歯周病の診断方法及び歯周病診断キット
【解決手段】３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬とを唾液と接触させ、唾液中の金属イオン還元力により発色させて、その発色強度により歯周病の進行程度を診断することを特徴とする歯周病の診断方法。
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａと、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬を含有する診断試薬Ｂとを備えてなることを特徴とする歯周病診断キット。
【効果】本発明の歯周病の診断方法及び歯周病診断キットによれば、被検者の歯周病の有無の診断あるいは歯周病の進行程度の予測を迅速に、簡単かつ正確に行うことができる。
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａと、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬を含有する診断試薬Ｂとを備えてなることを特徴とする歯周病診断キット。
【効果】本発明の歯周病の診断方法及び歯周病診断キットによれば、被検者の歯周病の有無の診断あるいは歯周病の進行程度の予測を迅速に、簡単かつ正確に行うことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者の唾液中の抗酸化力（還元力）を診断指標とする歯周病の診断方法及び歯周病診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、局所における細菌感染とそれに対する免疫防御反応の結果引き起こされる、歯周組織の破壊と歯槽骨の吸収を伴う慢性炎症疾患である。歯周病の初期症状としては、歯肉の発赤、腫脹、出血があげられるが、これらの症状は見過ごされる場合が多く、病状はさらに進行して歯肉の退縮、歯槽骨の吸収が起こり、最終的には歯の喪失に繋がる。歯の喪失を防ぐには適切な治療、処置が必要であり、そのためには歯周病の有無、程度を的確にとらえる診断が重要である。
【０００３】
現在行われている歯周病の診断には、(１)炎症の程度や出血の有無を目視で判断する（ＧＩ：歯肉炎指数、ＧＢＩ：歯肉出血指数）、（２）歯周ポケットの深さを測定する、（３）歯肉溝滲出液量を測定する、（４）レントゲン撮影により歯槽骨吸収を確認する、（５）歯の動揺を確認するなどの方法がある。しかし、これらの方法は、歯科医師の経験を積んだ技術が必要であり、しかも一人当たりの検診時間に長時間を要するという欠点がある。
【０００４】
また、歯垢中の歯周病原性細菌、歯肉溝滲出液や唾液に含まれる特定の酵素や特定の蛋白質などを診断指標として、歯周病の程度を判断するという方法も提案されており、例えば、下記に示す特許文献１〜５などに提案されている。
【０００５】
しかしながら、これらの診断方法の結果と歯周疾患の程度との相関は高くはなく、診断方法として満足できるものではなかった。このため、歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測をより的確かつ簡便に行うことができる診断技術の開発が望まれる。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−０４３１６５号公報
【特許文献２】特開平１０−５０１０７０号公報
【特許文献３】特許第３１６５７８８号明細書
【特許文献４】特開２００３−０６６０３９号公報
【特許文献５】国際公開第０２／０７９７８０号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ． ２００５ Ｏｃｔ；４０（５）：３７８−８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、歯周病の有無の診断又はその進行の予測を迅速、簡便かつ正確に行うことができる歯周病の診断方法及び歯周病診断キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、歯周病の有無やその進行程度と唾液中の還元力（＝抗酸化力）とに相関関係があり、被検者の唾液中の金属イオン還元能を測定することにより、被検者の歯周病の有無やその進行程度を診断できることを知見した。
【０００９】
更に、本発明においては、３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と、該金属と金属キレートを作る発色試薬とを被検者の唾液と接触させた場合、特に３価の鉄を含有する金属塩と発色試薬として２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン（以下、ＴＰＴＺと略す。）、あるいは２価の銅を含有する金属塩と発色試薬として２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン（以下、バソクプロイン（慣用名）と略す。）又はその塩を被検者の唾液と接触させた場合、唾液の還元力により上記金属イオンが還元されて発色試薬と金属キレートを作り発色し、その発色強度が被検者の歯周病の進行程度と高い相関関係があること、よって、上記発色強度を測定することで、被検者の唾液中の金属イオン還元能を測定でき、これにより、被検者の歯周病の有無又はその進行程度の予測を迅速に、簡便かつ正確に行うことができる。
【００１０】
この場合、ＴＰＴＺは２価の鉄イオンとキレートを作り赤紫色に発色する。３価の鉄を含有する金属塩とＴＰＴＺとを唾液と接触させたときに発色するのは、唾液中の抗酸化物質の作用により３価の鉄イオンが２価に還元されるためであり、発色強度は唾液の還元力の強さを示す。
同様に、バソクプロイン又はその塩は１価の銅イオンとキレートを作り、オレンジ色に発色する。２価の銅を含有する金属塩とバソクプロイン又はその塩とを唾液と接触させたときに発色するのは、唾液中の抗酸化物質の作用により、２価の銅イオンが１価に還元されるためであり、発色強度は唾液の還元力の強さを示す。
【００１１】
近年、活性酸素と様々な疾患との関連が明らかになっており、歯周病についてもその発症及び進行に活性酸素が関与しているという報告がある（非特許文献１；Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ． ２００５ Ｏｃｔ；４０（５）：３７８−８４参照）。そのため、本発明者は、歯周病を予防する、あるいはその進行を防ぐには、口腔内の抗酸化力が強く、活性酸素を消去することができることが望ましいと考えられること、よって、上記したように金属イオンの還元力を抗酸化力と言い換えると、唾液中の還元力（＝抗酸化力）を測定することにより、歯周病の診断が可能であることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００１２】
従って、本発明は、下記の歯周病の診断方法及び歯周病診断キットを提供する。
〔請求項１〕
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬とを唾液と接触させ、唾液中の金属イオン還元力により発色させて、その発色強度により歯周病の進行程度を診断することを特徴とする歯周病の診断方法。
〔請求項２〕
金属塩が３価の鉄を含有するものであり、発色試薬が２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジンである請求項１記載の歯周病の診断方法。
〔請求項３〕
金属塩が２価の銅を含有するものであり、発色試薬が２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン又はその塩である請求項１記載の歯周病の診断方法。
〔請求項４〕
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａと、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬を含有する診断試薬Ｂとを備えてなることを特徴とする歯周病診断キット。
〔請求項５〕
金属塩が３価の鉄を含有するものであり、発色試薬が２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジンである請求項４記載の歯周病診断キット。
〔請求項６〕
金属塩が２価の銅を含有するものであり、発色試薬が２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン又はその塩である請求項４記載の歯周病診断キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の歯周病の診断方法及び歯周病診断キットによれば、被検者の歯周病の有無の診断あるいは歯周病の進行程度の予測を迅速に、簡単かつ正確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明につき更に詳細に説明すると、本発明の歯周病の診断方法は、被検者の唾液中の金属イオン還元能を測定することを特徴とする。この場合、３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と、該金属と金属キレートを作る発色試薬とを唾液と接触させて反応させることで、被検者の唾液中の還元力により還元された金属塩の金属イオンが発色試薬と金属キレートを作って発色し、この発色強度を測定することによって、被検者の唾液中の金属イオン還元力の強さから歯周病の有無の診断や進行程度を診断することができる。
【００１５】
本発明において使用する金属塩としては、還元反応により酸化数が変化して発色試薬と金属キレートを作るものが使用され、具体的には３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩が好適に用いられる。
３価の鉄を含有する金属塩としては、例えば塩化鉄（ＩＩＩ）、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）等が挙げられる。２価の銅を含有する金属塩としては、例えば塩化銅（ＩＩ）、グルコン酸銅（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、硝酸銅（ＩＩ）、過塩素酸銅（ＩＩ）等が挙げられる。
【００１６】
また、発色試薬としては、上記還元により酸化数が変化した上記金属イオンとキレートを作って発色するものであればよく、例えば２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン（ＴＰＴＺ）、２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン（バソクプロイン）、２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸ジナトリウム塩（バソクプロインスルホン酸ナトリウム）等のバソクプロインの塩などが挙げられるが、とりわけ３価の鉄を含有する金属塩を使用する場合はＴＰＴＺ、２価の銅を含有する金属塩を使用する場合はバソクプロイン又はバソクプロインスルホン酸ナトリウムがそれぞれ好ましく使用される。
【００１７】
なお、本発明において、ヒト被検者からの検体として口腔内から採取した唾液が用いられるが、この唾液はそのまま反応に用いて、上記金属塩及び発色試薬と接触させることもできるし、遠心分離などにより不純物などを分離した後、上清を反応させてもよい。
【００１８】
本発明の歯周病の診断方法では、上記したように３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と発色試薬とを反応させるが、より好適には下記［Ｉ］、［ＩＩ］の方法が採用できる。また、本発明の歯周病診断キットは、上記金属塩を含有する診断試薬Ａと、発色試薬を含有する診断試薬Ｂとを備えてなるものであるが、下記診断試薬Ａと診断試薬Ｂとを備えた診断キットがより好適に使用される。
【００１９】
［Ｉ］３価の鉄を含有する金属塩と発色試薬であるＴＰＴＺとを唾液と接触させ、唾液により３価から２価に還元された鉄とＴＰＴＺとにより発色させ、その発色強度より歯周病の有無又は進行程度を診断する。この場合、３価の鉄を含有する金属塩を含有する診断試薬ＡとＴＰＴＺを含有する診断試薬Ｂとして保存し、使用時にこれら診断試薬Ａ、Ｂを混合して、唾液と接触させることが好ましい。
【００２０】
［ＩＩ］上記２価の銅を含有する金属塩とバソクプロイン又はその塩とを唾液と接触させ、唾液により２価から１価に還元された銅とバソクプロイン又はその塩とにより発色させ、その発色強度により歯周病の進行程度を診断する。この場合、２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａとバソクプロイン又はその塩を含有する診断試薬Ｂとして保存し、使用時にこれら診断試薬Ａ、Ｂを混合して、唾液と接触させることが好ましい。
【００２１】
本発明の歯周病診断キットにおいて、診断試薬Ａに使用する３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩は、イオン交換水等の溶媒で希釈して金属塩溶液として用いられる。
この場合、診断試薬Ａ中の金属塩濃度は、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、特に０．５〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬに満たないと十分な感度が得られない場合があり、１０ｍｇ／ｍＬを超えても感度は向上しない。
【００２２】
また、診断試薬Ｂに使用する発色試薬は、メタノール、イオン交換水や、希塩酸，希酢酸等の希酸などの溶媒で溶解・希釈して用いることが望ましく、特にＴＰＴＺの溶媒としては１％塩酸等の希酸が好適であり、バソクプロイン又はその塩の溶媒としては、メタノール、イオン交換水、又は１％塩酸等の希酸が好適である。
診断試薬Ｂ中の発色試薬の濃度は、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬ、特に０．０５〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．０１ｍｇ／ｍＬに満たないと十分な感度が得られない場合があり、１０ｍｇ／ｍＬを超えても感度は向上しない。
【００２３】
更に、本発明においては、発色反応を正確に行うために上記診断試薬Ａと診断試薬Ｂとを質量比で１：１０〜１０：１、特に１：２〜２：１の割合で使用することが好ましい。例えば、診断試薬Ａ１００μＬに対して診断試薬Ｂを１０〜１，０００μＬ、特に診断試薬Ａ１００μＬに対して診断試薬Ｂを５０〜２００μＬ使用することが好ましい。
【００２４】
診断試薬Ａと診断試薬Ｂは、診断キットとしてそれぞれを別々に保存し、使用時（診断時）にこれら診断試薬Ａ、Ｂを混合して唾液と接触させることが、保存安定性や感度などの点から望ましい。
【００２５】
使用時（診断時）に診断試薬Ａと診断試薬Ｂとを混合し、この混合物と唾液とを接触させる際の混合割合は、診断試薬Ａ、Ｂの混合物と唾液とを質量比で１００：１〜１：１、特に５０：１〜１０：１の割合で使用することが好ましい。例えば、診断試薬Ａ、Ｂの混合物１００μＬに対して唾液を１〜１００μＬ、特に２〜１０μＬ使用するのが好ましい。
【００２６】
なおこの場合、診断試薬Ａ及びＢの混合物と唾液との接触にあたっては、唾液に対して診断試薬Ａ及びＢの混合物中に含まれる金属塩の濃度が０．０５〜１０ｍｇ／ｍＬとなる範囲で診断試薬を唾液に添加することが、感度の面から好ましい。
【００２７】
本発明においては、診断試薬Ａ及びＢの混合物と唾液とが接触して発色後に吸光度を測定することで、発色強度を評価することができる。吸光度の測定は、吸光プレートリーダーを用いて行うことができ、具体的には、マイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）、吸光マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）などを用いることができる。なお、吸光度の測定は、診断試薬を唾液に添加、混合後、５〜３０分間反応させた後に行うことが望ましい。
【００２８】
吸光度測定における検出波長は、４４０〜６３０ｎｍの範囲とすることができるが、
［Ｉ］３価の鉄を含有する金属塩を含有する診断試薬ＡとＴＰＴＺを含有する診断試薬Ｂを用いる場合は、５７０〜６３０ｎｍが好ましく、
［ＩＩ］２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａとバソクプロイン又はその塩を含有する診断試薬Ｂを用いる場合は、４４０〜５００ｎｍが好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、実験例、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、以下の例において配合量はいずれも質量％である。
【００３０】
〔実験例１〕
下記の診断方法及び診断試薬について、抗酸化物質の測定能について下記方法で評価した。
【００３１】
［実施例１］３価鉄とＴＰＴＺを用いた抗酸化物質の測定
塩化鉄（ＩＩＩ）・６水和物（和光純薬工業（株）製）１ｇにイオン交換水を加えて１００ｍＬとし、診断試薬Ａとした。ＴＰＴＺ０．２ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて１００ｍＬとし、診断試薬Ｂとした。診断試薬Ａ５０ｍＬ及び診断試薬Ｂ５０ｍＬを使用時（診査時）の直前に混合した。アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）０．２ｇにリン酸緩衝液を加えて１０ｍＬとした。これをリン酸緩衝液で希釈して使用した。なお、リン酸緩衝液は、以下のように調製した。
【００３２】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）の調製：
リン酸水素２ナトリウム・１２水和物８．６ｇ、リン酸２水素ナトリウム・２水和物０．９９ｇ、塩化ナトリウム２５．５ｇをイオン交換水に溶解、３Ｌとした。
【００３３】
次に、マイクロテストプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ ３５−３０７２）に、濃度０．００６２５ｍｇ／ｍＬ、０．０１２５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸溶液１０μＬ、診断試薬Ａ、Ｂの混合液１５０μＬを添加、混合し、５分後に５９５ｎｍの吸光度測定を行った。吸光度測定には、マイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）を用いた。測定結果は図１に示すとおりであり、アスコルビン酸の濃度依存的に５９５ｎｍの吸光度は上昇した。この結果から、本発明にかかわる上記方法により、抗酸化物質の測定が可能であることがわかった。
【００３４】
［実施例２］２価銅とバソクプロインスルホン酸ナトリウムを用いた抗酸化物質の測定
塩化銅（ＩＩ）・２水和物（和光純薬工業（株）製）１ｇにイオン交換水を加えて１００ｍＬとし、診断試薬Ａとした。バソクプロインスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．２ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて１００ｍＬとし、診断試薬Ｂとした。診断試薬Ａ５０ｍＬ及び診断試薬Ｂ５０ｍＬを使用時（診査時）の直前に混合した。アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）０．２ｇにリン酸緩衝液を加えて１０ｍＬとした。これをリン酸緩衝液で希釈して使用した。なお、リン酸緩衝液は、実施例１と同様に調製、使用した。
【００３５】
マイクロテストプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ ３５−３０７２）に、濃度０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸溶液１０μＬ、診断試薬Ａと診断試薬Ｂの混合液１５０μＬを添加、混合し、５分後に４９２ｎｍの吸光度測定を行った。吸光度測定には、マイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）を用いた。
結果は図２に示すとおりであり、アスコルビン酸の濃度依存的に４５０ｎｍの吸光度は上昇した。この結果から、本発明にかかわる上記方法により、抗酸化物質の測定が可能であることがわかった。
【００３６】
〔実験例２〕
下記組成の歯周病診断試薬（キット）を実施例１と同様に調製し、これら診断試薬Ａ及びＢの混合物とアスコルビン酸を混合したときの発色強度を測定した。結果を表１に示す。
【００３７】
具体的な実験方法は、０．１ｍｇ／ｍＬ アスコルビン酸溶液１０μＬ、下記に示す診断試薬Ａと診断試薬Ｂの混合液１５０μＬをマイクロテストプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ ３５−３０７２）に添加、混合し、５分後にマイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）で吸光度を測定した。測定波長は、診断試薬ＢにＴＰＴＺを含有する場合は５９５ｎｍ、診断試薬Ｂにバソクプロイン又はその塩を含有する場合は４９２ｎｍ、診断試薬Ｂにキシレノールオレンジを含有する場合は５６０ｎｍとした。なお、０．１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸溶液は、実施例１と同様に調製し、使用した。
【００３８】
［実施例３］
診断試薬Ａ：
１０ｍｇ／ｍＬ塩化鉄（ＩＩＩ）溶液。塩化鉄（ＩＩＩ）（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
１０ｍｇ／ｍＬのＴＰＴＺ溶液。ＴＰＴＺ（和光純薬工業（株）製）１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００３９】
［実施例４］
診断試薬Ａ：
２ｍｇ／ｍＬ硝酸鉄溶液。硝酸鉄（和光純薬工業（株）製）０．２ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
１ｍｇ／ｍＬのＴＰＴＺ溶液。ＴＰＴＺ（和光純薬工業（株）製）０．１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４０】
［実施例５］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ硫酸鉄溶液。硫酸鉄（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
５ｍｇ／ｍＬのＴＰＴＺ溶液。ＴＰＴＺ（和光純薬工業（株）製）０．５ｇに０．３Ｍ酢酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４１】
［実施例６］
診断試薬Ａ：
０．５ｍｇ／ｍＬ塩化鉄溶液。塩化鉄（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．０１ｍｇ／ｍＬのＴＰＴＺ溶液。ＴＰＴＺ（和光純薬工業（株）製）０．００１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４２】
［実施例７］
診断試薬Ａ：
０．１ｍｇ／ｍＬ塩化銅溶液。塩化銅（和光純薬工業（株）製）０．０１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
１ｍｇ／ｍＬバソクプロインスルホン酸ナトリウム溶液。バソクプロインスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４３】
［実施例８］
診断試薬Ａ：
５ｍｇ／ｍＬグルコン酸銅溶液。グルコン酸銅（和光純薬工業（株）製）０．５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．０５ｍｇ／ｍＬバソクプロイン溶液。バソクプロイン（和光純薬工業（株）製）０．００５ｇにメタノールを加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４４】
［実施例９］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ硫酸銅溶液。硫酸銅（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．５ｍｇ／ｍＬバソクプロインスルホン酸ナトリウム溶液。バソクプロインスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇに０．３Ｍ酢酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４５】
［実施例１０］
診断試薬Ａ：
２ｍｇ／ｍＬ硝酸銅溶液。硝酸銅（和光純薬工業（株）製）０．２ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
５ｍｇ／ｍＬバソクプロイン溶液。バソクプロイン（和光純薬工業（株）製）０．５ｇにメタノールを加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４６】
［実施例１１］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ過塩素酸銅溶液。過塩素酸銅（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
１０ｍｇ／ｍＬバソクプロインスルホン酸ナトリウム溶液。バソクプロインスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４７】
［比較例１］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬフッ化すず（ＩＶ）溶液。フッ化すず（ＩＶ）（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．５ｍｇ／ｍＬの３，３’−ビス（Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル−ｏ−クレソルスルホフタレイン−２ナトリウム（キシレノールオレンジ）溶液。キシレノールオレンジ（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４８】
［比較例２］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ塩化鉄（ＩＩＩ）溶液。塩化鉄（ＩＩＩ）（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．５ｍｇ／ｍＬキシレノールオレンジ溶液。キシレノールオレンジ（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４９】
［比較例３］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ塩化銅溶液。塩化銅（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．５ｍｇ／ｍＬキシレノールオレンジ溶液。キシレノールオレンジ（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１の結果から、３価の鉄を含有する金属塩を含有する診断試薬ＡとＴＰＴＺを含有する診断試薬Ｂとをアスコルビン酸と反応させると、発色し、アスコルビン酸の測定が可能あることがわかった。
また、表１の結果から、２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａとバソクプロイン又はバソクプロインスルホン酸ナトリウムを含有する診断試薬Ｂを反応させると、発色し、アスコルビン酸の測定が可能であることがわかった。
【００５２】
〔実験例３〕ヒト唾液の発色とＧＩ（ＧＩ：歯肉炎指数）との関係
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間）し、この遠心上清を唾液溶液とした。マイクロテストプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ ３５−３０７２）に、唾液溶液１０μＬ、実施例１と同様に調製した診断試薬Ａ、Ｂの混合液１５０μＬを添加、混合し、５分後に５９５ｎｍの吸光度測定を行った。吸光度測定には、マイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）を用いた。被験者は、永久歯１６本以上を有する２６歳から７１歳の２２名とし、全ての永久歯を対象とし、被験歯につき頬側近心１箇所のＧＩを測定した。ＧＩの平均値が０．５未満の９名を健常群、ＧＩの平均値が０．５以上の１３名を歯周病群として、２群の吸光度分布を図３に示す。なお、ＧＩとは、歯肉の状態を判断する指標で、その基準は以下の通りである。
【００５３】
ＧＩ基準
０＝正常歯肉
１＝軽度の炎症。軽度の色変化、浮腫があるが、探針により出血しないもの。
２＝中程度の炎症。発赤、浮腫があり、探針により出血するもの。
３＝高度の炎症。著しい発赤、腫脹、自然出血の傾向、潰瘍形成のあるもの。
健常群の唾液の吸光度は歯周病群と比較して高い数値を示し（ｐ＜０．０５、ｔ検定）、健常群の唾液は３価の鉄イオンを還元する力が強いことが確認された。
【００５４】
図３の結果から、上記吸光度と歯周病の有無とは相関関係が認められ、本発明の診断方法により唾液中の金属イオン還元能を測定することで、歯周病の診断が可能であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の実施例１の吸光度測定結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例２の吸光度測定結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実験例３の吸光度分布を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者の唾液中の抗酸化力（還元力）を診断指標とする歯周病の診断方法及び歯周病診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、局所における細菌感染とそれに対する免疫防御反応の結果引き起こされる、歯周組織の破壊と歯槽骨の吸収を伴う慢性炎症疾患である。歯周病の初期症状としては、歯肉の発赤、腫脹、出血があげられるが、これらの症状は見過ごされる場合が多く、病状はさらに進行して歯肉の退縮、歯槽骨の吸収が起こり、最終的には歯の喪失に繋がる。歯の喪失を防ぐには適切な治療、処置が必要であり、そのためには歯周病の有無、程度を的確にとらえる診断が重要である。
【０００３】
現在行われている歯周病の診断には、(１)炎症の程度や出血の有無を目視で判断する（ＧＩ：歯肉炎指数、ＧＢＩ：歯肉出血指数）、（２）歯周ポケットの深さを測定する、（３）歯肉溝滲出液量を測定する、（４）レントゲン撮影により歯槽骨吸収を確認する、（５）歯の動揺を確認するなどの方法がある。しかし、これらの方法は、歯科医師の経験を積んだ技術が必要であり、しかも一人当たりの検診時間に長時間を要するという欠点がある。
【０００４】
また、歯垢中の歯周病原性細菌、歯肉溝滲出液や唾液に含まれる特定の酵素や特定の蛋白質などを診断指標として、歯周病の程度を判断するという方法も提案されており、例えば、下記に示す特許文献１〜５などに提案されている。
【０００５】
しかしながら、これらの診断方法の結果と歯周疾患の程度との相関は高くはなく、診断方法として満足できるものではなかった。このため、歯周病の有無の診断あるいはその進行の予測をより的確かつ簡便に行うことができる診断技術の開発が望まれる。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−０４３１６５号公報
【特許文献２】特開平１０−５０１０７０号公報
【特許文献３】特許第３１６５７８８号明細書
【特許文献４】特開２００３−０６６０３９号公報
【特許文献５】国際公開第０２／０７９７８０号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ． ２００５ Ｏｃｔ；４０（５）：３７８−８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、歯周病の有無の診断又はその進行の予測を迅速、簡便かつ正確に行うことができる歯周病の診断方法及び歯周病診断キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、歯周病の有無やその進行程度と唾液中の還元力（＝抗酸化力）とに相関関係があり、被検者の唾液中の金属イオン還元能を測定することにより、被検者の歯周病の有無やその進行程度を診断できることを知見した。
【０００９】
更に、本発明においては、３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と、該金属と金属キレートを作る発色試薬とを被検者の唾液と接触させた場合、特に３価の鉄を含有する金属塩と発色試薬として２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン（以下、ＴＰＴＺと略す。）、あるいは２価の銅を含有する金属塩と発色試薬として２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン（以下、バソクプロイン（慣用名）と略す。）又はその塩を被検者の唾液と接触させた場合、唾液の還元力により上記金属イオンが還元されて発色試薬と金属キレートを作り発色し、その発色強度が被検者の歯周病の進行程度と高い相関関係があること、よって、上記発色強度を測定することで、被検者の唾液中の金属イオン還元能を測定でき、これにより、被検者の歯周病の有無又はその進行程度の予測を迅速に、簡便かつ正確に行うことができる。
【００１０】
この場合、ＴＰＴＺは２価の鉄イオンとキレートを作り赤紫色に発色する。３価の鉄を含有する金属塩とＴＰＴＺとを唾液と接触させたときに発色するのは、唾液中の抗酸化物質の作用により３価の鉄イオンが２価に還元されるためであり、発色強度は唾液の還元力の強さを示す。
同様に、バソクプロイン又はその塩は１価の銅イオンとキレートを作り、オレンジ色に発色する。２価の銅を含有する金属塩とバソクプロイン又はその塩とを唾液と接触させたときに発色するのは、唾液中の抗酸化物質の作用により、２価の銅イオンが１価に還元されるためであり、発色強度は唾液の還元力の強さを示す。
【００１１】
近年、活性酸素と様々な疾患との関連が明らかになっており、歯周病についてもその発症及び進行に活性酸素が関与しているという報告がある（非特許文献１；Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ． ２００５ Ｏｃｔ；４０（５）：３７８−８４参照）。そのため、本発明者は、歯周病を予防する、あるいはその進行を防ぐには、口腔内の抗酸化力が強く、活性酸素を消去することができることが望ましいと考えられること、よって、上記したように金属イオンの還元力を抗酸化力と言い換えると、唾液中の還元力（＝抗酸化力）を測定することにより、歯周病の診断が可能であることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００１２】
従って、本発明は、下記の歯周病の診断方法及び歯周病診断キットを提供する。
〔請求項１〕
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬とを唾液と接触させ、唾液中の金属イオン還元力により発色させて、その発色強度により歯周病の進行程度を診断することを特徴とする歯周病の診断方法。
〔請求項２〕
金属塩が３価の鉄を含有するものであり、発色試薬が２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジンである請求項１記載の歯周病の診断方法。
〔請求項３〕
金属塩が２価の銅を含有するものであり、発色試薬が２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン又はその塩である請求項１記載の歯周病の診断方法。
〔請求項４〕
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａと、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬を含有する診断試薬Ｂとを備えてなることを特徴とする歯周病診断キット。
〔請求項５〕
金属塩が３価の鉄を含有するものであり、発色試薬が２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジンである請求項４記載の歯周病診断キット。
〔請求項６〕
金属塩が２価の銅を含有するものであり、発色試薬が２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン又はその塩である請求項４記載の歯周病診断キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の歯周病の診断方法及び歯周病診断キットによれば、被検者の歯周病の有無の診断あるいは歯周病の進行程度の予測を迅速に、簡単かつ正確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明につき更に詳細に説明すると、本発明の歯周病の診断方法は、被検者の唾液中の金属イオン還元能を測定することを特徴とする。この場合、３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と、該金属と金属キレートを作る発色試薬とを唾液と接触させて反応させることで、被検者の唾液中の還元力により還元された金属塩の金属イオンが発色試薬と金属キレートを作って発色し、この発色強度を測定することによって、被検者の唾液中の金属イオン還元力の強さから歯周病の有無の診断や進行程度を診断することができる。
【００１５】
本発明において使用する金属塩としては、還元反応により酸化数が変化して発色試薬と金属キレートを作るものが使用され、具体的には３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩が好適に用いられる。
３価の鉄を含有する金属塩としては、例えば塩化鉄（ＩＩＩ）、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）等が挙げられる。２価の銅を含有する金属塩としては、例えば塩化銅（ＩＩ）、グルコン酸銅（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、硝酸銅（ＩＩ）、過塩素酸銅（ＩＩ）等が挙げられる。
【００１６】
また、発色試薬としては、上記還元により酸化数が変化した上記金属イオンとキレートを作って発色するものであればよく、例えば２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジン（ＴＰＴＺ）、２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン（バソクプロイン）、２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸ジナトリウム塩（バソクプロインスルホン酸ナトリウム）等のバソクプロインの塩などが挙げられるが、とりわけ３価の鉄を含有する金属塩を使用する場合はＴＰＴＺ、２価の銅を含有する金属塩を使用する場合はバソクプロイン又はバソクプロインスルホン酸ナトリウムがそれぞれ好ましく使用される。
【００１７】
なお、本発明において、ヒト被検者からの検体として口腔内から採取した唾液が用いられるが、この唾液はそのまま反応に用いて、上記金属塩及び発色試薬と接触させることもできるし、遠心分離などにより不純物などを分離した後、上清を反応させてもよい。
【００１８】
本発明の歯周病の診断方法では、上記したように３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と発色試薬とを反応させるが、より好適には下記［Ｉ］、［ＩＩ］の方法が採用できる。また、本発明の歯周病診断キットは、上記金属塩を含有する診断試薬Ａと、発色試薬を含有する診断試薬Ｂとを備えてなるものであるが、下記診断試薬Ａと診断試薬Ｂとを備えた診断キットがより好適に使用される。
【００１９】
［Ｉ］３価の鉄を含有する金属塩と発色試薬であるＴＰＴＺとを唾液と接触させ、唾液により３価から２価に還元された鉄とＴＰＴＺとにより発色させ、その発色強度より歯周病の有無又は進行程度を診断する。この場合、３価の鉄を含有する金属塩を含有する診断試薬ＡとＴＰＴＺを含有する診断試薬Ｂとして保存し、使用時にこれら診断試薬Ａ、Ｂを混合して、唾液と接触させることが好ましい。
【００２０】
［ＩＩ］上記２価の銅を含有する金属塩とバソクプロイン又はその塩とを唾液と接触させ、唾液により２価から１価に還元された銅とバソクプロイン又はその塩とにより発色させ、その発色強度により歯周病の進行程度を診断する。この場合、２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａとバソクプロイン又はその塩を含有する診断試薬Ｂとして保存し、使用時にこれら診断試薬Ａ、Ｂを混合して、唾液と接触させることが好ましい。
【００２１】
本発明の歯周病診断キットにおいて、診断試薬Ａに使用する３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩は、イオン交換水等の溶媒で希釈して金属塩溶液として用いられる。
この場合、診断試薬Ａ中の金属塩濃度は、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、特に０．５〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬに満たないと十分な感度が得られない場合があり、１０ｍｇ／ｍＬを超えても感度は向上しない。
【００２２】
また、診断試薬Ｂに使用する発色試薬は、メタノール、イオン交換水や、希塩酸，希酢酸等の希酸などの溶媒で溶解・希釈して用いることが望ましく、特にＴＰＴＺの溶媒としては１％塩酸等の希酸が好適であり、バソクプロイン又はその塩の溶媒としては、メタノール、イオン交換水、又は１％塩酸等の希酸が好適である。
診断試薬Ｂ中の発色試薬の濃度は、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬ、特に０．０５〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．０１ｍｇ／ｍＬに満たないと十分な感度が得られない場合があり、１０ｍｇ／ｍＬを超えても感度は向上しない。
【００２３】
更に、本発明においては、発色反応を正確に行うために上記診断試薬Ａと診断試薬Ｂとを質量比で１：１０〜１０：１、特に１：２〜２：１の割合で使用することが好ましい。例えば、診断試薬Ａ１００μＬに対して診断試薬Ｂを１０〜１，０００μＬ、特に診断試薬Ａ１００μＬに対して診断試薬Ｂを５０〜２００μＬ使用することが好ましい。
【００２４】
診断試薬Ａと診断試薬Ｂは、診断キットとしてそれぞれを別々に保存し、使用時（診断時）にこれら診断試薬Ａ、Ｂを混合して唾液と接触させることが、保存安定性や感度などの点から望ましい。
【００２５】
使用時（診断時）に診断試薬Ａと診断試薬Ｂとを混合し、この混合物と唾液とを接触させる際の混合割合は、診断試薬Ａ、Ｂの混合物と唾液とを質量比で１００：１〜１：１、特に５０：１〜１０：１の割合で使用することが好ましい。例えば、診断試薬Ａ、Ｂの混合物１００μＬに対して唾液を１〜１００μＬ、特に２〜１０μＬ使用するのが好ましい。
【００２６】
なおこの場合、診断試薬Ａ及びＢの混合物と唾液との接触にあたっては、唾液に対して診断試薬Ａ及びＢの混合物中に含まれる金属塩の濃度が０．０５〜１０ｍｇ／ｍＬとなる範囲で診断試薬を唾液に添加することが、感度の面から好ましい。
【００２７】
本発明においては、診断試薬Ａ及びＢの混合物と唾液とが接触して発色後に吸光度を測定することで、発色強度を評価することができる。吸光度の測定は、吸光プレートリーダーを用いて行うことができ、具体的には、マイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）、吸光マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）などを用いることができる。なお、吸光度の測定は、診断試薬を唾液に添加、混合後、５〜３０分間反応させた後に行うことが望ましい。
【００２８】
吸光度測定における検出波長は、４４０〜６３０ｎｍの範囲とすることができるが、
［Ｉ］３価の鉄を含有する金属塩を含有する診断試薬ＡとＴＰＴＺを含有する診断試薬Ｂを用いる場合は、５７０〜６３０ｎｍが好ましく、
［ＩＩ］２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａとバソクプロイン又はその塩を含有する診断試薬Ｂを用いる場合は、４４０〜５００ｎｍが好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、実験例、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、以下の例において配合量はいずれも質量％である。
【００３０】
〔実験例１〕
下記の診断方法及び診断試薬について、抗酸化物質の測定能について下記方法で評価した。
【００３１】
［実施例１］３価鉄とＴＰＴＺを用いた抗酸化物質の測定
塩化鉄（ＩＩＩ）・６水和物（和光純薬工業（株）製）１ｇにイオン交換水を加えて１００ｍＬとし、診断試薬Ａとした。ＴＰＴＺ０．２ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて１００ｍＬとし、診断試薬Ｂとした。診断試薬Ａ５０ｍＬ及び診断試薬Ｂ５０ｍＬを使用時（診査時）の直前に混合した。アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）０．２ｇにリン酸緩衝液を加えて１０ｍＬとした。これをリン酸緩衝液で希釈して使用した。なお、リン酸緩衝液は、以下のように調製した。
【００３２】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）の調製：
リン酸水素２ナトリウム・１２水和物８．６ｇ、リン酸２水素ナトリウム・２水和物０．９９ｇ、塩化ナトリウム２５．５ｇをイオン交換水に溶解、３Ｌとした。
【００３３】
次に、マイクロテストプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ ３５−３０７２）に、濃度０．００６２５ｍｇ／ｍＬ、０．０１２５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸溶液１０μＬ、診断試薬Ａ、Ｂの混合液１５０μＬを添加、混合し、５分後に５９５ｎｍの吸光度測定を行った。吸光度測定には、マイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）を用いた。測定結果は図１に示すとおりであり、アスコルビン酸の濃度依存的に５９５ｎｍの吸光度は上昇した。この結果から、本発明にかかわる上記方法により、抗酸化物質の測定が可能であることがわかった。
【００３４】
［実施例２］２価銅とバソクプロインスルホン酸ナトリウムを用いた抗酸化物質の測定
塩化銅（ＩＩ）・２水和物（和光純薬工業（株）製）１ｇにイオン交換水を加えて１００ｍＬとし、診断試薬Ａとした。バソクプロインスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．２ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて１００ｍＬとし、診断試薬Ｂとした。診断試薬Ａ５０ｍＬ及び診断試薬Ｂ５０ｍＬを使用時（診査時）の直前に混合した。アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）０．２ｇにリン酸緩衝液を加えて１０ｍＬとした。これをリン酸緩衝液で希釈して使用した。なお、リン酸緩衝液は、実施例１と同様に調製、使用した。
【００３５】
マイクロテストプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ ３５−３０７２）に、濃度０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸溶液１０μＬ、診断試薬Ａと診断試薬Ｂの混合液１５０μＬを添加、混合し、５分後に４９２ｎｍの吸光度測定を行った。吸光度測定には、マイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）を用いた。
結果は図２に示すとおりであり、アスコルビン酸の濃度依存的に４５０ｎｍの吸光度は上昇した。この結果から、本発明にかかわる上記方法により、抗酸化物質の測定が可能であることがわかった。
【００３６】
〔実験例２〕
下記組成の歯周病診断試薬（キット）を実施例１と同様に調製し、これら診断試薬Ａ及びＢの混合物とアスコルビン酸を混合したときの発色強度を測定した。結果を表１に示す。
【００３７】
具体的な実験方法は、０．１ｍｇ／ｍＬ アスコルビン酸溶液１０μＬ、下記に示す診断試薬Ａと診断試薬Ｂの混合液１５０μＬをマイクロテストプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ ３５−３０７２）に添加、混合し、５分後にマイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）で吸光度を測定した。測定波長は、診断試薬ＢにＴＰＴＺを含有する場合は５９５ｎｍ、診断試薬Ｂにバソクプロイン又はその塩を含有する場合は４９２ｎｍ、診断試薬Ｂにキシレノールオレンジを含有する場合は５６０ｎｍとした。なお、０．１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸溶液は、実施例１と同様に調製し、使用した。
【００３８】
［実施例３］
診断試薬Ａ：
１０ｍｇ／ｍＬ塩化鉄（ＩＩＩ）溶液。塩化鉄（ＩＩＩ）（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
１０ｍｇ／ｍＬのＴＰＴＺ溶液。ＴＰＴＺ（和光純薬工業（株）製）１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００３９】
［実施例４］
診断試薬Ａ：
２ｍｇ／ｍＬ硝酸鉄溶液。硝酸鉄（和光純薬工業（株）製）０．２ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
１ｍｇ／ｍＬのＴＰＴＺ溶液。ＴＰＴＺ（和光純薬工業（株）製）０．１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４０】
［実施例５］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ硫酸鉄溶液。硫酸鉄（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
５ｍｇ／ｍＬのＴＰＴＺ溶液。ＴＰＴＺ（和光純薬工業（株）製）０．５ｇに０．３Ｍ酢酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４１】
［実施例６］
診断試薬Ａ：
０．５ｍｇ／ｍＬ塩化鉄溶液。塩化鉄（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．０１ｍｇ／ｍＬのＴＰＴＺ溶液。ＴＰＴＺ（和光純薬工業（株）製）０．００１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４２】
［実施例７］
診断試薬Ａ：
０．１ｍｇ／ｍＬ塩化銅溶液。塩化銅（和光純薬工業（株）製）０．０１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
１ｍｇ／ｍＬバソクプロインスルホン酸ナトリウム溶液。バソクプロインスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４３】
［実施例８］
診断試薬Ａ：
５ｍｇ／ｍＬグルコン酸銅溶液。グルコン酸銅（和光純薬工業（株）製）０．５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．０５ｍｇ／ｍＬバソクプロイン溶液。バソクプロイン（和光純薬工業（株）製）０．００５ｇにメタノールを加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４４】
［実施例９］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ硫酸銅溶液。硫酸銅（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．５ｍｇ／ｍＬバソクプロインスルホン酸ナトリウム溶液。バソクプロインスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇに０．３Ｍ酢酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４５】
［実施例１０］
診断試薬Ａ：
２ｍｇ／ｍＬ硝酸銅溶液。硝酸銅（和光純薬工業（株）製）０．２ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
５ｍｇ／ｍＬバソクプロイン溶液。バソクプロイン（和光純薬工業（株）製）０．５ｇにメタノールを加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４６】
［実施例１１］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ過塩素酸銅溶液。過塩素酸銅（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
１０ｍｇ／ｍＬバソクプロインスルホン酸ナトリウム溶液。バソクプロインスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）１ｇに０．１Ｍ塩酸を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４７】
［比較例１］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬフッ化すず（ＩＶ）溶液。フッ化すず（ＩＶ）（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．５ｍｇ／ｍＬの３，３’−ビス（Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル−ｏ−クレソルスルホフタレイン−２ナトリウム（キシレノールオレンジ）溶液。キシレノールオレンジ（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４８】
［比較例２］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ塩化鉄（ＩＩＩ）溶液。塩化鉄（ＩＩＩ）（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．５ｍｇ／ｍＬキシレノールオレンジ溶液。キシレノールオレンジ（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００４９】
［比較例３］
診断試薬Ａ：
１ｍｇ／ｍＬ塩化銅溶液。塩化銅（和光純薬工業（株）製）０．１ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
診断試薬Ｂ：
０．５ｍｇ／ｍＬキシレノールオレンジ溶液。キシレノールオレンジ（和光純薬工業（株）製）０．０５ｇにイオン交換水を加えて溶解し、１００ｍＬとした。
上記診断試薬Ａ５０ｍＬと診断試薬Ｂ５０ｍＬを混合し、混合液を試験に供した。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１の結果から、３価の鉄を含有する金属塩を含有する診断試薬ＡとＴＰＴＺを含有する診断試薬Ｂとをアスコルビン酸と反応させると、発色し、アスコルビン酸の測定が可能あることがわかった。
また、表１の結果から、２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａとバソクプロイン又はバソクプロインスルホン酸ナトリウムを含有する診断試薬Ｂを反応させると、発色し、アスコルビン酸の測定が可能であることがわかった。
【００５２】
〔実験例３〕ヒト唾液の発色とＧＩ（ＧＩ：歯肉炎指数）との関係
安静時無刺激全唾液２ｍＬを喀痰処理器（栄研器材（株）製）に採取し、遠心分離（使用機器 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ、処理条件４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間）し、この遠心上清を唾液溶液とした。マイクロテストプレート（９６ウェル、ＦＡＬＣＯＮ ３５−３０７２）に、唾液溶液１０μＬ、実施例１と同様に調製した診断試薬Ａ、Ｂの混合液１５０μＬを添加、混合し、５分後に５９５ｎｍの吸光度測定を行った。吸光度測定には、マイクロプレートリーダー（スペクトライメージ、和光純薬工業（株）製）を用いた。被験者は、永久歯１６本以上を有する２６歳から７１歳の２２名とし、全ての永久歯を対象とし、被験歯につき頬側近心１箇所のＧＩを測定した。ＧＩの平均値が０．５未満の９名を健常群、ＧＩの平均値が０．５以上の１３名を歯周病群として、２群の吸光度分布を図３に示す。なお、ＧＩとは、歯肉の状態を判断する指標で、その基準は以下の通りである。
【００５３】
ＧＩ基準
０＝正常歯肉
１＝軽度の炎症。軽度の色変化、浮腫があるが、探針により出血しないもの。
２＝中程度の炎症。発赤、浮腫があり、探針により出血するもの。
３＝高度の炎症。著しい発赤、腫脹、自然出血の傾向、潰瘍形成のあるもの。
健常群の唾液の吸光度は歯周病群と比較して高い数値を示し（ｐ＜０．０５、ｔ検定）、健常群の唾液は３価の鉄イオンを還元する力が強いことが確認された。
【００５４】
図３の結果から、上記吸光度と歯周病の有無とは相関関係が認められ、本発明の診断方法により唾液中の金属イオン還元能を測定することで、歯周病の診断が可能であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の実施例１の吸光度測定結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例２の吸光度測定結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実験例３の吸光度分布を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬とを唾液と接触させ、唾液中の金属イオン還元力により発色させて、その発色強度により歯周病の進行程度を診断することを特徴とする歯周病の診断方法。
【請求項２】
金属塩が３価の鉄を含有するものであり、発色試薬が２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジンである請求項１記載の歯周病の診断方法。
【請求項３】
金属塩が２価の銅を含有するものであり、発色試薬が２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン又はその塩である請求項１記載の歯周病の診断方法。
【請求項４】
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａと、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬を含有する診断試薬Ｂとを備えてなることを特徴とする歯周病診断キット。
【請求項５】
金属塩が３価の鉄を含有するものであり、発色試薬が２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジンである請求項４記載の歯周病診断キット。
【請求項６】
金属塩が２価の銅を含有するものであり、発色試薬が２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン又はその塩である請求項４記載の歯周病診断キット。
【請求項１】
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩と、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬とを唾液と接触させ、唾液中の金属イオン還元力により発色させて、その発色強度により歯周病の進行程度を診断することを特徴とする歯周病の診断方法。
【請求項２】
金属塩が３価の鉄を含有するものであり、発色試薬が２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジンである請求項１記載の歯周病の診断方法。
【請求項３】
金属塩が２価の銅を含有するものであり、発色試薬が２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン又はその塩である請求項１記載の歯周病の診断方法。
【請求項４】
３価の鉄及び／又は２価の銅を含有する金属塩を含有する診断試薬Ａと、該金属塩と金属キレートを作る発色試薬を含有する診断試薬Ｂとを備えてなることを特徴とする歯周病診断キット。
【請求項５】
金属塩が３価の鉄を含有するものであり、発色試薬が２，４，６−トリス−２−ピリジル−１，３，５−トリアジンである請求項４記載の歯周病診断キット。
【請求項６】
金属塩が２価の銅を含有するものであり、発色試薬が２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン又はその塩である請求項４記載の歯周病診断キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−１５１６３６（Ｐ２００８−１５１６３６Ａ）
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３９５９０（Ｐ２００６−３３９５９０）
【出願日】平成１８年１２月１８日（２００６．１２．１８）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１８日（２００６．１２．１８）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
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