標的物質検出素子及び標的物質検出方法
【課題】標的物質検出方法において、検体中の夾雑物が基体に非特異的に吸着することにより、標的物質検出のノイズを発生させていた。
【解決手段】構基体の表面に捕捉体がリンカーを介して固定化された標的物質検出素子であって、前記リンカーが光照射によって構造変化することと、前記基体はその近傍の物理量に応じて信号を出力するセンサ素子であることと、前記センサ素子は、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて前記信号が連続的に変化することを特徴とする標的物質検出素子。
【解決手段】構基体の表面に捕捉体がリンカーを介して固定化された標的物質検出素子であって、前記リンカーが光照射によって構造変化することと、前記基体はその近傍の物理量に応じて信号を出力するセンサ素子であることと、前記センサ素子は、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて前記信号が連続的に変化することを特徴とする標的物質検出素子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的物質を検出するための標的物質検出素子及び標的物質検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケミカルセンサは分子同士の相互作用を利用して、検体中に含まれる化学物質を標的物質として検出するセンサである。このケミカルセンサは医療、食品検査、環境検査などの分野において利用されている。ケミカルセンサの中でも、素子近傍の誘電率や電気ポテンシャルなどの物理量に応じて、電流や吸光度などの信号が変化する素子を用いた化学センサが知られている。
この素子を化学センサとして用いるには、次のような方法がある。まず、先ほど述べた素子に標的物質を特異的に捕捉する捕捉体を固定した標的物質検出素子を作製する。次にこの素子に標的物質を含む検体を接触させ、標的物質のみを特異的に当該素子上に捕らえさせる。この時、前記標的物質がもつ物理量によって、当該素子近傍の物理量が変化し、当該素子の信号が変化する。この信号を測定することによって前記標的物質の存否を検出する。
【０００３】
特許文献１には、捕捉体としてＤＮＡを電界効果トランジスタに固定化した標的物質検出素子が開示されている。さらに、当該素子の信号としてチャネルに一定電圧をかけたときの電流を信号として測定し、その信号による標的物質検出方法が開示されている。前記標的物質がＤＮＡに特異的に捕捉されると、当該素子近傍の電気ポテンシャルが変化する。この変化が当該素子の電流−電圧特性を変化させる。その結果、一定電圧をかけたときの電流が変化し、前記標的物質を検出することができる。
【０００４】
また、捕捉体としてビオチンを金属薄膜上に固定化した標的物質検出素子が知られている。当該素子は光の入射角によってプラズモン共鳴を起し、信号として吸光度を示す。さらに、光反射率が最大となる入射角を測定する標的物質検出方法が知られている。前記標的物質であるアビジンがビオチンに特異的に捕捉されると、当該素子近傍の誘電率が変化し、プラズモン共鳴の条件が変化する。この変化が当該素子の光入射角−光反射率特性を変化させる。その結果、光反射率が最大となる光入射角を測定することにより、前記標的物質を検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−７７２３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
医療、食品検査、環境検査などに用いられる検体は、一部の精製された検体以外は標的物質以外の夾雑物を含んだ検体であり、このような夾雑物を含んだ検体を対象として標的物質の検出することが多い。検体中に存在する様々な夾雑物は物理吸着、疎水性相互作用、ファンデルワールス力などの様々な要因によって様々な物質の表面に非特異的に吸着してしまっていることが知られている。また、この吸着は要因が特定できない為、夾雑物の非特異的な吸着を完全に防ぐことは困難である。
特許文献１等に開示されている標的物質検出方法においても、夾雑物を含む検体を対象とした場合、夾雑物が素子表面に非特異的に吸着してしまう。この非特異的な吸着によっても、当該素子の信号が変化し、それがノイズ増大の原因となってしまう。このようなノイズ増大は、Ｓ／Ｎ比（信号対雑音比）の低下につながり、前記標的物質の検出において大きな課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記課題を解決すべく、鋭意に研究を重ねた結果、下記の標的物質検出素子及び標的物質検出方法を見出した。
本発明の標的物質検出素子は、基体の表面に捕捉体がリンカーを介して固定化された標的物質検出素子であって、前記リンカーが光照射によって構造変化することと、前記基体はその近傍の物理量に応じて信号を出力するセンサ素子であることと、前記センサ素子は、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて前記信号が連続的に変化することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の標的物質検出方法は、前記標的物質検出素子に検体を接触させ、前記検体中の標的物質を前記標的物質検出素子にある捕捉体に捕捉せしめる第一の工程と、前記標的物質検出素子からの信号を測定する第二の工程と、前記リンカーに光を照射する第三の工程と、前記標的物質検出素子からの信号を測定する第四の工程と、前記第二工程で得られた信号と前記第四工程で得られた信号の差分を算出する第五の工程とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、検体中に含まれる標的物質の検出において、Ｓ／Ｎ比の高い測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）は電界効果トランジスタの基体で、（ｂ）はプラズモン共鳴素子の基体である。
【図２】（ａ）は構造変化前のリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｂ）は構造変化後のリンカーを有する標的物質検出素子である。
【図３】（ａ）は基体に結合する部位を複数有するリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｂ）は一つの捕捉体に結合する部位を複数有するリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｃ）複数の捕捉体と結合する部位を有するリンカーを有する標的物質検出素子である。
【図４】（ａ）は構造変化する部位を複数有するリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｂ）は構造変化する部位を複数種類有するリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｃ）は異なる波長の光により構造変化する部位を複数有するリンカーと異なる標的物質を補足する捕捉体を有する標的物質検出素子である。
【図５】（ａ）は標的物質検出素子で、（ｂ）は標的物質捕捉し、光を照射する前の標的物質検出素子で、（ｃ）標的物質捕捉し、光を照射した後の標的物質検出素子である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施の形態を図、式及び実施例等を使用して説明する。なお、これらの図、式、実施例等及び説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
【００１２】
（第一の形態）
本発明の第一の形態は、基体の表面に捕捉体がリンカーを介して固定化された標的物質検出素子であって、前記リンカーが光照射によって構造変化することと、前記基体はその近傍の物理量に応じて信号を出力するセンサ素子であることと、前記センサ素子は、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて前記信号が連続的に変化することを特徴とする。
【００１３】
（第二の形態）
本発明の第二の形態は、検体中の標的物質検出方法であって、前記標的物質検出素子に検体を接触させ、前記検体中の標的物質を前記標的物質検出素子にある捕捉体に捕捉せしめる第一の工程と、前記標的物質検出素子からの信号を測定する第二の工程と、前記リンカーに光を照射する第三の工程と、前記標的物質検出素子からの信号を測定する第四の工程と、前記第二工程で得られた信号と前記第四工程で得られた信号の差分を算出する第五の工程とを含むことを特徴とする。
【００１４】
以下は本発明に用いられる基体等に関する説明であり、特に説明がない限り、全ての実施形態に適用される。
【００１５】
（検体）
本発明に係る検体とは、後述する標的物質を含む、液体、気体、または液体、気体、固体の混合物である。測定対象となる検体の具体例としては、医療では血清、尿、唾液などの体液、食品検査では、食品を溶かした溶液や食品の成分を抽出した溶液、環境検査では土壌の成分を抽出した溶液や河川・海などの水溶液がある。これらの検体には標的物質以外の様々な物質が夾雑物として含まれている。
【００１６】
（標的物質）
本発明に係る標的物質とは、検出対象とする分子または分子の集合体である。標的物質の具体例としては、天然もしくは非天然に存在するＰＣＢ類、ダイオキシン類、内分泌撹乱物質、核酸分子（ＤＮＡやＲＮＡ等）、蛋白質、糖鎖、脂質、ホルモン等の分子とその複合体がある。
【００１７】
（基体）
本発明に係る基体とは、この基体とその近傍の場における物理量に応じて信号を出力するセンサ素子である。前記物理量には誘電率、電気ポテンシャル、磁気ポテンシャル、質量、熱量などがある。前記信号とは当該基体から出てくる反射光、透過光または発光などの強度や、流れる電流、もしくは生じる電圧などである。
また、本発明における基体は、単純に物理量に応じた信号を出力するのではなく、その物理量が存在する場と基体との距離によって出力する前記信号の強度が変化する。同じ物理量でも、前記基体により近い距離の場における物理量に対しては感度がよいため、より大きな信号を出力する。したがって、同じ物理量でも前記基体から遠い距離の場における物理量に対しては感度が鈍いため、出力される信号が小さくなる。
また、物理量がベクトルである場合、その向きによっても信号が変化する場合もある。
したがって、着目する物理量と測定に用いる信号によって、基体の構成は異なる。
【００１８】
例えば、着目する物理量が電気ポテンシャルで、信号が電流または電圧である場合、電界効果トランジスタを基体として用いることができる。図１（ａ）に代表的な電界効果トランジスタの基体を示す。この基体は半導体層１０１とソース領域１０２とドレイン領域１０３とを有している。また、ソース領域１０２とドレイン領域１０３が半導体層１０１を介して結合している。この基体は半導体層１０１にかかる電圧が変化すると、ソース領域１０２とドレイン領域１０３との間で流れる電流量、即ち信号が変化する特性を示す。この信号である電流量は、半導体層にかかる電圧が一定の場合、当該基体とその近傍の電気ポテンシャルによって変化する。また、半導体層１０１は絶縁層で覆われていてもよく、絶縁層に孤立電極が接続されていても良い。なお、電気特性の測定は電気回路に直結して行えるため、小型化・集積化が容易であるといった利点もある。
【００１９】
また、着目する物理量が誘電率で、測定に用いる信号が光である場合、プラズモン共鳴素子を基体として用いることができる。プラズモン共鳴とは金属に光を入射したときに、金属中の自由電子の振動、即ちプラズモンと入射光とが共鳴し、金属が光吸収を起す現象である。図１（ｂ）に代表的なプラズモン共鳴素子を示す。当該基体は基板１０４上に金属構造体１０５を有している。金属構造体１０５は１ｎｍから１０００ｎｍの厚さの膜、または構造体の任意の２点間の距離の最大が１ｎｍから１０００ｎｍの大きさを有する構造体である。当該構造体は１ｎｍから１０００ｎｍの間隔をもつ周期構造で前記基板上に設けることができる。
また、本発明に用いる構造体は、薄膜型もしくは微小構造体型（薄膜をパターニングしたものや微粒子など）等を例として挙げられ、特に限定されない。
金属構造体１０５に光を入射すると、光の波長や入射角度によって入射光が金属構造体１０５のプラズモンと共鳴し、金属構造体１０５が当該入射光を吸収し、即ち信号を示す。吸光度が極大となる波長や吸光度が極大となる入射角度は、金属構造体の周囲の誘電率によって変化する。また、基板１０４は入射する光に対し、透明であることが望ましい。なお、光学特性の測定は外部からの光を遮断することによってノイズを減らせるため、高感度な測定が行える利点がある。
【００２０】
（標的物質の捕捉体）
本発明に係る標的物質の捕捉体は、標的物質を特異的に捕捉する分子または分子の集合体である。自然界には特異的に結合する組み合わせが存在する。この組み合わせには抗体−抗原、酵素−基質、核酸−核酸、レセプター−リガンド、ホスト−ゲストなどが存在する。これらの組み合わせの一方が標的物質であり、他方が当該標的物質の捕捉体となる。
【００２１】
（リンカー）
本発明に係るリンカー２０１は、図２（ａ）に示すように、基体結合部位２０３と、捕捉体結合部位２０５と、構造変化部位２０６とを有する。
基体結合部位２０３は、リンカー２０１を基体２０２に固定化する役割を果たす。よって、図３（ａ）に示すように一つのリンカー３０１が複数の基体結合部位３０３を有してもよい。この場合では、基体３０２とリンカー３０１との結合は基体結合部位３０３が一つの場合に比べて安定性が向上する。基体結合部位３０３は、基体３０２とリンカー３０１とが互いに結合反応することができる部位（官能基等）の反応によって結合し形成される。この官能基は、アミノ基とカルボキシル基との反応、カルボキシル基と水酸基との反応、アルコキシドと水酸基との反応、ハロゲン化アリールとアミンとの反応などによって結合しうる官能基を用いることができる。
【００２２】
また捕捉体結合部位３０５は、リンカー３０１に捕捉体を保持させる役割を果たす。よって、図３（ｂ）に示すように一つのリンカー３０１が複数の捕捉体結合部位３０５を有してもよい。この場合でも、１つのリンカー３０１が複数の基体結合部位３０３を有する場合と同様に結合の安定性が向上する。また、図３（ｃ）に示すように一つのリンカー３０１が複数の捕捉体３０４と結合していてもよい。捕捉体結合部位３０５は、基体結合部位３０３と同様に、捕捉体３０４とリンカー３０１とが互いに結合反応することができる部位（官能基等）の反応によって結合し形成される。捕捉体結合部位３０５での官能基は、基体結合部位３０３と同様な官能基を用いることができる。
【００２３】
本発明に係る構造変化とは、分子の立体構造の変化である。図２（ａ）は構造変化前のリンカー２０１を示し、図２（ｂ）は構造変化後のリンカー２０１を示した模式的図である。
図２（ａ）に示すようにリンカー２０１と、基体結合部位２０３及び捕捉体結合部位２０５とは、構造変化部位２０６を介して結合している。図２（ｂ）に示すように構造変化部位２０６が構造変化することにより、基体２０２の表面と捕捉体２０４との距離または角度若しくはその両方が変化する。
図４（ａ）に示すように複数個の構造変化部位４０６を含んでも良い。複数の構造変化部位４０６を有することでリンカー４０１を全体としてより大きく構造変化させることができる。すなわち、基体４０２の表面と捕捉体４０４との距離または角度若しくはその両方をより大きく変化させることができる。
【００２４】
ここでいう距離とは、前記物理量が存在する場と基体の表面との距離をいう。リンカー４０１に結合している捕捉体４０４は基体４０２近傍の物理量を生じさせるため、前記物理量の位置は、捕捉体４０４の位置にある。よって、前記距離の具体例は、捕捉体４０４と基体４０２の表面との距離である。
また、図５に示すように、基体５０１の近傍の物理量は、捕捉体５０２に結合する標的物質５０４によって生じ、そして基体５０１で一定の信号が生じる。さらにリンカー５０３の構造変化による標的物質５０４と基体５０１の表面との距離の変化に応じて、基体５０１上の信号が連続的に変化する。本発明は後述するように、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて連続的に変化する信号を測定するため、前記距離のより好ましい例は、基体５０１の表面と標的物質５０４との距離である。
なお、基体５０１の表面と夾雑物５０５との結合も基体５０１の近傍の物理量を生じさせるが、基体５０１の表面と夾雑物５０５との位置は変化しないため、当該物理量が存在する場と基体５０１の表面との距離も変化しない。よって、夾雑物５０５の存在によって、基体５０１上の信号が連続的に変化することはない。
また、ここでいう角度とは、図５（ｂ）及び（ｃ）示すように、基体５０１の表面の垂線（若しくは垂直をなす平面）と標的物質５０４の中心線とのなす角度である。前記距離同様、当該角度は、リンカー５０３の構造変化によって変化する。
【００２５】
また、図４（ｂ）に示すようにリンカー４０１は異なる構造変化部位４０６の組み合わせを有しても良い。異なる構造変化を起す構造変化部位４０６を組み合わせたリンカー４０１は、単一の構造変化部位４０６を有するリンカー４０１より基体４０２の表面と捕捉体４０４との距離または角度若しくはその両方をより細かく調整して変化させることができる。また、前記異なる構造変化部位４０６とは、立体構造変化が異なる分子同士である。
図４（ｃ）に示すように異なる構造変化部位４０６と異なる捕捉体４０４との組み合わせを複数組設けることにより、特定の捕捉体４０４のみにおいて、捕捉体４０４と基体４０２の表面との距離または角度若しくはその両方を変化させることができる。この形態では、一つの標的物質検出素子を用いて複数の標的物質を検出することができるため、複数の標的物質を検出したい時に有効である。また、これら異なる構造変化部位４０６とは、異なる波長の光の照射によって異なる構造に変化する部位を指す。
光を照射することによって、構造が変化する構造変化部位４０６としては、アゾベンゼン誘導体、スチルベン誘導体、スピロピラン誘導体、スピロベンゾピラン誘導体、α−アリール−β−ケト酸誘導体、α−ヒドラゾノ−β−ケト酸誘導体、カルコン誘導体、アゾ化合物誘導体、ベンジリデンフタルイミデン誘導体、ヘミチオインジゴ誘導体、チオインジゴ誘導体、スピロオキサジン誘導体、シンナムアルデヒド誘導体、レチナ−ル誘導体、フルギド誘導体、ジアリ−ルエテン誘導体、ポリメチン系化合物、ベンゾチアゾリノスピロピラン誘導体、ベンゾキオピラン系ピロピラン誘導体、ケイ皮酸エステル誘導体などを含む分子があり、本発明に係るリンカーはこのような構造を含む分子が好ましい。
また、本発明に係る構造変化部位はアゾベンゼン誘導体を含むことがより好ましい。
【００２６】
（リンカーに照射する光）
本発明に係るリンカーに照射する光は、例えばリンカー４０１の構造変化を起すための手段である。照射する光の波長は構造変化部位４０６の構造によって異なる。
アゾベンゼンを構造変化部位４０６に用いた場合、下記化学式１から化学式２に構造変化させる場合は紫外光、より好ましくは３５０ｎｍ付近の波長の光を照射する。また、化学式２から化学式１に構造変化させる場合は可視光、より好ましくは、４５０ｎｍ付近の波長の光を照射する。
【００２７】
【化１】
（化学式１）
【００２８】
【化２】
（化学式２）
【００２９】
（標的物質検出素子）
本発明に係る標的物質検出素子は、図５（ａ）に示すように、基体５０１に捕捉体５０２がリンカー５０３を介して固定化された構造を有する。基体５０１、捕捉体５０２及びリンカー５０３に関しては前述した通りである。
【００３０】
（第一の工程）
本発明に係る第一の工程とは、例えば、図５（ｂ）に示すように、標的物質検出素子の捕捉体５０２に検体の標的物質５０４を接触させて特異的な結合を形成させ、標的物質５０４を捕捉体５０２に捕捉させる工程である。検体は後述する第二から第四の工程において接触させつづけてもよい。また、本工程において、標的物質５０４を捕捉体５０２に捕捉させた後は、前記標的物質検出素子を洗浄し、前記検体を排除してもよい。ただし、前記標的物質検出素子を洗浄する時にこの標的物質検出素子上から特異的に結合されている標的物質５０４が排除されない条件で洗浄する必要がある。なお、本工程において、検体中に存在する夾雑物５０５が基体５０１に非特異的に吸着する現象が起こることが多い。
この場合、基体５０１とその近傍の場において、標的物質５０４の捕捉または夾雑物５０５の吸着若しくはその両方によって物理量が変化する。また、標的物質５０４との相互作用により、捕捉体５０２の物理量が変化する場合もあり、この場合も基体５０１とその近傍の場において物理量が変化する。
【００３１】
（(第二の工程）
本発明に係る第二の工程とは、例えば、図５（ｂ）の状態の標的物質検出素子の信号を測定する工程である。前記基体に関する説明で述べたが、信号の測定とはセンサ素子から出力される電流や光の強度（信号）を測定することである。また、前記信号は単純な物理量だけでなく、その物理量が存在する場と基体の表面との距離によっても変化する。
従来のケミカルセンサにおいては、この第二工程の信号を用いて、標的物質の検出を行っていた。そのため、当該信号は、捕捉された標的物質の物理量または非特異的に吸着している夾雑物の物理量若しくはその両方によって生じる。また、前記捕捉体が標的物質との結合により構造変化する場合、前記捕捉体の物理量も変化するため、信号も生じる。これらの信号に含まれる夾雑物の物理量による信号成分は、前記標的物質の検出にとってノイズである。特に多量の夾雑物が存在するなかで、微量の標的物質を検出する時は、標的物質の物理量に比べて夾雑物による物理量が大きいため、Ｓ／Ｎ比が低下していた。
【００３２】
また、第二の工程において、信号を測定する際に光を入射する場合、後述する第三の工程で用いる光とは異なる波長の光を用いる。前記信号が電流で、外部入力が電圧である場合、電源を用い、素子に流れる電流を信号として測定することができる。また、前記信号が光である場合、ランプやレーザーなどの光源を用い、透過光、散乱光、反射光などの強度を信号として測定することができる。
【００３３】
（第三の工程）
本発明に係る第三の工程とは、たとえば、リンカー５０３に光を照射し、構造変化させることにより、図５（ｂ）の状態から図５（ｃ）の状態に変化させる工程である。この時、捕捉体５０２及び標的物質５０４と基体５０１の表面との距離または角度若しくはその両方は変化する。しかし、夾雑物５０５と基体５０１の表面との距離と角度は変化しない。
リンカー５０３の構造変化部位にアゾベンゼンを用いた場合、可視光を照射すると化学式１の構造となり、紫外光を照射すると化学式２の構造をとる。このアゾベンゼンの構造変化を用いて、リンカー５０３を構造変化させることができる。
【００３４】
（第四の工程）
本発明に係る第四の工程は、例えば、図５（ｃ）の状態の標的物質検出素子の信号を第二の工程と同様の手法で測定する工程である。
前記第三の工程で述べた通り、図５（ｃ）の状態は図５（ｂ）の状態と比較すると、捕捉体５０２及び標的物質５０４は基体５０１の表面との距離または角度若しくはその両方が変化しているが、夾雑物５０５と基体５０１の表面との距離と角度は変化していない。
したがって、リンカー５０３の構造変化の前後において、捕捉体５０２及び標的物質５０４は、基体５０１の表面との距離または角度若しくはその両方が変化したため、基体５０１で生じた信号を変化させうる。しかし、リンカー５０３の構造変化の前後において、夾雑物５０５と基体５０１の表面との距離と角度は変化していないため、夾雑物５０５の存在による基体５０１で生じた信号の変化はない。
また第二の工程と同様に、前記信号を測定する際に光を入射する場合、第三の工程で用いる光とは異なる波長の光を用いる必要がある。
【００３５】
（第五の工程）
本発明に係る第五の工程は、第二の工程で測定した信号と第四の工程で測定した信号との差分を算出する工程である。
前記第四の工程で説明したが、第二の工程で測定した信号と第四の工程で測定した信号とを比較すれば、夾雑物５０５の存在は基体５０１で生じた信号を変化させていないため、捕捉体５０２及び標的物質５０４のみが基体５０１で生じた信号を変化させていることがわかる。したがって第二の工程で測定した信号と第四の工程で測定した信号との差分を算出すると、夾雑物５０５による信号を打ち消した値を算出することができる。その結果、この値を用いて検体中に含まれる標的物質を検出し、夾雑物５０５によるノイズがない、かつ、Ｓ／Ｎ比の高い測定を行うことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
基体として電界効果トランジスタ、捕捉体としてビオチン、リンカーとして４，４’−ジアミノアゾベンゼンとマレイン酸とアミノプロプリトリメトキシシランとの複合体を用いた標的物質検出素子を例示する。
ソース領域とドレイン領域とは半導体層を介して結合しており、半導体層の表面は絶縁層によって覆われている電界効果トランジスタを基体として用いる。Ｐ型シリコン基板にフォトリソグラフィの手法を用いてソース領域とドレイン領域とにイオンを注入する。ソース領域とドレイン領域とに挟まれた半導体層、即ちフォトリソグラフィの手法を用いてチャネル領域の表面を酸化シリコン層で覆う。この電界効果トランジスタ素子を基体として用いる。
【００３８】
４，４’−ジアミノアゾベンゼンとビオチンと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとを混合して、アゾベンゼンのアミノ基とビオチンのカルボキシル基とカップリング反応させ、片側のアミノ基のみ反応した生成物を精製する。この場合、アミノ基とカルボキシル基とによって形成されるアミド結合が、捕捉体とリンカーとの結合部位になる。次にもう片方のアゾベンゼンに無水マレイン酸を混合してカップリング反応させ、捕捉体−リンカー前駆体を合成する。
基体の酸化シリコン層を１％アミノプロプリトリメトキシシラン溶液に浸し、アミノプロプリトリメトキシシランを基体に結合させる。この時、酸化シリコンの水酸基とアミノプロプリトリメトキシシランのメトキシ基とによって形成されるエーテル結合が、基体とリンカーとの結合部位となる。次に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを溶かした溶液に捕捉体−リンカー前駆体を浸し、捕捉体−リンカー前駆体と基体とを結合させ、標的物質検出素子とする。
【００３９】
（実施例２）
実施例１で作製した素子を用いて電流を信号として測定する方法を例示する。
まず、実施例１に例示した標的物質検出素子を作製し、当該標的物質検出素子のリンカーに４５０ｎｍの波長の光を照射する。光の照射によってアゾベンゼンの構造を化学式１の状態にする。
第一の工程として、標的物質検出素子の捕捉体を、夾雑物としてのアルブミンを含むアビジン溶液に浸す。この時、捕捉体がアビジンを捕捉する。また、同時に基体表面にアルブミンが非特異的に吸着する。
【００４０】
第二の工程として、ソース領域とドレイン領域とに電極を接続し、その間に電流計をつなぐ。次に半導体層に電圧をかけ、ソース−ドレイン間で流れる電流を信号として測定する。
第三の工程として、標的物質検出素子のリンカーに３５０ｎｍの波長の光を照射する。光の照射によってアゾベンゼンの構造を化学式２の状態にする。この時、ビオチンとアビジンとが基体の表面に近づく。
第四の工程として、第二の工程と同様に、ソース領域とドレイン領域とに電極を接続し、その間に電流計をつなぐ。次に半導体層に電圧をかけ、ソース−ドレイン間で流れる電流を信号として測定する。
第五の工程として、第二の工程と第四の工程とで測定した電流の差分を算出し、アビジンを検出する。この場合、既知のアビジンの量がわかっている溶液を用いて事前に検量線を作成しておくと、前記アビジンの量を定量することができる。
【００４１】
（比較例１）
実施例１と同様の方法で基体を作製する。
従来の標的物質検出素子と検出方法との例として、基体として電界効果トランジスタ、標的物質捕捉体としてアビジンを用いた方法を例示する。
前記基体の酸化シリコン層を１％アミノプロプリトリメトキシシラン溶液に浸し、アミノプロプリトリメトキシシランを基体に結合させる。次にビオチンと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとを溶かした溶液に浸し、基体と捕捉体とを結合し、標的物質検出素子とする。
【００４２】
作製した標的物質検出素子の捕捉体を、夾雑物としてのアルブミンを含むアビジン溶液に浸す。この時、捕捉体がアビジンを捕捉する。また、同時に基体表面にアルブミンが非特異的に吸着する。
ソース領域とドレイン領域とに電極を接続し、その間に電流計をつなぐ。次に半導体層に電圧をかけ、ソース−ドレイン間で流れる電流を信号として測定し、アビジンの量を定量する。
この比較例においては、アルブミンの量を変化させると電流値が変化してしまい、アビジンを定量することが不可能になる場合がある。しかし、実施例２においては、アルブミンの量を変化させても算出される値は変わらず、アビジンを定量することができる。
【００４３】
（実施例３）
基体としてプラズモン共鳴素子、捕捉体としてビオチンアビジン、リンカーとして４，４’−ジアミノアゾベンゼンとマレイン酸とを用い、前記基体を１１−アミノ−１−ウンデカチオールとの複合体を用いた例を例示する。
石英基板上に膜厚２０ｎｍ、２００ｎｍ×２００ｎｍの金の構造体を２５０ｎｍの間隔で正方配列でパターニングした基板フォトリソグラフィの手法を用いて作製し、これを基体として用いる。
【００４４】
前記基体を１１−アミノ−１−ウンデカチオール溶液に浸し、１１−アミノ−１−ウンデカチオールを基体に結合させる。この時、金と１１−アミノ−１−ウンデカチオールのチオール基によって形成されるチオエーテル結合が、基体とリンカーとの結合部位となる。次に実施例１と同様の捕捉体−リンカー前駆体を作製し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと共に溶かした溶液に基体を浸し、捕捉体−リンカー前駆体と基体を結合させ、標的物質検出素子とする。
【００４５】
（実施例４）
実施例３で作製した素子を用いて光を信号として測定する方法を例示する。
まず、実施例１に例示した標的物質検出素子を作製し、標的物質検出素子のリンカーに４５０ｎｍの波長の光を照射する。光の照射によってアゾベンゼンの構造を化学式１の状態にする。
第一の工程として、標的物質検出素子の捕捉体を、夾雑物としてのアルブミンを含むアビジン溶液に浸す。この時、捕捉体がアビジンを捕捉する。また、同時に基体表面にアルブミンが非特異的に吸着する。
第二の工程として、８００ｎｍから１０００ｎｍの波長の光を基体に照射し、透過してきた光の強度を測定することにより、吸光度スペクトルを測定する。さらに吸光度スペクトルの極大波長を求め、信号とする。
【００４６】
第三の工程として、標的物質検出素子のリンカーに３５０ｎｍの波長の光を照射する。光の照射によってアゾベンゼンの構造を化学式２の状態にする。この時、ビオチンとアビジンが基体表面に近づく。
第四の工程として、第二の工程と同様に、８００ｎｍから１０００ｎｍの波長の光を基体に照射し、透過してきた光の強度を測定することにより、吸光度スペクトルを測定する。さらに吸光度スペクトルの極大吸収波長を求め、信号とする。
第五の工程として、第二の工程と第四の工程とで求めた極大波長の差分を算出し、アビジンを検出する。この場合、既知のアビジンの量がわかっている溶液を用いて検量線を事前に作成しておくと、前記アビジンの量を定量することができる。
本実施例のように第二の工程と第四の工程とで光を入射して信号を測定する際は、リンカーが構造変化を起す光の波長を用いないことが好ましい。
【００４７】
（比較例２）
実施例３と同様の方法で基体を作製する。
従来の標的物質検出素子と検出方法の例として、基体としてプラズモン共鳴素子、捕捉体としてビオチンを用いた方法を例示する。
基体を１１−アミノ−１−ウンデカチオール溶液に浸し、１１−アミノ−１−ウンデカチオールを基体に結合させる。次にビオチンと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと共に溶かした溶液に基体を浸し、基体と捕捉体を結合し、標的物質検出素子とする。
【００４８】
作製した標的物質検出素子の捕捉体を、夾雑物としてアルブミンを含むアビジン溶液に浸す。この時、捕捉体がアビジンを捕捉する。また、同時に基体表面にアルブミンが非特異的に吸着する。
８００ｎｍから１０００ｎｍの波長の光を基体に照射し、透過してきた光の強度を測定することにより、吸光度スペクトルを測定する。さらに吸光度スペクトルの極大波長を求め、信号とする。
この比較例においては、アルブミンの量を変化させると極大吸収波長が変化してしまい、アビジンを定量することが不可能になる場合がある。しかし、実施例４においては、アルブミンの量を変化させても算出される値は変わらず、アビジンを定量することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明に開示される標的物質検出方法と標的物質検出素子と、及び本発明に基づいて開発されうる標的物質検出装置は医療、食品検査、環境検査などの検体中に含まれる特定物質を検出する場合において有効である。本発明を用いれば、夾雑物が含まれている検体においても精製などの工程を経ずに標的物質の検出が可能である。
【符号の説明】
【００５０】
１０１ 半導体層
１０２ ソース領域
１０３ ドレイン領域
１０４ 基板
４０６ 構造変化する部位
５０１ 基体
５０２ 捕捉体
５０３ リンカー
５０４ 標的物質
５０５ 検体中の夾雑物
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的物質を検出するための標的物質検出素子及び標的物質検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケミカルセンサは分子同士の相互作用を利用して、検体中に含まれる化学物質を標的物質として検出するセンサである。このケミカルセンサは医療、食品検査、環境検査などの分野において利用されている。ケミカルセンサの中でも、素子近傍の誘電率や電気ポテンシャルなどの物理量に応じて、電流や吸光度などの信号が変化する素子を用いた化学センサが知られている。
この素子を化学センサとして用いるには、次のような方法がある。まず、先ほど述べた素子に標的物質を特異的に捕捉する捕捉体を固定した標的物質検出素子を作製する。次にこの素子に標的物質を含む検体を接触させ、標的物質のみを特異的に当該素子上に捕らえさせる。この時、前記標的物質がもつ物理量によって、当該素子近傍の物理量が変化し、当該素子の信号が変化する。この信号を測定することによって前記標的物質の存否を検出する。
【０００３】
特許文献１には、捕捉体としてＤＮＡを電界効果トランジスタに固定化した標的物質検出素子が開示されている。さらに、当該素子の信号としてチャネルに一定電圧をかけたときの電流を信号として測定し、その信号による標的物質検出方法が開示されている。前記標的物質がＤＮＡに特異的に捕捉されると、当該素子近傍の電気ポテンシャルが変化する。この変化が当該素子の電流−電圧特性を変化させる。その結果、一定電圧をかけたときの電流が変化し、前記標的物質を検出することができる。
【０００４】
また、捕捉体としてビオチンを金属薄膜上に固定化した標的物質検出素子が知られている。当該素子は光の入射角によってプラズモン共鳴を起し、信号として吸光度を示す。さらに、光反射率が最大となる入射角を測定する標的物質検出方法が知られている。前記標的物質であるアビジンがビオチンに特異的に捕捉されると、当該素子近傍の誘電率が変化し、プラズモン共鳴の条件が変化する。この変化が当該素子の光入射角−光反射率特性を変化させる。その結果、光反射率が最大となる光入射角を測定することにより、前記標的物質を検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−７７２３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
医療、食品検査、環境検査などに用いられる検体は、一部の精製された検体以外は標的物質以外の夾雑物を含んだ検体であり、このような夾雑物を含んだ検体を対象として標的物質の検出することが多い。検体中に存在する様々な夾雑物は物理吸着、疎水性相互作用、ファンデルワールス力などの様々な要因によって様々な物質の表面に非特異的に吸着してしまっていることが知られている。また、この吸着は要因が特定できない為、夾雑物の非特異的な吸着を完全に防ぐことは困難である。
特許文献１等に開示されている標的物質検出方法においても、夾雑物を含む検体を対象とした場合、夾雑物が素子表面に非特異的に吸着してしまう。この非特異的な吸着によっても、当該素子の信号が変化し、それがノイズ増大の原因となってしまう。このようなノイズ増大は、Ｓ／Ｎ比（信号対雑音比）の低下につながり、前記標的物質の検出において大きな課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記課題を解決すべく、鋭意に研究を重ねた結果、下記の標的物質検出素子及び標的物質検出方法を見出した。
本発明の標的物質検出素子は、基体の表面に捕捉体がリンカーを介して固定化された標的物質検出素子であって、前記リンカーが光照射によって構造変化することと、前記基体はその近傍の物理量に応じて信号を出力するセンサ素子であることと、前記センサ素子は、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて前記信号が連続的に変化することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の標的物質検出方法は、前記標的物質検出素子に検体を接触させ、前記検体中の標的物質を前記標的物質検出素子にある捕捉体に捕捉せしめる第一の工程と、前記標的物質検出素子からの信号を測定する第二の工程と、前記リンカーに光を照射する第三の工程と、前記標的物質検出素子からの信号を測定する第四の工程と、前記第二工程で得られた信号と前記第四工程で得られた信号の差分を算出する第五の工程とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、検体中に含まれる標的物質の検出において、Ｓ／Ｎ比の高い測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）は電界効果トランジスタの基体で、（ｂ）はプラズモン共鳴素子の基体である。
【図２】（ａ）は構造変化前のリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｂ）は構造変化後のリンカーを有する標的物質検出素子である。
【図３】（ａ）は基体に結合する部位を複数有するリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｂ）は一つの捕捉体に結合する部位を複数有するリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｃ）複数の捕捉体と結合する部位を有するリンカーを有する標的物質検出素子である。
【図４】（ａ）は構造変化する部位を複数有するリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｂ）は構造変化する部位を複数種類有するリンカーを有する標的物質検出素子で、（ｃ）は異なる波長の光により構造変化する部位を複数有するリンカーと異なる標的物質を補足する捕捉体を有する標的物質検出素子である。
【図５】（ａ）は標的物質検出素子で、（ｂ）は標的物質捕捉し、光を照射する前の標的物質検出素子で、（ｃ）標的物質捕捉し、光を照射した後の標的物質検出素子である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施の形態を図、式及び実施例等を使用して説明する。なお、これらの図、式、実施例等及び説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
【００１２】
（第一の形態）
本発明の第一の形態は、基体の表面に捕捉体がリンカーを介して固定化された標的物質検出素子であって、前記リンカーが光照射によって構造変化することと、前記基体はその近傍の物理量に応じて信号を出力するセンサ素子であることと、前記センサ素子は、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて前記信号が連続的に変化することを特徴とする。
【００１３】
（第二の形態）
本発明の第二の形態は、検体中の標的物質検出方法であって、前記標的物質検出素子に検体を接触させ、前記検体中の標的物質を前記標的物質検出素子にある捕捉体に捕捉せしめる第一の工程と、前記標的物質検出素子からの信号を測定する第二の工程と、前記リンカーに光を照射する第三の工程と、前記標的物質検出素子からの信号を測定する第四の工程と、前記第二工程で得られた信号と前記第四工程で得られた信号の差分を算出する第五の工程とを含むことを特徴とする。
【００１４】
以下は本発明に用いられる基体等に関する説明であり、特に説明がない限り、全ての実施形態に適用される。
【００１５】
（検体）
本発明に係る検体とは、後述する標的物質を含む、液体、気体、または液体、気体、固体の混合物である。測定対象となる検体の具体例としては、医療では血清、尿、唾液などの体液、食品検査では、食品を溶かした溶液や食品の成分を抽出した溶液、環境検査では土壌の成分を抽出した溶液や河川・海などの水溶液がある。これらの検体には標的物質以外の様々な物質が夾雑物として含まれている。
【００１６】
（標的物質）
本発明に係る標的物質とは、検出対象とする分子または分子の集合体である。標的物質の具体例としては、天然もしくは非天然に存在するＰＣＢ類、ダイオキシン類、内分泌撹乱物質、核酸分子（ＤＮＡやＲＮＡ等）、蛋白質、糖鎖、脂質、ホルモン等の分子とその複合体がある。
【００１７】
（基体）
本発明に係る基体とは、この基体とその近傍の場における物理量に応じて信号を出力するセンサ素子である。前記物理量には誘電率、電気ポテンシャル、磁気ポテンシャル、質量、熱量などがある。前記信号とは当該基体から出てくる反射光、透過光または発光などの強度や、流れる電流、もしくは生じる電圧などである。
また、本発明における基体は、単純に物理量に応じた信号を出力するのではなく、その物理量が存在する場と基体との距離によって出力する前記信号の強度が変化する。同じ物理量でも、前記基体により近い距離の場における物理量に対しては感度がよいため、より大きな信号を出力する。したがって、同じ物理量でも前記基体から遠い距離の場における物理量に対しては感度が鈍いため、出力される信号が小さくなる。
また、物理量がベクトルである場合、その向きによっても信号が変化する場合もある。
したがって、着目する物理量と測定に用いる信号によって、基体の構成は異なる。
【００１８】
例えば、着目する物理量が電気ポテンシャルで、信号が電流または電圧である場合、電界効果トランジスタを基体として用いることができる。図１（ａ）に代表的な電界効果トランジスタの基体を示す。この基体は半導体層１０１とソース領域１０２とドレイン領域１０３とを有している。また、ソース領域１０２とドレイン領域１０３が半導体層１０１を介して結合している。この基体は半導体層１０１にかかる電圧が変化すると、ソース領域１０２とドレイン領域１０３との間で流れる電流量、即ち信号が変化する特性を示す。この信号である電流量は、半導体層にかかる電圧が一定の場合、当該基体とその近傍の電気ポテンシャルによって変化する。また、半導体層１０１は絶縁層で覆われていてもよく、絶縁層に孤立電極が接続されていても良い。なお、電気特性の測定は電気回路に直結して行えるため、小型化・集積化が容易であるといった利点もある。
【００１９】
また、着目する物理量が誘電率で、測定に用いる信号が光である場合、プラズモン共鳴素子を基体として用いることができる。プラズモン共鳴とは金属に光を入射したときに、金属中の自由電子の振動、即ちプラズモンと入射光とが共鳴し、金属が光吸収を起す現象である。図１（ｂ）に代表的なプラズモン共鳴素子を示す。当該基体は基板１０４上に金属構造体１０５を有している。金属構造体１０５は１ｎｍから１０００ｎｍの厚さの膜、または構造体の任意の２点間の距離の最大が１ｎｍから１０００ｎｍの大きさを有する構造体である。当該構造体は１ｎｍから１０００ｎｍの間隔をもつ周期構造で前記基板上に設けることができる。
また、本発明に用いる構造体は、薄膜型もしくは微小構造体型（薄膜をパターニングしたものや微粒子など）等を例として挙げられ、特に限定されない。
金属構造体１０５に光を入射すると、光の波長や入射角度によって入射光が金属構造体１０５のプラズモンと共鳴し、金属構造体１０５が当該入射光を吸収し、即ち信号を示す。吸光度が極大となる波長や吸光度が極大となる入射角度は、金属構造体の周囲の誘電率によって変化する。また、基板１０４は入射する光に対し、透明であることが望ましい。なお、光学特性の測定は外部からの光を遮断することによってノイズを減らせるため、高感度な測定が行える利点がある。
【００２０】
（標的物質の捕捉体）
本発明に係る標的物質の捕捉体は、標的物質を特異的に捕捉する分子または分子の集合体である。自然界には特異的に結合する組み合わせが存在する。この組み合わせには抗体−抗原、酵素−基質、核酸−核酸、レセプター−リガンド、ホスト−ゲストなどが存在する。これらの組み合わせの一方が標的物質であり、他方が当該標的物質の捕捉体となる。
【００２１】
（リンカー）
本発明に係るリンカー２０１は、図２（ａ）に示すように、基体結合部位２０３と、捕捉体結合部位２０５と、構造変化部位２０６とを有する。
基体結合部位２０３は、リンカー２０１を基体２０２に固定化する役割を果たす。よって、図３（ａ）に示すように一つのリンカー３０１が複数の基体結合部位３０３を有してもよい。この場合では、基体３０２とリンカー３０１との結合は基体結合部位３０３が一つの場合に比べて安定性が向上する。基体結合部位３０３は、基体３０２とリンカー３０１とが互いに結合反応することができる部位（官能基等）の反応によって結合し形成される。この官能基は、アミノ基とカルボキシル基との反応、カルボキシル基と水酸基との反応、アルコキシドと水酸基との反応、ハロゲン化アリールとアミンとの反応などによって結合しうる官能基を用いることができる。
【００２２】
また捕捉体結合部位３０５は、リンカー３０１に捕捉体を保持させる役割を果たす。よって、図３（ｂ）に示すように一つのリンカー３０１が複数の捕捉体結合部位３０５を有してもよい。この場合でも、１つのリンカー３０１が複数の基体結合部位３０３を有する場合と同様に結合の安定性が向上する。また、図３（ｃ）に示すように一つのリンカー３０１が複数の捕捉体３０４と結合していてもよい。捕捉体結合部位３０５は、基体結合部位３０３と同様に、捕捉体３０４とリンカー３０１とが互いに結合反応することができる部位（官能基等）の反応によって結合し形成される。捕捉体結合部位３０５での官能基は、基体結合部位３０３と同様な官能基を用いることができる。
【００２３】
本発明に係る構造変化とは、分子の立体構造の変化である。図２（ａ）は構造変化前のリンカー２０１を示し、図２（ｂ）は構造変化後のリンカー２０１を示した模式的図である。
図２（ａ）に示すようにリンカー２０１と、基体結合部位２０３及び捕捉体結合部位２０５とは、構造変化部位２０６を介して結合している。図２（ｂ）に示すように構造変化部位２０６が構造変化することにより、基体２０２の表面と捕捉体２０４との距離または角度若しくはその両方が変化する。
図４（ａ）に示すように複数個の構造変化部位４０６を含んでも良い。複数の構造変化部位４０６を有することでリンカー４０１を全体としてより大きく構造変化させることができる。すなわち、基体４０２の表面と捕捉体４０４との距離または角度若しくはその両方をより大きく変化させることができる。
【００２４】
ここでいう距離とは、前記物理量が存在する場と基体の表面との距離をいう。リンカー４０１に結合している捕捉体４０４は基体４０２近傍の物理量を生じさせるため、前記物理量の位置は、捕捉体４０４の位置にある。よって、前記距離の具体例は、捕捉体４０４と基体４０２の表面との距離である。
また、図５に示すように、基体５０１の近傍の物理量は、捕捉体５０２に結合する標的物質５０４によって生じ、そして基体５０１で一定の信号が生じる。さらにリンカー５０３の構造変化による標的物質５０４と基体５０１の表面との距離の変化に応じて、基体５０１上の信号が連続的に変化する。本発明は後述するように、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて連続的に変化する信号を測定するため、前記距離のより好ましい例は、基体５０１の表面と標的物質５０４との距離である。
なお、基体５０１の表面と夾雑物５０５との結合も基体５０１の近傍の物理量を生じさせるが、基体５０１の表面と夾雑物５０５との位置は変化しないため、当該物理量が存在する場と基体５０１の表面との距離も変化しない。よって、夾雑物５０５の存在によって、基体５０１上の信号が連続的に変化することはない。
また、ここでいう角度とは、図５（ｂ）及び（ｃ）示すように、基体５０１の表面の垂線（若しくは垂直をなす平面）と標的物質５０４の中心線とのなす角度である。前記距離同様、当該角度は、リンカー５０３の構造変化によって変化する。
【００２５】
また、図４（ｂ）に示すようにリンカー４０１は異なる構造変化部位４０６の組み合わせを有しても良い。異なる構造変化を起す構造変化部位４０６を組み合わせたリンカー４０１は、単一の構造変化部位４０６を有するリンカー４０１より基体４０２の表面と捕捉体４０４との距離または角度若しくはその両方をより細かく調整して変化させることができる。また、前記異なる構造変化部位４０６とは、立体構造変化が異なる分子同士である。
図４（ｃ）に示すように異なる構造変化部位４０６と異なる捕捉体４０４との組み合わせを複数組設けることにより、特定の捕捉体４０４のみにおいて、捕捉体４０４と基体４０２の表面との距離または角度若しくはその両方を変化させることができる。この形態では、一つの標的物質検出素子を用いて複数の標的物質を検出することができるため、複数の標的物質を検出したい時に有効である。また、これら異なる構造変化部位４０６とは、異なる波長の光の照射によって異なる構造に変化する部位を指す。
光を照射することによって、構造が変化する構造変化部位４０６としては、アゾベンゼン誘導体、スチルベン誘導体、スピロピラン誘導体、スピロベンゾピラン誘導体、α−アリール−β−ケト酸誘導体、α−ヒドラゾノ−β−ケト酸誘導体、カルコン誘導体、アゾ化合物誘導体、ベンジリデンフタルイミデン誘導体、ヘミチオインジゴ誘導体、チオインジゴ誘導体、スピロオキサジン誘導体、シンナムアルデヒド誘導体、レチナ−ル誘導体、フルギド誘導体、ジアリ−ルエテン誘導体、ポリメチン系化合物、ベンゾチアゾリノスピロピラン誘導体、ベンゾキオピラン系ピロピラン誘導体、ケイ皮酸エステル誘導体などを含む分子があり、本発明に係るリンカーはこのような構造を含む分子が好ましい。
また、本発明に係る構造変化部位はアゾベンゼン誘導体を含むことがより好ましい。
【００２６】
（リンカーに照射する光）
本発明に係るリンカーに照射する光は、例えばリンカー４０１の構造変化を起すための手段である。照射する光の波長は構造変化部位４０６の構造によって異なる。
アゾベンゼンを構造変化部位４０６に用いた場合、下記化学式１から化学式２に構造変化させる場合は紫外光、より好ましくは３５０ｎｍ付近の波長の光を照射する。また、化学式２から化学式１に構造変化させる場合は可視光、より好ましくは、４５０ｎｍ付近の波長の光を照射する。
【００２７】
【化１】
（化学式１）
【００２８】
【化２】
（化学式２）
【００２９】
（標的物質検出素子）
本発明に係る標的物質検出素子は、図５（ａ）に示すように、基体５０１に捕捉体５０２がリンカー５０３を介して固定化された構造を有する。基体５０１、捕捉体５０２及びリンカー５０３に関しては前述した通りである。
【００３０】
（第一の工程）
本発明に係る第一の工程とは、例えば、図５（ｂ）に示すように、標的物質検出素子の捕捉体５０２に検体の標的物質５０４を接触させて特異的な結合を形成させ、標的物質５０４を捕捉体５０２に捕捉させる工程である。検体は後述する第二から第四の工程において接触させつづけてもよい。また、本工程において、標的物質５０４を捕捉体５０２に捕捉させた後は、前記標的物質検出素子を洗浄し、前記検体を排除してもよい。ただし、前記標的物質検出素子を洗浄する時にこの標的物質検出素子上から特異的に結合されている標的物質５０４が排除されない条件で洗浄する必要がある。なお、本工程において、検体中に存在する夾雑物５０５が基体５０１に非特異的に吸着する現象が起こることが多い。
この場合、基体５０１とその近傍の場において、標的物質５０４の捕捉または夾雑物５０５の吸着若しくはその両方によって物理量が変化する。また、標的物質５０４との相互作用により、捕捉体５０２の物理量が変化する場合もあり、この場合も基体５０１とその近傍の場において物理量が変化する。
【００３１】
（(第二の工程）
本発明に係る第二の工程とは、例えば、図５（ｂ）の状態の標的物質検出素子の信号を測定する工程である。前記基体に関する説明で述べたが、信号の測定とはセンサ素子から出力される電流や光の強度（信号）を測定することである。また、前記信号は単純な物理量だけでなく、その物理量が存在する場と基体の表面との距離によっても変化する。
従来のケミカルセンサにおいては、この第二工程の信号を用いて、標的物質の検出を行っていた。そのため、当該信号は、捕捉された標的物質の物理量または非特異的に吸着している夾雑物の物理量若しくはその両方によって生じる。また、前記捕捉体が標的物質との結合により構造変化する場合、前記捕捉体の物理量も変化するため、信号も生じる。これらの信号に含まれる夾雑物の物理量による信号成分は、前記標的物質の検出にとってノイズである。特に多量の夾雑物が存在するなかで、微量の標的物質を検出する時は、標的物質の物理量に比べて夾雑物による物理量が大きいため、Ｓ／Ｎ比が低下していた。
【００３２】
また、第二の工程において、信号を測定する際に光を入射する場合、後述する第三の工程で用いる光とは異なる波長の光を用いる。前記信号が電流で、外部入力が電圧である場合、電源を用い、素子に流れる電流を信号として測定することができる。また、前記信号が光である場合、ランプやレーザーなどの光源を用い、透過光、散乱光、反射光などの強度を信号として測定することができる。
【００３３】
（第三の工程）
本発明に係る第三の工程とは、たとえば、リンカー５０３に光を照射し、構造変化させることにより、図５（ｂ）の状態から図５（ｃ）の状態に変化させる工程である。この時、捕捉体５０２及び標的物質５０４と基体５０１の表面との距離または角度若しくはその両方は変化する。しかし、夾雑物５０５と基体５０１の表面との距離と角度は変化しない。
リンカー５０３の構造変化部位にアゾベンゼンを用いた場合、可視光を照射すると化学式１の構造となり、紫外光を照射すると化学式２の構造をとる。このアゾベンゼンの構造変化を用いて、リンカー５０３を構造変化させることができる。
【００３４】
（第四の工程）
本発明に係る第四の工程は、例えば、図５（ｃ）の状態の標的物質検出素子の信号を第二の工程と同様の手法で測定する工程である。
前記第三の工程で述べた通り、図５（ｃ）の状態は図５（ｂ）の状態と比較すると、捕捉体５０２及び標的物質５０４は基体５０１の表面との距離または角度若しくはその両方が変化しているが、夾雑物５０５と基体５０１の表面との距離と角度は変化していない。
したがって、リンカー５０３の構造変化の前後において、捕捉体５０２及び標的物質５０４は、基体５０１の表面との距離または角度若しくはその両方が変化したため、基体５０１で生じた信号を変化させうる。しかし、リンカー５０３の構造変化の前後において、夾雑物５０５と基体５０１の表面との距離と角度は変化していないため、夾雑物５０５の存在による基体５０１で生じた信号の変化はない。
また第二の工程と同様に、前記信号を測定する際に光を入射する場合、第三の工程で用いる光とは異なる波長の光を用いる必要がある。
【００３５】
（第五の工程）
本発明に係る第五の工程は、第二の工程で測定した信号と第四の工程で測定した信号との差分を算出する工程である。
前記第四の工程で説明したが、第二の工程で測定した信号と第四の工程で測定した信号とを比較すれば、夾雑物５０５の存在は基体５０１で生じた信号を変化させていないため、捕捉体５０２及び標的物質５０４のみが基体５０１で生じた信号を変化させていることがわかる。したがって第二の工程で測定した信号と第四の工程で測定した信号との差分を算出すると、夾雑物５０５による信号を打ち消した値を算出することができる。その結果、この値を用いて検体中に含まれる標的物質を検出し、夾雑物５０５によるノイズがない、かつ、Ｓ／Ｎ比の高い測定を行うことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
基体として電界効果トランジスタ、捕捉体としてビオチン、リンカーとして４，４’−ジアミノアゾベンゼンとマレイン酸とアミノプロプリトリメトキシシランとの複合体を用いた標的物質検出素子を例示する。
ソース領域とドレイン領域とは半導体層を介して結合しており、半導体層の表面は絶縁層によって覆われている電界効果トランジスタを基体として用いる。Ｐ型シリコン基板にフォトリソグラフィの手法を用いてソース領域とドレイン領域とにイオンを注入する。ソース領域とドレイン領域とに挟まれた半導体層、即ちフォトリソグラフィの手法を用いてチャネル領域の表面を酸化シリコン層で覆う。この電界効果トランジスタ素子を基体として用いる。
【００３８】
４，４’−ジアミノアゾベンゼンとビオチンと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとを混合して、アゾベンゼンのアミノ基とビオチンのカルボキシル基とカップリング反応させ、片側のアミノ基のみ反応した生成物を精製する。この場合、アミノ基とカルボキシル基とによって形成されるアミド結合が、捕捉体とリンカーとの結合部位になる。次にもう片方のアゾベンゼンに無水マレイン酸を混合してカップリング反応させ、捕捉体−リンカー前駆体を合成する。
基体の酸化シリコン層を１％アミノプロプリトリメトキシシラン溶液に浸し、アミノプロプリトリメトキシシランを基体に結合させる。この時、酸化シリコンの水酸基とアミノプロプリトリメトキシシランのメトキシ基とによって形成されるエーテル結合が、基体とリンカーとの結合部位となる。次に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを溶かした溶液に捕捉体−リンカー前駆体を浸し、捕捉体−リンカー前駆体と基体とを結合させ、標的物質検出素子とする。
【００３９】
（実施例２）
実施例１で作製した素子を用いて電流を信号として測定する方法を例示する。
まず、実施例１に例示した標的物質検出素子を作製し、当該標的物質検出素子のリンカーに４５０ｎｍの波長の光を照射する。光の照射によってアゾベンゼンの構造を化学式１の状態にする。
第一の工程として、標的物質検出素子の捕捉体を、夾雑物としてのアルブミンを含むアビジン溶液に浸す。この時、捕捉体がアビジンを捕捉する。また、同時に基体表面にアルブミンが非特異的に吸着する。
【００４０】
第二の工程として、ソース領域とドレイン領域とに電極を接続し、その間に電流計をつなぐ。次に半導体層に電圧をかけ、ソース−ドレイン間で流れる電流を信号として測定する。
第三の工程として、標的物質検出素子のリンカーに３５０ｎｍの波長の光を照射する。光の照射によってアゾベンゼンの構造を化学式２の状態にする。この時、ビオチンとアビジンとが基体の表面に近づく。
第四の工程として、第二の工程と同様に、ソース領域とドレイン領域とに電極を接続し、その間に電流計をつなぐ。次に半導体層に電圧をかけ、ソース−ドレイン間で流れる電流を信号として測定する。
第五の工程として、第二の工程と第四の工程とで測定した電流の差分を算出し、アビジンを検出する。この場合、既知のアビジンの量がわかっている溶液を用いて事前に検量線を作成しておくと、前記アビジンの量を定量することができる。
【００４１】
（比較例１）
実施例１と同様の方法で基体を作製する。
従来の標的物質検出素子と検出方法との例として、基体として電界効果トランジスタ、標的物質捕捉体としてアビジンを用いた方法を例示する。
前記基体の酸化シリコン層を１％アミノプロプリトリメトキシシラン溶液に浸し、アミノプロプリトリメトキシシランを基体に結合させる。次にビオチンと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとを溶かした溶液に浸し、基体と捕捉体とを結合し、標的物質検出素子とする。
【００４２】
作製した標的物質検出素子の捕捉体を、夾雑物としてのアルブミンを含むアビジン溶液に浸す。この時、捕捉体がアビジンを捕捉する。また、同時に基体表面にアルブミンが非特異的に吸着する。
ソース領域とドレイン領域とに電極を接続し、その間に電流計をつなぐ。次に半導体層に電圧をかけ、ソース−ドレイン間で流れる電流を信号として測定し、アビジンの量を定量する。
この比較例においては、アルブミンの量を変化させると電流値が変化してしまい、アビジンを定量することが不可能になる場合がある。しかし、実施例２においては、アルブミンの量を変化させても算出される値は変わらず、アビジンを定量することができる。
【００４３】
（実施例３）
基体としてプラズモン共鳴素子、捕捉体としてビオチンアビジン、リンカーとして４，４’−ジアミノアゾベンゼンとマレイン酸とを用い、前記基体を１１−アミノ−１−ウンデカチオールとの複合体を用いた例を例示する。
石英基板上に膜厚２０ｎｍ、２００ｎｍ×２００ｎｍの金の構造体を２５０ｎｍの間隔で正方配列でパターニングした基板フォトリソグラフィの手法を用いて作製し、これを基体として用いる。
【００４４】
前記基体を１１−アミノ−１−ウンデカチオール溶液に浸し、１１−アミノ−１−ウンデカチオールを基体に結合させる。この時、金と１１−アミノ−１−ウンデカチオールのチオール基によって形成されるチオエーテル結合が、基体とリンカーとの結合部位となる。次に実施例１と同様の捕捉体−リンカー前駆体を作製し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと共に溶かした溶液に基体を浸し、捕捉体−リンカー前駆体と基体を結合させ、標的物質検出素子とする。
【００４５】
（実施例４）
実施例３で作製した素子を用いて光を信号として測定する方法を例示する。
まず、実施例１に例示した標的物質検出素子を作製し、標的物質検出素子のリンカーに４５０ｎｍの波長の光を照射する。光の照射によってアゾベンゼンの構造を化学式１の状態にする。
第一の工程として、標的物質検出素子の捕捉体を、夾雑物としてのアルブミンを含むアビジン溶液に浸す。この時、捕捉体がアビジンを捕捉する。また、同時に基体表面にアルブミンが非特異的に吸着する。
第二の工程として、８００ｎｍから１０００ｎｍの波長の光を基体に照射し、透過してきた光の強度を測定することにより、吸光度スペクトルを測定する。さらに吸光度スペクトルの極大波長を求め、信号とする。
【００４６】
第三の工程として、標的物質検出素子のリンカーに３５０ｎｍの波長の光を照射する。光の照射によってアゾベンゼンの構造を化学式２の状態にする。この時、ビオチンとアビジンが基体表面に近づく。
第四の工程として、第二の工程と同様に、８００ｎｍから１０００ｎｍの波長の光を基体に照射し、透過してきた光の強度を測定することにより、吸光度スペクトルを測定する。さらに吸光度スペクトルの極大吸収波長を求め、信号とする。
第五の工程として、第二の工程と第四の工程とで求めた極大波長の差分を算出し、アビジンを検出する。この場合、既知のアビジンの量がわかっている溶液を用いて検量線を事前に作成しておくと、前記アビジンの量を定量することができる。
本実施例のように第二の工程と第四の工程とで光を入射して信号を測定する際は、リンカーが構造変化を起す光の波長を用いないことが好ましい。
【００４７】
（比較例２）
実施例３と同様の方法で基体を作製する。
従来の標的物質検出素子と検出方法の例として、基体としてプラズモン共鳴素子、捕捉体としてビオチンを用いた方法を例示する。
基体を１１−アミノ−１−ウンデカチオール溶液に浸し、１１−アミノ−１−ウンデカチオールを基体に結合させる。次にビオチンと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと共に溶かした溶液に基体を浸し、基体と捕捉体を結合し、標的物質検出素子とする。
【００４８】
作製した標的物質検出素子の捕捉体を、夾雑物としてアルブミンを含むアビジン溶液に浸す。この時、捕捉体がアビジンを捕捉する。また、同時に基体表面にアルブミンが非特異的に吸着する。
８００ｎｍから１０００ｎｍの波長の光を基体に照射し、透過してきた光の強度を測定することにより、吸光度スペクトルを測定する。さらに吸光度スペクトルの極大波長を求め、信号とする。
この比較例においては、アルブミンの量を変化させると極大吸収波長が変化してしまい、アビジンを定量することが不可能になる場合がある。しかし、実施例４においては、アルブミンの量を変化させても算出される値は変わらず、アビジンを定量することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明に開示される標的物質検出方法と標的物質検出素子と、及び本発明に基づいて開発されうる標的物質検出装置は医療、食品検査、環境検査などの検体中に含まれる特定物質を検出する場合において有効である。本発明を用いれば、夾雑物が含まれている検体においても精製などの工程を経ずに標的物質の検出が可能である。
【符号の説明】
【００５０】
１０１ 半導体層
１０２ ソース領域
１０３ ドレイン領域
１０４ 基板
４０６ 構造変化する部位
５０１ 基体
５０２ 捕捉体
５０３ リンカー
５０４ 標的物質
５０５ 検体中の夾雑物
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体の表面に捕捉体がリンカーを介して固定化された標的物質検出素子であって、前記リンカーが光照射によって構造変化することと、前記基体はその近傍の物理量に応じて信号を出力するセンサ素子であることと、前記センサ素子は、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて前記信号が連続的に変化することを特徴とする標的物質検出素子。
【請求項２】
前記センサ素子が電界効果トランジスタまたはプラズモン共鳴素子である請求項１に記載の標的物質検出素子。
【請求項３】
前記リンカーがアゾベンゼン誘導体を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の標的物質検出素子。
【請求項４】
検体中の標的物質検出方法であって、
請求項１乃至３の何れかに記載された標的物質検出素子に検体を接触させ、前記検体中の標的物質を前記標的物質検出素子にある捕捉体に捕捉せしめる第一の工程と、
前記標的物質検出素子からの信号を測定する第二の工程と、
前記リンカーに光を照射する第三の工程と、
前記標的物質検出素子からの信号を測定する第四の工程と、
前記第二工程で得られた信号と前記第四工程で得られた信号との差分を算出する第五の工程とを含むことを特徴とする標的物質検出方法。
【請求項１】
基体の表面に捕捉体がリンカーを介して固定化された標的物質検出素子であって、前記リンカーが光照射によって構造変化することと、前記基体はその近傍の物理量に応じて信号を出力するセンサ素子であることと、前記センサ素子は、前記物理量が存在する場と前記基体の表面との距離に応じて前記信号が連続的に変化することを特徴とする標的物質検出素子。
【請求項２】
前記センサ素子が電界効果トランジスタまたはプラズモン共鳴素子である請求項１に記載の標的物質検出素子。
【請求項３】
前記リンカーがアゾベンゼン誘導体を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の標的物質検出素子。
【請求項４】
検体中の標的物質検出方法であって、
請求項１乃至３の何れかに記載された標的物質検出素子に検体を接触させ、前記検体中の標的物質を前記標的物質検出素子にある捕捉体に捕捉せしめる第一の工程と、
前記標的物質検出素子からの信号を測定する第二の工程と、
前記リンカーに光を照射する第三の工程と、
前記標的物質検出素子からの信号を測定する第四の工程と、
前記第二工程で得られた信号と前記第四工程で得られた信号との差分を算出する第五の工程とを含むことを特徴とする標的物質検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−１８０１０８（Ｐ２０１１−１８０１０８Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４７５６７（Ｐ２０１０−４７５６７）
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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