標的細菌またはその標的糖質抗原成分の存在を検出する方法
【課題】糖質抗原を有することにより特徴付けられる細菌によって引き起こされる細菌感染の、感受性および特異性の高い、迅速および正確な診断方法を提供する。
【解決手段】以下の段階を含む液体試料中におけるインフルエンザ菌の検出方法：（ａ）液体試料を多孔性試験用細片に加える段階；ここで前記細片は流体流路を形成し、（ｂ）前記試料を、試験用細片の流路に沿って横方向に流す段階；及び（ｃ）液体試料中のインフルエンザ菌の標的糖質抗原の存在下で、インフルエンザ菌の存在を示唆する抗原に結合された結合剤の一つを含む複合体と結合する段階。
【解決手段】以下の段階を含む液体試料中におけるインフルエンザ菌の検出方法：（ａ）液体試料を多孔性試験用細片に加える段階；ここで前記細片は流体流路を形成し、（ｂ）前記試料を、試験用細片の流路に沿って横方向に流す段階；及び（ｃ）液体試料中のインフルエンザ菌の標的糖質抗原の存在下で、インフルエンザ菌の存在を示唆する抗原に結合された結合剤の一つを含む複合体と結合する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の詳細な説明）
本出願は、本出願の全てにおいて割り当てられた権利を有するバイナックス（Ｂｉｎａｘ，Ｉｎｃ）社にその全てが割り当てられた、以下の米国特許出願の各々の一部継続出願である。
（１）１９９８年８月２５日に出願された、米国特許出願第０９／１３９，７２０号
（２）その一部継続出願を優先して現在放棄されている、１９９８年９月１６日に出願された、米国特許出願第０９／１５６，４８６号、
（３）１９９９年９月１６日に出願された、米国特許出願第０９／３９７，１１０号、
（４）米国特許出願第０９／１３９，７２０号の一部継続出願として１９９９年１２月１０日に出願された、米国特許出願第０９／４５８，９９８号。
【背景技術】
【０００２】
発明の序論
本発明は、糖質抗原を有することにより特徴付けられる細菌によって引き起こされる細菌感染の、感受性および特異性の高い、迅速および正確な診断を達成することに関連する。特に、本発明は、そのような糖質抗原を本質的にタンパク質を含まない状態にまで初期精製し、続いてそのように精製された各糖質抗原を、該抗原に対する未処理の多価抗体をアフィニティー精製するために使用し、そのように精製された該抗体を、元の細菌の存在を検出するために、正確性、特異性および感受性の高い診断試験において使用することに関わる。
【０００３】
本発明は、グラム染色に陽性または陰性であり得る、糖質抗原を有する細菌に適用できる。本発明に従って生産される精製抗体は、市販のモノクローナル抗体と少なくとも同じ程度の特異性および感受性をもつものであり、多くのそのようなモノクローナル抗体よりも生産および取り扱いが容易である。それらは、扱いにくい方法論を用いて、これまでは迅速および正確に同定することが困難であったため、それらが引き起こす細菌性疾患の診断が得られるのがしばしば遅れかつ難しかったような細菌を同定するため、例えばＩＣＴ免疫学的検定法による、迅速な診断試験のための広い機会を提供する。
【０００４】
上記に同定された各親出願は、その開示が本質的に、参照として本明細書に組み入れられる３つの出願に含まれる、その一部継続出願の米国特許出願第０９／３９７，１１０号の中に完全に示されている、現在放棄されている米国特許出願第０９／１５６，４８６号を例外として、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００５】
発明の背景
グラム陰性菌は、少なくとも１つのリポ多糖抗原または他のリポポリ糖質抗原を共通にもつ一方、グラム陽性菌は、リポテイコ酸またはテイコ酸またはそのいずれかの誘導体である、少なくとも１つの糖質抗原をもつ共通の特徴があることが知られている。グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両者の幾つかはまた、莢膜抗原である糖質抗原をも有する。即ち、これらの抗原は各々、その天然の状態において厚い莢膜層に封入されている。この莢膜層は、ほとんどの細菌の細菌細胞壁を取り囲む粘液様の物質を構成する。
【０００６】
その全容を参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／１３９，７２０号では、その全てがグラム陽性であるレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種の細菌のリポ糖質抗原を、本質的にタンパク質を含まない状態にまで精製することについて説明している。そこでは、限定はしないが、本質的にタンパク質を含まない状態まで精製することについて詳細を説明しているレジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１のＯ−多糖抗原を含む、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）各血清型の糖質抗原の精製について強調されている。
【０００７】
本出願は、レジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１（この血清型が、レジオネラ属が原因で生じる肺炎様疾患の約７０％の病原生物であることが知られている）の、本質的にタンパク質を含まないＯ−糖質抗原が、説明されるようにアフィニティーカラムに（スペーサー分子によって）結合され、未精製の抗原に対する未処理のポリクローナル抗体が説明されるようにカラムに通され、その結果生じる精製抗体は抗原特異性が高く、レジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１により引き起こされる疾患をもつ患者から得た体液中に同じ抗原が存在する場合、それを容易に同定することを示す。この診断のためには尿が好ましい体液であることが示される。なぜならば：
（１）レジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１抗原は、疾患状態の早期に尿中に現れ、適切な治療を開始した後でさえも数日間残存する；
（２）試験用試料の採集は非侵襲的かつ簡単であり、患者には最小限の負担を生じ、および特別に訓練を受けた職員または特別に設計された機器を必要としない；および
（３）例えば痰由来の試料は、試料を得ることまたは培養することの困難、患者の鼻または咽喉において慢性的に存在するが、疾患の原因ではない細菌コロニーの潜在的な存在、および他の同様な困難によって、偽陰性または偽陽性の結果を与える可能性があるからである。
【０００８】
尿中に存在するレジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１ 細菌は死んでおり、腎臓を通過しているため、少なくとも部分的にその細胞壁が破壊されている；ゆえに、抗原は、ＩＣＴ試験用細片上の２つの区域に沈積された抗原特異的な抗体が容易に近づき得る状態にある。
【０００９】
水溶性培地からなる環境的試料中の生きた細菌の、全部、およびある程度までの同定における、米国特許出願第０９／１３９，７２０号にて説明された抗原特異的な抗体の有効性は、特異性および感受性の高い酵素免疫学的検定法について説明される、同様に参照として本明細書に組み入れられる一部継続出願である米国特許出願第０９／４５８，９８８号においてさらに示される。本アッセイ法は、親出願において詳細を説明されるように、未処理のポリクローナル抗体の精製によって得られた抗原特異的な抗体を、抗原についての検出試薬として使用することに基づく。そのように精製された抗体の感受性および特異性は、酵素免疫学的検定法により有益な結果を生じた時間の短さによって、並びに長いインキュベーション時間（１時間）によるものと等しく有益な時間結果を与えた抗原特異的な抗体の濃度の低さ（試験毎に０．０５μｇ）によって、部分的に示される。
【００１０】
同様に参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／３９７，１１０号は、全ての肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の肺炎球菌の細胞壁において存在するＣ−多糖細胞壁抗原を、本質的にタンパク質を含まない状態まで精製することについて説明する。この抗原は、テイコ酸由来のホスホコリンを含む多糖である。肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の菌株は全てグラム染色陽性である。
【００１１】
本質的にタンパク質を含まない抗原（その重量パーセントで約１０％未満を含む）を、スペーサー分子に共有結合し、それを次にアフィニティーカラムに共有結合し、そのように調製されたカラムをその後、肺炎連鎖球菌に対する未処理のポリクローナル抗体を精製するために使用する。その結果生じる抗原特異的な精製抗体は、特に尿を含む体液中の肺炎連鎖球菌を同定するためのＩＣＴ試験において、高い感受性および特異性を示した。
【００１２】
探索される特異的な細菌の存在を調べる、ＥＬＩＳＡ法、対向免疫電気泳動および／またはラテックス凝集試験を含む種々の試験において、下気道の疾患の原因であると考えられる様々な感染性のグラム陰性菌またはグラム陽性菌の糖質抗原に対する未処理の多価抗体、またはそのような抗原に対するモノクローナル抗体を使用するために、数多の様々な取組みが過去になされてきた。試験の幾つかはある場合においては有用であったが、それらのいずれも、細胞培養試験に依存せずに用いるのに臨床的に十分許容できる信頼性をこれまでは得なかった。細胞培養試験の欠点およびそれらのあいまいな信頼性については当技術分野において広く報告されており、親出願である米国特許出願第０９／１３９，７２０号および同第０９／３９７，１１０号において議論されている。
【００１３】
親出願である米国特許出願第０９／１３９，７２０号にて最初に説明されたレジオネラ・ニューモフィラ菌血清群１のＩＣＴ試験、および、親出願である米国特許出願第０９／３９７，１１０号およびその親出願の米国特許出願第０９／１５６，７８６号の主題である、肺炎連鎖球菌のＩＣＴ試験について、米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）の承認を得るため、これらの出願の受託者であるバイナックス社（Ｂｉｎａｘ， Ｉｎｃ）には、各々についての大規模臨床試験を実施することが必要であった。これらの臨床試験の多くは、参照として本明細書に組み入れられる２つの親出願において説明されている。臨床試験についての重要な点の１つは、ＦＤＡの規制により、診断試験が既知の試験からの、および商業的な使用において、実質的な科学的および技術的発展を示すと認められる場合にのみ、診断試験の大規模臨床試験を要求されるということである。これら２つの試験の各々の感受性および特異性は、親出願において示されるものよりはるかに高いと考えられる。その理由は、示される数値は、これらの臨床試験結果を、以前から使用可能であった異なるアッセイ法または同定技術（細胞培養試験等）を用いて、同じ臨床試料について平行して得られる結果と比較することに基づいており、過去に使用可能であった試験法は、それらが関連細菌またはその抗原成分の検出のために使用可能な最良の同定法であると考えられていた場合でさえ、信頼性があいまいであることが知られていたからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願第０９／３９７，１１０号
【特許文献２】米国特許出願第０９／１５６，４８６号
【特許文献３】米国特許出願第０９／１３９，７２０号
【特許文献４】米国特許出願第０９／４５８，９８８号
【特許文献５】米国特許出願第０９／１５６，７８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
要するに本発明は、対応する細菌に感染した患者のヒト体液、特に尿に抗原が現れる、糖質抗原を有する広域スペクトルの細菌について、特異性および感受性の高い、迅速な診断試験を提供する機会を与える。
【００１６】
発明の簡単な説明
本発明は、液体、特にヒトまたは他の哺乳動物の体液、および特に尿中の、細菌の糖質抗原の存在を検出するための、特別に精製された、抗原特異性の高い新規の抗体に関する。
【００１７】
これらの抗体は、標的糖質抗原に対する未処理の多価抗体から、以下を含む方法によって調製される：
（ａ）本質的にタンパク質を含まない抗原、即ち、約１０パーセントを超えないタンパク質を含む抗原を得るため、未処理の標的抗原を精製する段階、
（ｂ）そのように精製された抗原を、共有結合によってスペーサー分子に結合する段階、
（ｃ）スペーサー分子の遊離末端を、クロマトグラフィーカラムに充填したアフィニティーゲルに共有結合する段階、
（ｄ）未処理の抗原に対する未処理の多価抗体を、カラムのゲルに通す段階、および
（ｅ）精製抗体を溶出する段階。
【００１８】
アフィニティーゲルから溶出された精製抗体は、特異性、感受性および正確性が高く、液体媒質、特に哺乳動物の体液、および特に尿において未処理の標的抗原を検出するために、特定的に開発された様々な免疫学的検定法の任意のものにおいて使用できる。
【００１９】
レジオネラ属の細菌のポリ糖質抗原、および特にレジオネラ・ニューモフィラ菌血清群１のＯ−多糖抗原を検出するための好ましいＩＣＴ法は、親出願の米国特許出願第０９／１３９，７２０号において説明されている一方、米国特許出願第０９／１５６，４８６号、および同第０９／３９７，１１０号では、肺炎連鎖球菌の全ての血清型に存在するＣ−多糖細胞壁抗原を検出するための、類似した好ましいＩＣＴ法について説明している。
【００２０】
インフルエンザｂ型菌の莢膜多糖抗原を検出するための同様のＩＣＴ法については、本明細書において詳細を説明される。
【００２１】
グラム陰性菌において典型的に認められるリポポリ糖質抗原、グラム陽性菌において典型的に認められるリポテイコ酸もしくはテイコ酸またはその誘導体を含む抗原、およびグラム陽性型およびグラム陰性型の両方の、多くの細菌の細胞壁を取り囲む厚い粘液様莢膜において頻繁に認められる莢膜ポリ糖質抗原を、本節の第二段落において説明される、糖質抗原に対する未処理のポリクローナル抗体を精製するための図式に従って得られるような、抗原特異的な抗体を検出試薬として用いる、迅速かつ特異性および感受性の高いＩＣＴ型の免疫学的検定法によって全て検出できるということは、これまでは認められていなかった。細菌の糖質抗原に対する未処理の多価抗体を、本質的にタンパク質を含まない、精製した標的細菌の糖質抗原を用いたアフィニティー精製を受けさせることによって、抗原特異性および感受性の高いものに変えられるという事実もまた、これまでは評価されていなかった。同様に、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方に由来する、および／または両型の細菌を取り囲む莢膜層に由来する糖質抗原を全て精製でき、抗原特異的な抗体を得るため、そのような抗原に対する抗体のアフィニティー精製に使用できるという事実は、これまでは認められておらず、そのような抗原特異的な抗体を検出試薬として使用して、細菌の糖質抗原が高い正確性、感受性および特異性をもって迅速に検出できることは評価されていなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１およびその関連図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、本発明に従って細菌の糖質抗原についてのアッセイ法を実施する際に好ましい型の、典型的なＩＣＴ装置を示す。
【図１Ａ】図１Ａは、本発明に従って細菌の糖質抗原についてのアッセイ法を実施する際に好ましい型の、典型的なＩＣＴ装置を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明に従って細菌の糖質抗原についてのアッセイ法を実施する際に好ましい型の、典型的なＩＣＴ装置を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明に従って細菌の糖質抗原についてのアッセイ法を実施する際に好ましい型の、典型的なＩＣＴ装置を示す。
【図２】図２は、グラフであり、図２では本発明の抗原特異的な精製抗体が、その抗体を生じさせたインフルエンザｂ型菌以外の血清型を検出する検出能を示すグラフである。
【図３】図３は、インフルエンザｂ型菌の抗原特異的な精製抗体が、インフルエンザ菌ａ型、ｃ型、ｄ型もしくはｆ型の抗原に対しては、交叉反応性がなかったことを示している。
【図４】図４は、インフルエンザｂ型菌の抗原特異的な精製抗体が、非典型的なインフルエンザ菌ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ３もしくはＮＴ４の任意のもの、またはパラインフルエンザ菌（Ｈ． ｐａｒａ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対しては、交叉反応性がなかったことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、細菌感染の検出法における著しい進歩を示すものである。
【００２４】
既知の全ての型の細菌の糖質抗原、即ち、リポ多糖類、抗原性リポテイコ酸およびテイコ酸およびそれらの抗原性誘導体を含むリポポリ糖質抗原、および多糖類を含む莢膜ポリ糖質抗原を、哺乳動物の体液において検出することに適用できるため、およびこれまで考えられなかった、細菌感染の検出への一体化したアプローチを表すため、本発明により、疾患状態において患者の体液中に現れる糖質抗原を細菌が有する場合には、実質的に、その細菌が原因となる任意の疾患の迅速な診断を可能にすることが期待できる。
【００２５】
特に重要なのは、本発明が、特定の細菌によって引き起こされる疾患がある群内において、例えば学校または老人センターの中のような小さい限られた群、または例えば町、市もしくはさらに大きな地域のような広範な集団のいずれかにおいて、流行していると考えられる状況において、迅速な診断および適切な治療の迅速な導入を与える機会である。
【００２６】
概して、本発明の好ましい免疫クロマトグラフィー法（「ＩＣＴ」）アッセイ法は、当技術分野において開示されている任意の既知の使い捨てＩＣＴ装置において実行されるように設計および構成できる。それは好ましくは、ヒト呼吸器系疾患の診断を含む使用分野の広い領域において、その全てがスミス−クライン・ダイアグノスティックス社（Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）に委託されるがバイナックス社（Ｂｉｎａｘ，Ｉｎｃ）に独占的に認可される（本出願の割り当てられた権利を与えられる）、同時係属中のハワード・チャンドラー（Ｈｏｗａｒｄ Ｃｈａｎｄｌｅｒ）の米国特許出願第０７／７０６，６３９号、またはその一部継続出願の１つにおいて開示される型のＩＣＴ装置を用いて、実行されるように設計され、かつ実行される。
【００２７】
好ましい装置は、そのある区域において、疾患の原因と疑われる細菌の標的糖質抗原に対する抗原特異性の高い、アフィニティー精製した抗体を適切に充填される。標識した抗原特異的な抗体を、装置の別の部分に装填する。最初に、細菌を含むと疑われる試験用試料を標識した抗原特異的抗体と接触させ、その後、それらを共に、結合した抗原特異的な非標識抗体を含む装置の部分に流し、疑われる細菌に固有の標的抗原が試料中に存在する場合、既に形成された標識抗体：標的糖質抗原の結合体は、固定化した抗原特異的な非標識抗体との接触によって結合し、見た目に明らかな呈色反応が生じる。標識は、標識抗体：抗原複合体が結合した非標識抗体と反応する際に目に見える呈色を生じさせるような、当技術分野において既知の任意の物質であってもよい。そのような標識は、細かく分割された様々な金属、様々な有機分子、および他の呈色分子と酵素の組み合わせのような、様々な分子の組み合わせを含む。本発明においては、金コロイド粒子が好ましい標識となる。
【００２８】
試料捕捉ラインにおいて、試験用試料を接触させた際に、試験用試料に存在する抗原が抗原特異的な標識抗体に捕捉されること、および、抗原特異的な標識抗体：抗原結合体が、結合した抗体によって容易に捕捉および保持されることを確実にする、十分な反応が起こるような、試験装置の２つの部位の各々にて存在する抗原特異的な抗体の濃度が、好ましい試験装置の設計においては非常に重要である。本発明に関連して行われた実験的研究により、標的糖質抗原に対して活性のある抗原特異的な抗体は、抗原：抗体反応が起こる試験装置の各部位において、表面積当たり７．７ｎｇ／ｍｍ２〜３８５ｎｇ／ｍｍ２の間の濃度で存在しなければならないことが示された。反応を生じさせる部位において、７．７ｎｇ／ｍｍ２より低い抗原特異的な抗体濃度が存在する場合、偽陰性の結果が生じる可能性が高い。
【００２９】
当技術分野において既知のように、感染性細菌はしばしば複数の抗原成分を有する。例えば、肺炎連鎖球菌は、親出願である米国特許出願第０９／１５６，４８６号および同第０９／３９７，１１０号において説明されたアッセイ法の標的である多糖細胞壁抗原に加えて、莢膜抗原をもつことが知られている。後者の抗原は、抗原が肺炎連鎖球菌の全ての既知の血清型に存在するため、かつ本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／３９７，１１０号にて説明されるように、その比較的低い交叉反応が、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる感染を他の感染から迅速に臨床的に識別させる性質のものであるため、これらの出願にて説明された、現在ＦＤＡの認可されている試験のための標的抗原として選択された。体液中の肺炎連鎖球菌を検出するための、以前に公表された試みでは、最良でも、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方を用いて６０〜７０％の範囲、つまり信頼性の高い診断のためには許容できない範囲の感受性および特異性をもつ系しか与えられなかったことが注目される。
【００３０】
各々説明され、かつＦＤＡに承認を受けた、レジオネラ・ニューモフィラ菌血清群１および肺炎連鎖球菌についてのＩＣＴ試験を用いた、進行中の臨床研究において、標的糖質抗原が都合良く検出されることが示された哺乳動物の体液には、好ましい尿に加え、痰、鼻咽頭滲出液、中耳液および脳脊髄液がある。これらの試験により、糖質標的抗原が存在する場合にそれが検出される、その他の体液には、血液および気管支液が含まれる。
【００３１】
任意の特定の細菌についての標的糖質抗原の選択は、それがある細菌の菌株の全てまたはほとんどの血清型に存在することが知られているかどうか、もし特定の血清型に特有な場合は、その血清型がその細菌によって引き起こされる疾患の最も一般的な原因であることが分かっているかどうか、および同様の問題点について、その抗原の交叉反応特性を考慮することに必然的に基づく。
【００３２】
本発明は、既に言及された型の糖質抗原、即ち、リポポリ糖質抗原、リポテイコ酸またはテイコ酸およびそのいずれかの誘導体を含む抗原、および莢膜糖質抗原の、１つまたはそれ以上をもつ任意の細菌によって引き起こされる細菌感染の、迅速な診断に関して独特の潜在能力を提供する。細菌のうち、その糖質標的抗原が本発明の範囲内であると考えられるものは、様々な型のインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｅｉｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、モラクセラ カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂ群連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）のその他の種、特定的に名前を挙げられていないクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ガードネレラ ワギナーリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、レイ菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、特定的に名前を挙げられていないプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）およびリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の様々な他の種、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）の様々な種、および説明される型の１つまたはそれ以上の糖質抗原をもつ、特定的に名前を挙げられていないあらゆる他の細菌種および菌株である。
【００３３】
本発明の技術により精製されるポリクローナル抗体は、例えばウサギまたはヤギのような動物個体に、目的とするアッセイ法の粗製標的抗原を注射することによる、従来法によって得られる。好ましくは抗原調製物は、動物個体への注射の前に加熱処理し、細胞を殺す。適切な時間経過を経た後、望ましい抗体を含む血清を得るため、動物個体から採血し、続いて抗体を精製する。この血清は、ＩｇＧ粗精製分画を生じるために、例えば硫酸アンモニウムまたはイオン交換樹脂を用いた中間精製段階を経ることができる、または直接精製することができる。
【００３４】
アフィニティー精製のため、動物個体を免疫化するために使用したものと同じ粗製標的糖質抗原を培養において増殖させ、その後本質的にタンパク質を含まない状態になるまで適切に精製する。本明細書において使用されるような「本質的にタンパク質を含まない状態」という表現は、約１０％（重量パーセント）を超えない、および好ましくはそれ未満のタンパク質を含む状態を意味する。
【００３５】
本質的にタンパク質を含まない状態になるまで抗原を精製した後、それをスペーサー分子に共有結合により結合させる。適したスペーサー分子の例には、ヒドラジン、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、ＢＳＡおよびヒドラジンの結合体、および、アフィニティーゲルに共有結合できるもう一方の反応性末端を維持しながら、ある末端において精製糖質抗原に共有結合できる同様の分子が含まれる。
【００３６】
精製糖質抗原：スペーサー分子結合体は、次にアフィニティーゲルに連結され、ゲルは、事前に免疫化した動物個体からの採血によって得られる血清中の未処理の多価抗体、またはそのＩｇＧ粗精製分画の精製に使用される。未処理の抗体（またはそのＩｇＧ粗精製分画）は、アフィニティーゲルに複数回流され、精製された、抗原特異性の高い抗体としてそこから溶出される。
【００３７】
以下の実施例は、その精製に用いられる莢膜糖質抗原の予備的分離および精製を含む、インフルエンザｂ型菌に対する抗体のアフィニティー精製の好ましい仕方を示す。これらの分離および精製の段階を達成するための多くの方法は、文献において知られており、本明細書において述べられるように、得られる精製抗原が本質的にタンパク質を含まない限り、本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書において説明されるものに置き換えられる。
【００３８】
実施例１−標的糖質抗原の培養のための培養条件
インフルエンザｂ型菌（ＡＴＣＣ番号＃１０２１１）を、栄養分を補足したミュラーヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ）ブロスにおいて、３７℃、５％ＣＯ２にて、撹拌せずに２４時間増殖させた。
【００３９】
１Ｌ当たりのブロス組成は以下のようであった：
カゼインの酸水解物 １７．５ｇ
ウシ心臓抽出物 ３．０ｇ
デンプン １．５ｇ
以下のような栄養分も含まれた：
ヘマチン １５ｍｇ／ｍｌ
ＮＡＤ（ニコチンアデニンジヌクレオチド）１５ｍｇ／ｍｌ
酵母抽出物 ５ｍｇ／ｍｌ
本混合物のｐＨは、２５℃にて測定して７．３±０．１であった。
【００４０】
実施例２−糖質抗原の精製
２４時間後、１．８２ｇの臭化セチルトリメチルアンモニウムＣＡＳ＃５７−０９−０を３０ｍｌの蒸留水中で溶解し、５００ｍｌのブロスの上清に溶液を加え、最終濃度０．０１Ｍの臭化セチルトリメチルアンモニウムを生じた。氷浴において撹拌しながら混合物を１時間インキュベートし、４℃において一晩インキュベートした。
【００４１】
実施例１により得られた混合物を、１２，０００ｒｐｍおよび４℃にて２０分間遠心分離し、ペレットおよび上清を得た。双方を以下のように各々採集および処理した：（１）０．５ＭのＮａＣｌにペレットを超音波で破砕しながら再懸濁し、その後４℃、再懸濁液の１０倍量のエタノールにおいて滴下沈降を行った。その結果得られた溶液を、４℃にて一晩保存し、沈降させた。
【００４２】
溶液をその後、１２，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心分離した。ペレットを蒸留水に溶解し、その後３，５００の分子量カットオフ値をもつ透析チューブにおいて、蒸留水に対して透析した。
【００４３】
（２）実施例１の混合物から得た上清を４℃において一晩保存し、その後沈降物が形成されたことを記録した。これを保持する容器の内容物の全てを１２，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。ペレットを回収し、０．５ＭのＮａＣｌに超音波で破砕しながら再懸濁した。その結果得られた溶液を、４℃、再懸濁液の１０倍量のエタノールにおいて滴下沈降した。溶液を４℃にて一晩保存し、沈降物を再度形成させた。溶液および沈降物を１２，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、ペレットを回収した。蒸留水にペレットを溶解し、３，５００の分子量カットオフ値をもつ透析チューブにおいて蒸留水に対して透析した。
【００４４】
その後、上記の（１）および（２）からの、透析した溶液をプールし、凍結乾燥した。９０ｍｇのインフルエンザｂ型菌多糖抗原が得られた。
【００４５】
５．３μｇ／ｍｌの濃度のこの抗原の溶液を調製し、タンパク質についてローリー法を行い、５％（重量パーセント）のタンパク質を含むことが認められた。溶液はまた、フェノール−硫酸法によって糖質について試験し、３６％（重量パーセント）を含むことが認められた。ＥＬＩＳＡ法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ−免疫ブロット法の両方により、活性について溶液を試験し、必要な活性をもつことが認められた。
【００４６】
実施例３−アフィニティーカラムの調製
５ｍｇの凍結乾燥したインフルエンザｂ型菌多糖抗原を、４．５２ｍｌの蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを５〜６に調整した；ｐＨ ５〜６、１５．６４ｍｇのウシ血清アルブミン−ヒドラジン結合体をその後加え、続いて３分間混合した。
【００４７】
２．６μｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（「ＥＤＡＣ」）を、１００μｌの蒸留水中に溶解した。５０μｌのこの溶液を、抗原／ＢＳＡ−ヒドラジン結合体溶液に加え、続いて３分間混合した。ＥＤＡＣ平衡溶液をその後この混合物に加え、続いて室温にて２時間混合した。その後ＮａＯＨを用いてｐＨを８に調整し、室温にて１時間混合し、引き続き４℃において一晩保存した。
【００４８】
翌日、保存した混合物のｐＨをＨＣｌを用いて７に調整し、一部をＥＬＩＳＡ試験に供し、その活性を確認した。
【００４９】
２．１２ｍｇのＥＤＡＣ処理した抗原／ＢＳＡヒドラジン結合体を、２．４ｇの洗浄したＳｐｈｅｒｉｌｏｓｅ（商標）ゲルと混合し、その結果生じた混合物を室温にて２時間、上から下まで混合する条件下でインキュベートした。３３．６ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムをその後、４８０μｌの溶解水にて溶解し、この溶液の半分を、抗原／ＢＳＡヒドラジン結合体／Ｓｐｈｅｒｉｌｏｓｅ（商標）ゲル混合物に加えた。その結果生じた混合物を、室温にて３．５時間、上から下まで混合する条件下でインキュベートした。結合した抗原／ＢＳＡヒドラジン／Ｓｐｈｅｒｉｌｏｓｅ（商標）ゲルを分離し、２０倍量の蒸留水で洗浄し、続いてｐＨ ７、４．８ｍｌの０．２Ｍ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌブロック緩衝液において再懸濁した。上述のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液の残りの２４０μｌを懸濁液に加え、この混合物を室温にて１時間、その後４℃にて一晩、上から下まで混合する条件下で通してインキュベートした。
【００５０】
結合し、ブロックされたゲルを分離し、続いて擬似抗体の精製を模倣するために、２０〜３０倍量の蒸留水、ｐＨ ７．２の３倍強リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ ９．２の標準強リン酸緩衝生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水に溶解したｐＨ ７．５の３Ｍ チオシアン酸ナトリウムで洗浄し、アフィニティーカラムに充填した。
【００５１】
実施例４−インフルエンザｂ型菌抗体の精製
ウサギ−α−インフルエンザｂ型菌血清に対し、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌ となるまでＮａＣｌを加え、血清中に溶解した。混合物を５，０００×Ｇにて２０分間遠心分離し、脱脂綿を通してろ過した。実施例３より得られたアフィニティーゲルを標準強のリン酸緩衝生理食塩水を用いて平衡化し、このゲルに血清ろ過物を４回アプライした。その後ゲルを３倍強のリン酸緩衝生理食塩水、続いて標準強のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、結合していない血清成分を除去した。
【００５２】
その後、リン酸緩衝生理食塩水に溶解した３Ｍのチオシアン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．５）、続いて蒸留水に溶解した３Ｍのチオシアン酸ナトリウム（ｐＨ ５〜６）を用いて、抗体をゲルから溶出した。回収された精製抗体を、ｐＨ ７．２の標準強リン酸緩衝生理食塩水において透析した。
【００５３】
実施例５−インフルエンザｂ型菌についてのＩＣＴアッセイ法
Ａ．試験装置の準備
試験結果および対照結果の両方を見ることができる観察窓を備えた、蝶番のついた厚紙の構造物を含む試験装置を、図１にて示されるように用意した。装置には、その右側部分に、試料で湿らせたスワブを受け取るために、事前に形成されたプラスチックのスワブウェルが置かれる凹所がある（図面においては１と称される）。図１Ａにて示される上部ラベルをその後、装置の右側部分の全体に被せ置く。上部ラベルには２つの穴が備えられ、下の穴（図１ＡにおいてはＢと示される）には、浸されたスワブが挿入され、上の穴（図１ＡにおいてはＡと示される）には、穴Ｂへのその挿入後にスワブが押し込まれる。穴ＡおよびＢをもつ上部ラベルの配置およびスワブウェルにより、アッセイの間中スワブは適切な位置に保持され、吸収された試験用試料液のスワブからの排出が促進される。
【００５４】
下記に説明される、事前に組み立てた試験用細片（図１においてはＣと示される）を、左側部分にある凹所（図１においては２と示される）に挿入し、その底部に塗られた接着剤により、決まった場所に保持する。図１Ｂに示される上部ラベルは左側部分の上に置く。それには、アッセイ法の実行のために装置が閉じられる際には右側部分の穴Ａに一致するような、１つの穴（図１ＢにおいてはＤと示される）が開けられている。
【００５５】
組み立てられた装置を、乾燥剤を入れて密封した袋において、使用するまで保管する。袋を密封し保管する前に、装置の右半分の外側の縁に弱い粘着テープを配置する。
【００５６】
Ｂ．試験用細片の調製および構成
図１Ｃにて示されるように、アッセイのための試験用細片は、金の粒子およびアフィニティー精製したウサギ抗インフルエンザ菌Ｂ抗体の結合体を充填した、吸収性材料のパッドからなる。使用においては、この結合体は、液体の試験用試料と接触させることにより、流動可能なように変えられる。金結合体と反応させた試料についての捕捉ラインが、アフィニティー精製したウサギ抗インフルエンザ菌Ｂ抗体をそこに埋め込むことによりその上で確立されているようなニトロセルロースパッドと、結合体パッドを接触させる。ニトロセルロースパッドはまた、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）によってパッドにすじをつけることにより確立された、下流の対照ラインをも含む。ニトロセルロースパッドを通した後、液体の貯水槽としての役割を担う吸収パッドにまで試料残渣を流す。
【００５７】
結合体パッドは不織ポリエステルまたは押出成形されたセルロースアセテートが可能である。本アッセイ法における使用のためのパッドの調製においては、「免疫化学；最新の方法および適用（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」（Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＳ．Ｖａｎ Ｎｏｒｄｅｎ編、Ｗｒｉｇｈｔ社、Ｂｒｉｓｔｏｌ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６）中の、デメイ（ＤｅＭａｙ）の「金プローブの調製および使用（Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｇｏｌｄ Ｐｒｏｂｅｓ）」の方法、またはその他の様々な既知の任意の方法に従い、アフィニティー精製した抗インフルエンザ菌Ｂ抗体に直径４５ ｎｍの金の粒子を連結する。アフィニティー精製は、好ましくは上記に説明されるように行う。「酵素免疫学的検定法の実践および理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」（Ｒ．Ｈ．ＢｕｒｄｅｎおよびＰ．Ｈ． Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｄｂｅｒｇ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））に含まれる、ティセン（Ｐ．Ｔｙｓｓｅｎ）の「免疫グロブリンまたは抗体の親和性クロマトグラフィー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」も参照のこと。様々な既知のアフィニティー精製法の任意のものは、本発明から逸脱することなく、好ましい方法に置き換えられる。
【００５８】
金結合体粒子を乾燥剤と混合し、結合体パッドに包埋する。使用される乾燥剤は、１．０％のウシ血清アルブミン、０．１％のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、２．０％のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、８．０％のスクロース、および０．０２％のアジ化ナトリウムを含む、ｐＨ ８．０の５ｍＭの水溶性ホウ酸ナトリウムである。パッドを十分に加熱し、存在する全ての液体を除去し、試験装置の組み立ての間湿度の低い環境において保存する。乾燥した結合体を保持し、試料で湿らされた場合にそれを解離するように、これらのパッドは特別に選択される。
【００５９】
ニトロセルロースパッドは、アフィニティー精製した抗インフルエンザｂ型菌抗体をパッドの第一部分に個別に包埋することにより、最初に処理される。これらの抗体は捕捉ラインとして作用する。対照ラインは、ヤギ抗ウサギＩｇＧでパッド表面上にすじをつけることにより確立される。ニトロセルロースパッド上にすじをつけられたそれらのラインについては、５％のメタノールおよび０．１０２％のイントラホワイト（Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ）色素を含む、ｐＨ ７．４の５ｍＭ リン酸ナトリウムからなる溶液を、抗体の担体液体として使用する。ニトロセルロースパッドをその後、それに対する永続的なタンパク質の吸収を促進するため、１８〜２５℃の温度で乾燥させる。
【００６０】
使用される吸収パッドは、アールストローム（Ａｈｌｓｔｒｏｍ）２４３のように、商品として販売される、セルロース誘導体材料のものである。それには特別な処理は不要である。試験装置を顧客への配送のために構成する場合、全てのパッドを図１Ｃにて示される順に粘着性細片上に集合させる。
【００６１】
Ｃ．免疫学的検定法
本発明に従ったアッセイ法の実行においては、図に示されるように配置された、スワブウェルを有する完成した試験装置、穴を備えた上層部分および試験用細片を使用する。ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ）繊維から製造したスワブを尿試料にしばらく浸し、その後試料から取り除き、装置の右側部分にある上層部分の穴Ｂを通して、試験装置のサンプルウェルに直ちに挿入する。２または３滴の「試薬Ａ」、この場合は、ｐＨ ６．５の０．０５Ｍのクエン酸ナトリウム−リン酸ナトリウム緩衝液に溶解した、２．０％のトゥイーン ２０、０．０５％のアジ化ナトリウムおよび０．５％のドデシル硫酸ナトリウムの溶液を、同じ穴を通して試料に加える。右側部分の縁にある粘着性細片を剥離し、その後装置を閉じる。試料を結合体パッドと直ちに接触し、免疫クロマトグラフィー用の細片を通して流す。１５分後、試験用試料および対照のための観察窓を見て、結果を記録する。
【００６２】
Ｄ．試料試験の結果
上記に説明されたように、２つの型の多くの尿検体を試験装置において分析した。評価された２つの型の尿試料は、如何なる肺炎型の感染もない患者由来の尿および、インフルエンザｂ型菌を含む尿であった。全ての試料を２通り試験した。以下の表は試験の結果を要約する：
【００６３】
【表１】
【００６４】
上記の結果は、不織ポリエステルの結合体パッドおよび押出成形されたセルロースアセテート結合体パッドの双方について一致していた。「試薬Ａ」を２滴または３滴のいずれか加えた場合に、差異は認められなかった。
【００６５】
実施例６−インフルエンザｂ型菌に対する抗原特異的な抗体の交叉反応性／適合性
インフルエンザｂ型菌結合体ワクチンとして、パスツール・メリュー・コンノート研究所（Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｍｅｒｉｅｕｘ−Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により「ＡＣＴ−ＨＩＢ」という商品名で販売されている、市販の合成インフルエンザｂ型菌調製物をウサギに注射し、約６０日間経過した後、ウサギから採血した。
【００６６】
実施例２において調製された、本質的にタンパク質を含まない精製莢膜抗原を、実施例３において示されたようにヒドラジン−ＢＳＡ結合体に共有結合し、次に抗原：ヒドラジン−ＢＳＡ 結合体を実施例３にて使用されたものと同じアフィニティーゲルに共有結合した。
【００６７】
インフルエンザｂ型菌に対する未処理のポリクローナル抗体を含むウサギ血清を、実施例４にて説明される方法で、精製抗原：ＢＳＡ−ヒドラジンアフィニティーゲルに対して精製した。ゲルから溶出された抗原特異的な抗体をその後、適合試験および交叉反応試験において使用し、結果をこれに関する図２、図３および図４のグラフに表した。
【００６８】
Ａ．適合試験
以下のように、改良ＥＬＩＳＡ法を用いて、適合試験を行った：
ダイネックス・テクノロジー社（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）の９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートを、様々な菌株のインフルエンザ菌細胞懸濁液（０．５〜０．７×１０８細胞／ｍｌ）の、１００ｍｃｌのアリコートで被覆した。プレートを３７℃において２時間インキュベートし、０．０２％のトゥイーン ２０を含むｐＨ ８．０のＰＢＳ（「ＰＢＳＴ」）で４回洗浄した。１ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＳＡを含むｐＨ ７．２のＰＢＳ ２００ｍｃｌを用いて、マイクロタイターウェルを室温にて１時間ブロッキングした。プレートをその後、再度ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００６９】
本実施例において以前に説明したように、商品であるＡＣＴ−ＨＩＢを用いて免疫化されたウサギから得られた、精製した抗原特異的な抗体を、（穴毎に）濃度０．５ｍｃｇ／ｍｌから開始し、０．００８ｍｃｇ／ｍｌで終了するよう、プレート中すべてを２倍に希釈した。
【００７０】
プレート上の最初の横の列を対照として使用した。抗体溶液の代わりに、１００ｍｃｌのＰＢＳをこの列の各ウェルに加えた。プレートを室温にて１時間インキュベートし、その後ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００７１】
その後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた１００ｍｌのヤギ抗ウサギＩｇＧを、ＰＢＳＴで１：６０００に希釈し、各ウェルに加え、プレートを室温にて４５分間インキュベートした。再度ＰＢＳＴで洗浄した後、ＫＰＬラボラトリーズ（ＫＰＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のＴＭＢペルオキシダーゼ基質系（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ）１００ｍｃｌを、各ウェルに加えた。
【００７２】
３〜５分間の発色反応後、５０ ｍｃｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて各ウェルにおける反応を停止した。分光光度ＥＬＩＳＡリーダーにおいて、４５０ ｎｍの波長にてプレートを計測した。
【００７３】
試験された様々なインフルエンザｂ型菌の菌株は、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、アクセッション番号＃１０２１１（これは実施例１〜５においてこれに関して使用された菌株である）、＃４３３３５、＃５１６５４、および＃４３３３４として入手可能な産物であった。図２においてそれについてのグラフに示される、試験の結果は、ＡＣＴ−ＨＩＢを用いたウサギに注射すること、ウサギから採血すること、および、その結果得られた抗体を含むウサギ血清を、実施例２および実施例３の手順に従い、ＡＴＣＣ＃１０２１１由来の精製莢膜抗原を用いて精製することにより得られた抗原特異的な抗体（図２においては「Ｈｉｂ−ａｂ」と示される）は、ＡＴＣＣ＃１０２１１に対し特異性および反応性が非常に高いが、０．０６３ｍｃｇ／ｍｌ〜０．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲において、対照と比較した場合、ＡＴＣＣ＃４３３３５、ＡＴＣＣ＃５１６５４およびＡＴＣＣ＃４３３３４の各々の莢膜抗原に対してなおも特異性および反応性が高いことを示す。さらに、抗原抗体反応の機器による検出を用い、本発明の抗原特異的な抗体は、０．００８ｍｇ／ｍｃｌ程度のより低濃度においても、対照と比較すると、抗原に対する認識できる反応性があることを示した。
【００７４】
Ｂ．交叉反応試験
これらの試験においては、本実施例の抗原特異的な精製インフルエンザｂ型菌抗体を、図２の適合試験について説明される試験プロトコールに従い、それらの試験について説明されるものと同じ対照を用い、２つのバッチにおいて、他種のインフルエンザ菌に対して試験した。
【００７５】
第一のバッチについて、図３は本発明の抗原特異的な抗体の、それらが特異的であるＡＴＣＣ＃１０２１１由来の抗原に対する反応性を、インフルエンザ菌抗原（図上では「Ｈｉ」と示される）ａ型、ｃ型、ｄ型およびｆ型と比較するグラフである。それにより、０．００８ｍｃｇ／ｍｌ〜０．０６３ｍｇ／ｍｌの濃度においては、ＡＴＣＣ＃１０２１１のインフルエンザｂ型菌抗原に対する高い反応性および特異性と比べて、ａ、ｃ、ｄおよびｆ型の全ての型との交叉反応性が欠如していることが示される。０．０６３ｍｃｇ／ｍｌをわずかに超える抗体濃度において、ｆ型インフルエンザ菌に対してのみ、かろうじて感知できる交叉反応性が認められるが、最高濃度０．５ｍｃｇ／ｍｌにおいてでさえ、ｆ型抗原に対する反応性は、抗体の最低濃度０．００８ｍｃｇ／ｍｌにおけるＡＴＣＣ＃１０２１１のａ型に対するものより低い。抗原特異的な抗体とｆ型とのわずかな交叉反応性は、問題視するにはあまりに低いと判断された。
【００７６】
第二のバッチについて、図４は、本発明の精製された抗原特異的な抗体の、型に分けられない４つのインフルエンザ菌種（ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ３およびＮＴ４）の各々に加えパラインフルエンザ菌（Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対する反応性を、インフルエンザｂ型菌の菌株ＡＴＣＣ＃１０２１１に対するものと比較したグラフである。図４は、本発明の抗原特異的な抗体は、０．１２５ｍｃｇ／ｍｌ〜０．５ｍｃｇ／ｍｌの抗体濃度において、インフルエンザ菌の型に分けられない種１、２、３および４の全てに対して交叉反応性を欠いており、パラインフルエンザ菌に対しては非常にわずかな交叉反応性を有することを表す。しかし、この交叉反応性は、０．００８ｍｃｇ／ｍｌの濃度における抗体の、インフルエンザｂ型菌の菌株ＡＴＣＣ＃１０２１１に対する反応性よりも低い程度のものであり、無視できるものと判断された。図４はまた、本発明の抗体の、インフルエンザｂ型菌莢膜抗原に対する高い特異性を確証するものである。
【００７７】
明らかに、細菌の糖質抗原に対する、抗原特異的な精製抗体は、本明細書において説明されるものに限らず、任意の型の免疫学的検定法において、対応する粗製標的糖質抗原を検出するため、有益に使用できる。同様に、同じ標的糖質抗原について過去に説明されたアッセイ法において、未処理のポリクローナル抗体をこれらの抗原特異的な精製抗体に置き換えることにより、そのような各アッセイ法のより高い信頼性、感受性および特異性がもたらされることは明らかである。さらに、未だ示されてはいないにも関わらず、先行技術において説明されたアッセイ法にて、モノクローナル抗体をこれらの抗原特異的な精製抗体に置き換えることにより、少なくとも同等に良い結果が得られると考えられ、多くの場合においては、報告されたものよりも良くかつ信頼性の高い結果が得られることが期待される。
【００７８】
本明細書にて開示されるような本発明の原理は、過去に他者により報告されたアッセイ技術のあらゆる適用、変更および組み合わせに容易に役立つことが指摘される。本明細書において開示される多くの段階は、特定的に開示されるものと異なる試薬または条件を用いて完遂できる。糖質抗原を本質的にタンパク質を含まない状態にまで精製する他の方法は、容易に考案できる。莫大な数の文献、特許および特許ではないもののいずれも、本明細書において説明および推奨される好ましいＩＣＴ装置に置き換えられるような、信頼性の高い、１回限りの使用の、使い捨て免疫学的検定試験装置の設計および使用について議論している。本発明は、特許請求の範囲がそのように限定する限りを例外として、置き換え可能なアッセイ装置、材料、成分または過程の段階に関して、限定されることは意図しない。
【技術分野】
【０００１】
（発明の詳細な説明）
本出願は、本出願の全てにおいて割り当てられた権利を有するバイナックス（Ｂｉｎａｘ，Ｉｎｃ）社にその全てが割り当てられた、以下の米国特許出願の各々の一部継続出願である。
（１）１９９８年８月２５日に出願された、米国特許出願第０９／１３９，７２０号
（２）その一部継続出願を優先して現在放棄されている、１９９８年９月１６日に出願された、米国特許出願第０９／１５６，４８６号、
（３）１９９９年９月１６日に出願された、米国特許出願第０９／３９７，１１０号、
（４）米国特許出願第０９／１３９，７２０号の一部継続出願として１９９９年１２月１０日に出願された、米国特許出願第０９／４５８，９９８号。
【背景技術】
【０００２】
発明の序論
本発明は、糖質抗原を有することにより特徴付けられる細菌によって引き起こされる細菌感染の、感受性および特異性の高い、迅速および正確な診断を達成することに関連する。特に、本発明は、そのような糖質抗原を本質的にタンパク質を含まない状態にまで初期精製し、続いてそのように精製された各糖質抗原を、該抗原に対する未処理の多価抗体をアフィニティー精製するために使用し、そのように精製された該抗体を、元の細菌の存在を検出するために、正確性、特異性および感受性の高い診断試験において使用することに関わる。
【０００３】
本発明は、グラム染色に陽性または陰性であり得る、糖質抗原を有する細菌に適用できる。本発明に従って生産される精製抗体は、市販のモノクローナル抗体と少なくとも同じ程度の特異性および感受性をもつものであり、多くのそのようなモノクローナル抗体よりも生産および取り扱いが容易である。それらは、扱いにくい方法論を用いて、これまでは迅速および正確に同定することが困難であったため、それらが引き起こす細菌性疾患の診断が得られるのがしばしば遅れかつ難しかったような細菌を同定するため、例えばＩＣＴ免疫学的検定法による、迅速な診断試験のための広い機会を提供する。
【０００４】
上記に同定された各親出願は、その開示が本質的に、参照として本明細書に組み入れられる３つの出願に含まれる、その一部継続出願の米国特許出願第０９／３９７，１１０号の中に完全に示されている、現在放棄されている米国特許出願第０９／１５６，４８６号を例外として、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００５】
発明の背景
グラム陰性菌は、少なくとも１つのリポ多糖抗原または他のリポポリ糖質抗原を共通にもつ一方、グラム陽性菌は、リポテイコ酸またはテイコ酸またはそのいずれかの誘導体である、少なくとも１つの糖質抗原をもつ共通の特徴があることが知られている。グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両者の幾つかはまた、莢膜抗原である糖質抗原をも有する。即ち、これらの抗原は各々、その天然の状態において厚い莢膜層に封入されている。この莢膜層は、ほとんどの細菌の細菌細胞壁を取り囲む粘液様の物質を構成する。
【０００６】
その全容を参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／１３９，７２０号では、その全てがグラム陽性であるレジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種の細菌のリポ糖質抗原を、本質的にタンパク質を含まない状態にまで精製することについて説明している。そこでは、限定はしないが、本質的にタンパク質を含まない状態まで精製することについて詳細を説明しているレジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１のＯ−多糖抗原を含む、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）各血清型の糖質抗原の精製について強調されている。
【０００７】
本出願は、レジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１（この血清型が、レジオネラ属が原因で生じる肺炎様疾患の約７０％の病原生物であることが知られている）の、本質的にタンパク質を含まないＯ−糖質抗原が、説明されるようにアフィニティーカラムに（スペーサー分子によって）結合され、未精製の抗原に対する未処理のポリクローナル抗体が説明されるようにカラムに通され、その結果生じる精製抗体は抗原特異性が高く、レジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１により引き起こされる疾患をもつ患者から得た体液中に同じ抗原が存在する場合、それを容易に同定することを示す。この診断のためには尿が好ましい体液であることが示される。なぜならば：
（１）レジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１抗原は、疾患状態の早期に尿中に現れ、適切な治療を開始した後でさえも数日間残存する；
（２）試験用試料の採集は非侵襲的かつ簡単であり、患者には最小限の負担を生じ、および特別に訓練を受けた職員または特別に設計された機器を必要としない；および
（３）例えば痰由来の試料は、試料を得ることまたは培養することの困難、患者の鼻または咽喉において慢性的に存在するが、疾患の原因ではない細菌コロニーの潜在的な存在、および他の同様な困難によって、偽陰性または偽陽性の結果を与える可能性があるからである。
【０００８】
尿中に存在するレジオネラ・ニューモフィラ菌血清型１ 細菌は死んでおり、腎臓を通過しているため、少なくとも部分的にその細胞壁が破壊されている；ゆえに、抗原は、ＩＣＴ試験用細片上の２つの区域に沈積された抗原特異的な抗体が容易に近づき得る状態にある。
【０００９】
水溶性培地からなる環境的試料中の生きた細菌の、全部、およびある程度までの同定における、米国特許出願第０９／１３９，７２０号にて説明された抗原特異的な抗体の有効性は、特異性および感受性の高い酵素免疫学的検定法について説明される、同様に参照として本明細書に組み入れられる一部継続出願である米国特許出願第０９／４５８，９８８号においてさらに示される。本アッセイ法は、親出願において詳細を説明されるように、未処理のポリクローナル抗体の精製によって得られた抗原特異的な抗体を、抗原についての検出試薬として使用することに基づく。そのように精製された抗体の感受性および特異性は、酵素免疫学的検定法により有益な結果を生じた時間の短さによって、並びに長いインキュベーション時間（１時間）によるものと等しく有益な時間結果を与えた抗原特異的な抗体の濃度の低さ（試験毎に０．０５μｇ）によって、部分的に示される。
【００１０】
同様に参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／３９７，１１０号は、全ての肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の肺炎球菌の細胞壁において存在するＣ−多糖細胞壁抗原を、本質的にタンパク質を含まない状態まで精製することについて説明する。この抗原は、テイコ酸由来のホスホコリンを含む多糖である。肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の菌株は全てグラム染色陽性である。
【００１１】
本質的にタンパク質を含まない抗原（その重量パーセントで約１０％未満を含む）を、スペーサー分子に共有結合し、それを次にアフィニティーカラムに共有結合し、そのように調製されたカラムをその後、肺炎連鎖球菌に対する未処理のポリクローナル抗体を精製するために使用する。その結果生じる抗原特異的な精製抗体は、特に尿を含む体液中の肺炎連鎖球菌を同定するためのＩＣＴ試験において、高い感受性および特異性を示した。
【００１２】
探索される特異的な細菌の存在を調べる、ＥＬＩＳＡ法、対向免疫電気泳動および／またはラテックス凝集試験を含む種々の試験において、下気道の疾患の原因であると考えられる様々な感染性のグラム陰性菌またはグラム陽性菌の糖質抗原に対する未処理の多価抗体、またはそのような抗原に対するモノクローナル抗体を使用するために、数多の様々な取組みが過去になされてきた。試験の幾つかはある場合においては有用であったが、それらのいずれも、細胞培養試験に依存せずに用いるのに臨床的に十分許容できる信頼性をこれまでは得なかった。細胞培養試験の欠点およびそれらのあいまいな信頼性については当技術分野において広く報告されており、親出願である米国特許出願第０９／１３９，７２０号および同第０９／３９７，１１０号において議論されている。
【００１３】
親出願である米国特許出願第０９／１３９，７２０号にて最初に説明されたレジオネラ・ニューモフィラ菌血清群１のＩＣＴ試験、および、親出願である米国特許出願第０９／３９７，１１０号およびその親出願の米国特許出願第０９／１５６，７８６号の主題である、肺炎連鎖球菌のＩＣＴ試験について、米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）の承認を得るため、これらの出願の受託者であるバイナックス社（Ｂｉｎａｘ， Ｉｎｃ）には、各々についての大規模臨床試験を実施することが必要であった。これらの臨床試験の多くは、参照として本明細書に組み入れられる２つの親出願において説明されている。臨床試験についての重要な点の１つは、ＦＤＡの規制により、診断試験が既知の試験からの、および商業的な使用において、実質的な科学的および技術的発展を示すと認められる場合にのみ、診断試験の大規模臨床試験を要求されるということである。これら２つの試験の各々の感受性および特異性は、親出願において示されるものよりはるかに高いと考えられる。その理由は、示される数値は、これらの臨床試験結果を、以前から使用可能であった異なるアッセイ法または同定技術（細胞培養試験等）を用いて、同じ臨床試料について平行して得られる結果と比較することに基づいており、過去に使用可能であった試験法は、それらが関連細菌またはその抗原成分の検出のために使用可能な最良の同定法であると考えられていた場合でさえ、信頼性があいまいであることが知られていたからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願第０９／３９７，１１０号
【特許文献２】米国特許出願第０９／１５６，４８６号
【特許文献３】米国特許出願第０９／１３９，７２０号
【特許文献４】米国特許出願第０９／４５８，９８８号
【特許文献５】米国特許出願第０９／１５６，７８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
要するに本発明は、対応する細菌に感染した患者のヒト体液、特に尿に抗原が現れる、糖質抗原を有する広域スペクトルの細菌について、特異性および感受性の高い、迅速な診断試験を提供する機会を与える。
【００１６】
発明の簡単な説明
本発明は、液体、特にヒトまたは他の哺乳動物の体液、および特に尿中の、細菌の糖質抗原の存在を検出するための、特別に精製された、抗原特異性の高い新規の抗体に関する。
【００１７】
これらの抗体は、標的糖質抗原に対する未処理の多価抗体から、以下を含む方法によって調製される：
（ａ）本質的にタンパク質を含まない抗原、即ち、約１０パーセントを超えないタンパク質を含む抗原を得るため、未処理の標的抗原を精製する段階、
（ｂ）そのように精製された抗原を、共有結合によってスペーサー分子に結合する段階、
（ｃ）スペーサー分子の遊離末端を、クロマトグラフィーカラムに充填したアフィニティーゲルに共有結合する段階、
（ｄ）未処理の抗原に対する未処理の多価抗体を、カラムのゲルに通す段階、および
（ｅ）精製抗体を溶出する段階。
【００１８】
アフィニティーゲルから溶出された精製抗体は、特異性、感受性および正確性が高く、液体媒質、特に哺乳動物の体液、および特に尿において未処理の標的抗原を検出するために、特定的に開発された様々な免疫学的検定法の任意のものにおいて使用できる。
【００１９】
レジオネラ属の細菌のポリ糖質抗原、および特にレジオネラ・ニューモフィラ菌血清群１のＯ−多糖抗原を検出するための好ましいＩＣＴ法は、親出願の米国特許出願第０９／１３９，７２０号において説明されている一方、米国特許出願第０９／１５６，４８６号、および同第０９／３９７，１１０号では、肺炎連鎖球菌の全ての血清型に存在するＣ−多糖細胞壁抗原を検出するための、類似した好ましいＩＣＴ法について説明している。
【００２０】
インフルエンザｂ型菌の莢膜多糖抗原を検出するための同様のＩＣＴ法については、本明細書において詳細を説明される。
【００２１】
グラム陰性菌において典型的に認められるリポポリ糖質抗原、グラム陽性菌において典型的に認められるリポテイコ酸もしくはテイコ酸またはその誘導体を含む抗原、およびグラム陽性型およびグラム陰性型の両方の、多くの細菌の細胞壁を取り囲む厚い粘液様莢膜において頻繁に認められる莢膜ポリ糖質抗原を、本節の第二段落において説明される、糖質抗原に対する未処理のポリクローナル抗体を精製するための図式に従って得られるような、抗原特異的な抗体を検出試薬として用いる、迅速かつ特異性および感受性の高いＩＣＴ型の免疫学的検定法によって全て検出できるということは、これまでは認められていなかった。細菌の糖質抗原に対する未処理の多価抗体を、本質的にタンパク質を含まない、精製した標的細菌の糖質抗原を用いたアフィニティー精製を受けさせることによって、抗原特異性および感受性の高いものに変えられるという事実もまた、これまでは評価されていなかった。同様に、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方に由来する、および／または両型の細菌を取り囲む莢膜層に由来する糖質抗原を全て精製でき、抗原特異的な抗体を得るため、そのような抗原に対する抗体のアフィニティー精製に使用できるという事実は、これまでは認められておらず、そのような抗原特異的な抗体を検出試薬として使用して、細菌の糖質抗原が高い正確性、感受性および特異性をもって迅速に検出できることは評価されていなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１およびその関連図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、本発明に従って細菌の糖質抗原についてのアッセイ法を実施する際に好ましい型の、典型的なＩＣＴ装置を示す。
【図１Ａ】図１Ａは、本発明に従って細菌の糖質抗原についてのアッセイ法を実施する際に好ましい型の、典型的なＩＣＴ装置を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明に従って細菌の糖質抗原についてのアッセイ法を実施する際に好ましい型の、典型的なＩＣＴ装置を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明に従って細菌の糖質抗原についてのアッセイ法を実施する際に好ましい型の、典型的なＩＣＴ装置を示す。
【図２】図２は、グラフであり、図２では本発明の抗原特異的な精製抗体が、その抗体を生じさせたインフルエンザｂ型菌以外の血清型を検出する検出能を示すグラフである。
【図３】図３は、インフルエンザｂ型菌の抗原特異的な精製抗体が、インフルエンザ菌ａ型、ｃ型、ｄ型もしくはｆ型の抗原に対しては、交叉反応性がなかったことを示している。
【図４】図４は、インフルエンザｂ型菌の抗原特異的な精製抗体が、非典型的なインフルエンザ菌ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ３もしくはＮＴ４の任意のもの、またはパラインフルエンザ菌（Ｈ． ｐａｒａ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対しては、交叉反応性がなかったことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、細菌感染の検出法における著しい進歩を示すものである。
【００２４】
既知の全ての型の細菌の糖質抗原、即ち、リポ多糖類、抗原性リポテイコ酸およびテイコ酸およびそれらの抗原性誘導体を含むリポポリ糖質抗原、および多糖類を含む莢膜ポリ糖質抗原を、哺乳動物の体液において検出することに適用できるため、およびこれまで考えられなかった、細菌感染の検出への一体化したアプローチを表すため、本発明により、疾患状態において患者の体液中に現れる糖質抗原を細菌が有する場合には、実質的に、その細菌が原因となる任意の疾患の迅速な診断を可能にすることが期待できる。
【００２５】
特に重要なのは、本発明が、特定の細菌によって引き起こされる疾患がある群内において、例えば学校または老人センターの中のような小さい限られた群、または例えば町、市もしくはさらに大きな地域のような広範な集団のいずれかにおいて、流行していると考えられる状況において、迅速な診断および適切な治療の迅速な導入を与える機会である。
【００２６】
概して、本発明の好ましい免疫クロマトグラフィー法（「ＩＣＴ」）アッセイ法は、当技術分野において開示されている任意の既知の使い捨てＩＣＴ装置において実行されるように設計および構成できる。それは好ましくは、ヒト呼吸器系疾患の診断を含む使用分野の広い領域において、その全てがスミス−クライン・ダイアグノスティックス社（Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）に委託されるがバイナックス社（Ｂｉｎａｘ，Ｉｎｃ）に独占的に認可される（本出願の割り当てられた権利を与えられる）、同時係属中のハワード・チャンドラー（Ｈｏｗａｒｄ Ｃｈａｎｄｌｅｒ）の米国特許出願第０７／７０６，６３９号、またはその一部継続出願の１つにおいて開示される型のＩＣＴ装置を用いて、実行されるように設計され、かつ実行される。
【００２７】
好ましい装置は、そのある区域において、疾患の原因と疑われる細菌の標的糖質抗原に対する抗原特異性の高い、アフィニティー精製した抗体を適切に充填される。標識した抗原特異的な抗体を、装置の別の部分に装填する。最初に、細菌を含むと疑われる試験用試料を標識した抗原特異的抗体と接触させ、その後、それらを共に、結合した抗原特異的な非標識抗体を含む装置の部分に流し、疑われる細菌に固有の標的抗原が試料中に存在する場合、既に形成された標識抗体：標的糖質抗原の結合体は、固定化した抗原特異的な非標識抗体との接触によって結合し、見た目に明らかな呈色反応が生じる。標識は、標識抗体：抗原複合体が結合した非標識抗体と反応する際に目に見える呈色を生じさせるような、当技術分野において既知の任意の物質であってもよい。そのような標識は、細かく分割された様々な金属、様々な有機分子、および他の呈色分子と酵素の組み合わせのような、様々な分子の組み合わせを含む。本発明においては、金コロイド粒子が好ましい標識となる。
【００２８】
試料捕捉ラインにおいて、試験用試料を接触させた際に、試験用試料に存在する抗原が抗原特異的な標識抗体に捕捉されること、および、抗原特異的な標識抗体：抗原結合体が、結合した抗体によって容易に捕捉および保持されることを確実にする、十分な反応が起こるような、試験装置の２つの部位の各々にて存在する抗原特異的な抗体の濃度が、好ましい試験装置の設計においては非常に重要である。本発明に関連して行われた実験的研究により、標的糖質抗原に対して活性のある抗原特異的な抗体は、抗原：抗体反応が起こる試験装置の各部位において、表面積当たり７．７ｎｇ／ｍｍ２〜３８５ｎｇ／ｍｍ２の間の濃度で存在しなければならないことが示された。反応を生じさせる部位において、７．７ｎｇ／ｍｍ２より低い抗原特異的な抗体濃度が存在する場合、偽陰性の結果が生じる可能性が高い。
【００２９】
当技術分野において既知のように、感染性細菌はしばしば複数の抗原成分を有する。例えば、肺炎連鎖球菌は、親出願である米国特許出願第０９／１５６，４８６号および同第０９／３９７，１１０号において説明されたアッセイ法の標的である多糖細胞壁抗原に加えて、莢膜抗原をもつことが知られている。後者の抗原は、抗原が肺炎連鎖球菌の全ての既知の血清型に存在するため、かつ本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／３９７，１１０号にて説明されるように、その比較的低い交叉反応が、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる感染を他の感染から迅速に臨床的に識別させる性質のものであるため、これらの出願にて説明された、現在ＦＤＡの認可されている試験のための標的抗原として選択された。体液中の肺炎連鎖球菌を検出するための、以前に公表された試みでは、最良でも、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方を用いて６０〜７０％の範囲、つまり信頼性の高い診断のためには許容できない範囲の感受性および特異性をもつ系しか与えられなかったことが注目される。
【００３０】
各々説明され、かつＦＤＡに承認を受けた、レジオネラ・ニューモフィラ菌血清群１および肺炎連鎖球菌についてのＩＣＴ試験を用いた、進行中の臨床研究において、標的糖質抗原が都合良く検出されることが示された哺乳動物の体液には、好ましい尿に加え、痰、鼻咽頭滲出液、中耳液および脳脊髄液がある。これらの試験により、糖質標的抗原が存在する場合にそれが検出される、その他の体液には、血液および気管支液が含まれる。
【００３１】
任意の特定の細菌についての標的糖質抗原の選択は、それがある細菌の菌株の全てまたはほとんどの血清型に存在することが知られているかどうか、もし特定の血清型に特有な場合は、その血清型がその細菌によって引き起こされる疾患の最も一般的な原因であることが分かっているかどうか、および同様の問題点について、その抗原の交叉反応特性を考慮することに必然的に基づく。
【００３２】
本発明は、既に言及された型の糖質抗原、即ち、リポポリ糖質抗原、リポテイコ酸またはテイコ酸およびそのいずれかの誘導体を含む抗原、および莢膜糖質抗原の、１つまたはそれ以上をもつ任意の細菌によって引き起こされる細菌感染の、迅速な診断に関して独特の潜在能力を提供する。細菌のうち、その糖質標的抗原が本発明の範囲内であると考えられるものは、様々な型のインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｅｉｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、モラクセラ カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂ群連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）のその他の種、特定的に名前を挙げられていないクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ガードネレラ ワギナーリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、レイ菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、特定的に名前を挙げられていないプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）およびリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の様々な他の種、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）の様々な種、および説明される型の１つまたはそれ以上の糖質抗原をもつ、特定的に名前を挙げられていないあらゆる他の細菌種および菌株である。
【００３３】
本発明の技術により精製されるポリクローナル抗体は、例えばウサギまたはヤギのような動物個体に、目的とするアッセイ法の粗製標的抗原を注射することによる、従来法によって得られる。好ましくは抗原調製物は、動物個体への注射の前に加熱処理し、細胞を殺す。適切な時間経過を経た後、望ましい抗体を含む血清を得るため、動物個体から採血し、続いて抗体を精製する。この血清は、ＩｇＧ粗精製分画を生じるために、例えば硫酸アンモニウムまたはイオン交換樹脂を用いた中間精製段階を経ることができる、または直接精製することができる。
【００３４】
アフィニティー精製のため、動物個体を免疫化するために使用したものと同じ粗製標的糖質抗原を培養において増殖させ、その後本質的にタンパク質を含まない状態になるまで適切に精製する。本明細書において使用されるような「本質的にタンパク質を含まない状態」という表現は、約１０％（重量パーセント）を超えない、および好ましくはそれ未満のタンパク質を含む状態を意味する。
【００３５】
本質的にタンパク質を含まない状態になるまで抗原を精製した後、それをスペーサー分子に共有結合により結合させる。適したスペーサー分子の例には、ヒドラジン、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、ＢＳＡおよびヒドラジンの結合体、および、アフィニティーゲルに共有結合できるもう一方の反応性末端を維持しながら、ある末端において精製糖質抗原に共有結合できる同様の分子が含まれる。
【００３６】
精製糖質抗原：スペーサー分子結合体は、次にアフィニティーゲルに連結され、ゲルは、事前に免疫化した動物個体からの採血によって得られる血清中の未処理の多価抗体、またはそのＩｇＧ粗精製分画の精製に使用される。未処理の抗体（またはそのＩｇＧ粗精製分画）は、アフィニティーゲルに複数回流され、精製された、抗原特異性の高い抗体としてそこから溶出される。
【００３７】
以下の実施例は、その精製に用いられる莢膜糖質抗原の予備的分離および精製を含む、インフルエンザｂ型菌に対する抗体のアフィニティー精製の好ましい仕方を示す。これらの分離および精製の段階を達成するための多くの方法は、文献において知られており、本明細書において述べられるように、得られる精製抗原が本質的にタンパク質を含まない限り、本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書において説明されるものに置き換えられる。
【００３８】
実施例１−標的糖質抗原の培養のための培養条件
インフルエンザｂ型菌（ＡＴＣＣ番号＃１０２１１）を、栄養分を補足したミュラーヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ）ブロスにおいて、３７℃、５％ＣＯ２にて、撹拌せずに２４時間増殖させた。
【００３９】
１Ｌ当たりのブロス組成は以下のようであった：
カゼインの酸水解物 １７．５ｇ
ウシ心臓抽出物 ３．０ｇ
デンプン １．５ｇ
以下のような栄養分も含まれた：
ヘマチン １５ｍｇ／ｍｌ
ＮＡＤ（ニコチンアデニンジヌクレオチド）１５ｍｇ／ｍｌ
酵母抽出物 ５ｍｇ／ｍｌ
本混合物のｐＨは、２５℃にて測定して７．３±０．１であった。
【００４０】
実施例２−糖質抗原の精製
２４時間後、１．８２ｇの臭化セチルトリメチルアンモニウムＣＡＳ＃５７−０９−０を３０ｍｌの蒸留水中で溶解し、５００ｍｌのブロスの上清に溶液を加え、最終濃度０．０１Ｍの臭化セチルトリメチルアンモニウムを生じた。氷浴において撹拌しながら混合物を１時間インキュベートし、４℃において一晩インキュベートした。
【００４１】
実施例１により得られた混合物を、１２，０００ｒｐｍおよび４℃にて２０分間遠心分離し、ペレットおよび上清を得た。双方を以下のように各々採集および処理した：（１）０．５ＭのＮａＣｌにペレットを超音波で破砕しながら再懸濁し、その後４℃、再懸濁液の１０倍量のエタノールにおいて滴下沈降を行った。その結果得られた溶液を、４℃にて一晩保存し、沈降させた。
【００４２】
溶液をその後、１２，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心分離した。ペレットを蒸留水に溶解し、その後３，５００の分子量カットオフ値をもつ透析チューブにおいて、蒸留水に対して透析した。
【００４３】
（２）実施例１の混合物から得た上清を４℃において一晩保存し、その後沈降物が形成されたことを記録した。これを保持する容器の内容物の全てを１２，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。ペレットを回収し、０．５ＭのＮａＣｌに超音波で破砕しながら再懸濁した。その結果得られた溶液を、４℃、再懸濁液の１０倍量のエタノールにおいて滴下沈降した。溶液を４℃にて一晩保存し、沈降物を再度形成させた。溶液および沈降物を１２，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、ペレットを回収した。蒸留水にペレットを溶解し、３，５００の分子量カットオフ値をもつ透析チューブにおいて蒸留水に対して透析した。
【００４４】
その後、上記の（１）および（２）からの、透析した溶液をプールし、凍結乾燥した。９０ｍｇのインフルエンザｂ型菌多糖抗原が得られた。
【００４５】
５．３μｇ／ｍｌの濃度のこの抗原の溶液を調製し、タンパク質についてローリー法を行い、５％（重量パーセント）のタンパク質を含むことが認められた。溶液はまた、フェノール−硫酸法によって糖質について試験し、３６％（重量パーセント）を含むことが認められた。ＥＬＩＳＡ法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ−免疫ブロット法の両方により、活性について溶液を試験し、必要な活性をもつことが認められた。
【００４６】
実施例３−アフィニティーカラムの調製
５ｍｇの凍結乾燥したインフルエンザｂ型菌多糖抗原を、４．５２ｍｌの蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを５〜６に調整した；ｐＨ ５〜６、１５．６４ｍｇのウシ血清アルブミン−ヒドラジン結合体をその後加え、続いて３分間混合した。
【００４７】
２．６μｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（「ＥＤＡＣ」）を、１００μｌの蒸留水中に溶解した。５０μｌのこの溶液を、抗原／ＢＳＡ−ヒドラジン結合体溶液に加え、続いて３分間混合した。ＥＤＡＣ平衡溶液をその後この混合物に加え、続いて室温にて２時間混合した。その後ＮａＯＨを用いてｐＨを８に調整し、室温にて１時間混合し、引き続き４℃において一晩保存した。
【００４８】
翌日、保存した混合物のｐＨをＨＣｌを用いて７に調整し、一部をＥＬＩＳＡ試験に供し、その活性を確認した。
【００４９】
２．１２ｍｇのＥＤＡＣ処理した抗原／ＢＳＡヒドラジン結合体を、２．４ｇの洗浄したＳｐｈｅｒｉｌｏｓｅ（商標）ゲルと混合し、その結果生じた混合物を室温にて２時間、上から下まで混合する条件下でインキュベートした。３３．６ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムをその後、４８０μｌの溶解水にて溶解し、この溶液の半分を、抗原／ＢＳＡヒドラジン結合体／Ｓｐｈｅｒｉｌｏｓｅ（商標）ゲル混合物に加えた。その結果生じた混合物を、室温にて３．５時間、上から下まで混合する条件下でインキュベートした。結合した抗原／ＢＳＡヒドラジン／Ｓｐｈｅｒｉｌｏｓｅ（商標）ゲルを分離し、２０倍量の蒸留水で洗浄し、続いてｐＨ ７、４．８ｍｌの０．２Ｍ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌブロック緩衝液において再懸濁した。上述のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液の残りの２４０μｌを懸濁液に加え、この混合物を室温にて１時間、その後４℃にて一晩、上から下まで混合する条件下で通してインキュベートした。
【００５０】
結合し、ブロックされたゲルを分離し、続いて擬似抗体の精製を模倣するために、２０〜３０倍量の蒸留水、ｐＨ ７．２の３倍強リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ ９．２の標準強リン酸緩衝生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水に溶解したｐＨ ７．５の３Ｍ チオシアン酸ナトリウムで洗浄し、アフィニティーカラムに充填した。
【００５１】
実施例４−インフルエンザｂ型菌抗体の精製
ウサギ−α−インフルエンザｂ型菌血清に対し、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌ となるまでＮａＣｌを加え、血清中に溶解した。混合物を５，０００×Ｇにて２０分間遠心分離し、脱脂綿を通してろ過した。実施例３より得られたアフィニティーゲルを標準強のリン酸緩衝生理食塩水を用いて平衡化し、このゲルに血清ろ過物を４回アプライした。その後ゲルを３倍強のリン酸緩衝生理食塩水、続いて標準強のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、結合していない血清成分を除去した。
【００５２】
その後、リン酸緩衝生理食塩水に溶解した３Ｍのチオシアン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．５）、続いて蒸留水に溶解した３Ｍのチオシアン酸ナトリウム（ｐＨ ５〜６）を用いて、抗体をゲルから溶出した。回収された精製抗体を、ｐＨ ７．２の標準強リン酸緩衝生理食塩水において透析した。
【００５３】
実施例５−インフルエンザｂ型菌についてのＩＣＴアッセイ法
Ａ．試験装置の準備
試験結果および対照結果の両方を見ることができる観察窓を備えた、蝶番のついた厚紙の構造物を含む試験装置を、図１にて示されるように用意した。装置には、その右側部分に、試料で湿らせたスワブを受け取るために、事前に形成されたプラスチックのスワブウェルが置かれる凹所がある（図面においては１と称される）。図１Ａにて示される上部ラベルをその後、装置の右側部分の全体に被せ置く。上部ラベルには２つの穴が備えられ、下の穴（図１ＡにおいてはＢと示される）には、浸されたスワブが挿入され、上の穴（図１ＡにおいてはＡと示される）には、穴Ｂへのその挿入後にスワブが押し込まれる。穴ＡおよびＢをもつ上部ラベルの配置およびスワブウェルにより、アッセイの間中スワブは適切な位置に保持され、吸収された試験用試料液のスワブからの排出が促進される。
【００５４】
下記に説明される、事前に組み立てた試験用細片（図１においてはＣと示される）を、左側部分にある凹所（図１においては２と示される）に挿入し、その底部に塗られた接着剤により、決まった場所に保持する。図１Ｂに示される上部ラベルは左側部分の上に置く。それには、アッセイ法の実行のために装置が閉じられる際には右側部分の穴Ａに一致するような、１つの穴（図１ＢにおいてはＤと示される）が開けられている。
【００５５】
組み立てられた装置を、乾燥剤を入れて密封した袋において、使用するまで保管する。袋を密封し保管する前に、装置の右半分の外側の縁に弱い粘着テープを配置する。
【００５６】
Ｂ．試験用細片の調製および構成
図１Ｃにて示されるように、アッセイのための試験用細片は、金の粒子およびアフィニティー精製したウサギ抗インフルエンザ菌Ｂ抗体の結合体を充填した、吸収性材料のパッドからなる。使用においては、この結合体は、液体の試験用試料と接触させることにより、流動可能なように変えられる。金結合体と反応させた試料についての捕捉ラインが、アフィニティー精製したウサギ抗インフルエンザ菌Ｂ抗体をそこに埋め込むことによりその上で確立されているようなニトロセルロースパッドと、結合体パッドを接触させる。ニトロセルロースパッドはまた、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）によってパッドにすじをつけることにより確立された、下流の対照ラインをも含む。ニトロセルロースパッドを通した後、液体の貯水槽としての役割を担う吸収パッドにまで試料残渣を流す。
【００５７】
結合体パッドは不織ポリエステルまたは押出成形されたセルロースアセテートが可能である。本アッセイ法における使用のためのパッドの調製においては、「免疫化学；最新の方法および適用（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」（Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＳ．Ｖａｎ Ｎｏｒｄｅｎ編、Ｗｒｉｇｈｔ社、Ｂｒｉｓｔｏｌ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６）中の、デメイ（ＤｅＭａｙ）の「金プローブの調製および使用（Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｇｏｌｄ Ｐｒｏｂｅｓ）」の方法、またはその他の様々な既知の任意の方法に従い、アフィニティー精製した抗インフルエンザ菌Ｂ抗体に直径４５ ｎｍの金の粒子を連結する。アフィニティー精製は、好ましくは上記に説明されるように行う。「酵素免疫学的検定法の実践および理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」（Ｒ．Ｈ．ＢｕｒｄｅｎおよびＰ．Ｈ． Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｄｂｅｒｇ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））に含まれる、ティセン（Ｐ．Ｔｙｓｓｅｎ）の「免疫グロブリンまたは抗体の親和性クロマトグラフィー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」も参照のこと。様々な既知のアフィニティー精製法の任意のものは、本発明から逸脱することなく、好ましい方法に置き換えられる。
【００５８】
金結合体粒子を乾燥剤と混合し、結合体パッドに包埋する。使用される乾燥剤は、１．０％のウシ血清アルブミン、０．１％のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、２．０％のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、８．０％のスクロース、および０．０２％のアジ化ナトリウムを含む、ｐＨ ８．０の５ｍＭの水溶性ホウ酸ナトリウムである。パッドを十分に加熱し、存在する全ての液体を除去し、試験装置の組み立ての間湿度の低い環境において保存する。乾燥した結合体を保持し、試料で湿らされた場合にそれを解離するように、これらのパッドは特別に選択される。
【００５９】
ニトロセルロースパッドは、アフィニティー精製した抗インフルエンザｂ型菌抗体をパッドの第一部分に個別に包埋することにより、最初に処理される。これらの抗体は捕捉ラインとして作用する。対照ラインは、ヤギ抗ウサギＩｇＧでパッド表面上にすじをつけることにより確立される。ニトロセルロースパッド上にすじをつけられたそれらのラインについては、５％のメタノールおよび０．１０２％のイントラホワイト（Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ）色素を含む、ｐＨ ７．４の５ｍＭ リン酸ナトリウムからなる溶液を、抗体の担体液体として使用する。ニトロセルロースパッドをその後、それに対する永続的なタンパク質の吸収を促進するため、１８〜２５℃の温度で乾燥させる。
【００６０】
使用される吸収パッドは、アールストローム（Ａｈｌｓｔｒｏｍ）２４３のように、商品として販売される、セルロース誘導体材料のものである。それには特別な処理は不要である。試験装置を顧客への配送のために構成する場合、全てのパッドを図１Ｃにて示される順に粘着性細片上に集合させる。
【００６１】
Ｃ．免疫学的検定法
本発明に従ったアッセイ法の実行においては、図に示されるように配置された、スワブウェルを有する完成した試験装置、穴を備えた上層部分および試験用細片を使用する。ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ）繊維から製造したスワブを尿試料にしばらく浸し、その後試料から取り除き、装置の右側部分にある上層部分の穴Ｂを通して、試験装置のサンプルウェルに直ちに挿入する。２または３滴の「試薬Ａ」、この場合は、ｐＨ ６．５の０．０５Ｍのクエン酸ナトリウム−リン酸ナトリウム緩衝液に溶解した、２．０％のトゥイーン ２０、０．０５％のアジ化ナトリウムおよび０．５％のドデシル硫酸ナトリウムの溶液を、同じ穴を通して試料に加える。右側部分の縁にある粘着性細片を剥離し、その後装置を閉じる。試料を結合体パッドと直ちに接触し、免疫クロマトグラフィー用の細片を通して流す。１５分後、試験用試料および対照のための観察窓を見て、結果を記録する。
【００６２】
Ｄ．試料試験の結果
上記に説明されたように、２つの型の多くの尿検体を試験装置において分析した。評価された２つの型の尿試料は、如何なる肺炎型の感染もない患者由来の尿および、インフルエンザｂ型菌を含む尿であった。全ての試料を２通り試験した。以下の表は試験の結果を要約する：
【００６３】
【表１】
【００６４】
上記の結果は、不織ポリエステルの結合体パッドおよび押出成形されたセルロースアセテート結合体パッドの双方について一致していた。「試薬Ａ」を２滴または３滴のいずれか加えた場合に、差異は認められなかった。
【００６５】
実施例６−インフルエンザｂ型菌に対する抗原特異的な抗体の交叉反応性／適合性
インフルエンザｂ型菌結合体ワクチンとして、パスツール・メリュー・コンノート研究所（Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｍｅｒｉｅｕｘ−Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により「ＡＣＴ−ＨＩＢ」という商品名で販売されている、市販の合成インフルエンザｂ型菌調製物をウサギに注射し、約６０日間経過した後、ウサギから採血した。
【００６６】
実施例２において調製された、本質的にタンパク質を含まない精製莢膜抗原を、実施例３において示されたようにヒドラジン−ＢＳＡ結合体に共有結合し、次に抗原：ヒドラジン−ＢＳＡ 結合体を実施例３にて使用されたものと同じアフィニティーゲルに共有結合した。
【００６７】
インフルエンザｂ型菌に対する未処理のポリクローナル抗体を含むウサギ血清を、実施例４にて説明される方法で、精製抗原：ＢＳＡ−ヒドラジンアフィニティーゲルに対して精製した。ゲルから溶出された抗原特異的な抗体をその後、適合試験および交叉反応試験において使用し、結果をこれに関する図２、図３および図４のグラフに表した。
【００６８】
Ａ．適合試験
以下のように、改良ＥＬＩＳＡ法を用いて、適合試験を行った：
ダイネックス・テクノロジー社（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）の９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートを、様々な菌株のインフルエンザ菌細胞懸濁液（０．５〜０．７×１０８細胞／ｍｌ）の、１００ｍｃｌのアリコートで被覆した。プレートを３７℃において２時間インキュベートし、０．０２％のトゥイーン ２０を含むｐＨ ８．０のＰＢＳ（「ＰＢＳＴ」）で４回洗浄した。１ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＳＡを含むｐＨ ７．２のＰＢＳ ２００ｍｃｌを用いて、マイクロタイターウェルを室温にて１時間ブロッキングした。プレートをその後、再度ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００６９】
本実施例において以前に説明したように、商品であるＡＣＴ−ＨＩＢを用いて免疫化されたウサギから得られた、精製した抗原特異的な抗体を、（穴毎に）濃度０．５ｍｃｇ／ｍｌから開始し、０．００８ｍｃｇ／ｍｌで終了するよう、プレート中すべてを２倍に希釈した。
【００７０】
プレート上の最初の横の列を対照として使用した。抗体溶液の代わりに、１００ｍｃｌのＰＢＳをこの列の各ウェルに加えた。プレートを室温にて１時間インキュベートし、その後ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【００７１】
その後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた１００ｍｌのヤギ抗ウサギＩｇＧを、ＰＢＳＴで１：６０００に希釈し、各ウェルに加え、プレートを室温にて４５分間インキュベートした。再度ＰＢＳＴで洗浄した後、ＫＰＬラボラトリーズ（ＫＰＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のＴＭＢペルオキシダーゼ基質系（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ）１００ｍｃｌを、各ウェルに加えた。
【００７２】
３〜５分間の発色反応後、５０ ｍｃｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて各ウェルにおける反応を停止した。分光光度ＥＬＩＳＡリーダーにおいて、４５０ ｎｍの波長にてプレートを計測した。
【００７３】
試験された様々なインフルエンザｂ型菌の菌株は、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、アクセッション番号＃１０２１１（これは実施例１〜５においてこれに関して使用された菌株である）、＃４３３３５、＃５１６５４、および＃４３３３４として入手可能な産物であった。図２においてそれについてのグラフに示される、試験の結果は、ＡＣＴ−ＨＩＢを用いたウサギに注射すること、ウサギから採血すること、および、その結果得られた抗体を含むウサギ血清を、実施例２および実施例３の手順に従い、ＡＴＣＣ＃１０２１１由来の精製莢膜抗原を用いて精製することにより得られた抗原特異的な抗体（図２においては「Ｈｉｂ−ａｂ」と示される）は、ＡＴＣＣ＃１０２１１に対し特異性および反応性が非常に高いが、０．０６３ｍｃｇ／ｍｌ〜０．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲において、対照と比較した場合、ＡＴＣＣ＃４３３３５、ＡＴＣＣ＃５１６５４およびＡＴＣＣ＃４３３３４の各々の莢膜抗原に対してなおも特異性および反応性が高いことを示す。さらに、抗原抗体反応の機器による検出を用い、本発明の抗原特異的な抗体は、０．００８ｍｇ／ｍｃｌ程度のより低濃度においても、対照と比較すると、抗原に対する認識できる反応性があることを示した。
【００７４】
Ｂ．交叉反応試験
これらの試験においては、本実施例の抗原特異的な精製インフルエンザｂ型菌抗体を、図２の適合試験について説明される試験プロトコールに従い、それらの試験について説明されるものと同じ対照を用い、２つのバッチにおいて、他種のインフルエンザ菌に対して試験した。
【００７５】
第一のバッチについて、図３は本発明の抗原特異的な抗体の、それらが特異的であるＡＴＣＣ＃１０２１１由来の抗原に対する反応性を、インフルエンザ菌抗原（図上では「Ｈｉ」と示される）ａ型、ｃ型、ｄ型およびｆ型と比較するグラフである。それにより、０．００８ｍｃｇ／ｍｌ〜０．０６３ｍｇ／ｍｌの濃度においては、ＡＴＣＣ＃１０２１１のインフルエンザｂ型菌抗原に対する高い反応性および特異性と比べて、ａ、ｃ、ｄおよびｆ型の全ての型との交叉反応性が欠如していることが示される。０．０６３ｍｃｇ／ｍｌをわずかに超える抗体濃度において、ｆ型インフルエンザ菌に対してのみ、かろうじて感知できる交叉反応性が認められるが、最高濃度０．５ｍｃｇ／ｍｌにおいてでさえ、ｆ型抗原に対する反応性は、抗体の最低濃度０．００８ｍｃｇ／ｍｌにおけるＡＴＣＣ＃１０２１１のａ型に対するものより低い。抗原特異的な抗体とｆ型とのわずかな交叉反応性は、問題視するにはあまりに低いと判断された。
【００７６】
第二のバッチについて、図４は、本発明の精製された抗原特異的な抗体の、型に分けられない４つのインフルエンザ菌種（ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ３およびＮＴ４）の各々に加えパラインフルエンザ菌（Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対する反応性を、インフルエンザｂ型菌の菌株ＡＴＣＣ＃１０２１１に対するものと比較したグラフである。図４は、本発明の抗原特異的な抗体は、０．１２５ｍｃｇ／ｍｌ〜０．５ｍｃｇ／ｍｌの抗体濃度において、インフルエンザ菌の型に分けられない種１、２、３および４の全てに対して交叉反応性を欠いており、パラインフルエンザ菌に対しては非常にわずかな交叉反応性を有することを表す。しかし、この交叉反応性は、０．００８ｍｃｇ／ｍｌの濃度における抗体の、インフルエンザｂ型菌の菌株ＡＴＣＣ＃１０２１１に対する反応性よりも低い程度のものであり、無視できるものと判断された。図４はまた、本発明の抗体の、インフルエンザｂ型菌莢膜抗原に対する高い特異性を確証するものである。
【００７７】
明らかに、細菌の糖質抗原に対する、抗原特異的な精製抗体は、本明細書において説明されるものに限らず、任意の型の免疫学的検定法において、対応する粗製標的糖質抗原を検出するため、有益に使用できる。同様に、同じ標的糖質抗原について過去に説明されたアッセイ法において、未処理のポリクローナル抗体をこれらの抗原特異的な精製抗体に置き換えることにより、そのような各アッセイ法のより高い信頼性、感受性および特異性がもたらされることは明らかである。さらに、未だ示されてはいないにも関わらず、先行技術において説明されたアッセイ法にて、モノクローナル抗体をこれらの抗原特異的な精製抗体に置き換えることにより、少なくとも同等に良い結果が得られると考えられ、多くの場合においては、報告されたものよりも良くかつ信頼性の高い結果が得られることが期待される。
【００７８】
本明細書にて開示されるような本発明の原理は、過去に他者により報告されたアッセイ技術のあらゆる適用、変更および組み合わせに容易に役立つことが指摘される。本明細書において開示される多くの段階は、特定的に開示されるものと異なる試薬または条件を用いて完遂できる。糖質抗原を本質的にタンパク質を含まない状態にまで精製する他の方法は、容易に考案できる。莫大な数の文献、特許および特許ではないもののいずれも、本明細書において説明および推奨される好ましいＩＣＴ装置に置き換えられるような、信頼性の高い、１回限りの使用の、使い捨て免疫学的検定試験装置の設計および使用について議論している。本発明は、特許請求の範囲がそのように限定する限りを例外として、置き換え可能なアッセイ装置、材料、成分または過程の段階に関して、限定されることは意図しない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、リポポリ糖質抗原、リポテイコ酸またはテイコ酸またはそのいずれかの誘導体を含む抗原、および莢膜糖質抗原から選択される標的細菌の糖質抗原に対する抗原特異的な抗体を得る方法：
（ａ）標的細菌の糖質抗原を、重量パーセントで約１０％を超えないタンパク質を含む、本質的にタンパク質を含まない抗原を生じるまで精製する段階、
（ｂ）本質的にタンパク質を含まない抗原をスペーサー分子に結合し、結合体を生じる段階、
（ｃ）段階（ｂ）にて得られた結合体をアフィニティーゲルに結合し、さらなる結合体を生じる段階、
（ｄ）段階（ｃ）のさらなる結合体上において、標的細菌抗原に対する未処理のポリクローナル抗体またはそのＩｇＧ粗精製分画を通す段階、および
（ｅ）段階（ｃ）のさらなる結合体から、粗製の標的細菌抗原に特異的な精製抗体を溶出する段階。
【請求項２】
請求項１記載の方法によって調製される、抗原特異的な抗体。
【請求項３】
請求項１記載の工程に従い、未処理のポリクローナル抗体またはそのＩｇＧ粗精製分画を精製することにより生産される、標的抗原に対する抗原特異的な抗体と試験用試料を接触させる段階を含む方法であり、標的細菌またはその標的糖質抗原を含有すると疑われる液体を含む試験用試料における、標的細菌またはその標的糖質抗原成分の存在についてアッセイする方法。
【請求項４】
試験用試料が、標的細菌により引き起こされる疾患を有すると疑われる哺乳動物の患者から得られる、哺乳動物の体液を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
試験用試料が、標的細菌により引き起こされる疾患を有すると疑われる患者から得られるヒトの尿を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
標的細菌がグラム陰性菌であり、その標的抗原成分がリポポリ糖質である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
リポ糖質がリポ多糖である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
標的細菌がグラム陽性菌であり、その標的抗原成分がリポテイコ酸、テイコ酸またはそのいずれかの誘導体を含む抗原である、請求項５記載の方法。
【請求項９】
標的細菌がグラム陽性またはグラム陰性であり、標的抗原が莢膜ポリ糖質抗原である、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
莢膜ポリ糖質抗原が莢膜多糖抗原である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、標的細菌またはそれらの標的糖質抗原成分の検出のためのＩＣＴアッセイ法：
（ａ）標的細菌またはそれらの標的糖質抗原成分を含むと疑われる液体の試料を、以下を有するような、吸湿性材料からなる細片を含むＩＣＴ装置と接触させる段階
（ｉ）以下の結合体を包埋した区画：
（１）対応する抗原性結合パートナーと抗体との反応において、目に見える呈色変化を表す標識試薬、および
（２）標的糖質抗原成分に対して抗原特異的な精製抗体であり、本質的にタンパク質を含まない精製標的糖質抗原成分がスペーサー分子によって連結された、クロマトグラフィー用アフィニティーカラムに通すことにより精製された抗体、
（ｉｉ）抗原特異的な同じ精製抗体を連結していない形態で結合させた第二の区画であり、呈色変化を見るための観察窓を備えた区画；
（ｂ）前記試料を、試験用細片に沿って第一の区画まで横に流す段階；
（ｃ）アフィニティー精製された抗体および標識の結合体と共に、該試験用細片に沿って第二の区画まで該試料を横に流す段階；および
（ｄ）段階（ａ）の開始から約１５〜２０分間以内に、呈色線が該第二の区画に現われたかを観察窓から観察し、それにより試料中の標的細菌もしくはその標的糖質抗原成分、またはその両方の存在が示され、または、呈色線がそのように現われないことにより、標的細菌およびそれらの標的糖質抗原成分が存在しないことが示される段階。
【請求項１２】
以下の段階を含む、グラム陽性菌またはグラム陰性菌から、本質的にタンパク質を含まない糖質成分または抗原成分を得る方法：
（ａ）望ましいサイズの試料を得るため、細菌を必要な時間培養し、それから細菌細胞を湿性細胞ペレットの形態にて採集する段階；
（ｂ）湿性細胞ペレットをアルカリ性溶液に懸濁し混合する段階；
（ｃ）強酸を用いてｐＨを酸性ｐＨにまで調整し、遠心分離する段階；
（ｄ）段階（ｃ）から上清を分離し、そのｐＨをおよそ中性になるまで調整する段階；（ｅ）残存タンパク質をなくすため、広域スペクトルプロテアーゼ酵素調製物を用いてこの産物を分解する段階；
（ｆ）弱アルカリ性水溶液を用いて、ｐＨをアルカリ性側に調整する段階；
（ｇ）弱アルカリ性溶液を用いて平衡化した、サイズ排除クロマトグラフィーカラムにおいて、本質的にタンパク質を含まない糖質抗原を分離する段階；および
（ｈ）第一ピークにおいて溶出された材料をプールし、そのｐＨをおよそ中性になるまで調整する段階。
【請求項１３】
標的細菌抗原がインフルエンザｂ型菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ）の莢膜糖質抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
インフルエンザｂ型菌の莢膜糖質抗原に特異的な、請求項２記載の抗原特異的な抗体。
【請求項１５】
標的細菌がインフルエンザｂ型菌であり、その標的糖質抗原成分がそれらの細菌の莢膜糖質抗原である、請求項３記載の方法。
【請求項１６】
標的細菌がインフルエンザｂ型菌であり、その標的糖質抗原成分がそれらの細菌の莢膜糖質抗原である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
試験用試料がヒトの尿を含む、請求項１５の方法。
【請求項１８】
標的細菌がインフルエンザｂ型菌であり、その標的糖質抗原成分がそれらの莢膜糖質抗原であり、標識試薬が細かく分割された金属の金である、請求項１１の方法。
【請求項１９】
細菌がインフルエンザｂ型菌であり、得られる本質的にタンパク質を含まない抗原成分が、それらの本質的にタンパク質を含まない莢膜糖質抗原成分である、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
抗原特異的な抗体が、抗原：抗体反応が起こる試験装置の各部位において、表面積当たり７．７ｎｇ／ｍｍ２〜３８５ｎｇ／ｍｍ２の間の濃度で存在する、請求項３記載の方法。
【請求項２１】
抗原特異的な抗体が、抗原：抗体反応が起こる試験装置の各部位において、表面積当たり７．７ｎｇ／ｍｍ２〜３８５ｎｇ／ｍｍ２の間の濃度で存在する、請求項１１記載の方法。
【請求項１】
以下の段階を含む、リポポリ糖質抗原、リポテイコ酸またはテイコ酸またはそのいずれかの誘導体を含む抗原、および莢膜糖質抗原から選択される標的細菌の糖質抗原に対する抗原特異的な抗体を得る方法：
（ａ）標的細菌の糖質抗原を、重量パーセントで約１０％を超えないタンパク質を含む、本質的にタンパク質を含まない抗原を生じるまで精製する段階、
（ｂ）本質的にタンパク質を含まない抗原をスペーサー分子に結合し、結合体を生じる段階、
（ｃ）段階（ｂ）にて得られた結合体をアフィニティーゲルに結合し、さらなる結合体を生じる段階、
（ｄ）段階（ｃ）のさらなる結合体上において、標的細菌抗原に対する未処理のポリクローナル抗体またはそのＩｇＧ粗精製分画を通す段階、および
（ｅ）段階（ｃ）のさらなる結合体から、粗製の標的細菌抗原に特異的な精製抗体を溶出する段階。
【請求項２】
請求項１記載の方法によって調製される、抗原特異的な抗体。
【請求項３】
請求項１記載の工程に従い、未処理のポリクローナル抗体またはそのＩｇＧ粗精製分画を精製することにより生産される、標的抗原に対する抗原特異的な抗体と試験用試料を接触させる段階を含む方法であり、標的細菌またはその標的糖質抗原を含有すると疑われる液体を含む試験用試料における、標的細菌またはその標的糖質抗原成分の存在についてアッセイする方法。
【請求項４】
試験用試料が、標的細菌により引き起こされる疾患を有すると疑われる哺乳動物の患者から得られる、哺乳動物の体液を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
試験用試料が、標的細菌により引き起こされる疾患を有すると疑われる患者から得られるヒトの尿を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
標的細菌がグラム陰性菌であり、その標的抗原成分がリポポリ糖質である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
リポ糖質がリポ多糖である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
標的細菌がグラム陽性菌であり、その標的抗原成分がリポテイコ酸、テイコ酸またはそのいずれかの誘導体を含む抗原である、請求項５記載の方法。
【請求項９】
標的細菌がグラム陽性またはグラム陰性であり、標的抗原が莢膜ポリ糖質抗原である、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
莢膜ポリ糖質抗原が莢膜多糖抗原である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、標的細菌またはそれらの標的糖質抗原成分の検出のためのＩＣＴアッセイ法：
（ａ）標的細菌またはそれらの標的糖質抗原成分を含むと疑われる液体の試料を、以下を有するような、吸湿性材料からなる細片を含むＩＣＴ装置と接触させる段階
（ｉ）以下の結合体を包埋した区画：
（１）対応する抗原性結合パートナーと抗体との反応において、目に見える呈色変化を表す標識試薬、および
（２）標的糖質抗原成分に対して抗原特異的な精製抗体であり、本質的にタンパク質を含まない精製標的糖質抗原成分がスペーサー分子によって連結された、クロマトグラフィー用アフィニティーカラムに通すことにより精製された抗体、
（ｉｉ）抗原特異的な同じ精製抗体を連結していない形態で結合させた第二の区画であり、呈色変化を見るための観察窓を備えた区画；
（ｂ）前記試料を、試験用細片に沿って第一の区画まで横に流す段階；
（ｃ）アフィニティー精製された抗体および標識の結合体と共に、該試験用細片に沿って第二の区画まで該試料を横に流す段階；および
（ｄ）段階（ａ）の開始から約１５〜２０分間以内に、呈色線が該第二の区画に現われたかを観察窓から観察し、それにより試料中の標的細菌もしくはその標的糖質抗原成分、またはその両方の存在が示され、または、呈色線がそのように現われないことにより、標的細菌およびそれらの標的糖質抗原成分が存在しないことが示される段階。
【請求項１２】
以下の段階を含む、グラム陽性菌またはグラム陰性菌から、本質的にタンパク質を含まない糖質成分または抗原成分を得る方法：
（ａ）望ましいサイズの試料を得るため、細菌を必要な時間培養し、それから細菌細胞を湿性細胞ペレットの形態にて採集する段階；
（ｂ）湿性細胞ペレットをアルカリ性溶液に懸濁し混合する段階；
（ｃ）強酸を用いてｐＨを酸性ｐＨにまで調整し、遠心分離する段階；
（ｄ）段階（ｃ）から上清を分離し、そのｐＨをおよそ中性になるまで調整する段階；（ｅ）残存タンパク質をなくすため、広域スペクトルプロテアーゼ酵素調製物を用いてこの産物を分解する段階；
（ｆ）弱アルカリ性水溶液を用いて、ｐＨをアルカリ性側に調整する段階；
（ｇ）弱アルカリ性溶液を用いて平衡化した、サイズ排除クロマトグラフィーカラムにおいて、本質的にタンパク質を含まない糖質抗原を分離する段階；および
（ｈ）第一ピークにおいて溶出された材料をプールし、そのｐＨをおよそ中性になるまで調整する段階。
【請求項１３】
標的細菌抗原がインフルエンザｂ型菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ）の莢膜糖質抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
インフルエンザｂ型菌の莢膜糖質抗原に特異的な、請求項２記載の抗原特異的な抗体。
【請求項１５】
標的細菌がインフルエンザｂ型菌であり、その標的糖質抗原成分がそれらの細菌の莢膜糖質抗原である、請求項３記載の方法。
【請求項１６】
標的細菌がインフルエンザｂ型菌であり、その標的糖質抗原成分がそれらの細菌の莢膜糖質抗原である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
試験用試料がヒトの尿を含む、請求項１５の方法。
【請求項１８】
標的細菌がインフルエンザｂ型菌であり、その標的糖質抗原成分がそれらの莢膜糖質抗原であり、標識試薬が細かく分割された金属の金である、請求項１１の方法。
【請求項１９】
細菌がインフルエンザｂ型菌であり、得られる本質的にタンパク質を含まない抗原成分が、それらの本質的にタンパク質を含まない莢膜糖質抗原成分である、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
抗原特異的な抗体が、抗原：抗体反応が起こる試験装置の各部位において、表面積当たり７．７ｎｇ／ｍｍ２〜３８５ｎｇ／ｍｍ２の間の濃度で存在する、請求項３記載の方法。
【請求項２１】
抗原特異的な抗体が、抗原：抗体反応が起こる試験装置の各部位において、表面積当たり７．７ｎｇ／ｍｍ２〜３８５ｎｇ／ｍｍ２の間の濃度で存在する、請求項１１記載の方法。
【図１】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１４５３０１（Ｐ２０１１−１４５３０１Ａ）
【公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−３１１３７（Ｐ２０１１−３１１３７）
【出願日】平成２３年２月１６日（２０１１．２．１６）
【分割の表示】特願２００１−５６３１３４（Ｐ２００１−５６３１３４）の分割
【原出願日】平成１３年３月１日（２００１．３．１）
【出願人】（５０５３１８８４６）バイナックス インコーポレイティッド (5)
【公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３１１３７（Ｐ２０１１−３１１３７）
【出願日】平成２３年２月１６日（２０１１．２．１６）
【分割の表示】特願２００１−５６３１３４（Ｐ２００１−５６３１３４）の分割
【原出願日】平成１３年３月１日（２００１．３．１）
【出願人】（５０５３１８８４６）バイナックス インコーポレイティッド (5)
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