入することでＨＴＳシステムにおいて多数の低分子化合物ライブラリーの活性を調べるための競合リガンド（Surrogate ligand）として用いることも可能である。蛍光プローブを導入した該ポリペプチドはイメージング等にも応用できる。
【００６０】
さらに本発明で取得されたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドを固相化することにより標的分子を検出するチップ等を作製することもできる。固相化の方法としては、ビオチン化、ポリペプチドの官能基とオルトゴナルな官能基の導入等が挙げられる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ ライブラリーDNAの配列とその構築
ライブラリー化する配列として、３本のジスルフィド結合を持つ構造モチーフを１０種、２本のジスルフィド結合を持つ構造モチーフを４種、１本のジスルフィド結合を持つループ状のモチーフを５種、ジスルフィド結合を持たない構造モチーフを３種、１５残基のランダムライブラリーを１種、合計２３種選択した。これらを発現させるために用いられるＤＮＡの原料として、配列番号１〜５１のＤＮＡをＤＮＡ合成機により合成した。このうち配列番号１〜３３はランダムあるいはセミランダム化する残基に相当する部位に混合塩基が導入されており、そのＡ：Ｔ：Ｇ：Ｃ比がＫにおいて０：５０：５０：０、Ｍにおいて５０：０：０：５０となるようにホスホアミダイトを混合した。Ｎは合計４種類の混合比でホスホアミダイトを混合し、そのＡ：Ｔ：Ｇ：Ｃ比は混合比１が３０：１５：３０：２５、混合比２が３０：３０：３０：１０、混合比３が１５：３０：２５：３０、混合比４が３０：３０：１０：３０となるようにした。基本的に配列番号１〜１４、１６〜２２においてＫの前に位置するＮが混合比２、Ｋの２つ前に位置するＮが混合比１であり、配列番号１５、２３〜３３においてはＭの後に位置するＮが混合比４、Ｍの２つ後に位置するＮが混合比３である。この基本則に優先してＮの混合比を指定した部位もあり、Ｇの次で後にＫが続くＮは混合比１、ＴとＴに挟まれたＮは混合比３、Ｍの次で後にＣが続くＮは混合比３とした。さらに配列番号１の３７番目、配列番号２の７２番目、配列番号６の６１番目、配列番号８の５７番目および配列番号１０の５７番目のＮは混合比１、配列番号５の７２番目および配列番号１０の３９番目のＮは混合比２、配列番号２８の４９番目、配列番号２９の２０番目、配列番号３１の４２番目および配列番号３３の２４番目のＮは混合比３、配列番号３１の２１番目および配列番号３３の２３番目のＮは混合比４とした。
【００６２】
化学合成したＤＮＡをオーバーラップ伸長反応により連結した。反応系としてはＴＯＹＯＢＯ社製ＫＯＤ ｐｌｕｓを用い、連結する２種のＤＮＡの濃度を０．５Ｍとし、ＰＣＲ装置中で９４℃で２分反応後、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、６８℃で５分の反応を５回ないし１０回繰り返し、さらに６８℃で５分反応させた。配列番号１と２３、配列番号２と２４、配列番号３と３５、配列番号４と２５、配列番号５と２６、配列番号６と２７、配列番号７と２８、配列番号８と２９、配列番号９と３０、配列番号１０と３１、配列番号１１と３６、配列番号１２と４１、配列番号１３と４２、配列番号１４と３６、配列番号１５と５０、配列番号１６と３６、配列番号１７と３６、配列番号１８と３６、配列番号１９と３６、配列番号２０と４３、配列番号２０と３２、配列番号２１と３２、配列番号２２と３３、これらの組合わせで連結を行なうことによりそれぞれ生成物１〜２３を得た。
【００６３】
目的物の純度が低い場合は８Ｍ尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し、抽出濃縮操作によって次の反応に用いた。続いて生成物１と配列番号３４、生成物２と配列番号３４、生成物４と配列番号３６、生成物５と配列番号３６、生成物６と配列番号３７、生成物７と配列番号３８、生成物８と配列番号３９、生成物９と配列番号３７、生成物１０と配列番号４０、生成物２１と配列番号４４、生成物２２と配列番号４４、生成物２３と配列番号３６のオーバーラップ伸長反応によりそれぞれ生成物２４〜３５を得た。目的物の純度が低い場合は８Ｍ尿素変性ＰＡＧＥで精製した。さらに生成物２４と配列番号４５、生成物２５と配列番号４６、生成物３と配列番号４７、生成物２６と配列番号４５、生成物２７と配列番号４６、生成物２８と配列番号４８、生成物２９と配列番号４７、生成物３０と配列番号４５、生成物３１と配列番号４７、生成物３２と配列番号４７、生成物１１と配列番号４７、生成物１２と配列番号４７、生成物１３と配列番号４７、生成物１４と配列番号４９、生成物１５と配列番号３４、生成物１６と配列番号４７、生成物１７と配列番号４７、生成物１８と配列番号４７、生成物１９と配列番号４７、生成物２０と配列番号４７、生成物３３と配列番号４７、生成物３４と配列番号５１、生成物３５と配列番号４７、の組合せでオーバーラップ伸長反応を行い、それぞれ生成物３６〜５８を得た。これらはすべて８Ｍ尿素変性ＰＡＧＥで精製し、得られたＤＮＡを定量して転写用の鋳型とした。
【００６４】
連結されたＤＮＡ配列は転写プロモーター配列のあとにｍＲＮＡに転写される配列として翻訳エンハンサー配列、ライブラリー配列、リンカー配列、ＦＬＡＧ配列、リンカー配列、ピューロマイシンリンカー結合配列を有している。得られたＤＮＡのうち生成物３９と４１の配列解析を行なったところ、上記のコンストラクトを完全に含む配列は生成物３９で１９/３１（６１％）、生成物４１で１８/３２（５６％）であり、このうちランダム化部位に終止コドンを含まないものはそれぞれ１５（４８％）、１４（４４％）であった。この配列解析の結果得られたランダム化部位におけるアミノ酸出現頻度（観測値）をその期待値とともに図１に示した。
【００６５】
実施例２ ライブラリーDNAの転写と転写産物のピューロマイシンリンカーとの連結
生成物３６〜５８のＤＮＡ分子を大きさなどを基準として９つのグループに分類し、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｒｉｂｏｍａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて定法に従い転写反応を行なった。翻訳時におけるｍＲＮＡの安定性向上を目的として転写反応液にはキャップアナログ（７．２ｍＭ、ＲＮＡ Ｃａｐｐｉｎｇ Ａｎａｌｏｇ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。９つのグループの組み合わせとＤＮＡ量（括弧内ｐｍｏｌ）、転写反応液の量（括弧内・μｌ）は次の通りである。生成物３６（４．２ｐｍｏｌ）（５０μｌ）、生成物３７
（１．７ｐｍｏｌ）と生成物４９（６．７ｐｍｏｌ）（５０μｌ）、生成物３８（５．８ｐｍｏｌ）と生成物４７（３．３ｐｍｏｌ）と生成物４８（４．２ｐｍｏｌ）（７０μｌ）、生成物３９（７．５ｐｍｏｌ）と生成物４０（７．５ｐｍｏｌ）（７５μｌ）、生成物４１（７．５ ｐｍｏｌ）と生成物４３（５．８ｐｍｏｌ）と生成物４４（５．８ｐｍｏｌ）（１００μｌ）、生成物４２（６．７ｐｍｏｌ）と生成物４５（３．３ｐｍｏｌ）（５０μｌ）、生成物４６（２．５ｐｍｏｌ）と生成物５５（３．３ｐｍｏｌ）（５０μｌ）、生成物５０〜５４（各３．３ｐｍｏｌ）（８０μｌ）、生成物５６（１．７ｐｍｏｌ）と生成物５７（３．３ｐｍｏｌ）と生成物５８（３．３ｐｍｏｌ）（６０μｌ）。得られた生成物をこの順に従って生成物５９〜６７とする。分析のために各ＤＮＡを鋳型に小スケールで転写反応を行い、生成物３６〜５８から生成物６８〜９０を得た。
【００６６】
続いてこれらのｍＲＮＡを特願２００３−３１５３８５号明細書に記載のピューロマイシンリンカー（Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ）と連結した。ピューロマイシンとｍＲＮＡの濃度がそれぞれ０．７５μＭ、０．５μＭになるように５％ジメチルスルホキシドを含むＴ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ）に溶解し、７２℃で１５０秒加熱したのち室温で１２分放置し、さらに１５℃まで冷却したのち１００分の１量（体積比）のＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を加えて１５℃で約２時間反応させた。実際に反応させたｍＲＮＡの量は生成物５９〜６７それぞれに対し１００ｐｍｏｌ、２００ｐｍｏｌ、３２０ｐｍｏｌ、３６０ｐｍｏｌ、４６０ｐｍｏｌ、２４０ｐｍｏｌ、１４０ｐｍｏｌ、３８０ｐｍｏｌ、２００ｐｍｏｌであり、反応後に得られた産物をそれぞれ生成物９１〜９９とする。生成物６８〜９０それぞれに対しても２０〜１５０ ｐｍｏｌ相当のｍＲＮＡをピューロマイシンリンカーと反応させ、生成物１００〜１２２を得た。生成物６８〜９０と生成物１００〜１２２を８Ｍ尿素変性７％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を図２に示す。
【００６７】
実施例３ ポリペプチド−核酸連結分子の調製
上記の生成物９１〜９９を小麦胚芽無細胞蛋白質合成系（ゾイジーン社製）に６ｐｍｏｌ／２４μｌの割合で加えて７５分間翻訳させ、ポリペプチドと核酸の連結した対応分子が形成されるかどうかを確認した。合成系に加えた直後と７５分後の混合液の一部（各生成物０．７５ｐｍｏｌ相当）を８Ｍ尿素変性７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、蛍光で検出した結果を図３に示す。さらに実際の選択実験に用いる対応付け分子を調製するため、生成物９１〜９９をそれぞれ４０ｐｍｏｌ、６５ｐｍｏｌ、６５ｐｍｏｌ、６５ｐｍｏｌ、８０ｐｍｏｌ、６５ｐｍｏｌ、３０ｐｍｏｌ、８８ｐｍｏｌ、１０２ｐｍｏｌ、生成物１００〜１２２を１３．５ｐｍｏｌずつ同様の条件で翻訳した。
【００６８】
翻訳後の溶液合計約３６５０μｌに５Ｍ ＮａＣｌを９８８μｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を４９．４μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ−Ｎａを１４８μｌ、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を４９．４μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴを５７μｌ加え、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏ ｄＴが結合したＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ（Ｔａｋａｒａ社製）６００μｌと４℃で約２時間反応させた。上清を除き、緩衝液Ａ（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭ ＤＴＴ）で３回、緩衝液Ｂ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭ ＤＴＴ）で１回、さらに緩衝液Ｃ（０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭ ＤＴＴ）で１回洗浄した後、５ｍＭ ＤＴＴ水溶液３３０μｌで３回溶出した。
【００６９】
この溶出画分に３２４μｌの５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１６２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、６０μｌのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＷＡＫＯ社製；４０Ｕ／μｌ）、８４μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製；２００Ｕ／μｌ）を添加し、５０℃で３分間加熱後、室温で１２分放置した。この溶液に水９４．５μｌ、５Ｍ ＮａＣｌを５４μｌ、０．１Ｍ リン酸水素２カリウムを３２４μｌ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０を２２．５μｌ、５０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを２２．５μｌ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを１１２．５μｌ加え、１５０μｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ社製）と室温で１時間反応させた。
【００７０】
上清を除き、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むｐＨ ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３６０μｌで３回、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むｐＨ８．０のＰＢＳ３６０μｌで３回洗浄し、１００μＭの３×ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅを溶かしたＰＢＳ（ｐＨ８．０）９６μｌで２回、３７μＭの３×ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅと０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を溶かしたＰＢＳ（ｐＨ８．０）２５７μｌで１回溶出した。合わせた溶出液にＰＢＳ（ｐＨ８．０）を１６．８μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ−Ｎａを２．４μｌ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０を２．４μｌ、２ｍＭ 酸化型グルタチオンを４．８μｌ、２ｍＭ 還元型グルタチオンを４．８μｌ加えて４℃で１５時間反応させた後、約６０μｌずつをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に置換したゲルろ過カラム（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６；ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に通して対応付け分子を精製した。これらを再び合わせた約４８０ｍｌの溶液に１０倍濃度のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１２μｌ、４．８％ ＢＳＡを７８μｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを２４μｌ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０を６μｌ加えて選択実験に用いる対応付け分子の溶液（約６００μｌ）とした。
【００７１】
実施例４ 標的蛋白質結合担体の調製と対応付け分子の選択
スクリーニングの標的蛋白質の調製については、まず常法に従ってヒトインターロイキン６（ｉｎｔｅｒｌｕｅｋｉｎ ６；ＩＬ６）あるいはヒト腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）のＮ末側にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｕｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ）を融合した蛋白質をコードするＤＮＡが挿入された大腸菌発現用ベクターを調製した。両者の間にはｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅで切断されるペプチド鎖をコードした配列を挿入した。これを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）で発現させ、目的とする融合蛋白質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズ（アマシャムファルマシア社製）を用いて精製し、溶出に使用したグルタチオンは脱塩カラムにより除去した。またネガティブコントロール用としてＧＳＴ蛋白質のみを合成し、同様の方法で精製した。もう一つの標的蛋白質としてｇｐ１３０のＦｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を購入し、精製せずにそのまま用いた。この融合蛋白質はｇｐ１３０とＦｃの間にＦａｃｔｏｒ Ｘａで切断可能な配列を有する。
【００７２】
ＧＳＴ（１００μｇ）、ＧＳＴ−ＩＬ６（３５μｇ）、ＧＳＴ−ＴＮＦ（１３０μｇ）をそれぞれ２５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０溶液（以下、「ＰＢＳＴ」と称することがある）に溶解し、３０μｌのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズと合わせて１５時間静かに混合した後、上清を除いてＰＢＳＴで４回洗浄し、ＧＳＴビーズ、ＧＳＴ−ＩＬ６ビーズ、ＧＳＴ−ＴＮＦビーズを得た。プロテインＧビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；アマシャムバイオサイエンス社製）３０μｌをＰＢＳＴで洗浄し、ｇｐ１３０／Ｆｃ １８μｇを溶かした０．２％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴ、２００μｌと合わせて１時間静かに混合し、上清を除いてＰＢＳＴで４回洗浄し、ｇｐ１３０／Ｆｃビーズを得た。
【００７３】
対応付け分子の溶液（約６００μｌ）をＧＳＴビーズと混合し、室温で１時間反応させた。上清を続いてＧＳＴ−ＩＬ６ビーズと混合して反応を行い、その上清をとってＧＳＴ−ＴＮＦビーズと反応させ、さらにその上清をプロテインＧビーズ７０μｌに加えて反応を行い、最後にその上清をｇｐ１３０／Ｆｃビーズと混合して反応させた。反応はすべて室温で約１時間行なった。上清を除いた後のビーズはただちに１５０μｌのＰＢＳＴで６回洗浄し、ｇｐ１３０／Ｆｃビーズはさらに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０の溶液（以下、これを「ＴＢＳＴ」と称することがある）１５０μｌで２回洗浄した。洗浄後のＧＳＴビーズ、ＧＳＴ−ＩＬ６ビーズ、ＧＳＴ−ＴＮＦビーズには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴの溶液２００μｌとｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ溶液２μｌを加えて室温で１時間反応させ、上清をとりビーズを同溶液２００μｌで洗った溶液と合わせて酵素溶出液とした。
【００７４】
洗浄後のｇｐ１３０／Ｆｃビーズには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０の溶液４２μｌとＦａｃｔｏｒ Ｘａ溶液（ＢｉｏＬａｂｓ社製）８μｌを加えて室温で２時間反応させ、上清をとり、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液１７５μｌでビーズを２回洗って上清と合わせ酵素溶出液とした。各酵素溶出液にＱｕｉｃｋ ｐｒｅｃｉｐ Ｐｌｕｓを３０μｌ、イソプロパノールを４３０μｌ加えて遠心し、対応付け分子を沈殿物として回収して７０％エタノール水溶液で洗い、風乾後、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１００ｍＭの水酸化カリウム水溶液２５μｌに溶解した。室温で１時間反応させた後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１００ｍＭの酢酸カリウム水溶液をほぼ等量加えて中和を確認し、ＰＣＲ反応の鋳型溶液とした。
【００７５】
ＰＣＲの反応サイクル数を決めるため、鋳型溶液の一部（４μｌ）で条件検討を行なった。プライマーとして配列番号５２と５３のＤＮＡ（それぞれ４０ｎＭ）、反応系としてＴＯＹＯＢＯ社製ＫＯＤ ｐｌｕｓを用い（鋳型溶液１μｌに対し１０μｌ）、ＰＣＲ装置上９４℃で２分反応後、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、６８℃で９０秒の反応サイクルを８、１２、１６、あるいは２０回実施後、さらに６８℃で５分反応させた。アガロースゲル電気泳動による解析結果より、ＧＳＴとＧＳＴ−ＴＮＦに対しては反応サイクルを１０回、ＧＳＴ−ＩＬ６とｇｐ１３０／Ｆｃに対しては１２回として残りの鋳型溶液を用いてＰＣＲ反応を行なった。精製して得られたそれぞれのＤＮＡ溶液のうち約半分（ＤＮＡとして４８０ ｎｇ）を配列番号５４と５５のプライマーＤＮＡ（それぞれ４０ｎＭ）とともにＫＯＤ ｐｌｕｓ反応液に加え（計４８０μｌ）、反応サイクル８回で再びＰＣＲ反応を行い、転写プロモーター配列からピューロマイシンリンカー結合配列までを含む最初のライブラリーと同じコンストラクトを有するＤＮＡを得た。
【００７６】
実施例５ ポリペプチド−核酸連結分子の濃縮操作
実施例２から実施例４の操作を第１ラウンドとし、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＩＬ６、ＧＳＴ−ＴＮＦ、ｇｐ１３０／Ｆｃのそれぞれに対して選択されたＤＮＡをもとに次の選択を繰り返す操作を第１０ラウンドまで実施した。具体的には、選択後にＰＣＲ反応を行なって得られた４種のＤＮＡ混合物のそれぞれを鋳型に実施例２の方法に基づいて転写反応を行い、得られたそれぞれのｍＲＮＡ混合物をピューロマイシンリンカーと連結させた。この核酸複合体を実施例３の方法に基づいてそれぞれ翻訳し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを遺伝情報として有する対応付け分子を調製した。実施例２と実施例３の方法に準じた第２ラウンド以降の操作は４種のライブラリー由来混合物を対象に並行して行い、反応のスケールを徐々に減らして実施した。実施例４に準じた選択実験も４種を並行して行い、ＧＳＴに対して選択された対応付け分子はＧＳＴビーズと反応させ、ＧＳＴ−ＩＬ６あるいはＧＳＴ−ＴＮＦ に対して選択された対応付け分子はＧＳＴビーズと混合した後に上清画分をＧＳＴ−ＩＬ６ビーズあるいはＧＳＴ−ＴＮＦビーズと反応させた。
【００７７】
ｇｐ１３０／Ｆｃに対して選択された対応付け分子はプロテインＧビーズとまず反応させた後に上清画分をｇｐ１３０／Ｆｃビーズと反応させた。反応はいずれも第１ラウンドと同様に室温約１時間とし、ビーズに固定する蛋白量は段階的に減らして、最後の第１０ラウンドにおいては対応付け分子と反応させる時の溶液量に対し、ＧＳＴが２０μｇ／２５０μｌ、ＧＳＴ−ＩＬ６が１０μｇ／２５０μｌ、ＧＳＴ−ＴＮＦが５μｇ／２５０μｌ、ｇｐ１３０／Ｆｃが１．５μｇ／２５０μｌであった。反応後の洗浄液の量と洗浄回数は段階的に増やし、第１０ラウンドにおいてはＧＳＴビーズを２５０μｌのＰＢＳＴで８回、ＧＳＴ−ＩＬ６ビーズを２５０μｌのＰＢＳＴで１０回、ＧＳＴ−ＴＮＦビーズを２５０μｌのＰＢＳＴで１０回、ｇｐ１３０／Ｆｃビーズを２５０μｌのＰＢＳＴで４回、さらに２５０μｌのＴＢＳＴで８回洗浄した。
【００７８】
酵素溶出とＰＣＲ鋳型溶液の調製は実施例４とほぼ同様の条件で行い、配列番号５２と５３のＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応は実施例４と同様に一部で条件検討を行い反応サイクル数を決定してから実施した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号５４と５５のＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲは鋳型ＤＮＡ、１５０ｎｇ／ＫＯＤ ｐｌｕｓ反応液３００μｌ、反応サイクル８回を基本として実施した。
【００７９】
実施例６ 選択されたポリペプチドの結合試験
第１０ラウンド選択後のＰＣＲで得られたＤＮＡをＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）によりＡ付加し、ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ（プロメガ社製）を用いて常法によりプラスミドに挿入した。これを大腸菌ＪＭ１０９にトランスフェクションして増幅し、選択されたＤＮＡ配列を含むプラスミドを回収した。配列番号５４と５５のＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、得られたＤＮＡを鋳型に転写反応を実施してｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡを実施例３で用いた無細胞翻訳系で翻訳し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースビーズで精製した。ＤＴＴを含まない溶出液（ＴＢＳＴ）中で１５時間放置した後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで約５倍に希釈してポリペプチド溶液とした。
【００８０】
９６ウェルのポリスチレンプレート（ＣＯＳＴＡＲ社製；９０１８）の各ウェルにＧＳＴ、ＧＳＴ−ＩＬ６、ＴＮＦのそれぞれを１μｇ／１００μｌの濃度でＰＢＳに溶かした溶液を加えて４℃で一晩静置した。ＧＳＴとＧＳＴ−ＩＬ６は実施例４で用いたものを使用し、ＴＮＦはＧＳＴ−ＴＮＦをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅで消化してＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズ上でＧＳＴを除くことにより得た。
【００８１】
ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを２００μｌ加えて３７℃で２時間振とうした後に溶液を除き、上記のポリペプチド溶液を加えて室温で１時間振とうした。溶液を除いてＰＢＳＴで３回ウェルを洗浄し、１ｍｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体−ＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ社製；Ａ８５９２）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１万倍に希釈した溶液１００μｌを各ウェルに添加して室温で１時間静置した。溶液を除いてＰＢＳＴで３回ウェルを洗浄し、１０ｍｇ／２５ｍｌのｏ−フェニレンジアミンと１０μｌ／２５ｍｌの３０％過酸化水素水を含むクエン酸緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ加えて室温で１０分静置した後に１規定の硫酸水溶液を等量加えて酵素反応を停止し、４９０ｎｍの吸収をプレートリーダーで測定した。ＧＳＴ−ＩＬ６に対して選択された４種のポリペプチドに対する結果を図４に、ＧＳＴ−ＴＮＦに対して選択された３種のポリペプチドに対する結果を図５にそれぞれ示した。ＧＳＴ−ＩＬ６に対して選択されたもののうち、２種がＧＳＴ−ＩＬ６に対して選択性を示し、ＧＳＴ−ＴＮＦに対して選択されたものは３種すべてＴＮＦに対する選択性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】生成物３９と４１の配列解析の結果得られたランダム化部位におけるアミノ酸出現頻度（観測値）をその期待値とともに示したグラフである。
【図２】ｍＲＮＡ（生成物６８〜９０）とそれをピューロマイシンリンカーと連結させた反応物（生成物１００〜１２２）を８Ｍ尿素変性７％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した写真である。
【図３】ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体（生成物９１〜９９）を無細胞翻訳系に加えた反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し蛍光で検出した写真である。
【図４】ＧＳＴ−ＩＬ６ビーズに対して選択されたポリペプチドの結合活性をプレートアッセイで測定した結果を示すグラフである。
【図５】ＧＳＴ−ＴＮＦビーズに対して選択されたポリペプチドの結合活性をプレートアッセイで測定した結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分子と相互作用するポリペプチドの選択方法、および目的蛋白質のファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の医薬品は各種抗生物質のような天然物、あるいはステロイドやカテコールアミンのようなヒト内在性物質から誘導された低分子化合物をベースに開発されているものが多い。一方で人工的に合成されたベンゼン置換体、複素環化合物誘導体など比較的シンプルな化合物についても医薬品としての成功例がしばしば見られる。これら従来の医薬品の開発においては限られた数の候補化合物を合成し、活性の確認を経たのち実用性の向上を目指した誘導体の合成展開が行なわれるのが一般的であり、合成と活性測定の対象となる化合物の数は限られていた。しかし医薬品開発の初期段階における合理性が追求された結果、多数の化合物に対して並行して活性試験を行なうハイスループットスクリーニングシステム（ＨＴＳ）がリード化合物取得のために用いられるようになり、特に９０年代初期に進展したコンビナトリアルケミストリーの技術は多検体アッセイ系の進歩とあいまって数百から数十万の低分子化合物ライブラリーを短期間でスクリーニングすることを可能にしている。こうしたシステムは天然の化合物に依存しないリード化合物開発の成功確率を高める一方、アッセイ系でヒットした化合物が医薬として不適である場合が少なくないという問題も生み出している。
【０００３】
しばしば医薬リードとして重要視される生理活性ペプチドはアミノ酸重合体としてコンビナトリアルケミストリーの概念が適用されやすい対象であり、天然のペプチド性リガンドの活性増強のみならず、新規なリガンドの開発も数多く試みられている。化学合成の手法においては非天然型アミノ酸も導入可能な固相合成法がアレイ技術などとともに用いられることが多い。遺伝子工学的な手法も応用可能であり、特に８０年代後半に実用化されたファージディスプレー法はペプチドなどの発現物を増幅可能な遺伝子と対応付けさせることで数百万から数億の多様性を有するライブラリーをスクリーニング対象とすることを可能にした。
【０００４】
ペプチドあるいはその類縁体に属する従来の医薬品はアンギオテンシン、エンドセリン、ソマトスタチン、バソプレッシンなどヒトに内在する生理活性ペプチドリガンドに由来するアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいはプロテアーゼの活性を抑えるための基質配列に由来する阻害剤であることが多い。こうした内在性のリガンドや基質に由来する医薬品の有用性は明らかであるが、創薬リードに成り得るそれらのペプチドの数には限界があり、疾患に対して理想的な創薬を可能にするには新たな相互作用の組合せを開拓する必要がある。ファージディスプレー法のように人工的なライブラリーを提示してスクリーニングをする技術はそれに適していると考えられ、蛋白質―蛋白質相互作用を阻害するペプチドの取得などが実際に試みられている。
【０００５】
しかし医薬のリードとなるペプチドがこの方法により取得される可能性は極めて限られていると予想される。その理由の第一は、ペプチドによる蛋白質―蛋白質相互作用阻害といった人工的な作用機序が受容体へのリガンド結合による応答という自然な機序と同等な薬理活性を生み出し得る場合が限られること、第二は受容体などの相互作用対象と共進化の結果生まれた内在性アゴニストと同じような高い親和性を標的蛋白質と人工的ペプチドの間に持たせることが原理的に難しい場合が多いこと、第三は化学的手法に比べて多様性が高いとは言えファージディスプレー法でスクリーニング可能なライブラリーにも限界が見られること、であり、技術的な解決が期待できる第三の問題において改善を試みない限り人工的な相互作用の同定に基づく医薬リードの創製は効率の悪い方法となる。
【０００６】
ファージディスプレー法において１度のスクリーニングにより探索可能な多様性の範囲は１０の６乗から９乗程度であり、これは２０種類のアミノ酸の組合せの数として５残基から７残基分に相当する。構造活性相関研究により標的分子との相互作用において特に重要な役割を果たしているとされるアミノ酸の数は一般に３から８程度であることが多いが、これは標的分子と直接相互作用しているアミノ酸に注目した場合の数であり、標的分子側が連続した数残基を特異的にリガンドとして認識するような深いキャビティを有していない限り安定な主鎖構造を持たない数残基のペプチドが高い親和性と特異性をもって標的分子に結合することはほとんど起こらない。
【０００７】
ペプチドと標的分子の相互作用の強さは両者の結合に伴う自由エネルギーの変化により決まるものであり、深いキャビティを持たない標的分子に対して強い相互作用がはたらくためには、結合に適した主鎖構造や側鎖の空間配置をペプチド側が持つことにより結合に伴うエントロピー的な不利が少なくなること、あるいは広い結合界面により局所的な相互作用の足し合わせがエネルギー的に有利であることが求められる。前者の条件に関しては、ジスルフィド結合で環状化しているような場合を除いて１０残基以下のペプチドが特定の安定した構造をとることは少なく、後者についても広い結合界面を形成するには１０残基以上が必要となり、いずれにしてもファージディスプレー法で網羅できる多様性の範囲を超えている。
【０００８】
医薬開発におけるペプチドスクリーニングは相互作用様式の解明による低分子化を目的として行なわれることが多い。ペプチドが内在性リガンドである場合、それが得られていることは標的分子の機能解明とリード化合物のスクリーニングに貢献するだけでなく、低分子リガンド設計にも直接的な情報を与える。人工的な相互作用様式の創出を伴うランダムペプチドライブラリーからのスクリーニングもファーマコフォアの同定による低分子化を目的の一つとして行われることが多い。この場合、特定の構造を持たずに標的分子と広い結合界面を形成することによって全体の親和性を獲得している比較的大きなペプチドは低分子でそれを再現することが原理的に困難である。したがって低分子化を目的として行なわれる人工的ペプチドリガンドのスクリーニングにおいては比較的限られた空間内において相互作用界面を抽出すること、そしてその成功確率を高めるためにはペプチド全体から生み出される構造の安定性が結合に伴うエントロピー的な不利を少なくするようなライブラリーを用いること、が重要となる。
【０００９】
独立して安定に存在できる蛋白質の３次構造は一般に百残基以上によって形成され、しばしば機能の単位と重複する。一方で比較的独立した小さな構造が蛋白質の中に含まれていることもあり、核内受容体のＤＮＡ結合ドメインに含まれるジンクフィンガーモチーフ、カルモジュリンなどにおいてカルシウム結合部位となるＥＦハンドモチーフなどはその代表例である。さらに十数残基から５０残基程度の大きさで３次構造を形成するペプチド・小型蛋白質も存在し、その中で複数のジスルフィド結合が構造形成の中心になっているものは特にシスチンノットモチーフと呼ばれる。これらの構造モチーフは構造の安定性を持ったペプチドライブラリーの土台として有用であり、ファージディスプレー法において応用されているものも多い（例えば、非特許文献１および２を参照）。
【００１０】
しかしファージディスプレー法でスクリーニング可能なペプチドの数を考えた場合、こうした構造モチーフの導入はむしろライブラリーの多様性を自ら限定することにつながり易いだけでなく、構造維持に耐えられない変異が導入されたものやフォールディングの問題からファージ上で提示不可能なものなどが想定の範囲を超えて含まれているという理由により目的の質を持ったライブラリーの多様性が期待したスケールよりも低いという問題ももたらす。限られた空間内においてファーマコフォアを抽出し、医薬開発に有益な情報を効率良く得るためには投入できるライブラリーのスケールにおいてファージディスプレー法を上回るスクリーニング技術が求められ、さらにそのスケールの大きなライブラリーは質の点においても優れていることが望まれる。
【００１１】
スクリーニング可能なライブラリーのスケールがファージディスプレー法を上回り、遺伝子工学的手法に特有な問題点に対してもある程度解決が期待できる方法としてリボソームディスプレー法と無細胞蛋白質ディスプレー法（例えば、特許文献１を参照）がある。いずれも細胞を介さずに遺伝情報と発現物を対応付けさせる技術であるが、前者は対応付け分子複合体の作製が容易である反面、その安定性維持のためスクリーニング条件に制約があり柔軟性に乏しい。後者は遺伝情報（ｍＲＮＡ）と発現物（蛋白質あるいはポリペプチド）をピューロマイシンリンカーを介して共有結合させることにより対応付けする技術であり、様々な条件下でスクリーニングできるだけでなく対応付け分子として前者よりはるかに小さいという利点も持つ（例えば、特許文献１あるいは非特許文献３を参照）。
【００１２】
しかしｍＲＮＡが溶媒中に露出しているというリボソームディスプレー法と共通した特徴がリボヌクレアーゼなどの混入する系での安定性という面で問題となるだけでなく、発現物と同等あるいはそれ以上の多様性を有するｍＲＮＡがアプタマーとして標的分子その他と無視できない親和性で結合するという問題も生じさせ、特にランダムペプチドライブラリーのような多様性が大きい系ではそれが無視できなくなることが推測されていた。我々は新たなピューロマイシンリンカーの開発などにより、遺伝情報側を効率良く２本鎖核酸とすることでｍＲＮＡのアプタマーとしての性質を抑える実用的なスクリーニング系の開発に成功し、無細胞蛋白質ディスプレー法によってファージディスプレー法では対処できない多様性の大きさを持ったライブラリーから有用ペプチド・蛋白質をスクリーニングすることを可能にしていた（例えば、特許文献２を参照）。
【００１３】
これらの技術の応用としてはこれまでのところ、天然に得られる遺伝子からライブラリー化されたポリペプチドから標的分子と相互作用する配列を選抜取得するスクリーニングのみしか行われておらず、取得される標的分子と相互作用するポリペプチドの機能にも限界があった。
【特許文献１】ＷＯ９８／１６６３６号公報
【特許文献２】特願２００３−３１５３８５号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，６７１−６７３（１９９４）
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７７，３１７−３３２（１９９８）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ，４１０，７１５−７１８（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ポリペプチドあるいは蛋白質が持ち得る多様性の大きさと比較した場合に、実際の溶液中において行なわれる従来のペプチドあるいは蛋白質のスクリーニング系が、網羅性に著しく欠けていた点を改善し、医薬リード化合物の設計などにおいて重要な標的分子とのファーマコフォアを明らかにするポリペプチドを効率良く取得する方法を提供するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、比較的安定な２次ないし３次の構造を有する天然に由来する構造モチーフあるいはそれらの構造を持つことが期待される人工的な構造モチーフを複数選び出し、それぞれに４ヶ所以上の変異を導入したライブラリーを構築し、さらに通常のランダムペプチドライブラリーもこれに加えて、無細胞蛋白質ディスプレー法を用いて標的蛋白質と接触させ、該蛋白質と相互作用するポリペプチドを選択する工程を繰り返すことにより、より特異的に、また高い親和性で標的蛋白質と相互作用をするポリペプチドを取得することに成功した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
【００１６】
すなわち、本発明によれば、
（１）変異を導入した構造モチーフを標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法、
（２）変異を導入した構造モチーフおよびランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法、
（３）標的分子と相互作用するポリペプチドを選択する方法が、無細胞蛋白質ディスプレー法である上記（１）または（２）に記載の方法、
（４）変異を導入した構造モチーフを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択することを特徴とするファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法、
（５）変異を導入した構造モチーフおよびランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択することを特徴とするファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法、
（６）標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択する方法が無細胞蛋白質ディスプレー法である上記（５）に記載の方法、
（７）上記（４）〜（６）のいずれかに記載の方法により得られたポリペプチドのアミノ酸配列からアミノ酸の存在頻度および／または出現頻度を指標として共通配列を選択する工程を含むことを特徴とする医薬的活性を有するポリペプチドの取得方法、
（８）上記（４）〜（７）のいずれかに記載の方法により得られたポリペプチドを化学的に改変して医薬的活性を向上させることを特徴とするペプチド誘導体の取得方法、
（９）上記（４）〜（８）のいずれかに記載の方法により得られたポリペプチドあるいはペプチド誘導体と標的分子との複合体を作製する工程、該複合体の立体構造解析を行い、標的分子と該ポリペプチドあるいは該ペプチド誘導体との結合部位を特定する工程、同定された結合部位から標的分子のファーマコフォアを明らかにして、該ファーマコフォアに合う低分子化合物を設計する工程を含むことを特徴とする標的分子と相互作用する化合物の分子設計方法、
が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、従来の高次構造解析の結果からは予測が困難な標的蛋白質のファーマコフォアを明らかにするポリペプチド、サブタイプなど類似の標的分子を選択的に認識するポリペプチド等を溶液中での実際のスクリーニングにより効率良く取得する方法が提供される。該方法は非天然型アミノ酸を変異部位に導入するスクリーニングにも対応しやすく、得られたポリペプチドのＣ末端にＰＥＧなどの高分子を導入して安定化を図ることにも適する。該方法により得られたポリペプチドは標的分子と複合体を形成した状態での構造解析、低分子医薬の設計、ペプチド誘導体あるいは蛋白性医薬の開発、医薬リードスクリーニング系におけるコントロール用リガンドの取得、標的分子の検出あるいはイメージング、等において有用である。さらに、安定な構造を土台に持つポリペプチドライブラリーを複数使用してファーマコフォア同定のためにスクリーニングするという方法は実際の溶液中でのスクリーニングのみならず、コンピューターを用いた仮想結合実験においても応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を更に詳細に説明するが、以下の構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらの内容のみに特定されるものではない。
（１）ライブラリーの設計と構築
本発明の１つは、変異構造モチーフ、あるいは変異構造モチーフとランダムペプチドからなるライブラリー（以下、これを「ライブラリー」と称することがある）を標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法である。また、標的分子が蛋白質である場合、上記ライブラリーと標的蛋白質とを接触させ、標的分子と高い親和性を示すポリペプチドを選択することで得られるポリペプチド（本明細書中ではこれを「ファーマコフォアを明らかにするポリペプチド」と称する）は該蛋白質のファーマコフォアを明らかにするものであり、医薬として実用化が可能な低分子化合物あるいはポリペプチド誘導体の開発において有用である。
【００１９】
そこで、本発明の方法に適したポリペプチドのライブラリーを考えると、高い親和性と特異性をもたらすファーマコフォアが選択されるポリペプチドと標的分子との間の比較的限られた空間に存在することが望ましい。そのようなファーマコフォアを効率良く同定するためのポリペプチドを選択するためには限られた空間におけるポリペプチドの多様性を可能な限り大きくすることが必要であり、標的分子と直接相互作用するアミノ酸残基のみならず、それらの配向や揺らぎを規定する他の残基においても多様性が求められる。
【００２０】
ペプチド鎖は側鎖だけでなくアルファ炭素の両側においても比較的高い回転の自由度を持つために仮想的には一定の空間内で様々な構造をとり得るが、実際の標的分子との相互作用においては結合に伴う内部エネルギー的な有利性がエントロピー的な不利を相殺できないような主鎖構造は生じ得ない。選択されるポリペプチドと標的分子との高い親和性は、標的分子側が選択されるポリペプチドの主鎖構造を安定化させるような明確なキャビティを持っていること、あるいは選択されるポリペプチド側が標的分子との結合に適した主鎖構造をとり易いこと、のいずれかによって可能になっていることがほとんどであり、特に２０残基を超えるようなポリペプチドに関しては後者の例が多い。したがって、深いキャビティを持たない標的分子に対してファーマコフォアを特定するためには、主鎖構造が二次ないし三次構造のレベルで安定になりやすいポリペプチドをライブラリー化してスクリーニング対象とすることが合理的と考えられる。
【００２１】
直接的に医薬リード化合物となるようなポリペプチドをスクリーニングにより効率良く得る技術を提供することも本方法の目的の一つであるが、安定な構造をとり易いポリペプチドはペプチダーゼやプロテアーゼに対する感受性が一般に低くなることが期待でき、血中での安定性という点で有利になりやすいと予想される。本発明において使用されるライブラリーは以上のことを踏まえて選定と構築がなされる。
【００２２】
ここで、「ポリペプチド」とは、残基数において６残基から１０残基程度の一般にオリゴペプチドと呼ばれるものから、構造安定性の高い１２０残基程度の大きさを持った蛋白質までを含むものとする。また、「相互作用する」とは、標的分子に結合して該物質の機能を制御することを意味する。さらに、「ファーマコフォア」とは、標的分子と相互作用する分子と標的分子の結合界面に存在して、親和性と特異性の獲得に寄与しているアミノ酸残基や官能基などの複数の部分構造の空間配置を意味する。また、本発明の方法で用いる「標的分子」とは、蛋白質、ポリペプチド、核酸、糖質、脂質、低分子化合物等のいずれのものでもよいが、特定の疾患と関連し、該分子の機能の制御が、該疾患の治療に有用であることがわかっている物質が特に好ましく用いられる。
【００２３】
本発明において、用いられる「構造モチーフ」とは、天然の蛋白質あるいはポリペプチドの全体ないし一部であってもよく、天然の構造からの類推または論理的設計によって得られた人工的なものでもよい。天然のポリペプチドの例としては、コノトキシン、アガトキシン、デンドロトキシン、チャリブドトキシン、アパミンなどのイオンチャネル阻害ペプチド、テッポウウリ由来トリプシンインヒビターやアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害ペプチド、ディフェンシンやヘプシジンなどの抗菌ペプチド、エンドセリンやインシュリンなどのペプチド性ホルモンが挙げられ、これらの多くにおいては二次以上の高次構造が複数のジスルフィド結合によって安定化されている。バソプレッシン、ウロテンシン、オキシトシン、ソマトスタチンのように一つのジスルフィド結合を有する重要な生理活性ペプチドもあり、二つのシステインの間に４残基から１２残基のアミノ酸を含むライブラリーも主鎖構造がある程度制限されたライブラリーとして利用される。
【００２４】
蛋白質の一部ないし全体に由来するものとしては、ジンクフィンガーモチーフ、ＥＦハンドモチーフ、アンキリンリピート、４本ヘリックスバンドル、免疫グロブリンフォールドのように多くの蛋白質に共通して現れる構造が有用である。人工的に設計される構造としては、ヘリックスターンヘリックスのようなアルファヘリックス構造を中心とした配列のライブラリー化が比較的容易である。構造モチーフという言葉は、βターン構造のような定義が明確なものを除けば、二次構造が連結して生じる部分構造や金属イオンへの配位結合で生じる小さな構造など十数残基から数十残基程度の特徴的な構造を意味することが多いが、ここでは一つのジスルフィド結合で生じる数残基から成るループ構造や、一般的な蛋白質のドメイン構造に近い大きさを持つ三次構造、あるいは標的分子との相互作用により初めて安定化される柔軟な構造も含めて「構造モチーフ」と定義する。
【００２５】
このような構造モチーフの中で、本発明の方法に用いるライブラリーとしての配列の選定は、選定された構造モチーフの組合わせによって一次構造上の多様性だけでなくファーマコフォアを探索する空間におけるライブラリーの多様性が大きくなることを目的として行なわれる。例えば一本のαヘリックス、βストランド、あるいはループ上において空間的に近い数残基はその組合せが同じであっても異なるものと見なすことができ、特にループ部分はその配列や周辺の構造によって異なる主鎖構造をとり易い。さらに三次構造的にはそれらの残基が一定の空間内で組合されることになり、主鎖構造及び側鎖の配向と種類が生み出す多様性が著しく大きくなる。
【００２６】
このような多様性を確保するには異なる構造モチーフライブラリーを多種類併用することが望ましいが、実際に用いるスクリーニング系が扱うことの可能なライブラリーのスケールには限界があるため、併用する構造モチーフライブラリーの数と種類、各ライブラリーにおける変異導入箇所の選択は制約の下で有効な多様性を生み出すように行なわれる必要がある。具体的には、用いる構造モチーフのもととなるポリペプチドはその構造が比較的複雑である場合に、立体構造がＸ線結晶構造解析などにより解明され実験的な証明が得られていることが望ましい。立体構造上の情報は相互作用クラスターとして複数の変異を導入する空間を決定する目的で求められるだけでなく、構造維持に著しく不利な変異の導入を避けるためにも重要となる。
【００２７】
例えばβターン構造上に存在するグリシン残基の変異はしばしば分子全体のフォールディングを著しく阻害することが知られており、あるいはプロリン残基は立体構造の中心となる二次構造の形成に不利になることが多い。立体構造が既知であればフォールディングにおいて脱落するポリペプチドを少なくしながら構造モチーフライブラリーの多様性の維持を図ることが比較的容易になる。
【００２８】
変異の導入がフォールディングに著しく不利にならない範囲では、二つ以上の相互作用クラスターを一つの分子に導入することも可能である。無細胞蛋白質ディスプレー法をスクリーニングに用いる場合、４〜２５の変異部位を導入した構造モチーフ、および完全ランダムライブラリーとともに４〜５０種類まとめてスクリーニングすることが好ましい。
スクリーニング技術に由来する制約もいくつか存在し、中でもフォールディングに関する問題はライブラリーの選択に大きな影響を与える。酵母ツーハイブリッド法、ファージディスプレー法、リボソームディスプレー法、無細胞蛋白質ディスプレー法は、フォールディングも含めた発現の効率において一長一短を持ち、翻訳される蛋白質あるいはポリペプチドごとに適不適がある。生物系に依存しない上に比較的安定な対応付け分子を形成する無細胞蛋白質ディスプレー法は翻訳後の巻き戻し操作などにおいて有利な点を持っていると考えられ、複数のジスルフィド結合を持つシスチンノットモチーフ等に対しては特にこの利点を応用しやすいが、すべての構造モチーフのフォールディングに適した条件を確立することは困難であり、さらに提示されるポリペプチドのＣ末端がピューロマイシンを介したｍＲＮＡとの連結のために塞がれているということも時として問題になると予想される。このため構造モチーフの選択に際しては、化学合成物や組換発現物などにおいてフォールディングの容易さが確認されているものを優先することが望ましく、さらにそれらの中ではＣ末端が溶液中に露出してリンカー配列等の付加によるフォールディングの阻害が予想されないものが望ましい。
【００２９】
ライブラリーの変異箇所に導入されるアミノ酸残基の出現確率は、構造モチーフに合わせて可能な範囲で変えることが必要となる。例えば、ジスルフィド結合によって形成される構造モチーフをライブラリーとして用い、あるいは標的分子が細胞外の蛋白質でジスルフィド結合が形成され易い条件でスクリーニングを行なう場合、ランダム部位に出現したシステインは期待した構造モチーフの形成を阻害し、あるいは他の分子との間で架橋される可能性があるため、ランダム化した部位のシステイン出現頻度は低いことが望まれる。さらにαヘリックスやβストランドの変異による不安定化が構造維持を阻害する可能性が高いと考えられる部位においては、それらの二次構造に不利にならないセミランダム化を行なうなどの対応も必要となる。加えて、トリプトファンやチロシンなど一分子に数多く出現した場合に非特異結合が増えるような残基は出現頻度を高くしないこと、最初に選択するライブラリーのスケールを落とすことになる終止コドンの出現頻度も制限すること、なども望まれる。これらのアミノ酸残基出現頻度の制御は、主にＤＮＡ化学合成の段階で塩基の混合比を設定することにより行なわれる。
【００３０】
ライブラリーの構築は、主に化学的に合成した複数のＤＮＡのオーバーラップ伸長法により行なわれる。オーバーラップさせる末端の相補鎖形成配列は、ランダム化部位を含まないほうが望ましい。ライブラリーの多様性の維持と各分子のコピー数格差抑制のため、オーバーラップ伸長反応のサイクルは１〜１０回程度に抑え、増幅のためのＰＣＲ反応は行なわないことが望ましい。
【００３１】
（２） ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドおよびそれをコードする核酸の選抜取得方法
本発明のファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいは後述するドメインポリペプチドの選抜取得方法として、酵母ツーハイブリッド法、ファージディスプレー法、リボソームディスプレー法、無細胞蛋白質ディスプレー法などが用いられるが、より大きなスケールのライブラリーの中からポリペプチドを柔軟な条件で選択できる無細胞蛋白質ディスプレー法が特に好ましく用いられる。
【００３２】
無細胞蛋白質ディスプレー法によるポリペプチドの選抜取得方法は、 （１）ポリペプチド部とそれをコードする核酸部が、核酸部の３’末端に結合した核酸構築物を介して直接結合したポリペプチド−核酸連結体群と標的分子とを接触させる工程、（２）標的分子に特異的に結合した該ポリペプチド−核酸連結体を取得し、該連結体の核酸部を増幅し、これを鋳型の一部として用いてポリペプチド部とそれをコードする核酸部が、核酸部の３’末端に結合した核酸構築物を介して直接結合したポリペプチド−核酸連結体群を調製する工程、（３）上記（１）および（２）の工程を、標的分子と相互作用させたポリペプチド−核酸連結体の核酸部が、標的分子に特異的に結合するポリペプチドをコードすることが確認されるまで繰り返す工程を含むことを特徴とするものである。具体的には、以下のとおりである。
【００３３】
（ｉ）ポリペプチド−核酸連結体および該連結体と標的分子を接触させる工程
本発明の方法で用いられる「ポリペプチド−核酸連結体」は、例えば、ＷＯ９８／１６６３６号公報に記載のもの等のように、ポリペプチド部とそれをコードする核酸部が、核酸部の３’末端に結合した核酸構築物を介して直接結合したものであり、蛋白質の相互作用解析等の強力なツールとなり得る分子である。
【００３４】
ここで、「ポリペプチド部」とは、核酸部に含まれるコーディング配列によりコードされるポリペプチドを含み、ポリペプチドは上記ライブラリーである。また、ポリペプチド−核酸連結体を精製するためのタグと上記蛋白質との融合ポリペプチドも含まれる。「核酸部」とは、ポリペプチド部のポリペプチドをコードするコーディング配列を含む核酸であり、さらに、用いるポリペプチド合成系においてポリペプチドの翻訳が開始されるための配列も含むことが多い。核酸部は一般にｍＲＮＡであり、その鋳型となるＤＮＡを「核酸部前駆体」とする。
【００３５】
核酸部前駆体は、具体的には、コーディング領域と発現制御領域を含むものである。発現制御配列とは、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識される配列等が挙げられる。プロモーター配列の種類は、適用する発現系に適したものを適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、大腸菌ウイルスＴ７のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＴ７プロモーター配列、SP6 RNAポリメラーゼにより認識されるＳＰ６プロモーター配列などが挙げられる。また、翻訳の際にリボソームによって認識される配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＲＮＡ配列（Kozak配列）に対応するＤＮＡ配列や、原核細胞のリボソームによって認識されるシャイン・ダルガノ配列（Shine-Dalgarno）、５’キャップ構造（Ｓｈａｔｋｉｎ，Ｃｅｌｌ，９，６４５−（１９７６））、オメガ配列等のｔａｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓのリボソームによって認識される配列、ＷＯ０３／５６００９号公報に記載の配列、ｒａｂｂｉｔβ−ｇｌｏｂｌｉｎ、Ｘｅｎｏｐｕｓβ−ｇｌｏｂｌｉｎ あるいはｂｒｏｍｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓのリボゾーム認識領域などが挙げられる。また、ポリペプチド−核酸連結体の核酸部を増幅するのに、PCRを用いる場合、PCRプライマー用配列を含むものも挙げられる。また、核酸部前駆体を増幅するためにPCRを用いる場合には、PCRプライマー結合用の共通配列を含むものも挙げられる。
【００３６】
コーディング配列とは、ポリペプチド−核酸連結体の蛋白質部に含まれるポリペプチドをコードする配列であり、この種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。また、該核酸部の３’末端に結合した「核酸構築物」とは、その末端に「核酸誘導体」を結合しており、該核酸部を鋳型として無細胞蛋白質翻訳系又は生細胞中で蛋白質（ポリペプチド）の翻訳を行った場合、ｍＲＮＡの末端付近まで翻訳が進んだ後、該核酸誘導体（例えば、ピューロマイシンなど）がリボソームのＡサイトに入ることにより蛋白質（ポリペプチド）と結合させる機能を有するものを意味する。具体的には、スペーサー、該ポリペプチド−核酸連結体を標識する標識部、また該連結体を固相に結合するための構造、核酸部を逆転写するためのプライマー部等を含むものが好ましい。
【００３７】
「核酸誘導体」としては、無細胞蛋白質翻訳系又は生細胞中で蛋白質（ポリペプチド）の翻訳が行われた時に、合成された蛋白質（ポリペプチド）のＣ末端に結合する能力を有する化合物である限り限定されないが、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、ピューロマイシン（Puromycin）と３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycinaminonucleoside 、 PANS-アミノ酸）、すなわち、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。
【００３８】
また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、すなわち、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。また、核酸あるいは核酸とアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべて本発明で用いられる核酸誘導体に含まれる。核酸誘導体としては、ピューロマイシン、ＰＡＮＳ−アミノ酸もしくはＡＡＮＳ−アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルデオキシシチジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。
【００３９】
このような核酸誘導体は、それ自体既知の化学結合方法によって製造することができる。具体的には、リン酸ジエステル結合で合成ユニットを結合させる場合は、ＤＮＡ合成機に一般的に用いられているホスホアミダイド法などにより固相合成で合成することが可能である。ペプチド結合を導入する場合は、活性エステル法などにより合成ユニットを結合させるが、ＤＮＡとの複合体を合成する場合は、両方の合成法に対応が可能な保護基が必要になる。
【００４０】
「スペーサー」は、ポリエチレン又はポリエチレングリコールあるいはその誘導体などの高分子物質や、オリゴヌクレオチドやペプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質等が用いられ、好ましくはポリエチレングリコールが用いられる。スペーサーの長さは特に限定されないが、好ましくは、分子量１５０〜６０００であるか、または主鎖の原子数は１０原子から４００原子であり、さらに好ましくは、分子量６００〜３０００であるか、または主鎖の原子数が４０原子から２００原子である。また、標識部を有しててもよい。
【００４１】
「標識部」は、親和性物質、共有結合性物質、蛍光物質、分解性物質等が挙げられる。これらは、「該連結物を固相に結合するための構造」としても用いられるし、また「該連結物を精製するための構造」としても用いられる。親和性物質としては、ポリＡ配列、ポリＴ配列、ビオチン、ＦＬＡＧ等の各種抗原又は抗体、Ｈｉｓタグ、ＮＴＡ等の配位子、受容体リガンド等が挙げられる。また、共有結合性物質としては、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド等の核酸末端部分、ヒドラジド、ケトン、チオエステル等の官能基、ソラレン等の架橋性物質が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセイン、オレゴングリーン、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ４８８等が挙げられる。分解性物質としては、光反応で分解する1-(2-ニトロフェニル)-エチル基を有する誘導体や、プロテアーゼやペプチダーゼに認識されるアミノ酸配列等が挙げられる。これらの標識物質は、それ自体既知の通常用いられるものであり、容易に入手可能であり、また常法により核酸等に結合して標識することができる。
【００４２】
好ましい核酸部とその３’末端側に結合した核酸構築物、核酸誘導体（以下、これを「ポリペプチド−核酸連結体鋳型」と称することがある）の好ましい構造としては、核酸部であるＲＮＡと、核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合している１本鎖核酸（以下、これを「スペーサー鎖」と称することがある）がアニーリングした構造を有し、さらに該スペーサー鎖と標識部を含む1本鎖核酸と核酸部がそれぞれ結合しているものが挙げられる。具体的には、PCT/JP2004/０１３３９９号明細書に記載のもので、製造法も該明細書に記載された方法が好ましく用いられる。このような構造を有することにより、核酸部と核酸構築物のRNAリガーセ等による結合効率が高く、またポリペプチド−核酸連結体を標識部により精製でき、核酸部のRNAを逆転写することができ、さらに核酸部を2本鎖DNAとすることもできる。
【００４３】
かくして構築されたポリペプチド−核酸連結体鋳型を蛋白質翻訳系に導入することによりポリペプチド−核酸連結体を製造することができる。核酸からそれがコードする蛋白質を人工的に生成させるための翻訳系は当業者に公知である。具体的には、適当な細胞より蛋白質合成能を有する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を合成させる無細胞蛋白質合成系が挙げられる。このような無細胞蛋白質合成系には、リボゾーム、開始因子、伸長因子及びｔＲＮＡ等の翻訳に必要な要素が含まれている。
【００４４】
このような無細胞蛋白質合成系としては、例えば、真核生物の無細胞蛋白質合成系が用いられ、より具体的には、ウサギ網状赤血球抽出液やコムギ胚芽抽出液などが挙げられるが、これらに限られるものではない。無細胞蛋白質合成系は、キットとして市販されているものを使用することができる。例えば、ウサギ網状赤血球抽出液のキットとしては、Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（Promega社製）等が用いられ、またコムギ胚芽抽出液としては、ゾイジーン無細胞蛋白質合成システム（ゾイジーン社製）や、ＰＲＯＴＥＩＯＳTM Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ（TOYOBO社製）等が挙げられる。蛋白質翻訳系としては、生細胞を使用してもよく、具体的には、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞等を用いることができる。無細胞蛋白質翻訳系又は生細胞などは、その中に蛋白質をコードする核酸を添加するか又は導入することによって蛋白質合成が行われるものである限り特に制限はない。本発明の核酸構築物を無細胞蛋白質合成系に導入する直前に、６０〜９０℃で加熱した後急冷する工程を行うと、蛋白質−核酸連結体の合成効率が高くなるため好ましい。
【００４５】
上記翻訳反応液から、ポリペプチド−核酸連結体を精製する場合、標識鎖に親和性物質あるいは共有結合物質が結合している場合には、該親和性物質あるいは共有結合物質を介して精製を行うことができる。精製の方法は、用いる親和性物質および共有結合物質に応じて適宜選択してそれ自体既知の定法を用いることができる。
上記で製造されたポリペプチド−核酸連結体は、上記標的分子と接触させ、該物質と相互作用する連結体を選択取得する工程に供する。この選択方法は、ポリペプチド−核酸連結体中のポリペプチドが有する機能（生物活性）を用いて標的分子と相互作用するポリペプチドを該連結体として選択することを意味する。このような相互作用の解析方法としては、例えばＷＯ98/16636号公報に記載の方法を用いることができる。また、標的分子と接触させるポリペプチド−核酸連結体は、上記ライブラリーを有する複数の連結体群である。
【００４６】
また、本発明のポリペプチド−核酸連結体および標的分子は、固相（支持体）に結合させて用いることもできる。ポリペプチド−核酸連結体の固相への結合は、上記標識部に親和性物質や共有結合性物質が結合している場合には、これらを用いて行うことができる。具体的には、親和性物質又は共有結合性物質が親和性を有するまたは結合する物質を予め固定化した固相に、上記ポリペプチド−核酸連結体を接触させることにより、当該ポリペプチド−核酸連結体を固相に容易に固定化することができる。固相への標的分子の結合は、例えば、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．＆Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，４０４−４０６；Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９０２２−９０２６等に記載されている方法等により行うことができる。
【００４７】
固相（支持体）としては、通常の核酸、ポリペプチド、糖質、脂質、化合物等の固定化に用いることができる支持体であれば特に限定されない。支持体としては、親和性物質や共有結合性物質どうしの結合形成、あるいは標的分子の結合に悪影響を及ぼさないものであればその形状は特に限定されず、例えば、平板、マイクロウェル、ビーズ等の任意の形態をとることができる。支持体の材質としては、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、アガロース、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー類、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブランフィルター等の多孔質物質を挙げることができる。
【００４８】
上記選択方法に付するポリペプチド−核酸連結体は、核酸部がRNAのものでもよいし、ｍＲＮＡ鎖をＤＮＡに逆転写したポリペプチド−逆転写核酸連結体でもよい。逆転写反応に必要な試薬及び反応条件は当業者に周知であり、必要に応じて適宜選択することができる。さらに得られたポリペプチド−逆転写核酸連結体のＲＮＡをＲＮＡ分解酵素などを用いて分解し、ＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ反応をすることにより２本鎖ＤＮＡ−蛋白質連結体を作製して用いることもできる。このような、ポリペプチド−逆転写核酸連結体、あるいは２本鎖ＤＮＡ−ポリペプチド連結体を用いれば、核酸部分の安定性がよいこと、また１本鎖ＲＮＡの非特異的吸着がないため好ましい。
【００４９】
（ii）標的分子に特異的に結合したポリペプチド−核酸連結体の取得、核酸部の増幅、該核酸部を鋳型の一部としたポリペプチド−核酸連結体の調製工程
上記選択方法で選択されたポリペプチド−核酸連結体は、これを再度標的分子との相互作用に基づいて選択する工程に供する。一度選択されたポリペプチド−核酸連結体の核酸部を増幅して、さらにポリペプチド−核酸連結体とするためには、（ａ）選択取得されたポリペプチド−核酸連結体の１本鎖ＲＮＡ部分を必要に応じて分解する等した後に、これをＰＣＲなどで増幅し（増幅工程）、（ｂ）増幅されたＤＮＡ鎖をもとにｍＲＮＡ鎖を製造し、さらに上記のポリペプチド−核酸連結体鋳型を製造し、これを翻訳してポリペプチド−核酸連結体を調製することにより行なうことができる。
【００５０】
（ａ）増幅工程は、ＰＣＲを用いて例えば以下のように行うことも好ましい。ポリペプチド−核酸連結体の核酸中、増幅するのは少なくともコーディング配列を含む領域である。このように増幅されたＤＮＡについて、それ自体既知の定法により塩基配列を解析することにより、上記選択方法で選択された蛋白質をコードするＤＮＡ配列を同定できるので、該配列をもとにＤＮＡまたはＲＮＡも取得することができる。該領域を増幅するのに用いられるＰＣＲプライマーとしては、特に制限はないが、全てのポリペプチド−核酸連結体に共通に用いられる配列として、５’側のプライマーは、コーディング配列の５’上流側に連結されている配列が好ましく用いられる。具体的には、上記したポリペプチド−核酸連結体の場合、５’側のプライマーは、翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列などが好ましく用いられ、３’側のプライマーは、タグ配列や共通配列が好ましく用いられる。
かくして調製されたポリペプチド−核酸連結体鋳型は、上記（i）に記載の方法により翻訳され、ポリペプチド−核酸連結体が調製される。
【００５１】
（iii）濃縮操作
本発明の方法では、上記（i）および（ii）に記載の工程を、標的分子に特異的に結合したポリペプチド−核酸連結体が全体として標的分子に対して高い親和性と特異性を示すまで繰り返す（本明細書では、これを「濃縮操作」と称することがある）。求められる親和性は目的により異なるが、高い親和性を有するポリペプチドの取得を目的とする場合はライブラリーと接触させる標的分子の濃度を低くすることが必要であり、期待する解離定数の近辺でその値を設定する。
【００５２】
本発明の方法では、一般にこの濃縮操作を２〜１５回行なうことによって、ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドと、それをコードする核酸の連結体が取得される。取得された連結体の核酸部を上記方法により増幅して常法により塩基配列を解析することにより、該ポリペプチドをコードする塩基配列を同定することができる。また、該塩基配列を有する核酸を常法により合成すればポリペプチドをコードする核酸を取得することができ、またこの核酸を公知の、例えば、上記した蛋白質合成方法等により翻訳合成することにより、ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドを取得することができる。
【００５３】
さらには、多様性の大きなライブラリーから濃縮操作の結果として同定される上記塩基配列は、一般に複数であるので、上記の標的分子への親和性に基づいて選択されたポリペプチドが、ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドであることを確認するためには、標的分子に作用してその機能に影響するかどうかを調べることが好ましい。具体的方法としては、まず上記で取得された塩基配列がコードするポリペプチドを常法により化学合成し、あるいは該塩基配列を有する核酸を常法により合成して、大腸菌あるいは無細胞翻訳系で翻訳合成する等の方法により、活性測定用のポリペプチドを調製する。生体内で標的分子と相互作用する蛋白質等と標的分子の結合に該ペプチドが与える影響、あるいは標的分子の機能を測定可能な細胞実験系における該ペプチドの薬理作用等を調べることにより、ファーマコフォアの解明に有用なポリペプチドを選択することができる。
【００５４】
また、上記のようにして取得したポリペプチドのアミノ酸配列からアミノ酸の存在頻度および／または出現頻度を指標として共通配列を選択する工程を含むことを特徴とする医薬的活性を有するポリペプチド（本明細書中では、これを「ドメインポリペプチド」と称することがある）を取得することもできる。具体的には、上記で取得されたポリペプチドをコードする核酸からドメインポリペプチドをコードするクラスターを取得することにより行う。「ドメインポリペプチドをコードするクラスター」（以下、「クラスター」と称することがある）とは、上記ドメインポリペプチドをコードする核酸を共通配列として含むほぼ同じ長さの核酸のかたまりを意味する。共通配列を含むほぼ同じ長さのかたまりとは、上記で取得されるポリペプチド−核酸連結体群の５０％以上が該共通配列を含み、その鎖長が最も短い核酸と長い核酸が１倍〜１０倍の範囲に入ってくることを意味する。このようなクラスターが形成されたことは、形成を確認し得る方法であれば特に制限はないが、例えば、標的分子と相互作用することで選択取得されたポリペプチド−核酸連結体の核酸部を、ＲＮＡのまま、又はＤＮＡとしてアガロースゲルまたはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中を電気泳動等で分離した場合にバンドが観察されることにより確認することができる。
【００５５】
（３）ファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドを用いた医薬開発
本発明に従ったライブラリーのスクリーニングで取得されたポリペプチドに対して解析実験を行なうことにより、医薬リード開発に必要な情報がもたらされる。相同性の高い配列が複数得られている場合にはそのアライメントから構造活性相関についての情報が少なからず得られることがある。配列のアライメントから必要な情報が充分得られない場合は、取得された配列をもとにそれをコードするＤＮＡの再ランダム化を行い、無細胞蛋白質ディスプレー法またはその他の方法でスクリーニングするか、あるいは置換した部位を有するポリペプチドを無細胞翻訳、大腸菌発現、化学合成などにより１つないし数百種合成して活性測定をすることで構造活性相関についての情報を得ることができる。
【００５６】
得られたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドが明確に区別され得る複数の立体構造あるいはジスルフィド架橋をとる場合には、実際に該ポリペプチドを合成して活性に必要な立体構造あるいはジスルフィド架橋を確認する必要があり、立体構造の確認方法としてはＸ線結晶構造解析、ＮＭＲによる構造解析、円偏光二色性解析などが挙げられ、ジスルフィド架橋の確認方法としては酵素による限定加水分解法と質量分析法を合わせた方法がある。
【００５７】
得られたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドと標的分子の間でファーマコフォアを抽出する方法としては、両者が結合した共結晶を形成させ、Ｘ線結晶構造解析により両者の座標を得ることがもっとも望ましい。得られた空間座標をもとに上記ポリペプチド側を改変する、低分子をドッキングさせる、あるいは新規に原子を発生させてde novoで分子を形成する等の手法により上記ポリペプチドと同様の活性を持った低分子化合物を開発することが可能となる。共結晶が得られない時でも、上記ポリペプチド側の立体構造が土台となる構造モチーフ等から推測できる場合、あるいはＭＤ等の手法により限られた主鎖構造が候補となる場合には標的分子側の立体構造情報の有無に関わらず上記ポリペプチドの低分子化合物への改変ができることもある。さらに一般的に、上記ポリペプチド側についての詳細な構造情報はＮＭＲによる溶液中での立体構造解析により取得することが比較的容易である。上記ポリペプチド側あるいは標的分子側において相互作用に関わっている部位についての情報が著しく不明である場合にはＨＳＱＣ（Heteronuclear single quantum correlation）等の手法が有用である。これらの構造情報とペプチドミメティクスの手法の組み合わせによっても新たな低分子化合物が創出される。
【００５８】
かくして設計された低分子化合物は、標的分子が疾病に関連するものである場合、該疾病治療薬として用いることができる。この場合、上記工程により医薬組成物を製造する方法も本発明に含まれる。
取得されたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドをそのまま、あるいは改変を加えてペプチド医薬として応用することも可能である。親和性と選択性の向上を目的とした改変には通常のアミノ酸あるいは非天然型アミノ酸による置換等が有効である。また、ヒトに対する抗原性を低下させることを目的とした改変が行なわれる場合もある。安定性を目的とした改変においては、該ポリペプチドの主鎖あるいは側鎖の置換の他にＰＥＧなどの高分子との融合が行なわれることもあり、上述した無細胞蛋白質ディスプレー法で選択されたポリペプチドは特にＣ末端とその周辺への導入に対して許容性が高いと予想される。
【００５９】
取得されたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドはそれ自体あるいはその構造情報から医薬リードを開発する目的以外にも応用でき、例えば蛍光プローブをポリペプチドに導入することでＨＴＳシステムにおいて多数の低分子化合物ライブラリーの活性を調べるための競合リガンド（Surrogate ligand）として用いることも可能である。蛍光プローブを導入した該ポリペプチドはイメージング等にも応用できる。
【００６０】
さらに本発明で取得されたファーマコフォアを明らかにするポリペプチドあるいはドメインポリペプチドを固相化することにより標的分子を検出するチップ等を作製することもできる。固相化の方法としては、ビオチン化、ポリペプチドの官能基とオルトゴナルな官能基の導入等が挙げられる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ ライブラリーDNAの配列とその構築
ライブラリー化する配列として、３本のジスルフィド結合を持つ構造モチーフを１０種、２本のジスルフィド結合を持つ構造モチーフを４種、１本のジスルフィド結合を持つループ状のモチーフを５種、ジスルフィド結合を持たない構造モチーフを３種、１５残基のランダムライブラリーを１種、合計２３種選択した。これらを発現させるために用いられるＤＮＡの原料として、配列番号１〜５１のＤＮＡをＤＮＡ合成機により合成した。このうち配列番号１〜３３はランダムあるいはセミランダム化する残基に相当する部位に混合塩基が導入されており、そのＡ：Ｔ：Ｇ：Ｃ比がＫにおいて０：５０：５０：０、Ｍにおいて５０：０：０：５０となるようにホスホアミダイトを混合した。Ｎは合計４種類の混合比でホスホアミダイトを混合し、そのＡ：Ｔ：Ｇ：Ｃ比は混合比１が３０：１５：３０：２５、混合比２が３０：３０：３０：１０、混合比３が１５：３０：２５：３０、混合比４が３０：３０：１０：３０となるようにした。基本的に配列番号１〜１４、１６〜２２においてＫの前に位置するＮが混合比２、Ｋの２つ前に位置するＮが混合比１であり、配列番号１５、２３〜３３においてはＭの後に位置するＮが混合比４、Ｍの２つ後に位置するＮが混合比３である。この基本則に優先してＮの混合比を指定した部位もあり、Ｇの次で後にＫが続くＮは混合比１、ＴとＴに挟まれたＮは混合比３、Ｍの次で後にＣが続くＮは混合比３とした。さらに配列番号１の３７番目、配列番号２の７２番目、配列番号６の６１番目、配列番号８の５７番目および配列番号１０の５７番目のＮは混合比１、配列番号５の７２番目および配列番号１０の３９番目のＮは混合比２、配列番号２８の４９番目、配列番号２９の２０番目、配列番号３１の４２番目および配列番号３３の２４番目のＮは混合比３、配列番号３１の２１番目および配列番号３３の２３番目のＮは混合比４とした。
【００６２】
化学合成したＤＮＡをオーバーラップ伸長反応により連結した。反応系としてはＴＯＹＯＢＯ社製ＫＯＤ ｐｌｕｓを用い、連結する２種のＤＮＡの濃度を０．５Ｍとし、ＰＣＲ装置中で９４℃で２分反応後、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、６８℃で５分の反応を５回ないし１０回繰り返し、さらに６８℃で５分反応させた。配列番号１と２３、配列番号２と２４、配列番号３と３５、配列番号４と２５、配列番号５と２６、配列番号６と２７、配列番号７と２８、配列番号８と２９、配列番号９と３０、配列番号１０と３１、配列番号１１と３６、配列番号１２と４１、配列番号１３と４２、配列番号１４と３６、配列番号１５と５０、配列番号１６と３６、配列番号１７と３６、配列番号１８と３６、配列番号１９と３６、配列番号２０と４３、配列番号２０と３２、配列番号２１と３２、配列番号２２と３３、これらの組合わせで連結を行なうことによりそれぞれ生成物１〜２３を得た。
【００６３】
目的物の純度が低い場合は８Ｍ尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し、抽出濃縮操作によって次の反応に用いた。続いて生成物１と配列番号３４、生成物２と配列番号３４、生成物４と配列番号３６、生成物５と配列番号３６、生成物６と配列番号３７、生成物７と配列番号３８、生成物８と配列番号３９、生成物９と配列番号３７、生成物１０と配列番号４０、生成物２１と配列番号４４、生成物２２と配列番号４４、生成物２３と配列番号３６のオーバーラップ伸長反応によりそれぞれ生成物２４〜３５を得た。目的物の純度が低い場合は８Ｍ尿素変性ＰＡＧＥで精製した。さらに生成物２４と配列番号４５、生成物２５と配列番号４６、生成物３と配列番号４７、生成物２６と配列番号４５、生成物２７と配列番号４６、生成物２８と配列番号４８、生成物２９と配列番号４７、生成物３０と配列番号４５、生成物３１と配列番号４７、生成物３２と配列番号４７、生成物１１と配列番号４７、生成物１２と配列番号４７、生成物１３と配列番号４７、生成物１４と配列番号４９、生成物１５と配列番号３４、生成物１６と配列番号４７、生成物１７と配列番号４７、生成物１８と配列番号４７、生成物１９と配列番号４７、生成物２０と配列番号４７、生成物３３と配列番号４７、生成物３４と配列番号５１、生成物３５と配列番号４７、の組合せでオーバーラップ伸長反応を行い、それぞれ生成物３６〜５８を得た。これらはすべて８Ｍ尿素変性ＰＡＧＥで精製し、得られたＤＮＡを定量して転写用の鋳型とした。
【００６４】
連結されたＤＮＡ配列は転写プロモーター配列のあとにｍＲＮＡに転写される配列として翻訳エンハンサー配列、ライブラリー配列、リンカー配列、ＦＬＡＧ配列、リンカー配列、ピューロマイシンリンカー結合配列を有している。得られたＤＮＡのうち生成物３９と４１の配列解析を行なったところ、上記のコンストラクトを完全に含む配列は生成物３９で１９/３１（６１％）、生成物４１で１８/３２（５６％）であり、このうちランダム化部位に終止コドンを含まないものはそれぞれ１５（４８％）、１４（４４％）であった。この配列解析の結果得られたランダム化部位におけるアミノ酸出現頻度（観測値）をその期待値とともに図１に示した。
【００６５】
実施例２ ライブラリーDNAの転写と転写産物のピューロマイシンリンカーとの連結
生成物３６〜５８のＤＮＡ分子を大きさなどを基準として９つのグループに分類し、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｒｉｂｏｍａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて定法に従い転写反応を行なった。翻訳時におけるｍＲＮＡの安定性向上を目的として転写反応液にはキャップアナログ（７．２ｍＭ、ＲＮＡ Ｃａｐｐｉｎｇ Ａｎａｌｏｇ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。９つのグループの組み合わせとＤＮＡ量（括弧内ｐｍｏｌ）、転写反応液の量（括弧内・μｌ）は次の通りである。生成物３６（４．２ｐｍｏｌ）（５０μｌ）、生成物３７
（１．７ｐｍｏｌ）と生成物４９（６．７ｐｍｏｌ）（５０μｌ）、生成物３８（５．８ｐｍｏｌ）と生成物４７（３．３ｐｍｏｌ）と生成物４８（４．２ｐｍｏｌ）（７０μｌ）、生成物３９（７．５ｐｍｏｌ）と生成物４０（７．５ｐｍｏｌ）（７５μｌ）、生成物４１（７．５ ｐｍｏｌ）と生成物４３（５．８ｐｍｏｌ）と生成物４４（５．８ｐｍｏｌ）（１００μｌ）、生成物４２（６．７ｐｍｏｌ）と生成物４５（３．３ｐｍｏｌ）（５０μｌ）、生成物４６（２．５ｐｍｏｌ）と生成物５５（３．３ｐｍｏｌ）（５０μｌ）、生成物５０〜５４（各３．３ｐｍｏｌ）（８０μｌ）、生成物５６（１．７ｐｍｏｌ）と生成物５７（３．３ｐｍｏｌ）と生成物５８（３．３ｐｍｏｌ）（６０μｌ）。得られた生成物をこの順に従って生成物５９〜６７とする。分析のために各ＤＮＡを鋳型に小スケールで転写反応を行い、生成物３６〜５８から生成物６８〜９０を得た。
【００６６】
続いてこれらのｍＲＮＡを特願２００３−３１５３８５号明細書に記載のピューロマイシンリンカー（Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ）と連結した。ピューロマイシンとｍＲＮＡの濃度がそれぞれ０．７５μＭ、０．５μＭになるように５％ジメチルスルホキシドを含むＴ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ）に溶解し、７２℃で１５０秒加熱したのち室温で１２分放置し、さらに１５℃まで冷却したのち１００分の１量（体積比）のＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を加えて１５℃で約２時間反応させた。実際に反応させたｍＲＮＡの量は生成物５９〜６７それぞれに対し１００ｐｍｏｌ、２００ｐｍｏｌ、３２０ｐｍｏｌ、３６０ｐｍｏｌ、４６０ｐｍｏｌ、２４０ｐｍｏｌ、１４０ｐｍｏｌ、３８０ｐｍｏｌ、２００ｐｍｏｌであり、反応後に得られた産物をそれぞれ生成物９１〜９９とする。生成物６８〜９０それぞれに対しても２０〜１５０ ｐｍｏｌ相当のｍＲＮＡをピューロマイシンリンカーと反応させ、生成物１００〜１２２を得た。生成物６８〜９０と生成物１００〜１２２を８Ｍ尿素変性７％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を図２に示す。
【００６７】
実施例３ ポリペプチド−核酸連結分子の調製
上記の生成物９１〜９９を小麦胚芽無細胞蛋白質合成系（ゾイジーン社製）に６ｐｍｏｌ／２４μｌの割合で加えて７５分間翻訳させ、ポリペプチドと核酸の連結した対応分子が形成されるかどうかを確認した。合成系に加えた直後と７５分後の混合液の一部（各生成物０．７５ｐｍｏｌ相当）を８Ｍ尿素変性７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、蛍光で検出した結果を図３に示す。さらに実際の選択実験に用いる対応付け分子を調製するため、生成物９１〜９９をそれぞれ４０ｐｍｏｌ、６５ｐｍｏｌ、６５ｐｍｏｌ、６５ｐｍｏｌ、８０ｐｍｏｌ、６５ｐｍｏｌ、３０ｐｍｏｌ、８８ｐｍｏｌ、１０２ｐｍｏｌ、生成物１００〜１２２を１３．５ｐｍｏｌずつ同様の条件で翻訳した。
【００６８】
翻訳後の溶液合計約３６５０μｌに５Ｍ ＮａＣｌを９８８μｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を４９．４μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ−Ｎａを１４８μｌ、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を４９．４μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴを５７μｌ加え、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏ ｄＴが結合したＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ（Ｔａｋａｒａ社製）６００μｌと４℃で約２時間反応させた。上清を除き、緩衝液Ａ（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭ ＤＴＴ）で３回、緩衝液Ｂ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭ ＤＴＴ）で１回、さらに緩衝液Ｃ（０．２５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍＭ ＤＴＴ）で１回洗浄した後、５ｍＭ ＤＴＴ水溶液３３０μｌで３回溶出した。
【００６９】
この溶出画分に３２４μｌの５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１６２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、６０μｌのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＷＡＫＯ社製；４０Ｕ／μｌ）、８４μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製；２００Ｕ／μｌ）を添加し、５０℃で３分間加熱後、室温で１２分放置した。この溶液に水９４．５μｌ、５Ｍ ＮａＣｌを５４μｌ、０．１Ｍ リン酸水素２カリウムを３２４μｌ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０を２２．５μｌ、５０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを２２．５μｌ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを１１２．５μｌ加え、１５０μｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ社製）と室温で１時間反応させた。
【００７０】
上清を除き、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むｐＨ ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３６０μｌで３回、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むｐＨ８．０のＰＢＳ３６０μｌで３回洗浄し、１００μＭの３×ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅを溶かしたＰＢＳ（ｐＨ８．０）９６μｌで２回、３７μＭの３×ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅと０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を溶かしたＰＢＳ（ｐＨ８．０）２５７μｌで１回溶出した。合わせた溶出液にＰＢＳ（ｐＨ８．０）を１６．８μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ−Ｎａを２．４μｌ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０を２．４μｌ、２ｍＭ 酸化型グルタチオンを４．８μｌ、２ｍＭ 還元型グルタチオンを４．８μｌ加えて４℃で１５時間反応させた後、約６０μｌずつをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に置換したゲルろ過カラム（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６；ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に通して対応付け分子を精製した。これらを再び合わせた約４８０ｍｌの溶液に１０倍濃度のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１２μｌ、４．８％ ＢＳＡを７８μｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを２４μｌ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０を６μｌ加えて選択実験に用いる対応付け分子の溶液（約６００μｌ）とした。
【００７１】
実施例４ 標的蛋白質結合担体の調製と対応付け分子の選択
スクリーニングの標的蛋白質の調製については、まず常法に従ってヒトインターロイキン６（ｉｎｔｅｒｌｕｅｋｉｎ ６；ＩＬ６）あるいはヒト腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）のＮ末側にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｕｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ）を融合した蛋白質をコードするＤＮＡが挿入された大腸菌発現用ベクターを調製した。両者の間にはｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅで切断されるペプチド鎖をコードした配列を挿入した。これを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）で発現させ、目的とする融合蛋白質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズ（アマシャムファルマシア社製）を用いて精製し、溶出に使用したグルタチオンは脱塩カラムにより除去した。またネガティブコントロール用としてＧＳＴ蛋白質のみを合成し、同様の方法で精製した。もう一つの標的蛋白質としてｇｐ１３０のＦｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を購入し、精製せずにそのまま用いた。この融合蛋白質はｇｐ１３０とＦｃの間にＦａｃｔｏｒ Ｘａで切断可能な配列を有する。
【００７２】
ＧＳＴ（１００μｇ）、ＧＳＴ−ＩＬ６（３５μｇ）、ＧＳＴ−ＴＮＦ（１３０μｇ）をそれぞれ２５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０溶液（以下、「ＰＢＳＴ」と称することがある）に溶解し、３０μｌのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズと合わせて１５時間静かに混合した後、上清を除いてＰＢＳＴで４回洗浄し、ＧＳＴビーズ、ＧＳＴ−ＩＬ６ビーズ、ＧＳＴ−ＴＮＦビーズを得た。プロテインＧビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；アマシャムバイオサイエンス社製）３０μｌをＰＢＳＴで洗浄し、ｇｐ１３０／Ｆｃ １８μｇを溶かした０．２％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴ、２００μｌと合わせて１時間静かに混合し、上清を除いてＰＢＳＴで４回洗浄し、ｇｐ１３０／Ｆｃビーズを得た。
【００７３】
対応付け分子の溶液（約６００μｌ）をＧＳＴビーズと混合し、室温で１時間反応させた。上清を続いてＧＳＴ−ＩＬ６ビーズと混合して反応を行い、その上清をとってＧＳＴ−ＴＮＦビーズと反応させ、さらにその上清をプロテインＧビーズ７０μｌに加えて反応を行い、最後にその上清をｇｐ１３０／Ｆｃビーズと混合して反応させた。反応はすべて室温で約１時間行なった。上清を除いた後のビーズはただちに１５０μｌのＰＢＳＴで６回洗浄し、ｇｐ１３０／Ｆｃビーズはさらに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０の溶液（以下、これを「ＴＢＳＴ」と称することがある）１５０μｌで２回洗浄した。洗浄後のＧＳＴビーズ、ＧＳＴ−ＩＬ６ビーズ、ＧＳＴ−ＴＮＦビーズには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴの溶液２００μｌとｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ溶液２μｌを加えて室温で１時間反応させ、上清をとりビーズを同溶液２００μｌで洗った溶液と合わせて酵素溶出液とした。
【００７４】
洗浄後のｇｐ１３０／Ｆｃビーズには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０の溶液４２μｌとＦａｃｔｏｒ Ｘａ溶液（ＢｉｏＬａｂｓ社製）８μｌを加えて室温で２時間反応させ、上清をとり、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液１７５μｌでビーズを２回洗って上清と合わせ酵素溶出液とした。各酵素溶出液にＱｕｉｃｋ ｐｒｅｃｉｐ Ｐｌｕｓを３０μｌ、イソプロパノールを４３０μｌ加えて遠心し、対応付け分子を沈殿物として回収して７０％エタノール水溶液で洗い、風乾後、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１００ｍＭの水酸化カリウム水溶液２５μｌに溶解した。室温で１時間反応させた後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１００ｍＭの酢酸カリウム水溶液をほぼ等量加えて中和を確認し、ＰＣＲ反応の鋳型溶液とした。
【００７５】
ＰＣＲの反応サイクル数を決めるため、鋳型溶液の一部（４μｌ）で条件検討を行なった。プライマーとして配列番号５２と５３のＤＮＡ（それぞれ４０ｎＭ）、反応系としてＴＯＹＯＢＯ社製ＫＯＤ ｐｌｕｓを用い（鋳型溶液１μｌに対し１０μｌ）、ＰＣＲ装置上９４℃で２分反応後、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、６８℃で９０秒の反応サイクルを８、１２、１６、あるいは２０回実施後、さらに６８℃で５分反応させた。アガロースゲル電気泳動による解析結果より、ＧＳＴとＧＳＴ−ＴＮＦに対しては反応サイクルを１０回、ＧＳＴ−ＩＬ６とｇｐ１３０／Ｆｃに対しては１２回として残りの鋳型溶液を用いてＰＣＲ反応を行なった。精製して得られたそれぞれのＤＮＡ溶液のうち約半分（ＤＮＡとして４８０ ｎｇ）を配列番号５４と５５のプライマーＤＮＡ（それぞれ４０ｎＭ）とともにＫＯＤ ｐｌｕｓ反応液に加え（計４８０μｌ）、反応サイクル８回で再びＰＣＲ反応を行い、転写プロモーター配列からピューロマイシンリンカー結合配列までを含む最初のライブラリーと同じコンストラクトを有するＤＮＡを得た。
【００７６】
実施例５ ポリペプチド−核酸連結分子の濃縮操作
実施例２から実施例４の操作を第１ラウンドとし、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＩＬ６、ＧＳＴ−ＴＮＦ、ｇｐ１３０／Ｆｃのそれぞれに対して選択されたＤＮＡをもとに次の選択を繰り返す操作を第１０ラウンドまで実施した。具体的には、選択後にＰＣＲ反応を行なって得られた４種のＤＮＡ混合物のそれぞれを鋳型に実施例２の方法に基づいて転写反応を行い、得られたそれぞれのｍＲＮＡ混合物をピューロマイシンリンカーと連結させた。この核酸複合体を実施例３の方法に基づいてそれぞれ翻訳し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを遺伝情報として有する対応付け分子を調製した。実施例２と実施例３の方法に準じた第２ラウンド以降の操作は４種のライブラリー由来混合物を対象に並行して行い、反応のスケールを徐々に減らして実施した。実施例４に準じた選択実験も４種を並行して行い、ＧＳＴに対して選択された対応付け分子はＧＳＴビーズと反応させ、ＧＳＴ−ＩＬ６あるいはＧＳＴ−ＴＮＦ に対して選択された対応付け分子はＧＳＴビーズと混合した後に上清画分をＧＳＴ−ＩＬ６ビーズあるいはＧＳＴ−ＴＮＦビーズと反応させた。
【００７７】
ｇｐ１３０／Ｆｃに対して選択された対応付け分子はプロテインＧビーズとまず反応させた後に上清画分をｇｐ１３０／Ｆｃビーズと反応させた。反応はいずれも第１ラウンドと同様に室温約１時間とし、ビーズに固定する蛋白量は段階的に減らして、最後の第１０ラウンドにおいては対応付け分子と反応させる時の溶液量に対し、ＧＳＴが２０μｇ／２５０μｌ、ＧＳＴ−ＩＬ６が１０μｇ／２５０μｌ、ＧＳＴ−ＴＮＦが５μｇ／２５０μｌ、ｇｐ１３０／Ｆｃが１．５μｇ／２５０μｌであった。反応後の洗浄液の量と洗浄回数は段階的に増やし、第１０ラウンドにおいてはＧＳＴビーズを２５０μｌのＰＢＳＴで８回、ＧＳＴ−ＩＬ６ビーズを２５０μｌのＰＢＳＴで１０回、ＧＳＴ−ＴＮＦビーズを２５０μｌのＰＢＳＴで１０回、ｇｐ１３０／Ｆｃビーズを２５０μｌのＰＢＳＴで４回、さらに２５０μｌのＴＢＳＴで８回洗浄した。
【００７８】
酵素溶出とＰＣＲ鋳型溶液の調製は実施例４とほぼ同様の条件で行い、配列番号５２と５３のＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応は実施例４と同様に一部で条件検討を行い反応サイクル数を決定してから実施した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号５４と５５のＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲは鋳型ＤＮＡ、１５０ｎｇ／ＫＯＤ ｐｌｕｓ反応液３００μｌ、反応サイクル８回を基本として実施した。
【００７９】
実施例６ 選択されたポリペプチドの結合試験
第１０ラウンド選択後のＰＣＲで得られたＤＮＡをＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）によりＡ付加し、ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ（プロメガ社製）を用いて常法によりプラスミドに挿入した。これを大腸菌ＪＭ１０９にトランスフェクションして増幅し、選択されたＤＮＡ配列を含むプラスミドを回収した。配列番号５４と５５のＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、得られたＤＮＡを鋳型に転写反応を実施してｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡを実施例３で用いた無細胞翻訳系で翻訳し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースビーズで精製した。ＤＴＴを含まない溶出液（ＴＢＳＴ）中で１５時間放置した後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで約５倍に希釈してポリペプチド溶液とした。
【００８０】
９６ウェルのポリスチレンプレート（ＣＯＳＴＡＲ社製；９０１８）の各ウェルにＧＳＴ、ＧＳＴ−ＩＬ６、ＴＮＦのそれぞれを１μｇ／１００μｌの濃度でＰＢＳに溶かした溶液を加えて４℃で一晩静置した。ＧＳＴとＧＳＴ−ＩＬ６は実施例４で用いたものを使用し、ＴＮＦはＧＳＴ−ＴＮＦをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅで消化してＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズ上でＧＳＴを除くことにより得た。
【００８１】
ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを２００μｌ加えて３７℃で２時間振とうした後に溶液を除き、上記のポリペプチド溶液を加えて室温で１時間振とうした。溶液を除いてＰＢＳＴで３回ウェルを洗浄し、１ｍｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体−ＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ社製；Ａ８５９２）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１万倍に希釈した溶液１００μｌを各ウェルに添加して室温で１時間静置した。溶液を除いてＰＢＳＴで３回ウェルを洗浄し、１０ｍｇ／２５ｍｌのｏ−フェニレンジアミンと１０μｌ／２５ｍｌの３０％過酸化水素水を含むクエン酸緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ加えて室温で１０分静置した後に１規定の硫酸水溶液を等量加えて酵素反応を停止し、４９０ｎｍの吸収をプレートリーダーで測定した。ＧＳＴ−ＩＬ６に対して選択された４種のポリペプチドに対する結果を図４に、ＧＳＴ−ＴＮＦに対して選択された３種のポリペプチドに対する結果を図５にそれぞれ示した。ＧＳＴ−ＩＬ６に対して選択されたもののうち、２種がＧＳＴ−ＩＬ６に対して選択性を示し、ＧＳＴ−ＴＮＦに対して選択されたものは３種すべてＴＮＦに対する選択性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】生成物３９と４１の配列解析の結果得られたランダム化部位におけるアミノ酸出現頻度（観測値）をその期待値とともに示したグラフである。
【図２】ｍＲＮＡ（生成物６８〜９０）とそれをピューロマイシンリンカーと連結させた反応物（生成物１００〜１２２）を８Ｍ尿素変性７％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した写真である。
【図３】ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体（生成物９１〜９９）を無細胞翻訳系に加えた反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し蛍光で検出した写真である。
【図４】ＧＳＴ−ＩＬ６ビーズに対して選択されたポリペプチドの結合活性をプレートアッセイで測定した結果を示すグラフである。
【図５】ＧＳＴ−ＴＮＦビーズに対して選択されたポリペプチドの結合活性をプレートアッセイで測定した結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異を導入した構造モチーフを標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法。
【請求項２】
変異を導入した構造モチーフおよびランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法。
【請求項３】
標的分子と相互作用するポリペプチドを選択する方法が、無細胞蛋白質ディスプレー法である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
変異を導入した構造モチーフを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択することを特徴とするファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法。
【請求項５】
変異を導入した構造モチーフおよびランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択することを特徴とするファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法。
【請求項６】
標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択する方法が無細胞蛋白質ディスプレー法である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか1項に記載の方法により得られたポリペプチドのアミノ酸配列からアミノ酸の存在頻度および／または出現頻度を指標として共通配列を選択する工程を含むことを特徴とする医薬的活性を有するポリペプチドの取得方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法により得られたポリペプチドを化学的に改変して医薬的活性を向上させることを特徴とするペプチド誘導体の取得方法。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか1項に記載の方法により得られたポリペプチドあるいはペプチド誘導体と標的分子との複合体を作製する工程、該複合体の立体構造解析を行い、標的分子と該ポリペプチドあるいは該ペプチド誘導体との結合部位を特定する工程、同定された結合部位から標的分子のファーマコフォアを明らかにして、該ファーマコフォアに合う低分子化合物を設計する工程を含むことを特徴とする標的分子と相互作用する化合物の分子設計方法。
【請求項１】
変異を導入した構造モチーフを標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法。
【請求項２】
変異を導入した構造モチーフおよびランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子と相互作用するポリペプチドを選択することを特徴とする標的分子−ポリペプチド間相互作用解析方法。
【請求項３】
標的分子と相互作用するポリペプチドを選択する方法が、無細胞蛋白質ディスプレー法である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
変異を導入した構造モチーフを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択することを特徴とするファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法。
【請求項５】
変異を導入した構造モチーフおよびランダムペプチドを標的分子と接触させ、標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択することを特徴とするファーマコフォアを明らかにするポリペプチドの取得方法。
【請求項６】
標的分子に対し高親和性を示すポリペプチドを選択する方法が無細胞蛋白質ディスプレー法である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか1項に記載の方法により得られたポリペプチドのアミノ酸配列からアミノ酸の存在頻度および／または出現頻度を指標として共通配列を選択する工程を含むことを特徴とする医薬的活性を有するポリペプチドの取得方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法により得られたポリペプチドを化学的に改変して医薬的活性を向上させることを特徴とするペプチド誘導体の取得方法。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか1項に記載の方法により得られたポリペプチドあるいはペプチド誘導体と標的分子との複合体を作製する工程、該複合体の立体構造解析を行い、標的分子と該ポリペプチドあるいは該ペプチド誘導体との結合部位を特定する工程、同定された結合部位から標的分子のファーマコフォアを明らかにして、該ファーマコフォアに合う低分子化合物を設計する工程を含むことを特徴とする標的分子と相互作用する化合物の分子設計方法。
【図１】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−１４３４２３（Ｐ２００７−１４３４２３Ａ）
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３３８８８１（Ｐ２００５−３３８８８１）
【出願日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【出願人】（５０２２６２４６９）ゾイジーン株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【出願人】（５０２２６２４６９）ゾイジーン株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
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