樹状細胞、及び抗癌剤
【課題】特異的な免疫応答による強力な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦの機能を阻害することができ、腹膜播種を治療可能な、腺癌に対する抗癌剤の提供。
【解決手段】Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有することを特徴とする樹状細胞、及び該樹状細胞を含有することを特徴とし、ＶＥＧＦの産生を抑制し、腫瘍を縮小させ、癌による体重増加、及び腹水の産生を抑制することができ、更に腹膜播種モデルマウスの生存率を高め、生存日数を延長させることが可能な抗癌剤である。
【解決手段】Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有することを特徴とする樹状細胞、及び該樹状細胞を含有することを特徴とし、ＶＥＧＦの産生を抑制し、腫瘍を縮小させ、癌による体重増加、及び腹水の産生を抑制することができ、更に腹膜播種モデルマウスの生存率を高め、生存日数を延長させることが可能な抗癌剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有する樹状細胞、及び該樹状細胞を含有する抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍に対する免疫療法の歴史は古く、ＯＫ−４３２などの菌体成分やワクチンウイルスなどを用いた臨床試験が行われている。
しかし、これらの免疫療法は、腫瘍を縮小させる効果（奏功率）が低く、更に非特異的な炎症反応による巻き込み現象を期待したものであるため特異性も低い点で問題である。
【０００３】
生体内における抗原特異的免疫応答のメカニズムとして、抗原提示細胞による免疫応答が挙げられる。抗原提示細胞の１種である樹状細胞は、未成熟樹状細胞が抗原を貪食することにより活性化され、樹状突起を有する成熟樹状細胞となり、リンパ器官に遊走する。前記成熟樹状細胞は、リンパ器官において貪食した抗原に特異的なＴ細胞やＢ細胞を活性化するため、免疫応答に非常に重要な細胞である。
【０００４】
このような機構を利用して、１９９０年代半ば頃より、腫瘍抗原をパルスした樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（ＤＣ））を用いた腫瘍特異的免疫療法に関する臨床研究成果が発表（非特許文献１〜２参照）され、前記腫瘍特異的免疫療法が腫瘍を縮小させる効果を示すことが明らかになりつつある。
しかし、樹状細胞による腫瘍特異的免疫療法の臨床成績は満足できるものではなく（非特許文献３参照）、新たな治療法の開発、及び確立が強く望まれている。
【０００５】
近年、腫瘍特異的免疫療法に、組換えセンダイウイルスベクター（組換えＳｅＶベクター）により活性化した樹上細胞を利用する試みが行われた。組換えＳｅＶベクターを生体へ投与すると一連の免疫反応が惹起される。組換えＳｅＶベクターが導入された樹状細胞は、樹状突起を伸ばし、強力に活性化された状態となる（特許文献４参照）。また、組換えＳｅＶベクターが導入された樹状細胞は、担癌マウスモデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示すことが知られている（非特許文献５〜６参照）。
【０００６】
しかしながら、組換えＳｅＶベクターが導入された樹状細胞を用いた癌治療は、我が国において最も発生頻度の高い腺癌（胃癌、大腸癌など）に対する治療においては、有効であるか否かは明らかとなっていない点で問題である。特に、腹膜播種をきたしやすい難治性消化器癌、及び女性器癌に対して新しい治療法の開発が望まれているのが現状である。
【０００７】
腹膜播種は、各種消化器癌、及び女性器癌に認められる癌の症状が進行した病態の１つである。具体的には、癌細胞が、腹腔内に転移し、増殖し、多量の腹水を伴った病態を呈する。また腹膜播種をきたした癌は、癌細胞の完全切除が難しく、既存の治療法では対処できないため、完治させることが困難な点で問題である。
【０００８】
癌の進行は、血管新生により促進されることが知られている。即ち、血管新生は、腫瘍細胞塊へ酸素や栄養を供給することで腫瘍細胞を増加させる。更に、血管新生により血管内に腫瘍細胞が侵入し、転移を促す。
このような、血管新生を誘導する血管新生因子の１つとして、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）が知られている。前記ＶＥＧＦは、血管新生を誘導するだけでなく、腹水の産生促進、血管透過性の亢進、更には前述した樹状細胞の免疫機能の抑制などの機能も有することが知られている。
【０００９】
したがって、特異的な免疫応答による強力な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦの機能を阻害することができ、腹膜播種を治療可能な、腺癌に対する抗癌剤の開発が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００５／４２７３７号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｎｅｓｔｌｅ ＦＯ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９８， ４（３）， ｐ．３２８−３２
【非特許文献２】Ｏ’ Ｎｅｉｌｌ ＤＷ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ， ２００４， １０４（８）， ｐ．２２３５−２２４６
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９８， ４， ｐ．３２８−３３２
【非特許文献４】Ｈｓｕ ＦＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９６， ２（１）， ｐ．５２−８
【非特許文献５】Ｓｈｉｂａｔａ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００６， １７７（６）， ｐ．３５６４−３５７６
【非特許文献６】Ｙｏｎｅｙａｍａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ２００７， ３５５， ｐ．１２９−１３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、特異的な免疫応答による強力な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦの機能を阻害することができ、腹膜播種を治療可能な、腺癌に対する抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、Ｆｌｔ−１遺伝子を導入した組換えセンダイウイルスベクターが樹状細胞を活性化すること、該組換えセンダイウイルスベクターを含有する樹状細胞がＦＬＴ−１タンパク質の産生量を増加させ、ＶＥＧＦタンパク質の産生を抑制すること、該樹状細胞を投与した腹膜播種モデルマウスにおいて、腫瘍の縮小、体重増加の抑制、及び腹水産生の抑制が認められること、更に該樹状細胞を投与した腹膜播種モデルマウスは生存率が高く、生存日数が延長されることを知見し、本発明の完成に至った。
【００１４】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有することを特徴とする樹状細胞である。
＜２＞ 組換えパラミクソウイルスベクターが、組換えセンダイウイルスベクターである前記＜１＞に記載の樹状細胞である。
＜３＞ Ｆｌｔ−１遺伝子が、配列番号：１で表される遺伝子を有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の樹状細胞である。
＜４＞ Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターにより活性化される前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の樹状細胞である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の樹状細胞を含有することを特徴とする抗癌剤である。
＜６＞ 腺癌治療用である前記＜５＞に記載の抗癌剤である。
＜７＞ 腺癌が、消化器癌、及び女性器癌の少なくともいずれかである前記＜５＞から＜６＞にいずれかに記載の抗癌剤である。
＜８＞ 腹水産生を抑制する前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の抗癌剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、特異的な免疫応答による強力な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦの機能を阻害することができ、腹膜播種を治療可能な、腺癌に対する抗癌剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、及び未処理ＤＣのＣＤ４０（活性化した樹状細胞のマーカー）の発現を、フローサイトメーターで測定した結果を表す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、及び未処理ＤＣのＣＤ８３（活性化した樹状細胞のマーカー）の発現を、フローサイトメーターで測定した結果を表す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、未処理ＤＣ、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ＣＴ２６のｍＶＥＧＦタンパク質の発現量を表す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、未処理ＤＣ、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ＣＴ２６のｈＦＬＴ−１タンパク質の発現量を表す図である。
【図３】図３は、正常マウス、及びＣＴ２６投与後２１日目の腹膜播種モデルマウスの全体像を表す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、正常マウス、及び腹膜播種モデルマウスの、循環血漿中、及び腹水中におけるｍＶＥＧＦタンパク質の発現量を表す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、正常マウス、及び腹膜播種モデルマウスの、循環血漿中、及び腹水中におけるｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、腹膜播種モデルマウスへのＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ又はＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の投与後２１日目、及び３５日目の腹膜播種モデルマウスの全体像を表す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、腹膜播種モデルマウスへのＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の投与後２１日目の腸管の全体像を表す図である。
【図６】図６は、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ＬＰＳのいずれかを週１回３週間投与した腹膜播種モデルマウスの寿命曲線を表す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰを投与した腹膜播種モデルマウスの寿命曲線を表す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を投与した腹膜播種モデルマウスの寿命曲線を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（樹状細胞）
本発明の樹状細胞は、Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００１８】
＜組換えパラミクソウイルスベクター＞
前記組換えパラミクソウイルスベクターは、前記Ｆｌｔ−１遺伝子が導入されたウイルスベクターである（「組換えパラミクソウイルスベクター遺伝子」と称することがある。）。
【００１９】
−Ｆｌｔ−１遺伝子−
前記Ｆｌｔ−１遺伝子は、可溶性のタンパク質であるヒトの血管内皮細胞増殖因子（ｈＶＥＧＦ）の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり、ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１と呼ばれることもある（以下、「ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）。
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子の塩基配列としては、配列番号：１で表される塩基配列が好ましいが、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる塩基配列であってもよく、配列番号：１で表される塩基配列に、更にその他の塩基配列が付加された塩基配列であってもよい。
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子の塩基配列が、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる場合、その一部の塩基配列としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の塩基配列としても、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子の塩基配列は、配列番号：１で表される塩基配列に、１若しくは数個の塩基が、欠失、置換、挿入された塩基配列からなるものであってもよい。
【００２０】
−−入手方法−−
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーより入手する方法、市販品より入手する方法、ヒトなどの各種動物細胞より調製して入手する方法、合成により入手する方法などが挙げられる。
前記ｈＦＬＴ−１タンパク質を入手する方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を所望の発現ベクターに組み込み常法を用いて発現させる方法、市販品より入手する方法、ヒトなどの各種動物細胞より調製して入手する方法、合成により入手する方法、などが挙げられる。
【００２１】
−−パラミクソウイルスベクター−−
パラミクソウイルスベクターは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスに由来するウイルスベクターである。
このベクターは、ゲノムに１本鎖ＲＮＡを有し、細胞質内で遺伝子を発現するため、染色体と相互作用せず、遺伝毒性のない安全なベクターである。また、標的細胞への高い遺伝子導入効率、及び発現効率を示す。
前記パラミクソウイルスベクターは、ウイルスベクターの一種であるため、標的細胞への遺伝子導入の際、高い遺伝子導入効率が得られる点で有利である。
前記パラミクソウイルス科のウイルスとしては、例えば、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型などが挙げられる。
前記パラミクソウイルスベクターの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記センダイウイルス由来のウイルスベクターが、毒性が低い点、導入遺伝子の発現効率が高い点、導入遺伝子の宿主染色体への組み込みが行われず安全性に優れる点で好ましい。
【００２２】
−−センダイウイルスベクター−−
前記センダイウイルスベクター（以下、「ＳｅＶベクター」、「ＳｅＶベクター遺伝子」と称することがある。）は、センダイウイルスに由来するベクターであり、所望の遺伝子を標的細胞である前記樹状細胞に導入することが可能な運搬体である。
【００２３】
前記ＳｅＶベクターの塩基配列としては、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を導入した際、前記樹状細胞でｈＦｌｔ−１遺伝子を発現することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、欠陥干渉粒子（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＤＩ粒子）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ， １９９４， ６８， ｐ．８４１３−８４１７参照）などの不完全ウイルスをコードする塩基配列を有するＳｅＶベクター、Ｆ遺伝子を有するＳｅＶベクター、Ｆ遺伝子を欠失しているＳｅＶベクター、温度感受性の遺伝子を有するＳｅＶベクターなどが挙げられる。
これらの中でも、Ｆ遺伝子を欠失しているＳｅＶベクターが、伝播力を欠如している点で好ましく、配列番号：２で表される塩基配列が特に好ましい。
【００２４】
前記ＳｅＶベクターの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、遺伝子の形態であってもよく、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態であってもよく、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であってもよく、感染力を有するウイルス粒子の形態であってもよい。
前記感染力とは、細胞への接着能、及び膜融合能の少なくともいずれかによって、センダイウイルス粒子が保持する核酸などを細胞内へ導入することができる能力をいう。
【００２５】
また、前記ＳｅＶベクターは、本発明の効果を損なわない限り、その他の成分を含む組成物の形態であってもよい。
前記ＳｅＶベクター中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脱イオン水、超純水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、５質量％デキストロース水溶液、生体適合性のポリオルなどが挙げられる。
前記生体適合性のポリオルとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７などが挙げられる。前記組成物が、前記ポリオルを含むと、前記ＳｅＶベクターの導入率を１０倍〜１００倍に上昇させることができる点で好ましい（Ｍａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １９９５， ６， ｐ．４１−５３参照）。
なお、前記ポリオルは、前記組成物に含まれていてもよく、前記ＳｅＶベクターと前記ポリオルとを別々に調製し、前記ＳｅＶベクターを前記樹状細胞へ導入する際、同時に導入してもよい。
【００２６】
また、前記ＳｅＶベクターは、前記感染力を有している一方で伝播力を欠如していることが好ましい。
センダイウイルスの天然型の遺伝子は、３’末端の短いリーダー領域、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）遺伝子、リン酸化タンパク質（Ｐ）遺伝子、マトリクスタンパク質（Ｍ）遺伝子、フュージョンタンパク質（Ｆ）遺伝子、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子、ラージタンパク質（Ｌ）遺伝子、及び５’末端の短いトレイラー領域を、前記した順序で有する。
前記伝播力を欠如させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、及びＭ遺伝子の少なくともいずれかを欠失させておくことが好ましく、前記Ｆ遺伝子を欠失させることが特に好ましい。
前記伝播力を欠如させたＳｅＶベクター遺伝子（ｃＤＮＡ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｆ遺伝子が欠失したセンダイウイルスＺ株由来のＳｅＶベクター遺伝子、ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）（Ｙｕ Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ， １９９７， ２， ｐ．４５７−４６６参照）、ｐＳｅＶ（＋）（Ｋａｔｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９７， １６， ｐ．５７８−５８７参照）などが挙げられる。
【００２７】
−−入手方法−−
前記パラミクソウイルスベクターを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラミクソウイルス科に属するウイルスより調製して入手する方法、市販品より入手する方法、合成により入手する方法などが挙げられる。
【００２８】
−含有量−
前記樹状細胞中の、前記組換えパラミクソウイルスベクターの含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
＜その他の成分＞
前記樹状細胞中の前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記樹状細胞を所望の濃度に希釈するための水、生理食塩水、各種緩衝液などが挙げられる。
前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
＜製造方法＞
前記樹状細胞の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＳｅＶベクターに前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を導入した組換えＳｅＶベクター（以下、「ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）を作製し、該ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１から組換えセンダイウイルス（以下、「ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）を作製し、該ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を前記樹状細胞へ感染させることで、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１を含有する樹状細胞を製造する方法などが挙げられる。
【００３１】
−組換えＳｅＶベクター（ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１）の作製−
−−ｈＦｌｔ−１遺伝子の調製−−
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリー鋳型としてＰＣＲ法を行い、ｃＤＮＡを合成する方法などが挙げられる。
前記ＰＣＲ法に用いる酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造（株）製）、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）などが挙げられるが、これらの中でも、Ｖｅｎｔポリメラーゼが好ましい。
【００３２】
前記ＰＣＲ法に用いるフォワード側プライマー配列を設計する前記Ｆｌｔ−１遺伝子の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、フォワード側のプライマー配列には、前記Ｆｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡの５’末端から２５塩基近傍までを含むように選択することが好ましい。
前記フォワード側のプライマー配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５’末端に「ＡＣＴＴ」を含み、その３’末端側に「ＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ認識部位）」を付加し、更にその３’末端側にスペーサー配列として任意の９塩基又は該９塩基に６の倍数の塩基数を有する任意の塩基を付加した配列が特に好ましく、前記スペーサー配列の３’末端側に前記Ｆｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡの開始コドン（ＡＴＧ）を含めた前記Ｆｌｔ−１遺伝子のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅｄｅｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の２５塩基相当の配列を付加することが更に好ましい。
【００３３】
前記ＰＣＲ法に用いるリバース側プライマー配列を設計する前記Ｆｌｔ−１遺伝子の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記リバース側のプライマー配列には、前記Ｆｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡの３’末端から２５塩基近傍を含むように選択することが好ましい。
前記リバース側のプライマー配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５’末端に「ＡＣＴＴ」を含み、その３’末端側に「ＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ認識部位）」を付加し、更にその３’末端側に、ＳｅＶウイルスベクターのＳ配列の相補鎖配列（５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’）、Ｉ配列の相補鎖配列（５’−ＡＡＧ−３’）、及びＥ配列の相補鎖配列（５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’）を連続して（ＥＩＳ配列の相補的配列を）含ませることが好ましく、前記ＥＩＳ配列の相補的配列の３’末端側に前記Ｆｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡの終止コドン（ＴＧＡ）を含めたＦｌｔ−１遺伝子のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅｄｅｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の２５塩基相当の配列を付加することが更に好ましい。
前記フォワード側のプライマー配列と、前記リバース側とのプライマー配列とを用いて、前記Ｆｌｔ−１遺伝子をＰＣＲ法にて増幅した後、前記フォワード側のプライマー配列に含まれるＮｏｔＩ認識部位から、前記リバース側のプライマー配列に含まれるＮｏｔＩ認識部位までの塩基数の合計が６の倍数になるように設計することが好ましい（いわゆる「６のルール」、Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， １９９８， ７２， ｐ．８９１−８９９、及びＣａｌａｉｎ Ｐ， ａｎｄ Ｒｏｕｘ． Ｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， １９９３， ６７， ｐ．４８２２−４８３０参照）。
【００３４】
前記ｃＤＮＡは、所望のベクター、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（インビトロジェン（株）製）などに導入し、シーケンサーにより塩基配列を確認することが好ましい。
【００３５】
−−ｈＦｌｔ−１遺伝子のＳｅＶベクターへの導入−−
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を前記ＳｅＶベクターに導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡを導入したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと、前記ＳｅＶベクターとを所望の制限酵素で消化し、常法によりライゲーションすることにより導入する方法、前記ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに導入していないｈＦｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡを直接前記ＳｅＶベクターへ導入する方法などが挙げられる。
このようにして導入した、ｈＦｌｔ−１遺伝子を有する組換えセンダイウイルスベクター（以下、「ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）の塩基配列としては、前記樹状細胞でｈＦｌｔ−１遺伝子を発現することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：３で表される塩基配列が特に好ましい。
なお、前記配列番号：３で表される塩基配列は、Ｆ遺伝子を欠失しているＳｅＶベクターに前記ｈＦｌｔ−１遺伝子が導入されており、伝播力を欠如している点で好ましい。
【００３６】
−−組換えＳｅＶウイルス（ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１）の作製−−
上記のようにして作製したｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１より、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を作製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、試験管内又は培養細胞内で転写させる方法など、公知の方法を用いることができる（例えば、国際公開第９７／１６５３８号パンフレット、及び国際公開第９７／１６５３９号パンフレット参照）。
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１は、後述する樹状細胞への導入にそのまま用いてもよいが、増幅させてから用いることが、ウイルス力価が高く、効率良く樹状細胞へ導入できる点で好ましい。
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１がＦ遺伝子を欠失していない場合、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を増殖する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を培養細胞に接種し、数時間後、培養上清を回収することで前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を回収し、該回収したｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を、更に培養細胞へ接種し、同様の操作を数回繰り返して増幅する方法などが挙げられる。
前記ウイルス力価を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エンドポイント（ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ）希釈法（Ｋａｔｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ， １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）などが挙げられる。
【００３７】
前記培養細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＬＬＣＭＫ２細胞、ヒト由来の細胞、サル腎臓由来のＣＶ−１細胞、ハムスター腎臓由来のＢＨＫ細胞などが挙げられる。なお、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１がＦ遺伝子を欠失している場合は、前記培養細胞は、Ｆタンパク質を高発現しているパッケージング細胞が好ましい。
前記培養細胞内で転写させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１を所望の培養細胞にトランスフェクションする方法などが挙げられる。
なお、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１は、そのエンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるように、接着因子、リガンド、受容体などが結合していてもよい。
【００３８】
−−保存−−
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の保存方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、−８０℃で保存する方法が、ウイルス力価を維持できる点で好ましい。
【００３９】
−樹状細胞の調製−
前記樹状細胞を調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、造血前駆細胞を採取し、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ）、幹細胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ：ＳＣＦ）、ＩＬ−３、及びＩＬ−６（ＦＳ３６）を含む１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（例えば、インビトロジェン（株）製）で培養後、ＧＭ−ＳＣＦ、及びＩＬ−４を含む１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０で培養する方法などが挙げられる。前記培地で培養することにより、前記造血前駆細胞は、樹状細胞へと分化する。
前記造血前駆細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒト由来の造血前駆細胞が、前記樹状細胞をヒトに用いる場合、抗原性が少ない点で好ましい。
【００４０】
−樹状細胞へのｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１の導入−
前述のように調製した樹状細胞へ、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１を導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記樹状細胞に、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を感染させる方法などが挙げられる。
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、樹状細胞の培養培地に前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を添加する方法などが挙げられる。
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１が前記樹状細胞に感染したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
−−樹状細胞の活性化の確認−−
前記樹状細胞が、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１の導入により活性化したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、樹状細胞のマーカーの発現により確認する方法などが挙げられる。
前記樹状細胞のマーカーは、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲなどが挙げられる。
前記マーカーを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫学的測定法により確認する方法などが挙げられる。
前記免疫学的測定法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫染色法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメーターで検出する方法などが挙げられる。
【００４２】
−−ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によるＦｌｔ−１遺伝子の発現の確認−−
前記樹状細胞において、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によりＦｌｔ−１遺伝子が発現しているか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、免疫学的測定法などが挙げられる。
前記免疫学的測定法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫染色法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
【００４３】
＜用途＞
本発明の樹状細胞は、ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によりｈＦｌｔ−１遺伝子を発現しているため、ＶＥＧＦタンパク質の機能を阻害し、血管新生、及び血管透過性を抑制でき、かつ、ＶＥＧＦタンパク質による樹状細胞の免疫機能の抑制を阻害できることから、後述する抗癌剤へ好適に利用可能である。
【００４４】
（抗癌剤）
本発明の抗癌剤は、前述の樹状細胞を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００４５】
前記抗癌剤の標的となる癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、腺癌であることが、我が国において最も発生頻度が高い癌を治療できる点で好ましい。
前記腺癌とは、上皮性の悪性腫瘍の一種であり、胃、腸、子宮体部、肺、乳房、卵巣、前立腺、甲状腺、肝臓、腎臓、膵臓、及び胆嚢などに発生する癌である。
前記抗癌剤は、これらの癌の中でも、腹膜播種をきたしやすい胃癌や大腸癌などの各種消化器癌、子宮癌などの女性器癌などを治療できることが好ましい。前記消化器癌や女性器癌は、多量の腹水を伴う症状を呈する。
前記腹水とは、正常な状態でごく少量の液体である腹腔内の液体が、血漿タンパク質の減少による膠質浸透圧の低下、門脈圧亢進、腹膜炎、悪性腫瘍の腹膜播種、肝癌の破裂などの原因により、多量に濾出、及び滲出し、腹腔内に異常に多量の液体が貯留した状態乃至その液体をいう。腹水が貯留すると、体重増加、腹部膨隆、尿量減少が認められる。
前記抗癌剤は、このような腹水の産生を抑制できる点で有利である。
【００４６】
＜樹状細胞＞
前記抗癌剤中の樹状細胞は、前述したｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１を含有する樹状細胞であることが好ましい。
前記抗癌剤中の、前記樹状細胞の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗癌剤は、前記樹状細胞そのものであってもよい。
【００４７】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプン、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤などが挙げられる。
前記安定剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルブミン、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）（ペンタファームジャパン（株）製）などが挙げられる。
前記抗癌剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４８】
＜使用＞
前記抗癌剤は、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記抗癌剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００４９】
＜剤型＞
前記抗癌剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００５０】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記樹状細胞に、必要に応じて、前記その他の成分、賦形剤、各種添加剤などを加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００５１】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記樹状細胞に、必要に応じて、前記その他の成分、添加剤などを加えることにより製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００５２】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記樹状細胞に、必要に応じて、前記その他の成分、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００５３】
＜投与＞
前記抗癌剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、直腸内投与、静脈内投与、皮下投与、経皮投与などの全身投与法、皮膚上投与、吸入投与、注腸投与、点眼、点耳、経鼻投与、膣内投与などの局所投与法などが挙げられるが、局所投与法が、前記抗癌剤が効率的に送達でき、かつ副作用を低減できる点で好ましい。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、既に腺癌を発症した後に使用しもよく、前記腺癌と診断される前に使用してもよい。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００５４】
＜用途＞
前記抗癌剤は、腹水中のＶＥＧＦの機能を阻害し、かつ腹水の産生を抑制することができることから、消化器癌、女性器癌などの腺癌の予防乃至治療に好適に用いることができる。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１：組換えＳｅＶベクターを含む樹状細胞）
【００５７】
＜組換えＳｅＶベクター（ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１）の作製＞
−ｈＦｌｔ−１遺伝子の調製−
ヒト由来可溶性Ｆｌｔ−１（ｈＦｌｔ−１）のｃＤＮＡは、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）を用いてＰＣＲ法により調製した。ＰＣＲ法に用いたプライマーは、フォワードプライマーとして下記配列番号：４で表される塩基配列、リバースプライマーとして下記配列番号：５で表される塩基配列を用いた。前記プライマー配列は、３’末端側にＮｏｔＩ認識部位（ＧＣＧＧＣＣ）を含むように設計した。
なお、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子中に含まれるＮｏｔＩ認識部位は、予め除去した。
【００５８】
プライマー配列
５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＴ−３’ （配列番号：４）
５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＡＣＡＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＣ−３’ （配列番号：５）
【００５９】
ＰＣＲ法により得られたｈＦｌｔ−１のｃＤＮＡをＮｏｔＩで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（インビトロジェン（株）製）のＮｏｔＩ部位に挿入し（以下、「ｐＢＳ−ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）、クローニングを行った。
ｐＢＳ−ｈＦｌｔ−１のクローンをシーケンサー（アプライドバイオシステムズ（株）製）で分析し、ｈＦｌｔ−１の塩基配列を解析したところ、配列番号：１で表される塩基配列を有することが確認された。
【００６０】
−ｈＦｌｔ−１遺伝子のＳｅＶベクターへの導入−
ｐＢＳ−ｈＦｌｔ−１をＮｏｔＩで切断して切り出したｈＦｌｔ−１を、Ｆ遺伝子を欠失させ、伝播力を欠如した配列番号：２で表される塩基配列を有するセンダイウイルスベクター（「センダイウイルスベクター遺伝子（ｃＤＮＡ）」と称することがある。）のＮｏｔＩ部位に挿入後、クローニングを行い、ｈＦｌｔ−１遺伝子を有する組換えセンダイウイルスベクター（配列番号：３）（以下、「ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）を得た。
また、比較対照としては、配列番号：２で表される塩基配列を有するベクターの塩基番号７２６７と、塩基番号７２６８との間にＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ５７６０９．１）を導入したベクター（以下、「ｐＳｅＶ／ＧＦＰ」と称することがある。）を用いた。
なお、前記配列番号：２で表される塩基配列を有するセンダイウイルスベクターは、Ｂａｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ．, Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２００７， １４（２４）， ｐ．１６８８−１６９４を参照して作製した。
【００６１】
＜ウイルスの産生＞
−サル腎臓由来細胞株ＬＬＣＭＫ２の培養−
サル腎臓由来細胞株ＬＬＣＭＫ２（ＡＴＣＣ社製）を６穴プラスチックプレートに播種し、１０質量％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（インビトロジェン（株）製）、及び抗生物質（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）（インビトロジェン（株）製）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）（インビトロジェン（株）製）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７０％〜８０％コンフルエント（約１×１０６細胞／穴）になるまで培養した。
【００６２】
−ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１、及びｐＳｅＶ／ＧＦＰの導入−
前記ＬＬＣＭＫ２に、Ｔ７ポリメラーゼを発現するＵＶ照射により不活化した組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ ＴＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９８６， ８３， ｐ．８１２２−８１２６参照）を、２の感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で感染させた。
ｖＴＦ７−３の感染１時間後、１μｇのｐＧＥＭ−Ｎ（Ｋａｔｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）、０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ（Ｋａｔｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）、及び１μｇのｐＧＥＭ−Ｐ（Ｋａｔｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）と共に、３μｇの前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１又は３μｇの前記ｐＳｅＶ／ＧＦＰを、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、製造元の方法に従ってトランスフェクションした。
なお、前記ｐＧＥＭ−Ｎ（ヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子）、前記ｐＧＥＭ−Ｐ（リン酸化タンパク質）、及び前記ｐＧＥＭ−Ｌ（ラージタンパク質遺伝子）は、全長センダイウイルスゲノムの再構成に必須な、トランスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミドである。
【００６３】
ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１又はｐＳｅＶ／ＧＦＰをトランスフェクションしたＬＬＣＭＫ２は、１００μｇ／ｍＬのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ社製）、及び４０μｇ／ｍＬのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＭＥＭ（血清非添加）で４８時間培養した。次いで、前記ＬＬＣＭＫ２を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕することにより、ｈＦｌｔ−１遺伝子を含む組換えセンダイウイルス（以下、「ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）、及び比較対照としてのセンダイウイルス（以下、「ｒＳｅＶ／ＧＦＰ」と称することがある。）を得た。
なお、ｖＴＦ７−３は、前記ＡｒａＣを含むＭＥＭ培地で除去できる。
【００６４】
−ウイルスの増幅−
ＬＬＣＭＫ２を２２５ｃｍ２フラスコに播種し、１０質量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、及びペニシリンストレプトマイシン（ナカライテスク（株）製）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でコンフルエント（３×１０７細胞／フラスコ）になるまで培養した。
このＬＬＣＭＫ２に、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを、０．５の感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で接種し、３５．５℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間放置することにより増幅した。１時間後、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを含む上清を除去し、０．０００３質量％トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製）、及びペニシリンストレプトマイシン（ナカライテスク（株）製）を含むＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）（以下、「Ｔｒｙｐｓｉｎ／Ｐ／Ｓ含有ＭＥＭ」と称することがある。）を添加し、３５．５℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。２４時間ごとに新鮮なＴｒｙｐｓｉｎ／Ｐ／Ｓ含有ＭＥＭに培地交換しながら３日間培養した。
３日後の培養上清を回収し、濃縮し、赤血球凝集活性（ＨＡ）測定することにより、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びｒＳｅＶ／ＧＦＰの力価を測定した。結果を下記表１に示す。
前記ＨＡは、エンドポイント（ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ）希釈法（Ｋａｔｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ， １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）により決定した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
＜樹状細胞への導入＞
−樹状細胞の調製−
樹状細胞の調製は、国際公開第２００８／１４３０４７号パンフレットに記載の方法で行った。即ち、８週齢のＢｕｌｂ／ｃマウス（ＫＢＴオリエンタル社製）の骨髄細胞をＳｐｉｎＳｅｐ（登録商標） Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｐｒｅ−Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で採取した。採取した骨髄細胞には造血系前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）が含まれている。この造血系前駆細胞を、Ｆｌｔ−３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、幹細胞因子（ＳＣＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、及びＩＬ−６（ＦＳ３６）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含む１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン（株）製）（以下、「ＦＳ３６添加培地」と称することがある。）で２１日間培養した。次いで、ＦＳ３６培地を、ＧＭ−ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、及びＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含む１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（以下、「ＧＭＩＬ−４添加培地」と称することがある。）に交換し、更に７日間培養することにより、成熟樹状細胞（ＤＣ）を得た。
【００６７】
−導入−
前述のようにして増幅したｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを、それぞれ５０の感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で添加した１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０にて、前述のようにして調製した成熟樹状細胞（ＤＣ）を８時間又は４８時間培養し、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを感染させることにより、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを成熟樹状細胞（ＤＣ）に導入した。次いで、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを導入した成熟樹状細胞（ＤＣ）を、それぞれピペッティングすることにより回収し、ＰＢＳ（インビトロジェン（株）製）で洗浄し、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を導入した樹状細胞（以下、「ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）、及びｒＳｅＶ／ＧＦＰを導入した樹状細胞（以下、「ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ」と称することがある。）を得た。
また、ポジティブコントロールとしてはＬＰＳで刺激した樹状細胞を用いた。即ち、１０質量％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ（インビトロジェン（株）製）に１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（カタログＮＯ．Ｌ７８９５−１ＭＧ、Ｓｉｇｍａ社製）を添加した培地で、前述のように調製した成熟樹状細胞（ＤＣ）を８時間又は４８時間培養後、前述の方法と同様にして回収、洗浄することにより、ＬＰＳ刺激した成熟樹状細胞（以下、「ＤＣ／ＬＰＳ」と称することがある。）を得た。
なお、４８時間培養した樹状細胞は、後述する樹状細胞の活性化の確認、及びｈＦｌｔ−１発現の確認に、８時間培養した樹状細胞は、後述する腹水播種モデルマウスへの投与に用いた。
【００６８】
（試験例１：ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１による樹状細胞の活性化の確認）
ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びｒＳｅＶ／ＧＦＰの導入により、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰが活性化しているか否かを確認するため、活性化樹状細胞のマーカーであるＣＤ４０、及びＣＤ８３の発現を確認した。
【００６９】
＜方法＞
樹状細胞のみを解析するため、実施例１の４８時間培養したＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ＬＰＳ、及び未処理の樹状細胞（以下「未処理ＤＣ」と称することがある。）について、ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、及びＨ−２Ｋｄ（ＭＨＣクラスＩ）−ＦＩＴＣでターゲティングを行った。次いで、ＰＥ標識抗マウスＣＤ４０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、及びＰＥ標識抗マウスＣＤ８３抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用い、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で解析し、ＣＤ４０陽性細胞、及びＣＤ８３陽性細胞の割合を調べた。なお、死細胞の選別には、ＰＩ染色（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製）を用いた。
【００７０】
＜結果＞
フローサイトメーターの結果を、下記表２に示す。下記表２中、「ＭＦＩ」は、平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。
また、ＣＤ４０陽性細胞を示すヒストグラムを図１Ａに、ＣＤ８３陽性細胞を示すヒストグラムを図１Ｂに示す。
【００７１】
【表２】
表２、及び図１Ａ〜Ｂの結果より、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰは、未処理ＤＣと比較して、いずれも活性化していることが認められた。また、その活性化の強度は、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰと比較してＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の方が強かった。
【００７２】
（試験例２：ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１によるｈＦＬＴ−１タンパク質発現の確認）
ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を導入することにより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１でｈＦＬＴ−１タンパク質が産生されているか否かについて、確認を行った。
【００７３】
＜方法＞
１×１０５個／ｍＬのマウス大腸癌細胞株ＣＴ２６（ｃｏｌｏｎ２６）（九州大学大学院 病理病態学より供与）を添加した１０質量％ＦＢＳを含むＩＭＤＭで成熟樹状細胞（ＤＣ）を４８時間培養し、ＣＴ２６を感染させた樹状細胞（以下、「ＤＣ／ＣＴ２６」と称することがある。）を得た。
ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、及びＤＣ／ＬＰＳは、実施例１の４８時間培養した細胞を用いた。また、コントロールとしては、未処理ＤＣを用いた。
４８時間培養後のＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ＣＴ２６、及び未処理ＤＣを回収し、ＲＰＭＩ１６４０に１×１０６細胞／ｍＬとなるように希釈し、更に２４時間培養した。
２４時間培養後の培養上清を回収し、培養上清中のマウスＶＥＧＦ（ｍＶＥＧＦ）タンパク質の発現量、及びｈＦＬＴ−１タンパク質の発現量を、マウスＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット、及びマウスＦｌｔ−１ ＥＬＩＳＡキット（共に、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、製造元の方法に従い測定した。
【００７４】
＜結果＞
結果を下記表３に示す。また、図２ＡにｍＶＥＧＦタンパク質の発現量を、図２ＢにｈＦＬＴ−１タンパク質の発現量を示す。
【００７５】
【表３】
これらの結果より、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１では、ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によりｈＦＬＴ−１タンパク質が過剰発現していることが確認された。更に、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１では、ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によりｍＶＥＧＦタンパク質の発現が抑制されていることが認められた。
【００７６】
（実施例２：腹膜播種モデルマウスへの抗腫瘍効果）
＜腹膜播種モデルマウスの作製＞
−順化−
試験動物として、８週齢のＢｕｌｂ／ｃマウス（ＫＢＴオリエンタル社製）を使用した。前記マウスが到着後、一般的な健康状態について評価し、試験前に３日間順化した。
【００７７】
−飼育−
前記マウスは、順化の間は集団で収容し、その後生存中は米国国家研究会議のガイドライン「試験動物の管理と使用に関する指針」に従い、個体ごとに収容した。
動物室の環境は、温度２４℃、相対湿度５０％、昼夜それぞれ１２時間となるように制御し、温度、及び相対湿度は毎日測定した。給餌は、全ての試験動物に自由給餌で与えた。
【００７８】
−マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６の投与−
順化したＢｕｌｂ／ｃマウスに、マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６を１×１０５個／個体を腹腔内投与することにより、腹膜播種モデルマウスを作製した。
【００７９】
＜腹膜播種モデルマウスの病態の検討＞
−方法−
ＣＴ２６投与後２１日目の腹膜播種モデルマウス、及び正常Ｂｕｌｂ／ｃマウスより、循環血液、及び腹水を採取した。採取した循環血液は、２，０００×ｇで２０分間遠心することにより、循環血漿を分離した。この循環血漿、及び腹水中のｍＶＥＧＦタンパク質、及びマウスＦＬＴ−１（ｍＦＬＴ−１）のタンパク質の発現量をマウスＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット、及びマウスＦｌｔ−１ ＥＬＩＳＡキット（共に、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、製造元の方法に従い測定した。なお、正常マウスには腹水が存在しなかったため、正常マウスの腹水については測定しなかった。
図３にＣＴ２６投与後２１日目の腹膜播種モデルマウスの全体像、及び正常Ｂｕｌｂ／ｃマウスの全体像を示す。
【００８０】
−結果−
結果を下記表４に示す。また、図４Ａに腹膜播種モデルマウスの循環血漿中、及び腹水中のｍＶＥＧＦタンパク質の発現量を、図４Ｂに腹膜播種モデルマウスの循環血漿中、及び腹水中のｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量を示す。
【００８１】
【表４】
これらの結果より、腹膜播種モデルでは、正常マウスと比較して、循環血漿中のｍＶＥＧＦタンパク質、及びｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量が増加していることが認められた。
また、腹膜播種モデルマウスの循環血漿中ではｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量の方がｍＶＥＧＦタンパク質の発現量より多かったのに対し、腹水中ではｍＶＥＧＦタンパク質の発現量の方がｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量より多く、腹水中ではｍＦＬＴ−１タンパク質とＶＥＧＦタンパク質とのバランスが変化し、ｍＶＥＧＦタンパク質の発現が有利な環境となっていることが示唆された。
【００８２】
＜樹状細胞（ＤＣ）の抗癌作用の検討＞
前述したような病態を有する腹膜播種モデルマウスを用い、実施例１で作製したＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の抗癌作用について検討を行った。
【００８３】
−投与−
０日目に、１×１０５個／個体のＣＴ２６と、１×１０６細胞／個体のＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１（実施例１で８時間培養した細胞）、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ（実施例１で８時間培養した細胞）、ＤＣ／ＬＰＳ（実施例１で８時間培養した細胞）、及びＰＢＳのいずれかとを同時に投与した。ここでの「コントロールのマウス」とは、結果的には、１×１０５個のＣＴ２６及びＰＢＳのみが投与されたマウスをいう。なお、前記「同時に投与」とは、ＣＴ２６投与後、５分間以内にＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰＤＣ／ＬＰＳ、及びＰＢＳのいずれかを投与することをいう。
以下、コントロールのマウスを「未投与群」、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を投与したマウスを「ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群」、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰを投与したマウスを「ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群」、ＤＣ／ＬＰＳを投与したマウスを「ＤＣ／ＬＰＳ群」、と称することがある。
各投与群について、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ＬＰＳ、及びＰＢＳのいずれかを、更に週１回３週間投与した群、週２回３週間投与した群、週１回６週間投与した群に分け、それぞれの生存日数を観察した。投与スケジュールを下記表５に示す。
また、週１回６週間投与した群は、平均体重も測定した。週１回６週間投与した群の投与後２８日目の平均体重、及び生存日数を、下記表６に示す。
なお、各投与群について、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ＬＰＳ、及びＰＢＳのいずれかを、週２回６週間のスケジュール（表５参照）で投与したマウスについては、臨床所見の観察に用いた（図５Ａ〜Ｂ参照）。
【００８４】
【表５】
【００８５】
【表６】
【００８６】
−結果−
図５Ａに、投与後２１日目、及び３５日目のマウスの全体像を、図５Ｂに、投与後２１日目の腸管の全体像を示す。図５Ｂの腸管全体像中の矢印は、腫瘍部分を示す。
また、図６に週１回３週間投与した場合の寿命曲線を、図７ＡにＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群の寿命曲線を、図７ＢにＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群の寿命曲線を示す。図６、及び図７Ａ〜Ｂの生存率は、下記計算式より算出した。
生存率 ＝ 各日数の生存個体数 ／ ０日目の生存個体数
【００８７】
図５Ａ〜Ｂより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群では、未投与群と比較して腫瘍が縮小していることが認められたが、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、更に腫瘍が縮小していた。投与後２１日目の腸管を観察しても、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与による腫瘍の縮小は明らかであった（図５Ｂ）。
また、図６より、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群、及びＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、未投与群と比較して有意に生存日数の延長が認められた（ｐ＜０．０１）。更に、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群と比較して生存率が高く、生存日数も長かった。
図７Ａより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群は、週１回３週間投与群、週２回３週間投与群、及び週１回６週間投与群のいずれの投与群においても、未投与群と比較して有意な生存日数の延長が認められた（ｐ＜０．０５）。また、３週間投与した群と、６週間投与した群とを比較すると、投与期間を長くした方が生存日数の延長が認められ、週１回６週間投与した群の生存日数は９５日を超えていた。
図７Ｂより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群においても、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群（図７Ａ）と同様の傾向が認められ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群は、週１回３週間投与群、週２回３週間投与群、及び週１回６週間投与群のいずれの投与群においても、未投与群と比較して有意な生存日数の延長が認められた（ｐ＜０．０１）。また、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群（図７Ｂ）ではＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群（図７Ａ）と比較して明らかに生存率が高く、生存日数も延長されており、週１回３週間投与した群でも、生存日数は９５日を超えていた。
【００８８】
表６より、週１回６週間投与した場合、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群では、未投与群と比較して平均体重の減少が認められ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、更に平均体重が減少していた。これより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１により癌による体重増加が抑制され、更に腹水産生が抑制されていることが示唆された。
また、生存日数は、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群では、未投与群と比較して生存日数の延長が認められ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、更に延長していることが認められた。
【００８９】
実施例１〜２の結果より、本発明の樹状細胞（ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１）は、ｈＦＬＴ−１タンパク質の発現量を増加させることでｍＶＥＧＦタンパク質の産生を抑制できること、腹膜播種モデルマウスにおいて、従来用いられていたＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰと比較して、有意な腫瘍縮小効果、体重増加の抑制作用、及び腹水産生の抑制作用を有し、更に生存率を高め、生存日数を延長させることができることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の樹状細胞を含む抗癌剤は、特異的な免疫応答による強力な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦの機能を阻害することができることから、腹膜播種を伴う腺癌の治療乃至予防に好適に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有する樹状細胞、及び該樹状細胞を含有する抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍に対する免疫療法の歴史は古く、ＯＫ−４３２などの菌体成分やワクチンウイルスなどを用いた臨床試験が行われている。
しかし、これらの免疫療法は、腫瘍を縮小させる効果（奏功率）が低く、更に非特異的な炎症反応による巻き込み現象を期待したものであるため特異性も低い点で問題である。
【０００３】
生体内における抗原特異的免疫応答のメカニズムとして、抗原提示細胞による免疫応答が挙げられる。抗原提示細胞の１種である樹状細胞は、未成熟樹状細胞が抗原を貪食することにより活性化され、樹状突起を有する成熟樹状細胞となり、リンパ器官に遊走する。前記成熟樹状細胞は、リンパ器官において貪食した抗原に特異的なＴ細胞やＢ細胞を活性化するため、免疫応答に非常に重要な細胞である。
【０００４】
このような機構を利用して、１９９０年代半ば頃より、腫瘍抗原をパルスした樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（ＤＣ））を用いた腫瘍特異的免疫療法に関する臨床研究成果が発表（非特許文献１〜２参照）され、前記腫瘍特異的免疫療法が腫瘍を縮小させる効果を示すことが明らかになりつつある。
しかし、樹状細胞による腫瘍特異的免疫療法の臨床成績は満足できるものではなく（非特許文献３参照）、新たな治療法の開発、及び確立が強く望まれている。
【０００５】
近年、腫瘍特異的免疫療法に、組換えセンダイウイルスベクター（組換えＳｅＶベクター）により活性化した樹上細胞を利用する試みが行われた。組換えＳｅＶベクターを生体へ投与すると一連の免疫反応が惹起される。組換えＳｅＶベクターが導入された樹状細胞は、樹状突起を伸ばし、強力に活性化された状態となる（特許文献４参照）。また、組換えＳｅＶベクターが導入された樹状細胞は、担癌マウスモデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示すことが知られている（非特許文献５〜６参照）。
【０００６】
しかしながら、組換えＳｅＶベクターが導入された樹状細胞を用いた癌治療は、我が国において最も発生頻度の高い腺癌（胃癌、大腸癌など）に対する治療においては、有効であるか否かは明らかとなっていない点で問題である。特に、腹膜播種をきたしやすい難治性消化器癌、及び女性器癌に対して新しい治療法の開発が望まれているのが現状である。
【０００７】
腹膜播種は、各種消化器癌、及び女性器癌に認められる癌の症状が進行した病態の１つである。具体的には、癌細胞が、腹腔内に転移し、増殖し、多量の腹水を伴った病態を呈する。また腹膜播種をきたした癌は、癌細胞の完全切除が難しく、既存の治療法では対処できないため、完治させることが困難な点で問題である。
【０００８】
癌の進行は、血管新生により促進されることが知られている。即ち、血管新生は、腫瘍細胞塊へ酸素や栄養を供給することで腫瘍細胞を増加させる。更に、血管新生により血管内に腫瘍細胞が侵入し、転移を促す。
このような、血管新生を誘導する血管新生因子の１つとして、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）が知られている。前記ＶＥＧＦは、血管新生を誘導するだけでなく、腹水の産生促進、血管透過性の亢進、更には前述した樹状細胞の免疫機能の抑制などの機能も有することが知られている。
【０００９】
したがって、特異的な免疫応答による強力な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦの機能を阻害することができ、腹膜播種を治療可能な、腺癌に対する抗癌剤の開発が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００５／４２７３７号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｎｅｓｔｌｅ ＦＯ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９８， ４（３）， ｐ．３２８−３２
【非特許文献２】Ｏ’ Ｎｅｉｌｌ ＤＷ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ， ２００４， １０４（８）， ｐ．２２３５−２２４６
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９８， ４， ｐ．３２８−３３２
【非特許文献４】Ｈｓｕ ＦＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９６， ２（１）， ｐ．５２−８
【非特許文献５】Ｓｈｉｂａｔａ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００６， １７７（６）， ｐ．３５６４−３５７６
【非特許文献６】Ｙｏｎｅｙａｍａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ２００７， ３５５， ｐ．１２９−１３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、特異的な免疫応答による強力な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦの機能を阻害することができ、腹膜播種を治療可能な、腺癌に対する抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、Ｆｌｔ−１遺伝子を導入した組換えセンダイウイルスベクターが樹状細胞を活性化すること、該組換えセンダイウイルスベクターを含有する樹状細胞がＦＬＴ−１タンパク質の産生量を増加させ、ＶＥＧＦタンパク質の産生を抑制すること、該樹状細胞を投与した腹膜播種モデルマウスにおいて、腫瘍の縮小、体重増加の抑制、及び腹水産生の抑制が認められること、更に該樹状細胞を投与した腹膜播種モデルマウスは生存率が高く、生存日数が延長されることを知見し、本発明の完成に至った。
【００１４】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有することを特徴とする樹状細胞である。
＜２＞ 組換えパラミクソウイルスベクターが、組換えセンダイウイルスベクターである前記＜１＞に記載の樹状細胞である。
＜３＞ Ｆｌｔ−１遺伝子が、配列番号：１で表される遺伝子を有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の樹状細胞である。
＜４＞ Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターにより活性化される前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の樹状細胞である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の樹状細胞を含有することを特徴とする抗癌剤である。
＜６＞ 腺癌治療用である前記＜５＞に記載の抗癌剤である。
＜７＞ 腺癌が、消化器癌、及び女性器癌の少なくともいずれかである前記＜５＞から＜６＞にいずれかに記載の抗癌剤である。
＜８＞ 腹水産生を抑制する前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の抗癌剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、特異的な免疫応答による強力な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦの機能を阻害することができ、腹膜播種を治療可能な、腺癌に対する抗癌剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、及び未処理ＤＣのＣＤ４０（活性化した樹状細胞のマーカー）の発現を、フローサイトメーターで測定した結果を表す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、及び未処理ＤＣのＣＤ８３（活性化した樹状細胞のマーカー）の発現を、フローサイトメーターで測定した結果を表す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、未処理ＤＣ、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ＣＴ２６のｍＶＥＧＦタンパク質の発現量を表す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、未処理ＤＣ、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ＣＴ２６のｈＦＬＴ−１タンパク質の発現量を表す図である。
【図３】図３は、正常マウス、及びＣＴ２６投与後２１日目の腹膜播種モデルマウスの全体像を表す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、正常マウス、及び腹膜播種モデルマウスの、循環血漿中、及び腹水中におけるｍＶＥＧＦタンパク質の発現量を表す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、正常マウス、及び腹膜播種モデルマウスの、循環血漿中、及び腹水中におけるｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、腹膜播種モデルマウスへのＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ又はＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の投与後２１日目、及び３５日目の腹膜播種モデルマウスの全体像を表す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、腹膜播種モデルマウスへのＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の投与後２１日目の腸管の全体像を表す図である。
【図６】図６は、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ＬＰＳのいずれかを週１回３週間投与した腹膜播種モデルマウスの寿命曲線を表す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰを投与した腹膜播種モデルマウスの寿命曲線を表す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を投与した腹膜播種モデルマウスの寿命曲線を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（樹状細胞）
本発明の樹状細胞は、Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００１８】
＜組換えパラミクソウイルスベクター＞
前記組換えパラミクソウイルスベクターは、前記Ｆｌｔ−１遺伝子が導入されたウイルスベクターである（「組換えパラミクソウイルスベクター遺伝子」と称することがある。）。
【００１９】
−Ｆｌｔ−１遺伝子−
前記Ｆｌｔ−１遺伝子は、可溶性のタンパク質であるヒトの血管内皮細胞増殖因子（ｈＶＥＧＦ）の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり、ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１と呼ばれることもある（以下、「ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）。
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子の塩基配列としては、配列番号：１で表される塩基配列が好ましいが、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる塩基配列であってもよく、配列番号：１で表される塩基配列に、更にその他の塩基配列が付加された塩基配列であってもよい。
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子の塩基配列が、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる場合、その一部の塩基配列としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の塩基配列としても、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子の塩基配列は、配列番号：１で表される塩基配列に、１若しくは数個の塩基が、欠失、置換、挿入された塩基配列からなるものであってもよい。
【００２０】
−−入手方法−−
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーより入手する方法、市販品より入手する方法、ヒトなどの各種動物細胞より調製して入手する方法、合成により入手する方法などが挙げられる。
前記ｈＦＬＴ−１タンパク質を入手する方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を所望の発現ベクターに組み込み常法を用いて発現させる方法、市販品より入手する方法、ヒトなどの各種動物細胞より調製して入手する方法、合成により入手する方法、などが挙げられる。
【００２１】
−−パラミクソウイルスベクター−−
パラミクソウイルスベクターは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスに由来するウイルスベクターである。
このベクターは、ゲノムに１本鎖ＲＮＡを有し、細胞質内で遺伝子を発現するため、染色体と相互作用せず、遺伝毒性のない安全なベクターである。また、標的細胞への高い遺伝子導入効率、及び発現効率を示す。
前記パラミクソウイルスベクターは、ウイルスベクターの一種であるため、標的細胞への遺伝子導入の際、高い遺伝子導入効率が得られる点で有利である。
前記パラミクソウイルス科のウイルスとしては、例えば、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型などが挙げられる。
前記パラミクソウイルスベクターの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記センダイウイルス由来のウイルスベクターが、毒性が低い点、導入遺伝子の発現効率が高い点、導入遺伝子の宿主染色体への組み込みが行われず安全性に優れる点で好ましい。
【００２２】
−−センダイウイルスベクター−−
前記センダイウイルスベクター（以下、「ＳｅＶベクター」、「ＳｅＶベクター遺伝子」と称することがある。）は、センダイウイルスに由来するベクターであり、所望の遺伝子を標的細胞である前記樹状細胞に導入することが可能な運搬体である。
【００２３】
前記ＳｅＶベクターの塩基配列としては、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を導入した際、前記樹状細胞でｈＦｌｔ−１遺伝子を発現することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、欠陥干渉粒子（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＤＩ粒子）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ， １９９４， ６８， ｐ．８４１３−８４１７参照）などの不完全ウイルスをコードする塩基配列を有するＳｅＶベクター、Ｆ遺伝子を有するＳｅＶベクター、Ｆ遺伝子を欠失しているＳｅＶベクター、温度感受性の遺伝子を有するＳｅＶベクターなどが挙げられる。
これらの中でも、Ｆ遺伝子を欠失しているＳｅＶベクターが、伝播力を欠如している点で好ましく、配列番号：２で表される塩基配列が特に好ましい。
【００２４】
前記ＳｅＶベクターの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、遺伝子の形態であってもよく、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態であってもよく、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であってもよく、感染力を有するウイルス粒子の形態であってもよい。
前記感染力とは、細胞への接着能、及び膜融合能の少なくともいずれかによって、センダイウイルス粒子が保持する核酸などを細胞内へ導入することができる能力をいう。
【００２５】
また、前記ＳｅＶベクターは、本発明の効果を損なわない限り、その他の成分を含む組成物の形態であってもよい。
前記ＳｅＶベクター中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脱イオン水、超純水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、５質量％デキストロース水溶液、生体適合性のポリオルなどが挙げられる。
前記生体適合性のポリオルとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７などが挙げられる。前記組成物が、前記ポリオルを含むと、前記ＳｅＶベクターの導入率を１０倍〜１００倍に上昇させることができる点で好ましい（Ｍａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １９９５， ６， ｐ．４１−５３参照）。
なお、前記ポリオルは、前記組成物に含まれていてもよく、前記ＳｅＶベクターと前記ポリオルとを別々に調製し、前記ＳｅＶベクターを前記樹状細胞へ導入する際、同時に導入してもよい。
【００２６】
また、前記ＳｅＶベクターは、前記感染力を有している一方で伝播力を欠如していることが好ましい。
センダイウイルスの天然型の遺伝子は、３’末端の短いリーダー領域、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）遺伝子、リン酸化タンパク質（Ｐ）遺伝子、マトリクスタンパク質（Ｍ）遺伝子、フュージョンタンパク質（Ｆ）遺伝子、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子、ラージタンパク質（Ｌ）遺伝子、及び５’末端の短いトレイラー領域を、前記した順序で有する。
前記伝播力を欠如させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、及びＭ遺伝子の少なくともいずれかを欠失させておくことが好ましく、前記Ｆ遺伝子を欠失させることが特に好ましい。
前記伝播力を欠如させたＳｅＶベクター遺伝子（ｃＤＮＡ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｆ遺伝子が欠失したセンダイウイルスＺ株由来のＳｅＶベクター遺伝子、ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）（Ｙｕ Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ， １９９７， ２， ｐ．４５７−４６６参照）、ｐＳｅＶ（＋）（Ｋａｔｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９７， １６， ｐ．５７８−５８７参照）などが挙げられる。
【００２７】
−−入手方法−−
前記パラミクソウイルスベクターを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラミクソウイルス科に属するウイルスより調製して入手する方法、市販品より入手する方法、合成により入手する方法などが挙げられる。
【００２８】
−含有量−
前記樹状細胞中の、前記組換えパラミクソウイルスベクターの含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
＜その他の成分＞
前記樹状細胞中の前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記樹状細胞を所望の濃度に希釈するための水、生理食塩水、各種緩衝液などが挙げられる。
前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
＜製造方法＞
前記樹状細胞の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＳｅＶベクターに前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を導入した組換えＳｅＶベクター（以下、「ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）を作製し、該ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１から組換えセンダイウイルス（以下、「ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）を作製し、該ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を前記樹状細胞へ感染させることで、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１を含有する樹状細胞を製造する方法などが挙げられる。
【００３１】
−組換えＳｅＶベクター（ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１）の作製−
−−ｈＦｌｔ−１遺伝子の調製−−
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリー鋳型としてＰＣＲ法を行い、ｃＤＮＡを合成する方法などが挙げられる。
前記ＰＣＲ法に用いる酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造（株）製）、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）などが挙げられるが、これらの中でも、Ｖｅｎｔポリメラーゼが好ましい。
【００３２】
前記ＰＣＲ法に用いるフォワード側プライマー配列を設計する前記Ｆｌｔ−１遺伝子の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、フォワード側のプライマー配列には、前記Ｆｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡの５’末端から２５塩基近傍までを含むように選択することが好ましい。
前記フォワード側のプライマー配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５’末端に「ＡＣＴＴ」を含み、その３’末端側に「ＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ認識部位）」を付加し、更にその３’末端側にスペーサー配列として任意の９塩基又は該９塩基に６の倍数の塩基数を有する任意の塩基を付加した配列が特に好ましく、前記スペーサー配列の３’末端側に前記Ｆｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡの開始コドン（ＡＴＧ）を含めた前記Ｆｌｔ−１遺伝子のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅｄｅｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の２５塩基相当の配列を付加することが更に好ましい。
【００３３】
前記ＰＣＲ法に用いるリバース側プライマー配列を設計する前記Ｆｌｔ−１遺伝子の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記リバース側のプライマー配列には、前記Ｆｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡの３’末端から２５塩基近傍を含むように選択することが好ましい。
前記リバース側のプライマー配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５’末端に「ＡＣＴＴ」を含み、その３’末端側に「ＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ認識部位）」を付加し、更にその３’末端側に、ＳｅＶウイルスベクターのＳ配列の相補鎖配列（５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’）、Ｉ配列の相補鎖配列（５’−ＡＡＧ−３’）、及びＥ配列の相補鎖配列（５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’）を連続して（ＥＩＳ配列の相補的配列を）含ませることが好ましく、前記ＥＩＳ配列の相補的配列の３’末端側に前記Ｆｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡの終止コドン（ＴＧＡ）を含めたＦｌｔ−１遺伝子のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅｄｅｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の２５塩基相当の配列を付加することが更に好ましい。
前記フォワード側のプライマー配列と、前記リバース側とのプライマー配列とを用いて、前記Ｆｌｔ−１遺伝子をＰＣＲ法にて増幅した後、前記フォワード側のプライマー配列に含まれるＮｏｔＩ認識部位から、前記リバース側のプライマー配列に含まれるＮｏｔＩ認識部位までの塩基数の合計が６の倍数になるように設計することが好ましい（いわゆる「６のルール」、Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， １９９８， ７２， ｐ．８９１−８９９、及びＣａｌａｉｎ Ｐ， ａｎｄ Ｒｏｕｘ． Ｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， １９９３， ６７， ｐ．４８２２−４８３０参照）。
【００３４】
前記ｃＤＮＡは、所望のベクター、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（インビトロジェン（株）製）などに導入し、シーケンサーにより塩基配列を確認することが好ましい。
【００３５】
−−ｈＦｌｔ−１遺伝子のＳｅＶベクターへの導入−−
前記ｈＦｌｔ−１遺伝子を前記ＳｅＶベクターに導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡを導入したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと、前記ＳｅＶベクターとを所望の制限酵素で消化し、常法によりライゲーションすることにより導入する方法、前記ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに導入していないｈＦｌｔ−１遺伝子のｃＤＮＡを直接前記ＳｅＶベクターへ導入する方法などが挙げられる。
このようにして導入した、ｈＦｌｔ−１遺伝子を有する組換えセンダイウイルスベクター（以下、「ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）の塩基配列としては、前記樹状細胞でｈＦｌｔ−１遺伝子を発現することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：３で表される塩基配列が特に好ましい。
なお、前記配列番号：３で表される塩基配列は、Ｆ遺伝子を欠失しているＳｅＶベクターに前記ｈＦｌｔ−１遺伝子が導入されており、伝播力を欠如している点で好ましい。
【００３６】
−−組換えＳｅＶウイルス（ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１）の作製−−
上記のようにして作製したｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１より、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を作製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、試験管内又は培養細胞内で転写させる方法など、公知の方法を用いることができる（例えば、国際公開第９７／１６５３８号パンフレット、及び国際公開第９７／１６５３９号パンフレット参照）。
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１は、後述する樹状細胞への導入にそのまま用いてもよいが、増幅させてから用いることが、ウイルス力価が高く、効率良く樹状細胞へ導入できる点で好ましい。
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１がＦ遺伝子を欠失していない場合、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を増殖する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を培養細胞に接種し、数時間後、培養上清を回収することで前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を回収し、該回収したｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を、更に培養細胞へ接種し、同様の操作を数回繰り返して増幅する方法などが挙げられる。
前記ウイルス力価を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エンドポイント（ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ）希釈法（Ｋａｔｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ， １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）などが挙げられる。
【００３７】
前記培養細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＬＬＣＭＫ２細胞、ヒト由来の細胞、サル腎臓由来のＣＶ−１細胞、ハムスター腎臓由来のＢＨＫ細胞などが挙げられる。なお、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１がＦ遺伝子を欠失している場合は、前記培養細胞は、Ｆタンパク質を高発現しているパッケージング細胞が好ましい。
前記培養細胞内で転写させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１を所望の培養細胞にトランスフェクションする方法などが挙げられる。
なお、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１は、そのエンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるように、接着因子、リガンド、受容体などが結合していてもよい。
【００３８】
−−保存−−
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の保存方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、−８０℃で保存する方法が、ウイルス力価を維持できる点で好ましい。
【００３９】
−樹状細胞の調製−
前記樹状細胞を調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、造血前駆細胞を採取し、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ）、幹細胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ：ＳＣＦ）、ＩＬ−３、及びＩＬ−６（ＦＳ３６）を含む１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（例えば、インビトロジェン（株）製）で培養後、ＧＭ−ＳＣＦ、及びＩＬ−４を含む１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０で培養する方法などが挙げられる。前記培地で培養することにより、前記造血前駆細胞は、樹状細胞へと分化する。
前記造血前駆細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒト由来の造血前駆細胞が、前記樹状細胞をヒトに用いる場合、抗原性が少ない点で好ましい。
【００４０】
−樹状細胞へのｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１の導入−
前述のように調製した樹状細胞へ、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１を導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記樹状細胞に、前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を感染させる方法などが挙げられる。
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、樹状細胞の培養培地に前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を添加する方法などが挙げられる。
前記ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１が前記樹状細胞に感染したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
−−樹状細胞の活性化の確認−−
前記樹状細胞が、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１の導入により活性化したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、樹状細胞のマーカーの発現により確認する方法などが挙げられる。
前記樹状細胞のマーカーは、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲなどが挙げられる。
前記マーカーを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫学的測定法により確認する方法などが挙げられる。
前記免疫学的測定法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫染色法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメーターで検出する方法などが挙げられる。
【００４２】
−−ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によるＦｌｔ−１遺伝子の発現の確認−−
前記樹状細胞において、前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によりＦｌｔ−１遺伝子が発現しているか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、免疫学的測定法などが挙げられる。
前記免疫学的測定法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫染色法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
【００４３】
＜用途＞
本発明の樹状細胞は、ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によりｈＦｌｔ−１遺伝子を発現しているため、ＶＥＧＦタンパク質の機能を阻害し、血管新生、及び血管透過性を抑制でき、かつ、ＶＥＧＦタンパク質による樹状細胞の免疫機能の抑制を阻害できることから、後述する抗癌剤へ好適に利用可能である。
【００４４】
（抗癌剤）
本発明の抗癌剤は、前述の樹状細胞を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００４５】
前記抗癌剤の標的となる癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、腺癌であることが、我が国において最も発生頻度が高い癌を治療できる点で好ましい。
前記腺癌とは、上皮性の悪性腫瘍の一種であり、胃、腸、子宮体部、肺、乳房、卵巣、前立腺、甲状腺、肝臓、腎臓、膵臓、及び胆嚢などに発生する癌である。
前記抗癌剤は、これらの癌の中でも、腹膜播種をきたしやすい胃癌や大腸癌などの各種消化器癌、子宮癌などの女性器癌などを治療できることが好ましい。前記消化器癌や女性器癌は、多量の腹水を伴う症状を呈する。
前記腹水とは、正常な状態でごく少量の液体である腹腔内の液体が、血漿タンパク質の減少による膠質浸透圧の低下、門脈圧亢進、腹膜炎、悪性腫瘍の腹膜播種、肝癌の破裂などの原因により、多量に濾出、及び滲出し、腹腔内に異常に多量の液体が貯留した状態乃至その液体をいう。腹水が貯留すると、体重増加、腹部膨隆、尿量減少が認められる。
前記抗癌剤は、このような腹水の産生を抑制できる点で有利である。
【００４６】
＜樹状細胞＞
前記抗癌剤中の樹状細胞は、前述したｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１を含有する樹状細胞であることが好ましい。
前記抗癌剤中の、前記樹状細胞の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗癌剤は、前記樹状細胞そのものであってもよい。
【００４７】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプン、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤などが挙げられる。
前記安定剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルブミン、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）（ペンタファームジャパン（株）製）などが挙げられる。
前記抗癌剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４８】
＜使用＞
前記抗癌剤は、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記抗癌剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００４９】
＜剤型＞
前記抗癌剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００５０】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記樹状細胞に、必要に応じて、前記その他の成分、賦形剤、各種添加剤などを加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００５１】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記樹状細胞に、必要に応じて、前記その他の成分、添加剤などを加えることにより製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００５２】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記樹状細胞に、必要に応じて、前記その他の成分、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００５３】
＜投与＞
前記抗癌剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、直腸内投与、静脈内投与、皮下投与、経皮投与などの全身投与法、皮膚上投与、吸入投与、注腸投与、点眼、点耳、経鼻投与、膣内投与などの局所投与法などが挙げられるが、局所投与法が、前記抗癌剤が効率的に送達でき、かつ副作用を低減できる点で好ましい。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、既に腺癌を発症した後に使用しもよく、前記腺癌と診断される前に使用してもよい。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００５４】
＜用途＞
前記抗癌剤は、腹水中のＶＥＧＦの機能を阻害し、かつ腹水の産生を抑制することができることから、消化器癌、女性器癌などの腺癌の予防乃至治療に好適に用いることができる。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１：組換えＳｅＶベクターを含む樹状細胞）
【００５７】
＜組換えＳｅＶベクター（ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１）の作製＞
−ｈＦｌｔ−１遺伝子の調製−
ヒト由来可溶性Ｆｌｔ−１（ｈＦｌｔ−１）のｃＤＮＡは、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）を用いてＰＣＲ法により調製した。ＰＣＲ法に用いたプライマーは、フォワードプライマーとして下記配列番号：４で表される塩基配列、リバースプライマーとして下記配列番号：５で表される塩基配列を用いた。前記プライマー配列は、３’末端側にＮｏｔＩ認識部位（ＧＣＧＧＣＣ）を含むように設計した。
なお、前記ｈＦｌｔ−１遺伝子中に含まれるＮｏｔＩ認識部位は、予め除去した。
【００５８】
プライマー配列
５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＴ−３’ （配列番号：４）
５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＡＣＡＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＴＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＣ−３’ （配列番号：５）
【００５９】
ＰＣＲ法により得られたｈＦｌｔ−１のｃＤＮＡをＮｏｔＩで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（インビトロジェン（株）製）のＮｏｔＩ部位に挿入し（以下、「ｐＢＳ−ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）、クローニングを行った。
ｐＢＳ−ｈＦｌｔ−１のクローンをシーケンサー（アプライドバイオシステムズ（株）製）で分析し、ｈＦｌｔ−１の塩基配列を解析したところ、配列番号：１で表される塩基配列を有することが確認された。
【００６０】
−ｈＦｌｔ−１遺伝子のＳｅＶベクターへの導入−
ｐＢＳ−ｈＦｌｔ−１をＮｏｔＩで切断して切り出したｈＦｌｔ−１を、Ｆ遺伝子を欠失させ、伝播力を欠如した配列番号：２で表される塩基配列を有するセンダイウイルスベクター（「センダイウイルスベクター遺伝子（ｃＤＮＡ）」と称することがある。）のＮｏｔＩ部位に挿入後、クローニングを行い、ｈＦｌｔ−１遺伝子を有する組換えセンダイウイルスベクター（配列番号：３）（以下、「ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）を得た。
また、比較対照としては、配列番号：２で表される塩基配列を有するベクターの塩基番号７２６７と、塩基番号７２６８との間にＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ５７６０９．１）を導入したベクター（以下、「ｐＳｅＶ／ＧＦＰ」と称することがある。）を用いた。
なお、前記配列番号：２で表される塩基配列を有するセンダイウイルスベクターは、Ｂａｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ．, Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２００７， １４（２４）， ｐ．１６８８−１６９４を参照して作製した。
【００６１】
＜ウイルスの産生＞
−サル腎臓由来細胞株ＬＬＣＭＫ２の培養−
サル腎臓由来細胞株ＬＬＣＭＫ２（ＡＴＣＣ社製）を６穴プラスチックプレートに播種し、１０質量％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（インビトロジェン（株）製）、及び抗生物質（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）（インビトロジェン（株）製）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）（インビトロジェン（株）製）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７０％〜８０％コンフルエント（約１×１０６細胞／穴）になるまで培養した。
【００６２】
−ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１、及びｐＳｅＶ／ＧＦＰの導入−
前記ＬＬＣＭＫ２に、Ｔ７ポリメラーゼを発現するＵＶ照射により不活化した組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ ＴＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９８６， ８３， ｐ．８１２２−８１２６参照）を、２の感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で感染させた。
ｖＴＦ７−３の感染１時間後、１μｇのｐＧＥＭ−Ｎ（Ｋａｔｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）、０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ（Ｋａｔｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）、及び１μｇのｐＧＥＭ−Ｐ（Ｋａｔｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）と共に、３μｇの前記ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１又は３μｇの前記ｐＳｅＶ／ＧＦＰを、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、製造元の方法に従ってトランスフェクションした。
なお、前記ｐＧＥＭ−Ｎ（ヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子）、前記ｐＧＥＭ−Ｐ（リン酸化タンパク質）、及び前記ｐＧＥＭ−Ｌ（ラージタンパク質遺伝子）は、全長センダイウイルスゲノムの再構成に必須な、トランスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミドである。
【００６３】
ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１又はｐＳｅＶ／ＧＦＰをトランスフェクションしたＬＬＣＭＫ２は、１００μｇ／ｍＬのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ社製）、及び４０μｇ／ｍＬのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＭＥＭ（血清非添加）で４８時間培養した。次いで、前記ＬＬＣＭＫ２を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕することにより、ｈＦｌｔ−１遺伝子を含む組換えセンダイウイルス（以下、「ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）、及び比較対照としてのセンダイウイルス（以下、「ｒＳｅＶ／ＧＦＰ」と称することがある。）を得た。
なお、ｖＴＦ７−３は、前記ＡｒａＣを含むＭＥＭ培地で除去できる。
【００６４】
−ウイルスの増幅−
ＬＬＣＭＫ２を２２５ｃｍ２フラスコに播種し、１０質量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、及びペニシリンストレプトマイシン（ナカライテスク（株）製）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でコンフルエント（３×１０７細胞／フラスコ）になるまで培養した。
このＬＬＣＭＫ２に、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを、０．５の感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で接種し、３５．５℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間放置することにより増幅した。１時間後、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを含む上清を除去し、０．０００３質量％トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製）、及びペニシリンストレプトマイシン（ナカライテスク（株）製）を含むＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）（以下、「Ｔｒｙｐｓｉｎ／Ｐ／Ｓ含有ＭＥＭ」と称することがある。）を添加し、３５．５℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。２４時間ごとに新鮮なＴｒｙｐｓｉｎ／Ｐ／Ｓ含有ＭＥＭに培地交換しながら３日間培養した。
３日後の培養上清を回収し、濃縮し、赤血球凝集活性（ＨＡ）測定することにより、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びｒＳｅＶ／ＧＦＰの力価を測定した。結果を下記表１に示す。
前記ＨＡは、エンドポイント（ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ）希釈法（Ｋａｔｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ， １９９６， １， ｐ．５６９−５７９参照）により決定した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
＜樹状細胞への導入＞
−樹状細胞の調製−
樹状細胞の調製は、国際公開第２００８／１４３０４７号パンフレットに記載の方法で行った。即ち、８週齢のＢｕｌｂ／ｃマウス（ＫＢＴオリエンタル社製）の骨髄細胞をＳｐｉｎＳｅｐ（登録商標） Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｐｒｅ−Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で採取した。採取した骨髄細胞には造血系前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）が含まれている。この造血系前駆細胞を、Ｆｌｔ−３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、幹細胞因子（ＳＣＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、及びＩＬ−６（ＦＳ３６）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含む１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン（株）製）（以下、「ＦＳ３６添加培地」と称することがある。）で２１日間培養した。次いで、ＦＳ３６培地を、ＧＭ−ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、及びＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含む１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（以下、「ＧＭＩＬ−４添加培地」と称することがある。）に交換し、更に７日間培養することにより、成熟樹状細胞（ＤＣ）を得た。
【００６７】
−導入−
前述のようにして増幅したｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを、それぞれ５０の感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で添加した１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０にて、前述のようにして調製した成熟樹状細胞（ＤＣ）を８時間又は４８時間培養し、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを感染させることにより、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを成熟樹状細胞（ＤＣ）に導入した。次いで、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１又はｒＳｅＶ／ＧＦＰを導入した成熟樹状細胞（ＤＣ）を、それぞれピペッティングすることにより回収し、ＰＢＳ（インビトロジェン（株）製）で洗浄し、ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を導入した樹状細胞（以下、「ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１」と称することがある。）、及びｒＳｅＶ／ＧＦＰを導入した樹状細胞（以下、「ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ」と称することがある。）を得た。
また、ポジティブコントロールとしてはＬＰＳで刺激した樹状細胞を用いた。即ち、１０質量％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ（インビトロジェン（株）製）に１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（カタログＮＯ．Ｌ７８９５−１ＭＧ、Ｓｉｇｍａ社製）を添加した培地で、前述のように調製した成熟樹状細胞（ＤＣ）を８時間又は４８時間培養後、前述の方法と同様にして回収、洗浄することにより、ＬＰＳ刺激した成熟樹状細胞（以下、「ＤＣ／ＬＰＳ」と称することがある。）を得た。
なお、４８時間培養した樹状細胞は、後述する樹状細胞の活性化の確認、及びｈＦｌｔ−１発現の確認に、８時間培養した樹状細胞は、後述する腹水播種モデルマウスへの投与に用いた。
【００６８】
（試験例１：ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１による樹状細胞の活性化の確認）
ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びｒＳｅＶ／ＧＦＰの導入により、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰが活性化しているか否かを確認するため、活性化樹状細胞のマーカーであるＣＤ４０、及びＣＤ８３の発現を確認した。
【００６９】
＜方法＞
樹状細胞のみを解析するため、実施例１の４８時間培養したＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ＬＰＳ、及び未処理の樹状細胞（以下「未処理ＤＣ」と称することがある。）について、ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、及びＨ−２Ｋｄ（ＭＨＣクラスＩ）−ＦＩＴＣでターゲティングを行った。次いで、ＰＥ標識抗マウスＣＤ４０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、及びＰＥ標識抗マウスＣＤ８３抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用い、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で解析し、ＣＤ４０陽性細胞、及びＣＤ８３陽性細胞の割合を調べた。なお、死細胞の選別には、ＰＩ染色（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製）を用いた。
【００７０】
＜結果＞
フローサイトメーターの結果を、下記表２に示す。下記表２中、「ＭＦＩ」は、平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。
また、ＣＤ４０陽性細胞を示すヒストグラムを図１Ａに、ＣＤ８３陽性細胞を示すヒストグラムを図１Ｂに示す。
【００７１】
【表２】
表２、及び図１Ａ〜Ｂの結果より、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、及びＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰは、未処理ＤＣと比較して、いずれも活性化していることが認められた。また、その活性化の強度は、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰと比較してＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の方が強かった。
【００７２】
（試験例２：ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１によるｈＦＬＴ−１タンパク質発現の確認）
ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を導入することにより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１でｈＦＬＴ−１タンパク質が産生されているか否かについて、確認を行った。
【００７３】
＜方法＞
１×１０５個／ｍＬのマウス大腸癌細胞株ＣＴ２６（ｃｏｌｏｎ２６）（九州大学大学院 病理病態学より供与）を添加した１０質量％ＦＢＳを含むＩＭＤＭで成熟樹状細胞（ＤＣ）を４８時間培養し、ＣＴ２６を感染させた樹状細胞（以下、「ＤＣ／ＣＴ２６」と称することがある。）を得た。
ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、及びＤＣ／ＬＰＳは、実施例１の４８時間培養した細胞を用いた。また、コントロールとしては、未処理ＤＣを用いた。
４８時間培養後のＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ＬＰＳ、ＤＣ／ＣＴ２６、及び未処理ＤＣを回収し、ＲＰＭＩ１６４０に１×１０６細胞／ｍＬとなるように希釈し、更に２４時間培養した。
２４時間培養後の培養上清を回収し、培養上清中のマウスＶＥＧＦ（ｍＶＥＧＦ）タンパク質の発現量、及びｈＦＬＴ−１タンパク質の発現量を、マウスＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット、及びマウスＦｌｔ−１ ＥＬＩＳＡキット（共に、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、製造元の方法に従い測定した。
【００７４】
＜結果＞
結果を下記表３に示す。また、図２ＡにｍＶＥＧＦタンパク質の発現量を、図２ＢにｈＦＬＴ−１タンパク質の発現量を示す。
【００７５】
【表３】
これらの結果より、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１では、ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によりｈＦＬＴ−１タンパク質が過剰発現していることが確認された。更に、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１では、ｐＳｅＶ−ｈＦｌｔ−１によりｍＶＥＧＦタンパク質の発現が抑制されていることが認められた。
【００７６】
（実施例２：腹膜播種モデルマウスへの抗腫瘍効果）
＜腹膜播種モデルマウスの作製＞
−順化−
試験動物として、８週齢のＢｕｌｂ／ｃマウス（ＫＢＴオリエンタル社製）を使用した。前記マウスが到着後、一般的な健康状態について評価し、試験前に３日間順化した。
【００７７】
−飼育−
前記マウスは、順化の間は集団で収容し、その後生存中は米国国家研究会議のガイドライン「試験動物の管理と使用に関する指針」に従い、個体ごとに収容した。
動物室の環境は、温度２４℃、相対湿度５０％、昼夜それぞれ１２時間となるように制御し、温度、及び相対湿度は毎日測定した。給餌は、全ての試験動物に自由給餌で与えた。
【００７８】
−マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６の投与−
順化したＢｕｌｂ／ｃマウスに、マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６を１×１０５個／個体を腹腔内投与することにより、腹膜播種モデルマウスを作製した。
【００７９】
＜腹膜播種モデルマウスの病態の検討＞
−方法−
ＣＴ２６投与後２１日目の腹膜播種モデルマウス、及び正常Ｂｕｌｂ／ｃマウスより、循環血液、及び腹水を採取した。採取した循環血液は、２，０００×ｇで２０分間遠心することにより、循環血漿を分離した。この循環血漿、及び腹水中のｍＶＥＧＦタンパク質、及びマウスＦＬＴ−１（ｍＦＬＴ−１）のタンパク質の発現量をマウスＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット、及びマウスＦｌｔ−１ ＥＬＩＳＡキット（共に、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、製造元の方法に従い測定した。なお、正常マウスには腹水が存在しなかったため、正常マウスの腹水については測定しなかった。
図３にＣＴ２６投与後２１日目の腹膜播種モデルマウスの全体像、及び正常Ｂｕｌｂ／ｃマウスの全体像を示す。
【００８０】
−結果−
結果を下記表４に示す。また、図４Ａに腹膜播種モデルマウスの循環血漿中、及び腹水中のｍＶＥＧＦタンパク質の発現量を、図４Ｂに腹膜播種モデルマウスの循環血漿中、及び腹水中のｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量を示す。
【００８１】
【表４】
これらの結果より、腹膜播種モデルでは、正常マウスと比較して、循環血漿中のｍＶＥＧＦタンパク質、及びｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量が増加していることが認められた。
また、腹膜播種モデルマウスの循環血漿中ではｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量の方がｍＶＥＧＦタンパク質の発現量より多かったのに対し、腹水中ではｍＶＥＧＦタンパク質の発現量の方がｍＦＬＴ−１タンパク質の発現量より多く、腹水中ではｍＦＬＴ−１タンパク質とＶＥＧＦタンパク質とのバランスが変化し、ｍＶＥＧＦタンパク質の発現が有利な環境となっていることが示唆された。
【００８２】
＜樹状細胞（ＤＣ）の抗癌作用の検討＞
前述したような病態を有する腹膜播種モデルマウスを用い、実施例１で作製したＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１の抗癌作用について検討を行った。
【００８３】
−投与−
０日目に、１×１０５個／個体のＣＴ２６と、１×１０６細胞／個体のＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１（実施例１で８時間培養した細胞）、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ（実施例１で８時間培養した細胞）、ＤＣ／ＬＰＳ（実施例１で８時間培養した細胞）、及びＰＢＳのいずれかとを同時に投与した。ここでの「コントロールのマウス」とは、結果的には、１×１０５個のＣＴ２６及びＰＢＳのみが投与されたマウスをいう。なお、前記「同時に投与」とは、ＣＴ２６投与後、５分間以内にＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰＤＣ／ＬＰＳ、及びＰＢＳのいずれかを投与することをいう。
以下、コントロールのマウスを「未投与群」、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１を投与したマウスを「ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群」、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰを投与したマウスを「ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群」、ＤＣ／ＬＰＳを投与したマウスを「ＤＣ／ＬＰＳ群」、と称することがある。
各投与群について、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ＬＰＳ、及びＰＢＳのいずれかを、更に週１回３週間投与した群、週２回３週間投与した群、週１回６週間投与した群に分け、それぞれの生存日数を観察した。投与スケジュールを下記表５に示す。
また、週１回６週間投与した群は、平均体重も測定した。週１回６週間投与した群の投与後２８日目の平均体重、及び生存日数を、下記表６に示す。
なお、各投与群について、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ、ＤＣ／ＬＰＳ、及びＰＢＳのいずれかを、週２回６週間のスケジュール（表５参照）で投与したマウスについては、臨床所見の観察に用いた（図５Ａ〜Ｂ参照）。
【００８４】
【表５】
【００８５】
【表６】
【００８６】
−結果−
図５Ａに、投与後２１日目、及び３５日目のマウスの全体像を、図５Ｂに、投与後２１日目の腸管の全体像を示す。図５Ｂの腸管全体像中の矢印は、腫瘍部分を示す。
また、図６に週１回３週間投与した場合の寿命曲線を、図７ＡにＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群の寿命曲線を、図７ＢにＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群の寿命曲線を示す。図６、及び図７Ａ〜Ｂの生存率は、下記計算式より算出した。
生存率 ＝ 各日数の生存個体数 ／ ０日目の生存個体数
【００８７】
図５Ａ〜Ｂより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群では、未投与群と比較して腫瘍が縮小していることが認められたが、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、更に腫瘍が縮小していた。投与後２１日目の腸管を観察しても、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与による腫瘍の縮小は明らかであった（図５Ｂ）。
また、図６より、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群、及びＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、未投与群と比較して有意に生存日数の延長が認められた（ｐ＜０．０１）。更に、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群と比較して生存率が高く、生存日数も長かった。
図７Ａより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群は、週１回３週間投与群、週２回３週間投与群、及び週１回６週間投与群のいずれの投与群においても、未投与群と比較して有意な生存日数の延長が認められた（ｐ＜０．０５）。また、３週間投与した群と、６週間投与した群とを比較すると、投与期間を長くした方が生存日数の延長が認められ、週１回６週間投与した群の生存日数は９５日を超えていた。
図７Ｂより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群においても、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群（図７Ａ）と同様の傾向が認められ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群は、週１回３週間投与群、週２回３週間投与群、及び週１回６週間投与群のいずれの投与群においても、未投与群と比較して有意な生存日数の延長が認められた（ｐ＜０．０１）。また、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群（図７Ｂ）ではＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群（図７Ａ）と比較して明らかに生存率が高く、生存日数も延長されており、週１回３週間投与した群でも、生存日数は９５日を超えていた。
【００８８】
表６より、週１回６週間投与した場合、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群では、未投与群と比較して平均体重の減少が認められ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、更に平均体重が減少していた。これより、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１により癌による体重増加が抑制され、更に腹水産生が抑制されていることが示唆された。
また、生存日数は、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰ投与群では、未投与群と比較して生存日数の延長が認められ、ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１投与群では、更に延長していることが認められた。
【００８９】
実施例１〜２の結果より、本発明の樹状細胞（ＤＣ／ｒＳｅＶ／ｈＦｌｔ−１）は、ｈＦＬＴ−１タンパク質の発現量を増加させることでｍＶＥＧＦタンパク質の産生を抑制できること、腹膜播種モデルマウスにおいて、従来用いられていたＤＣ／ｒＳｅＶ／ＧＦＰと比較して、有意な腫瘍縮小効果、体重増加の抑制作用、及び腹水産生の抑制作用を有し、更に生存率を高め、生存日数を延長させることができることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の樹状細胞を含む抗癌剤は、特異的な免疫応答による強力な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦの機能を阻害することができることから、腹膜播種を伴う腺癌の治療乃至予防に好適に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有することを特徴とする樹状細胞。
【請求項２】
組換えパラミクソウイルスベクターが、組換えセンダイウイルスベクターである請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載の樹状細胞を含有することを特徴とする抗癌剤。
【請求項４】
腺癌治療用である請求項３に記載の抗癌剤。
【請求項５】
腹水産生を抑制する請求項３から４のいずれかに記載の抗癌剤。
【請求項１】
Ｆｌｔ−１遺伝子が導入された組換えパラミクソウイルスベクターを含有することを特徴とする樹状細胞。
【請求項２】
組換えパラミクソウイルスベクターが、組換えセンダイウイルスベクターである請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載の樹状細胞を含有することを特徴とする抗癌剤。
【請求項４】
腺癌治療用である請求項３に記載の抗癌剤。
【請求項５】
腹水産生を抑制する請求項３から４のいずれかに記載の抗癌剤。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公開番号】特開２０１０−２６３８５９（Ｐ２０１０−２６３８５９Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１９３３３（Ｐ２００９−１１９３３３）
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１１月１６日 国立大学法人九州大学医学部外科第二講座主催の「九州大学医学部外科第二講座 第１０５回 開講記念会」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０５０４８４８２）ディナベック株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１１月１６日 国立大学法人九州大学医学部外科第二講座主催の「九州大学医学部外科第二講座 第１０５回 開講記念会」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０５０４８４８２）ディナベック株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
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