標的遺伝子の発現変化による食品機能成分及び医薬品感受性評価方法

【課題】食品成分を摂取する者の感受性の個体差や感受性の変化を評価する方法、またはその感受性を見ることで他の成分の摂取に与える影響の予測などの評価方法を提供する。
【解決手段】所定の遺伝子群のうち1又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の作用と関連づけることを特徴とする前記方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標的遺伝子の発現変化による食品機能成分及び医薬品感受性評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
現在の社会では健康に対する意識が年々高まっており、そのような社会背景も後押しして、医療や医薬の分野での研究は勿論のこと、食品の分野においても健康に関する研究が飛躍的に進んできている。食には以下の3つの機能があり、栄養を補給する生命維持の一次機能、味覚や嗜好を満足させる二次機能、そして体内の生理系統を調節して健康の維持や健康の回復に効果を及ぼす第三次機能があるが、近年、この第三次機能が注目を集めている。昭和59年の文部省特定研究「食品機能の系統的解析と展開」を礎として食品の第三次機能の研究が進み、また、平成3年の特定保健用食品制度のスタートにより、食品の第三次機能についての研究がより盛んに行われるようになってきた。
【0003】
特定保健用食品としては、血中コレステロールの低減や血圧上昇抑制や整腸作用、血糖値上昇抑制などの効果が謳われているものが多く販売されているが、それらの特定保健用食品に含まれる機能成分の作用メカニズムについては詳細が解明されていない部分も多く、現在も作用メカニズムの研究が行われている。
【0004】
食品機能成分の作用メカニズムの研究において、近年の報告では食品機能成分が細胞内外の受容体に結合し、その結合後に機能が発揮されることが報告されている(非特許文献1)。これは、食品の機能成分が特定の標的分子に結合することで細胞内にシグナルを伝達して効果を発揮するというものであり、受け取り側のその標的分子の有無または発現量により、同じ食品成分であっても効果が異なることを示している。
【0005】
食品や医薬品の活性評価としては、その評価対象に期待される効果によって様々な評価方法がある。その中のひとつとして、遺伝子の発現量によって評価を行う方法もいくつかは報告されており、例えば漢方の活性を複数の遺伝子発現量の変化により評価する方法も報告されている(特許文献1)。また、疾患に対してどのような医学的介入を行うかの決定を遺伝子発現解析より個体差を考慮して判定する方法(特許文献2)も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開2007319051号公報
【特許文献2】特表2009537154号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Tachibana H, et al. Nat Struct Mol Biol. 2004;11:380−381
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、食品機能成分や治療薬が結合する又は標的とする各物質の遺伝子発現量に着目して、食品成分を摂取する者の感受性の個体差や感受性の変化を評価する方法、またはその感受性を見ることで他の成分の摂取に与える影響の予測などの評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、所定の遺伝子の発現に着目することにより、被験生物の感受性などを検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1) 下記の遺伝子群のうち1又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の作用と関連づけることを特徴とする前記方法。
(2) 被験生物の被験物質に対する感受性を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
(3) 被験物質の機能を予測する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
(4) 分子A又は遺伝子Aを標的として作用する被験物質X、及び当該分子A又は遺伝子Aとは異なる他の分子B又は遺伝子Bを標的として作用する被験物質Yを、同時に又は相前後して接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を指標として、前記被験物質Xと被験物質Yとが互いに影響を及ぼすか否かを予測する方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9
【発明の効果】
【0010】
本発明は、様々な食品機能成分や治療薬が結合する又は標的とする各物質の遺伝子発現量に着目し、その遺伝子発現の変化を複数同時に測定することで、その食品機能成分や治療薬を摂取する生体のその摂取成分に対する感受性を評価することや、食品機能成分や治療薬の生態機能を予測し、また他の食品、医薬品との相性を予測することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明の方法の概要を示す図である。
【図2】本発明の方法の概要を示す図である。
【図3】本発明の方法によりプラセボ対照3群並行群間比較試験二重盲検法でお茶成分の摂取者の時間経過(摂取期間)による感受性の変化及び摂取物の機能の予測を行った結果を示す図である。
【図4】本発明の方法によりATRAの機能、他の食品成分への影響を予測した結果を示す図である。
【図5】本発明の方法によりequolを測定し、クラスター解析でフラボノイド系成分と比較した結果を示す図である。
【図6A】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス大腿四頭筋の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図6B】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス大腿四頭筋の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図7A】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス肝臓の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図7B】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス肝臓の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図7C】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス肝臓の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図8A】廃用性筋萎縮における遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図8B】廃用性筋萎縮における遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を詳細に説明する。
1.本発明の概要
本発明は、被験物質を摂取又は投与された被験生物から試料を採取し、その採取した試料中の遺伝子を検出して被験物質の所定の遺伝子群に対する作用を測定することで、被験生物の感受性を評価する方法、又は被験物質の機能(作用)を予測する方法である。本発明において対象となる遺伝子群を以下に示す。また、表1に標的となるタンパク質の遺伝子名、被験物質群、被験物質が標的に結合した場合に作用する機能を示している。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9
【表1】



【0013】
生体の細胞表面などには、機能性成分(リガンド)に対する受容体が発現しており、リガンドが受容体に結合することにより、その後のシグナル伝達が起こり、所定の機能が発揮される。
しかしながら、個体差や環境の変化により、受容体が発現しない場合がある。例えば、図1において、個体A(左パネル)と個体B(右パネル)において、成分aに対する受容体1はどちらの個体にも発現するのに対し、個体Bにおいては受容体bが発現せず、リガンドである成分bを結合することができない。従って、個体によって、受容体2を介したシグナル伝達が起こらずに、生体機能や感受性に個体差が生じることとなる。
本発明においては、所定の成分(図1では成分aや成分b)を摂取又は投与した生体から所定の遺伝子(例えば受容体1の遺伝子や受容体2の遺伝子)の発現を検出し、その検出の態様によって機能性成分の作用、あるいは機能性成分に対する被験生物の感受性などを判定することを特徴とするものである。
【0014】
また、図2に示すように、受容体1のリガンドである成分aを摂取し、その摂取を継続すると、何らかの相互作用が生じて受容体1とは異なる受容体2が増加することがある。その結果、受容体2のリガンドである成分bに対する反応性が高まる(図2B)。このことは、成分aの摂取により成分bの感受性が高まったことを示すものであり、また、成分aは成分bに影響を及ぼす分子であることを示すものである。他方、成分aを摂取し続けると、成分aに対する受容体が増えて成分aに対する反応性又は感受性が摂取開始時と比較して高まることもある(図2C)。
【0015】
このように、成分の摂取前後や摂取期間中における受容体遺伝子の発現を比較することにより、一の成分が他の成分にどのように影響を及ぼすのか、あるいは、一の成分の感受性が高まるのか低下するのかを調べることができる。
【0016】
そこで本発明は、被験生物の感受性の評価、被験物質の機能を予測する工程を含む。各工程を以下に示す。
(1)被験物質を接触、摂取又は投与する前、又は投与等を行なった後の被験生物から試料を採取する。
(2)採取された試料を検出可能な状態へ処理し、遺伝子の検出を行う。
(3)得られた検出結果より、被験生物の感受性の評価や被験物質の機能予測を行う。
【0017】
2.定義
被験物質とは、被験生物に接触させる物質、被験生物が摂取する物質又は被験生物に投与する物質を意味し、食品や薬物が含まれる。
食品とはすべての飲食物のことであり、生鮮食品、加工食品、飲料、調味料材料、食品添加物などの加工材料、植物の粉砕物、植物からの抽出物、それら食品の混合物、食品成分といったものが含まれる。薬物としては医薬品、医薬部外品、薬剤候補物、薬剤混合物、化粧品、化粧品成分、香料、着色料が含まれる。
【0018】
食品は本発明においては特に効能、機能が示されている食品が好ましく、以下に分類分けと食品例を挙げるが、これに限定するものではない。
例えば生鮮食物であれば、コメ、麦、トウモロコシ、カブ、ダイコン、ハツカダイコン、ワサビ、ホースラディッシュ、ゴボウ、チョロギ、ショウガ、ニンジン、ラッキョウ、レンコン、ユリ根、ナス、ペピーノ、トマト、タマリロ、タカノツメ、トウガラシ、シシトウガラシ、ハバネロ、ピーマン、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、ツノニガウリ、シロウリ、ツルレイシ、トウガン、ヘチマ、ユウガオ、オクラ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、エダマメ、ササゲ、シカクマメ、ソラマメ、ダイズ、ナタマメ、ラッカセイ、レンズマメ、ゴマ、スプラウト、モヤシ、かいわれ大根、イチゴ、スイカ、メロン、マクワウリ、カラシナ、キャベツ、クレソン、ケール、コマツナ、サイシン、サンチュ、山東菜、シュンギク、シロナ、セリ、セロリ、タアサイ、ダイコンナ、タカナ、チシャ、チンゲンサイ、ニラ、菜の花、野沢菜、白菜、パセリ、ハルナ、フダンソウ、ホウレンソウ、ミズナ、ミブナ、ミツバ、メキャベツ、ルッコラ、レタス、はなっこりー、ワサビナ、アサツキ、アスパラガス、ウド、コールラビ、ザーサイ、タケノコ、ニンニク、ヨウサイ、ネギ、ワケギ、タマネギ、アーティチョーク、ブロッコリー、カリフラワー、食用菊、なばな、フキノトウ、ミョウガ、サツマイモ、サトイモ、ジャガイモ、ナガイモ、ヤマノイモ、エノキタケ、エリンギ、キクラゲ、キヌガサタケ、シイタケ、シメジ、シロキクラゲ、タモギタケ、チチタケ、ナメコ、ナラタケ、ハタケシメジ、ヒラタケ、ブナシメジ、ブナピー、ポルチーニ、ホンシメジ、マイタケ、マッシュルーム、マツタケ、ヤマブシタケ、カリン、チュウゴクナシ、ナシ、マルメロ、セイヨウカリン、ジューンベリー、シポーバ、リンゴ、アメリカンチェリー、アンズ、ウメ、サクランボ、スミミザクラ、スピノサスモモ、スモモ、モモ、アーモンド、イチョウ、クリ、クルミ、ペカン、アケビ、イチジク、カキ、キイチゴ、キウイフルーツ、グミ、クワ、クランベリー、コケモモ、ザクロ、サルナシ、シーバックソーン、スグリ、ナツメ、ニワウメ、ビルベリー、フサスグリ、ブドウ、ブラックベリー、ブルーベリー、ポーポー、マツブサ、ラズベリー、ユスラウメ、柑橘類、オリーブ、ビワ、ヤマモモ、トロピカルフルーツ、イチゴ、スイカ、メロン、バナナ及びこれらの食材の可食部、葉、種子、他に牛肉、豚肉、鶏肉、卵、馬肉、羊肉、猪肉、鹿肉、魚やカニ、海老、イカ、蛸といった魚介類、海草などが挙げられる。加工食品としてはケフィア、ヨーグルト、納豆、味噌、醤油、漬物などといった発酵食品が挙げられ、他に煎茶、玉露、番茶といった緑茶や、白茶、ウーロン茶といった青茶、紅茶、黒茶、コーヒーのような飲料、前述した生鮮食品からの窄汁、塩、こしょうといった調味料などを挙げることができる。
【0019】
さらに食品中の成分として例を挙げると、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート(EGCG)などを含むカテキン類、ダイゼイン、ダイジン、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、フォルモノネチンなどを含むイソフラボン類、シアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジンなどを含むアントシアニン類、ケルセチン、ミリセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、セサミン、クルクミン、リモニン、ガンマ−アミノ酪酸(GABA)、アスタキサンチン、ガランギン、シトラール、トリゴネリン塩酸塩、エラグ酸、キナ酸、サポニン、カプサイシン、ハイドロコルチゾン、オレイン酸、ベンジルイソチオシアネート、マンギフェリン、アピゲニン、ルテオリン、クロロゲン酸、リモネン、スクアレン、レチノール、ロズマリン酸、カフェ酸、リポ酸などの物質、カロテノイド類、アラキドン酸、リノレン酸などを含む多価不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、9c11tCLA、10t12cCLAなどを含む共役リノール酸類、胆汁酸、葉酸、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンD、ビタミンE、ビタミン誘導体などのビタミン類、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖類、糖化最終産物、免疫賦活物質、その他リバビリン、インターフェロン類など多様な化合物を挙げることができる。また食品中の成分としては厚生労働省の指定添加物リスト記載の添加物等が含まれる。
【0020】
薬物としても以下に分類分けと食品例を挙げるが、これに限定するものではない。たとえば薬剤成分としてはアスピリン、アミラーゼ、アラントイン、アロイン、アンジオテンシン、アンドロステンジオン、インベルターゼ、AMT、N−ニトロソフェンフルラミン、エフェドリン、カオリン、カタラーゼ、γ−オリザノール、グアイフェネジン、グルタチオン、2C−I、2−CT−2、2−CT−7、GHB、GBL、シクロフェニール、臭化水素酸デキストロメトルファン、スルフォンアミド、タイシャセキ、タウリン、脱N−ジメチルシブトミン、DHEA、1−デオキシノジリマイシン、TMA−2、ニコチン、パパイン、パンクレアチン、BZP 1、BD、BDD、5−HTP(ヒドロキシトリプトファン)、ビンカミン、プロスタグランジン、プロテアーゼ、ブロメライン、ペプシン、ホモシルデナフィル、マルターゼ、メラトニン、ヨウキセキ、ラクターゼ、リパーゼ、ルンブルキナーゼ等の薬剤成分、ビンブラスチン、ビンクリスチンや、パクリタキセル、リグナン由来の薬剤が挙げられ、そのほか厚生労働省 「医薬品の範囲に関する基準」に記載の植物由来物、動物由来物、化学物質等なども挙げられる。
【0021】
化粧品成分としてはアクリル酸、アシタバエキス、アスコルビン酸、アセトン、アセロラエキス、アプレシエ、甘草エキス、アミノ酪酸、アラントイン、アルギニン、アルテアエキス、アルブチン、アルミナ、アロエベラエキス、安息香酸Na、イオウ、イソオクタン酸セチル、イソステアリン酸、イソフラボン、イチョウエキス、ウコンエキス、ウワウルシエキス、エタノール、エステル類、エデト酸、エラグ酸、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、オウゴンエキス、オキシベンゾン、オタネニンジンエキス、オリーブ油、オレイン酸、加水分解コラーゲン、加水分解コンキオリン、カッコンエキス、カミツレエキス、カルボマー、カロチン、カワラヨモギエキス、カンフル、キウイエキス、キサンタンガム、キュウリエキス、クエン酸、グリコール酸、グリセリン、グリチルリチン酸2カリウム、グルタチオン、グルタミン酸、クロレラエキス、ケイヒエキス、ケラチン、コーン油、コウジ酸、コハク酸、コムギ胚芽エキス、コメヌカエキス、サクラ葉エキス、サフラワー油、サリチル酸ナトリウム、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化チタン、シクロメチコン、ジステアリン酸グリコール、シソエキス、シャクヤクエキス、ジブチルヒドロキシトルエン、ジブロピレングリコール、ジメチコン、シラカバエキス、シリカ、シルクエキス、スーパーオキシドジスムターゼ、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水添レシチン、酢酸トコフェロール、スクワラン、ステアリン酸、ステアリルアルコール、スルホコハク酸、セージエキス、セタノール、セラミド3、セリン、ソウハクヒエキス、ソルビトール、ダイズエキス、ダイズステロール、タルク、チャエキス、チューベロース、月見草油、ツバキ油、テトラオレイン酸ソルベス−60、テンシャエキス、トウエキス、トコフェロール、トリエタノールアミン、トレハロース、ナイアシンアミド、ナイロン12、ナガサリエキス、ナズナエキス、ニコチン酸トコフェロール、乳酸、乳酸ナトリウム、尿素、ネオペンタン酸オクチルドデシル、ノバラ油、パーフルオロ、白金、パパイン、ハマメリスエキス、パラフィン、パラベン、パルミチン酸レチノール、パレス−3硫酸ナトリウム、パンテノール、BG、PG、PCA−ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒトオリゴペプチド、ビフィズス菌発酵エキス、フェノキシエタノール、ブクリョウエキス、ブドウ種子油、ブナエキス、フラーレン、プラセンタエキス、フラビンアデニンジヌクレオチド、プルラン、ベタイン、ベニバナ、ベンジルアルコール、ホップエキス、ホホバ油、ポリアクリル酸Na、ポリエチレン、ポリソルベート60、ポリビニルアルコール、マイカ、マカデミアナッツ油、マンニトール、ミツロウ、ミネラルオイル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ムクロジエキス、メトキシケイヒ酸オクチル、メドウフォーム油、メントール、ヤシ油脂肪酸、ユーカリエキス、ユキノシタエキス、ユズエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ラウリン酸、ラウレス7、ラウロイル加水分解シルク、ラクトフェリン、ラノリン、リノール酸、リボフラビン、レイシエキス、レチノール、レモンエキス、ローズマリーエキス、ローズヒップ油、ローヤルゼリー、ワセリン、ワレモコウエキスなどが挙げられる。
【0022】
被験生物とは、被験物質を接触、摂取又は投与する対象となる生物であり、動植物個体、動植物組織、動植物細胞(培養細胞を含む)、線形動物及び微生物(ウイルス、菌類)などが含まれる。
動物は昆虫、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類の生きている動物を指す。動物はヒト、マウス、ラット、ウマ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、ブタ、アカゲザル、コモンマーモセット、ニワトリ、アフリカツメガエル、ニシツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ、蚊、線虫、ショウジョウバエ、マラリア原虫などが挙げられ、植物としては、アブラナ、藻類、褐藻類などが挙げられる。
細胞は培養細胞としてU937細胞、RAW264.7細胞、RBL−2H3細胞、Jurkat細胞、HL−60細胞、MOLT−4細胞、Huh−7細胞、HepG2細胞、Hep3B細胞、Caco−2細胞、HeLa細胞、MCF−7細胞、A431細胞、S1T細胞、Su9T01細胞、HUT101細胞、PLC/PRF−5細胞、Li90細胞、HUVEC細胞、HMEC細胞、HT17細胞、NIH−3T3細胞、3T3−L1細胞、MH134細胞、dRLh−84細胞、RLN−10細胞、PC3細胞、PC12細胞、3Y1細胞、B16細胞、KU812、PANC−1細胞、U266細胞、A549細胞、RPMI8226細胞、ARH−77細胞、MKN−45細胞などヒト、マウス、ラットなど哺乳動物由来細胞株、またはこれらの細胞株から派生する細胞株、各種組織由来の初代細胞、幹細胞、ES細胞やiPS細胞を挙げることができる。菌類としては出芽酵母、分裂酵母、大腸菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌、マラリア、緑膿菌、古細菌、真菌、キノコ類を挙げることができる。
【0023】
接触、摂取または投与する方法は、動物に対しては被験物質を経口、経皮、静脈、腹腔、局所で投与することであり、細胞、菌類に対しては、培地に対して被験物質を添加することをいう。接触、摂取又は投与する被験物質の状態は固体、粉末、溶液、懸濁液といずれでもかまわないが、摂取する方法に適した状態が望ましい。
被験生物から採取された試料とは、被験生物から単離又は取り出した生体試料のことをいい、血液、皮膚、粘膜、その他臓器、破砕液又はそれらより取り出された核酸のことをいう。試料中の遺伝子の検出とは採取された試料中のmRNAの量を測定することである。mRNA量測定法としては、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法(RT−PCR法)、リアルタイムPCR法、ノーザンブロッティング及びドットブロット、核酸マイクロアレイなどの方法が挙げられる。測定のための試料の調製は各測定方法に適した方法で行う。
参照とは、被験生物の測定結果と比較し、その結果を判断するための対照被験生物及び対象被験生物群である。
【0024】
3.測定方法
RT−PCR法の場合、生体試料から抽出したmRNAから逆転写反応によってcDNAを合成し、測定対象の遺伝子配列に相補的な2種類のDNA断片をプライマーとしたPCR法により測定対象の遺伝子の一部配列を増幅し、増幅されたDNA断片を検出することで、mRNA量を定量することができる。使用するプライマーは、測定対象の遺伝子の塩基配列をPCR法等の核酸増幅法により増幅できるように設計・合成することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーの設計・合成は当業者に容易に実施することができる。例えば、PCR法においては、2つのプライマーの一方が測定対象遺伝子の2本鎖DNAのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが2本鎖DNA のマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。プライマーの長さとしては、例えば、少なくとも10塩基、好ましくは少なくとも15塩基、より好ましくは少なくとも20塩基とする。具体的に、プライマーは、GenbankやNCBIなどのデータベースより各遺伝子のアクセッション番号により登録された1種以上の塩基配列に基づき設計し、化学合成できる。プライマーの調製は常法に従って実施できる。PCR法により増幅されたDNA断片は、アガロースゲル電気泳動の後、DNAに特異的に結合するエチジウムブロマイドやSYBER GREENなどの蛍光物質で標識することにより視覚化し、定量することができる。
【0025】
また、PCR法としては、定量性の高いリアルタイムPCR法を採用することがより好ましい。ABIPRISM7500(アプライドバイオシステムズ社製)などのリアルタイムPCR装置を用いてPCRを行うことで、増幅産物をリアルタイムに検出・モニタリングし、測定対象の遺伝子発現量(mRNA量)をより定量的に測定することが可能である。増幅されるDNAは前述のSYBER GREENなどの蛍光物質で標識することにより検出できる。また、リアルタイムPCR法では、通常の2種類のプライマーと合わせてTaqManプローブを用いる方法が、核酸増幅の特異性及び測定の感度を上げる方法としてより好ましい。予めクエンチングされたFAM、VICなどの蛍光物質で標識されているTaqMan(登録商標)プローブを含めた3種のDNA断片を用いることにより、測定対象の遺伝子配列を特異的に増幅し、高感度に検出することが可能である。TaqManプローブを用いたリアルタイムPCR法は周知であり、使用するプローブとプライマーの選択は当業者に容易に実施することができる。遺伝子特異的なプローブ及びプライマーは、各遺伝子のmRNA又はcDNA配列情報に基づいて、Primer express(アプライドバイオシステムズ社製)などの作製ソフトを使用することにより設計することが可能である。また、既に特定の遺伝子を検出するために特異的にデザインされ、製品化されたプローブ及びプライマーを用いることもできる。
【0026】
ノーザンブロッティング及びドットブロット等の解析法を適用する場合、測定対象の遺伝子に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするDNA断片を用いて測定することができる。この解析方法において使用されるDNA断片の長さは、特に限定されないが、測定対象の遺伝子に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズさせるのに十分な長さである。
【0027】
DNA断片の長さとしては、例えば、少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも100塩基、より好ましくは少なくとも200塩基の配列である。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、高い相同性(相同性又は同一性が60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上)を有する一対のポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて採用される条件を設定することができる。具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(Saline Sodium Citrate;150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム)溶液を用い、65℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。
【0028】
これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。また、この解析法で使用するDNA断片は、表1に示した遺伝子のmRNA又はcDNAに対して特異的にハイブリダイズする塩基配列であればよく、最も好ましくは、表1に示した遺伝子の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列として設計することができる。
【0029】
また、この解析法で使用するDNA断片は、表1に示した遺伝子のmRNA又はcDNAに対して特異的にハイブリダイズするならば、表1に示した遺伝子の塩基配列の相補鎖に対して高い相同性(相同性又は同一性が60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上)を有する塩基配列として設計することもできる。ここで、特異的にハイブリダイズするとは、上述したストリンジェントな条件と言い換えることができる。さらに、この解析法で使用するDNA断片としては、上述した遺伝子の塩基配列に基づいて設計するが、これら遺伝子において知られるSNP等の多型を含まないように設計することが好ましい。これによりDNA断片を用いた遺伝子の検出誤差を低く抑えることができる。さらにまた、遺伝子発現量を測定する手段としては、特に限定されず、生体由来試料に由来するcDNAを固定化したメンブレンフィルター又はリボプローブを用いたRNAプロテクションアッセイ等の従来公知の手段を適用することができる。
【0030】
また、本発明においては検出のために核酸マイクロアレイを使用した解析方法を適用することができる。核酸マイクロアレイでは、特定の遺伝子と特異的にハイブリダイズするDNA断片(オリゴヌクレオチド)をチップ上で高密度に合成・集積した核酸マイクロアレイに対して、生体試料由来のRNA、cDNA又はcRNA(aRNA)をハイブリダイズすることにより、遺伝子のmRNA量を網羅的に定量することができる。例えば、三菱レイヨン社製のDNAチップ(ジェノパール(登録商標))の場合、各対応配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、高密度に固定化されており、生体試料由来のRNAからT7 オリゴdTプライマーを使用して2本鎖cDNA合成を行った後、in vitro TranscriptionによりaRNAを合成する。aRNA合成の際にビオチンを取り込み、サンプルを標識する。ビオチン標識aRNAを断片化してDNAアレイにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後に蛍光色素を修飾したストレプトアビジンなどによりaRNAを検出する。蛍光検出機で蛍光を読み取り、得られたアレイイメージを数値化し、各遺伝子の発現量を比較・定量することができる。また、用いる核酸マイクロアレイは上述の方法に限るものではなく、当業者が入手可能な複数種の核酸マイクロアレイを用いて同様の解析が可能である。
【0031】
4.遺伝子検出結果と被験物質の作用と関連付ける方法
被験物質を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料及び接触、摂取又は投与前またはブランク(プラセボ、溶媒のみなど)を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料を測定し、得られたmRNA量測定結果より被験物質の作用を関連付ける。測定結果で評価に使用するデータは、判定値以上の値のみを使用する。判定値はネガティブコントロールの平均値Xを用いることができ、さらにはXに標準偏差σを足した値、さらにはX+2σ、さらにはX+3σが望ましい。ネガティブコントロールとは、被験生物からの試料で検出されるはずのない遺伝子であり、例えば被験生物と異なる他種生物の遺伝子などである。得られたデータの各サンプル間の誤差をハウスキーピング遺伝子(gapdh、actin、arbp等)の値で補正し、補正したデータを用いてmRNA量の変動を判定する。mRNA量の変動は検定により統計的に判定する。各被験生物より試料をn=3以上取得し、t検定を行う。P値が0.05以下の場合に、さらには0.01以下の場合に有意に変動したと判定する。変動した遺伝子の中で被験物質の接触、摂取又は投与した場合のみで変動した遺伝子がある場合、被験物質はその遺伝子に対して作用したと判定する。
【0032】
ところで、本発明の方法では、複数の被験生物由来の試料を用いてmRNAのレベルを測定する場合がある。従って、予め規定された数の被験生物(1次母集団)において上記mRNAを測定し、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる単数又は複数の被験生物由来の試料のmRNAとを比較することができる。
さらに、上記測定された被験生物由来のデータを前記母集団の値に組み込んでmRNAレベルを再度データ処理し(平均値化等)、対象となる被験生物(母集団)の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、mRNAの臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、検出精度を高めることができる(本発明の感受性評価方法、機能予測方法、及び被験物質の影響を予測する方法についても、同様に実施することができる)。
【0033】
5.被験生物の感受性評価方法
感受性の評価は、前項に記載の作用した遺伝子と表1の被験物質となる成分、被験物質となる成分が標的のタンパク質と結合した場合の機能を見て、評価を行う。例えばMYPT1のmRNA量が減少していても67LRとZAP70、BCL2のmRNA量が増加していた場合、お茶のEGCGに対して、アポトーシス誘導作用を促進する機能の点で感受性が高いと評価することが出来る。さらに、評価の方法としては被験生物と参照とを比較して行い、複数の遺伝子のmRNA量を総合的に評価することが好ましい。被験生物とは、被験物質を接触、摂取又は投与し、表1の遺伝子の発現量の変化を観測することで感受性を評価する対象者であり、参照とは、被験生物の測定結果と比較し、その結果を判断するための対照被験生物及び対象被験生物群である。
【0034】
総合的に評価する方法は以下の通りである。
比較方法は被験物質を摂取した場合の生態変化(体重、血中の成分など被験物質が及ぼす効果に関するデータ)や生活習慣とmRNA量とを対応付けしたデータベースを作成し、そのデータベースと被験生物のmRNA量の測定結果とを照らし合わせて総合的に評価する。評価方法は、多変量解析による計算処理を行うのが好ましく、回帰分析、学習法、クラスター解析、相関分析などがある。まず被験生物について、被験物質摂取後の各遺伝子の発現量の値をハウスキーピング遺伝子を基準に相対値に表す、又は摂取後の値を摂取前の値又はブランクで除算した値を百分率又はLogなどで表す。参照についても同様に表し、被験生物と参照との値から計算処理を行う。このときに使用する遺伝子のデータは前項で記載した方法で変動した又は作用したと判断した遺伝子群の値を用いることが望ましい。
【0035】
6.被験物質の機能予測方法
被験物質の機能の予測方法においては、mRNA量測定結果より各遺伝子に関連する機能からその被験物質の機能を予測することができる。複数の遺伝子の結果を用いて複合的に評価するのが好ましい。
総合的に評価する方法は以下の通りである。
例えば、ある被験物質Aの摂取前後で、67LRとZAP70、BCL2のmRNA量が増加し、eEF1AやMYPT1に変化がない場合、この被験物質Aはアポトーシス誘導作用を促進する機能が強いと予測できる。また、67LRとeEF1A、MYPT1のmRNA量が増加した場合はヒスタミン放出阻害作用を促進する機能が強いと予測できる。さらに定量的に機能の予測を行う場合は被験生物と参照又は参照群を比較する方法が好ましく、ここでいう参照は機能性が既知の試料を摂取した被験生物群が好ましい。具体的な比較方法は機能性既知試料を摂取した参照群のmRNA量とその機能性を対応付けしたデータベースを作成し、機能性未知試料を摂取した被験生物のmRNA量の測定結果を総合的に評価して機能性未知材料の機能性を予測する。総合的な評価方法は、前項に記載の方法と同様に行う。
本発明においては、被験物質に関するポジティブな機能性に加えて、副作用や毒性といったネガティブ機能性に関しても、mRNA量の変化の方向、組合せなどから、総合的に判定できるようにするのが望ましい。それにより、食材、医薬品、医薬品候補物質のポジティブな機能性だけでなく、ネガティブな機能性も併せて評価することができる。また、総合的に判断することで、他の摂取する物質への影響を評価することが出来る。例えば、治療患者の補完代替医療として用いる食品、サプリメントにおいては、その治療患者にどの食品、そのサプリメントを摂取することが良いかを評価することができ、また医薬品同士、食品成分同士を組み合わせた摂取においてもそれらの組合せによる影響を予測することもできる。
【0036】
7.被験物質の影響を予測する方法
本発明は、分子A又は遺伝子Aを標的として作用する被験物質X、及び当該分子A又は遺伝子Aとは異なる他の分子B又は遺伝子Bを標的として作用する被験物質Yを、同時に又は相前後して接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、前記遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を指標として、前記被験物質Xと被験物質Yとが互いに影響を及ぼすか否かを予測する方法を提供する。
この方法は、成分aが他の成分bにどのように影響するかを評価するというものである(図2)。
具体的には、以下の手法により評価する。
被験物質Xの接触、摂取又は投与前後で採取された試料のmRNA量を検出し、前述と同様にmRNAの量の変動を判定する。変動している遺伝子に結合する成分が被験物質Yとすると、XとYは影響を及ぼすと判定できる。ただし影響の効果が正に働くか(お互いの機能を高めあうか)、負に働くか(お互いの機能を打ち消しあうか)は変動の増減のみでは一様に述べることはできず、これは表1の被験物質が結合した場合の機能を参照する。例えば、X=アポトーシス誘導作用、Y=アポトーシス抑制作用の場合、被験物質Xを摂取して、Yが結合する遺伝子が増加した場合、お互いの機能を打ち消しあうと評価できる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例1】
【0037】
以下の通り、プラセボ対照3群並行群間比較試験二重盲検法により評価した。
介入群にはやぶきた茶エキス粉末を入れたカプセルもしくはたべにふうきエキス粉末を入れたカプセルを粉末1.8g/dayとなるように計12週間投与した。対照群には実薬と外観の類似したプラセボ(デンプン粉)を12週間投与した。また、試験開始1ヶ月前から試験終了までの16週間、被験者にカテキンを含む緑茶、紅茶、ウーロン茶、サプリメント等の摂取制限をした。30〜70歳の住民249人を予備検査(血液・尿検査、身体測定)等の結果から総コレステロールやLDL−コレステロールが高い人を中心に161人を選考後、無作為に3群に分けた。摂取開始日、摂取6週間後、摂取12週間後にパクスジーンRNA採血管(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)を用いて採血し、採血した血液検体2.5mLから、PAXgene Blood RNA Kit(QIAGEN)を用いてtotal RNAを精製した。このTotal RNA 1μgより合成Amp II−Biotin Enhancedキット(アプライドバイオシステムズ社製)を用い、添付のプロトコールに従ってaRNAの調製を行った。得られたaRNA 5μgをプラスチックチューブに入れ、Message AmpII−Biotin Enhancedキット(アプライドバイオシステムズ社製)付属の5x Array Fragmentation Buffeを4μL添加し、20μLにメスアップしてよく混合した後、94℃で7.5分間加熱して断片化を行った。断片化後の溶液20μLに、18μLの1M Tris−HCl溶液(インビトロジェン社製)、18μLの1M NaCl溶液(ナカライテスク社製)及び15μLの0.5% Tween 20溶液をそれぞれ混合し、Nuclease−free waterで150μLにメスアップして、検体液を調製した。
【0038】
調製した検体液に、核酸マイクロアレイ(三菱レイヨン株式会社製DNAチップ プローブは表2に示すものを用いた(配列番号1〜98)。)を浸漬し、65℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。当該アレイからハイブリダイゼーションに用いた検体液を除去した後、当該アレイを65℃の0.12M TNT溶液(0.12M Tris−HCl、0.12M NaCl、0.5%Tween 20溶液)中に浸漬し(20分間×2回)、次いで、65℃に温めた0.12M TN溶液(0.12M Tris−HCl、0.12M NaCl)に10分間浸漬して、洗浄した。核酸マイクロアレイにおけるシグナルの検出は、DNAチップ検出装置(横河電機製:MB−M3A、レーザー波長:633nm)を用い、Cy5の蛍光強度を測定した(露光時間:0.1秒, 1秒, 4秒, 40秒)。なお、結果はバックグランドを減算後、β−actinの値を用いて補正した。
【表2−1】


【表2−2】

【0039】
結果を図3に示す。図3の各遺伝子に記載のグラフは、左からやぶきた0週、やぶきた6週、やぶきた12週、べにふうき0週、べにふうき6週、プラセボ0週、プラセボ12週である。
やぶきた茶を摂取した人々においては、67LRやeEF1A、MYTP1などEGCGに関連する遺伝子、TLRファミリーが摂取期間と共に増加しているのに対し、べにふうき茶、プラセボを摂取した人々では増加していない。このことから、やぶきた茶はべにふうき茶と比較してポジティブフィードバックの効果があり、また自然免疫反応を促進する効果もあることがわかる。また、やぶきた茶を摂取した場合はFOLR3が増加したのに対して、べにふうき茶、プラセボはFOLR1、FOLR2が増加したことから、やぶきた茶とべにふうき茶で葉酸レセプターに働く作用が異なることが分かる。従って、本発明の方法は摂取者の時間経過(摂取期間)による感受性の変化を観測すること、また摂取物の機能の予測をする点で有効であるといえる。
【実施例2】
【0040】
マウスメラノーマ細胞株B16を1 x 10cells/mL にて2mL dishに播種し、5% FBS−DMEMで24h培養した。その後終濃度0.1 mMのATRA含有1% FBS−DMEM (5 mg/mL BSA) に置換し、24hあるいは 48 h 培養した後、Trizolにて細胞を溶解した。Message Amp II−Biotin Enhancedキット(アプライドバイオシステムズ社製)を用い、添付のプロトコールに従ってTotal RNA 1 mgからaRNAの調製を行った。aRNA 5μgをプラスチックチューブに入れ、Message AmpII−Biotin Enhancedキット(アプライドバイオシステムズ社製)付属の5x Array
Fragmentation Buffeを4μL添加し、20μLにメスアップしてよく混合した後、94℃で7.5分間加熱して断片化を行った。断片化後の溶液 20μLに、18μLの1M Tris−HCl溶液(インビトロジェン社製)、18μLの1M NaCl溶液(ナカライテスク社製)及び15μLの0.5% Tween 20溶液をそれぞれ混合し、Nuclease−free waterで150μLにメスアップして、検体液を調製した。
【0041】
調製した検体液に、核酸マイクロアレイ(三菱レイヨン株式会社製DNAチップ プローブは表3に示すもの(配列番号99〜188)を使用した。)を浸漬し、65℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。当該アレイからハイブリダイゼーションに用いた検体液を除去した後、当該アレイを65℃の0.12M TNT溶液(0.12M Tris−HCl、0.12M NaCl、0.5%Tween 20溶液)中に浸漬し(20分間×2回)、次いで、65℃に温めた0.12M TN溶液(0.12M Tris−HCl、0.12M NaCl)に10分間浸漬して、洗浄後にシグナルを検出した。核酸マイクロアレイにおけるシグナルの検出は、DNAチップ検出装置(横河電機製:MB−M3A、レーザー波長:633nm)を用い、Cy5の蛍光強度を測定した(露光時間:0.1秒, 1秒, 4秒, 40秒)。なお、結果はバックグランドを減算後、β−actinの値を用いて補正した。
【表3−1】


【表3−2】



【0042】
結果を図4に示す。ATRAを添加した場合はVimentinの発現量がブランク(エタノール)と比較して約50%減少しており、67LR、Pparg、TopI、Fabp5、Adipor1、Adipor2、C3、Ager、TLR9の発現量は約25%から95%増加していた。このことから、ATRAはカテキン(EGCG)、フラボノイド、脂肪酸などの感受性を増加させると予想され、それらの成分を含む食品の摂取に影響を与えると考えられる。従って、本発明の方法は食品成分の組み合わせを評価する点で有効である。
【実施例3】
【0043】
マウスメラノーマ細胞株B16を1 x 10 cells/mLにて2mL dishに播種し、5% FBS−DMEMで24hr培養した。その後終濃度0.1 mMのequol含有1% FBS−DMEM (5 mg/mL BSA)に置換し、以下実施例2と同様の操作を行った。得られた結果をchrysin、apigenin、luteolin、daidzein、genisteinの結果と比較して評価した。評価方法はバックグランドを減算後、ハウスキーピング遺伝子で補正し、ブランクサンプルの値を基準に百分率で表し、それを解析ソフトMev(Tigr)のHCL(Pearson correlation)でクラスタリングを行った。その結果を図5に示す。クラスタリングの結果equolはapigeninと近い性質を示す可能性が示唆された。
【実施例4】
【0044】
マウスを用いて高脂肪高ショ糖食による感受性遺伝子の変化を観測した。
12週齢のオスC57BL/6Jマウス(九動株式会社)に、普通食(AIN−93G、株式会社KBTオリエンタル)または高脂肪高ショ糖食(株式会社KBTオリエンタル)を6週間制限摂食させた(4 g/day/mouse)。その後イソフルラン(アボットジャパン株式会社)麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺を行い、肝臓および大腿四頭筋を摘出した。摘出した臓器よりRNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、添付のプロトコールに従ってTotal RNAを抽出した。以下aRNAの調製、核酸マイクロアレイアレイによる測定、データ解析は実施例1と同様に行った。
大腿四頭筋の結果を図6A及びB、肝臓の結果を図7A〜Cに示す。図中、「Control」は普通食を摂食させたマウスの結果を示し、HFHSは高脂肪高ショ糖食を摂食させたマウスの結果を示す(Mean±S.D.、*p<0.05)。
大腿四頭筋においては普通食群と比較して高脂肪高ショ糖食群では複数の遺伝子で有意な発現量の減少が観測された。大腿四頭筋で発現が有意に減少した遺伝子(P<0.05)は、Zap70、Ar、Esr1、Stx3、Clec7a、Cd11b、Gria3、Gria4、Tlr1及びTlr9であった。また、発現量が増加した遺伝子は観測されなかった。
肝臓では発現量が有意に変化した食品因子感知遺伝子は一種類であった。肝臓で発現が有意に減少した遺伝子(P<0.05)は、Cd11bであった。
これらの結果から、高脂肪高ショ糖による感受性遺伝子の変化及び臓器間で感受性遺伝子の発現量変化の違いを測定することができた。
【実施例5】
【0045】
廃用性筋萎縮の状態と通常の状態とでの感受性遺伝子の変化を観測した。
12週齢のオスC57BL/6Jマウス(九動株式会社)を平均体重が等しくなるように群分けし、水をゾンデによって2日に一回強制投与した。投与開始から7日後、尾懸垂群(TS:Tail Suspension群、N=3)と通常群(GR:Ground群、N=3)に分け、尾懸垂試験を開始した。尾懸垂試験開始から10日後、イソフルラン(アボットジャパン株式会社)麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺を行い、各臓器及び各筋肉を摘出した。餌は固形MF食(株式会社KBTオリエンタル)を自由摂食させた。
大腿四頭筋から RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、添付のプロトコールに従ってTotal RNAを抽出した。以下aRNAの調製、核酸マイクロアレイアレイによる測定、解析は実施例1と同様に行った。
有意な発現量の変化があった遺伝子の結果を図8A及びBに示す。図中、「TS」は尾懸垂群を示し、「GR」は通常群を示す(Mean±S.D.、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。食品因子感知遺伝子の多くが廃用性筋萎縮により発現量が減少する傾向が見られ、増加した遺伝子はPpardとLgals3、Feel−2であった。この結果のように、廃用性筋萎縮状態により感受性遺伝子の発現量が低下することを該核酸マイクロアレイで測定することができた。
【配列表フリーテキスト】
【0046】
配列番号1〜188:合成DNA

【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の遺伝子群のうち1又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の作用と関連づけることを特徴とする前記方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9
【請求項2】
被験生物の被験物質に対する感受性を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9
【請求項3】
被験物質の機能を予測する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9
【請求項4】
分子A又は遺伝子Aを標的として作用する被験物質X、及び当該分子A又は遺伝子Aとは異なる他の分子B又は遺伝子Bを標的として作用する被験物質Yを、同時に又は相前後して接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を指標として、前記被験物質Xと被験物質Yとが互いに影響を及ぼすか否かを予測する方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9
【請求項5】
被験物質が食品又は薬物である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。

【図6A】
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【図6B】
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【図7A】
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【図7B】
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【図7C】
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【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図8A】
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【図8B】
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【公開番号】特開2012−231786(P2012−231786A)
【公開日】平成24年11月29日(2012.11.29)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−91877(P2012−91877)
【出願日】平成24年4月13日(2012.4.13)
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第1項適用申請有り 日本農芸化学会2011年度大会講演要旨集
【出願人】(504145342)国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】(000006035)三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Fターム(参考)】