【課題】標識試薬および標識化分析物の混合物を含む、標識試薬、標識化分析物、およびそれらに由来するフラグメントイオン、ならびに標識化分析物の分析のための方法を提供すること
【解決手段】本発明は、標識試薬、標識された分析物（その混合物を含む）、およびそれから誘導されるフラグメントイオンに関する。本発明はまた、標識試薬（Ｎ−置換ピペラジン酢酸ベースの標識試薬を含む）、標識された分析物（その混合物を含む）およびそれから誘導されるフラグメントイオンの生成方法、ならびにその標識された分析物の分析方法に関する。本発明の方法によれば、定量されるべき分析物は、標識化される。標識化された分析物、分析物それ自体、その分析物の１種以上のフラグメントおよび／またはその標識のフラグメントは、質量分析により定量され得る。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンデム質量分析計におけるフラグメンテーションおよびさらなる分析のために選択される２種以上の異なる同重体標識で標識化された同じ分析物のフラグメントイオンの混合物であって、ここで該標識化分析物のうちの少なくとも２つが、以下：
【化１】

からなる群より選択される式の化合物であり、ここで観察されるイオンフラグメントが、正電荷を帯びているかまたは負電荷を帯びているかのいずれかである、混合物。
【請求項２】
前記分析物がペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、または１５００ダルトン未満の分子量を有する低分子である、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
前記フラグメンテーションおよびさらなる分析が、以下：
【化２】

からなる群より選択される式の、少なくとも２種の特徴イオンを生成する、請求項１に記載の混合物。
【請求項４】
前記フラグメンテーションおよびさらなる分析が、^１３ＣＣ_５Ｈ_１３Ｎ_２^＋、^１３ＣＣ_５Ｈ_１３^１５ＮＮ^＋、^１３Ｃ_２Ｃ_４Ｈ_１３^１５ＮＮ^＋および^１３Ｃ_３Ｃ_３Ｈ_１３^１５ＮＮ^＋からなる群より選択される分子式の、少なくとも２種の特徴イオンを生成する、請求項１に記載の混合物。
【請求項５】
方法であって、以下：
ａ）各々１つ以上の反応性分析物を含む２つ以上のサンプルを、一セットの標識試薬のうちの異なる標識試薬と反応させて、それにより各々１つ以上の標識化分析物を含む２つ以上の差次的に標識化されたサンプルを生成する工程であって、ここで該一セットの異なる標識試薬が、各々、式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ
またはそれらの塩形態および／もしくは水和物形態を含み、ここで、
ｉ）ＲＧは、求核剤であるかまたは求電子剤であり、かつ該サンプルの１つ以上の反応性分析物と反応し得る反応性基であり；
ｉｉ）ＲＰは、固定電荷を有するか、またはイオン化可能であるレポーター部分であって、各レポーターの総質量は、該セットの各試薬に対して異なり；
ｉｉｉ）ＬＫは、該反応性基と該レポーター基とを連結するリンカー部分であり、該リンカーの質量は、該レポーターとリンカーの組合せの凝集体総質量が、該セットの各試薬に対して同じであるように、該セットの異なる標識試薬に対するレポーター間の総質量の差を補い；
ｉｖ）Ｘは、該レポーターの原子と該リンカーの原子との間の結合であり；
ｖ）Ｙは、該リンカーの原子と該反応性基の原子との間の結合であり、いったん該標識試薬が該反応性分析物と反応すると、結合Ｙは該リンカーを該分析物に連結し；そして
ｖｉ）結合ＸおよびＹは、解離エネルギーレベルに供された場合に、該標識化分析物の少なくとも一部分においてフラグメント化する、工程；
ｂ）該差次的に標識されたサンプルの２つ以上またはその一部と、必要に応じて１つ以上の較正用標準とを混合し、それによりサンプル混合物を生成する工程；ならびに
ｃ）工程（ａ）を実施した後に、各差次的に標識化されたサンプルを少なくとも１種の酵素で消化し、該サンプルの成分を部分的または完全に分解する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
方法であって、以下：
ａ）各々１つ以上の反応性分析物を含む２つ以上のサンプルを、一セットの標識試薬のうちの異なる標識試薬と反応させて、それにより各々１つ以上の標識化分析物を含む２つ以上の差次的に標識化されたサンプルを生成する工程であって、ここで該一セットの異なる標識試薬が、各々、式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ
またはそれらの塩形態および／もしくは水和物形態を含み、ここで、
ｉ）ＲＧは、求電子剤であり、かつ該サンプルの１つ以上の反応性分析物と反応し得る反応性基であり；
ｉｉ）ＲＰは、固定電荷を有するか、またはイオン化可能であるレポーター部分であって、各レポーターの総質量は、該セットの各試薬に対して異なり；
ｉｉｉ）ＬＫは、該反応性基と該レポーター基とを連結するリンカー部分であり、ここで
ａ）該リンカーの質量は、該レポーターとリンカーの組合せの凝集体総質量が、該セットの各試薬に対して同じであるように、該セットの異なる標識試薬に対するレポーター間の総質量の差を補い；そして
ｂ）該リンカーは、少なくとも１つの重原子同位体を含み、そして以下：
【化３】

の式を有し、ここでＲ^１は、同じかまたは異なり、かつ必要に応じて１個のヘテロ原子を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含むアルキル基、または置換もしくは非置換のアリール基であり、ここで該アルキル基およびアリール基の炭素原子は、独立に連結された水素原子、重水素原子および／またはフッ素原子を含み；
ｉｖ）Ｘは、該レポーターの原子と該リンカーの原子との間の結合であり；そして
ｖ）Ｙは、該リンカーの原子と該反応性基の原子との間の結合であり、いったん該標識試薬が該反応性分析物と反応すると、結合Ｙは該リンカーを該分析物に連結する、工程；
ｂ）該差次的に標識されたサンプルの２つ以上またはその一部と、必要に応じて１つ以上の較正用標準とを混合し、それによりサンプル混合物を生成する工程；ならびに
ｃ）工程（ａ）を実施した後に、各差次的に標識化されたサンプルを少なくとも１種の酵素で消化し、該サンプルの成分を部分的または完全に分解する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
方法であって、以下：
ａ）各々１つ以上の反応性分析物を含む２つ以上のサンプルを、一セットの標識試薬のうちの異なる標識試薬と反応させて、それにより各々１つ以上の標識化分析物を含む２つ以上の差次的に標識化されたサンプルを生成する工程であって、ここで該一セットの異なる標識試薬が、各々、式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ
またはそれらの塩形態および／もしくは水和物形態を含み、ここで、
ｉ）ＲＧは、求核剤であるかまたは求電子剤であり、かつ該サンプルの１つ以上の反応性分析物と反応し得る反応性基であり；
ｉｉ）ＲＰは、固定電荷を有するか、またはイオン化可能であるレポーター部分であって、各レポーターの総質量は、該セットの各試薬に対して異なり；
ｉｉｉ）ＬＫは、該反応性基と該レポーター基とを連結するリンカー部分であり、該リンカーの質量は、該レポーターとリンカーの組合せの凝集体総質量が、該セットの各試薬に対して同じであるように、該セットの異なる標識試薬に対するレポーター間の総質量の差を補い；
ｉｖ）Ｘは、該レポーターの原子と該リンカーの原子との間の結合であり；
ｖ）Ｙは、該リンカーの原子と該反応性基の原子との間の結合であり、いったん該標識試薬が該反応性分析物と反応すると、結合Ｙは該リンカーを該分析物に連結し；そして
ｖｉ）結合ＸおよびＹは、解離エネルギーレベルに供された場合に、該標識化分析物の少なくとも一部分においてフラグメント化する、工程；
ｂ）該差次的に標識されたサンプルの２つ以上またはその一部と、必要に応じて１つ以上の較正用標準とを混合し、それによりサンプル混合物を生成する工程；ならびに
ｃ）該分析物の官能基と担体の官能基との反応により、該分析物を該担体に固定化する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
前記工程（ｃ）が前記工程（ａ）の前に実施されるか、または前記工程（ａ）が前記工程（ｃ）の前に実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）を実施する前または実施した後のいずれかに、各サンプルを少なくとも１種の酵素で消化し、前記サンプルの成分を部分的または完全に分解する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項５、７、８または９のいずれかに記載の方法であって、
ｉ）質量分析計中に適用された解離エネルギーの条件下で、結合Ｘは、結合Ｙに比べてフラグメンテーションをより受けにくく；そして／または
ｉｉ）質量分析計中に適用された解離エネルギーの条件下で、結合Ｘは、Ｚ−ｐｒｏアミノ酸二量体またはＺ−ａｓｐアミノ酸二量体のペプチド結合に比べてフラグメンテーションをより受けにくく、ここでＺは、任意の天然アミノ酸であり、ｐｒｏはプロリンであり、ａｓｐはアスパラギン酸である、方法。
【請求項１１】
方法であって、以下：
ａ）各々１つ以上の反応性分析物を含む２つ以上のサンプルを、一セットの標識試薬のうちの異なる標識試薬と反応させて、それにより各々１つ以上の標識化分析物を含む２つ以上の差次的に標識化されたサンプルを生成する工程であって、ここで該一セットの異なる標識試薬が、各々、式：
ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ
またはそれらの塩形態および／もしくは水和物形態を含み、ここで、
ｉ）ＲＧは、求電子剤であり、かつ該サンプルの１つ以上の反応性分析物と反応し得る反応性基であり；
ｉｉ）ＲＰは、固定電荷を有するか、またはイオン化可能であるレポーター部分であって、各レポーターの総質量は、該セットの各試薬に対して異なり；
ｉｉｉ）ＬＫは、該反応性基と該レポーター基とを連結するリンカー部分であり、ここで
ａ）該リンカーの質量は、該レポーターとリンカーの組合せの凝集体総質量が、該セットの各試薬に対して同じであるように、該セットの異なる標識試薬に対するレポーター間の総質量の差を補い；そして
ｂ）該リンカーは、少なくとも１つの重原子同位体を含み、そして以下：
【化４】

の式を有し、ここでＲ^１は、同じかまたは異なり、かつ必要に応じて１個のヘテロ原子を含んでいてもよい１〜８個の炭素原子を含むアルキル基、または置換もしくは非置換のアリール基であり、ここで該アルキル基およびアリール基の炭素原子は、独立に連結された水素原子、重水素原子および／またはフッ素原子を含み；
ｉｖ）Ｘは、該レポーターの原子と該リンカーの原子との間の結合であり；
ｖ）Ｙは、該リンカーの原子と該反応性基の原子との間の結合であり、いったん該標識試薬が該反応性分析物と反応すると、結合Ｙは該リンカーを該分析物に連結する、工程；
ｂ）該差次的に標識されたサンプルの２つ以上またはその一部と、必要に応じて１つ以上の較正用標準とを混合し、それによりサンプル混合物を生成する工程；ならびに
ｃ）該分析物の官能基と担体の官能基との反応により、該分析物を該担体に固定化する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記工程（ｃ）が前記工程（ａ）の前に実施されるか、または前記工程（ａ）が前記工程（ｃ）の前に実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）を実施する前または実施した後のいずれかに、各サンプルを少なくとも１種の酵素で消化し、前記サンプルの成分を部分的または完全に分解する工程をさらに包含する、請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプル混合物が、２種以上の異なる同重体標識で標識化された同じ分析物を含み、ここで該標識化分析物のうちの少なくとも２つが、以下：
【化５】

からなる群より選択される式の化合物、またはそれらの塩形態および／または水和物形態である、請求項５〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記分析物がタンパク質である、請求項５〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
分子式^１３ＣＣ_５Ｈ_１３Ｎ_２^＋、^１３ＣＣ_５Ｈ_１３^１５ＮＮ^＋、^１３Ｃ_２Ｃ_４Ｈ_１３^１５ＮＮ^＋または^１３Ｃ_３Ｃ_３Ｈ_１３^１５ＮＮ^＋の特徴イオン。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１６Ｃ】

【図１６Ｄ】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１８】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図１９Ｃ】

【図２０】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２１Ｃ】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【公開番号】特開２０１０−２１７１９７（Ｐ２０１０−２１７１９７Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４２１０３（Ｐ２０１０−１４２１０３）
【出願日】平成２２年６月２２日（２０１０．６．２２）
【分割の表示】特願２００６−５４７６２３（Ｐ２００６−５４７６２３）の分割
【原出願日】平成１７年１月５日（２００５．１．５）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド　バイオシステムズ，　エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】