機能化ナノ粒子
機能化ナノ粒子が提供される。このナノ粒子は、二官能性ペプチドが付着する単層膜でコーティングしたナノ粒子で構成される。このペプチドを機能化し、ＤＮＡおよびＲＮＡをはじめとするさまざまなバイオポリマーを結合させる。この機能化ナノ粒子は、バイオポリマーの捕獲時ならびにナノメートル規模の電子デバイスをプログラムにより組み立てる目的で有用なものである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本件出願は、２００２年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／４０６，７３６号の利益を主張するものであり、その全開示内容は引用することにより本願明細書に編入される。
【技術分野】
【０００２】
本発明はナノテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、ナノデバイス組み立て用にバイオポリマーを結合すべく機能化させたペプチドリガンドを有する機能化ナノ粒子を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
生体分子とのハイブリッドなどのナノ材料には、エレクトロニクス、光学、ゲノミクス、プロテオミクス、生体臨床医学ならびに生体分析などの用途に活用できる可能性が秘められている。生体分子をこれらの用途の多くでテンプレートとして用いる機能は、無機ナノ材料と生体分子との間の特異的結合に基づく合理的な設計をいかにうまく達成できるかに左右される。その単純さと特異性、さらには操作しやすさの理由で、テンプレートとして用いるのに魅力的な生体分子のひとつにＤＮＡがある。
【０００４】
ＤＮＡの相補鎖を用いて金属質ナノ粒子の構造体を組み立てることが文献に報告されている。オリゴヌクレオチドで標識した金ナノ粒子を用いて、非特許文献１は凝集物を調製し、かたや非特許文献２は二量体を調製した。非特許文献３も短鎖オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着した相補的オリゴヌクレオチドリガンドに対するブリッジとして使用し、凝集した金ナノ粒子の非構造的ネットワークを調製した。非特許文献４は、一本鎖ＤＮＡテンプレートを用いて金ナノ粒子を相補的な配列に結合させた。
【０００５】
特許文献１には、インターカレーションを起こす試薬、溝結合剤またはアルキル化剤を用いることで、一結合領域を核酸に付着させることのできる、二官能性リンカーを利用して金属質ナノ粒子を核酸分子に結合するための方法が説明されている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願第２００２／００７２０６９号明細書
【非特許文献１】マーキン（Ｍｉｒｋｉｎ），Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３８２巻、１９９６年８月、第６０７ページ
【非特許文献２】ユン（Ｙｕｎ），Ｃ．ら、ＪＡＣＳ（２００２）、１２４（２６）、７６４４〜７６４５
【非特許文献３】ミューシック（Ｍｕｃｉｃ），Ｒ．ら、ＪＡＣＳ、１９９８、１２０、第１２６７４〜５ページ
【非特許文献４】アリビサトス（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３８２巻、１９９６年８月、第６０９ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の機能化ナノ粒子は、ナノ粒子をデバイスに組み立てる課題に対処する上で有用なものであるが、結合が核酸ハイブリダイゼーションに依存するＤＮＡ結合リガンドに制約されるという欠点がある。結合の選択肢の幅がさらに広い機能化ナノ粒子が当業界で有用なこともあろう。
【０００８】
ナノ粒子を組み立てるためのテンプレートとしてＤＮＡを用いるひとつの方法に、ＤＮＡならびにナノ粒子に対しても高い親和性および特異性で結合できる二官能性を持つタンパク質を利用することがある。ひとつの手法として、ＤＮＡ結合ドメインとナノ粒子結合ドメインとで構成される融合タンパク質を生成することがあろう。
【０００９】
他のリガンドをナノ粒子に付着させているにもかかわらず、二官能性ペプチドをナノ粒子または他のナノ構造体と併用してナノスケールの導電性デバイスを得る用途に関する報告は全くない。当該技術分野におけるこの欠如についてのひとつの理由として、非核酸リガンドで特異的に機能化されているナノ粒子を生成するのが非常に困難だという点があろう。
【００１０】
本願出願人らは、ナノ粒子に結合可能な結合ドメインをひとつと、ＤＮＡなどの生体テンプレートと選択的に結合可能な第２の結合ドメインとを有する二官能性タンパク質またはペプチドを用いることで、従来技術の欠点を解決した。このようなナノ粒子については、自己組織化して合理的なものとすることが可能である。
【００１１】
発明の概要
本発明は、ナノデバイスへの組み立てに役立つナノ粒子を提供するものである。二官能性タンパク質を受け入れるように機能化させた単層膜でナノ粒子をコーティングする。二官能性タンパク質は、ひとつのドメインでナノ粒子の表面に結合し、２つ目のドメインで核酸に結合する。本発明のナノ粒子は、ナノデバイスへの自己組織化が容易なように設計し得るものである。
【００１２】
したがって、一態様において、本発明は、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）各々結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインで（ａ）のナノ粒子に付着されている、機能化ナノ粒子を提供するものである。
【００１３】
もうひとつの態様において、本発明は、核酸、ペプチド、生体細胞、および無機ナノチューブよりなる群から選択される捕獲部分を、本発明の機能化ナノ粒子と接触させることを含んでなる、捕獲部分を捕獲するための方法を提供するものである。好ましい捕獲部分は核酸である。
【００１４】
また、本発明は、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のナノ粒子に付着されており、そして核酸結合アミノ酸配列において核酸断片に付着されている、核酸ナノ粒子複合体を提供するものである。
【００１５】
もうひとつの態様において、本発明は、
ａ）各々が
ｉ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｉｉ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなる複数の機能化ナノ粒子であって、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して金属質ナノ粒子に付着されており、そして各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列が非反復性である、複数の機能化ナノ粒子を提供し、
ｂ）（ａ）の各二官能性ペプチドの各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列に対する親和性を有するペプチド結合ドメインを有する核酸マトリクスを提供し、
ｃ）二官能性ペプチドの核酸結合アミノ酸配列が（ｂ）の核酸マトリクスのペプチド結合ドメインと結合する条件下で（ａ）の機能化ナノ粒子を（ｂ）の核酸マトリクスと接触させ、ナノ粒子を固定化することを含んでなる、複数のナノ粒子を核酸マトリクス上に固定化するための方法を提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、本発明の方法によって作製されるナノメートル規模の電子デバイスを提供するものである。
【００１７】
もうひとつの実施形態において、本発明は、
ａ）カーボンナノチューブと、
ｂ）カーボンナノチューブに対する親和性を有する第１の結合ドメインと、結合対のメンバーを含んでなる第２の結合ドメインと、を有する二官能性タンパク質と、含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のカーボンナノチューブに付着されている、機能化カーボンナノチューブを提供するものである。
【００１８】
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明および添付の配列の説明から、本発明についてなお一層完全に理解することができる。
【００１９】
以下の配列は米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（施行規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に従ったものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いる記号および形式は米国特許施行規則第１．８２２に記載の規則に準拠している。
【００２０】
配列番号１は、亜鉛フィンガー標的配列Ｚｉｆ２６８のＤＮＡ配列である。
配列番号２は、亜鉛フィンガー標的配列ＮＲＥのＤＮＡ配列である。
配列番号３は、亜鉛フィンガー標的配列Ｓｐ１ＣのＤＮＡ配列である。
配列番号４〜２７は、カーボンナノチューブ結合タンパク質ＣＮＰ１〜ＣＮＰ２４のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、マウス亜鉛フィンガー配列Ｚｉｆ２６８のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、亜鉛フィンガー標的配列Ｚｉｆ２６８のＤＮＡ配列である。
配列番号３０は、プライマー８２１−ＺＮＦ１のＤＮＡ配列である。
配列番号３１は、プライマー８２２−ＺＮＦ２のＤＮＡ配列である。
配列番号３２は、プライマー８２３−ＺＮＦ３のＤＮＡ配列である。
配列番号３３は、プライマー８２４−ＺＮＦ４のＤＮＡ配列である。
配列番号３４は、プライマー８２５−ＺＮＦ５のＤＮＡ配列である。
配列番号３５は、プライマー８２６−ＺＮＦ６のＤＮＡ配列である。
配列番号３６は、プライマー８２７−ＺＮＦ７のＤＮＡ配列である。
配列番号３７は、プライマー８２８−ＺＮＦ８のＤＮＡ配列である。
配列番号３８は、プライマー８２９−ＺＮＦ９のＤＮＡ配列である。
配列番号３９は、プライマー８４８−ＺＮＲ１０のＤＮＡ配列である。
配列番号４０は、プライマー８４９−ＺＮＲ１１のＤＮＡ配列である。
配列番号４１は、プライマー８５０−ＺＮＲ１２のＤＮＡ配列である。
配列番号４２は、プライマー８５１−ＺＮＲ１３のＤＮＡ配列である。
配列番号４３は、プライマー８５２ＺＮＲ１４のＤＮＡ配列である。
配列番号４４は、プライマー８５３−ＺＮＲ１５のＤＮＡ配列である。
配列番号４５は、プライマー８５４−ＺＮＲ１６のＤＮＡ配列である。
配列番号４６は、プライマー８５５−ＺＮＲ１７のＤＮＡ配列である。
配列番号４７は、プライマー８５６−ＺＮＲ１８のＤＮＡ配列である。
配列番号４８は、プライマー８９７−２ＺｎＲＥのＤＮＡ配列である。
配列番号４９は、プライマー８７２−ＮＺＦのＤＮＡ配列である。
配列番号５０は、プライマー８７３−ＮＺＲのＤＮＡ配列である。
配列番号５１は、プライマー８７４−Ｎ／ＺＦのＤＮＡ配列である。
配列番号５２は、プライマー８７５−Ｎ／ＺＲのＤＮＡ配列である。
配列番号５３は、プライマー８７６−Ｎ／／ＺＦのＤＮＡ配列である。
配列番号５４は、プライマー８７７−Ｎ／／ＺＲのＤＮＡ配列である。
配列番号５５は、プライマー８７８−ＣＡＰＢ５’のＤＮＡ配列である。
配列番号５６は、プライマー８７９−ＣＡＰＢ３’のＤＮＡ配列である。
配列番号５７は、プライマー８８０−ＣＡＰＥ５’のＤＮＡ配列である。
配列番号５８は、プライマー８８１−ＣＡＰＥ３’のＤＮＡ配列である。
【００２１】
発明の詳細な記述
本発明は、表面に付加された二官能性ペプチドリガンドを含んでなる機能化ナノ粒子を提供するものである。ナノ粒子に対して遠位の部分でペプチドを機能化し、核酸、ナノチューブ、他のペプチドなどのバイオポリマーを含む多種多様な材料と結合させる。
【００２２】
機能化ナノ粒子については、バイオポリマーのマトリクスに固定化し、ナノ回路の土台として機能する導電性のネットワークを形成することができる。固定化したナノ粒子には、ナノスケールの電子デバイス、多機能触媒、化学センサの分野ならびに、バイオセンサ、生体アッセイなどの多くの生物学的用途において有用性がある。
【００２３】
本願開示内容全体をとおして多数の略号および定義を用いるが、これらは特許請求の範囲および明細書を解釈するにあたって使用できるものである。
【００２４】
「ＣＮＢＰ」はカーボンナノチューブ結合ペプチドを意味し、
「ＭＷＮＴ」は多層ナノチューブを意味し、
「ＳＷＮＴ」は単層ナノチューブを意味し、
「ＴＥＭ」は透過電子顕微鏡を意味し、
「ＣＮＴ」はカーボンナノチューブを意味し、
「ＧＳＨ」は化合物グルタチオンを示す。
【００２５】
「ＴＰ」はチオプロニンの略号である。
「ＨＴＨはヘリックスターンヘリックスの略号である。
【００２６】
本願明細書において「ナノ粒子」とは、平均粒径が１〜１００ｎｍの間にある金属質粒子または半導体粒子であると定義する。好ましくは、粒子の平均粒径が約１〜４０ｎｍの間である。本願明細書において使用する場合、「粒度」と「粒径」は同じ意味である。
【００２７】
「合金」とは、本願明細書において、２種以上の金属の均質な混合物であると定義される。
【００２８】
「単層膜」とは、単一分子の厚さである、ナノ粒子にコーティングされる材料の層を示す。
【００２９】
「混合単層膜」とは、少なくとも２種類の分子成分を有する単層膜を示す。
【００３０】
「捕獲コーティング成分」とは、本願明細書において使用する場合、何らかのリガンドまたは捕獲部分との親和性を持つ、ナノ粒子に単層膜を形成できる材料を示す。「捕獲」成分は、混合単層膜の少ない方の部分をなし、単層膜の５０％未満を占めるものであればよい。
【００３１】
「遮蔽用コーティング成分」とは、捕獲部分ではない物質の非特異的結合を防止する機能を持つ、ナノ粒子に単層膜を形成できる材料を示す。遮蔽用コーティング成分はさまざまな材料で構成されるもので構わないが、エチレングリコールが特に適している。
【００３２】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに結合された２以上のアミノ酸を示す。ペプチドには、プロセシングや翻訳後修飾などの何らかの自然なプロセスで修飾されたものだけでなく、化学修飾の手法で修飾されたものも含まれる。この修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ末端またはカルボキシル末端をはじめとして、ペプチド内のどこにでも起こり得るものである。修飾の一例として、アミド化、アシル化、アセチル化、架橋、環化、グリコシル化、水酸化、リン酸化、ラセミ化ならびに、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、脂質または脂質誘導体などのさまざまな部分の共有付着（たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ− Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版 クライトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（１９９３）およびＰｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８３）を参照のこと）があげられるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を示す。本願明細書では以下の略号を使用して具体的なアミノ酸を特定する。
【００３４】
【表１】
【００３５】
本願明細書において使用する場合、「ペプチド」という用語と「ポリペプチド」という用語は同義に用いられる。
【００３６】
本願明細書において使用する場合、「二官能性」という用語は、ペプチドについていえば、少なくとも２つのエンティティに対する親和性を持つペプチドを意味する。本発明の代表的な二官能性ペプチドとして、Ｃ末端またはＮ末端がナノ粒子に結合するように機能化され、反対側の末端が、一般にはバイオポリマーまたはカーボンナノチューブなどのナノ構造体である何らかの捕獲部分に結合するように機能化されたものがあげられる。
【００３７】
「結合ドメイン」という用語は、特定のエンティティまたは捕獲部分に対する結合親和性を持つ二官能性ペプチドの一部を示す。
【００３８】
「炭素ナノ構造体結合ペプチド」という用語は、炭素ナノ構造体に結合するように選択されたペプチドを示す。カーボンナノチューブに対する特定の親和性を持つペプチドを生成する場合、これらのペプチドを「炭素ナノ構造体結合ペプチド」またはＣＮＢＰと呼ぶ。
【００３９】
「ナノ構造体」という用語は、少なくとも１つの特徴寸法（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）が約１００ミクロン未満である、チューブ、ロッド、シリンダ、束状構造体、ウエハ、ディスク、シート、プレート、平面、錐体、細長い小片、顆粒、楕円体、楔体、ポリマー繊維、天然繊維、このような他の物体を意味する。
【００４０】
「ナノロッド」という用語は、中空であっても中実であってもよく、断面形状が円形であっても円形でなくても構わない、さまざまなナノ構造体を意味する。本発明のナノロッドには、ナノチューブ、ナノファイバ、ポリマーナノファイバ、束状構造体、多層構造体を含み得る。
【００４１】
「ナノチューブ」という用語は、ナノロッドの一部分集合であって、狭い方の寸法（直径）が約１〜２００ｎｍであり、長い方の寸法（長さ）については、短い方の寸法に対する長い方の寸法の比すなわちアスペクト比が少なくとも５である、中空の物品を示す。通常、アスペクト比は１０〜２０００の間である。
【００４２】
「ナノ平面」とは、１つの特徴寸法が５００ナノメートル未満である、単層または二層のグラファイトシートまたはグラフェンシートなどの表面を意味する。
【００４３】
「ナノファイバ」とは、寸法が１０００ナノメートル未満と小さい天然のフィラメントまたはポリマーフィラメントを意味する。
【００４４】
「炭素ベースのナノチューブ」または「カーボンナノチューブ」とは、本願明細書において、主に炭素原子で構成される中空の構造体を意味する。カーボンナノチューブを、金属などの他の元素でドープすることも可能である。
【００４５】
「機能化カーボンナノチューブ」という用語は、二官能性タンパク質またはペプチドが付着したカーボンナノチューブを示す。本発明の機能化カーボンナノチューブは、このナノチューブに付加され、核酸分子などの捕獲部分に対する親和性を持つことになる遊離結合ドメインを有する二官能性ペプチドを有するものである。
【００４６】
「結合対」という用語は、化学ポリマーまたはバイオポリマーをベースにした、互いに特異的に結合するカップルを示す。結合対の一般的な例に、抗原／抗体またはハプテン／抗ハプテン系などの免疫型の結合対がある。
【００４７】
本願明細書において使用する場合、「固体担体」という用語は、ニトロセルロースまたはナイロンなど、核酸マトリクスを固定化できる材料を示す。
【００４８】
本願明細書において使用する場合、「核酸断片」は、任意に、合成、非天然、あるいは改変したヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形で単離された核酸断片が、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントで構成されるものであっても構わない。
【００４９】
「核酸結合アミノ酸配列」という用語は、特定の核酸標的配列に対する親和性を有する連続したアミノ酸の連続配列を示す。
【００５０】
「標的配列」という用語は、特異的に認識され、核酸結合ペプチドに結合する核酸の連続配列を意味する。
【００５１】
「亜鉛−フィンガー」または「Ｚｎ−フィンガー」という用語は、特定の核酸配列に結合する特定のアミノ酸配列を示す。Ｚｎ−フィンガー配列は従来技術において周知であり、（ｉ）本願明細書においてＺｉｆ２６８とも呼ぶＧＣＧＴＧＧＧＣＧ［配列番号１］（キム（Ｋｉｍ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８年３月１７日；９５（６）：２８１２〜７）、（ｉｉ）本願明細書においてＮＲＥとも呼ぶＡＡＧＧＧＴＴＣＡ［配列番号２］（キム（Ｋｉｍ）ら、上掲）、本願明細書においてＳｐ１Ｃとも呼ぶＧＧＧＧＣＧＧＧＧ［配列番号３］（ウォルフェ（Ｗｏｌｆｅ）ら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２０００；２９：１８３〜２１２）を含むがこれに限定されるものではないＤＮＡの標的連続配列の特異性を有する。
【００５２】
「捕獲部分」とは、二官能性ペプチドの結合ドメインによって結合できる物質を示す。捕獲部分はどのような物質であってもよいが、一般にはペプチドやタンパク質、核酸断片などのバイオポリマーであるが、多種多様なナノ構造体も含み得る。
【００５３】
「ファージ」または「バクテリオファージ」とは、細菌に感染するウイルスを示す。本発明に関する限りは改変された形態を用いてもよい。好ましいバクテリオファージは、Ｍ１３およびλと呼ばれる２つの「野生型」ファージに由来するものである。λファージは、１０〜２０ｋｂ前後の範囲のＤＮＡのセグメントをクローニングにするのに用いられる。これらのファージは溶菌性ファージすなわち、その宿主細胞を溶解してさらに多くのファージを放出することによって複製する。Ｍ１３系は細菌内部で成長できるため、自己が感染した細胞を破壊することはなく、新たなファージを連続して作り続けさせる。これは一本鎖ＤＮＡファージである。
【００５４】
「ファージディスプレイ」という用語は、機能的外来ペプチドまたは小タンパク質をバクテリオファージまたはファージミド粒子の表面に提示すること示す。遺伝子組み換えファージを用いて、ペプチドをそれぞれの固有表面タンパク質のセグメントとして提示することが可能であろう。遺伝子配列の異なるファージの集団によってペプチドライブラリを生成することもできる。
【００５５】
「遺伝子」とは、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する制御配列をはじめとする特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「天然遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ自然界に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含んでなるあらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含んでなるものであってもよいし、同一起源由来であるが自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含んでなるものであってもよい。
【００５６】
「コード領域」の「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「好適な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造があげられる。
【００５７】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含んでなるものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件または生理学的条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほぼ常に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。
【００５８】
本願明細書で使用する「発現」という用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を示す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示すこともある。
【００５９】
「シグナルペプチド」という用語は、分泌された成熟タンパク質に先行するアミノ末端ポリペプチドを示す。シグナルペプチドは成熟タンパク質から切断され、よって成熟タンパク質中には存在しない。シグナルペプチドには、分泌されたタンパク質を細胞膜から押し出し、所定の場所まで移動させる機能がある。シグナルペプチドはシグナルタンパク質とも呼ばれる。
【００６０】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」の各用語は、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形で、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持っていることの多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状で一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する特定のベクターを示す。
【００６１】
「ヘテロ接合」という用語は、少なくとも２種類の材料が定義された空間内で順番に並置されることを示す。
【００６２】
本願明細書で利用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニングの手法は従来技術において周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ（１９８９）（以下、「マニアティス」とする）およびシルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．およびエンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・コールド出版局スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｌｄ Ｐｒｅｓｓ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ（１９８４）ならびに、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７）によって説明されている。
【００６３】
被覆ナノ粒子
本発明は、二官能性ペプチド用の付着点として機能する単層膜でコーティングしたナノ粒子を提供するものである。好適なナノ粒子は平均粒径が１から１００ｎｍの間にある金属質粒子または半導体粒子である。好ましくは、粒子の平均直径は約１から４０ｎｍの間である。金属質ナノ粒子としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルトならびに、これらの金属で構成される合金の粒子があげられるが、これに限定されるものではない。「半導体ナノ粒子」としては、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、シリコン、酸化スズ、酸化鉄、リン化インジウムの粒子があげられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
本発明のナノ粒子は単層膜でコーティングされている。単層膜は、二官能性ペプチドに対する付着部（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）として機能すると同時に、ナノ粒子に水溶性を持たせる役割も果たす。コーティングによって水溶性となったナノ粒子を本願明細書では「安定化されている」と呼ぶ。安定化された水溶性の金属ナノ粒子および半導体ナノ粒子を作製する方法は従来技術において周知である。これらの粒子は、有機コーティングの性質に応じて荷電していることもあれば中性のこともある。たとえば、本願明細書に援用する、テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら（Ｌａｎｇｍｕｉｒ １５：６６〜７６（１９９９）には、チオプロニンまたはコエンザイムＡ単層膜で保護された、安定化された荷電水溶性金ナノ粒子を作製するための方法が記載されている。チオプロニン保護金ナノ粒子を作製するにあたって、四塩化金酸とＮ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン（チオプロニン）とをメタノールと酢酸との混合物に同時溶解させた。素早く攪拌しながら水素化ホウ素ナトリウムを添加した。これらの粒子の平均粒度については、反応時のチオプロニンと四塩化金酸とのモル比を変えることで制御できる。コエンザイムＡ保護金ナノ粒子についても、反応におけるチオプロニンをコエンザイムＡに変えて同様にして作製した。
【００６５】
金属金、銀、白金、パラジウム、コバルトおよびニッケルの安定化された水溶性ナノ粒子を作製する同様の方法が、ヒース（Ｈｅａｔｈ）らによって本願明細書に援用する米国特許第６，１０３，８６８号に説明されている。この方法では、１以上の金属塩の溶液または分散液を、チオール、ホスフィン、ジスルフィド、アミン、オキシドまたはアミドなどの官能基を有する有機表面パッシバントの溶液と混合した。続いて還元剤を添加し、金属塩を還元して遊離金属を得た。
【００６６】
被覆ナノ粒子を作製するための他の好適な方法も周知である（たとえば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ １６９：１０７〜１１６（２０００）、ハーゲマイヤー（Ｈａｇｅｍｅｙｅｒ）らの米国特許第６，０７４，９７９号明細書、ウェルフィング（Ｗｕｅｌｆｉｎｇ）ら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１２６９６〜１２６９７（１９９８）、チャン（Ｃｈａｎ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２０１６〜２０１８（１９９８）、ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：８１２２〜８１２３（１９９９）、ナパー（Ｎａｐｐｅｒ）（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｓｃｉ ５８：３９０〜４０７（１９７７）を参照のこと）。
【００６７】
安定化された水溶性半導体ナノ粒子および金属ナノ粒子のいずれに関しても、たとえば、ポリ（エチレングリコール）およびグルタチオンまたはポリ（エチレングリコール）ならびにチオプロニンなどのさまざまな安定化用コーティングまたは単層の混合物を用いることが可能である。
【００６８】
よって、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）各々が結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなる機能化ナノ粒子であって、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインで（ａ）のナノ粒子に付着されている機能化ナノ粒子を提供することは、本発明の範囲内である。
【００６９】
あるいは、単層膜の一成分が二官能性ペプチドに対する付着点となり、混合単層膜の他の成分が望ましくないタンパク質または捕獲部分の非特異的結合に対するシールドとして機能する混合単層膜でコーティングしたナノ粒子を提供すると有用な場合もある。この実施形態では、一般に、捕獲成分と遮蔽成分とを有する混合単層膜が同じ単層膜の一部である。一般に、捕獲成分は混合単層膜の約５０％未満をなし、約２０％〜４０％が好ましい。逆に、遮蔽成分は単層膜の主成分を形成し、単層膜の少なくとも約５０％をなし、６０％から約９０％が好ましい。
【００７０】
このような混合単層膜の捕獲成分は、本発明の二官能性ペプチドと結合できるものでなければならない。捕獲成分は、捕獲部分への結合を可能にするさまざまな化学基で機能化し得るものである。このような化学反応基の非限定的な例としては、−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＨＯ−基、−ＯＨ基、−Ｘ（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）基、スクシンイミド基、およびエポキシ基よりなる群から選択されるものがあげられる。好適な捕獲成分の好ましい例にチオプロニンおよびＧＳＨがある。チオプロニン（ＴＰと略記）はＮ−２−メルカプトプロピオニル−グリシンであり、ペプチドに合った都合のよい結合部位として機能する露出したカルボキシ基が存在することから、特に捕獲成分として好適である。
【００７１】
混合単層膜の遮蔽成分は、被覆ナノ粒子に対する非捕獲部分材料の結合をブロックする機能を果たし、特定の二官能性タンパク質または捕獲部分を結合、単離または固定化する目的でナノ粒子を利用できるようにするものである。好適な遮蔽成分としては、短鎖エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールメタクリレート、糖類、クラウンエーテル、アクリルアミドがあげられるが、これに限定されるものではなく、短鎖エチレングリコールオリゴマーが好ましい。
【００７２】
二官能性ペプチド
本発明は、安定化された被覆ナノ粒子に付着された二官能性ペプチドを提供するものである。二官能性ペプチドは一般に、少なくとも２つの結合ドメインを持つことになる。一方の結合ドメインがナノ粒子をコーティングしている単層膜に対する親和性を持ち、他方の結合ドメインが何らかの捕獲部分に対する親和性を持つ。
【００７３】
本発明の二官能性ペプチドは約５から約１００アミノ酸長になり、約１０から約３０アミノ酸であると好ましく、一般には線状の二次構造に達するものである。
【００７４】
二官能性ペプチドを、ナノ粒子をコーティングする単層膜に対する親和性を有する結合ドメインを少なくともひとつ持つように操作する。一般に、この結合ドメインは結合対のメンバーになる。化学ベースおよびタンパク質ベースの結合対は従来技術において周知であり、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、６ＸヒスチジンＴａｇ／Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン／ビオチン、Ｓ−タンパク質／Ｓ−ペプチド、クチナーゼ／ホスホネートインヒビターなどの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない。さらに、結合対には、抗原／抗体またはハプテン／抗ハプテン系などの免疫型のあらゆるクラスの結合対ならびに、ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；葉酸／葉酸結合タンパク質などの非免疫型のあらゆるクラスの結合対；ペプチド核酸配列を含む相補的核酸セグメント；プロテインＡまたはＧ／免疫グロブリン；マレイミドおよびハロアセチル誘導体をはじめとするスルフヒドリル反応基などの共有結合を形成する結合対、イソトリオシアネート、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニルなどのアミン反応基も含まれる。
【００７５】
もうひとつの態様では、捕獲部分に対する親和性を有する第２の結合ドメインを含むように二官能性ペプチドを設計する。本発明の代表的な捕獲部分としては、たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸断片、コラーゲンなどのバイオポリマーならびに、さまざまなナノ構造（本願明細書にて定義するようなナノロッド、ナノチューブ、ナノ平面、ナノ繊維）などのナノデバイスの組み立てと合成に役立つナノ材料があげられる。本発明において好ましいのは核酸およびカーボンナノチューブ捕獲部分である。
【００７６】
核酸結合ドメインまたはモチーフは従来技術において周知であり、多くのものが本発明で使用するのに適している。たとえば、よく知られたひとつのファミリに、「ヘリックスターンヘリックス」モチーフで区別されるものがある。これらの配列には、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＲＰ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿４１７８１６）（マッケイ（ＭｃＫａｙ），Ｄ．Ｂ．およびシュテイツ（Ｓｔｅｉｔｚ），Ｔ．Ａ． １９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、７４４〜７４９）、λｃｒｏ（ジーンバンク受託番号：Ｐ０３０４０）（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、７５４〜７５８）、λｃｌ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０４０６２８）（パボ（Ｐａｂｏ），Ｃ．Ｏ．およびルイス（Ｌｅｗｉｓ），Ｍ．、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９８、４４３〜４４７）を含むがこれに限定されるものではない。これらの例は３つとも、ポリペプチドの例外的にかたいターンで分離されたαヘリックスの表面露出ペアで構成される、比較的小さなポリペプチドの二量体（＝長さ１００ａａ）である。各二量体におけるこれらのヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）モチーフの空間分離は基本的に同一であって３４Åに等しいが、これはデュプレックスの一方のフェイスに沿ったＢ型ＤＮＡの連続した主溝（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）の相対的な分離でもある。タンパク質配列データベースでの検索から、原核生物細胞と真核生物細胞の両方からのＨＴＨ含有ＤＮＡ結合タンパク質が数百ほど確認されている（ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．Ｃ．、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５３、７１５〜７１９；アガワール（Ａｇｇａｒｗａａｌ），Ａ．Ｋ．およびハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．Ｃ．、１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９、９３３〜９６９）。
【００７７】
他のタイプのＤＮＡ結合ドメインも本発明に使用するのに適している。非「ＨＴＨ」タイプの１５０を超えるタンパク質について、ＤＮＡ標的を持つ複合体の分子レベルでの研究がなされ、この特定のタイプの分子間認識イベントに関する大きなデータベースが得られている（リリー（Ｌｉｌｌｅｙ），Ｄ．Ｍ．Ｊ．（編）、１９９５、ＤＮＡ−タンパク質構造相互作用。ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ＯＵＰ、オックスフォード；ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．Ｃ．、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５３、７１５〜７１９）。これらの他のモチーフの多くは、ＨＴＨのヘリックス間の領域に対する制約が緩和される、真核生物転写因子で普通にみられるヘリックス−ループ−ヘリックス構造体の場合や、亜鉛フィンガーの場合と同じような認識αヘリックスも含んでいる（ルイジ（Ｌｕｉｓｉ），Ｂ．Ｆ．、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、３７９〜３８０）。逆平行βリボンにおける一対のポリペプチド鎖に基づく別個の認識モチーフもファージＰ２２リプレッサーＡｒｃ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４２）およびＭｎｔ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４１）、Ｅ． ｃｏｌｉメチオニンリプレッサータンパク質、ＭｅｔＪ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿４１８３７３）および細菌ＤＮＡパッケージングタンパク質ＨＵ（ラウマン（Ｒａｕｍａｎｎ）ら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、４、３６〜４３）で同定されている。真核生物ＴＡＴＡ結合タンパク質でもβ−シート認識モチーフを利用する（パティコグロウ（Ｐａｔｉｋｏｇｌｏｕ），Ｇ．およびバーレイ（Ｂｕｒｌｅｙ），Ｓ．Ｋ．、１９９７、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．、２６、２８９〜３２５）。
【００７８】
さらに、ＲＮＡ結合ドメインまたはモチーフを用いてもよい。ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴＲＳ）複合体（キューザック（Ｃｕｓａｃｋ），Ｓ．、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２、８２４〜８３１）、ＭＳ２バクテリオファージ翻訳抑制複合体（バレガード（Ｖａｌｅｇａｒｄ）ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７１、６２３〜６２６；バレガード（Ｖａｌｅｇａｒｄ）ら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７１、７２４〜７３８）、スプライセオソーム由来のＵ１Ａ複合体（オーブリッジ（Ｏｕｂｒｉｄｇｅ）ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７２、４３２〜４３８；ナガイ（Ｎａｇａｉ），Ｋ．、１９９６、Ｃｕｒｒ Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、６、５３〜６１）の３種類に対する結晶構造体を利用できる。タンパク質の一般的な標的部位には、ステム−ループ、ステム−バブル、シュードノット、このような小さな部位で構成される複合体部位がある。このような部位を認識するタンパク質モチーフとしては、ウイルスのコートタンパク質サブユニット（ロスマン（Ｒｏｓｓｍａｎｎ），Ｍ．Ｇ．およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ），Ｊ．Ｅ．、１９８９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８、５３３〜５７３；ベールガード（Ｖａｌｅｇａｒｄ）ら １９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４５、３６〜４１）；９０〜１００アミノ酸長の保存されたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）（セント・ジョンストン（Ｓｔ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）ら、１９９２、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８９、１０９７９〜１０９８３；バイクロフト（Ｂｙｃｒｏｆｔ）ら、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，３５６３〜３５７１；カラット（Ｋｈａｒｒａｔ）ら、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．、１４、３５７２〜３５８４）；ＲＧＧ ｂｏｘを含有するタンパク質すなわち、いくつかのアルギニン−グリシン−グリシン配列リピートに芳香族であることの多い他の残基が散在した２０〜２５アミノ酸の領域；オクタペプチドを含有する５０アミノ酸長以内のｋ相同性（ＫＨ）ドメインすなわちＩＧＸ２ＧＸＪ（Ｘはいずれかのアミノ酸である）；いわゆるアルギニンフォーク（ナガイ（Ｎａｇａｉ），Ｋ．、１９９６、Ｃｕｒｒ Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、６、５３〜６１）があげられる。最も一般的なＲＮＡ結合ドメインはＲＮＰドメインであり、これは高等生物の少なくとも６００タンパク質で生じるものである（マスコ（Ｍｕｓｃｏ）ら、１９９６、Ｃｅｌｌ、８５、２３７〜２４５；ナガイ（Ｎａｇａｉ）ら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８、５１５〜５２０；エイビス（Ａｖｉｓ）ら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５７，３９８〜４１１）。
【００７９】
本発明において好ましいのは、標的配列に対する高い結合親和性および特異性を呈し、容易に入手可能で文献に説明のあるＺｎ−フィンガー結合タンパク質である。本発明で使用するのに好ましいＺｎフィンガータンパク質は、以下の標的配列：ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ［配列番号１］；ＡＡＧＧＧＴＴＣＡ［配列番号２］およびＧＧＧＧＣＧＧＧＧ［配列番号３］と結合するものである。
【００８０】
あるいは、本発明の二官能性タンパク質については、ナノロッド、ナノファイバまたはナノチューブなどのさまざまなナノ構造体と結合するように設計できる。たとえばカーボンナノチューブに結合するペプチドを生成することが可能である。ｔｈｅのナノチューブ結合ペプチドを無作為に生成した後、炭素ナノ構造体の集団からＣＮＴへの結合親和性を基準に選択することもできる。ペプチドのライブラリのランダムライブラリの生成は周知であり、バクテリアディスプレイ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）（ケンプ（Ｋｅｍｐ），Ｄ．Ｊ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（７）：４５２０〜４５２４、１９８１、ヘルフマン（Ｈｅｌｆｍａｎ），Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０（１）：３１〜３５、１９８３）酵母ディスプレイ（チエン（Ｃｈｉｅｎ） ＣＴら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９１年１１月１日；８８（２１）：９５７８〜８２）コンビナトリアル固相ペプチド合成（米国特許第５４４９７５４号明細書、米国特許第５４８０９７１号明細書、米国特許第５５８５２７５号明細書、米国特許第５６３９６０３号明細書）、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；米国特許第５，５７１，６９８号明細書；米国特許第５，８３７，５００号明細書）をはじめとする多種多様な手法で達成できるものである。このような生体ペプチドライブラリを生成するための手法は、デイニー（Ｄａｎｉ），Ｍ．、Ｊ．ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＆ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓ．、２１（４）、４４７〜４６８（２００１）に説明されている。
【００８１】
ペプチドを無作為に生成するための好ましい方法のひとつに、ファージディスプレイによるものがある。ファージディスプレイは、ペプチドまたはタンパク質をバクテリオファージのコートタンパク質に遺伝子的に融合させ、ビリオン中の融合残渣をＤＮＡでコードしたまま融合タンパク質をファージバイロン（ｖｉｒｏｎ）の外に提示する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択手法である。提示されたタンパク質とこれをコードするＤＮＡとが上記のように物理的に結び付いていることから、各々が対応するＤＮＡ配列と結び付いた大量のタンパク質バリアントを「バイオパニング」と呼ばれる単純なｉｎ ｖｉｔｒｏ選択手順でスクリーニングすることができる。この最も単純な形態で、バイオパニングは、ファージ提示後のバリアントのプールを、プレートまたはビーズに固定化しておいた該当する標的とともにインキュベートし、未結合のファージを洗い流し、ファージと標的との間の結合相互作用を破壊して特異的に結合したファージを溶出することで実施される。次に、溶出されたファージをｉｎ ｖｉｖｏにて増幅し、このプロセスを繰り返して、もっともしっかりとした結合配列優先でファージプールを段階的に富化する。選択／増幅を３回またはそれ以上繰り返した後、個々のクローンをＤＮＡ配列決定でキャラクタライズする。
【００８２】
上記の方法を利用して、本願出願人らは、以下に列挙するカーボンナノチューブと選択的に結合する多数のペプチドを生成した。
【００８３】
【表２】
【００８４】
カーボンナノチューブを結合する目的で、これらのペプチドまたは同じようにして生成した他のペプチドを二官能性ペプチドに取り入れてもよいと思われる。
【００８５】
二官能性ペプチドの設計を定めたら、このペプチドを従来技術において周知の多種多様な手段で合成・生成することができる。たとえば、アミノ酸を樹脂に順次加えた後、樹脂から切り離して精製する固相ペプチド合成（たとえば、ヨクム（Ｙｏｋｕｍ）ら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２０００）、７９〜１０２。編者（ら）：ケート（Ｋａｔｅｓ），スティーブン（Ｓｔｅｖｅｎ） Ａ．；アルベリシオ（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ），フェルナンド（Ｆｅｒｎａｎｄｏ）。出版社：マーセル・デッカー・インコーポレイテッド（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク；アルベリシオ（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ），フェルナンド（Ｆｅｒｎａｎｄｏ）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２０００）、５５（２）、１２３〜１３９；フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ），グレッグ（Ｇｒｅｇｇ） Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９８）、５２７〜５４５。編者（ら）：ラプレイ（Ｒａｐｌｅｙ），ラルフ（Ｒａｌｐｈ）；ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ），ジョン（Ｊｏｈｎ） Ｍ．出版社：ヒューマナ（Ｈｕｍａｎａ）、ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）を参照のこと）によってペプチドを合成してもよいし、あるいは、組換え手段によってペプチドを生成してもよい。選択したペプチドをコードするＤＮＡコード領域を設計し、化学的に合成することができる。その後は、これらの断片をさまざまな微生物発現宿主の形質転換に適した発現ベクターやクローニングベクターにクローニングすることができる。
【００８６】
外来タンパク質の発現を高いレベルで指示する、プロモーターなどの制御配列を含む微生物の発現系および発現ベクターが当業者間で周知である。このうちどれを使って本配列の遺伝子産物生成用のキメラ遺伝子を構築しても構わない。
【００８７】
好適な宿主細胞の形質転換に役立つベクターまたはカセットは従来技術において周知である。一般に、このベクターまたはカセットには、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、自己複製または染色体組み込みを可能にする配列が含まれる。好適なベクターは、転写開始制御部を含む遺伝子の５’の領域と転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’の領域とを含んでなる。これは両方の制御領域が形質転換宿主細胞と相同遺伝子に由来するものである場合に最も好ましいが、このような制御領域が生産宿主として選択した特定の種に固有の遺伝子に由来するものでなくてもよいことは理解できよう。
【００８８】
所望の宿主細胞での上記遺伝子の発現をドライブするのに役立つ開始制御領域またはプロモーターには多くのものがあり、当業者には馴染みのあるものである。これらの遺伝子をドライブできるほとんどすべてのプロモーターが本発明に適しており、その一例として、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（酵母菌属での発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア属での発現に有用）、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での発現に有用）ならびに、バシラス属での発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよびさまざまなファージプロモーターがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００８９】
終結制御領域も好ましい宿主に固有のさまざまな遺伝子から誘導することができる。任意に、終結部位が必要ないこともあるが、終結部位を含む形が最も好ましい。
【００９０】
場合によっては、本件遺伝子産物を形質転換宿主の分泌生成物として生成する方が望ましいことがある。所望のタンパク質を成長培地に分泌することには、精製手順を単純化してコストを抑えられるという利点がある。細胞膜での発現可能なタンパク質の活発な移動を容易にする上で分泌シグナル配列が役立つ場合が多いことは従来技術において周知である。宿主産生宿主で機能的な分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を取り入れることで、分泌できる形質転換宿主を作出することができる。適切なシグナル配列を選択するための方法は従来技術において周知である（たとえば、ＥＰ ５４６０４９号；国際公開第９３２４６３１号を参照のこと）。分泌シグナルＤＮＡまたはファシリテーターを、発現制御ＤＮＡと本件遺伝子または遺伝子断片との間で、後者と同一の読み枠内に配置することができる。
【００９１】
二官能性ペプチドの被覆ナノ粒子への連結
二官能性ペプチドを被覆ナノ粒子に付加するには、多種多様な方法を用いることが可能である。これについては、連結の化学的な性質から共有結合と非共有結合の２つのカテゴリに分けることができる。共有結合による連結方法では、被覆ナノ粒子上の官能基および二官能性ペプチド上の官能基と反応させるのに小さなクロスリンカー分子を利用する。この方法の基本原理ならびに、これに合った多くのクロスリンカー分子については文献に十分な説明がある（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、グレッグ（Ｇｒｅｇ）Ｔ．ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）。アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サン・ディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、１９９６）。この方法の一例では、分子ＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩］を利用して被覆ナノ粒子（Ａｕ−Ｔｐなど）のカルボキシル基と二官能性ペプチドのアミン基とを架橋させる。
【００９２】
【化１】
【００９３】
非共有結合による方法では、被覆ナノ粒子（Ａｕ−ＧＳＨなど）にあらかじめ付加されたリガンドとこれに対応する二官能性ペプチドのリガンド−結合ドメイン（Ａｕ−ＧＳＨの場合はＧＳＴ）との共有結合の相互作用を利用することはない。上記にて説明したとおり、この目的で多種多様なリガンド／リガンド結合ドメイン対を利用することができる。
【００９４】
【化２】
【００９５】
固定化ナノ粒子
二官能性タンパク質またはペプチドが付着したナノ粒子については、ペプチドの結合ドメインのうちの１つをとおして多種多様な捕獲部分に固定化できる。一般に、捕獲部分が特定の構造と一致し、それ自体を固体担体に固定できる。本発明の代表的な捕獲部分としては、たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸断片、コラーゲンなどのバイオポリマーならびに、さまざまなナノ構造体（本願明細書にて定義するようなナノロッド、ナノチューブ、ナノ平面、ナノファイバ）などのナノデバイスの組み立てと合成に役立つナノ材料があげられる。
【００９６】
本発明の文脈におけるＣＮＴ結合ペプチドの利点のひとつに、一般的なナノ粒子に代えてＣＮＴを利用できる点があげられる。したがって、たとえば、核酸結合ドメインで機能化したＣＮＴ結合ペプチドがＣＮＴと核酸分子または核酸マトリクスとを連結させる上で役立つことがある。このような設計にすることで、複合体ナノ粒子を構成しなければならない必要性が簡素化され、核酸マトリクスによって構築されたパターンに従ってＣＮＴのマトリクスを構成できるようになる。
【００９７】
捕獲部分として、あるいはナノ粒子の代わりに役立つ炭素ナノ構造体には、主に炭素で構成され、少なくとも１つの特徴寸法が約１００ｎｍ未満である、チューブ、ロッド、シリンダ、束状構造体、ウエハ、ディスク、シート、プレート、平面、錐体、細長い小片、顆粒、楕円体、楔体、ポリマー繊維、天然繊維、このような他の物体の形をとる構造体がある。本発明の好ましい炭素ナノ構造体はナノチューブである。
【００９８】
特に好適なナノチューブは通常、直径が約１〜２００ｎｍであり、狭い方の寸法に対する長さ寸法の比すなわちアスペクト比が少なくとも５である。通常、アスペクト比は１０から２０００の間である。カーボンナノチューブは主に炭素原子で構成されるが、金属などの他の元素でドープされたものであっても構わない。炭素ベースのナノチューブについては、多層ナノチューブ（ＭＷＮＴ）であっても単層ナノチューブ（ＳＷＮＴ）であっても構わない。ＭＷＮＴは、たとえば、各々直径の異なる同心のナノチューブをいくつか含むものである。すなわち、直径の最も小さいチューブがこれより直径の大きなチューブの中に入り、これがさらに直径の大きな別のナノチューブの中に入っている。一方、ＳＷＮＴはナノチューブ１本で構成される。
【００９９】
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）は多種多様な方法で製造できるものであり、さらに市販もされている。ＣＮＴ合成方法には、グラファイトのレーザ蒸発法（Ａ．セス（Ｔｈｅｓｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、４８３（１９９６）、アーク放電（Ｃ．ジャーネット（Ｊｏｕｒｎｅｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８、７５６（１９９７）、ＨｉＰＣｏ（高圧一酸化炭素）プロセス（Ｐ．ニコラエフ（Ｎｉｋｏｌａｅｖ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．３１３、９１〜９７（１９９９）が含まれる。化学蒸着法（ＣＶＤ）を利用してカーボンナノチューブを生成することも可能である（Ｊ．コング（Ｋｏｎｇ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２９２、５６７〜５７４（１９９８）；Ｊ．コング（Ｋｏｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９５、８７８〜８７９（１９９８）；Ａ．キャッセル（Ｃａｓｓｅｌｌ）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０３、６４８４〜６４９２（１９９９）；Ｈ．ダイ（Ｄａｉ）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０３、１１２４６〜１１２５５（１９９９）。
【０１００】
あるいは、捕獲部分が核酸マトリクスまたはペプチドなどのバイオポリマーあるいは特定の構造的コンホメーションを持つペプチドの集団であっても構わない。本発明の二官能性ペプチドを機能化させて核酸結合ドメインを含んでなるようにしてある場合、捕獲部分が核酸であると好ましい。
【０１０１】
二官能性ペプチドによるナノ粒子の捕獲と以後の固定化用に、捕獲部分を固体担体に固定化してもよい。この目的のために、好適な固体担体としては、シリコンウェハ、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリグリシジルメタクリレート、置換ポリスチレン（アミン化またはカルボキシル化ポリスチレン；ポリアクリルアミド；ポリアミド；ポリ塩化ビニルなど）などの合成ポリマー担体；ガラス、アガロース、ニトロセルロース、ナイロンがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０１０２】
本発明の重要な利点のひとつに、機能化ナノ粒子の設計によってナノ構造体の作成に取り入れられるプログラマビリティの態様がある。特定の核酸結合ドメインを有する二官能性ペプチドを各々含んでなる複数の機能化ナノ粒子を構成することもできるであろうと思われる。各核酸結合領域は特定の核酸の連続配列に対する特定の親和性を持つことになる。よって、核酸マトリクスの特定の領域に結合するように機能化ナノ粒子を設計することが可能であり、その堆積量を正確に制御することが可能である。金属または半導体を正確かつ制御された形で堆積させる機能があることで、電子ヘテロ接合、相互接続部、ナノ回路などのナノメートル規模の電子デバイスを構成するにあたって不可欠な要件が満足される。
【０１０３】
よって、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のナノ粒子に付着されており、そして核酸結合アミノ酸配列で核酸断片に付着されている、核酸ナノ粒子複合体を提供することは、本発明の範囲内である。
【０１０４】
さらに、
ａ）各々が
ｉ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｉｉ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなる複数の機能化ナノ粒子であって、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して金属質ナノ粒子に付着されており、そして各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列が非反復性である、複数の機能化ナノ粒子を提供し、
ｂ）（ａ）の各二官能性ペプチドの各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列に対する親和性を有するペプチド結合ドメインを有する核酸マトリクスを提供し、
ｃ）二官能性ペプチドの核酸結合アミノ酸配列が（ｂ）の核酸マトリクスのペプチド結合ドメインと結合する条件下で（ａ）の機能化ナノ粒子を（ｂ）の核酸マトリクスと接触させ、ナノ粒子を固定化することを含んでなる、複数のナノ粒子を核酸マトリクス上に固定化するための方法を提供することは、本発明の範囲内である。
【０１０５】
ナノメートル規模の電子デバイス
導電性ヘテロ接合および相互接続部をナノスケールで構成するにあたって、捕獲部分のマトリクスに固定化した本発明の金属質ナノ粒子または半導体ナノ粒子を用いることができる。金属質の場合、固定化したナノ粒子は、ナノメートル規模の電子デバイス同士を連結させ、高密度電子回路の製造を可能にし得るものと思われる。隣接するナノ粒子間の距離を両者間の電位差によって制御可能な形で金属質ナノ粒子を並べてアレイ化した後、このマトリクスをリーバー（Ｌｅｉｂｅｒ）ならびにその共同研究者ら（ルーキーズ（Ｒｕｅｃｋｅｓ）Ｔ．ら（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９、９４〜９７）がカーボンナノチューブで提案しているものに近い不揮発性メモリデバイスとして利用できるものと思われる。
【０１０６】
半導体性ナノ粒子は、スイッチ、増幅器あるいはロジックゲートとしてそのまま利用可能な３端子ゲートデバイスでの用途が見込まれるものである。金属粒子を有機半導体と連結することで、たとえば、負性微分抵抗を呈する２端子スイッチングデバイス（ファン（Ｆａｎ）ら（２００２）ＪＡＣＳ １２４、５５５０〜５５６０など）を開発することが可能になる。他の考え得る用途として、電界放出ディスプレイデバイスの放出点源ならびに、導電性コーティング中の導電性成分としての用途があげられる。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
【０１０８】
基本方法
実施例で用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は従来技術において周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびＴ．Ｊ．シルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）（１９８４）ならびにオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版（１９８７）に記載されている。
【０１０９】
細菌培養の管理と成長に適した材料および方法が従来技術において周知である。以下の実施例において使用するのに適した手法が、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ（Ｒａｌｐｈ） Ｎ．・コスティロー（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ） Ｗ．ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ） Ａ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、ノエル（Ｎｏｅｌ） Ｒ．クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグズ・フィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ），ＤＣ．（１９９４）またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ） Ｄ．ブラック（Ｂｒｏｃｋ）著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウアー・アソシエーツ・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）（１９８９）に記載されている。特に明記しない限り、細菌細胞の成長および管理に用いる試薬、制限酵素、材料はいずれも、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ＤＩＦＣＯ ラボラトリーズ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ギブコ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から入手したものである。
【０１１０】
略号の意味は以下のとおりである。「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｄ」は日（単数または複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
【０１１１】
実施例１
二官能性タンパク質のクローニング
公開されているＺｉｆ２６８アミノ酸配列（パヴレティッシュ（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ） ＮＰ、パボ（Ｐａｂｏ） ＣＯ；Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１年５月１０日；２５２（５００７）：８０９〜１７）を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉで最も頻繁に見られるコドンを用いてＤＮＡ配列を生成した。この配列を用いて、遺伝子全体をカバーすべく１８のオリゴ（各３１ヌクレオチド長）からなる組を設計し、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から５’ホスホリル化形態として購入した。標準的な手順（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）に従ってアニーリングとライゲーション反応とを実施した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有する２つのプライマー（＃８２１、＃８９７）を用いて生成物をＰＣＲ増幅した。制限消化後、ＰＣＲ産物をｐＥＴ４１Ａ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）にクローニングしてＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質コード配列を含有するｐＥＤ１０５を得た。クローニングベクターｐＥＴ４１ａには、ＧＳＴ配列ならびに複数のクローニング部位が含まれている。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の「クイック・チェンジ（Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ）」キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を用いてｐＥＤ１０５のＺｉｆ ２６８の末端で停止コドンＴＡＡを導入し、ｐＥＤ１０７を得た。直接配列決定によってすべてのクローンの完全性を確認した。これらの配列を以下に示す。
【０１１２】
Ｚｉｆ２６８タンパク質のアミノ酸配列（９０アミノ酸、１０．８ｋＤａ）：
ＭＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＥＲＫＲ
ＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ［配列番号２８］
【０１１３】
Ｚｉｆ２６８のヌクレオチド配列（Ｅ．ｃｏｌｉコドンを用いて保存）：
ＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＣＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＧＴＣＡＣＡＴＣＣＧ
ＴＡＴＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＧＴＡＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡ
ＴＣＣＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＡＡＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧＴ
ＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣ［配列番号２９］
【０１１４】
Ｚｉｆ２６８クローニングに用いるプライマー：
８２１−ＺＮＦ１：ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＣＣ［配列番号３０］
８２２−ＺＮＦ２：ＣＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＣＧ［配列番号３１］
８２３−ＺＮＦ３：ＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＧＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＡＴＣ［配列番号３２］
８２４−ＺＮＦ４：ＣＡＣＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＧＴＡ［配列番号３３］
８２５−ＺＮＦ５：ＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡ［配列番号３４］
８２６−ＺＮＦ６：ＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴ［配列番号３５］
８２７−ＺＮＦ７：ＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＧＴＣ［配列番号３６］
８２８−ＺＮＦ８：ＧＴＡＡＡＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧ［配列番号３７］
８２９−ＺＮＦ９：ＴＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣ［配列番号３８］
８４８−ＺＮＲ１０：ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＧＣＡＧＧＴＧＧＡＴＴ［配列番号３９］
８４９−ＺＮＲ１１：ＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＡＣＧＡＧ［配列番号４０］
８５０−ＺＮＲ１２：ＣＧＡＡＴＴＴＡＣＧＡＣＣＧＣＡＧＡＴＧＴＣＧＣＡＡＧＣＧＡＡ［配列番号４１］
８５１−ＺＮＲ１３：ＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＧＧＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＧＡＴＧＴＧＧ［配列番号４２］
８５２−ＺＮＲ１４：ＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＴＴＡＣ［配列番号４３］
８５３−ＺＮＲ１５：ＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＣＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＴＣＴＧ［配列番号４４］
８５４−ＺＮＲ１６：ＡＣＣＧＧＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＧＡＴＧＴＧＡＣＧＧＧＴＣＡＧＴ［配列番号４５］
８５５−ＺＮＲ１７：ＴＣＧＴＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＣＧＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡＧ［配列番号４６］
８５６−ＺＮＲ１８：ＡＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＡＣＧＴＴＣＣＡＴ［配列番号４７］
【０１１５】
ＰＣＲプライマー：
８２１−ＺＮＦ１：ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＣＣ［配列番号４８］
８９７−２ＺｎＲＥ：ＣＣＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＴＴＴ ＣＴＧ ＡＣＧ［配列番号４９］
【０１１６】
実施例２
二官能性タンパク質の過発現および精製
ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質遺伝子を含有するプラスミドｐＥＤ１０７をＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）に形質転換した。ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から提供されている以下のプロトコールに従って過発現を実施した。まずＧＳＴ親和性精製キット（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて精製を行ったが、その結果を図１に示す。図１は、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加後０時間、１時間、２時間（それぞれレーン２、３、４）の時点でのタンパク質の誘導を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５％）である。第１レーンはタンパク質サイズマーカー（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのマーク１２）である。ＢはＧＳＴ親和性精製実験での溶出画分２〜６を示す。
【０１１７】
ｐＥＤ１０７でコードされるＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質の計算で求めた分子量は４３ｋＤａであったが、これは過発現させたタンパク質で観察された値と一致している。
【０１１８】
実施例３
Ｚｉｆ２６８によって認識されるＤＮＡ断片のクローニング
タンパク質活性アッセイの目的で、複製数を１から２３の範囲として、Ｚｉｆ ２６８ＤＮＡ結合部位のタンデムアレイを持つ一連のプラスミドコンストラクトを作出した。Ｚｉｆ２６８ ＤＮＡ結合部位を配列５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’［配列番号１］で同定した。このコンストラクトでは、２つの隣接するＺｉｆ２６８部位間の空間を、別の亜鉛フィンガータンパク質ＮＲＥのＤＮＡ結合部位である配列５’−ＡＡＧＧＧＴＴＣＡ−３’［配列番号２］（キム（Ｋｉｍ） ＪＳ、パボ（Ｐａｂｏ） ＣＯ；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１９９８年３月１７日；９５（６）：２８１２〜７）で埋めた。
【０１１９】
クローニングに用いるプライマーを以下に列挙する。８７２−ＮＺＦおよび８７３−ＮＺＲプライマーは、Ｚｉｆ２６８部位の前にあるＮＲＥ部位をコードする。ある単位を別の単位でアニールして結合部位の複製を複数形成できるように、上記の２つのプライマーの末端を、突出末端ＡＡＧおよびＴＴＣを有するように設計した（下記のスキームを参照のこと）。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
８７４−Ｎ／ＺＦプライマーおよび８７５−Ｎ／ＺＲプライマーは、１ヌクレオチドのｇスペーサを挟んでＺｉｆ２６８部位の前にあるＮＲＥ部位をコードする。８７６−Ｎ／／ＺＦプライマーおよび８７７−Ｎ／／ＺＲプライマーは、２ヌクレオチドのＧＴスペーサを挟んでＺｉｆ２６８部位の前にあるＮＲＥ部位をコードする。２つの末端にある２対のキャッピングプライマーによって、結合部位単位の成長が停止する。キャッピングプライマーはＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位も取り込む。
【０１２２】
０．１Ｍ ＮａＣｌ中にてアニーリングを行った後、Ｔ４リガーゼでのライゲーション反応を実施した。次に、ライゲーション反応混合物を、プライマー８７８および８８１でのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。クリンナップ後、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＵＣ１８にクローニングした。クローンを配列決定し、配列決定の結果に基づいて各クローンの結合部位数を確認した。１から２３の間にタンデムアレイのＺｉｆ２６８結合部位を含有するクローンを得た。
【０１２３】
ＤＮＡ結合部位のクローニングに用いるプライマー
８７２−ＮＺＦ：ＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧ［配列番号４９］
８７３−ＮＺＲ：ＣＴＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＣ［配列番号５０］
８７４−Ｎ／ＺＦ：ＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＣＧＧ［配列番号５１］
８７５−Ｎ／ＺＲ：ＣＴＴＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＴＧＡＡＣＣ［配列番号５２］
８７６−Ｎ／／ＺＦ：ＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧＴＧＣＧＴＧＧＧＣＧＧＴ［配列番号５３］
８７７−Ｎ／／ＺＲ：ＣＴＴＡＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＡＡＣＣ［配列番号５４］
８７８−ＣＡＰＢ５’：ＧＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧ［配列番号５５］
８７９−ＣＡＰＢ３’：ＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣ［配列番号５６］
８８０−ＣＡＰＥ５’：ＡＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡ［配列番号５７］
８８１−ＣＡＰＥ３’：ＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴ［配列番号５８］
【０１２４】
実施例４
平均直径３．０ｎｍのＧＳＨ単層膜保護金ナノ粒子の合成
一般的な反応では、ＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード）６０ｍＬと酢酸（ＨＰＬＣグレード）１０ｍＬとを、２５０ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内で内で２〜５分間攪拌することによって混合した。四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４×Ｈ２Ｏ）（９９．９９％）０．３７ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とグルタチオン（ＧＳＨ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から最低９９％）６１．４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）とを上記の混合溶媒に加え、５分間攪拌することによって溶解させたところ、透明な黄色の溶液が得られた。次に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４、９９％）０．６ｇ（１６ｍｍｏｌ）をナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（登録商標）水３０ｇに溶解させた。このＮａＢＨ４溶液を上記の溶液に素早く攪拌しながら滴下して加えた。ＮａＢＨ４の最初の１滴を加えると、ＨＡｕＣｌ４溶液は瞬時に黄色から暗褐色に変化した。この反応は発熱を伴うものであった。反応時に生成された熱により、１５分以内の間溶液を温かい状態に維持した。この反応時、溶液のｐＨが１．２から５．０以内まで変化した。攪拌を２時間継続した。得られたＧＳＨ保護金ナノ粒子は水に可溶であった。希釈すると、溶液は透明な紫色になった。
【０１２５】
実施例５
ＤＮＡ結合活性アッセイ
ゲル電気泳動を利用して、図２に示すように精製Ｚｎフィンガータンパク質が標的ＤＮＡ配列に対して高い親和性および特異性で結合していることを確認した。図２は、電気泳動度移動アッセイである。レーン１および７はライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）からの「１ＫｂプラスＤＮＡラダー」である。レーン２〜６は、後述するようにタンパク質の量が増した同量のＤＮＡの結合反応物からの分離を示す。
【０１２６】
この例では、２３のＺｉｆ２６８結合部位を含む短い方の切片と、結合部位を含まない長い方の切片の２種類の異なるＤＮＡ片をＰＥＤ１０７（ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質）と混合した。ＤＮＡについては以下のようにして調製した。プラスミドＮＺ−２３、５μｇ（〜２ｐｍｏｌｅ）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、２３のＮＺ結合部位と線状化したｐＵＣ１８ベクターに対応する長い方の切片とを含む４２０ｂｐの断片を得た。精製後、１ｍｇ／ｍＬ（〜２０ｐｍｏｌ／μＬ）ＰＥＤ１０７が０μＬ、１μＬ、２μＬ、３μＬ、４μＬ入った５本のチューブにＤＮＡを等分した。Ｈ２Ｏを用いて総反応容量を１０μＬにした。この反応混合物をＲＴで１０分間インキュベートし、１％アガロースゲルに仕込んだ（図２のレーン２〜５）。試料を６０分間９０Ｖで電気泳動した。タンパク質の濃度が高くなるにつれて、短い方のＤＮＡ片がゲルにうまくトラップされたが、長い方の切片ではこれが起こらないことから、Ｚｎフィンガータンパク質とその標的配列との間に特定の複合体が形成されていることが分かる。
【０１２７】
実施例６
ナノ粒子結合活性アッセイ
一般的な実験では、ＯＤ５００＝１０（〜１０μＭ）に等しい濃度のＡｕ−ＧＳＨ粒子２μＬを、１ｍｇ／ｍＬのＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８タンパク質または対照としてのＢＳＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）８μＬ（〜２０μＭ）と混合した。室温にて１０分間のインキュベーション後、反応混合物全体を１％アガロースゲルに仕込んだ。１×ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ）中、９０Ｖの定電圧で２０分間ゲル電気泳動を実施した。ゲル像については、ＨＰスキャンジェット（ＳｃａｎＪｅｔ） ６３００Ｃ上でゲルを直接走査して得た。図３から明らかなように、ＢＳＡタンパク質はＡｕ−ＧＳＨ粒子に結合できないのに対し、二官能性タンパク質ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８はＧＳＨ−Ａｕ粒子の移動性を阻害したことから、ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８とＡｕ−ＧＳＨとの間に複合体が形成されていることが分かる。
【０１２８】
実施例７
二官能性アッセイ
この例では、二官能性タンパク質ＰＥＤ１０７（ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８）がＡｕ−ＧＳＨ粒子とＺｉｆ２６８結合部位を持つＤＮＡ配列の両方に結合するであろうことを試験した。
【０１２９】
以下のようにして３回の反応の準備を整えた。１）濃度ＯＤ５００＝１０（〜１０μＭ）のＡｕ−ＧＳＨ粒子２μＬ、２）濃度ＯＤ５００＝１０（〜１０μＭ）のＡｕ−ＧＳＨ粒子２μＬを１ｍｇ／ｍＬ ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８タンパク質８μＬと混合した、３）５μＬのＮＺ−２３（１μｇ／μＬ）を加えたこと以外は２と同一。
【０１３０】
室温にて１０分間のインキュベーション後、反応混合物全体を１％アガロースゲルに仕込んだ。１×ＴＡＥ緩衝液（トリス−酢酸塩−ＥＤＴＡ）中、９０Ｖの定電圧で２０分間ゲル電気泳動を実施した。ゲル像については、ＨＰスキャンジェット（ＳｃａｎＪｅｔ） ６３００Ｃ上でゲルを直接走査して得た。図４から明らかなように、タンパク質認識配列を含有するＤＮＡ片を加えると、タンパク質−粒子複合体が異なる速度で移動し、ＤＮＡはＡｕ粒子と一緒に移動する。図４Ａは、スキャンジェット（ＳｃａｎＪｅｔ） ６３００Ｃで記録したゲル画像である。図４Ｂは、イーグル・アイ（Ｅａｇｌｅ Ｅｙｅ） ＩＩ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）で記録したＵＶ照射下でのゲル画像である。これらの結果から、実施例２で生成した二官能性タンパク質が特に粒子をＤＮＡに向けて送れることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８タンパク質の過発現および精製を表すゲルを示す。
【図２】精製ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質によるＤＮＡ結合のゲルシフトアッセイである。
【図３】精製ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質ｖｓ．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質についてのナノ粒子結合アッセイを示す。
【図４Ａ−４Ｂ】Ａｕ−ＧＳＨナノ粒子およびＤＮＡの両方に対する精製ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８タンパク質結合についてのゲルシフトアッセイである。図４Ａは、スキャンジェット（ＳｃａｎＪｅｔ）ｓ６３００Ｃで記録されたゲル画像であり、図４ＢはＵＶ照射下でのゲル画像である。
【配列表】
【０００１】
本件出願は、２００２年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／４０６，７３６号の利益を主張するものであり、その全開示内容は引用することにより本願明細書に編入される。
【技術分野】
【０００２】
本発明はナノテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、ナノデバイス組み立て用にバイオポリマーを結合すべく機能化させたペプチドリガンドを有する機能化ナノ粒子を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
生体分子とのハイブリッドなどのナノ材料には、エレクトロニクス、光学、ゲノミクス、プロテオミクス、生体臨床医学ならびに生体分析などの用途に活用できる可能性が秘められている。生体分子をこれらの用途の多くでテンプレートとして用いる機能は、無機ナノ材料と生体分子との間の特異的結合に基づく合理的な設計をいかにうまく達成できるかに左右される。その単純さと特異性、さらには操作しやすさの理由で、テンプレートとして用いるのに魅力的な生体分子のひとつにＤＮＡがある。
【０００４】
ＤＮＡの相補鎖を用いて金属質ナノ粒子の構造体を組み立てることが文献に報告されている。オリゴヌクレオチドで標識した金ナノ粒子を用いて、非特許文献１は凝集物を調製し、かたや非特許文献２は二量体を調製した。非特許文献３も短鎖オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着した相補的オリゴヌクレオチドリガンドに対するブリッジとして使用し、凝集した金ナノ粒子の非構造的ネットワークを調製した。非特許文献４は、一本鎖ＤＮＡテンプレートを用いて金ナノ粒子を相補的な配列に結合させた。
【０００５】
特許文献１には、インターカレーションを起こす試薬、溝結合剤またはアルキル化剤を用いることで、一結合領域を核酸に付着させることのできる、二官能性リンカーを利用して金属質ナノ粒子を核酸分子に結合するための方法が説明されている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願第２００２／００７２０６９号明細書
【非特許文献１】マーキン（Ｍｉｒｋｉｎ），Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３８２巻、１９９６年８月、第６０７ページ
【非特許文献２】ユン（Ｙｕｎ），Ｃ．ら、ＪＡＣＳ（２００２）、１２４（２６）、７６４４〜７６４５
【非特許文献３】ミューシック（Ｍｕｃｉｃ），Ｒ．ら、ＪＡＣＳ、１９９８、１２０、第１２６７４〜５ページ
【非特許文献４】アリビサトス（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３８２巻、１９９６年８月、第６０９ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の機能化ナノ粒子は、ナノ粒子をデバイスに組み立てる課題に対処する上で有用なものであるが、結合が核酸ハイブリダイゼーションに依存するＤＮＡ結合リガンドに制約されるという欠点がある。結合の選択肢の幅がさらに広い機能化ナノ粒子が当業界で有用なこともあろう。
【０００８】
ナノ粒子を組み立てるためのテンプレートとしてＤＮＡを用いるひとつの方法に、ＤＮＡならびにナノ粒子に対しても高い親和性および特異性で結合できる二官能性を持つタンパク質を利用することがある。ひとつの手法として、ＤＮＡ結合ドメインとナノ粒子結合ドメインとで構成される融合タンパク質を生成することがあろう。
【０００９】
他のリガンドをナノ粒子に付着させているにもかかわらず、二官能性ペプチドをナノ粒子または他のナノ構造体と併用してナノスケールの導電性デバイスを得る用途に関する報告は全くない。当該技術分野におけるこの欠如についてのひとつの理由として、非核酸リガンドで特異的に機能化されているナノ粒子を生成するのが非常に困難だという点があろう。
【００１０】
本願出願人らは、ナノ粒子に結合可能な結合ドメインをひとつと、ＤＮＡなどの生体テンプレートと選択的に結合可能な第２の結合ドメインとを有する二官能性タンパク質またはペプチドを用いることで、従来技術の欠点を解決した。このようなナノ粒子については、自己組織化して合理的なものとすることが可能である。
【００１１】
発明の概要
本発明は、ナノデバイスへの組み立てに役立つナノ粒子を提供するものである。二官能性タンパク質を受け入れるように機能化させた単層膜でナノ粒子をコーティングする。二官能性タンパク質は、ひとつのドメインでナノ粒子の表面に結合し、２つ目のドメインで核酸に結合する。本発明のナノ粒子は、ナノデバイスへの自己組織化が容易なように設計し得るものである。
【００１２】
したがって、一態様において、本発明は、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）各々結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインで（ａ）のナノ粒子に付着されている、機能化ナノ粒子を提供するものである。
【００１３】
もうひとつの態様において、本発明は、核酸、ペプチド、生体細胞、および無機ナノチューブよりなる群から選択される捕獲部分を、本発明の機能化ナノ粒子と接触させることを含んでなる、捕獲部分を捕獲するための方法を提供するものである。好ましい捕獲部分は核酸である。
【００１４】
また、本発明は、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のナノ粒子に付着されており、そして核酸結合アミノ酸配列において核酸断片に付着されている、核酸ナノ粒子複合体を提供するものである。
【００１５】
もうひとつの態様において、本発明は、
ａ）各々が
ｉ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｉｉ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなる複数の機能化ナノ粒子であって、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して金属質ナノ粒子に付着されており、そして各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列が非反復性である、複数の機能化ナノ粒子を提供し、
ｂ）（ａ）の各二官能性ペプチドの各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列に対する親和性を有するペプチド結合ドメインを有する核酸マトリクスを提供し、
ｃ）二官能性ペプチドの核酸結合アミノ酸配列が（ｂ）の核酸マトリクスのペプチド結合ドメインと結合する条件下で（ａ）の機能化ナノ粒子を（ｂ）の核酸マトリクスと接触させ、ナノ粒子を固定化することを含んでなる、複数のナノ粒子を核酸マトリクス上に固定化するための方法を提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、本発明の方法によって作製されるナノメートル規模の電子デバイスを提供するものである。
【００１７】
もうひとつの実施形態において、本発明は、
ａ）カーボンナノチューブと、
ｂ）カーボンナノチューブに対する親和性を有する第１の結合ドメインと、結合対のメンバーを含んでなる第２の結合ドメインと、を有する二官能性タンパク質と、含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のカーボンナノチューブに付着されている、機能化カーボンナノチューブを提供するものである。
【００１８】
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明および添付の配列の説明から、本発明についてなお一層完全に理解することができる。
【００１９】
以下の配列は米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（施行規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に従ったものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いる記号および形式は米国特許施行規則第１．８２２に記載の規則に準拠している。
【００２０】
配列番号１は、亜鉛フィンガー標的配列Ｚｉｆ２６８のＤＮＡ配列である。
配列番号２は、亜鉛フィンガー標的配列ＮＲＥのＤＮＡ配列である。
配列番号３は、亜鉛フィンガー標的配列Ｓｐ１ＣのＤＮＡ配列である。
配列番号４〜２７は、カーボンナノチューブ結合タンパク質ＣＮＰ１〜ＣＮＰ２４のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、マウス亜鉛フィンガー配列Ｚｉｆ２６８のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、亜鉛フィンガー標的配列Ｚｉｆ２６８のＤＮＡ配列である。
配列番号３０は、プライマー８２１−ＺＮＦ１のＤＮＡ配列である。
配列番号３１は、プライマー８２２−ＺＮＦ２のＤＮＡ配列である。
配列番号３２は、プライマー８２３−ＺＮＦ３のＤＮＡ配列である。
配列番号３３は、プライマー８２４−ＺＮＦ４のＤＮＡ配列である。
配列番号３４は、プライマー８２５−ＺＮＦ５のＤＮＡ配列である。
配列番号３５は、プライマー８２６−ＺＮＦ６のＤＮＡ配列である。
配列番号３６は、プライマー８２７−ＺＮＦ７のＤＮＡ配列である。
配列番号３７は、プライマー８２８−ＺＮＦ８のＤＮＡ配列である。
配列番号３８は、プライマー８２９−ＺＮＦ９のＤＮＡ配列である。
配列番号３９は、プライマー８４８−ＺＮＲ１０のＤＮＡ配列である。
配列番号４０は、プライマー８４９−ＺＮＲ１１のＤＮＡ配列である。
配列番号４１は、プライマー８５０−ＺＮＲ１２のＤＮＡ配列である。
配列番号４２は、プライマー８５１−ＺＮＲ１３のＤＮＡ配列である。
配列番号４３は、プライマー８５２ＺＮＲ１４のＤＮＡ配列である。
配列番号４４は、プライマー８５３−ＺＮＲ１５のＤＮＡ配列である。
配列番号４５は、プライマー８５４−ＺＮＲ１６のＤＮＡ配列である。
配列番号４６は、プライマー８５５−ＺＮＲ１７のＤＮＡ配列である。
配列番号４７は、プライマー８５６−ＺＮＲ１８のＤＮＡ配列である。
配列番号４８は、プライマー８９７−２ＺｎＲＥのＤＮＡ配列である。
配列番号４９は、プライマー８７２−ＮＺＦのＤＮＡ配列である。
配列番号５０は、プライマー８７３−ＮＺＲのＤＮＡ配列である。
配列番号５１は、プライマー８７４−Ｎ／ＺＦのＤＮＡ配列である。
配列番号５２は、プライマー８７５−Ｎ／ＺＲのＤＮＡ配列である。
配列番号５３は、プライマー８７６−Ｎ／／ＺＦのＤＮＡ配列である。
配列番号５４は、プライマー８７７−Ｎ／／ＺＲのＤＮＡ配列である。
配列番号５５は、プライマー８７８−ＣＡＰＢ５’のＤＮＡ配列である。
配列番号５６は、プライマー８７９−ＣＡＰＢ３’のＤＮＡ配列である。
配列番号５７は、プライマー８８０−ＣＡＰＥ５’のＤＮＡ配列である。
配列番号５８は、プライマー８８１−ＣＡＰＥ３’のＤＮＡ配列である。
【００２１】
発明の詳細な記述
本発明は、表面に付加された二官能性ペプチドリガンドを含んでなる機能化ナノ粒子を提供するものである。ナノ粒子に対して遠位の部分でペプチドを機能化し、核酸、ナノチューブ、他のペプチドなどのバイオポリマーを含む多種多様な材料と結合させる。
【００２２】
機能化ナノ粒子については、バイオポリマーのマトリクスに固定化し、ナノ回路の土台として機能する導電性のネットワークを形成することができる。固定化したナノ粒子には、ナノスケールの電子デバイス、多機能触媒、化学センサの分野ならびに、バイオセンサ、生体アッセイなどの多くの生物学的用途において有用性がある。
【００２３】
本願開示内容全体をとおして多数の略号および定義を用いるが、これらは特許請求の範囲および明細書を解釈するにあたって使用できるものである。
【００２４】
「ＣＮＢＰ」はカーボンナノチューブ結合ペプチドを意味し、
「ＭＷＮＴ」は多層ナノチューブを意味し、
「ＳＷＮＴ」は単層ナノチューブを意味し、
「ＴＥＭ」は透過電子顕微鏡を意味し、
「ＣＮＴ」はカーボンナノチューブを意味し、
「ＧＳＨ」は化合物グルタチオンを示す。
【００２５】
「ＴＰ」はチオプロニンの略号である。
「ＨＴＨはヘリックスターンヘリックスの略号である。
【００２６】
本願明細書において「ナノ粒子」とは、平均粒径が１〜１００ｎｍの間にある金属質粒子または半導体粒子であると定義する。好ましくは、粒子の平均粒径が約１〜４０ｎｍの間である。本願明細書において使用する場合、「粒度」と「粒径」は同じ意味である。
【００２７】
「合金」とは、本願明細書において、２種以上の金属の均質な混合物であると定義される。
【００２８】
「単層膜」とは、単一分子の厚さである、ナノ粒子にコーティングされる材料の層を示す。
【００２９】
「混合単層膜」とは、少なくとも２種類の分子成分を有する単層膜を示す。
【００３０】
「捕獲コーティング成分」とは、本願明細書において使用する場合、何らかのリガンドまたは捕獲部分との親和性を持つ、ナノ粒子に単層膜を形成できる材料を示す。「捕獲」成分は、混合単層膜の少ない方の部分をなし、単層膜の５０％未満を占めるものであればよい。
【００３１】
「遮蔽用コーティング成分」とは、捕獲部分ではない物質の非特異的結合を防止する機能を持つ、ナノ粒子に単層膜を形成できる材料を示す。遮蔽用コーティング成分はさまざまな材料で構成されるもので構わないが、エチレングリコールが特に適している。
【００３２】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに結合された２以上のアミノ酸を示す。ペプチドには、プロセシングや翻訳後修飾などの何らかの自然なプロセスで修飾されたものだけでなく、化学修飾の手法で修飾されたものも含まれる。この修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ末端またはカルボキシル末端をはじめとして、ペプチド内のどこにでも起こり得るものである。修飾の一例として、アミド化、アシル化、アセチル化、架橋、環化、グリコシル化、水酸化、リン酸化、ラセミ化ならびに、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、脂質または脂質誘導体などのさまざまな部分の共有付着（たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ− Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版 クライトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（１９９３）およびＰｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８３）を参照のこと）があげられるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を示す。本願明細書では以下の略号を使用して具体的なアミノ酸を特定する。
【００３４】
【表１】
【００３５】
本願明細書において使用する場合、「ペプチド」という用語と「ポリペプチド」という用語は同義に用いられる。
【００３６】
本願明細書において使用する場合、「二官能性」という用語は、ペプチドについていえば、少なくとも２つのエンティティに対する親和性を持つペプチドを意味する。本発明の代表的な二官能性ペプチドとして、Ｃ末端またはＮ末端がナノ粒子に結合するように機能化され、反対側の末端が、一般にはバイオポリマーまたはカーボンナノチューブなどのナノ構造体である何らかの捕獲部分に結合するように機能化されたものがあげられる。
【００３７】
「結合ドメイン」という用語は、特定のエンティティまたは捕獲部分に対する結合親和性を持つ二官能性ペプチドの一部を示す。
【００３８】
「炭素ナノ構造体結合ペプチド」という用語は、炭素ナノ構造体に結合するように選択されたペプチドを示す。カーボンナノチューブに対する特定の親和性を持つペプチドを生成する場合、これらのペプチドを「炭素ナノ構造体結合ペプチド」またはＣＮＢＰと呼ぶ。
【００３９】
「ナノ構造体」という用語は、少なくとも１つの特徴寸法（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）が約１００ミクロン未満である、チューブ、ロッド、シリンダ、束状構造体、ウエハ、ディスク、シート、プレート、平面、錐体、細長い小片、顆粒、楕円体、楔体、ポリマー繊維、天然繊維、このような他の物体を意味する。
【００４０】
「ナノロッド」という用語は、中空であっても中実であってもよく、断面形状が円形であっても円形でなくても構わない、さまざまなナノ構造体を意味する。本発明のナノロッドには、ナノチューブ、ナノファイバ、ポリマーナノファイバ、束状構造体、多層構造体を含み得る。
【００４１】
「ナノチューブ」という用語は、ナノロッドの一部分集合であって、狭い方の寸法（直径）が約１〜２００ｎｍであり、長い方の寸法（長さ）については、短い方の寸法に対する長い方の寸法の比すなわちアスペクト比が少なくとも５である、中空の物品を示す。通常、アスペクト比は１０〜２０００の間である。
【００４２】
「ナノ平面」とは、１つの特徴寸法が５００ナノメートル未満である、単層または二層のグラファイトシートまたはグラフェンシートなどの表面を意味する。
【００４３】
「ナノファイバ」とは、寸法が１０００ナノメートル未満と小さい天然のフィラメントまたはポリマーフィラメントを意味する。
【００４４】
「炭素ベースのナノチューブ」または「カーボンナノチューブ」とは、本願明細書において、主に炭素原子で構成される中空の構造体を意味する。カーボンナノチューブを、金属などの他の元素でドープすることも可能である。
【００４５】
「機能化カーボンナノチューブ」という用語は、二官能性タンパク質またはペプチドが付着したカーボンナノチューブを示す。本発明の機能化カーボンナノチューブは、このナノチューブに付加され、核酸分子などの捕獲部分に対する親和性を持つことになる遊離結合ドメインを有する二官能性ペプチドを有するものである。
【００４６】
「結合対」という用語は、化学ポリマーまたはバイオポリマーをベースにした、互いに特異的に結合するカップルを示す。結合対の一般的な例に、抗原／抗体またはハプテン／抗ハプテン系などの免疫型の結合対がある。
【００４７】
本願明細書において使用する場合、「固体担体」という用語は、ニトロセルロースまたはナイロンなど、核酸マトリクスを固定化できる材料を示す。
【００４８】
本願明細書において使用する場合、「核酸断片」は、任意に、合成、非天然、あるいは改変したヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形で単離された核酸断片が、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントで構成されるものであっても構わない。
【００４９】
「核酸結合アミノ酸配列」という用語は、特定の核酸標的配列に対する親和性を有する連続したアミノ酸の連続配列を示す。
【００５０】
「標的配列」という用語は、特異的に認識され、核酸結合ペプチドに結合する核酸の連続配列を意味する。
【００５１】
「亜鉛−フィンガー」または「Ｚｎ−フィンガー」という用語は、特定の核酸配列に結合する特定のアミノ酸配列を示す。Ｚｎ−フィンガー配列は従来技術において周知であり、（ｉ）本願明細書においてＺｉｆ２６８とも呼ぶＧＣＧＴＧＧＧＣＧ［配列番号１］（キム（Ｋｉｍ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８年３月１７日；９５（６）：２８１２〜７）、（ｉｉ）本願明細書においてＮＲＥとも呼ぶＡＡＧＧＧＴＴＣＡ［配列番号２］（キム（Ｋｉｍ）ら、上掲）、本願明細書においてＳｐ１Ｃとも呼ぶＧＧＧＧＣＧＧＧＧ［配列番号３］（ウォルフェ（Ｗｏｌｆｅ）ら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２０００；２９：１８３〜２１２）を含むがこれに限定されるものではないＤＮＡの標的連続配列の特異性を有する。
【００５２】
「捕獲部分」とは、二官能性ペプチドの結合ドメインによって結合できる物質を示す。捕獲部分はどのような物質であってもよいが、一般にはペプチドやタンパク質、核酸断片などのバイオポリマーであるが、多種多様なナノ構造体も含み得る。
【００５３】
「ファージ」または「バクテリオファージ」とは、細菌に感染するウイルスを示す。本発明に関する限りは改変された形態を用いてもよい。好ましいバクテリオファージは、Ｍ１３およびλと呼ばれる２つの「野生型」ファージに由来するものである。λファージは、１０〜２０ｋｂ前後の範囲のＤＮＡのセグメントをクローニングにするのに用いられる。これらのファージは溶菌性ファージすなわち、その宿主細胞を溶解してさらに多くのファージを放出することによって複製する。Ｍ１３系は細菌内部で成長できるため、自己が感染した細胞を破壊することはなく、新たなファージを連続して作り続けさせる。これは一本鎖ＤＮＡファージである。
【００５４】
「ファージディスプレイ」という用語は、機能的外来ペプチドまたは小タンパク質をバクテリオファージまたはファージミド粒子の表面に提示すること示す。遺伝子組み換えファージを用いて、ペプチドをそれぞれの固有表面タンパク質のセグメントとして提示することが可能であろう。遺伝子配列の異なるファージの集団によってペプチドライブラリを生成することもできる。
【００５５】
「遺伝子」とは、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する制御配列をはじめとする特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「天然遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ自然界に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含んでなるあらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含んでなるものであってもよいし、同一起源由来であるが自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含んでなるものであってもよい。
【００５６】
「コード領域」の「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「好適な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造があげられる。
【００５７】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含んでなるものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件または生理学的条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほぼ常に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。
【００５８】
本願明細書で使用する「発現」という用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を示す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示すこともある。
【００５９】
「シグナルペプチド」という用語は、分泌された成熟タンパク質に先行するアミノ末端ポリペプチドを示す。シグナルペプチドは成熟タンパク質から切断され、よって成熟タンパク質中には存在しない。シグナルペプチドには、分泌されたタンパク質を細胞膜から押し出し、所定の場所まで移動させる機能がある。シグナルペプチドはシグナルタンパク質とも呼ばれる。
【００６０】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」の各用語は、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形で、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持っていることの多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状で一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する特定のベクターを示す。
【００６１】
「ヘテロ接合」という用語は、少なくとも２種類の材料が定義された空間内で順番に並置されることを示す。
【００６２】
本願明細書で利用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニングの手法は従来技術において周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ（１９８９）（以下、「マニアティス」とする）およびシルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．およびエンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・コールド出版局スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｌｄ Ｐｒｅｓｓ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ（１９８４）ならびに、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７）によって説明されている。
【００６３】
被覆ナノ粒子
本発明は、二官能性ペプチド用の付着点として機能する単層膜でコーティングしたナノ粒子を提供するものである。好適なナノ粒子は平均粒径が１から１００ｎｍの間にある金属質粒子または半導体粒子である。好ましくは、粒子の平均直径は約１から４０ｎｍの間である。金属質ナノ粒子としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルトならびに、これらの金属で構成される合金の粒子があげられるが、これに限定されるものではない。「半導体ナノ粒子」としては、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、シリコン、酸化スズ、酸化鉄、リン化インジウムの粒子があげられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
本発明のナノ粒子は単層膜でコーティングされている。単層膜は、二官能性ペプチドに対する付着部（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）として機能すると同時に、ナノ粒子に水溶性を持たせる役割も果たす。コーティングによって水溶性となったナノ粒子を本願明細書では「安定化されている」と呼ぶ。安定化された水溶性の金属ナノ粒子および半導体ナノ粒子を作製する方法は従来技術において周知である。これらの粒子は、有機コーティングの性質に応じて荷電していることもあれば中性のこともある。たとえば、本願明細書に援用する、テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら（Ｌａｎｇｍｕｉｒ １５：６６〜７６（１９９９）には、チオプロニンまたはコエンザイムＡ単層膜で保護された、安定化された荷電水溶性金ナノ粒子を作製するための方法が記載されている。チオプロニン保護金ナノ粒子を作製するにあたって、四塩化金酸とＮ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン（チオプロニン）とをメタノールと酢酸との混合物に同時溶解させた。素早く攪拌しながら水素化ホウ素ナトリウムを添加した。これらの粒子の平均粒度については、反応時のチオプロニンと四塩化金酸とのモル比を変えることで制御できる。コエンザイムＡ保護金ナノ粒子についても、反応におけるチオプロニンをコエンザイムＡに変えて同様にして作製した。
【００６５】
金属金、銀、白金、パラジウム、コバルトおよびニッケルの安定化された水溶性ナノ粒子を作製する同様の方法が、ヒース（Ｈｅａｔｈ）らによって本願明細書に援用する米国特許第６，１０３，８６８号に説明されている。この方法では、１以上の金属塩の溶液または分散液を、チオール、ホスフィン、ジスルフィド、アミン、オキシドまたはアミドなどの官能基を有する有機表面パッシバントの溶液と混合した。続いて還元剤を添加し、金属塩を還元して遊離金属を得た。
【００６６】
被覆ナノ粒子を作製するための他の好適な方法も周知である（たとえば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ １６９：１０７〜１１６（２０００）、ハーゲマイヤー（Ｈａｇｅｍｅｙｅｒ）らの米国特許第６，０７４，９７９号明細書、ウェルフィング（Ｗｕｅｌｆｉｎｇ）ら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１２６９６〜１２６９７（１９９８）、チャン（Ｃｈａｎ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２０１６〜２０１８（１９９８）、ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：８１２２〜８１２３（１９９９）、ナパー（Ｎａｐｐｅｒ）（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｓｃｉ ５８：３９０〜４０７（１９７７）を参照のこと）。
【００６７】
安定化された水溶性半導体ナノ粒子および金属ナノ粒子のいずれに関しても、たとえば、ポリ（エチレングリコール）およびグルタチオンまたはポリ（エチレングリコール）ならびにチオプロニンなどのさまざまな安定化用コーティングまたは単層の混合物を用いることが可能である。
【００６８】
よって、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）各々が結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなる機能化ナノ粒子であって、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインで（ａ）のナノ粒子に付着されている機能化ナノ粒子を提供することは、本発明の範囲内である。
【００６９】
あるいは、単層膜の一成分が二官能性ペプチドに対する付着点となり、混合単層膜の他の成分が望ましくないタンパク質または捕獲部分の非特異的結合に対するシールドとして機能する混合単層膜でコーティングしたナノ粒子を提供すると有用な場合もある。この実施形態では、一般に、捕獲成分と遮蔽成分とを有する混合単層膜が同じ単層膜の一部である。一般に、捕獲成分は混合単層膜の約５０％未満をなし、約２０％〜４０％が好ましい。逆に、遮蔽成分は単層膜の主成分を形成し、単層膜の少なくとも約５０％をなし、６０％から約９０％が好ましい。
【００７０】
このような混合単層膜の捕獲成分は、本発明の二官能性ペプチドと結合できるものでなければならない。捕獲成分は、捕獲部分への結合を可能にするさまざまな化学基で機能化し得るものである。このような化学反応基の非限定的な例としては、−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＨＯ−基、−ＯＨ基、−Ｘ（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）基、スクシンイミド基、およびエポキシ基よりなる群から選択されるものがあげられる。好適な捕獲成分の好ましい例にチオプロニンおよびＧＳＨがある。チオプロニン（ＴＰと略記）はＮ−２−メルカプトプロピオニル−グリシンであり、ペプチドに合った都合のよい結合部位として機能する露出したカルボキシ基が存在することから、特に捕獲成分として好適である。
【００７１】
混合単層膜の遮蔽成分は、被覆ナノ粒子に対する非捕獲部分材料の結合をブロックする機能を果たし、特定の二官能性タンパク質または捕獲部分を結合、単離または固定化する目的でナノ粒子を利用できるようにするものである。好適な遮蔽成分としては、短鎖エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールメタクリレート、糖類、クラウンエーテル、アクリルアミドがあげられるが、これに限定されるものではなく、短鎖エチレングリコールオリゴマーが好ましい。
【００７２】
二官能性ペプチド
本発明は、安定化された被覆ナノ粒子に付着された二官能性ペプチドを提供するものである。二官能性ペプチドは一般に、少なくとも２つの結合ドメインを持つことになる。一方の結合ドメインがナノ粒子をコーティングしている単層膜に対する親和性を持ち、他方の結合ドメインが何らかの捕獲部分に対する親和性を持つ。
【００７３】
本発明の二官能性ペプチドは約５から約１００アミノ酸長になり、約１０から約３０アミノ酸であると好ましく、一般には線状の二次構造に達するものである。
【００７４】
二官能性ペプチドを、ナノ粒子をコーティングする単層膜に対する親和性を有する結合ドメインを少なくともひとつ持つように操作する。一般に、この結合ドメインは結合対のメンバーになる。化学ベースおよびタンパク質ベースの結合対は従来技術において周知であり、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、６ＸヒスチジンＴａｇ／Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン／ビオチン、Ｓ−タンパク質／Ｓ−ペプチド、クチナーゼ／ホスホネートインヒビターなどの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない。さらに、結合対には、抗原／抗体またはハプテン／抗ハプテン系などの免疫型のあらゆるクラスの結合対ならびに、ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；葉酸／葉酸結合タンパク質などの非免疫型のあらゆるクラスの結合対；ペプチド核酸配列を含む相補的核酸セグメント；プロテインＡまたはＧ／免疫グロブリン；マレイミドおよびハロアセチル誘導体をはじめとするスルフヒドリル反応基などの共有結合を形成する結合対、イソトリオシアネート、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニルなどのアミン反応基も含まれる。
【００７５】
もうひとつの態様では、捕獲部分に対する親和性を有する第２の結合ドメインを含むように二官能性ペプチドを設計する。本発明の代表的な捕獲部分としては、たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸断片、コラーゲンなどのバイオポリマーならびに、さまざまなナノ構造（本願明細書にて定義するようなナノロッド、ナノチューブ、ナノ平面、ナノ繊維）などのナノデバイスの組み立てと合成に役立つナノ材料があげられる。本発明において好ましいのは核酸およびカーボンナノチューブ捕獲部分である。
【００７６】
核酸結合ドメインまたはモチーフは従来技術において周知であり、多くのものが本発明で使用するのに適している。たとえば、よく知られたひとつのファミリに、「ヘリックスターンヘリックス」モチーフで区別されるものがある。これらの配列には、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＲＰ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿４１７８１６）（マッケイ（ＭｃＫａｙ），Ｄ．Ｂ．およびシュテイツ（Ｓｔｅｉｔｚ），Ｔ．Ａ． １９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、７４４〜７４９）、λｃｒｏ（ジーンバンク受託番号：Ｐ０３０４０）（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９０、７５４〜７５８）、λｃｌ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０４０６２８）（パボ（Ｐａｂｏ），Ｃ．Ｏ．およびルイス（Ｌｅｗｉｓ），Ｍ．、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９８、４４３〜４４７）を含むがこれに限定されるものではない。これらの例は３つとも、ポリペプチドの例外的にかたいターンで分離されたαヘリックスの表面露出ペアで構成される、比較的小さなポリペプチドの二量体（＝長さ１００ａａ）である。各二量体におけるこれらのヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）モチーフの空間分離は基本的に同一であって３４Åに等しいが、これはデュプレックスの一方のフェイスに沿ったＢ型ＤＮＡの連続した主溝（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）の相対的な分離でもある。タンパク質配列データベースでの検索から、原核生物細胞と真核生物細胞の両方からのＨＴＨ含有ＤＮＡ結合タンパク質が数百ほど確認されている（ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．Ｃ．、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５３、７１５〜７１９；アガワール（Ａｇｇａｒｗａａｌ），Ａ．Ｋ．およびハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．Ｃ．、１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９、９３３〜９６９）。
【００７７】
他のタイプのＤＮＡ結合ドメインも本発明に使用するのに適している。非「ＨＴＨ」タイプの１５０を超えるタンパク質について、ＤＮＡ標的を持つ複合体の分子レベルでの研究がなされ、この特定のタイプの分子間認識イベントに関する大きなデータベースが得られている（リリー（Ｌｉｌｌｅｙ），Ｄ．Ｍ．Ｊ．（編）、１９９５、ＤＮＡ−タンパク質構造相互作用。ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ＯＵＰ、オックスフォード；ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．Ｃ．、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５３、７１５〜７１９）。これらの他のモチーフの多くは、ＨＴＨのヘリックス間の領域に対する制約が緩和される、真核生物転写因子で普通にみられるヘリックス−ループ−ヘリックス構造体の場合や、亜鉛フィンガーの場合と同じような認識αヘリックスも含んでいる（ルイジ（Ｌｕｉｓｉ），Ｂ．Ｆ．、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５６、３７９〜３８０）。逆平行βリボンにおける一対のポリペプチド鎖に基づく別個の認識モチーフもファージＰ２２リプレッサーＡｒｃ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４２）およびＭｎｔ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４１）、Ｅ． ｃｏｌｉメチオニンリプレッサータンパク質、ＭｅｔＪ（ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿４１８３７３）および細菌ＤＮＡパッケージングタンパク質ＨＵ（ラウマン（Ｒａｕｍａｎｎ）ら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、４、３６〜４３）で同定されている。真核生物ＴＡＴＡ結合タンパク質でもβ−シート認識モチーフを利用する（パティコグロウ（Ｐａｔｉｋｏｇｌｏｕ），Ｇ．およびバーレイ（Ｂｕｒｌｅｙ），Ｓ．Ｋ．、１９９７、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．、２６、２８９〜３２５）。
【００７８】
さらに、ＲＮＡ結合ドメインまたはモチーフを用いてもよい。ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴＲＳ）複合体（キューザック（Ｃｕｓａｃｋ），Ｓ．、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２、８２４〜８３１）、ＭＳ２バクテリオファージ翻訳抑制複合体（バレガード（Ｖａｌｅｇａｒｄ）ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７１、６２３〜６２６；バレガード（Ｖａｌｅｇａｒｄ）ら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７１、７２４〜７３８）、スプライセオソーム由来のＵ１Ａ複合体（オーブリッジ（Ｏｕｂｒｉｄｇｅ）ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７２、４３２〜４３８；ナガイ（Ｎａｇａｉ），Ｋ．、１９９６、Ｃｕｒｒ Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、６、５３〜６１）の３種類に対する結晶構造体を利用できる。タンパク質の一般的な標的部位には、ステム−ループ、ステム−バブル、シュードノット、このような小さな部位で構成される複合体部位がある。このような部位を認識するタンパク質モチーフとしては、ウイルスのコートタンパク質サブユニット（ロスマン（Ｒｏｓｓｍａｎｎ），Ｍ．Ｇ．およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ），Ｊ．Ｅ．、１９８９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８、５３３〜５７３；ベールガード（Ｖａｌｅｇａｒｄ）ら １９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４５、３６〜４１）；９０〜１００アミノ酸長の保存されたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）（セント・ジョンストン（Ｓｔ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）ら、１９９２、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８９、１０９７９〜１０９８３；バイクロフト（Ｂｙｃｒｏｆｔ）ら、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，３５６３〜３５７１；カラット（Ｋｈａｒｒａｔ）ら、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．、１４、３５７２〜３５８４）；ＲＧＧ ｂｏｘを含有するタンパク質すなわち、いくつかのアルギニン−グリシン−グリシン配列リピートに芳香族であることの多い他の残基が散在した２０〜２５アミノ酸の領域；オクタペプチドを含有する５０アミノ酸長以内のｋ相同性（ＫＨ）ドメインすなわちＩＧＸ２ＧＸＪ（Ｘはいずれかのアミノ酸である）；いわゆるアルギニンフォーク（ナガイ（Ｎａｇａｉ），Ｋ．、１９９６、Ｃｕｒｒ Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、６、５３〜６１）があげられる。最も一般的なＲＮＡ結合ドメインはＲＮＰドメインであり、これは高等生物の少なくとも６００タンパク質で生じるものである（マスコ（Ｍｕｓｃｏ）ら、１９９６、Ｃｅｌｌ、８５、２３７〜２４５；ナガイ（Ｎａｇａｉ）ら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８、５１５〜５２０；エイビス（Ａｖｉｓ）ら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５７，３９８〜４１１）。
【００７９】
本発明において好ましいのは、標的配列に対する高い結合親和性および特異性を呈し、容易に入手可能で文献に説明のあるＺｎ−フィンガー結合タンパク質である。本発明で使用するのに好ましいＺｎフィンガータンパク質は、以下の標的配列：ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ［配列番号１］；ＡＡＧＧＧＴＴＣＡ［配列番号２］およびＧＧＧＧＣＧＧＧＧ［配列番号３］と結合するものである。
【００８０】
あるいは、本発明の二官能性タンパク質については、ナノロッド、ナノファイバまたはナノチューブなどのさまざまなナノ構造体と結合するように設計できる。たとえばカーボンナノチューブに結合するペプチドを生成することが可能である。ｔｈｅのナノチューブ結合ペプチドを無作為に生成した後、炭素ナノ構造体の集団からＣＮＴへの結合親和性を基準に選択することもできる。ペプチドのライブラリのランダムライブラリの生成は周知であり、バクテリアディスプレイ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）（ケンプ（Ｋｅｍｐ），Ｄ．Ｊ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（７）：４５２０〜４５２４、１９８１、ヘルフマン（Ｈｅｌｆｍａｎ），Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０（１）：３１〜３５、１９８３）酵母ディスプレイ（チエン（Ｃｈｉｅｎ） ＣＴら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９１年１１月１日；８８（２１）：９５７８〜８２）コンビナトリアル固相ペプチド合成（米国特許第５４４９７５４号明細書、米国特許第５４８０９７１号明細書、米国特許第５５８５２７５号明細書、米国特許第５６３９６０３号明細書）、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；米国特許第５，５７１，６９８号明細書；米国特許第５，８３７，５００号明細書）をはじめとする多種多様な手法で達成できるものである。このような生体ペプチドライブラリを生成するための手法は、デイニー（Ｄａｎｉ），Ｍ．、Ｊ．ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＆ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓ．、２１（４）、４４７〜４６８（２００１）に説明されている。
【００８１】
ペプチドを無作為に生成するための好ましい方法のひとつに、ファージディスプレイによるものがある。ファージディスプレイは、ペプチドまたはタンパク質をバクテリオファージのコートタンパク質に遺伝子的に融合させ、ビリオン中の融合残渣をＤＮＡでコードしたまま融合タンパク質をファージバイロン（ｖｉｒｏｎ）の外に提示する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択手法である。提示されたタンパク質とこれをコードするＤＮＡとが上記のように物理的に結び付いていることから、各々が対応するＤＮＡ配列と結び付いた大量のタンパク質バリアントを「バイオパニング」と呼ばれる単純なｉｎ ｖｉｔｒｏ選択手順でスクリーニングすることができる。この最も単純な形態で、バイオパニングは、ファージ提示後のバリアントのプールを、プレートまたはビーズに固定化しておいた該当する標的とともにインキュベートし、未結合のファージを洗い流し、ファージと標的との間の結合相互作用を破壊して特異的に結合したファージを溶出することで実施される。次に、溶出されたファージをｉｎ ｖｉｖｏにて増幅し、このプロセスを繰り返して、もっともしっかりとした結合配列優先でファージプールを段階的に富化する。選択／増幅を３回またはそれ以上繰り返した後、個々のクローンをＤＮＡ配列決定でキャラクタライズする。
【００８２】
上記の方法を利用して、本願出願人らは、以下に列挙するカーボンナノチューブと選択的に結合する多数のペプチドを生成した。
【００８３】
【表２】
【００８４】
カーボンナノチューブを結合する目的で、これらのペプチドまたは同じようにして生成した他のペプチドを二官能性ペプチドに取り入れてもよいと思われる。
【００８５】
二官能性ペプチドの設計を定めたら、このペプチドを従来技術において周知の多種多様な手段で合成・生成することができる。たとえば、アミノ酸を樹脂に順次加えた後、樹脂から切り離して精製する固相ペプチド合成（たとえば、ヨクム（Ｙｏｋｕｍ）ら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２０００）、７９〜１０２。編者（ら）：ケート（Ｋａｔｅｓ），スティーブン（Ｓｔｅｖｅｎ） Ａ．；アルベリシオ（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ），フェルナンド（Ｆｅｒｎａｎｄｏ）。出版社：マーセル・デッカー・インコーポレイテッド（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク；アルベリシオ（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ），フェルナンド（Ｆｅｒｎａｎｄｏ）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２０００）、５５（２）、１２３〜１３９；フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ），グレッグ（Ｇｒｅｇｇ） Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９８）、５２７〜５４５。編者（ら）：ラプレイ（Ｒａｐｌｅｙ），ラルフ（Ｒａｌｐｈ）；ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ），ジョン（Ｊｏｈｎ） Ｍ．出版社：ヒューマナ（Ｈｕｍａｎａ）、ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）を参照のこと）によってペプチドを合成してもよいし、あるいは、組換え手段によってペプチドを生成してもよい。選択したペプチドをコードするＤＮＡコード領域を設計し、化学的に合成することができる。その後は、これらの断片をさまざまな微生物発現宿主の形質転換に適した発現ベクターやクローニングベクターにクローニングすることができる。
【００８６】
外来タンパク質の発現を高いレベルで指示する、プロモーターなどの制御配列を含む微生物の発現系および発現ベクターが当業者間で周知である。このうちどれを使って本配列の遺伝子産物生成用のキメラ遺伝子を構築しても構わない。
【００８７】
好適な宿主細胞の形質転換に役立つベクターまたはカセットは従来技術において周知である。一般に、このベクターまたはカセットには、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、自己複製または染色体組み込みを可能にする配列が含まれる。好適なベクターは、転写開始制御部を含む遺伝子の５’の領域と転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’の領域とを含んでなる。これは両方の制御領域が形質転換宿主細胞と相同遺伝子に由来するものである場合に最も好ましいが、このような制御領域が生産宿主として選択した特定の種に固有の遺伝子に由来するものでなくてもよいことは理解できよう。
【００８８】
所望の宿主細胞での上記遺伝子の発現をドライブするのに役立つ開始制御領域またはプロモーターには多くのものがあり、当業者には馴染みのあるものである。これらの遺伝子をドライブできるほとんどすべてのプロモーターが本発明に適しており、その一例として、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（酵母菌属での発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア属での発現に有用）、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での発現に有用）ならびに、バシラス属での発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよびさまざまなファージプロモーターがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００８９】
終結制御領域も好ましい宿主に固有のさまざまな遺伝子から誘導することができる。任意に、終結部位が必要ないこともあるが、終結部位を含む形が最も好ましい。
【００９０】
場合によっては、本件遺伝子産物を形質転換宿主の分泌生成物として生成する方が望ましいことがある。所望のタンパク質を成長培地に分泌することには、精製手順を単純化してコストを抑えられるという利点がある。細胞膜での発現可能なタンパク質の活発な移動を容易にする上で分泌シグナル配列が役立つ場合が多いことは従来技術において周知である。宿主産生宿主で機能的な分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を取り入れることで、分泌できる形質転換宿主を作出することができる。適切なシグナル配列を選択するための方法は従来技術において周知である（たとえば、ＥＰ ５４６０４９号；国際公開第９３２４６３１号を参照のこと）。分泌シグナルＤＮＡまたはファシリテーターを、発現制御ＤＮＡと本件遺伝子または遺伝子断片との間で、後者と同一の読み枠内に配置することができる。
【００９１】
二官能性ペプチドの被覆ナノ粒子への連結
二官能性ペプチドを被覆ナノ粒子に付加するには、多種多様な方法を用いることが可能である。これについては、連結の化学的な性質から共有結合と非共有結合の２つのカテゴリに分けることができる。共有結合による連結方法では、被覆ナノ粒子上の官能基および二官能性ペプチド上の官能基と反応させるのに小さなクロスリンカー分子を利用する。この方法の基本原理ならびに、これに合った多くのクロスリンカー分子については文献に十分な説明がある（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、グレッグ（Ｇｒｅｇ）Ｔ．ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）。アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サン・ディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、１９９６）。この方法の一例では、分子ＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩］を利用して被覆ナノ粒子（Ａｕ−Ｔｐなど）のカルボキシル基と二官能性ペプチドのアミン基とを架橋させる。
【００９２】
【化１】
【００９３】
非共有結合による方法では、被覆ナノ粒子（Ａｕ−ＧＳＨなど）にあらかじめ付加されたリガンドとこれに対応する二官能性ペプチドのリガンド−結合ドメイン（Ａｕ−ＧＳＨの場合はＧＳＴ）との共有結合の相互作用を利用することはない。上記にて説明したとおり、この目的で多種多様なリガンド／リガンド結合ドメイン対を利用することができる。
【００９４】
【化２】
【００９５】
固定化ナノ粒子
二官能性タンパク質またはペプチドが付着したナノ粒子については、ペプチドの結合ドメインのうちの１つをとおして多種多様な捕獲部分に固定化できる。一般に、捕獲部分が特定の構造と一致し、それ自体を固体担体に固定できる。本発明の代表的な捕獲部分としては、たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸断片、コラーゲンなどのバイオポリマーならびに、さまざまなナノ構造体（本願明細書にて定義するようなナノロッド、ナノチューブ、ナノ平面、ナノファイバ）などのナノデバイスの組み立てと合成に役立つナノ材料があげられる。
【００９６】
本発明の文脈におけるＣＮＴ結合ペプチドの利点のひとつに、一般的なナノ粒子に代えてＣＮＴを利用できる点があげられる。したがって、たとえば、核酸結合ドメインで機能化したＣＮＴ結合ペプチドがＣＮＴと核酸分子または核酸マトリクスとを連結させる上で役立つことがある。このような設計にすることで、複合体ナノ粒子を構成しなければならない必要性が簡素化され、核酸マトリクスによって構築されたパターンに従ってＣＮＴのマトリクスを構成できるようになる。
【００９７】
捕獲部分として、あるいはナノ粒子の代わりに役立つ炭素ナノ構造体には、主に炭素で構成され、少なくとも１つの特徴寸法が約１００ｎｍ未満である、チューブ、ロッド、シリンダ、束状構造体、ウエハ、ディスク、シート、プレート、平面、錐体、細長い小片、顆粒、楕円体、楔体、ポリマー繊維、天然繊維、このような他の物体の形をとる構造体がある。本発明の好ましい炭素ナノ構造体はナノチューブである。
【００９８】
特に好適なナノチューブは通常、直径が約１〜２００ｎｍであり、狭い方の寸法に対する長さ寸法の比すなわちアスペクト比が少なくとも５である。通常、アスペクト比は１０から２０００の間である。カーボンナノチューブは主に炭素原子で構成されるが、金属などの他の元素でドープされたものであっても構わない。炭素ベースのナノチューブについては、多層ナノチューブ（ＭＷＮＴ）であっても単層ナノチューブ（ＳＷＮＴ）であっても構わない。ＭＷＮＴは、たとえば、各々直径の異なる同心のナノチューブをいくつか含むものである。すなわち、直径の最も小さいチューブがこれより直径の大きなチューブの中に入り、これがさらに直径の大きな別のナノチューブの中に入っている。一方、ＳＷＮＴはナノチューブ１本で構成される。
【００９９】
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）は多種多様な方法で製造できるものであり、さらに市販もされている。ＣＮＴ合成方法には、グラファイトのレーザ蒸発法（Ａ．セス（Ｔｈｅｓｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、４８３（１９９６）、アーク放電（Ｃ．ジャーネット（Ｊｏｕｒｎｅｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８、７５６（１９９７）、ＨｉＰＣｏ（高圧一酸化炭素）プロセス（Ｐ．ニコラエフ（Ｎｉｋｏｌａｅｖ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．３１３、９１〜９７（１９９９）が含まれる。化学蒸着法（ＣＶＤ）を利用してカーボンナノチューブを生成することも可能である（Ｊ．コング（Ｋｏｎｇ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２９２、５６７〜５７４（１９９８）；Ｊ．コング（Ｋｏｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９５、８７８〜８７９（１９９８）；Ａ．キャッセル（Ｃａｓｓｅｌｌ）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０３、６４８４〜６４９２（１９９９）；Ｈ．ダイ（Ｄａｉ）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０３、１１２４６〜１１２５５（１９９９）。
【０１００】
あるいは、捕獲部分が核酸マトリクスまたはペプチドなどのバイオポリマーあるいは特定の構造的コンホメーションを持つペプチドの集団であっても構わない。本発明の二官能性ペプチドを機能化させて核酸結合ドメインを含んでなるようにしてある場合、捕獲部分が核酸であると好ましい。
【０１０１】
二官能性ペプチドによるナノ粒子の捕獲と以後の固定化用に、捕獲部分を固体担体に固定化してもよい。この目的のために、好適な固体担体としては、シリコンウェハ、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリグリシジルメタクリレート、置換ポリスチレン（アミン化またはカルボキシル化ポリスチレン；ポリアクリルアミド；ポリアミド；ポリ塩化ビニルなど）などの合成ポリマー担体；ガラス、アガロース、ニトロセルロース、ナイロンがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０１０２】
本発明の重要な利点のひとつに、機能化ナノ粒子の設計によってナノ構造体の作成に取り入れられるプログラマビリティの態様がある。特定の核酸結合ドメインを有する二官能性ペプチドを各々含んでなる複数の機能化ナノ粒子を構成することもできるであろうと思われる。各核酸結合領域は特定の核酸の連続配列に対する特定の親和性を持つことになる。よって、核酸マトリクスの特定の領域に結合するように機能化ナノ粒子を設計することが可能であり、その堆積量を正確に制御することが可能である。金属または半導体を正確かつ制御された形で堆積させる機能があることで、電子ヘテロ接合、相互接続部、ナノ回路などのナノメートル規模の電子デバイスを構成するにあたって不可欠な要件が満足される。
【０１０３】
よって、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のナノ粒子に付着されており、そして核酸結合アミノ酸配列で核酸断片に付着されている、核酸ナノ粒子複合体を提供することは、本発明の範囲内である。
【０１０４】
さらに、
ａ）各々が
ｉ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｉｉ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなる複数の機能化ナノ粒子であって、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して金属質ナノ粒子に付着されており、そして各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列が非反復性である、複数の機能化ナノ粒子を提供し、
ｂ）（ａ）の各二官能性ペプチドの各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列に対する親和性を有するペプチド結合ドメインを有する核酸マトリクスを提供し、
ｃ）二官能性ペプチドの核酸結合アミノ酸配列が（ｂ）の核酸マトリクスのペプチド結合ドメインと結合する条件下で（ａ）の機能化ナノ粒子を（ｂ）の核酸マトリクスと接触させ、ナノ粒子を固定化することを含んでなる、複数のナノ粒子を核酸マトリクス上に固定化するための方法を提供することは、本発明の範囲内である。
【０１０５】
ナノメートル規模の電子デバイス
導電性ヘテロ接合および相互接続部をナノスケールで構成するにあたって、捕獲部分のマトリクスに固定化した本発明の金属質ナノ粒子または半導体ナノ粒子を用いることができる。金属質の場合、固定化したナノ粒子は、ナノメートル規模の電子デバイス同士を連結させ、高密度電子回路の製造を可能にし得るものと思われる。隣接するナノ粒子間の距離を両者間の電位差によって制御可能な形で金属質ナノ粒子を並べてアレイ化した後、このマトリクスをリーバー（Ｌｅｉｂｅｒ）ならびにその共同研究者ら（ルーキーズ（Ｒｕｅｃｋｅｓ）Ｔ．ら（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９、９４〜９７）がカーボンナノチューブで提案しているものに近い不揮発性メモリデバイスとして利用できるものと思われる。
【０１０６】
半導体性ナノ粒子は、スイッチ、増幅器あるいはロジックゲートとしてそのまま利用可能な３端子ゲートデバイスでの用途が見込まれるものである。金属粒子を有機半導体と連結することで、たとえば、負性微分抵抗を呈する２端子スイッチングデバイス（ファン（Ｆａｎ）ら（２００２）ＪＡＣＳ １２４、５５５０〜５５６０など）を開発することが可能になる。他の考え得る用途として、電界放出ディスプレイデバイスの放出点源ならびに、導電性コーティング中の導電性成分としての用途があげられる。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
【０１０８】
基本方法
実施例で用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は従来技術において周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびＴ．Ｊ．シルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）（１９８４）ならびにオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版（１９８７）に記載されている。
【０１０９】
細菌培養の管理と成長に適した材料および方法が従来技術において周知である。以下の実施例において使用するのに適した手法が、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ（Ｒａｌｐｈ） Ｎ．・コスティロー（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ） Ｗ．ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ） Ａ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、ノエル（Ｎｏｅｌ） Ｒ．クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグズ・フィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ），ＤＣ．（１９９４）またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ） Ｄ．ブラック（Ｂｒｏｃｋ）著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウアー・アソシエーツ・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）（１９８９）に記載されている。特に明記しない限り、細菌細胞の成長および管理に用いる試薬、制限酵素、材料はいずれも、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ＤＩＦＣＯ ラボラトリーズ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ギブコ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から入手したものである。
【０１１０】
略号の意味は以下のとおりである。「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｄ」は日（単数または複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
【０１１１】
実施例１
二官能性タンパク質のクローニング
公開されているＺｉｆ２６８アミノ酸配列（パヴレティッシュ（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ） ＮＰ、パボ（Ｐａｂｏ） ＣＯ；Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１年５月１０日；２５２（５００７）：８０９〜１７）を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉで最も頻繁に見られるコドンを用いてＤＮＡ配列を生成した。この配列を用いて、遺伝子全体をカバーすべく１８のオリゴ（各３１ヌクレオチド長）からなる組を設計し、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から５’ホスホリル化形態として購入した。標準的な手順（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）に従ってアニーリングとライゲーション反応とを実施した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有する２つのプライマー（＃８２１、＃８９７）を用いて生成物をＰＣＲ増幅した。制限消化後、ＰＣＲ産物をｐＥＴ４１Ａ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）にクローニングしてＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質コード配列を含有するｐＥＤ１０５を得た。クローニングベクターｐＥＴ４１ａには、ＧＳＴ配列ならびに複数のクローニング部位が含まれている。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の「クイック・チェンジ（Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ）」キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を用いてｐＥＤ１０５のＺｉｆ ２６８の末端で停止コドンＴＡＡを導入し、ｐＥＤ１０７を得た。直接配列決定によってすべてのクローンの完全性を確認した。これらの配列を以下に示す。
【０１１２】
Ｚｉｆ２６８タンパク質のアミノ酸配列（９０アミノ酸、１０．８ｋＤａ）：
ＭＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＥＲＫＲ
ＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ［配列番号２８］
【０１１３】
Ｚｉｆ２６８のヌクレオチド配列（Ｅ．ｃｏｌｉコドンを用いて保存）：
ＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＣＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＧＴＣＡＣＡＴＣＣＧ
ＴＡＴＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＧＴＡＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡ
ＴＣＣＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＡＡＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧＴ
ＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣ［配列番号２９］
【０１１４】
Ｚｉｆ２６８クローニングに用いるプライマー：
８２１−ＺＮＦ１：ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＣＣ［配列番号３０］
８２２−ＺＮＦ２：ＣＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＣＧ［配列番号３１］
８２３−ＺＮＦ３：ＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＧＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＡＴＣ［配列番号３２］
８２４−ＺＮＦ４：ＣＡＣＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＧＴＡ［配列番号３３］
８２５−ＺＮＦ５：ＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡ［配列番号３４］
８２６−ＺＮＦ６：ＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴ［配列番号３５］
８２７−ＺＮＦ７：ＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＧＴＣ［配列番号３６］
８２８−ＺＮＦ８：ＧＴＡＡＡＴＴＣＧＣＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧ［配列番号３７］
８２９−ＺＮＦ９：ＴＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣ［配列番号３８］
８４８−ＺＮＲ１０：ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＧＣＡＧＧＴＧＧＡＴＴ［配列番号３９］
８４９−ＺＮＲ１１：ＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＡＣＧＡＧ［配列番号４０］
８５０−ＺＮＲ１２：ＣＧＡＡＴＴＴＡＣＧＡＣＣＧＣＡＧＡＴＧＴＣＧＣＡＡＧＣＧＡＡ［配列番号４１］
８５１−ＺＮＲ１３：ＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＧＧＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＧＡＴＧＴＧＧ［配列番号４２］
８５２−ＺＮＲ１４：ＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＴＴＡＣ［配列番号４３］
８５３−ＺＮＲ１５：ＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＣＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＴＣＴＧ［配列番号４４］
８５４−ＺＮＲ１６：ＡＣＣＧＧＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＧＡＴＧＴＧＡＣＧＧＧＴＣＡＧＴ［配列番号４５］
８５５−ＺＮＲ１７：ＴＣＧＴＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＣＧＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡＧ［配列番号４６］
８５６−ＺＮＲ１８：ＡＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＡＣＧＴＴＣＣＡＴ［配列番号４７］
【０１１５】
ＰＣＲプライマー：
８２１−ＺＮＦ１：ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＣＣ［配列番号４８］
８９７−２ＺｎＲＥ：ＣＣＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＴＴＴ ＣＴＧ ＡＣＧ［配列番号４９］
【０１１６】
実施例２
二官能性タンパク質の過発現および精製
ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質遺伝子を含有するプラスミドｐＥＤ１０７をＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）に形質転換した。ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から提供されている以下のプロトコールに従って過発現を実施した。まずＧＳＴ親和性精製キット（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて精製を行ったが、その結果を図１に示す。図１は、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加後０時間、１時間、２時間（それぞれレーン２、３、４）の時点でのタンパク質の誘導を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５％）である。第１レーンはタンパク質サイズマーカー（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのマーク１２）である。ＢはＧＳＴ親和性精製実験での溶出画分２〜６を示す。
【０１１７】
ｐＥＤ１０７でコードされるＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質の計算で求めた分子量は４３ｋＤａであったが、これは過発現させたタンパク質で観察された値と一致している。
【０１１８】
実施例３
Ｚｉｆ２６８によって認識されるＤＮＡ断片のクローニング
タンパク質活性アッセイの目的で、複製数を１から２３の範囲として、Ｚｉｆ ２６８ＤＮＡ結合部位のタンデムアレイを持つ一連のプラスミドコンストラクトを作出した。Ｚｉｆ２６８ ＤＮＡ結合部位を配列５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’［配列番号１］で同定した。このコンストラクトでは、２つの隣接するＺｉｆ２６８部位間の空間を、別の亜鉛フィンガータンパク質ＮＲＥのＤＮＡ結合部位である配列５’−ＡＡＧＧＧＴＴＣＡ−３’［配列番号２］（キム（Ｋｉｍ） ＪＳ、パボ（Ｐａｂｏ） ＣＯ；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１９９８年３月１７日；９５（６）：２８１２〜７）で埋めた。
【０１１９】
クローニングに用いるプライマーを以下に列挙する。８７２−ＮＺＦおよび８７３−ＮＺＲプライマーは、Ｚｉｆ２６８部位の前にあるＮＲＥ部位をコードする。ある単位を別の単位でアニールして結合部位の複製を複数形成できるように、上記の２つのプライマーの末端を、突出末端ＡＡＧおよびＴＴＣを有するように設計した（下記のスキームを参照のこと）。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
８７４−Ｎ／ＺＦプライマーおよび８７５−Ｎ／ＺＲプライマーは、１ヌクレオチドのｇスペーサを挟んでＺｉｆ２６８部位の前にあるＮＲＥ部位をコードする。８７６−Ｎ／／ＺＦプライマーおよび８７７−Ｎ／／ＺＲプライマーは、２ヌクレオチドのＧＴスペーサを挟んでＺｉｆ２６８部位の前にあるＮＲＥ部位をコードする。２つの末端にある２対のキャッピングプライマーによって、結合部位単位の成長が停止する。キャッピングプライマーはＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位も取り込む。
【０１２２】
０．１Ｍ ＮａＣｌ中にてアニーリングを行った後、Ｔ４リガーゼでのライゲーション反応を実施した。次に、ライゲーション反応混合物を、プライマー８７８および８８１でのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。クリンナップ後、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＵＣ１８にクローニングした。クローンを配列決定し、配列決定の結果に基づいて各クローンの結合部位数を確認した。１から２３の間にタンデムアレイのＺｉｆ２６８結合部位を含有するクローンを得た。
【０１２３】
ＤＮＡ結合部位のクローニングに用いるプライマー
８７２−ＮＺＦ：ＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧ［配列番号４９］
８７３−ＮＺＲ：ＣＴＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＣ［配列番号５０］
８７４−Ｎ／ＺＦ：ＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＣＧＧ［配列番号５１］
８７５−Ｎ／ＺＲ：ＣＴＴＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＴＧＡＡＣＣ［配列番号５２］
８７６−Ｎ／／ＺＦ：ＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧＴＧＣＧＴＧＧＧＣＧＧＴ［配列番号５３］
８７７−Ｎ／／ＺＲ：ＣＴＴＡＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＡＡＣＣ［配列番号５４］
８７８−ＣＡＰＢ５’：ＧＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧ［配列番号５５］
８７９−ＣＡＰＢ３’：ＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣ［配列番号５６］
８８０−ＣＡＰＥ５’：ＡＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡ［配列番号５７］
８８１−ＣＡＰＥ３’：ＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴ［配列番号５８］
【０１２４】
実施例４
平均直径３．０ｎｍのＧＳＨ単層膜保護金ナノ粒子の合成
一般的な反応では、ＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード）６０ｍＬと酢酸（ＨＰＬＣグレード）１０ｍＬとを、２５０ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内で内で２〜５分間攪拌することによって混合した。四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４×Ｈ２Ｏ）（９９．９９％）０．３７ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とグルタチオン（ＧＳＨ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から最低９９％）６１．４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）とを上記の混合溶媒に加え、５分間攪拌することによって溶解させたところ、透明な黄色の溶液が得られた。次に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４、９９％）０．６ｇ（１６ｍｍｏｌ）をナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（登録商標）水３０ｇに溶解させた。このＮａＢＨ４溶液を上記の溶液に素早く攪拌しながら滴下して加えた。ＮａＢＨ４の最初の１滴を加えると、ＨＡｕＣｌ４溶液は瞬時に黄色から暗褐色に変化した。この反応は発熱を伴うものであった。反応時に生成された熱により、１５分以内の間溶液を温かい状態に維持した。この反応時、溶液のｐＨが１．２から５．０以内まで変化した。攪拌を２時間継続した。得られたＧＳＨ保護金ナノ粒子は水に可溶であった。希釈すると、溶液は透明な紫色になった。
【０１２５】
実施例５
ＤＮＡ結合活性アッセイ
ゲル電気泳動を利用して、図２に示すように精製Ｚｎフィンガータンパク質が標的ＤＮＡ配列に対して高い親和性および特異性で結合していることを確認した。図２は、電気泳動度移動アッセイである。レーン１および７はライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）からの「１ＫｂプラスＤＮＡラダー」である。レーン２〜６は、後述するようにタンパク質の量が増した同量のＤＮＡの結合反応物からの分離を示す。
【０１２６】
この例では、２３のＺｉｆ２６８結合部位を含む短い方の切片と、結合部位を含まない長い方の切片の２種類の異なるＤＮＡ片をＰＥＤ１０７（ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質）と混合した。ＤＮＡについては以下のようにして調製した。プラスミドＮＺ−２３、５μｇ（〜２ｐｍｏｌｅ）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、２３のＮＺ結合部位と線状化したｐＵＣ１８ベクターに対応する長い方の切片とを含む４２０ｂｐの断片を得た。精製後、１ｍｇ／ｍＬ（〜２０ｐｍｏｌ／μＬ）ＰＥＤ１０７が０μＬ、１μＬ、２μＬ、３μＬ、４μＬ入った５本のチューブにＤＮＡを等分した。Ｈ２Ｏを用いて総反応容量を１０μＬにした。この反応混合物をＲＴで１０分間インキュベートし、１％アガロースゲルに仕込んだ（図２のレーン２〜５）。試料を６０分間９０Ｖで電気泳動した。タンパク質の濃度が高くなるにつれて、短い方のＤＮＡ片がゲルにうまくトラップされたが、長い方の切片ではこれが起こらないことから、Ｚｎフィンガータンパク質とその標的配列との間に特定の複合体が形成されていることが分かる。
【０１２７】
実施例６
ナノ粒子結合活性アッセイ
一般的な実験では、ＯＤ５００＝１０（〜１０μＭ）に等しい濃度のＡｕ−ＧＳＨ粒子２μＬを、１ｍｇ／ｍＬのＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８タンパク質または対照としてのＢＳＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）８μＬ（〜２０μＭ）と混合した。室温にて１０分間のインキュベーション後、反応混合物全体を１％アガロースゲルに仕込んだ。１×ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ）中、９０Ｖの定電圧で２０分間ゲル電気泳動を実施した。ゲル像については、ＨＰスキャンジェット（ＳｃａｎＪｅｔ） ６３００Ｃ上でゲルを直接走査して得た。図３から明らかなように、ＢＳＡタンパク質はＡｕ−ＧＳＨ粒子に結合できないのに対し、二官能性タンパク質ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８はＧＳＨ−Ａｕ粒子の移動性を阻害したことから、ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８とＡｕ−ＧＳＨとの間に複合体が形成されていることが分かる。
【０１２８】
実施例７
二官能性アッセイ
この例では、二官能性タンパク質ＰＥＤ１０７（ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８）がＡｕ−ＧＳＨ粒子とＺｉｆ２６８結合部位を持つＤＮＡ配列の両方に結合するであろうことを試験した。
【０１２９】
以下のようにして３回の反応の準備を整えた。１）濃度ＯＤ５００＝１０（〜１０μＭ）のＡｕ−ＧＳＨ粒子２μＬ、２）濃度ＯＤ５００＝１０（〜１０μＭ）のＡｕ−ＧＳＨ粒子２μＬを１ｍｇ／ｍＬ ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８タンパク質８μＬと混合した、３）５μＬのＮＺ−２３（１μｇ／μＬ）を加えたこと以外は２と同一。
【０１３０】
室温にて１０分間のインキュベーション後、反応混合物全体を１％アガロースゲルに仕込んだ。１×ＴＡＥ緩衝液（トリス−酢酸塩−ＥＤＴＡ）中、９０Ｖの定電圧で２０分間ゲル電気泳動を実施した。ゲル像については、ＨＰスキャンジェット（ＳｃａｎＪｅｔ） ６３００Ｃ上でゲルを直接走査して得た。図４から明らかなように、タンパク質認識配列を含有するＤＮＡ片を加えると、タンパク質−粒子複合体が異なる速度で移動し、ＤＮＡはＡｕ粒子と一緒に移動する。図４Ａは、スキャンジェット（ＳｃａｎＪｅｔ） ６３００Ｃで記録したゲル画像である。図４Ｂは、イーグル・アイ（Ｅａｇｌｅ Ｅｙｅ） ＩＩ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）で記録したＵＶ照射下でのゲル画像である。これらの結果から、実施例２で生成した二官能性タンパク質が特に粒子をＤＮＡに向けて送れることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８タンパク質の過発現および精製を表すゲルを示す。
【図２】精製ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質によるＤＮＡ結合のゲルシフトアッセイである。
【図３】精製ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８融合タンパク質ｖｓ．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質についてのナノ粒子結合アッセイを示す。
【図４Ａ−４Ｂ】Ａｕ−ＧＳＨナノ粒子およびＤＮＡの両方に対する精製ＧＳＴ−Ｚｉｆ２６８タンパク質結合についてのゲルシフトアッセイである。図４Ａは、スキャンジェット（ＳｃａｎＪｅｔ）ｓ６３００Ｃで記録されたゲル画像であり、図４ＢはＵＶ照射下でのゲル画像である。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）各々結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインで（ａ）のナノ粒子に付着されている、機能化ナノ粒子。
【請求項２】
ナノ粒子が金属質である、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項３】
ナノ粒子を含んでなる金属が、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの合金よりなる群から選択される、請求項２に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項４】
ナノ粒子が半導体である、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項５】
ナノ粒子を含んでなる半導体が、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、シリコン、酸化スズ、酸化鉄、およびリン化インジウムよりなる群から選択される、請求項４に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項６】
前記単層膜が、
ａ）−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＨＯ−基、−ＯＨ基、−Ｘ（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）基、スクシンイミド基、およびエポキシ基よりなる群から選択される反応基を有する分子、ならびに
ｂ）ペプチド、チオプロニン、およびＧＳＨよりなる群から選択される生体分子、
よりなる群から選択される、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項７】
前記単層膜が遮蔽成分をさらに含んでなる、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項８】
遮蔽成分が、短鎖エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールメタクリレート、糖類、クラウンエーテル、およびアクリルアミドよりなる群から選択される、請求項７に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項９】
前記第１の結合ドメインが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、６ＸヒスチジンＴａｇ／Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン／ビオチン、Ｓ−タンパク質／Ｓ−ペプチド、クチナーゼ／ホスホネートインヒビター、抗原／抗体、ハプテン／抗ハプテン、葉酸／葉酸結合タンパク質、およびプロテインＡまたはＧ／免疫グロブリンよりなる群から選択される結合対のメンバーを含んでなる、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１０】
前記第２の結合ドメインが核酸結合アミノ酸配列である、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１１】
前記核酸結合アミノ酸配列が、ＤＮＡ結合ドメインとＲＮＡ結合ドメインとよりなる群から選択される、請求項１０に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１２】
前記核酸結合アミノ酸配列が、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿４１７８１６、ジーンバンク受託番号：Ｐ０３０４０、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０４０６２８、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４２、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４１よりなる群から選択されるサイテーションによって説明される、請求項１１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１３】
核酸結合アミノ酸配列がＤＮＡ結合亜鉛フィンガー配列である、請求項１０に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１４】
亜鉛フィンガー配列が、配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択される標的配列に結合する、請求項１３に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１５】
前記第２の結合ドメインが、核酸、ペプチド、生体細胞、および無機ナノチューブよりなる群から選択される捕獲部分に対する親和性を有する、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１６】
二官能性ペプチドの第２の結合ドメインがカーボンナノチューブに対する親和性を有する、請求項１５に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１７】
二官能性ペプチドが、配列番号４〜２７よりなる群から選択される、カーボンナノチューブ結合親和性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１６に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１８】
核酸、ペプチド、生体細胞、および無機ナノチューブよりなる群から選択される捕獲部分を、請求項１に記載の機能化ナノ粒子と接触させることを含んでなる、捕獲部分を捕獲するための方法。
【請求項１９】
機能化ナノ粒子が、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のナノ粒子に付着されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
捕獲部分が核酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸結合アミノ酸配列がＤＮＡ結合亜鉛フィンガー配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
亜鉛フィンガー配列が、配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択される標的配列に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のナノ粒子に付着されており、そして核酸結合アミノ酸配列で核酸断片に付着されている、核酸ナノ粒子複合体。
【請求項２４】
核酸断片が固体担体に固定化されている、請求項２３に記載の核酸ナノ粒子複合体。
【請求項２５】
核酸結合アミノ酸配列が亜鉛フィンガーである、請求項２３に記載の核酸ナノ粒子複合体。
【請求項２６】
ａ）各々が
ｉ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｉｉ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなる複数の機能化ナノ粒子であって、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して金属質ナノ粒子に付着されており、そして各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列が非反復性である、複数の機能化ナノ粒子を提供し、
ｂ）（ａ）の各二官能性ペプチドの各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列に対する親和性を有するペプチド結合ドメインを有する核酸マトリクスを提供し、
ｃ）二官能性ペプチドの核酸結合アミノ酸配列が（ｂ）の核酸マトリクスのペプチド結合ドメインと結合する条件下で（ａ）の機能化ナノ粒子を（ｂ）の核酸マトリクスと接触させ、ナノ粒子を固定化することを含んでなる、複数のナノ粒子を核酸マトリクス上に固定化するための方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法で製造されるナノメートル規模の電子デバイス。
【請求項２８】
電子ヘテロ接合、電子相互接続部、およびナノワイヤよりなる群から選択される、請求項２７に記載のナノメートル規模の電子デバイス。
【請求項２９】
ａ）カーボンナノチューブと、
ｂ）カーボンナノチューブに対する親和性を有する第１の結合ドメインと、結合対のメンバーを含んでなる第２の結合ドメインと、を有する二官能性タンパク質と、含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のカーボンナノチューブに付着されている、機能化カーボンナノチューブ。
【請求項３０】
前記第２の結合ドメインが核酸結合アミノ酸配列である、請求項２９に記載の機能化カーボンナノチューブ。
【請求項３１】
前記核酸結合アミノ酸配列が、ＤＮＡ結合ドメインおよびＲＮＡ結合ドメインよりなる群から選択される、請求項３０に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項３２】
前記核酸結合アミノ酸配列が、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿４１７８１６、ジーンバンク受託番号：Ｐ０３０４０、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０４０６２８、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４２、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４１よりなる群から選択されるサイテーションによって説明される、請求項３１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項３３】
核酸結合アミノ酸配列がＤＮＡ結合亜鉛フィンガー配列である、請求項３１に記載の機能化カーボンナノチューブ。
【請求項３４】
亜鉛フィンガー配列が、配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択される標的配列に結合されている、請求項３３に記載の機能化カーボンナノチューブ。
【請求項１】
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）各々結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインで（ａ）のナノ粒子に付着されている、機能化ナノ粒子。
【請求項２】
ナノ粒子が金属質である、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項３】
ナノ粒子を含んでなる金属が、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの合金よりなる群から選択される、請求項２に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項４】
ナノ粒子が半導体である、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項５】
ナノ粒子を含んでなる半導体が、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、シリコン、酸化スズ、酸化鉄、およびリン化インジウムよりなる群から選択される、請求項４に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項６】
前記単層膜が、
ａ）−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＨＯ−基、−ＯＨ基、−Ｘ（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）基、スクシンイミド基、およびエポキシ基よりなる群から選択される反応基を有する分子、ならびに
ｂ）ペプチド、チオプロニン、およびＧＳＨよりなる群から選択される生体分子、
よりなる群から選択される、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項７】
前記単層膜が遮蔽成分をさらに含んでなる、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項８】
遮蔽成分が、短鎖エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールメタクリレート、糖類、クラウンエーテル、およびアクリルアミドよりなる群から選択される、請求項７に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項９】
前記第１の結合ドメインが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、６ＸヒスチジンＴａｇ／Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン／ビオチン、Ｓ−タンパク質／Ｓ−ペプチド、クチナーゼ／ホスホネートインヒビター、抗原／抗体、ハプテン／抗ハプテン、葉酸／葉酸結合タンパク質、およびプロテインＡまたはＧ／免疫グロブリンよりなる群から選択される結合対のメンバーを含んでなる、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１０】
前記第２の結合ドメインが核酸結合アミノ酸配列である、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１１】
前記核酸結合アミノ酸配列が、ＤＮＡ結合ドメインとＲＮＡ結合ドメインとよりなる群から選択される、請求項１０に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１２】
前記核酸結合アミノ酸配列が、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿４１７８１６、ジーンバンク受託番号：Ｐ０３０４０、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０４０６２８、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４２、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４１よりなる群から選択されるサイテーションによって説明される、請求項１１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１３】
核酸結合アミノ酸配列がＤＮＡ結合亜鉛フィンガー配列である、請求項１０に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１４】
亜鉛フィンガー配列が、配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択される標的配列に結合する、請求項１３に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１５】
前記第２の結合ドメインが、核酸、ペプチド、生体細胞、および無機ナノチューブよりなる群から選択される捕獲部分に対する親和性を有する、請求項１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１６】
二官能性ペプチドの第２の結合ドメインがカーボンナノチューブに対する親和性を有する、請求項１５に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１７】
二官能性ペプチドが、配列番号４〜２７よりなる群から選択される、カーボンナノチューブ結合親和性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１６に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項１８】
核酸、ペプチド、生体細胞、および無機ナノチューブよりなる群から選択される捕獲部分を、請求項１に記載の機能化ナノ粒子と接触させることを含んでなる、捕獲部分を捕獲するための方法。
【請求項１９】
機能化ナノ粒子が、
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のナノ粒子に付着されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
捕獲部分が核酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸結合アミノ酸配列がＤＮＡ結合亜鉛フィンガー配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
亜鉛フィンガー配列が、配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択される標的配列に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｂ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のナノ粒子に付着されており、そして核酸結合アミノ酸配列で核酸断片に付着されている、核酸ナノ粒子複合体。
【請求項２４】
核酸断片が固体担体に固定化されている、請求項２３に記載の核酸ナノ粒子複合体。
【請求項２５】
核酸結合アミノ酸配列が亜鉛フィンガーである、請求項２３に記載の核酸ナノ粒子複合体。
【請求項２６】
ａ）各々が
ｉ）捕獲コーティング成分を含んでなる単層膜でコーティングしたナノ粒子、ならびに
ｉｉ）結合対のメンバーを含んでなる第１の結合ドメインと核酸結合アミノ酸配列を含んでなる第２の結合ドメインとの第１の結合ドメインと第２の結合ドメインを有する二官能性タンパク質、を含んでなる複数の機能化ナノ粒子であって、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して金属質ナノ粒子に付着されており、そして各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列が非反復性である、複数の機能化ナノ粒子を提供し、
ｂ）（ａ）の各二官能性ペプチドの各第２の結合ドメインの核酸結合アミノ酸配列に対する親和性を有するペプチド結合ドメインを有する核酸マトリクスを提供し、
ｃ）二官能性ペプチドの核酸結合アミノ酸配列が（ｂ）の核酸マトリクスのペプチド結合ドメインと結合する条件下で（ａ）の機能化ナノ粒子を（ｂ）の核酸マトリクスと接触させ、ナノ粒子を固定化することを含んでなる、複数のナノ粒子を核酸マトリクス上に固定化するための方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法で製造されるナノメートル規模の電子デバイス。
【請求項２８】
電子ヘテロ接合、電子相互接続部、およびナノワイヤよりなる群から選択される、請求項２７に記載のナノメートル規模の電子デバイス。
【請求項２９】
ａ）カーボンナノチューブと、
ｂ）カーボンナノチューブに対する親和性を有する第１の結合ドメインと、結合対のメンバーを含んでなる第２の結合ドメインと、を有する二官能性タンパク質と、含んでなり、かつ、
二官能性タンパク質が第１の結合ドメインを介して（ａ）のカーボンナノチューブに付着されている、機能化カーボンナノチューブ。
【請求項３０】
前記第２の結合ドメインが核酸結合アミノ酸配列である、請求項２９に記載の機能化カーボンナノチューブ。
【請求項３１】
前記核酸結合アミノ酸配列が、ＤＮＡ結合ドメインおよびＲＮＡ結合ドメインよりなる群から選択される、請求項３０に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項３２】
前記核酸結合アミノ酸配列が、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿４１７８１６、ジーンバンク受託番号：Ｐ０３０４０、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０４０６２８、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４２、ジーンバンク受託番号：ＮＰ＿０５９６４１よりなる群から選択されるサイテーションによって説明される、請求項３１に記載の機能化ナノ粒子。
【請求項３３】
核酸結合アミノ酸配列がＤＮＡ結合亜鉛フィンガー配列である、請求項３１に記載の機能化カーボンナノチューブ。
【請求項３４】
亜鉛フィンガー配列が、配列番号１、配列番号２、および配列番号３よりなる群から選択される標的配列に結合されている、請求項３３に記載の機能化カーボンナノチューブ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５０５２５３（Ｐ２００６−５０５２５３Ａ）
【公表日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３２８４５（Ｐ２００４−５３２８４５）
【出願日】平成１５年７月３１日（２００３．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２４０９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２０４５３
【国際公開日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月３１日（２００３．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２４０９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２０４５３
【国際公開日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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