毛質の評価方法
【課題】毛髪に含まれるタンパク質を同定することにより毛質を評価することが可能な毛質の評価方法を提供する。
【解決手段】毛質の評価方法は、毛髪からタンパク質を抽出する工程と、抽出されたタンパク質を、ペプチド結合加水分解酵素を用いて加水分解する工程と、加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する工程を有する。
【解決手段】毛質の評価方法は、毛髪からタンパク質を抽出する工程と、抽出されたタンパク質を、ペプチド結合加水分解酵素を用いて加水分解する工程と、加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する工程を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、毛髪のダメージを評価する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、特許文献１には、毛髪に紫外光を照射し、３３０ｎｍ付近に蛍光極大を有するケラチン中の芳香族アミノ酸の蛍光バンドの波形及び／又は蛍光極大波長を測定して、基準値に対する波形の変化及び／又は波長シフトの度合いから毛髪の損傷・劣化を評価する方法が開示されている。特許文献２には、毛髪を、還元剤を含有する抽出溶剤を用いて抽出し、得られる蛋白質量を指標とする毛髪損傷の評価方法が開示されている。特許文献３には、毛髪を長手方向に沿って引き裂いてその引き裂き強度を求め、引き裂き強度に基づいて毛髪の損傷度を評価する方法が開示されている。特許文献４には、毛髪における酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで毛髪のダメージを評価する方法が開示されている。
【０００３】
また、毛髪への荷重を負荷し、そのときの荷重の大きさと毛髪の伸長との関係から微小荷重かつ微小伸長域の非フック領域の面積を求め、得られた面積に基づいてくせ毛の程度を評価する方法（特許文献５参照）が知られている。
【０００４】
一方、毛髪中のヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）の発現を指標とする毛質の評価方法が知られている（特許文献６参照）。しかしながら、遺伝子の発現を指標としているため、生細胞である毛根を用いる必要があるという問題がある。
【特許文献１】特開平９−１７３３０１号公報
【特許文献２】特開２００１−３５６１２５号公報
【特許文献３】特開２００２−２８２２４０号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／０５７２１１号公報
【特許文献５】特開平８−１５１１１号公報
【特許文献６】特開２００６−１４７２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、毛髪に含まれるタンパク質を同定することにより毛質を評価することが可能な毛質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１に記載の発明は、毛質の評価方法において、毛髪からタンパク質を抽出する工程と、該抽出されたタンパク質を、ペプチド結合加水分解酵素を用いて加水分解する工程と、該加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する工程を有することを特徴とする。
【０００７】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の毛質の評価方法において、前記毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元することにより前記タンパク質を抽出することを特徴とする。
【０００８】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の毛質の評価方法において、前記毛髪を水中に浸漬することにより前記タンパク質を抽出することを特徴とする。
【０００９】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の毛質の評価方法において、前記ケラチンを同定する際に、ケラチンのトリプトファン残基の酸化の有無を分析することを特徴とする。
【００１０】
請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の毛質の評価方法において、前記キャピラリーＬＣは、多次元のキャピラリーＬＣであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、毛髪に含まれるタンパク質を同定することにより毛質を評価することが可能な毛質の評価方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、本発明を実施するための最良の形態を図面と共に説明する。
【００１３】
本発明の毛質の評価方法は、毛髪からタンパク質を抽出する工程と、抽出されたタンパク質を、ペプチド結合加水分解酵素を用いて加水分解する工程と、加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する工程を有する。
【００１４】
毛髪からタンパク質を抽出する方法としては、特に限定されないが、毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元することにより抽出する方法、毛髪を水中に浸漬することにより抽出する方法等が挙げられる。
【００１５】
本発明において、毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元することによりタンパク質を抽出すると、毛髪を構成するケラチン及びケラチン関連タンパク質を分析することができる。溶媒としては、タンパク質を抽出することが可能であれば、特に限定されないが、水、リン酸緩衝液、トリスリン酸緩衝液等が挙げられる。また、毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元する際に用いられる還元剤としては、特に限定されないが、ジチオエリトリトール、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等が挙げられる。このとき、還元剤と共に、塩酸グアニン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の変性剤を添加してもよい。さらに、毛髪中のジスルフィド結合を還元する際に、４０．０〜９９．９℃に加熱してもよい。
【００１６】
毛髪から抽出されたタンパク質を加水分解するペプチド結合加水分解酵素としては、特に限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、リシルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ等が挙げられる。
【００１７】
ペプチド結合加水分解酵素により加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析する際には、遠心分離した上清を用いることができる。なお、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する際に、ケラチンのトリプトファン残基の酸化の有無を分析することにより、毛髪のダメージを評価することができる。また、ケラチン関連タンパク質を同定することにより、毛髪のくせ毛を評価することができる。
【００１８】
本発明において、毛髪を水中に浸漬することによりタンパク質を抽出すると、毛髪からのケラチンの溶出量を分析することができ、その結果、毛髪のダメージを評価することができる。なお、毛髪を浸漬する水は、３５．０〜８０．０℃に加熱されていてもよい。また、毛髪を浸漬する際に、振とうしてもよい。
【００１９】
毛髪から抽出されたタンパク質を加水分解するペプチド結合加水分解酵素としては、特に限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、リシルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ等が挙げられる。
【００２０】
ペプチド結合加水分解酵素により加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析する際には、遠心分離した上清を用いることができる。
【００２１】
なお、キャピラリーＬＣは、一次元及び多次元のキャピラリーＬＣのいずれであってもよいが、分離能を考慮すると、多次元のキャピラリーＬＣが好ましく、二〜三次元のキャピラリーＬＣが特に好ましい。また、キャピラリーＬＣは、イオン交換クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）及び逆相クロマトグラフィーのいずれであってもよいが、分離能が高く、オンライン脱塩ができることから、逆相クロマトグラフィーが好ましい。このとき、試料の溶出法は、アイソクラティック溶出法及びグラジエント溶出法のいずれであってもよいが、分離能を考慮すると、グラジエント溶出法が好ましい。
【実施例】
【００２２】
［実施例１］
内径１００μｍ、長さ１２０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）のテーパー状の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、高さが１００ｍｍとなるように充填し、分析用逆相キャピラリーカラムを得た。
【００２３】
内径２５０μｍ、長さ１５０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムの出口側に、平均粒径が５μｍのカチオン交換樹脂型充填剤Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＣＸ ｒｅｓｉｎｓ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）と、平均粒径が５μｍのアニオン交換樹脂型充填剤ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰ（ＰｏｌｙＬＣ社製）を質量比２：１で混合したもの、入口側に、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、それぞれ高さが２５ｍｍとなるように充填し、トラップ用逆相キャピラリーカラム及びＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラムからなる二相型キャピラリーカラムを得た。
【００２４】
なお、分析用逆相キャピラリーカラム及び二相型キャピラリーカラムを作製する際には、高圧窒素ガス及び加圧型充填容器を用いて、スラリー充填法により充填剤を充填した。
【００２５】
年齢２８〜４１才の日本人女性（３名）由来の毛髪（直毛）からタンパク質を抽出した。具体的には、まず、毛髪を水洗した後、ＳＤＳを２質量％、ジチオエリトリトールを２０ｍＭ含むリン酸緩衝液中、６５℃で７２時間インキュベートし、ジスルフィド結合を還元した。このとき、２４時間及び４８時間インキュベートした後に、マグネチックスターラーで１時間攪拌した。次に、液に対して４０ｍＭになるように、ヨードアセトアミドを添加してチオール基をアルキル化処理した後、液に対して２．５倍の体積のエタノールを添加してタンパク質を沈殿させた。これを７０体積％エタノール水溶液で洗浄した後、尿素を２Ｍ、アセトニトリルを２体積％、重炭酸アンモニウムを０．１Ｍ含む水溶液に溶解させた。次に、液中の全タンパク質に対して約２質量％のトリプシンを添加して、３７℃で１６時間インキュベートし、タンパク質を加水分解させた。さらに、液に対して１体積％のギ酸を添加して反応を停止させた後、１４０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得た。
【００２６】
次に、６ステップのＭｕｄＰＩＴ型分析（二次元ＨＰＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ）により、タンパク質を分析した。
【００２７】
まず、ペプチドを約４μｇ含む上清を、加圧法により、二相型キャピラリーカラムにロードした後、試料溶液の１０倍以上の体積の移動相Ａ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比９５：５：０．１の混合液；ｐＨ〜２．６）を用いて、洗浄、脱塩した。この二相型キャピラリーカラム１０を、貫通孔型ユニオン（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（不図示）を介して、分析用逆相キャピラリーカラム２０と接続した（図１参照）。次に、内径が１００μｍのキャピラリーを配管として用いたＮａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２型ＨＰＬＣ装置（資生堂社製）に接続した。このとき、トラップ用逆相キャピラリーカラム１１は、ＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラム１２及び分析用逆相キャピラリーカラム２０の上流側に配置した。
【００２８】
移動相としては、移動相Ａ、移動相Ｂ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比２０：８０：０．１の混合液）、移動相Ｃ（５００ｍＭの酢酸アンモニウムを含む移動相Ａ；ｐＨ〜６．８）を用い、ペプチドの溶出法は、矩形状に加える移動相Ｃの体積％をステップ毎に漸増させた、計６ステップのグラジエント溶出法とした。
【００２９】
ステップ１のグラジエントプロファイルは、５分間移動相Ａを流し、次の５分間で移動相Ｂの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｂの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｂの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。
【００３０】
ステップ２〜６のグラジエントプロファイルは、１分間移動相Ａを流し、次の４分間移動相Ｃの比率をＸ［体積％］（表１参照）として流し、次の５分間で移動相Ｃの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｃの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｃの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。以上のようにして得られたベースピーククロマトグラムを図２に示す。なお、図２（ａ）〜（ｆ）は、それぞれステップ１〜６のベースピーククロマトグラムである。
【００３１】
【表１】
このとき、ポンプの送液の流速を２５０μＬ／分とし、抵抗型キャピラリーによるスプリットにより、カラムの流速を３００〜４００ｎＬ／分に調整した。
【００３２】
また、ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを測定する際には、イオントラップ型質量分析計ＬＣＱ−Ｄｅｃａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。このとき、分析用逆相キャピラリーカラムから溶出されたペプチドは、スプリットすることなく、質量分析計に直接導入した。
【００３３】
なお、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４００〜１４００のフルスキャンＭＳスペクトル測定１回及びデータ依存型ＭＳ／ＭＳスペクトル測定３回を、各ステップを通じて繰り返した。このとき、標準化解裂エネルギーは３５％とした。また、マイクロスキャンは、ＭＳスペクトル測定及びＭＳ／ＭＳ測定ともに３とした。さらに、動的排除設定は、リピートカウント１、リピート期間０．５０分、排除リストサイズ２５、排除期間１０．００分とした。
【００３４】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上で動くＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムにより、非冗長ヒトデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ＦＡＳＴＡ／ｎｒ．ｇｚ、２００７／２／８版）に対して、検索した。なお、タンパク質の同定に必要なペプチド数は１以上とし、少なくとも片末端がトリプシンの基質特異性に適合するペプチドのみでタンパク質を同定した。また、これ以外のサーチ基準は、（１）フラグメントイオンには平均質量を使用すること、（２）システイン残基は、アルキル化が完全と仮定し＋５７マスユニットを加算した質量とし、メチオニン残基は、酸化・非酸化が混在していると仮定し、＋１６マスユニット（酸化）、＋０マスユニット（非酸化）を加算した質量とすることとした。
【００３５】
その結果、毛髪に含まれるケラチンは、Ｈａ１、Ｈａ２、Ｈａ３、Ｈａ４、Ｈａ５、Ｈａ６、Ｈａ７、Ｈａ８、Ｈｂ１、Ｈｂ２、Ｈｂ３、Ｈｂ５、Ｈｂ６であることがわかった。また、毛髪に含まれるケラチン関連タンパク質は、ＫＡＰ３−１、ＫＡＰ３−２、ＫＡＰ３−３、ＫＡＰ１０−１０、ＫＡＰ１１−１、ＫＡＰ１３−１であることがわかった。
【００３６】
［実施例２］
太陽紫外光シミュレーター（ＯＲＩＥＬ社）を用いて、年齢２８〜４１才の日本人女性（３名）由来の毛髪に、擬似太陽光を１６時間照射した（積算９４６Ｊ／ｃｍ２）。得られた毛髪を用いた以外は、実施例１と同様にして、タンパク質を分析した。
【００３７】
その結果、毛髪に含まれるケラチン及びケラチン関連タンパク質は、実施例１と同様であったが、ケラチンＨａ１及びＨａ３のトリプトファン残基が酸化されている点で実施例１とは異なることがわかった。
【００３８】
したがって、ケラチンＨａ１及びＨａ３のトリプトファン残基の酸化の有無を分析することにより、毛髪のダメージを評価することができる。
【００３９】
［実施例３］
年齢２０〜４０才のアフリカ人女性（３名）由来の毛髪（縮毛）を用いた以外は、実施例１と同様にして、タンパク質を分析した。
【００４０】
その結果、毛髪に含まれるケラチンは、Ｈａ１、Ｈａ２、Ｈａ３、Ｈａ４、Ｈａ５、Ｈａ６、Ｈａ８、Ｈｂ１、Ｈｂ２、Ｈｂ３、Ｈｂ５、Ｈｂ６であることがわかった。また、毛髪に含まれるケラチン関連タンパク質は、ＫＡＰ１−９、ＫＡＰ１１−１、ＫＡＰ１３−１、ＫＡＰ１９−５であることがわかった。
【００４１】
実施例１及び３から、直毛及び縮毛の毛髪に含まれるケラチン関連タンパク質が異なることがわかる。したがって、毛髪に含まれるケラチン関連タンパク質を同定することにより、毛質を評価することができることがわかる。
【００４２】
［実施例４］
内径１００μｍ、長さ１２０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）のテーパー状の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、高さが１００ｍｍとなるように充填し、分析用逆相キャピラリーカラムを得た。
【００４３】
内径２５０μｍ、長さ１５０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、高さが１０ｍｍとなるように充填し、トラップ用逆相キャピラリーカラムを得た。
【００４４】
なお、分析用逆相キャピラリーカラム及びトラップ用逆相キャピラリーカラムを作製する際には、高圧窒素ガス及び加圧型充填容器を用いて、スラリー充填法により充填剤を充填した。
【００４５】
年齢２８〜４１才の日本人女性（３名）由来の毛髪からタンパク質を抽出した。具体的には、まず、約５ｇの毛髪を精製水で軽くリンスした後、４０℃の水中で８時間振とうした。次に、液から毛髪を取り除いて、凍結減圧乾燥機で濃縮した後、尿素を２Ｍ、アセトニトリルを２体積％、重炭酸アンモニウムを０．１Ｍ含む水溶液に溶解させた。さらに、液に対して４０ｍＭになるように、ヨードアセトアミドを添加した後、液に対して２質量％のトリプシンを添加して、３７℃で１６時間インキュベートし、タンパク質を加水分解させた。最後に、液に対して１体積％のギ酸を添加して反応を停止させた後、１４０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得た。
【００４６】
次に、１ステップのＭｕｄＰＩＴ型分析（一次元ＨＰＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ）により、タンパク質を分析した。
【００４７】
まず、ペプチドを約４μｇ含む上清を、加圧法によりトラップ用逆相キャピラリーカラムにロードした後、試料溶液の１０倍以上の体積の移動相Ａ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比９５：５：０．１の混合液；ｐＨ〜２．６）を用いて、洗浄、脱塩した。このトラップ用逆相キャピラリーカラムを、貫通孔型ユニオン（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を介して、分析用逆相キャピラリーカラムと接続した。次に、内径が１００μｍのキャピラリーを配管として用いたＮａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２型ＨＰＬＣ装置（資生堂社製）に接続した。このとき、トラップ用逆相キャピラリーカラムは、分析用逆相キャピラリーカラムの上流側に配置した。
【００４８】
移動相としては、移動相Ａ、移動相Ｂ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比２０：８０：０．１の混合液）を用い、ペプチドの溶出法は、１ステップのグラジエント溶出法とした。
【００４９】
ステップ１のグラジエントプロファイルは、５分間移動相Ａを流し、次の５分間で移動相Ｂの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｂの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｂの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。
【００５０】
なお、ポンプの送液の流速を２５０μＬ／分とし、抵抗型キャピラリーによるスプリットにより、カラムの流速を３００〜４００ｎＬ／分に調整した。
【００５１】
また、ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを測定する際には、イオントラップ／静電型ＦＴハイブリッド型質量分析計ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。このとき、分析用逆相キャピラリーカラムから溶出されたペプチドは、スプリットすることなく、質量分析計に直接導入した。
【００５２】
なお、高質量精度の分子量測定（＜５ｐｐｍ）と高速ＭＳ／ＭＳ測定を両立するパラレル検出モードとし、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４００〜１８００のフルスキャン高質量精度ＭＳスペクトル測定１回及びデータ依存型ＭＳ／ＭＳスペクトル測定７回を、ステップ１を通じて繰り返した。また、マイクロスキャンは、ＭＳスペクトル測定及びＭＳ／ＭＳ測定ともに１とした。さらに、動的排除設定は、リピートカウント１、リピート期間０．５０分、排除リストサイズ５０、排除期間１．００分とした。
【００５３】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上で動くＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムにより、非冗長ヒトデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ＦＡＳＴＡ／ｎｒ．ｇｚ、２００７／２／８版）に対して、検索した。なお、タンパク質の同定に必要なペプチド数は１以上とし、少なくとも片末端がトリプシンの基質特異性に適合するペプチドのみでタンパク質を同定した。また、これ以外のサーチ基準は、（１）データベース検索時のプリカーサー質量の許容幅を５０ｐｐｍとすること、（２）サーチ時の［Ｍ＋Ｈ］＋の値をモノアイソトピック質量で計算すること、（３）フラグメントイオンには平均質量を使用すること、（４）システイン残基は、アルキル化が完全と仮定し＋５７マスユニットを加算した質量とし、メチオニン残基は、酸化・非酸化が混在していると仮定し、＋１６マスユニット（酸化）、＋０マスユニット（非酸化）を加算した質量とすることとした。
【００５４】
その結果、ケラチンＨａ１、Ｈａ２、Ｈａ３、Ｈｂ６が毛髪から流出していることがわかった。
【００５５】
［実施例５］
太陽紫外光シミュレーター（ＯＲＩＥＬ社）を用いて、年齢２８〜４１才の日本人女性由来の毛髪に、擬似太陽光を１６時間照射した（積算９４６Ｊ／ｃｍ２）。得られた毛髪を用いた以外は、実施例４と同様にして、タンパク質を分析した。
【００５６】
その結果、毛髪から流出しているケラチンは、実施例４と同様であった。一方、Ｌｏｗｒｙ法に基づく比色法（ＤＣプロテインアッセイキット（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製））により、毛髪から流出したタンパク質を定量した結果、実施例４よりも多いことがわかった。
【００５７】
したがって、毛髪から流出するケラチンＨａ１、Ｈａ２、Ｈａ３、Ｈｂ６を定量することにより、毛髪のダメージを評価することができることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１のＨＰＬＣ装置を示す図である。
【図２】実施例１のベースピーククロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
１０ 二相型キャピラリーカラム
１１ トラップ用逆相キャピラリーカラム
１２ ＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラム
２０ 分析用逆相キャピラリーカラム
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、毛髪のダメージを評価する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、特許文献１には、毛髪に紫外光を照射し、３３０ｎｍ付近に蛍光極大を有するケラチン中の芳香族アミノ酸の蛍光バンドの波形及び／又は蛍光極大波長を測定して、基準値に対する波形の変化及び／又は波長シフトの度合いから毛髪の損傷・劣化を評価する方法が開示されている。特許文献２には、毛髪を、還元剤を含有する抽出溶剤を用いて抽出し、得られる蛋白質量を指標とする毛髪損傷の評価方法が開示されている。特許文献３には、毛髪を長手方向に沿って引き裂いてその引き裂き強度を求め、引き裂き強度に基づいて毛髪の損傷度を評価する方法が開示されている。特許文献４には、毛髪における酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで毛髪のダメージを評価する方法が開示されている。
【０００３】
また、毛髪への荷重を負荷し、そのときの荷重の大きさと毛髪の伸長との関係から微小荷重かつ微小伸長域の非フック領域の面積を求め、得られた面積に基づいてくせ毛の程度を評価する方法（特許文献５参照）が知られている。
【０００４】
一方、毛髪中のヘアケラチンＨａ２遺伝子、ヘアケラチンＨｂ２遺伝子、ＫＡＰ５．１遺伝子（配列番号１）、ＫＡＰ５．２遺伝子（配列番号２）、ＫＡＰ５．３遺伝子（配列番号３）、ＫＡＰ５．４遺伝子（配列番号４）及び／又はＫＡＰ５．５遺伝子（配列番号５）の発現を指標とする毛質の評価方法が知られている（特許文献６参照）。しかしながら、遺伝子の発現を指標としているため、生細胞である毛根を用いる必要があるという問題がある。
【特許文献１】特開平９−１７３３０１号公報
【特許文献２】特開２００１−３５６１２５号公報
【特許文献３】特開２００２−２８２２４０号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／０５７２１１号公報
【特許文献５】特開平８−１５１１１号公報
【特許文献６】特開２００６−１４７２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、毛髪に含まれるタンパク質を同定することにより毛質を評価することが可能な毛質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１に記載の発明は、毛質の評価方法において、毛髪からタンパク質を抽出する工程と、該抽出されたタンパク質を、ペプチド結合加水分解酵素を用いて加水分解する工程と、該加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する工程を有することを特徴とする。
【０００７】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の毛質の評価方法において、前記毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元することにより前記タンパク質を抽出することを特徴とする。
【０００８】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の毛質の評価方法において、前記毛髪を水中に浸漬することにより前記タンパク質を抽出することを特徴とする。
【０００９】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の毛質の評価方法において、前記ケラチンを同定する際に、ケラチンのトリプトファン残基の酸化の有無を分析することを特徴とする。
【００１０】
請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の毛質の評価方法において、前記キャピラリーＬＣは、多次元のキャピラリーＬＣであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、毛髪に含まれるタンパク質を同定することにより毛質を評価することが可能な毛質の評価方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、本発明を実施するための最良の形態を図面と共に説明する。
【００１３】
本発明の毛質の評価方法は、毛髪からタンパク質を抽出する工程と、抽出されたタンパク質を、ペプチド結合加水分解酵素を用いて加水分解する工程と、加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する工程を有する。
【００１４】
毛髪からタンパク質を抽出する方法としては、特に限定されないが、毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元することにより抽出する方法、毛髪を水中に浸漬することにより抽出する方法等が挙げられる。
【００１５】
本発明において、毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元することによりタンパク質を抽出すると、毛髪を構成するケラチン及びケラチン関連タンパク質を分析することができる。溶媒としては、タンパク質を抽出することが可能であれば、特に限定されないが、水、リン酸緩衝液、トリスリン酸緩衝液等が挙げられる。また、毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元する際に用いられる還元剤としては、特に限定されないが、ジチオエリトリトール、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等が挙げられる。このとき、還元剤と共に、塩酸グアニン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の変性剤を添加してもよい。さらに、毛髪中のジスルフィド結合を還元する際に、４０．０〜９９．９℃に加熱してもよい。
【００１６】
毛髪から抽出されたタンパク質を加水分解するペプチド結合加水分解酵素としては、特に限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、リシルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ等が挙げられる。
【００１７】
ペプチド結合加水分解酵素により加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析する際には、遠心分離した上清を用いることができる。なお、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する際に、ケラチンのトリプトファン残基の酸化の有無を分析することにより、毛髪のダメージを評価することができる。また、ケラチン関連タンパク質を同定することにより、毛髪のくせ毛を評価することができる。
【００１８】
本発明において、毛髪を水中に浸漬することによりタンパク質を抽出すると、毛髪からのケラチンの溶出量を分析することができ、その結果、毛髪のダメージを評価することができる。なお、毛髪を浸漬する水は、３５．０〜８０．０℃に加熱されていてもよい。また、毛髪を浸漬する際に、振とうしてもよい。
【００１９】
毛髪から抽出されたタンパク質を加水分解するペプチド結合加水分解酵素としては、特に限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、リシルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ等が挙げられる。
【００２０】
ペプチド結合加水分解酵素により加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析する際には、遠心分離した上清を用いることができる。
【００２１】
なお、キャピラリーＬＣは、一次元及び多次元のキャピラリーＬＣのいずれであってもよいが、分離能を考慮すると、多次元のキャピラリーＬＣが好ましく、二〜三次元のキャピラリーＬＣが特に好ましい。また、キャピラリーＬＣは、イオン交換クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）及び逆相クロマトグラフィーのいずれであってもよいが、分離能が高く、オンライン脱塩ができることから、逆相クロマトグラフィーが好ましい。このとき、試料の溶出法は、アイソクラティック溶出法及びグラジエント溶出法のいずれであってもよいが、分離能を考慮すると、グラジエント溶出法が好ましい。
【実施例】
【００２２】
［実施例１］
内径１００μｍ、長さ１２０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）のテーパー状の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、高さが１００ｍｍとなるように充填し、分析用逆相キャピラリーカラムを得た。
【００２３】
内径２５０μｍ、長さ１５０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムの出口側に、平均粒径が５μｍのカチオン交換樹脂型充填剤Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＣＸ ｒｅｓｉｎｓ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）と、平均粒径が５μｍのアニオン交換樹脂型充填剤ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰ（ＰｏｌｙＬＣ社製）を質量比２：１で混合したもの、入口側に、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、それぞれ高さが２５ｍｍとなるように充填し、トラップ用逆相キャピラリーカラム及びＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラムからなる二相型キャピラリーカラムを得た。
【００２４】
なお、分析用逆相キャピラリーカラム及び二相型キャピラリーカラムを作製する際には、高圧窒素ガス及び加圧型充填容器を用いて、スラリー充填法により充填剤を充填した。
【００２５】
年齢２８〜４１才の日本人女性（３名）由来の毛髪（直毛）からタンパク質を抽出した。具体的には、まず、毛髪を水洗した後、ＳＤＳを２質量％、ジチオエリトリトールを２０ｍＭ含むリン酸緩衝液中、６５℃で７２時間インキュベートし、ジスルフィド結合を還元した。このとき、２４時間及び４８時間インキュベートした後に、マグネチックスターラーで１時間攪拌した。次に、液に対して４０ｍＭになるように、ヨードアセトアミドを添加してチオール基をアルキル化処理した後、液に対して２．５倍の体積のエタノールを添加してタンパク質を沈殿させた。これを７０体積％エタノール水溶液で洗浄した後、尿素を２Ｍ、アセトニトリルを２体積％、重炭酸アンモニウムを０．１Ｍ含む水溶液に溶解させた。次に、液中の全タンパク質に対して約２質量％のトリプシンを添加して、３７℃で１６時間インキュベートし、タンパク質を加水分解させた。さらに、液に対して１体積％のギ酸を添加して反応を停止させた後、１４０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得た。
【００２６】
次に、６ステップのＭｕｄＰＩＴ型分析（二次元ＨＰＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ）により、タンパク質を分析した。
【００２７】
まず、ペプチドを約４μｇ含む上清を、加圧法により、二相型キャピラリーカラムにロードした後、試料溶液の１０倍以上の体積の移動相Ａ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比９５：５：０．１の混合液；ｐＨ〜２．６）を用いて、洗浄、脱塩した。この二相型キャピラリーカラム１０を、貫通孔型ユニオン（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（不図示）を介して、分析用逆相キャピラリーカラム２０と接続した（図１参照）。次に、内径が１００μｍのキャピラリーを配管として用いたＮａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２型ＨＰＬＣ装置（資生堂社製）に接続した。このとき、トラップ用逆相キャピラリーカラム１１は、ＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラム１２及び分析用逆相キャピラリーカラム２０の上流側に配置した。
【００２８】
移動相としては、移動相Ａ、移動相Ｂ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比２０：８０：０．１の混合液）、移動相Ｃ（５００ｍＭの酢酸アンモニウムを含む移動相Ａ；ｐＨ〜６．８）を用い、ペプチドの溶出法は、矩形状に加える移動相Ｃの体積％をステップ毎に漸増させた、計６ステップのグラジエント溶出法とした。
【００２９】
ステップ１のグラジエントプロファイルは、５分間移動相Ａを流し、次の５分間で移動相Ｂの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｂの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｂの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。
【００３０】
ステップ２〜６のグラジエントプロファイルは、１分間移動相Ａを流し、次の４分間移動相Ｃの比率をＸ［体積％］（表１参照）として流し、次の５分間で移動相Ｃの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｃの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｃの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。以上のようにして得られたベースピーククロマトグラムを図２に示す。なお、図２（ａ）〜（ｆ）は、それぞれステップ１〜６のベースピーククロマトグラムである。
【００３１】
【表１】
このとき、ポンプの送液の流速を２５０μＬ／分とし、抵抗型キャピラリーによるスプリットにより、カラムの流速を３００〜４００ｎＬ／分に調整した。
【００３２】
また、ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを測定する際には、イオントラップ型質量分析計ＬＣＱ−Ｄｅｃａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。このとき、分析用逆相キャピラリーカラムから溶出されたペプチドは、スプリットすることなく、質量分析計に直接導入した。
【００３３】
なお、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４００〜１４００のフルスキャンＭＳスペクトル測定１回及びデータ依存型ＭＳ／ＭＳスペクトル測定３回を、各ステップを通じて繰り返した。このとき、標準化解裂エネルギーは３５％とした。また、マイクロスキャンは、ＭＳスペクトル測定及びＭＳ／ＭＳ測定ともに３とした。さらに、動的排除設定は、リピートカウント１、リピート期間０．５０分、排除リストサイズ２５、排除期間１０．００分とした。
【００３４】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上で動くＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムにより、非冗長ヒトデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ＦＡＳＴＡ／ｎｒ．ｇｚ、２００７／２／８版）に対して、検索した。なお、タンパク質の同定に必要なペプチド数は１以上とし、少なくとも片末端がトリプシンの基質特異性に適合するペプチドのみでタンパク質を同定した。また、これ以外のサーチ基準は、（１）フラグメントイオンには平均質量を使用すること、（２）システイン残基は、アルキル化が完全と仮定し＋５７マスユニットを加算した質量とし、メチオニン残基は、酸化・非酸化が混在していると仮定し、＋１６マスユニット（酸化）、＋０マスユニット（非酸化）を加算した質量とすることとした。
【００３５】
その結果、毛髪に含まれるケラチンは、Ｈａ１、Ｈａ２、Ｈａ３、Ｈａ４、Ｈａ５、Ｈａ６、Ｈａ７、Ｈａ８、Ｈｂ１、Ｈｂ２、Ｈｂ３、Ｈｂ５、Ｈｂ６であることがわかった。また、毛髪に含まれるケラチン関連タンパク質は、ＫＡＰ３−１、ＫＡＰ３−２、ＫＡＰ３−３、ＫＡＰ１０−１０、ＫＡＰ１１−１、ＫＡＰ１３−１であることがわかった。
【００３６】
［実施例２］
太陽紫外光シミュレーター（ＯＲＩＥＬ社）を用いて、年齢２８〜４１才の日本人女性（３名）由来の毛髪に、擬似太陽光を１６時間照射した（積算９４６Ｊ／ｃｍ２）。得られた毛髪を用いた以外は、実施例１と同様にして、タンパク質を分析した。
【００３７】
その結果、毛髪に含まれるケラチン及びケラチン関連タンパク質は、実施例１と同様であったが、ケラチンＨａ１及びＨａ３のトリプトファン残基が酸化されている点で実施例１とは異なることがわかった。
【００３８】
したがって、ケラチンＨａ１及びＨａ３のトリプトファン残基の酸化の有無を分析することにより、毛髪のダメージを評価することができる。
【００３９】
［実施例３］
年齢２０〜４０才のアフリカ人女性（３名）由来の毛髪（縮毛）を用いた以外は、実施例１と同様にして、タンパク質を分析した。
【００４０】
その結果、毛髪に含まれるケラチンは、Ｈａ１、Ｈａ２、Ｈａ３、Ｈａ４、Ｈａ５、Ｈａ６、Ｈａ８、Ｈｂ１、Ｈｂ２、Ｈｂ３、Ｈｂ５、Ｈｂ６であることがわかった。また、毛髪に含まれるケラチン関連タンパク質は、ＫＡＰ１−９、ＫＡＰ１１−１、ＫＡＰ１３−１、ＫＡＰ１９−５であることがわかった。
【００４１】
実施例１及び３から、直毛及び縮毛の毛髪に含まれるケラチン関連タンパク質が異なることがわかる。したがって、毛髪に含まれるケラチン関連タンパク質を同定することにより、毛質を評価することができることがわかる。
【００４２】
［実施例４］
内径１００μｍ、長さ１２０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）のテーパー状の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、高さが１００ｍｍとなるように充填し、分析用逆相キャピラリーカラムを得た。
【００４３】
内径２５０μｍ、長さ１５０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、高さが１０ｍｍとなるように充填し、トラップ用逆相キャピラリーカラムを得た。
【００４４】
なお、分析用逆相キャピラリーカラム及びトラップ用逆相キャピラリーカラムを作製する際には、高圧窒素ガス及び加圧型充填容器を用いて、スラリー充填法により充填剤を充填した。
【００４５】
年齢２８〜４１才の日本人女性（３名）由来の毛髪からタンパク質を抽出した。具体的には、まず、約５ｇの毛髪を精製水で軽くリンスした後、４０℃の水中で８時間振とうした。次に、液から毛髪を取り除いて、凍結減圧乾燥機で濃縮した後、尿素を２Ｍ、アセトニトリルを２体積％、重炭酸アンモニウムを０．１Ｍ含む水溶液に溶解させた。さらに、液に対して４０ｍＭになるように、ヨードアセトアミドを添加した後、液に対して２質量％のトリプシンを添加して、３７℃で１６時間インキュベートし、タンパク質を加水分解させた。最後に、液に対して１体積％のギ酸を添加して反応を停止させた後、１４０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得た。
【００４６】
次に、１ステップのＭｕｄＰＩＴ型分析（一次元ＨＰＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ）により、タンパク質を分析した。
【００４７】
まず、ペプチドを約４μｇ含む上清を、加圧法によりトラップ用逆相キャピラリーカラムにロードした後、試料溶液の１０倍以上の体積の移動相Ａ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比９５：５：０．１の混合液；ｐＨ〜２．６）を用いて、洗浄、脱塩した。このトラップ用逆相キャピラリーカラムを、貫通孔型ユニオン（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を介して、分析用逆相キャピラリーカラムと接続した。次に、内径が１００μｍのキャピラリーを配管として用いたＮａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２型ＨＰＬＣ装置（資生堂社製）に接続した。このとき、トラップ用逆相キャピラリーカラムは、分析用逆相キャピラリーカラムの上流側に配置した。
【００４８】
移動相としては、移動相Ａ、移動相Ｂ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比２０：８０：０．１の混合液）を用い、ペプチドの溶出法は、１ステップのグラジエント溶出法とした。
【００４９】
ステップ１のグラジエントプロファイルは、５分間移動相Ａを流し、次の５分間で移動相Ｂの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｂの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｂの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。
【００５０】
なお、ポンプの送液の流速を２５０μＬ／分とし、抵抗型キャピラリーによるスプリットにより、カラムの流速を３００〜４００ｎＬ／分に調整した。
【００５１】
また、ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを測定する際には、イオントラップ／静電型ＦＴハイブリッド型質量分析計ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。このとき、分析用逆相キャピラリーカラムから溶出されたペプチドは、スプリットすることなく、質量分析計に直接導入した。
【００５２】
なお、高質量精度の分子量測定（＜５ｐｐｍ）と高速ＭＳ／ＭＳ測定を両立するパラレル検出モードとし、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４００〜１８００のフルスキャン高質量精度ＭＳスペクトル測定１回及びデータ依存型ＭＳ／ＭＳスペクトル測定７回を、ステップ１を通じて繰り返した。また、マイクロスキャンは、ＭＳスペクトル測定及びＭＳ／ＭＳ測定ともに１とした。さらに、動的排除設定は、リピートカウント１、リピート期間０．５０分、排除リストサイズ５０、排除期間１．００分とした。
【００５３】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上で動くＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムにより、非冗長ヒトデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ＦＡＳＴＡ／ｎｒ．ｇｚ、２００７／２／８版）に対して、検索した。なお、タンパク質の同定に必要なペプチド数は１以上とし、少なくとも片末端がトリプシンの基質特異性に適合するペプチドのみでタンパク質を同定した。また、これ以外のサーチ基準は、（１）データベース検索時のプリカーサー質量の許容幅を５０ｐｐｍとすること、（２）サーチ時の［Ｍ＋Ｈ］＋の値をモノアイソトピック質量で計算すること、（３）フラグメントイオンには平均質量を使用すること、（４）システイン残基は、アルキル化が完全と仮定し＋５７マスユニットを加算した質量とし、メチオニン残基は、酸化・非酸化が混在していると仮定し、＋１６マスユニット（酸化）、＋０マスユニット（非酸化）を加算した質量とすることとした。
【００５４】
その結果、ケラチンＨａ１、Ｈａ２、Ｈａ３、Ｈｂ６が毛髪から流出していることがわかった。
【００５５】
［実施例５］
太陽紫外光シミュレーター（ＯＲＩＥＬ社）を用いて、年齢２８〜４１才の日本人女性由来の毛髪に、擬似太陽光を１６時間照射した（積算９４６Ｊ／ｃｍ２）。得られた毛髪を用いた以外は、実施例４と同様にして、タンパク質を分析した。
【００５６】
その結果、毛髪から流出しているケラチンは、実施例４と同様であった。一方、Ｌｏｗｒｙ法に基づく比色法（ＤＣプロテインアッセイキット（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製））により、毛髪から流出したタンパク質を定量した結果、実施例４よりも多いことがわかった。
【００５７】
したがって、毛髪から流出するケラチンＨａ１、Ｈａ２、Ｈａ３、Ｈｂ６を定量することにより、毛髪のダメージを評価することができることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１のＨＰＬＣ装置を示す図である。
【図２】実施例１のベースピーククロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
１０ 二相型キャピラリーカラム
１１ トラップ用逆相キャピラリーカラム
１２ ＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラム
２０ 分析用逆相キャピラリーカラム
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛髪からタンパク質を抽出する工程と、
該抽出されたタンパク質を、ペプチド結合加水分解酵素を用いて加水分解する工程と、
該加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する工程を有することを特徴とする毛質の評価方法。
【請求項２】
前記毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元することにより前記タンパク質を抽出することを特徴とする請求項１に記載の毛質の評価方法。
【請求項３】
前記毛髪を水中に浸漬することにより前記タンパク質を抽出することを特徴とする請求項１に記載の毛質の評価方法。
【請求項４】
前記ケラチンを同定する際に、ケラチンのトリプトファン残基の酸化の有無を分析することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の毛質の評価方法。
【請求項５】
前記キャピラリーＬＣは、多次元のキャピラリーＬＣであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の毛質の評価方法。
【請求項１】
毛髪からタンパク質を抽出する工程と、
該抽出されたタンパク質を、ペプチド結合加水分解酵素を用いて加水分解する工程と、
該加水分解されたタンパク質を、キャピラリーＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、ケラチン及び／又はケラチン関連タンパク質を同定する工程を有することを特徴とする毛質の評価方法。
【請求項２】
前記毛髪のジスルフィド結合を溶媒中で還元することにより前記タンパク質を抽出することを特徴とする請求項１に記載の毛質の評価方法。
【請求項３】
前記毛髪を水中に浸漬することにより前記タンパク質を抽出することを特徴とする請求項１に記載の毛質の評価方法。
【請求項４】
前記ケラチンを同定する際に、ケラチンのトリプトファン残基の酸化の有無を分析することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の毛質の評価方法。
【請求項５】
前記キャピラリーＬＣは、多次元のキャピラリーＬＣであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の毛質の評価方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１１２７８８（Ｐ２０１０−１１２７８８Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８４２６８（Ｐ２００８−２８４２６８）
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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