歯周病菌プロテアーゼ阻害剤、並びにこれを用いた口腔組成物及び食料品
【課題】安全性に優れ、且つ歯周病の治療や予防に有用である歯周病菌プロテアーゼ阻害剤、並びにこれを用いた口腔組成物及び食料品を提供する。
【解決手段】本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤は、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。また、本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を医療用途のみならず、機能性食品成分としても用いることができる。
【解決手段】本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤は、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。また、本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を医療用途のみならず、機能性食品成分としても用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ科植物由来のタンパク質を有効成分とする歯周病菌プロテアーゼ阻害剤、並びにこれを用いた口腔組成物及び食料品に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病菌であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは成人性歯肉炎の最も重要な病原菌として認知され、幅広い研究が行われている（非特許文献１）。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは嫌気性のグラム陰性桿菌であり、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の産生能が非常に高い。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが産生するプロテアーゼには複数の分子種が存在するが、特に、トリプシン様システインプロテアーゼであるアルギニン特異的システインプロテアーゼ（Ｒｇｐ）とリジン特異的システインプロテアーゼ（Ｋｇｐ）は本菌種が産生する主要酵素であり、様々な研究が行われてきた（非特許文献２及び３）。これらの研究を通して、ＲｇｐやＫｇｐがヒト・トランスフェリンを分解し、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖とヒドロキシルラジカルの産生を促進すること（非特許文献４）、ＲｇｐやＫｇｐがヒト血清アルブミン存在下でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖に重要な役割を果たしていること（非特許文献５）、Ｋｇｐに対する特異抗体がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染からマウスを保護すること（非特許文献６）、ＫｇｐがＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの鉄獲得に関わっていること（非特許文献７）、ＲｇｐのペプチドドメインがマウスにおいてＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対する免疫性を付与すること（非特許文献８）、歯周病患者においてジンジパインに対する抗体の産生が認められること（非特許文献９）などが報告されている。これらの知見はいずれも、歯周組織環境におけるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖と病原性にＲｇｐとＫｇｐが大きな役割を果たしていることを指し示しており、ＲｇｐとＫｇｐが歯周病の治療・予防の重要な標的因子であることは疑う余地がないと言える。
【０００３】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの感染生理におけるＲｇｐやＫｇｐの役割が、上述のように明らかになるにつれて、歯周病の治療や予防を目的に、ＲｇｐやＫｇｐの阻害剤を開発しようとする試みが実施されている。合成薬剤や抗生物質としては、１−（３−フェニルプロピオニル）ピペラジン−３（Ｒ，Ｓ）−カルボン酸−[４−アミノ−１（Ｓ）−（ベンゾチアゾール−２−カルボニル）ブチル]アミド（非特許文献１０）、ベンザミジン誘導体（非特許文献１１）、テトラサイクリンとその誘導体（非特許文献１２）が報告されている。
【０００４】
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＦＡ−７０株が産生するアンチパインアナログ（ＦＡ−７０Ｃ１）がＲｇｐを強く阻害するとの結果も見出されている（非特許文献１３）。ＦＡ−７０Ｃ１がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの病原性を抑えるという知見も同時に得られており、このことからもジンジパイン阻害剤が歯周病の予防に有効であるのは確実である。
【０００５】
従来、安全性の観点から、植物成分からジンジパイン阻害剤を見出そうとする試みも行われている。例えば、特許文献１には、カテキン又はカテキン混合物を有効成分とする病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤が開示されており、このカテキン又はカテキン混合物がアルギニン特異的システインプロテアーゼ（Ｒｇｐ）やリジン特異的システインプロテアーゼ（Ｋｇｐ）の活性を阻害することが記載されている。また、特許文献２には、赤霊芝及び／又は黒霊芝がジンジパイン阻害剤として記載されている。さらに、特許文献３には、黄杞葉、緑茶、ウコン、ヨモギ、カリン、刺梨、ギムネマ、ルイボス茶、サンザシ、ラカンカ、シリマリン、枸杞子、紫玄米、エレウテロコック、月桃葉、ドクダミ、大棗及び霊芝がジンジパイン阻害剤として記載されている。
【特許文献１】特願２００４−１４３１２７号公報
【特許文献２】特願２００５−３５９０９号公報
【特許文献３】特願２００３−３３５６４８号公報
【非特許文献１】Biology of the species Porphyromonas gingivalis, CRCPress, Inc., Florida（１９９３）
【非特許文献２】Clin. Infect. Dis. ２８：４５６−４６５（１９９９）
【非特許文献３】Oral Microbiol. Immunol. １３：２６３−２７０（１９９８）
【非特許文献４】Infect. Immun. ７２：４３５１−４３５６（２００４）
【非特許文献５】Infect. Immun. ６９：５１６６−５１７２（２００１）
【非特許文献６】Infect. Immun. ６９：２９７２−２９７９（２００１）
【非特許文献７】Acta Biochim．Polonica ５１：２５３−２６２（２００４）
【非特許文献８】Infect. Immun. ６６：４１０８−４１１４（１９９８）
【非特許文献９】Infect. Immun. ７２：１３７４−１３８２（２００４）
【非特許文献１０】Infect. Immun. ７０：６９６８−６９７５（２００２）
【非特許文献１１】Biol. Chem．３８３：１１９３−１１９８（２００２）
【非特許文献１２】Antimicrob. Agents Chemother．４５：２８７１−２８７６（２００１）
【非特許文献１３】Biol. Chem．３８４：９１１−９２０（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、合成薬物は医薬品としての利用には適しているものの、食品を介した歯周病の予防目的には適していない。また、上記特許文献２や３に挙げられた植物の中には、日常的な摂食が健康に及ぼす影響については必ずしも明らかになっていないものも含まれており、安全性の点で不安が残る。従って、食品から医薬品までの幅広い利用が可能なジンジパイン阻害剤は限られており、歯周病予防に適した様々な機能性食品を具現化するためには、安全性に優れた天然物由来の新たな阻害剤が求められている。
【０００７】
そこで、本発明は、安全性に優れ、且つ歯周病の治療や予防に有用である歯周病菌プロテアーゼ阻害剤、並びにこれを用いた口腔組成物及び食料品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、イネ科植物由来のタンパク質がジンジパイン阻害活性を有することを見出し、本発明に想到した。
【０００９】
本発明における請求項１の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤は、イネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１０】
本発明における請求項２の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤は、請求項１において、前記イネ科植物由来のタンパク質が、イネに含まれるタンパク質、イネ由来のオリザシスタチン又はそれらの部分ペプチドのうちの少なくとも１つからなることを特徴とする。
【００１１】
本発明における請求項３の口腔用組成物は、請求項１又は２記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする。
【００１２】
本発明における請求項４の食料品は、請求項１又は２記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明における請求項１の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００１４】
本発明における請求項２の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００１５】
本発明における請求項３の口腔用組成物によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００１６】
本発明における請求項４の食料品によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤は、イネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有するものである。
【００１８】
本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤の有効成分の原料として用いられるイネ科植物とは、植物分類学上のイネ科に属する植物をいい、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエなどが挙げられ、特にイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖa）を用いるのが好ましい。ここで、産業廃棄物である米糠や、イネ刈り後にイネ株から発生する再生イネ等の利用価値のないイネを用いれば、極めて安価に本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤の有効成分の原料を得ることができる。
【００１９】
本発明において用いられるイネ科植物由来のタンパク質とは、イネ科植物に含まれるタンパク質をいい、例えばイネに含まれるタンパク質、イネ由来のオリザシスタチン又はそれらの部分ペプチドが含まれる。ここでいう「部分ペプチド」とは、本発明の有効成分であるイネ科植物由来のタンパク質の全アミノ酸配列の一部からなるペプチドであって、イネ科植物由来のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつジンジパイン阻害活性機能の活性部位の領域を少なくとも含むタンパク質をいう。この「部分ペプチド」は、有効成分であるタンパク質の製造過程において得られるか、又は、得られたタンパク質を慣用のアミノ酸配列切断手段によって切断し、後述する活性測定試験により活性の有無を確認することによって得ることができる。
【００２０】
なお、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖa）由来のオリザシスタチンは、これまでに３種類の存在が報告されており、それぞれオリザシスタチン−I（阿部ら：J.BIo.Chem, 262, 16793-16797(1987)）、オリザシスタチン−II（近藤ら：J.BIo.Chem, 265, 15832-15837(1990)）、オリザシスタチン−III（World Rice Research Conference 2004, Abstract p.117 (2004)、J. Agric. Food Chem. Web release 07-Jun-2005 (2005)）と命名されている。また、このオリザシスタチン−Iは、Ｎ末端のメチオニンよりＣ末端のアラニンまでの合計１０２残基のアミノ酸より構成されており、オリザシスタチン−IIは、Ｎ末端のメチオニンよりＣ末端のアラニンまでの合計１０７残基のアミノ酸より構成されている。また、オリザシスタチン−IIIは、Ｎ末端のメチオニンからＣ末端のアラニンまでの合計１０８残基のアミノ酸より構成され、分子量１２，０００のタンパク質である。
【００２１】
イネ科植物由来のタンパク質の製造方法は、イネ科植物の葉、茎、皮、根、種子などの抽出物から慣用の方法に従って、タンパク質画分を分離して得ることができる。ここで、前記抽出物の製造方法は、特に限定されないが、例えば、イネ科植物の葉、茎、皮、根、種子などの植物体部分を、水又はリン酸緩衝液のような溶媒で磨砕した後、ろ過又は遠心分離により上清を集め、これを必要に応じて溶媒で希釈することにより得ることができる。
【００２２】
また、抽出物からのタンパク質画分の分離精製は、特に限定されないが、例えば、前記抽出物に硫酸アンモニウムを加えて、析出したタンパク質を遠心分離により集め、さらにリン酸緩衝液などを用いて溶解させて、これを透析やゲルろ過などの操作を行い、低分子画分等を取り除くことにより分離精製を行うことができる。
【００２３】
さらに、前記抽出物を加熱処理してもよい。加熱方法としては、電気やガスなどの熱源を用いた方法や、マイクロ波などが利用可能であり、方法は特に限定しない。加熱処理の温度範囲としては特に限定しないが、好ましくは６０〜１２０℃の温度範囲で加熱処理を行う。
【００２４】
また、本発明において、ジンジパイン阻害活性機能を有する有効成分には、上述したように所望のタンパク質を精製したものを用いてもよいが、有効成分であるタンパク質を有効量含むのであれば、植物体組織またはその乾燥品、粉砕品、抽出物をそのまま有効成分として使用してもよい。なお、乾燥品や粉砕品の調製方法も本発明による有効成分を含んで得ることができる限り、特に限定されない。
【００２５】
本発明の口腔組成物は、前記本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含んでおればよく、口腔組成物の種類は特に限定されず、例えば歯磨きやマウスウォッシュのように口腔内で用いられているものを含み、具体的には、練り状、液体状、粉末状の歯磨き剤、マウススプレーなどの口中清涼剤、トローチ剤、うがい剤、シロップ剤等の医薬品又は医薬部外品が挙げられる。
【００２６】
また、本発明の食料品は、前記本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含んでおればよく、食料品の種類は特に限定されず、例えば、飴、チューインガム、トローチ、ジャム、飲料等が挙げられる。
【００２７】
また、本発明の口腔組成物及び食料品において、本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤の配合割合は、口腔組成物、食料品の種類及び該口腔組成物や食料品に配合される他の成分の種類や量に応じて適宜選択することができる。また、歯周病菌プロテアーゼ阻害剤の剤型は特に限定されず任意である。
【００２８】
本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００２９】
本発明の口腔組成物及び食料品によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００３０】
以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
米糠タンパク質の抽出。コシヒカリ玄米を９０％まで精米した際に生じる米糠１ｋｇを原料として、これに４倍量の２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ６．０）を加えて、４℃で１時間浸漬した。次いで、磨砕処理を行い、固形分を除いた後、８０℃で１０分間加熱処理し、タンパク質分解酵素の活性を失活させた。生じた沈殿物を除去し、抽出物に３０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して沈殿する画分を除去し、その上清に７０％飽和になるように硫酸アンモニウムを追加して沈殿する画分を米糠タンパク質画分として分離した。本画分は、リン酸ナトリウム緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ６．０）に再溶解し、４℃で透析後、凍結保存した。
【実施例２】
【００３２】
組換えオリザシスタチン−Ｉ, −II, −IIIの調製。
（オリザシスタチン−Ｉならびにオリザシスタチン−IIIをコードするｃＤＮＡの単離）コシヒカリのカルスから抽出したＲＮＡを用いて、オリザシスタチン−Ｉとオリザシスタチン−IIIをコードするｃＤＮＡをＰＣＲクローニングにより取得した。増幅反応にはTaKaRa One Step RNA PCR Kit（タカラバイオ製）を利用した。オリザシスタチン-I ｃＤＮＡのクローニングに用いたプライマーは５’−ＡＴＧＴＣＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣＣ−３’と５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＴＴＧＣ−３’、オリザシスタチン−III ｃＤＮＡ用のプライマーは、５’−ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧ−３’と５’−ＣＴＡＴＧＴＡＣＧＴＴＴＡＧＧＣＧＧＴＧ−３’である。ＰＣＲ増幅産物は、TA cloning Kit（インビトロジェン製）によりｐＣＲ２．１にサブクローニングした。
【００３３】
（オリザシスタチン−Ｉならびにオリザシスタチン−IIIの発現プラスミドの構築）オリザシスタチン−Ｉならびにオリザシスタチン−IIIは、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列をＮ末に有し、ＧＳＴ配列とオリザシスタチン配列の間にFactor Xaによる切断部位を持つ融合タンパク質として発現させた。Factor Xa切断部位（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）は、ＰＣＲ反応を利用して、オリザシスタチン−Ｉならびにオリザシスタチン−IIIの翻訳シグナルの直上に付加した。そのために用いたプライマーは、オリザシスタチン−Ｉ用が５’−ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣＣ−３’と５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＴＴＧＣ−３’、オリザシスタチン−III用が５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡ−３’と５’−ＴＴＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣ−３’である。ＰＣＲ増幅産物は、TA cloning Kit（インビトロジェン製）によりｐＣＲ２．１にサブクローニングした。制限酵素で切断後、Factor Xa認識部位を付加したオリザシスタチン−Ｉ配列はpGEX-4T-2（アマシャムバイオサイエンス製）、Factor Xa認識部位を付加したオリザシスタチン−III配列はpGEX-6P-2（アマシャムバイオサイエンス製）の、それぞれＧＳＴコーディング領域の下流に挿入した。
（オリザシスタチン−IIをコードする発現プラスミドの構築）Factor Xa認識部位をN末に付加したオリザシスタチン-II ｃＤＮＡを、オリザシスタチン-III ｃＤＮＡをテンプレートとするＰＣＲ反応により合成した。そのために用いたプライマーは５’− ＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＡ−３’と５’− ＴＴＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣ−３’である。ＰＣＲ増幅断片はTA cloning Kit（インビトロジェン製）によりｐＣＲ２．１にサブクローニングした。制限酵素で切断後、Factor Xa認識部位を付加したオリザシスタチン−II配列はpGEX-6P-2（アマシャムバイオサイエンス製）のＧＳＴコーディング領域の下流に挿入した。
【００３４】
（組換えオリザシスタチン−Ｉ、オリザシスタチン−IIならびにオリザシスタチン−IIIの調製）ＧＳＴ−オリザシスタチン（−Ｉ/−II/−III）発現プラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１株（アマシャムバイオサイエンス製）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で、３７℃で培養した。培養開始から３時間後にＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-β-D-galactoside）を１．０ｍＭの濃度になるように添加し、更に６時間の培養を行った。培養終了後、集菌した菌体を１% Triton X-100を含むＰＢＳ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４/１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４-１４０ｍＭ ＮａＣｌ-２．７ｍＭ ＫＣｌ）に懸濁し、超音波処理にて菌体を破壊した。次いで、固形分を遠心分離によって除去した菌体破砕液から、GSTrap HPカラム（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて融合タンパク質をアフィニティー精製した。融合タンパク質を含む画分を回収したあと、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)-１００ｍＭ ＮａＣｌ−５ｍＭ ＣａＣｌ２で透析し、更に５Ｕ／ｍｌの濃度になるようにFactor Xa（ノバジェン製）を加えて、２５℃で２〜３時間の切断反応を行った。反応液からHiTrap Benzamidine FFカラム（アマシャムバイオサイエンス製）でFactor Xaを吸着除去した後、GSTrap HPカラムクロマトグラフィーによって切断されたＧＳＴを除去し、オリザシスタチン−Ｉ、オリザシスタチン−IIならびにオリザシスタチン−IIIの精製標品を得た。
【実施例３】
【００３５】
ジンジパイン阻害活性の測定。
（酵素標品の調製）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＪＣＭ８５２５を、５％ウシ胎児血清を添加したＫＧＢ培地で波長６００ｎｍにおける吸光度が２．１に達するまで培養し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、１０分間）で菌体を集めた。次いで、菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１ｍＭ ＣａＣｌ２を含む、ｐＨ７．４）に懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した後、固形分を遠心分離で除去した。回収した破砕上清をＲｇｐ（アルギニン特異的システインプロテアーゼ）並びにＫｇｐ（リジン特異的システインプロテアーゼ）測定の酵素標品として使用した。
【００３６】
（Ｒｇｐ阻害活性）測定用の緩衝液には、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／１０ｍＭ Ｌ−システイン（ｐＨ７．６）を使用した。酵素標品として前述のＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体抽出液（２．７８μｇタンパク質／ｍｌ）と所定濃度の測定サンプル（イネタンパク質標品）を加え、４０℃で５分間のプレインキュベーションを行った。その後、酵素基質となるＢｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を５０μＭの濃度になるように添加し、酵素反応を開始した。蛍光分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＦ−５３００ＰＣ；（株）島津製作所社製、励起波長３８０ｎｍ、吸収波長４４０ｎｍ）を用いて、反応の進行に伴う蛍光強度の増加をモニタリングし、酵素反応の強さは基質から遊離するＡＭＣ量で評価した。３０〜７０％硫安分画によって調製した米糠タンパク質標品のＲｇｐ阻害活性を図１に示す。
【００３７】
図１に示したように、２．０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で強いＲｇｐ阻害活性を認めることができた。また、９０℃、３０分間の加熱処理によってＲｇｐ阻害活性が増強されたことから、米糠タンパク質標品の阻害活性に対する加熱処理の有効性が明らかとなった。これらの結果より、米糠タンパク質がジンジパイン阻害剤として、さらには、歯周病予防因子として利用できることが明らかとなった。
【００３８】
（Ｋｇｐ阻害活性）測定用の緩衝液には、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／１０ｍＭ Ｌ−システイン（ｐＨ７．６）を使用した。酵素標品として前述のＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体抽出液（２１．５μｇタンパク質／ｍｌ）と所定濃度の測定サンプル（イネタンパク質標品又はオリザシスタチン−Ｉ，−II，−III）を加え、４０℃で５分間のプレインキュベーションを行った。その後、酵素基質となるＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を５０μＭの濃度になるように添加し、酵素反応を開始した。蛍光分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＦ−５３００ＰＣ；（株）島津製作所社製、励起波長３８０ｎｍ、吸収波長４４０ｎｍ）を用いて、反応の進行に伴う蛍光強度の増加をモニタリングし、酵素反応の強さは基質から遊離するＡＭＣ量で評価した。オリザシスタチン−Ｉ，−II，及び−IIIのＫｇｐ阻害活性を図２に示し、３０〜７０％硫安分画によって調製した米糠タンパク質標品のＫｇｐ阻害活性を図３に示す。
【００３９】
図２及び図３に示すように、オリザシスタチン−IIIは１０μＭ以下の低い濃度でＫｇｐに対して阻害活性を示し、米糠タンパク質標品も２ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で強いＫｇｐ活性を示した。オリザシスタチン−IIIと米糠タンパク質標品のいずれの場合においても、加熱処理はＫｇｐ阻害活性を増強した。以上の結果からも、オリザシスタチン−IIIや米糠タンパク質標品というイネ由来のタンパク質が、ジンジパイン阻害剤として、更には、歯周病予防因子として利用できることが明らかとなった。
【実施例４】
【００４０】
（練歯磨の調製）以下の処方により常法に従って練歯磨を調製した。
【００４１】
炭酸カルシウム５０．００重量％、グリセリン２０．００重量％、カラギーナン０．５０重量％、カルボキシメチルセルロース１．００重量％、ラウリル硫酸ナトリウム２．００重量％、香料１．００重量％、サッカリン０．１０重量％、イネ由来タンパク質画分２．００重量％、水２３．４０重量％。
【実施例５】
【００４２】
（寒天ゼリーの調製）以下の処方により常法に従って寒天ゼリーを調製した。
【００４３】
寒天１５ｇ、水あめ２５０ｇ、砂糖６００ｇ、水４５０ｍｌ、香料・洋酒 少量、オリザシスタチン−ＩＩＩ５ｇを均一に過熱・攪拌し、型に入れ、冷却し寒天ゼリーを得た。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】米糠タンパク質標品のＲｇｐ阻害活性試験の結果を示すグラフである。
【図２】オリザシスタチン−Ｉ，−II，及び−IIIのＫｇｐ阻害活性試験の結果を示すグラフである。
【図３】米糠タンパク質標品のＫｇｐ阻害活性試験の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ科植物由来のタンパク質を有効成分とする歯周病菌プロテアーゼ阻害剤、並びにこれを用いた口腔組成物及び食料品に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病菌であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは成人性歯肉炎の最も重要な病原菌として認知され、幅広い研究が行われている（非特許文献１）。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは嫌気性のグラム陰性桿菌であり、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の産生能が非常に高い。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが産生するプロテアーゼには複数の分子種が存在するが、特に、トリプシン様システインプロテアーゼであるアルギニン特異的システインプロテアーゼ（Ｒｇｐ）とリジン特異的システインプロテアーゼ（Ｋｇｐ）は本菌種が産生する主要酵素であり、様々な研究が行われてきた（非特許文献２及び３）。これらの研究を通して、ＲｇｐやＫｇｐがヒト・トランスフェリンを分解し、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖とヒドロキシルラジカルの産生を促進すること（非特許文献４）、ＲｇｐやＫｇｐがヒト血清アルブミン存在下でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖に重要な役割を果たしていること（非特許文献５）、Ｋｇｐに対する特異抗体がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染からマウスを保護すること（非特許文献６）、ＫｇｐがＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの鉄獲得に関わっていること（非特許文献７）、ＲｇｐのペプチドドメインがマウスにおいてＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対する免疫性を付与すること（非特許文献８）、歯周病患者においてジンジパインに対する抗体の産生が認められること（非特許文献９）などが報告されている。これらの知見はいずれも、歯周組織環境におけるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの増殖と病原性にＲｇｐとＫｇｐが大きな役割を果たしていることを指し示しており、ＲｇｐとＫｇｐが歯周病の治療・予防の重要な標的因子であることは疑う余地がないと言える。
【０００３】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの感染生理におけるＲｇｐやＫｇｐの役割が、上述のように明らかになるにつれて、歯周病の治療や予防を目的に、ＲｇｐやＫｇｐの阻害剤を開発しようとする試みが実施されている。合成薬剤や抗生物質としては、１−（３−フェニルプロピオニル）ピペラジン−３（Ｒ，Ｓ）−カルボン酸−[４−アミノ−１（Ｓ）−（ベンゾチアゾール−２−カルボニル）ブチル]アミド（非特許文献１０）、ベンザミジン誘導体（非特許文献１１）、テトラサイクリンとその誘導体（非特許文献１２）が報告されている。
【０００４】
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＦＡ−７０株が産生するアンチパインアナログ（ＦＡ−７０Ｃ１）がＲｇｐを強く阻害するとの結果も見出されている（非特許文献１３）。ＦＡ−７０Ｃ１がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの病原性を抑えるという知見も同時に得られており、このことからもジンジパイン阻害剤が歯周病の予防に有効であるのは確実である。
【０００５】
従来、安全性の観点から、植物成分からジンジパイン阻害剤を見出そうとする試みも行われている。例えば、特許文献１には、カテキン又はカテキン混合物を有効成分とする病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤が開示されており、このカテキン又はカテキン混合物がアルギニン特異的システインプロテアーゼ（Ｒｇｐ）やリジン特異的システインプロテアーゼ（Ｋｇｐ）の活性を阻害することが記載されている。また、特許文献２には、赤霊芝及び／又は黒霊芝がジンジパイン阻害剤として記載されている。さらに、特許文献３には、黄杞葉、緑茶、ウコン、ヨモギ、カリン、刺梨、ギムネマ、ルイボス茶、サンザシ、ラカンカ、シリマリン、枸杞子、紫玄米、エレウテロコック、月桃葉、ドクダミ、大棗及び霊芝がジンジパイン阻害剤として記載されている。
【特許文献１】特願２００４−１４３１２７号公報
【特許文献２】特願２００５−３５９０９号公報
【特許文献３】特願２００３−３３５６４８号公報
【非特許文献１】Biology of the species Porphyromonas gingivalis, CRCPress, Inc., Florida（１９９３）
【非特許文献２】Clin. Infect. Dis. ２８：４５６−４６５（１９９９）
【非特許文献３】Oral Microbiol. Immunol. １３：２６３−２７０（１９９８）
【非特許文献４】Infect. Immun. ７２：４３５１−４３５６（２００４）
【非特許文献５】Infect. Immun. ６９：５１６６−５１７２（２００１）
【非特許文献６】Infect. Immun. ６９：２９７２−２９７９（２００１）
【非特許文献７】Acta Biochim．Polonica ５１：２５３−２６２（２００４）
【非特許文献８】Infect. Immun. ６６：４１０８−４１１４（１９９８）
【非特許文献９】Infect. Immun. ７２：１３７４−１３８２（２００４）
【非特許文献１０】Infect. Immun. ７０：６９６８−６９７５（２００２）
【非特許文献１１】Biol. Chem．３８３：１１９３−１１９８（２００２）
【非特許文献１２】Antimicrob. Agents Chemother．４５：２８７１−２８７６（２００１）
【非特許文献１３】Biol. Chem．３８４：９１１−９２０（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、合成薬物は医薬品としての利用には適しているものの、食品を介した歯周病の予防目的には適していない。また、上記特許文献２や３に挙げられた植物の中には、日常的な摂食が健康に及ぼす影響については必ずしも明らかになっていないものも含まれており、安全性の点で不安が残る。従って、食品から医薬品までの幅広い利用が可能なジンジパイン阻害剤は限られており、歯周病予防に適した様々な機能性食品を具現化するためには、安全性に優れた天然物由来の新たな阻害剤が求められている。
【０００７】
そこで、本発明は、安全性に優れ、且つ歯周病の治療や予防に有用である歯周病菌プロテアーゼ阻害剤、並びにこれを用いた口腔組成物及び食料品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、イネ科植物由来のタンパク質がジンジパイン阻害活性を有することを見出し、本発明に想到した。
【０００９】
本発明における請求項１の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤は、イネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１０】
本発明における請求項２の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤は、請求項１において、前記イネ科植物由来のタンパク質が、イネに含まれるタンパク質、イネ由来のオリザシスタチン又はそれらの部分ペプチドのうちの少なくとも１つからなることを特徴とする。
【００１１】
本発明における請求項３の口腔用組成物は、請求項１又は２記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする。
【００１２】
本発明における請求項４の食料品は、請求項１又は２記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明における請求項１の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００１４】
本発明における請求項２の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００１５】
本発明における請求項３の口腔用組成物によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００１６】
本発明における請求項４の食料品によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤は、イネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有するものである。
【００１８】
本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤の有効成分の原料として用いられるイネ科植物とは、植物分類学上のイネ科に属する植物をいい、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエなどが挙げられ、特にイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖa）を用いるのが好ましい。ここで、産業廃棄物である米糠や、イネ刈り後にイネ株から発生する再生イネ等の利用価値のないイネを用いれば、極めて安価に本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤の有効成分の原料を得ることができる。
【００１９】
本発明において用いられるイネ科植物由来のタンパク質とは、イネ科植物に含まれるタンパク質をいい、例えばイネに含まれるタンパク質、イネ由来のオリザシスタチン又はそれらの部分ペプチドが含まれる。ここでいう「部分ペプチド」とは、本発明の有効成分であるイネ科植物由来のタンパク質の全アミノ酸配列の一部からなるペプチドであって、イネ科植物由来のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつジンジパイン阻害活性機能の活性部位の領域を少なくとも含むタンパク質をいう。この「部分ペプチド」は、有効成分であるタンパク質の製造過程において得られるか、又は、得られたタンパク質を慣用のアミノ酸配列切断手段によって切断し、後述する活性測定試験により活性の有無を確認することによって得ることができる。
【００２０】
なお、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖa）由来のオリザシスタチンは、これまでに３種類の存在が報告されており、それぞれオリザシスタチン−I（阿部ら：J.BIo.Chem, 262, 16793-16797(1987)）、オリザシスタチン−II（近藤ら：J.BIo.Chem, 265, 15832-15837(1990)）、オリザシスタチン−III（World Rice Research Conference 2004, Abstract p.117 (2004)、J. Agric. Food Chem. Web release 07-Jun-2005 (2005)）と命名されている。また、このオリザシスタチン−Iは、Ｎ末端のメチオニンよりＣ末端のアラニンまでの合計１０２残基のアミノ酸より構成されており、オリザシスタチン−IIは、Ｎ末端のメチオニンよりＣ末端のアラニンまでの合計１０７残基のアミノ酸より構成されている。また、オリザシスタチン−IIIは、Ｎ末端のメチオニンからＣ末端のアラニンまでの合計１０８残基のアミノ酸より構成され、分子量１２，０００のタンパク質である。
【００２１】
イネ科植物由来のタンパク質の製造方法は、イネ科植物の葉、茎、皮、根、種子などの抽出物から慣用の方法に従って、タンパク質画分を分離して得ることができる。ここで、前記抽出物の製造方法は、特に限定されないが、例えば、イネ科植物の葉、茎、皮、根、種子などの植物体部分を、水又はリン酸緩衝液のような溶媒で磨砕した後、ろ過又は遠心分離により上清を集め、これを必要に応じて溶媒で希釈することにより得ることができる。
【００２２】
また、抽出物からのタンパク質画分の分離精製は、特に限定されないが、例えば、前記抽出物に硫酸アンモニウムを加えて、析出したタンパク質を遠心分離により集め、さらにリン酸緩衝液などを用いて溶解させて、これを透析やゲルろ過などの操作を行い、低分子画分等を取り除くことにより分離精製を行うことができる。
【００２３】
さらに、前記抽出物を加熱処理してもよい。加熱方法としては、電気やガスなどの熱源を用いた方法や、マイクロ波などが利用可能であり、方法は特に限定しない。加熱処理の温度範囲としては特に限定しないが、好ましくは６０〜１２０℃の温度範囲で加熱処理を行う。
【００２４】
また、本発明において、ジンジパイン阻害活性機能を有する有効成分には、上述したように所望のタンパク質を精製したものを用いてもよいが、有効成分であるタンパク質を有効量含むのであれば、植物体組織またはその乾燥品、粉砕品、抽出物をそのまま有効成分として使用してもよい。なお、乾燥品や粉砕品の調製方法も本発明による有効成分を含んで得ることができる限り、特に限定されない。
【００２５】
本発明の口腔組成物は、前記本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含んでおればよく、口腔組成物の種類は特に限定されず、例えば歯磨きやマウスウォッシュのように口腔内で用いられているものを含み、具体的には、練り状、液体状、粉末状の歯磨き剤、マウススプレーなどの口中清涼剤、トローチ剤、うがい剤、シロップ剤等の医薬品又は医薬部外品が挙げられる。
【００２６】
また、本発明の食料品は、前記本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含んでおればよく、食料品の種類は特に限定されず、例えば、飴、チューインガム、トローチ、ジャム、飲料等が挙げられる。
【００２７】
また、本発明の口腔組成物及び食料品において、本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤の配合割合は、口腔組成物、食料品の種類及び該口腔組成物や食料品に配合される他の成分の種類や量に応じて適宜選択することができる。また、歯周病菌プロテアーゼ阻害剤の剤型は特に限定されず任意である。
【００２８】
本発明の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００２９】
本発明の口腔組成物及び食料品によれば、副作用等の心配のない古くから用いられ、天然物であるイネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有しているため、安全性に優れ、且つジンジパインを阻害するので歯周病の治療や予防に有用である。
【００３０】
以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
米糠タンパク質の抽出。コシヒカリ玄米を９０％まで精米した際に生じる米糠１ｋｇを原料として、これに４倍量の２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ６．０）を加えて、４℃で１時間浸漬した。次いで、磨砕処理を行い、固形分を除いた後、８０℃で１０分間加熱処理し、タンパク質分解酵素の活性を失活させた。生じた沈殿物を除去し、抽出物に３０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して沈殿する画分を除去し、その上清に７０％飽和になるように硫酸アンモニウムを追加して沈殿する画分を米糠タンパク質画分として分離した。本画分は、リン酸ナトリウム緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ６．０）に再溶解し、４℃で透析後、凍結保存した。
【実施例２】
【００３２】
組換えオリザシスタチン−Ｉ, −II, −IIIの調製。
（オリザシスタチン−Ｉならびにオリザシスタチン−IIIをコードするｃＤＮＡの単離）コシヒカリのカルスから抽出したＲＮＡを用いて、オリザシスタチン−Ｉとオリザシスタチン−IIIをコードするｃＤＮＡをＰＣＲクローニングにより取得した。増幅反応にはTaKaRa One Step RNA PCR Kit（タカラバイオ製）を利用した。オリザシスタチン-I ｃＤＮＡのクローニングに用いたプライマーは５’−ＡＴＧＴＣＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣＣ−３’と５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＴＴＧＣ−３’、オリザシスタチン−III ｃＤＮＡ用のプライマーは、５’−ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧ−３’と５’−ＣＴＡＴＧＴＡＣＧＴＴＴＡＧＧＣＧＧＴＧ−３’である。ＰＣＲ増幅産物は、TA cloning Kit（インビトロジェン製）によりｐＣＲ２．１にサブクローニングした。
【００３３】
（オリザシスタチン−Ｉならびにオリザシスタチン−IIIの発現プラスミドの構築）オリザシスタチン−Ｉならびにオリザシスタチン−IIIは、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列をＮ末に有し、ＧＳＴ配列とオリザシスタチン配列の間にFactor Xaによる切断部位を持つ融合タンパク質として発現させた。Factor Xa切断部位（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）は、ＰＣＲ反応を利用して、オリザシスタチン−Ｉならびにオリザシスタチン−IIIの翻訳シグナルの直上に付加した。そのために用いたプライマーは、オリザシスタチン−Ｉ用が５’−ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＣＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣＣ−３’と５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＴＴＧＣ−３’、オリザシスタチン−III用が５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡ−３’と５’−ＴＴＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣ−３’である。ＰＣＲ増幅産物は、TA cloning Kit（インビトロジェン製）によりｐＣＲ２．１にサブクローニングした。制限酵素で切断後、Factor Xa認識部位を付加したオリザシスタチン−Ｉ配列はpGEX-4T-2（アマシャムバイオサイエンス製）、Factor Xa認識部位を付加したオリザシスタチン−III配列はpGEX-6P-2（アマシャムバイオサイエンス製）の、それぞれＧＳＴコーディング領域の下流に挿入した。
（オリザシスタチン−IIをコードする発現プラスミドの構築）Factor Xa認識部位をN末に付加したオリザシスタチン-II ｃＤＮＡを、オリザシスタチン-III ｃＤＮＡをテンプレートとするＰＣＲ反応により合成した。そのために用いたプライマーは５’− ＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＡ−３’と５’− ＴＴＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＡＧＧＧＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣ−３’である。ＰＣＲ増幅断片はTA cloning Kit（インビトロジェン製）によりｐＣＲ２．１にサブクローニングした。制限酵素で切断後、Factor Xa認識部位を付加したオリザシスタチン−II配列はpGEX-6P-2（アマシャムバイオサイエンス製）のＧＳＴコーディング領域の下流に挿入した。
【００３４】
（組換えオリザシスタチン−Ｉ、オリザシスタチン−IIならびにオリザシスタチン−IIIの調製）ＧＳＴ−オリザシスタチン（−Ｉ/−II/−III）発現プラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１株（アマシャムバイオサイエンス製）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で、３７℃で培養した。培養開始から３時間後にＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-β-D-galactoside）を１．０ｍＭの濃度になるように添加し、更に６時間の培養を行った。培養終了後、集菌した菌体を１% Triton X-100を含むＰＢＳ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４/１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４-１４０ｍＭ ＮａＣｌ-２．７ｍＭ ＫＣｌ）に懸濁し、超音波処理にて菌体を破壊した。次いで、固形分を遠心分離によって除去した菌体破砕液から、GSTrap HPカラム（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて融合タンパク質をアフィニティー精製した。融合タンパク質を含む画分を回収したあと、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)-１００ｍＭ ＮａＣｌ−５ｍＭ ＣａＣｌ２で透析し、更に５Ｕ／ｍｌの濃度になるようにFactor Xa（ノバジェン製）を加えて、２５℃で２〜３時間の切断反応を行った。反応液からHiTrap Benzamidine FFカラム（アマシャムバイオサイエンス製）でFactor Xaを吸着除去した後、GSTrap HPカラムクロマトグラフィーによって切断されたＧＳＴを除去し、オリザシスタチン−Ｉ、オリザシスタチン−IIならびにオリザシスタチン−IIIの精製標品を得た。
【実施例３】
【００３５】
ジンジパイン阻害活性の測定。
（酵素標品の調製）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＪＣＭ８５２５を、５％ウシ胎児血清を添加したＫＧＢ培地で波長６００ｎｍにおける吸光度が２．１に達するまで培養し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、１０分間）で菌体を集めた。次いで、菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１ｍＭ ＣａＣｌ２を含む、ｐＨ７．４）に懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した後、固形分を遠心分離で除去した。回収した破砕上清をＲｇｐ（アルギニン特異的システインプロテアーゼ）並びにＫｇｐ（リジン特異的システインプロテアーゼ）測定の酵素標品として使用した。
【００３６】
（Ｒｇｐ阻害活性）測定用の緩衝液には、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／１０ｍＭ Ｌ−システイン（ｐＨ７．６）を使用した。酵素標品として前述のＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体抽出液（２．７８μｇタンパク質／ｍｌ）と所定濃度の測定サンプル（イネタンパク質標品）を加え、４０℃で５分間のプレインキュベーションを行った。その後、酵素基質となるＢｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を５０μＭの濃度になるように添加し、酵素反応を開始した。蛍光分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＦ−５３００ＰＣ；（株）島津製作所社製、励起波長３８０ｎｍ、吸収波長４４０ｎｍ）を用いて、反応の進行に伴う蛍光強度の増加をモニタリングし、酵素反応の強さは基質から遊離するＡＭＣ量で評価した。３０〜７０％硫安分画によって調製した米糠タンパク質標品のＲｇｐ阻害活性を図１に示す。
【００３７】
図１に示したように、２．０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で強いＲｇｐ阻害活性を認めることができた。また、９０℃、３０分間の加熱処理によってＲｇｐ阻害活性が増強されたことから、米糠タンパク質標品の阻害活性に対する加熱処理の有効性が明らかとなった。これらの結果より、米糠タンパク質がジンジパイン阻害剤として、さらには、歯周病予防因子として利用できることが明らかとなった。
【００３８】
（Ｋｇｐ阻害活性）測定用の緩衝液には、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／１０ｍＭ Ｌ−システイン（ｐＨ７．６）を使用した。酵素標品として前述のＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体抽出液（２１．５μｇタンパク質／ｍｌ）と所定濃度の測定サンプル（イネタンパク質標品又はオリザシスタチン−Ｉ，−II，−III）を加え、４０℃で５分間のプレインキュベーションを行った。その後、酵素基質となるＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を５０μＭの濃度になるように添加し、酵素反応を開始した。蛍光分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＦ−５３００ＰＣ；（株）島津製作所社製、励起波長３８０ｎｍ、吸収波長４４０ｎｍ）を用いて、反応の進行に伴う蛍光強度の増加をモニタリングし、酵素反応の強さは基質から遊離するＡＭＣ量で評価した。オリザシスタチン−Ｉ，−II，及び−IIIのＫｇｐ阻害活性を図２に示し、３０〜７０％硫安分画によって調製した米糠タンパク質標品のＫｇｐ阻害活性を図３に示す。
【００３９】
図２及び図３に示すように、オリザシスタチン−IIIは１０μＭ以下の低い濃度でＫｇｐに対して阻害活性を示し、米糠タンパク質標品も２ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で強いＫｇｐ活性を示した。オリザシスタチン−IIIと米糠タンパク質標品のいずれの場合においても、加熱処理はＫｇｐ阻害活性を増強した。以上の結果からも、オリザシスタチン−IIIや米糠タンパク質標品というイネ由来のタンパク質が、ジンジパイン阻害剤として、更には、歯周病予防因子として利用できることが明らかとなった。
【実施例４】
【００４０】
（練歯磨の調製）以下の処方により常法に従って練歯磨を調製した。
【００４１】
炭酸カルシウム５０．００重量％、グリセリン２０．００重量％、カラギーナン０．５０重量％、カルボキシメチルセルロース１．００重量％、ラウリル硫酸ナトリウム２．００重量％、香料１．００重量％、サッカリン０．１０重量％、イネ由来タンパク質画分２．００重量％、水２３．４０重量％。
【実施例５】
【００４２】
（寒天ゼリーの調製）以下の処方により常法に従って寒天ゼリーを調製した。
【００４３】
寒天１５ｇ、水あめ２５０ｇ、砂糖６００ｇ、水４５０ｍｌ、香料・洋酒 少量、オリザシスタチン−ＩＩＩ５ｇを均一に過熱・攪拌し、型に入れ、冷却し寒天ゼリーを得た。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】米糠タンパク質標品のＲｇｐ阻害活性試験の結果を示すグラフである。
【図２】オリザシスタチン−Ｉ，−II，及び−IIIのＫｇｐ阻害活性試験の結果を示すグラフである。
【図３】米糠タンパク質標品のＫｇｐ阻害活性試験の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有することを特徴とする歯周病菌プロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記イネ科植物由来のタンパク質が、イネに含まれるタンパク質、イネ由来のオリザシスタチン又はそれらの部分ペプチドのうちの少なくとも１つからなることを特徴とする請求項１記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする口腔用組成物。
【請求項４】
請求項１又は２記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする食料品。
【請求項１】
イネ科植物由来のタンパク質を有効成分として含有することを特徴とする歯周病菌プロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記イネ科植物由来のタンパク質が、イネに含まれるタンパク質、イネ由来のオリザシスタチン又はそれらの部分ペプチドのうちの少なくとも１つからなることを特徴とする請求項１記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする口腔用組成物。
【請求項４】
請求項１又は２記載の歯周病菌プロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする食料品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−１６００２（Ｐ２００７−１６００２Ａ）
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２０１３５６（Ｐ２００５−２０１３５６）
【出願日】平成１７年７月１１日（２００５．７．１１）
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【出願人】（５９１０９６３０３）株式会社ブルボン (13)
【出願人】（０００２１８９８２）島田化学工業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１１日（２００５．７．１１）
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【出願人】（５９１０９６３０３）株式会社ブルボン (13)
【出願人】（０００２１８９８２）島田化学工業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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