標的核酸を増幅して検出するための方法
【課題】本発明は、標的核酸の増幅および検出方法を提供する。
【解決手段】前記方法は、標的核酸を含有すると疑われる試料を、前記標的核酸に実質的に相補的である２種のプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させることを含む。次いで増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する。増幅に続いて、前記試料を検出前インキュベーション工程にかける。前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記重合剤を不活性化する。最終的に、増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する。
【解決手段】前記方法は、標的核酸を含有すると疑われる試料を、前記標的核酸に実質的に相補的である２種のプライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させることを含む。次いで増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する。増幅に続いて、前記試料を検出前インキュベーション工程にかける。前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記重合剤を不活性化する。最終的に、増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸の増幅および検出方法に関する。詳細には、増幅された核酸生成物を検出する改良方法に関する。本発明は、種々の医学的および学術的研究、法医学的調査、ならびに診断方法、例えば、遺伝子障害もしくは感染症の検出に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にプローブを用いる非常に精巧なハイブリッド形成アッセイの発展を包含する、微量の核酸を検出するための技術は、この２０年間で急速に進歩した。研究者らは、ヒトおよび動物の試験被検体中の疾患および遺伝的特徴を検出するためのそのような技術の価値を直ちに認めてきた。核酸の増幅および検出にプライマーおよびプローブを使用することは、相補性の概念、すなわち、相補的ヌクレオチド（ヌクレオチド対としても既知である）間の水素結合による二本鎖の核酸の結合に基づいている。
少量のＤＮＡを増幅し検出する方法を見いだすために、多くの研究が行われてきた。種々の方法が既知であり、それらは、検出するために被検体中の核酸の数を増幅するかまたは著しく増大するのに使用されてきた。そのような増幅技術には、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および分枝ＤＮＡが含まれる。
【０００３】
ＰＣＲは、これらのうち最もよく知られている増幅方法である。ＰＣＲについての詳細は、例えば、米国特許第 4,638,195号明細書（Mullis他）、米国特許第 4,683,202号明細書（Mullis）および米国特許第 4,965,188号明細書（Mullis他）を包含する従来技術文献によく記載されている。あまり詳しくはないが、ＰＣＲでは、重合剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸が存在しており、適当な条件下で、ハイブリッド形成プライマーを標的核酸の鎖に巻き込む。その結果、鋳型に相補的であるヌクレオチドを加えたプライマー伸長生成物が、鋳型に沿って生成する。
【０００４】
一度、プライマー伸長生成物を変性し、そして鋳型のコピーを１つ作り、標的核酸と同じ配列を有する核酸の量を指数関数的に増加させるのに望まれる回数だけ、プライミング、伸長および変性のサイクルを実施できる。実際には、標的核酸は、それがより容易に検出されるように何回も複製（または増幅）される。一度、標的核酸が十分に増幅されると、種々の検出方法を用いて、標的の存在を定性的および／または定量的に検出することができる。
一度、標的核酸が十分に増幅されると、種々の検出方法を用いて、その存在を検出することができる。ＰＣＲ生成物を検出するのに使用される標準検出方法には、臭化エチジウム染色アガロースゲルが用いられる。しかしながら、臭化エチジウム染色ゲルの使用は、例えば、比較的乏しい感度および特異性を包含する幾つかの欠点を有する。
【０００５】
放射性標識および電気泳動の使用を排除する、改良されたＰＣＲ生成物の検出方法が開発された。これらの非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出方法は、プローブに対する特異的ハイブリッド形成および酵素的信号発生による。そのような非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出方法（逆ドット・ブロット検出としても既知である）は、米国特許第 5,229,297号明細書（Schnepilsky 他）、同第 5,328,825号明細書（Warren他）および同第 5,422,271号明細書（Chen他）に記載されている。また、そのような方法は、Findlay 他，Clinical Chemistry, 39:1927-1933 (1993) に記載されている。
【０００６】
これらの非同位体検出方法は、臭化エチジウム染色検出よりも高い感度および特異性を有し、そして放射能の使用を回避する。これらの方法は、ビオチニル化プライマー（複数）で増幅を行ってまたはビオチニル化プローブを用いて操作することで、増幅された核酸を検出する。ビオチニル化生成物もしくはプローブは、次いでアビジンもしくはストレプトアビジン接合酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と反応する。次いで色素前駆体（もしくは発光性信号試薬）を酵素と接触状態にして色素（ルミネセンス）に変換し、それにより検出可能な信号を発生させることができる。
【０００７】
しかしながら、非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出方法は、それら自身に欠点を持たない訳ではない。非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出が標準ＰＣＲ変性条件（９５℃）を利用して実施され、濃縮されたかまたは最低限に希釈された増幅された核酸生成物を変性する場合、増幅反応を行うために利用される酵素、例えば、熱安定性ポリメラーゼもしくはＤＮＡリガーゼは、まだなお存在しかつ活性であるだろう。検出の最中におけるそのような活性酵素の存在は、酵素とプローブとの間で増幅生成物に対する結合の競合を引き起こす。そのような競合は、プローブに結合する増幅された核酸生成物の量を低減し、そのために検出信号を低減しうる。
【０００８】
この問題に対する１つの解決方法は、高レベルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｍｇ++のキレート化剤を、増幅を行った後であるが検出する前に、ＰＣＲ増幅混合物に添加することである。ＥＤＴＡは、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを包含する、活性にＭｇ++を必要とする多数の酵素を阻害することができる。しかしながら、ＥＤＴＡの使用は、ＰＣＲ増幅および検出方法に追加段階を加えることになる。加えて、ＥＤＴＡを使用すると、ＥＤＴＡを添加するために反応容器を開ける必要がある。当業者らが承知のように、反応容器を開けることは、汚染を懸念して避けるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、ＥＤＴＡもしくは別のそのような酵素阻害剤の添加により検出中の増幅プロセスを妨害することは望ましくない。それよりは、汚染の危険性を増大することなく、検出する前に増幅酵素を不活性化する方法が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
検出する前に増幅後インキュベーション段階を用いて増幅酵素を不活性化することにより、前記課題を解決することが本発明の目的である。
ある態様では、本発明は、
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、前記標的核酸の一部分に実質的に相補的である少なくとも２種のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性増幅酵素と、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する工程、
（ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記熱安定性増幅酵素を不活性化する工程、並びに
（ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法に関する。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および前記標的核酸に実質的に相補的である少なくとも２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する工程、
（ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記重合剤を不活性化する工程、並びに
（ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも一方がビオチンで標識されており且ついずれも前記標的核酸に実質的に相補的である少なくとも２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅後インキュベーション段階として、前記試料を０．５分間〜５分間、約１０５℃でインキュベートして、前記ポリメラーゼを不活性化する工程、並びに
（ｉｉｉ）前記ビオチニル化され増幅された標的核酸を、ストレプトアビジン酵素接合体と反応させ、続いて前記酵素を基質試薬と反応させて、検出可能な比色または化学ルミネセンス信号を生成することにより、前記ビオチニル化され増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法に関する。
本発明の様々な別の目的および利点が、以下の発明の説明から明らかであるだろう。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸の増幅および検出のための一般的な原理および条件は周知であり、その詳細は、米国特許第 4,683,195号明細書（Mullis他）、米国特許第 4,683,202号明細書（Mullis）および米国特許第 4,965,188号明細書（Mullis他）を包含する多数の文献に提供されている。これらはすべて引用することにより本明細書中に組み入れられる。従って、従来技術文献における教示および本明細書中に提供される特別な教示を考えると、当業者にとって、本明細書で教示したように、生成物検出の前に増幅後インキュベーション工程を加えて増幅酵素を不活性化することにより検出感度を増大する本発明の実施に際して困難はないはずである。
【００１４】
熱安定性酵素を使用する別の増幅および検出方法を、本発明の実施に際して使用することもできる。本発明は、増幅中に使用される熱安定性酵素（複数）を不活性化する、増幅後，検出前のインキュベーション工程を提供する。従って、本発明は、熱安定性酵素を使用する任意の増幅方法と共に使用するのに適する。別の熱安定性増幅方法には、例えば、欧州特許第 0 320 308号明細書（1987年12月発行）および欧州特許第 0 439 182号明細書（1990年 1月発行）に記載された、熱安定性ＤＮＡリガーゼを用いて隣接したプローブを結合させそれによって相補的核酸配列を生成する、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が含まれる。ＬＣＲでは、標的核酸を、４種のオリゴヌクレオチド・プローブおよび熱安定性ＤＮＡリガーゼを用いて増幅する。オリゴヌクレオチド・プローブのうち２種が、増幅しようとするＤＮＡ鋳型の一本鎖上の隣接した部位に相補的である。これらのプローブは、２つのプローブ間にニックが形成されるように、そのＤＮＡ鎖とハイブリッド形成する。次いでニックを、熱安定性ＤＮＡリガーゼにより封じ、それによって標的に相補的な新しいＤＮＡ鎖を生成する。第３および第４のプローブは、ＤＮＡ鋳型の第２の鎖に相補的であり、最初のプローブ対のように機能して相補的ＤＮＡを生成する。ＬＣＲの増幅された生成物は、標準検出方法を用いて検出できる。本発明の増幅後，検出前インキュベーション段階をＬＣＲに用いると、検出する前にＤＮＡリガーゼを不活性化できる。従って、本明細書に提供した教示により、当業者は、ＰＣＲで認められた増幅後酵素変性段階をこれらの別の既知増幅および検出方法に適応させることが可能だろう。この開示の残りは、説明の都合上ＰＣＲを用いる本発明の実施に向けられている。
【００１５】
本発明は、検出感度を改良するために既知ＰＣＲ方法を改良するものである。驚くべきことに、本発明によると、増幅後，検出前インキュベーション工程を採用することにより、重合剤を不活性化し、プローブと重合剤との間における増幅された標的核酸に対する結合の競合を低減できることがわかった。この競合の低減により、検出感度が高められる。
本発明は、試験被検体中に存在する１種以上の標的核酸の増幅および検出に向けられている。試験被検体には、細胞性もしくはウイルス性物質、体液または検出できる遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する別の細胞性物質が含まれうる。
【００１６】
増幅し検出しようとする核酸は、プラスミド類並びにいずれかの供給源（例えば、細菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物、もしくはヒト）由来の天然産ＤＮＡもしくはＲＮＡを包含する種々供給源より得ることができる。それは、限定されるものではないが、既知方法を用いて、血液、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、組織材料もしくは当該技術分野で既知である別の供給源を包含する様々な組織から抽出してもよい。本発明は、ゲノム（genomic ）ＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは細菌もしくはウイルス感染細胞中に見いだされるＤＮＡもしくはＲＮＡ中に見いだされる１つ以上の核酸配列の増幅及び検出に特に有用である。
【００１７】
本明細書に記載された方法を用いて、感染症、遺伝子障害および細胞障害、例えば、癌に関連する標的核酸を増幅し検出することができる。また、それを法医学的調査およびＤＮＡタイピングに使用してもよい。感染性病原体、例えば、細菌およびウイルスに関連した核酸の検出による、それらの検出に特に有用である。非常に高い感度および／または定量性が必要とされるとき、それは特に有用である。
【００１８】
本発明により検出できる細菌には、限定されるものではないが、ヒトの血液中に見いだされる細菌、例えば、サルモネラ種（Salmonella species）、ストレプトコッカス種（Streptococcus species ）、クラミジア種（Chlamydia species ）、ゴノコッカル種（Gonococcal species）、マイコバクテリア種（Mycobacteria species）（例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）およびトリ型結核菌複合体（Mycobacterium avium complex ）、マイコプラズマ種（Mycoplasma species）（例えば、マイコプラズマ・ヘモフィルス・インフルエンザ（Mycoplasma Hemophilus influenzae）およびマイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae ，肺炎マイコプラズマ））、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、ボレリア・ブルグドルフェライ（Borrelia burgdorferei ）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile ）、カンピロバクテリア種（Camplyobacteri species）、エルシニア種（Yersinia species）、シゲラ種（Shigella species）ならびにリステリア種（Listeria species）が含まれる。検出可能であるウイルスには、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus ）、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus）、ＥＢウイルス（Epstein Barr virus）、ヒトパピローマウイルス（human papilloma virus ）、インフルエンザウイルス（influenza viruses ）、肝炎ウイルス（hepatitis virus ）ならびにレトロウイルス（例えば、HTLV-I、HTLV-II 、HIV-I およびHIV-II）が含まれる。原生動物寄生体、酵母およびかびも、本発明により検出可能である。別の検出可能な種は、当業者に容易に明らかであるだろう。
【００１９】
「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに必須であるとみなされる試薬のいずれか、すなわち、各標的核酸につき一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターおよび１つ以上のデオキシリボヌクレオシド−５′−三燐酸（ｄＮＴＰ類）を称する。ＰＣＲに使用される別の任意の試薬および材料を以下に記載する。
「プライマー」の語は、核酸鎖（すなわち、鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置かれた場合に合成の開始点として作用できる、天然産又は合成的に生成されたオリゴヌクレオチドを称する。そのような条件には、別のＰＣＲ試薬の存在ならびに適当な温度およびpHが含まれる。
【００２０】
本発明のプライマーは、プライムおよび増幅しようとする特異的核酸配列に対して「実質的に相補的」であるように選択される。これは、それらが、それぞれの核酸配列とハイブリッド形成するのに十分に相補的であり、所望のハイブリッド形成生成物を形成し、次いでＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能でなければならないことを意味する。典型的には、「実質的に相補的」なプライマーは、標的配列に相補的である塩基を少なくとも７０％以上含有するだろう。より好ましくは８０％の塩基が相補的であり、さらにより好ましくは９０％の塩基が相補的である。最も好ましい状態では、プライマーが標的核酸配列に対して９０％〜１００％の正確な相補性を有する。
【００２１】
プライマーは、増幅で最大効率を発揮させるために好ましくは一本鎖であるが、所望であれば二本鎖領域を含有することができる。それは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。各プライマーの正確なサイズは、予測される用途、プライマーの濃度および配列、標的とされる配列の複雑さ、反応温度、ならびにプライマーの供給源に応じて変化するだろう。一般的には、本発明に使用されるプライマーは、１２〜６０個のヌクレオチドを有し、そして好ましくはそれらが１６〜４０個のヌクレオチドを有する。より好ましくは、各プライマーが１８〜３５個のヌクレオチドを有する。
【００２２】
本明細書中の有用なプライマーは、例えば、ABI ＤＮＡ合成機（Applied Biosystemsより入手可能）またはバイオサーチ8600シリーズもしくは8800シリーズ合成機（Biosearch 8600 Series もしくは8800 Series Synthesizer ）（Milligen-Biosearch, Inc.より入手可能）を包含する、既知技法および装置を用いて調製できる。この装置の使用方法は周知であり、例えば、米国特許第 4,965,188号明細書（Gelfand 他）に記載されている。それは、引用することにより本明細書中に組み入れられる。また、生物学的供給源から単離された天然プライマーが有用である（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）。通常、一組の少なくとも２つのプライマーが各標的核酸に使用される。従って、複数の組のプライマーを用いて、複数の標的核酸を同時に増幅することができる。
【００２３】
本明細書中で用いられる「プローブ」とは、標的核酸の核酸配列に実質的に相補的であり、かつ増幅された標的核酸の検出または捕捉に用いられるオリゴヌクレオチドである。
本発明に用いられるプライマーおよび／またはプローブは、任意に標識することができる。当該技術分野で既知である方法を用いて、プライマーおよび／またはプローブを、特異的バインディング・リガンド（例えば、ビオチン）、酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼ）、放射性同位体、高電子密度試薬、色原体、発蛍光団、リン光体部分、またはフェリチンで標識できる。好ましくは、標識が特異的バインディング・リガンドである。より好ましくは、標識がビオチンもしくはその誘導体、ストレプトアビジンもしくはその誘導体、またはハプテンである。
【００２４】
ＰＣＲに必要な更なるＰＣＲ試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターおよび適当なｄＮＴＰ類が含まれる。これらの試薬は、試験キットの一部として、または試験装置の試薬室に別個に提供できる。
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型との複合体中のプライマーの３′−ヒドロキシ末端にデオキシリボクレオシド一燐酸分子を加える酵素であるが、しかしこの添加は、鋳型依存方式である。一般的には、伸長生成物の合成は、合成が終わるまで新たに合成される鎖の５′から３′方向に進行する。有用なＤＮＡポリメラーゼには、例えば、大腸菌（E. coli ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー（Klenow）ポリメラーゼ、逆転写酵素、および当該技術分野で既知の別のものが含まれる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼが、熱に安定であり、より高い温度、特にＤＮＡ鎖のプライミングおよび伸長に用いられる高温で優先的に活性であることを意味する、熱安定性である。より詳細には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されるポリメラーゼ連鎖反応に用いられる高温で実質的に不活性化されない。そのような温度は、pH、ヌクレオチド組成、プライマーの長さ、塩濃度および当該技術分野で既知の別の条件を包含する多数の反応条件により変化するだろう。
【００２５】
数多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが従来技術文献に報告されており、それらには米国特許第 4,965,188号明細書（Gelfand 他）および米国特許第 4,889,818号明細書（Gelfand 他）に詳細に記載されているものが包含される。両方とも引用することにより本明細書に組み入れられる。特に有用なポリメラーゼは、種々のサーマス細菌種、例えば、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）もしくはサーマス・フラバス（Thermus flavus）より得られるものである。別の有用な熱安定性ポリメラーゼが、サーモコッカス・リテラリス（Thermococcus literalis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）、サーモトガ種（Thermotoga sp.）およびWO-A-89/06691 （1989年 7月27日発行）に記載のものを包含する種々の微生物源より得られる。幾つかの有用な熱安定性ポリメラーゼが市販されている、例えば、アプリタック（AppliTaq）（商標）、ティース（Tth ）、およびウルトマ（UlTma ）（商標）がPerkin Elmerから、フー（Pfu ）がStratageneから、そしてベント（Vent）およびディープベント（DeepVent）がNew England Biolabs から市販されている。また、天然のポリメラーゼを生物体から単離して、組換え技法を用いて遺伝子工学酵素を生成するための数多くの技法が既知である。
【００２６】
ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターは、活性について酵素が依存する非タンパク質化合物を称する。従って、酵素はコファクターが存在しないと触媒的に不活性である。限定されるものではないが、マンガン塩およびマグネシウム塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩を包含する数多くのそのような物質が既知コファクターである。マグネシウムの塩化物および硫酸塩が好ましい。
また、２種以上のデオキシリボヌクレオシド−５′−三燐酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰがＰＣＲに必要とされる。類似体、例えば、ｄＩＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰも有用である。好ましくは、４種の普通の三燐酸塩（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）が一緒に使用される。
【００２７】
本明細書中に記載されるＰＣＲ試薬は、標的核酸を増幅させるのに適する濃度でＰＣＲに用いられる。増幅に必要とされるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、コファクターおよびデオキシリボヌクレオシド−５′−三燐酸の最低量、ならびに各々の適当な範囲は、当該技術分野で周知である。一般的にはＤＮＡポリメラーゼの最低量は少なくとも約０．５単位／１００μＬの溶液であるが、約２〜約２５単位／１００μＬの溶液が好ましく、約７〜約２０単位／１００μＬの溶液がより好ましい。所定の増幅系には別の量が有用であるかもしれない。「単位」は、３０分間に７４℃で総ヌクレオチド（ｄＮＴＰ類）１０ナノモルを伸長核酸鎖に組み入れるのに必要とされる酵素活性の量として本明細書で定義される。プライマーの最低量は、少なくとも約０．０７５マイクロモル濃度であり、約０．１〜約２マイクロモル濃度が好ましいが、別の量が当該技術分野で周知である。一般的には、コファクターは約２〜約１５ミリモル濃度の量で存在する。各ｄＮＴＰの量は、一般的には約０．２５〜約３．５ミリモル濃度である。
【００２８】
ＰＣＲ試薬は、個別に供給することもできるし、または種々の組合せで供給することもできるし、あるいはすべて任意の適当な緩衝剤を用いて約７〜約９の範囲のpHを有する緩衝液に含めて供給することもでき、そのようなことの多くが当該技術分野で既知である。
ＰＣＲに使用できる別の試薬には、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体、エキソヌクレアーゼおよび／またはグリコシラーゼが含まれる。抗体を使用して、増幅の前にポリメラーゼを阻害できる。本発明に有用な抗体は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を約５０℃より下の温度で阻害し、そしてより高い温度で非活性化される。有用な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体断片が含まれる。好ましくは、抗体がモノクローナルである。本発明に有用な抗体は、既知方法、例えば、Harlow他，抗体：実験マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor, NY (1988) に記載のものを用いて調製できる。
【００２９】
代表的なモノクローナル抗体は、米国特許第 5,338,671号明細書（Scalice 他）に記載されており、その内容は引用することにより本明細書に組み入れられる。２つのそのようなモノクローナル抗体が、従来の方法、およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Rockville, MD ）に寄託されているハイブリドーマ・セルラインHB 11126もしくは11127 のいずれかを包含する出発物質を用いて当業者により容易に得られる。モノクローナル抗体は、ＤＮＡポリメラーゼに対するモル比約５：１〜約５００：１の量で存在する。
【００３０】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体は、単独で、またはSutherland他により1995年 2月 7日に出願された、「ポリメラーゼ連鎖反応における特異性を増強するための、抗ポリメラーゼ抗体に対する捕捉剤としてのエキソヌクレアーゼおよび／またはグルコシラーゼの使用（Use of Exonuclease and/or Glycosylase as Supplements to Anti-Polymerase Antibody to Increase Specificity in Polymerase Chain Reaction)」と題する米国特許出願番号第 08/385,019 号明細書に記載されているように、エキソヌクレアーゼおよび／またはグリコシラーゼと組み合わせて本発明に使用することができる。抗体、エキソヌクレアーゼおよびグリコシラーゼを組み合わせて使用すると、ゼロ・サイクル・アーチファクトの生成を低減する。ＰＣＲにおける使用に適するエキソヌクレアーゼには、限定されるものではないが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＩＩ、ポリヌクレオチド・ホスホリラーゼおよびＢＡＬ ３１ヌクレアーゼが含まれる。そのようなエキソヌクレアーゼは、市販されているか、または当該技術分野で既知の方法により得ることができる。本発明に有用なグリコシラーゼは、通常のものとは異なる塩基、すなわち、ＤＮＡ中のＡ、Ｇ、ＣもしくはＴならびにＲＮＡ中のＡ、Ｇ、ＣおよびＵ以外の塩基を特異的に切断するものである。好ましいグリコシラーゼには、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼおよび３−メチアデニン−ＤＮＡグリコシラーゼＩおよびＩＩが含まれる。好ましい態様では、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼに対するモノクローナル抗体、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼが使用される。
【００３１】
標的核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか）は、任意の様々な前記供給源から得ることができる。一般的には、試料を何らかの方法で処理して、ＤＮＡをプライマーおよび別のＰＣＲ試薬と接触可能にする。これは、通常、当該技術分野で既知である種々方法の１つを用いて試料から望ましくないタンパク質および細胞性物質を除去することを意味する。
増幅し検出しようとする核酸はしばしば二本鎖型であるので、プライミングおよび増幅を行う前に二本鎖を分離（すなわち、変性）しなければならない。変性は、熱処理のみ単独で用いて、または従来技術文献に記載されるように鎖を分離するための任意の別の適当な物理的、化学的もしくは酵素的手段と組み合わせて用いて達成できる。初期変性は、一般的には標的核酸を含有することが疑われる試料を、約８５°〜約１００℃の第１温度で適当な時間、例えば、約１秒間〜３分間加熱することにより実施される。
【００３２】
次いで変性した鎖を、一般的には、鎖をプライミングするために約５５°〜約７０℃の範囲内である温度に冷却する。初期変性の後に鎖を冷却するのに要する時間は、ＰＣＲ方法に使用される機器の型により変化するだろう。
一旦、変性した鎖を第２温度に冷却し、ＰＣＲ試薬を含有する反応混合物と共に変性した鎖を、鎖に対するプライマーのアニーリング（ハイブリッド形成）およびプライマーの伸長を行ってプライマー伸長生成物を形成するのに適する温度でインキュベートする。一般的には、この温度は、少なくとも約５０℃であり、好ましくは約６２°〜約７５℃の範囲である。インキュベーション時間は、インキュベーション温度および所望の伸長生成物の長さにより広範に変化できるが、好ましい態様では、約１〜約１２０秒間である。ＰＣＲの各サイクルは、２つまたは３つの異なる温度、１つは変性用、そして第２または第３の温度はプライミングおよび／またはプライマー伸長生成物形成用の温度のいずれかを用いて実施できる。
【００３３】
少なくとも１つのプライマー伸長生成物の生成後の任意の時点で、増幅を停止し標的プライマー伸長生成物（前記「増幅された標的」）を検出することができる。しかしながら、次いでハイブリッド形成されたプライマー伸長生成物を変性する場合、プライミング、伸長および変性のサイクルを更に所望の回数、ＰＣＲを実施できる。実施されるＰＣＲサイクルの回数は、幾分、増幅された所望の標的の量によるであろうし、当業者らにより容易に決定されうる。一般的には、少なくとも２０回実施され、２０〜５０回が好ましい。
【００３４】
複数の標的核酸を増幅するとき、特に標的の一方がより低いコピー数の標的でありかつ一方が高いコピー数の標的である場合、Backus他により1994年 6月 6日に出願され、「中間復元段階を用いる増幅方法（Method of Amplification Using Intermediate Renaturation Step）」と題する米国特許出願番号第08/264,102号明細書に記載されたように、第２の復元段階を第１ＰＣＲサイクルを実施した後に使用することができる。少なくとも１５回の第１増幅サイクルの後（第１増幅サイクルは変性、プライミングおよび伸長を含む）、各変性段階後かつプライマー・アニーリング前に復元段階が含まれていることを除いて同じ段階を有する第２増幅サイクルを実施する。復元は、米国特許出願番号第08/264,102号明細書に記載されたように、反応混合物を第４温度に冷却することにより達成される。
【００３５】
本発明では、所望の回数ＰＣＲサイクルを用いて標的核酸を増幅した後、増幅後，検出前インキュベーション段階を行ってＤＮＡポリメラーゼを不活性化し、それにより検出感度を増大する。増幅後インキュベーション段階を実施する際の条件は、使用される熱安定性酵素に依存するが、温度およびインキュベーション期間を組み合わせて酵素を不活性化するようなものであるだろう。好ましくは、この増幅後インキュベーション段階が、増幅された標的を含有するＰＣＲ増幅混合物を約９５℃〜約１２０℃の温度で約１秒間〜約３０分間インキュベートすることにより実施される。好ましくは、増幅後インキュベーション段階が、１００℃〜１１０℃の温度で１５秒間〜１０分間、より好ましくは約１０５℃の温度で５分間以下加熱することを含む。
【００３６】
一度、増幅後インキュベーションを行うと、増幅された核酸標的を検出できる。検出は、数多くの既知方法、例えば、米国特許第 4,965,188号明細書（Gelfand 他）に記載されたもので達成できる。例えば、増幅された核酸を、サザン・ブロッティング、ドット・ブロット法または標識されたプローブを用いて非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出を用いて検出できる。あるいは、適当に標識されたプライマーを用いて増幅を実施することができ、そして標識を検出するための方法及び装置を用いて、増幅されたプライマー伸長生成物を検出できる。
【００３７】
好ましい態様では、増幅された標的核酸が、検出のために標識され、かつ増幅された標的と直接的または間接的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド・プローブを用いて検出される。プローブは、可溶性であってもまたは固形支持体に付着していてもよい。別の好ましい態様では、標的核酸を増幅するのに用いられる１つ以上のプライマーが、例えば、特異的バインディング部分で標識される。標識されたプライマーが組み入れられている得られたプライマー伸長生成物は、プローブで捕捉することができる。プローブとハイブリッド形成した増幅された標的の検出は、当該技術分野で周知である適当な検出装置および方法を用いて、標識されたプローブもしくは標識され増幅された標的の存在を検出することにより達成できる。検出装置を使用することなく、所定の標識を目視可能にしてもよい。
【００３８】
より好ましい態様では、標的核酸を増幅するのに使用される１つ以上のプライマーをビオチンで標識し、そしてビオチニル化され増幅された標識核酸を、固形支持体に付着されたプローブに対してハイブリッド形成させる。次いで結合した標的を、酸化剤、例えば、過酸化水素および適当な色素生成性組成物の存在下ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体と接触させることにより、それらを検出する。例えば、有用な色素提供性試薬には、テトラメチルベンジジンおよびその誘導体、ならびにロイコ色素、例えば、米国特許第 4,089,747号明細書（Bruschi ）に記載されたようなトリアリールイミダゾールロイコ色素が含まれる。
【００３９】
本明細書中で用いられる語句「約」が時間に関する場合、その制限時間の±１０％を意味する。温度に関して用いられる場合、語句「約」は±５℃を意味する。
以下の実施例は、本発明の実施を具体的に示すために含めるものであって、いずれにしても限定することを意味するものではない。すべてのパーセンテージは、特に断らないかぎり重量パーセントである。
【実施例】
【００４０】
材料
サーマス・アクアティクス由来の組換えＤＮＡポリメラーゼは、既知方法、例えば、EP-A-0 482 714に記載されたものを用いて調製したものであり、約２５０，０００単位／タンパク質１mgの活性を有するものであった。
【００４１】
以下の実施例で用いたプライマーは、以下の配列を有するものであった。
５′−CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT −３′（配列番号：１）
５′−TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT −３′（配列番号：２）
捕捉プローブは以下の配列を有する。
５′−GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG−３′（配列番号：３）
以下の実施例で用いたプライマー及びプローブは、標準ホスホルアミダイト化学及びABI １μモル濃度スケール、第１サイクル・プロトコールを用いてApplied Biosystems Model 380B ，スリー・カラムＤＮＡ合成器（three column DNA synthesizer）を使用して、既知出発物質及び方法を用いて調製した。制御された孔質ガラス支持体（controlled pore glass supports）に導入されたヌクレオシド−３′−ホスホルアミダイト及びヌクレオシドは、Applied Biosystemsより入手した。プライマーは先に同定した配列を有するものであった。それらを、米国特許第 4,962,029号明細書に従って５′末端を２つのアミノテトラエチレングリコール・スペーサーで機能化し、続いて１つのDuPont市販のビオチンホスホルアミダイトで機能化した。プローブは、３′末端を２つのテトラエチレングリコール・スペーサーで機能化し、続いて米国特許第 4,914,210号明細書に従って１つのアミノジオール連結基で機能化した。核酸精製カラム、続いて逆相ＨＰＬＣ技法を用いて、すべての精製を実施した。デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ類）は、Sigma Chemical Co.より入手した。
【００４２】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液は、市販（Sigma Chemical Co.) のストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの接合体、カゼイン（ 0.5％）およびメルチオレート（ 0.5％）を燐酸緩衝溶液（２４ミリモル濃度の燐酸ナトリウムおよび７５ミリモル濃度の塩化ナトリウム）に含むものを用いた。１０ミリモル濃度の４′−ヒドロキシアセトアニリドを接合体安定剤として添加した。実施例１および２では、最終接合体濃度は１．１nMであった。実施例３では、最終接合体濃度は０．２８nMであった。
【００４３】
サイトメガロウイルス、菌株AD 169ＤＮＡは、Applied Biotechnology Inc.より受け取った。簡単には、従来の方法を用いてヒト包皮線維芽細胞セルラインからＤＮＡを抽出した。
ウイルス・ロット明細書
ウイルス：サイトメガロウイルス，菌株AD 169
増殖のセルライン：ヒト包皮線維芽細胞
ウイルス調製：ショ糖密度勾配精製，１０００×濃縮
ウイルス粒子カウント：１０００×で１．６５×１０10vp/mL
活性ウイルスにおけるＴＣＩＤ50力価：１０００×で１０7 ＴＣＩＤ50単位／mL
ＤＮＡ抽出明細書
容量：０．１mL
懸濁緩衝液：１０mMトリス／１mMＥＤＴＡ，pH８．０
抽出法：ＳＤＳ、プロテイナーゼＫ消化、続いてフェノール／クロロホルム抽出 そしてエタノール沈殿。１mLの抽出物を１mLの精製ウイルスから調製した。
輸送および保管：６×０．１mLを−７０℃で凍結して輸送した。−２０℃以下で保管した。
【００４４】
ロイコ色素分散体は、アガロース（０．５％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（２５０マイクロモル濃度）、ジエチレントリアミン五酢酸（１００マイクロモル濃度）、３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）、ポリビニルピロリドン（１１２ミリモル濃度）、および燐酸ナトリウム，一塩基性，一水和物（10ミリモル濃度）、ならびに過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）（８．８２ミリモル濃度）を含有するものであった。
【００４５】
洗浄溶液（pH７．４）は、塩化ナトリウム（３７３ミリモル濃度）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（２．５ミリモル濃度）、デシル硫酸ナトリウム（３８ミリモル濃度）およびエチルセリチオサリチル酸ナトリウム塩（２５マイクロモル濃度）を燐酸ナトリウム，一塩基性一水和物緩衝液（２５ミリモル濃度）に含有するものであった。
モノクローナル抗体を反応混合物に用いた。これらの抗体「ＴＰ１−１２．２」および「ＴＰ４−９．２」は、サーマス・アクアティクス由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、Sutherland他により1995年 2月 7日に出願され、「ポリメラーゼ連鎖反応における特異性を増強するための抗ポリメラーゼ抗体に対する捕捉剤としてのエキソヌクレアーゼおよび／またはグリコシラーゼの使用（Use of Exonuclease and/or Glycosylase as Supplements to Anti-Polymerase Antibody to Increase Specificity in Polymerase Chain Reaction)」と題する米国特許出願番号第 08/385,019 号明細書により詳細に記載されている。
【００４６】
ポリメラーゼ連鎖反応混合物（７５mL）には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（１０ミリモル濃度，pH８）、塩化カリウム（５０ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（４ミリモル濃度）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（各々０．３mM）、配列番号：１および配列番号：２のプライマー（各々０．４マイクロモル濃度）、ＩＶ型ゼラチン（１００mg/mL ）、Ｔａｑポリメラーゼ（１６単位／１００μL ）、およびグリセロール（９．５％）を含有するものであった。モル濃度が５０倍過剰な（ポリメラーゼを越える）ＴＰ１−１２．２および５×過剰なＴＰ４−９．２を用いた。
ＰＣＲ増幅は、米国特許第 5,089,233号明細書に記載の自動ＰＣＲ処理装置を用いて実施した。
【００４７】
捕捉試薬を形成するために、従来の乳化重合法を用いてポリ〔スチレン−コ−３（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（重量比９５：５，平均直径１μm ）から調製したポリマー粒子（平均直径１μm ）にプローブを共有結合させた。粒子の水への懸濁液を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１モル濃度，pH６）で洗浄し、そして約１０％固体になるように懸濁した。洗浄した粒子の試料（３．３mL）を、緩衝液（０．１モル濃度）中３．３３％固体になるように希釈し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド ヒドロクロリド（８４mg/mL の水溶液を２．１mL）およびプローブ（４４．４４OD/mL のナノピュア水で調製したものを９８３μL ）を混合した。得られた懸濁液を水浴中５０℃で約２時間時々混ぜながら加熱し、そして遠心分離した。次いで粒子を、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（０．００１モル濃度）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（０．０１モル濃度，pH８）で３回洗浄し、そして４％固体となるように再懸濁した。次いで粒子を、膠を加えて２％固体の状態で臨床診断用（Clinical Diagnostic's)ＰＣＲパウチの不連続なスポットに固定化した。ＰＣＲ生成物を、臨床診断用パウチ検出システムを用いて検出した。
別の試薬および材料は、商業的供給源から入手するか、または容易に入手可能な出発物質および従来の方法を用いて調製した。
【００４８】
検出感度を増強するための生成物検出前の増幅後インキュベーション段階
実施例１
本実施例は、ＰＣＲを用いて生成された核酸生成物を、増幅後インキュベーション段階を使用して、ポリメラーゼを変性することにより検出する本発明を具体的に示すものである。
陽性プールは、以下のＰＣＲプロトコールを４０〜４５サイクル用いてＣＭＶ標的を増幅することにより生成した。
１．９５℃で１５秒間加熱することによる変性、そして
２．７０℃で３０秒間プライミングおよび伸長するサイクル。
生成物濃度は、既知濃度のＤＮＡ鎖と共にゲル電気泳動することにより定量した。次いで、得られた増幅後ＰＣＲ反応混合物を下記のように用いた。
【００４９】
ＰＣＲ後反応混合物を生成することに加えて、前記ＰＣＲプロトコールを用いてＣＭＶ ＤＮＡ標的を添加していないＰＣＲ反応混合物でＰＣＲ増幅を実施することにより、ＣＭＶ陰性生成物プールを調製した。
増幅後ＰＣＲ反応混合物（１０-7〜１０-8M ）を、ＣＭＶ陰性生成物プールで１：１００〜１：５０００に希釈して最終ＣＭＶ ＤＮＡ濃度が１×１０-10 M 、２．５×１０-11 M 、または５×１０-11 M となるようにした。次いで希釈した増幅後ＰＣＲ反応混合物を、増幅後インキュベーションにかけてポリメラーゼを不活性化した。増幅後インキュベーション段階を２分間９７℃もしくは１００℃で、または５分間１００℃で実施した。
【００５０】
増幅後インキュベーションの後に、５８℃で５分間臨床診断用ＰＣＲパウチの内部で捕捉試薬を用いて標的核酸を捕捉することにより、増幅された生成物を検出した。次いで捕捉された生成物を、５５℃で１分間ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液と接触させてインキュベートした。洗浄溶液を用いて１分間５５℃で洗浄を実施し、その後色素提供性組成物を添加し、そして４分間４０℃でインキュベートした。得られた信号を線配列スキャナーで読み取った。スキャナーは反射率濃度（ΔＤｒ）の変化を測定した。ΔＤｒは、色素発色開始前の初期読み取り値と色素発色４分後の最終読み取り値との間の反射率濃度における差である。目視的に陰性な捕捉ビーズにおけるスキャナーのバックグラウンドは、０．０５〜０．１Ｄｒ単位の範囲であった。
【００５１】
以下の結果は、増幅後インキュベーション段階が検出感度を増強することを示している。
増幅後インキュベーション条件 生成物濃度 ＣＭＶ ΔＤｒ
（スキャナー）
９７℃で２分間 １×１０-10 M ０．１７５
９７℃で２分間 ５×１０-11 M ０．１４
９７℃で２分間 ２．５×１０-11 M ０．１１
１００℃で２分間 １×１０-10 M ０．２６５
１００℃で２分間 ５×１０-11 M ０．１９
１００℃で２分間 ２．５×１０-11 M ０．１３
１００℃で５分間 １×１０-10 M ０．４３５
１００℃で５分間 ５×１０-11 M ０．３１
１００℃で５分間 ２．５×１０-11 M ０．２１
【００５２】
これらの結果は、１００℃で５分間増幅後インキュベーション段階を行うと、バックグラウンドを越えて少なくとも４倍そして恐らく少なくとも５倍有効検出限界を増強することを示している。これらの結果に基づいて、特に、１００℃でのインキュベーション期間を２分間から５分間に増加することによる改良の結果に基づいて、第２実験は、増幅後インキュベーションを１００℃で１５分間実施した。
【００５３】
実施例２
この第２実験では、ＣＭＶ ＤＮＡの増幅を、実施例１に記載されたように実施した。実施例１に記載したように、得られた増幅後ＰＣＲ反応混合物を、ＣＭＶ陰性生成物プールで希釈し、増幅後インキュベーションにかけてポリメラーゼを不活性化した。増幅後インキュベーション段階を１５分間１００℃で実施した。増幅後インキュベーションの後に、実施例１に記載したように増幅された生成物を検出した。
以下の結果は、増幅後インキュベーション段階が検出感度を増強することを示している。
増幅後インキュベーション条件 生成物濃度 ＣＭＶ ΔＤｒ
（スキャナー）
９７℃で２分間 １×１０-10 M ０．１４０
９７℃で２分間 １×１０-10 M ０．１２２
１００℃で５分間 １×１０-10 M ０．３３６
１００℃で５分間 １×１０-10 M ０．３４６
１００℃で１５分間 １×１０-10 M ０．５０３
１００℃で１５分間 １×１０-10 M ０．４８０
これらの結果は、１００℃での増幅後インキュベーション時間を増加すると、更なる利益が得られることを示唆している。
【００５４】
実施例３
インキュベーション温度を増加することにより更なる検出感度向上が実現できるかどうか測定するために、ＣＭＶ ＤＮＡの増幅を、実施例１に記載されたように実施し、１００℃もしくは１０３℃で増幅後インキュベーションを行った。１０３℃で様々なインキュベーション時間について調査した。加えて、最終接合体濃度もしくは０．２８nM の低感度検出化学についてこの実験を実施した。この実験の結果は以下のとおりであった。
増幅後インキュベーション条件 生成物濃度 ＣＭＶ ΔＤｒ
（スキャナー）
１００℃で５分間 １×１０-10 M ０．１５２
１００℃で１５分間 １×１０-10 M ０．２７０
１０３℃で２分間 １×１０-10 M ０．２６４
１０３℃で５分間 １×１０-10 M ０．３１８
これらの結果は、少なくとも更に２倍増強そして恐らく３倍増強が、増幅後インキュベーション段階温度を１００℃から１０３℃に増加することにより、そして５分間インキュベーション期間を維持することにより達成されうることを具体的に示している。
【００５５】
以上本明細書中に言及したすべての刊行物は、これにより引用することによって組み入れられる。
前記本発明を、明瞭にし理解する目的で幾らか詳細に記載してきたが、様式および細部の様々な変化が本発明の真の範囲から逸脱することなく可能であることは、この開示の解釈から当業者らに認められるだろう。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
（１）一般情報
（ｉ）出願人：バッカス，ジョン ダブリュ．（Backus, John W. ）
クラマー，マルシア エル．（Kramer, Marcia L. ）
ファルボ，ジョセフ（Falvo, Joseph ）
（ｉｉ）発明の名称：標的核酸を増幅して検出するための方法
（ｉｉｉ）配列の数：３
（ｉｖ）通信用住所：
（Ａ）名宛人：ステーシア エル．オグデン（Stasia L. Ogden ）
（Ｂ）ストリート：ワン ジェイアンドジェイ プラザ（One J&J Plaza ）
（Ｃ）シティー：ニューブロンスウィック（New Brunswick ）
（Ｄ）ステート：ニュージャージー（New Jersey）
（Ｅ）国：ＵＳＡ
（Ｆ）ＺＩＰ：０８９３３
（ｖ）コンピューター読み取り可能なフォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ 互換性
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース（Patent In Release ）＃１．０，バージョン＃１．２５
（ｖｉ）最新の出願データ：
（Ａ）出願数：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）代理人／代理業者情報
（Ａ）氏名：オグデン，ステーシア エル．（Ogden, Stasia L.）
（Ｂ）登録番号：３６，２２８
（Ｃ）参照／ドケット番号：ＣＤＳ−９２
（ｉｘ）遠距離通信情報：
（Ａ）電話：９０８−５２４−２８１９
（Ｂ）テレファックス：９０８−５２４−２８０８
【００５７】
配列番号：１
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（genomic ）
配列
CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT 25
【００５８】
配列番号：２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（genomic ）
配列
TGCACTGCCA GGTGCTTCGG CTCAT 25
【００５９】
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（genomic ）
配列
GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG 30
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸の増幅および検出方法に関する。詳細には、増幅された核酸生成物を検出する改良方法に関する。本発明は、種々の医学的および学術的研究、法医学的調査、ならびに診断方法、例えば、遺伝子障害もしくは感染症の検出に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にプローブを用いる非常に精巧なハイブリッド形成アッセイの発展を包含する、微量の核酸を検出するための技術は、この２０年間で急速に進歩した。研究者らは、ヒトおよび動物の試験被検体中の疾患および遺伝的特徴を検出するためのそのような技術の価値を直ちに認めてきた。核酸の増幅および検出にプライマーおよびプローブを使用することは、相補性の概念、すなわち、相補的ヌクレオチド（ヌクレオチド対としても既知である）間の水素結合による二本鎖の核酸の結合に基づいている。
少量のＤＮＡを増幅し検出する方法を見いだすために、多くの研究が行われてきた。種々の方法が既知であり、それらは、検出するために被検体中の核酸の数を増幅するかまたは著しく増大するのに使用されてきた。そのような増幅技術には、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および分枝ＤＮＡが含まれる。
【０００３】
ＰＣＲは、これらのうち最もよく知られている増幅方法である。ＰＣＲについての詳細は、例えば、米国特許第 4,638,195号明細書（Mullis他）、米国特許第 4,683,202号明細書（Mullis）および米国特許第 4,965,188号明細書（Mullis他）を包含する従来技術文献によく記載されている。あまり詳しくはないが、ＰＣＲでは、重合剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸が存在しており、適当な条件下で、ハイブリッド形成プライマーを標的核酸の鎖に巻き込む。その結果、鋳型に相補的であるヌクレオチドを加えたプライマー伸長生成物が、鋳型に沿って生成する。
【０００４】
一度、プライマー伸長生成物を変性し、そして鋳型のコピーを１つ作り、標的核酸と同じ配列を有する核酸の量を指数関数的に増加させるのに望まれる回数だけ、プライミング、伸長および変性のサイクルを実施できる。実際には、標的核酸は、それがより容易に検出されるように何回も複製（または増幅）される。一度、標的核酸が十分に増幅されると、種々の検出方法を用いて、標的の存在を定性的および／または定量的に検出することができる。
一度、標的核酸が十分に増幅されると、種々の検出方法を用いて、その存在を検出することができる。ＰＣＲ生成物を検出するのに使用される標準検出方法には、臭化エチジウム染色アガロースゲルが用いられる。しかしながら、臭化エチジウム染色ゲルの使用は、例えば、比較的乏しい感度および特異性を包含する幾つかの欠点を有する。
【０００５】
放射性標識および電気泳動の使用を排除する、改良されたＰＣＲ生成物の検出方法が開発された。これらの非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出方法は、プローブに対する特異的ハイブリッド形成および酵素的信号発生による。そのような非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出方法（逆ドット・ブロット検出としても既知である）は、米国特許第 5,229,297号明細書（Schnepilsky 他）、同第 5,328,825号明細書（Warren他）および同第 5,422,271号明細書（Chen他）に記載されている。また、そのような方法は、Findlay 他，Clinical Chemistry, 39:1927-1933 (1993) に記載されている。
【０００６】
これらの非同位体検出方法は、臭化エチジウム染色検出よりも高い感度および特異性を有し、そして放射能の使用を回避する。これらの方法は、ビオチニル化プライマー（複数）で増幅を行ってまたはビオチニル化プローブを用いて操作することで、増幅された核酸を検出する。ビオチニル化生成物もしくはプローブは、次いでアビジンもしくはストレプトアビジン接合酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と反応する。次いで色素前駆体（もしくは発光性信号試薬）を酵素と接触状態にして色素（ルミネセンス）に変換し、それにより検出可能な信号を発生させることができる。
【０００７】
しかしながら、非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出方法は、それら自身に欠点を持たない訳ではない。非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出が標準ＰＣＲ変性条件（９５℃）を利用して実施され、濃縮されたかまたは最低限に希釈された増幅された核酸生成物を変性する場合、増幅反応を行うために利用される酵素、例えば、熱安定性ポリメラーゼもしくはＤＮＡリガーゼは、まだなお存在しかつ活性であるだろう。検出の最中におけるそのような活性酵素の存在は、酵素とプローブとの間で増幅生成物に対する結合の競合を引き起こす。そのような競合は、プローブに結合する増幅された核酸生成物の量を低減し、そのために検出信号を低減しうる。
【０００８】
この問題に対する１つの解決方法は、高レベルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｍｇ++のキレート化剤を、増幅を行った後であるが検出する前に、ＰＣＲ増幅混合物に添加することである。ＥＤＴＡは、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを包含する、活性にＭｇ++を必要とする多数の酵素を阻害することができる。しかしながら、ＥＤＴＡの使用は、ＰＣＲ増幅および検出方法に追加段階を加えることになる。加えて、ＥＤＴＡを使用すると、ＥＤＴＡを添加するために反応容器を開ける必要がある。当業者らが承知のように、反応容器を開けることは、汚染を懸念して避けるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、ＥＤＴＡもしくは別のそのような酵素阻害剤の添加により検出中の増幅プロセスを妨害することは望ましくない。それよりは、汚染の危険性を増大することなく、検出する前に増幅酵素を不活性化する方法が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
検出する前に増幅後インキュベーション段階を用いて増幅酵素を不活性化することにより、前記課題を解決することが本発明の目的である。
ある態様では、本発明は、
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、前記標的核酸の一部分に実質的に相補的である少なくとも２種のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性増幅酵素と、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する工程、
（ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記熱安定性増幅酵素を不活性化する工程、並びに
（ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法に関する。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および前記標的核酸に実質的に相補的である少なくとも２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する工程、
（ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記重合剤を不活性化する工程、並びに
（ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも一方がビオチンで標識されており且ついずれも前記標的核酸に実質的に相補的である少なくとも２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅後インキュベーション段階として、前記試料を０．５分間〜５分間、約１０５℃でインキュベートして、前記ポリメラーゼを不活性化する工程、並びに
（ｉｉｉ）前記ビオチニル化され増幅された標的核酸を、ストレプトアビジン酵素接合体と反応させ、続いて前記酵素を基質試薬と反応させて、検出可能な比色または化学ルミネセンス信号を生成することにより、前記ビオチニル化され増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法に関する。
本発明の様々な別の目的および利点が、以下の発明の説明から明らかであるだろう。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸の増幅および検出のための一般的な原理および条件は周知であり、その詳細は、米国特許第 4,683,195号明細書（Mullis他）、米国特許第 4,683,202号明細書（Mullis）および米国特許第 4,965,188号明細書（Mullis他）を包含する多数の文献に提供されている。これらはすべて引用することにより本明細書中に組み入れられる。従って、従来技術文献における教示および本明細書中に提供される特別な教示を考えると、当業者にとって、本明細書で教示したように、生成物検出の前に増幅後インキュベーション工程を加えて増幅酵素を不活性化することにより検出感度を増大する本発明の実施に際して困難はないはずである。
【００１４】
熱安定性酵素を使用する別の増幅および検出方法を、本発明の実施に際して使用することもできる。本発明は、増幅中に使用される熱安定性酵素（複数）を不活性化する、増幅後，検出前のインキュベーション工程を提供する。従って、本発明は、熱安定性酵素を使用する任意の増幅方法と共に使用するのに適する。別の熱安定性増幅方法には、例えば、欧州特許第 0 320 308号明細書（1987年12月発行）および欧州特許第 0 439 182号明細書（1990年 1月発行）に記載された、熱安定性ＤＮＡリガーゼを用いて隣接したプローブを結合させそれによって相補的核酸配列を生成する、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が含まれる。ＬＣＲでは、標的核酸を、４種のオリゴヌクレオチド・プローブおよび熱安定性ＤＮＡリガーゼを用いて増幅する。オリゴヌクレオチド・プローブのうち２種が、増幅しようとするＤＮＡ鋳型の一本鎖上の隣接した部位に相補的である。これらのプローブは、２つのプローブ間にニックが形成されるように、そのＤＮＡ鎖とハイブリッド形成する。次いでニックを、熱安定性ＤＮＡリガーゼにより封じ、それによって標的に相補的な新しいＤＮＡ鎖を生成する。第３および第４のプローブは、ＤＮＡ鋳型の第２の鎖に相補的であり、最初のプローブ対のように機能して相補的ＤＮＡを生成する。ＬＣＲの増幅された生成物は、標準検出方法を用いて検出できる。本発明の増幅後，検出前インキュベーション段階をＬＣＲに用いると、検出する前にＤＮＡリガーゼを不活性化できる。従って、本明細書に提供した教示により、当業者は、ＰＣＲで認められた増幅後酵素変性段階をこれらの別の既知増幅および検出方法に適応させることが可能だろう。この開示の残りは、説明の都合上ＰＣＲを用いる本発明の実施に向けられている。
【００１５】
本発明は、検出感度を改良するために既知ＰＣＲ方法を改良するものである。驚くべきことに、本発明によると、増幅後，検出前インキュベーション工程を採用することにより、重合剤を不活性化し、プローブと重合剤との間における増幅された標的核酸に対する結合の競合を低減できることがわかった。この競合の低減により、検出感度が高められる。
本発明は、試験被検体中に存在する１種以上の標的核酸の増幅および検出に向けられている。試験被検体には、細胞性もしくはウイルス性物質、体液または検出できる遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する別の細胞性物質が含まれうる。
【００１６】
増幅し検出しようとする核酸は、プラスミド類並びにいずれかの供給源（例えば、細菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物、もしくはヒト）由来の天然産ＤＮＡもしくはＲＮＡを包含する種々供給源より得ることができる。それは、限定されるものではないが、既知方法を用いて、血液、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、組織材料もしくは当該技術分野で既知である別の供給源を包含する様々な組織から抽出してもよい。本発明は、ゲノム（genomic ）ＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは細菌もしくはウイルス感染細胞中に見いだされるＤＮＡもしくはＲＮＡ中に見いだされる１つ以上の核酸配列の増幅及び検出に特に有用である。
【００１７】
本明細書に記載された方法を用いて、感染症、遺伝子障害および細胞障害、例えば、癌に関連する標的核酸を増幅し検出することができる。また、それを法医学的調査およびＤＮＡタイピングに使用してもよい。感染性病原体、例えば、細菌およびウイルスに関連した核酸の検出による、それらの検出に特に有用である。非常に高い感度および／または定量性が必要とされるとき、それは特に有用である。
【００１８】
本発明により検出できる細菌には、限定されるものではないが、ヒトの血液中に見いだされる細菌、例えば、サルモネラ種（Salmonella species）、ストレプトコッカス種（Streptococcus species ）、クラミジア種（Chlamydia species ）、ゴノコッカル種（Gonococcal species）、マイコバクテリア種（Mycobacteria species）（例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）およびトリ型結核菌複合体（Mycobacterium avium complex ）、マイコプラズマ種（Mycoplasma species）（例えば、マイコプラズマ・ヘモフィルス・インフルエンザ（Mycoplasma Hemophilus influenzae）およびマイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae ，肺炎マイコプラズマ））、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、ボレリア・ブルグドルフェライ（Borrelia burgdorferei ）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile ）、カンピロバクテリア種（Camplyobacteri species）、エルシニア種（Yersinia species）、シゲラ種（Shigella species）ならびにリステリア種（Listeria species）が含まれる。検出可能であるウイルスには、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus ）、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus）、ＥＢウイルス（Epstein Barr virus）、ヒトパピローマウイルス（human papilloma virus ）、インフルエンザウイルス（influenza viruses ）、肝炎ウイルス（hepatitis virus ）ならびにレトロウイルス（例えば、HTLV-I、HTLV-II 、HIV-I およびHIV-II）が含まれる。原生動物寄生体、酵母およびかびも、本発明により検出可能である。別の検出可能な種は、当業者に容易に明らかであるだろう。
【００１９】
「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに必須であるとみなされる試薬のいずれか、すなわち、各標的核酸につき一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターおよび１つ以上のデオキシリボヌクレオシド−５′−三燐酸（ｄＮＴＰ類）を称する。ＰＣＲに使用される別の任意の試薬および材料を以下に記載する。
「プライマー」の語は、核酸鎖（すなわち、鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置かれた場合に合成の開始点として作用できる、天然産又は合成的に生成されたオリゴヌクレオチドを称する。そのような条件には、別のＰＣＲ試薬の存在ならびに適当な温度およびpHが含まれる。
【００２０】
本発明のプライマーは、プライムおよび増幅しようとする特異的核酸配列に対して「実質的に相補的」であるように選択される。これは、それらが、それぞれの核酸配列とハイブリッド形成するのに十分に相補的であり、所望のハイブリッド形成生成物を形成し、次いでＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能でなければならないことを意味する。典型的には、「実質的に相補的」なプライマーは、標的配列に相補的である塩基を少なくとも７０％以上含有するだろう。より好ましくは８０％の塩基が相補的であり、さらにより好ましくは９０％の塩基が相補的である。最も好ましい状態では、プライマーが標的核酸配列に対して９０％〜１００％の正確な相補性を有する。
【００２１】
プライマーは、増幅で最大効率を発揮させるために好ましくは一本鎖であるが、所望であれば二本鎖領域を含有することができる。それは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。各プライマーの正確なサイズは、予測される用途、プライマーの濃度および配列、標的とされる配列の複雑さ、反応温度、ならびにプライマーの供給源に応じて変化するだろう。一般的には、本発明に使用されるプライマーは、１２〜６０個のヌクレオチドを有し、そして好ましくはそれらが１６〜４０個のヌクレオチドを有する。より好ましくは、各プライマーが１８〜３５個のヌクレオチドを有する。
【００２２】
本明細書中の有用なプライマーは、例えば、ABI ＤＮＡ合成機（Applied Biosystemsより入手可能）またはバイオサーチ8600シリーズもしくは8800シリーズ合成機（Biosearch 8600 Series もしくは8800 Series Synthesizer ）（Milligen-Biosearch, Inc.より入手可能）を包含する、既知技法および装置を用いて調製できる。この装置の使用方法は周知であり、例えば、米国特許第 4,965,188号明細書（Gelfand 他）に記載されている。それは、引用することにより本明細書中に組み入れられる。また、生物学的供給源から単離された天然プライマーが有用である（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）。通常、一組の少なくとも２つのプライマーが各標的核酸に使用される。従って、複数の組のプライマーを用いて、複数の標的核酸を同時に増幅することができる。
【００２３】
本明細書中で用いられる「プローブ」とは、標的核酸の核酸配列に実質的に相補的であり、かつ増幅された標的核酸の検出または捕捉に用いられるオリゴヌクレオチドである。
本発明に用いられるプライマーおよび／またはプローブは、任意に標識することができる。当該技術分野で既知である方法を用いて、プライマーおよび／またはプローブを、特異的バインディング・リガンド（例えば、ビオチン）、酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼ）、放射性同位体、高電子密度試薬、色原体、発蛍光団、リン光体部分、またはフェリチンで標識できる。好ましくは、標識が特異的バインディング・リガンドである。より好ましくは、標識がビオチンもしくはその誘導体、ストレプトアビジンもしくはその誘導体、またはハプテンである。
【００２４】
ＰＣＲに必要な更なるＰＣＲ試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターおよび適当なｄＮＴＰ類が含まれる。これらの試薬は、試験キットの一部として、または試験装置の試薬室に別個に提供できる。
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型との複合体中のプライマーの３′−ヒドロキシ末端にデオキシリボクレオシド一燐酸分子を加える酵素であるが、しかしこの添加は、鋳型依存方式である。一般的には、伸長生成物の合成は、合成が終わるまで新たに合成される鎖の５′から３′方向に進行する。有用なＤＮＡポリメラーゼには、例えば、大腸菌（E. coli ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー（Klenow）ポリメラーゼ、逆転写酵素、および当該技術分野で既知の別のものが含まれる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼが、熱に安定であり、より高い温度、特にＤＮＡ鎖のプライミングおよび伸長に用いられる高温で優先的に活性であることを意味する、熱安定性である。より詳細には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されるポリメラーゼ連鎖反応に用いられる高温で実質的に不活性化されない。そのような温度は、pH、ヌクレオチド組成、プライマーの長さ、塩濃度および当該技術分野で既知の別の条件を包含する多数の反応条件により変化するだろう。
【００２５】
数多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが従来技術文献に報告されており、それらには米国特許第 4,965,188号明細書（Gelfand 他）および米国特許第 4,889,818号明細書（Gelfand 他）に詳細に記載されているものが包含される。両方とも引用することにより本明細書に組み入れられる。特に有用なポリメラーゼは、種々のサーマス細菌種、例えば、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）もしくはサーマス・フラバス（Thermus flavus）より得られるものである。別の有用な熱安定性ポリメラーゼが、サーモコッカス・リテラリス（Thermococcus literalis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）、サーモトガ種（Thermotoga sp.）およびWO-A-89/06691 （1989年 7月27日発行）に記載のものを包含する種々の微生物源より得られる。幾つかの有用な熱安定性ポリメラーゼが市販されている、例えば、アプリタック（AppliTaq）（商標）、ティース（Tth ）、およびウルトマ（UlTma ）（商標）がPerkin Elmerから、フー（Pfu ）がStratageneから、そしてベント（Vent）およびディープベント（DeepVent）がNew England Biolabs から市販されている。また、天然のポリメラーゼを生物体から単離して、組換え技法を用いて遺伝子工学酵素を生成するための数多くの技法が既知である。
【００２６】
ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターは、活性について酵素が依存する非タンパク質化合物を称する。従って、酵素はコファクターが存在しないと触媒的に不活性である。限定されるものではないが、マンガン塩およびマグネシウム塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩を包含する数多くのそのような物質が既知コファクターである。マグネシウムの塩化物および硫酸塩が好ましい。
また、２種以上のデオキシリボヌクレオシド−５′−三燐酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰがＰＣＲに必要とされる。類似体、例えば、ｄＩＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰも有用である。好ましくは、４種の普通の三燐酸塩（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）が一緒に使用される。
【００２７】
本明細書中に記載されるＰＣＲ試薬は、標的核酸を増幅させるのに適する濃度でＰＣＲに用いられる。増幅に必要とされるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、コファクターおよびデオキシリボヌクレオシド−５′−三燐酸の最低量、ならびに各々の適当な範囲は、当該技術分野で周知である。一般的にはＤＮＡポリメラーゼの最低量は少なくとも約０．５単位／１００μＬの溶液であるが、約２〜約２５単位／１００μＬの溶液が好ましく、約７〜約２０単位／１００μＬの溶液がより好ましい。所定の増幅系には別の量が有用であるかもしれない。「単位」は、３０分間に７４℃で総ヌクレオチド（ｄＮＴＰ類）１０ナノモルを伸長核酸鎖に組み入れるのに必要とされる酵素活性の量として本明細書で定義される。プライマーの最低量は、少なくとも約０．０７５マイクロモル濃度であり、約０．１〜約２マイクロモル濃度が好ましいが、別の量が当該技術分野で周知である。一般的には、コファクターは約２〜約１５ミリモル濃度の量で存在する。各ｄＮＴＰの量は、一般的には約０．２５〜約３．５ミリモル濃度である。
【００２８】
ＰＣＲ試薬は、個別に供給することもできるし、または種々の組合せで供給することもできるし、あるいはすべて任意の適当な緩衝剤を用いて約７〜約９の範囲のpHを有する緩衝液に含めて供給することもでき、そのようなことの多くが当該技術分野で既知である。
ＰＣＲに使用できる別の試薬には、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体、エキソヌクレアーゼおよび／またはグリコシラーゼが含まれる。抗体を使用して、増幅の前にポリメラーゼを阻害できる。本発明に有用な抗体は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を約５０℃より下の温度で阻害し、そしてより高い温度で非活性化される。有用な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体断片が含まれる。好ましくは、抗体がモノクローナルである。本発明に有用な抗体は、既知方法、例えば、Harlow他，抗体：実験マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor, NY (1988) に記載のものを用いて調製できる。
【００２９】
代表的なモノクローナル抗体は、米国特許第 5,338,671号明細書（Scalice 他）に記載されており、その内容は引用することにより本明細書に組み入れられる。２つのそのようなモノクローナル抗体が、従来の方法、およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Rockville, MD ）に寄託されているハイブリドーマ・セルラインHB 11126もしくは11127 のいずれかを包含する出発物質を用いて当業者により容易に得られる。モノクローナル抗体は、ＤＮＡポリメラーゼに対するモル比約５：１〜約５００：１の量で存在する。
【００３０】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体は、単独で、またはSutherland他により1995年 2月 7日に出願された、「ポリメラーゼ連鎖反応における特異性を増強するための、抗ポリメラーゼ抗体に対する捕捉剤としてのエキソヌクレアーゼおよび／またはグルコシラーゼの使用（Use of Exonuclease and/or Glycosylase as Supplements to Anti-Polymerase Antibody to Increase Specificity in Polymerase Chain Reaction)」と題する米国特許出願番号第 08/385,019 号明細書に記載されているように、エキソヌクレアーゼおよび／またはグリコシラーゼと組み合わせて本発明に使用することができる。抗体、エキソヌクレアーゼおよびグリコシラーゼを組み合わせて使用すると、ゼロ・サイクル・アーチファクトの生成を低減する。ＰＣＲにおける使用に適するエキソヌクレアーゼには、限定されるものではないが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＩＩ、ポリヌクレオチド・ホスホリラーゼおよびＢＡＬ ３１ヌクレアーゼが含まれる。そのようなエキソヌクレアーゼは、市販されているか、または当該技術分野で既知の方法により得ることができる。本発明に有用なグリコシラーゼは、通常のものとは異なる塩基、すなわち、ＤＮＡ中のＡ、Ｇ、ＣもしくはＴならびにＲＮＡ中のＡ、Ｇ、ＣおよびＵ以外の塩基を特異的に切断するものである。好ましいグリコシラーゼには、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼおよび３−メチアデニン−ＤＮＡグリコシラーゼＩおよびＩＩが含まれる。好ましい態様では、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼに対するモノクローナル抗体、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼが使用される。
【００３１】
標的核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか）は、任意の様々な前記供給源から得ることができる。一般的には、試料を何らかの方法で処理して、ＤＮＡをプライマーおよび別のＰＣＲ試薬と接触可能にする。これは、通常、当該技術分野で既知である種々方法の１つを用いて試料から望ましくないタンパク質および細胞性物質を除去することを意味する。
増幅し検出しようとする核酸はしばしば二本鎖型であるので、プライミングおよび増幅を行う前に二本鎖を分離（すなわち、変性）しなければならない。変性は、熱処理のみ単独で用いて、または従来技術文献に記載されるように鎖を分離するための任意の別の適当な物理的、化学的もしくは酵素的手段と組み合わせて用いて達成できる。初期変性は、一般的には標的核酸を含有することが疑われる試料を、約８５°〜約１００℃の第１温度で適当な時間、例えば、約１秒間〜３分間加熱することにより実施される。
【００３２】
次いで変性した鎖を、一般的には、鎖をプライミングするために約５５°〜約７０℃の範囲内である温度に冷却する。初期変性の後に鎖を冷却するのに要する時間は、ＰＣＲ方法に使用される機器の型により変化するだろう。
一旦、変性した鎖を第２温度に冷却し、ＰＣＲ試薬を含有する反応混合物と共に変性した鎖を、鎖に対するプライマーのアニーリング（ハイブリッド形成）およびプライマーの伸長を行ってプライマー伸長生成物を形成するのに適する温度でインキュベートする。一般的には、この温度は、少なくとも約５０℃であり、好ましくは約６２°〜約７５℃の範囲である。インキュベーション時間は、インキュベーション温度および所望の伸長生成物の長さにより広範に変化できるが、好ましい態様では、約１〜約１２０秒間である。ＰＣＲの各サイクルは、２つまたは３つの異なる温度、１つは変性用、そして第２または第３の温度はプライミングおよび／またはプライマー伸長生成物形成用の温度のいずれかを用いて実施できる。
【００３３】
少なくとも１つのプライマー伸長生成物の生成後の任意の時点で、増幅を停止し標的プライマー伸長生成物（前記「増幅された標的」）を検出することができる。しかしながら、次いでハイブリッド形成されたプライマー伸長生成物を変性する場合、プライミング、伸長および変性のサイクルを更に所望の回数、ＰＣＲを実施できる。実施されるＰＣＲサイクルの回数は、幾分、増幅された所望の標的の量によるであろうし、当業者らにより容易に決定されうる。一般的には、少なくとも２０回実施され、２０〜５０回が好ましい。
【００３４】
複数の標的核酸を増幅するとき、特に標的の一方がより低いコピー数の標的でありかつ一方が高いコピー数の標的である場合、Backus他により1994年 6月 6日に出願され、「中間復元段階を用いる増幅方法（Method of Amplification Using Intermediate Renaturation Step）」と題する米国特許出願番号第08/264,102号明細書に記載されたように、第２の復元段階を第１ＰＣＲサイクルを実施した後に使用することができる。少なくとも１５回の第１増幅サイクルの後（第１増幅サイクルは変性、プライミングおよび伸長を含む）、各変性段階後かつプライマー・アニーリング前に復元段階が含まれていることを除いて同じ段階を有する第２増幅サイクルを実施する。復元は、米国特許出願番号第08/264,102号明細書に記載されたように、反応混合物を第４温度に冷却することにより達成される。
【００３５】
本発明では、所望の回数ＰＣＲサイクルを用いて標的核酸を増幅した後、増幅後，検出前インキュベーション段階を行ってＤＮＡポリメラーゼを不活性化し、それにより検出感度を増大する。増幅後インキュベーション段階を実施する際の条件は、使用される熱安定性酵素に依存するが、温度およびインキュベーション期間を組み合わせて酵素を不活性化するようなものであるだろう。好ましくは、この増幅後インキュベーション段階が、増幅された標的を含有するＰＣＲ増幅混合物を約９５℃〜約１２０℃の温度で約１秒間〜約３０分間インキュベートすることにより実施される。好ましくは、増幅後インキュベーション段階が、１００℃〜１１０℃の温度で１５秒間〜１０分間、より好ましくは約１０５℃の温度で５分間以下加熱することを含む。
【００３６】
一度、増幅後インキュベーションを行うと、増幅された核酸標的を検出できる。検出は、数多くの既知方法、例えば、米国特許第 4,965,188号明細書（Gelfand 他）に記載されたもので達成できる。例えば、増幅された核酸を、サザン・ブロッティング、ドット・ブロット法または標識されたプローブを用いて非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出を用いて検出できる。あるいは、適当に標識されたプライマーを用いて増幅を実施することができ、そして標識を検出するための方法及び装置を用いて、増幅されたプライマー伸長生成物を検出できる。
【００３７】
好ましい態様では、増幅された標的核酸が、検出のために標識され、かつ増幅された標的と直接的または間接的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチド・プローブを用いて検出される。プローブは、可溶性であってもまたは固形支持体に付着していてもよい。別の好ましい態様では、標的核酸を増幅するのに用いられる１つ以上のプライマーが、例えば、特異的バインディング部分で標識される。標識されたプライマーが組み入れられている得られたプライマー伸長生成物は、プローブで捕捉することができる。プローブとハイブリッド形成した増幅された標的の検出は、当該技術分野で周知である適当な検出装置および方法を用いて、標識されたプローブもしくは標識され増幅された標的の存在を検出することにより達成できる。検出装置を使用することなく、所定の標識を目視可能にしてもよい。
【００３８】
より好ましい態様では、標的核酸を増幅するのに使用される１つ以上のプライマーをビオチンで標識し、そしてビオチニル化され増幅された標識核酸を、固形支持体に付着されたプローブに対してハイブリッド形成させる。次いで結合した標的を、酸化剤、例えば、過酸化水素および適当な色素生成性組成物の存在下ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体と接触させることにより、それらを検出する。例えば、有用な色素提供性試薬には、テトラメチルベンジジンおよびその誘導体、ならびにロイコ色素、例えば、米国特許第 4,089,747号明細書（Bruschi ）に記載されたようなトリアリールイミダゾールロイコ色素が含まれる。
【００３９】
本明細書中で用いられる語句「約」が時間に関する場合、その制限時間の±１０％を意味する。温度に関して用いられる場合、語句「約」は±５℃を意味する。
以下の実施例は、本発明の実施を具体的に示すために含めるものであって、いずれにしても限定することを意味するものではない。すべてのパーセンテージは、特に断らないかぎり重量パーセントである。
【実施例】
【００４０】
材料
サーマス・アクアティクス由来の組換えＤＮＡポリメラーゼは、既知方法、例えば、EP-A-0 482 714に記載されたものを用いて調製したものであり、約２５０，０００単位／タンパク質１mgの活性を有するものであった。
【００４１】
以下の実施例で用いたプライマーは、以下の配列を有するものであった。
５′−CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT −３′（配列番号：１）
５′−TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT −３′（配列番号：２）
捕捉プローブは以下の配列を有する。
５′−GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG−３′（配列番号：３）
以下の実施例で用いたプライマー及びプローブは、標準ホスホルアミダイト化学及びABI １μモル濃度スケール、第１サイクル・プロトコールを用いてApplied Biosystems Model 380B ，スリー・カラムＤＮＡ合成器（three column DNA synthesizer）を使用して、既知出発物質及び方法を用いて調製した。制御された孔質ガラス支持体（controlled pore glass supports）に導入されたヌクレオシド−３′−ホスホルアミダイト及びヌクレオシドは、Applied Biosystemsより入手した。プライマーは先に同定した配列を有するものであった。それらを、米国特許第 4,962,029号明細書に従って５′末端を２つのアミノテトラエチレングリコール・スペーサーで機能化し、続いて１つのDuPont市販のビオチンホスホルアミダイトで機能化した。プローブは、３′末端を２つのテトラエチレングリコール・スペーサーで機能化し、続いて米国特許第 4,914,210号明細書に従って１つのアミノジオール連結基で機能化した。核酸精製カラム、続いて逆相ＨＰＬＣ技法を用いて、すべての精製を実施した。デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ類）は、Sigma Chemical Co.より入手した。
【００４２】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液は、市販（Sigma Chemical Co.) のストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの接合体、カゼイン（ 0.5％）およびメルチオレート（ 0.5％）を燐酸緩衝溶液（２４ミリモル濃度の燐酸ナトリウムおよび７５ミリモル濃度の塩化ナトリウム）に含むものを用いた。１０ミリモル濃度の４′−ヒドロキシアセトアニリドを接合体安定剤として添加した。実施例１および２では、最終接合体濃度は１．１nMであった。実施例３では、最終接合体濃度は０．２８nMであった。
【００４３】
サイトメガロウイルス、菌株AD 169ＤＮＡは、Applied Biotechnology Inc.より受け取った。簡単には、従来の方法を用いてヒト包皮線維芽細胞セルラインからＤＮＡを抽出した。
ウイルス・ロット明細書
ウイルス：サイトメガロウイルス，菌株AD 169
増殖のセルライン：ヒト包皮線維芽細胞
ウイルス調製：ショ糖密度勾配精製，１０００×濃縮
ウイルス粒子カウント：１０００×で１．６５×１０10vp/mL
活性ウイルスにおけるＴＣＩＤ50力価：１０００×で１０7 ＴＣＩＤ50単位／mL
ＤＮＡ抽出明細書
容量：０．１mL
懸濁緩衝液：１０mMトリス／１mMＥＤＴＡ，pH８．０
抽出法：ＳＤＳ、プロテイナーゼＫ消化、続いてフェノール／クロロホルム抽出 そしてエタノール沈殿。１mLの抽出物を１mLの精製ウイルスから調製した。
輸送および保管：６×０．１mLを−７０℃で凍結して輸送した。−２０℃以下で保管した。
【００４４】
ロイコ色素分散体は、アガロース（０．５％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（２５０マイクロモル濃度）、ジエチレントリアミン五酢酸（１００マイクロモル濃度）、３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）、ポリビニルピロリドン（１１２ミリモル濃度）、および燐酸ナトリウム，一塩基性，一水和物（10ミリモル濃度）、ならびに過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）（８．８２ミリモル濃度）を含有するものであった。
【００４５】
洗浄溶液（pH７．４）は、塩化ナトリウム（３７３ミリモル濃度）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（２．５ミリモル濃度）、デシル硫酸ナトリウム（３８ミリモル濃度）およびエチルセリチオサリチル酸ナトリウム塩（２５マイクロモル濃度）を燐酸ナトリウム，一塩基性一水和物緩衝液（２５ミリモル濃度）に含有するものであった。
モノクローナル抗体を反応混合物に用いた。これらの抗体「ＴＰ１−１２．２」および「ＴＰ４−９．２」は、サーマス・アクアティクス由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、Sutherland他により1995年 2月 7日に出願され、「ポリメラーゼ連鎖反応における特異性を増強するための抗ポリメラーゼ抗体に対する捕捉剤としてのエキソヌクレアーゼおよび／またはグリコシラーゼの使用（Use of Exonuclease and/or Glycosylase as Supplements to Anti-Polymerase Antibody to Increase Specificity in Polymerase Chain Reaction)」と題する米国特許出願番号第 08/385,019 号明細書により詳細に記載されている。
【００４６】
ポリメラーゼ連鎖反応混合物（７５mL）には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（１０ミリモル濃度，pH８）、塩化カリウム（５０ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（４ミリモル濃度）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（各々０．３mM）、配列番号：１および配列番号：２のプライマー（各々０．４マイクロモル濃度）、ＩＶ型ゼラチン（１００mg/mL ）、Ｔａｑポリメラーゼ（１６単位／１００μL ）、およびグリセロール（９．５％）を含有するものであった。モル濃度が５０倍過剰な（ポリメラーゼを越える）ＴＰ１−１２．２および５×過剰なＴＰ４−９．２を用いた。
ＰＣＲ増幅は、米国特許第 5,089,233号明細書に記載の自動ＰＣＲ処理装置を用いて実施した。
【００４７】
捕捉試薬を形成するために、従来の乳化重合法を用いてポリ〔スチレン−コ−３（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（重量比９５：５，平均直径１μm ）から調製したポリマー粒子（平均直径１μm ）にプローブを共有結合させた。粒子の水への懸濁液を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１モル濃度，pH６）で洗浄し、そして約１０％固体になるように懸濁した。洗浄した粒子の試料（３．３mL）を、緩衝液（０．１モル濃度）中３．３３％固体になるように希釈し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド ヒドロクロリド（８４mg/mL の水溶液を２．１mL）およびプローブ（４４．４４OD/mL のナノピュア水で調製したものを９８３μL ）を混合した。得られた懸濁液を水浴中５０℃で約２時間時々混ぜながら加熱し、そして遠心分離した。次いで粒子を、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（０．００１モル濃度）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（０．０１モル濃度，pH８）で３回洗浄し、そして４％固体となるように再懸濁した。次いで粒子を、膠を加えて２％固体の状態で臨床診断用（Clinical Diagnostic's)ＰＣＲパウチの不連続なスポットに固定化した。ＰＣＲ生成物を、臨床診断用パウチ検出システムを用いて検出した。
別の試薬および材料は、商業的供給源から入手するか、または容易に入手可能な出発物質および従来の方法を用いて調製した。
【００４８】
検出感度を増強するための生成物検出前の増幅後インキュベーション段階
実施例１
本実施例は、ＰＣＲを用いて生成された核酸生成物を、増幅後インキュベーション段階を使用して、ポリメラーゼを変性することにより検出する本発明を具体的に示すものである。
陽性プールは、以下のＰＣＲプロトコールを４０〜４５サイクル用いてＣＭＶ標的を増幅することにより生成した。
１．９５℃で１５秒間加熱することによる変性、そして
２．７０℃で３０秒間プライミングおよび伸長するサイクル。
生成物濃度は、既知濃度のＤＮＡ鎖と共にゲル電気泳動することにより定量した。次いで、得られた増幅後ＰＣＲ反応混合物を下記のように用いた。
【００４９】
ＰＣＲ後反応混合物を生成することに加えて、前記ＰＣＲプロトコールを用いてＣＭＶ ＤＮＡ標的を添加していないＰＣＲ反応混合物でＰＣＲ増幅を実施することにより、ＣＭＶ陰性生成物プールを調製した。
増幅後ＰＣＲ反応混合物（１０-7〜１０-8M ）を、ＣＭＶ陰性生成物プールで１：１００〜１：５０００に希釈して最終ＣＭＶ ＤＮＡ濃度が１×１０-10 M 、２．５×１０-11 M 、または５×１０-11 M となるようにした。次いで希釈した増幅後ＰＣＲ反応混合物を、増幅後インキュベーションにかけてポリメラーゼを不活性化した。増幅後インキュベーション段階を２分間９７℃もしくは１００℃で、または５分間１００℃で実施した。
【００５０】
増幅後インキュベーションの後に、５８℃で５分間臨床診断用ＰＣＲパウチの内部で捕捉試薬を用いて標的核酸を捕捉することにより、増幅された生成物を検出した。次いで捕捉された生成物を、５５℃で１分間ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液と接触させてインキュベートした。洗浄溶液を用いて１分間５５℃で洗浄を実施し、その後色素提供性組成物を添加し、そして４分間４０℃でインキュベートした。得られた信号を線配列スキャナーで読み取った。スキャナーは反射率濃度（ΔＤｒ）の変化を測定した。ΔＤｒは、色素発色開始前の初期読み取り値と色素発色４分後の最終読み取り値との間の反射率濃度における差である。目視的に陰性な捕捉ビーズにおけるスキャナーのバックグラウンドは、０．０５〜０．１Ｄｒ単位の範囲であった。
【００５１】
以下の結果は、増幅後インキュベーション段階が検出感度を増強することを示している。
増幅後インキュベーション条件 生成物濃度 ＣＭＶ ΔＤｒ
（スキャナー）
９７℃で２分間 １×１０-10 M ０．１７５
９７℃で２分間 ５×１０-11 M ０．１４
９７℃で２分間 ２．５×１０-11 M ０．１１
１００℃で２分間 １×１０-10 M ０．２６５
１００℃で２分間 ５×１０-11 M ０．１９
１００℃で２分間 ２．５×１０-11 M ０．１３
１００℃で５分間 １×１０-10 M ０．４３５
１００℃で５分間 ５×１０-11 M ０．３１
１００℃で５分間 ２．５×１０-11 M ０．２１
【００５２】
これらの結果は、１００℃で５分間増幅後インキュベーション段階を行うと、バックグラウンドを越えて少なくとも４倍そして恐らく少なくとも５倍有効検出限界を増強することを示している。これらの結果に基づいて、特に、１００℃でのインキュベーション期間を２分間から５分間に増加することによる改良の結果に基づいて、第２実験は、増幅後インキュベーションを１００℃で１５分間実施した。
【００５３】
実施例２
この第２実験では、ＣＭＶ ＤＮＡの増幅を、実施例１に記載されたように実施した。実施例１に記載したように、得られた増幅後ＰＣＲ反応混合物を、ＣＭＶ陰性生成物プールで希釈し、増幅後インキュベーションにかけてポリメラーゼを不活性化した。増幅後インキュベーション段階を１５分間１００℃で実施した。増幅後インキュベーションの後に、実施例１に記載したように増幅された生成物を検出した。
以下の結果は、増幅後インキュベーション段階が検出感度を増強することを示している。
増幅後インキュベーション条件 生成物濃度 ＣＭＶ ΔＤｒ
（スキャナー）
９７℃で２分間 １×１０-10 M ０．１４０
９７℃で２分間 １×１０-10 M ０．１２２
１００℃で５分間 １×１０-10 M ０．３３６
１００℃で５分間 １×１０-10 M ０．３４６
１００℃で１５分間 １×１０-10 M ０．５０３
１００℃で１５分間 １×１０-10 M ０．４８０
これらの結果は、１００℃での増幅後インキュベーション時間を増加すると、更なる利益が得られることを示唆している。
【００５４】
実施例３
インキュベーション温度を増加することにより更なる検出感度向上が実現できるかどうか測定するために、ＣＭＶ ＤＮＡの増幅を、実施例１に記載されたように実施し、１００℃もしくは１０３℃で増幅後インキュベーションを行った。１０３℃で様々なインキュベーション時間について調査した。加えて、最終接合体濃度もしくは０．２８nM の低感度検出化学についてこの実験を実施した。この実験の結果は以下のとおりであった。
増幅後インキュベーション条件 生成物濃度 ＣＭＶ ΔＤｒ
（スキャナー）
１００℃で５分間 １×１０-10 M ０．１５２
１００℃で１５分間 １×１０-10 M ０．２７０
１０３℃で２分間 １×１０-10 M ０．２６４
１０３℃で５分間 １×１０-10 M ０．３１８
これらの結果は、少なくとも更に２倍増強そして恐らく３倍増強が、増幅後インキュベーション段階温度を１００℃から１０３℃に増加することにより、そして５分間インキュベーション期間を維持することにより達成されうることを具体的に示している。
【００５５】
以上本明細書中に言及したすべての刊行物は、これにより引用することによって組み入れられる。
前記本発明を、明瞭にし理解する目的で幾らか詳細に記載してきたが、様式および細部の様々な変化が本発明の真の範囲から逸脱することなく可能であることは、この開示の解釈から当業者らに認められるだろう。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
（１）一般情報
（ｉ）出願人：バッカス，ジョン ダブリュ．（Backus, John W. ）
クラマー，マルシア エル．（Kramer, Marcia L. ）
ファルボ，ジョセフ（Falvo, Joseph ）
（ｉｉ）発明の名称：標的核酸を増幅して検出するための方法
（ｉｉｉ）配列の数：３
（ｉｖ）通信用住所：
（Ａ）名宛人：ステーシア エル．オグデン（Stasia L. Ogden ）
（Ｂ）ストリート：ワン ジェイアンドジェイ プラザ（One J&J Plaza ）
（Ｃ）シティー：ニューブロンスウィック（New Brunswick ）
（Ｄ）ステート：ニュージャージー（New Jersey）
（Ｅ）国：ＵＳＡ
（Ｆ）ＺＩＰ：０８９３３
（ｖ）コンピューター読み取り可能なフォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ 互換性
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース（Patent In Release ）＃１．０，バージョン＃１．２５
（ｖｉ）最新の出願データ：
（Ａ）出願数：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）代理人／代理業者情報
（Ａ）氏名：オグデン，ステーシア エル．（Ogden, Stasia L.）
（Ｂ）登録番号：３６，２２８
（Ｃ）参照／ドケット番号：ＣＤＳ−９２
（ｉｘ）遠距離通信情報：
（Ａ）電話：９０８−５２４−２８１９
（Ｂ）テレファックス：９０８−５２４−２８０８
【００５７】
配列番号：１
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（genomic ）
配列
CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT 25
【００５８】
配列番号：２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（genomic ）
配列
TGCACTGCCA GGTGCTTCGG CTCAT 25
【００５９】
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（genomic ）
配列
GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG 30
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、前記標的核酸の一部分に実質的に相補的である少なくとも２種のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性増幅酵素と、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する工程、
（ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記熱安定性増幅酵素を不活性化する工程、並びに
（ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法。
【請求項２】
４種のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性ＤＮＡリガーゼを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および前記標的核酸に実質的に相補的である２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する工程、
（ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記重合剤を不活性化する工程、並びに
（ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法。
【請求項４】
前記増幅後インキュベーション工程を、１５秒間〜１０分間、１００℃〜１１０℃で実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅後インキュベーション工程を、０．５分間〜５分間、約１０５℃で実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸がＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸がＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオシド三燐酸がデオキシリボヌクレオシド三燐酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記デオキシリボヌクレオシド三燐酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus ）ポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ポリメラーゼおよびサーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）ポリメラーゼからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマーの少なくとも一方が標識されている、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライマーが標識されている、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーの少なくとも一方が、特異的バインディング・リガンドで標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記特異的バインディング・リガンドがビオチンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅された標的核酸を、１種以上の標的核酸のうちの１つとハイブリダイズし得る標識されたプローブを用いて検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識されたプローブを、固形支持体に付着してある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プライマーの少なくとも一方を、特異的バインディング部分で標識し、そして前記増幅された標的核酸を、１種以上の標的核酸のうちの１つとハイブリダイズし得るプローブを用いて検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記プローブを、固形支持体に付着してある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも一方がビオチンで標識されており且ついずれも前記標的核酸に実質的に相補的である２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅後インキュベーション段階として、前記試料を０．５分間〜５分間、約１０５℃でインキュベートして、前記ポリメラーゼを不活性化する工程、並びに
（ｉｉｉ）前記ビオチニル化され増幅された標的核酸を、ストレプトアビジン酵素接合体と反応させ、続いて前記酵素を基質試薬と反応させて、検出可能な比色または化学ルミネセンス信号を生成することにより、前記ビオチニル化され増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法。
【請求項２１】
前記ビオチニル化され増幅された標的核酸を、アビジン−ペルオキシダーゼ接合体を接触させ、続いて酸化剤の存在下、ペルオキシダーゼをルミノールと反応させて検出可能な化学ルミネセンス信号を生成するか、またはロイコ色素と反応させて検出可能な比色信号を生成することにより、前記ビオチニル化され増幅された標的核酸を検出する、請求項２０に記載の方法。
【請求項１】
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、前記標的核酸の一部分に実質的に相補的である少なくとも２種のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性増幅酵素と、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する工程、
（ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記熱安定性増幅酵素を不活性化する工程、並びに
（ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法。
【請求項２】
４種のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性ＤＮＡリガーゼを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および前記標的核酸に実質的に相補的である２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成する工程、
（ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記重合剤を不活性化する工程、並びに
（ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法。
【請求項４】
前記増幅後インキュベーション工程を、１５秒間〜１０分間、１００℃〜１１０℃で実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅後インキュベーション工程を、０．５分間〜５分間、約１０５℃で実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸がＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸がＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオシド三燐酸がデオキシリボヌクレオシド三燐酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記デオキシリボヌクレオシド三燐酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus ）ポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ポリメラーゼおよびサーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）ポリメラーゼからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマーの少なくとも一方が標識されている、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライマーが標識されている、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーの少なくとも一方が、特異的バインディング・リガンドで標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記特異的バインディング・リガンドがビオチンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅された標的核酸を、１種以上の標的核酸のうちの１つとハイブリダイズし得る標識されたプローブを用いて検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識されたプローブを、固形支持体に付着してある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プライマーの少なくとも一方を、特異的バインディング部分で標識し、そして前記増幅された標的核酸を、１種以上の標的核酸のうちの１つとハイブリダイズし得るプローブを用いて検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記プローブを、固形支持体に付着してある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも一方がビオチンで標識されており且ついずれも前記標的核酸に実質的に相補的である２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）増幅後インキュベーション段階として、前記試料を０．５分間〜５分間、約１０５℃でインキュベートして、前記ポリメラーゼを不活性化する工程、並びに
（ｉｉｉ）前記ビオチニル化され増幅された標的核酸を、ストレプトアビジン酵素接合体と反応させ、続いて前記酵素を基質試薬と反応させて、検出可能な比色または化学ルミネセンス信号を生成することにより、前記ビオチニル化され増幅された標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、
を含む、標的核酸を増幅して検出するための方法。
【請求項２１】
前記ビオチニル化され増幅された標的核酸を、アビジン−ペルオキシダーゼ接合体を接触させ、続いて酸化剤の存在下、ペルオキシダーゼをルミノールと反応させて検出可能な化学ルミネセンス信号を生成するか、またはロイコ色素と反応させて検出可能な比色信号を生成することにより、前記ビオチニル化され増幅された標的核酸を検出する、請求項２０に記載の方法。
【公開番号】特開２０１２−１０５６６３（Ｐ２０１２−１０５６６３Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１９５５０（Ｐ２０１２−１９５５０）
【出願日】平成２４年２月１日（２０１２．２．１）
【分割の表示】特願平９−５６３３７の分割
【原出願日】平成９年３月１１日（１９９７．３．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５９４１９９３３７）オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月１日（２０１２．２．１）
【分割の表示】特願平９−５６３３７の分割
【原出願日】平成９年３月１１日（１９９７．３．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５９４１９９３３７）オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド (14)
【Ｆターム（参考）】
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