標識遷移金属錯体
本発明は、遷移金属原子、化学的または生物学的物質が遷移金属原子に付着することを可能とするための反応性部分、安定化架橋としての不活性三座配位子部分、およびマーカを含む標識遷移金属錯体に関する。本発明はまた、標識遷移金属錯体に付着する化学的または生物学的物質を含む標識化学的または生物学的物質、物質の質量分析を容易にするために物質の分子量の規定推移を創出するための錯体の使用、質量分析によって化学的または生物学的物質を区別可能にする方法および化学的または生物学的物質の質量分析方法に関する。さらに、本発明はまた少なくとも２つの異なる分子量の遷移金属錯体のセット、異なる安定同位体を含有する遷移金属錯体、本発明の方法によって得られる化学的または生物学的物質ならびに本発明の使用および／または方法を支持する部品のキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、標識遷移金属錯体、そのような錯体を含む標識された化学的または生物学的物質、およびその標識された化学的または生物学的物質を作製する方法に関し、そのような遷移金属錯体の具体的使用にも関する。
【０００２】
ＤＮＡ分子などの生物有機分子の標識は、組換えＤＮＡ技術などの分野における用途に所望される。しかし、多くの場合、当業者は核酸高分子を標識するのではなく、特定のヌクレオチドを標識することを所望する。ヌクレオチドを標識する主な目的は、これらの標識ヌクレオチドが核酸分子に組み込まれ得ることである。このようにすると、生じるポリ核酸上での標識の位置を変化させることが可能であるが、標識を高分子に付着させるときには、そのようなことはできない。
【０００３】
ヌクレオチドを、充分な方法でシス白金錯体を利用して標識に結合することが可能であることが知られている。しかし、そのような標識ヌクレオチドは、仮に組込まれるとしても、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ分子に満足には組込まれない。
【０００４】
ポリ核酸に組み込むことが可能なヌクレオチドを標識する利用可能な別の方法は、より標準的な標識方法である。しかし、これらの方法もまた、あらゆるヌクレオチドの標識にも適しているわけではないので、重大な不利を有している。場合によっては、たとえば、少数の特定のヌクレオチド残基だけが特定のポリ核酸に存在するとき、またはポリ核酸の末端ヌクレオチド残基が標識されなければならないとき、あらゆるヌクレオチドを標識可能であることが所望される。そのような標準的方法の例が、Daleらによって、Biochemistry、第１４巻、１９７５年、２４４７〜２４５７頁に記載されており、この方法は標識技術として直接共有結合水銀化を含む。Daleらは、シトシンおよびウラシルが穏和な条件下でそれらのＣ５-位置にて水銀化されることを報告している。しかし、Daleらはまた、アデニン、チミンおよびグアニン塩基について、ネガティブな結果が得られたと報告している。
【０００５】
ゆえに、標識とすべての異なるヌクレオチドを含む生物有機分子とを結合するのに優れた普遍的標識システムであって、効果的にポリ核酸に、その標識システムによって標識されたあらゆるヌクレオチドを酵素的に組込むことを可能にする普遍的標識システムが必要である。
【０００６】
驚いたことに、本発明者らは、少なくとも公知の方法と同じくらいに効果的な、化学的または生物学的物質に標識可能な遷移金属錯体の新規カテゴリを開発した。さらに、本発明の標識システムに結合したヌクレオチドは、非常に効果的にポリヌクレオチドに組込むことが可能であると考えられる。
【０００７】
これらの標識遷移金属錯体は、安定化架橋としての不活性三座配位子部分、マーカ、および化学的または生物学的物質が遷移金属原子に付着することを可能とするための反応性部分を含む。
【０００８】
したがって、本発明は、遷移金属原子、化学的または生物学的物質が遷移金属原子に付着することを可能とするための反応性部分、安定化架橋としての不活性三座配位子部分、およびマーカを含む標識遷移金属錯体に関する。
【０００９】
これらの遷移金属錯体は、二座配位子部分に基づく錯体よりも高収量で作製可能であるが、それらの錯体はさらに、向上した安定性および純度を示す。しかも、本発明の金属錯体は、二座配位子部分に基づく遷移金属錯体と比較して、よりよく反応し、より効率的な標識をもたらす。さらに、本発明に従う遷移金属錯体の作製は１段階の手順で実行可能であるるため、非常に有利である。
【００１０】
三座配位子を使用する利点に、キレート効果およびトランス効果がある。キレート効果とは、金属が同一分子の３つの部位に結合することによって、遷移金属原子が配位子により迅速かつ効率的に配位するということである。結果として、得られる錯体の純度はより高くなる。トランス効果とは、脱離基が三座配位子部分の結合部位のトランス位置に存在して、配位に極性を与えることによって、本発明に従う遷移金属錯体の反応性および標識効率が向上するということである。好ましくは、結合部位は二級または三級アミンであり、これによって上記の極性に寄与する。
【００１１】
接近可能なＳ（硫黄）原子またはＮ（窒素）原子を含有するほぼすべての化学的または生物学的物質が、本発明に従う標識遷移金属錯体によって標識可能である。標識遷移金属錯体によって標識されるのに適した物質は、核酸（ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、または多重鎖）などの生物有機分子である。
遷移金属錯体はグアニン残基のＮ-７位置に非常に容易に（非共有結合で）結合する。この方法によって、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が、一本鎖でもそれ以外でも容易に同定され得（たとえば、検出され、分離され、精製され、単離される）、さらに、非標識ＤＮＡ／ＲＮＡ分子が標識プローブにハイブリダイズする、ハイブリダイゼーション技術用のプローブ生産をも可能にする。標識遷移金属錯体は、仮に妨害するとしても、ハイブリダイゼーションをほとんど妨害しない。また、この技術は、プローブの作製において、修飾されたヌクレオチドの使用を必要としない。ただし、たんぱく、ペプチドおよびその他の生物有機分子もまた、本発明に従う標識物質によって同定可能である。
【００１２】
本発明に従う標識遷移金属錯体は、生物有機分子を、ニトロセルロース、ナイロンフィルタ、マイクロタイタープレート、ビーズ、ガラス、繊維などの固体表面に付着させるのにも非常に適している。
【００１３】
本発明に従う遷移金属錯体を用いて修飾されたヌクレオチド、ならびにそのヌクレオチドが組み込まれているオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、またはこれらの新規白金化合物を用いて直接修飾されているオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、生物医学研究、臨床診断および組換えＤＮＡ技術においてプローブとして使用可能である。
【００１４】
本発明に従う錯体の多種多様な有用性は、たとえば（ポリ）核酸または（ポリ）ペプチドおよびそれらの誘導体といった生物有機分子と安定した錯体を形成することのできる遷移金属錯体の能力に基づいており、それは言い換えると、生物有機分子に付着する検出可能部分、または生物有機分子と相互作用する検出可能部分のいずれかを利用して検出可能である、ということである。いくつかの使用には、たとえば細菌およびウイルスといった病原体を含む核酸を検出して同定し、細菌を抗生物質抵抗性に関してスクリーニングし、動物を薬剤効果に関する遺伝性疾患についてスクリーニングし、たとえば２１トリソミー、鎌状赤血球貧血といった遺伝性疾患、染色体核型を診断し、癌細胞を同定することが含まれる。さらに、標識錯体は薬理学、特に薬剤スクリーニング、薬剤ターゲットの同定、薬剤モニタリングおよび薬剤送達において非常に有用である。
【００１５】
本発明は、注目する生物学的物質を同定、決定および／または局限するための診断キットをも包含し、このキットは、本発明の遷移金属錯体と、任意で、検出用の他の適当な手段とを含む。もちろん、本発明は、標識遷移金属錯体の各要素が別々に、つまり非結合の形で存在しているキットをも含む。
【００１６】
本発明に従う適当な遷移金属錯体の例は、遷移金属がバナジウム、クロム、鉄、ニッケル、銅、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、コバルト、マンガン、オスミウム、ロジウム、イリジウム、亜鉛、およびカドミウムから成る群から選ばれる錯体である。好ましくは、本発明に従えば、遷移金属が鉄、ニッケル、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、およびコバルトから成る群から選ばれる。より好ましくは、遷移金属が白金、コバルト、またはルテニウムである。
【００１７】
遷移金属錯体の反応性部分は、好適には優れた脱離配位子である。好ましくは、反応性部分がＣｌ−、ＮＯ３−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ３２−、ＺＳＯ３−、Ｉ−、Ｂｒ−、Ｆ−、酢酸イオン、カルボン酸イオン、リン酸イオン、硝酸エチルイオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、ホスホン酸イオン、ＺＯ−、および水の群から選ばれる。ここで、Ｚは水素部分または１〜１０の炭素原子を有するアルキルまたはアリール基として定義される。これらの配位子のうち、Ｃｌ−およびＮＯ３−が最も好ましい。
【００１８】
本発明に従う標識遷移金属錯体は、安定化架橋としての不活性三座配位子を含む。ここで使用される不活性とは、配位子部分が標識処理中、遷移金属錯体に付着したままであり、その後物質と化学反応することがないということを表している。
【００１９】
遷移金属は、三座配位子部分に存在する窒素、酸素、硫黄もしくはリン原子、またはこれらの原子のあらゆる組合せを利用して三座配位子部分に付着する。たとえば、遷移金属は２つの窒素原子および１つの酸素原子または硫黄原子を利用して三座配位子部分に付着させることが可能である。しかし、遷移金属が３つの窒素原子を利用して三座配位子部分に付着するのが好ましい。
【００２０】
本発明においては、化学元素の硬度は酸化状態と原子の半径との比として定義される。この定義に基づくと、硬度は周期表の行においては左から右へ増加し、周期表の列においては上から下へ減少する。生じた錯体の安定性に有益な効果を及ぼすため、遷移金属は、その遷移金属の硬度と類似した硬度の原子（窒素、酸素、硫黄、またはリン）を介して遷移金属に結合する三座配位子と結合することが好ましい。この考え方に基づくと、白金は窒素または硫黄を介して三座配位子に結合するのが好ましい。
【００２１】
遷移金属の酸化状態は、特定の三座配位子部分との安定した結合が達成されるように選ばれるのがさらに好ましい。たとえば、酸素を介して遷移金属に結合する三座配位子部分は、Ｐｔ（II）またはＰｄ（II）よりも、Ｐｔ（IV）、Ｐｄ（IV）、Ｍｏ（VI）、Ｗ（VI）、Ｒｕ（III）、Ｃｏ（III）、Ｆｅ（II）、およびＦｅ（III）と結合するのが好ましい。窒素を介して遷移金属に結合する三座配位子部分は、遷移金属の特定の酸化状態を特に好むとは考えられないが、Ｃｕ（Ｉ）はあまり好ましくない。リンまたは硫黄を介して遷移金属に結合する三座配位子部分は、Ｐｔ（IV）、Ｆｅ（III）、またはＲｕ（III）よりも、Ｐｔ（II）、Ｐｄ（II）、Ｆｅ（II）、およびＣｏ（II）と結合するのが好ましい。
【００２２】
一般に、本発明に従って使用することが可能な適当な三座配位子部分は、Ｎ、Ｐ、ＳおよびＯから独立して選ばれ、１〜５の、好ましくは１〜３の原子によって分離された少なくとも３つのドナー原子を有する配位子部分を含有する。
【００２３】
本発明に従って使用することが可能な好ましい三座配位子部分は、以下の化学式を有する配位子部分を含有し、この化学式は、Ｘ、ＹおよびＺの種々の可能な組み合わせによって、各々がＸ、ＹおよびＺの特異的組合せを有する種々の実施形態を生み出し、この個々の実施形態をここでは「ブロック」とよぶ。
【００２４】
【化１】
【００２５】
ブロックＩ
ＸはＮＲ、ＰＲ、ＯまたはＳである；ＲはＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してＸに結合する；ＹおよびＺは、(ＣＨ２)ｎＮＲ１Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＰＲ１Ｒ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＮＲ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＰＲ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｐ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｐ＝Ｒ２、Ｒ６ＯＲ５、Ｒ６ＳＲ２、Ｒ７ＣＯＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＳ−Ｎａ+またはＲ８-Ｒ９から成る群から独立して選ばれ、ｎは１〜５、優先的には１〜３であり、Ｒ１はＨ、Ｃ(Ｏ)Ｒ３、Ｃ(Ｓ)Ｒ３、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈ、Ｃ、または鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ１はＸに結合しない。Ｒ２はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈまたは鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に、またはＣ(Ｏ)、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｒ２のＣに、ならびにＲ５がＣ(Ｏ)Ｒ２およびＣ(Ｓ)Ｒ２であるとき、Ｒ５のＣ(Ｏ)Ｒ２およびＣ(Ｓ)Ｒ２のＣに、Ｃ(Ｏ)またはＣ(Ｓ)のあらゆる原子の一部をも介さずに、鎖もしくは環の原子、またはＲ２の鎖の置換基もしくは環の置換基のヘテロ原子を介して結合する。Ｒ２はＸに結合しない。Ｒ３はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈまたは鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ１がＣ(Ｏ)Ｒ３およびＣ(Ｓ)Ｒ３の１つであるとき、Ｃ(Ｏ)またはＣ(Ｓ)のあらゆる原子の一部をも介さずに、鎖もしくは環の原子、または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＲ１に結合し、Ｒ３はＸに結合しない。Ｒ４はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈまたは鎖もしくは環の原子または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＣ原子に結合する。Ｒ４はＸに結合しない。Ｒ５はＨ、Ｃ(Ｏ)Ｒ２、Ｃ(Ｓ)Ｒ２、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈ、Ｃ、または鎖もしくは環の原子を介してＯ原子に結合する。Ｒ５はＸに結合しない。Ｒ６は置換または非置換の脂肪族鎖であり、ＸとＲ６ＯＲ７のＯとの間、およびＸとＲ６ＳＲ２のＳとの間の炭素原子数は１〜５の間で変化し、優先的には２または３である。Ｒ６はＣＨ２基を介してＸに結合する。Ｒ７は、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、ＸとＣＯＯ−またはＲ７ＣＯＯ−Ｎａ+のＯ原子との間、ＸとＲ７ＣＯＳ−Ｎａ+のＣＯＳ−のＳ原子との間、ＸとＲ７ＣＳＳ−Ｎａ+のＣＳＳ−のＳ原子の１つとの間の炭素原子数は、１〜５の間で変化し、優先的には２または３である。Ｒ７はＸに結合しない。Ｒ８は置換または非置換の脂肪族環であって、Ｘと、Ｒ８をＲ９に結合する原子との間の炭素原子数は、１〜５の間で変化し、優先的には２または３である。Ｒ９は、置換または非置換の、５または６員環の、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳ含有の、ジエンまたは非ジエンの、芳香族または非芳香族の、５員環または６員環の、置換または非置換の環であって、Ｘと環の配位原子との間の原子数は、２〜１０の間で変化し、優先的には２または３である。Ｒ９はＸに結合しない。
【００２６】
ブロックＩＩ
ＹとＺとが同じで、Ｘ、ＹおよびＺが、独立して、置換または非置換の、５員環または６員環の、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳ含有の、ジエンまたは非ジエン含有の、芳香族または非芳香族の環であって、Ｘの配位原子とＹおよびＺ双方との間の原子数が、１〜５、好ましくは２または３である。
【００２７】
ブロックＩＩＩ
ＸはＮＲ、ＰＲ、ＯまたはＳである；ＲはＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してＸに結合する；Ｚは、Ｈ、(ＣＨ２)ｎＮＲ１Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＰＲ１Ｒ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＮＲ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＰＲ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｐ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｐ＝Ｒ２、Ｒ６ＯＲ５、Ｒ６ＳＲ２、Ｒ７ＣＯＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＳ−Ｎａ+、および前述中で定義された（ブロックＩ）Ｒ８-Ｒ９から成る群から選ばれ；ＹはＡ２Ｎ(Ｃ２Ｈ４)ＮＡ(Ｃ２Ｈ４)、Ａ２Ｎ(Ｃ２Ｈ４)ＮＡ(Ｃ２Ｈ４)、Ａ２Ｐ(Ｃ２Ｈ４)ＮＡ(Ｃ２Ｈ４)、Ａ２Ｎ(Ｃ２Ｈ４)ＰＡ(Ｃ２Ｈ４)またはＡ２Ｐ(Ｃ２Ｈ４)ＰＡ(Ｃ２Ｈ４)であり、ＡはＺと同じ意味を有する。
【００２８】
ブロックＩＶ
ＸはＮＲ、ＰＲ、ＯまたはＳである；ＲはＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してＸに結合する；Ｚは、Ｈ、(ＣＨ2)nＮＲ1Ｒ2、(ＣＨ2)nＰＲ1Ｒ2、Ｒ3Ｒ4Ｃ＝ＮＲ2、Ｒ3Ｒ4Ｃ＝ＰＲ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)ＮＲ2Ｒ3、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)ＰＲ2Ｒ3、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)Ｎ＝Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)Ｐ＝Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)ＯＲ5、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)ＮＲ2Ｒ3、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)ＰＲ2Ｒ3、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)ＯＲ5、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)Ｎ＝Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)Ｐ＝Ｒ2、Ｒ6ＯＲ5、Ｒ6ＳＲ2、Ｒ7ＣＯＯ-Ｎａ+、Ｒ7ＣＳＯ-Ｎａ+、Ｒ7ＣＳＳ-Ｎａ+、および前述中で定義された（ブロックＩ）Ｒ8-Ｒ9から成る群から選ばれ；ＹはＲ2Ｒ3ＮＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ2Ｒ3ＰＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ5ＯＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ1、Ｒ1Ｒ2ＮＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＰＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ5ＯＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＮＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｓ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＰＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｓ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ5ＯＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｓ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ2Ｒ3ＮＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ2Ｒ3ＰＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ5ＯＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ1、Ｒ1Ｒ2ＮＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ1Ｒ2ＰＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ5ＯＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ2、Ｒ2ＳＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ1Ｒ2ＮＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＰＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ5ＯＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｏ（Ｃ2Ｈ4）、Ｒ2ＳＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＮＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ1Ｒ2ＰＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ5ＯＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ2、Ｒ2ＳＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)n、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)n、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)n、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)n、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)n、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)n、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)n、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)n、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ３、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ1またはＲ2Ｓ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ1である。
【００２９】
Ｙにおいて、Ｒ1〜Ｒ5のすべては、Ｒ1およびＲ3を除いて、ブロックＩにおいてと同じ意味を有する。Ｒ1はＨ、Ｃ(Ｏ)Ｒ11、Ｃ(Ｓ)Ｒ11、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈ、Ｃ、または鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ1はＸに結合しない。Ｒ3はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈまたは鎖もしくは環の原子または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ3はＸに結合しない。Ｒ10はＨ、Ｃ(Ｏ)Ｒ12、Ｃ(Ｓ)Ｒ12、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈ、Ｃ、または鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ10はＸに結合しない。Ｒ11はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｒ1がＣ(Ｏ)Ｒ11またはＣ(Ｓ)Ｒ11であるとき、Ｃ(Ｏ)またはＣ(Ｓ)のあらゆる原子をも介さずに、鎖もしくは環の原子、または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＲ1のＣに結合する。Ｒ11はＸに結合しない。Ｒ12はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｒ10がＣ(Ｏ)Ｒ12またはＣ(Ｓ)Ｒ12であるとき、Ｃ(Ｏ)またはＣ(Ｓ)のあらゆる原子をも介さずに、鎖もしくは環の原子、または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＲ10のＣに結合する。Ｒ12はＸに結合しない。
【００３０】
ブロックＶ
ＸはＮＲ、ＰＲ、ＯまたはＳである；ＲはＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してＸに結合する；ＹおよびＺは、独立して、ＡＢＮ(ＣＨ２)ｎまたはＡＢＰ(ＣＨ２)ｎであり、ｎは２または３であり、ＡおよびＢは、(ＣＨ２)ｎＮＲ１Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＰＲ１Ｒ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＮＲ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＰＲ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｐ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｐ＝Ｒ２、Ｒ６ＯＲ５、Ｒ６ＳＲ２、Ｒ７ＣＯＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＳ−Ｎａ+、またはＲ８-Ｒ９から成る群から選ばれ、前述中で定義されたように（ブロックＩ）、ｎは１〜５、優先的には２または３である。
【００３１】
ブロックＶＩ
Ｎ、Ｐ、ＯおよびＳから独立して選ばれた最小でも３つのヘテロ原子を含有するあらゆる置換大員環。大員環とは、３つ以上の原子がドナーヘテロ原子である、最小でも９つの原子を含有する環状分子として定義される。
【００３２】
ブロックＶＩＩ
Ｘは置換または非置換の、５または６員環の、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳ含有の、ジエンまたは非ジエン含有の、芳香族または非芳香族の環である。ＹまたはＺの少なくとも１つは、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳヘテロドナー原子を含有し、置換または非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換の環であり、環上の置換基を介してＸに結合している。ＹまたはＺの１つのみがＮおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳヘテロドナー原子を含有している場合、この基準を満たすＹとＺとの間の候補は、最小でも２つのＮおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳヘテロドナー原子を含有し、これら２つのヘテロドナー原子間の原子数、およびこれらヘテロ原子のうちＸに最も近い原子と、Ｘに含まれる最も近いヘテロドナー原子との間の原子数は、２または３である。ＹおよびＺの双方がヘテロドナー原子を含有している場合、ＹおよびＺのそれぞれが最小でも１つのＮ、Ｐ、ＯまたはＳヘテロドナー原子を含有し、Ｙのヘテロドナー原子とＸのヘテロドナー原子との間の原子数、およびＺのヘテロドナー原子とＸのヘテロドナー原子との間の原子数は２または３である。
【００３３】
さらに、本発明に従って使用することが可能な好ましい三座配位子部分は、以下の化学式を有する配位子部分を含有する:
ＹＸＺ …（II）
【００３４】
Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、置換または非置換の、５員環または６員環の、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳ含有の、ジエンまたは非ジエン含有の、芳香族または非芳香族の環であって、Ｘの配位原子とＹおよびＺ双方との間の原子数は１である。
【００３５】
原理上、物質のあらゆる型の窒素、酸素、リンまたは硫黄を含む反応部位でも、本発明に従う方法を用いて標識することが可能である。好ましい反応部位は、アミン、ホスホアミン、チオール、チオエーテル、硫化物、チオアミド、チオール、アミド、ホスホアミド、チオホスホアミド、イミド、イミン、ホスホイミン、アルデヒド、ケトン、エステル、無水物、チオ無水物、アルコール、エーテル、尿素、チオ尿素、ホスホ尿素、アシル尿素、アシルホスホ尿素、オキソ尿素、チオアルデヒド、チオケトン、チオエステル、チオリン酸エステル、チオ無水物、カルボン酸もしくはチオカルボン酸およびそれらの塩、またはピリジン、イミダゾール、ピラゾール、ホスホピリジン、ホスホイミダゾール、ホスホピラゾール、フラン、またはチオフェンを含む反応部位を含有する。標識可能な物質の例は、アミノ酸（好ましくはメチオニン、システイン、およびヒスチジン）、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、たんぱく、免疫グロブリン、酵素、人工酵素、ホスホアミノ酸、リン脂質、脂質（たとえばホスファチジル コリン、スフィンゴ脂質）、糖たんぱく、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸、ペプチド核酸オリゴマ、ペプチド核酸ポリマ、アミン、アミノグリコシド、ヌクレオペプチド、および糖ペプチドの群から選ばれる物質である。本発明に従って、好ましくは、物質は、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドの群から選ばれる。
【００３６】
本発明に従って、任意でスペーサによって、マーカが不活性三座配位子部分に適切に含まれるか、三座配位子部分に付着する。遷移金属の酸化状態が（II）より高い場合、マーカは遷移金属にも付着させることが可能である。
【００３７】
マーカは、不活性部分に含まれ得るか、三座配位子部分に付着するスペーサに付着し得る限り、いずれの型のマーカであっても使用することが可能である。そのようなマーカは、放射性標識；酵素；アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチン、ビオシチン、イミノビオチンなどの特異的結合ペア要素；コロイド状染料物質；リン光性発光標識（たとえばユーロピウムキレート、白金ポルフィリン）；化学発光標識（たとえばルミノー）；シアニン、Alex染料（Molecular Probes）、またはBodipy染料（Molecular Probes）、ローダミン、カルボキシローダミンなどの蛍光色素；ジニトロフェノール（ＤＮＰ）；tert-ブトキシカルボニル；たとえばキレート配位にあるまたはないユーロピウムまたはテルビウムといったランタニド；還元物質（エオシン、エリトロシンなど）；（有色の）ラテックス ゾル；ジゴキシゲニン；金属（たとえば二核または多核錯体の場合、たとえばルテニウム）；金属ゾルまたは別の粒子ゾル（セレン、炭素など）；ダンシルリジン；紫外染料；可視染料；赤外染料；クマリン（たとえばアミノメチルクマリン）；固体支持；細胞上または細胞内に生理学的効果を及ぼす、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、抗体、アミノ酸、たんぱくまたは（ポリ）ペプチド（たとえばプロテインＡ、プロテインＧ、膜シャトル分子）など、である。特殊分類のマーカは遷移金属それ自身である。そのような遷移金属マーカは、前述の他の型のマーカと共に存在するか否かに関わらず、他の遷移金属マーカなしに存在し得（単核）、または、ホモもしくはヘテロの配位の双方において、他の遷移金属マーカと共に存在し得る（二核または多核）。そのような標識錯体は、たとえばバイオセンサといった電気化学的検出手段において特に有用である。
【００３８】
とりわけ、ＤＮＰ、フルオレセイン、シアニン染料およびテトラメチルローダミンが特に好ましい。なぜなら、これらは物質に結合した白金と安定した錯体を形成することが可能だからである。他の好ましいマーカは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびジゴキシゲニンを含む。
【００３９】
本発明の１つの実施形態において、マーカはスペーサによって不活性三座配位子部分に連結する。好ましくは、そのようなスペーサは、少なくとも４原子、好ましくは最高で２０原子を有する鎖であって、一端に電子供与部分を含み、マーカと反応する部分を含む鎖を含み、鎖は電子供与部分を介して三座配位子部分に付着する。スペーサが三座配位子部分と反応する前に、最初にスペーサをマーカに付着させることが可能である。スペーサの電子供与部分は、たとえば、アミン基またはチオラートアニオンである。鎖が少なくとも１つのヘテロ原子をさらに有することが好ましい。非常に好ましいスペーサは、ポリエチレングリコール、１,６-ジアミノヘキサンおよび１,８-ジアミノ-３,６-ジオキサオクタンである。本発明の好ましい実施形態において、マーカに付着する前の、中間体遷移金属-スペーサ錯体として、１,６-ジアミノヘキサンtert-ブトキシカルボニルが使用される。好ましい実施形態において、スペーサは、たとえば別の同位体と原子を置換することで、分子量の点で異なる。
【００４０】
本発明の特に好ましい錯体は、添付の実施例において記載される三座配位子部分含有遷移金属錯体である。たとえば図６、化合物ｎｏ．５および図９、化合物ｎｏ．４などに示されるようなＮ３ トランス-Ｃ３三座配位子錯体；たとえば図８、化合物ｎｏ．１０および図１３、化合物ｎｏ．５などに示されるようなＮ３ シス-Ｃ２三座配位子錯体；たとえば図１６、化合物ｎｏ．４などに示されるようなＮ３ シス-Ｃ２三座配位子錯体；たとえば図１７、化合物ｎｏ．３などに示されるようなＮＳ２ トランス-Ｃ２三座配位子錯体；たとえば図１５、化合物ｎｏ．７などに示されるような架橋(ピリジン)３トランス三座配位子錯体として、その中で参照される好ましい実施形態を特に参照する。ここでの「シス」という用語は、遷移金属上の脱離基およびマーカ（任意にスペーサアームを介して結合する）の位置が隣り合うことを示し、ここでの「トランス」という用語は、遷移金属上の脱離基およびマーカ（任意にスペーサアームを介して結合する）の位置が反対側であることを示す。Ｃ２またはＣ３は、個々のティース（teeth）を架橋する炭素原子数で表した大きさを示し、Ｎ３は三座配位子ティースがすべて窒素原子であることを示し、ＮＳ２は三座配位子ティースの２つが硫黄原子で、３番目が窒素原子であることを示す。ここでの「三座配位子ティース」という用語は、三座配位子部分のうち遷移金属への配位結合に実際に加わる部分を示す。
【００４１】
本発明の錯体の特別な利点は、遷移金属錯体と化学的または生物学的物質との間で配位結合形成を可能にすることであり、それによって標識化合物としての使用への適性を大いに高められる。この標識化合物は、好ましくは、マーカ部分として、フルオレセイン；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）；ジエチルアミノメチルクマリン（ＤＥＡＣ）；カルボキシ-フルオレセイン（ＦＡＭ）；カルボキシ-テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）；カルボキシ-Ｘ-ローダミン（ＲＯＸ）；カスケードブルー（ＣＢ）；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；オレゴングリーン（ＯＧ）；Alexa４８８（Ａ４８８）；ローダミングリーン（ＲＧｒ）；カルボキシ-ローダミン ６Ｇ（Ｒ６Ｇ）；テキサスレッド（ＴｘＲ）；Ｃｙ３；Ｃｙ３．５；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；カルボキシナフトフルオレセイン（ＣＮＦ）およびBodipy（登録商標）染料などの蛍光標識、またはビオチン（ＢＩＯ）；ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）；および２,４-ジニトロフェニル（ＤＮＰ）などのハプテン標識を含む。したがって、本発明の遷移金属錯体は、全体として、標識化合物とよぶのに適している。標識化合物は核酸を標識するのに用いられるのに非常に適している。当然のことながら、たんぱく性分子などの、他の化学的または生物学的物質もまた、本発明の三座配位子錯体によって標識されるのに非常に適している。
【００４２】
さらに、本発明は少なくとも１つの異なる安定同位体を含有する標識遷移金属錯体によって標識された化学的または生物学的物質に関する。この物質はアミノ酸、ペプチドまたはたんぱくであるのが好ましい。
【００４３】
本発明の特別な側面は、生物系の機能を理解し、病状または薬物投与の効果を評価するのに重要な手段である、たんぱくの同定およびそれらの細胞間相互作用のマッピングにおける、本発明に従う標識遷移金属錯体の使用に関する。そのようにして、プロテオームの組成と、プロテオームにおける質的および量的変化とを決定することが可能である。ヒトプロテオームは、広く多様な特性を有し、９桁にまでわたる濃度レベルで自然に産する１０００００を超すたんぱくを含む。この数字はプロテオームの研究者が抱えるいくつかの難問を明らかにしている。細胞または組織で発現されるたんぱくの大規模な（究極的には国際的な）分析はプロテオーム分析（Penningtonら、１９９７年、Trends Cell Biol.、第７巻、１６８−１７３頁）またはプロテオミクスと称されている。ゲノム分析と比較して、プロテオーム分析は特有の難問を抱えている。
【００４４】
広い範囲の技術が、たんぱくを同定し、その細胞間相互作用をマップするのに利用できる。未知のたんぱくの性質を明らかにし、その機能を評価するために、連続する多数の工程が一般に含まれる（PattersonおよびAebersold、２００３年、Nat. Genet.、第３３巻、別冊、３１１−３２３頁）。
【００４５】
第１段階は、プロテオームディスプレイおよびマッピング技術によって形成される。たんぱくマップまたはフィンガープリントを得るのにもっとも広く使用される手順は、二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）である（Rabilloud、２０００年、Anal. Chem.、第７２巻（１）、４８Ａ−５５Ａ頁）。２ＤＥにおいて、たんぱくは１次元においてその等電点（ｐＩ）によって分離され、続いて第２の次元において分子量（ＭＷ）によって分離される。分離されたたんぱくは、クマシーブルー、銀染色、蛍光染色、または放射性標識（Patton、２００２年、J. Chromatogr. B, Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.、第７７１巻（１−２）、３−３１頁）などの一般的な染色を用いて視覚化することが可能である。生じたスポットの複雑なパターンは、さらなる処理のために高度な画像分析を必要とする。通常、たとえば異なる細胞分裂期を代表する２つまたは複数のたんぱくプロフィールが比較される。異なった形で発現された注目たんぱくのスポットが、後の分離分析のためにゲルから切出される。このような方法で、細胞の状態変化によるプロテオームの変化を視覚化することが可能であり、たんぱく発現の特徴的な変化を特定することが可能である。
【００４６】
続く第２段階は、たんぱく同定技術、主として質量分析（ＭＳ）によって代表される。質量分析計は基本的にイオン化モジュール、質量分析器および検出器の組合せであり、イオン化された検体（たとえばペプチドまたはたんぱく）の質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定する。検体は高速原子衝撃（ＦＡＢ）、電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）または大気圧化学イオン化（ＡＰｃＩ）のいずれかによって帯電可能である。質量分析器は質量分析計の最もフレキシブルな部分である。電場が荷電粒子を偏向させ、エネルギポテンシャルが質量およびポテンシャルに基づいて慣性移動に変換され得るので、質量分析器は、電場ポテンシャルを変えることによって、その質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づき、ある質量を検出器に向ける。分析器は、存在するイオンをリストに入れるために、ｍ／ｚの狭い範囲を安定化させるか、ｍ／ｚのある範囲にわたって走査するために使用することが可能である。様々な型式が存在し、飛行時間、イオントラップ、および四重極質量分析器を含む。検出器は単純に、イオンが表面を通り過ぎるか表面に衝突するかしたときに誘起される電荷を記録する。
【００４７】
質量分析計は非特異的な検出器であるため、別の検体をＭＳに与えるために、質量分析計をガス（ＧＣ）または液体クロマトグラフ（ＬＣ）に連結するための特異的なインターフェースがしばしば使用される。タンデム質量分析計（ＭＳ-ＭＳまたはＭＳｎ）は質量分析の複数ラウンドが可能なものである。たとえば、１つの質量分析器は、質量分析計に入った多数から１つのペプチドを分離することができる。その後、第２の質量分析器は、ガスがペプチドに衝突してフラグメントにする間、ペプチドイオンを安定化させる。その後、第３の質量分析器が、ペプチドから産生されたフラグメントをリストに入れる。衝突誘起解離とよばれるこの工程は、プロテオミクスにおける多数の実験の基礎である。現在では様々な質量分析計が利用でき、それぞれがある用途に関して特異的な利点を有している（GygiおよびAebersold、２０００年、Curr. Opin. Chem. Biol.、第４巻（５）、４８９−４９４頁； Mannら、２００１年、Ann. Rev. Biochem.、第７０巻、４３７−４７３頁）。
【００４８】
たんぱくの機能分析を評価する最終工程は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの技術に関係するものであって、たとえば既知のたんぱくおよびそのターゲットの、生体分子の相互作用に関する詳細な情報を提供することが可能である。ＳＰＲ現象は、特定の角度にて偏光が全反射される条件下で、光学インターフェースにて薄い金属膜中に生じる。その手順は、光学共鳴の微妙な変化を測定し、この膜の反対側の媒体の屈折率に感受性である。屈折率の変化は、分子が金属表面に付着している生体分子に結合するとき、または生体分子から解離するときに生じる。このように、リアルタイムの結合活性プロフィールが会合または解離の相互作用特性によって生成される（Greenら、２０００年、Biomaterials、第２１巻（１８）、１８２３−１８３５頁； RichとMyszka、２０００年、Curr. Opin. Biotechnol.、第１１巻（１）、５４−６１頁； McDonnell、２００１年、Curr. Opin. Chem. Biol.、第５巻（５）、５７２−５７７頁）。
【００４９】
一般に、技術的進歩は種々のたんぱくの検出の感度および定量化を改良することに向けられてきた。さらに、進歩は、２ＤＥを旧式のものとし得る、つまりゲルから独立した方法を提供することに向けられてきた。２ＤＥパターンの複雑さ、および低い存在量の、小さい（１０ｋＤａ未満の）または難溶性の（たとえば膜結合の）たんぱくに対する固有のバイアスが直接プロテオームにおけるたんぱくの（半）定量的測定を可能にする技術の開発を誘発してきた（Regnierら、２００２年、J. Mass Spectrom.、第３７巻（２）、１３３−１４５頁； BauerとKuster、２００３年、Eur. J. Biochem.、第２７０巻（４）、５７０−５７８頁）。
【００５０】
２ＤＥの使用を避ける非常に適した手段は、Gygiら（１９９９年）（Nat. Biotechnol.、第１７巻（１０）、９９４−９９９頁）によって開発されたＩＣＡＴ（同位体コードアフィニティータグ）手順である。この手順は、安定同位体での特異的標識に基づくＭＳによって２つの異なる広範囲のたんぱく発現プロフィールを迅速に比較することができる。第１世代ＩＣＡＴ試薬は、ｉ）たんぱくのシステイン（Ｃｙｓ）残基を標識できるチオール-特異的たんぱく反応基（ヨードアセトアミド）、ii）たんぱくの２集団の特異的標識のための８つの水素（１Ｈ）原子（ｄ０、軽同位体）または８つの重水素（２Ｈ）原子（ｄ８、重同位体）のいずれか一方を含有する２つの異なるリンカー部分、およびiii）標識ペプチドを選択的に単離できる、ほとんどがビオチンであるアフィニティタグ、から成っていた。
【００５１】
ＩＣＡＴ手順それ自身は、たんぱくの複雑な混合物中のシステイン側鎖の還元およびアルキル化を含み、これによって、ある細胞状態のたんぱくはｄ０-標識タグで標識され、第２の細胞状態（たとえば病状）のたんぱくはｄ８型タグで標識される。その後、ＭＳ分析に適したフラグメントを提供するために、２つの混合物は統合され、たんぱく分解にかけられる。ペプチドの標識サブセットを取出すために、たんぱく分解ペプチドの複雑な混合物は、アフィニティカラムクロマトグラフィによって精製される。その後、サンプルは、ｄ０およびｄ８同位体の相対存在量に基づいてたんぱくの定量的情報つまり存在量を提供するためのＬＣ-ＭＳと、ペプチド分子量およびアミノ酸配列情報に基づいて定性的情報を提供するためのＬＣ-ＭＳ-ＭＳとの組合せによって分析される。
【００５２】
重ＩＣＡＴ試薬で標識されたペプチドと軽ＩＣＡＴで標識されたペプチドとの不適切な共溶出、およびアフィニティタグで捕獲された標識ペプチドの低い回収率が、第２世代のＩＣＡＴ試薬の開発をもたらした。これらのＩＣＡＴ試薬は、ｉ）たんぱくのシステイン（Ｃｙｓ）残基を標識できるチオール-特異的たんぱく反応基（ヨードアセトアミド）、ii）たんぱくの２集団の特異的標識のための炭素原子（軽い）または炭素同位体（重い）のいずれか一方の規定数を含有するリンカー部分、iii）標識ペプチドを選択的に単離できる、ほとんどがビオチンであるアフィニティタグ、ならびにiv）ＭＳおよびＭＳ-ＭＳ分析に先立ちＩＣＡＴ試薬タグのビオチン部分を除去できる酸開裂部位、から成る。たんぱく反応基は遊離システインのアルキル化によって同位体コードアフィニティタグをたんぱくに共有結合させる。ＩＣＡＴ技術はたんぱくのシステイン残基の標識に基づいているので、システインを含有しないたんぱくはＩＣＡＴで検出されないだろう。さらに、システイン残基は御しやすいペプチド；つまり、たんぱく分解に由来するおよそ６００〜３５００Ｄａの分子量（ＭＷ）のペプチド、に存在しなければならない。このＭＷ範囲外のペプチドは、たんぱく同定のための必須の定性的情報を提供するのに充分な数のアミノ酸を含んでいないか、衝突活性化解離によるＭＳ-ＭＳフラグメント化に適していないほど大きいか、のどちらかだろう。さらに、システインに基づくＩＣＡＴタグは、修飾が偶発的にＣｙｓ含有ペプチドに生じなければ、リン酸化反応などの翻訳後の修飾に基づくプロテオームにおける変化に関する情報を生成できない。
【００５３】
化学的標識手順および代謝標識手順によってたんぱくを特異的に標識する別の種々の方法が開発されてきた（GosheとSmith、２００３年、Curr. Opin. Biotechnol.、第１４巻（１）、１０１−１０９頁）。化学的方法は、個々のペプチド、またはたんぱくのトリプシン消化物の、古典的なたんぱく修飾に基づいている。たとえば、リジン（Ｌｙｓ）残基は、４つの２Ｈ原子（ｄ４）を含有する２-メチルオキシ-１Ｈ-イミダゾールの重誘導体を用いて、Ｃ-末端にて標識することが可能である（Petersら、２００１年、Rapid Commun. Mass Spectrom.、第１５巻（２４）、２３８７−２３９２頁）。Ｌｙｓ残基はまた、mass-coded abundance tagging（ＭＣＡＴ；CagneyおよびEmili、２００２年、Nat. Biotechnol.、第２０巻（２）、１６３−１７０頁）とよばれる処理において、Ｏ-メチル-イソ尿素を用いる特異的グアニジン化によって標識することが可能である。メチオニン（Ｍｅｔ）残基は、たとえば（ｄ０／ｄ４）-ニコチン酸の活性エステルを用いて標識することが可能である（Shenら、２００３年、Molec. Cell Proteomics、第２巻、３１５−３２４頁）。Ｃｙｓ残基は、Ｎ-（ｄ０/ｄ５）-エチル-ヨードアセトアミドを用いる特異的アルキル化によって標識することが可能である。ペプチドの一級アミンは、Ｎ-アセトキシ-（ｄ０／ｄ３）-スクシンイミド誘導体を用いて特異的に標識することが可能である（ChakrabortyおよびRegnier、２００２年）。
【００５４】
しかし、一般に、前述の標識方法は、ＭＳ分析前に混合物の複雑さを軽減するために、２ＤＥ分離または−ＩＣＡＴの場合−アフィニティクロマトグラフィ精製を必要とする。ｉＴＲＡＱおよびｉＰＲＯＴは、特異的スクリーニングのために同位体ではなく標識試薬の異なる異性体を使用する同重同位の標識技術である。
【００５５】
関連する標識化学反応はまた、１つには化学試薬の不安定さおよびその所望されない交差反応性によって、安定性を欠いており、これは得られるシグナル対に不均一性をもたらす。また、平均ヒトプロテオーム範囲は、たとえばＩＣＡＴについて８５％と、比較的低い。これらの要因が、プロテオーム研究における、特に（自動化された）ハイスループット用途の場合の、特異的標識方法の利用を妨害している。
【００５６】
現在、プロテオーム研究およびルーチン（診断）試験の双方における大規模な分析を支持できる、ペプチドの特異的標識のための安定した手順の必要性がある。したがって、そのような標識手順が、特異性の高いアミノ酸ターゲット残基の標識、プロテオームの広い範囲、および安定した標識条件を示すことが所望される。また、標識は、複雑な質量スペクトルをもたらすべきではなく、つまり、多すぎないアミノ酸残基が標識されるべきである。好ましくは、選ばれたアミノ酸の標識を飽和方法で実行することが可能であり、好ましくは、重同位体標識分子が軽標識分子と同一の、たとえば同じ保持時間といったクロマトグラフ特性を有するべきで、好ましくは、重同位体標識分子が軽標識分子と同一のイオン化特性を有するべきで、理想的には、標識がたんぱくの酵素消化を妨害すべきではない。
【００５７】
さらに、特異的標識後、生成物は、重量分析にかけられる前に、アフィニティクロマトグラフィ以外の別の手段によって分離することが可能であることが所望される。現在の技術に対してさらに所望される改良は、ＭＳに先立つ精製工程の省略である。あるいは、その代わりに、標識分子と非標識分子間の分別がＭＳ-ＭＳ中になされ得るのが有利である。
【００５８】
驚いたことに、本発明に従う標識遷移金属錯体が使用される標識方法は、これらの必要性の１以上を満たすことが分かった。この方法は、質量分析のイオン化処理を乗り切る、物質と標識間との結合をもたらすのが利点である。
【００５９】
したがって、本発明に従う標識遷移金属錯体という新規カテゴリは、生物有機分子の特異的標識方法においてタグとして使用可能であることが利点である。その標識錯体は、特異的発現標識のための既存の試薬に対する改良を構成し、先行技術の試薬の種々の問題を回避する。
【００６０】
本発明はまた、化学的または生物学的物質の質量分析による区別を可能にする方法に関し、その方法は、物質を本発明に従う少なくとも１つの標識遷移金属錯体で特異的に標識する工程を含む。
【００６１】
さらに、本発明は、物質または物質を含有するサンプルの質量分析を容易にするために、化学的または生物学的物質の分子量に規定シフトを創出するための本発明に従う標識遷移金属錯体の使用に関する。
【００６２】
標識遷移金属錯体の結合に際しての化学的または生物学的物質の分子量における規定シフトの創出は、最終的には標識遷移金属錯体の物質への付着に起因する。したがって、シフトは、基本的に、標識遷移金属錯体の質量マイナス脱離基の脱離部分の質量に比例する物質の質量の変化に一致する。この質量変化は質量分析によって決定することが可能である。
【００６３】
本発明はまた、本発明に従う質量分析によって化学的または生物学的物質を区別可能にする方法に関し、物質を、少なくとも１つの標識遷移金属錯体で特異的に標識することを含み、適当な標識遷移金属錯体とは、先に記載されたものである。それぞれが独自の標識特異性を有する２つの異なる標識遷移金属錯体の使用は、１つのサンプル内の異なる物質を特異的に標識することを可能にする。
【００６４】
別の側面において、本発明は化学的または生物学的物質の質量分析方法に関し、この方法は、物質を本発明に従う少なくとも１つの標識遷移金属錯体で特異的に標識する工程、および、質量分析によって物質を分析する工程を含む。
【００６５】
本発明の方法の好ましい実施形態において、化学的または生物学的物質は異なるサンプルに由来する。
【００６６】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施形態において、物質を特異的に標識する工程は、本発明に従う少なくとも２つの標識遷移金属錯体によって実行され、この標識遷移金属錯体は分子量が異なり、この分子量差は１Ｄａである。
【００６７】
本発明の方法の好ましい実施形態において、標識遷移金属錯体は、同じ標識特性、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）における、たとえば同じ疎水性または親水性などの、同じ性質、および同じ金属酸化状態を示す。
【００６８】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施形態において、スペーサを含有する標識遷移金属錯体は、質量分析における親イオンスキャニングまたはニュートラルロススキャニングに適している。
【００６９】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施形態において、遷移金属同位体フィンガープリントは標識物質の同定手段として使用することが可能である。
【００７０】
標識遷移金属錯体間の分子量差は、遷移金属錯体またはこれに付着した配位子、スペーサ、反応性部分および／もしくはマーカのあらゆる部分における、特定の同位体、原子、原子団、分子、もしくは分子団の存在または不在による。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、標識遷移金属錯体間の分子量差は、たとえば第１の標識遷移金属錯体が軽同位体を含有し、少なくとも第２の標識遷移金属錯体が重同位体を含有するといった、錯体中の異なる安定同位体の存在による。
【００７２】
分子量に差異を生じさせる安定同位体は、標識遷移金属錯体のあらゆる部分に含有されてもよい。安定同位体は、スペーサを利用して適切に、不活性三座配位子部分に含められるか、三座配位子部分に付着される。
【００７３】
別の側面において、本発明は少なくとも２つの異なる分子量の標識遷移金属錯体のセットを提供する。
【００７４】
本発明のさらなる側面は、少なくとも２つの異なる分子量の標識遷移金属錯体のセットを含む部品のキットに関する。好ましくは、分子量の差異は遷移金属錯体間の少なくとも１つの異なる安定同位体の存在に起因する。
【００７５】
ここで使用される「化学的または生物学的物質」は、硫黄、酸素、リン、および／または窒素を含有する１つ以上の反応部位を含むものとして解釈されるべきであり、このような反応部位を含むように（たとえばセリン、トレオニン、またはチロシン残基の組み込みによって）修飾された物質を含んでいる。
【００７６】
さらに、「物質」は、微生物、ウイルスもしくはプリオンに、または、硫黄反応型、リン反応型、酸素反応型もしくは窒素反応型の１つ以上の反応部位を含む物質、もしくは、それらによって作られた、マイクロアレイ、マイクロタイタープレート、試験紙もしくは試験管などの、製品に関する。特に、物質は生物有機化合物を含む、無機または有機化合物に関する。
【００７７】
ここで使用される「生物有機分子」は、生物由来炭素含有分子を示す。また、生物有機分子は、たとえば治療効果または予防効果、免疫応答、代謝過程などを誘発する、またはそれらに影響を及ぼすことによって、生物系における作用を誘発する、または作用に影響を及ぼすことのできる化合物を示す。
【００７８】
「標識」という用語は、ここでは、標識金属錯体を物質に結合させる／付着させるプロセスを示すために使用される。
【００７９】
「特異的標識」という用語は、ここでは、反応部位間、物質間またはサンプル間にマーカの不均等な分布をもたらす標識反応を示すために使用される。特異的標識は、たとえば特異的に標識されたＰ-、Ｏ-、Ｓ-およびＮ-反応部位を有する物質などの、特徴的な反応部位にて異なるマーカを有する物質をもたらす。特異的標識はまた、１つのサンプルから異なるマーカまたは異なるマーカ密度を有する同一の物質をもたらし、たとえば、１つのサンプルは特異的に標識される同一のたんぱくを有し得る。特異的標識はまた、２つのサンプルから異なるマーカまたは異なるマーカ密度を有する同一の物質をもたらす。そのような特異的標識型は、細胞間のプロテオーム、ゲノムまたは代謝産物の比較分析に非常に適している。
【００８０】
ここで同意語として使用される「マーカ」、「タグ」または「標識」は、遷移金属錯体を介して物質に付着することが可能であり、物質を検出、測定または視覚化するのに使用することが可能であるあらゆる部分である。
【００８１】
ここで使用される化合物の「残基」は、化合物それ自体、またはより大きな物質の部分、たとえばたんぱく中のアミノ酸残基として解釈されるべきである。
【００８２】
「異なる安定同位体」は、ここでは、原子の安定した同位体であって、自然界で最も多く存在するその原子の同位体とは別の同位体として定義される。Ｃ（炭素）の場合、１３Ｃ（１．０７％）は、通常存在する１２Ｃ（９８．９３％）に対し、異なる安定同位体である。遷移金属の場合、たとえばＰｔ（白金）については、１９２Ｐｔ（０．７９％）、１９４Ｐｔ（３２．９％）、１９６Ｐｔ（２５．３％）、および１９８Ｐｔ（７．２％）は、通常存在する１９５Ｐｔ（３３．８％）に対し、異なる安定同位体である。
【００８３】
標識遷移金属錯体に結合される物質は、（硫黄含有反応部位に付着するとき）Ｍｅ-Ｓ付加化合物として、（窒素含有反応部位に付着するとき）Ｍｅ-Ｎ付加化合物として、または一般にＭｅ-付加化合物として示される。
【００８４】
今後、硫黄含有反応部位はＳ-反応部位として、窒素含有反応部位はＮ-反応部位として示される。同様に、酸素含有反応部位はＯ-反応部位として、リン含有反応部位はＰ-反応部位として示される。
【００８５】
化学的または生物学的物質は、たとえば化学的、生物学的または医学的研究もしくは診断において、物質を同定、検出、視覚化、分離、精製、単離、定量化またはモニターするために、検出マーカで標識されることは当該技術において既知である。種々の標識方法が当該技術から既知である（レビューのため、Hermanson、１９９６年、Bioconjugate techniques、Academic Press、ＩＳＢＮ ０-１２-３４２３３５-Ｘを参照されたい）。特定の検出マーカおよび特定の標識方法を選択する際には、多数の要因が関与する。そのような要因は、物質の性質、標識反応の条件、標識反応中の感度、物質に対する特異性および標識物質の検出限界を含む。
【００８６】
種々の反応部位に対する標識遷移金属錯体の反応性は、広範な様々な物質に対する迅速な標識反応および優れた感度を可能にするので、多数の用途において利点がある。
【００８７】
本願発明者は、標識反応におけるリンカーとして、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびマレイミドなどのリンカーに優る、標識遷移金属錯体を使用する特別の利点は、本発明に従う標識遷移金属錯体が質量分析にルーチンで適用できるということであると見出した。さらに、最も多く存在する遷移金属原子とその異なる安定同位体との間の特定の構成および比が、質量分析における標識物質の同定に規定手段を提供することが可能である。標識反応に本発明の標識遷移金属錯体を使用するさらなる利点は、使用される反応性部分に応じて、そのような錯体が広範な種々の化学的物質の標識を支持できることである。
【００８８】
別の利点は、たんぱくが、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）および／またはシステイン（Ｃｙｓ）残基にて適当な標識遷移金属錯体によって標識されることである。これは、ペプチド鎖の側基をより多く標識し、よってより高い標識密度を達成できる可能性を提供する。これはまた、ペプチド鎖のさらなるアミノ酸残基の標識を可能にする。
【００８９】
生体たんぱくおよび／またはペプチドは、システインを含むとは限らず、システイン標識は、プロテオームにおけるたんぱくの８５％のみの検出を可能にするだけである。メチオニン残基を標識できれば、プロテオームにおけるたんぱくの９７％の検出が可能になる。組合せにより、本発明の標識錯体の使用は９８．３５％のプロテオーム範囲を提供する。したがって、新しいターゲットアミノ酸を選択できるこの見込みは、プロテオーム研究において重要な利点である。
【００９０】
さらに、本発明に従う標識遷移金属錯体での標識反応特異性は、化学的または生物学的物質の硫黄含有反応部位と窒素含有反応部位とを区別するように制御される。したがって、本発明に従う標識遷移金属錯体を用いることで、物質の標識を、種々の反応部位を一緒に含有する物質または物質団内の特定の反応部位に向かわせることができる。
【００９１】
本発明に従う標識遷移金属錯体の使用の１つの実施形態において、サンプル中の化学的または生物学的物質は、欧州特許出願公開第１２６２７７８号明細書に記載される方法に従って特異的に標識される。
【００９２】
好ましい実施形態において、本発明に従う標識遷移金属錯体の使用は、構成が比較されるべき２つの異なるサンプル中に存在する化学的または生物学的物質の特異的標識を含む。好ましい使用は、たんぱく発現プロフィールの測定、またはプロテオームの結果と、参照サンプル由来の対応結果とを比較するために、試験サンプル中のプロテオームの測定を含む。
【００９３】
たんぱくの特異的標識手順における標識遷移金属錯体の使用のさらに別の利点は、後続のトリプシン消化に妨害がないことである。これは、ＭＳ分析に適当な長さのペプチドを提供するために、トリプシン消化にかけられる細胞プロテオームの標識手順において、特に有利である。
【００９４】
１つのサンプルに由来する物質つまり混合物として生じる物質を標識できる見込みとは別に、化学的または生物学的物質は異なるサンプルに由来してもよい。たとえば、特異的標識は、参照サンプル中の物質を標識することなく試験サンプル中の物質を標識すること、またはその逆を含み得る。その後、両サンプル中に存在する同一の物質は、試験サンプル中の物質の分子量における規定シフトの結果として、質量分析によって区別することが可能である。あるいは、特異的標識は両サンプル中の物質の標識を含んでもよい。そのような例において、質量分析によって物質を区別可能にすることは、物質の、少なくとも２つの異なる分子量の標識遷移金属錯体による特異的標識を含む。
【００９５】
特異的標識方法は、広範な種々のバッファ溶液中で、および幅広いｐＨ範囲にわたって実行される。適したバッファ溶液は、ＴＲＩＳ／グリシンおよびリン酸バッファなどの一般に使用されるバッファをすべて含む。Tween-２０、Triton X-１００またはＳＤＳなどの界面活性剤が標識混合物中に存在してもよい。バッファが、一般に使用される濃度にて、塩酸、硝酸、硫酸またはリン酸のナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩などの塩の存在は、標識反応にほとんど影響を及ぼさない。ＭＳにおいて好ましい標識用バッファは、蒸発後に痕跡残存物を残さない、たとえば酢酸アンモニウムなどを含有するバッファである。
【００９６】
特異的標識反応に関する反応パラメータはまた、物質が特異的に標識されるように選択され、特定のｐＨ値の選択を含む。ここで使用されるｐＨは、２０℃の水溶液のｐＨ値として解釈されるべきである。一般に、Ｍｅ-Ｓ付加化合物の形成はｐＨ非依存的で、Ｍｅ-Ｎ付加化合物の形成はｐＨ依存的である。好ましい実施形態において、１つ以上のＳ-反応部位は、そのｐＨを使用することによって、１つ以上の窒素含有部位に優先して選択的に標識される。
【００９７】
指針として、物質の標識されるべきでないすべてのＮ-反応部位の最低ｐＫａを下回るｐＨに標識反応のｐＨを選択することで、１つ以上のＳ-反応部位の特異的標識が可能になる。熟練者は、ｐＫａに加えて、標識されるべき物質付近の微環境の影響を含む、他の要因が影響することを理解できよう。一般に、Ｓ-反応部位は、酸性ｐＨにてＮ-反応部位に優先して特異的に標識される。
【００９８】
理論的には、Ｍｅ-Ｓ付加化合物の形成は１工程プロセスである。反応基は、Ｓが白金に電子対を提供すると、白金錯体を離れる。このプロセスは、Ｍｅ-ＸのＭｅ-Ｓへの直接変換であって、ｐＨ非依存的であると考えられる。他方、Ｎ供与体は、Ｎ置換に先立ち、酸素による白金錯体の反応基の置換を必要とする。初めに、Ｍｅ-ＸはＭｅ-Ｏになり、結果としてＭｅ-Ｎを生じる。これは、ｐＨを変化させることで第１工程が制御することが可能である２工程スキームである。したがって、溶液のｐＨに影響を及ぼす要因は、Ｍｅ-Ｎ付加化合物の形成を妨害するかもしれない。
【００９９】
イオンの存在はまた、Ｎ-反応部位に対する遷移金属錯体の選択性を制御するために用いることが可能である。実施形態において、１つ以上の脱離配位子、好ましくはアニオン部分が、Ｓ-反応部位の分別標識を増大するために、標識遷移金属錯体をＮ-反応部位に標識するのを阻害するのに用いられる。そのような脱離配位子の好ましい例は、Ｃｌ−、ＮＯ３−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ３２−、ＺＳＯ３−、Ｉ−、Ｂｒ−、Ｆ−、酢酸イオン、炭酸イオン、リン酸イオン、硝酸エチルイオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、ホスホン酸イオン、ＺＯ−および水を含む。ここで、Ｚは、水素部分または１〜１０の炭素原子を有するアルキルまたはアリール基として定義される。特に良好な結果は、特に好ましくは塩化物イオンであるアニオン部分を含む塩を用いることで達成される。対イオンはアルカリカチオン、アルカリ土類カチオン、または標識するのにも用いられるカチオンであるのが好ましい。好ましい実施形態において、Ｎ-反応部位への標識の阻害に用いられるアニオン部分の総イオン強度は、少なくとも０．１ｍｏｌ／ｌである。より好ましくは、総イオン強度は０．１〜０．５ｍｏｌ／ｌの範囲にある。
【０１００】
遷移金属イオンの存在もまた、標識されるべき反応部位の選択のために使用することが可能である。特に、そのようなイオンは、Ｓ-反応部位の標識を妨げるか鈍化させ、または標識Ｍｅ-Ｓ付加化合物を不安定にさせて、効果的に１つ以上のＮ-反応部位がＳ-反応部位に優先して特異的に標識されるのに、適していることが見出されている。この物質またはサンプルの特異的標識の型式は、一部の物質のみが分析されなければならないときに、特に利点がある。
【０１０１】
前述のパラメータに加えて、本発明に従う方法はさらに、好ましくは０〜１２０℃の範囲で、より好ましくは２０〜７０℃の範囲で変化する温度；一般的に１分〜４８時間の範囲の、好ましくは１０分〜２４時間の範囲の、より好ましくは２５分〜１５時間の範囲の反応時間；試薬の濃度、試薬のモル比、標識遷移金属錯体の総純荷電などのパラメータによって微調整される。これらのパラメータは、当該技術において既知であるいずれかの方法で、特定用途に応じて調整される。標識遷移金属錯体の総純荷電は、たとえば、中性ｐＨでのヒスチジンにおけるＭｅ-Ｎ付加化合物形成の特異性に影響を及ぼす。フルオレセイン-およびシアニン遷移金属錯体などの中性Ｍｅ-錯体は、Ｍｅ-Ｎ付加化合物を形成し、一方で、たとえばローダミン-およびジニトロフェノールＭｅ錯体といった正荷電遷移金属標識錯体は、効果的でないか、効果が劣る。正荷電標識遷移金属錯体は、ペプチド、たんぱくなどの等電点以上では、Ｎ付加化合物に対して特異的標識を示す。Ｎ-反応部位のＳ-反応部位に優先する選択的標識、またはその逆を可能にすることとは別に、本発明に従う方法はまた、欧州特許出願公開第１２６２７７８号明細書に記載されるような正しい条件を選択することによって、特徴的なＮ-反応部位または特徴的Ｓ-反応部位を分別することができる。
【０１０２】
単一物質の特異的標識のための前述の指針はまた、異なる化合物、および異なる起源由来の化合物の特異的標識に必要な、または最適な標識を得るために採用することが可能である。
【０１０３】
本発明に従う化学的または生物学的物質の質量分析方法は、まず、ＭＳによるそれらの物質の区別を可能にしなければならず、したがって、前述の少なくとも１つの標識遷移金属錯体で物質を特異的に標識する第１工程を含む。さらに、その方法は質量分析によって物質の分子量を分析する工程を含む。熟練者は、ＭＳ検出の種々の可能性に精通している。
【０１０４】
ＭＳ検出に先立ち、異なるサンプル由来の物質が任意に混合されて、混合物がＭＳ分析にかけられる。特異的標識物質またはサンプルをＭＳ分析に先立って混合する利点は、ＭＳ条件が、試験される物質すべてについて等しくなり、分子量のシフトが容易に識別することが可能であることである。
【０１０５】
また、ＭＳ検出に先立ち、標識物質は、たとえばアフィニティタグ物質のアフィニティ単離によって、または、特に本発明の方法においてはイオン交換クロマトグラフィによって、もしくは蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）との組合せにおいて蛍光マーカを用いることによって、非標識物質から精製することが可能である。さらに、本発明の標識遷移金属錯体は、先に精製することなく、ＭＳ-ＭＳ中に（特異的）標識物質を分離する機会を提供する。
【０１０６】
したがって、サンプル比較を含む方法において、両サンプルは、精製工程が両サンプルに実行することが可能であるようにするために、異なる分子量の標識遷移金属錯体で標識されるのが好ましい。このようにすることで、精製バイアスは両サンプルについて等しくなる。捕獲試薬に結合できる標識はすべて、アフィニティ標識として使用することが可能である。本発明の好ましい実施形態において、アフィニティ標識はビオチン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、フルオレセインまたはDyomics ６４７染料であり、好ましい捕獲試薬は、それぞれ、ストレプトアビジンもしくはアビジン、抗-ＤＮＰ、抗-フルオレセイン、および抗- Dyomics ６４７である。アフィニティタグ物質のアフィニティ単離後、それらのいくつかは同位体で標識され、アフィニティ標識と捕獲試薬との相互作用は、単離材料のＭＳ分析を可能にするように、崩壊すなわち切断される。アフィニティ標識は、置換配位子の添加によって捕獲試薬から置換されて、遊離アフィニティ標識またはアフィニティ標識の誘導体となり、また、溶媒（たとえば溶媒の種類またはｐＨ）もしくは温度条件を変えることによって、結合錯体は、化学的、酵素的、熱的または光化学的に開裂されて、ＭＳ分析のために単離物質を放出することが可能である。
【０１０７】
ＭＳ検出に先立ち、標識物質は、予め選択された分子種の検出を可能にするために分離される。たとえば液体クロマトグラフィ（ＬＣ）またはガスクロマトグラフィ（ＧＣ）による事前の分離によって、たんぱくの複雑な混合物のＭＳによる分析が可能となる。熟練者は特定の用途に必要な、または最適な分離手順を決定することができるだろう。
【０１０８】
化学的または生物学的物質の質量分析方法は、試験サンプルおよび参照サンプルの比較分析を含んでもよい。特異的標識後、２つのサンプルが混合され、混合物がクロマトグラフの分離に続いて質量分析にかけられると、標識遷移金属錯体で標識された物質は、非標識物質と比較して予測可能な分子量シフトを示すだろう。このように、本発明の方法は、サンプル間の化学的または生物学的物質の比較質量分析を可能にする。
【０１０９】
そのような方法はまた、分子量に基づいて試験サンプルの物質を参照サンプルの物質から区別するために、少なくとも２つの異なる分子量の標識遷移金属錯体を用意し、サンプル間で物質を特異的に標識することを含む。言い換えれば、試験サンプル物質は第１の分子量の標識遷移金属錯体で標識され、参照サンプル物質は第２の分子量の標識遷移金属錯体で標識される。必要とされる分解能にもよるが、１Ｄａという標識遷移金属錯体間の分子量差で充分である。先のセットにおける標識遷移金属錯体間の分子量差は２Ｄａを超えるのが効果的で、４Ｄａを超えるのがより効果的で、６Ｄａを超えるのが好ましく、８Ｄａを超えるのがより好ましく、１０Ｄａを超えるのがさらに好ましい。
【０１１０】
異なる分子量を有する２つの標識遷移金属錯体の目的は、化学的には実質的に同一でありながら、質量によって区別可能な試薬のペアまたはセットを生成することである。
【０１１１】
分子量の差異は、遷移金属錯体の原子または配位子を、より大きいまたはより小さい分子量の原子または配位子と置換することによってもたらすことが可能である。適当な質量変換配位子は、脂肪族基、炭水化物、アルコール官能基、およびたとえばＦ、ＣｌおよびＢｒなどのハロゲンを含む。
【０１１２】
分子量の差異はまた、遷移金属錯体の原子を別の安定同位体と置換することによってもたらすことが可能である。加えて、たとえば錯体中の１つ以上の原子を安定同位体と置換することによって、遷移金属錯体は異なる態様で同位体標識することが可能である。たとえば、水素は重水素で、１２Ｃは１３Ｃで、１４Ｎは１５Ｎで、１９５Ｐｔは１９２Ｐｔ、１９４Ｐｔ、１９６Ｐｔまたは１９８Ｐｔで、１６Ｏは１８Ｏで、置換することが可能である。錯体に存在するＰまたはＳ原子もまた置換することが可能である。好ましい実施形態においては、１Ｈおよび２Ｈ、１２Ｃおよび１３Ｃ、１４Ｎおよび１５Ｎ、１６Ｏおよび１８Ｏ、またはそれらの組合せが使用される。さらに、遷移金属同位体、たとえばＰｔ同位体の混合物の使用は、標識物質の識別をより容易にさせる質量分布の独特のパターンを提供する。
【０１１３】
さらに別の実施形態において、遷移金属錯体に付着したマーカが、前述の錯体に分子量差を提供する。このように、分子量差がマーカ（の存在）に起因してもよい。好ましい実施形態において、複雑性は単同位体白金および１５Ｎ、１３Ｃおよび／またはＤ標識配位子を使用することで軽減される。
【０１１４】
本発明は、前述のような少なくとも２つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットに関する。そのようなセットは、細胞および組織中における広範囲のたんぱく発現プロフィールの定性分析、特に定量分析に使用することが可能である。
【０１１５】
さらに別の側面において、本発明は前述のような少なくとも１つの異なる安定同位体を含有する遷移金属錯体に関する。
【０１１６】
さらに、本発明は、少なくとも１つの異なる安定同位体を含有する標識遷移金属錯体で標識された化学的または生物学的物質に関する。その物質はアミノ酸、ペプチドまたはたんぱくであるのが好ましい。
【０１１７】
本発明に従う遷移金属錯体は、（絶対的）定量に非常に適している。これは、内部物質標準を用いて単一のサンプル中の物質の絶対量を決定する方法である。そのような方法の焦点は、注目する重要な物質、またはその修飾状態に合わせられる。この方法は、物質が標識されることを必要としないが、質量分析に先立ち特定の内部標準が作製されることを必要とする。適当な内部標準は、調査下の物質と同じではなく類似した特徴を有する物質である。
【０１１８】
本発明のさらなる側面は、少なくとも２つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットを含む部品のキットに関する。好ましくは、分子量の差異は遷移金属錯体中の異なる安定同位体の存在に起因する。部品のキットはさらに、反応取扱説明書、１つ以上の試験サンプル、１つ以上の他の試薬、１つ以上の試験管または試験紙など、および、バッファ、マーカ調製品およびイオン強度を調整する調製品から形成される群から選ばれる１つ以上の調合物を含む。そのようなキットは本発明に従う方法を採用するのに非常に適している。
【０１１９】
本発明は、たんぱく混合物中のたんぱくまたはたんぱく機能の迅速な定量分析のための分析用試薬、およびこれらの試薬を用いる質量分析に基づく方法を提供する。分析法は、細胞および組織中における広範囲のたんぱく発現プロフィールの定性分析、特に定量分析、つまりプロテオームの定量分析のために使用することが可能である。この方法はまた、細胞、組織または生体液中の発現レベルが、サンプルが由来した細胞、組織または有機体の刺激（たとえば薬剤投与または潜在的に毒性の物質との接触）によって、環境変化（たとえば栄養水準、温度、時間の経過）によって、または条件もしくは細胞状態の変化（たとえば病状、悪性腫瘍、部位特定的突然変異、遺伝子ノックアウト）によって影響されるたんぱくをスクリーニングし、同定するために採用することが可能である。そのような選別において同定されたたんぱくは、変化した状況のためのマーカとして機能し得る。たとえば、正常および悪性細胞のたんぱく発現プロフィールの比較は、存在または不在が悪性腫瘍の特性および診断であるたんぱくの同定をもたらし得る。
さらに、本発明は以下の限定しない実施例によって説明される。
【０１２０】
実施例
Ｉ．三座配位子の作製および遷移金属錯体形成
以下の型の配位子、それらのＫ２ＰｔＣｌ４との錯体形成、ならびにそれに続く、ＮＨＳエステルとの反応およびマーカの組み込みのための錯体のＢＯＣ-脱保護が記載される。
【０１２１】
【化２】
【０１２２】
２の合成（図５：スキーム１）（ボールド体タイプの数字は、参照される図およびスキームに示される化合物を指す。たとえば本実施例では、図５：スキーム１の化合物が参照される）
【０１２３】
１，Ｎ-Ｂｏｃ-へキサン-１,６-ジアミン（１４０．５ｍｇ、６４９．５μｍｏｌ）をＨ２Ｏ／ＥｔＯＨ １／１（２０ｍｌ）の混合物に溶解した。アクリロニトリル（４２５．５μｌ、６．４９５ｍｍｏｌ）をその溶液に添加した。混合物を一夜６０℃で還流し、乾固して、純粋な油性の薄茶色の物質が生じた。残さがＣＨ２Ｃｌ２に溶解され、ＭｇＳＯ４上で乾燥された。ろ過および減圧下での溶媒の除去によって２が得られた。（収量：１６６．８ｍｇ、９５％）。１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δ １．３５（４Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)２(ＣＨ２)２）；１．４３（１３Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＨ２)２(ＣＨ２)＋ｔＢｕ）；２．６０（６Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)５＋(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＮ）；２．９４（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＮ）；３．１（２Ｈ、ｍ、(ＣＨ２)ＮＨＢｏｃ）；４．５５（１Ｈ、ブロードピーク、ＮＨＢｏｃ）。
【０１２４】
３の合成（図５：スキーム１）
２（１５３．０ｍｇ、４７４．５μｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）に溶解した。溶液を０℃で３０分間攪拌した後、Ｅｔ２Ｏ中のＬｉＡｌＨ４溶液（１Ｍ、２．９ｍｌ、２９００μｍｏｌ）を滴加した。混合物を０℃で９０分間攪拌し、室温になるまで静置した。過剰のＬｉＡｌＨ４を水４ｍｌを滴加して注意深く分解した。Ｌｉ塩をろ過によって除去し、水（１０ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）で洗浄した。水層が分離し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を混合し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、減圧下で乾固して、無色の油として３を得た（収量：９９．３ｍｇ、６３％）。１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δ １．２３（４Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)２(ＣＨ２)２)；１．３８（１３Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＨ２)２(ＣＨ２)＋ｔＢｕ）；１．５２（４Ｈ、ｍ、(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＮＨ２）；２．３２（２Ｈ、ｍ、Ｎ(ＣＨ２)(ＣＨ２)５）；２．４４（４Ｈ、ｍ、Ｎ(ＣＨ２)(ＣＨ２)２ＮＨ２）；２．７４（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＮＨ２）；３．０２（２Ｈ、ｍ、(ＣＨ２)ＮＨＢｏｃ）；３．３０（４Ｈ、ブロードピーク、ＮＨ２）；４．７２（１Ｈ、ブロードピーク、ＮＨＢｏｃ）。
【０１２５】
６の合成（図７：スキーム３）
ＣＨ２Ｃｌ２ ７０ｍｌ中の塩化クロルアセチル溶液１６５μｌ（２３３．９７ｍｇ、２．０７２ｍｍｏｌ）を、秒毎５滴の速度で、室温で、Ｎ-アセチルエチレンジアミン１９８．５０μｌ（２１１．６０ｍｇ、２．０７１ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２ １４０ｍｌおよび１Ｍ ＮａＯＨ水溶液２０７１．６μｌ（８０．７７ｍｇ、２．０７２ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。添加の完了後、その混合物を一夜室温で攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。固体をＭｅＯＨで洗浄し、ＮａＣｌ塩を遠心分離によって分離した。澄明なＭｅＯＨ抽出物を減圧下で乾燥し、ＭｅＯＨによる洗浄および遠心分離工程を、ＮａＣｌが分離されなくなるまで繰返した。ＭｅＯＨ抽出物を減圧下で乾固し、６を得た。
【０１２６】
７の合成（図７：スキーム３）
ＭｅＣＮ中の６の溶液（１７ｍｌあたり１ｍｍｏｌ）を、秒毎５滴の速度で、７５℃で（６の溶液を添加するフラスコの上端に還流冷却器が導入されている）、（６のモル数に対して）Ｋ２ＣＯ３の３Ｍ当量、（６のモル数に対して）ＫＩの１Ｍ当量、および（６のモル数に対して）１、つまりＭｅＣＮ中のＮ-Ｂｏｃ-へキサン-１,６-ジアミン（３４ｍｌで１は１ｍｍｏｌ）の１Ｍ当量を含む混合物に添加した。添加の完了後、混合物を一夜還流した。その後、溶媒を減圧下で除去した。固体をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、Ｋ+塩をろ過した。ＣＨ２Ｃｌ２抽出物を減圧下で乾固し、７を得た。
【０１２７】
８の合成（図７：スキーム３）
３の作製に関して記載した手順を、３の代わりに７を用いて繰返し、７を得た。
【０１２８】
Ｋ２ＰｔＣｌ４とのＢｏｃ三座配位子（スキーム２の３（図６）およびスキーム４の８（図８））の錯体形成に関する一般的なプロトコール
Ｋ２ＰｔＣｌ４およびＬの１Ｍ当量をＤＭＦに添加した（ｍｌあたりのＫ２ＰｔＣｌ４は４．６９×１０−６ｍｏｌ）。ここでＬは使用した三座配位子である。その後、混合物を４０℃で一夜熱し、その間に、赤色Ｋ２ＰｔＣｌ４塩が溶解した。溶液を乾固し、Ｋ+塩を水で洗浄した。不溶性固体をろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、減圧下で乾燥した。
４：１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＭｅＯＤ)：δＰｔ-２５２０ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＩ+)： ｍ／ｚ ５６１ [Ｍ−Ｃｌ]+
【０１２９】
Ｂｏｃ-脱保護および続くマーカのＰｔ錯体への組み込みに関する一般的なプロトコール
[Ｐｔ(Ｌ)Ｃｌ] Ｃｌ １２６μｌを２００ｍＭ ＨＣｌ（３ｍｌ）に溶解した。その後、その溶液を５０℃で一夜攪拌した。１Ｍ ＮａＯＨの添加によってｐＨを８に調整した。その後、５×スクシンイミド結合緩衝液（２ｍｌ）を溶液に添加した。ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＮＨＳ-スクシンイミドエステル（６３μｍｏｌ）を続いて滴加した。その溶液を遮光下で室温にて一夜攪拌した。その後、１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した種を、セファデックス カラム（Ｇ１５）に通して精製し、減圧下で溶媒を除去して得た。
Ｂｏｃ脱保護後の４：１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＭｅＯＤ)：δＰｔ-２５１２ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＩ+)：ｍ／ｚ ４６１ [Ｍ−Ｃｌ]+
【０１３０】
ＩＩ．Ｋ２ＰｔＣｌ４のジエチレントリアミンとの錯体形成
ジエチレントリアミンは市販のものが利用可能である（Aldrich、カタログ＃Ｄ９，３８５-６）。Ｋ２ＰｔＣｌ４（１ｇ）をミリＱ（２５ｍｌ）に溶解した。溶解しなかった小さな黄色の結晶および灰色の物質をろ過した。ジエチレントリアミン（０．５ｍｌ）をその澄明な赤色溶液に添加した。ＨＣｌ水溶液（６Ｍ）を用いてｐＨを３に調整した。溶液を６．５時間還流した。反応の２時間後、ＮａＯＨ水溶液（１および５Ｍ）を用いてｐＨを４に調整した。反応混合物を一夜室温にて冷却した。その後、ＨＣｌ水溶液（６Ｍ）を用いてｐＨを１まで酸性にした。その後、反応混合物を７２時間フリーザ（−２０℃）内に置いた。生じた白色結晶をろ過した。ろ液のｐＨを６に調整し、溶媒をいくらか蒸発させて、その溶液を氷浴中で冷却した。これで２次結晶が得られ、ろ取した。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (Ｄ２Ｏ)：δＰｔ-２７２２ｐｐｍ
【０１３１】
ＩＩＩ．ＡＰＥＴ錯体の作製
−４’−アミノペンチルエーテル−２，２’：６’，２”テルピリジン（２）の作製
【０１３２】
【化３】
【０１３３】
８０℃の乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）中の粉末ＫＯＨ ９８６ｍｇの攪拌懸濁液（１７．６ｍｍｏｌ、４．７ｅｑ）に、５-アミノペンタノール ３８５．８ｍｇ（３．７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加した。アルコールの添加後、溶液がオレンジ色から茶色に変化した。３０分後、４’-クロロ-２,２’:６’,２買eルピリジン １ｇ（３．７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加した。２については８０℃での４時間の攪拌後、３については８０℃での１８時間３０分の攪拌後、溶液を冷却ミリＱ ２００ｍｌに注いだ。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍｌ）で抽出した。混合有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ロータリーエバポレータによって蒸発させた。産物収量は黄色粒子 ９０８．４ｍｇであった（７３％）。
【０１３４】
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
δ １．３ [ブロードピーク、２Ｈ、ＣＨ２]、１．９ [ブロードピーク、２Ｈ、ＣＨ２]、２．２ [ブロードピーク、２Ｈ、ＣＨ２]、２．５ [ブロードピーク、２Ｈ、ＣＨ２]、２．６ [ブロードピーク、２Ｈ、ＮＨ２]、３．６ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２]、６．８ [ｄｄ、 ２Ｈ、Ｈ４,４・/SUB>]、７．３ [ｔ、２Ｈ、Ｈ５,５・/SUB>]、７．４２ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、７．９ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ３,３・/SUB>]、８．１ [ｄ、２Ｈ、Ｈ６,６・/SUB>]。
【０１３５】
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
δ ２３．５ [ＣＨ２]、２９．０９ [ＣＨ２]、３３．４ [ＣＨ２]、４２ [ＣＨ２-ＮＨ２]、６８．４ [ＣＨ２-Ｏ]、１０７．５ [ＣＨ、Ｃ３’,５’]、１２１．５ [ＣＨ、Ｃ５, ５・/SUB>]、１２４．３ [ＣＨ、Ｃ３,３・/SUB>]、１３７．２ [ＣＨ、Ｃ４,４・/SUB>]、１４９．３ [ＣＨ、Ｃ６,６・/SUB>]、１５６．０３ [Ｃ、Ｃ２,２・/SUB>]、１５７．１ [Ｃ、Ｃ２’,６’]、１６７．３ [Ｃ、Ｃ４’]。
【０１３６】
ＵＶ／可視吸収（ＣＨＣｌ３）
λｍａｘ２４５ｎｍ（ε１６ ５００Ｍ−１.ｃｍ−１）
２７９ｎｍ（ε１６ ５００Ｍ−１.ｃｍ−１）
−４’-ポリエチレングリコールエーテル-２,２’:６’,２・テルピリジン（３）の作製
【０１３７】
【化４】
【０１３８】
８０℃の乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）中の粉末ＫＯＨ ９８．６ｍｇの攪拌懸濁液（１．７６ｍｍｏｌ、４．７ｅｑ）に、ＰＥＧ ３００ １１２．２ｍｇ（０．３７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加した。３０分後、４’-クロロ-２,２’:６’,２・テルピリジン １００ｍｇを添加した（０．３７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）。８０℃での２０時間の攪拌後、溶液を冷却ミリＱ ２００ｍｌに注いだ。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍｌ）で抽出した。混合有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ロータリーエバポレータによって蒸発させた。黄色い油が３５％の収量で得られた（６８．３ｍｇ）。
【０１３９】
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
δ ３ [ブロードピーク、１Ｈ、ＯＨ]、３．６７ [２Ｈ、ＣＨ２]、３．６０ [ｍ、６Ｈ、ＣＨ２]、３．８６ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２]、４．３３ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２]、７．２４ [ｔ、２Ｈ、Ｈ５,５”]、７．７４ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ４,４”]、７．９５ [ｓ、２Ｈ、 Ｈ３’,５’]、８．５ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ３,３”]、８．６ [ｄ、２Ｈ、Ｈ６,６”]。
【０１４０】
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
δ ６２．２ [ＣＨ２-Ｏ]、６８．５ [ＣＨ２-Ｏ]、７１．３ [ＣＨ２-Ｏ]、７１．６ [ＣＨ２-Ｏ]、７３．５ [ＣＨ２-Ｏ]、１０８．２ [ＣＨ、Ｃ３’,５’]、１２２．０６ [ＣＨ、Ｃ５,５”]、１２４．６０ [ＣＨ、Ｃ３,３”]、１３７．５４ [ＣＨ、Ｃ４,４”]、１４９．７３ [ＣＨ、Ｃ６,６”]、１５６．７ [Ｃ、Ｃ２,２”]、１５７．７ [Ｃ、Ｃ２’,６’]、１６７．７ [Ｃ、Ｃ４’]。
−蛍光色素（またはハプテン）のＡＰＥＴ（６ａ〜ｄ）との結合
【０１４１】
【化５】
【０１４２】
磁気攪拌装置が備えられたミクロリアクタにおいて、ＡＰＥＴを染料のＤＭＦ １ｅｑ ３００μｌに溶解し、ＴＥＡ ３ｅｑを添加し、溶液を暗所にて室温で２０時間攪拌した。溶媒を除去した。産物純度をＲＰ ＨＰＬＣによってチェックし、産物をＬｕｎａ １０ Ｃ１８ （２）上でのアセトニトリル／ＴＥＡＡバッファによる分取用ＲＰ ＨＰＬＣによって精製された。
収量：
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
＞ＤＥＡＣ（６ａ）：
δ １．２４ [ｔ、６Ｈ、ＣＨ３]、１．６６ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．７３ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．８７ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、３．４７ [ｍ、６Ｈ、ＣＨ２]、４．２７ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｏ]、６．４８ [ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４８Ｈｚ、ＣＨ]、６．６３ [ｄｄ、ＩＨ、ＪＰ＝２．４１およびＪｏ＝８．９５Ｈｚ、ＣＨ]、７．３３ [ｍ、２Ｈ、Ｈ５,５”]、７．４３ [ｄ、１Ｈ、Ｊｏ＝８．９５Ｈｚ、ＣＨ]、７．８４ [ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝１．７７およびＪ＝７．７１Ｈｚ、Ｈ４,４”]、７．９７ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．５８ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ３,３”]、８．６９ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ６,６”]、８．７１ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、８．８６ [ｔ、１Ｈ、アミド]。
【０１４５】
＞ＤＥＡＣ（６ａ）：
δ １．２４ [ｔ、６Ｈ、ＣＨ３]、１．６６ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．７３ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．８７ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、３．４７ [ｍ、６Ｈ、ＣＨ２]、４．２７ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｏ]、６．４８ [ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４８Ｈｚ、ＣＨ]、６．６３ [ｄｄ、ＩＨ、ＪＰ＝２．４１およびＪｏ＝８．９５Ｈｚ、ＣＨ]、７．３３ [ｍ、２Ｈ、Ｈ５,５”]、７．４３ [ｄ、１Ｈ、Ｊｏ＝８．９５Ｈｚ、ＣＨ]、７．８４ [ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝１．７７およびＪ＝７．７１Ｈｚ、Ｈ４,４”]、７．９７ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．５８ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ３,３”]、８．６９ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ６,６”]、８．７１ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、８．８６ [ｔ、１Ｈ、アミド]。
【０１４６】
＞６ ＴＡＭＲＡ （６ｂ）：
δ １．２９ [ｓ、６Ｈ、ＣＨ３]、１．３２ [ｓ、６Ｈ、ＣＨ３]、１．５７ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．６６ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．８７ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、４．２２ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｏ]、３．４２ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２-ＮＨ]、６．３８ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、６．４０ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、６．４７ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、６．４８ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、６．５８ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、６．６１ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、７．３１ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．７８Ｈｚ、Ｈ５,５”]、７．４９ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、７．８５ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．７１Ｈｚ、Ｈ４,４”]、７．９９ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．０４ [ｄ、１Ｈ、ＣＨ]、８．０７ [ｄ、１Ｈ、ＣＨ]、８．６１ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．９５Ｈｚ、Ｈ３,３”]、８．６７ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝４．５０Ｈｚ、Ｈ６,６”]。
【０１４７】
＞ＬＣビオチン（６ｃ）：
δ １．５４ [ｍ、４Ｈ、ＣＨ２]、１．６２ [ｍ、１２Ｈ、ＣＨ２]、１．９２ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、２．２０ [ｔ、４Ｈ、ＣＨ２]、３．１８ [ｔ、４Ｈ、ＣＨ２-ＮＨ]、３．３４ [ｍ、３Ｈ、ＣＨ-ＮＨおよびＣＨ２-ＮＨ]、３．３８ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｓ]、４．３２ [ｍ、４Ｈ、ＮＨ]、４．５３ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ-Ｓ]、７．５５ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝１．５５および５．０８、Ｈ５,５”]、７．７５ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．０５ [ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝１．６０および７．７８Ｈｚ、Ｈ４,４”]、８．５７ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．９６Ｈｚ、Ｈ３,３”]、８．６９ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝４．２６Ｈｚ、Ｈ６,６”]。
ＤＮＰ（６ｄ）：
δ １．２０ [ｍ、４Ｈ、ＣＨ２]、１．５０ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２]、１．６０ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２]、１．７６ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２]、１．８９ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２]、２．２２ [ｍ、４Ｈ、ＣＨ２]、３．３３ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｏ]、３．３７ [ｍ、２Ｈ、 ＣＨ２-ＮＨ]、４．２７ [ブロードピーク、１Ｈ、ＮＨ]、５．５７ [ｍ、１Ｈ、ＮＨ]、７．３７ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝４．６８Ｈｚ、Ｈ５,５”]、７．８８ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．０２Ｈｚ、Ｈ４,４”]、７．９８ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．１８ [ｄｄ、１Ｈ、Ｊｍ＝２．６１およびＪｏ＝９．４８Ｈｚ、ＣＨ]、８．４７ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、８．６０ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．８３Ｈｚ、Ｈ３,３”]、８．６７ [ｄ、２Ｈ、Ｈ６,６”]、９．０６ [ｄ、１Ｈ、Ｊｍ＝２．６４Ｈｚ、ＣＨ]。
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
【０１４８】
＞ＤＥＡＣ（６ａ）：
δ １３．２０ [ＣＨ３、ＣＨ３-ＣＨ２]、２４．２９ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２]、２６．１６ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２]、２９．５４ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２]、３０．１１ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＮＨ]、４０．３３ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ３]、４５．８３ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ３]、６８．８４ [ＣＨ２、Ｏ-ＣＨ２]、１０８．３３ [ＣＨ、Ｃ３’,５’]、１１０．６８ [ＣＨ]、１２２．２０ [ＣＨ、Ｃ５,５”]、１２４．５２ [ＣＨ、Ｃ３,３”]、１３１．９１ [ＣＨ]、１３７．５０ [ＣＨ、Ｃ４,４”]、１４８．８８ [ＣＨ]、１４９．７６ [ＣＨ、Ｃ６,６”]、１５７．００ [Ｃ、Ｃ２,２”]、１５７．７６ [Ｃ、Ｃ２’,６’]、１６８．００ [Ｃ、Ｃ４’]、１７３．００ [Ｃ、Ｃ＝Ｏアミド]。
ＵＶ／可視吸収 (ＣＨＣｌ３)
【０１４９】
【表２】
【０１５０】
発光スペクトル
【０１５１】
【表３】
【０１５２】
−Ｋ２ＰｔＣｌ４の６ｃ、ＬＣビオチン ＡＰＥＴとの錯体形成
Ｋ２ＰｔＣｌ４（６．０ｍｇ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）に溶解した。その溶液をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）中のＤＮＰ ＡＰＥＴ（８．３ｍｇ）溶液にゆっくり添加した。その溶液が遮光下で４０℃にて一夜加熱した。その後、混合物を減圧化で乾固した。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (Ｄ２Ｏ)：δＰｔ -２７０１， -２９５４および -２９５１ｐｐｍ。
【０１５３】
−Ｋ２ＰｔＣｌ４の６ｄ、ＤＮＰ ＡＰＥＴとの錯体形成
Ｋ２ＰｔＣｌ４（６．０ｍｇ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）に溶解した。その溶液をプロパノール（１ｍｌ）およびＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）中のＤＮＰ ＡＰＥＴ（９．３ｍｇ）溶液にゆっくり添加した。その溶液を遮光下で４０℃にて一夜加熱した。その後、混合物を減圧化で乾固した。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (Ｄ２Ｏ)：δＰｔ -２６８６および -３４４２ｐｐｍ。
【０１５４】
ＡＰＥＴ錯体の作製についての付加情報
４’-クロロ２,２’:６’,２’’ルピリジンおよび５-アミノペンタノールをAldrichから購入した。Ｋ２ＰｔＣｌ４をSigmaから購入した。ＥＺ Ｌｉｎｋ ＮＨＳ ＬＣビオチンをPierceから購入した。６ ＴＡＭＲＡ-ＳＥ、ＤＮＰ-ＳＥ、ＤＥＡＣをMolecular Probesから得た。配位子に関してカラムクロマトグラフィをFlukaのシリカゲル６０上で実行した。錯体をIGN Biomedical GmbHのAlumina N上で精製した。全溶媒をMerckから得て、精製せずに使用した。使用した水は、脱塩されたミリＱ水であった（Ｒ＝１８．２ＭΩ／ｃｍ）。ＲＰ ＨＰＬＣによる全分析ランに使用した溶離液は：
＞ Ａ：１０％ ＣＨ３ＣＮ／９０％ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｐＨ ５
＞ Ｂ：７０％ ＣＨ３ＣＮ／３０％ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｐＨ ５、であった。
【０１５５】
１Ｍ ＴＥＡＡバッファ ｐＨ ５．０： ５００ｍｌのメスシリンダ内で、ミリＱ水 ２００ｍｌ、酢酸 ３０ｍｌおよびＴＥＡ ７０ｍｌを攪拌した。その後、ミリＱ水を４００ｍｌまで添加した。溶液を室温で冷却し、ｐＨを酢酸で５に調整した。容積をミリＱで５００ｍｌに調整した。溶液を２〜６℃で保存した。
【０１５６】
アセトニトリルバッファ １０％／０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ ５．０ ９０％： １０００ｍｌのメスシリンダ内で、アセトニトリル １００ｍｌ、１Ｍ ＴＥＡＡ ９０ｍｌ ｐＨ ５．０およびミリＱ ８１０ｍｌを室温で攪拌した。溶液を膜フィルタ １．０μｍでろ過した。その後、溶液を１０〜２０分間真空ポンプで脱気した。バッファを２〜６℃で保存した。
【０１５７】
アセトニトリルバッファ ７０％／０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ ５．０ ３０％： １０００ｍｌのメスシリンダ内で、アセトニトリル ７００ｍｌ、１Ｍ ＴＥＡＡ ３０ｍｌ ｐＨ ５．０およびミリＱ水 ２７０ｍｌを室温で攪拌した。溶液を膜フィルタ １．０μｍでろ過した。その後、溶液を１０〜２０分間真空ポンプで脱気した。バッファを２〜６℃で保存した。
【０１５８】
カラム：ＲＰ ＨＰＬＣ分析をPhenomex Luna ５ａ Ｃ１８（２）カラムを備えるAmersham Pharmacia Biotech Akta explorerを用いて実行した。カラムおよび分析の特性は以下のとおりである：高さ ２５ｃｍ、直径 ０．４６ｃｍ、カラム容積 ４．１５５ｍｌ、圧力 １４ＭＰａ、流速 １ｍｌ／ｍｉｎ。
【０１５９】
波長：分析は一般に３つの波長で実行したが（２５４，２８０および２１５ｎｍ）、波長は、遊離した蛍光色素（またはハプテン）をより容易に検出するために、蛍光色素に適合させた。
【０１６０】
ＮＭＲ：作製した化合物を１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲ分光法によって特徴付けた。１Ｈ ＮＭＲは３００ＭＨｚで、１３Ｃ ＮＭＲは７５ＭＨｚで、双方ともBruker DPX ３００ スペクトロメータにて記録した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは内部テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を基準とした。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは溶媒共鳴を基準とした。全サンプルを室温で測定した。
【０１６１】
ＵＶ／可視：ＵＶスペクトルをAmersham Pharmacia Biotech Ultrospec ４０００ スペクトロメータにて記録した。スペクトルを、配位子および錯体に関して、２００〜７００ｎｍの間で石英キュベット内で測定した。
【０１６２】
発光スペクトル：発光スペクトルをPerkin Elmer LS ４５Luminescence Spectrometerにて記録した。励起波長をモノクロメータで選択した。各励起波長を染料の最大吸収に選択した。スペクトルを室温で記録した。
【０１６３】
ＩＶ．核酸およびたんぱくの標識におけるＡＰＥＴ−Ｐｔ／Ｐｄ／Ｒｕ／Ｃｏ試薬の使用
白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）およびコバルト（Ｃｏ）を含む様々な金属をＡＰＥＴスペーサに導入した。初めに、蛍光色素またはハプテンをＡＰＥＴに付着させ、その後様々な金属を標識ＡＰＥＴ分子に導入した。化学分析をＨ-ＮＭＲによって行った。ＲＰ-ＨＰＬＣ精製試薬の純度は８０〜９９％間で変化させた。
【０１６４】
ビオチン-ＡＰＥＴ-錯体：
ビオチン-ＡＰＥＴスペーサをＣｄ２+、Ｃｏ２+、Ｃｕ２+、Ｆｅ３+、Ｍｎ２+、Ｎｉ２+、Ｐｄ２+、Ｐｔ２+、Ｒｕ２+およびＺｎ２+と錯体形成させた。ＤＭＦまたはＤＭＳＯに可溶であるＰｔ、ＰｄおよびＲｕ錯体を除いて、全錯体が水溶性であった。これら試薬の純度は８２〜９９％で、８０％を超える収量であった。Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｐｄ錯体はあまり安定ではなかった（考えられる解釈：Ｐｄの、別のＢｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｐｄ分子のビオチンのチオエーテルとの結合を介した鎖の形成があり、これはＨＰＬＣクロマトグラムにおいて見られた）。標識錯体を、異なる比、温度、インキュベーション時間およびｐＨにてたんぱくおよびＤＮＡとインキュベートした。Ｐｔ、ＰｄおよびＲｕ含有Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-錯体はたんぱくおよびＤＮＡの双方を標識し、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-ＣｏはＤＮＡを標識しないがたんぱくを標識し（ｐＨ８．０にて）、他の金属はあまり反応しないか、安定した結合を形成しないことがわかった。
【０１６５】
図１は、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕが、基準となる二座配位子の白金標識錯体（Ｂｉｏ-ＢＯＣ-Ｐｔ）よりもＤＮＡとよく反応することを示す。ＤＮＡは、より速く、かなり低温で標識される。また、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕが基準となるＦｌｕ-ＢＯＣ-Ｐｔと１：１で混合されるとき、シグナルの大部分がビオチン検出によって発見される。Ｆｌｕ-ＢＯＣ-ＰｔがＢｉｏ-ＢＯＣ-Ｐｔと混合される場合、シグナルの大部分がフルオレセイン検出によって発見される。Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-ＰｔはＢｉｏ-ＢＯＣ-Ｐｔと同様の反応をした（データ示さず）。興味深いことに、メチオニンビーズはＰｄおよびＰｔ含有ＡＰＥＴ錯体によって標識されたが、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕ錯体はメチオニンビーズに、反応をさほど、どちらかといえば全く示さなかった。Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕは全ＲＮＡの標識を含むマイクロアレイ実験において首尾よく使用された。一般に、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕはより安定で、基準となるビオチン- ＢＯＣ-Ｐｔを凌ぐ。Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-ＲｕはたんぱくおよびＤＮＡの双方とよりよく反応する（たとえば、より低温で充分に標識する）。Ｒｕが硫黄ではなく窒素とのみよく反応すると考えられることを考慮すれば、ビオチン-ＡＰＥＴ-Ｒｕは基準となるビオチン-ＢＯＣ-Ｐｔ錯体よりも安定した試薬であるかもしれない（たとえば、より低温で充分に標識しない）。
【０１６６】
ＤＮＰ-ＡＰＥＴ-錯体：
Ｐｔ、ＰｄおよびＲｕ含有ＤＮＰ-ＡＰＥＴ錯体はＤＮＡおよびたんぱくに対してよく反応する（表１参照）。図２に示すように、４０℃を超える温度でのＤＮＡに対する反応は、基準となる二座配位子のＤＮＰ-ＢＯＣ-Ｐｔと同程度である。ＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｐｄは、６０℃を超える温度では標識がほとんど観察されないので、あまり安定してＤＮＡに結合しなかった。
【０１６７】
全ヒト血清のターゲット標識を、基準となるＤＮＰ-ＢＯＣ-ＰｔおよびＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｒｕ、Ｐｔ、Ｐｄ錯体を用いて実行した。ＩｇＡ-、ＩｇＧ-およびＩｇＭ キャプチャ ＥＬＩＳＡ分析を展開した。ＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｐｔおよび-Ｐｄで使用した標識比にて、ほとんどのたんぱくがすぐに沈澱した。Ｐｔ錯体はより速くたんぱくを沈殿させたが、Ｐｄ錯体よりもかなり標識されにくいことをデータは示している。真にポジティブの結果はＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｐｔでは見られなかった。ＩｇＧ検出に関して、ＢＯＣ-Ｐｔ＝ＡＰＥＴ-Ｐｄ＞ＡＰＥＴ-Ｒｕであり、ＩｇＡ検出に関して、ＢＯＣ-Ｐｔ＝ＡＰＥＴ-Ｐｄ＝ＡＰＥＴ-Ｒｕであった。使用した最も低い比率では、２０％のＩｇＧおよび５０％のＩｇＡのみが溶解し（１時間３７℃での標識）、一方で、対照の二座配位子の標識錯体およびＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｒｕで得られた最良の結果は８５％を超えるＩｇＧおよび７５％を超えるＩｇＡを含む画分に由来したので（２０時間３７℃での標識）、ＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｐｄは比率を低下させることで最適化することが可能である。
【０１６８】
Ｃｙ３／５-ＡＰＥＴ-錯体：
ＤＮＡ標識は、Ｃｙ３-ＡＰＥＴ-Ｐｔ、Ｃｙ５-ＡＰＥＴ-ＰｄおよびＣｙ５-ＡＰＥＴ-Ｒｕによって行った。全ヒト血清のターゲット標識を、基準となるＣｙ５-ＢＯＣ-Ｐｔ、Ｃｙ５-ＡＰＥＴ-ＲｕおよびＣｙ５-ＡＰＥＴ-Ｐｄを用いて実行した。ＩｇＡ キャプチャ ＥＬＩＳＡ分析を展開した。Ｃｙ５はハプテンとして機能した（ＨＲＰ共役ＭｏＡｂ抗-Ｃｙ５によって検出された）。図３は、すべての場合において、Ｃｙ５標識ＩｇＡが検出されることを示す。最良の結果は対照のＣｙ５-ＢＯＣ-Ｐｔ錯体で得られた。
Ｖ．ペプチドマーカ-三座配位子-Ｐｔ錯体の合成
ペプチドは１６個のアミノ酸長であって、細胞の原形質膜を超えて生体分子を移送するシャトル分子として機能する。このペプチドは固体支持として一端および他端に末端ＮＨ２基を有する。アミンを、溶液ｍｌあたりアミン ０．０２ｍｇの濃度となるように、ミリＱおよびエタノールの５０：５０混合物中に溶解した。アクリロニトリルの１０００倍モル当量を溶液に添加した。溶液を一夜還流した（６５℃の加熱）（水冷却機に連結された丸底フラスコの上端に還流冷却器が取り付けられている）。混合物をロータリー蒸発下で乾燥し、固化物を乾燥エタノール（３〜５ｍｌ）で洗浄し、再び乾固するまで蒸発させた。ニトリル化合物を、１：１のモル比で乾燥エタノール（ニトリル ２０ｍｍｏｌについて２０ｍｌ）中で塩化ニッケル(II)と混合した。新しく調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液（ニトリル １ｍｍｏｌあたり１ｍｍｏｌ）を、かなり慎重に（少しずつ）添加した（２ｍｍｏｌ）。溶液を室温で２時間攪拌した。次に、溶液をミリＱでろ過し、金属ニッケルを磁石を用いて除去した。ろ液をＤＭＦ ２ｍｌに溶解した。テトラクロロ白金(II)酸カリウム ５当量（１００μｍｏｌ）を添加し（粉末）、混合物を４０℃に一夜保った。次に、混合物をろ過し、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ミリＱおよびＤＣＭ（ジクロロメタン）で洗浄した。溶液をロータリー蒸発下で乾固した。固体支持は、ペプチドを固体支持に結合させるのに用いた化学反応型に応じて、基準的な化学反応によって除去することが可能である。この場合は、ＴＦＡ化学反応を使用した。最終的に、遷移金属―三座配位子―（ペプチド）マーカから成る、単機能的なＰｔ錯体が合成された。
【０１６９】
ＶＩ．マスタギング
ジエチレントリアミン Ｐｔ錯体（Ｐｔ[ジエン Ｃｌ−] Ｃｌ−； ５μＭ溶液を使用した）は、本化合物がＭＳ中で安定し、ＰｔおよびＮの模擬同位体分布の同位体パターン特性を有することを明らかにした。光標識化合物に関して得られた最も多く存在する分子イオン（図４）は、ｍ／ｚ＝３３４に分子イオン[Ｍ１+]を有する。本化合物の合成からの夾雑ピークは観察されなかった。他の唯一の可視ピークは、標識反応中に観察されたｍ／ｚ＝３１５のＯＨ-基と置換されたＣｌ−の損失であった。
【０１７０】
ＹＧＧＦＭＫペプチドの３Ｍ 過剰Ｐｔ[ジエンＣｌ] Ｃｌでの標識を、４５および８５℃で実行した。３Ｍ 過剰標識化合物との、５ｍＭ 酢酸アンモニウム ｐＨ６〜７中での１時間のインキュベーション後、メチオニン含有ペプチドであるペプチドは、両温度で完全に標識された。８５℃での標識は４５℃での標識よりも多くの副反応物をもたらさなかったものの、副反応物の強度は４５℃よりも８５℃で大きかった。しかし、これはナノスプレーキャピラリの位置に起因し得る。この単機能的な三座配位子標識化合物はペプチドの標識をもたらした。
【０１７１】
ＭＳ測定を、陽イオンモードで作動し、Ｚ-スプレー ナノ電気スプレー源を備えた三連四重極機器（Micromass、マンチェスター、英国）にて実行した。ナノ電気スプレーニードルをＰ-９７ プラー（Sutter Instruments、ナヴァト、カリフォルニア）上でホウケイ酸ガラスキャピラリー（Kwik- Fil、 World Precision Instruments、サラソータ、フロリダ）から作製した。このニードルを、Edwards Scancoat （Edwards Laboratories、ミルピタス、カリフォルニア）six Pirani 501 （２００秒間で４０ｍＶ、１ｋＶ）を用いて、薄い金層で被膜した（およそ５００Å）。ナノスプレーニードルとマススペクトロメータオリフィスとの間のポテンシャルは通常１，２００Ｖに設定した。コーン電圧は３０Ｖであった。ナノスプレーニードルは常におよそ３０℃に保った。ＭＳ／ＭＳ測定に関して、衝突エネルギは、充分な配列情報を得るために必要とされる適切な電圧に設定した（＜２０Ｖ）。衝突ガスとしてアルゴンを使用した。四重極質量分解能パラメータを、前駆イオンの全同位体エンベロープを選択するために、比較的大きなマスウィンドウに設定した。
【０１７２】
ＶＩＩ．Ｎ３トランス-Ｃ３三座配位子の合成（スキーム５）
１の作製−アクリロニトリルのマイケル付加：
Ｎ-Ｂｏｃ-ヘキサン-１,６-ジアミン（１４０．５ｍｇ、６４９．５μｍｏｌ）をＨ２Ｏ／ＥｔＯＨ １／１の混合物（２０ｍｌ）中に溶解した。アクリロニトリル（４２５．５μｌ、６．４９５ｍｍｏｌ）をその溶液に添加した。混合物を一夜６０℃で還流し、乾固して、純粋な油性の薄茶色の物質を得た。残さをＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。続くろ過および減圧下での溶媒の除去によって、１を得た。（収量：１６６．８ ｍｇ、９５％）
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δ １．３５ （４Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)２(ＣＨ２)２）；１．４３ （１３Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＨ２）２(ＣＨ２)＋ｔＢｕ）；２．６０ （６Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)５＋(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＮ）；２．９４ （４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＮ）；３．１ （２Ｈ、ｍ、(ＣＨ２)ＮＨＢｏｃ）；４．５５ （１Ｈ、ブロードピーク、ＮＨＢｏｃ）。
【０１７３】
２の作製−水素化リチウムアルミニウムでの還元：
１（１５１．０ｍｇ、５．１２９×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍｌ）中に溶解した。その溶液を２０分間氷浴（０℃）中で攪拌した。その後、水素化リチウムアルミニウム（ジエチルエーテル中の１Ｍ 溶液 ５ｍｌ、５ｍｍｏｌ）を添加した。白色固体が沈殿するのが直ちに観察された。その混合物を３０分間０℃（氷浴）で攪拌し、その間に温度は室温と平衡になった。その後、ミリＱ ７．５ｍｌを慎重に添加して、過剰の水素化リチウムアルミニウムを中和した。ミリＱの添加はより重要な量の白色固体の沈殿をもたらした。その後、混合物をろ過した。有機抽出物を水性抽出物から分離し、減圧下で乾燥して、無色の油を得た。（収量：２３．５ ｍｇ、１５．１％）。
【０１７４】
１の１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δＨ １．２２ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．４１ （ｍ、１３Ｈ、ｔＢｕプロトンおよびヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、１．８２ （ブロードシングレット、４Ｈ、ＮＨ２）、２．２９ （ｍ、８Ｈ、(ＣＨ２)２ＮＨ２）、２．６８ （ｍ、２Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨＢｏｃ）、３．０６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、４．６１ （ｍ、２Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ３０３ [Ｍ＋Ｈ]+。
【０１７５】
３の作製−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
２（８２９．２ ｍｇ、２．５０９ｍｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（５３５．４ｍｌ）中に溶解した。その後、固体の状態でテトラクロロ白金酸カリウム（１０４１．４ｍｇ、２．５０９ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で一夜加熱した。加熱によって赤色白金塩が溶解するのが観察された。その後、混合物をろ過して、白色塩化カリウム固体を分離した。ろ液を減圧下での加熱によって乾固した。その後、ミリＱ（約３０ｍｌ）を添加して、残留塩化カリウム塩を除去した。水性抽出物をろ過した。茶色固体をジエチルエーテル（１０ｍｌ）で洗浄し、減圧下で乾燥した。（収量：８５３．００ｍｇ、５７．０％）。
【０１７６】
４ａの作製および５のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステルとの反応：
３（７．３ｍｇ、１．２×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（４ｍｌ）と混合した。その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いて、ｐＨを約８．０に調整した。
【０１７７】
不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して、茶色の残さを可溶化することもできる。その後、ミリＱ（４７６μｌ）、ミリＱ中の水酸化ナトリウム（１Ｍ 溶液、２５μｌ）を添加した。
【０１７８】
Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（９５．２μｌ）中のＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステル（４．７６ ｍｇ、１．０×１０−５ｍｏｌ）を滴加した。ミリＱ（３８１μｌ）、トリエチルアミン（３μｌ）、ミリＱ（１６２μｌ）、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（パスツールピペットによる４滴の滴加）、メタノール（パスツールピペットによる５滴の滴加）およびジクロロメタン（４滴）を添加した。ｐＨが８．０前後であると確認した。トリエチルアミンをこのｐＨ調整にために添加してもよい。その混合物を５分間遮光下にて室温で攪拌した後、ｐＨが８．０前後であることが確認した。
【０１７９】
ここでも、トリエチルアミンをｐＨ調整のために使用してもよい。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。その後、不溶性物質をろ過した。ろ液を乾固させた。
【０１８０】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -３１２９および -２５１９ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ８００ [Ｍ]+。
【０１８１】
たんぱく標識におけるＮ３ トランス-Ｂｉｏ ＵＬＳ (４ａ)の使用
たんぱく ５０μｇを含むHELA細胞溶解物を、標識バッファ ５０μｌ中の化合物４ａで、３時間３７℃にて標識した。４ａの量はそれぞれ０．５，１，２，４または１６μｇであった。標識反応を還元サンプルバッファの添加によって停止した。BIO-APを検出抗体として使用した（１：１０００）。ウェスタンブロットの結果を図１０に示す。
【０１８２】
４ｂの作製および５のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去および６-ＦＡＭ フルオレセイン スクシンイミジルエステルとの反応
３（２．１５ｍｇ、３．６×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（３６６．４６μｌ）と混合した。その後、メタノール（パスツールピペットから３滴の滴下）およびＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドを、総容積が約１ｍｌになるよう添加した。
【０１８３】
その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色の個体が溶解するのが観察された。その後、ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いて、溶液の半分のｐＨを約８．０に調整した。その後、スクシンイミド結合バッファ（５×、６５．７０μｌ）を添加した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して、茶色の残さを可溶化することもできる。
【０１８４】
Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１６４．２３５μｌ）中のフルオレセイン スクシンイミジルエステル（０．８２ ｍｇ、２．１×１０−６ｍｏｌ）を滴加した。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
【０１８５】
たんぱく標識におけるＮ３ トランス-Ｆｌｕ ＵＬＳ (４ｂ)の使用
４ｂ １，２，４，６，７．５，１０，１２．５および２５μｇを、異なる分子量の６つのたんぱく混合物（ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ、カルボニックアンヒドラーゼ、オボアルブミン、ＢＳＡ、ホスホリラーゼＢ） ５０μｇを標識するのに使用した。この標識（１時間５０℃）を、抗ＦＬＵ-ＡＰで検出されるブロット上で１２．５μｇにて、ＦＬＵ- ＵＬＳの基準となる標識量と比較した（図１１）。
【０１８６】
核酸のＮ３ トランス-Ｆｌｕ ＵＬＳ (４ｂ)での標識
ＤＮＡ [第１染色体のセントロメア周辺（１ｑ１２）に位置するヒト反復サテライトIII ＤＮＡ配列を乗せる１．７７ｋｂインサートを有するpUC19プラスミド] を、４ｂ １０μｇを１００μｌの容積中のＤＮＡ ３μｇに添加することで、４ｂによって標識した。混合物を８５℃１時間でインキュベートし、非結合４ｂを標準的なエタノール沈殿によって除去した。ＤＮＡ沈殿物は、ＵＶ光で照射されたとき、緑色蛍光発光を示した。精製４ｂ標識ＤＮＡをin situハイブリダイゼーション分析においてプローブとして用いた。プローブを、６０％ ホルムアミド、１×ＳＳＣおよび１０％ 硫酸デキストランを含むハイブリゼーションバッファに溶解し、最終濃度 ４ｎｇ／μｌとした。１０μｌを、基準となる前処理ヒト中期分裂標本に適用し、ターゲットおよびプローブの双方が変性し得るように、８０℃で５分間インキュベートした。次に、スライドを３７℃で一夜インキュベートし、非結合または不完全な結合のプローブを、６５℃の１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で洗浄して除去した。再水和後、標本をＤＡＰＩを含む抗退色試薬中に埋め込んだ。フルオレセイン画像を、デジタルカメラを備えたLeica蛍光顕微鏡を用いて記録した。
【０１８７】
図１は、４ｂ標識プローブが蛍光in situハイブリダイゼーションによってヒト第１２染色体の１ｑ１２-領域を視覚化するのに用いられ得ることを示す。４ｂのプローブＤＮＡ標識効率は、厳しい条件下でさえ直接の蛍光発光による視覚化を可能にする。
【０１８８】
４ｃの作製および５のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＤＮＰスクシンイミジルエステルとの反応：
３（２．１５ｍｇ、３．６×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（１６３．６２μｌ）と混合した。その後、メタノール（パスツールピペットから３滴の滴下）およびＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドを、総容積が約１ｍｌになるように添加した。
【０１８９】
その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色の個体が溶解するのが観察された。その後、ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いて、溶液の半分のｐＨを約８．０に調整した。その後、スクシンイミド結合バッファ（５×、２４５．４３μｌ）を添加した。
【０１９０】
不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して、茶色の残さを可溶化することもできる。Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（２４５．４３μｌ）中のＤＮＰ スクシンイミジルエステル（１．６ ｍｇ、３．３４×１０−６ｍｏｌ）を滴加した。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。
【０１９１】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
【０１９２】
ＶＩＩＩ．Ｎ３シス-Ｃ２三座配位子の合成（スキーム６）
１の作製−塩化クロロアセチルとの反応：
Ｎ-Ｂｏｃ-１,６-ジアミノヘキサン（１７５．６ｍｇ、８．１２×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタン（１５．４ｍｌ）、ミリＱ（３８８３μｌ）および１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（８１１．５μｌ、８．１２×１０−４ｍｏｌ）に溶解した。その混合物を２０分間０℃（氷浴）で攪拌した。
【０１９３】
ジクロロメタン（２９４０．４０μｌ）中の塩化クロロアセチル（６４．５μｌ、８．１０×１０−４ｍｏｌ）を添加した。その混合物を３０分間０℃で攪拌した。
【０１９４】
その後、有機層を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で乾燥した。白色個体が得られた。（収量：１６１．４ｍｇ、６７．９％）。
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．３５ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．４４ （ｓ、９Ｈ、ｔＢｕプロトン）、１．５３ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、３．１０ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、３．２６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨ２）、４．０４ （ｓ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)）、４．５２ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨＢｏｃ）、６．６１ （ブロードｓ、２Ｈ、ＣｌＣＨ２ＮＨＣ(Ｏ)）ｐｐｍ。
【０１９５】
２の作製−エチレンジアミンとの反応：
エチレンジアミン（１４７．４ｍｇ、２．４５２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍｌ）中に溶解した。１（１６１．４ｍｇ、５．５１×１０−４ｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍｌ）中に溶解した。その溶液を７５℃でエチレンジアミン溶液に、５秒あたり約１滴の速度で滴加した。添加の完了後、その混合物を７５℃で一夜加熱した。
【０１９６】
その後、固体をろ過した。ろ液を乾固した。不溶性の物質をジクロロメタン（３×３ｍｌ）中に抽出した。有機抽出物を水性残さから分離し、減圧下で乾燥し、無色の油を得た。（収量：４１．３ｍｇ、２３．７％）。
２の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．０９ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．３５ （ｓ、９Ｈ、ｔＢｕプロトン）、１．３９ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、２．６２ （ｔ、２Ｈ、Ｊ＝ ７．１４Ｈｚ、ＮＨ２ＣＨ２）、２．９１ （ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４１Ｈｚ、Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨ２）、３．０１ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、３．１４ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨ、ＮＨＣＨ２Ｃ(Ｏ)）、３．２６ （ｔ、Ｊ＝５．３６Ｈｚ、２Ｈ、ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、３．４０ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)）、４．７９ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨＢｏｃ）、７．１４ （ブロードｓ、１Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)ＮＨ）ｐｐｍ。
【０１９７】
３の作製−水素化アルミニウムリチウムでの還元：
２（４１．３ｍｇ、１．６１×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）中に溶解した。その溶液を２０分間氷浴（０℃）中で攪拌した。その後、水素化アルミニウムリチウム（ジエチルエーテル中の１Ｍ 溶液 １ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を添加した。白色個体が沈殿するのが直ちに観察された。その混合物を３０分間０℃（氷浴）で攪拌し、その間に温度は室温と平衡になった。その後、ミリＱ １．５ｍｌを慎重に添加して、過剰の水素化リチウムアルミニウムを中和した。ミリＱの添加はより重要な量の白色固体の沈殿をもたらした。その後、混合物をろ過した。有機抽出物を水性抽出物から分離し、減圧下で乾燥し、無色の油を得た。（収量：３３．８ｍｇ、６９．４％）。
【０１９８】
３の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．２９ （ｍ、８Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．４１ （ｍ、９Ｈ、ｔＢｕプロトン）、１．８０ （ブロードｓ、４Ｈ、アミンＮＨ）、２．６２ （ｍ、４Ｈ、ＮＨ２ＣＨ２およびＮＨＣＨ２(ＣＨ２)５）、３．０５ （ｍ、６Ｈ、ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ(ＣＨ２)２ＮＨ）、３．２１ （ｍ、２Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。
【０１９９】
４の作製−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
３（３３．８ｍｇ、１．１２×１０−４ｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１７．１ｍｌ）中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム（４６．１ｍｇ、１．１１×１０−４ｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で週末をまたいで加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド溶液が薄い茶色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。固体をミリＱ（２０ｍｌ）で洗浄した。再度、茶色の固体をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１７．１ｍｌ）中に溶解し、その溶液を４０℃で一夜加熱した。その後、溶媒を減圧下で除去した。最後に、茶色の固体をメタノール ４７．２ｍｌ中に溶解し、その溶液を６０℃で週末をまたいで加熱した。（収量：３４．３ｍｇ、５９．８％）。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＣＤ３ＯＤ)：δＰｔ -２５２３ｐｐｍ。
【０２００】
５の作製および６のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステルとの反応：
４（３４．３ｍｇ、６．６９×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（９８０．８８μｌ）と混合した。その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いてｐＨを約８．０に調整した。その混合物を１時間室温で静置した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。
【０２０１】
Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（４２２μｌ）中のＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステル（２１．１ｍｇ、ｍｏｌ）を滴加した。ｐＨが８．０前後であると確認した。トリエチルアミンをこのｐＨ調整のために添加してもよい。その混合物を５分間遮光下にて室温で攪拌した後、ｐＨが８．０前後であることを確認した。ここでも、トリエチルアミンをｐＨ調整のために使用してもよい。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。（収量：１５ｍｇ、２７．８％）。
【０２０２】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＣＤ３ＯＤ)：δＰｔ -２６３０ｐｐｍ。
標識化合物としてのＮ３ シス-Ｂｉｏ ＵＬＳ (５)の使用
６つのたんぱく混合物（前記参照） ２５μｇを、標識バッファ ５０μｌ中で１６時間３７℃にて標識した。５の量は、それぞれ５、１０、１２．５、１５または２０μｇであった。標識反応を還元サンプルバッファの添加によって停止した。検出抗体：BIO-AP １：１０００。
標識の結果を図１４に示す。
【０２０３】
７の合成−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
６ｃ（５．８ｍｇ、８．６×１０−６ｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１１．２ｍｌ）中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム（３．６ｍｇ、８．８×１０−６ｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で一夜加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド溶液がオレンジ色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。（収量：１２．４ｍｇ、３７．４％）
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＨ １．２７ （ｍ、４Ｈ、脂肪族ＣＨ２）、１．５７ （ｍ、８Ｈ、脂肪族ＣＨ２）、１．８８ （ｍ、４Ｈ、脂肪族ＣＨ２）、２．１１ （ｍ、４Ｈ、Ｃ(Ｏ)ＣＨ２）、３．１１ （ｍ、４Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ(Ｏ)）、４．２９ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ）、４．６１ （ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２）、７．５０ （ｍ、２Ｈ、芳香族Ｈ）、７．８０ （ｍ、２Ｈ、芳香族Ｈ）、８．６９ （ｍ、 ４Ｈ、芳香族Ｈ）ｐｐｍ。１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -２７０７ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ８６７ [Ｍ]+。
図１５はスキーム７の合成−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成−を示す。
【０２０４】
ＩＸ．Ｎ３トランス-Ｃ２三座配位子の合成（スキーム７）
１の作製−クロロアセトニトリルの付加：
Ｎ-Ｂｏｃ-１,６-ジアミノヘキサン（６７．９８ｍｇ、３．１４２×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタンの最小量（１ｍｌ）中に溶解した。その後、アセトニトリルを添加した（２５ｍｌ）。炭酸カリウム（２２４．１ｍｇ、１．６２１ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（１２２．３ｍｇ、７．３６７×１０−４ｍｏｌ）も、固体の状態で添加した。その後、クロロアセトニトリル（１．０ｍｌ、１６ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を７５℃で一夜加熱した。加熱中溶液が黒色に変わるのが観察された。その後、固体をろ過した。ろ液を乾固した。不溶性の物質をジクロロメタン（３×３ｍｌ）中に抽出した。有機抽出物を混合し、ろ過し、減圧下で乾燥した。オレンジ色の固体が単離された。
【０２０５】
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＭｅＯＤ)：δＨ １．２２ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．３６ （ｍ、１３Ｈ、ｔＢｕプロトンおよびヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、２．６３ （ｍ、２Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨＢｏｃ）、２．９９ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、３．７６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＮ）、６．４９ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。 ２の作製−水素化アルミニウムリチウムでの還元：
１（１５１．０ｍｇ、５．１２９×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍｌ）中に溶解した。その溶液を２０分間氷浴（０℃）中で攪拌した。その後、水素化アルミニウムリチウム（ジエチルエーテル中の１Ｍ 溶液 ５ｍｌ、５ｍｍｏｌ）を添加した。白色個体が沈殿するのが直ちに観察された。その混合物を３０分間０℃（氷浴）で攪拌し、その間に温度は室温と平衡になった。その後、ミリＱ ７．５ｍｌを慎重に添加して、過剰の水素化リチウムアルミニウムを中和した。ミリＱの添加はより重要な量の白色固体の沈殿をもたらした。その後、混合物をろ過した。有機抽出物を水性抽出物から分離し、減圧下で乾燥し、無色の油を得た。（収量：２３．５ｍｇ、１５．１％）。
【０２０６】
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．２２ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．４１ （ｍ、１３Ｈ、ｔＢｕプロトンおよびヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、１．８２ （ブロードシングレット、４Ｈ、ＮＨ２）、２．２９ （ｍ、８Ｈ、(ＣＨ２)２ＮＨ２）、２．６８ （ｍ、２Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨＢｏｃ）、３．０６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、４．６１ （ｍ、２Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ３０３ [Ｍ＋Ｈ]+。
【０２０７】
３の作製−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
２（２３．５ｍｇ、７．７７×１０−５ｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１２．５ｍｌ）中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム（３２．４ｍｇ、７．８０×１０−５ｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で一夜加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド溶液が薄い茶色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -２５８６ｐｐｍ。（収量：２７ｍｇ、６１．１％）。
【０２０８】
４の作製および５のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステルとの反応：
３（１３．５ｍｇ、４．１３×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（６７０．０３μｌ）と混合した。その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いてｐＨを約８．０に調整した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して、茶色の残さを可溶化することもできる。Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（ｍｌ）中のＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステル（１８．７６ｍｇ、４．１３×１０−５ｍｏｌ）を滴加した。ｐＨが８．０前後であると確認した。トリエチルアミンをこのｐＨ調整のために添加してもよい。その混合物を５分間遮光下にて室温で攪拌した後、ｐＨが８．０前後であることを確認した。ここでも、トリエチルアミンをｐＨ調整のために使用してもよい。その後、混合物を遮光下加熱中に室温で一夜攪拌した。その後、不溶性物質をろ過した。
【０２０９】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -２７０７ｐｐｍ。 ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ７７２ [Ｍ]+。
【０２１０】
Ｘ．ＮＳ２トランス-Ｃ２三配位子の合成（スキーム８）
１の作製−２-クロロエチルメチルエーテルの付加：
Ｎ-Ｂｏｃ-１,６-ジアミノヘキサン（１０１．３ｍｇ、４．６８８×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタンの最小量（１ｍｌ）中に溶解した。その後、アセトニトリルを添加した（３０ｍｌ）。炭酸カリウム（３２７．１ｍｇ、２．３６７ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（１５７．１ｍｇ、９．４６３×１０−４ｍｏｌ）も、固体の状態で添加した。その後、２-クロロエチルメチルエーテル（９３．３μｌ、９．３５×１０−４ｍｏｌ）を添加した。その混合物を７５℃で一夜加熱した。その後、固体をろ過した。ろ液を乾燥した。残さをジクロロメタン（３×３ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を混合し、ろ過し、減圧下で乾燥し、白色個体を得た。（収量：１９．２ｍｇ、１１．２％）。
【０２１１】
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．２７ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２)、１．４０ （ｍ、９Ｈ、ｔＢｕプロトン）、１．４４ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、２．１０ （ｓ、６Ｈ、ＣＨ３）、２．５４ （ｍ、６Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨＢｏｃおよびＮＣＨ２ＣＨ２Ｓ）、２．７６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、３．２１ （ｍ、２Ｈ、ＮＨＢｏｃ）、４．５４ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。
ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ３６５ [Ｍ+Ｈ]+。
【０２１２】
２の作製−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
１（１９．２ｍｇ、５．２６×１０−５ｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１１．２ｍｌ）中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム（２１．７ｍｇ、５．２３×１０−５ｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で一夜加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド溶液がオレンジ色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。（収量：１２．４ｍｇ、３７．４％）。
【０２１３】
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -３５４３ｐｐｍ。
３の作製および４のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステルとの反応：
２（１２．４ｍｇ、１．９７×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（１３３６．３９μｌ）と混合した。その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ；２４０μｌ）および塩酸（２００ｍＭ；１０μｌ）を用いてｐＨを約８．０に調整した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して茶色の残さを可溶化することもできる。
【０２１４】
Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１５９．８６μｌ）中のＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステル（７．９９３ｍｇ、１．７６×１０−５ｍｏｌ）を滴加した。ｐＨが８．０前後であると確認した。トリエチルアミンをこのｐＨ調整のために添加してもよい。その混合物を５分間遮光下にて室温で攪拌した後、ｐＨが８．０前後であることを確認した。ここでも、トリエチルアミンをｐＨ調整のために使用してもよい。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。その後、不溶性物質をろ過した。ＨＰＬＣを用いて精製を実行した。ターゲット種が画分１０に溶出するのがわかった（５７．９４〜６２．９４ｍｌ）。
【０２１５】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
【０２１６】
１の１Ｈ ＮＭＲ (Ｄ２Ｏ)：δＨ １．６２ （ｍ、１２Ｈ、ＬＣ-ビオチンスペーサ由来）、１．７７ （ｍ、８Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、２．９４ （ｍ、４Ｈ、Ｃ(Ｏ)ＣＨ２）、３．０５ （ｓ、６Ｈ、ＣＨ３）、３．３０ （ｍ、 ６Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨおよびＮＣＨ２ＣＨ２Ｓ）、３．５４ （ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２ＣＨ２Ｓ）、３．８６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)ＮＨ）、４．０ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ）ｐｐｍ。
【０２１７】
ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ７８２ [Ｍ+−Ｃｌ-＋ＯＨ-]+。
分取用ＨＰＬＣ分析法の詳細：
分析用ＨＰＬＣ分析は、容積が８８．２４７ｍｌ（２５０×２１．２μｌ）の逆相Luna3 C18カラムで、ＮａＣｌ （１００ｍＭ； バッファＡ中で９０％およびバッファＢ中で７０％）／２-プロパノール （バッファＡ中で１０％およびバッファＢ中で９０％）によって実行した。総計で（およそ）８０３．０ｍｌを５．０ｍｌ／ｍｉｎ．の速度でカラムを通して溶出した。この方法では、３０％濃度に達する９４．２５〜１８２．４９ｍｌ（１．０ カラム容積）のＢ、８０％濃度に達する１８２．４９〜４０３．２１ｍｌ（２．５ カラム容積）のＢ、１００％濃度に達する４０３．２１〜４４７．３３ｍｌ（０．５ カラム容積）のＢ、および、再度、溶出する５７９．９１〜６２４．０３ｍｌ（０．５ カラム容積）の純粋なＡ、の直線勾配を組み込んだ。４４７．３３〜５７９．８１ｍｌで、純粋なＢが溶出された。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】全ヒトＤＮＡ（５００〜１５００ｂｐ）のＢｉｏ-Ｂｏｃ-ＰｔまたはＢｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕによる標識を示す図である。
【図２】全ヒトＤＮＡ（５００〜１５００ｂｐ）のＤＮＰ-ＢＯＣ-ＰｔまたはＤＮＰ-ＡＰＥＴ-ＵＬＳによる標識を示す図である。
【図３】Ｃｙ５-標識試薬で標識された全血清のＩｇＡキャプチャＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図４】Ｐｔ [ジエン Ｃｌ−] Ｃｌ−のＥＳＩ-ＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】３への経路（スキーム１）を示す図である。
【図６】３から標識Ｐｔ（II）錯体への経路（スキーム２）を示す図である。
【図７】８への経路（スキーム３）を示す図である。
【図８】８から標識Ｐｔ（II）錯体への経路（スキーム４）を示す図である。
【図９】Ｎ３ トランス-Ｃ３三座配位子の合成経路（スキーム５）を示す図である。
【図１０】Ｎ３ トランス-Ｂｉｏ ＵＬＳで標識されたHELA細胞溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図１１】Ｎ３ トランス-Ｆｌｕ ＵＬＳ（４ｂ）で標識された６つのたんぱく混合物のウェスタンブロットを示す図である。
【図１２】Ｎ３ トランス-Ｆｌｕ ＵＬＳ（４ｂ）で標識された１．ｑ１２ ＤＮＡプローブとハイブリダイズされたヒト中期分裂を示す図である。
【図１３】Ｎ３ シス-Ｃ２三座配位子の合成経路（スキーム６）を示す図である。
【図１４】Ｎ３ シス-Ｂｉｏ-ＵＬＳ（５）で標識された６つのたんぱく混合物のウェスタンブロットを示す図である。
【図１５】７の合成経路を示す図である。
【図１６】Ｎ３ トランス-Ｃ２三座配位子の合成経路（スキーム７）を示す図である。
【図１７】ＮＳ２ トランス-Ｃ２三座配位子の合成経路（スキーム８）を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、標識遷移金属錯体、そのような錯体を含む標識された化学的または生物学的物質、およびその標識された化学的または生物学的物質を作製する方法に関し、そのような遷移金属錯体の具体的使用にも関する。
【０００２】
ＤＮＡ分子などの生物有機分子の標識は、組換えＤＮＡ技術などの分野における用途に所望される。しかし、多くの場合、当業者は核酸高分子を標識するのではなく、特定のヌクレオチドを標識することを所望する。ヌクレオチドを標識する主な目的は、これらの標識ヌクレオチドが核酸分子に組み込まれ得ることである。このようにすると、生じるポリ核酸上での標識の位置を変化させることが可能であるが、標識を高分子に付着させるときには、そのようなことはできない。
【０００３】
ヌクレオチドを、充分な方法でシス白金錯体を利用して標識に結合することが可能であることが知られている。しかし、そのような標識ヌクレオチドは、仮に組込まれるとしても、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ分子に満足には組込まれない。
【０００４】
ポリ核酸に組み込むことが可能なヌクレオチドを標識する利用可能な別の方法は、より標準的な標識方法である。しかし、これらの方法もまた、あらゆるヌクレオチドの標識にも適しているわけではないので、重大な不利を有している。場合によっては、たとえば、少数の特定のヌクレオチド残基だけが特定のポリ核酸に存在するとき、またはポリ核酸の末端ヌクレオチド残基が標識されなければならないとき、あらゆるヌクレオチドを標識可能であることが所望される。そのような標準的方法の例が、Daleらによって、Biochemistry、第１４巻、１９７５年、２４４７〜２４５７頁に記載されており、この方法は標識技術として直接共有結合水銀化を含む。Daleらは、シトシンおよびウラシルが穏和な条件下でそれらのＣ５-位置にて水銀化されることを報告している。しかし、Daleらはまた、アデニン、チミンおよびグアニン塩基について、ネガティブな結果が得られたと報告している。
【０００５】
ゆえに、標識とすべての異なるヌクレオチドを含む生物有機分子とを結合するのに優れた普遍的標識システムであって、効果的にポリ核酸に、その標識システムによって標識されたあらゆるヌクレオチドを酵素的に組込むことを可能にする普遍的標識システムが必要である。
【０００６】
驚いたことに、本発明者らは、少なくとも公知の方法と同じくらいに効果的な、化学的または生物学的物質に標識可能な遷移金属錯体の新規カテゴリを開発した。さらに、本発明の標識システムに結合したヌクレオチドは、非常に効果的にポリヌクレオチドに組込むことが可能であると考えられる。
【０００７】
これらの標識遷移金属錯体は、安定化架橋としての不活性三座配位子部分、マーカ、および化学的または生物学的物質が遷移金属原子に付着することを可能とするための反応性部分を含む。
【０００８】
したがって、本発明は、遷移金属原子、化学的または生物学的物質が遷移金属原子に付着することを可能とするための反応性部分、安定化架橋としての不活性三座配位子部分、およびマーカを含む標識遷移金属錯体に関する。
【０００９】
これらの遷移金属錯体は、二座配位子部分に基づく錯体よりも高収量で作製可能であるが、それらの錯体はさらに、向上した安定性および純度を示す。しかも、本発明の金属錯体は、二座配位子部分に基づく遷移金属錯体と比較して、よりよく反応し、より効率的な標識をもたらす。さらに、本発明に従う遷移金属錯体の作製は１段階の手順で実行可能であるるため、非常に有利である。
【００１０】
三座配位子を使用する利点に、キレート効果およびトランス効果がある。キレート効果とは、金属が同一分子の３つの部位に結合することによって、遷移金属原子が配位子により迅速かつ効率的に配位するということである。結果として、得られる錯体の純度はより高くなる。トランス効果とは、脱離基が三座配位子部分の結合部位のトランス位置に存在して、配位に極性を与えることによって、本発明に従う遷移金属錯体の反応性および標識効率が向上するということである。好ましくは、結合部位は二級または三級アミンであり、これによって上記の極性に寄与する。
【００１１】
接近可能なＳ（硫黄）原子またはＮ（窒素）原子を含有するほぼすべての化学的または生物学的物質が、本発明に従う標識遷移金属錯体によって標識可能である。標識遷移金属錯体によって標識されるのに適した物質は、核酸（ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、または多重鎖）などの生物有機分子である。
遷移金属錯体はグアニン残基のＮ-７位置に非常に容易に（非共有結合で）結合する。この方法によって、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が、一本鎖でもそれ以外でも容易に同定され得（たとえば、検出され、分離され、精製され、単離される）、さらに、非標識ＤＮＡ／ＲＮＡ分子が標識プローブにハイブリダイズする、ハイブリダイゼーション技術用のプローブ生産をも可能にする。標識遷移金属錯体は、仮に妨害するとしても、ハイブリダイゼーションをほとんど妨害しない。また、この技術は、プローブの作製において、修飾されたヌクレオチドの使用を必要としない。ただし、たんぱく、ペプチドおよびその他の生物有機分子もまた、本発明に従う標識物質によって同定可能である。
【００１２】
本発明に従う標識遷移金属錯体は、生物有機分子を、ニトロセルロース、ナイロンフィルタ、マイクロタイタープレート、ビーズ、ガラス、繊維などの固体表面に付着させるのにも非常に適している。
【００１３】
本発明に従う遷移金属錯体を用いて修飾されたヌクレオチド、ならびにそのヌクレオチドが組み込まれているオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、またはこれらの新規白金化合物を用いて直接修飾されているオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、生物医学研究、臨床診断および組換えＤＮＡ技術においてプローブとして使用可能である。
【００１４】
本発明に従う錯体の多種多様な有用性は、たとえば（ポリ）核酸または（ポリ）ペプチドおよびそれらの誘導体といった生物有機分子と安定した錯体を形成することのできる遷移金属錯体の能力に基づいており、それは言い換えると、生物有機分子に付着する検出可能部分、または生物有機分子と相互作用する検出可能部分のいずれかを利用して検出可能である、ということである。いくつかの使用には、たとえば細菌およびウイルスといった病原体を含む核酸を検出して同定し、細菌を抗生物質抵抗性に関してスクリーニングし、動物を薬剤効果に関する遺伝性疾患についてスクリーニングし、たとえば２１トリソミー、鎌状赤血球貧血といった遺伝性疾患、染色体核型を診断し、癌細胞を同定することが含まれる。さらに、標識錯体は薬理学、特に薬剤スクリーニング、薬剤ターゲットの同定、薬剤モニタリングおよび薬剤送達において非常に有用である。
【００１５】
本発明は、注目する生物学的物質を同定、決定および／または局限するための診断キットをも包含し、このキットは、本発明の遷移金属錯体と、任意で、検出用の他の適当な手段とを含む。もちろん、本発明は、標識遷移金属錯体の各要素が別々に、つまり非結合の形で存在しているキットをも含む。
【００１６】
本発明に従う適当な遷移金属錯体の例は、遷移金属がバナジウム、クロム、鉄、ニッケル、銅、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、コバルト、マンガン、オスミウム、ロジウム、イリジウム、亜鉛、およびカドミウムから成る群から選ばれる錯体である。好ましくは、本発明に従えば、遷移金属が鉄、ニッケル、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、およびコバルトから成る群から選ばれる。より好ましくは、遷移金属が白金、コバルト、またはルテニウムである。
【００１７】
遷移金属錯体の反応性部分は、好適には優れた脱離配位子である。好ましくは、反応性部分がＣｌ−、ＮＯ３−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ３２−、ＺＳＯ３−、Ｉ−、Ｂｒ−、Ｆ−、酢酸イオン、カルボン酸イオン、リン酸イオン、硝酸エチルイオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、ホスホン酸イオン、ＺＯ−、および水の群から選ばれる。ここで、Ｚは水素部分または１〜１０の炭素原子を有するアルキルまたはアリール基として定義される。これらの配位子のうち、Ｃｌ−およびＮＯ３−が最も好ましい。
【００１８】
本発明に従う標識遷移金属錯体は、安定化架橋としての不活性三座配位子を含む。ここで使用される不活性とは、配位子部分が標識処理中、遷移金属錯体に付着したままであり、その後物質と化学反応することがないということを表している。
【００１９】
遷移金属は、三座配位子部分に存在する窒素、酸素、硫黄もしくはリン原子、またはこれらの原子のあらゆる組合せを利用して三座配位子部分に付着する。たとえば、遷移金属は２つの窒素原子および１つの酸素原子または硫黄原子を利用して三座配位子部分に付着させることが可能である。しかし、遷移金属が３つの窒素原子を利用して三座配位子部分に付着するのが好ましい。
【００２０】
本発明においては、化学元素の硬度は酸化状態と原子の半径との比として定義される。この定義に基づくと、硬度は周期表の行においては左から右へ増加し、周期表の列においては上から下へ減少する。生じた錯体の安定性に有益な効果を及ぼすため、遷移金属は、その遷移金属の硬度と類似した硬度の原子（窒素、酸素、硫黄、またはリン）を介して遷移金属に結合する三座配位子と結合することが好ましい。この考え方に基づくと、白金は窒素または硫黄を介して三座配位子に結合するのが好ましい。
【００２１】
遷移金属の酸化状態は、特定の三座配位子部分との安定した結合が達成されるように選ばれるのがさらに好ましい。たとえば、酸素を介して遷移金属に結合する三座配位子部分は、Ｐｔ（II）またはＰｄ（II）よりも、Ｐｔ（IV）、Ｐｄ（IV）、Ｍｏ（VI）、Ｗ（VI）、Ｒｕ（III）、Ｃｏ（III）、Ｆｅ（II）、およびＦｅ（III）と結合するのが好ましい。窒素を介して遷移金属に結合する三座配位子部分は、遷移金属の特定の酸化状態を特に好むとは考えられないが、Ｃｕ（Ｉ）はあまり好ましくない。リンまたは硫黄を介して遷移金属に結合する三座配位子部分は、Ｐｔ（IV）、Ｆｅ（III）、またはＲｕ（III）よりも、Ｐｔ（II）、Ｐｄ（II）、Ｆｅ（II）、およびＣｏ（II）と結合するのが好ましい。
【００２２】
一般に、本発明に従って使用することが可能な適当な三座配位子部分は、Ｎ、Ｐ、ＳおよびＯから独立して選ばれ、１〜５の、好ましくは１〜３の原子によって分離された少なくとも３つのドナー原子を有する配位子部分を含有する。
【００２３】
本発明に従って使用することが可能な好ましい三座配位子部分は、以下の化学式を有する配位子部分を含有し、この化学式は、Ｘ、ＹおよびＺの種々の可能な組み合わせによって、各々がＸ、ＹおよびＺの特異的組合せを有する種々の実施形態を生み出し、この個々の実施形態をここでは「ブロック」とよぶ。
【００２４】
【化１】
【００２５】
ブロックＩ
ＸはＮＲ、ＰＲ、ＯまたはＳである；ＲはＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してＸに結合する；ＹおよびＺは、(ＣＨ２)ｎＮＲ１Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＰＲ１Ｒ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＮＲ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＰＲ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｐ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｐ＝Ｒ２、Ｒ６ＯＲ５、Ｒ６ＳＲ２、Ｒ７ＣＯＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＳ−Ｎａ+またはＲ８-Ｒ９から成る群から独立して選ばれ、ｎは１〜５、優先的には１〜３であり、Ｒ１はＨ、Ｃ(Ｏ)Ｒ３、Ｃ(Ｓ)Ｒ３、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈ、Ｃ、または鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ１はＸに結合しない。Ｒ２はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈまたは鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に、またはＣ(Ｏ)、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｒ２のＣに、ならびにＲ５がＣ(Ｏ)Ｒ２およびＣ(Ｓ)Ｒ２であるとき、Ｒ５のＣ(Ｏ)Ｒ２およびＣ(Ｓ)Ｒ２のＣに、Ｃ(Ｏ)またはＣ(Ｓ)のあらゆる原子の一部をも介さずに、鎖もしくは環の原子、またはＲ２の鎖の置換基もしくは環の置換基のヘテロ原子を介して結合する。Ｒ２はＸに結合しない。Ｒ３はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈまたは鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ１がＣ(Ｏ)Ｒ３およびＣ(Ｓ)Ｒ３の１つであるとき、Ｃ(Ｏ)またはＣ(Ｓ)のあらゆる原子の一部をも介さずに、鎖もしくは環の原子、または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＲ１に結合し、Ｒ３はＸに結合しない。Ｒ４はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈまたは鎖もしくは環の原子または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＣ原子に結合する。Ｒ４はＸに結合しない。Ｒ５はＨ、Ｃ(Ｏ)Ｒ２、Ｃ(Ｓ)Ｒ２、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈ、Ｃ、または鎖もしくは環の原子を介してＯ原子に結合する。Ｒ５はＸに結合しない。Ｒ６は置換または非置換の脂肪族鎖であり、ＸとＲ６ＯＲ７のＯとの間、およびＸとＲ６ＳＲ２のＳとの間の炭素原子数は１〜５の間で変化し、優先的には２または３である。Ｒ６はＣＨ２基を介してＸに結合する。Ｒ７は、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、ＸとＣＯＯ−またはＲ７ＣＯＯ−Ｎａ+のＯ原子との間、ＸとＲ７ＣＯＳ−Ｎａ+のＣＯＳ−のＳ原子との間、ＸとＲ７ＣＳＳ−Ｎａ+のＣＳＳ−のＳ原子の１つとの間の炭素原子数は、１〜５の間で変化し、優先的には２または３である。Ｒ７はＸに結合しない。Ｒ８は置換または非置換の脂肪族環であって、Ｘと、Ｒ８をＲ９に結合する原子との間の炭素原子数は、１〜５の間で変化し、優先的には２または３である。Ｒ９は、置換または非置換の、５または６員環の、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳ含有の、ジエンまたは非ジエンの、芳香族または非芳香族の、５員環または６員環の、置換または非置換の環であって、Ｘと環の配位原子との間の原子数は、２〜１０の間で変化し、優先的には２または３である。Ｒ９はＸに結合しない。
【００２６】
ブロックＩＩ
ＹとＺとが同じで、Ｘ、ＹおよびＺが、独立して、置換または非置換の、５員環または６員環の、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳ含有の、ジエンまたは非ジエン含有の、芳香族または非芳香族の環であって、Ｘの配位原子とＹおよびＺ双方との間の原子数が、１〜５、好ましくは２または３である。
【００２７】
ブロックＩＩＩ
ＸはＮＲ、ＰＲ、ＯまたはＳである；ＲはＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してＸに結合する；Ｚは、Ｈ、(ＣＨ２)ｎＮＲ１Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＰＲ１Ｒ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＮＲ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＰＲ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｐ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｐ＝Ｒ２、Ｒ６ＯＲ５、Ｒ６ＳＲ２、Ｒ７ＣＯＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＳ−Ｎａ+、および前述中で定義された（ブロックＩ）Ｒ８-Ｒ９から成る群から選ばれ；ＹはＡ２Ｎ(Ｃ２Ｈ４)ＮＡ(Ｃ２Ｈ４)、Ａ２Ｎ(Ｃ２Ｈ４)ＮＡ(Ｃ２Ｈ４)、Ａ２Ｐ(Ｃ２Ｈ４)ＮＡ(Ｃ２Ｈ４)、Ａ２Ｎ(Ｃ２Ｈ４)ＰＡ(Ｃ２Ｈ４)またはＡ２Ｐ(Ｃ２Ｈ４)ＰＡ(Ｃ２Ｈ４)であり、ＡはＺと同じ意味を有する。
【００２８】
ブロックＩＶ
ＸはＮＲ、ＰＲ、ＯまたはＳである；ＲはＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してＸに結合する；Ｚは、Ｈ、(ＣＨ2)nＮＲ1Ｒ2、(ＣＨ2)nＰＲ1Ｒ2、Ｒ3Ｒ4Ｃ＝ＮＲ2、Ｒ3Ｒ4Ｃ＝ＰＲ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)ＮＲ2Ｒ3、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)ＰＲ2Ｒ3、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)Ｎ＝Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)Ｐ＝Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)ＯＲ5、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)ＮＲ2Ｒ3、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)ＰＲ2Ｒ3、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)ＯＲ5、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)Ｎ＝Ｒ2、(ＣＨ2)nＣ(Ｓ)Ｐ＝Ｒ2、Ｒ6ＯＲ5、Ｒ6ＳＲ2、Ｒ7ＣＯＯ-Ｎａ+、Ｒ7ＣＳＯ-Ｎａ+、Ｒ7ＣＳＳ-Ｎａ+、および前述中で定義された（ブロックＩ）Ｒ8-Ｒ9から成る群から選ばれ；ＹはＲ2Ｒ3ＮＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ2Ｒ3ＰＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ5ＯＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ1、Ｒ1Ｒ2ＮＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＰＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ5ＯＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＮＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｓ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＰＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｓ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ5ＯＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｓ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ2Ｒ3ＮＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ2Ｒ3ＰＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ5ＯＣ(Ｏ)ＣＨ2Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ1、Ｒ1Ｒ2ＮＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ1Ｒ2ＰＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ5ＯＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ2、Ｒ2ＳＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ1Ｒ2ＮＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＰＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ5ＯＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｏ（Ｃ2Ｈ4）、Ｒ2ＳＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｏ(Ｃ2Ｈ4)、Ｒ1Ｒ2ＮＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ1Ｒ2ＰＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ5ＯＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ2、Ｒ2ＳＣＨ2Ｃ(Ｏ)Ｐ(Ｃ2Ｈ4)Ｒ10、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)n、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)n、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)n、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＯ(ＣＨ2)n、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)n、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)n、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)n、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＳ(ＣＨ2)n、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)n(ＮＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＮ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)n(ＰＲ3)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ2Ｓ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ1、Ｒ1Ｒ2Ｎ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ３、Ｒ1Ｒ2Ｐ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ3、Ｒ5Ｏ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ1またはＲ2Ｓ(ＣＨ2)nＰ(ＣＨ2)nＲ1である。
【００２９】
Ｙにおいて、Ｒ1〜Ｒ5のすべては、Ｒ1およびＲ3を除いて、ブロックＩにおいてと同じ意味を有する。Ｒ1はＨ、Ｃ(Ｏ)Ｒ11、Ｃ(Ｓ)Ｒ11、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈ、Ｃ、または鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ1はＸに結合しない。Ｒ3はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈまたは鎖もしくは環の原子または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ3はＸに結合しない。Ｒ10はＨ、Ｃ(Ｏ)Ｒ12、Ｃ(Ｓ)Ｒ12、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｈ、Ｃ、または鎖もしくは環の原子を介してＮ原子またはＰ原子に結合し、Ｒ10はＸに結合しない。Ｒ11はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｒ1がＣ(Ｏ)Ｒ11またはＣ(Ｓ)Ｒ11であるとき、Ｃ(Ｏ)またはＣ(Ｓ)のあらゆる原子をも介さずに、鎖もしくは環の原子、または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＲ1のＣに結合する。Ｒ11はＸに結合しない。Ｒ12はＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、Ｒ10がＣ(Ｏ)Ｒ12またはＣ(Ｓ)Ｒ12であるとき、Ｃ(Ｏ)またはＣ(Ｓ)のあらゆる原子をも介さずに、鎖もしくは環の原子、または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してＲ10のＣに結合する。Ｒ12はＸに結合しない。
【００３０】
ブロックＶ
ＸはＮＲ、ＰＲ、ＯまたはＳである；ＲはＨ、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換もしくは非置換の環のうちの１つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してＸに結合する；ＹおよびＺは、独立して、ＡＢＮ(ＣＨ２)ｎまたはＡＢＰ(ＣＨ２)ｎであり、ｎは２または３であり、ＡおよびＢは、(ＣＨ２)ｎＮＲ１Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＰＲ１Ｒ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＮＲ２、Ｒ３Ｒ４Ｃ＝ＰＲ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)Ｐ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＮＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＰＲ２Ｒ３、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)ＯＲ５、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｎ＝Ｒ２、(ＣＨ２)ｎＣ(Ｓ)Ｐ＝Ｒ２、Ｒ６ＯＲ５、Ｒ６ＳＲ２、Ｒ７ＣＯＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＯ−Ｎａ+、Ｒ７ＣＳＳ−Ｎａ+、またはＲ８-Ｒ９から成る群から選ばれ、前述中で定義されたように（ブロックＩ）、ｎは１〜５、優先的には２または３である。
【００３１】
ブロックＶＩ
Ｎ、Ｐ、ＯおよびＳから独立して選ばれた最小でも３つのヘテロ原子を含有するあらゆる置換大員環。大員環とは、３つ以上の原子がドナーヘテロ原子である、最小でも９つの原子を含有する環状分子として定義される。
【００３２】
ブロックＶＩＩ
Ｘは置換または非置換の、５または６員環の、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳ含有の、ジエンまたは非ジエン含有の、芳香族または非芳香族の環である。ＹまたはＺの少なくとも１つは、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳヘテロドナー原子を含有し、置換または非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、５員環もしくは６員環の、置換の環であり、環上の置換基を介してＸに結合している。ＹまたはＺの１つのみがＮおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳヘテロドナー原子を含有している場合、この基準を満たすＹとＺとの間の候補は、最小でも２つのＮおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳヘテロドナー原子を含有し、これら２つのヘテロドナー原子間の原子数、およびこれらヘテロ原子のうちＸに最も近い原子と、Ｘに含まれる最も近いヘテロドナー原子との間の原子数は、２または３である。ＹおよびＺの双方がヘテロドナー原子を含有している場合、ＹおよびＺのそれぞれが最小でも１つのＮ、Ｐ、ＯまたはＳヘテロドナー原子を含有し、Ｙのヘテロドナー原子とＸのヘテロドナー原子との間の原子数、およびＺのヘテロドナー原子とＸのヘテロドナー原子との間の原子数は２または３である。
【００３３】
さらに、本発明に従って使用することが可能な好ましい三座配位子部分は、以下の化学式を有する配位子部分を含有する:
ＹＸＺ …（II）
【００３４】
Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、置換または非置換の、５員環または６員環の、Ｎおよび／またはＰおよび／またはＯおよび／またはＳ含有の、ジエンまたは非ジエン含有の、芳香族または非芳香族の環であって、Ｘの配位原子とＹおよびＺ双方との間の原子数は１である。
【００３５】
原理上、物質のあらゆる型の窒素、酸素、リンまたは硫黄を含む反応部位でも、本発明に従う方法を用いて標識することが可能である。好ましい反応部位は、アミン、ホスホアミン、チオール、チオエーテル、硫化物、チオアミド、チオール、アミド、ホスホアミド、チオホスホアミド、イミド、イミン、ホスホイミン、アルデヒド、ケトン、エステル、無水物、チオ無水物、アルコール、エーテル、尿素、チオ尿素、ホスホ尿素、アシル尿素、アシルホスホ尿素、オキソ尿素、チオアルデヒド、チオケトン、チオエステル、チオリン酸エステル、チオ無水物、カルボン酸もしくはチオカルボン酸およびそれらの塩、またはピリジン、イミダゾール、ピラゾール、ホスホピリジン、ホスホイミダゾール、ホスホピラゾール、フラン、またはチオフェンを含む反応部位を含有する。標識可能な物質の例は、アミノ酸（好ましくはメチオニン、システイン、およびヒスチジン）、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、たんぱく、免疫グロブリン、酵素、人工酵素、ホスホアミノ酸、リン脂質、脂質（たとえばホスファチジル コリン、スフィンゴ脂質）、糖たんぱく、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸、ペプチド核酸オリゴマ、ペプチド核酸ポリマ、アミン、アミノグリコシド、ヌクレオペプチド、および糖ペプチドの群から選ばれる物質である。本発明に従って、好ましくは、物質は、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドの群から選ばれる。
【００３６】
本発明に従って、任意でスペーサによって、マーカが不活性三座配位子部分に適切に含まれるか、三座配位子部分に付着する。遷移金属の酸化状態が（II）より高い場合、マーカは遷移金属にも付着させることが可能である。
【００３７】
マーカは、不活性部分に含まれ得るか、三座配位子部分に付着するスペーサに付着し得る限り、いずれの型のマーカであっても使用することが可能である。そのようなマーカは、放射性標識；酵素；アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチン、ビオシチン、イミノビオチンなどの特異的結合ペア要素；コロイド状染料物質；リン光性発光標識（たとえばユーロピウムキレート、白金ポルフィリン）；化学発光標識（たとえばルミノー）；シアニン、Alex染料（Molecular Probes）、またはBodipy染料（Molecular Probes）、ローダミン、カルボキシローダミンなどの蛍光色素；ジニトロフェノール（ＤＮＰ）；tert-ブトキシカルボニル；たとえばキレート配位にあるまたはないユーロピウムまたはテルビウムといったランタニド；還元物質（エオシン、エリトロシンなど）；（有色の）ラテックス ゾル；ジゴキシゲニン；金属（たとえば二核または多核錯体の場合、たとえばルテニウム）；金属ゾルまたは別の粒子ゾル（セレン、炭素など）；ダンシルリジン；紫外染料；可視染料；赤外染料；クマリン（たとえばアミノメチルクマリン）；固体支持；細胞上または細胞内に生理学的効果を及ぼす、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、抗体、アミノ酸、たんぱくまたは（ポリ）ペプチド（たとえばプロテインＡ、プロテインＧ、膜シャトル分子）など、である。特殊分類のマーカは遷移金属それ自身である。そのような遷移金属マーカは、前述の他の型のマーカと共に存在するか否かに関わらず、他の遷移金属マーカなしに存在し得（単核）、または、ホモもしくはヘテロの配位の双方において、他の遷移金属マーカと共に存在し得る（二核または多核）。そのような標識錯体は、たとえばバイオセンサといった電気化学的検出手段において特に有用である。
【００３８】
とりわけ、ＤＮＰ、フルオレセイン、シアニン染料およびテトラメチルローダミンが特に好ましい。なぜなら、これらは物質に結合した白金と安定した錯体を形成することが可能だからである。他の好ましいマーカは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびジゴキシゲニンを含む。
【００３９】
本発明の１つの実施形態において、マーカはスペーサによって不活性三座配位子部分に連結する。好ましくは、そのようなスペーサは、少なくとも４原子、好ましくは最高で２０原子を有する鎖であって、一端に電子供与部分を含み、マーカと反応する部分を含む鎖を含み、鎖は電子供与部分を介して三座配位子部分に付着する。スペーサが三座配位子部分と反応する前に、最初にスペーサをマーカに付着させることが可能である。スペーサの電子供与部分は、たとえば、アミン基またはチオラートアニオンである。鎖が少なくとも１つのヘテロ原子をさらに有することが好ましい。非常に好ましいスペーサは、ポリエチレングリコール、１,６-ジアミノヘキサンおよび１,８-ジアミノ-３,６-ジオキサオクタンである。本発明の好ましい実施形態において、マーカに付着する前の、中間体遷移金属-スペーサ錯体として、１,６-ジアミノヘキサンtert-ブトキシカルボニルが使用される。好ましい実施形態において、スペーサは、たとえば別の同位体と原子を置換することで、分子量の点で異なる。
【００４０】
本発明の特に好ましい錯体は、添付の実施例において記載される三座配位子部分含有遷移金属錯体である。たとえば図６、化合物ｎｏ．５および図９、化合物ｎｏ．４などに示されるようなＮ３ トランス-Ｃ３三座配位子錯体；たとえば図８、化合物ｎｏ．１０および図１３、化合物ｎｏ．５などに示されるようなＮ３ シス-Ｃ２三座配位子錯体；たとえば図１６、化合物ｎｏ．４などに示されるようなＮ３ シス-Ｃ２三座配位子錯体；たとえば図１７、化合物ｎｏ．３などに示されるようなＮＳ２ トランス-Ｃ２三座配位子錯体；たとえば図１５、化合物ｎｏ．７などに示されるような架橋(ピリジン)３トランス三座配位子錯体として、その中で参照される好ましい実施形態を特に参照する。ここでの「シス」という用語は、遷移金属上の脱離基およびマーカ（任意にスペーサアームを介して結合する）の位置が隣り合うことを示し、ここでの「トランス」という用語は、遷移金属上の脱離基およびマーカ（任意にスペーサアームを介して結合する）の位置が反対側であることを示す。Ｃ２またはＣ３は、個々のティース（teeth）を架橋する炭素原子数で表した大きさを示し、Ｎ３は三座配位子ティースがすべて窒素原子であることを示し、ＮＳ２は三座配位子ティースの２つが硫黄原子で、３番目が窒素原子であることを示す。ここでの「三座配位子ティース」という用語は、三座配位子部分のうち遷移金属への配位結合に実際に加わる部分を示す。
【００４１】
本発明の錯体の特別な利点は、遷移金属錯体と化学的または生物学的物質との間で配位結合形成を可能にすることであり、それによって標識化合物としての使用への適性を大いに高められる。この標識化合物は、好ましくは、マーカ部分として、フルオレセイン；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）；ジエチルアミノメチルクマリン（ＤＥＡＣ）；カルボキシ-フルオレセイン（ＦＡＭ）；カルボキシ-テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）；カルボキシ-Ｘ-ローダミン（ＲＯＸ）；カスケードブルー（ＣＢ）；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；オレゴングリーン（ＯＧ）；Alexa４８８（Ａ４８８）；ローダミングリーン（ＲＧｒ）；カルボキシ-ローダミン ６Ｇ（Ｒ６Ｇ）；テキサスレッド（ＴｘＲ）；Ｃｙ３；Ｃｙ３．５；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；カルボキシナフトフルオレセイン（ＣＮＦ）およびBodipy（登録商標）染料などの蛍光標識、またはビオチン（ＢＩＯ）；ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）；および２,４-ジニトロフェニル（ＤＮＰ）などのハプテン標識を含む。したがって、本発明の遷移金属錯体は、全体として、標識化合物とよぶのに適している。標識化合物は核酸を標識するのに用いられるのに非常に適している。当然のことながら、たんぱく性分子などの、他の化学的または生物学的物質もまた、本発明の三座配位子錯体によって標識されるのに非常に適している。
【００４２】
さらに、本発明は少なくとも１つの異なる安定同位体を含有する標識遷移金属錯体によって標識された化学的または生物学的物質に関する。この物質はアミノ酸、ペプチドまたはたんぱくであるのが好ましい。
【００４３】
本発明の特別な側面は、生物系の機能を理解し、病状または薬物投与の効果を評価するのに重要な手段である、たんぱくの同定およびそれらの細胞間相互作用のマッピングにおける、本発明に従う標識遷移金属錯体の使用に関する。そのようにして、プロテオームの組成と、プロテオームにおける質的および量的変化とを決定することが可能である。ヒトプロテオームは、広く多様な特性を有し、９桁にまでわたる濃度レベルで自然に産する１０００００を超すたんぱくを含む。この数字はプロテオームの研究者が抱えるいくつかの難問を明らかにしている。細胞または組織で発現されるたんぱくの大規模な（究極的には国際的な）分析はプロテオーム分析（Penningtonら、１９９７年、Trends Cell Biol.、第７巻、１６８−１７３頁）またはプロテオミクスと称されている。ゲノム分析と比較して、プロテオーム分析は特有の難問を抱えている。
【００４４】
広い範囲の技術が、たんぱくを同定し、その細胞間相互作用をマップするのに利用できる。未知のたんぱくの性質を明らかにし、その機能を評価するために、連続する多数の工程が一般に含まれる（PattersonおよびAebersold、２００３年、Nat. Genet.、第３３巻、別冊、３１１−３２３頁）。
【００４５】
第１段階は、プロテオームディスプレイおよびマッピング技術によって形成される。たんぱくマップまたはフィンガープリントを得るのにもっとも広く使用される手順は、二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）である（Rabilloud、２０００年、Anal. Chem.、第７２巻（１）、４８Ａ−５５Ａ頁）。２ＤＥにおいて、たんぱくは１次元においてその等電点（ｐＩ）によって分離され、続いて第２の次元において分子量（ＭＷ）によって分離される。分離されたたんぱくは、クマシーブルー、銀染色、蛍光染色、または放射性標識（Patton、２００２年、J. Chromatogr. B, Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.、第７７１巻（１−２）、３−３１頁）などの一般的な染色を用いて視覚化することが可能である。生じたスポットの複雑なパターンは、さらなる処理のために高度な画像分析を必要とする。通常、たとえば異なる細胞分裂期を代表する２つまたは複数のたんぱくプロフィールが比較される。異なった形で発現された注目たんぱくのスポットが、後の分離分析のためにゲルから切出される。このような方法で、細胞の状態変化によるプロテオームの変化を視覚化することが可能であり、たんぱく発現の特徴的な変化を特定することが可能である。
【００４６】
続く第２段階は、たんぱく同定技術、主として質量分析（ＭＳ）によって代表される。質量分析計は基本的にイオン化モジュール、質量分析器および検出器の組合せであり、イオン化された検体（たとえばペプチドまたはたんぱく）の質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定する。検体は高速原子衝撃（ＦＡＢ）、電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）または大気圧化学イオン化（ＡＰｃＩ）のいずれかによって帯電可能である。質量分析器は質量分析計の最もフレキシブルな部分である。電場が荷電粒子を偏向させ、エネルギポテンシャルが質量およびポテンシャルに基づいて慣性移動に変換され得るので、質量分析器は、電場ポテンシャルを変えることによって、その質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づき、ある質量を検出器に向ける。分析器は、存在するイオンをリストに入れるために、ｍ／ｚの狭い範囲を安定化させるか、ｍ／ｚのある範囲にわたって走査するために使用することが可能である。様々な型式が存在し、飛行時間、イオントラップ、および四重極質量分析器を含む。検出器は単純に、イオンが表面を通り過ぎるか表面に衝突するかしたときに誘起される電荷を記録する。
【００４７】
質量分析計は非特異的な検出器であるため、別の検体をＭＳに与えるために、質量分析計をガス（ＧＣ）または液体クロマトグラフ（ＬＣ）に連結するための特異的なインターフェースがしばしば使用される。タンデム質量分析計（ＭＳ-ＭＳまたはＭＳｎ）は質量分析の複数ラウンドが可能なものである。たとえば、１つの質量分析器は、質量分析計に入った多数から１つのペプチドを分離することができる。その後、第２の質量分析器は、ガスがペプチドに衝突してフラグメントにする間、ペプチドイオンを安定化させる。その後、第３の質量分析器が、ペプチドから産生されたフラグメントをリストに入れる。衝突誘起解離とよばれるこの工程は、プロテオミクスにおける多数の実験の基礎である。現在では様々な質量分析計が利用でき、それぞれがある用途に関して特異的な利点を有している（GygiおよびAebersold、２０００年、Curr. Opin. Chem. Biol.、第４巻（５）、４８９−４９４頁； Mannら、２００１年、Ann. Rev. Biochem.、第７０巻、４３７−４７３頁）。
【００４８】
たんぱくの機能分析を評価する最終工程は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの技術に関係するものであって、たとえば既知のたんぱくおよびそのターゲットの、生体分子の相互作用に関する詳細な情報を提供することが可能である。ＳＰＲ現象は、特定の角度にて偏光が全反射される条件下で、光学インターフェースにて薄い金属膜中に生じる。その手順は、光学共鳴の微妙な変化を測定し、この膜の反対側の媒体の屈折率に感受性である。屈折率の変化は、分子が金属表面に付着している生体分子に結合するとき、または生体分子から解離するときに生じる。このように、リアルタイムの結合活性プロフィールが会合または解離の相互作用特性によって生成される（Greenら、２０００年、Biomaterials、第２１巻（１８）、１８２３−１８３５頁； RichとMyszka、２０００年、Curr. Opin. Biotechnol.、第１１巻（１）、５４−６１頁； McDonnell、２００１年、Curr. Opin. Chem. Biol.、第５巻（５）、５７２−５７７頁）。
【００４９】
一般に、技術的進歩は種々のたんぱくの検出の感度および定量化を改良することに向けられてきた。さらに、進歩は、２ＤＥを旧式のものとし得る、つまりゲルから独立した方法を提供することに向けられてきた。２ＤＥパターンの複雑さ、および低い存在量の、小さい（１０ｋＤａ未満の）または難溶性の（たとえば膜結合の）たんぱくに対する固有のバイアスが直接プロテオームにおけるたんぱくの（半）定量的測定を可能にする技術の開発を誘発してきた（Regnierら、２００２年、J. Mass Spectrom.、第３７巻（２）、１３３−１４５頁； BauerとKuster、２００３年、Eur. J. Biochem.、第２７０巻（４）、５７０−５７８頁）。
【００５０】
２ＤＥの使用を避ける非常に適した手段は、Gygiら（１９９９年）（Nat. Biotechnol.、第１７巻（１０）、９９４−９９９頁）によって開発されたＩＣＡＴ（同位体コードアフィニティータグ）手順である。この手順は、安定同位体での特異的標識に基づくＭＳによって２つの異なる広範囲のたんぱく発現プロフィールを迅速に比較することができる。第１世代ＩＣＡＴ試薬は、ｉ）たんぱくのシステイン（Ｃｙｓ）残基を標識できるチオール-特異的たんぱく反応基（ヨードアセトアミド）、ii）たんぱくの２集団の特異的標識のための８つの水素（１Ｈ）原子（ｄ０、軽同位体）または８つの重水素（２Ｈ）原子（ｄ８、重同位体）のいずれか一方を含有する２つの異なるリンカー部分、およびiii）標識ペプチドを選択的に単離できる、ほとんどがビオチンであるアフィニティタグ、から成っていた。
【００５１】
ＩＣＡＴ手順それ自身は、たんぱくの複雑な混合物中のシステイン側鎖の還元およびアルキル化を含み、これによって、ある細胞状態のたんぱくはｄ０-標識タグで標識され、第２の細胞状態（たとえば病状）のたんぱくはｄ８型タグで標識される。その後、ＭＳ分析に適したフラグメントを提供するために、２つの混合物は統合され、たんぱく分解にかけられる。ペプチドの標識サブセットを取出すために、たんぱく分解ペプチドの複雑な混合物は、アフィニティカラムクロマトグラフィによって精製される。その後、サンプルは、ｄ０およびｄ８同位体の相対存在量に基づいてたんぱくの定量的情報つまり存在量を提供するためのＬＣ-ＭＳと、ペプチド分子量およびアミノ酸配列情報に基づいて定性的情報を提供するためのＬＣ-ＭＳ-ＭＳとの組合せによって分析される。
【００５２】
重ＩＣＡＴ試薬で標識されたペプチドと軽ＩＣＡＴで標識されたペプチドとの不適切な共溶出、およびアフィニティタグで捕獲された標識ペプチドの低い回収率が、第２世代のＩＣＡＴ試薬の開発をもたらした。これらのＩＣＡＴ試薬は、ｉ）たんぱくのシステイン（Ｃｙｓ）残基を標識できるチオール-特異的たんぱく反応基（ヨードアセトアミド）、ii）たんぱくの２集団の特異的標識のための炭素原子（軽い）または炭素同位体（重い）のいずれか一方の規定数を含有するリンカー部分、iii）標識ペプチドを選択的に単離できる、ほとんどがビオチンであるアフィニティタグ、ならびにiv）ＭＳおよびＭＳ-ＭＳ分析に先立ちＩＣＡＴ試薬タグのビオチン部分を除去できる酸開裂部位、から成る。たんぱく反応基は遊離システインのアルキル化によって同位体コードアフィニティタグをたんぱくに共有結合させる。ＩＣＡＴ技術はたんぱくのシステイン残基の標識に基づいているので、システインを含有しないたんぱくはＩＣＡＴで検出されないだろう。さらに、システイン残基は御しやすいペプチド；つまり、たんぱく分解に由来するおよそ６００〜３５００Ｄａの分子量（ＭＷ）のペプチド、に存在しなければならない。このＭＷ範囲外のペプチドは、たんぱく同定のための必須の定性的情報を提供するのに充分な数のアミノ酸を含んでいないか、衝突活性化解離によるＭＳ-ＭＳフラグメント化に適していないほど大きいか、のどちらかだろう。さらに、システインに基づくＩＣＡＴタグは、修飾が偶発的にＣｙｓ含有ペプチドに生じなければ、リン酸化反応などの翻訳後の修飾に基づくプロテオームにおける変化に関する情報を生成できない。
【００５３】
化学的標識手順および代謝標識手順によってたんぱくを特異的に標識する別の種々の方法が開発されてきた（GosheとSmith、２００３年、Curr. Opin. Biotechnol.、第１４巻（１）、１０１−１０９頁）。化学的方法は、個々のペプチド、またはたんぱくのトリプシン消化物の、古典的なたんぱく修飾に基づいている。たとえば、リジン（Ｌｙｓ）残基は、４つの２Ｈ原子（ｄ４）を含有する２-メチルオキシ-１Ｈ-イミダゾールの重誘導体を用いて、Ｃ-末端にて標識することが可能である（Petersら、２００１年、Rapid Commun. Mass Spectrom.、第１５巻（２４）、２３８７−２３９２頁）。Ｌｙｓ残基はまた、mass-coded abundance tagging（ＭＣＡＴ；CagneyおよびEmili、２００２年、Nat. Biotechnol.、第２０巻（２）、１６３−１７０頁）とよばれる処理において、Ｏ-メチル-イソ尿素を用いる特異的グアニジン化によって標識することが可能である。メチオニン（Ｍｅｔ）残基は、たとえば（ｄ０／ｄ４）-ニコチン酸の活性エステルを用いて標識することが可能である（Shenら、２００３年、Molec. Cell Proteomics、第２巻、３１５−３２４頁）。Ｃｙｓ残基は、Ｎ-（ｄ０/ｄ５）-エチル-ヨードアセトアミドを用いる特異的アルキル化によって標識することが可能である。ペプチドの一級アミンは、Ｎ-アセトキシ-（ｄ０／ｄ３）-スクシンイミド誘導体を用いて特異的に標識することが可能である（ChakrabortyおよびRegnier、２００２年）。
【００５４】
しかし、一般に、前述の標識方法は、ＭＳ分析前に混合物の複雑さを軽減するために、２ＤＥ分離または−ＩＣＡＴの場合−アフィニティクロマトグラフィ精製を必要とする。ｉＴＲＡＱおよびｉＰＲＯＴは、特異的スクリーニングのために同位体ではなく標識試薬の異なる異性体を使用する同重同位の標識技術である。
【００５５】
関連する標識化学反応はまた、１つには化学試薬の不安定さおよびその所望されない交差反応性によって、安定性を欠いており、これは得られるシグナル対に不均一性をもたらす。また、平均ヒトプロテオーム範囲は、たとえばＩＣＡＴについて８５％と、比較的低い。これらの要因が、プロテオーム研究における、特に（自動化された）ハイスループット用途の場合の、特異的標識方法の利用を妨害している。
【００５６】
現在、プロテオーム研究およびルーチン（診断）試験の双方における大規模な分析を支持できる、ペプチドの特異的標識のための安定した手順の必要性がある。したがって、そのような標識手順が、特異性の高いアミノ酸ターゲット残基の標識、プロテオームの広い範囲、および安定した標識条件を示すことが所望される。また、標識は、複雑な質量スペクトルをもたらすべきではなく、つまり、多すぎないアミノ酸残基が標識されるべきである。好ましくは、選ばれたアミノ酸の標識を飽和方法で実行することが可能であり、好ましくは、重同位体標識分子が軽標識分子と同一の、たとえば同じ保持時間といったクロマトグラフ特性を有するべきで、好ましくは、重同位体標識分子が軽標識分子と同一のイオン化特性を有するべきで、理想的には、標識がたんぱくの酵素消化を妨害すべきではない。
【００５７】
さらに、特異的標識後、生成物は、重量分析にかけられる前に、アフィニティクロマトグラフィ以外の別の手段によって分離することが可能であることが所望される。現在の技術に対してさらに所望される改良は、ＭＳに先立つ精製工程の省略である。あるいは、その代わりに、標識分子と非標識分子間の分別がＭＳ-ＭＳ中になされ得るのが有利である。
【００５８】
驚いたことに、本発明に従う標識遷移金属錯体が使用される標識方法は、これらの必要性の１以上を満たすことが分かった。この方法は、質量分析のイオン化処理を乗り切る、物質と標識間との結合をもたらすのが利点である。
【００５９】
したがって、本発明に従う標識遷移金属錯体という新規カテゴリは、生物有機分子の特異的標識方法においてタグとして使用可能であることが利点である。その標識錯体は、特異的発現標識のための既存の試薬に対する改良を構成し、先行技術の試薬の種々の問題を回避する。
【００６０】
本発明はまた、化学的または生物学的物質の質量分析による区別を可能にする方法に関し、その方法は、物質を本発明に従う少なくとも１つの標識遷移金属錯体で特異的に標識する工程を含む。
【００６１】
さらに、本発明は、物質または物質を含有するサンプルの質量分析を容易にするために、化学的または生物学的物質の分子量に規定シフトを創出するための本発明に従う標識遷移金属錯体の使用に関する。
【００６２】
標識遷移金属錯体の結合に際しての化学的または生物学的物質の分子量における規定シフトの創出は、最終的には標識遷移金属錯体の物質への付着に起因する。したがって、シフトは、基本的に、標識遷移金属錯体の質量マイナス脱離基の脱離部分の質量に比例する物質の質量の変化に一致する。この質量変化は質量分析によって決定することが可能である。
【００６３】
本発明はまた、本発明に従う質量分析によって化学的または生物学的物質を区別可能にする方法に関し、物質を、少なくとも１つの標識遷移金属錯体で特異的に標識することを含み、適当な標識遷移金属錯体とは、先に記載されたものである。それぞれが独自の標識特異性を有する２つの異なる標識遷移金属錯体の使用は、１つのサンプル内の異なる物質を特異的に標識することを可能にする。
【００６４】
別の側面において、本発明は化学的または生物学的物質の質量分析方法に関し、この方法は、物質を本発明に従う少なくとも１つの標識遷移金属錯体で特異的に標識する工程、および、質量分析によって物質を分析する工程を含む。
【００６５】
本発明の方法の好ましい実施形態において、化学的または生物学的物質は異なるサンプルに由来する。
【００６６】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施形態において、物質を特異的に標識する工程は、本発明に従う少なくとも２つの標識遷移金属錯体によって実行され、この標識遷移金属錯体は分子量が異なり、この分子量差は１Ｄａである。
【００６７】
本発明の方法の好ましい実施形態において、標識遷移金属錯体は、同じ標識特性、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）における、たとえば同じ疎水性または親水性などの、同じ性質、および同じ金属酸化状態を示す。
【００６８】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施形態において、スペーサを含有する標識遷移金属錯体は、質量分析における親イオンスキャニングまたはニュートラルロススキャニングに適している。
【００６９】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施形態において、遷移金属同位体フィンガープリントは標識物質の同定手段として使用することが可能である。
【００７０】
標識遷移金属錯体間の分子量差は、遷移金属錯体またはこれに付着した配位子、スペーサ、反応性部分および／もしくはマーカのあらゆる部分における、特定の同位体、原子、原子団、分子、もしくは分子団の存在または不在による。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、標識遷移金属錯体間の分子量差は、たとえば第１の標識遷移金属錯体が軽同位体を含有し、少なくとも第２の標識遷移金属錯体が重同位体を含有するといった、錯体中の異なる安定同位体の存在による。
【００７２】
分子量に差異を生じさせる安定同位体は、標識遷移金属錯体のあらゆる部分に含有されてもよい。安定同位体は、スペーサを利用して適切に、不活性三座配位子部分に含められるか、三座配位子部分に付着される。
【００７３】
別の側面において、本発明は少なくとも２つの異なる分子量の標識遷移金属錯体のセットを提供する。
【００７４】
本発明のさらなる側面は、少なくとも２つの異なる分子量の標識遷移金属錯体のセットを含む部品のキットに関する。好ましくは、分子量の差異は遷移金属錯体間の少なくとも１つの異なる安定同位体の存在に起因する。
【００７５】
ここで使用される「化学的または生物学的物質」は、硫黄、酸素、リン、および／または窒素を含有する１つ以上の反応部位を含むものとして解釈されるべきであり、このような反応部位を含むように（たとえばセリン、トレオニン、またはチロシン残基の組み込みによって）修飾された物質を含んでいる。
【００７６】
さらに、「物質」は、微生物、ウイルスもしくはプリオンに、または、硫黄反応型、リン反応型、酸素反応型もしくは窒素反応型の１つ以上の反応部位を含む物質、もしくは、それらによって作られた、マイクロアレイ、マイクロタイタープレート、試験紙もしくは試験管などの、製品に関する。特に、物質は生物有機化合物を含む、無機または有機化合物に関する。
【００７７】
ここで使用される「生物有機分子」は、生物由来炭素含有分子を示す。また、生物有機分子は、たとえば治療効果または予防効果、免疫応答、代謝過程などを誘発する、またはそれらに影響を及ぼすことによって、生物系における作用を誘発する、または作用に影響を及ぼすことのできる化合物を示す。
【００７８】
「標識」という用語は、ここでは、標識金属錯体を物質に結合させる／付着させるプロセスを示すために使用される。
【００７９】
「特異的標識」という用語は、ここでは、反応部位間、物質間またはサンプル間にマーカの不均等な分布をもたらす標識反応を示すために使用される。特異的標識は、たとえば特異的に標識されたＰ-、Ｏ-、Ｓ-およびＮ-反応部位を有する物質などの、特徴的な反応部位にて異なるマーカを有する物質をもたらす。特異的標識はまた、１つのサンプルから異なるマーカまたは異なるマーカ密度を有する同一の物質をもたらし、たとえば、１つのサンプルは特異的に標識される同一のたんぱくを有し得る。特異的標識はまた、２つのサンプルから異なるマーカまたは異なるマーカ密度を有する同一の物質をもたらす。そのような特異的標識型は、細胞間のプロテオーム、ゲノムまたは代謝産物の比較分析に非常に適している。
【００８０】
ここで同意語として使用される「マーカ」、「タグ」または「標識」は、遷移金属錯体を介して物質に付着することが可能であり、物質を検出、測定または視覚化するのに使用することが可能であるあらゆる部分である。
【００８１】
ここで使用される化合物の「残基」は、化合物それ自体、またはより大きな物質の部分、たとえばたんぱく中のアミノ酸残基として解釈されるべきである。
【００８２】
「異なる安定同位体」は、ここでは、原子の安定した同位体であって、自然界で最も多く存在するその原子の同位体とは別の同位体として定義される。Ｃ（炭素）の場合、１３Ｃ（１．０７％）は、通常存在する１２Ｃ（９８．９３％）に対し、異なる安定同位体である。遷移金属の場合、たとえばＰｔ（白金）については、１９２Ｐｔ（０．７９％）、１９４Ｐｔ（３２．９％）、１９６Ｐｔ（２５．３％）、および１９８Ｐｔ（７．２％）は、通常存在する１９５Ｐｔ（３３．８％）に対し、異なる安定同位体である。
【００８３】
標識遷移金属錯体に結合される物質は、（硫黄含有反応部位に付着するとき）Ｍｅ-Ｓ付加化合物として、（窒素含有反応部位に付着するとき）Ｍｅ-Ｎ付加化合物として、または一般にＭｅ-付加化合物として示される。
【００８４】
今後、硫黄含有反応部位はＳ-反応部位として、窒素含有反応部位はＮ-反応部位として示される。同様に、酸素含有反応部位はＯ-反応部位として、リン含有反応部位はＰ-反応部位として示される。
【００８５】
化学的または生物学的物質は、たとえば化学的、生物学的または医学的研究もしくは診断において、物質を同定、検出、視覚化、分離、精製、単離、定量化またはモニターするために、検出マーカで標識されることは当該技術において既知である。種々の標識方法が当該技術から既知である（レビューのため、Hermanson、１９９６年、Bioconjugate techniques、Academic Press、ＩＳＢＮ ０-１２-３４２３３５-Ｘを参照されたい）。特定の検出マーカおよび特定の標識方法を選択する際には、多数の要因が関与する。そのような要因は、物質の性質、標識反応の条件、標識反応中の感度、物質に対する特異性および標識物質の検出限界を含む。
【００８６】
種々の反応部位に対する標識遷移金属錯体の反応性は、広範な様々な物質に対する迅速な標識反応および優れた感度を可能にするので、多数の用途において利点がある。
【００８７】
本願発明者は、標識反応におけるリンカーとして、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびマレイミドなどのリンカーに優る、標識遷移金属錯体を使用する特別の利点は、本発明に従う標識遷移金属錯体が質量分析にルーチンで適用できるということであると見出した。さらに、最も多く存在する遷移金属原子とその異なる安定同位体との間の特定の構成および比が、質量分析における標識物質の同定に規定手段を提供することが可能である。標識反応に本発明の標識遷移金属錯体を使用するさらなる利点は、使用される反応性部分に応じて、そのような錯体が広範な種々の化学的物質の標識を支持できることである。
【００８８】
別の利点は、たんぱくが、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）および／またはシステイン（Ｃｙｓ）残基にて適当な標識遷移金属錯体によって標識されることである。これは、ペプチド鎖の側基をより多く標識し、よってより高い標識密度を達成できる可能性を提供する。これはまた、ペプチド鎖のさらなるアミノ酸残基の標識を可能にする。
【００８９】
生体たんぱくおよび／またはペプチドは、システインを含むとは限らず、システイン標識は、プロテオームにおけるたんぱくの８５％のみの検出を可能にするだけである。メチオニン残基を標識できれば、プロテオームにおけるたんぱくの９７％の検出が可能になる。組合せにより、本発明の標識錯体の使用は９８．３５％のプロテオーム範囲を提供する。したがって、新しいターゲットアミノ酸を選択できるこの見込みは、プロテオーム研究において重要な利点である。
【００９０】
さらに、本発明に従う標識遷移金属錯体での標識反応特異性は、化学的または生物学的物質の硫黄含有反応部位と窒素含有反応部位とを区別するように制御される。したがって、本発明に従う標識遷移金属錯体を用いることで、物質の標識を、種々の反応部位を一緒に含有する物質または物質団内の特定の反応部位に向かわせることができる。
【００９１】
本発明に従う標識遷移金属錯体の使用の１つの実施形態において、サンプル中の化学的または生物学的物質は、欧州特許出願公開第１２６２７７８号明細書に記載される方法に従って特異的に標識される。
【００９２】
好ましい実施形態において、本発明に従う標識遷移金属錯体の使用は、構成が比較されるべき２つの異なるサンプル中に存在する化学的または生物学的物質の特異的標識を含む。好ましい使用は、たんぱく発現プロフィールの測定、またはプロテオームの結果と、参照サンプル由来の対応結果とを比較するために、試験サンプル中のプロテオームの測定を含む。
【００９３】
たんぱくの特異的標識手順における標識遷移金属錯体の使用のさらに別の利点は、後続のトリプシン消化に妨害がないことである。これは、ＭＳ分析に適当な長さのペプチドを提供するために、トリプシン消化にかけられる細胞プロテオームの標識手順において、特に有利である。
【００９４】
１つのサンプルに由来する物質つまり混合物として生じる物質を標識できる見込みとは別に、化学的または生物学的物質は異なるサンプルに由来してもよい。たとえば、特異的標識は、参照サンプル中の物質を標識することなく試験サンプル中の物質を標識すること、またはその逆を含み得る。その後、両サンプル中に存在する同一の物質は、試験サンプル中の物質の分子量における規定シフトの結果として、質量分析によって区別することが可能である。あるいは、特異的標識は両サンプル中の物質の標識を含んでもよい。そのような例において、質量分析によって物質を区別可能にすることは、物質の、少なくとも２つの異なる分子量の標識遷移金属錯体による特異的標識を含む。
【００９５】
特異的標識方法は、広範な種々のバッファ溶液中で、および幅広いｐＨ範囲にわたって実行される。適したバッファ溶液は、ＴＲＩＳ／グリシンおよびリン酸バッファなどの一般に使用されるバッファをすべて含む。Tween-２０、Triton X-１００またはＳＤＳなどの界面活性剤が標識混合物中に存在してもよい。バッファが、一般に使用される濃度にて、塩酸、硝酸、硫酸またはリン酸のナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩などの塩の存在は、標識反応にほとんど影響を及ぼさない。ＭＳにおいて好ましい標識用バッファは、蒸発後に痕跡残存物を残さない、たとえば酢酸アンモニウムなどを含有するバッファである。
【００９６】
特異的標識反応に関する反応パラメータはまた、物質が特異的に標識されるように選択され、特定のｐＨ値の選択を含む。ここで使用されるｐＨは、２０℃の水溶液のｐＨ値として解釈されるべきである。一般に、Ｍｅ-Ｓ付加化合物の形成はｐＨ非依存的で、Ｍｅ-Ｎ付加化合物の形成はｐＨ依存的である。好ましい実施形態において、１つ以上のＳ-反応部位は、そのｐＨを使用することによって、１つ以上の窒素含有部位に優先して選択的に標識される。
【００９７】
指針として、物質の標識されるべきでないすべてのＮ-反応部位の最低ｐＫａを下回るｐＨに標識反応のｐＨを選択することで、１つ以上のＳ-反応部位の特異的標識が可能になる。熟練者は、ｐＫａに加えて、標識されるべき物質付近の微環境の影響を含む、他の要因が影響することを理解できよう。一般に、Ｓ-反応部位は、酸性ｐＨにてＮ-反応部位に優先して特異的に標識される。
【００９８】
理論的には、Ｍｅ-Ｓ付加化合物の形成は１工程プロセスである。反応基は、Ｓが白金に電子対を提供すると、白金錯体を離れる。このプロセスは、Ｍｅ-ＸのＭｅ-Ｓへの直接変換であって、ｐＨ非依存的であると考えられる。他方、Ｎ供与体は、Ｎ置換に先立ち、酸素による白金錯体の反応基の置換を必要とする。初めに、Ｍｅ-ＸはＭｅ-Ｏになり、結果としてＭｅ-Ｎを生じる。これは、ｐＨを変化させることで第１工程が制御することが可能である２工程スキームである。したがって、溶液のｐＨに影響を及ぼす要因は、Ｍｅ-Ｎ付加化合物の形成を妨害するかもしれない。
【００９９】
イオンの存在はまた、Ｎ-反応部位に対する遷移金属錯体の選択性を制御するために用いることが可能である。実施形態において、１つ以上の脱離配位子、好ましくはアニオン部分が、Ｓ-反応部位の分別標識を増大するために、標識遷移金属錯体をＮ-反応部位に標識するのを阻害するのに用いられる。そのような脱離配位子の好ましい例は、Ｃｌ−、ＮＯ３−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ３２−、ＺＳＯ３−、Ｉ−、Ｂｒ−、Ｆ−、酢酸イオン、炭酸イオン、リン酸イオン、硝酸エチルイオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、ホスホン酸イオン、ＺＯ−および水を含む。ここで、Ｚは、水素部分または１〜１０の炭素原子を有するアルキルまたはアリール基として定義される。特に良好な結果は、特に好ましくは塩化物イオンであるアニオン部分を含む塩を用いることで達成される。対イオンはアルカリカチオン、アルカリ土類カチオン、または標識するのにも用いられるカチオンであるのが好ましい。好ましい実施形態において、Ｎ-反応部位への標識の阻害に用いられるアニオン部分の総イオン強度は、少なくとも０．１ｍｏｌ／ｌである。より好ましくは、総イオン強度は０．１〜０．５ｍｏｌ／ｌの範囲にある。
【０１００】
遷移金属イオンの存在もまた、標識されるべき反応部位の選択のために使用することが可能である。特に、そのようなイオンは、Ｓ-反応部位の標識を妨げるか鈍化させ、または標識Ｍｅ-Ｓ付加化合物を不安定にさせて、効果的に１つ以上のＮ-反応部位がＳ-反応部位に優先して特異的に標識されるのに、適していることが見出されている。この物質またはサンプルの特異的標識の型式は、一部の物質のみが分析されなければならないときに、特に利点がある。
【０１０１】
前述のパラメータに加えて、本発明に従う方法はさらに、好ましくは０〜１２０℃の範囲で、より好ましくは２０〜７０℃の範囲で変化する温度；一般的に１分〜４８時間の範囲の、好ましくは１０分〜２４時間の範囲の、より好ましくは２５分〜１５時間の範囲の反応時間；試薬の濃度、試薬のモル比、標識遷移金属錯体の総純荷電などのパラメータによって微調整される。これらのパラメータは、当該技術において既知であるいずれかの方法で、特定用途に応じて調整される。標識遷移金属錯体の総純荷電は、たとえば、中性ｐＨでのヒスチジンにおけるＭｅ-Ｎ付加化合物形成の特異性に影響を及ぼす。フルオレセイン-およびシアニン遷移金属錯体などの中性Ｍｅ-錯体は、Ｍｅ-Ｎ付加化合物を形成し、一方で、たとえばローダミン-およびジニトロフェノールＭｅ錯体といった正荷電遷移金属標識錯体は、効果的でないか、効果が劣る。正荷電標識遷移金属錯体は、ペプチド、たんぱくなどの等電点以上では、Ｎ付加化合物に対して特異的標識を示す。Ｎ-反応部位のＳ-反応部位に優先する選択的標識、またはその逆を可能にすることとは別に、本発明に従う方法はまた、欧州特許出願公開第１２６２７７８号明細書に記載されるような正しい条件を選択することによって、特徴的なＮ-反応部位または特徴的Ｓ-反応部位を分別することができる。
【０１０２】
単一物質の特異的標識のための前述の指針はまた、異なる化合物、および異なる起源由来の化合物の特異的標識に必要な、または最適な標識を得るために採用することが可能である。
【０１０３】
本発明に従う化学的または生物学的物質の質量分析方法は、まず、ＭＳによるそれらの物質の区別を可能にしなければならず、したがって、前述の少なくとも１つの標識遷移金属錯体で物質を特異的に標識する第１工程を含む。さらに、その方法は質量分析によって物質の分子量を分析する工程を含む。熟練者は、ＭＳ検出の種々の可能性に精通している。
【０１０４】
ＭＳ検出に先立ち、異なるサンプル由来の物質が任意に混合されて、混合物がＭＳ分析にかけられる。特異的標識物質またはサンプルをＭＳ分析に先立って混合する利点は、ＭＳ条件が、試験される物質すべてについて等しくなり、分子量のシフトが容易に識別することが可能であることである。
【０１０５】
また、ＭＳ検出に先立ち、標識物質は、たとえばアフィニティタグ物質のアフィニティ単離によって、または、特に本発明の方法においてはイオン交換クロマトグラフィによって、もしくは蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）との組合せにおいて蛍光マーカを用いることによって、非標識物質から精製することが可能である。さらに、本発明の標識遷移金属錯体は、先に精製することなく、ＭＳ-ＭＳ中に（特異的）標識物質を分離する機会を提供する。
【０１０６】
したがって、サンプル比較を含む方法において、両サンプルは、精製工程が両サンプルに実行することが可能であるようにするために、異なる分子量の標識遷移金属錯体で標識されるのが好ましい。このようにすることで、精製バイアスは両サンプルについて等しくなる。捕獲試薬に結合できる標識はすべて、アフィニティ標識として使用することが可能である。本発明の好ましい実施形態において、アフィニティ標識はビオチン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、フルオレセインまたはDyomics ６４７染料であり、好ましい捕獲試薬は、それぞれ、ストレプトアビジンもしくはアビジン、抗-ＤＮＰ、抗-フルオレセイン、および抗- Dyomics ６４７である。アフィニティタグ物質のアフィニティ単離後、それらのいくつかは同位体で標識され、アフィニティ標識と捕獲試薬との相互作用は、単離材料のＭＳ分析を可能にするように、崩壊すなわち切断される。アフィニティ標識は、置換配位子の添加によって捕獲試薬から置換されて、遊離アフィニティ標識またはアフィニティ標識の誘導体となり、また、溶媒（たとえば溶媒の種類またはｐＨ）もしくは温度条件を変えることによって、結合錯体は、化学的、酵素的、熱的または光化学的に開裂されて、ＭＳ分析のために単離物質を放出することが可能である。
【０１０７】
ＭＳ検出に先立ち、標識物質は、予め選択された分子種の検出を可能にするために分離される。たとえば液体クロマトグラフィ（ＬＣ）またはガスクロマトグラフィ（ＧＣ）による事前の分離によって、たんぱくの複雑な混合物のＭＳによる分析が可能となる。熟練者は特定の用途に必要な、または最適な分離手順を決定することができるだろう。
【０１０８】
化学的または生物学的物質の質量分析方法は、試験サンプルおよび参照サンプルの比較分析を含んでもよい。特異的標識後、２つのサンプルが混合され、混合物がクロマトグラフの分離に続いて質量分析にかけられると、標識遷移金属錯体で標識された物質は、非標識物質と比較して予測可能な分子量シフトを示すだろう。このように、本発明の方法は、サンプル間の化学的または生物学的物質の比較質量分析を可能にする。
【０１０９】
そのような方法はまた、分子量に基づいて試験サンプルの物質を参照サンプルの物質から区別するために、少なくとも２つの異なる分子量の標識遷移金属錯体を用意し、サンプル間で物質を特異的に標識することを含む。言い換えれば、試験サンプル物質は第１の分子量の標識遷移金属錯体で標識され、参照サンプル物質は第２の分子量の標識遷移金属錯体で標識される。必要とされる分解能にもよるが、１Ｄａという標識遷移金属錯体間の分子量差で充分である。先のセットにおける標識遷移金属錯体間の分子量差は２Ｄａを超えるのが効果的で、４Ｄａを超えるのがより効果的で、６Ｄａを超えるのが好ましく、８Ｄａを超えるのがより好ましく、１０Ｄａを超えるのがさらに好ましい。
【０１１０】
異なる分子量を有する２つの標識遷移金属錯体の目的は、化学的には実質的に同一でありながら、質量によって区別可能な試薬のペアまたはセットを生成することである。
【０１１１】
分子量の差異は、遷移金属錯体の原子または配位子を、より大きいまたはより小さい分子量の原子または配位子と置換することによってもたらすことが可能である。適当な質量変換配位子は、脂肪族基、炭水化物、アルコール官能基、およびたとえばＦ、ＣｌおよびＢｒなどのハロゲンを含む。
【０１１２】
分子量の差異はまた、遷移金属錯体の原子を別の安定同位体と置換することによってもたらすことが可能である。加えて、たとえば錯体中の１つ以上の原子を安定同位体と置換することによって、遷移金属錯体は異なる態様で同位体標識することが可能である。たとえば、水素は重水素で、１２Ｃは１３Ｃで、１４Ｎは１５Ｎで、１９５Ｐｔは１９２Ｐｔ、１９４Ｐｔ、１９６Ｐｔまたは１９８Ｐｔで、１６Ｏは１８Ｏで、置換することが可能である。錯体に存在するＰまたはＳ原子もまた置換することが可能である。好ましい実施形態においては、１Ｈおよび２Ｈ、１２Ｃおよび１３Ｃ、１４Ｎおよび１５Ｎ、１６Ｏおよび１８Ｏ、またはそれらの組合せが使用される。さらに、遷移金属同位体、たとえばＰｔ同位体の混合物の使用は、標識物質の識別をより容易にさせる質量分布の独特のパターンを提供する。
【０１１３】
さらに別の実施形態において、遷移金属錯体に付着したマーカが、前述の錯体に分子量差を提供する。このように、分子量差がマーカ（の存在）に起因してもよい。好ましい実施形態において、複雑性は単同位体白金および１５Ｎ、１３Ｃおよび／またはＤ標識配位子を使用することで軽減される。
【０１１４】
本発明は、前述のような少なくとも２つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットに関する。そのようなセットは、細胞および組織中における広範囲のたんぱく発現プロフィールの定性分析、特に定量分析に使用することが可能である。
【０１１５】
さらに別の側面において、本発明は前述のような少なくとも１つの異なる安定同位体を含有する遷移金属錯体に関する。
【０１１６】
さらに、本発明は、少なくとも１つの異なる安定同位体を含有する標識遷移金属錯体で標識された化学的または生物学的物質に関する。その物質はアミノ酸、ペプチドまたはたんぱくであるのが好ましい。
【０１１７】
本発明に従う遷移金属錯体は、（絶対的）定量に非常に適している。これは、内部物質標準を用いて単一のサンプル中の物質の絶対量を決定する方法である。そのような方法の焦点は、注目する重要な物質、またはその修飾状態に合わせられる。この方法は、物質が標識されることを必要としないが、質量分析に先立ち特定の内部標準が作製されることを必要とする。適当な内部標準は、調査下の物質と同じではなく類似した特徴を有する物質である。
【０１１８】
本発明のさらなる側面は、少なくとも２つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットを含む部品のキットに関する。好ましくは、分子量の差異は遷移金属錯体中の異なる安定同位体の存在に起因する。部品のキットはさらに、反応取扱説明書、１つ以上の試験サンプル、１つ以上の他の試薬、１つ以上の試験管または試験紙など、および、バッファ、マーカ調製品およびイオン強度を調整する調製品から形成される群から選ばれる１つ以上の調合物を含む。そのようなキットは本発明に従う方法を採用するのに非常に適している。
【０１１９】
本発明は、たんぱく混合物中のたんぱくまたはたんぱく機能の迅速な定量分析のための分析用試薬、およびこれらの試薬を用いる質量分析に基づく方法を提供する。分析法は、細胞および組織中における広範囲のたんぱく発現プロフィールの定性分析、特に定量分析、つまりプロテオームの定量分析のために使用することが可能である。この方法はまた、細胞、組織または生体液中の発現レベルが、サンプルが由来した細胞、組織または有機体の刺激（たとえば薬剤投与または潜在的に毒性の物質との接触）によって、環境変化（たとえば栄養水準、温度、時間の経過）によって、または条件もしくは細胞状態の変化（たとえば病状、悪性腫瘍、部位特定的突然変異、遺伝子ノックアウト）によって影響されるたんぱくをスクリーニングし、同定するために採用することが可能である。そのような選別において同定されたたんぱくは、変化した状況のためのマーカとして機能し得る。たとえば、正常および悪性細胞のたんぱく発現プロフィールの比較は、存在または不在が悪性腫瘍の特性および診断であるたんぱくの同定をもたらし得る。
さらに、本発明は以下の限定しない実施例によって説明される。
【０１２０】
実施例
Ｉ．三座配位子の作製および遷移金属錯体形成
以下の型の配位子、それらのＫ２ＰｔＣｌ４との錯体形成、ならびにそれに続く、ＮＨＳエステルとの反応およびマーカの組み込みのための錯体のＢＯＣ-脱保護が記載される。
【０１２１】
【化２】
【０１２２】
２の合成（図５：スキーム１）（ボールド体タイプの数字は、参照される図およびスキームに示される化合物を指す。たとえば本実施例では、図５：スキーム１の化合物が参照される）
【０１２３】
１，Ｎ-Ｂｏｃ-へキサン-１,６-ジアミン（１４０．５ｍｇ、６４９．５μｍｏｌ）をＨ２Ｏ／ＥｔＯＨ １／１（２０ｍｌ）の混合物に溶解した。アクリロニトリル（４２５．５μｌ、６．４９５ｍｍｏｌ）をその溶液に添加した。混合物を一夜６０℃で還流し、乾固して、純粋な油性の薄茶色の物質が生じた。残さがＣＨ２Ｃｌ２に溶解され、ＭｇＳＯ４上で乾燥された。ろ過および減圧下での溶媒の除去によって２が得られた。（収量：１６６．８ｍｇ、９５％）。１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δ １．３５（４Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)２(ＣＨ２)２）；１．４３（１３Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＨ２)２(ＣＨ２)＋ｔＢｕ）；２．６０（６Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)５＋(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＮ）；２．９４（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＮ）；３．１（２Ｈ、ｍ、(ＣＨ２)ＮＨＢｏｃ）；４．５５（１Ｈ、ブロードピーク、ＮＨＢｏｃ）。
【０１２４】
３の合成（図５：スキーム１）
２（１５３．０ｍｇ、４７４．５μｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）に溶解した。溶液を０℃で３０分間攪拌した後、Ｅｔ２Ｏ中のＬｉＡｌＨ４溶液（１Ｍ、２．９ｍｌ、２９００μｍｏｌ）を滴加した。混合物を０℃で９０分間攪拌し、室温になるまで静置した。過剰のＬｉＡｌＨ４を水４ｍｌを滴加して注意深く分解した。Ｌｉ塩をろ過によって除去し、水（１０ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）で洗浄した。水層が分離し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を混合し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、減圧下で乾固して、無色の油として３を得た（収量：９９．３ｍｇ、６３％）。１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δ １．２３（４Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)２(ＣＨ２)２)；１．３８（１３Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＨ２)２(ＣＨ２)＋ｔＢｕ）；１．５２（４Ｈ、ｍ、(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＮＨ２）；２．３２（２Ｈ、ｍ、Ｎ(ＣＨ２)(ＣＨ２)５）；２．４４（４Ｈ、ｍ、Ｎ(ＣＨ２)(ＣＨ２)２ＮＨ２）；２．７４（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＮＨ２）；３．０２（２Ｈ、ｍ、(ＣＨ２)ＮＨＢｏｃ）；３．３０（４Ｈ、ブロードピーク、ＮＨ２）；４．７２（１Ｈ、ブロードピーク、ＮＨＢｏｃ）。
【０１２５】
６の合成（図７：スキーム３）
ＣＨ２Ｃｌ２ ７０ｍｌ中の塩化クロルアセチル溶液１６５μｌ（２３３．９７ｍｇ、２．０７２ｍｍｏｌ）を、秒毎５滴の速度で、室温で、Ｎ-アセチルエチレンジアミン１９８．５０μｌ（２１１．６０ｍｇ、２．０７１ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２ １４０ｍｌおよび１Ｍ ＮａＯＨ水溶液２０７１．６μｌ（８０．７７ｍｇ、２．０７２ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。添加の完了後、その混合物を一夜室温で攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。固体をＭｅＯＨで洗浄し、ＮａＣｌ塩を遠心分離によって分離した。澄明なＭｅＯＨ抽出物を減圧下で乾燥し、ＭｅＯＨによる洗浄および遠心分離工程を、ＮａＣｌが分離されなくなるまで繰返した。ＭｅＯＨ抽出物を減圧下で乾固し、６を得た。
【０１２６】
７の合成（図７：スキーム３）
ＭｅＣＮ中の６の溶液（１７ｍｌあたり１ｍｍｏｌ）を、秒毎５滴の速度で、７５℃で（６の溶液を添加するフラスコの上端に還流冷却器が導入されている）、（６のモル数に対して）Ｋ２ＣＯ３の３Ｍ当量、（６のモル数に対して）ＫＩの１Ｍ当量、および（６のモル数に対して）１、つまりＭｅＣＮ中のＮ-Ｂｏｃ-へキサン-１,６-ジアミン（３４ｍｌで１は１ｍｍｏｌ）の１Ｍ当量を含む混合物に添加した。添加の完了後、混合物を一夜還流した。その後、溶媒を減圧下で除去した。固体をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、Ｋ+塩をろ過した。ＣＨ２Ｃｌ２抽出物を減圧下で乾固し、７を得た。
【０１２７】
８の合成（図７：スキーム３）
３の作製に関して記載した手順を、３の代わりに７を用いて繰返し、７を得た。
【０１２８】
Ｋ２ＰｔＣｌ４とのＢｏｃ三座配位子（スキーム２の３（図６）およびスキーム４の８（図８））の錯体形成に関する一般的なプロトコール
Ｋ２ＰｔＣｌ４およびＬの１Ｍ当量をＤＭＦに添加した（ｍｌあたりのＫ２ＰｔＣｌ４は４．６９×１０−６ｍｏｌ）。ここでＬは使用した三座配位子である。その後、混合物を４０℃で一夜熱し、その間に、赤色Ｋ２ＰｔＣｌ４塩が溶解した。溶液を乾固し、Ｋ+塩を水で洗浄した。不溶性固体をろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、減圧下で乾燥した。
４：１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＭｅＯＤ)：δＰｔ-２５２０ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＩ+)： ｍ／ｚ ５６１ [Ｍ−Ｃｌ]+
【０１２９】
Ｂｏｃ-脱保護および続くマーカのＰｔ錯体への組み込みに関する一般的なプロトコール
[Ｐｔ(Ｌ)Ｃｌ] Ｃｌ １２６μｌを２００ｍＭ ＨＣｌ（３ｍｌ）に溶解した。その後、その溶液を５０℃で一夜攪拌した。１Ｍ ＮａＯＨの添加によってｐＨを８に調整した。その後、５×スクシンイミド結合緩衝液（２ｍｌ）を溶液に添加した。ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＮＨＳ-スクシンイミドエステル（６３μｍｏｌ）を続いて滴加した。その溶液を遮光下で室温にて一夜攪拌した。その後、１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した種を、セファデックス カラム（Ｇ１５）に通して精製し、減圧下で溶媒を除去して得た。
Ｂｏｃ脱保護後の４：１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＭｅＯＤ)：δＰｔ-２５１２ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＩ+)：ｍ／ｚ ４６１ [Ｍ−Ｃｌ]+
【０１３０】
ＩＩ．Ｋ２ＰｔＣｌ４のジエチレントリアミンとの錯体形成
ジエチレントリアミンは市販のものが利用可能である（Aldrich、カタログ＃Ｄ９，３８５-６）。Ｋ２ＰｔＣｌ４（１ｇ）をミリＱ（２５ｍｌ）に溶解した。溶解しなかった小さな黄色の結晶および灰色の物質をろ過した。ジエチレントリアミン（０．５ｍｌ）をその澄明な赤色溶液に添加した。ＨＣｌ水溶液（６Ｍ）を用いてｐＨを３に調整した。溶液を６．５時間還流した。反応の２時間後、ＮａＯＨ水溶液（１および５Ｍ）を用いてｐＨを４に調整した。反応混合物を一夜室温にて冷却した。その後、ＨＣｌ水溶液（６Ｍ）を用いてｐＨを１まで酸性にした。その後、反応混合物を７２時間フリーザ（−２０℃）内に置いた。生じた白色結晶をろ過した。ろ液のｐＨを６に調整し、溶媒をいくらか蒸発させて、その溶液を氷浴中で冷却した。これで２次結晶が得られ、ろ取した。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (Ｄ２Ｏ)：δＰｔ-２７２２ｐｐｍ
【０１３１】
ＩＩＩ．ＡＰＥＴ錯体の作製
−４’−アミノペンチルエーテル−２，２’：６’，２”テルピリジン（２）の作製
【０１３２】
【化３】
【０１３３】
８０℃の乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）中の粉末ＫＯＨ ９８６ｍｇの攪拌懸濁液（１７．６ｍｍｏｌ、４．７ｅｑ）に、５-アミノペンタノール ３８５．８ｍｇ（３．７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加した。アルコールの添加後、溶液がオレンジ色から茶色に変化した。３０分後、４’-クロロ-２,２’:６’,２買eルピリジン １ｇ（３．７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加した。２については８０℃での４時間の攪拌後、３については８０℃での１８時間３０分の攪拌後、溶液を冷却ミリＱ ２００ｍｌに注いだ。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍｌ）で抽出した。混合有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ロータリーエバポレータによって蒸発させた。産物収量は黄色粒子 ９０８．４ｍｇであった（７３％）。
【０１３４】
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
δ １．３ [ブロードピーク、２Ｈ、ＣＨ２]、１．９ [ブロードピーク、２Ｈ、ＣＨ２]、２．２ [ブロードピーク、２Ｈ、ＣＨ２]、２．５ [ブロードピーク、２Ｈ、ＣＨ２]、２．６ [ブロードピーク、２Ｈ、ＮＨ２]、３．６ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２]、６．８ [ｄｄ、 ２Ｈ、Ｈ４,４・/SUB>]、７．３ [ｔ、２Ｈ、Ｈ５,５・/SUB>]、７．４２ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、７．９ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ３,３・/SUB>]、８．１ [ｄ、２Ｈ、Ｈ６,６・/SUB>]。
【０１３５】
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
δ ２３．５ [ＣＨ２]、２９．０９ [ＣＨ２]、３３．４ [ＣＨ２]、４２ [ＣＨ２-ＮＨ２]、６８．４ [ＣＨ２-Ｏ]、１０７．５ [ＣＨ、Ｃ３’,５’]、１２１．５ [ＣＨ、Ｃ５, ５・/SUB>]、１２４．３ [ＣＨ、Ｃ３,３・/SUB>]、１３７．２ [ＣＨ、Ｃ４,４・/SUB>]、１４９．３ [ＣＨ、Ｃ６,６・/SUB>]、１５６．０３ [Ｃ、Ｃ２,２・/SUB>]、１５７．１ [Ｃ、Ｃ２’,６’]、１６７．３ [Ｃ、Ｃ４’]。
【０１３６】
ＵＶ／可視吸収（ＣＨＣｌ３）
λｍａｘ２４５ｎｍ（ε１６ ５００Ｍ−１.ｃｍ−１）
２７９ｎｍ（ε１６ ５００Ｍ−１.ｃｍ−１）
−４’-ポリエチレングリコールエーテル-２,２’:６’,２・テルピリジン（３）の作製
【０１３７】
【化４】
【０１３８】
８０℃の乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）中の粉末ＫＯＨ ９８．６ｍｇの攪拌懸濁液（１．７６ｍｍｏｌ、４．７ｅｑ）に、ＰＥＧ ３００ １１２．２ｍｇ（０．３７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加した。３０分後、４’-クロロ-２,２’:６’,２・テルピリジン １００ｍｇを添加した（０．３７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）。８０℃での２０時間の攪拌後、溶液を冷却ミリＱ ２００ｍｌに注いだ。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍｌ）で抽出した。混合有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ロータリーエバポレータによって蒸発させた。黄色い油が３５％の収量で得られた（６８．３ｍｇ）。
【０１３９】
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
δ ３ [ブロードピーク、１Ｈ、ＯＨ]、３．６７ [２Ｈ、ＣＨ２]、３．６０ [ｍ、６Ｈ、ＣＨ２]、３．８６ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２]、４．３３ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２]、７．２４ [ｔ、２Ｈ、Ｈ５,５”]、７．７４ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ４,４”]、７．９５ [ｓ、２Ｈ、 Ｈ３’,５’]、８．５ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ３,３”]、８．６ [ｄ、２Ｈ、Ｈ６,６”]。
【０１４０】
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
δ ６２．２ [ＣＨ２-Ｏ]、６８．５ [ＣＨ２-Ｏ]、７１．３ [ＣＨ２-Ｏ]、７１．６ [ＣＨ２-Ｏ]、７３．５ [ＣＨ２-Ｏ]、１０８．２ [ＣＨ、Ｃ３’,５’]、１２２．０６ [ＣＨ、Ｃ５,５”]、１２４．６０ [ＣＨ、Ｃ３,３”]、１３７．５４ [ＣＨ、Ｃ４,４”]、１４９．７３ [ＣＨ、Ｃ６,６”]、１５６．７ [Ｃ、Ｃ２,２”]、１５７．７ [Ｃ、Ｃ２’,６’]、１６７．７ [Ｃ、Ｃ４’]。
−蛍光色素（またはハプテン）のＡＰＥＴ（６ａ〜ｄ）との結合
【０１４１】
【化５】
【０１４２】
磁気攪拌装置が備えられたミクロリアクタにおいて、ＡＰＥＴを染料のＤＭＦ １ｅｑ ３００μｌに溶解し、ＴＥＡ ３ｅｑを添加し、溶液を暗所にて室温で２０時間攪拌した。溶媒を除去した。産物純度をＲＰ ＨＰＬＣによってチェックし、産物をＬｕｎａ １０ Ｃ１８ （２）上でのアセトニトリル／ＴＥＡＡバッファによる分取用ＲＰ ＨＰＬＣによって精製された。
収量：
【０１４３】
【表１】
【０１４４】
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
＞ＤＥＡＣ（６ａ）：
δ １．２４ [ｔ、６Ｈ、ＣＨ３]、１．６６ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．７３ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．８７ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、３．４７ [ｍ、６Ｈ、ＣＨ２]、４．２７ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｏ]、６．４８ [ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４８Ｈｚ、ＣＨ]、６．６３ [ｄｄ、ＩＨ、ＪＰ＝２．４１およびＪｏ＝８．９５Ｈｚ、ＣＨ]、７．３３ [ｍ、２Ｈ、Ｈ５,５”]、７．４３ [ｄ、１Ｈ、Ｊｏ＝８．９５Ｈｚ、ＣＨ]、７．８４ [ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝１．７７およびＪ＝７．７１Ｈｚ、Ｈ４,４”]、７．９７ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．５８ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ３,３”]、８．６９ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ６,６”]、８．７１ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、８．８６ [ｔ、１Ｈ、アミド]。
【０１４５】
＞ＤＥＡＣ（６ａ）：
δ １．２４ [ｔ、６Ｈ、ＣＨ３]、１．６６ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．７３ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．８７ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、３．４７ [ｍ、６Ｈ、ＣＨ２]、４．２７ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｏ]、６．４８ [ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４８Ｈｚ、ＣＨ]、６．６３ [ｄｄ、ＩＨ、ＪＰ＝２．４１およびＪｏ＝８．９５Ｈｚ、ＣＨ]、７．３３ [ｍ、２Ｈ、Ｈ５,５”]、７．４３ [ｄ、１Ｈ、Ｊｏ＝８．９５Ｈｚ、ＣＨ]、７．８４ [ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝１．７７およびＪ＝７．７１Ｈｚ、Ｈ４,４”]、７．９７ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．５８ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ３,３”]、８．６９ [ｄｄ、２Ｈ、Ｈ６,６”]、８．７１ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、８．８６ [ｔ、１Ｈ、アミド]。
【０１４６】
＞６ ＴＡＭＲＡ （６ｂ）：
δ １．２９ [ｓ、６Ｈ、ＣＨ３]、１．３２ [ｓ、６Ｈ、ＣＨ３]、１．５７ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．６６ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、１．８７ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、４．２２ [ｔ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｏ]、３．４２ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２-ＮＨ]、６．３８ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、６．４０ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、６．４７ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、６．４８ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、６．５８ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、６．６１ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、７．３１ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．７８Ｈｚ、Ｈ５,５”]、７．４９ [ｓ、１Ｈ、ＣＨ]、７．８５ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．７１Ｈｚ、Ｈ４,４”]、７．９９ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．０４ [ｄ、１Ｈ、ＣＨ]、８．０７ [ｄ、１Ｈ、ＣＨ]、８．６１ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．９５Ｈｚ、Ｈ３,３”]、８．６７ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝４．５０Ｈｚ、Ｈ６,６”]。
【０１４７】
＞ＬＣビオチン（６ｃ）：
δ １．５４ [ｍ、４Ｈ、ＣＨ２]、１．６２ [ｍ、１２Ｈ、ＣＨ２]、１．９２ [クインテット、２Ｈ、ＣＨ２]、２．２０ [ｔ、４Ｈ、ＣＨ２]、３．１８ [ｔ、４Ｈ、ＣＨ２-ＮＨ]、３．３４ [ｍ、３Ｈ、ＣＨ-ＮＨおよびＣＨ２-ＮＨ]、３．３８ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｓ]、４．３２ [ｍ、４Ｈ、ＮＨ]、４．５３ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ-Ｓ]、７．５５ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝１．５５および５．０８、Ｈ５,５”]、７．７５ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．０５ [ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝１．６０および７．７８Ｈｚ、Ｈ４,４”]、８．５７ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．９６Ｈｚ、Ｈ３,３”]、８．６９ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝４．２６Ｈｚ、Ｈ６,６”]。
ＤＮＰ（６ｄ）：
δ １．２０ [ｍ、４Ｈ、ＣＨ２]、１．５０ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２]、１．６０ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２]、１．７６ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２]、１．８９ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２]、２．２２ [ｍ、４Ｈ、ＣＨ２]、３．３３ [ｍ、２Ｈ、ＣＨ２-Ｏ]、３．３７ [ｍ、２Ｈ、 ＣＨ２-ＮＨ]、４．２７ [ブロードピーク、１Ｈ、ＮＨ]、５．５７ [ｍ、１Ｈ、ＮＨ]、７．３７ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝４．６８Ｈｚ、Ｈ５,５”]、７．８８ [ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．０２Ｈｚ、Ｈ４,４”]、７．９８ [ｓ、２Ｈ、Ｈ３’,５’]、８．１８ [ｄｄ、１Ｈ、Ｊｍ＝２．６１およびＪｏ＝９．４８Ｈｚ、ＣＨ]、８．４７ [ｍ、１Ｈ、ＣＨ]、８．６０ [ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．８３Ｈｚ、Ｈ３,３”]、８．６７ [ｄ、２Ｈ、Ｈ６,６”]、９．０６ [ｄ、１Ｈ、Ｊｍ＝２．６４Ｈｚ、ＣＨ]。
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)
【０１４８】
＞ＤＥＡＣ（６ａ）：
δ １３．２０ [ＣＨ３、ＣＨ３-ＣＨ２]、２４．２９ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２]、２６．１６ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２]、２９．５４ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２]、３０．１１ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＮＨ]、４０．３３ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ３]、４５．８３ [ＣＨ２、ＣＨ２-ＣＨ３]、６８．８４ [ＣＨ２、Ｏ-ＣＨ２]、１０８．３３ [ＣＨ、Ｃ３’,５’]、１１０．６８ [ＣＨ]、１２２．２０ [ＣＨ、Ｃ５,５”]、１２４．５２ [ＣＨ、Ｃ３,３”]、１３１．９１ [ＣＨ]、１３７．５０ [ＣＨ、Ｃ４,４”]、１４８．８８ [ＣＨ]、１４９．７６ [ＣＨ、Ｃ６,６”]、１５７．００ [Ｃ、Ｃ２,２”]、１５７．７６ [Ｃ、Ｃ２’,６’]、１６８．００ [Ｃ、Ｃ４’]、１７３．００ [Ｃ、Ｃ＝Ｏアミド]。
ＵＶ／可視吸収 (ＣＨＣｌ３)
【０１４９】
【表２】
【０１５０】
発光スペクトル
【０１５１】
【表３】
【０１５２】
−Ｋ２ＰｔＣｌ４の６ｃ、ＬＣビオチン ＡＰＥＴとの錯体形成
Ｋ２ＰｔＣｌ４（６．０ｍｇ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）に溶解した。その溶液をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）中のＤＮＰ ＡＰＥＴ（８．３ｍｇ）溶液にゆっくり添加した。その溶液が遮光下で４０℃にて一夜加熱した。その後、混合物を減圧化で乾固した。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (Ｄ２Ｏ)：δＰｔ -２７０１， -２９５４および -２９５１ｐｐｍ。
【０１５３】
−Ｋ２ＰｔＣｌ４の６ｄ、ＤＮＰ ＡＰＥＴとの錯体形成
Ｋ２ＰｔＣｌ４（６．０ｍｇ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）に溶解した。その溶液をプロパノール（１ｍｌ）およびＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）中のＤＮＰ ＡＰＥＴ（９．３ｍｇ）溶液にゆっくり添加した。その溶液を遮光下で４０℃にて一夜加熱した。その後、混合物を減圧化で乾固した。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (Ｄ２Ｏ)：δＰｔ -２６８６および -３４４２ｐｐｍ。
【０１５４】
ＡＰＥＴ錯体の作製についての付加情報
４’-クロロ２,２’:６’,２’’ルピリジンおよび５-アミノペンタノールをAldrichから購入した。Ｋ２ＰｔＣｌ４をSigmaから購入した。ＥＺ Ｌｉｎｋ ＮＨＳ ＬＣビオチンをPierceから購入した。６ ＴＡＭＲＡ-ＳＥ、ＤＮＰ-ＳＥ、ＤＥＡＣをMolecular Probesから得た。配位子に関してカラムクロマトグラフィをFlukaのシリカゲル６０上で実行した。錯体をIGN Biomedical GmbHのAlumina N上で精製した。全溶媒をMerckから得て、精製せずに使用した。使用した水は、脱塩されたミリＱ水であった（Ｒ＝１８．２ＭΩ／ｃｍ）。ＲＰ ＨＰＬＣによる全分析ランに使用した溶離液は：
＞ Ａ：１０％ ＣＨ３ＣＮ／９０％ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｐＨ ５
＞ Ｂ：７０％ ＣＨ３ＣＮ／３０％ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｐＨ ５、であった。
【０１５５】
１Ｍ ＴＥＡＡバッファ ｐＨ ５．０： ５００ｍｌのメスシリンダ内で、ミリＱ水 ２００ｍｌ、酢酸 ３０ｍｌおよびＴＥＡ ７０ｍｌを攪拌した。その後、ミリＱ水を４００ｍｌまで添加した。溶液を室温で冷却し、ｐＨを酢酸で５に調整した。容積をミリＱで５００ｍｌに調整した。溶液を２〜６℃で保存した。
【０１５６】
アセトニトリルバッファ １０％／０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ ５．０ ９０％： １０００ｍｌのメスシリンダ内で、アセトニトリル １００ｍｌ、１Ｍ ＴＥＡＡ ９０ｍｌ ｐＨ ５．０およびミリＱ ８１０ｍｌを室温で攪拌した。溶液を膜フィルタ １．０μｍでろ過した。その後、溶液を１０〜２０分間真空ポンプで脱気した。バッファを２〜６℃で保存した。
【０１５７】
アセトニトリルバッファ ７０％／０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ ５．０ ３０％： １０００ｍｌのメスシリンダ内で、アセトニトリル ７００ｍｌ、１Ｍ ＴＥＡＡ ３０ｍｌ ｐＨ ５．０およびミリＱ水 ２７０ｍｌを室温で攪拌した。溶液を膜フィルタ １．０μｍでろ過した。その後、溶液を１０〜２０分間真空ポンプで脱気した。バッファを２〜６℃で保存した。
【０１５８】
カラム：ＲＰ ＨＰＬＣ分析をPhenomex Luna ５ａ Ｃ１８（２）カラムを備えるAmersham Pharmacia Biotech Akta explorerを用いて実行した。カラムおよび分析の特性は以下のとおりである：高さ ２５ｃｍ、直径 ０．４６ｃｍ、カラム容積 ４．１５５ｍｌ、圧力 １４ＭＰａ、流速 １ｍｌ／ｍｉｎ。
【０１５９】
波長：分析は一般に３つの波長で実行したが（２５４，２８０および２１５ｎｍ）、波長は、遊離した蛍光色素（またはハプテン）をより容易に検出するために、蛍光色素に適合させた。
【０１６０】
ＮＭＲ：作製した化合物を１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲ分光法によって特徴付けた。１Ｈ ＮＭＲは３００ＭＨｚで、１３Ｃ ＮＭＲは７５ＭＨｚで、双方ともBruker DPX ３００ スペクトロメータにて記録した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは内部テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を基準とした。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは溶媒共鳴を基準とした。全サンプルを室温で測定した。
【０１６１】
ＵＶ／可視：ＵＶスペクトルをAmersham Pharmacia Biotech Ultrospec ４０００ スペクトロメータにて記録した。スペクトルを、配位子および錯体に関して、２００〜７００ｎｍの間で石英キュベット内で測定した。
【０１６２】
発光スペクトル：発光スペクトルをPerkin Elmer LS ４５Luminescence Spectrometerにて記録した。励起波長をモノクロメータで選択した。各励起波長を染料の最大吸収に選択した。スペクトルを室温で記録した。
【０１６３】
ＩＶ．核酸およびたんぱくの標識におけるＡＰＥＴ−Ｐｔ／Ｐｄ／Ｒｕ／Ｃｏ試薬の使用
白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）およびコバルト（Ｃｏ）を含む様々な金属をＡＰＥＴスペーサに導入した。初めに、蛍光色素またはハプテンをＡＰＥＴに付着させ、その後様々な金属を標識ＡＰＥＴ分子に導入した。化学分析をＨ-ＮＭＲによって行った。ＲＰ-ＨＰＬＣ精製試薬の純度は８０〜９９％間で変化させた。
【０１６４】
ビオチン-ＡＰＥＴ-錯体：
ビオチン-ＡＰＥＴスペーサをＣｄ２+、Ｃｏ２+、Ｃｕ２+、Ｆｅ３+、Ｍｎ２+、Ｎｉ２+、Ｐｄ２+、Ｐｔ２+、Ｒｕ２+およびＺｎ２+と錯体形成させた。ＤＭＦまたはＤＭＳＯに可溶であるＰｔ、ＰｄおよびＲｕ錯体を除いて、全錯体が水溶性であった。これら試薬の純度は８２〜９９％で、８０％を超える収量であった。Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｐｄ錯体はあまり安定ではなかった（考えられる解釈：Ｐｄの、別のＢｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｐｄ分子のビオチンのチオエーテルとの結合を介した鎖の形成があり、これはＨＰＬＣクロマトグラムにおいて見られた）。標識錯体を、異なる比、温度、インキュベーション時間およびｐＨにてたんぱくおよびＤＮＡとインキュベートした。Ｐｔ、ＰｄおよびＲｕ含有Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-錯体はたんぱくおよびＤＮＡの双方を標識し、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-ＣｏはＤＮＡを標識しないがたんぱくを標識し（ｐＨ８．０にて）、他の金属はあまり反応しないか、安定した結合を形成しないことがわかった。
【０１６５】
図１は、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕが、基準となる二座配位子の白金標識錯体（Ｂｉｏ-ＢＯＣ-Ｐｔ）よりもＤＮＡとよく反応することを示す。ＤＮＡは、より速く、かなり低温で標識される。また、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕが基準となるＦｌｕ-ＢＯＣ-Ｐｔと１：１で混合されるとき、シグナルの大部分がビオチン検出によって発見される。Ｆｌｕ-ＢＯＣ-ＰｔがＢｉｏ-ＢＯＣ-Ｐｔと混合される場合、シグナルの大部分がフルオレセイン検出によって発見される。Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-ＰｔはＢｉｏ-ＢＯＣ-Ｐｔと同様の反応をした（データ示さず）。興味深いことに、メチオニンビーズはＰｄおよびＰｔ含有ＡＰＥＴ錯体によって標識されたが、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕ錯体はメチオニンビーズに、反応をさほど、どちらかといえば全く示さなかった。Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕは全ＲＮＡの標識を含むマイクロアレイ実験において首尾よく使用された。一般に、Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕはより安定で、基準となるビオチン- ＢＯＣ-Ｐｔを凌ぐ。Ｂｉｏ-ＡＰＥＴ-ＲｕはたんぱくおよびＤＮＡの双方とよりよく反応する（たとえば、より低温で充分に標識する）。Ｒｕが硫黄ではなく窒素とのみよく反応すると考えられることを考慮すれば、ビオチン-ＡＰＥＴ-Ｒｕは基準となるビオチン-ＢＯＣ-Ｐｔ錯体よりも安定した試薬であるかもしれない（たとえば、より低温で充分に標識しない）。
【０１６６】
ＤＮＰ-ＡＰＥＴ-錯体：
Ｐｔ、ＰｄおよびＲｕ含有ＤＮＰ-ＡＰＥＴ錯体はＤＮＡおよびたんぱくに対してよく反応する（表１参照）。図２に示すように、４０℃を超える温度でのＤＮＡに対する反応は、基準となる二座配位子のＤＮＰ-ＢＯＣ-Ｐｔと同程度である。ＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｐｄは、６０℃を超える温度では標識がほとんど観察されないので、あまり安定してＤＮＡに結合しなかった。
【０１６７】
全ヒト血清のターゲット標識を、基準となるＤＮＰ-ＢＯＣ-ＰｔおよびＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｒｕ、Ｐｔ、Ｐｄ錯体を用いて実行した。ＩｇＡ-、ＩｇＧ-およびＩｇＭ キャプチャ ＥＬＩＳＡ分析を展開した。ＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｐｔおよび-Ｐｄで使用した標識比にて、ほとんどのたんぱくがすぐに沈澱した。Ｐｔ錯体はより速くたんぱくを沈殿させたが、Ｐｄ錯体よりもかなり標識されにくいことをデータは示している。真にポジティブの結果はＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｐｔでは見られなかった。ＩｇＧ検出に関して、ＢＯＣ-Ｐｔ＝ＡＰＥＴ-Ｐｄ＞ＡＰＥＴ-Ｒｕであり、ＩｇＡ検出に関して、ＢＯＣ-Ｐｔ＝ＡＰＥＴ-Ｐｄ＝ＡＰＥＴ-Ｒｕであった。使用した最も低い比率では、２０％のＩｇＧおよび５０％のＩｇＡのみが溶解し（１時間３７℃での標識）、一方で、対照の二座配位子の標識錯体およびＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｒｕで得られた最良の結果は８５％を超えるＩｇＧおよび７５％を超えるＩｇＡを含む画分に由来したので（２０時間３７℃での標識）、ＤＮＰ-ＡＰＥＴ-Ｐｄは比率を低下させることで最適化することが可能である。
【０１６８】
Ｃｙ３／５-ＡＰＥＴ-錯体：
ＤＮＡ標識は、Ｃｙ３-ＡＰＥＴ-Ｐｔ、Ｃｙ５-ＡＰＥＴ-ＰｄおよびＣｙ５-ＡＰＥＴ-Ｒｕによって行った。全ヒト血清のターゲット標識を、基準となるＣｙ５-ＢＯＣ-Ｐｔ、Ｃｙ５-ＡＰＥＴ-ＲｕおよびＣｙ５-ＡＰＥＴ-Ｐｄを用いて実行した。ＩｇＡ キャプチャ ＥＬＩＳＡ分析を展開した。Ｃｙ５はハプテンとして機能した（ＨＲＰ共役ＭｏＡｂ抗-Ｃｙ５によって検出された）。図３は、すべての場合において、Ｃｙ５標識ＩｇＡが検出されることを示す。最良の結果は対照のＣｙ５-ＢＯＣ-Ｐｔ錯体で得られた。
Ｖ．ペプチドマーカ-三座配位子-Ｐｔ錯体の合成
ペプチドは１６個のアミノ酸長であって、細胞の原形質膜を超えて生体分子を移送するシャトル分子として機能する。このペプチドは固体支持として一端および他端に末端ＮＨ２基を有する。アミンを、溶液ｍｌあたりアミン ０．０２ｍｇの濃度となるように、ミリＱおよびエタノールの５０：５０混合物中に溶解した。アクリロニトリルの１０００倍モル当量を溶液に添加した。溶液を一夜還流した（６５℃の加熱）（水冷却機に連結された丸底フラスコの上端に還流冷却器が取り付けられている）。混合物をロータリー蒸発下で乾燥し、固化物を乾燥エタノール（３〜５ｍｌ）で洗浄し、再び乾固するまで蒸発させた。ニトリル化合物を、１：１のモル比で乾燥エタノール（ニトリル ２０ｍｍｏｌについて２０ｍｌ）中で塩化ニッケル(II)と混合した。新しく調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液（ニトリル １ｍｍｏｌあたり１ｍｍｏｌ）を、かなり慎重に（少しずつ）添加した（２ｍｍｏｌ）。溶液を室温で２時間攪拌した。次に、溶液をミリＱでろ過し、金属ニッケルを磁石を用いて除去した。ろ液をＤＭＦ ２ｍｌに溶解した。テトラクロロ白金(II)酸カリウム ５当量（１００μｍｏｌ）を添加し（粉末）、混合物を４０℃に一夜保った。次に、混合物をろ過し、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ミリＱおよびＤＣＭ（ジクロロメタン）で洗浄した。溶液をロータリー蒸発下で乾固した。固体支持は、ペプチドを固体支持に結合させるのに用いた化学反応型に応じて、基準的な化学反応によって除去することが可能である。この場合は、ＴＦＡ化学反応を使用した。最終的に、遷移金属―三座配位子―（ペプチド）マーカから成る、単機能的なＰｔ錯体が合成された。
【０１６９】
ＶＩ．マスタギング
ジエチレントリアミン Ｐｔ錯体（Ｐｔ[ジエン Ｃｌ−] Ｃｌ−； ５μＭ溶液を使用した）は、本化合物がＭＳ中で安定し、ＰｔおよびＮの模擬同位体分布の同位体パターン特性を有することを明らかにした。光標識化合物に関して得られた最も多く存在する分子イオン（図４）は、ｍ／ｚ＝３３４に分子イオン[Ｍ１+]を有する。本化合物の合成からの夾雑ピークは観察されなかった。他の唯一の可視ピークは、標識反応中に観察されたｍ／ｚ＝３１５のＯＨ-基と置換されたＣｌ−の損失であった。
【０１７０】
ＹＧＧＦＭＫペプチドの３Ｍ 過剰Ｐｔ[ジエンＣｌ] Ｃｌでの標識を、４５および８５℃で実行した。３Ｍ 過剰標識化合物との、５ｍＭ 酢酸アンモニウム ｐＨ６〜７中での１時間のインキュベーション後、メチオニン含有ペプチドであるペプチドは、両温度で完全に標識された。８５℃での標識は４５℃での標識よりも多くの副反応物をもたらさなかったものの、副反応物の強度は４５℃よりも８５℃で大きかった。しかし、これはナノスプレーキャピラリの位置に起因し得る。この単機能的な三座配位子標識化合物はペプチドの標識をもたらした。
【０１７１】
ＭＳ測定を、陽イオンモードで作動し、Ｚ-スプレー ナノ電気スプレー源を備えた三連四重極機器（Micromass、マンチェスター、英国）にて実行した。ナノ電気スプレーニードルをＰ-９７ プラー（Sutter Instruments、ナヴァト、カリフォルニア）上でホウケイ酸ガラスキャピラリー（Kwik- Fil、 World Precision Instruments、サラソータ、フロリダ）から作製した。このニードルを、Edwards Scancoat （Edwards Laboratories、ミルピタス、カリフォルニア）six Pirani 501 （２００秒間で４０ｍＶ、１ｋＶ）を用いて、薄い金層で被膜した（およそ５００Å）。ナノスプレーニードルとマススペクトロメータオリフィスとの間のポテンシャルは通常１，２００Ｖに設定した。コーン電圧は３０Ｖであった。ナノスプレーニードルは常におよそ３０℃に保った。ＭＳ／ＭＳ測定に関して、衝突エネルギは、充分な配列情報を得るために必要とされる適切な電圧に設定した（＜２０Ｖ）。衝突ガスとしてアルゴンを使用した。四重極質量分解能パラメータを、前駆イオンの全同位体エンベロープを選択するために、比較的大きなマスウィンドウに設定した。
【０１７２】
ＶＩＩ．Ｎ３トランス-Ｃ３三座配位子の合成（スキーム５）
１の作製−アクリロニトリルのマイケル付加：
Ｎ-Ｂｏｃ-ヘキサン-１,６-ジアミン（１４０．５ｍｇ、６４９．５μｍｏｌ）をＨ２Ｏ／ＥｔＯＨ １／１の混合物（２０ｍｌ）中に溶解した。アクリロニトリル（４２５．５μｌ、６．４９５ｍｍｏｌ）をその溶液に添加した。混合物を一夜６０℃で還流し、乾固して、純粋な油性の薄茶色の物質を得た。残さをＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。続くろ過および減圧下での溶媒の除去によって、１を得た。（収量：１６６．８ ｍｇ、９５％）
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δ １．３５ （４Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)２(ＣＨ２)２）；１．４３ （１３Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＨ２）２(ＣＨ２)＋ｔＢｕ）；２．６０ （６Ｈ、ｍ、ＮＨ(ＣＨ２)(ＣＨ２)５＋(ＣＨ２)(ＣＨ２)ＣＮ）；２．９４ （４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＮ）；３．１ （２Ｈ、ｍ、(ＣＨ２)ＮＨＢｏｃ）；４．５５ （１Ｈ、ブロードピーク、ＮＨＢｏｃ）。
【０１７３】
２の作製−水素化リチウムアルミニウムでの還元：
１（１５１．０ｍｇ、５．１２９×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍｌ）中に溶解した。その溶液を２０分間氷浴（０℃）中で攪拌した。その後、水素化リチウムアルミニウム（ジエチルエーテル中の１Ｍ 溶液 ５ｍｌ、５ｍｍｏｌ）を添加した。白色固体が沈殿するのが直ちに観察された。その混合物を３０分間０℃（氷浴）で攪拌し、その間に温度は室温と平衡になった。その後、ミリＱ ７．５ｍｌを慎重に添加して、過剰の水素化リチウムアルミニウムを中和した。ミリＱの添加はより重要な量の白色固体の沈殿をもたらした。その後、混合物をろ過した。有機抽出物を水性抽出物から分離し、減圧下で乾燥して、無色の油を得た。（収量：２３．５ ｍｇ、１５．１％）。
【０１７４】
１の１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δＨ １．２２ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．４１ （ｍ、１３Ｈ、ｔＢｕプロトンおよびヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、１．８２ （ブロードシングレット、４Ｈ、ＮＨ２）、２．２９ （ｍ、８Ｈ、(ＣＨ２)２ＮＨ２）、２．６８ （ｍ、２Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨＢｏｃ）、３．０６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、４．６１ （ｍ、２Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ３０３ [Ｍ＋Ｈ]+。
【０１７５】
３の作製−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
２（８２９．２ ｍｇ、２．５０９ｍｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（５３５．４ｍｌ）中に溶解した。その後、固体の状態でテトラクロロ白金酸カリウム（１０４１．４ｍｇ、２．５０９ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で一夜加熱した。加熱によって赤色白金塩が溶解するのが観察された。その後、混合物をろ過して、白色塩化カリウム固体を分離した。ろ液を減圧下での加熱によって乾固した。その後、ミリＱ（約３０ｍｌ）を添加して、残留塩化カリウム塩を除去した。水性抽出物をろ過した。茶色固体をジエチルエーテル（１０ｍｌ）で洗浄し、減圧下で乾燥した。（収量：８５３．００ｍｇ、５７．０％）。
【０１７６】
４ａの作製および５のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステルとの反応：
３（７．３ｍｇ、１．２×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（４ｍｌ）と混合した。その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いて、ｐＨを約８．０に調整した。
【０１７７】
不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して、茶色の残さを可溶化することもできる。その後、ミリＱ（４７６μｌ）、ミリＱ中の水酸化ナトリウム（１Ｍ 溶液、２５μｌ）を添加した。
【０１７８】
Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（９５．２μｌ）中のＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステル（４．７６ ｍｇ、１．０×１０−５ｍｏｌ）を滴加した。ミリＱ（３８１μｌ）、トリエチルアミン（３μｌ）、ミリＱ（１６２μｌ）、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（パスツールピペットによる４滴の滴加）、メタノール（パスツールピペットによる５滴の滴加）およびジクロロメタン（４滴）を添加した。ｐＨが８．０前後であると確認した。トリエチルアミンをこのｐＨ調整にために添加してもよい。その混合物を５分間遮光下にて室温で攪拌した後、ｐＨが８．０前後であることが確認した。
【０１７９】
ここでも、トリエチルアミンをｐＨ調整のために使用してもよい。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。その後、不溶性物質をろ過した。ろ液を乾固させた。
【０１８０】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -３１２９および -２５１９ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ８００ [Ｍ]+。
【０１８１】
たんぱく標識におけるＮ３ トランス-Ｂｉｏ ＵＬＳ (４ａ)の使用
たんぱく ５０μｇを含むHELA細胞溶解物を、標識バッファ ５０μｌ中の化合物４ａで、３時間３７℃にて標識した。４ａの量はそれぞれ０．５，１，２，４または１６μｇであった。標識反応を還元サンプルバッファの添加によって停止した。BIO-APを検出抗体として使用した（１：１０００）。ウェスタンブロットの結果を図１０に示す。
【０１８２】
４ｂの作製および５のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去および６-ＦＡＭ フルオレセイン スクシンイミジルエステルとの反応
３（２．１５ｍｇ、３．６×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（３６６．４６μｌ）と混合した。その後、メタノール（パスツールピペットから３滴の滴下）およびＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドを、総容積が約１ｍｌになるよう添加した。
【０１８３】
その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色の個体が溶解するのが観察された。その後、ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いて、溶液の半分のｐＨを約８．０に調整した。その後、スクシンイミド結合バッファ（５×、６５．７０μｌ）を添加した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して、茶色の残さを可溶化することもできる。
【０１８４】
Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１６４．２３５μｌ）中のフルオレセイン スクシンイミジルエステル（０．８２ ｍｇ、２．１×１０−６ｍｏｌ）を滴加した。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
【０１８５】
たんぱく標識におけるＮ３ トランス-Ｆｌｕ ＵＬＳ (４ｂ)の使用
４ｂ １，２，４，６，７．５，１０，１２．５および２５μｇを、異なる分子量の６つのたんぱく混合物（ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ、カルボニックアンヒドラーゼ、オボアルブミン、ＢＳＡ、ホスホリラーゼＢ） ５０μｇを標識するのに使用した。この標識（１時間５０℃）を、抗ＦＬＵ-ＡＰで検出されるブロット上で１２．５μｇにて、ＦＬＵ- ＵＬＳの基準となる標識量と比較した（図１１）。
【０１８６】
核酸のＮ３ トランス-Ｆｌｕ ＵＬＳ (４ｂ)での標識
ＤＮＡ [第１染色体のセントロメア周辺（１ｑ１２）に位置するヒト反復サテライトIII ＤＮＡ配列を乗せる１．７７ｋｂインサートを有するpUC19プラスミド] を、４ｂ １０μｇを１００μｌの容積中のＤＮＡ ３μｇに添加することで、４ｂによって標識した。混合物を８５℃１時間でインキュベートし、非結合４ｂを標準的なエタノール沈殿によって除去した。ＤＮＡ沈殿物は、ＵＶ光で照射されたとき、緑色蛍光発光を示した。精製４ｂ標識ＤＮＡをin situハイブリダイゼーション分析においてプローブとして用いた。プローブを、６０％ ホルムアミド、１×ＳＳＣおよび１０％ 硫酸デキストランを含むハイブリゼーションバッファに溶解し、最終濃度 ４ｎｇ／μｌとした。１０μｌを、基準となる前処理ヒト中期分裂標本に適用し、ターゲットおよびプローブの双方が変性し得るように、８０℃で５分間インキュベートした。次に、スライドを３７℃で一夜インキュベートし、非結合または不完全な結合のプローブを、６５℃の１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で洗浄して除去した。再水和後、標本をＤＡＰＩを含む抗退色試薬中に埋め込んだ。フルオレセイン画像を、デジタルカメラを備えたLeica蛍光顕微鏡を用いて記録した。
【０１８７】
図１は、４ｂ標識プローブが蛍光in situハイブリダイゼーションによってヒト第１２染色体の１ｑ１２-領域を視覚化するのに用いられ得ることを示す。４ｂのプローブＤＮＡ標識効率は、厳しい条件下でさえ直接の蛍光発光による視覚化を可能にする。
【０１８８】
４ｃの作製および５のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＤＮＰスクシンイミジルエステルとの反応：
３（２．１５ｍｇ、３．６×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（１６３．６２μｌ）と混合した。その後、メタノール（パスツールピペットから３滴の滴下）およびＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドを、総容積が約１ｍｌになるように添加した。
【０１８９】
その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色の個体が溶解するのが観察された。その後、ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いて、溶液の半分のｐＨを約８．０に調整した。その後、スクシンイミド結合バッファ（５×、２４５．４３μｌ）を添加した。
【０１９０】
不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して、茶色の残さを可溶化することもできる。Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（２４５．４３μｌ）中のＤＮＰ スクシンイミジルエステル（１．６ ｍｇ、３．３４×１０−６ｍｏｌ）を滴加した。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。
【０１９１】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
【０１９２】
ＶＩＩＩ．Ｎ３シス-Ｃ２三座配位子の合成（スキーム６）
１の作製−塩化クロロアセチルとの反応：
Ｎ-Ｂｏｃ-１,６-ジアミノヘキサン（１７５．６ｍｇ、８．１２×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタン（１５．４ｍｌ）、ミリＱ（３８８３μｌ）および１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（８１１．５μｌ、８．１２×１０−４ｍｏｌ）に溶解した。その混合物を２０分間０℃（氷浴）で攪拌した。
【０１９３】
ジクロロメタン（２９４０．４０μｌ）中の塩化クロロアセチル（６４．５μｌ、８．１０×１０−４ｍｏｌ）を添加した。その混合物を３０分間０℃で攪拌した。
【０１９４】
その後、有機層を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で乾燥した。白色個体が得られた。（収量：１６１．４ｍｇ、６７．９％）。
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．３５ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．４４ （ｓ、９Ｈ、ｔＢｕプロトン）、１．５３ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、３．１０ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、３．２６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨ２）、４．０４ （ｓ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)）、４．５２ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨＢｏｃ）、６．６１ （ブロードｓ、２Ｈ、ＣｌＣＨ２ＮＨＣ(Ｏ)）ｐｐｍ。
【０１９５】
２の作製−エチレンジアミンとの反応：
エチレンジアミン（１４７．４ｍｇ、２．４５２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍｌ）中に溶解した。１（１６１．４ｍｇ、５．５１×１０−４ｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍｌ）中に溶解した。その溶液を７５℃でエチレンジアミン溶液に、５秒あたり約１滴の速度で滴加した。添加の完了後、その混合物を７５℃で一夜加熱した。
【０１９６】
その後、固体をろ過した。ろ液を乾固した。不溶性の物質をジクロロメタン（３×３ｍｌ）中に抽出した。有機抽出物を水性残さから分離し、減圧下で乾燥し、無色の油を得た。（収量：４１．３ｍｇ、２３．７％）。
２の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．０９ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．３５ （ｓ、９Ｈ、ｔＢｕプロトン）、１．３９ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、２．６２ （ｔ、２Ｈ、Ｊ＝ ７．１４Ｈｚ、ＮＨ２ＣＨ２）、２．９１ （ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４１Ｈｚ、Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨ２）、３．０１ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、３．１４ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨ、ＮＨＣＨ２Ｃ(Ｏ)）、３．２６ （ｔ、Ｊ＝５．３６Ｈｚ、２Ｈ、ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、３．４０ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)）、４．７９ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨＢｏｃ）、７．１４ （ブロードｓ、１Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)ＮＨ）ｐｐｍ。
【０１９７】
３の作製−水素化アルミニウムリチウムでの還元：
２（４１．３ｍｇ、１．６１×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）中に溶解した。その溶液を２０分間氷浴（０℃）中で攪拌した。その後、水素化アルミニウムリチウム（ジエチルエーテル中の１Ｍ 溶液 １ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を添加した。白色個体が沈殿するのが直ちに観察された。その混合物を３０分間０℃（氷浴）で攪拌し、その間に温度は室温と平衡になった。その後、ミリＱ １．５ｍｌを慎重に添加して、過剰の水素化リチウムアルミニウムを中和した。ミリＱの添加はより重要な量の白色固体の沈殿をもたらした。その後、混合物をろ過した。有機抽出物を水性抽出物から分離し、減圧下で乾燥し、無色の油を得た。（収量：３３．８ｍｇ、６９．４％）。
【０１９８】
３の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．２９ （ｍ、８Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．４１ （ｍ、９Ｈ、ｔＢｕプロトン）、１．８０ （ブロードｓ、４Ｈ、アミンＮＨ）、２．６２ （ｍ、４Ｈ、ＮＨ２ＣＨ２およびＮＨＣＨ２(ＣＨ２)５）、３．０５ （ｍ、６Ｈ、ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ(ＣＨ２)２ＮＨ）、３．２１ （ｍ、２Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。
【０１９９】
４の作製−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
３（３３．８ｍｇ、１．１２×１０−４ｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１７．１ｍｌ）中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム（４６．１ｍｇ、１．１１×１０−４ｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で週末をまたいで加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド溶液が薄い茶色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。固体をミリＱ（２０ｍｌ）で洗浄した。再度、茶色の固体をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１７．１ｍｌ）中に溶解し、その溶液を４０℃で一夜加熱した。その後、溶媒を減圧下で除去した。最後に、茶色の固体をメタノール ４７．２ｍｌ中に溶解し、その溶液を６０℃で週末をまたいで加熱した。（収量：３４．３ｍｇ、５９．８％）。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＣＤ３ＯＤ)：δＰｔ -２５２３ｐｐｍ。
【０２００】
５の作製および６のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステルとの反応：
４（３４．３ｍｇ、６．６９×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（９８０．８８μｌ）と混合した。その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いてｐＨを約８．０に調整した。その混合物を１時間室温で静置した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。
【０２０１】
Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（４２２μｌ）中のＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステル（２１．１ｍｇ、ｍｏｌ）を滴加した。ｐＨが８．０前後であると確認した。トリエチルアミンをこのｐＨ調整のために添加してもよい。その混合物を５分間遮光下にて室温で攪拌した後、ｐＨが８．０前後であることを確認した。ここでも、トリエチルアミンをｐＨ調整のために使用してもよい。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。（収量：１５ｍｇ、２７．８％）。
【０２０２】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＣＤ３ＯＤ)：δＰｔ -２６３０ｐｐｍ。
標識化合物としてのＮ３ シス-Ｂｉｏ ＵＬＳ (５)の使用
６つのたんぱく混合物（前記参照） ２５μｇを、標識バッファ ５０μｌ中で１６時間３７℃にて標識した。５の量は、それぞれ５、１０、１２．５、１５または２０μｇであった。標識反応を還元サンプルバッファの添加によって停止した。検出抗体：BIO-AP １：１０００。
標識の結果を図１４に示す。
【０２０３】
７の合成−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
６ｃ（５．８ｍｇ、８．６×１０−６ｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１１．２ｍｌ）中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム（３．６ｍｇ、８．８×１０−６ｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で一夜加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド溶液がオレンジ色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。（収量：１２．４ｍｇ、３７．４％）
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＨ １．２７ （ｍ、４Ｈ、脂肪族ＣＨ２）、１．５７ （ｍ、８Ｈ、脂肪族ＣＨ２）、１．８８ （ｍ、４Ｈ、脂肪族ＣＨ２）、２．１１ （ｍ、４Ｈ、Ｃ(Ｏ)ＣＨ２）、３．１１ （ｍ、４Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ(Ｏ)）、４．２９ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ）、４．６１ （ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２）、７．５０ （ｍ、２Ｈ、芳香族Ｈ）、７．８０ （ｍ、２Ｈ、芳香族Ｈ）、８．６９ （ｍ、 ４Ｈ、芳香族Ｈ）ｐｐｍ。１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -２７０７ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ８６７ [Ｍ]+。
図１５はスキーム７の合成−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成−を示す。
【０２０４】
ＩＸ．Ｎ３トランス-Ｃ２三座配位子の合成（スキーム７）
１の作製−クロロアセトニトリルの付加：
Ｎ-Ｂｏｃ-１,６-ジアミノヘキサン（６７．９８ｍｇ、３．１４２×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタンの最小量（１ｍｌ）中に溶解した。その後、アセトニトリルを添加した（２５ｍｌ）。炭酸カリウム（２２４．１ｍｇ、１．６２１ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（１２２．３ｍｇ、７．３６７×１０−４ｍｏｌ）も、固体の状態で添加した。その後、クロロアセトニトリル（１．０ｍｌ、１６ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を７５℃で一夜加熱した。加熱中溶液が黒色に変わるのが観察された。その後、固体をろ過した。ろ液を乾固した。不溶性の物質をジクロロメタン（３×３ｍｌ）中に抽出した。有機抽出物を混合し、ろ過し、減圧下で乾燥した。オレンジ色の固体が単離された。
【０２０５】
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＭｅＯＤ)：δＨ １．２２ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．３６ （ｍ、１３Ｈ、ｔＢｕプロトンおよびヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、２．６３ （ｍ、２Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨＢｏｃ）、２．９９ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、３．７６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＮ）、６．４９ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。 ２の作製−水素化アルミニウムリチウムでの還元：
１（１５１．０ｍｇ、５．１２９×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍｌ）中に溶解した。その溶液を２０分間氷浴（０℃）中で攪拌した。その後、水素化アルミニウムリチウム（ジエチルエーテル中の１Ｍ 溶液 ５ｍｌ、５ｍｍｏｌ）を添加した。白色個体が沈殿するのが直ちに観察された。その混合物を３０分間０℃（氷浴）で攪拌し、その間に温度は室温と平衡になった。その後、ミリＱ ７．５ｍｌを慎重に添加して、過剰の水素化リチウムアルミニウムを中和した。ミリＱの添加はより重要な量の白色固体の沈殿をもたらした。その後、混合物をろ過した。有機抽出物を水性抽出物から分離し、減圧下で乾燥し、無色の油を得た。（収量：２３．５ｍｇ、１５．１％）。
【０２０６】
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．２２ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、１．４１ （ｍ、１３Ｈ、ｔＢｕプロトンおよびヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、１．８２ （ブロードシングレット、４Ｈ、ＮＨ２）、２．２９ （ｍ、８Ｈ、(ＣＨ２)２ＮＨ２）、２．６８ （ｍ、２Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨＢｏｃ）、３．０６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、４．６１ （ｍ、２Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ３０３ [Ｍ＋Ｈ]+。
【０２０７】
３の作製−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
２（２３．５ｍｇ、７．７７×１０−５ｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１２．５ｍｌ）中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム（３２．４ｍｇ、７．８０×１０−５ｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で一夜加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド溶液が薄い茶色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -２５８６ｐｐｍ。（収量：２７ｍｇ、６１．１％）。
【０２０８】
４の作製および５のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステルとの反応：
３（１３．５ｍｇ、４．１３×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（６７０．０３μｌ）と混合した。その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）および塩酸（２００ｍＭ）を用いてｐＨを約８．０に調整した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して、茶色の残さを可溶化することもできる。Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（ｍｌ）中のＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステル（１８．７６ｍｇ、４．１３×１０−５ｍｏｌ）を滴加した。ｐＨが８．０前後であると確認した。トリエチルアミンをこのｐＨ調整のために添加してもよい。その混合物を５分間遮光下にて室温で攪拌した後、ｐＨが８．０前後であることを確認した。ここでも、トリエチルアミンをｐＨ調整のために使用してもよい。その後、混合物を遮光下加熱中に室温で一夜攪拌した。その後、不溶性物質をろ過した。
【０２０９】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -２７０７ｐｐｍ。 ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ７７２ [Ｍ]+。
【０２１０】
Ｘ．ＮＳ２トランス-Ｃ２三配位子の合成（スキーム８）
１の作製−２-クロロエチルメチルエーテルの付加：
Ｎ-Ｂｏｃ-１,６-ジアミノヘキサン（１０１．３ｍｇ、４．６８８×１０−４ｍｏｌ）をジクロロメタンの最小量（１ｍｌ）中に溶解した。その後、アセトニトリルを添加した（３０ｍｌ）。炭酸カリウム（３２７．１ｍｇ、２．３６７ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（１５７．１ｍｇ、９．４６３×１０−４ｍｏｌ）も、固体の状態で添加した。その後、２-クロロエチルメチルエーテル（９３．３μｌ、９．３５×１０−４ｍｏｌ）を添加した。その混合物を７５℃で一夜加熱した。その後、固体をろ過した。ろ液を乾燥した。残さをジクロロメタン（３×３ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を混合し、ろ過し、減圧下で乾燥し、白色個体を得た。（収量：１９．２ｍｇ、１１．２％）。
【０２１１】
１の１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)：δＨ １．２７ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２)、１．４０ （ｍ、９Ｈ、ｔＢｕプロトン）、１．４４ （ｍ、４Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来残留ＣＨ２）、２．１０ （ｓ、６Ｈ、ＣＨ３）、２．５４ （ｍ、６Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨＢｏｃおよびＮＣＨ２ＣＨ２Ｓ）、２．７６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＢｏｃ）、３．２１ （ｍ、２Ｈ、ＮＨＢｏｃ）、４．５４ （ブロードｓ、１Ｈ、ＮＨＢｏｃ）ｐｐｍ。
ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ３６５ [Ｍ+Ｈ]+。
【０２１２】
２の作製−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成：
１（１９．２ｍｇ、５．２６×１０−５ｍｏｌ）をＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１１．２ｍｌ）中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム（２１．７ｍｇ、５．２３×１０−５ｍｏｌ）を添加した。その混合物を４０℃で一夜加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド溶液がオレンジ色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。（収量：１２．４ｍｇ、３７．４％）。
【０２１３】
１９５Ｐｔ ＮＭＲ (ＤＭＦ-ｄ７)：δＰｔ -３５４３ｐｐｍ。
３の作製および４のin-situ作製−Ｂｏｃ-保護基の除去およびＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステルとの反応：
２（１２．４ｍｇ、１．９７×１０−５ｍｏｌ）を２００ｍＭ 塩酸（１３３６．３９μｌ）と混合した。その混合物を５０℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリＱ中の水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ；２４０μｌ）および塩酸（２００ｍＭ；１０μｌ）を用いてｐＨを約８．０に調整した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して茶色の残さを可溶化することもできる。
【０２１４】
Ｎ,Ｎ’-ジメチルホルムアミド（１５９．８６μｌ）中のＥＺ-ｌｉｎｋ-ＬＣ-ビオチン スクシンイミジルエステル（７．９９３ｍｇ、１．７６×１０−５ｍｏｌ）を滴加した。ｐＨが８．０前後であると確認した。トリエチルアミンをこのｐＨ調整のために添加してもよい。その混合物を５分間遮光下にて室温で攪拌した後、ｐＨが８．０前後であることを確認した。ここでも、トリエチルアミンをｐＨ調整のために使用してもよい。その後、混合物を遮光下にて室温で一夜攪拌した。その後、不溶性物質をろ過した。ＨＰＬＣを用いて精製を実行した。ターゲット種が画分１０に溶出するのがわかった（５７．９４〜６２．９４ｍｌ）。
【０２１５】
脱塩は、スクシンイミジルエステルとの反応後に、溶媒を除去することで達成することが可能である。その後、残さを最小量のミリＱに溶解し、その溶液をSephadex G15カラムを通して処理する。
【０２１６】
１の１Ｈ ＮＭＲ (Ｄ２Ｏ)：δＨ １．６２ （ｍ、１２Ｈ、ＬＣ-ビオチンスペーサ由来）、１．７７ （ｍ、８Ｈ、ヘキサンジアミンスペーサ由来ＣＨ２）、２．９４ （ｍ、４Ｈ、Ｃ(Ｏ)ＣＨ２）、３．０５ （ｓ、６Ｈ、ＣＨ３）、３．３０ （ｍ、 ６Ｈ、ＮＣＨ２(ＣＨ２)５ＮＨおよびＮＣＨ２ＣＨ２Ｓ）、３．５４ （ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２ＣＨ２Ｓ）、３．８６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ(Ｏ)ＮＨ）、４．０ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ）ｐｐｍ。
【０２１７】
ＭＳ (ＥＳＩ+) ｍ／ｚ： ７８２ [Ｍ+−Ｃｌ-＋ＯＨ-]+。
分取用ＨＰＬＣ分析法の詳細：
分析用ＨＰＬＣ分析は、容積が８８．２４７ｍｌ（２５０×２１．２μｌ）の逆相Luna3 C18カラムで、ＮａＣｌ （１００ｍＭ； バッファＡ中で９０％およびバッファＢ中で７０％）／２-プロパノール （バッファＡ中で１０％およびバッファＢ中で９０％）によって実行した。総計で（およそ）８０３．０ｍｌを５．０ｍｌ／ｍｉｎ．の速度でカラムを通して溶出した。この方法では、３０％濃度に達する９４．２５〜１８２．４９ｍｌ（１．０ カラム容積）のＢ、８０％濃度に達する１８２．４９〜４０３．２１ｍｌ（２．５ カラム容積）のＢ、１００％濃度に達する４０３．２１〜４４７．３３ｍｌ（０．５ カラム容積）のＢ、および、再度、溶出する５７９．９１〜６２４．０３ｍｌ（０．５ カラム容積）の純粋なＡ、の直線勾配を組み込んだ。４４７．３３〜５７９．８１ｍｌで、純粋なＢが溶出された。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】全ヒトＤＮＡ（５００〜１５００ｂｐ）のＢｉｏ-Ｂｏｃ-ＰｔまたはＢｉｏ-ＡＰＥＴ-Ｒｕによる標識を示す図である。
【図２】全ヒトＤＮＡ（５００〜１５００ｂｐ）のＤＮＰ-ＢＯＣ-ＰｔまたはＤＮＰ-ＡＰＥＴ-ＵＬＳによる標識を示す図である。
【図３】Ｃｙ５-標識試薬で標識された全血清のＩｇＡキャプチャＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図４】Ｐｔ [ジエン Ｃｌ−] Ｃｌ−のＥＳＩ-ＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】３への経路（スキーム１）を示す図である。
【図６】３から標識Ｐｔ（II）錯体への経路（スキーム２）を示す図である。
【図７】８への経路（スキーム３）を示す図である。
【図８】８から標識Ｐｔ（II）錯体への経路（スキーム４）を示す図である。
【図９】Ｎ３ トランス-Ｃ３三座配位子の合成経路（スキーム５）を示す図である。
【図１０】Ｎ３ トランス-Ｂｉｏ ＵＬＳで標識されたHELA細胞溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図１１】Ｎ３ トランス-Ｆｌｕ ＵＬＳ（４ｂ）で標識された６つのたんぱく混合物のウェスタンブロットを示す図である。
【図１２】Ｎ３ トランス-Ｆｌｕ ＵＬＳ（４ｂ）で標識された１．ｑ１２ ＤＮＡプローブとハイブリダイズされたヒト中期分裂を示す図である。
【図１３】Ｎ３ シス-Ｃ２三座配位子の合成経路（スキーム６）を示す図である。
【図１４】Ｎ３ シス-Ｂｉｏ-ＵＬＳ（５）で標識された６つのたんぱく混合物のウェスタンブロットを示す図である。
【図１５】７の合成経路を示す図である。
【図１６】Ｎ３ トランス-Ｃ２三座配位子の合成経路（スキーム７）を示す図である。
【図１７】ＮＳ２ トランス-Ｃ２三座配位子の合成経路（スキーム８）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遷移金属原子と、化学的または生物学的物質が遷移金属原子に付着することを可能とするための反応性部分と、安定化架橋としての不活性三座配位子部分と、マーカとを含むことを特徴とする標識遷移金属錯体。
【請求項２】
遷移金属がバナジウム、クロム、鉄、ニッケル、銅、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、コバルト、マンガン、オスミウム、ロジウム、イリジウム、亜鉛、およびカドミウムから成る群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の錯体。
【請求項３】
遷移金属が鉄、ニッケル、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、およびコバルトから成る群から選ばれることを特徴とする請求項２記載の錯体。
【請求項４】
遷移金属が白金、コバルト、またはルテニウムであることを特徴とする請求項３記載の錯体。
【請求項５】
マーカが三座配位子部分に含まれるか、または三座配位子部分に付着されており、任意であるが、スペーサを用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項６】
遷移金属原子が、３つのドナー原子を介して三座配位子部分に付着し、３つのドナー原子はそれぞれ窒素、酸素、硫黄、およびリン原子の群から独立して選ばれ、三座配位子部分に存在することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項７】
遷移金属原子が３つの窒素原子を介して三座配位子部分に付着することを特徴とする請求項６記載の錯体。
【請求項８】
三座配位子部分のドナー原子は、１〜５、好ましくは１〜３の原子によって互いに分離されることを特徴とする請求項６または７記載の錯体。
【請求項９】
マーカが蛍光標識であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項１０】
反応性部分がＣｌ−、ＮＯ３−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ３２−、ＺＳＯ３−、Ｉ−、Ｂｒ−、Ｆ−、酢酸イオン、炭酸イオン、リン酸イオン、硝酸エチルイオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、ホスホン酸イオン、ＺＯ−、および水から成る群から選ばれることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遷移金属錯体に付着した化学的または生物学的物質を含み、化学的または生物学的物質が反応性部分を置換していることを特徴とする標識化学的または生物学的物質。
【請求項１２】
物質が、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、たんぱく、免疫グロブリン、酵素、人工酵素、リン脂質、糖たんぱく、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸、ペプチド核酸オリゴマ、ペプチド核酸ポリマ、アミンおよびアミノグリコシドから成る群から選ばれることを特徴とする請求項１１記載の標識化学的または生物学的物質。
【請求項１３】
反応性部分が化学的または生物学的物質によって置換される条件下で、化学的または生物学的物質が請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遷移金属錯体に接触させられることを特徴とする請求項１１または１２記載の標識化学的または生物学的物質の作製方法。
【請求項１４】
物質または物質を含有するサンプルの質量分析を容易にするために、化学的または生物学的物質の分子量に規定シフトを作出するための、請求項１〜１０のいずれか１項で定義される遷移金属錯体の使用。
【請求項１５】
質量分析による化学的または生物学的物質の区別を可能にする方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの遷移金属錯体による物質の特異的標識工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
化学的または生物学的物質の質量分析方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの遷移金属錯体による物質の特異的標識工程と、質量分析によって物質を分析する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
少なくとも２つの物質が標識され、物質が異なるサンプルに由来することを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
物質を特異的に標識する工程が請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも２つの遷移金属錯体によって実行され、遷移金属錯体が異なる分子量であり、分子量差が１Ｄａ以上であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットであって、各遷移金属錯体が請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遷移金属錯体であることを特徴とするセット。
【請求項２０】
請求項１９に記載の少なくとも２つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットを含むことを特徴とする部品のキット。
【請求項２１】
さらに反応取扱説明書、試験サンプル、試験管または試験紙、バッファ、マーカ調製品およびイオン強度を調整する調製品から成る群から選ばれる少なくとも１つの品目を含むことを特徴とする請求項２０記載の部品のキット。
【請求項２２】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法を採用する部品のキット。
【請求項１】
遷移金属原子と、化学的または生物学的物質が遷移金属原子に付着することを可能とするための反応性部分と、安定化架橋としての不活性三座配位子部分と、マーカとを含むことを特徴とする標識遷移金属錯体。
【請求項２】
遷移金属がバナジウム、クロム、鉄、ニッケル、銅、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、コバルト、マンガン、オスミウム、ロジウム、イリジウム、亜鉛、およびカドミウムから成る群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の錯体。
【請求項３】
遷移金属が鉄、ニッケル、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、およびコバルトから成る群から選ばれることを特徴とする請求項２記載の錯体。
【請求項４】
遷移金属が白金、コバルト、またはルテニウムであることを特徴とする請求項３記載の錯体。
【請求項５】
マーカが三座配位子部分に含まれるか、または三座配位子部分に付着されており、任意であるが、スペーサを用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項６】
遷移金属原子が、３つのドナー原子を介して三座配位子部分に付着し、３つのドナー原子はそれぞれ窒素、酸素、硫黄、およびリン原子の群から独立して選ばれ、三座配位子部分に存在することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項７】
遷移金属原子が３つの窒素原子を介して三座配位子部分に付着することを特徴とする請求項６記載の錯体。
【請求項８】
三座配位子部分のドナー原子は、１〜５、好ましくは１〜３の原子によって互いに分離されることを特徴とする請求項６または７記載の錯体。
【請求項９】
マーカが蛍光標識であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項１０】
反応性部分がＣｌ−、ＮＯ３−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ３２−、ＺＳＯ３−、Ｉ−、Ｂｒ−、Ｆ−、酢酸イオン、炭酸イオン、リン酸イオン、硝酸エチルイオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、ホスホン酸イオン、ＺＯ−、および水から成る群から選ばれることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遷移金属錯体に付着した化学的または生物学的物質を含み、化学的または生物学的物質が反応性部分を置換していることを特徴とする標識化学的または生物学的物質。
【請求項１２】
物質が、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、たんぱく、免疫グロブリン、酵素、人工酵素、リン脂質、糖たんぱく、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸、ペプチド核酸オリゴマ、ペプチド核酸ポリマ、アミンおよびアミノグリコシドから成る群から選ばれることを特徴とする請求項１１記載の標識化学的または生物学的物質。
【請求項１３】
反応性部分が化学的または生物学的物質によって置換される条件下で、化学的または生物学的物質が請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遷移金属錯体に接触させられることを特徴とする請求項１１または１２記載の標識化学的または生物学的物質の作製方法。
【請求項１４】
物質または物質を含有するサンプルの質量分析を容易にするために、化学的または生物学的物質の分子量に規定シフトを作出するための、請求項１〜１０のいずれか１項で定義される遷移金属錯体の使用。
【請求項１５】
質量分析による化学的または生物学的物質の区別を可能にする方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの遷移金属錯体による物質の特異的標識工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
化学的または生物学的物質の質量分析方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの遷移金属錯体による物質の特異的標識工程と、質量分析によって物質を分析する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
少なくとも２つの物質が標識され、物質が異なるサンプルに由来することを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
物質を特異的に標識する工程が請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも２つの遷移金属錯体によって実行され、遷移金属錯体が異なる分子量であり、分子量差が１Ｄａ以上であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットであって、各遷移金属錯体が請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遷移金属錯体であることを特徴とするセット。
【請求項２０】
請求項１９に記載の少なくとも２つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットを含むことを特徴とする部品のキット。
【請求項２１】
さらに反応取扱説明書、試験サンプル、試験管または試験紙、バッファ、マーカ調製品およびイオン強度を調整する調製品から成る群から選ばれる少なくとも１つの品目を含むことを特徴とする請求項２０記載の部品のキット。
【請求項２２】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法を採用する部品のキット。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【公表番号】特表２００８−５２３０５４（Ｐ２００８−５２３０５４Ａ）
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４５３９４（Ｐ２００７−５４５３９４）
【出願日】平成１７年１２月１日（２００５．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００５／０００８２４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６２３９１
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５００２６７６４２）クレアテック バイオテクノロジー ベー．ファウ． (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｋｒｅａｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｖｌｉｅｒｗｅｇ ２０，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ＮＥＴＨＥＲＬＡＮＤＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１日（２００５．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００５／０００８２４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６２３９１
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５００２６７６４２）クレアテック バイオテクノロジー ベー．ファウ． (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｋｒｅａｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｖｌｉｅｒｗｅｇ ２０，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ＮＥＴＨＥＲＬＡＮＤＳ
【Ｆターム（参考）】
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