機能グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを有しないＥ．ＣＯＬＩＢＬ２１株
本発明は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの欠失を含む新規非病原性大腸菌（Ｅ，ｃｏｌｉ） Ｂ ＢＬ２１株、及びペプチド製造のためのその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムの操作、改善した非病原性Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｂ株、並びにペプチド及びタンパク質製造のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、広範な市販の製品の製造のために使用されている。遺伝子操作した細菌、例えば、大腸菌を宿主細胞として生物試薬、例えば、ペプチド及び核酸の生産のために実験室で使用すること及び工業的に使用することは、当該技術分野においてよく知られている。自然な環境における細菌は、標準的な工業的又は実験室における増殖で通常与えられるものではない多数の環境に曝されるため、それらのゲノムは、多数の環境依存的なストレス誘導遺伝子、又はそうでなければ非必須遺伝子を有し、それらは、前記生物の工業的又は実験室における使用には必要とされない可能性があり、又は望ましくない可能性すらある。
【０００３】
細菌性病原体は、毒性因子、例えば、細胞表面における莢膜多糖類を含み、それは、細菌とその周囲の環境との間の相互作用を媒介し、細菌の病原性に直接関連する多数の機能を有する。８０を超える血清学的及び化学的に異なるタイプの多糖類莢膜が、Ｅ．Ｃｏｌｉについて開示されており、Ｋ抗原と称されている。多糖類莢膜は、４つのグループに分類され、そのうちグループＩＩ莢膜多糖類は、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌のものと類似している。グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターは、侵襲性疾患と関連する莢膜のタイプの大半を含み、３つの機能的領域からなる保存された遺伝子構成を有する。領域１及び３は、グループＩＩ遺伝子クラスターの間で保存されており、合成部位から細胞表面に多糖類を輸送するために必要なペプチドをコードしており、領域２は、血清型特異的であり、特定の多糖類を含む個々の単糖類の生合成及び重合に関与する酵素をコードしている。領域１は、６つの遺伝子のｋｐｓＦＥＤＵＣＳを含み、それらは１つの転写単位に構成されている。領域２は、血清型特異的であり、グループ２抗原の間で異なる。領域３は、２つの遺伝子のｋｐｓＭ及びｋｐｓＴを含み、それらは１つの転写単位に構成されている［Andreishcheva et al. Gene (2006) 384: 113-119］。
【０００４】
Ｅ．ＣｏｌｉのＫ−１２株及びＢ株は、莢膜を有さず、ペプチドの製造に一般的に使用される株である。Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２のゲノムは、完全に配列決定されており、莢膜遺伝子を全く含まない。組換えペプチドの高収量発現のための好ましい株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、グループＩＩ莢膜多糖類をコードする遺伝子クラスターを含むことが認められており、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂの祖先が水平伝播によってこれらの莢膜遺伝子を獲得したに違いないと解されている。Ｅ．ｃｏｌｉの莢膜に位置するＫ抗原は、遺伝子の機能形態を有する株の病理表現形と関連する場合が多い。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの領域２が、挿入エレメント（ＩＳ１）によって不活性状態になっており、抗原の生産が妨げられているが、野生型の莢膜抗原の排出及び提示を補助する領域１及び３はインタクトなままである［Andreishcheva et al. Gene (2006) 384: 113-119］。しかしながら、機能的なグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの再構築の可能性が理論的にはあり、例えば、領域２のＩＳ１が無くなり、それによって、グループＩＩクラスターが再構築される可能性がある。代替的には、ＩＳ１変異領域が外来性の野生型の領域２と交換されると、グループＩＩクラスターも再構築される可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Andreishcheva et al. Gene (2006) 384: 113-119
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの永久的なノックアウト（ＫＯ）を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を提供し、当該株を他の商業的に重要な株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２と同じ安全な種類にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、不可逆的に不活性化されたグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株に関する。
【０００８】
１つの実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株は、遺伝子ＩＩ莢膜遺伝子クラスターの全体又は一部の欠失を有することを特徴とする。
【０００９】
１つの実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの全体の欠失を有することを特徴とする。
【００１０】
１つの実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの一部の欠失を有することを特徴とする。
【００１１】
さらなる実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの１又は複数の点変異を有することを特徴とする。
【００１２】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１３】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも２５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１４】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも４０％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１５】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも５５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１６】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの７５から１００％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１７】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも８５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１８】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも９５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１９】
１つの実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの３０％が欠失されている。
【００２０】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの５０％が欠失されている。
【００２１】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの７０％が欠失されている。
【００２２】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの８０％が欠失されている。
【００２３】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの９０％が欠失されている。
【００２４】
１つの実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉの株がＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、さらなる実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉの株がＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸ Δａｌｒである。
【００２５】
本発明は、
ａ．選択マーカーによってグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを置換する工程、
ｂ．選択マーカーを除去する工程、
ｃ．ＰＣＲ分析によって欠失を確認する工程
を含む方法によってグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターが欠失される、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法も企図する。
【００２６】
１つの実施態様では、選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。
【００２７】
他の実施態様では、抗生物質耐性遺伝子は、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、バンコマイシン、及びエリスロマイシンからなる群から選択される。
【００２８】
さらなる他の実施態様では、抗生物質耐性遺伝子はクロラムフェニコールである。
【００２９】
本発明は、本発明のＥ．ｃｏｌｉ株に、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを導入することによって、ペプチドを製造するための方法にも関する。
【００３０】
１つの実施態様では、本発明は、ペプチドをコードするＤＮＡの発現のための条件で適切な培養培地において、本発明に係るＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株を培養する工程を含む、ペプチドの製造方法も企図する。発現ベクターで発現するペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現することができる任意のペプチドであってよい。そのようなペプチドの代表例は、ｈＧＨ、グルカゴン様ペプチド、インターロイキン、インスリンアナログ、野生型アジポネクチン、ＦＧＦ−２１、トリプシン、アプロチニン、アミリン及びレプチン並びにそれらのアナログ、並びに酵素、例えば、シアリダーゼ、トランスグルタミナーゼ（ｔＧａｓｅ）、ＨＲＶ（ヒトライノウイルス）３Ｃプロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、及びそれらのバリアントである。
【００３１】
１つの実施態様では、本発明のＥ．ｃｏｌｉ株は、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む。
【００３２】
１つの実施態様では、製造するペプチドはｈＧＨである。
【００３３】
他の実施態様では、製造するペプチドはＦＧＦ−２１である。
【００３４】
他の実施態様では、製造するペプチドはアミリンである。
【００３５】
他の実施態様では、製造するペプチドはレプチンである。
【００３６】
他の実施態様では、製造するペプチドはシアリダーゼである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、非コード隣接領域を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）莢膜遺伝子クラスターの遺伝子構成を示す。Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）莢膜遺伝子クラスターのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（大きい矢印）；転写方向（矢頭）；領域１遺伝子（灰色の矢印）；領域２のＯＲＦ（黒色の矢印）；領域３の遺伝子（白色の矢印）；ＩＳ１エレメント（白色ボックス）［Andreishcheva et al. Gene (2006) 384: 113-119］。小さい矢印は、非コード左アーム（ＬＡ）及び右アーム（ＲＡ）の位置を示す。
【図２】図２は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターノックアウト方法：ａ）抗生物質耐性遺伝子によるグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの置換、及びｂ）抗生物質耐性遺伝子の除去のワークフローの略図である。
【図３】図３は、ノックアウト候補のＰＣＲスクリーニングを示す。ノックアウト候補（親株ではない）（ＢＬ又はＤ）から増幅した、正しいサイズである１６８６ｂｐ（ＬＡ＋ｃａｔの一部、上の図のＡ１からＡ３、下の図のＢ１からＢ３、及び１５７８ｂｐ（ＲＡ＋ｃａｔの一部、上の図のＡ１からＡ３、下の図のＢ１からＢ３）は、グループＩＩ遺伝子クラスターのノックアウトが成功したことを示す。陰性対照については、親株のみであると約３ｋｂのサイズのバンドを有するが、グループＩＩノックアウト株ではそうではない。ＢＬはＢＬ２１（ＤＥ３）を示し、ＤはＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ株を示す。Ａ１からＡ３は、異なるコロニーナンバーのＢＬ２１（ＤＥ３）ノックアウト候補であり、Ｂ１からＢ３はＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ株のノックアウト候補である。
【図４】図４は、振盪したフラスコ中の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株の増殖の比較である。使用する記号は、以下の株を示す：●：ＢＬ２１（ＤＥ３）；□：ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）；−：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ；△：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）。
【図５】図５は、異なるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の発酵増殖曲線を示す。使用する記号は、以下の株を示す：◆：ＢＬ２１（ＤＥ３）；□：ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）；−：ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＮＮＣ１−ｇ；○：ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−ｇ。
【図６】図６は、異なる誘導時点におけるｈＧＨ発現のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気誘導（ＰＡＧＥ）を示す：ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＮＮＣ−１ｇにおける発現、及びｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮｃ１−ｇにおける発現。ａ）及びｂ）の双方において、レーン１から３は、ｈＧＨの異なる濃度：５μｇ、２．５μｇ、及び１．２５μｇの各々を示す。レーン４は誘導前のｈＧＨの発現を示し、レーン５から１４は、１から１０時間の毎時の異なる誘導時点におけるｈＧＨの発現を示す。全てのサンプルは、同じロードＯＤに対して正規化した。
【図７】図７は、ｈＧＨ発現の誘導の前及び後の異なるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の増殖を示す。使用する記号は、以下の株を示す：◆：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈ；□：ＢＬ２１ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈ；Δ：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈ誘導；−：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈ誘導。
【図８】図８は、異なる誘導時点におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したｈＧＨの発現を示す：ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈ；ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈ。ａ）及びｂ）の双方において、レーン１から３は異なる濃度：５μｇ、２．５μｇ、及び１．２５μｇの各々におけるｈＧＨの発現を示す。レーン４は誘導前のｈＧＨの発現を示し、レーン５から１３は１から９時間の毎時の誘導時点におけるｈＧＨの発現を示す。全てのサンプルは、同じロードＯＤに対して正規化した。
【図９】図９は、ＦＤＭ１−２培地における高細胞密度発酵におけるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１ａ．２３の増殖曲線を示す。ｈＧＨ変異体であるＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現は、細胞密度が７０ＯＤ６００に達した際に、０．２ｍＭの終濃度までＩＰＴＧを添加することによって誘導し、２５℃で培養し続けた。最終的な細胞密度は、誘導の８時間後に約１００ＯＤ６００に達した。
【図１０】図１０は、高細胞密度発酵の間のＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現を示す。レーン１：マーカー；レーン２から４：５、２．５、１．２５μｇの各々の濃度の標準としての精製ｈＧＨ；レーン５から１３：０、１、２、３、４、５、６、７、及び８時間の各々の間にわたって誘導した後の異なる時間間隔で得たサンプル。矢印は標的タンパク質であるＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）を示す。
【図１１】図１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるアースロバクター ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼの発現のための発酵サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１：マーカー；レーン２：誘導前のホモジネート；レーン３：誘導後のホモジネート；レーン４：最終サンプルのホモジネート；レーン５：誘導前の不溶性画分；レーン６：誘導後の不溶性画分：レーン７：最終サンプルの不溶性画分：レーン８：誘導前の可溶性画分；レーン９：誘導語の可溶性画分；レーン１０：最終サンプルの可溶性画分；レーン１１から１２：標準シアリダーゼ（１５０及び３００ｍｇ／ｌ）。全てのサンプルは１０倍希釈した。
【図１２】図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１ ＤＥ３及びＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）のヒト由来ＦＧＦ２１、アミリン、及びレプチンの発現を示す。レーン１：マーカー；レーン３から８：ＢＬ２１ ＤＥ３における発現；レーン９から１４：ＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）における発現；レーン３及び９：非誘導；レーン４及び１０：誘導したＦＧＦ２１；レーン５及び１１：非誘導；レーン６及び１２：誘導したアミリン；レーン７及び１３：非誘導；レーン８及び１４：誘導したレプチン。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、不可逆的に不活性化したグループＩＩクラスターを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株に関連し、ペプチド製造のための永久的に安全な株を提供する。
【００３９】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）の野生型又は任意の他の株のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの損傷又は不活性化は、クラスター全体又はその一部の欠失を含む任意の適切な方法又は遺伝子クラスターの１又は複数の点変異によって達成されてよい。
【００４０】
本発明のＥ．ｃｏｌｉ株は、一般的に産業的に使用されていた株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２と比較して、ペプチド製造のためのより着実かつ高収量な方法を提供するという利点を有する。
【００４１】
本発明で使用するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ＷＯ２００８／０２５７４４に記載のダブルノックアウト（２×ＫＯ）であってよい。このＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、双方がＤ，Ｌ−アラニンラセマーゼをコードするａｌｒ及びｄａｄＸの２遺伝子を欠失している。このダブルノックアウト株は、Ｄ−アラニンの増殖培地に対する添加又は必要なＤ−アラニンを供給することができるプラスミド上のラセマーゼ遺伝子の１つの存在のいずれかが無ければ増殖することができない。この２×ＫＯ Ｄ−アラニン栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株は、本明細書においてＥ．ｃｏｌｉ． Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸと称され、細胞中のプラスミドの維持のための非抗生物質選択方法を可能にする。
【００４２】
本発明の１つの実施態様では、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸ株のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスター内の１又は複数の遺伝子を欠失する。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）はＳｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔ［J.Mol.Biol. (1986) 189:113-130］及びＳｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ［Methods in Enzymology (1990) 185:60-89］に開示されており、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ及びＮｏｖａｇｅｎから入手可能である。
【００４３】
本発明の１つの実施態様では、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスター内の１又は複数の遺伝子が欠失される。本発明の他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸのグループＩＩ莢膜遺伝子クラスター内の１又は複数の遺伝子が欠失される。
【００４４】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスター内の欠失に選択される１又は複数の遺伝子は、潜在的な病原性に関与するものである。１６ｋｂのグループＩＩ莢膜遺伝子クラスター全体の欠失は、病原性の莢膜の表現型の潜在的な再構築の予防を提供する。図１は、領域１遺伝子ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ、領域２ ＯＲＦ１−４、及び領域３ ｋｐｓＭ及びｋｐｓＴを含む莢膜を有する株のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターに含まれる遺伝子を示す。これらの遺伝子のいずれか１つ又はそれらの組合せが欠失されてよい。
【００４５】
グループＩＩ莢膜遺伝子クラスター全体の欠失は、３つの領域の欠失、すなわち、Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を意味する。得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）である。
【００４６】
１つの実施態様では、本発明は、挿入エレメント（ＩＳ１）は別として、グループＩＩ遺伝子クラスターを不活性化するのに十分な任意の修飾を企図する。
【００４７】
細菌は１倍体生物であり、すなわち、それらは１つのみの染色体を有するため、組換えはたいてい、環境から新規ＤＮＡを獲得した際にのみ、例えば、形質転換を通じて生じる。さらに、例えば、線状ＤＮＡを分解する細胞内エキソンクレアーゼのため、細菌は、線状ＤＮＡでは容易に形質転換できない。しかしながら、組換え複合体のエキソヌクレアーゼを欠いている、組換え能力がある変異体は、線状ＤＮＡで形質転換をすることができる。リコンビナーゼは、天然の組換え反応を触媒する酵素であり、λ Ｒｅｄは、他の組換え系と比較した際に組換え速度の向上を示すことが示されている。本発明の株のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの欠失方法は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ［(2000) PNAS 97(12): 6640-6645］によって開発されたＲｅｄ媒介組換え技術又は他の従来の方法論に基づいてよい。
【００４８】
図２は、本発明の株の１６ｋｂのグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの欠失方法の略図を示す。１つの実施態様では、前記方法の第一工程は、ヌクレオチド相同性伸長部（nucleotide homolgy extension）又はＲＡ及びＬＡ領域（図１参照）とともにプライマーを使用することによるＰＣＲによって生成される、選択マーカーを使用する、１６ｋｂのグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの置換である。これは、これらの隣接相同性伸長部におけるＲｅｄ媒介組換えによって達成される。選択の後の、本方法の第二工程は、選択マーカーに隣接する直接反復ＦＲＴ（ＦＬＰ認識標的）部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを発現するヘルパープラスミドを使用することによる選択マーカーの除去である。Ｒｅｄ及びＦＬＰヘルパープラスミドは、温度感受性レプリコンであるため、３７℃における増殖によって取除く。第三工程は、ＰＣＲ分析による欠失の確認を含む。
【００４９】
細菌の形質転換は、ＤＮＡを取込むことによる安定な遺伝子変化と称されてよい。コンピテンスは、外来性ＤＮＡを取込むことができる状態を示す。ある細菌は、天然に、実験室条件下でＤＮＡを取込むことができ、そのような細菌は、細胞の１又は複数の膜を越えてＤＮＡを輸送するための機構を特定する遺伝子セットを有するが、他のものは、天然には通常生じない条件を使用して、細胞が受動的にＤＮＡ透過性にされる実験手法によって誘導しなければならない。二価陽イオン、例えば、Ｃａ２＋（ＣａＣｌ２中）の存在下で細胞を冷却することは、プラスミドＤＮＡに透過性になるように細胞壁を調製する。細胞をＤＮＡとともに氷上でインキュベートし、次いで、短くヒートショックを与え（例えば、３０から１２０秒間、４２℃）、ＤＮＡを細胞内に入れる。これは当該技術分野においてよく知られた方法である［Sambrook et al., A Laboratory Manual (1989) CSH］。エレクトロポレーションは、細菌（及び他の）細胞に穴を作製する他の方法であり、それらにｋＶ範囲の電場で短い間でショックを与えることによる。この穴を通って、プラスミドＤＮＡは細胞に入ることができる。この方法は、大きなプラスミドＤＮＡの使用に適している。天然の膜修復機構は、ショックの後に穴を直ぐに閉じるであろう。細胞に維持及び安定に保持するために、プラスミドＤＮＡ分子は、染色体からは独立して細胞内で複製することを可能にする複製起点を含む必要がある。
【００５０】
本明細書に記載の任意の遺伝子不活性化方法を使用する際に、グループＩＩ遺伝子クラスターの一部又は全体の任意の標的とした不活性化が選択マーカーによって検出されて、修飾されたＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株クローンが同定及び単離される。
【００５１】
選択マーカーは、任意の適切なマーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子又は栄養要求性マーカーであってよい。
【００５２】
適切な抗生物質耐性遺伝子は、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、バンコマイシン及びエリスロマイシン若しくはβ−ラクタムの任意の他の代表例、アミノグリコシド、グリコペプチド、又はマクロライド抗生物質である。
【００５３】
本明細書で使用する用語「クローニング」は、ＤＮＡの配列の多数の同一のコピーの作製を伴う。標的ＤＮＡ配列は、次いで、クローニングベクターに挿入される。このベクターは自己複製ウイルス、プラスミド、又は高等生物細胞に由来するため、適当なサイズのＤＮＡが挿入される際は、「標的及びベクターＤＮＡ断片を、次いで、連結し」、組換えＤＮＡ分子を作製する。次いで、形質転換後に幾つかの同一のコピーを生産する細菌株（通常はＥ．ｃｏｌｉ）に組換えＤＮＡ分子を入れる。形質転換は、細菌が有するＤＮＡ取込み機構である。しかしながら、所定の複製起点を有する１つの組換えＤＮＡ分子のみが、１つの細菌細胞内で確立することができ、そのため、各クローンは１つのＤＮＡインサートのみを有する。
【００５４】
本明細書で使用する用語「ゲノム」又は「遺伝的構成物」は、遺伝することが可能であり及び／又はそうでなければ伝達性である、遺伝的物質全体、その構造及び機能の双方を指し、特定の細胞又は微生物内に含まれている。微生物のゲノム（遺伝的構成物）は、かくして、染色体ＤＮＡ及び染色体外ＤＮＡ（例えば、プラスミド及びＲ因子など）を含むと解される。
【００５５】
本明細書で使用する用語「約」は、所定の数値の合理的な近傍、例えば、±１０％を意味する。
【００５６】
本明細書で使用する用語「ノックアウト」は、１つ又は複数の遺伝子が欠失又は不活性化されている（生物から「ノックアウト」されている）、遺伝子操作された細菌株を意味する。ノックアウト生物は、配列決定されているが、未知の機能を有する遺伝子の役割を研究するためのモデルとして通常は使用される。ノックアウト技術を使用して、興味のある生物から望ましくない遺伝子及び／又は潜在的な病原性遺伝子を除去してよい。
【００５７】
本明細書で使用する用語「遺伝子クラスター」は、遺伝的及び機能的に連関した２以上の遺伝子のセットを意味する。共通の祖先に由来する集団は同じ遺伝子クラスターの種を有する傾向があり、細菌の進化の過程を遡るのに有用である。
【００５８】
用語「親株」は、縮小したゲノムの株の由来である任意の細菌株であってよい。本発明に係る親株の代表例は、Ｅ．ｃｏｌｉ株、例えば、Ｂ若しくはＣ、又はそれらと実質的に同一のゲノム配列を有する株を含むが、それらに限らない。
【００５９】
所定の細菌宿主細胞で製造されるペプチドの「レベル」又は「量」なる本明細書で使用される用語は、選択した製造方法に従って、細胞培養物中に存在する又は検出可能なペプチドの定量的尺度であってよい。例えば、選択したペプチド製造方法が細胞自体の内部におけるペプチドの蓄積をもたらす場合には、製造されたペプチドのレベル又は量は、細胞自体の内部に存在するペプチドの定量的尺度である。ペプチド製造方法がペプチドの分泌を伴う場合には、ペプチド製造レベルは、増殖培地に存在するペプチドの定量的尺度であろう。
【００６０】
ペプチドの「収量」なる本明細書で使用する用語は、本質的に純粋なペプチドの定量値であり、ここでいうペプチドは、宿主株と天然に関連を有するペプチドから本質的に遊離して回収及び／又は精製されている。細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株によって製造されたペプチドの定量的な「収量」又は「量」を確認する際に、従来のペプチド特異的な方法、例えば、イムノアッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、酵素活性、分光光度法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを使用することができる。
【００６１】
本明細書で使用する用語「発現調節配列」は、作動可能に連結した核酸の転写を管理する転写因子結合部位の配列又はプロモーターを意味する。
【００６２】
二本鎖核酸に関連して使用する用語「遊離端」は、平滑遊離端若しくは付着遊離端又はそれらの組合せを有する線状核酸を意味してよい。
【００６３】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、ポリペプチド又はその前駆体をコードする核酸配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。ポリペプチドは、全長又は断片の所望の活性又は機能的性質（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、抗原性など）が維持されている限りにおいて、コード配列の全長又はコード配列の任意の一部によってコードされ得る。前記用語は、全長ｍＲＮＡに転写される遺伝子に寄与する、５’及び３’末端の双方のコード領域に隣接して位置する配列も包含する。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態（ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｏｒｍ）を含む。遺伝子のゲノム形態又はクローンは、例えばイントロンと称される非コード配列で中断されるコード領域を含んでよい。
【００６４】
用語「導入する」又は「導入された」は、株への核酸の添加と関連して使用される際には、核酸が、株の染色体に組み込まれるか又はベクター、例えば、プラスミド上で株に含まれることを意味する。
【００６５】
本明細書で使用する用語「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、終止コドンを含まない遺伝子配列である。
【００６６】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、天然又は組換えのいずれかの、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質、並びにその断片、誘導体、ホモログ、バリアント、及び融合体を意味する。
【００６７】
グループＩＩノックアウト株の増殖は、振盪したフラスコ中及び高密度発酵槽中で、それらの親株と比較して評価した。実験によって、グループＩＩノックアウトは、いずれの株の背景においても細胞増殖に影響を与えないことが示された。高密度発酵槽において、発現試験をするために、複数のペプチドを有する発現ベクターでグループＩＩ欠失株を形質転換した。
【００６８】
１つの実施態様では、本発明のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株において製造するためのペプチドは、ｈＧＨ、グルカゴン様ペプチド、インターロイキン、インスリンアナログ、野生型アジポネクチン、ＦＧＦ−２１、トリプシン、アプロチニン、アミリン及びレプチン並びにそれらのアナログ、酵素、例えば、シアリダーゼ、トランスグルタミナーゼ（ｔＧａｓｅ）、ＨＲＶ（ヒトライノウイルス）３Ｃプロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、及びそれらのバリアント、並びに任意の他のペプチド又はＥ．ｃｏｌｉで発現系が作動可能であるペプチドからなるが、それらに限らない群から選択されてよい。
【００６９】
本発明は、上述のヒトペプチドの製造方法にも関する。一般的には、クローン化した野生型ペプチドの核酸配列は、所望のタンパク質をコードするように修飾される。この修飾配列は、次いで、発現ベクターに挿入され、次に宿主細胞に形質転換又は形質移入される。作動可能な発現系は、典型的には、Ｓｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔ［J.Mol.Biol. (1986) 189:113-130］及びＳｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．［Methods in Enzymology (1990) 185:60-89］に記載の従来の遺伝子発現成分を含む。
【００７０】
宿主細胞中で製造するペプチドは、融合ペプチドとして合成されるか、培地中又は細胞膜周辺腔に分泌されるか、細胞質中に遊離の形態で製造されるか、又は細胞内構造体、例えば、封入体に蓄積される。同様に、ペプチド精製は、興味のあるペプチドに対して従来技術によって適合される、上述の従来の一般的に利用可能な方法の使用を伴う。
【００７１】
本発明は、任意のタイプのペプチドの製造に適している。
【００７２】
１つの実施態様では、グループＩＩノックアウトＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１宿主細胞中における製造に選択されるペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）であり、１つの実施態様では、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、ｈＧＨ前駆体からｈＧＨを作製する方法を開示するＥＰ２１７８１４に記載の前駆体ペプチドから製造される。
【００７３】
さらなる実施態様では、成長ホルモンは、ｈＧＨアナログの前駆体であるＭＥＡＥ（ＳＥＱ ＩＤ １６）−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）であり、ｈＧＨ分子の１０１位のロイシンがシステインによって置換されている。
【００７４】
他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１、及び／又はその誘導体である。
【００７５】
本明細書で使用する用語「グルカゴン様ペプチド」は、グルカゴンファミリーのペプチド、エキセンジン、及びそのアナログを意味する。グルカゴンファミリーのペプチドは、プレグルカゴン遺伝子によってコードされ、高い相同性を有する３つの小さなペプチド、すなわち、グルカゴン（１−２９）、ＧＬＰ−１（１−３７）、及びＧＬＰ−２（１−３３）を含む。エキセンジンは、トカゲで発現しているペプチドであり、かつ、ＧＬＰ−１のようにインスリン分泌を促進する。エキセンジンの例は、エキセンジン−３及びエキセンジン−４である。
【００７６】
本明細書で使用する用語「グルカゴン様ペプチドアナログ」は、修飾されたグルカゴン様ペプチドであり、グルカゴン様ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、及び／又は１又は複数のアミノ酸残基がグルカゴン様ペプチドから欠失されており、及び／又は１又は複数のアミノ酸残基がグルカゴン様ペプチドに付加されている。そのようなアミノ酸残基の付加又は欠失はペプチドの任意の位置で起こり得る。
【００７７】
実験
株のグリセロールストックを調製するために、適当な抗生物質を含む２ｍｌのＬＢ培地を含む１２ｍｌ試験管に１つのコロニー移して、２２０ｒｐｍで振盪しながら２時間にわたって３７℃で増殖させた。
【００７８】
発酵種菌を調製するために、グリセロールストックの細胞を、アンピシリンを含むか又は含まないＬＢプレートにストリークする。一晩の後に細胞をＬＢ培地で洗浄して、各々適当な抗生物質濃度を有する１００ｍｌの発酵複合培地を含む５００ｍｌ振盪フラスコに植菌して、３７℃において２２０ｒｐｍで浸透しながら３〜４時間にわたって増殖させた。次いで、約０．５ ＯＤ６００の濃度に細胞をリアクターに植菌した。
【００７９】
適当な抗生物質を含む２．５Ｌの初期容量の発酵複合培地を含む５Ｌバイオリアクターにおいて、好気条件下で発酵を実施した。０時点において、リアクターは約０．５のＯＤ６００に植菌した。５Ｎ ＮＨ３及びＨ２ＳＯ４を使用してｐＨを７．０に維持した。６ｍｌ／分の一定空気流速を培養期間に培養物に拡散させた。温度は３７℃に維持した。２０％の飽和Ｏ２まで溶存酸素レベルを維持することによって、攪拌をカスケード制御した。
【００８０】
フェドバッチ実験を実施して、高密度発酵槽において、グループＩＩ欠失株の増殖及びペプチド発現を親株と比較した。２７ｇ／ｌのグリセロールを添加した複合培地を発酵槽に入れた。０時点において、発酵槽は０．５のＯＤ６００に植菌した。溶存酸素の増加によって示された、基礎のグリセロールの摂取に伴って、工程を増加する際にグリセロール及び酵母抽出物を連続的に添加した。ＯＤ６００及びタンパク質発現を測定するためのサンプルは、発酵槽から回収して、分光光度計及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００８１】
細菌中のタンパク質発現の誘導は、当該技術分野においてよく知られている。本発明では、タンパク質発現の誘導はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって実施する。
【００８２】
本発明のある実施態様で使用するプラスミド及び株を、表１及び２の各々に記載する。プラスミドの作製は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．［A Laboratory Manual (1989) CSH］に記載された標準的な分子生物学的技術を使用して実施した。
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【実施例】
【００８６】
実施例１：置換カセットの構築
ＰＣＲ増幅のためのＤＮＡの起源として、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用した。オリゴヌクレオチドプライマー（LA_BL_GII_F/LA_BL_GII_R）（表３）を合成して、ＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩクローニング部位を含むＫｐｓＭの５’末端の上流の１００１ｂｐ領域を標的とした。左アーム（ＬＡ）として、ゲノムＤＮＡから当該領域を増幅した。右アーム（ＲＡ）に関しては、オリゴヌクレオチドプライマー（RA1_BL_GII_F/RA1_BL_GII_R）（表３）を合成して、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩクローニング部位を含むＫｐｓＦの５’末端の上流の１１０８ｂｐ領域を標的とした。左アーム及び右アームのＰＣＲ産物を産生した。以下のパラメータ：９４℃で５０秒間の変性、５７℃で６０秒間のアニーリング、及び７２℃で６０秒間のプライマー伸長を全部で３０サイクル含むプログラムを使用して、サーマルサイクラーにおいてＤＮＡ増幅反応を実施した。正確なバンドサイズのＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲル上でゲル電気泳動によって観察して、５０μｌの増幅産物をゲルから抽出して、置換断片を構築するために使用した。オリゴヌクレオチド配列のリストを表３に示す。
【００８７】
増幅した左アームは、ゲルから精製して、プラスミドｐＥＺ−Ｔに連結し、プラスミド−Ｔ−ＬＡを製造した。制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩによって、ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ断片を消化して、ｐＥＺ−Ｔ−ＬＡのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結し、ｐＥＺ−Ｔ−ＬＡ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴをもたらした。増幅した右アームをプラスミドｐＧＥＭ−Ｔに連結して、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩで消化した。アンピシリン耐性遺伝子を有するＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ消化したＤＮＡ断片を、プラスミドｐＥＺ−ＬＡ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴに連結した。クロラムフェニコール耐性遺伝子は、置換断片を同定するための選択マーカーを提供する。得られたプラスミドｐＥＺ−ＬＡ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ−ＲＡを使用して、ノックアウトＢＬ２１（ＤＥ３）株を製造した。
【００８８】
実施例２：ノックアウトＢＬ２１（ＤＥ３）株の製造
ＬＢ培地で一晩にわたって３７℃においてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を増殖させ、ＢＬ２１（ＤＥ３）のヒートショックコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。プラスミドｐＫＤ４６でＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換して、形質転換した細胞を０．４ＯＤ６００ｎｍまで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地中で増殖させた。Ｒｅｄリコンビナーゼの発現は、Ｌ−アラビノース（終濃度１ｍｍｏｌ／ｌ）によって１時間にわたって誘導した。
【００８９】
グループＩＩ遺伝子クラスターノックアウトについては、ｐＥＺ−Ｔ−ＬＡ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ−ＲＡから増幅した置換断片の５００ｎｇを、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に、エレクトロポレーションによって移した。エレクトロポレーションコンピテント細胞は標準的な方法で調製した。細胞の回収は、３０℃で１．５時間にわたって実施した。８μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加したＬＢ寒天に細胞をプレーティングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔのクロラムフェニコール耐性コロニーが、３０℃における一晩のインキュベーション後に形成された。
【００９０】
染色体の正しい位置におけるグループＩＩ遺伝子クラスターの完全なノックアウトを確実なものとするために、グループＩＩ遺伝子クラスターの左及び右アームの外側に相同性を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。近いフランキング領域の高い相同性に基づいて、２つのゲノムのグループＩＩクラスターの類似している位置を推定して、Ｅ．ｃｏｌｉ ５３６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＣＰ０００２４７．１）の１８ｋｂの公開配列の外側のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）のフランキング配列の欠失をＰＣＲスクリーニングプライマーの設計のために使用した。３つのクロラムフェニコール耐性コロニーを遺伝子置換について試験した。
【００９１】
クロラムフェニコール耐性コロニーの表現型試験を、少なくとも２世代にわたってＬＢ＋Ｃｍ（２５μｇ／ｍｌ）における増殖によって実施した。クロラムフェニコール耐性コロニーの全てが、ＬＢ＋Ｃｍ（２５μｇ／ｍｌ）培地において非常に良好に増殖することができるであろう。クロラムフェニコール耐性Ｄ−アラニン栄養要求性株も、Ｄ−アラニンを添加して同様の方法において試験した。
【００９２】
置換の成功が、１６８６ｂｐ及び１５７８ｂｐのバンドによって確認された。
【００９３】
オリゴヌクレオチドプライマー（ＬＡ＿ＳＥＱ＿Ｆ１／Ｃａｔ＿ＩＤ＿Ｒ）を使用して、左アーム及びｃａｔ遺伝子の一部を含むバンド（１６８６ｂｐのサイズ）を増幅し、オリゴヌクレオチドプライマー（ＲＡ＿ＳＥＱ＿Ｒ１／Ｃａｔ＿ＳＥＱ＿Ｆ）を使用して、右アーム及びｃａｔ遺伝子の一部を含むバンド（１５７８ｂｐのサイズ）を増幅した。３つのクロラムフェニコール耐性コロニーに関しては、バンドの正確なサイズによって、１６ｋｂのグループＩＩ遺伝子クラスターがｃａｔ遺伝子によって置換されたことが示された（図３）。ｋｐｓＦ及びｋｐｓＥの一部を含む右アームを含む３０００ｂｐのバンドのネガティブコントロールを作製した。これは、コントロール株（置換前）にのみ現れて、クロラムフェニコール耐性株には現れないべきである。オリゴヌクレオチドプライマー（ＲＡ６＿ＢＬ＿ＧＩＩ＿Ｆ／ＲＡ６＿ＢＬ＿ＧＩＩ＿Ｒ）（表３）を使用して、ｋｐｓＦ及びｋｐｓＥを増幅した。ＰＣＲの結果は、対照株のみ当該バンドを有し、クロラムフェニコール耐性株が有しないことを示した。
【００９４】
ＬＢ培地における増殖の間にＤ−アラニンの添加を必要とする、Ｄ−アラニン栄養要求株であるＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄｘΔａｌｒに同じ消去法を適用した。
【００９５】
クロラムフェニコール耐性株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔを、それらの表現型及びＰＣＲスクリーニングによって確認し、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターがｃａｔ遺伝子によって置換されたことを確認した。
【００９６】
実施例３：薬剤耐性マーカーの除去及びグループＩＩノックアウト株の特性決定
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔ細胞を、ＬＢ培地において、３７℃で、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール又は第二の株には２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに１００ｍＭのＤ−アラニンとともに増殖させた。２つのノックアウト株のエレクトロポレーションコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。プラスミドｐＣＰ２０（ＣｍＲ、ＡｍｐＲ）で２つのノックアウトコンピテント株を形質転換した。薬剤耐性マーカーの除去は、穏やかに振盪しながら１時間にわたって３０℃においてＳＯＣブロスで形質転換した細胞を増殖させることによって実施した。プレート状のアンピシリン耐性候補クローンの複数のシングルコロニーを、３０℃で一晩培養した後に選択した。候補クローンを、ＬＢ培地のみ又はＤ−アラニンを添加したＬＢ培地で３７℃において３時間にわたって増殖させ、プラスミドｐＣＰ２０を除去した。ＬＢ培地のみ又はＤ−アラニンを添加したＬＢ培地で現れた、５つのシングルコロニーをＰＣＲスクリーニングによってさらに特性決定した。
【００９７】
ＬＢ、ＬＢ＋Ｃｍ（８μｇ／ｍｌ）、及びＬＢ＋Ａｍｐの複数のシングルコロニーを増殖させることによって、ｃａｔ除去株の表現型試験を実施した。全てのｃａｔを除去したコロニーは、ＬＢ培地でのみ増殖できるであろう。ｃａｔを除去したＤ−アラニン栄養要求性株については、５つのコロニーの全てがＤ−アラニンを添加したＬＢ培地のみで増殖できるであろう。かくして、ｃａｔ遺伝子が除去された。
【００９８】
ｃａｔ遺伝子の除去の成功は、２３８１ｂｐバンドによって確認されるべきである。オリゴヌクレオチドプライマー（ＬＡ＿ＳＥＱ＿Ｆ２／ＲＡ＿ＳＥＱ＿Ｒ１）を使用して、左アーム及び右アームを含むバンドを増幅した。全てのシングルコロニーについて、２３８１ｂｐのバンドの出現によって、ｃａｔ遺伝子が除去されたことが示された。
【００９９】
ノックアウト株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）は、それらの表現型及びＰＣＲスクリーニングによって確認した。双方の株のグリセロールストックを保存のために調製した。
【０１００】
実施例４：振盪フラスコ中におけるノックアウト宿主株の増殖
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）細胞を、ＬＢプレートで一晩にわたって３７℃で増殖させた。一晩たったプレートから回収した適当量の細胞を、２５ｍｌのＬＢ培地を含むバッフル付き２５０ｍｌ振盪フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ）に約０．０５ ＯＤ６００の濃度まで植菌した。２２０ｒｐｍで振盪しながら８時間にわたって、細胞を３７℃で増殖させた。各株のサンプルを１／２時間毎に回収し、ＯＤ６００で細胞の増殖を比較した。
【０１０１】
振盪フラスコにおける増殖の比較のために、Ｄ−アラニンを添加して、同一の作業順序をＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）に対して実施した。
【０１０２】
図４の結果は、ＢＬ２１Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）の一晩の増殖は、ＬＢ培地を用いた振盪フラスコにおいて、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）と同一であったことを示す。ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）をＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒと比較した際も同じ結果が得られるであろう。
【０１０３】
実施例５：高密度発酵における宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）の間の増殖及びＭＥＡＥ−ｈＧＨ発現の比較
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）細胞をＬＢプレート上で増殖させた。ノックアウト株のヒートショックコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。ｈＧＨの発現カセットを含むプラスミドｐＮＮＣ１−ｇ（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ（ＡｍｐＲ））で、Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）コンピテント細胞を形質転換し、そこから形質転換した細胞のグリセロールストックを調製した。
【０１０４】
高密度発酵は、上述のとおり好気条件下で実施した。
【０１０５】
図５は、ＢＬ２１Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）の経時的な増殖が、複合培地中で高密度発酵槽において、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）と同一であったことを示す。同じ結果が、ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−ｇをＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＮＮＣ１−ｇと比較した際にも得られるであろう。非誘導状態において、細胞密度が約１４０のＯＧ６００に達した。ｈＧＨの発現は、細胞の増殖が８０のＯＤ６００に達した際に、１ｍＭの濃度までＩＰＴＧを添加することによって実施した。３０℃におけるＩＰＴＧ誘導の１０時間後に、細胞密度が約１００のＯＤ６００に達した。
【０１０６】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＮＮＣ１−ｇ及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−ｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで認められるとおり、ｈＧＨの製造に有効である。ｈＧＨ発現レベルにおける増大は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで示される１から１０時間の誘導時間の増大にしたがう（図６）。ｈＧＨを製造する２つの株の能力は同一である。すなわち、遺伝子ＩＩクラスターを有するＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較した際の、宿主株Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）によるｈＧＨ発現における顕著な差異は認められなかった。
【０１０７】
実施例６：高密度発酵における宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）の間の増殖及びＭＥＡＥ−ｈＧＨ発現の比較
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）細胞を、Ｄ−アラニンを添加したＬＢ培地で増殖させた。ノックアウト株のヒートショックコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。Ｄ−アラニン補足遺伝子を含むｐＮＮＣ１−１ｈ（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ及びａｌｒＰ−ａｌｒＣＤ（ＡｍｐＲ））をＡａｔＩＩ／ＰｓｉＩを使用して消化し、その後の平滑末端及びプラスミドのセルフライゲーションによって、プラスミド上のａｌｒ遺伝子の選択のためのｂｌａ−プラスミドを得た。プラスミドｐＮＮＣ１−１ｈ（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ，ａｌｒＰ−ａｌｒＣＤ，ｂｌａ−）で、ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）コンピテント細胞を形質転換した。Ｄ−アラニンを添加していないＬＢプレート上に一晩であらわれたコロニーを、グリセロールストックの調製のために単離した。
【０１０８】
高密度発酵を図５に記載のとおりに実施した。
【０１０９】
図７は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈの経時的な増殖が、ＦＭＣ１培地中で高密度発酵槽において、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈと同一であったことを示す。同じ結果が、Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈをＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈと比較した際にもｈＧＨの誘導下で得られるであろう。非誘導状態において、細胞密度が約１２０のＯＧ６００に達した。ｈＧＨの発現は、細胞の増殖が８０のＯＤ６００に達した際に、１ｍＭの濃度までＩＰＴＧを添加することによって実施した。３０℃におけるＩＰＴＧ誘導の９時間後に、細胞密度が約１００のＯＤ６００に達した。
【０１１０】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈ及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結果で認められるとおり、ｈＧＨの製造に有効である（図８）。ｈＧＨ発現レベルにおける増大は、誘導時間の増大にしたがう。ｈＧＨを製造する２つの株の能力は同一である。
【０１１１】
実施例７：高細胞密度発酵における宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を使用した細胞増殖及びＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現の評価
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）細胞を、Ｄ−アラニンを添加したＬＢ培地で増殖させた。ヒートショック方法を使用する形質転換のために、このトリプルノックアウト株のコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。
【０１１２】
アンピシリン耐性をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子を欠失するために、ＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）をコードし、かつ、宿主細胞のＤ−アラニン欠乏を補足するａｌｒＰ−ａｌｒＣＤを含むプラスミドｐＮＮＣ１ａ．２３（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ））をＡａｔＩＩ／ＰｓｉＩで消化し、その後に末端平滑化及びβラクタマーゼ遺伝子の除去のためのセルフライゲーションを実施した。得られたプラスミドであるｐＮＮＣ１ａ．２３（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ，ａｌｒ，ｂｌａ−）で宿主細胞であるＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）をヒートショック法によって形質転換した。Ｄ−アラニンを添加していないＬＢプレートで増殖したシングルコロニーを選択して、−８０℃における保存のためのグリセロールストックを調製した。
【０１１３】
２つのバッチの高細胞密度発酵を実施例５に記載のとおりに実施した。プロセスの間の細胞増殖を観察した。結果は、図９に示す。
【０１１４】
プラスミドｐＮＮＣ１ａ．２３を有する株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）によるＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現を高細胞密度発酵において評価した。結果は、回収時の細胞密度が、ＯＤ６００ｎｍで測定した際に約１００に達し得ることを示し、標的タンパク質であるＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現レベルが、図１０に示すとおり、８時間の誘導の後に約７ｇ／ｌに達した。
【０１１５】
実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるアースロバクター ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼの発現
アースロバクター ウレアファシエンスのシアリダーゼ（ＡＵＳ，５３．４ｋＤａ理論的質量）を、Ｃ末端のＨｉｓタグとともに大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）で製造した。Ｃ末端にＨｉｓ６タグを有する、アースロバクター ウレアファシエンスのシアリダーゼの遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御の下に発現ベクターｐＥＴ−２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。アースロバクター ウレアファシエンス由来のシアリダーゼ酵素を製造するために、以下のタンパク質配列をコードする合成コドン最適化遺伝子を産生した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：
MAPTPPNSPTLPPGSFSETNLAADRTAANFFYRIPALTYLGNDVVLAAWDGRPGSAADAPNPNSIVQRRSTDGGKTWGPVQVIAAGHVADASGPRYGYSDPSYIYDAEANKVFAFFVYSKDQGFGGSQFGNDDADRNVISSAVIESSDAGVTWSQPRLITSVTKPGTSKTNPAAGDVRSNFASSGEGIQLKYGPHKGRLIQQYAGDVRQADGSNKIQAYSVYSDDHGVTWHKGANVGDRMDENKTVELSDGRVLLNSRDNANRGYRKVAVSTDGGATYGPVSQDTELPDPANNGAIARMFPNAAQGSADAKKLIFTNANSKTGRENVSARVSCDDGETWPGVRTIRSGFSAYSTVTRLADGKFGVLYEGNYTDNMPFATFDDAWLNYVCAPLAVPAVNIAPSATQEVPVTVTNQEATTLSGATATVYTPSGWSATTVPVPDVAPGASVTVTVALTAPADASGPRSLNAAFTTADGRVSQFTFTATTPVAPQVGLTITGSALEHHHHHH。
【０１１６】
合成遺伝子は、ｐＥＴ−２４ａ発現ベクターにＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片として導入し、ＡＵＳ発現ベクターｐＬＬＣ０２８を製造した。得られたベクターで、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を形質転換し、形質転換体を−８０℃でグリセロール中で保存した。
【０１１７】
凍結した最初の細胞クローン（ＩＣＣ）の１つの凍結チューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）を使用して、２つの酵母抽出物媒体（酵母抽出物５ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ）寒天フラスコに植菌した。寒天媒体には選択のためにカナマイシンを含めた。インキュベーションを３０℃で２５時間にわたって実施した。インキュベーションの後に、滅菌０．９％ＮａＣｌ溶液を使用して細胞を寒天表面から洗って回収した。１０Ｌ発酵は、２つの寒天フラスコからの前培養物を使用して植菌した。得られた植菌材料の容量は７５ｍで、ＯＤ６００ｎｍは４．３であり、発酵槽の始めのＯＤ６００ｎｍは約０．０３であった。発酵は、１０Ｌの開始作業容量で２０Ｌステンレススチール容器で実施した。発酵は、４０ｇ／ｌ酵母抽出物、１５ｇ／ｌグリセロール（８７％）、塩、及び微量金属を含む複合培地に対して８時間のバッチフェーズで開始し、続いて、所定のプロファイルでグリセロールを加えた。最初の１７時間は、発酵温度は３７であった。その後、温度を３０℃まで下げた。発酵時間が１８時間経過した時点で、誘導因子であるＩＰＴＧを０．１ｍＭで添加して、タンパク質発現を誘導した。誘導の期間は２２時間までであり得る。回収プロセスは、遠心分離、高圧ホモジナイゼーション、０．２μｍの孔径を有するＳａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅを使用したクロスフロー精密濾過からなる。
【０１１８】
ＡＵＳ発酵は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び酵素活性アッセイを使用して分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、発現したシアリダーゼが、ビーズミリングの後に、可溶性及びペレット画分の双方にあらわれることが明らかになった。図１１は、３０℃の誘導温度及び０．１ｍＭのＩＰＴＧで得られた１０Ｌバッチに由来する典型的な発酵の結果を示す。
【０１１９】
実施例９：ＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３ Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるヒト線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の発現
ヒトＦＧＦ２１のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４９２（１）:２０３−２０６ （２０００）のＮｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌに開示されている。前記配列は、公開データベースからも得られる（各々、Accession nos. EMBL:AB021975及びUNIPROT:Q9NSA1）。
【０１２０】
天然のポリペプチドは、分泌のための２８アミノ酸のシグナルペプチド（以下に斜体で記載）とともに合成されるが、成熟ＦＧＦポリペプチドは、残部の１８１アミノ酸からなる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：
MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPA-LPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPS QGRSPSYAS。
【０１２１】
シグナルペプチドはないが、Ｎ末端のメチオニンを添加して、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドをクローニングして、Ｅ．ｃｏｌｉで細胞内タンパク質として発現させた。特に、３’末端にメチオニンのＡＴＧコドン並びにＮｄｅ１及びＢａｍＨ１制限酵素部位を３’末端及び５’末端の各々に含む５５０ｂｐのコード領域を、ファージＴ７プロモーターの制御下のＮｄｅ１−ＢａｍＨ１において発現ベクターｐＥＴ １１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１ ＤＥ３ Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を形質転換した。細胞をＬＢ ａｍｐ １００μｇ／ｍｌ中においてＯＤ４５０が０．５になるまで増殖させ、０．３ｍＭ ＩＰＴＧで４時間にわたって３７℃で発現を誘導した。ＦＧＦ２１発現分析のために細胞の粗抽出物を超音波処理によって作製した。
【０１２２】
図１２のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１ ＤＥ３およびＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるＦＧＦ２１の発現が等しく成功したことを示す。発現したＦＧＦ２１（Ｍｅｔ−ＦＧＦ２１）の計算分子量（Ｍｗ）は１９．５ｋＤであるが、ゲル上では２５ｋＤタンパク質として移動し、これはタンパク質の移動を遅らせるプロリンが多く含まれているためであろう。
【０１２３】
本実施例は、ＦＧＦ２１の産生量は宿主細胞の遺伝子操作によって影響を受けないことを示す。
【０１２４】
実施例１０：ＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるヒトアミリンの発現
３７アミノ酸のアミロイドペプチドであるアミリンの配列は、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （８４） ： ８６２８−８６３２， （１９８７）のＣｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．によって公開された。遺伝子をクローニングして、サーモトガ・マリティマ（thermotoga maritima）由来のリボソームタンパク質ＲＬ２３にＮ末端に融合した。１４６アミノ酸の融合タンパク質は、以下の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を有する：
KQEKLSLHDVLIRPIITEKALILREQRKYVFEVNPLANKNLVKEAVEKLFNVKVEKVNILNMKPKPKRRGIFEGKTRSWKKAVVTLKEGYTIKELEGEHSSSSDDDDKKCNTATCATQRLA-NFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY。
【０１２５】
前記遺伝子を、実施例９に記載のとおり、Ｎｄｅ１−ＢａｍＨ１断片として、Ｔ７プロモーターの制御下においてｐＥＴ１１ｃにクローニングして、プラスミドを使用してＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を形質転換した。
【０１２６】
発現は実施例９に記載のとおり実施し、結果は図１２に示す。図１２は、２種のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ宿主であるＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）における等しく高い産生量の発現を示す。
【０１２７】
実施例１１：ＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるヒトレプチンの発現
１４６アミノ酸長のヒトレプチンの配列は、Ｄｉａｂｅｔｅｓ （４４）： ８５５−８５８ （１９９５）のＭａｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌに公開されている。前記タンパク質は、２１アミノ酸のシグナルペプチドが添加されてヒトにおいて分泌される。Ｅ．ｃｏｌｉで細胞内に発現させた成熟レプチンは、以下の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を有する：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC。
【０１２８】
レプチン遺伝子は、実施例９に記載のとおり、４５０ｂｐのＮｄｅ１−ＢａｍＨ１断片として、Ｔ７プロモーターの制御下においてｐＥＴ １１ｃにクローニングし、このプラスミドを使用してＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を形質転換した。
【０１２９】
発現は実施例９に記載のとおりに実施した。結果は図１２に示す。図１２は、２種のＥ．ｃｏｌｉ宿主であるＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）における等しく高い産生量の発現を示す。
【０１３０】
グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの除去は、いずれの増殖条件における細胞の増殖にも影響を与えることがないと結論付けられる。グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの除去がタンパク質発現に影響を与えないとも結論付けられる。したがって、治療用タンパク質製造のための市販の宿主株としてＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用するための、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを完全に取り除いたより安全な株がこれにより製造される。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）のグループＩＩ莢膜遺伝子を欠失する遺伝子操作によって、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２と同じ安全カテゴリーになる。グループＩＩ遺伝子クラスターが、これら２種の株の唯一の顕著な違いだからである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムの操作、改善した非病原性Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｂ株、並びにペプチド及びタンパク質製造のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、広範な市販の製品の製造のために使用されている。遺伝子操作した細菌、例えば、大腸菌を宿主細胞として生物試薬、例えば、ペプチド及び核酸の生産のために実験室で使用すること及び工業的に使用することは、当該技術分野においてよく知られている。自然な環境における細菌は、標準的な工業的又は実験室における増殖で通常与えられるものではない多数の環境に曝されるため、それらのゲノムは、多数の環境依存的なストレス誘導遺伝子、又はそうでなければ非必須遺伝子を有し、それらは、前記生物の工業的又は実験室における使用には必要とされない可能性があり、又は望ましくない可能性すらある。
【０００３】
細菌性病原体は、毒性因子、例えば、細胞表面における莢膜多糖類を含み、それは、細菌とその周囲の環境との間の相互作用を媒介し、細菌の病原性に直接関連する多数の機能を有する。８０を超える血清学的及び化学的に異なるタイプの多糖類莢膜が、Ｅ．Ｃｏｌｉについて開示されており、Ｋ抗原と称されている。多糖類莢膜は、４つのグループに分類され、そのうちグループＩＩ莢膜多糖類は、インフルエンザ菌及び髄膜炎菌のものと類似している。グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターは、侵襲性疾患と関連する莢膜のタイプの大半を含み、３つの機能的領域からなる保存された遺伝子構成を有する。領域１及び３は、グループＩＩ遺伝子クラスターの間で保存されており、合成部位から細胞表面に多糖類を輸送するために必要なペプチドをコードしており、領域２は、血清型特異的であり、特定の多糖類を含む個々の単糖類の生合成及び重合に関与する酵素をコードしている。領域１は、６つの遺伝子のｋｐｓＦＥＤＵＣＳを含み、それらは１つの転写単位に構成されている。領域２は、血清型特異的であり、グループ２抗原の間で異なる。領域３は、２つの遺伝子のｋｐｓＭ及びｋｐｓＴを含み、それらは１つの転写単位に構成されている［Andreishcheva et al. Gene (2006) 384: 113-119］。
【０００４】
Ｅ．ＣｏｌｉのＫ−１２株及びＢ株は、莢膜を有さず、ペプチドの製造に一般的に使用される株である。Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２のゲノムは、完全に配列決定されており、莢膜遺伝子を全く含まない。組換えペプチドの高収量発現のための好ましい株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、グループＩＩ莢膜多糖類をコードする遺伝子クラスターを含むことが認められており、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂの祖先が水平伝播によってこれらの莢膜遺伝子を獲得したに違いないと解されている。Ｅ．ｃｏｌｉの莢膜に位置するＫ抗原は、遺伝子の機能形態を有する株の病理表現形と関連する場合が多い。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの領域２が、挿入エレメント（ＩＳ１）によって不活性状態になっており、抗原の生産が妨げられているが、野生型の莢膜抗原の排出及び提示を補助する領域１及び３はインタクトなままである［Andreishcheva et al. Gene (2006) 384: 113-119］。しかしながら、機能的なグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの再構築の可能性が理論的にはあり、例えば、領域２のＩＳ１が無くなり、それによって、グループＩＩクラスターが再構築される可能性がある。代替的には、ＩＳ１変異領域が外来性の野生型の領域２と交換されると、グループＩＩクラスターも再構築される可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Andreishcheva et al. Gene (2006) 384: 113-119
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの永久的なノックアウト（ＫＯ）を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を提供し、当該株を他の商業的に重要な株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２と同じ安全な種類にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、不可逆的に不活性化されたグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株に関する。
【０００８】
１つの実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株は、遺伝子ＩＩ莢膜遺伝子クラスターの全体又は一部の欠失を有することを特徴とする。
【０００９】
１つの実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの全体の欠失を有することを特徴とする。
【００１０】
１つの実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの一部の欠失を有することを特徴とする。
【００１１】
さらなる実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの１又は複数の点変異を有することを特徴とする。
【００１２】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１３】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも２５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１４】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも４０％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１５】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも５５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１６】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの７５から１００％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１７】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも８５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１８】
他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの少なくとも９５％が欠失によって永久的に不活性化されていることを特徴とする。
【００１９】
１つの実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの３０％が欠失されている。
【００２０】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの５０％が欠失されている。
【００２１】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの７０％が欠失されている。
【００２２】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの８０％が欠失されている。
【００２３】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの９０％が欠失されている。
【００２４】
１つの実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉの株がＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、さらなる実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉの株がＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸ Δａｌｒである。
【００２５】
本発明は、
ａ．選択マーカーによってグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを置換する工程、
ｂ．選択マーカーを除去する工程、
ｃ．ＰＣＲ分析によって欠失を確認する工程
を含む方法によってグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターが欠失される、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法も企図する。
【００２６】
１つの実施態様では、選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。
【００２７】
他の実施態様では、抗生物質耐性遺伝子は、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、バンコマイシン、及びエリスロマイシンからなる群から選択される。
【００２８】
さらなる他の実施態様では、抗生物質耐性遺伝子はクロラムフェニコールである。
【００２９】
本発明は、本発明のＥ．ｃｏｌｉ株に、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを導入することによって、ペプチドを製造するための方法にも関する。
【００３０】
１つの実施態様では、本発明は、ペプチドをコードするＤＮＡの発現のための条件で適切な培養培地において、本発明に係るＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株を培養する工程を含む、ペプチドの製造方法も企図する。発現ベクターで発現するペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現することができる任意のペプチドであってよい。そのようなペプチドの代表例は、ｈＧＨ、グルカゴン様ペプチド、インターロイキン、インスリンアナログ、野生型アジポネクチン、ＦＧＦ−２１、トリプシン、アプロチニン、アミリン及びレプチン並びにそれらのアナログ、並びに酵素、例えば、シアリダーゼ、トランスグルタミナーゼ（ｔＧａｓｅ）、ＨＲＶ（ヒトライノウイルス）３Ｃプロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、及びそれらのバリアントである。
【００３１】
１つの実施態様では、本発明のＥ．ｃｏｌｉ株は、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む。
【００３２】
１つの実施態様では、製造するペプチドはｈＧＨである。
【００３３】
他の実施態様では、製造するペプチドはＦＧＦ−２１である。
【００３４】
他の実施態様では、製造するペプチドはアミリンである。
【００３５】
他の実施態様では、製造するペプチドはレプチンである。
【００３６】
他の実施態様では、製造するペプチドはシアリダーゼである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、非コード隣接領域を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）莢膜遺伝子クラスターの遺伝子構成を示す。Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）莢膜遺伝子クラスターのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（大きい矢印）；転写方向（矢頭）；領域１遺伝子（灰色の矢印）；領域２のＯＲＦ（黒色の矢印）；領域３の遺伝子（白色の矢印）；ＩＳ１エレメント（白色ボックス）［Andreishcheva et al. Gene (2006) 384: 113-119］。小さい矢印は、非コード左アーム（ＬＡ）及び右アーム（ＲＡ）の位置を示す。
【図２】図２は、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターノックアウト方法：ａ）抗生物質耐性遺伝子によるグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの置換、及びｂ）抗生物質耐性遺伝子の除去のワークフローの略図である。
【図３】図３は、ノックアウト候補のＰＣＲスクリーニングを示す。ノックアウト候補（親株ではない）（ＢＬ又はＤ）から増幅した、正しいサイズである１６８６ｂｐ（ＬＡ＋ｃａｔの一部、上の図のＡ１からＡ３、下の図のＢ１からＢ３、及び１５７８ｂｐ（ＲＡ＋ｃａｔの一部、上の図のＡ１からＡ３、下の図のＢ１からＢ３）は、グループＩＩ遺伝子クラスターのノックアウトが成功したことを示す。陰性対照については、親株のみであると約３ｋｂのサイズのバンドを有するが、グループＩＩノックアウト株ではそうではない。ＢＬはＢＬ２１（ＤＥ３）を示し、ＤはＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ株を示す。Ａ１からＡ３は、異なるコロニーナンバーのＢＬ２１（ＤＥ３）ノックアウト候補であり、Ｂ１からＢ３はＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ株のノックアウト候補である。
【図４】図４は、振盪したフラスコ中の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株の増殖の比較である。使用する記号は、以下の株を示す：●：ＢＬ２１（ＤＥ３）；□：ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）；−：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ；△：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）。
【図５】図５は、異なるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の発酵増殖曲線を示す。使用する記号は、以下の株を示す：◆：ＢＬ２１（ＤＥ３）；□：ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）；−：ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＮＮＣ１−ｇ；○：ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−ｇ。
【図６】図６は、異なる誘導時点におけるｈＧＨ発現のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気誘導（ＰＡＧＥ）を示す：ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＮＮＣ−１ｇにおける発現、及びｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮｃ１−ｇにおける発現。ａ）及びｂ）の双方において、レーン１から３は、ｈＧＨの異なる濃度：５μｇ、２．５μｇ、及び１．２５μｇの各々を示す。レーン４は誘導前のｈＧＨの発現を示し、レーン５から１４は、１から１０時間の毎時の異なる誘導時点におけるｈＧＨの発現を示す。全てのサンプルは、同じロードＯＤに対して正規化した。
【図７】図７は、ｈＧＨ発現の誘導の前及び後の異なるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の増殖を示す。使用する記号は、以下の株を示す：◆：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈ；□：ＢＬ２１ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈ；Δ：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈ誘導；−：ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈ誘導。
【図８】図８は、異なる誘導時点におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したｈＧＨの発現を示す：ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈ；ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈ。ａ）及びｂ）の双方において、レーン１から３は異なる濃度：５μｇ、２．５μｇ、及び１．２５μｇの各々におけるｈＧＨの発現を示す。レーン４は誘導前のｈＧＨの発現を示し、レーン５から１３は１から９時間の毎時の誘導時点におけるｈＧＨの発現を示す。全てのサンプルは、同じロードＯＤに対して正規化した。
【図９】図９は、ＦＤＭ１−２培地における高細胞密度発酵におけるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１ａ．２３の増殖曲線を示す。ｈＧＨ変異体であるＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現は、細胞密度が７０ＯＤ６００に達した際に、０．２ｍＭの終濃度までＩＰＴＧを添加することによって誘導し、２５℃で培養し続けた。最終的な細胞密度は、誘導の８時間後に約１００ＯＤ６００に達した。
【図１０】図１０は、高細胞密度発酵の間のＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現を示す。レーン１：マーカー；レーン２から４：５、２．５、１．２５μｇの各々の濃度の標準としての精製ｈＧＨ；レーン５から１３：０、１、２、３、４、５、６、７、及び８時間の各々の間にわたって誘導した後の異なる時間間隔で得たサンプル。矢印は標的タンパク質であるＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）を示す。
【図１１】図１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるアースロバクター ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼの発現のための発酵サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１：マーカー；レーン２：誘導前のホモジネート；レーン３：誘導後のホモジネート；レーン４：最終サンプルのホモジネート；レーン５：誘導前の不溶性画分；レーン６：誘導後の不溶性画分：レーン７：最終サンプルの不溶性画分：レーン８：誘導前の可溶性画分；レーン９：誘導語の可溶性画分；レーン１０：最終サンプルの可溶性画分；レーン１１から１２：標準シアリダーゼ（１５０及び３００ｍｇ／ｌ）。全てのサンプルは１０倍希釈した。
【図１２】図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１ ＤＥ３及びＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）のヒト由来ＦＧＦ２１、アミリン、及びレプチンの発現を示す。レーン１：マーカー；レーン３から８：ＢＬ２１ ＤＥ３における発現；レーン９から１４：ＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）における発現；レーン３及び９：非誘導；レーン４及び１０：誘導したＦＧＦ２１；レーン５及び１１：非誘導；レーン６及び１２：誘導したアミリン；レーン７及び１３：非誘導；レーン８及び１４：誘導したレプチン。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、不可逆的に不活性化したグループＩＩクラスターを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株に関連し、ペプチド製造のための永久的に安全な株を提供する。
【００３９】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）の野生型又は任意の他の株のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの損傷又は不活性化は、クラスター全体又はその一部の欠失を含む任意の適切な方法又は遺伝子クラスターの１又は複数の点変異によって達成されてよい。
【００４０】
本発明のＥ．ｃｏｌｉ株は、一般的に産業的に使用されていた株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２と比較して、ペプチド製造のためのより着実かつ高収量な方法を提供するという利点を有する。
【００４１】
本発明で使用するＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ＷＯ２００８／０２５７４４に記載のダブルノックアウト（２×ＫＯ）であってよい。このＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、双方がＤ，Ｌ−アラニンラセマーゼをコードするａｌｒ及びｄａｄＸの２遺伝子を欠失している。このダブルノックアウト株は、Ｄ−アラニンの増殖培地に対する添加又は必要なＤ−アラニンを供給することができるプラスミド上のラセマーゼ遺伝子の１つの存在のいずれかが無ければ増殖することができない。この２×ＫＯ Ｄ−アラニン栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株は、本明細書においてＥ．ｃｏｌｉ． Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸと称され、細胞中のプラスミドの維持のための非抗生物質選択方法を可能にする。
【００４２】
本発明の１つの実施態様では、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸ株のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスター内の１又は複数の遺伝子を欠失する。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）はＳｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔ［J.Mol.Biol. (1986) 189:113-130］及びＳｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ［Methods in Enzymology (1990) 185:60-89］に開示されており、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ及びＮｏｖａｇｅｎから入手可能である。
【００４３】
本発明の１つの実施態様では、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスター内の１又は複数の遺伝子が欠失される。本発明の他の実施態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸのグループＩＩ莢膜遺伝子クラスター内の１又は複数の遺伝子が欠失される。
【００４４】
他の実施態様では、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスター内の欠失に選択される１又は複数の遺伝子は、潜在的な病原性に関与するものである。１６ｋｂのグループＩＩ莢膜遺伝子クラスター全体の欠失は、病原性の莢膜の表現型の潜在的な再構築の予防を提供する。図１は、領域１遺伝子ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ、領域２ ＯＲＦ１−４、及び領域３ ｋｐｓＭ及びｋｐｓＴを含む莢膜を有する株のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターに含まれる遺伝子を示す。これらの遺伝子のいずれか１つ又はそれらの組合せが欠失されてよい。
【００４５】
グループＩＩ莢膜遺伝子クラスター全体の欠失は、３つの領域の欠失、すなわち、Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を意味する。得られるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）である。
【００４６】
１つの実施態様では、本発明は、挿入エレメント（ＩＳ１）は別として、グループＩＩ遺伝子クラスターを不活性化するのに十分な任意の修飾を企図する。
【００４７】
細菌は１倍体生物であり、すなわち、それらは１つのみの染色体を有するため、組換えはたいてい、環境から新規ＤＮＡを獲得した際にのみ、例えば、形質転換を通じて生じる。さらに、例えば、線状ＤＮＡを分解する細胞内エキソンクレアーゼのため、細菌は、線状ＤＮＡでは容易に形質転換できない。しかしながら、組換え複合体のエキソヌクレアーゼを欠いている、組換え能力がある変異体は、線状ＤＮＡで形質転換をすることができる。リコンビナーゼは、天然の組換え反応を触媒する酵素であり、λ Ｒｅｄは、他の組換え系と比較した際に組換え速度の向上を示すことが示されている。本発明の株のグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの欠失方法は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ［(2000) PNAS 97(12): 6640-6645］によって開発されたＲｅｄ媒介組換え技術又は他の従来の方法論に基づいてよい。
【００４８】
図２は、本発明の株の１６ｋｂのグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの欠失方法の略図を示す。１つの実施態様では、前記方法の第一工程は、ヌクレオチド相同性伸長部（nucleotide homolgy extension）又はＲＡ及びＬＡ領域（図１参照）とともにプライマーを使用することによるＰＣＲによって生成される、選択マーカーを使用する、１６ｋｂのグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの置換である。これは、これらの隣接相同性伸長部におけるＲｅｄ媒介組換えによって達成される。選択の後の、本方法の第二工程は、選択マーカーに隣接する直接反復ＦＲＴ（ＦＬＰ認識標的）部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを発現するヘルパープラスミドを使用することによる選択マーカーの除去である。Ｒｅｄ及びＦＬＰヘルパープラスミドは、温度感受性レプリコンであるため、３７℃における増殖によって取除く。第三工程は、ＰＣＲ分析による欠失の確認を含む。
【００４９】
細菌の形質転換は、ＤＮＡを取込むことによる安定な遺伝子変化と称されてよい。コンピテンスは、外来性ＤＮＡを取込むことができる状態を示す。ある細菌は、天然に、実験室条件下でＤＮＡを取込むことができ、そのような細菌は、細胞の１又は複数の膜を越えてＤＮＡを輸送するための機構を特定する遺伝子セットを有するが、他のものは、天然には通常生じない条件を使用して、細胞が受動的にＤＮＡ透過性にされる実験手法によって誘導しなければならない。二価陽イオン、例えば、Ｃａ２＋（ＣａＣｌ２中）の存在下で細胞を冷却することは、プラスミドＤＮＡに透過性になるように細胞壁を調製する。細胞をＤＮＡとともに氷上でインキュベートし、次いで、短くヒートショックを与え（例えば、３０から１２０秒間、４２℃）、ＤＮＡを細胞内に入れる。これは当該技術分野においてよく知られた方法である［Sambrook et al., A Laboratory Manual (1989) CSH］。エレクトロポレーションは、細菌（及び他の）細胞に穴を作製する他の方法であり、それらにｋＶ範囲の電場で短い間でショックを与えることによる。この穴を通って、プラスミドＤＮＡは細胞に入ることができる。この方法は、大きなプラスミドＤＮＡの使用に適している。天然の膜修復機構は、ショックの後に穴を直ぐに閉じるであろう。細胞に維持及び安定に保持するために、プラスミドＤＮＡ分子は、染色体からは独立して細胞内で複製することを可能にする複製起点を含む必要がある。
【００５０】
本明細書に記載の任意の遺伝子不活性化方法を使用する際に、グループＩＩ遺伝子クラスターの一部又は全体の任意の標的とした不活性化が選択マーカーによって検出されて、修飾されたＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株クローンが同定及び単離される。
【００５１】
選択マーカーは、任意の適切なマーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子又は栄養要求性マーカーであってよい。
【００５２】
適切な抗生物質耐性遺伝子は、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、バンコマイシン及びエリスロマイシン若しくはβ−ラクタムの任意の他の代表例、アミノグリコシド、グリコペプチド、又はマクロライド抗生物質である。
【００５３】
本明細書で使用する用語「クローニング」は、ＤＮＡの配列の多数の同一のコピーの作製を伴う。標的ＤＮＡ配列は、次いで、クローニングベクターに挿入される。このベクターは自己複製ウイルス、プラスミド、又は高等生物細胞に由来するため、適当なサイズのＤＮＡが挿入される際は、「標的及びベクターＤＮＡ断片を、次いで、連結し」、組換えＤＮＡ分子を作製する。次いで、形質転換後に幾つかの同一のコピーを生産する細菌株（通常はＥ．ｃｏｌｉ）に組換えＤＮＡ分子を入れる。形質転換は、細菌が有するＤＮＡ取込み機構である。しかしながら、所定の複製起点を有する１つの組換えＤＮＡ分子のみが、１つの細菌細胞内で確立することができ、そのため、各クローンは１つのＤＮＡインサートのみを有する。
【００５４】
本明細書で使用する用語「ゲノム」又は「遺伝的構成物」は、遺伝することが可能であり及び／又はそうでなければ伝達性である、遺伝的物質全体、その構造及び機能の双方を指し、特定の細胞又は微生物内に含まれている。微生物のゲノム（遺伝的構成物）は、かくして、染色体ＤＮＡ及び染色体外ＤＮＡ（例えば、プラスミド及びＲ因子など）を含むと解される。
【００５５】
本明細書で使用する用語「約」は、所定の数値の合理的な近傍、例えば、±１０％を意味する。
【００５６】
本明細書で使用する用語「ノックアウト」は、１つ又は複数の遺伝子が欠失又は不活性化されている（生物から「ノックアウト」されている）、遺伝子操作された細菌株を意味する。ノックアウト生物は、配列決定されているが、未知の機能を有する遺伝子の役割を研究するためのモデルとして通常は使用される。ノックアウト技術を使用して、興味のある生物から望ましくない遺伝子及び／又は潜在的な病原性遺伝子を除去してよい。
【００５７】
本明細書で使用する用語「遺伝子クラスター」は、遺伝的及び機能的に連関した２以上の遺伝子のセットを意味する。共通の祖先に由来する集団は同じ遺伝子クラスターの種を有する傾向があり、細菌の進化の過程を遡るのに有用である。
【００５８】
用語「親株」は、縮小したゲノムの株の由来である任意の細菌株であってよい。本発明に係る親株の代表例は、Ｅ．ｃｏｌｉ株、例えば、Ｂ若しくはＣ、又はそれらと実質的に同一のゲノム配列を有する株を含むが、それらに限らない。
【００５９】
所定の細菌宿主細胞で製造されるペプチドの「レベル」又は「量」なる本明細書で使用される用語は、選択した製造方法に従って、細胞培養物中に存在する又は検出可能なペプチドの定量的尺度であってよい。例えば、選択したペプチド製造方法が細胞自体の内部におけるペプチドの蓄積をもたらす場合には、製造されたペプチドのレベル又は量は、細胞自体の内部に存在するペプチドの定量的尺度である。ペプチド製造方法がペプチドの分泌を伴う場合には、ペプチド製造レベルは、増殖培地に存在するペプチドの定量的尺度であろう。
【００６０】
ペプチドの「収量」なる本明細書で使用する用語は、本質的に純粋なペプチドの定量値であり、ここでいうペプチドは、宿主株と天然に関連を有するペプチドから本質的に遊離して回収及び／又は精製されている。細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株によって製造されたペプチドの定量的な「収量」又は「量」を確認する際に、従来のペプチド特異的な方法、例えば、イムノアッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、酵素活性、分光光度法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを使用することができる。
【００６１】
本明細書で使用する用語「発現調節配列」は、作動可能に連結した核酸の転写を管理する転写因子結合部位の配列又はプロモーターを意味する。
【００６２】
二本鎖核酸に関連して使用する用語「遊離端」は、平滑遊離端若しくは付着遊離端又はそれらの組合せを有する線状核酸を意味してよい。
【００６３】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、ポリペプチド又はその前駆体をコードする核酸配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。ポリペプチドは、全長又は断片の所望の活性又は機能的性質（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、抗原性など）が維持されている限りにおいて、コード配列の全長又はコード配列の任意の一部によってコードされ得る。前記用語は、全長ｍＲＮＡに転写される遺伝子に寄与する、５’及び３’末端の双方のコード領域に隣接して位置する配列も包含する。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態（ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｏｒｍ）を含む。遺伝子のゲノム形態又はクローンは、例えばイントロンと称される非コード配列で中断されるコード領域を含んでよい。
【００６４】
用語「導入する」又は「導入された」は、株への核酸の添加と関連して使用される際には、核酸が、株の染色体に組み込まれるか又はベクター、例えば、プラスミド上で株に含まれることを意味する。
【００６５】
本明細書で使用する用語「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、終止コドンを含まない遺伝子配列である。
【００６６】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、天然又は組換えのいずれかの、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質、並びにその断片、誘導体、ホモログ、バリアント、及び融合体を意味する。
【００６７】
グループＩＩノックアウト株の増殖は、振盪したフラスコ中及び高密度発酵槽中で、それらの親株と比較して評価した。実験によって、グループＩＩノックアウトは、いずれの株の背景においても細胞増殖に影響を与えないことが示された。高密度発酵槽において、発現試験をするために、複数のペプチドを有する発現ベクターでグループＩＩ欠失株を形質転換した。
【００６８】
１つの実施態様では、本発明のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株において製造するためのペプチドは、ｈＧＨ、グルカゴン様ペプチド、インターロイキン、インスリンアナログ、野生型アジポネクチン、ＦＧＦ−２１、トリプシン、アプロチニン、アミリン及びレプチン並びにそれらのアナログ、酵素、例えば、シアリダーゼ、トランスグルタミナーゼ（ｔＧａｓｅ）、ＨＲＶ（ヒトライノウイルス）３Ｃプロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、及びそれらのバリアント、並びに任意の他のペプチド又はＥ．ｃｏｌｉで発現系が作動可能であるペプチドからなるが、それらに限らない群から選択されてよい。
【００６９】
本発明は、上述のヒトペプチドの製造方法にも関する。一般的には、クローン化した野生型ペプチドの核酸配列は、所望のタンパク質をコードするように修飾される。この修飾配列は、次いで、発現ベクターに挿入され、次に宿主細胞に形質転換又は形質移入される。作動可能な発現系は、典型的には、Ｓｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔ［J.Mol.Biol. (1986) 189:113-130］及びＳｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．［Methods in Enzymology (1990) 185:60-89］に記載の従来の遺伝子発現成分を含む。
【００７０】
宿主細胞中で製造するペプチドは、融合ペプチドとして合成されるか、培地中又は細胞膜周辺腔に分泌されるか、細胞質中に遊離の形態で製造されるか、又は細胞内構造体、例えば、封入体に蓄積される。同様に、ペプチド精製は、興味のあるペプチドに対して従来技術によって適合される、上述の従来の一般的に利用可能な方法の使用を伴う。
【００７１】
本発明は、任意のタイプのペプチドの製造に適している。
【００７２】
１つの実施態様では、グループＩＩノックアウトＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１宿主細胞中における製造に選択されるペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）であり、１つの実施態様では、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、ｈＧＨ前駆体からｈＧＨを作製する方法を開示するＥＰ２１７８１４に記載の前駆体ペプチドから製造される。
【００７３】
さらなる実施態様では、成長ホルモンは、ｈＧＨアナログの前駆体であるＭＥＡＥ（ＳＥＱ ＩＤ １６）−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）であり、ｈＧＨ分子の１０１位のロイシンがシステインによって置換されている。
【００７４】
他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１、及び／又はその誘導体である。
【００７５】
本明細書で使用する用語「グルカゴン様ペプチド」は、グルカゴンファミリーのペプチド、エキセンジン、及びそのアナログを意味する。グルカゴンファミリーのペプチドは、プレグルカゴン遺伝子によってコードされ、高い相同性を有する３つの小さなペプチド、すなわち、グルカゴン（１−２９）、ＧＬＰ−１（１−３７）、及びＧＬＰ−２（１−３３）を含む。エキセンジンは、トカゲで発現しているペプチドであり、かつ、ＧＬＰ−１のようにインスリン分泌を促進する。エキセンジンの例は、エキセンジン−３及びエキセンジン−４である。
【００７６】
本明細書で使用する用語「グルカゴン様ペプチドアナログ」は、修飾されたグルカゴン様ペプチドであり、グルカゴン様ペプチドの１又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、及び／又は１又は複数のアミノ酸残基がグルカゴン様ペプチドから欠失されており、及び／又は１又は複数のアミノ酸残基がグルカゴン様ペプチドに付加されている。そのようなアミノ酸残基の付加又は欠失はペプチドの任意の位置で起こり得る。
【００７７】
実験
株のグリセロールストックを調製するために、適当な抗生物質を含む２ｍｌのＬＢ培地を含む１２ｍｌ試験管に１つのコロニー移して、２２０ｒｐｍで振盪しながら２時間にわたって３７℃で増殖させた。
【００７８】
発酵種菌を調製するために、グリセロールストックの細胞を、アンピシリンを含むか又は含まないＬＢプレートにストリークする。一晩の後に細胞をＬＢ培地で洗浄して、各々適当な抗生物質濃度を有する１００ｍｌの発酵複合培地を含む５００ｍｌ振盪フラスコに植菌して、３７℃において２２０ｒｐｍで浸透しながら３〜４時間にわたって増殖させた。次いで、約０．５ ＯＤ６００の濃度に細胞をリアクターに植菌した。
【００７９】
適当な抗生物質を含む２．５Ｌの初期容量の発酵複合培地を含む５Ｌバイオリアクターにおいて、好気条件下で発酵を実施した。０時点において、リアクターは約０．５のＯＤ６００に植菌した。５Ｎ ＮＨ３及びＨ２ＳＯ４を使用してｐＨを７．０に維持した。６ｍｌ／分の一定空気流速を培養期間に培養物に拡散させた。温度は３７℃に維持した。２０％の飽和Ｏ２まで溶存酸素レベルを維持することによって、攪拌をカスケード制御した。
【００８０】
フェドバッチ実験を実施して、高密度発酵槽において、グループＩＩ欠失株の増殖及びペプチド発現を親株と比較した。２７ｇ／ｌのグリセロールを添加した複合培地を発酵槽に入れた。０時点において、発酵槽は０．５のＯＤ６００に植菌した。溶存酸素の増加によって示された、基礎のグリセロールの摂取に伴って、工程を増加する際にグリセロール及び酵母抽出物を連続的に添加した。ＯＤ６００及びタンパク質発現を測定するためのサンプルは、発酵槽から回収して、分光光度計及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００８１】
細菌中のタンパク質発現の誘導は、当該技術分野においてよく知られている。本発明では、タンパク質発現の誘導はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって実施する。
【００８２】
本発明のある実施態様で使用するプラスミド及び株を、表１及び２の各々に記載する。プラスミドの作製は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．［A Laboratory Manual (1989) CSH］に記載された標準的な分子生物学的技術を使用して実施した。
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【実施例】
【００８６】
実施例１：置換カセットの構築
ＰＣＲ増幅のためのＤＮＡの起源として、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用した。オリゴヌクレオチドプライマー（LA_BL_GII_F/LA_BL_GII_R）（表３）を合成して、ＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩクローニング部位を含むＫｐｓＭの５’末端の上流の１００１ｂｐ領域を標的とした。左アーム（ＬＡ）として、ゲノムＤＮＡから当該領域を増幅した。右アーム（ＲＡ）に関しては、オリゴヌクレオチドプライマー（RA1_BL_GII_F/RA1_BL_GII_R）（表３）を合成して、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩクローニング部位を含むＫｐｓＦの５’末端の上流の１１０８ｂｐ領域を標的とした。左アーム及び右アームのＰＣＲ産物を産生した。以下のパラメータ：９４℃で５０秒間の変性、５７℃で６０秒間のアニーリング、及び７２℃で６０秒間のプライマー伸長を全部で３０サイクル含むプログラムを使用して、サーマルサイクラーにおいてＤＮＡ増幅反応を実施した。正確なバンドサイズのＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲル上でゲル電気泳動によって観察して、５０μｌの増幅産物をゲルから抽出して、置換断片を構築するために使用した。オリゴヌクレオチド配列のリストを表３に示す。
【００８７】
増幅した左アームは、ゲルから精製して、プラスミドｐＥＺ−Ｔに連結し、プラスミド−Ｔ−ＬＡを製造した。制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩによって、ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ断片を消化して、ｐＥＺ−Ｔ−ＬＡのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結し、ｐＥＺ−Ｔ−ＬＡ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴをもたらした。増幅した右アームをプラスミドｐＧＥＭ−Ｔに連結して、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩで消化した。アンピシリン耐性遺伝子を有するＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ消化したＤＮＡ断片を、プラスミドｐＥＺ−ＬＡ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴに連結した。クロラムフェニコール耐性遺伝子は、置換断片を同定するための選択マーカーを提供する。得られたプラスミドｐＥＺ−ＬＡ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ−ＲＡを使用して、ノックアウトＢＬ２１（ＤＥ３）株を製造した。
【００８８】
実施例２：ノックアウトＢＬ２１（ＤＥ３）株の製造
ＬＢ培地で一晩にわたって３７℃においてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を増殖させ、ＢＬ２１（ＤＥ３）のヒートショックコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。プラスミドｐＫＤ４６でＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換して、形質転換した細胞を０．４ＯＤ６００ｎｍまで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地中で増殖させた。Ｒｅｄリコンビナーゼの発現は、Ｌ−アラビノース（終濃度１ｍｍｏｌ／ｌ）によって１時間にわたって誘導した。
【００８９】
グループＩＩ遺伝子クラスターノックアウトについては、ｐＥＺ−Ｔ−ＬＡ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ−ＲＡから増幅した置換断片の５００ｎｇを、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に、エレクトロポレーションによって移した。エレクトロポレーションコンピテント細胞は標準的な方法で調製した。細胞の回収は、３０℃で１．５時間にわたって実施した。８μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加したＬＢ寒天に細胞をプレーティングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔのクロラムフェニコール耐性コロニーが、３０℃における一晩のインキュベーション後に形成された。
【００９０】
染色体の正しい位置におけるグループＩＩ遺伝子クラスターの完全なノックアウトを確実なものとするために、グループＩＩ遺伝子クラスターの左及び右アームの外側に相同性を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。近いフランキング領域の高い相同性に基づいて、２つのゲノムのグループＩＩクラスターの類似している位置を推定して、Ｅ．ｃｏｌｉ ５３６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＣＰ０００２４７．１）の１８ｋｂの公開配列の外側のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）のフランキング配列の欠失をＰＣＲスクリーニングプライマーの設計のために使用した。３つのクロラムフェニコール耐性コロニーを遺伝子置換について試験した。
【００９１】
クロラムフェニコール耐性コロニーの表現型試験を、少なくとも２世代にわたってＬＢ＋Ｃｍ（２５μｇ／ｍｌ）における増殖によって実施した。クロラムフェニコール耐性コロニーの全てが、ＬＢ＋Ｃｍ（２５μｇ／ｍｌ）培地において非常に良好に増殖することができるであろう。クロラムフェニコール耐性Ｄ−アラニン栄養要求性株も、Ｄ−アラニンを添加して同様の方法において試験した。
【００９２】
置換の成功が、１６８６ｂｐ及び１５７８ｂｐのバンドによって確認された。
【００９３】
オリゴヌクレオチドプライマー（ＬＡ＿ＳＥＱ＿Ｆ１／Ｃａｔ＿ＩＤ＿Ｒ）を使用して、左アーム及びｃａｔ遺伝子の一部を含むバンド（１６８６ｂｐのサイズ）を増幅し、オリゴヌクレオチドプライマー（ＲＡ＿ＳＥＱ＿Ｒ１／Ｃａｔ＿ＳＥＱ＿Ｆ）を使用して、右アーム及びｃａｔ遺伝子の一部を含むバンド（１５７８ｂｐのサイズ）を増幅した。３つのクロラムフェニコール耐性コロニーに関しては、バンドの正確なサイズによって、１６ｋｂのグループＩＩ遺伝子クラスターがｃａｔ遺伝子によって置換されたことが示された（図３）。ｋｐｓＦ及びｋｐｓＥの一部を含む右アームを含む３０００ｂｐのバンドのネガティブコントロールを作製した。これは、コントロール株（置換前）にのみ現れて、クロラムフェニコール耐性株には現れないべきである。オリゴヌクレオチドプライマー（ＲＡ６＿ＢＬ＿ＧＩＩ＿Ｆ／ＲＡ６＿ＢＬ＿ＧＩＩ＿Ｒ）（表３）を使用して、ｋｐｓＦ及びｋｐｓＥを増幅した。ＰＣＲの結果は、対照株のみ当該バンドを有し、クロラムフェニコール耐性株が有しないことを示した。
【００９４】
ＬＢ培地における増殖の間にＤ−アラニンの添加を必要とする、Ｄ−アラニン栄養要求株であるＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄｘΔａｌｒに同じ消去法を適用した。
【００９５】
クロラムフェニコール耐性株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔを、それらの表現型及びＰＣＲスクリーニングによって確認し、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターがｃａｔ遺伝子によって置換されたことを確認した。
【００９６】
実施例３：薬剤耐性マーカーの除去及びグループＩＩノックアウト株の特性決定
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）：：ｃａｔ細胞を、ＬＢ培地において、３７℃で、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール又は第二の株には２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに１００ｍＭのＤ−アラニンとともに増殖させた。２つのノックアウト株のエレクトロポレーションコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。プラスミドｐＣＰ２０（ＣｍＲ、ＡｍｐＲ）で２つのノックアウトコンピテント株を形質転換した。薬剤耐性マーカーの除去は、穏やかに振盪しながら１時間にわたって３０℃においてＳＯＣブロスで形質転換した細胞を増殖させることによって実施した。プレート状のアンピシリン耐性候補クローンの複数のシングルコロニーを、３０℃で一晩培養した後に選択した。候補クローンを、ＬＢ培地のみ又はＤ−アラニンを添加したＬＢ培地で３７℃において３時間にわたって増殖させ、プラスミドｐＣＰ２０を除去した。ＬＢ培地のみ又はＤ−アラニンを添加したＬＢ培地で現れた、５つのシングルコロニーをＰＣＲスクリーニングによってさらに特性決定した。
【００９７】
ＬＢ、ＬＢ＋Ｃｍ（８μｇ／ｍｌ）、及びＬＢ＋Ａｍｐの複数のシングルコロニーを増殖させることによって、ｃａｔ除去株の表現型試験を実施した。全てのｃａｔを除去したコロニーは、ＬＢ培地でのみ増殖できるであろう。ｃａｔを除去したＤ−アラニン栄養要求性株については、５つのコロニーの全てがＤ−アラニンを添加したＬＢ培地のみで増殖できるであろう。かくして、ｃａｔ遺伝子が除去された。
【００９８】
ｃａｔ遺伝子の除去の成功は、２３８１ｂｐバンドによって確認されるべきである。オリゴヌクレオチドプライマー（ＬＡ＿ＳＥＱ＿Ｆ２／ＲＡ＿ＳＥＱ＿Ｒ１）を使用して、左アーム及び右アームを含むバンドを増幅した。全てのシングルコロニーについて、２３８１ｂｐのバンドの出現によって、ｃａｔ遺伝子が除去されたことが示された。
【００９９】
ノックアウト株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）は、それらの表現型及びＰＣＲスクリーニングによって確認した。双方の株のグリセロールストックを保存のために調製した。
【０１００】
実施例４：振盪フラスコ中におけるノックアウト宿主株の増殖
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）細胞を、ＬＢプレートで一晩にわたって３７℃で増殖させた。一晩たったプレートから回収した適当量の細胞を、２５ｍｌのＬＢ培地を含むバッフル付き２５０ｍｌ振盪フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ）に約０．０５ ＯＤ６００の濃度まで植菌した。２２０ｒｐｍで振盪しながら８時間にわたって、細胞を３７℃で増殖させた。各株のサンプルを１／２時間毎に回収し、ＯＤ６００で細胞の増殖を比較した。
【０１０１】
振盪フラスコにおける増殖の比較のために、Ｄ−アラニンを添加して、同一の作業順序をＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）に対して実施した。
【０１０２】
図４の結果は、ＢＬ２１Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）の一晩の増殖は、ＬＢ培地を用いた振盪フラスコにおいて、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）と同一であったことを示す。ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）をＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒと比較した際も同じ結果が得られるであろう。
【０１０３】
実施例５：高密度発酵における宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）の間の増殖及びＭＥＡＥ−ｈＧＨ発現の比較
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）細胞をＬＢプレート上で増殖させた。ノックアウト株のヒートショックコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。ｈＧＨの発現カセットを含むプラスミドｐＮＮＣ１−ｇ（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ（ＡｍｐＲ））で、Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）コンピテント細胞を形質転換し、そこから形質転換した細胞のグリセロールストックを調製した。
【０１０４】
高密度発酵は、上述のとおり好気条件下で実施した。
【０１０５】
図５は、ＢＬ２１Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）の経時的な増殖が、複合培地中で高密度発酵槽において、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）と同一であったことを示す。同じ結果が、ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−ｇをＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＮＮＣ１−ｇと比較した際にも得られるであろう。非誘導状態において、細胞密度が約１４０のＯＧ６００に達した。ｈＧＨの発現は、細胞の増殖が８０のＯＤ６００に達した際に、１ｍＭの濃度までＩＰＴＧを添加することによって実施した。３０℃におけるＩＰＴＧ誘導の１０時間後に、細胞密度が約１００のＯＤ６００に達した。
【０１０６】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＮＮＣ１−ｇ及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−ｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで認められるとおり、ｈＧＨの製造に有効である。ｈＧＨ発現レベルにおける増大は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで示される１から１０時間の誘導時間の増大にしたがう（図６）。ｈＧＨを製造する２つの株の能力は同一である。すなわち、遺伝子ＩＩクラスターを有するＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較した際の、宿主株Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）によるｈＧＨ発現における顕著な差異は認められなかった。
【０１０７】
実施例６：高密度発酵における宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸ及びＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）の間の増殖及びＭＥＡＥ−ｈＧＨ発現の比較
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）細胞を、Ｄ−アラニンを添加したＬＢ培地で増殖させた。ノックアウト株のヒートショックコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。Ｄ−アラニン補足遺伝子を含むｐＮＮＣ１−１ｈ（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ及びａｌｒＰ−ａｌｒＣＤ（ＡｍｐＲ））をＡａｔＩＩ／ＰｓｉＩを使用して消化し、その後の平滑末端及びプラスミドのセルフライゲーションによって、プラスミド上のａｌｒ遺伝子の選択のためのｂｌａ−プラスミドを得た。プラスミドｐＮＮＣ１−１ｈ（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ，ａｌｒＰ−ａｌｒＣＤ，ｂｌａ−）で、ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）コンピテント細胞を形質転換した。Ｄ−アラニンを添加していないＬＢプレート上に一晩であらわれたコロニーを、グリセロールストックの調製のために単離した。
【０１０８】
高密度発酵を図５に記載のとおりに実施した。
【０１０９】
図７は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈの経時的な増殖が、ＦＭＣ１培地中で高密度発酵槽において、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈと同一であったことを示す。同じ結果が、Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈをＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈと比較した際にもｈＧＨの誘導下で得られるであろう。非誘導状態において、細胞密度が約１２０のＯＧ６００に達した。ｈＧＨの発現は、細胞の増殖が８０のＯＤ６００に達した際に、１ｍＭの濃度までＩＰＴＧを添加することによって実施した。３０℃におけるＩＰＴＧ誘導の９時間後に、細胞密度が約１００のＯＤ６００に達した。
【０１１０】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒ／ｐＮＮＣ１−１ｈ及びＢ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）／ｐＮＮＣ１−１ｈは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結果で認められるとおり、ｈＧＨの製造に有効である（図８）。ｈＧＨ発現レベルにおける増大は、誘導時間の増大にしたがう。ｈＧＨを製造する２つの株の能力は同一である。
【０１１１】
実施例７：高細胞密度発酵における宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｌｒΔｄａｄＸΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を使用した細胞増殖及びＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現の評価
凍結ストックからのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）細胞を、Ｄ−アラニンを添加したＬＢ培地で増殖させた。ヒートショック方法を使用する形質転換のために、このトリプルノックアウト株のコンピテント細胞を標準的な方法によって調製した。
【０１１２】
アンピシリン耐性をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子を欠失するために、ＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）をコードし、かつ、宿主細胞のＤ−アラニン欠乏を補足するａｌｒＰ−ａｌｒＣＤを含むプラスミドｐＮＮＣ１ａ．２３（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ））をＡａｔＩＩ／ＰｓｉＩで消化し、その後に末端平滑化及びβラクタマーゼ遺伝子の除去のためのセルフライゲーションを実施した。得られたプラスミドであるｐＮＮＣ１ａ．２３（ｐＥＴ１１ｄ−ＭＥＡＥ−ｈＧＨ，ａｌｒ，ｂｌａ−）で宿主細胞であるＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）をヒートショック法によって形質転換した。Ｄ−アラニンを添加していないＬＢプレートで増殖したシングルコロニーを選択して、−８０℃における保存のためのグリセロールストックを調製した。
【０１１３】
２つのバッチの高細胞密度発酵を実施例５に記載のとおりに実施した。プロセスの間の細胞増殖を観察した。結果は、図９に示す。
【０１１４】
プラスミドｐＮＮＣ１ａ．２３を有する株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒΔ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）によるＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現を高細胞密度発酵において評価した。結果は、回収時の細胞密度が、ＯＤ６００ｎｍで測定した際に約１００に達し得ることを示し、標的タンパク質であるＭＥＡＥ−ｈＧＨ（Ｌ１０１Ｃ）の発現レベルが、図１０に示すとおり、８時間の誘導の後に約７ｇ／ｌに達した。
【０１１５】
実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるアースロバクター ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼの発現
アースロバクター ウレアファシエンスのシアリダーゼ（ＡＵＳ，５３．４ｋＤａ理論的質量）を、Ｃ末端のＨｉｓタグとともに大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）で製造した。Ｃ末端にＨｉｓ６タグを有する、アースロバクター ウレアファシエンスのシアリダーゼの遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御の下に発現ベクターｐＥＴ−２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。アースロバクター ウレアファシエンス由来のシアリダーゼ酵素を製造するために、以下のタンパク質配列をコードする合成コドン最適化遺伝子を産生した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：
MAPTPPNSPTLPPGSFSETNLAADRTAANFFYRIPALTYLGNDVVLAAWDGRPGSAADAPNPNSIVQRRSTDGGKTWGPVQVIAAGHVADASGPRYGYSDPSYIYDAEANKVFAFFVYSKDQGFGGSQFGNDDADRNVISSAVIESSDAGVTWSQPRLITSVTKPGTSKTNPAAGDVRSNFASSGEGIQLKYGPHKGRLIQQYAGDVRQADGSNKIQAYSVYSDDHGVTWHKGANVGDRMDENKTVELSDGRVLLNSRDNANRGYRKVAVSTDGGATYGPVSQDTELPDPANNGAIARMFPNAAQGSADAKKLIFTNANSKTGRENVSARVSCDDGETWPGVRTIRSGFSAYSTVTRLADGKFGVLYEGNYTDNMPFATFDDAWLNYVCAPLAVPAVNIAPSATQEVPVTVTNQEATTLSGATATVYTPSGWSATTVPVPDVAPGASVTVTVALTAPADASGPRSLNAAFTTADGRVSQFTFTATTPVAPQVGLTITGSALEHHHHHH。
【０１１６】
合成遺伝子は、ｐＥＴ−２４ａ発現ベクターにＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片として導入し、ＡＵＳ発現ベクターｐＬＬＣ０２８を製造した。得られたベクターで、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を形質転換し、形質転換体を−８０℃でグリセロール中で保存した。
【０１１７】
凍結した最初の細胞クローン（ＩＣＣ）の１つの凍結チューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）を使用して、２つの酵母抽出物媒体（酵母抽出物５ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ）寒天フラスコに植菌した。寒天媒体には選択のためにカナマイシンを含めた。インキュベーションを３０℃で２５時間にわたって実施した。インキュベーションの後に、滅菌０．９％ＮａＣｌ溶液を使用して細胞を寒天表面から洗って回収した。１０Ｌ発酵は、２つの寒天フラスコからの前培養物を使用して植菌した。得られた植菌材料の容量は７５ｍで、ＯＤ６００ｎｍは４．３であり、発酵槽の始めのＯＤ６００ｎｍは約０．０３であった。発酵は、１０Ｌの開始作業容量で２０Ｌステンレススチール容器で実施した。発酵は、４０ｇ／ｌ酵母抽出物、１５ｇ／ｌグリセロール（８７％）、塩、及び微量金属を含む複合培地に対して８時間のバッチフェーズで開始し、続いて、所定のプロファイルでグリセロールを加えた。最初の１７時間は、発酵温度は３７であった。その後、温度を３０℃まで下げた。発酵時間が１８時間経過した時点で、誘導因子であるＩＰＴＧを０．１ｍＭで添加して、タンパク質発現を誘導した。誘導の期間は２２時間までであり得る。回収プロセスは、遠心分離、高圧ホモジナイゼーション、０．２μｍの孔径を有するＳａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅを使用したクロスフロー精密濾過からなる。
【０１１８】
ＡＵＳ発酵は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び酵素活性アッセイを使用して分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、発現したシアリダーゼが、ビーズミリングの後に、可溶性及びペレット画分の双方にあらわれることが明らかになった。図１１は、３０℃の誘導温度及び０．１ｍＭのＩＰＴＧで得られた１０Ｌバッチに由来する典型的な発酵の結果を示す。
【０１１９】
実施例９：ＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３ Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるヒト線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の発現
ヒトＦＧＦ２１のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４９２（１）:２０３−２０６ （２０００）のＮｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌに開示されている。前記配列は、公開データベースからも得られる（各々、Accession nos. EMBL:AB021975及びUNIPROT:Q9NSA1）。
【０１２０】
天然のポリペプチドは、分泌のための２８アミノ酸のシグナルペプチド（以下に斜体で記載）とともに合成されるが、成熟ＦＧＦポリペプチドは、残部の１８１アミノ酸からなる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：
MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPA-LPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPS QGRSPSYAS。
【０１２１】
シグナルペプチドはないが、Ｎ末端のメチオニンを添加して、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドをクローニングして、Ｅ．ｃｏｌｉで細胞内タンパク質として発現させた。特に、３’末端にメチオニンのＡＴＧコドン並びにＮｄｅ１及びＢａｍＨ１制限酵素部位を３’末端及び５’末端の各々に含む５５０ｂｐのコード領域を、ファージＴ７プロモーターの制御下のＮｄｅ１−ＢａｍＨ１において発現ベクターｐＥＴ １１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１ ＤＥ３ Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を形質転換した。細胞をＬＢ ａｍｐ １００μｇ／ｍｌ中においてＯＤ４５０が０．５になるまで増殖させ、０．３ｍＭ ＩＰＴＧで４時間にわたって３７℃で発現を誘導した。ＦＧＦ２１発現分析のために細胞の粗抽出物を超音波処理によって作製した。
【０１２２】
図１２のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１ ＤＥ３およびＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるＦＧＦ２１の発現が等しく成功したことを示す。発現したＦＧＦ２１（Ｍｅｔ−ＦＧＦ２１）の計算分子量（Ｍｗ）は１９．５ｋＤであるが、ゲル上では２５ｋＤタンパク質として移動し、これはタンパク質の移動を遅らせるプロリンが多く含まれているためであろう。
【０１２３】
本実施例は、ＦＧＦ２１の産生量は宿主細胞の遺伝子操作によって影響を受けないことを示す。
【０１２４】
実施例１０：ＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるヒトアミリンの発現
３７アミノ酸のアミロイドペプチドであるアミリンの配列は、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （８４） ： ８６２８−８６３２， （１９８７）のＣｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．によって公開された。遺伝子をクローニングして、サーモトガ・マリティマ（thermotoga maritima）由来のリボソームタンパク質ＲＬ２３にＮ末端に融合した。１４６アミノ酸の融合タンパク質は、以下の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を有する：
KQEKLSLHDVLIRPIITEKALILREQRKYVFEVNPLANKNLVKEAVEKLFNVKVEKVNILNMKPKPKRRGIFEGKTRSWKKAVVTLKEGYTIKELEGEHSSSSDDDDKKCNTATCATQRLA-NFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY。
【０１２５】
前記遺伝子を、実施例９に記載のとおり、Ｎｄｅ１−ＢａｍＨ１断片として、Ｔ７プロモーターの制御下においてｐＥＴ１１ｃにクローニングして、プラスミドを使用してＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を形質転換した。
【０１２６】
発現は実施例９に記載のとおり実施し、結果は図１２に示す。図１２は、２種のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ宿主であるＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）における等しく高い産生量の発現を示す。
【０１２７】
実施例１１：ＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）におけるヒトレプチンの発現
１４６アミノ酸長のヒトレプチンの配列は、Ｄｉａｂｅｔｅｓ （４４）： ８５５−８５８ （１９９５）のＭａｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌに公開されている。前記タンパク質は、２１アミノ酸のシグナルペプチドが添加されてヒトにおいて分泌される。Ｅ．ｃｏｌｉで細胞内に発現させた成熟レプチンは、以下の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を有する：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC。
【０１２８】
レプチン遺伝子は、実施例９に記載のとおり、４５０ｂｐのＮｄｅ１−ＢａｍＨ１断片として、Ｔ７プロモーターの制御下においてｐＥＴ １１ｃにクローニングし、このプラスミドを使用してＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）を形質転換した。
【０１２９】
発現は実施例９に記載のとおりに実施した。結果は図１２に示す。図１２は、２種のＥ．ｃｏｌｉ宿主であるＢＬ２１ ＤＥ３及びＢＬ２１ ＤＥ３Δ（ｋｐｓＭ−ｋｐｓＦ）における等しく高い産生量の発現を示す。
【０１３０】
グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの除去は、いずれの増殖条件における細胞の増殖にも影響を与えることがないと結論付けられる。グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの除去がタンパク質発現に影響を与えないとも結論付けられる。したがって、治療用タンパク質製造のための市販の宿主株としてＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用するための、グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを完全に取り除いたより安全な株がこれにより製造される。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）のグループＩＩ莢膜遺伝子を欠失する遺伝子操作によって、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２と同じ安全カテゴリーになる。グループＩＩ遺伝子クラスターが、これら２種の株の唯一の顕著な違いだからである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不可逆的に不活性化されたグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを有することを特徴とする、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項２】
グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの全体又は一部の欠失を有することを特徴とする、請求項１に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項３】
グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの全体の欠失を有することを特徴とする、請求項１に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項４】
前記Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項５】
前記Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ株。
【請求項６】
ペプチドをコードする挿入ＤＮＡ配列を有する発現ベクターも含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項７】
前記ペプチドが、ｈＧＨ、グルカゴン様ペプチド、インターロイキン、インスリンアナログ、野生型アジポネクチン、ＦＧＦ−２１、トリプシン、アプロチニン、アミリン及びレプチン並びにそれらのアナログ、並びに酵素、例えば、シアリダーゼ、トランスグルタミナーゼ（ｔＧａｓｅ）、ＨＲＶ（ヒトライノウイルス）３Ｃプロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項８】
前記グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターが、
ａ．選択マーカーによってグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを置換する工程、
ｂ．前記選択マーカーを除去する工程、
ｃ．ＰＣＲ分析によって欠失を確認する工程
を含む方法によって欠失される、請求項１から７のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法。
【請求項９】
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項８に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法。
【請求項１０】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、バンコマイシン、及びエリスロマイシンからなる群から選択される、請求項９に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法。
【請求項１１】
前記抗生物質がクロラムフェニコールである、請求項９に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株を適切な培養培地で培養して、その後に、よく知られた技術によって発現したペプチドを単離及び精製することを含む、ペプチドの製造方法。
【請求項１３】
前記ペプチドがｈＧＨである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドがＦＧＦ−２１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドがアミリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
不可逆的に不活性化されたグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを有することを特徴とする、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項２】
グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの全体又は一部の欠失を有することを特徴とする、請求項１に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項３】
グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターの全体の欠失を有することを特徴とする、請求項１に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項４】
前記Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項５】
前記Ｅ．ｃｏｌｉがＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｄａｄＸΔａｌｒである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ株。
【請求項６】
ペプチドをコードする挿入ＤＮＡ配列を有する発現ベクターも含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項７】
前記ペプチドが、ｈＧＨ、グルカゴン様ペプチド、インターロイキン、インスリンアナログ、野生型アジポネクチン、ＦＧＦ−２１、トリプシン、アプロチニン、アミリン及びレプチン並びにそれらのアナログ、並びに酵素、例えば、シアリダーゼ、トランスグルタミナーゼ（ｔＧａｓｅ）、ＨＲＶ（ヒトライノウイルス）３Ｃプロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１株。
【請求項８】
前記グループＩＩ莢膜遺伝子クラスターが、
ａ．選択マーカーによってグループＩＩ莢膜遺伝子クラスターを置換する工程、
ｂ．前記選択マーカーを除去する工程、
ｃ．ＰＣＲ分析によって欠失を確認する工程
を含む方法によって欠失される、請求項１から７のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法。
【請求項９】
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項８に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法。
【請求項１０】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、バンコマイシン、及びエリスロマイシンからなる群から選択される、請求項９に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法。
【請求項１１】
前記抗生物質がクロラムフェニコールである、請求項９に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株を適切な培養培地で培養して、その後に、よく知られた技術によって発現したペプチドを単離及び精製することを含む、ペプチドの製造方法。
【請求項１３】
前記ペプチドがｈＧＨである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドがＦＧＦ−２１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドがアミリンである、請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図９】
【図１２】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図９】
【図１２】
【公表番号】特表２０１２−５０８００１（Ｐ２０１２−５０８００１Ａ）
【公表日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３５１３４（Ｐ２０１１−５３５１３４）
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６４９０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５２３３５
【国際公開日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（５１１０９９６８５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６４９０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５２３３５
【国際公開日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（５１１０９９６８５）
【Ｆターム（参考）】
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