機能性核酸を用いた分子センサー
【課題】特殊なプローブや検出機器を用いなくとも、目的分子の存在、濃度を簡便に検出し得る機能性核酸及びこれを用いて目的分子を検出する方法を提供する。
【解決手段】本発明の機能性核酸分子は、（ａ）レポーター遺伝子配列、（ｂ）前記レポーター遺伝子配列と機能的に結合したリボソーム結合部位、（ｃ）前記リボソーム結合部位と分子内でハイブリダイズし得るアンチリボソーム結合部位、及び（ｄ）前記リボソーム結合部位とアンチリボソーム結合部位との間に連結されたアプタザイム配列、を含む。目的分子の非存在下において、前記アンチリボソーム結合部位は、前記リボソーム結合部位とハイブリダイズして二重鎖を形成し、そして目的分子の存在下において、前記アプタザイムは自己切断触媒活性を示し、前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離する。
【解決手段】本発明の機能性核酸分子は、（ａ）レポーター遺伝子配列、（ｂ）前記レポーター遺伝子配列と機能的に結合したリボソーム結合部位、（ｃ）前記リボソーム結合部位と分子内でハイブリダイズし得るアンチリボソーム結合部位、及び（ｄ）前記リボソーム結合部位とアンチリボソーム結合部位との間に連結されたアプタザイム配列、を含む。目的分子の非存在下において、前記アンチリボソーム結合部位は、前記リボソーム結合部位とハイブリダイズして二重鎖を形成し、そして目的分子の存在下において、前記アプタザイムは自己切断触媒活性を示し、前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性核酸を用いた分子センサーに関し、より詳細には、目的分子との結合により自己切断酵素活性をもつ機能性核酸（アプタザイム）とレポーター遺伝子とを含む核酸分子を用いて、目的分子を検出する方法、及びこのような方法に用いる核酸分子等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、インビトロで選択されたＲＮＡアプタマー、又はＤＮＡアプタマーは、種々の分子に対するセンサーとして大きな注目を集めている。アプタマーは、目的とする有機分子、イオン、タンパク質、又は細胞等を特異的に認識することができる。この認識機構は、アプタマー分子内に存在するリン酸基や有機塩基の有する疎水性及び親水性の両方の性質によって形成されている。アプタマーがその目的分子と複合体を形成すると分子量の増加をもたらし、目的分子が大きい場合には、質量検出器によって直接検出することができる。また、いくつかのアプタマーは目的分子との結合により構造変化を起こす。このような構造変化と、蛍光的又は電気化学的方法とを組み合わせることにより、低分子量の目的分子でも検出することが可能である。ただし、その際は、アプタマーを直接的若しくは間接的に蛍光色素又は電気応答性物質で標識しなければならない。
【０００３】
「アプタザイム」又は「アロステリックリボザイム」と称される核酸は、特定の分子（コファクター）によってアロステリックに活性化される酵素機能を有し、センサーとして利用可能である。アプタザイムは、アプタマードメイン及びリボザイムドメインの両方を分子内に有し、コファクターとの複合体形成という信号を、例えば自己切断のようなより明確な触媒活性へ容易に伝達することができる。
【０００４】
例えば、国際公開公報ＷＯ０３／０１４３７５号パンフレット（特許文献１）には、アプタザイムを蛍光標識することによって、目的分子の結合を光学的に検出するシステムが開示されている。また、国際公開公報ＷＯ００／２６２２６号パンフレット（特許文献２）には、アプタザイムの５’末端を放射性同位元素である３２Ｐで標識して切断されたアプタザイムを検出する方法が開示されている。質量変化を測定する方法としては、アプタザイムを金表面に固定化し、特定の分子との結合によって誘起された酵素活性によるアプタザイムの質量変化を測定する方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００５】
一方、塩基配列の相同性に基づいてＤＮＡを検出する方法として、分子ビーコン法（例えば、非特許文献１参照）が知られている。この方法は、目的配列と相補的な配列をループドメインに有するヘアピン構造のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、例えば、５’末端及び３’末端に標識されたＦＲＥＴを検出する方法である。さらに、無細胞タンパク質合成系において、分子ビーコン型リボ核酸と連結したレポーター遺伝子の発現を指標として、目的とするＤＮＡを検出する方法が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、これらの方法は核酸配列の相補性に基づくため、ＤＮＡ等の核酸分子の検出に利用できるに過ぎず、低分子化合物やペプチド、タンパク質等の検出は不可能である。
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ０３／０１４３７５号パンフレット
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ００／２６２２６号パンフレット
【特許文献３】米国出願公開公報第２００４０１７５６９３号
【非特許文献１】Tyagi, S., Kramer, F.R., Nat. Biotechnol. 1996, Vol. 14, pp.303-308
【非特許文献２】Sando, S., Narita A., Abe, K., and Aoyama Y., J. Am. Chem. Soc., 2005, Vol.127, pp.5300-5301
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記従来技術によれば、アプタザイムを用いて目的分子を検出するためには、何れも蛍光物質や放射性同位元素等で標識する必要があり、そのための時間やコスト、さらには特殊な検出装置が必要になるという課題がある。また、これらの標識のために不安定なＲＮＡを直接用いなければならないという問題点もある。本発明は、特殊なプローブや検出機器を用いなくとも、目的分子の存在、濃度を簡便に検出し得る機能性核酸及びこれを用いて目的分子を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はかかる課題を解決するためになされたものであって、目的分子の存在下において自己切断触媒活性を示すアプタザイムと、タンパク質の翻訳段階におけるレポーター遺伝子の発現制御機構とを組み合わせることによって完成されたものである。
【０００９】
すなわち、第一の観点において、目的分子を検出するための本発明の機能性核酸分子は、（ａ）レポーター遺伝子配列、（ｂ）前記レポーター遺伝子配列と機能的に結合したリボソーム結合部位、（ｃ）前記リボソーム結合部位と分子内でハイブリダイズし得るアンチリボソーム結合部位、及び（ｄ）前記リボソーム結合部位とアンチリボソーム結合部位との間に連結されたアプタザイム配列、を含むことを特徴とする。目的分子の非存在下において、前記アンチリボソーム結合部位は、前記リボソーム結合部位とハイブリダイズして二重鎖を形成する。そして目的分子の存在下において、前記アプタザイムは自己切断触媒活性を示し、それによって前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離する。翻訳反応系が共存すると、当該核酸分子のリボソーム結合部位にリボソームが結合して翻訳が開始され、前記レポーター遺伝子が発現される。目的分子に対するアプタザイムを選択することによって所望の目的分子を検出することが可能であるが、検出対象としては、例えば、低分子化合物、ペプチド及びタンパク質等が挙げられる。
【００１０】
別の観点において、本発明は上記核酸分子をコードする二本鎖ＤＮＡであって、当該コード領域の上流に機能的に連結された転写プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡを提供する。転写プロモーター配列としては、用いる翻訳反応系において機能しうるものであれば特に限定されないが、強力なプロモーター活性を有する、ファージ由来のＴ７プロモーターが好ましい。
【００１１】
さらに異なる観点において、本発明は上記核酸分子を用いる目的分子の検出方法を提供する。当該検出方法は、上記核酸分子と、目的分子を含む試料とを、翻訳反応系内において所定の時間接触させる工程、及び前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、を含むことを特徴とする。前記核酸分子が二本鎖ＤＮＡの場合は、転写／翻訳共役反応系を用いることができる。
【００１２】
さらになお異なる観点において、本発明は、目的分子の検出のための本発明の核酸分子を含むキット、及び本発明の核酸分子によって形質転換された原核生物の細胞等を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、従来技術のように蛍光標識や放射性標識を行うことなく、且つ特殊な機器を用いなくとも目的分子を検出することが可能である。また、不安定であるＲＮＡを直接扱わなくても、より安定なＤＮＡをセンサー前駆体として用いることができる。本発明に係るＤＮＡには転写プロモーターが導入されており、用いる翻訳系にＲＮＡポリメラーゼを添加することによってＲＮＡを容易に合成できるからである。機能性ＲＮＡ自身をセンサーとして用いることも可能であるが、センサー前駆体であるＤＮＡを用いた方がより効率的であり感度も向上するという知見が得られている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（定義）
本明細書中で使用される用語「リボザイム」とは、酵素のような作用を有するＲＮＡのオリゴヌクレオチドであり「ＲＮＡ酵素」若しくは「核酸酵素」と呼ばれる場合もある。一般的に、これらはＲＮＡ分子の切断を触媒するエンドリボヌクレアーゼ作用を示す。切断部位の位置は高度に配列特異的である。リボザイムの中には、ポリメラーゼ又は脱リン酸化酵素のように作用するものもある。
【００１５】
用語「アプタマー」とは、標的リガンドに最適に結合するように特異的に選択される核酸をいう。標的リガンドとしては、増殖因子、酵素、受容体、膜タンパク質、ウイルスタンパク質等の種々のタンパク質が挙げられるが、金属イオンや分子量の小さい有機化合物、ペプチド、ウイルス等とも結合することが分かってきた。標的リガンドに特異的なアプタマーを探し出す方法としては、ＳＥＬＥＸ法（試験管内人工進化法 Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）(Tuerk, C., Gold, L., Science, 1990 Vol. 249, pp.505-510参照）が知られている。この方法は、標的とする目的分子に対し、ランダムな配列をもつ多数のオリゴヌクレオチドの混合物であるオリゴヌクレオチドライブラリを作用させることにより、親和性の高いオリゴヌクレオチドを選び出し、選び出されたオリゴヌクレオチドを増幅生産するという作業を繰り返す。これによって、標的とする目的分子に対し特異的に結合するオリゴヌクレオチドを得る方法である。
【００１６】
用語「アプタザイム」とは、エフェクターによって調節されるリボザイム又は核酸酵素を意味する。アプタザイムは、典型的にはエフェクターを認識するアプタマードメインと、触媒作用を示すリボザイムドメインを含む。エフェクターは、アプタマードメインとリボザイムドメインとの特異的な相互作用を通じてアプタザイムの触媒活性を高め、又は低下させることができる。従って、アプタザイムの活性はエフェクターの存在の有無やその量を監視するために用いられうる。この方法は、これまで種々の診断及び検出のためのアプタザイムセンサーを設計するために用いられている。アプタザイムの設計に用いる核酸分子としては、ＲＮＡ（リボザイム）、ＤＮＡ（デオキシリボザイム）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。一般的には、リボザイムはデオキシリボザイムよりも不安定である。種々のエフェクター分子、例えば、金属イオンや低分子化合物により調節されるアプタザイムの作製方法は公知であり（米国特許第６６３０３０６号等参照）、その内容は参照により本願に組み込まれる。
【００１７】
（機能性核酸分子）
以下に図面を参照しながら本発明の機能性核酸分子について説明する。図１は、本発明の好ましい実施形態における機能性核酸分子を模式的に表したものである。図１上部の二本鎖鋳型ＤＮＡは、Ｔ７プロモーターの制御下において、レポーター遺伝子をコードする。レポーター遺伝子上流には、５’末端から順に、ステム−ループ構造、アンチ−リボソーム結合部位（アンチ−ＲＢＳ）、アプタザイム配列、及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞タンパク質合成系においてこの鋳型ＤＮＡが転写されると、アンチ−ＲＢＳはＲＢＳとハイブリダイズしてリボソームがＲＢＳに結合することを阻害する（左下部のＯＦＦ状態）。ｍＲＮＡの５’末端側（領域）に存在するステム−ループ構造は転写産物を安定化し、同時にアンチ−ＲＢＳが正確にＲＢＳと結合して二重鎖を形成するために有用である。このようなステム−ループ構造は、少なくとも１０塩基長程度の長さがあればよく、好ましくは１０〜２００塩基長、より好ましくは１３〜１００塩基長、さらに好ましくは１７〜５０塩基長程度である。アプタザイムに対するコファクターの存在下では、（Ｉ）アプタザイムが立体構造の変化を起こし、（ＩＩ）これによって自己切断活性を誘導する。一般的に分子間で形成された二重鎖の融解温度（Ｔｍ）は、分子内二重鎖の融解温度よりも低いため、（ＩＩＩ）所定の条件下において切断されたアンチ−ＲＢＳドメインがＲＢＳから解離する。これによってリボソームがＲＢＳに接触可能となり、下流のレポーター遺伝子の発現が活性化される（右下部のＯＮ状態）。
【００１８】
ここで、転写プロモーターとしては、反応系において転写されるプロモーターであれば特に限定されないが、強力なプロモーターであるＴ７プロモーターが好ましい。また、レポーター遺伝子も翻訳系において検出可能なものであれば何れも使用可能できるが、検出が容易で感度が高いものとして、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子等が好ましい。
【００１９】
アプタザイム配列としては、目的分子によって調節可能な核酸酵素であれば特に限定されないが、好ましくは、目的分子としてテオフィリンのような低分子によってリボザイム活性が調節されるアプタザイムが用いられる。Breakerらによって試験管内で選択されたテオフィリン依存性アプタザイムが報告されている(Soukup, G. A., Emilsson, G.A.M., Breaker, R.R., J. Mol. Biol., 2000, Vol.298, pp.623-)。このアプタザイムは、図２（ａ）に示したように、アプタマードメイン、伝達モジュール、及びハンマーヘッドリボザイムの３つのドメインからなっている。コファクターであるテオフィリンがアプタマードメインに結合することによってリボザイムドメインの立体構造が変化し、ヘリックスＡとヘリックスＢの間の切断部位（矢印で示す）における自己切断活性を誘導する。この自己切断活性の発現に必要な切断部位に隣接するＧＵＡトリプレット配列に下線を付加した。このＧＵＡトリプレット以外の２つのヘリックスＡ及びヘリックスＢの配列は、当該アプタザイムの酵素活性とは関係ないことが知られているため、上記ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖をこれら２つのヘリックス構造の何れかと置換した核酸分子を作製した。ヘリックスＡの代わりにＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を挿入した場合は、アプタザイム配列とＲＢＳの間が切断されるため５’末端からＲＢＳまでの配列が短くなり（図２（ｂ）右上挿入図参照）効率的な翻訳が起こらなかった。一方、ヘリックスＢに上記ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を挿入した核酸分子では、アプタザイム配列とアンチ−ＲＢＳの間が切断されるため５’末端からＲＢＳまでの配列が長く（図２（ｂ）参照）効率的な翻訳が起こった。さらにこの場合、切断後のｍＲＮＡの５’末端側にステム−ループ構造（ヘリックスＡ）が存在するため、ｍＲＮＡが安定であることも利点としてあげられる。
【００２０】
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、ｍＲＮＡの翻訳開始コドン近傍にあり、リボソームの１６ｓｒＲＮＡ分子の３’末端近くにある配列と塩基対を形成してリボソーム小サブユニットと結合するために必要な配列である。大腸菌のｍＲＮＡのリボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ配列とも呼ばれる。この配列はプリンを多く含んでいるという傾向はあるものの、１６ｓｒＲＮＡと完全に相補的な配列となることはあまりなく、また長さも３塩基から９塩基程度である。ｍＲＮＡのＲＢＳに結合したリボソーム小サブユニットは遺伝子の開始コドン（ＡＵＧ：メチオニンに該当）までｍＲＮＡ上を移動し、メチオニン−ｔＲＮＡが開始コドンに結合して３０ｓ開始複合体を形成する。シャイン−ダルガルノ配列と翻訳開始コドンとの距離は、翻訳の効率と関連性のあることが知られ、最適距離は４塩基から９塩基であると推定されている。ｍＲＮＡ上において、このＲＢＳが強固に二重鎖を形成しているとリボソームがＲＢＳに接触できないため翻訳が開始されない。
【００２１】
アンチリボソーム結合部位（アンチ−ＲＢＳ）は、上記ＲＢＳと分子内でハイブリダイズし得るものであれば特に限定されないが、目的分子の存在又は非存在下においてのＯＮ／ＯＦＦ転換効率が向上するように最適化されることが好ましい。具体的には、目的分子の非存在下では分子内でＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖が安定に形成されるが、目的分子の存在下では自己切断により前記二重鎖が解離しやすいことである。一般的に分子間で形成される核酸配列二重鎖の融解温度（Ｔｍ）は、分子内二重鎖の融解温度よりも低いことが知られている。ＤＮＡやＲＮＡのＴｍ値の計算は、種々のコンピューターソフトウェアを用いて行うことができる。最も正確なＴｍ値の推定ソフトウェアの一つとして、例えば、ＨｙＴｈｅｒ（商標）が知られており、オンライン上で使用可能である(http://ozone3.chem.wayne.edu/)。Ｔｍでは、二本鎖状態の核酸と一本鎖状態の核酸が同率比で存在しており、Ｔｍ以上では、ほとんどがハイブリダイズできずに一本鎖状態になっていると考えられる。
【００２２】
本発明に係る核酸分子は、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡの何れでもよいが、２０〜４０℃の水溶液中において分子内で会合し、ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を含むステム−ループ構造を形成する一本鎖ＲＮＡであることが好ましい。さらに好ましくは、上記ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖のＴｍは反応溶液温度程度か、それ以下である。従って、好ましい実施形態において、上記ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖は、当該ＲＢＳと、アンチ−ＲＢＳと、それらの隣接配列とによって形成され、その二重鎖の長さは６〜２０塩基対である。より好ましくは８〜１５塩基対である。当該二重鎖にはＧ−Ｕペア、又は１〜数個のミスマッチを含んでもよい。
【００２３】
（レポーター遺伝子）
本発明において用いられるレポーター遺伝子は、翻訳反応系において発現し検出が容易なものであれば特に限定されないが、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びエクオリン等の遺伝子を挙げることができる。ホタルルシフェラーゼはＡＴＰの存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、光子を生成する化学ルミネッセンス反応を触媒する。ルシフェラーゼは単量体のタンパク質で翻訳後の修飾を必要としないから、遺伝子発現のレポーターとして適している。大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）は種々の細胞の形質転換におけるレポーター遺伝子としてよく使用される。この酵素の生体内での基質はラクトースであるが、ほぼあらゆるβ−ガラクトシドを加水分解することができ、例えば、無色の基質であるオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を加水分解して４２０ｎｍの光を吸収する黄色のオルト−ニトロフェノールを生成する。また、ｘ−ｇａｌはこの酵素により分解されてインディゴブルーの呈色反応を示す。アルカリフォスファターゼは、分子触媒活性の極めて高い酵素であり、種々の蛍光及び発光基質も開発されているため高感度検出に好適である。ＧＦＰはオワンクラゲ(Aequorea Victoria)等から発見された蛍光タンパク質であり、共存する発光タンパク質であるエクオリンの青色化学発光をエネルギー変換して緑色にすることが知られている。このＧＦＰは上記ルシフェラーゼやエクオリンのように特殊な蛍光団を必要とせず、自らアポタンパク質上で自動的に蛍光団を形成する。このため、クローン化されたＧＦＰのｃＤＮＡを用いて多くの細菌や動物細胞等で発現され、遺伝子発現の指標として利用されている。また、ＧＦＰ遺伝子に種々の突然変異を導入して多くのＧＦＰ誘導体が作製され、これらの中には野生型ＧＦＰよりも強い蛍光強度を示したり、異なる波長の蛍光を発する誘導体もあることが報告されている。
【００２４】
（目的分子又はコファクター）
本発明の方法において検出可能な目的分子としては、アプタザイムのコファクターとなりうるもので、かつ翻訳反応を阻害しないものであれば特に限定されないが、例えば、低分子化合物、細菌又はウイルス由来の抗原タンパク質、毒物分子、コカイン、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びＨＩＶ−由来分子などを含む。
【００２５】
また、本発明の別の観点において、上記レポーター遺伝子に代えて所望の遺伝子を挿入した核酸分子は、原核生物の翻訳反応系において上記目的分子又はコファクターに相当するリガンド分子による遺伝子発現制御システムとして利用することもできる。すなわち、リガンド分子の非存在下ではアンチ−ＲＢＳがＲＢＳに結合して当該所望の遺伝子の発現を抑制し、リガンド分子を添加することによって、前記アプタザイムが自己切断触媒活性を示し、それによって前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離する。その結果、前記所望の遺伝子の発現を誘導しうるのである。
【００２６】
（目的分子の検出方法）
本発明の検出方法は、無細胞タンパク質合成系において、目的分子を含む試料と本発明の機能性核酸分子を所定の時間接触させることにより、目的分子の濃度に応じて発現するレポーター遺伝子の活性を測定する工程を含む。用いる機能性核酸分子としては、ＲＮＡ及びこれをコードする鋳型ＤＮＡの何れでもよいが、検出感度及び取扱いの容易さの観点から二本鎖鋳型ＤＮＡを用いることが好ましい。ＤＮＡはＲＮＡに比べて酵素的に分解されにくく安定に存在するからである。これらの核酸分子を調製する方法は、化学合成法、ＰＣＲ、ＤＮＡのクローン化と複製、その他の公知技術を用いることができる。鋳型ＤＮＡとしてはＰＣＲにより合成した増幅産物をそのまま用いることができるが、好ましくはプラスミドなどにクローン化し、組換え体を用いて大量に調製及び精製したＤＮＡの方が検出感度に優れる。ＲＮＡの場合は、無細胞系として翻訳反応系を用いるが、二本鎖鋳型ＤＮＡの場合は転写／翻訳共役反応系を用いる必要がある。このような無細胞系としては、大腸菌由来のもの、コムギ胚芽由来のもの、ウサギ網状赤血球由来のものが市販されているが、大腸菌等の原核細胞由来の抽出液が好ましい。大腸菌の抽出液では、転写、翻訳の共役反応によりＤＮＡからタンパク質を合成できることが知られ、例えば、ズベイらによって大腸菌のＳ３０抽出液を用いる方法が系統的に開発されている（例えば、ジェフリー・ズベイ(Geoffrey Zubay)、「アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Annual Review of Genetics）」１９７３年、第７巻、ｐ．２６７−２８７参照）。Ｓ３０抽出液には、ｍＲＮＡの翻訳に必要なリボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ポリペプチド鎖開始因子（ＩＦ）、同伸長因子（ＥＦ）及び同終結因子が含まれている。合成タンパク質の鋳型としてＤＮＡを用いる場合は、強力なプロモーター（一般的にはＴ７プロモーター）の下流に目的タンパク質遺伝子を配置したＤＮＡが用いられ、転写と翻訳の両反応を共役させるために、系内にＴ７ＲＮＡポリメラーゼと４種類のリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ）を添加する。アミノアシルｔＲＮＡの合成、及びｍＲＮＡの翻訳反応にはＡＴＰのエネルギーが必要であることから、クレアチンキナーゼ−クレアチンリン酸系等のエネルギー再生系を無細胞系に加える。このような構成成分により、細胞内で起こるタンパク質合成反応を試験管内で再構成している。
【００２７】
大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいるが、更に補充的な混合液を添加することができる。具体的な調製方法としては、まず最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡ、ＲＮＡが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は−８０℃にて保存する。
【００２８】
転写、翻訳及びエネルギー再生に必要な全てのタンパク質因子にタグを付けて別々に調製し、これらを再構成した無細胞タンパク質合成系も知られている。これらのタンパク質因子に大腸菌７０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＮＴＰ等の転写、翻訳に必要な成分を添加したキットも販売されている。
【００２９】
（検出キット）
本発明の方法に用いるために上記方法により調製された核酸分子、及び大腸菌の細胞抽出液等の無細胞翻訳反応試薬は、使用しやすいように一定量ごと分注して、目的分子の検出キットとして配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書や陽性コントロールサンプル等を添付することができる。
【００３０】
（バイオセンサー）
本発明はまた、上記核酸分子によって形質転換された原核細胞からなるバイオセンサーに関する。特に、本発明の二本鎖ＤＮＡからなる核酸分子は安定であり、プラスミドＤＮＡとして種々の原核細胞で安定に存在しうる。或いは、本発明の二本鎖ＤＮＡを支持体に固定化したバイオセンサーを用いてもよい。
【００３１】
以下に具体的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
［実験材料及び方法］
１ 鋳型ＤＮＡの調製
ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpBESTluc、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするプラスミドpSV-β-Galactosidaseは、プロメガ社から購入した。本実施例で用いた全ての鋳型ＤＮＡは、以下に説明するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びβ−ガラクトシダーゼ用の鋳型の調製については、これに続いて連結反応により調製した。ＰＣＲは、２０μＬの反応混合液中、４ｐｍｏｌの正方向プライマー、４ｐｍｏｌの逆方向プライマー、０．５ユニットのPrimeSTAR HS ＤＮＡポリメラーゼ（商品名、タカラバイオ社）、それぞれ４ｎｍｏｌのｄＮＴＰｓ（タカラバイオ社）、及び４μＬの５倍濃度PrimeSTAR反応用緩衝液を含み、第一次ＰＣＲ用には２００ｐｇのpBESTluc又はpSV-β-Galactosidaseを、第二次以降のＰＣＲ用には約２０ｆｍｏｌの精製したＰＣＲ産物を鋳型として用いた。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いて精製し、２６０ｎｍの吸光度を測定して定量した。
【００３３】
２ 鋳型ＤＮＡのインビトロにおける転写／翻訳共役反応
インビトロにおける転写／翻訳反応は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む再構成された無細胞翻訳システム（ピュアシステム、クラシックＩＩ、ポストゲノム研究所）を用いて行った。約０．１μｇの鋳型ＤＮＡを含む１０μＬの反応溶液を、種々の濃度のテオフィリン、カフェイン又はｃＧＭＰの存在下又は非存在下において、３７℃で１時間インキュベートした。反応終了後の翻訳溶液はさらに精製することなく次のアッセイに用いた。
【００３４】
３ ｍＲＮＡ鋳型の調製
鋳型ＤＮＡのインビトロ転写反応は、MEGAscript T7 Kit（商品名、アンビオン）を用いて行った。０．３μｇの鋳型ＤＮＡを含む１０μｌの反応溶液を３７℃で４．５時間インキュベートした。当該キットに添付されているTURBO DNaseを１ユニット添加した後、さらに１５分間３７℃でインキュベートした。転写産物は、RNeasy MinElute Cleanup Kit（商品名、キアゲン）を用いて精製し、上述と同様の方法で定量した。
【００３５】
４ ｍＲＮＡ鋳型のインビトロ翻訳反応
インビトロ翻訳反応は、ピュアシステム、クラシックＩＩを用いて行った。約１μｇのｍＲＮＡを含む１０μｌの反応溶液を、種々の濃度のコファクター（テオフィリン）の存在又は非存在下で３７℃、１時間インキュベートした。生成した翻訳産物を含む溶液は精製せずに次のアッセイに用いた。
【００３６】
５ ルシフェラーゼアッセイ
翻訳溶液と水を等量含む５μｌの混合物を１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ）と混合した。化学発光強度の測定は、ワラック社の１４２０ＡＲＶＯｓｘ装置により、黒色９６穴プレート（コーニングコースター３９１５）を用いて行った。化学発光の映像はクールセイバーＡＥ−６９５５（アトー）により取得した。
【００３７】
６ β−ガラクトシダーゼアッセイ
１０μｌの翻訳溶液を、４０μｌの１×レポーターリシスバッファー（プロメガ）、及び５０μｌのオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を含む２×アッセイバッファー（プロメガ社のβ−ガラクトシダーゼアッセイシステム）と混合した。混合溶液は３７℃にて３時間インキュベートした。この反応溶液の４０５ｎｍにおける吸光度をワラック社の１４２０ＡＲＶＯｓｘ装置により、透明の９６穴プレート（コーニングコースター３６３５）を用いて測定した。β−ガラクトシダーゼを含まない（鋳型なしの翻訳溶液）バックグラウンド強度をそれぞれの測定データから差し引いた。
【００３８】
［実施例１］テオフィリン誘導アプタザイムとルシフェラーゼ遺伝子とを用いた核酸分子（リボスイッチ）の作製と、これを用いたテオフィリンの検出
ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpBESTlucと、以下のプライマー対とを用いて第一次ＰＣＲを行った。
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAG-3'（配列番号１）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００３９】
引き続き、以下のそれぞれのプライマー対と、直前のＰＣＲ増幅産物とを用いて順に第二次、第三次、及び第四次ＰＣＲを行った。
第二次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-ACCCTGATGAGCCTGGATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGTTAGACGAAACAAGAAGGAGATATACCAATG-3'（配列番号３）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
第三次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTTTTTGTAGGTTGCCCGAAAGGGCGACCCTGATGAGCCTGG-3'（配列番号４）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
第四次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTATCACCTTTTTGTAGGTTG-3'（配列番号５）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００４０】
第三次ＰＣＲによって増幅された二本鎖ＤＮＡは、５’末端のＴ７プロモーターから転写されるテオフィリン依存性アプタザイムとルシフェラーゼをコードしており、ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳによって形成される二重鎖は、表１の二重鎖２の配列を有する。また、第四次ＰＣＲによって増幅された二本鎖ＤＮＡは、同様に５’末端のＴ７プロモーターから転写されるテオフィリン依存性アプタザイムとルシフェラーゼをコードしており、ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖は、表１の二重鎖５の配列を有する（全体配列を配列番号２４に示す）。
【００４１】
対照実験に用いるための通常の５’非翻訳領域（Ｔ７ファージのｇ１０リーダー配列）を有する鋳型ＤＮＡは、以下のプライマー対を用いて増幅した。
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAG-3'（配列番号６）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
第二次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号７）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００４２】
このようにして、種々の塩基配列及び長さのＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を有する核酸分子を作製し、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として翻訳のＯＮ／ＯＦＦ転換効率を調べた。ＯＮ／ＯＦＦ転換効率とは、ここではテオフィリンの非存在下（ＯＦＦ）に対する存在下（ＯＮ）における翻訳されたルシフェラーゼ活性として規定される。その結果を下記の表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
ハンマーヘッド型リボザイムの触媒活性を維持する上で、切断部位の上流に隣接するＧＵＡのトリプレット塩基が不可欠であることが分かっているため、このＧＵＡトリプレットに隣接して直接ＲＢＳを結合した核酸分子を作製した（表１の二重鎖１）。この核酸分子１のテオフィリン１ｍＭの場合のＯＮ／ＯＦＦ転換効率は、表１に示したように約２．２倍であった。テオフィリン存在下（ＯＮ状態）でのルシフェラーゼ活性は５７０８ｃｐｓであり、タンパク質大量合成のために一般的に用いられる５’−非翻訳領域（Ｔ７ファージのｇ１０リーダー配列）を有する鋳型から転写される場合（１０００００ｃｐｓ以上）と比べて極めて小さいことが分かった。そこで、ＲＢＳ配列の５’側に、Ｔ７ファージのｇ１０リーダー配列と同じ３つのプリン塩基ＡＡＧを挿入した一連の核酸分子２〜５を作製した。このようにして作製した核酸分子２は、ＯＮ状態において約６倍のルシフェラーゼ活性を示したが、ＯＮ／ＯＦＦ転換効率は、わずかに１．７倍上昇したに過ぎなかった。これはＯＦＦ状態においても活性が上昇したことに起因する。テオフィリン非存在下（ＯＦＦ状態）における発現を抑えるために、次に、アンチ−ＲＢＳ部位の相補鎖を延長した核酸分子３及び４を作製した。
【００４５】
より長いアンチ−ＲＢＳ部位及びその隣接塩基からなる配列：5'-UUUCCUUUUU-3'（配列番号８）及び5'-AUAUUUCCUUUUU-3'（配列番号９）を含む核酸は、ＯＦＦ状態における発現を効率的に抑えたが、同時にＯＮ状態における発現量も低下し、ＯＮ／ＯＦＦ転換効率はそれぞれ４．４及び４．６と中程度に留まった。そこで、アンチ−ＲＢＳ二重鎖の中にミスマッチを導入した配列５：5'-UAUCACCUUUUU-3'（配列番号１０）を含む核酸を作製したところ、予想外にも極めて高いＯＮ／ＯＦＦ転換効率（７．２）を有することが分かった。
【００４６】
この最適化された二重鎖５を含む核酸分子を用いて、種々の濃度のテオフィリン又はカフェイン存在下でＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を図３に示した。カフェインはテオフィリンと比べてＮ７位にメチル基を有する以外は類似する構造を有するにもかかわらず、１ｍＭの濃度でＯＮ／ＯＦＦ転換効率がほぼ１であり、当該核酸分子が高い特異性（テオフィリン依存性及びテオフィリン直交性）を有することが示された。
【００４７】
鋳型ＤＮＡの代わりに鋳型ｍＲＮＡを用いて同様の実験を行った結果を図４に示す。これらの結果より、本核酸分子の活性は転写レベルではなくて翻訳レベルにおいて制御されていることが示唆される。また、ｍＲＮＡを用いた場合よりも鋳型ＤＮＡを用いた場合の方が効率が良い。
【００４８】
［実施例２］テオフィリン誘導アプタザイムとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とを用いた核酸分子（リボスイッチ）の作製と、これを用いたテオフィリンの検出
β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、約３０００ｂｐと非常に長いため、最初に前方部分と後方部分とに分けてＰＣＲを行い、続いてそれぞれの増幅断片を制限酵素ＡａｔＩＩで切断し、両方のＤＮＡ断片をライゲーションハイ（商品名、東洋紡）により連結した。下記プライマー配列中のＡａｔＩＩサイトを下線で示した。
【００４９】
前方部分
β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするプラスミドpSV-β-Galactosidaseと、以下のプライマー対とを用いて第一次ＰＣＲを行った。
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGGCGCTGTATGGCGAGATC-3'（配列番号１１）
逆方向プライマー：5'-GGATTAGTTATTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3'（配列番号１２）
【００５０】
引き続き、以下のそれぞれのプライマー対と、直前のＰＣＲ増幅産物とを用いて順に第二次、第三次、第四次、及び第五次ＰＣＲを行った。
第二次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTC-3'（配列番号１３）
逆方向プライマー：5'-GGATTAGTTATTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3'（配列番号１２）
第三次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-ACCCTGATGAGCCTGGATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGTTAGACGAAACAAGAAGGAGATATACCAATG-3'（配列番号１４）
逆方向プライマー：5'-GTTTATGCAGCAACGAGACGTCAC-3'（配列番号１５）
第四次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'- CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCC TCCTTTTTGTAGGTTGCCCGAAAGGGCGACCCTGATGAGCCTGG-3'（配列番号１６）
逆方向プライマー：5'- GTTTATGCAGCAACGAGACGTCAC-3'（配列番号１５）
第五次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'- CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCC TATCACCTTTTTGTAGGTTG-3'（配列番号１７）
逆方向プライマー：5'- GTTTATGCAGCAACGAGACGTCAC-3'（配列番号１５）
【００５１】
後方部分
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CATTTTCCGTGACGTCTCGTTG-3'（配列番号１８）
逆方向プライマー：5'-GGATTAGTTATTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3'（配列番号１９）
【００５２】
上記ＰＣＲにより増幅した前方部分と後方部分とを連結後、全長ＤＮＡを鋳型として、以下の最終プライマー対を用いてＰＣＲを行い、５’末端のＴ７プロモーターから転写されるテオフィリン依存性リボスイッチをコードする二本鎖ＤＮＡ断片を取得した。
【００５３】
最終的なＰＣＲ
正方向プライマー：5'-CTTAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3'（配列番号２０）
逆方向プライマー：5'-GGATTAGTTATTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3'（配列番号１９）
【００５４】
このようにして作製したテオフィリン誘導アプタザイムとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とを含む二本鎖ＤＮＡ（最適化されたＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を含む）を用いて、種々の濃度のテオフィリン存在下でＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を図５（Ａ）に示す。本測定方法においては、翻訳産物であるβ−ガラクトシダーゼが無色のオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を黄色のオルト−ニトロフェノールに加水分解するため酵素活性の発現を可視化することができる。実際に、インビトロにおける転写／翻訳共役反応（３７℃、１時間）の後、反応溶液にＯＮＰＧを添加してさらに数時間３７℃でインキュベートするだけで特殊な検出器を用いずにテオフィリンを可視的に検出することができた（図５（Ｂ））。１ｍＭ又は２ｍＭのテオフィリンに対するＯＮ／ＯＦＦ転換効率は、それぞれ２０及び４０であり、ルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合（約７及び９）に比べてより高い値を示した。その理由の一つとしては、大腸菌由来の酵素であるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に比べて、ルシフェラーゼ遺伝子がレアコドンを多く有していることが挙げられる。レアコドンとは、それに対応するｔＲＮＡ量が翻訳反応系において乏しいコドンをいう。このことは、翻訳反応系の条件を最適化することによって、さらに検出感度が向上する可能性を示唆する。
【００５５】
［実施例３］ｃＧＭＰ依存性アプタザイムとルシフェラーゼ遺伝子とを用いた核酸分子（リボスイッチ）の作製と、これを用いたｃＧＭＰの検出
ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpBESTlucと、以下のプライマー対とを用いて第一次ＰＣＲを行った。
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAG-3'（配列番号２１）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００５６】
引き続き、以下のそれぞれのプライマー対と、直前のＰＣＲ増幅産物とを用いて順に第二次、及び第三次ＰＣＲを行った。
第二次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CCTTTTTGTAGGTTGCCCGAAAGGGCGACCCTGATGAGCC CACCGATGGTGAAAGTGGCTGACGACCAATCGAAACAAGAAGGAGATATACCAATG-3'（配列番号２２）
第三次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCATATTTCCTTTTTGTAGGTTG-3'（配列番号２３）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００５７】
このようにして作製したｃＧＭＰ依存性アプタザイムの塩基配列の一部及びその推定二次構造を図６に示した。Breaker et al.によって報告されたｃＧＭＰ依存性アプタザイムは、実施例１で最適化されたアンチ−ＲＢＳ配列５と相補的な配列を含むため、まず最初に、当該リボザイムの活性を損なわないように塩基置換を行った変異体アプタザイムを合成した。しかしながら、この変異体アプタザイムもなお、正確なＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を形成するには不十分であったため、上述した表１のアンチ−ＲＢＳ配列４を用いたところ、アンチ−ＲＢＳ配列５を用いた場合よりもＯＮ／ＯＦＦ転換効率が高くなることが分かった。種々の濃度のｃＧＭＰ存在下においてルシフェラーゼアッセイを行い、ＯＮ／ＯＦＦ転換効率を調べた結果を図７に示す。１０ｍＭのｃＧＭＰ存在下において、約１０の高いＯＮ／ＯＦＦ転換効率を示した。この結果は、異なるアプタザイムを用いる場合においても、それぞれの目的分子に合わせて容易に本発明の核酸分子をデザインできることを示す。
【００５８】
［実施例４］インビボアッセイ
実施例１で作製したテオフィリン依存性アプタザイムを含む核酸分子を図８に示すプラスミドｐＥＴ１５ｂ＿５ＳＬ４ｍｉｓＬｕｃのＴＡＲ(Theophyline-Aptazyme-Riboswitch)領域にクローン化した。図８に示したように、本発明の機能性核酸分子はＴ７プロモーターの制御下において発現が調節される。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（ノバジェン、ラクトースオペロンの制御下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をゲノムに含む）に形質転換した。この形質転換大腸菌を一晩培養後、培養液で１／２０に希釈後、さらに３７℃で振とう培養し、培養液の６００ｎｍでの吸光度が約０．５に達したときに、最終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。また、最終濃度が０〜５ｍＭの種々の濃度となるようにテオフィリンを添加した。引き続き２３℃又は３７℃で１．５〜２．５時間培養を続け、菌体を回収して溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図９に示した。図９に示したように、２３℃で培養したときにテオフィリンの濃度依存的にＯＮ／ＯＦＦ転換効率が増加することが認められた。３７℃に比べて２３℃の方が効率が良い理由としては、アプタザイム活性の至適温度が２３℃付近であるから、及び低温の方が転写／翻訳反応の速度が遅くなり、細胞内で合成されたｍＲＮＡのＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖が形成し易くなるから、並びにアプタザイムによって切断されたｍＲＮＡの分解速度が遅くなるから等の理由が考えられる。また、培養液に５ｍＭのマグネシウムを添加したときの方が若干活性が上昇した。これらの結果より、本発明のリボスイッチを用いる目的分子の検出方法は、インビボにおいても適用可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明に係る核酸分子及びこれを用いる目的分子（コファクター）の検出方法の一実施形態を示した模式図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るテオフィリン依存性アプタザイムの構造を示した模式図である。
【図３】実施例１において、ＲＢＳ二重鎖５を用いて調製した本発明の核酸分子について、種々の濃度のテオフィリン又はカフェイン存在下におけるルシフェラーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を示す。
【図４】実施例１において、ＲＢＳ二重鎖５を用いて調製した本発明の核酸分子について、直接ｍＲＮＡを用いて反応した場合のルシフェラーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を示す。
【図５】実施例２において、ＲＢＳ二重鎖５を用いて調製した本発明の核酸分子について、種々の濃度のテオフィリン存在下におけるβ−ガラクトシダーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果（Ａ）、及びテオフィリンの非存在（−）及び存在（２ｍＭ）下におけるアッセイ溶液の写真を示す。
【図６】実施例３において調製したｃＧＭＰ依存性アプタザイムを含む本発明の核酸分子の塩基配列と推定二次構造を示した模式図である。
【図７】実施例３において、種々の濃度のｃＧＭＰ存在下におけるルシフェラーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を示す。
【図８】本発明に係る核酸分子をＴＡＲ領域に挿入したプラスミド構造を示した模式図である。
【図９】実施例４で調製した形質転換大腸菌を用いて、種々の濃度のテオフィリン存在下におけるルシフェラーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性核酸を用いた分子センサーに関し、より詳細には、目的分子との結合により自己切断酵素活性をもつ機能性核酸（アプタザイム）とレポーター遺伝子とを含む核酸分子を用いて、目的分子を検出する方法、及びこのような方法に用いる核酸分子等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、インビトロで選択されたＲＮＡアプタマー、又はＤＮＡアプタマーは、種々の分子に対するセンサーとして大きな注目を集めている。アプタマーは、目的とする有機分子、イオン、タンパク質、又は細胞等を特異的に認識することができる。この認識機構は、アプタマー分子内に存在するリン酸基や有機塩基の有する疎水性及び親水性の両方の性質によって形成されている。アプタマーがその目的分子と複合体を形成すると分子量の増加をもたらし、目的分子が大きい場合には、質量検出器によって直接検出することができる。また、いくつかのアプタマーは目的分子との結合により構造変化を起こす。このような構造変化と、蛍光的又は電気化学的方法とを組み合わせることにより、低分子量の目的分子でも検出することが可能である。ただし、その際は、アプタマーを直接的若しくは間接的に蛍光色素又は電気応答性物質で標識しなければならない。
【０００３】
「アプタザイム」又は「アロステリックリボザイム」と称される核酸は、特定の分子（コファクター）によってアロステリックに活性化される酵素機能を有し、センサーとして利用可能である。アプタザイムは、アプタマードメイン及びリボザイムドメインの両方を分子内に有し、コファクターとの複合体形成という信号を、例えば自己切断のようなより明確な触媒活性へ容易に伝達することができる。
【０００４】
例えば、国際公開公報ＷＯ０３／０１４３７５号パンフレット（特許文献１）には、アプタザイムを蛍光標識することによって、目的分子の結合を光学的に検出するシステムが開示されている。また、国際公開公報ＷＯ００／２６２２６号パンフレット（特許文献２）には、アプタザイムの５’末端を放射性同位元素である３２Ｐで標識して切断されたアプタザイムを検出する方法が開示されている。質量変化を測定する方法としては、アプタザイムを金表面に固定化し、特定の分子との結合によって誘起された酵素活性によるアプタザイムの質量変化を測定する方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００５】
一方、塩基配列の相同性に基づいてＤＮＡを検出する方法として、分子ビーコン法（例えば、非特許文献１参照）が知られている。この方法は、目的配列と相補的な配列をループドメインに有するヘアピン構造のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、例えば、５’末端及び３’末端に標識されたＦＲＥＴを検出する方法である。さらに、無細胞タンパク質合成系において、分子ビーコン型リボ核酸と連結したレポーター遺伝子の発現を指標として、目的とするＤＮＡを検出する方法が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、これらの方法は核酸配列の相補性に基づくため、ＤＮＡ等の核酸分子の検出に利用できるに過ぎず、低分子化合物やペプチド、タンパク質等の検出は不可能である。
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ０３／０１４３７５号パンフレット
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ００／２６２２６号パンフレット
【特許文献３】米国出願公開公報第２００４０１７５６９３号
【非特許文献１】Tyagi, S., Kramer, F.R., Nat. Biotechnol. 1996, Vol. 14, pp.303-308
【非特許文献２】Sando, S., Narita A., Abe, K., and Aoyama Y., J. Am. Chem. Soc., 2005, Vol.127, pp.5300-5301
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記従来技術によれば、アプタザイムを用いて目的分子を検出するためには、何れも蛍光物質や放射性同位元素等で標識する必要があり、そのための時間やコスト、さらには特殊な検出装置が必要になるという課題がある。また、これらの標識のために不安定なＲＮＡを直接用いなければならないという問題点もある。本発明は、特殊なプローブや検出機器を用いなくとも、目的分子の存在、濃度を簡便に検出し得る機能性核酸及びこれを用いて目的分子を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はかかる課題を解決するためになされたものであって、目的分子の存在下において自己切断触媒活性を示すアプタザイムと、タンパク質の翻訳段階におけるレポーター遺伝子の発現制御機構とを組み合わせることによって完成されたものである。
【０００９】
すなわち、第一の観点において、目的分子を検出するための本発明の機能性核酸分子は、（ａ）レポーター遺伝子配列、（ｂ）前記レポーター遺伝子配列と機能的に結合したリボソーム結合部位、（ｃ）前記リボソーム結合部位と分子内でハイブリダイズし得るアンチリボソーム結合部位、及び（ｄ）前記リボソーム結合部位とアンチリボソーム結合部位との間に連結されたアプタザイム配列、を含むことを特徴とする。目的分子の非存在下において、前記アンチリボソーム結合部位は、前記リボソーム結合部位とハイブリダイズして二重鎖を形成する。そして目的分子の存在下において、前記アプタザイムは自己切断触媒活性を示し、それによって前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離する。翻訳反応系が共存すると、当該核酸分子のリボソーム結合部位にリボソームが結合して翻訳が開始され、前記レポーター遺伝子が発現される。目的分子に対するアプタザイムを選択することによって所望の目的分子を検出することが可能であるが、検出対象としては、例えば、低分子化合物、ペプチド及びタンパク質等が挙げられる。
【００１０】
別の観点において、本発明は上記核酸分子をコードする二本鎖ＤＮＡであって、当該コード領域の上流に機能的に連結された転写プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡを提供する。転写プロモーター配列としては、用いる翻訳反応系において機能しうるものであれば特に限定されないが、強力なプロモーター活性を有する、ファージ由来のＴ７プロモーターが好ましい。
【００１１】
さらに異なる観点において、本発明は上記核酸分子を用いる目的分子の検出方法を提供する。当該検出方法は、上記核酸分子と、目的分子を含む試料とを、翻訳反応系内において所定の時間接触させる工程、及び前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、を含むことを特徴とする。前記核酸分子が二本鎖ＤＮＡの場合は、転写／翻訳共役反応系を用いることができる。
【００１２】
さらになお異なる観点において、本発明は、目的分子の検出のための本発明の核酸分子を含むキット、及び本発明の核酸分子によって形質転換された原核生物の細胞等を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、従来技術のように蛍光標識や放射性標識を行うことなく、且つ特殊な機器を用いなくとも目的分子を検出することが可能である。また、不安定であるＲＮＡを直接扱わなくても、より安定なＤＮＡをセンサー前駆体として用いることができる。本発明に係るＤＮＡには転写プロモーターが導入されており、用いる翻訳系にＲＮＡポリメラーゼを添加することによってＲＮＡを容易に合成できるからである。機能性ＲＮＡ自身をセンサーとして用いることも可能であるが、センサー前駆体であるＤＮＡを用いた方がより効率的であり感度も向上するという知見が得られている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（定義）
本明細書中で使用される用語「リボザイム」とは、酵素のような作用を有するＲＮＡのオリゴヌクレオチドであり「ＲＮＡ酵素」若しくは「核酸酵素」と呼ばれる場合もある。一般的に、これらはＲＮＡ分子の切断を触媒するエンドリボヌクレアーゼ作用を示す。切断部位の位置は高度に配列特異的である。リボザイムの中には、ポリメラーゼ又は脱リン酸化酵素のように作用するものもある。
【００１５】
用語「アプタマー」とは、標的リガンドに最適に結合するように特異的に選択される核酸をいう。標的リガンドとしては、増殖因子、酵素、受容体、膜タンパク質、ウイルスタンパク質等の種々のタンパク質が挙げられるが、金属イオンや分子量の小さい有機化合物、ペプチド、ウイルス等とも結合することが分かってきた。標的リガンドに特異的なアプタマーを探し出す方法としては、ＳＥＬＥＸ法（試験管内人工進化法 Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）(Tuerk, C., Gold, L., Science, 1990 Vol. 249, pp.505-510参照）が知られている。この方法は、標的とする目的分子に対し、ランダムな配列をもつ多数のオリゴヌクレオチドの混合物であるオリゴヌクレオチドライブラリを作用させることにより、親和性の高いオリゴヌクレオチドを選び出し、選び出されたオリゴヌクレオチドを増幅生産するという作業を繰り返す。これによって、標的とする目的分子に対し特異的に結合するオリゴヌクレオチドを得る方法である。
【００１６】
用語「アプタザイム」とは、エフェクターによって調節されるリボザイム又は核酸酵素を意味する。アプタザイムは、典型的にはエフェクターを認識するアプタマードメインと、触媒作用を示すリボザイムドメインを含む。エフェクターは、アプタマードメインとリボザイムドメインとの特異的な相互作用を通じてアプタザイムの触媒活性を高め、又は低下させることができる。従って、アプタザイムの活性はエフェクターの存在の有無やその量を監視するために用いられうる。この方法は、これまで種々の診断及び検出のためのアプタザイムセンサーを設計するために用いられている。アプタザイムの設計に用いる核酸分子としては、ＲＮＡ（リボザイム）、ＤＮＡ（デオキシリボザイム）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。一般的には、リボザイムはデオキシリボザイムよりも不安定である。種々のエフェクター分子、例えば、金属イオンや低分子化合物により調節されるアプタザイムの作製方法は公知であり（米国特許第６６３０３０６号等参照）、その内容は参照により本願に組み込まれる。
【００１７】
（機能性核酸分子）
以下に図面を参照しながら本発明の機能性核酸分子について説明する。図１は、本発明の好ましい実施形態における機能性核酸分子を模式的に表したものである。図１上部の二本鎖鋳型ＤＮＡは、Ｔ７プロモーターの制御下において、レポーター遺伝子をコードする。レポーター遺伝子上流には、５’末端から順に、ステム−ループ構造、アンチ−リボソーム結合部位（アンチ−ＲＢＳ）、アプタザイム配列、及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞タンパク質合成系においてこの鋳型ＤＮＡが転写されると、アンチ−ＲＢＳはＲＢＳとハイブリダイズしてリボソームがＲＢＳに結合することを阻害する（左下部のＯＦＦ状態）。ｍＲＮＡの５’末端側（領域）に存在するステム−ループ構造は転写産物を安定化し、同時にアンチ−ＲＢＳが正確にＲＢＳと結合して二重鎖を形成するために有用である。このようなステム−ループ構造は、少なくとも１０塩基長程度の長さがあればよく、好ましくは１０〜２００塩基長、より好ましくは１３〜１００塩基長、さらに好ましくは１７〜５０塩基長程度である。アプタザイムに対するコファクターの存在下では、（Ｉ）アプタザイムが立体構造の変化を起こし、（ＩＩ）これによって自己切断活性を誘導する。一般的に分子間で形成された二重鎖の融解温度（Ｔｍ）は、分子内二重鎖の融解温度よりも低いため、（ＩＩＩ）所定の条件下において切断されたアンチ−ＲＢＳドメインがＲＢＳから解離する。これによってリボソームがＲＢＳに接触可能となり、下流のレポーター遺伝子の発現が活性化される（右下部のＯＮ状態）。
【００１８】
ここで、転写プロモーターとしては、反応系において転写されるプロモーターであれば特に限定されないが、強力なプロモーターであるＴ７プロモーターが好ましい。また、レポーター遺伝子も翻訳系において検出可能なものであれば何れも使用可能できるが、検出が容易で感度が高いものとして、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子等が好ましい。
【００１９】
アプタザイム配列としては、目的分子によって調節可能な核酸酵素であれば特に限定されないが、好ましくは、目的分子としてテオフィリンのような低分子によってリボザイム活性が調節されるアプタザイムが用いられる。Breakerらによって試験管内で選択されたテオフィリン依存性アプタザイムが報告されている(Soukup, G. A., Emilsson, G.A.M., Breaker, R.R., J. Mol. Biol., 2000, Vol.298, pp.623-)。このアプタザイムは、図２（ａ）に示したように、アプタマードメイン、伝達モジュール、及びハンマーヘッドリボザイムの３つのドメインからなっている。コファクターであるテオフィリンがアプタマードメインに結合することによってリボザイムドメインの立体構造が変化し、ヘリックスＡとヘリックスＢの間の切断部位（矢印で示す）における自己切断活性を誘導する。この自己切断活性の発現に必要な切断部位に隣接するＧＵＡトリプレット配列に下線を付加した。このＧＵＡトリプレット以外の２つのヘリックスＡ及びヘリックスＢの配列は、当該アプタザイムの酵素活性とは関係ないことが知られているため、上記ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖をこれら２つのヘリックス構造の何れかと置換した核酸分子を作製した。ヘリックスＡの代わりにＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を挿入した場合は、アプタザイム配列とＲＢＳの間が切断されるため５’末端からＲＢＳまでの配列が短くなり（図２（ｂ）右上挿入図参照）効率的な翻訳が起こらなかった。一方、ヘリックスＢに上記ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を挿入した核酸分子では、アプタザイム配列とアンチ−ＲＢＳの間が切断されるため５’末端からＲＢＳまでの配列が長く（図２（ｂ）参照）効率的な翻訳が起こった。さらにこの場合、切断後のｍＲＮＡの５’末端側にステム−ループ構造（ヘリックスＡ）が存在するため、ｍＲＮＡが安定であることも利点としてあげられる。
【００２０】
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、ｍＲＮＡの翻訳開始コドン近傍にあり、リボソームの１６ｓｒＲＮＡ分子の３’末端近くにある配列と塩基対を形成してリボソーム小サブユニットと結合するために必要な配列である。大腸菌のｍＲＮＡのリボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ配列とも呼ばれる。この配列はプリンを多く含んでいるという傾向はあるものの、１６ｓｒＲＮＡと完全に相補的な配列となることはあまりなく、また長さも３塩基から９塩基程度である。ｍＲＮＡのＲＢＳに結合したリボソーム小サブユニットは遺伝子の開始コドン（ＡＵＧ：メチオニンに該当）までｍＲＮＡ上を移動し、メチオニン−ｔＲＮＡが開始コドンに結合して３０ｓ開始複合体を形成する。シャイン−ダルガルノ配列と翻訳開始コドンとの距離は、翻訳の効率と関連性のあることが知られ、最適距離は４塩基から９塩基であると推定されている。ｍＲＮＡ上において、このＲＢＳが強固に二重鎖を形成しているとリボソームがＲＢＳに接触できないため翻訳が開始されない。
【００２１】
アンチリボソーム結合部位（アンチ−ＲＢＳ）は、上記ＲＢＳと分子内でハイブリダイズし得るものであれば特に限定されないが、目的分子の存在又は非存在下においてのＯＮ／ＯＦＦ転換効率が向上するように最適化されることが好ましい。具体的には、目的分子の非存在下では分子内でＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖が安定に形成されるが、目的分子の存在下では自己切断により前記二重鎖が解離しやすいことである。一般的に分子間で形成される核酸配列二重鎖の融解温度（Ｔｍ）は、分子内二重鎖の融解温度よりも低いことが知られている。ＤＮＡやＲＮＡのＴｍ値の計算は、種々のコンピューターソフトウェアを用いて行うことができる。最も正確なＴｍ値の推定ソフトウェアの一つとして、例えば、ＨｙＴｈｅｒ（商標）が知られており、オンライン上で使用可能である(http://ozone3.chem.wayne.edu/)。Ｔｍでは、二本鎖状態の核酸と一本鎖状態の核酸が同率比で存在しており、Ｔｍ以上では、ほとんどがハイブリダイズできずに一本鎖状態になっていると考えられる。
【００２２】
本発明に係る核酸分子は、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡの何れでもよいが、２０〜４０℃の水溶液中において分子内で会合し、ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を含むステム−ループ構造を形成する一本鎖ＲＮＡであることが好ましい。さらに好ましくは、上記ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖のＴｍは反応溶液温度程度か、それ以下である。従って、好ましい実施形態において、上記ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖は、当該ＲＢＳと、アンチ−ＲＢＳと、それらの隣接配列とによって形成され、その二重鎖の長さは６〜２０塩基対である。より好ましくは８〜１５塩基対である。当該二重鎖にはＧ−Ｕペア、又は１〜数個のミスマッチを含んでもよい。
【００２３】
（レポーター遺伝子）
本発明において用いられるレポーター遺伝子は、翻訳反応系において発現し検出が容易なものであれば特に限定されないが、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びエクオリン等の遺伝子を挙げることができる。ホタルルシフェラーゼはＡＴＰの存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、光子を生成する化学ルミネッセンス反応を触媒する。ルシフェラーゼは単量体のタンパク質で翻訳後の修飾を必要としないから、遺伝子発現のレポーターとして適している。大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）は種々の細胞の形質転換におけるレポーター遺伝子としてよく使用される。この酵素の生体内での基質はラクトースであるが、ほぼあらゆるβ−ガラクトシドを加水分解することができ、例えば、無色の基質であるオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を加水分解して４２０ｎｍの光を吸収する黄色のオルト−ニトロフェノールを生成する。また、ｘ−ｇａｌはこの酵素により分解されてインディゴブルーの呈色反応を示す。アルカリフォスファターゼは、分子触媒活性の極めて高い酵素であり、種々の蛍光及び発光基質も開発されているため高感度検出に好適である。ＧＦＰはオワンクラゲ(Aequorea Victoria)等から発見された蛍光タンパク質であり、共存する発光タンパク質であるエクオリンの青色化学発光をエネルギー変換して緑色にすることが知られている。このＧＦＰは上記ルシフェラーゼやエクオリンのように特殊な蛍光団を必要とせず、自らアポタンパク質上で自動的に蛍光団を形成する。このため、クローン化されたＧＦＰのｃＤＮＡを用いて多くの細菌や動物細胞等で発現され、遺伝子発現の指標として利用されている。また、ＧＦＰ遺伝子に種々の突然変異を導入して多くのＧＦＰ誘導体が作製され、これらの中には野生型ＧＦＰよりも強い蛍光強度を示したり、異なる波長の蛍光を発する誘導体もあることが報告されている。
【００２４】
（目的分子又はコファクター）
本発明の方法において検出可能な目的分子としては、アプタザイムのコファクターとなりうるもので、かつ翻訳反応を阻害しないものであれば特に限定されないが、例えば、低分子化合物、細菌又はウイルス由来の抗原タンパク質、毒物分子、コカイン、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びＨＩＶ−由来分子などを含む。
【００２５】
また、本発明の別の観点において、上記レポーター遺伝子に代えて所望の遺伝子を挿入した核酸分子は、原核生物の翻訳反応系において上記目的分子又はコファクターに相当するリガンド分子による遺伝子発現制御システムとして利用することもできる。すなわち、リガンド分子の非存在下ではアンチ−ＲＢＳがＲＢＳに結合して当該所望の遺伝子の発現を抑制し、リガンド分子を添加することによって、前記アプタザイムが自己切断触媒活性を示し、それによって前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離する。その結果、前記所望の遺伝子の発現を誘導しうるのである。
【００２６】
（目的分子の検出方法）
本発明の検出方法は、無細胞タンパク質合成系において、目的分子を含む試料と本発明の機能性核酸分子を所定の時間接触させることにより、目的分子の濃度に応じて発現するレポーター遺伝子の活性を測定する工程を含む。用いる機能性核酸分子としては、ＲＮＡ及びこれをコードする鋳型ＤＮＡの何れでもよいが、検出感度及び取扱いの容易さの観点から二本鎖鋳型ＤＮＡを用いることが好ましい。ＤＮＡはＲＮＡに比べて酵素的に分解されにくく安定に存在するからである。これらの核酸分子を調製する方法は、化学合成法、ＰＣＲ、ＤＮＡのクローン化と複製、その他の公知技術を用いることができる。鋳型ＤＮＡとしてはＰＣＲにより合成した増幅産物をそのまま用いることができるが、好ましくはプラスミドなどにクローン化し、組換え体を用いて大量に調製及び精製したＤＮＡの方が検出感度に優れる。ＲＮＡの場合は、無細胞系として翻訳反応系を用いるが、二本鎖鋳型ＤＮＡの場合は転写／翻訳共役反応系を用いる必要がある。このような無細胞系としては、大腸菌由来のもの、コムギ胚芽由来のもの、ウサギ網状赤血球由来のものが市販されているが、大腸菌等の原核細胞由来の抽出液が好ましい。大腸菌の抽出液では、転写、翻訳の共役反応によりＤＮＡからタンパク質を合成できることが知られ、例えば、ズベイらによって大腸菌のＳ３０抽出液を用いる方法が系統的に開発されている（例えば、ジェフリー・ズベイ(Geoffrey Zubay)、「アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Annual Review of Genetics）」１９７３年、第７巻、ｐ．２６７−２８７参照）。Ｓ３０抽出液には、ｍＲＮＡの翻訳に必要なリボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ポリペプチド鎖開始因子（ＩＦ）、同伸長因子（ＥＦ）及び同終結因子が含まれている。合成タンパク質の鋳型としてＤＮＡを用いる場合は、強力なプロモーター（一般的にはＴ７プロモーター）の下流に目的タンパク質遺伝子を配置したＤＮＡが用いられ、転写と翻訳の両反応を共役させるために、系内にＴ７ＲＮＡポリメラーゼと４種類のリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ）を添加する。アミノアシルｔＲＮＡの合成、及びｍＲＮＡの翻訳反応にはＡＴＰのエネルギーが必要であることから、クレアチンキナーゼ−クレアチンリン酸系等のエネルギー再生系を無細胞系に加える。このような構成成分により、細胞内で起こるタンパク質合成反応を試験管内で再構成している。
【００２７】
大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいるが、更に補充的な混合液を添加することができる。具体的な調製方法としては、まず最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡ、ＲＮＡが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は−８０℃にて保存する。
【００２８】
転写、翻訳及びエネルギー再生に必要な全てのタンパク質因子にタグを付けて別々に調製し、これらを再構成した無細胞タンパク質合成系も知られている。これらのタンパク質因子に大腸菌７０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＮＴＰ等の転写、翻訳に必要な成分を添加したキットも販売されている。
【００２９】
（検出キット）
本発明の方法に用いるために上記方法により調製された核酸分子、及び大腸菌の細胞抽出液等の無細胞翻訳反応試薬は、使用しやすいように一定量ごと分注して、目的分子の検出キットとして配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書や陽性コントロールサンプル等を添付することができる。
【００３０】
（バイオセンサー）
本発明はまた、上記核酸分子によって形質転換された原核細胞からなるバイオセンサーに関する。特に、本発明の二本鎖ＤＮＡからなる核酸分子は安定であり、プラスミドＤＮＡとして種々の原核細胞で安定に存在しうる。或いは、本発明の二本鎖ＤＮＡを支持体に固定化したバイオセンサーを用いてもよい。
【００３１】
以下に具体的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
［実験材料及び方法］
１ 鋳型ＤＮＡの調製
ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpBESTluc、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするプラスミドpSV-β-Galactosidaseは、プロメガ社から購入した。本実施例で用いた全ての鋳型ＤＮＡは、以下に説明するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びβ−ガラクトシダーゼ用の鋳型の調製については、これに続いて連結反応により調製した。ＰＣＲは、２０μＬの反応混合液中、４ｐｍｏｌの正方向プライマー、４ｐｍｏｌの逆方向プライマー、０．５ユニットのPrimeSTAR HS ＤＮＡポリメラーゼ（商品名、タカラバイオ社）、それぞれ４ｎｍｏｌのｄＮＴＰｓ（タカラバイオ社）、及び４μＬの５倍濃度PrimeSTAR反応用緩衝液を含み、第一次ＰＣＲ用には２００ｐｇのpBESTluc又はpSV-β-Galactosidaseを、第二次以降のＰＣＲ用には約２０ｆｍｏｌの精製したＰＣＲ産物を鋳型として用いた。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いて精製し、２６０ｎｍの吸光度を測定して定量した。
【００３３】
２ 鋳型ＤＮＡのインビトロにおける転写／翻訳共役反応
インビトロにおける転写／翻訳反応は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む再構成された無細胞翻訳システム（ピュアシステム、クラシックＩＩ、ポストゲノム研究所）を用いて行った。約０．１μｇの鋳型ＤＮＡを含む１０μＬの反応溶液を、種々の濃度のテオフィリン、カフェイン又はｃＧＭＰの存在下又は非存在下において、３７℃で１時間インキュベートした。反応終了後の翻訳溶液はさらに精製することなく次のアッセイに用いた。
【００３４】
３ ｍＲＮＡ鋳型の調製
鋳型ＤＮＡのインビトロ転写反応は、MEGAscript T7 Kit（商品名、アンビオン）を用いて行った。０．３μｇの鋳型ＤＮＡを含む１０μｌの反応溶液を３７℃で４．５時間インキュベートした。当該キットに添付されているTURBO DNaseを１ユニット添加した後、さらに１５分間３７℃でインキュベートした。転写産物は、RNeasy MinElute Cleanup Kit（商品名、キアゲン）を用いて精製し、上述と同様の方法で定量した。
【００３５】
４ ｍＲＮＡ鋳型のインビトロ翻訳反応
インビトロ翻訳反応は、ピュアシステム、クラシックＩＩを用いて行った。約１μｇのｍＲＮＡを含む１０μｌの反応溶液を、種々の濃度のコファクター（テオフィリン）の存在又は非存在下で３７℃、１時間インキュベートした。生成した翻訳産物を含む溶液は精製せずに次のアッセイに用いた。
【００３６】
５ ルシフェラーゼアッセイ
翻訳溶液と水を等量含む５μｌの混合物を１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ）と混合した。化学発光強度の測定は、ワラック社の１４２０ＡＲＶＯｓｘ装置により、黒色９６穴プレート（コーニングコースター３９１５）を用いて行った。化学発光の映像はクールセイバーＡＥ−６９５５（アトー）により取得した。
【００３７】
６ β−ガラクトシダーゼアッセイ
１０μｌの翻訳溶液を、４０μｌの１×レポーターリシスバッファー（プロメガ）、及び５０μｌのオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を含む２×アッセイバッファー（プロメガ社のβ−ガラクトシダーゼアッセイシステム）と混合した。混合溶液は３７℃にて３時間インキュベートした。この反応溶液の４０５ｎｍにおける吸光度をワラック社の１４２０ＡＲＶＯｓｘ装置により、透明の９６穴プレート（コーニングコースター３６３５）を用いて測定した。β−ガラクトシダーゼを含まない（鋳型なしの翻訳溶液）バックグラウンド強度をそれぞれの測定データから差し引いた。
【００３８】
［実施例１］テオフィリン誘導アプタザイムとルシフェラーゼ遺伝子とを用いた核酸分子（リボスイッチ）の作製と、これを用いたテオフィリンの検出
ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpBESTlucと、以下のプライマー対とを用いて第一次ＰＣＲを行った。
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAG-3'（配列番号１）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００３９】
引き続き、以下のそれぞれのプライマー対と、直前のＰＣＲ増幅産物とを用いて順に第二次、第三次、及び第四次ＰＣＲを行った。
第二次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-ACCCTGATGAGCCTGGATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGTTAGACGAAACAAGAAGGAGATATACCAATG-3'（配列番号３）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
第三次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTTTTTGTAGGTTGCCCGAAAGGGCGACCCTGATGAGCCTGG-3'（配列番号４）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
第四次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTATCACCTTTTTGTAGGTTG-3'（配列番号５）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００４０】
第三次ＰＣＲによって増幅された二本鎖ＤＮＡは、５’末端のＴ７プロモーターから転写されるテオフィリン依存性アプタザイムとルシフェラーゼをコードしており、ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳによって形成される二重鎖は、表１の二重鎖２の配列を有する。また、第四次ＰＣＲによって増幅された二本鎖ＤＮＡは、同様に５’末端のＴ７プロモーターから転写されるテオフィリン依存性アプタザイムとルシフェラーゼをコードしており、ＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖は、表１の二重鎖５の配列を有する（全体配列を配列番号２４に示す）。
【００４１】
対照実験に用いるための通常の５’非翻訳領域（Ｔ７ファージのｇ１０リーダー配列）を有する鋳型ＤＮＡは、以下のプライマー対を用いて増幅した。
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAG-3'（配列番号６）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
第二次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3'（配列番号７）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００４２】
このようにして、種々の塩基配列及び長さのＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を有する核酸分子を作製し、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として翻訳のＯＮ／ＯＦＦ転換効率を調べた。ＯＮ／ＯＦＦ転換効率とは、ここではテオフィリンの非存在下（ＯＦＦ）に対する存在下（ＯＮ）における翻訳されたルシフェラーゼ活性として規定される。その結果を下記の表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
ハンマーヘッド型リボザイムの触媒活性を維持する上で、切断部位の上流に隣接するＧＵＡのトリプレット塩基が不可欠であることが分かっているため、このＧＵＡトリプレットに隣接して直接ＲＢＳを結合した核酸分子を作製した（表１の二重鎖１）。この核酸分子１のテオフィリン１ｍＭの場合のＯＮ／ＯＦＦ転換効率は、表１に示したように約２．２倍であった。テオフィリン存在下（ＯＮ状態）でのルシフェラーゼ活性は５７０８ｃｐｓであり、タンパク質大量合成のために一般的に用いられる５’−非翻訳領域（Ｔ７ファージのｇ１０リーダー配列）を有する鋳型から転写される場合（１０００００ｃｐｓ以上）と比べて極めて小さいことが分かった。そこで、ＲＢＳ配列の５’側に、Ｔ７ファージのｇ１０リーダー配列と同じ３つのプリン塩基ＡＡＧを挿入した一連の核酸分子２〜５を作製した。このようにして作製した核酸分子２は、ＯＮ状態において約６倍のルシフェラーゼ活性を示したが、ＯＮ／ＯＦＦ転換効率は、わずかに１．７倍上昇したに過ぎなかった。これはＯＦＦ状態においても活性が上昇したことに起因する。テオフィリン非存在下（ＯＦＦ状態）における発現を抑えるために、次に、アンチ−ＲＢＳ部位の相補鎖を延長した核酸分子３及び４を作製した。
【００４５】
より長いアンチ−ＲＢＳ部位及びその隣接塩基からなる配列：5'-UUUCCUUUUU-3'（配列番号８）及び5'-AUAUUUCCUUUUU-3'（配列番号９）を含む核酸は、ＯＦＦ状態における発現を効率的に抑えたが、同時にＯＮ状態における発現量も低下し、ＯＮ／ＯＦＦ転換効率はそれぞれ４．４及び４．６と中程度に留まった。そこで、アンチ−ＲＢＳ二重鎖の中にミスマッチを導入した配列５：5'-UAUCACCUUUUU-3'（配列番号１０）を含む核酸を作製したところ、予想外にも極めて高いＯＮ／ＯＦＦ転換効率（７．２）を有することが分かった。
【００４６】
この最適化された二重鎖５を含む核酸分子を用いて、種々の濃度のテオフィリン又はカフェイン存在下でＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を図３に示した。カフェインはテオフィリンと比べてＮ７位にメチル基を有する以外は類似する構造を有するにもかかわらず、１ｍＭの濃度でＯＮ／ＯＦＦ転換効率がほぼ１であり、当該核酸分子が高い特異性（テオフィリン依存性及びテオフィリン直交性）を有することが示された。
【００４７】
鋳型ＤＮＡの代わりに鋳型ｍＲＮＡを用いて同様の実験を行った結果を図４に示す。これらの結果より、本核酸分子の活性は転写レベルではなくて翻訳レベルにおいて制御されていることが示唆される。また、ｍＲＮＡを用いた場合よりも鋳型ＤＮＡを用いた場合の方が効率が良い。
【００４８】
［実施例２］テオフィリン誘導アプタザイムとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とを用いた核酸分子（リボスイッチ）の作製と、これを用いたテオフィリンの検出
β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、約３０００ｂｐと非常に長いため、最初に前方部分と後方部分とに分けてＰＣＲを行い、続いてそれぞれの増幅断片を制限酵素ＡａｔＩＩで切断し、両方のＤＮＡ断片をライゲーションハイ（商品名、東洋紡）により連結した。下記プライマー配列中のＡａｔＩＩサイトを下線で示した。
【００４９】
前方部分
β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするプラスミドpSV-β-Galactosidaseと、以下のプライマー対とを用いて第一次ＰＣＲを行った。
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGGCGCTGTATGGCGAGATC-3'（配列番号１１）
逆方向プライマー：5'-GGATTAGTTATTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3'（配列番号１２）
【００５０】
引き続き、以下のそれぞれのプライマー対と、直前のＰＣＲ増幅産物とを用いて順に第二次、第三次、第四次、及び第五次ＰＣＲを行った。
第二次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTC-3'（配列番号１３）
逆方向プライマー：5'-GGATTAGTTATTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3'（配列番号１２）
第三次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-ACCCTGATGAGCCTGGATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGTTAGACGAAACAAGAAGGAGATATACCAATG-3'（配列番号１４）
逆方向プライマー：5'-GTTTATGCAGCAACGAGACGTCAC-3'（配列番号１５）
第四次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'- CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCC TCCTTTTTGTAGGTTGCCCGAAAGGGCGACCCTGATGAGCCTGG-3'（配列番号１６）
逆方向プライマー：5'- GTTTATGCAGCAACGAGACGTCAC-3'（配列番号１５）
第五次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'- CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCC TATCACCTTTTTGTAGGTTG-3'（配列番号１７）
逆方向プライマー：5'- GTTTATGCAGCAACGAGACGTCAC-3'（配列番号１５）
【００５１】
後方部分
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CATTTTCCGTGACGTCTCGTTG-3'（配列番号１８）
逆方向プライマー：5'-GGATTAGTTATTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3'（配列番号１９）
【００５２】
上記ＰＣＲにより増幅した前方部分と後方部分とを連結後、全長ＤＮＡを鋳型として、以下の最終プライマー対を用いてＰＣＲを行い、５’末端のＴ７プロモーターから転写されるテオフィリン依存性リボスイッチをコードする二本鎖ＤＮＡ断片を取得した。
【００５３】
最終的なＰＣＲ
正方向プライマー：5'-CTTAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3'（配列番号２０）
逆方向プライマー：5'-GGATTAGTTATTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3'（配列番号１９）
【００５４】
このようにして作製したテオフィリン誘導アプタザイムとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とを含む二本鎖ＤＮＡ（最適化されたＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を含む）を用いて、種々の濃度のテオフィリン存在下でＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を図５（Ａ）に示す。本測定方法においては、翻訳産物であるβ−ガラクトシダーゼが無色のオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を黄色のオルト−ニトロフェノールに加水分解するため酵素活性の発現を可視化することができる。実際に、インビトロにおける転写／翻訳共役反応（３７℃、１時間）の後、反応溶液にＯＮＰＧを添加してさらに数時間３７℃でインキュベートするだけで特殊な検出器を用いずにテオフィリンを可視的に検出することができた（図５（Ｂ））。１ｍＭ又は２ｍＭのテオフィリンに対するＯＮ／ＯＦＦ転換効率は、それぞれ２０及び４０であり、ルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合（約７及び９）に比べてより高い値を示した。その理由の一つとしては、大腸菌由来の酵素であるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に比べて、ルシフェラーゼ遺伝子がレアコドンを多く有していることが挙げられる。レアコドンとは、それに対応するｔＲＮＡ量が翻訳反応系において乏しいコドンをいう。このことは、翻訳反応系の条件を最適化することによって、さらに検出感度が向上する可能性を示唆する。
【００５５】
［実施例３］ｃＧＭＰ依存性アプタザイムとルシフェラーゼ遺伝子とを用いた核酸分子（リボスイッチ）の作製と、これを用いたｃＧＭＰの検出
ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpBESTlucと、以下のプライマー対とを用いて第一次ＰＣＲを行った。
第一次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-AGGAGATATACCAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAG-3'（配列番号２１）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００５６】
引き続き、以下のそれぞれのプライマー対と、直前のＰＣＲ増幅産物とを用いて順に第二次、及び第三次ＰＣＲを行った。
第二次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CCTTTTTGTAGGTTGCCCGAAAGGGCGACCCTGATGAGCC CACCGATGGTGAAAGTGGCTGACGACCAATCGAAACAAGAAGGAGATATACCAATG-3'（配列番号２２）
第三次ＰＣＲ用
正方向プライマー：5'-CTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCATATTTCCTTTTTGTAGGTTG-3'（配列番号２３）
逆方向プライマー：5'-TATTCATTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG-3'（配列番号２）
【００５７】
このようにして作製したｃＧＭＰ依存性アプタザイムの塩基配列の一部及びその推定二次構造を図６に示した。Breaker et al.によって報告されたｃＧＭＰ依存性アプタザイムは、実施例１で最適化されたアンチ−ＲＢＳ配列５と相補的な配列を含むため、まず最初に、当該リボザイムの活性を損なわないように塩基置換を行った変異体アプタザイムを合成した。しかしながら、この変異体アプタザイムもなお、正確なＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖を形成するには不十分であったため、上述した表１のアンチ−ＲＢＳ配列４を用いたところ、アンチ−ＲＢＳ配列５を用いた場合よりもＯＮ／ＯＦＦ転換効率が高くなることが分かった。種々の濃度のｃＧＭＰ存在下においてルシフェラーゼアッセイを行い、ＯＮ／ＯＦＦ転換効率を調べた結果を図７に示す。１０ｍＭのｃＧＭＰ存在下において、約１０の高いＯＮ／ＯＦＦ転換効率を示した。この結果は、異なるアプタザイムを用いる場合においても、それぞれの目的分子に合わせて容易に本発明の核酸分子をデザインできることを示す。
【００５８】
［実施例４］インビボアッセイ
実施例１で作製したテオフィリン依存性アプタザイムを含む核酸分子を図８に示すプラスミドｐＥＴ１５ｂ＿５ＳＬ４ｍｉｓＬｕｃのＴＡＲ(Theophyline-Aptazyme-Riboswitch)領域にクローン化した。図８に示したように、本発明の機能性核酸分子はＴ７プロモーターの制御下において発現が調節される。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（ノバジェン、ラクトースオペロンの制御下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をゲノムに含む）に形質転換した。この形質転換大腸菌を一晩培養後、培養液で１／２０に希釈後、さらに３７℃で振とう培養し、培養液の６００ｎｍでの吸光度が約０．５に達したときに、最終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。また、最終濃度が０〜５ｍＭの種々の濃度となるようにテオフィリンを添加した。引き続き２３℃又は３７℃で１．５〜２．５時間培養を続け、菌体を回収して溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図９に示した。図９に示したように、２３℃で培養したときにテオフィリンの濃度依存的にＯＮ／ＯＦＦ転換効率が増加することが認められた。３７℃に比べて２３℃の方が効率が良い理由としては、アプタザイム活性の至適温度が２３℃付近であるから、及び低温の方が転写／翻訳反応の速度が遅くなり、細胞内で合成されたｍＲＮＡのＲＢＳ／アンチ−ＲＢＳ二重鎖が形成し易くなるから、並びにアプタザイムによって切断されたｍＲＮＡの分解速度が遅くなるから等の理由が考えられる。また、培養液に５ｍＭのマグネシウムを添加したときの方が若干活性が上昇した。これらの結果より、本発明のリボスイッチを用いる目的分子の検出方法は、インビボにおいても適用可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明に係る核酸分子及びこれを用いる目的分子（コファクター）の検出方法の一実施形態を示した模式図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るテオフィリン依存性アプタザイムの構造を示した模式図である。
【図３】実施例１において、ＲＢＳ二重鎖５を用いて調製した本発明の核酸分子について、種々の濃度のテオフィリン又はカフェイン存在下におけるルシフェラーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を示す。
【図４】実施例１において、ＲＢＳ二重鎖５を用いて調製した本発明の核酸分子について、直接ｍＲＮＡを用いて反応した場合のルシフェラーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を示す。
【図５】実施例２において、ＲＢＳ二重鎖５を用いて調製した本発明の核酸分子について、種々の濃度のテオフィリン存在下におけるβ−ガラクトシダーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果（Ａ）、及びテオフィリンの非存在（−）及び存在（２ｍＭ）下におけるアッセイ溶液の写真を示す。
【図６】実施例３において調製したｃＧＭＰ依存性アプタザイムを含む本発明の核酸分子の塩基配列と推定二次構造を示した模式図である。
【図７】実施例３において、種々の濃度のｃＧＭＰ存在下におけるルシフェラーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を示す。
【図８】本発明に係る核酸分子をＴＡＲ領域に挿入したプラスミド構造を示した模式図である。
【図９】実施例４で調製した形質転換大腸菌を用いて、種々の濃度のテオフィリン存在下におけるルシフェラーゼアッセイのＯＮ／ＯＦＦ転換効率を測定した結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的分子を検出するための核酸分子であって、
（ａ）レポーター遺伝子配列、
（ｂ）前記レポーター遺伝子配列と機能的に結合したリボソーム結合部位、
（ｃ）前記リボソーム結合部位と分子内でハイブリダイズし得るアンチリボソーム結合部位、及び
（ｄ）前記リボソーム結合部位とアンチリボソーム結合部位との間に連結されたアプタザイム配列、を含み、
目的分子の非存在下において、前記アンチリボソーム結合部位は、前記リボソーム結合部位とハイブリダイズして二重鎖を形成し、そして
目的分子の存在下において、前記アプタザイムは自己切断触媒活性を示し、前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離することを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が一本鎖ＲＮＡからなり、前記二重鎖を含むステム−ループ構造を形成することを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ステム−ループ構造は、２０〜４０℃の温度の水溶液中において前記一本鎖ＲＮＡが分子内で会合することにより形成されることを特徴とする請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記アプタザイム配列が、目的分子と結合するアプタマー領域と、触媒活性を有するリボザイム領域と、を含み、前記目的分子がアプタマー領域と結合したとき、リボザイム領域の構造変化を引き起こして前記自己切断触媒活性を示すことを特徴とする請求項１〜３何れか記載の核酸分子。
【請求項５】
前記自己切断部位が、アプタザイム配列とアンチリボソーム結合部位との間に位置することを特徴とする請求項１〜４何れか記載の核酸分子。
【請求項６】
前記リボソーム結合部位と、アンチリボソーム結合部位と、それらの隣接配列とによって分子内で形成される二重鎖が、６〜２０塩基対の長さを有することを特徴とする請求項１〜５何れか記載の核酸分子。
【請求項７】
前記アンチリボソーム結合部位の５’側に、少なくとも１０塩基長のステム−ループ構造を形成しうる配列を含むことを特徴とする請求項１〜６何れか記載の核酸分子。
【請求項８】
前記アンチリボソーム結合部位及びその隣接塩基が、配列番号９又は１０で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜７何れか記載の核酸分子。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求項１〜８何れか記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜９何れか記載の核酸分子をコードする二本鎖ＤＮＡであって、当該コード領域の上流に機能的に連結された転写プロモーター配列を含むことを特徴とする二本鎖ＤＮＡ。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜９何れか記載の核酸分子と、目的分子を含む試料とを、翻訳反応系内において所定の時間接触させる工程、及び
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
を含むことを特徴とする目的分子の検出方法。
【請求項１２】
（ａ）請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡと、目的分子を含む試料とを、転写／翻訳共役反応系内において所定の時間接触させる工程、及び
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
を含むことを特徴とする目的分子の検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜９何れか記載の核酸分子と、無細胞翻訳反応試薬とを含むことを特徴とする目的分子の検出キット。
【請求項１４】
請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡと、無細胞転写／翻訳共役反応試薬とを含むことを特徴とする目的分子の検出キット。
【請求項１５】
請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡによって形質転換された組換え原核細胞。
【請求項１６】
原核生物の翻訳反応系においてリガンド分子の添加によって遺伝子発現を誘導し得る核酸分子であって、
（ａ）所望の遺伝子配列、
（ｂ）前記遺伝子配列と機能的に結合したリボソーム結合部位、
（ｃ）前記リボソーム結合部位と分子内でハイブリダイズし得るアンチリボソーム結合部位、及び
（ｄ）前記リボソーム結合部位とアンチリボソーム結合部位との間に連結されたアプタザイム配列、を含み、
前記アプタザイムがリガンドの存在下において自己切断触媒活性を示し、前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離することを特徴とする核酸分子。
【請求項１】
目的分子を検出するための核酸分子であって、
（ａ）レポーター遺伝子配列、
（ｂ）前記レポーター遺伝子配列と機能的に結合したリボソーム結合部位、
（ｃ）前記リボソーム結合部位と分子内でハイブリダイズし得るアンチリボソーム結合部位、及び
（ｄ）前記リボソーム結合部位とアンチリボソーム結合部位との間に連結されたアプタザイム配列、を含み、
目的分子の非存在下において、前記アンチリボソーム結合部位は、前記リボソーム結合部位とハイブリダイズして二重鎖を形成し、そして
目的分子の存在下において、前記アプタザイムは自己切断触媒活性を示し、前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離することを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が一本鎖ＲＮＡからなり、前記二重鎖を含むステム−ループ構造を形成することを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ステム−ループ構造は、２０〜４０℃の温度の水溶液中において前記一本鎖ＲＮＡが分子内で会合することにより形成されることを特徴とする請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記アプタザイム配列が、目的分子と結合するアプタマー領域と、触媒活性を有するリボザイム領域と、を含み、前記目的分子がアプタマー領域と結合したとき、リボザイム領域の構造変化を引き起こして前記自己切断触媒活性を示すことを特徴とする請求項１〜３何れか記載の核酸分子。
【請求項５】
前記自己切断部位が、アプタザイム配列とアンチリボソーム結合部位との間に位置することを特徴とする請求項１〜４何れか記載の核酸分子。
【請求項６】
前記リボソーム結合部位と、アンチリボソーム結合部位と、それらの隣接配列とによって分子内で形成される二重鎖が、６〜２０塩基対の長さを有することを特徴とする請求項１〜５何れか記載の核酸分子。
【請求項７】
前記アンチリボソーム結合部位の５’側に、少なくとも１０塩基長のステム−ループ構造を形成しうる配列を含むことを特徴とする請求項１〜６何れか記載の核酸分子。
【請求項８】
前記アンチリボソーム結合部位及びその隣接塩基が、配列番号９又は１０で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜７何れか記載の核酸分子。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求項１〜８何れか記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜９何れか記載の核酸分子をコードする二本鎖ＤＮＡであって、当該コード領域の上流に機能的に連結された転写プロモーター配列を含むことを特徴とする二本鎖ＤＮＡ。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜９何れか記載の核酸分子と、目的分子を含む試料とを、翻訳反応系内において所定の時間接触させる工程、及び
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
を含むことを特徴とする目的分子の検出方法。
【請求項１２】
（ａ）請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡと、目的分子を含む試料とを、転写／翻訳共役反応系内において所定の時間接触させる工程、及び
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
を含むことを特徴とする目的分子の検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜９何れか記載の核酸分子と、無細胞翻訳反応試薬とを含むことを特徴とする目的分子の検出キット。
【請求項１４】
請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡと、無細胞転写／翻訳共役反応試薬とを含むことを特徴とする目的分子の検出キット。
【請求項１５】
請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡによって形質転換された組換え原核細胞。
【請求項１６】
原核生物の翻訳反応系においてリガンド分子の添加によって遺伝子発現を誘導し得る核酸分子であって、
（ａ）所望の遺伝子配列、
（ｂ）前記遺伝子配列と機能的に結合したリボソーム結合部位、
（ｃ）前記リボソーム結合部位と分子内でハイブリダイズし得るアンチリボソーム結合部位、及び
（ｄ）前記リボソーム結合部位とアンチリボソーム結合部位との間に連結されたアプタザイム配列、を含み、
前記アプタザイムがリガンドの存在下において自己切断触媒活性を示し、前記アンチリボソーム結合部位を含む当該切断部位から５’側の核酸断片が前記リボソーム結合部位から解離することを特徴とする核酸分子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２２０１９１（Ｐ２００８−２２０１９１Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５８７６０（Ｐ２００７−５８７６０）
【出願日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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