歯科補綴のための骨移植およびバイオ複合材料
生分解性ポリマーおよびβ−リン酸三カルシウムの顆粒の複合材料であり、有効成分として、生分解性ポリマー中に埋め込まれた生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰを（生分解性ポリマーに対する可塑剤として同時に活性である、塩基性の有機化合物とのムチデンタル（ｍｕｔｉ−ｄｅｎｔａｌ）包接化合物として）さらに含む、骨欠損治療および骨の新生のための骨移植片またはバイオ複合材料。バイオ複合材料は、成型および成形可能であり、外科手術または歯科補綴によって配置した場合に原位置で速やかに硬化し、骨の修復、ならびに損傷または罹患している組織および病変の治癒を促進する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、リン酸三カルシウムの顆粒および吸収性ポリマーまたはコポリマーを含む基材からできている骨移植片およびバイオ複合材料に関する。本発明は、とりわけ、歯科補綴の過程における骨および軟部組織病変の治癒を加速し、改善するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
骨インプラントの安定性は、その内方成長の性質に大いに依存する。歯科インプラントが働くには顎において十分な骨が存在しなくてはならず、骨はインプラントを保持および支持するのに十分強力でなければならない。深さまたは厚さに関して不十分または不完全な上顎または下顎の骨が存在する場合、歯科インプラントとの確実な組込みを提供するのに、歯科補綴において移植片が使用される。従来の移植片は、患者の自分の骨（自家移植片）、屍体からの処理加工した骨（同種移植片）、ウシの骨またはサンゴ（異種移植片）、および合成の骨様または骨擬態性の材料を含んでいる。
【０００３】
典型的な手順において、歯科または口腔の外科手術は、移植部位で顎骨を曝露するための保護歯周組織または歯肉に大きな組織片を作り出し、存在する骨中および骨上にいくつかのタイプのブロックおよびアンレーの移植片を装着し、最後に不要な感染を食い止めるための措置をとる。次いで、保護歯周組織を部位および移植部位にわたって縫合し、数週間または数カ月間治癒させる。治癒は、分化、遊走、付着、増殖、細胞外マトリックスの合成、および最後に石灰化などの複雑な連続する適応性の細胞反応を伴う。しかし、移植片またはインプラントの周囲の骨中への骨組込みは理解が不十分である。骨誘導および骨形成は極めて多量の成長因子を伴い、これらのプロセスに寄与すると言われている多数のさらなる分子が存在する。
【０００４】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成を異所性に誘発することが知られている唯一の成長因子である。補充的投与量のＢＭＰは、未分化の間葉細胞の骨芽細胞への分化を誘発することによって骨の治癒を後押しする。しかし、骨の移植片およびインプラントは、非常に自然のようである生存する血管骨をもたらす。ＵＳ−Ａ ５ ４７８ ２３７（Ｉｓｈｉｋａｗａ）は、ヒドロキシアパタイトの層でコーティングされているインプラントを開示しており、ＷＯ ０２／０７８７５９（Ｓｔｒａｔｅｃ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ）は無構造でナノ結晶のリン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイトを含む多孔性の金属酸化物の層を有するインプラントを開示しており、ＷＯ ０２／０８５２５０（ＫＥＲＡＭＥＤ ＧｍｂＨ）は、吸収性のリン酸カルシウム相のコーティングが骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、フィブロネクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＶＣＡＭおよびこれらの誘導体などの接着およびシグナルのタンパク質を含んでいるインプラントを開示している。このタイプのさらなる移植片およびインプラントは、ＥＰ １ １６６ ８０４ Ａ２（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）およびＷＯ ９９／０８７３０（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において記載されている。ＤＥ １００ ３７ ８５０ Ａ１（Ｊｅｎｉｓｓｅｎ Ｈ）およびＷＯ ０３／０５９４０７ Ａ１（Ｓｔｒａｕｍａｎｎ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＧ）は、ユビキチンまたはトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）またはオステオスタチン、骨形成性ペプチドおよび骨成長性ペプチド（ＯＧＰ）などの全身性ホルモンで処置した移植片およびインプラントを記載している。ＵＳ ７，２２９，５４５ Ｂ２（Ｂｉｏｍｅｔ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）は、リン酸カルシウムで石灰化したコラーゲンマトリックスでできている骨類似性のコーティングを教示しており、ＥＰ １ ４４２ ７５５ Ａ１（Ｄｅｐｕｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は骨形成性タンパク質ＯＰ−１、ＢＭＰ−７および非コラーゲン性の骨基質タンパク質を含む生物活性のセラミックコーティングを教示している。骨形成性活性は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子（ＩＧＦ）および前述のファミリーメンバーに対してさらに報告されている。
【０００５】
ＷＯ ２００５／１０４９８８（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら）は、グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰで処理したインプラントおよび骨修復マトリックスを請求している。インプラントは、チタン、ジルコニウム、セラミック、金属合金またはステンレス鋼でできており、無構造または結晶のヒドロキシアパタイトおよび／またはリン酸カルシウムでコーティングされ得る。しかし、このような骨擬態性コーティングは、インプラントの長期間安定性に影響を及ぼす時間とともに基部から緩む傾向があるという不都合がある。
【０００６】
ＷＯ ０３／０４７６４６（Ｉｎｉｏｎ Ｌｔｄ．、Ｔａｍｐｅｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）は、医用インプラントに適用され得る骨移植片を教示している。移植片またはインプラントは、吸収性のポリマーまたはコポリマーのマトリックスおよびＮ−メチル−２−ピロリジン（ＮＭＰ）を含む基材でできている。Ｒｅｉｃｈｈａｒｄｔらは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００６年、１１巻（２）、２７ｆにおいて、ポリグリコール酸およびポリ乳酸のコポリマーでコーティングされているβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の顆粒を含むバイオ複合材料を記載している。バイオ複合材料は、Ｎ−メチル−ピロリジンと混合することによって配置用に成型可能に作製され得る。Ｎａｉｒらは、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ａｐｐｌ．、２００６年、２０巻、３０７−２４頁において歯科用移植片およびインプラントを開示しており、この場合β−ＴＣＰ顆粒はポリグリコール酸−ポリ乳酸コポリマーの熱融合によって一緒に保持される。β−ＴＣＰ粒子は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化および増殖、ならびに骨の治癒を阻害すると記載されている。Ｗａｎｇらは、Ｊ．Ｏｒｔｈ．Ｒｅｓ．、２００２年、２０巻、１１７５ｆｆにおいて、金属磨耗粒子、ならびに作用し、広範囲の表面積に対するこのような種類の阻害を記載している。
【０００７】
ＵＳ ６，４５８，７６３（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら）は、損傷または罹患している骨および軟骨に対する生物活性組成物を請求している。生物活性組成物は、薬学的に許容されるベース、およびリン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、石膏などの、生理学的な無機充填剤を含む送達ビヒクルによって投与される。頭頂隆起またはそれに隣接するラット頭蓋冠中に穴をあけ、１４日間の期間にわたって浸透圧ポンプを用いて頭蓋冠の損傷の部位に生物活性組成物を汲み入れると、インビボで開けられた穴の周囲に骨組織の成長の誘導が観察される。投与方法および組成物は、明らかに歯科補綴に適さない。
【０００８】
ＷＯ ９４／１３３１０（Ｈｏeｏeｋら）は、有効成分として、スタヒロコッカスオーリウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の骨組織に対する付着および骨髄炎に対抗すると思われる競合ペプチドを含む組成物を請求している（Ｒｙｄｅｎら、１９８９年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８４巻、３３１ｆ頁）。
【０００９】
先行技術はそれにもかかわらず、歯科インプラントが、外科手術の間に導入される感染、または患者が正しい口腔衛生の日常作業にしたがわなかったことによって引き起こされるペリインプランティティス（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ）と呼ばれる歯周の状態をしばしば生じるという問題を示している。インプランティティス（ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ）は、外科手術前後の日々に抗生物質および特別な含嗽液の過程によって取り扱われ得るが、ペリインプランティティス、ならびに改善された傷および軟部組織の治癒の予防的処置がより望ましい。骨内インプラントの、無菌的な弛み、炎症反応および長期安定性は、さらに問題であり続ける。生物活性のコーティングにもかかわらず、外科手術と、骨移植片および骨内の歯の移植片およびインプラントが典型的な圧力、せん断、ずり応力および張力に持ちこたえることができるまでの骨組込みとの間にはかなりの期間が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第５４７８２３７号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／０７８７５９号
【特許文献３】国際公開第０２／０８５２５０号
【特許文献４】欧州特許出願公開第１１６６８０４号明細書
【特許文献５】国際公開第９９／０８７３０号
【特許文献６】独国特許出願公開第１００３７８５０号明細書
【特許文献７】国際公開第０３／０５９４０７号
【特許文献８】米国特許第７，２２９，５４５号明細書
【特許文献９】欧州特許出願公開第１４４２７５５号明細書
【特許文献１０】国際公開第２００５／１０４９８８号
【特許文献１１】国際公開第０３／０４７６４６号
【特許文献１２】米国特許第６，４５８，７６３号明細書
【特許文献１３】国際公開第９４／１３３１０号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒｅｉｃｈｈａｒｄｔら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００６年、１１巻（２）、２７ｆ
【非特許文献２】Ｎａｉｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ａｐｐｌ．、２００６年、２０巻、３０７−２４頁
【非特許文献３】Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｏｒｔｈ．Ｒｅｓ．、２００２年、２０巻、１１７５ｆｆ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の一目的は、とりわけ、配置を容易にする移植材料、ならびに歯科補綴の経過において骨および軟部組織病変の治癒を促進するための方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
この目的は、請求項１において請求するバイオ複合材料によって達成される。本発明のさらなる実施形態は従属項において開示される。
【００１４】
骨欠損治療および骨の新生のための本発明の骨移植片は、生分解性ポリマーおよびβ−リン酸三カルシウムの顆粒の複合材料であり、
少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する有機化合物、および非変性の条件下で得た生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰをベースとする分散液または溶液である骨誘導性混合物（グリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰが、前記骨誘導性混合物中に、ヒト血清中に存在する定型的なヒトＢＳＰよりも、カルシウム、ヒドロキシアパタイトおよび補体因子Ｈに対する親和性が低減した塩または複合体として存在する。）、ならびに場合によって薬学的に許容される賦形剤または担体を提供するステップ、
生分解性ポリマーまたはコポリマーでコーティングされている、β結晶型の二リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２の顆粒をベースとする骨伝導性混合物、および、場合によって、薬学的に許容される賦形剤または担体を提供するステップ（該骨伝導性混合物は、成型および成形可能であり、外科手術または歯科補綴によって配置した場合に原位置で速やかに硬化する。）、および
前記骨誘導性および骨伝導性の混合物を、配置直前または配置の間に合わせて、骨の修復、ならびに損傷または罹患している組織および病変の治癒を促進する骨移植材料を得るステップ
によって得られる。
【００１５】
本発明の第２の態様において、骨誘導性ヒトＢＳＰは、無血清条件下で成長した真核細胞から発現され、得られたグリコシル化不十分のヒトＢＳＰである。
【００１６】
本発明の第３の態様において、グリコシル化不十分のヒトＢＳＰは初乳または母乳から得られたものである。
【００１７】
本発明において用いられる有機化合物は、少なくとも１つの環窒素含有塩基性基を有する有機化合物が好ましい。前記有機化合物は、生分解性ポリマーまたはコポリマーの分散剤および可塑剤の両方であり得るのが好ましく、Ｎ−イソプロピルピロリドン、Ｎ−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチルピロリドン（１−メチル−２−ピロリドン）、Ｎ−エチルピロリドン、Ｎ−プロピルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−ブタンジアミン、１−（２−アミノエチル）−ピペラジン、２−（１−ピロリジル）エチルアミン、４−アミノ−２−メトキシ−ピリミジン、２−ジメチルアミノ−エタノール、１−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、２−メルカプト−ピリミジン、２−メルカプトベンゾイミダゾール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、４−（２−アミノ−エチル）−ピリジン、２−アミノ−６−メトキシベンゾチアゾール、４−（アミノエチル）ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジアリル−メラミン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、１−（３−アミノプロピル）−イミダゾール、４−（２−ヒドロキシエチル）−ピリジン、１−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールからなる群から選択され得る。
【００１８】
本発明のさらなる一態様において、前記生分解性ポリマーまたはコポリマーは、ポリグリコリド、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリトリメチレンカーボネート、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリジオキサノン、ポリ乳酸ポリマー、ポリグリコール酸ポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリ−ヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリチロシンカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリペプチド、ポリデプシペプチド、ポリビニルアルコール、ポリエステルアミド、ポリアミド、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリシアノアクリレート、ポリフマレート、ポリ（アミノ酸）、修飾多糖、修飾タンパク質およびそれらのコポリマー、ターポリマーまたはそれらの混合物もしくはポリマーブレンドからなる群から選択される。
【００１９】
本発明の別の一態様は、直径３００から８００μｍ、好ましくは４００から７００μｍを有する、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２のコーティングされている顆粒を好ましくは含むことができる、歯科補綴において使用するための骨伝導性組成物に関する。本発明のバイオ複合材料が、５０体積パーセントを超えるβリン酸三カルシウムの顆粒、１つ以上の生分解性ポリマーおよびコポリマーを含む１０から４０体積パーセントの間のポリマーベース、０．５から１０体積パーセントのバイオ複合材料の可塑性および作業性を増大させる、ＢＳＰの溶媒または分散剤としての第１の骨誘導性混合物を含み得るのが好ましい。前記複合材料は、１から２００μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）複合材料の量のヒトｒＢＳＰを含み得る。好ましくは、前記骨誘導性混合物は、硬化前に１から２００μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の量のヒトｒＢＳＰを含み得る。
【００２０】
本発明によると、前記生分解性ポリマーは、その組成が乳酸５０から８０パーセントおよびグリコール酸２０から５０パーセントである、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマーであってよい。前記ＰＬＡ：ＰＧＡコポリマーは、約２５，０００と約１，０００，０００との間の選択された重量平均分子量範囲を有することができる。骨移植材料が、硬化後に１ＧＰａと約１００ＧＰａの間のヤング率を有するのが好ましい。
【００２１】
本発明のさらなる一態様は、
少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する有機化合物および生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰをベースとする分散液または溶液である骨誘導性混合物を提供するステップと、
顆粒が生分解性ポリマーまたはコポリマーでコーティングされている、β結晶型の二リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２の顆粒をベースとする骨伝導性混合物を提供するステップと、
前記骨誘導性および骨伝導性の混合物を合わせて、最初に成型および成形可能であり、外科手術または歯科補綴によって配置した場合に原位置で硬化する複合材料を得るステップとを含む骨誘導性および骨伝導性を有する骨移植片を調製する方法に関する。
【００２２】
骨移植材料を、少なくとも１つの窒素含有塩基性基および生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰを有する有機化合物をベースとする分散液または溶液と合わせるステップを含む、傷および軟部組織病変の治癒を促進する性質を有する骨移植材料を提供する方法。
【００２３】
本発明は、上記で規定したバイオ複合材料の投与または使用を含む、傷および軟部組織病変の治癒を促進する方法をさらに含む。適用または使用は、前記バイオ複合材料を、組織の骨格、顆粒状骨移植代替材料、２相軟骨インプラント、体重支持骨インプラント、非体重支持インプラントおよび低体重支持インプラントまたは固定装置、ビョウ、ピン、ネジ、骨アンレーおよびフィルムからなる群から選択されるインプラント装置に形成することを含み得る。
【００２４】
本発明は、吸収性ポリマー（１つもしくは複数）またはコポリマー（１つもしくは複数）のポリマーマトリックス、Ｎ−メチル−２−ピロリジン（ＮＭＰ）および好ましくは縫合材料としてデザインされている、薬学的有効量のヒトｒＢＳＰを含む傷治癒の性質を有する吸収性ポリマー組成物にさらに拡張する。本発明は、ＮＭＰおよびヒトｒＢＳＰの溶液が、再手術または手術後にインプラントもしくは傷に添加または適用される、治療方法にも拡張する。
【００２５】
本発明の原理は、基体、スペーサーブッシング（ｓｐａｃｅｒ ｂｕｓｈｉｎｇ）底部または基本要素およびスペーサーブッシング上部またはリング部材からなるスペーサーアセンブリーからなるインプラントにとりわけ有用である。基体には、雌螺を有する内孔（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｂｏｒｅ）が提供される。上部端または終端に近接する基体はくぼみを有し、くぼみは停止段部（ｓｔｏｐ ｓｈｏｕｌｄｅｒ）を提供するように孔よりも直径が大きい。軸のねじれを防ぐための手段を提供するために、セラミックの歯がネジ止めされ得るように、停止段部には、均一に、周囲に間隙のある、ポケットをかみ合わせるくぼみが提供される。
【００２６】
次に、本発明、その特徴および利点を添付の図面を参照して例示によってのみ記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のバイオ複合材料を調製するためのステップを示す模式図である。
【図２Ａ】ヒトｒＢＳＰ／ＮＭＰおよび生物吸収性ポリマーでコーティングされているβ−ＴＣＰ顆粒を含むバイオ複合材料の調製を示す写真である。
【図２Ｂ】ヒトｒＢＳＰ／ＮＭＰおよび生物吸収性ポリマーでコーティングされているβ−ＴＣＰ顆粒を含むバイオ複合材料の調製を示す写真である。
【図２Ｃ】ヒトｒＢＳＰ／ＮＭＰおよび生物吸収性ポリマーでコーティングされているβ−ＴＣＰ顆粒を含むバイオ複合材料の調製を示す写真である。
【図３Ａ】本発明のバイオ複合材料の外科手術の配置および原位置での硬化を示す写真である。
【図３Ｂ】本発明のバイオ複合材料の外科手術の配置および原位置での硬化を示す写真である。
【図３Ｃ】本発明のバイオ複合材料の外科手術の配置および原位置での硬化を示す写真である。
【図４Ａ】配置部位（患者女性、７３歳）、および手術１日後、手術３日後の傷の治癒を示す写真である。
【図４Ｂ】配置部位（患者女性、７３歳）、および手術１日後、手術３日後の傷の治癒を示す写真である。
【図４Ｃ】配置部位（患者女性、７３歳）、および手術１日後、手術３日後の傷の治癒を示す写真である。
【図４Ｄ】配置部位（患者女性、７３歳）、および手術１日後、手術３日後の傷の治癒を示す写真である。
【図４Ｅ】手術２．５カ月後、ならびにインプラントおよび歯科前の状況を示す、エックス線ＣＴである。
【図４Ｆ】手術２．５カ月後、ならびにインプラントおよび歯科前の状況を示す、エックス線ＣＴである。
【図４Ｇ】手術２．５カ月後、ならびにインプラントおよび歯科前の状況を示す、エックス線ＣＴである。
【図４Ｈ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｊ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｋ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｌ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｍ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｎ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図５−１】外科手術１２週後の本発明による、配置したｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料から取った骨検体（ＤＳ６４−長さ１．２ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。厚さ２から３マイクロメートルの組織切片を、Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図５−２】外科手術１２週後の本発明による、配置したｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料から取った骨検体（ＤＳ６４−長さ１．２ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。厚さ２から３マイクロメートルの組織切片を、Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図５−３】外科手術１２週後の本発明による、配置したｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料から取った骨検体（ＤＳ６４−長さ１．２ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。厚さ２から３マイクロメートルの組織切片を、Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図６−１】やはり配置１２週後に取った、別のｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料インプラントからの骨検体（Ｄ７８−長さ０．５ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。調製、固定およびＭａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図６−２】やはり配置１２週後に取った、別のｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料インプラントからの骨検体（Ｄ７８−長さ０．５ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。調製、固定およびＭａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図７−１】外科手術３カ月のｒｈＢＳＰ／ＴＣＰバイオ複合材料から取った、第３の組織検体（Ｄ５９−長さ０．６ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。調製、固定およびＭａｓｓｏｎのトリクローム染色、トルイジンブルーまたはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図７−２】外科手術３カ月のｒｈＢＳＰ／ＴＣＰバイオ複合材料から取った、第３の組織検体（Ｄ５９−長さ０．６ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。調製、固定およびＭａｓｓｏｎのトリクローム染色、トルイジンブルーまたはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（発明の詳細な記述および好ましい実施形態）
図１を参照すると、本発明の骨移植片またはバイオ複合材料は、ａ）β−リン酸三カルシウムの顆粒および生分解性のポリマーまたはコポリマーをベースとする基材（Ａ）を、（ｉ）第１に生分解性ポリマーもしくはコポリマーの可塑剤であり、第２にｐＫＩ４．０を有する酸性タンパク質と塩を形成することができる少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する１つ以上の有機化合物、ならびに（ｉｉ）実質的に純粋な活性ヒトｒＢＳＰを含む分散液または溶液である第１の組成物（Ｂ）、ならびに（ｃ）場合によって、薬学的に許容される賦形剤または担体と合わせて、（ｃ）活性なヒトｒＢＳＰの塩、少なくとも１つの塩基性窒素基を有する可塑剤、生物吸収性ポリマーまたはコポリマー、および成型可能であり、配置後に原位置で速やかに硬化するβ−ＴＣＰの顆粒を含むバイオ複合材料（Ｃ）を得るステップによって得られる。言及した通り、成型可能なバイオ複合材料（Ｃ）は、外科手術または歯科補綴によって配置され得、配置後に血液および水（Ｄ）の作用により原位置で速やかに硬化する。硬化後、硬化したバイオ複合材料（Ｄ）は、β−リン酸三カルシウム骨格の顆粒、および生分解性のポリマーまたはコポリマー中に埋め込まれた活性ヒトｒＢＳＰの塩を含む。
【００２９】
インプラントが成功する秘訣は、依然として最初の治癒のプロセスである。本発明の骨移植材料は、骨誘導性および骨伝導性であり、さらに速やかに再吸収されずに軟部組織、とりわけ損傷し罹患している結合組織の治癒を促進する。換言すると、骨移植材料は血管形成性であるが、硬化したβ−リン酸三カルシウム骨格の生物吸収性は、それが骨形成と平行して進行するように調節され得るので、線維芽細胞および結合組織細胞の移入に対する物理的バリアも提供する。本発明のバイオ複合材料は、したがって、巨視的に歯科インプラントに対する初期の物理的支持を提供し、微視的に骨系の細胞に対する骨格および骨の石灰化に対する核を提供する。さらに、これは血管形成および傷の治癒を促進し、線維性癒合を阻害する。
【００３０】
本発明の成型可能なバイオ複合材料は、生物吸収性ポリマー中に含まれている可塑剤が周囲の体液（血液、血清、水、痰）中に希釈されて出る場合に速やかに固化する生物吸収性のポリマーまたはコポリマーでβ−結晶型のリン酸三カルシウムの顆粒がコーティングされているので、配置後速やかに物理的および機械的性質を有する。
【００３１】
上記で言及した通り、成分（Ａ）を最初に、本発明にしたがって生物吸収性のポリマーまたはコポリマーに対する可塑剤と合わせて、配置の間に成型可能な基材を作製する。可塑剤または分散剤（Ｂ）は、ｐＫＩ４．０を有する、ヒトｒＢＳＰなどの酸性糖タンパク質に対する担体および生理学的共イオンとして同様に機能することができるように、窒素含有塩基性基を有する化合物の群から選択される。可塑剤は、自らを、ポリマーまたはコポリマーの鎖の間に埋め込み、これらの間隔を離し、「自由体積」を増大し、ポリマーまたはコポリマーのガラス転移点を低下させることによって作用する。本発明の適切な可塑剤および生理学的共イオンは、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−ブタンジアミン、１−（２−アミノエチル）−ピペラジン、２−（１−ピロリジル）エチル−アミン、４−アミノ−２−メトキシ−ピリミジン、２−ジメチルアミノエタノール、１−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、２−メルカプトピリミジン、２−メルカプトベンゾ−イミダゾール。Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、４−（２−アミノエチル）−ピリジン、２−アミノ−６−メトキシベンゾチアゾール、４−（アミノエチル）ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジアリルメラミン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、１−（３−アミノプロピル）−イミダゾール、４−（２−ヒドロキシエチル）−ピリジン、１−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールである。適切な化合物は、２から１４のｐＫａ値、好ましくは５から１４の、最も好ましくは５から１２のｐＫａ値を有する非反応性の塩基性基によって特徴づけられる。ｐＫａ値は表から得られ得る。上記に示す限界値は２５℃におけるｐＫａ値の測定値を意味する。インビトロにおける骨芽細胞の成熟およびインビボにおける骨の再生を増強することが知られている１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ＝ＣＡＳ数。８７２−５０−４；Ｎ−メチルピロリドン、１−メチルピロリドン、Ｎ−メチル−α−ピロリドン、１−メチルアザシクロペンタン−２−オン、Ｎ−メチル−γ−ブチロラクトン（ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ））の使用が最も好ましい（Ｍｉｇｕｅｌら、２００６年、Ｅｕｒｏｐ．Ｃｅｌｌｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１１巻、補完２：５）。しかし、この活性の根底にある生物学的メカニズムは依然として分かっていない。
【００３２】
本発明の生物吸収性および生体適合性のポリマーは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ＰＬＧＡまたはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の酸性コポリマーであるのが好ましい。ＰＬＧＡは、グリコール酸および乳酸の環状二量体（１，４−ジオキサン−２，５−ジオン）の開環共重合によって合成される。重合化の間、グリコール酸または乳酸の連続的な単量体単位がエステル結合によって一緒に連結され、直鎖状の脂肪族のポリエステルを生成物として生じる。重合化に用いられるグリコリドに対するラクチドの比率に応じて、様々な形態のＰＬＧＡが得られる。その組成が乳酸７５％およびグリコール酸２５％であるコポリマーを特定するＰＬＧＡ７５：２５が、最も好ましい。ＰＬＧＡのガラス転移点は、４０℃から６０℃の範囲にあり、やはり存在する可塑剤またはＮＭＰの量に依存する。乳酸のホモポリマー（ポリラクチド）およびグリコール酸のホモポリマー（ポリグリコリド）と異なり、ＰＬＧＡは、テトラヒドロフラン、アセトンまたは酢酸エチルなどの溶媒によって溶解され、したがって、βリン酸三カルシウムの粒子などの粒子状の材料上に容易にコーティングされ得る。
【００３３】
ＰＬＧＡは、エステル連結の加水分解によって水の存在下で分解して単量体の乳酸およびグリコール酸を生成し、これらは体内の様々な代謝経路に入ることができるので、生体材料の適用にＰＬＧＡを用いることに付随する全身性の毒性は存在しない。ＰＬＧＡの分解に必要とされる時間は、単量体の比率に部分的に依存する。ＰＬＧＡ５０：５０は約２カ月以内にインビボで速やかに分解され、エステルでエンドキャップされているポリマーはより長い分解半減期を有する。乳酸の純粋なポリマー（ＰＬＡ）、グリコール酸の純粋なポリマー（ＰＧＡ）およびこれら２つの物質の様々な比率のコポリマー間の分解の比率における違いは、炭素−１４およびトリチウムで標識したポリマーでできているインプラントを用いて、ラットおよび他の哺乳動物において熱心に研究されている。様々なポリマーおよびコポリマーの半減期は、インプラントの領域、ならびに肝臓、脾臓、腎臓、肺からの組織中に存在する放射能から計算され、もちろん各時間間隔に対する実験を通して回収された尿および糞便中に存在する放射能から計算された。ポリマーおよびコポリマーの半減期は、１００％ＰＧＡに対して５カ月から、５０：５０ＰＧＡ：ＰＬＡコポリマーで１週間に低減し、１００％ＰＬＡでは６．１カ月に速やかに増大した。軟部組織または骨において、分解の速度における違いは観察されなかった。尿、糞便または他の組織試料において著しい放射能は検出されなかった。これらの試験から、インプラントの分解速度のコントロールは、ＰＬＡおよびＰＧＡの組成を、ＰＬＡを７５％と１００％との間に、それに伴いＰＧＡを対応する２５％から０％に変化させることによって最も達成され得ると結論付けることができる。これは、２週間から６カ月のインプラントの半減期の範囲をもたらす。したがって、このような生分解性ポリマーが最も好ましい。
【００３４】
別の生物吸収性のポリエステルは、その分解がＰＬＧＡの分解より遅いため、長期間埋め込み型装置に用いられ得るポリカプロラクトンである。ポリカプロラクトン（商品名Ｒｅｓｉｌｏｎ（商標））は、組織修復では骨格および歯科補綴では根管充填として研究されている。一般的に、生分解性ポリマーは、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリカプロラクトン、ポリトリメチレンカーボネート、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリチロシン−カーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリペプチド、ポリデプシペプチド、ポリビニルアルコール、ポリエステルアミド、ポリアミド、ポリ無水物、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリシアノアクリレート、ポリフマレート、ポリ（アミノ酸）、修飾多糖、修飾タンパク質、およびそれらのコポリマー、ターポリマー、またはそれらの混合物もしくはポリマーブレンドからなる群から選択され得る。ポリマーマトリックスが、ポリグリコリド、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリトリメチレンカーボネート、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリジオキサノンおよびそれらのコポリマー、ターポリマー、またはそれらの混合物もしくはポリマーブレンドからなる群から選択されるのが好ましい。
【００３５】
本発明の骨伝導性構造成分は、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）である。ＴＣＰ骨格が非常に速やかに分解する場合、線維性癒合が開口にわたって骨の修復なしに生じる。骨格内に孔または経路がほとんど存在しない場合、骨の再生はとりわけ遅い。ＴＣＰの純度は、骨の形成および生体適合性の両方に影響を及ぼし、β−結晶型のＴＣＰ（β−ＴＣＰ）が骨格として最も好ましい。骨格が宿主の骨芽細胞および間葉細胞の移入を可能にしなければならないので、直径約２００から４００μｍの平均孔サイズおよび１００から２００μｍの経路を介して相互接続されている孔が好ましい。しかし、多孔性のβ−ＴＣＰは機械的性質が弱く、インビボで速やかに分解する。これは幾分弱い機械的性質を意味する。本発明のβ−ＴＣＰは、したがって、速やかな分解を避けるために、相が純粋なβ−結晶型を得る温度で焼結されたものであるのが好ましい。本発明によると、骨格は、それゆえ、生分解性のポリマーでマイクロコーティングされており、約１００から５０００μｍの、好ましくはより小型の骨空洞の充填には２００から７００μｍの、大型の骨空洞（例えば、切除後の空洞）には５００から１５００μｍの、ポリマーコーティングされているＴＣＰ顆粒に対して取扱いが良好であるように形成されている、β−ＴＣＰの、細密な、相純粋な粒子であるのが好ましい。非常に大型のポリマーコーティングされているβ−ＴＣＰ顆粒が、形成外科および再建外科におけるより大型の骨置換のための骨伝導性骨格として用いられ得る。
【００３６】
活性のヒトｒＢＳＰを、β−ＴＣＰ骨格の顆粒上にコーティングされている生物吸収性ポリマー中に埋め込む可塑剤と混合することによって、活性なヒトｒＢＳＰが、硬化後であっても骨電導性の環境においてその骨伝導性活性を遂行することができる骨擬態性の材料中に組み込まれる。使用される活性なヒトｒＢＳＰはグリコシル化不十分であり、ポリマーまたはコポリマー中に埋め込まれているのが好ましいので、補体因子Ｈによる非活性化をさらに回避し、骨の石灰化に対する核を形成することができる。ヒトｒＢＳＰは、可塑剤によって生物吸収性ポリマーおよび／またはコポリマー中にさらに埋め込まれ、その結果生物吸収性ポリマーまたはコポリマーの生物吸収と平行して放出される。要約すると、ヒトｒＢＳＰの長期間の活性は、（ｉ）生理学的な包接化合物または錯塩の、可塑剤の塩基性窒素との形成によって、（ｉｉ）未熟な石灰化および補体因子Ｈに対する結合からそれを防ぐ生物吸収性ポリマーまたはコポリマーにおける物理的組み入れによって、ならびに（ｉｉｉ）グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは、補体因子Ｈによって定型的なの骨細胞からの完全にグリコシル化されているヒトＢＳＰよりもさほど効率的に非活性化されないので、そのグリコシル化不十分によって、得られる。したがって、組換えヒトｒＢＳＰは無血清培地中で培養された細胞から得たものでなければならない。それにもかかわらず、ヒトｒＢＳＰは、骨の石灰化およびリン酸カルシウム沈澱に対するインビボの核であり続ける。したがって、本発明は、損傷した骨および結合組織の修復のためのヒトｒＢＳＰを含む移植片組成物を包含する。導入において言及した通り、ヒトの骨のシアロタンパク質は、オステオカルシンおよびオステオネクチンの他に、骨の細胞外マトリックスにおける主要な非コラーゲン性タンパク質である。
【００３７】
リンカーおよびリンカー−タグによって骨格またはポリマー−バックボーンに連結している、骨活性のｒＢＳＰを有することがさらに企図される。しかし、ヒトＢＳＰはシステイン残基を含んでいない。ヒトＢＳＰは高度の負の荷電を所有し（ｐＩ＝４．０）、そこで強力な陰イオン交換ＨＰＬＣを最初に用いてＢＳＰ複合体を単離する。したがって、可塑剤の塩基性基は同様の結合性の効果を発揮することがある。
【００３８】
本発明者らはあらゆる理論によって拘泥しようとするものではないが、本発明の組成物における酸性ヒトｒＢＳＰは骨誘導性および生体内鉱質形成性の両方の効果を有し、骨芽細胞および破骨細胞の骨移植材料に対する接着および走化性の遊走を促進する。本発明者らの所見は、ヒトｒＢＳＰの包接化合物または錯塩および塩基性の可塑剤が生分解性ポリマーまたはコポリマー中に含まれる場合、場合によって支持体または賦形剤とともに、とりわけ軟部組織および傷の治癒に関して相乗的な活性を有することを支持している。各成分は生物学的活性を有し、組み合わせることで有用な血管形成および骨伝導性の効果をもたらす。提供されるガレニック形態（ｇａｌｅｎｉｃ ｆｏｒｍ）は、規定された一致した順序で血管形成活性および骨形成活性が必要とされる手術部位に容易に投与され得る、生分解性ポリマーおよび無機質の支持体の顆粒の混合物をベースとする。ヒトｒＢＳＰは傷の治癒および骨形成における補助だけではないという強力な証拠が存在する。ヒトｒＢＳＰはまた、歯科手術の経過において炎症およびインプランティティスを阻害する。本発明のバイオ複合材料におけるＴＣＰ骨格は、バイオ複合材料およびヒトｒＢＳＰはその骨伝導性効果を完全に発達させ、骨の再生を促進することができるように、最終的に線維性癒合および内皮の内方成長に対抗する一時的な機械的バリアを提供する。生分解性ポリマーは、ヒトｒＢＳＰの埋め込み、および活性型におけるゆっくりとした放出のこの関係において必要とされる。
【００３９】
インビボでＢＳＰの発現は初期の骨の石灰化と一致し、ＢＳＰは大腿骨インプラント上にコーティングされる場合に骨誘導性であることが示されていた（ＯＴｏｏｌｅ ＧＣら、２００４年、Ｊ Ｏｒｔｈ Ｒｅｓ、２２巻、６４１−６４６頁）。同様の効果が、骨形成タンパク質ＯＰ−１、ＢＭＰ−７、様々な他の非コラーゲン性骨基質タンパク質、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子（ＩＧＦ）および前述のファミリーメンバーに対してやはり報告されている。しかし、これらの生物活性分子の骨の活性は推測にすぎない、というのはこれらの骨結合性活性はインビトロでもインビボでも測定され得ないからである。
【００４０】
しかし、本発明のバイオ複合材料は、抜歯部位、または骨再生および軟部組織の治癒が必要とされる部位に、直接配置され、硬化され得る。より小さな抜歯の場合には、半硬化したバイオ複合材料が周囲の保護歯周組織のレベルで切断され得、その結果軟部組織と骨移植材料との間に最小の間隙だけを有する平滑表面が得られる；図４Ａ−Ｃを参照されたい。次いで、骨移植材料は１日または２日内に治癒するが（図４Ｄを参照されたい）、軟部組織は骨移植材料に付着している。したがって、保護歯周組織内の組織片はより小さく、手術全体は患者にとってそれほど重いものではあり得ない。より小さな歯科インプラントの場合、インプラントの部位にわたって保護歯周組織を縫合する必要ももはやない；図４Ｃを参照されたい。
【００４１】
破骨細胞および骨芽細胞の骨基質に対する接着と一緒に、ＢＳＰは内皮細胞の接着、播種および配向、ならびに血管の形成にさらに関与する（Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅら、２０００年、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８６巻（８）、８８５−９１頁）。しかし、線維性癒合および内皮の内方成長は、さらなる骨がイノッサル（ｅｎｏｓｓａｌ）移植片の物理的支持に必要とされるインプラントの部位では望ましくない。これは、本発明によって、バイオ複合材料中にβ−ＴＣＰの顆粒を有することによって実現される。それにもかかわらず、ヒトｒＢＳＰは炎症反応を抑制し、関与するタンパク質、すなわちインターロイキンＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＫＬ、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などの放出を変調する。
【００４２】
本発明は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を促進し、必要とされる骨の再生および骨芽細胞の増殖の部位への骨芽細胞の遊走を誘発し、最終的に骨の石灰化のための核を提供する新規な骨移植片および複合材料を提供する。多数のタンパク質が、骨形成の性質、特にコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよび天然の細胞外マトリックスタンパク質の混合物に対して研究されている（Ｓｏｄｅｋら、Ｊ、２０００年、Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏｌ．、２４巻、９９−１２６頁；Ｍｅｙｅｒ Ｕ ら、１９９８年、Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ −Ｍａｔｅｒ Ｍｅｄ、９巻、３０１−３０７頁；Ｌａｃｏｕｔｕｒｅ ＭＥら、２００２年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ、１７巻、４８１−４９２頁；Ｓａｌｉｈ Ｅら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３６４巻、４６５−４７４頁）。機械的に緊張させた骨芽細胞の支持的接着において、Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンを比べると、付着に利用可能な分子の数が制限されている場合、緊張の抵抗性を支配する主要な因子は数々のインテグリン−細胞外マトリックスの付着であったことが明らかにされた（Ｌａｃｏｕｔｕｒｅ ＭＥら、２００２年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ、１７巻、４８１−４９２２０頁）。このように、これらのタンパク質を本発明のバイオ複合材料中に組み入れることも企図されている。
【００４３】
先行技術において、初期の治癒プロセスにおける生理学的改善を得るのに利用可能な手段は存在しない（Ｌｅｋｉｃ Ｐら、１９９６年、Ａｎａｔ Ｒｅｃ、２４４巻、５０−５８頁）。これは、生物模倣型の移植材料のいかなる大きな表面積も、細胞増殖の遅れをもたらすからである。インビボで生物学的機能を発揮することができ、補助因子Ｈまたは石灰化のいずれかによって非活性化されないが、ＢＳＰの沈着がインビボで骨形成の最初のステップを表すような、ＢＳＰの投与に利用可能な方法または組成物はさらに存在しなかった（Ｒｉｍｉｎｕｃｃｉ Ｍら、２００３年、Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ、３６巻、１０２７−１０３６頁）。さらに、ＢＳＰは骨の修復において骨誘導性であり、重大な欠損において治癒を実現することが見出された（Ｗａｎｇ ＭＬら、２００２年、Ｊ Ｏｒｔｈ Ｒｅｓ、２０巻、１１７５−１１８４頁；Ｗａｎｇ Ｊら、２００４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１９巻、２２１頁、抄録）。このように、誘導性薬剤によってＢＳＰの発現を誘導するように努力がなされてきた（Ｃｈｏｕら、２００５年、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２６巻、２８５−２９５２９頁）。しかし、これらの努力は結局成功しなかった。
【００４４】
ＢＳＰは、間葉系幹細胞および骨芽細胞に対するその分化および増殖の可能性を低減する、ある種の細胞外成熟を受けることが推測され得る。いくつかの研究グループは、補体の溶解の代替経路を制限することが知られている補体系の因子ＨにＢＳＰが高親和性で結合するので、ＢＳＰは栄養膜およびＢＳＰ生成性腫瘍細胞を免疫系による攻撃から保護すると仮定さえしている（Ｆｅｄａｒｋｏら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００、２７５巻、１６６６６−１６６７２頁；ＷＯ ００／０６２０６５）。しかし、ＢＳＰは、認識配列であるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸ＲＧＤによってインビボでインテグリン受容体に特異的に結合することが証明されている。ＲＧＤ認識配列のα（ｖ）β（３）インテグリン受容体に対する結合は、内皮細胞の接着、播種および配向はＢＳＰによって媒介されるという観察のために、ＢＳＰは骨基質の形成および傷治癒における事象の中心にある。さらに、腫瘍周囲の血管形成は、腫瘍細胞におけるＢＳＰ発現と平行して生じる（Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅら、２０００年、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８６巻（８）、８８５ｆｆ）。しかし、「遊離のＢＳＰ」は高親和性で補体因子Ｈによって結合されており、その結果先行技術の組成物によるＢＳＰのあらゆる投与はその生理学的機能を発揮することができなかった。１５０ｋＤａの因子Ｈの大型分子は、抗体または受容体が結合することができない程度に小型のＢＳＰ（およそ６５ｋＤａ）に結合する。さらに、因子Ｈは血清中に過剰に存在する（健康人の場合ＢＳＰが血清１ｍｌあたり＜２０ｎｇであるのに比べて、１ｍＬあたり因子Ｈ０．５ｍｇ）。
【００４５】
しかし、本発明者らのデータは、低濃度のグリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは、間葉系幹細胞の分化および骨芽細胞の初期の付着を誘発するのに十分であることを示している。これは、大型の表面材料または外来材料が骨細胞の分化および定着を遅らせないように、グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰを生分解性のポリマー中に組み入れることによって実現される。しかし、本発明のグリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは依然として高度に酸性であり、ヒドロキシ基およびリン酸カルシウムと反応し、沈澱する。グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰコーティングを塩基性溶媒および生物吸収性ポリマー用の可塑剤中に溶解することによって、ＢＳＰタンパク質が生物学的機能をもはや発揮することができない状態にＢＳＰタンパク質を維持すると思われる。グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは、その孔が好ましくは１０から１０００μｍの、より好ましくは２０から５００μｍの、最も好ましくは５０から２００μｍの直径サイズを有するβ−ＴＣＰの顆粒でできている骨格中に組み入れられるのが最も好ましい。換言すると、骨移植片の石灰化された、または骨性の骨組込みは、骨芽細胞が付着し、移植材料の孔中に実際に成長した場合に実現され得る。このように、孔は、好ましくは１０から１０００μｍの、より好ましくは２０から５００μｍの、最も好ましくは５０から２００μｍの直径サイズを有さなければならない。グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは、好ましくは１から１００μｇ／ｍＬの、好ましくは１０から５０μｇ／ｍＬの濃度で本発明の組成物中に含まれる。
【００４６】
本明細書以下に記載する本発明の実施例および実施形態は、限定的なものとして、または他の方法で限定的なものとして解釈されるべきではなく、むしろ本質における例示としてのみ解釈されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲において規定されている。
【実施例】
【００４７】
本実験において用いられる手順は全て倫理委員会によって認可された。１９６４年のヘルシンキ宣言の規則（ＮＩＨ出版、第８６−２３、１９８５年改定）にしたがった。
【００４８】
実施例１−骨誘導性ヒトｒＢＳＰとの血管形成性混合物の調製
グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰを、Ｗｕｔｔｋｅらによって記載されている方法にしたがって単離した（Ｗｕｔｔｋｅら、２００１年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｂｏｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｏｎｅ ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７６巻、３６８３９−３６８４８頁）。簡潔に述べると、ヒトＢＳＰに対する完全なｃＤＮＡ（シグナルペプチドなし）をＰＣＲによって増幅し、エピソームの真核生物発現ベクターｐＣＥＰ−Ｐｕ中にクローニングした（Ｋｏｈｆｅｌｄｔ Ｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｓ．、１９９７年、４１４巻（３）、５５７−６１頁における、Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｔｅｓｔｉｃａｎ）。発現構築物を、リポソームが媒介する安定なトランスフェクションによって、胚性腎細胞系ＥＢＮＡ−２９３またはヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７中に導入した。ＦＣＳ中のタンパク質が発現されたｒＢＳＰと反応し、組換えＢＳＰの精製を妨げないように、一過性の細胞を、無血清培地中２日間トランスフェクションした４８時間後に培養した。次いで、ＢＳＰ発現性細胞を無血清条件下で培養した。組換えヒトＢＳＰの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットによってモニタリングした。
【００４９】
トランスフェクトした細胞の無血清培養上清２．５リットルを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムによって精製し、そこから得られたのは均一な組換えＨｉｓ−ｍｙｃ−ＥＫ−ＢＳＰ（ヒトｒＢＳＰ）２５０μｇであった。ヒトｒＢＳＰを部分的にグリコシル化し、スレオニン１２５にはグリコシル化はなかった。ヒトｒＢＳＰのアミノ酸配列は、８８位（ＮＴＴ）、１６１（ＮＣＴ）、１６６位（ＮＳＴ）および１７４位（ＮＧＳ）に４つのＮ−グリコシル化部位を含んでいる。同定されたＮ−グリカン構造は全て、組換えＥＢＮＡ−２９３ＢＳＰ上に両方とも見出すことができた。しかし、Ｎ−グリカン全体におけるそれぞれの構造のパーセンテージ比率において違いが存在した。骨からのＢＳＰ Ｎ−グリカンの主な割合はアンテナ３本の構造（５８％）であり、ＥＢＮＡ細胞系においてアンテナ４本の構造（４８％）であった。ＭＡＬＤＡ−ＴＯＦ質量分析によってペプチドの質量を決定し、ペプチドの一部分をＰＳＤ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって配列決定した。これらの中で、ヒトｒＢＳＰ配列ＤＡＴＰＧＴＧにおけるスレオニンをＯ−グリコシル化する。ヒトの骨から単離したＢＳＰでは、第３のＯ−グリコシル化がもたらされた。組換えＢＳＰでは、第３のグリコシル化部位は存在しない。おそらく、このグリコシル化部位はＴＧＬＡＡ−ＢＳＰ部分構造上にある。
【００５０】
無血清条件下で培養した細胞から単離したヒトｒＢＳＰ２５０μｇを、次いで凍結乾燥し、Ｎ−メチルピロリジン５ｍＬ中に溶解して、血管形成活性および骨誘導性活性を有するヒトｒＢＳＰ（５０μｇ／ｍＬ）を含む塩基性溶液を得た。
【００５１】
実施例２−骨伝導性を有する成型可能な骨移植片およびバイオ複合材料の調製
骨移植片および骨伝導性材料として、ＤＳ ＤＥＮＴＡＬ Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＡＧ （Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ−Ｚｕｒｉｃｈ、Ｗａｇｉｓｔｒａｓｓｅ、スイス）の市販のＥａｓｙ Ｇｒａｆｔ（商標）「スペースホルダー」材料が用いられた。バイオ複合材料はβ−結晶相の純粋なリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）の顆粒を含んでいた。ＴＣＰ−材料を顆粒に圧縮し、本実施例において、顆粒は５００μｍから６３０μｍの直径を有し、５０パーセントを超える微孔質および約５μｍの平均孔サイズを有する分画が用いられた。配置を促進するために、硬質の顆粒材料が、規定された量の可塑剤を加えることによって配置に対して成型可能であり得るように、市販のＥａｓｙ Ｇｒａｆｔ（商標）スペースホルダー材料を、生分解性ＰＬＧＡポリマーの１０μｍの層でさらにコーティングする。
【００５２】
実施例３−骨誘導性、骨伝導性および血管形成性を有するバイオ複合材料およびスペースホルダーの調製
本発明のバイオ複合材料を、β−ＴＣＰのＰＬＧＡ−コーティングした顆粒（ＤＳ ＤＥＮＴＡＬ Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＡＧ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ−Ｚｕｒｉｃｈ、Ｗａｇｉｓｔｒａｓｓｅ、スイスのＥａｓｙ Ｇｒａｆｔ（商標）「スペースホルダー」材料）を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）およびヒトｒＢＳＰ５０μｇ／ｍＬを含む塩基性の有機可塑剤溶液で、５秒から１分間の間、硬化した顆粒状のＴＣＰ−材料が流動性になり、生分解性のＰＬＧＡ−コーティング内に埋め込まれている多座配位のヒトｒＢＳＰ−ＮＭＰ錯塩の液状の包接化合物が得られるように穏やかに振盪しながら、浸漬し、含浸することによって調製した。生分解性のＰＬＧＡは、ＴＣＰチャネルおよび孔内の、さらに顆粒内間隙および凹部内の圧縮されたＴＣＰ材料の表面に位置するので、ヒトｒＢＳＰ ＮＭＰ錯塩の包接化合物は、それによって顆粒状のβ−ＴＣＰ材料内にやはり安置されていた。その結果、β−結晶相の純粋なリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）の顆粒、生分解性のＰＬＧＡポリマー、ならびにＮＭＰおよび生物学的に活性なヒトｒＢＳＰの安置された包接化合物からなるバイオ複合材料が得られた。バイオ複合材料は、配置の間に成型可能であり、配置後、２分以内に過剰のＮＭＰが水および血液中に拡散することによって原位置で硬化した。バイオ複合材料の成分は、好ましくは、得られた硬化したバイオ複合材料が、硬化後β−ＴＣＰ／ＰＬＧＡ材料（ＥａｓｙＧｒａｆｔ（商標）スペースホルダー）１ミリリットルあたり約２０μｇのヒトｒＢＳＰを含むと予想された比率で混合された。
【００５３】
顆粒状のＴＣＰ材料との混合は、シリンジ装置またはアンプルによって体外で（図２Ａ、Ｂを参照されたい）、代わりにＴＣＰ材料の一部分が原位置の成型用に配置されている場合は原位置で（図２Ｃ）のいずれかで行われた。
【００５４】
実施例４−外科手術
図４Ａ−Ｋは歯科外科における、および骨形成のためのバイオ複合材料の適用を記載するものである。臨床上、治癒時間、とりわけ軟部組織の治癒は５０％速く、完全であることが判明し、インプランティティスの積極的な阻害ならびに組織および傷の治癒の活性化と一致して進行した。成型用の可塑剤としてＮＭＰを有する定型のＥａｓｙ Ｇｒａｆｔ（商標）材料と比較して、傷の治癒における反応時間は実際に半減し（５０％）、骨材料の産生は倍加する。骨密度測定を行って、ＢＳＰ／ＮＭＰが加速する軟部組織および硬組織の治癒を定量する。インプラント直後に取ったインプラント（バイオ複合材料）のバイオプシーは、ＢＳＰ誘導性の新しく形成した骨材料は、天然の骨組織と組織学的に区別することができないことを示唆しており、これにより、観察される再生の加速および天然の病変の治癒と一致して、骨芽細胞の観察される速やかな移入および天然の骨の石灰化プロセスが確認される。
【００５５】
図４Ａは、歯科外科前の患者（女性、７３歳）の歯科および骨の状況を示すエックス線である。図４Ｂは、予め形成したヒトｒＢＳＰ／ＮＭＢ（顆粒状のＴＣＰ／ＰＬＧＡ１ｍＬあたりヒトｒＢＳＰ／ＮＭＰ５０μｇ）の混合物を含浸させ、それを含む、成型可能な骨移植片（ＥａｓｙＧｒａｆｔ（商標））の配置を示す。最終の硬化の前に過剰の顆粒状の移植片を除去（切断）し、保護歯周組織の組織片を手操作で圧縮し、縫合せずに閉じた。図４Ｃおよび４Ｄは、手術１日後および３週間後の臨床状況を示す。高齢の患者にしては最初の傷の治癒が加速し、軟部組織の治癒が短期間で完了することに留意されたい。図４ＥおよびＦは、埋め込み２．５カ月後のエックス線およびＣＴであり、１１１３ＨＵのクレスト領域（ｃｒｅｓｔａｌ ｒｅｇｉｏｎ）において新しく形成した骨を示す。新しく形成した骨の隣接面間レベルに留意されたい。図４Ｇは、歯科インプラント（スクリュー）が配置される方法を示す。図４ＨからＮは、以下の歯科のステップの例、すなわち、位置決め装置の配置（４Ｈ）、出血点の配置（４Ｉ）、インプラント部位の骨の外側圧力圧縮（４Ｋ）、位置決め後のインプラント（４Ｌ）を示す。幅（３ｍｍ）および乳頭突起を保存するための隣接面間距離（＞３ｍｍ）に留意されたい。仮の（４Ｍ）および最終の歯科溶液（４Ｎ）。
【００５６】
とりわけ、図４Ｃから４Ｆは、顆粒状のＴＣＰ移植材料をヒトｒＢＳＰで処置した場合の組織および傷の治癒の加速を確認するものである。図４Ｅは、軟部組織の速やかな治癒は骨移植材料の骨誘導性および骨形成性を阻まず、または妨害せず、ｒＢＳＰは生分解性ポリマー中に埋め込まれた場合、その骨誘導性活性を十分に発揮し、発展させ得ることをさらに確認するものである。
【００５７】
実施例５−後に配置したバイオ複合材料の組織学的検査
本発明のバイオ複合材料を、抜歯後配置し、外科手術１２週後に骨検体（長さ−Ｄ６８：１．２ｃｍ；Ｄ７８：０．５ｃｍ；Ｄ５９：０．６ｃｍ）を取った。トレパン（ｔｒｅｐａｎ）核を脱水し、２から３マイクロメートル厚の組織切片に切断した組織試料を含むポリマー化樹脂材料および硬化したブロック中に埋め込んだ。組織切片を、マッソン三色染色法（Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｅｎｅｒ）、トルイジンブルー、およびエオジンと対にしたヘマトキシリンで普通染色するために顕微鏡用スライドガラス上に搭載する。
【００５８】
マッソン三色染色法において：核は黒色、細胞質−赤色／桃色、赤血球−赤色、コラーゲン線維および軟骨−青色／緑色、筋肉繊維−赤色。
【００５９】
Ｈ＆Ｅ普通染色（エオジンと対にしたヘマトキシリン）において、核、核酸およびＥＲは青色、細胞質−桃色、赤血球−橙色／赤色、弾性繊維、細網繊維およびコラーゲン繊維−桃色。
【００６０】
トルイジンブルーでの普通染色において、核および核酸、原形質、赤血球およびコラーゲン線維は青色で、肥満細胞顆粒は低ｐＨのため紫色。
【００６１】
図５に関して、検体（Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒ染色）の切片ＤＳ６４（Ｄｕｎｎｓｃｈｎｉｔｔ ＃６４）の全体像は、１０倍の倍率下で骨組織の重要な内方成長を示し、いくつかの外来の顆粒状材料（β−ＴＣＰ顆粒）が見える。ＤＳ６４／０１−０３の視野上で骨新生が優勢であり、外来材料の比率は少ない。より高倍率の視野では、ＤＳ６４／０４は初期段階の層状の骨形成を示し（たった１２週後で！）、層状の骨の形成の初期の開始を示している。通常、層状の骨は、およそ９カ月後にこのような種類の検体においてのみ検出され得るにすぎない。視野ＤＳ６４／０５−０７は、外来材料の単離されているゾーンを示すが、いくつかの位置では重要な骨新生の明らかな徴候が存在する。ＤＳ６４／０８−１０の顕微鏡視野は、様々な倍率でのＨ＆Ｅ染色に基づくものである。顕微鏡視野は、初期段階の新しく形成された層状の骨を示しており、高倍率では周辺部分における骨芽細胞の鎖を示している。視野Ｄ６４／１１−１３はトルイジンで染色したものである。上首尾の再生および新しく形成された骨材料がトレパン核内に見出され得る。
【００６２】
図６に関して、検体ＤＳ７８の全体像は、トレパン核内に骨新生があまりないことを示している。高倍率では編組み状の骨の徴候が存在する。顕微鏡視野ＤＳ７８／１１−１３を参照されたい。このように、編組み状の骨の層状の骨への成熟が起ころうとしている。
【００６３】
図７に関して、および検体ＤＳ５９に関すると、トレパン核の左端の全体像（ＤＳ５９−９）は、外来材料の痕跡がいくつかあるだけの広範囲に及ぶ骨の再構築および重要な骨新生を示している。トレパン核の右端の全体像（ＤＳ５９−０６）は、同様に、重要な骨新生および骨の再構築を示している。新しく形成された骨材料は層状のタイプであり、顕微鏡視野ＤＳ５９／０７上に見られ得る。これは非常に活動的な新生を意味する。視野ＤＳ５９／０９は血管新生および脈管新生の島、すなわち線維芽細胞、骨芽細胞および結合組織の形成、ならびに骨の再構築および骨新生の全ての徴候を示している。
【００６４】
要約すると、検体６４および５９は初期の発生および非常に優勢な骨新生を示している。検体７８は骨の形成が少ないことを示している。全ての場合において、組織学は、頑強な新しい編組み状および層状の骨の形成を明らかにしており、残りの外来材料は最小の痕跡にすぎなかった。このように、本発明の新しいバイオ複合材料は、加速された再建を経験しており、骨の再構築および骨の形成を誘発していると思われる。
【００６５】
実施例６−破骨細胞に対するヒトｒＢＳＰのインビトロ活性
破骨細胞の活性化および分化は、骨芽細胞からのＲＡＮＫＬの発現およびＯＰＧ（オステオプロテゲニン）の発現に依存する。ＯＰＧは、ＲＡＮＫＬの活性に対抗し、破骨細胞の分化を阻害すると思われる。ヒト一次骨芽細胞をインビトロでヒトｒＢＳＰとインキュベートし、上清中のＯＰＧおよびＲＡＮＫＬの発現をＥＬＩＳＡおよびリアルタイムＰＣＲで決定すると、ヒトｒＢＳＰは一般的に、破骨細胞からのＲＡＮＫＬの発現を抑制し、ＯＰＧの放出を刺激したことが見出された。ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧの割合の増加は破骨細胞の活性化を意味し、これは本発明のバイオ複合材料の骨誘導性を説明し得る。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、リン酸三カルシウムの顆粒および吸収性ポリマーまたはコポリマーを含む基材からできている骨移植片およびバイオ複合材料に関する。本発明は、とりわけ、歯科補綴の過程における骨および軟部組織病変の治癒を加速し、改善するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
骨インプラントの安定性は、その内方成長の性質に大いに依存する。歯科インプラントが働くには顎において十分な骨が存在しなくてはならず、骨はインプラントを保持および支持するのに十分強力でなければならない。深さまたは厚さに関して不十分または不完全な上顎または下顎の骨が存在する場合、歯科インプラントとの確実な組込みを提供するのに、歯科補綴において移植片が使用される。従来の移植片は、患者の自分の骨（自家移植片）、屍体からの処理加工した骨（同種移植片）、ウシの骨またはサンゴ（異種移植片）、および合成の骨様または骨擬態性の材料を含んでいる。
【０００３】
典型的な手順において、歯科または口腔の外科手術は、移植部位で顎骨を曝露するための保護歯周組織または歯肉に大きな組織片を作り出し、存在する骨中および骨上にいくつかのタイプのブロックおよびアンレーの移植片を装着し、最後に不要な感染を食い止めるための措置をとる。次いで、保護歯周組織を部位および移植部位にわたって縫合し、数週間または数カ月間治癒させる。治癒は、分化、遊走、付着、増殖、細胞外マトリックスの合成、および最後に石灰化などの複雑な連続する適応性の細胞反応を伴う。しかし、移植片またはインプラントの周囲の骨中への骨組込みは理解が不十分である。骨誘導および骨形成は極めて多量の成長因子を伴い、これらのプロセスに寄与すると言われている多数のさらなる分子が存在する。
【０００４】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成を異所性に誘発することが知られている唯一の成長因子である。補充的投与量のＢＭＰは、未分化の間葉細胞の骨芽細胞への分化を誘発することによって骨の治癒を後押しする。しかし、骨の移植片およびインプラントは、非常に自然のようである生存する血管骨をもたらす。ＵＳ−Ａ ５ ４７８ ２３７（Ｉｓｈｉｋａｗａ）は、ヒドロキシアパタイトの層でコーティングされているインプラントを開示しており、ＷＯ ０２／０７８７５９（Ｓｔｒａｔｅｃ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ）は無構造でナノ結晶のリン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイトを含む多孔性の金属酸化物の層を有するインプラントを開示しており、ＷＯ ０２／０８５２５０（ＫＥＲＡＭＥＤ ＧｍｂＨ）は、吸収性のリン酸カルシウム相のコーティングが骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、フィブロネクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＶＣＡＭおよびこれらの誘導体などの接着およびシグナルのタンパク質を含んでいるインプラントを開示している。このタイプのさらなる移植片およびインプラントは、ＥＰ １ １６６ ８０４ Ａ２（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）およびＷＯ ９９／０８７３０（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において記載されている。ＤＥ １００ ３７ ８５０ Ａ１（Ｊｅｎｉｓｓｅｎ Ｈ）およびＷＯ ０３／０５９４０７ Ａ１（Ｓｔｒａｕｍａｎｎ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＧ）は、ユビキチンまたはトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）またはオステオスタチン、骨形成性ペプチドおよび骨成長性ペプチド（ＯＧＰ）などの全身性ホルモンで処置した移植片およびインプラントを記載している。ＵＳ ７，２２９，５４５ Ｂ２（Ｂｉｏｍｅｔ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）は、リン酸カルシウムで石灰化したコラーゲンマトリックスでできている骨類似性のコーティングを教示しており、ＥＰ １ ４４２ ７５５ Ａ１（Ｄｅｐｕｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は骨形成性タンパク質ＯＰ−１、ＢＭＰ−７および非コラーゲン性の骨基質タンパク質を含む生物活性のセラミックコーティングを教示している。骨形成性活性は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子（ＩＧＦ）および前述のファミリーメンバーに対してさらに報告されている。
【０００５】
ＷＯ ２００５／１０４９８８（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら）は、グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰで処理したインプラントおよび骨修復マトリックスを請求している。インプラントは、チタン、ジルコニウム、セラミック、金属合金またはステンレス鋼でできており、無構造または結晶のヒドロキシアパタイトおよび／またはリン酸カルシウムでコーティングされ得る。しかし、このような骨擬態性コーティングは、インプラントの長期間安定性に影響を及ぼす時間とともに基部から緩む傾向があるという不都合がある。
【０００６】
ＷＯ ０３／０４７６４６（Ｉｎｉｏｎ Ｌｔｄ．、Ｔａｍｐｅｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）は、医用インプラントに適用され得る骨移植片を教示している。移植片またはインプラントは、吸収性のポリマーまたはコポリマーのマトリックスおよびＮ−メチル−２−ピロリジン（ＮＭＰ）を含む基材でできている。Ｒｅｉｃｈｈａｒｄｔらは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００６年、１１巻（２）、２７ｆにおいて、ポリグリコール酸およびポリ乳酸のコポリマーでコーティングされているβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の顆粒を含むバイオ複合材料を記載している。バイオ複合材料は、Ｎ−メチル−ピロリジンと混合することによって配置用に成型可能に作製され得る。Ｎａｉｒらは、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ａｐｐｌ．、２００６年、２０巻、３０７−２４頁において歯科用移植片およびインプラントを開示しており、この場合β−ＴＣＰ顆粒はポリグリコール酸−ポリ乳酸コポリマーの熱融合によって一緒に保持される。β−ＴＣＰ粒子は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化および増殖、ならびに骨の治癒を阻害すると記載されている。Ｗａｎｇらは、Ｊ．Ｏｒｔｈ．Ｒｅｓ．、２００２年、２０巻、１１７５ｆｆにおいて、金属磨耗粒子、ならびに作用し、広範囲の表面積に対するこのような種類の阻害を記載している。
【０００７】
ＵＳ ６，４５８，７６３（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら）は、損傷または罹患している骨および軟骨に対する生物活性組成物を請求している。生物活性組成物は、薬学的に許容されるベース、およびリン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、石膏などの、生理学的な無機充填剤を含む送達ビヒクルによって投与される。頭頂隆起またはそれに隣接するラット頭蓋冠中に穴をあけ、１４日間の期間にわたって浸透圧ポンプを用いて頭蓋冠の損傷の部位に生物活性組成物を汲み入れると、インビボで開けられた穴の周囲に骨組織の成長の誘導が観察される。投与方法および組成物は、明らかに歯科補綴に適さない。
【０００８】
ＷＯ ９４／１３３１０（Ｈｏeｏeｋら）は、有効成分として、スタヒロコッカスオーリウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の骨組織に対する付着および骨髄炎に対抗すると思われる競合ペプチドを含む組成物を請求している（Ｒｙｄｅｎら、１９８９年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８４巻、３３１ｆ頁）。
【０００９】
先行技術はそれにもかかわらず、歯科インプラントが、外科手術の間に導入される感染、または患者が正しい口腔衛生の日常作業にしたがわなかったことによって引き起こされるペリインプランティティス（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ）と呼ばれる歯周の状態をしばしば生じるという問題を示している。インプランティティス（ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ）は、外科手術前後の日々に抗生物質および特別な含嗽液の過程によって取り扱われ得るが、ペリインプランティティス、ならびに改善された傷および軟部組織の治癒の予防的処置がより望ましい。骨内インプラントの、無菌的な弛み、炎症反応および長期安定性は、さらに問題であり続ける。生物活性のコーティングにもかかわらず、外科手術と、骨移植片および骨内の歯の移植片およびインプラントが典型的な圧力、せん断、ずり応力および張力に持ちこたえることができるまでの骨組込みとの間にはかなりの期間が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第５４７８２３７号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／０７８７５９号
【特許文献３】国際公開第０２／０８５２５０号
【特許文献４】欧州特許出願公開第１１６６８０４号明細書
【特許文献５】国際公開第９９／０８７３０号
【特許文献６】独国特許出願公開第１００３７８５０号明細書
【特許文献７】国際公開第０３／０５９４０７号
【特許文献８】米国特許第７，２２９，５４５号明細書
【特許文献９】欧州特許出願公開第１４４２７５５号明細書
【特許文献１０】国際公開第２００５／１０４９８８号
【特許文献１１】国際公開第０３／０４７６４６号
【特許文献１２】米国特許第６，４５８，７６３号明細書
【特許文献１３】国際公開第９４／１３３１０号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒｅｉｃｈｈａｒｄｔら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００６年、１１巻（２）、２７ｆ
【非特許文献２】Ｎａｉｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ａｐｐｌ．、２００６年、２０巻、３０７−２４頁
【非特許文献３】Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｏｒｔｈ．Ｒｅｓ．、２００２年、２０巻、１１７５ｆｆ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の一目的は、とりわけ、配置を容易にする移植材料、ならびに歯科補綴の経過において骨および軟部組織病変の治癒を促進するための方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
この目的は、請求項１において請求するバイオ複合材料によって達成される。本発明のさらなる実施形態は従属項において開示される。
【００１４】
骨欠損治療および骨の新生のための本発明の骨移植片は、生分解性ポリマーおよびβ−リン酸三カルシウムの顆粒の複合材料であり、
少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する有機化合物、および非変性の条件下で得た生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰをベースとする分散液または溶液である骨誘導性混合物（グリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰが、前記骨誘導性混合物中に、ヒト血清中に存在する定型的なヒトＢＳＰよりも、カルシウム、ヒドロキシアパタイトおよび補体因子Ｈに対する親和性が低減した塩または複合体として存在する。）、ならびに場合によって薬学的に許容される賦形剤または担体を提供するステップ、
生分解性ポリマーまたはコポリマーでコーティングされている、β結晶型の二リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２の顆粒をベースとする骨伝導性混合物、および、場合によって、薬学的に許容される賦形剤または担体を提供するステップ（該骨伝導性混合物は、成型および成形可能であり、外科手術または歯科補綴によって配置した場合に原位置で速やかに硬化する。）、および
前記骨誘導性および骨伝導性の混合物を、配置直前または配置の間に合わせて、骨の修復、ならびに損傷または罹患している組織および病変の治癒を促進する骨移植材料を得るステップ
によって得られる。
【００１５】
本発明の第２の態様において、骨誘導性ヒトＢＳＰは、無血清条件下で成長した真核細胞から発現され、得られたグリコシル化不十分のヒトＢＳＰである。
【００１６】
本発明の第３の態様において、グリコシル化不十分のヒトＢＳＰは初乳または母乳から得られたものである。
【００１７】
本発明において用いられる有機化合物は、少なくとも１つの環窒素含有塩基性基を有する有機化合物が好ましい。前記有機化合物は、生分解性ポリマーまたはコポリマーの分散剤および可塑剤の両方であり得るのが好ましく、Ｎ−イソプロピルピロリドン、Ｎ−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチルピロリドン（１−メチル−２−ピロリドン）、Ｎ−エチルピロリドン、Ｎ−プロピルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−ブタンジアミン、１−（２−アミノエチル）−ピペラジン、２−（１−ピロリジル）エチルアミン、４−アミノ−２−メトキシ−ピリミジン、２−ジメチルアミノ−エタノール、１−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、２−メルカプト−ピリミジン、２−メルカプトベンゾイミダゾール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、４−（２−アミノ−エチル）−ピリジン、２−アミノ−６−メトキシベンゾチアゾール、４−（アミノエチル）ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジアリル−メラミン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、１−（３−アミノプロピル）−イミダゾール、４−（２−ヒドロキシエチル）−ピリジン、１−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールからなる群から選択され得る。
【００１８】
本発明のさらなる一態様において、前記生分解性ポリマーまたはコポリマーは、ポリグリコリド、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリトリメチレンカーボネート、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリジオキサノン、ポリ乳酸ポリマー、ポリグリコール酸ポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリ−ヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリチロシンカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリペプチド、ポリデプシペプチド、ポリビニルアルコール、ポリエステルアミド、ポリアミド、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリシアノアクリレート、ポリフマレート、ポリ（アミノ酸）、修飾多糖、修飾タンパク質およびそれらのコポリマー、ターポリマーまたはそれらの混合物もしくはポリマーブレンドからなる群から選択される。
【００１９】
本発明の別の一態様は、直径３００から８００μｍ、好ましくは４００から７００μｍを有する、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２のコーティングされている顆粒を好ましくは含むことができる、歯科補綴において使用するための骨伝導性組成物に関する。本発明のバイオ複合材料が、５０体積パーセントを超えるβリン酸三カルシウムの顆粒、１つ以上の生分解性ポリマーおよびコポリマーを含む１０から４０体積パーセントの間のポリマーベース、０．５から１０体積パーセントのバイオ複合材料の可塑性および作業性を増大させる、ＢＳＰの溶媒または分散剤としての第１の骨誘導性混合物を含み得るのが好ましい。前記複合材料は、１から２００μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）複合材料の量のヒトｒＢＳＰを含み得る。好ましくは、前記骨誘導性混合物は、硬化前に１から２００μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の量のヒトｒＢＳＰを含み得る。
【００２０】
本発明によると、前記生分解性ポリマーは、その組成が乳酸５０から８０パーセントおよびグリコール酸２０から５０パーセントである、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマーであってよい。前記ＰＬＡ：ＰＧＡコポリマーは、約２５，０００と約１，０００，０００との間の選択された重量平均分子量範囲を有することができる。骨移植材料が、硬化後に１ＧＰａと約１００ＧＰａの間のヤング率を有するのが好ましい。
【００２１】
本発明のさらなる一態様は、
少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する有機化合物および生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰをベースとする分散液または溶液である骨誘導性混合物を提供するステップと、
顆粒が生分解性ポリマーまたはコポリマーでコーティングされている、β結晶型の二リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２の顆粒をベースとする骨伝導性混合物を提供するステップと、
前記骨誘導性および骨伝導性の混合物を合わせて、最初に成型および成形可能であり、外科手術または歯科補綴によって配置した場合に原位置で硬化する複合材料を得るステップとを含む骨誘導性および骨伝導性を有する骨移植片を調製する方法に関する。
【００２２】
骨移植材料を、少なくとも１つの窒素含有塩基性基および生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰを有する有機化合物をベースとする分散液または溶液と合わせるステップを含む、傷および軟部組織病変の治癒を促進する性質を有する骨移植材料を提供する方法。
【００２３】
本発明は、上記で規定したバイオ複合材料の投与または使用を含む、傷および軟部組織病変の治癒を促進する方法をさらに含む。適用または使用は、前記バイオ複合材料を、組織の骨格、顆粒状骨移植代替材料、２相軟骨インプラント、体重支持骨インプラント、非体重支持インプラントおよび低体重支持インプラントまたは固定装置、ビョウ、ピン、ネジ、骨アンレーおよびフィルムからなる群から選択されるインプラント装置に形成することを含み得る。
【００２４】
本発明は、吸収性ポリマー（１つもしくは複数）またはコポリマー（１つもしくは複数）のポリマーマトリックス、Ｎ−メチル−２−ピロリジン（ＮＭＰ）および好ましくは縫合材料としてデザインされている、薬学的有効量のヒトｒＢＳＰを含む傷治癒の性質を有する吸収性ポリマー組成物にさらに拡張する。本発明は、ＮＭＰおよびヒトｒＢＳＰの溶液が、再手術または手術後にインプラントもしくは傷に添加または適用される、治療方法にも拡張する。
【００２５】
本発明の原理は、基体、スペーサーブッシング（ｓｐａｃｅｒ ｂｕｓｈｉｎｇ）底部または基本要素およびスペーサーブッシング上部またはリング部材からなるスペーサーアセンブリーからなるインプラントにとりわけ有用である。基体には、雌螺を有する内孔（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｂｏｒｅ）が提供される。上部端または終端に近接する基体はくぼみを有し、くぼみは停止段部（ｓｔｏｐ ｓｈｏｕｌｄｅｒ）を提供するように孔よりも直径が大きい。軸のねじれを防ぐための手段を提供するために、セラミックの歯がネジ止めされ得るように、停止段部には、均一に、周囲に間隙のある、ポケットをかみ合わせるくぼみが提供される。
【００２６】
次に、本発明、その特徴および利点を添付の図面を参照して例示によってのみ記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のバイオ複合材料を調製するためのステップを示す模式図である。
【図２Ａ】ヒトｒＢＳＰ／ＮＭＰおよび生物吸収性ポリマーでコーティングされているβ−ＴＣＰ顆粒を含むバイオ複合材料の調製を示す写真である。
【図２Ｂ】ヒトｒＢＳＰ／ＮＭＰおよび生物吸収性ポリマーでコーティングされているβ−ＴＣＰ顆粒を含むバイオ複合材料の調製を示す写真である。
【図２Ｃ】ヒトｒＢＳＰ／ＮＭＰおよび生物吸収性ポリマーでコーティングされているβ−ＴＣＰ顆粒を含むバイオ複合材料の調製を示す写真である。
【図３Ａ】本発明のバイオ複合材料の外科手術の配置および原位置での硬化を示す写真である。
【図３Ｂ】本発明のバイオ複合材料の外科手術の配置および原位置での硬化を示す写真である。
【図３Ｃ】本発明のバイオ複合材料の外科手術の配置および原位置での硬化を示す写真である。
【図４Ａ】配置部位（患者女性、７３歳）、および手術１日後、手術３日後の傷の治癒を示す写真である。
【図４Ｂ】配置部位（患者女性、７３歳）、および手術１日後、手術３日後の傷の治癒を示す写真である。
【図４Ｃ】配置部位（患者女性、７３歳）、および手術１日後、手術３日後の傷の治癒を示す写真である。
【図４Ｄ】配置部位（患者女性、７３歳）、および手術１日後、手術３日後の傷の治癒を示す写真である。
【図４Ｅ】手術２．５カ月後、ならびにインプラントおよび歯科前の状況を示す、エックス線ＣＴである。
【図４Ｆ】手術２．５カ月後、ならびにインプラントおよび歯科前の状況を示す、エックス線ＣＴである。
【図４Ｇ】手術２．５カ月後、ならびにインプラントおよび歯科前の状況を示す、エックス線ＣＴである。
【図４Ｈ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｊ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｋ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｌ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｍ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図４Ｎ】例示の歯科後の傷の治癒および骨の再生を示す写真である。
【図５−１】外科手術１２週後の本発明による、配置したｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料から取った骨検体（ＤＳ６４−長さ１．２ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。厚さ２から３マイクロメートルの組織切片を、Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図５−２】外科手術１２週後の本発明による、配置したｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料から取った骨検体（ＤＳ６４−長さ１．２ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。厚さ２から３マイクロメートルの組織切片を、Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図５−３】外科手術１２週後の本発明による、配置したｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料から取った骨検体（ＤＳ６４−長さ１．２ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。厚さ２から３マイクロメートルの組織切片を、Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図６−１】やはり配置１２週後に取った、別のｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料インプラントからの骨検体（Ｄ７８−長さ０．５ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。調製、固定およびＭａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図６−２】やはり配置１２週後に取った、別のｒｈＢＳＰ／ＴＣＰ−バイオ複合材料インプラントからの骨検体（Ｄ７８−長さ０．５ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。調製、固定およびＭａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム染色、またはトルイジンブルー、またはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図７−１】外科手術３カ月のｒｈＢＳＰ／ＴＣＰバイオ複合材料から取った、第３の組織検体（Ｄ５９−長さ０．６ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。調製、固定およびＭａｓｓｏｎのトリクローム染色、トルイジンブルーまたはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【図７−２】外科手術３カ月のｒｈＢＳＰ／ＴＣＰバイオ複合材料から取った、第３の組織検体（Ｄ５９−長さ０．６ｃｍ）を示す顕微鏡写真である。調製、固定およびＭａｓｓｏｎのトリクローム染色、トルイジンブルーまたはエオジンと対にしたヘマトキシリンで染色。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（発明の詳細な記述および好ましい実施形態）
図１を参照すると、本発明の骨移植片またはバイオ複合材料は、ａ）β−リン酸三カルシウムの顆粒および生分解性のポリマーまたはコポリマーをベースとする基材（Ａ）を、（ｉ）第１に生分解性ポリマーもしくはコポリマーの可塑剤であり、第２にｐＫＩ４．０を有する酸性タンパク質と塩を形成することができる少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する１つ以上の有機化合物、ならびに（ｉｉ）実質的に純粋な活性ヒトｒＢＳＰを含む分散液または溶液である第１の組成物（Ｂ）、ならびに（ｃ）場合によって、薬学的に許容される賦形剤または担体と合わせて、（ｃ）活性なヒトｒＢＳＰの塩、少なくとも１つの塩基性窒素基を有する可塑剤、生物吸収性ポリマーまたはコポリマー、および成型可能であり、配置後に原位置で速やかに硬化するβ−ＴＣＰの顆粒を含むバイオ複合材料（Ｃ）を得るステップによって得られる。言及した通り、成型可能なバイオ複合材料（Ｃ）は、外科手術または歯科補綴によって配置され得、配置後に血液および水（Ｄ）の作用により原位置で速やかに硬化する。硬化後、硬化したバイオ複合材料（Ｄ）は、β−リン酸三カルシウム骨格の顆粒、および生分解性のポリマーまたはコポリマー中に埋め込まれた活性ヒトｒＢＳＰの塩を含む。
【００２９】
インプラントが成功する秘訣は、依然として最初の治癒のプロセスである。本発明の骨移植材料は、骨誘導性および骨伝導性であり、さらに速やかに再吸収されずに軟部組織、とりわけ損傷し罹患している結合組織の治癒を促進する。換言すると、骨移植材料は血管形成性であるが、硬化したβ−リン酸三カルシウム骨格の生物吸収性は、それが骨形成と平行して進行するように調節され得るので、線維芽細胞および結合組織細胞の移入に対する物理的バリアも提供する。本発明のバイオ複合材料は、したがって、巨視的に歯科インプラントに対する初期の物理的支持を提供し、微視的に骨系の細胞に対する骨格および骨の石灰化に対する核を提供する。さらに、これは血管形成および傷の治癒を促進し、線維性癒合を阻害する。
【００３０】
本発明の成型可能なバイオ複合材料は、生物吸収性ポリマー中に含まれている可塑剤が周囲の体液（血液、血清、水、痰）中に希釈されて出る場合に速やかに固化する生物吸収性のポリマーまたはコポリマーでβ−結晶型のリン酸三カルシウムの顆粒がコーティングされているので、配置後速やかに物理的および機械的性質を有する。
【００３１】
上記で言及した通り、成分（Ａ）を最初に、本発明にしたがって生物吸収性のポリマーまたはコポリマーに対する可塑剤と合わせて、配置の間に成型可能な基材を作製する。可塑剤または分散剤（Ｂ）は、ｐＫＩ４．０を有する、ヒトｒＢＳＰなどの酸性糖タンパク質に対する担体および生理学的共イオンとして同様に機能することができるように、窒素含有塩基性基を有する化合物の群から選択される。可塑剤は、自らを、ポリマーまたはコポリマーの鎖の間に埋め込み、これらの間隔を離し、「自由体積」を増大し、ポリマーまたはコポリマーのガラス転移点を低下させることによって作用する。本発明の適切な可塑剤および生理学的共イオンは、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−ブタンジアミン、１−（２−アミノエチル）−ピペラジン、２−（１−ピロリジル）エチル−アミン、４−アミノ−２−メトキシ−ピリミジン、２−ジメチルアミノエタノール、１−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、２−メルカプトピリミジン、２−メルカプトベンゾ−イミダゾール。Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、４−（２−アミノエチル）−ピリジン、２−アミノ−６−メトキシベンゾチアゾール、４−（アミノエチル）ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジアリルメラミン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、１−（３−アミノプロピル）−イミダゾール、４−（２−ヒドロキシエチル）−ピリジン、１−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールである。適切な化合物は、２から１４のｐＫａ値、好ましくは５から１４の、最も好ましくは５から１２のｐＫａ値を有する非反応性の塩基性基によって特徴づけられる。ｐＫａ値は表から得られ得る。上記に示す限界値は２５℃におけるｐＫａ値の測定値を意味する。インビトロにおける骨芽細胞の成熟およびインビボにおける骨の再生を増強することが知られている１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ＝ＣＡＳ数。８７２−５０−４；Ｎ−メチルピロリドン、１−メチルピロリドン、Ｎ−メチル−α−ピロリドン、１−メチルアザシクロペンタン−２−オン、Ｎ−メチル−γ−ブチロラクトン（ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ））の使用が最も好ましい（Ｍｉｇｕｅｌら、２００６年、Ｅｕｒｏｐ．Ｃｅｌｌｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１１巻、補完２：５）。しかし、この活性の根底にある生物学的メカニズムは依然として分かっていない。
【００３２】
本発明の生物吸収性および生体適合性のポリマーは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ＰＬＧＡまたはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の酸性コポリマーであるのが好ましい。ＰＬＧＡは、グリコール酸および乳酸の環状二量体（１，４−ジオキサン−２，５−ジオン）の開環共重合によって合成される。重合化の間、グリコール酸または乳酸の連続的な単量体単位がエステル結合によって一緒に連結され、直鎖状の脂肪族のポリエステルを生成物として生じる。重合化に用いられるグリコリドに対するラクチドの比率に応じて、様々な形態のＰＬＧＡが得られる。その組成が乳酸７５％およびグリコール酸２５％であるコポリマーを特定するＰＬＧＡ７５：２５が、最も好ましい。ＰＬＧＡのガラス転移点は、４０℃から６０℃の範囲にあり、やはり存在する可塑剤またはＮＭＰの量に依存する。乳酸のホモポリマー（ポリラクチド）およびグリコール酸のホモポリマー（ポリグリコリド）と異なり、ＰＬＧＡは、テトラヒドロフラン、アセトンまたは酢酸エチルなどの溶媒によって溶解され、したがって、βリン酸三カルシウムの粒子などの粒子状の材料上に容易にコーティングされ得る。
【００３３】
ＰＬＧＡは、エステル連結の加水分解によって水の存在下で分解して単量体の乳酸およびグリコール酸を生成し、これらは体内の様々な代謝経路に入ることができるので、生体材料の適用にＰＬＧＡを用いることに付随する全身性の毒性は存在しない。ＰＬＧＡの分解に必要とされる時間は、単量体の比率に部分的に依存する。ＰＬＧＡ５０：５０は約２カ月以内にインビボで速やかに分解され、エステルでエンドキャップされているポリマーはより長い分解半減期を有する。乳酸の純粋なポリマー（ＰＬＡ）、グリコール酸の純粋なポリマー（ＰＧＡ）およびこれら２つの物質の様々な比率のコポリマー間の分解の比率における違いは、炭素−１４およびトリチウムで標識したポリマーでできているインプラントを用いて、ラットおよび他の哺乳動物において熱心に研究されている。様々なポリマーおよびコポリマーの半減期は、インプラントの領域、ならびに肝臓、脾臓、腎臓、肺からの組織中に存在する放射能から計算され、もちろん各時間間隔に対する実験を通して回収された尿および糞便中に存在する放射能から計算された。ポリマーおよびコポリマーの半減期は、１００％ＰＧＡに対して５カ月から、５０：５０ＰＧＡ：ＰＬＡコポリマーで１週間に低減し、１００％ＰＬＡでは６．１カ月に速やかに増大した。軟部組織または骨において、分解の速度における違いは観察されなかった。尿、糞便または他の組織試料において著しい放射能は検出されなかった。これらの試験から、インプラントの分解速度のコントロールは、ＰＬＡおよびＰＧＡの組成を、ＰＬＡを７５％と１００％との間に、それに伴いＰＧＡを対応する２５％から０％に変化させることによって最も達成され得ると結論付けることができる。これは、２週間から６カ月のインプラントの半減期の範囲をもたらす。したがって、このような生分解性ポリマーが最も好ましい。
【００３４】
別の生物吸収性のポリエステルは、その分解がＰＬＧＡの分解より遅いため、長期間埋め込み型装置に用いられ得るポリカプロラクトンである。ポリカプロラクトン（商品名Ｒｅｓｉｌｏｎ（商標））は、組織修復では骨格および歯科補綴では根管充填として研究されている。一般的に、生分解性ポリマーは、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリカプロラクトン、ポリトリメチレンカーボネート、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリチロシン−カーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリペプチド、ポリデプシペプチド、ポリビニルアルコール、ポリエステルアミド、ポリアミド、ポリ無水物、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリシアノアクリレート、ポリフマレート、ポリ（アミノ酸）、修飾多糖、修飾タンパク質、およびそれらのコポリマー、ターポリマー、またはそれらの混合物もしくはポリマーブレンドからなる群から選択され得る。ポリマーマトリックスが、ポリグリコリド、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリトリメチレンカーボネート、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリジオキサノンおよびそれらのコポリマー、ターポリマー、またはそれらの混合物もしくはポリマーブレンドからなる群から選択されるのが好ましい。
【００３５】
本発明の骨伝導性構造成分は、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）である。ＴＣＰ骨格が非常に速やかに分解する場合、線維性癒合が開口にわたって骨の修復なしに生じる。骨格内に孔または経路がほとんど存在しない場合、骨の再生はとりわけ遅い。ＴＣＰの純度は、骨の形成および生体適合性の両方に影響を及ぼし、β−結晶型のＴＣＰ（β−ＴＣＰ）が骨格として最も好ましい。骨格が宿主の骨芽細胞および間葉細胞の移入を可能にしなければならないので、直径約２００から４００μｍの平均孔サイズおよび１００から２００μｍの経路を介して相互接続されている孔が好ましい。しかし、多孔性のβ−ＴＣＰは機械的性質が弱く、インビボで速やかに分解する。これは幾分弱い機械的性質を意味する。本発明のβ−ＴＣＰは、したがって、速やかな分解を避けるために、相が純粋なβ−結晶型を得る温度で焼結されたものであるのが好ましい。本発明によると、骨格は、それゆえ、生分解性のポリマーでマイクロコーティングされており、約１００から５０００μｍの、好ましくはより小型の骨空洞の充填には２００から７００μｍの、大型の骨空洞（例えば、切除後の空洞）には５００から１５００μｍの、ポリマーコーティングされているＴＣＰ顆粒に対して取扱いが良好であるように形成されている、β−ＴＣＰの、細密な、相純粋な粒子であるのが好ましい。非常に大型のポリマーコーティングされているβ−ＴＣＰ顆粒が、形成外科および再建外科におけるより大型の骨置換のための骨伝導性骨格として用いられ得る。
【００３６】
活性のヒトｒＢＳＰを、β−ＴＣＰ骨格の顆粒上にコーティングされている生物吸収性ポリマー中に埋め込む可塑剤と混合することによって、活性なヒトｒＢＳＰが、硬化後であっても骨電導性の環境においてその骨伝導性活性を遂行することができる骨擬態性の材料中に組み込まれる。使用される活性なヒトｒＢＳＰはグリコシル化不十分であり、ポリマーまたはコポリマー中に埋め込まれているのが好ましいので、補体因子Ｈによる非活性化をさらに回避し、骨の石灰化に対する核を形成することができる。ヒトｒＢＳＰは、可塑剤によって生物吸収性ポリマーおよび／またはコポリマー中にさらに埋め込まれ、その結果生物吸収性ポリマーまたはコポリマーの生物吸収と平行して放出される。要約すると、ヒトｒＢＳＰの長期間の活性は、（ｉ）生理学的な包接化合物または錯塩の、可塑剤の塩基性窒素との形成によって、（ｉｉ）未熟な石灰化および補体因子Ｈに対する結合からそれを防ぐ生物吸収性ポリマーまたはコポリマーにおける物理的組み入れによって、ならびに（ｉｉｉ）グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは、補体因子Ｈによって定型的なの骨細胞からの完全にグリコシル化されているヒトＢＳＰよりもさほど効率的に非活性化されないので、そのグリコシル化不十分によって、得られる。したがって、組換えヒトｒＢＳＰは無血清培地中で培養された細胞から得たものでなければならない。それにもかかわらず、ヒトｒＢＳＰは、骨の石灰化およびリン酸カルシウム沈澱に対するインビボの核であり続ける。したがって、本発明は、損傷した骨および結合組織の修復のためのヒトｒＢＳＰを含む移植片組成物を包含する。導入において言及した通り、ヒトの骨のシアロタンパク質は、オステオカルシンおよびオステオネクチンの他に、骨の細胞外マトリックスにおける主要な非コラーゲン性タンパク質である。
【００３７】
リンカーおよびリンカー−タグによって骨格またはポリマー−バックボーンに連結している、骨活性のｒＢＳＰを有することがさらに企図される。しかし、ヒトＢＳＰはシステイン残基を含んでいない。ヒトＢＳＰは高度の負の荷電を所有し（ｐＩ＝４．０）、そこで強力な陰イオン交換ＨＰＬＣを最初に用いてＢＳＰ複合体を単離する。したがって、可塑剤の塩基性基は同様の結合性の効果を発揮することがある。
【００３８】
本発明者らはあらゆる理論によって拘泥しようとするものではないが、本発明の組成物における酸性ヒトｒＢＳＰは骨誘導性および生体内鉱質形成性の両方の効果を有し、骨芽細胞および破骨細胞の骨移植材料に対する接着および走化性の遊走を促進する。本発明者らの所見は、ヒトｒＢＳＰの包接化合物または錯塩および塩基性の可塑剤が生分解性ポリマーまたはコポリマー中に含まれる場合、場合によって支持体または賦形剤とともに、とりわけ軟部組織および傷の治癒に関して相乗的な活性を有することを支持している。各成分は生物学的活性を有し、組み合わせることで有用な血管形成および骨伝導性の効果をもたらす。提供されるガレニック形態（ｇａｌｅｎｉｃ ｆｏｒｍ）は、規定された一致した順序で血管形成活性および骨形成活性が必要とされる手術部位に容易に投与され得る、生分解性ポリマーおよび無機質の支持体の顆粒の混合物をベースとする。ヒトｒＢＳＰは傷の治癒および骨形成における補助だけではないという強力な証拠が存在する。ヒトｒＢＳＰはまた、歯科手術の経過において炎症およびインプランティティスを阻害する。本発明のバイオ複合材料におけるＴＣＰ骨格は、バイオ複合材料およびヒトｒＢＳＰはその骨伝導性効果を完全に発達させ、骨の再生を促進することができるように、最終的に線維性癒合および内皮の内方成長に対抗する一時的な機械的バリアを提供する。生分解性ポリマーは、ヒトｒＢＳＰの埋め込み、および活性型におけるゆっくりとした放出のこの関係において必要とされる。
【００３９】
インビボでＢＳＰの発現は初期の骨の石灰化と一致し、ＢＳＰは大腿骨インプラント上にコーティングされる場合に骨誘導性であることが示されていた（ＯＴｏｏｌｅ ＧＣら、２００４年、Ｊ Ｏｒｔｈ Ｒｅｓ、２２巻、６４１−６４６頁）。同様の効果が、骨形成タンパク質ＯＰ−１、ＢＭＰ−７、様々な他の非コラーゲン性骨基質タンパク質、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子（ＩＧＦ）および前述のファミリーメンバーに対してやはり報告されている。しかし、これらの生物活性分子の骨の活性は推測にすぎない、というのはこれらの骨結合性活性はインビトロでもインビボでも測定され得ないからである。
【００４０】
しかし、本発明のバイオ複合材料は、抜歯部位、または骨再生および軟部組織の治癒が必要とされる部位に、直接配置され、硬化され得る。より小さな抜歯の場合には、半硬化したバイオ複合材料が周囲の保護歯周組織のレベルで切断され得、その結果軟部組織と骨移植材料との間に最小の間隙だけを有する平滑表面が得られる；図４Ａ−Ｃを参照されたい。次いで、骨移植材料は１日または２日内に治癒するが（図４Ｄを参照されたい）、軟部組織は骨移植材料に付着している。したがって、保護歯周組織内の組織片はより小さく、手術全体は患者にとってそれほど重いものではあり得ない。より小さな歯科インプラントの場合、インプラントの部位にわたって保護歯周組織を縫合する必要ももはやない；図４Ｃを参照されたい。
【００４１】
破骨細胞および骨芽細胞の骨基質に対する接着と一緒に、ＢＳＰは内皮細胞の接着、播種および配向、ならびに血管の形成にさらに関与する（Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅら、２０００年、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８６巻（８）、８８５−９１頁）。しかし、線維性癒合および内皮の内方成長は、さらなる骨がイノッサル（ｅｎｏｓｓａｌ）移植片の物理的支持に必要とされるインプラントの部位では望ましくない。これは、本発明によって、バイオ複合材料中にβ−ＴＣＰの顆粒を有することによって実現される。それにもかかわらず、ヒトｒＢＳＰは炎症反応を抑制し、関与するタンパク質、すなわちインターロイキンＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＫＬ、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などの放出を変調する。
【００４２】
本発明は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を促進し、必要とされる骨の再生および骨芽細胞の増殖の部位への骨芽細胞の遊走を誘発し、最終的に骨の石灰化のための核を提供する新規な骨移植片および複合材料を提供する。多数のタンパク質が、骨形成の性質、特にコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよび天然の細胞外マトリックスタンパク質の混合物に対して研究されている（Ｓｏｄｅｋら、Ｊ、２０００年、Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏｌ．、２４巻、９９−１２６頁；Ｍｅｙｅｒ Ｕ ら、１９９８年、Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ −Ｍａｔｅｒ Ｍｅｄ、９巻、３０１−３０７頁；Ｌａｃｏｕｔｕｒｅ ＭＥら、２００２年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ、１７巻、４８１−４９２頁；Ｓａｌｉｈ Ｅら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３６４巻、４６５−４７４頁）。機械的に緊張させた骨芽細胞の支持的接着において、Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンを比べると、付着に利用可能な分子の数が制限されている場合、緊張の抵抗性を支配する主要な因子は数々のインテグリン−細胞外マトリックスの付着であったことが明らかにされた（Ｌａｃｏｕｔｕｒｅ ＭＥら、２００２年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ、１７巻、４８１−４９２２０頁）。このように、これらのタンパク質を本発明のバイオ複合材料中に組み入れることも企図されている。
【００４３】
先行技術において、初期の治癒プロセスにおける生理学的改善を得るのに利用可能な手段は存在しない（Ｌｅｋｉｃ Ｐら、１９９６年、Ａｎａｔ Ｒｅｃ、２４４巻、５０−５８頁）。これは、生物模倣型の移植材料のいかなる大きな表面積も、細胞増殖の遅れをもたらすからである。インビボで生物学的機能を発揮することができ、補助因子Ｈまたは石灰化のいずれかによって非活性化されないが、ＢＳＰの沈着がインビボで骨形成の最初のステップを表すような、ＢＳＰの投与に利用可能な方法または組成物はさらに存在しなかった（Ｒｉｍｉｎｕｃｃｉ Ｍら、２００３年、Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ、３６巻、１０２７−１０３６頁）。さらに、ＢＳＰは骨の修復において骨誘導性であり、重大な欠損において治癒を実現することが見出された（Ｗａｎｇ ＭＬら、２００２年、Ｊ Ｏｒｔｈ Ｒｅｓ、２０巻、１１７５−１１８４頁；Ｗａｎｇ Ｊら、２００４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１９巻、２２１頁、抄録）。このように、誘導性薬剤によってＢＳＰの発現を誘導するように努力がなされてきた（Ｃｈｏｕら、２００５年、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２６巻、２８５−２９５２９頁）。しかし、これらの努力は結局成功しなかった。
【００４４】
ＢＳＰは、間葉系幹細胞および骨芽細胞に対するその分化および増殖の可能性を低減する、ある種の細胞外成熟を受けることが推測され得る。いくつかの研究グループは、補体の溶解の代替経路を制限することが知られている補体系の因子ＨにＢＳＰが高親和性で結合するので、ＢＳＰは栄養膜およびＢＳＰ生成性腫瘍細胞を免疫系による攻撃から保護すると仮定さえしている（Ｆｅｄａｒｋｏら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００、２７５巻、１６６６６−１６６７２頁；ＷＯ ００／０６２０６５）。しかし、ＢＳＰは、認識配列であるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸ＲＧＤによってインビボでインテグリン受容体に特異的に結合することが証明されている。ＲＧＤ認識配列のα（ｖ）β（３）インテグリン受容体に対する結合は、内皮細胞の接着、播種および配向はＢＳＰによって媒介されるという観察のために、ＢＳＰは骨基質の形成および傷治癒における事象の中心にある。さらに、腫瘍周囲の血管形成は、腫瘍細胞におけるＢＳＰ発現と平行して生じる（Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅら、２０００年、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８６巻（８）、８８５ｆｆ）。しかし、「遊離のＢＳＰ」は高親和性で補体因子Ｈによって結合されており、その結果先行技術の組成物によるＢＳＰのあらゆる投与はその生理学的機能を発揮することができなかった。１５０ｋＤａの因子Ｈの大型分子は、抗体または受容体が結合することができない程度に小型のＢＳＰ（およそ６５ｋＤａ）に結合する。さらに、因子Ｈは血清中に過剰に存在する（健康人の場合ＢＳＰが血清１ｍｌあたり＜２０ｎｇであるのに比べて、１ｍＬあたり因子Ｈ０．５ｍｇ）。
【００４５】
しかし、本発明者らのデータは、低濃度のグリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは、間葉系幹細胞の分化および骨芽細胞の初期の付着を誘発するのに十分であることを示している。これは、大型の表面材料または外来材料が骨細胞の分化および定着を遅らせないように、グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰを生分解性のポリマー中に組み入れることによって実現される。しかし、本発明のグリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは依然として高度に酸性であり、ヒドロキシ基およびリン酸カルシウムと反応し、沈澱する。グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰコーティングを塩基性溶媒および生物吸収性ポリマー用の可塑剤中に溶解することによって、ＢＳＰタンパク質が生物学的機能をもはや発揮することができない状態にＢＳＰタンパク質を維持すると思われる。グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは、その孔が好ましくは１０から１０００μｍの、より好ましくは２０から５００μｍの、最も好ましくは５０から２００μｍの直径サイズを有するβ−ＴＣＰの顆粒でできている骨格中に組み入れられるのが最も好ましい。換言すると、骨移植片の石灰化された、または骨性の骨組込みは、骨芽細胞が付着し、移植材料の孔中に実際に成長した場合に実現され得る。このように、孔は、好ましくは１０から１０００μｍの、より好ましくは２０から５００μｍの、最も好ましくは５０から２００μｍの直径サイズを有さなければならない。グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰは、好ましくは１から１００μｇ／ｍＬの、好ましくは１０から５０μｇ／ｍＬの濃度で本発明の組成物中に含まれる。
【００４６】
本明細書以下に記載する本発明の実施例および実施形態は、限定的なものとして、または他の方法で限定的なものとして解釈されるべきではなく、むしろ本質における例示としてのみ解釈されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲において規定されている。
【実施例】
【００４７】
本実験において用いられる手順は全て倫理委員会によって認可された。１９６４年のヘルシンキ宣言の規則（ＮＩＨ出版、第８６−２３、１９８５年改定）にしたがった。
【００４８】
実施例１−骨誘導性ヒトｒＢＳＰとの血管形成性混合物の調製
グリコシル化不十分のヒトｒＢＳＰを、Ｗｕｔｔｋｅらによって記載されている方法にしたがって単離した（Ｗｕｔｔｋｅら、２００１年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｂｏｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｏｎｅ ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７６巻、３６８３９−３６８４８頁）。簡潔に述べると、ヒトＢＳＰに対する完全なｃＤＮＡ（シグナルペプチドなし）をＰＣＲによって増幅し、エピソームの真核生物発現ベクターｐＣＥＰ−Ｐｕ中にクローニングした（Ｋｏｈｆｅｌｄｔ Ｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｓ．、１９９７年、４１４巻（３）、５５７−６１頁における、Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｔｅｓｔｉｃａｎ）。発現構築物を、リポソームが媒介する安定なトランスフェクションによって、胚性腎細胞系ＥＢＮＡ−２９３またはヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７中に導入した。ＦＣＳ中のタンパク質が発現されたｒＢＳＰと反応し、組換えＢＳＰの精製を妨げないように、一過性の細胞を、無血清培地中２日間トランスフェクションした４８時間後に培養した。次いで、ＢＳＰ発現性細胞を無血清条件下で培養した。組換えヒトＢＳＰの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットによってモニタリングした。
【００４９】
トランスフェクトした細胞の無血清培養上清２．５リットルを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムによって精製し、そこから得られたのは均一な組換えＨｉｓ−ｍｙｃ−ＥＫ−ＢＳＰ（ヒトｒＢＳＰ）２５０μｇであった。ヒトｒＢＳＰを部分的にグリコシル化し、スレオニン１２５にはグリコシル化はなかった。ヒトｒＢＳＰのアミノ酸配列は、８８位（ＮＴＴ）、１６１（ＮＣＴ）、１６６位（ＮＳＴ）および１７４位（ＮＧＳ）に４つのＮ−グリコシル化部位を含んでいる。同定されたＮ−グリカン構造は全て、組換えＥＢＮＡ−２９３ＢＳＰ上に両方とも見出すことができた。しかし、Ｎ−グリカン全体におけるそれぞれの構造のパーセンテージ比率において違いが存在した。骨からのＢＳＰ Ｎ−グリカンの主な割合はアンテナ３本の構造（５８％）であり、ＥＢＮＡ細胞系においてアンテナ４本の構造（４８％）であった。ＭＡＬＤＡ−ＴＯＦ質量分析によってペプチドの質量を決定し、ペプチドの一部分をＰＳＤ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって配列決定した。これらの中で、ヒトｒＢＳＰ配列ＤＡＴＰＧＴＧにおけるスレオニンをＯ−グリコシル化する。ヒトの骨から単離したＢＳＰでは、第３のＯ−グリコシル化がもたらされた。組換えＢＳＰでは、第３のグリコシル化部位は存在しない。おそらく、このグリコシル化部位はＴＧＬＡＡ−ＢＳＰ部分構造上にある。
【００５０】
無血清条件下で培養した細胞から単離したヒトｒＢＳＰ２５０μｇを、次いで凍結乾燥し、Ｎ−メチルピロリジン５ｍＬ中に溶解して、血管形成活性および骨誘導性活性を有するヒトｒＢＳＰ（５０μｇ／ｍＬ）を含む塩基性溶液を得た。
【００５１】
実施例２−骨伝導性を有する成型可能な骨移植片およびバイオ複合材料の調製
骨移植片および骨伝導性材料として、ＤＳ ＤＥＮＴＡＬ Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＡＧ （Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ−Ｚｕｒｉｃｈ、Ｗａｇｉｓｔｒａｓｓｅ、スイス）の市販のＥａｓｙ Ｇｒａｆｔ（商標）「スペースホルダー」材料が用いられた。バイオ複合材料はβ−結晶相の純粋なリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）の顆粒を含んでいた。ＴＣＰ−材料を顆粒に圧縮し、本実施例において、顆粒は５００μｍから６３０μｍの直径を有し、５０パーセントを超える微孔質および約５μｍの平均孔サイズを有する分画が用いられた。配置を促進するために、硬質の顆粒材料が、規定された量の可塑剤を加えることによって配置に対して成型可能であり得るように、市販のＥａｓｙ Ｇｒａｆｔ（商標）スペースホルダー材料を、生分解性ＰＬＧＡポリマーの１０μｍの層でさらにコーティングする。
【００５２】
実施例３−骨誘導性、骨伝導性および血管形成性を有するバイオ複合材料およびスペースホルダーの調製
本発明のバイオ複合材料を、β−ＴＣＰのＰＬＧＡ−コーティングした顆粒（ＤＳ ＤＥＮＴＡＬ Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＡＧ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ−Ｚｕｒｉｃｈ、Ｗａｇｉｓｔｒａｓｓｅ、スイスのＥａｓｙ Ｇｒａｆｔ（商標）「スペースホルダー」材料）を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）およびヒトｒＢＳＰ５０μｇ／ｍＬを含む塩基性の有機可塑剤溶液で、５秒から１分間の間、硬化した顆粒状のＴＣＰ−材料が流動性になり、生分解性のＰＬＧＡ−コーティング内に埋め込まれている多座配位のヒトｒＢＳＰ−ＮＭＰ錯塩の液状の包接化合物が得られるように穏やかに振盪しながら、浸漬し、含浸することによって調製した。生分解性のＰＬＧＡは、ＴＣＰチャネルおよび孔内の、さらに顆粒内間隙および凹部内の圧縮されたＴＣＰ材料の表面に位置するので、ヒトｒＢＳＰ ＮＭＰ錯塩の包接化合物は、それによって顆粒状のβ−ＴＣＰ材料内にやはり安置されていた。その結果、β−結晶相の純粋なリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）の顆粒、生分解性のＰＬＧＡポリマー、ならびにＮＭＰおよび生物学的に活性なヒトｒＢＳＰの安置された包接化合物からなるバイオ複合材料が得られた。バイオ複合材料は、配置の間に成型可能であり、配置後、２分以内に過剰のＮＭＰが水および血液中に拡散することによって原位置で硬化した。バイオ複合材料の成分は、好ましくは、得られた硬化したバイオ複合材料が、硬化後β−ＴＣＰ／ＰＬＧＡ材料（ＥａｓｙＧｒａｆｔ（商標）スペースホルダー）１ミリリットルあたり約２０μｇのヒトｒＢＳＰを含むと予想された比率で混合された。
【００５３】
顆粒状のＴＣＰ材料との混合は、シリンジ装置またはアンプルによって体外で（図２Ａ、Ｂを参照されたい）、代わりにＴＣＰ材料の一部分が原位置の成型用に配置されている場合は原位置で（図２Ｃ）のいずれかで行われた。
【００５４】
実施例４−外科手術
図４Ａ−Ｋは歯科外科における、および骨形成のためのバイオ複合材料の適用を記載するものである。臨床上、治癒時間、とりわけ軟部組織の治癒は５０％速く、完全であることが判明し、インプランティティスの積極的な阻害ならびに組織および傷の治癒の活性化と一致して進行した。成型用の可塑剤としてＮＭＰを有する定型のＥａｓｙ Ｇｒａｆｔ（商標）材料と比較して、傷の治癒における反応時間は実際に半減し（５０％）、骨材料の産生は倍加する。骨密度測定を行って、ＢＳＰ／ＮＭＰが加速する軟部組織および硬組織の治癒を定量する。インプラント直後に取ったインプラント（バイオ複合材料）のバイオプシーは、ＢＳＰ誘導性の新しく形成した骨材料は、天然の骨組織と組織学的に区別することができないことを示唆しており、これにより、観察される再生の加速および天然の病変の治癒と一致して、骨芽細胞の観察される速やかな移入および天然の骨の石灰化プロセスが確認される。
【００５５】
図４Ａは、歯科外科前の患者（女性、７３歳）の歯科および骨の状況を示すエックス線である。図４Ｂは、予め形成したヒトｒＢＳＰ／ＮＭＢ（顆粒状のＴＣＰ／ＰＬＧＡ１ｍＬあたりヒトｒＢＳＰ／ＮＭＰ５０μｇ）の混合物を含浸させ、それを含む、成型可能な骨移植片（ＥａｓｙＧｒａｆｔ（商標））の配置を示す。最終の硬化の前に過剰の顆粒状の移植片を除去（切断）し、保護歯周組織の組織片を手操作で圧縮し、縫合せずに閉じた。図４Ｃおよび４Ｄは、手術１日後および３週間後の臨床状況を示す。高齢の患者にしては最初の傷の治癒が加速し、軟部組織の治癒が短期間で完了することに留意されたい。図４ＥおよびＦは、埋め込み２．５カ月後のエックス線およびＣＴであり、１１１３ＨＵのクレスト領域（ｃｒｅｓｔａｌ ｒｅｇｉｏｎ）において新しく形成した骨を示す。新しく形成した骨の隣接面間レベルに留意されたい。図４Ｇは、歯科インプラント（スクリュー）が配置される方法を示す。図４ＨからＮは、以下の歯科のステップの例、すなわち、位置決め装置の配置（４Ｈ）、出血点の配置（４Ｉ）、インプラント部位の骨の外側圧力圧縮（４Ｋ）、位置決め後のインプラント（４Ｌ）を示す。幅（３ｍｍ）および乳頭突起を保存するための隣接面間距離（＞３ｍｍ）に留意されたい。仮の（４Ｍ）および最終の歯科溶液（４Ｎ）。
【００５６】
とりわけ、図４Ｃから４Ｆは、顆粒状のＴＣＰ移植材料をヒトｒＢＳＰで処置した場合の組織および傷の治癒の加速を確認するものである。図４Ｅは、軟部組織の速やかな治癒は骨移植材料の骨誘導性および骨形成性を阻まず、または妨害せず、ｒＢＳＰは生分解性ポリマー中に埋め込まれた場合、その骨誘導性活性を十分に発揮し、発展させ得ることをさらに確認するものである。
【００５７】
実施例５−後に配置したバイオ複合材料の組織学的検査
本発明のバイオ複合材料を、抜歯後配置し、外科手術１２週後に骨検体（長さ−Ｄ６８：１．２ｃｍ；Ｄ７８：０．５ｃｍ；Ｄ５９：０．６ｃｍ）を取った。トレパン（ｔｒｅｐａｎ）核を脱水し、２から３マイクロメートル厚の組織切片に切断した組織試料を含むポリマー化樹脂材料および硬化したブロック中に埋め込んだ。組織切片を、マッソン三色染色法（Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｅｎｅｒ）、トルイジンブルー、およびエオジンと対にしたヘマトキシリンで普通染色するために顕微鏡用スライドガラス上に搭載する。
【００５８】
マッソン三色染色法において：核は黒色、細胞質−赤色／桃色、赤血球−赤色、コラーゲン線維および軟骨−青色／緑色、筋肉繊維−赤色。
【００５９】
Ｈ＆Ｅ普通染色（エオジンと対にしたヘマトキシリン）において、核、核酸およびＥＲは青色、細胞質−桃色、赤血球−橙色／赤色、弾性繊維、細網繊維およびコラーゲン繊維−桃色。
【００６０】
トルイジンブルーでの普通染色において、核および核酸、原形質、赤血球およびコラーゲン線維は青色で、肥満細胞顆粒は低ｐＨのため紫色。
【００６１】
図５に関して、検体（Ｍａｓｓｏｎ−Ｇｏｌｄｎｅｒ染色）の切片ＤＳ６４（Ｄｕｎｎｓｃｈｎｉｔｔ ＃６４）の全体像は、１０倍の倍率下で骨組織の重要な内方成長を示し、いくつかの外来の顆粒状材料（β−ＴＣＰ顆粒）が見える。ＤＳ６４／０１−０３の視野上で骨新生が優勢であり、外来材料の比率は少ない。より高倍率の視野では、ＤＳ６４／０４は初期段階の層状の骨形成を示し（たった１２週後で！）、層状の骨の形成の初期の開始を示している。通常、層状の骨は、およそ９カ月後にこのような種類の検体においてのみ検出され得るにすぎない。視野ＤＳ６４／０５−０７は、外来材料の単離されているゾーンを示すが、いくつかの位置では重要な骨新生の明らかな徴候が存在する。ＤＳ６４／０８−１０の顕微鏡視野は、様々な倍率でのＨ＆Ｅ染色に基づくものである。顕微鏡視野は、初期段階の新しく形成された層状の骨を示しており、高倍率では周辺部分における骨芽細胞の鎖を示している。視野Ｄ６４／１１−１３はトルイジンで染色したものである。上首尾の再生および新しく形成された骨材料がトレパン核内に見出され得る。
【００６２】
図６に関して、検体ＤＳ７８の全体像は、トレパン核内に骨新生があまりないことを示している。高倍率では編組み状の骨の徴候が存在する。顕微鏡視野ＤＳ７８／１１−１３を参照されたい。このように、編組み状の骨の層状の骨への成熟が起ころうとしている。
【００６３】
図７に関して、および検体ＤＳ５９に関すると、トレパン核の左端の全体像（ＤＳ５９−９）は、外来材料の痕跡がいくつかあるだけの広範囲に及ぶ骨の再構築および重要な骨新生を示している。トレパン核の右端の全体像（ＤＳ５９−０６）は、同様に、重要な骨新生および骨の再構築を示している。新しく形成された骨材料は層状のタイプであり、顕微鏡視野ＤＳ５９／０７上に見られ得る。これは非常に活動的な新生を意味する。視野ＤＳ５９／０９は血管新生および脈管新生の島、すなわち線維芽細胞、骨芽細胞および結合組織の形成、ならびに骨の再構築および骨新生の全ての徴候を示している。
【００６４】
要約すると、検体６４および５９は初期の発生および非常に優勢な骨新生を示している。検体７８は骨の形成が少ないことを示している。全ての場合において、組織学は、頑強な新しい編組み状および層状の骨の形成を明らかにしており、残りの外来材料は最小の痕跡にすぎなかった。このように、本発明の新しいバイオ複合材料は、加速された再建を経験しており、骨の再構築および骨の形成を誘発していると思われる。
【００６５】
実施例６−破骨細胞に対するヒトｒＢＳＰのインビトロ活性
破骨細胞の活性化および分化は、骨芽細胞からのＲＡＮＫＬの発現およびＯＰＧ（オステオプロテゲニン）の発現に依存する。ＯＰＧは、ＲＡＮＫＬの活性に対抗し、破骨細胞の分化を阻害すると思われる。ヒト一次骨芽細胞をインビトロでヒトｒＢＳＰとインキュベートし、上清中のＯＰＧおよびＲＡＮＫＬの発現をＥＬＩＳＡおよびリアルタイムＰＣＲで決定すると、ヒトｒＢＳＰは一般的に、破骨細胞からのＲＡＮＫＬの発現を抑制し、ＯＰＧの放出を刺激したことが見出された。ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧの割合の増加は破骨細胞の活性化を意味し、これは本発明のバイオ複合材料の骨誘導性を説明し得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性ポリマーおよびβ−リン酸三カルシウムの顆粒の複合材料である、骨欠損治療および骨の新生のための骨移植材料であって、
少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する有機化合物、および非変性の条件下で得た生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰをベースとする分散液または溶液である骨誘導性混合物（グリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰが、前記骨誘導性混合物中に、ヒト血清中に存在する定型的なヒトＢＳＰよりも、カルシウム、ヒドロキシアパタイトおよび補体因子Ｈに対する親和性が低減した塩または複合体として存在する。）、ならびに場合によって、薬学的に許容される賦形剤または担体を提供するステップ、
生分解性ポリマーまたはコポリマーでコーティングされている、β結晶型の二リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２の顆粒をベースとする骨伝導性混合物、および場合によって、薬学的に許容される賦形剤または担体を提供するステップ（該骨伝導性混合物は、成型および成形可能であり、外科手術または歯科補綴によって配置した場合に原位置で速やかに硬化する。）、および
前記骨誘導性および骨伝導性の混合物を、配置直前または配置の間に合わせて、骨の修復、ならびに損傷または罹患している組織および病変の治癒を促進する骨移植材料を得るステップ
によって得られる、骨移植材料。
【請求項２】
骨誘導性のヒトＢＳＰが、無血清条件下で成長した真核細胞から発現され、得られた、グリコシル化不十分のヒトＢＳＰである、請求項１の骨移植材料。
【請求項３】
ヒトＢＳＰが初乳または母乳から得られた、請求項１の骨移植材料。
【請求項４】
前記有機化合物が、少なくとも１つの環窒素含有塩基性基を有する有機化合物、より好ましくは少なくとも１つの環窒素含有塩基性基を有し、ならびに生分解性ポリマーまたはコポリマーの分散剤および可塑剤の両方である有機化合物から選択される、請求項１から３のいずれかの骨移植材料。
【請求項５】
有機化合物が、Ｎ−イソプロピルピロリドン、Ｎ−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチルピロリドン（１−メチル−２−ピロリドン）、Ｎ−エチルピロリドン、Ｎ−プロピルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−ブタンジアミン、１−（２−アミノエチル）−ピペラジン、２−（１−ピロリジル）エチルアミン、４−アミノ−２−メトキシ−ピリミジン、２−ジメチルアミノエタノール、１−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、２−メルカプトピリミジン、２−メルカプトベンゾイミダゾール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、４−（２−アミノエチル）−ピリジン、２−アミノ−６−メトキシベンゾチアゾール、４−（アミノエチル）ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジアリルメラミン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、１−（３−アミノプロピル）−イミダゾール、４−（２−ヒドロキシエチル）−ピリジン、１−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールからなる群から選択される、請求項１から４のいずれかの骨移植材料。
【請求項６】
前記生分解性ポリマーまたはコポリマーが、ポリグリコリド、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリトリメチレンカーボネート、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリジオキサノン、ポリ乳酸ポリマー、ポリグリコール酸ポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリチロシンカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリペプチド、ポリデプシペプチド、ポリビニルアルコール、ポリエステルアミド、ポリアミド、ポリ無水物、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリシアノアクリレート、ポリフマレート、ポリ（アミノ酸）、修飾多糖、修飾タンパク質およびそれらのコポリマー、ターポリマー、またはそれらの混合物もしくはポリマーブレンドからなる群から選択される、請求項１から５のいずれかの骨移植材料。
【請求項７】
前記骨伝導性混合物が、歯科補綴において使用するための、直径３００μｍから８００μｍ、好ましくは４００μｍから７００μｍを有する、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２のコーティングされている顆粒を含む、請求項１から６のいずれかの骨移植材料。
【請求項８】
前記複合材料が、５０体積パーセントを超えるβリン酸三カルシウムの顆粒、１つ以上の生分解性ポリマーおよびコポリマーを含む１０から４０体積パーセントの間のポリマーベース、０．５から１０体積パーセントのバイオ複合材料の可塑性および作業性を増大させる、ＢＳＰの溶媒または分散剤としての第１の骨誘導性混合物を含む、請求項１から７のいずれかの骨移植材料。
【請求項９】
前記複合材料が、１０から２００ｎｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）複合材料の量のヒトＢＳＰを含む、請求項１から８のいずれかの骨移植材料。
【請求項１０】
前記骨誘導性混合物が、硬化前に１０から２００μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の量のヒトＢＳＰを含む、請求項１から８のいずれかの骨移植材料。
【請求項１１】
前記生分解性ポリマーが、その組成が乳酸５０から８０パーセント、およびグリコール酸２０から５０パーセントであるポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマーであり、および好ましくは約２５，０００と約１，０００，０００の間の重量平均分子量範囲を有するＰＬＡ：ＰＧＡコポリマーである、請求項１から１０のいずれかの骨移植材料。
【請求項１２】
硬化後に１ＧＰａと約１００ＧＰａの間のヤング率を有する、請求項１から１１のいずれかの骨移植材料。
【請求項１３】
骨誘導性および骨伝導性を有する骨移植材料を作製する方法であって、
少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する有機化合物、および生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰをベースとする分散液または溶液である骨誘導性混合物を提供するステップ、
顆粒が生分解性ポリマーまたはコポリマーでコーティングされている、β結晶型の二リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２の顆粒をベースとする骨伝導性混合物を提供するステップ、および
前記骨誘導性および骨伝導性の混合物を合わせて、最初に成型および成形可能であり、外科手術または歯科補綴によって配置した場合に原位置で硬化する複合材料を得るステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
傷および軟部組織病変の治癒を促進する性質を有する骨移植材料を提供する方法であって、骨移植材料を、少なくとも１つの窒素含有塩基性基および生理学的有効量のグリコシル化不十分のヒトＢＳＰを有する有機化合物をベースとする分散液または溶液と合わせるステップを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかの、または請求項１から１４のいずれかにおいて得られた骨移植材料を適用することを含む、傷および軟部組織病変の治癒を促進する方法。
【請求項１】
生分解性ポリマーおよびβ−リン酸三カルシウムの顆粒の複合材料である、骨欠損治療および骨の新生のための骨移植材料であって、
少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する有機化合物、および非変性の条件下で得た生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰをベースとする分散液または溶液である骨誘導性混合物（グリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰが、前記骨誘導性混合物中に、ヒト血清中に存在する定型的なヒトＢＳＰよりも、カルシウム、ヒドロキシアパタイトおよび補体因子Ｈに対する親和性が低減した塩または複合体として存在する。）、ならびに場合によって、薬学的に許容される賦形剤または担体を提供するステップ、
生分解性ポリマーまたはコポリマーでコーティングされている、β結晶型の二リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２の顆粒をベースとする骨伝導性混合物、および場合によって、薬学的に許容される賦形剤または担体を提供するステップ（該骨伝導性混合物は、成型および成形可能であり、外科手術または歯科補綴によって配置した場合に原位置で速やかに硬化する。）、および
前記骨誘導性および骨伝導性の混合物を、配置直前または配置の間に合わせて、骨の修復、ならびに損傷または罹患している組織および病変の治癒を促進する骨移植材料を得るステップ
によって得られる、骨移植材料。
【請求項２】
骨誘導性のヒトＢＳＰが、無血清条件下で成長した真核細胞から発現され、得られた、グリコシル化不十分のヒトＢＳＰである、請求項１の骨移植材料。
【請求項３】
ヒトＢＳＰが初乳または母乳から得られた、請求項１の骨移植材料。
【請求項４】
前記有機化合物が、少なくとも１つの環窒素含有塩基性基を有する有機化合物、より好ましくは少なくとも１つの環窒素含有塩基性基を有し、ならびに生分解性ポリマーまたはコポリマーの分散剤および可塑剤の両方である有機化合物から選択される、請求項１から３のいずれかの骨移植材料。
【請求項５】
有機化合物が、Ｎ−イソプロピルピロリドン、Ｎ−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチルピロリドン（１−メチル−２−ピロリドン）、Ｎ−エチルピロリドン、Ｎ−プロピルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−ブタンジアミン、１−（２−アミノエチル）−ピペラジン、２−（１−ピロリジル）エチルアミン、４−アミノ−２−メトキシ−ピリミジン、２−ジメチルアミノエタノール、１−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、２−メルカプトピリミジン、２−メルカプトベンゾイミダゾール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、４−（２−アミノエチル）−ピリジン、２−アミノ−６−メトキシベンゾチアゾール、４−（アミノエチル）ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジアリルメラミン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、１−（３−アミノプロピル）−イミダゾール、４−（２−ヒドロキシエチル）−ピリジン、１−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールからなる群から選択される、請求項１から４のいずれかの骨移植材料。
【請求項６】
前記生分解性ポリマーまたはコポリマーが、ポリグリコリド、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリトリメチレンカーボネート、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリジオキサノン、ポリ乳酸ポリマー、ポリグリコール酸ポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリチロシンカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリペプチド、ポリデプシペプチド、ポリビニルアルコール、ポリエステルアミド、ポリアミド、ポリ無水物、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリシアノアクリレート、ポリフマレート、ポリ（アミノ酸）、修飾多糖、修飾タンパク質およびそれらのコポリマー、ターポリマー、またはそれらの混合物もしくはポリマーブレンドからなる群から選択される、請求項１から５のいずれかの骨移植材料。
【請求項７】
前記骨伝導性混合物が、歯科補綴において使用するための、直径３００μｍから８００μｍ、好ましくは４００μｍから７００μｍを有する、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２のコーティングされている顆粒を含む、請求項１から６のいずれかの骨移植材料。
【請求項８】
前記複合材料が、５０体積パーセントを超えるβリン酸三カルシウムの顆粒、１つ以上の生分解性ポリマーおよびコポリマーを含む１０から４０体積パーセントの間のポリマーベース、０．５から１０体積パーセントのバイオ複合材料の可塑性および作業性を増大させる、ＢＳＰの溶媒または分散剤としての第１の骨誘導性混合物を含む、請求項１から７のいずれかの骨移植材料。
【請求項９】
前記複合材料が、１０から２００ｎｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）複合材料の量のヒトＢＳＰを含む、請求項１から８のいずれかの骨移植材料。
【請求項１０】
前記骨誘導性混合物が、硬化前に１０から２００μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の量のヒトＢＳＰを含む、請求項１から８のいずれかの骨移植材料。
【請求項１１】
前記生分解性ポリマーが、その組成が乳酸５０から８０パーセント、およびグリコール酸２０から５０パーセントであるポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマーであり、および好ましくは約２５，０００と約１，０００，０００の間の重量平均分子量範囲を有するＰＬＡ：ＰＧＡコポリマーである、請求項１から１０のいずれかの骨移植材料。
【請求項１２】
硬化後に１ＧＰａと約１００ＧＰａの間のヤング率を有する、請求項１から１１のいずれかの骨移植材料。
【請求項１３】
骨誘導性および骨伝導性を有する骨移植材料を作製する方法であって、
少なくとも１つの窒素含有塩基性基を有する有機化合物、および生理学的有効量のグリコシル化不十分の組換えヒトＢＳＰをベースとする分散液または溶液である骨誘導性混合物を提供するステップ、
顆粒が生分解性ポリマーまたはコポリマーでコーティングされている、β結晶型の二リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２の顆粒をベースとする骨伝導性混合物を提供するステップ、および
前記骨誘導性および骨伝導性の混合物を合わせて、最初に成型および成形可能であり、外科手術または歯科補綴によって配置した場合に原位置で硬化する複合材料を得るステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
傷および軟部組織病変の治癒を促進する性質を有する骨移植材料を提供する方法であって、骨移植材料を、少なくとも１つの窒素含有塩基性基および生理学的有効量のグリコシル化不十分のヒトＢＳＰを有する有機化合物をベースとする分散液または溶液と合わせるステップを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかの、または請求項１から１４のいずれかにおいて得られた骨移植材料を適用することを含む、傷および軟部組織病変の治癒を促進する方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｊ】
【図４Ｋ】
【図４Ｌ】
【図４Ｍ】
【図４Ｎ】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｊ】
【図４Ｋ】
【図４Ｌ】
【図４Ｍ】
【図４Ｎ】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【公表番号】特表２０１２−５３１２８６（Ｐ２０１２−５３１２８６Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１８０９８（Ｐ２０１２−５１８０９８）
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９５８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０００９７０
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１２００２４３７）アルムブルスター・バイオテクノロジー・ゲー・エム・ベー・ハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９５８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０００９７０
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１２００２４３７）アルムブルスター・バイオテクノロジー・ゲー・エム・ベー・ハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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