水性二相系からの注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェア
注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェアは、ヒドロゲル前駆体が分散性水相中であるエマルジョンを形成し、そしてヒドロゲル前駆体を重合させることによって製造される。望ましい場合には、ヒドロゲル前駆体は、ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート、およびＮ−イソプロピルアクリルアミドであり、そしてエマルジョンの連続相は、デキストランおよびデキストラン溶解性減少剤の水溶液である。ミクロスフェアは、水溶液から、蛋白質(例えばサイトカイン)を負荷され得る。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、The National Textile Center との二次契約によって、United States Department of Commerce Prime Grant Award No. 99-27-07400 下で、少なくとも一部分米国政府の支援を得た。米国政府は本発明にある種の権利を有する。
【０００２】
関連明細書の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第 60/440,646 号(2003年1月17日出願)に基づく権利を主張している。
【０００３】
技術分野
本発明は、水溶液から水溶性蛋白質を負荷し、薬物(例えば水溶性蛋白質薬物)の制御放出に有用である、注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェア、およびその製造に関する。
【０００４】
本発明の背景
薬物送達系における最も大きな挑戦の一つは、蛋白質をベースとした薬物の制御送達であり、これは、該薬物の循環系における短半減期、低浸透性、速い蛋白質分解 (低安定性)、および免疫原性による。多単位投与形(例えばポリマー性ミクロスフェア)の使用によって、一単位投与形(例えば錠剤)が投与された場合と比較して、患者において、吸収差が大きく減少し、ヒトの身体における標的部位に、より効果的な薬物蓄積(accumulation)をもたらす。多くの技術が、薬物投与のためのポリマー性ミクロスフェアの製造のために提案されている。最も一般的に用いられる報告された技術は、溶媒蒸発または多重エマルジョン溶媒蒸発を含む。これらの技術は、有機溶媒に依拠するものであり、該溶媒は、蛋白質をベースとした薬物の生物活性の低下を起こし、かつ一般的に毒性であり、そのため完全除去が必要である。
【０００５】
口腔癌を有する患者の全生存率はここ４０年間で約５０％である。サイトカイン免疫療法は、動物モデルおよび初期臨床試験で勇気付けられる結果を示している。しかし、サイトカインを全身に投与した場合、それらは広範な毒性像を示す。炎症誘発性サイトカインの腫瘍微小環境への局所徐放がヒドロゲルからの放出によって可能であるが、既知のヒドロゲルのサイトカインでの負荷は、有機溶液からのサイトカインの負荷を必要とし、このことがサイトカイン生物活性の著しい損失をもたらす。
【０００６】
従って、有機溶媒の使用を必要とせず形成することができ、かつ、薬物を不活性化することなく水溶性蛋白質薬物を負荷するポリマー性ミクロスフェア投与剤形に対する要請がある。
【０００７】
本発明の要約
注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェアは、水溶性であるヒドロゲル前駆体から得られ、そしてその製造に有機溶媒の使用を必要としないこと、そして得られたヒドロゲル・ミクロスフェアは、蛋白質を不活性化することなく、水溶液から水溶性蛋白質を負荷することが見出された。
【０００８】
ここで、本発明の方法は、蛋白質活性の有意な損失なしに水溶液から蛋白質を負荷する、注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェアを製造するものであり、活性蛋白質のための徐放性担体を提供する。
【０００９】
本発明の方法は、
ａ) 少なくとも１個のヒドロゲル前駆体がヒドロゲル形成において架橋リンカーおよびモノマーの両方として機能する、水に可溶なヒドロゲル前駆体の水溶液(第１水溶液という)を製造すること；
ｂ) 第１水溶液と第２水溶液を混合し、ここで、該第２水溶液は水に溶解したポリマーを含み、該ポリマーが、存在する何れかの溶解性減少剤と共に存在するポリマーの濃度で、該混合に際して、第１水溶液と非混和性の水相を形成し、該第２水溶液は、第１水溶液と、それによって第１水溶液と第２水溶液の混合によりエマルジョンを形成する際に連続相となる相対的量で混合されること；
ｃ) 第２水溶液が連続相であり、そして第１水溶液が分散相であり、そして該分散相が２５から６０μｍ(レーザー回折によって測定)の範囲の直径を有するスフェアからなるエマルジョンを形成すること；
ｄ) 該分散相のヒドロゲル前駆体を重合しヒドロゲル・ミクロスフェアを形成すること；
ｅ) ヒドロゲル・ミクロスフェアを集めること；
の段階を含むものである。
【００１０】
本発明の別の態様は、水溶液からサイトカインを負荷し得る、注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェアを指向する。ヒドロゲルの注射可能性は、投与を簡略化するのに有益である。
【００１１】
“ヒドロゲル”という用語は、ここでは、水中で膨潤し、そして溶解することなくその構造中に有意な量の水を保持することが可能なポリマー性物質を意味する。
【００１２】
“ヒドロゲル前駆体”という用語は、ここでは、ヒドロゲルを形成するために水溶液中で重合可能な水溶性組成物を意味する。
“ミクロスフェア”という用語は、ここでは、別の定義をされない限り、１から２００もしくは３００μｍの範囲の直径を有する球状粒子を意味する。
【００１３】
詳細な説明
ヒドロゲル形成において架橋リンカーおよびモノマーの両方として機能するヒドロゲル前駆体は、好ましくは、ポリ(エチレングリコール ジアクリレート)(時には、ＰＥＧ−ＤＡと記載される場合もある)である。ここで、ポリ(エチレングリコール)は、２,０００から３５,０００の範囲の重量平均分子量を有する。ＰＥＧ−ＤＡは、好ましくは、Cruise, G.M., et al, Biomaterials 19, 1287-1294 (1998)に記載されている通りに、ポリ(エチレングリコール) ジオールから、塩化アクリロイルとの反応によって、ポリ(エチレングリコール)のアクリレート ジエステルを形成させて製造される。ポリ(エチレングリコール) ジオール出発物質は市販されている。
【００１４】
好ましくは、第１水溶液に含まれる他のヒドロゲル前駆体はまた、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(ＮＩＰＡＡｍと記載されることもある)である。ＮＩＰＡＡｍは、得られたヒドロゲルに温度感受性を与え、それによって、低臨界溶液温度(lower critical solution temperature)を超えたときに、得られたヒドロゲルは、水およびそれに溶解している蛋白質を失う。“低臨界溶液温度”(ここでは、“ＬＣＳＴ”と記載する場合もある)という用語は、ヒドロゲル・ミクロスフェアをサーモグラフにかけて測定した吸熱ピークであり、それより上の温度で、ヒドロゲルが崩壊し、ヒドロゲルの体積が劇的に収縮する温度である。ここで、ＮＩＰＡＡｍおよびＰＥＧ−ＤＡからのヒドロゲルは約２９℃のＬＣＳＴを有する。“温度感受性”という用語は、収縮や水の喪失を起こす温度の変化を意味する。
【００１５】
ＮＩＰＡＡｍおよびＰＥＧ−ＤＡを含む第１水溶液に関して、第１水溶液におけるＮＩＰＡＡｍの濃度は、例えば５から２５％(wt/vol%)の範囲であり、そして第１水溶液におけるＰＥＧ−ＤＡの濃度は、例えば２から５０％(wt/vol%)の範囲である。
【００１６】
第２水溶液におけるポリマーは水溶性であり、そして上記のように、第２水溶液中に存在する何れかの溶解性減少剤と共に第２水溶液中に存在するポリマーの濃度で、段階(ｂ)の混合の際に、該第１水溶液と混和可能ではない水溶液を形成する。第２水溶液のポリマーには、水溶性多糖類が望ましい。約４０,０００から８０,０００の範囲の重量平均分子量を有するデキストランが特に望ましい。他の水溶性多糖類、例えばキトサン、澱粉、藻類フコイダン、セルロース、ペクチン、ヘパリン、カシューナッツ・ゴム、およびグリコーゲンは、デキストランの代わりに用いられ得る。第２水溶液のための多糖類以外の他のポリマーは、例えば、ポリ電解質、例えばポリエチレンイミンまたはポリアクリル酸；ポリ(ビニルピロリドン)；エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー；およびカゼイン酸ナトリウムおよびアルギン酸ナトリウムの混合物である。
【００１７】
第２水溶液のポリマーとしてデキストランを使用する際に、デキストランの水への溶解性を減少させ、段階(ｂ)の混合の際に、ポリマー−ポリマー不溶性による２相水系を形成させ、すなわちＰＥＧ−ＤＡおよびＮＩＰＡＡｍのデキストランからの“塩析”を起こさせ、乳化剤もしくは安定剤を必要とすることなく２つの水相の間の非混和性を助長するために、化合物が第２水溶液に加えられ得る。この目的のために望ましい化合物は、ＭｇＳＯ４である。ＫＣｌなどの他の塩、およびリン酸マグネシウムが、ＭｇＳＯ４に代わって用いられ得る。
【００１８】
第２水溶液中のデキストランおよびＭｇＳＯ４に関して、該溶液のデキストランの濃度は、例えば１０から５０％(wt/vol%)の範囲であり、ＭｇＳＯ４の濃度は、例えば、１０から６０％(wt/vol%)の範囲であり得る。
【００１９】
段階(ｂ)において、第１および第２水溶液は、第２水溶液が、連続相を構成し、第１水溶液が段階(ｃ)におけるエマルジョンの形成の際に分散相を構成するような相対的比率で混合される。
【００２０】
段階(ｃ)におけるエマルジョンの形成は、例えば１５分間から２時間激しく混合することによって行われ、それによって２相の水中水型エマルジョン系を形成し、例えば１０分間から１時間静置することによって安定化する。分散相は、直径がレーザー回折によって測定したとき２５から６０μｍの範囲であるスフェアの第１水溶液によって構成される。上記の通り、乳化剤は存在する必要がなく、乳化剤は存在しない方が好ましい。
【００２１】
段階(ｄ)の重合は、形成したエマルジョンへの開始剤の添加によって、容易に行われる。ＰＥＧ−ＤＡおよびＮＩＰＡＡｍの重合および架橋のためには、硫酸アンモニウムおよびＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミンの開始剤系が望ましい。他の開始剤系は、例えば、ペルオキシ二硫酸アンモニウムと重亜硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムと重亜硫酸ナトリウム、ペルオキシ二硫酸アンモニウムとアスコルビン酸、過硫酸カリウムとアスコルビン酸、および過酸化水素とＦｅ２＋の系を含む。重合および架橋反応は、１５分間から２４時間で、１５から４５℃で行われ得る。
【００２２】
段階(ｅ)の回収は、連続相をデカンテーションし、蒸留水と共に繰り返し遠心分離することにより精製することによって行われ得る。
【００２３】
回収したヒドロゲル・ミクロスフェアの乾燥は、好ましくは、ミクロスフェアの形状を維持し、それらを相互に分離した状態に維持して行う。これは、例えば、水で膨潤したミクロスフェアを含む水溶液をガラススライド上に置き、過剰の水を湿らせた濾紙で除き、そして例えば１５から３０時間空気中で乾燥するか、または凍結乾燥によって乾燥することによって行われ得る。
【００２４】
乾燥したミクロスフェアは、走査電子顕微鏡を用いて測定したとき、１０から３５μｍの範囲の凍結乾燥径を有する。
水溶性蛋白質、例えばサイトカイン(例えばインターロイキン−２)の負荷は、例えば、乾燥したヒドロゲル・ミクロスフェアを、可溶性蛋白質を含むリン酸緩衝溶液中に、１から４日間浸漬することによって行う。
【００２５】
以下に、水溶液からサイトカインを負荷し得る、注射可能なミクロスフェアを指向する、本発明の態様について述べる。注射可能なミクロスフェアは、好ましくは、ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート(ここで、ポリエチレングリコールは２,０００から３５,０００の範囲の重量平均分子量を有する)、およびＮ−イソプロピルアクリルアミドを重合することによって形成されるヒドロゲル・ミクロスフェアであり、上記の通りに製造し、上記の通りにサイトカインを負荷する。
【００２６】
注射可能なヒドロゲルは、温度の上昇が収縮および水分の喪失を起こすという、温度感受性放出パターンを有する。
ここで、重量平均分子量は、単分散ポリスチレン標準を用いるゲル浸透クロマトグラフィーによって決定する。
【００２７】
本発明は、米国仮特許出願第 60/440,646 号の一部である、「水性２相系中で合成されるＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡ ヒドロゲル・ミクロスフェア」と題された文書に示されている実験および結果および結論によって支持され、米国仮特許出願第 60/440,646 号の全体は、引用によって本明細書に組み込まれている)。
本発明は、下記の実施例によって説明される。
【実施例】
【００２８】
実施例 I
ポリ(エチレングリコール)(重量平均分子量 ３,６００) ジアクリレート(ＰＥＧ−ＤＡ)を、Cruise, G.M., et al, Biomaterials 19, 1287-1294 (1998) の方法によって製造した。
【００２９】
ＰＥＧ−ＤＡ(０.３５ｇ)およびＮ−イソプロピルアクリルアミド(ＮＩＰＡＡｍ, ０.７５ｇ)を、蒸留水(５.０ml)に溶解し、水溶液を形成した。次に、デキストラン(重量平均分子量４３,０００, ３.０g)、および無水硫酸マグネシウム(ＭｇＳＯ４, ３.０ｇ)を蒸留水(１０ ml)に溶解し、第２水溶液を形成した。２つの水溶液を３０分間撹拌速度８００rpmで激しく混合した。相分離が起り、生成した水中水型エマルジョン系を２０分間安定化させた。次にペルオキシ二硫酸アンモニウム(１５０μｌ, ５.０ｗｔ％水溶液)、およびＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン(１００μｌ)を加え、重合／架橋反応を開始させた。反応は、２２℃で３０分間撹拌することなく行い、ＮＩＰＡＡｍおよびＰＥＧ−ＤＡ中のアクリロイル部分を重合させた。最後に、生成したヒドロゲル・ミクロスフェアを回収し、蒸留水と共に反復して遠心分離することによって精製した。乾燥を上記の通りに空気中で乾燥させることによって行った。
【００３０】
ヒドロゲル・ミクロスフェアの制御放出機能を検討するために、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を、モデルの高分子量蛋白質薬として選択した。
【００３１】
乾燥したヒドロゲル・ミクロスフェアを、ＢＳＡ負荷リン酸緩衝溶液(８.０ｇのＢＳＡおよび２５mlのリン酸緩衝食塩水) (ＰＢＳ, ｐＨ ７.４)に、２２℃で２日間浸漬し、それによって、平衡分配によりヒドロゲル・ミクロスフェアにＢＳＡを負荷した。膨潤したＢＳＡ負荷ヒドロゲル・ミクロスフェアを、次のＢＳＡ放出試験に用いた。ヒドロゲル・ミクロスフェアからのＢＳＡの放出試験は、ｐＨ ７.４ リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中で、そのＬＣＳＴ以下(２２℃)もしくはそれ以上(３７℃)の温度で行った。放出プロファイルは、２７７μｍの吸光度でＵＶスペクトルによってモニターした。２２℃で、ヒドロゲル・ミクロスフェアから、ほぼ６０％のＢＳＡが、１２時間で放出された。一方、ヒドロゲル・ミクロスフェアから、３７℃で４０％ ＢＳＡが放出された。このことは、薬物放出が、環境の温度の変化によって制御され得ることを示している。全てのＢＳＡが２４時間で放出されなかったことから、この試験は、徐放性を証明している。この結果の外挿より、約１週間以上ＢＳＡの放出が持続するであろうことが示される。
【００３２】
実施例 II
ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート(ＰＥＧ−ＤＡ)を、Cruise, G.M., et al. Biomaterials 19, 1287-1294 (1998) の方法によって、重量平均分子量８,０００のポリ(エチレングリコール) ジオールを用いて製造した。要するに、２５ｇのポリ(エチレングリコール)ジオール(８,０００)(ＰＥＧジオールと表記)を、５０mlの無水ベンゼンに溶解し、ＰＥＧ溶液を形成した。トリエチルアミン(ＰＥＧジオール末端基に対して４倍モル過剰)を、室温でＰＥＧ溶液に加え、次に塩化アクリロイル(ＰＥＧジオール末端基に対して４倍モル過剰)をＰＥＧ溶液に滴下し、ＰＥＧのアクリレート ジエステルを形成した。混合物を乾燥Ｎ２下で３５℃で終夜撹拌した。反応中に生じる不溶性トリエチルアミン塩を濾過して除き、ＰＥＧ ジアクリレート(ＰＥＧ−ＤＡ)生成物を、１.０Ｌの冷却したジエチルエーテル(４℃)を添加することによって沈殿させた。沈殿ＰＥＧ−ＤＡを集め、無水ベンゼン／冷却ジエチルエーテル中で２回再結晶することによって精製した。精製ＰＥＧ−ＤＡを集め、真空下で終夜４０℃で回収した。
【００３３】
ＰＥＧ−ＤＡ(８,０００, ０.３５ｇ)、およびＮ−イソプロピルアクリルアミド(ＮＩＰＡＡｍ, ０.７５ｇ)を、５.０mLの蒸留水に溶解し、水相を形成した。ジアクリレート基が存在するので、ＰＥＧ−ＤＡは、次の重合／架橋反応において架橋リンカーおよび前駆体として作用する。次に、デキストラン(重量平均分子量６６,０００, ３.０ｇ)および無水ＭｇＳＯ４(３.０g)を１０mLの蒸留水に溶解し、もう一方の水相を形成した。ここで、上記の２個の非混和性水相の形成を促進するために、無水ＭｇＳＯ４を用いて、ＰＥＧ−ＤＡおよびＮＩＰＡＡｍを、デキストランから塩析させた(すなわち、２つの水系：デキストランおよびＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡの間の非混和性を増大させた)。これらの２つの水溶液を撹拌速度８００rpmで６０分間激しく混合した。相分離を起こし、そして得られた水中水型エマルジョン系を３０分間安定化させた。次に、０.５mLの過硫酸アンモニウム溶液(５０mg/mL)および０.１mLのＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチレン ジアミンを加えた。
【００３４】
撹拌することなく、ＮＩＰＡＡｍおよびＰＥＧ−ＤＡ相中でアクリロイル部分を重合／架橋するために、混合物を室温で１２時間静置した。得られた架橋されたＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡ ミクロスフェアは、繰り返し遠心分離して蒸留水で洗浄することによって精製した。水中１０ｗｔ％の濃度での膨潤したミクロスフェアの懸濁液は、室温で半透明である。
【００３５】
濃縮された平衡膨潤ミクロスフェアを、バーチス凍結乾燥機(Gardiner, NY)で、真空下で、−４２℃で、少なくとも３日間、水が完全に昇華するまで乾燥した。
前駆体からの凍結乾燥したミクロスフェアの収率は、約５４％であった。
【００３６】
膨潤ヒドロゲル・ミクロスフェアの粒度は、レーザー回折によって、次のようにして決定した。凍結乾燥したミクロスフェアを、ＨＰＬＣグレードの水に懸濁(５％ vol)し、超音波処理して、均一な懸濁液を得た。レーザー回折を利用する粒度分析器(Particle Size Analyzer 2010, Brinkman Instruments, Inc., NY, USA)を用いて粒子径を測定した。約６０％の膨潤ミクロスフェアが、約５０μｍの直径を有することが分かった。
【００３７】
凍結乾燥したヒドロゲル・ミクロスフェアを、走査電子顕微鏡(Hitachi S4500 SEM, Mountain View, CA, USA)を用いて分析した。ＳＥＭ観察前に、ミクロスフェアをアルミニウムの台に固定し、金でコートした。ＳＥＭ像は直径約２５μｍの粒度を示した。
【００３８】
粒度分析器によって測定された直径と、ＳＥＭ測定による直径の間の粒度の不一致は、一方が流体力学的直径を、もう一方が非流体力学的直径を測定しているという差異による。ＳＥＭ観察に高度真空が必要なために、ＳＥＭを用いて自然の膨潤状態におけるヒドロゲル・ミクロスフェアを観察することは不可能であることが分かった。環境走査電子顕微鏡(ESEM, Phillips ElectroScan 220)、および直接観察のために室温でミクロスフェア懸濁液の液滴を顕微鏡の試料受けに採取することによって調製したサンプルの使用は、直径約２５μｍの水和したミクロスフェアの粒度を示し、これは、ＳＥＭ観察によって、凍結乾燥した粒子で得られた粒度と一致している。
【００３９】
ヒドロゲルのＬＣＳＴの挙動は、示差走査熱量分析(ＤＳＣ)(TA 2920 Modulated DSC, TA Instruments, Inc, DE, USA)を用いて観察した。それぞれのサンプルを室温で蒸留水に浸漬し、平衡に達した後、ＤＳＣ測定を行った。約１０mgの平衡膨潤サンプルを、密封用アルミニウム容器中に置き、密封用アルミニウム蓋で密封した。熱分析は、１５から５５℃で、膨潤ミクロスフェアのサンプルで、３℃/分の加熱速度で、乾燥窒素下(４０mL/分)に行った。約２９.１℃のＬＣＳＴが観察された。ＬＣＳＴの存在は、ヒドロゲル・ミクロスフェアが温度感受性である、すなわち温度の上昇が収縮および水の喪失を起こすことを示している。
【００４０】
室温(２２℃)での平衡膨潤率を次のように測定した。
前もって定められた量の凍結乾燥ミクロスフェアのサンプルを、円筒状プラスチックチューブ(４５ml)中に入れ、チューブのふたを密閉し、その重量を測定した。水(約３０ml)をチューブに加え、ミクロスフェアを室温で連続的に振盪しながら１２時間膨潤させた。膨潤ヒドロゲル・ミクロスフェアを遠心分離し、濃縮した。上部の透明な液体をピペットで注意深く除いた後、回収したミクロスフェアを素早く秤量し、プラスチックチューブに入れた。次いで、同体積の新しい水を、振盪しながら濃縮したミクロスフェアに加えた。チューブを室温で８時間インキュベートし、次に膨潤ヒドロゲル・ミクロスフェアを遠心分離し、再度濃縮した。この膨潤−遠心分離−秤量プロセスを、ミクロスフェアの重量が一定になる(これは、溶媒中で平衡膨潤状態に達したヒドロゲル・ミクロスフェアを意味する)まで、数回繰り返した。それぞれのサンプルについて、３つの平衡膨潤の間の平均値を取り、膨張率を次式により計算した：
膨張率＝(Ｗｓ−Ｗｄ)／Ｗｄ
[ここで、Ｗｓは、膨潤ヒドロゲル・ミクロスフェアの重量であり、そしてＷｄは乾燥ミクロスフェアの重量である]。計算された膨潤率は２０±４である。
【００４１】
モデルの薬物を次のように組み込む。膨潤率は、含浸させた薬物を放出する速度と量に関係する。膨潤率が大きいほど、放出速度は速くなり、かつ放出される薬物の量が多くなるのが普通の場合であると考えられている。ここで算定した膨潤率は、ヒドロゲル・ミクロスフェアの徐放有用性を示す。
【００４２】
ヒドロゲル・ミクロスフェアに含浸するためのモデル蛋白質薬物として、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を選択した。
ヒドロゲル・ミクロスフェアを製剤化する前にＢＳＡを取り込むように、前負荷法を用いた。ＢＳＡの一定量(ポリマー前駆体の３.０ｗｔ％)を、前駆体溶液(すなわちＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡ水相)に加えた。次に、ヒドロゲル・ミクロスフェアを製造するために、このＢＳＡ負荷ＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡ溶液を、デキストラン／ＭｇＳＯ４溶液に加えた。重合および架橋後、ＢＳＡ負荷ＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡヒドロゲル・ミクロスフェアを、遠心分離によって素早く精製し、蒸留水で５時間洗浄した。
【００４３】
次に、薬物負荷ヒドロゲル・ミクロスフェア(１０mg)を、１.５mLのリン酸緩衝溶液(ＰＢＳ)(０.１Ｍ, ｐＨ ７.４)を含む２.０mLのバイアル中に入れた。バイアルを、前もって定められた温度(室温, すなわち２２℃か３７℃で)で、インキュベーター中に置いた。前もって定められた浸漬時間で、バイアルを１０,０００rpmで５分間遠心分離し、１.０mLの上清を除き、新しいＰＢＳに置き換えた。上清のＢＳＡ含量を、Perkin Elmer Lambda 2 UV/VIS spectrometer (Norwalk, Connecticut) によって、２７７nmで測定し、放出されたＢＳＡの濃度を、ＢＳＡ標準キャリブレーション曲線から計算した。全ての放出試験を２回行った。結果を、下記の等式：
累積放出量(％)＝(Ｍｔ／Ｍｏ)×１００
[ここで、Ｍｔは、時間ｔでのヒドロゲル・ミクロスフェアから放出されたＢＳＡの量であり、そしてＭｏは、ヒドロゲル・ミクロスフェア中に負荷したＢＳＡの初期量である]に従って、時間の関数としての累積放出量として表した。
【００４４】
２２℃(ＬＣＳＴ以下)および３７℃(ＬＣＳＴ以上)で、経時的にヒドロゲル・ミクロスフェアから放出されたＢＳＡの累積量を計算した。温度と無関係に、ヒドロゲルは、始めに比較的速く放出する時間、次にゆっくり放出する時間によって特徴付けられる、二相調節を示す。３７℃でのＢＳＡの放出速度および放出量は、２２℃のものより遅く、かつ少なかった。例えば、始めの８時間以内では、放出された累積ＢＳＡは、２２℃で約２１％であり、そして３７℃で１３％であった。２２日の試験期間中の累積ＢＳＡ放出量は、２２℃で６０％であったのに対し、３７℃で５２％であった。推測に拘束されるつもりはないが、３７℃で放出が少ないのは、ＬＣＳＴ以上で崩壊したマトリックス中にＢＳＡが捕捉されていることによると想定される。
本試験は、外温の違いによる放出速度の違いを示した。
【００４５】
変法
変法は当業者に明らかである。従って、本発明の範囲は、請求項によって定義される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、The National Textile Center との二次契約によって、United States Department of Commerce Prime Grant Award No. 99-27-07400 下で、少なくとも一部分米国政府の支援を得た。米国政府は本発明にある種の権利を有する。
【０００２】
関連明細書の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第 60/440,646 号(2003年1月17日出願)に基づく権利を主張している。
【０００３】
技術分野
本発明は、水溶液から水溶性蛋白質を負荷し、薬物(例えば水溶性蛋白質薬物)の制御放出に有用である、注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェア、およびその製造に関する。
【０００４】
本発明の背景
薬物送達系における最も大きな挑戦の一つは、蛋白質をベースとした薬物の制御送達であり、これは、該薬物の循環系における短半減期、低浸透性、速い蛋白質分解 (低安定性)、および免疫原性による。多単位投与形(例えばポリマー性ミクロスフェア)の使用によって、一単位投与形(例えば錠剤)が投与された場合と比較して、患者において、吸収差が大きく減少し、ヒトの身体における標的部位に、より効果的な薬物蓄積(accumulation)をもたらす。多くの技術が、薬物投与のためのポリマー性ミクロスフェアの製造のために提案されている。最も一般的に用いられる報告された技術は、溶媒蒸発または多重エマルジョン溶媒蒸発を含む。これらの技術は、有機溶媒に依拠するものであり、該溶媒は、蛋白質をベースとした薬物の生物活性の低下を起こし、かつ一般的に毒性であり、そのため完全除去が必要である。
【０００５】
口腔癌を有する患者の全生存率はここ４０年間で約５０％である。サイトカイン免疫療法は、動物モデルおよび初期臨床試験で勇気付けられる結果を示している。しかし、サイトカインを全身に投与した場合、それらは広範な毒性像を示す。炎症誘発性サイトカインの腫瘍微小環境への局所徐放がヒドロゲルからの放出によって可能であるが、既知のヒドロゲルのサイトカインでの負荷は、有機溶液からのサイトカインの負荷を必要とし、このことがサイトカイン生物活性の著しい損失をもたらす。
【０００６】
従って、有機溶媒の使用を必要とせず形成することができ、かつ、薬物を不活性化することなく水溶性蛋白質薬物を負荷するポリマー性ミクロスフェア投与剤形に対する要請がある。
【０００７】
本発明の要約
注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェアは、水溶性であるヒドロゲル前駆体から得られ、そしてその製造に有機溶媒の使用を必要としないこと、そして得られたヒドロゲル・ミクロスフェアは、蛋白質を不活性化することなく、水溶液から水溶性蛋白質を負荷することが見出された。
【０００８】
ここで、本発明の方法は、蛋白質活性の有意な損失なしに水溶液から蛋白質を負荷する、注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェアを製造するものであり、活性蛋白質のための徐放性担体を提供する。
【０００９】
本発明の方法は、
ａ) 少なくとも１個のヒドロゲル前駆体がヒドロゲル形成において架橋リンカーおよびモノマーの両方として機能する、水に可溶なヒドロゲル前駆体の水溶液(第１水溶液という)を製造すること；
ｂ) 第１水溶液と第２水溶液を混合し、ここで、該第２水溶液は水に溶解したポリマーを含み、該ポリマーが、存在する何れかの溶解性減少剤と共に存在するポリマーの濃度で、該混合に際して、第１水溶液と非混和性の水相を形成し、該第２水溶液は、第１水溶液と、それによって第１水溶液と第２水溶液の混合によりエマルジョンを形成する際に連続相となる相対的量で混合されること；
ｃ) 第２水溶液が連続相であり、そして第１水溶液が分散相であり、そして該分散相が２５から６０μｍ(レーザー回折によって測定)の範囲の直径を有するスフェアからなるエマルジョンを形成すること；
ｄ) 該分散相のヒドロゲル前駆体を重合しヒドロゲル・ミクロスフェアを形成すること；
ｅ) ヒドロゲル・ミクロスフェアを集めること；
の段階を含むものである。
【００１０】
本発明の別の態様は、水溶液からサイトカインを負荷し得る、注射可能なヒドロゲル・ミクロスフェアを指向する。ヒドロゲルの注射可能性は、投与を簡略化するのに有益である。
【００１１】
“ヒドロゲル”という用語は、ここでは、水中で膨潤し、そして溶解することなくその構造中に有意な量の水を保持することが可能なポリマー性物質を意味する。
【００１２】
“ヒドロゲル前駆体”という用語は、ここでは、ヒドロゲルを形成するために水溶液中で重合可能な水溶性組成物を意味する。
“ミクロスフェア”という用語は、ここでは、別の定義をされない限り、１から２００もしくは３００μｍの範囲の直径を有する球状粒子を意味する。
【００１３】
詳細な説明
ヒドロゲル形成において架橋リンカーおよびモノマーの両方として機能するヒドロゲル前駆体は、好ましくは、ポリ(エチレングリコール ジアクリレート)(時には、ＰＥＧ−ＤＡと記載される場合もある)である。ここで、ポリ(エチレングリコール)は、２,０００から３５,０００の範囲の重量平均分子量を有する。ＰＥＧ−ＤＡは、好ましくは、Cruise, G.M., et al, Biomaterials 19, 1287-1294 (1998)に記載されている通りに、ポリ(エチレングリコール) ジオールから、塩化アクリロイルとの反応によって、ポリ(エチレングリコール)のアクリレート ジエステルを形成させて製造される。ポリ(エチレングリコール) ジオール出発物質は市販されている。
【００１４】
好ましくは、第１水溶液に含まれる他のヒドロゲル前駆体はまた、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(ＮＩＰＡＡｍと記載されることもある)である。ＮＩＰＡＡｍは、得られたヒドロゲルに温度感受性を与え、それによって、低臨界溶液温度(lower critical solution temperature)を超えたときに、得られたヒドロゲルは、水およびそれに溶解している蛋白質を失う。“低臨界溶液温度”(ここでは、“ＬＣＳＴ”と記載する場合もある)という用語は、ヒドロゲル・ミクロスフェアをサーモグラフにかけて測定した吸熱ピークであり、それより上の温度で、ヒドロゲルが崩壊し、ヒドロゲルの体積が劇的に収縮する温度である。ここで、ＮＩＰＡＡｍおよびＰＥＧ−ＤＡからのヒドロゲルは約２９℃のＬＣＳＴを有する。“温度感受性”という用語は、収縮や水の喪失を起こす温度の変化を意味する。
【００１５】
ＮＩＰＡＡｍおよびＰＥＧ−ＤＡを含む第１水溶液に関して、第１水溶液におけるＮＩＰＡＡｍの濃度は、例えば５から２５％(wt/vol%)の範囲であり、そして第１水溶液におけるＰＥＧ−ＤＡの濃度は、例えば２から５０％(wt/vol%)の範囲である。
【００１６】
第２水溶液におけるポリマーは水溶性であり、そして上記のように、第２水溶液中に存在する何れかの溶解性減少剤と共に第２水溶液中に存在するポリマーの濃度で、段階(ｂ)の混合の際に、該第１水溶液と混和可能ではない水溶液を形成する。第２水溶液のポリマーには、水溶性多糖類が望ましい。約４０,０００から８０,０００の範囲の重量平均分子量を有するデキストランが特に望ましい。他の水溶性多糖類、例えばキトサン、澱粉、藻類フコイダン、セルロース、ペクチン、ヘパリン、カシューナッツ・ゴム、およびグリコーゲンは、デキストランの代わりに用いられ得る。第２水溶液のための多糖類以外の他のポリマーは、例えば、ポリ電解質、例えばポリエチレンイミンまたはポリアクリル酸；ポリ(ビニルピロリドン)；エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー；およびカゼイン酸ナトリウムおよびアルギン酸ナトリウムの混合物である。
【００１７】
第２水溶液のポリマーとしてデキストランを使用する際に、デキストランの水への溶解性を減少させ、段階(ｂ)の混合の際に、ポリマー−ポリマー不溶性による２相水系を形成させ、すなわちＰＥＧ−ＤＡおよびＮＩＰＡＡｍのデキストランからの“塩析”を起こさせ、乳化剤もしくは安定剤を必要とすることなく２つの水相の間の非混和性を助長するために、化合物が第２水溶液に加えられ得る。この目的のために望ましい化合物は、ＭｇＳＯ４である。ＫＣｌなどの他の塩、およびリン酸マグネシウムが、ＭｇＳＯ４に代わって用いられ得る。
【００１８】
第２水溶液中のデキストランおよびＭｇＳＯ４に関して、該溶液のデキストランの濃度は、例えば１０から５０％(wt/vol%)の範囲であり、ＭｇＳＯ４の濃度は、例えば、１０から６０％(wt/vol%)の範囲であり得る。
【００１９】
段階(ｂ)において、第１および第２水溶液は、第２水溶液が、連続相を構成し、第１水溶液が段階(ｃ)におけるエマルジョンの形成の際に分散相を構成するような相対的比率で混合される。
【００２０】
段階(ｃ)におけるエマルジョンの形成は、例えば１５分間から２時間激しく混合することによって行われ、それによって２相の水中水型エマルジョン系を形成し、例えば１０分間から１時間静置することによって安定化する。分散相は、直径がレーザー回折によって測定したとき２５から６０μｍの範囲であるスフェアの第１水溶液によって構成される。上記の通り、乳化剤は存在する必要がなく、乳化剤は存在しない方が好ましい。
【００２１】
段階(ｄ)の重合は、形成したエマルジョンへの開始剤の添加によって、容易に行われる。ＰＥＧ−ＤＡおよびＮＩＰＡＡｍの重合および架橋のためには、硫酸アンモニウムおよびＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミンの開始剤系が望ましい。他の開始剤系は、例えば、ペルオキシ二硫酸アンモニウムと重亜硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムと重亜硫酸ナトリウム、ペルオキシ二硫酸アンモニウムとアスコルビン酸、過硫酸カリウムとアスコルビン酸、および過酸化水素とＦｅ２＋の系を含む。重合および架橋反応は、１５分間から２４時間で、１５から４５℃で行われ得る。
【００２２】
段階(ｅ)の回収は、連続相をデカンテーションし、蒸留水と共に繰り返し遠心分離することにより精製することによって行われ得る。
【００２３】
回収したヒドロゲル・ミクロスフェアの乾燥は、好ましくは、ミクロスフェアの形状を維持し、それらを相互に分離した状態に維持して行う。これは、例えば、水で膨潤したミクロスフェアを含む水溶液をガラススライド上に置き、過剰の水を湿らせた濾紙で除き、そして例えば１５から３０時間空気中で乾燥するか、または凍結乾燥によって乾燥することによって行われ得る。
【００２４】
乾燥したミクロスフェアは、走査電子顕微鏡を用いて測定したとき、１０から３５μｍの範囲の凍結乾燥径を有する。
水溶性蛋白質、例えばサイトカイン(例えばインターロイキン−２)の負荷は、例えば、乾燥したヒドロゲル・ミクロスフェアを、可溶性蛋白質を含むリン酸緩衝溶液中に、１から４日間浸漬することによって行う。
【００２５】
以下に、水溶液からサイトカインを負荷し得る、注射可能なミクロスフェアを指向する、本発明の態様について述べる。注射可能なミクロスフェアは、好ましくは、ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート(ここで、ポリエチレングリコールは２,０００から３５,０００の範囲の重量平均分子量を有する)、およびＮ−イソプロピルアクリルアミドを重合することによって形成されるヒドロゲル・ミクロスフェアであり、上記の通りに製造し、上記の通りにサイトカインを負荷する。
【００２６】
注射可能なヒドロゲルは、温度の上昇が収縮および水分の喪失を起こすという、温度感受性放出パターンを有する。
ここで、重量平均分子量は、単分散ポリスチレン標準を用いるゲル浸透クロマトグラフィーによって決定する。
【００２７】
本発明は、米国仮特許出願第 60/440,646 号の一部である、「水性２相系中で合成されるＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡ ヒドロゲル・ミクロスフェア」と題された文書に示されている実験および結果および結論によって支持され、米国仮特許出願第 60/440,646 号の全体は、引用によって本明細書に組み込まれている)。
本発明は、下記の実施例によって説明される。
【実施例】
【００２８】
実施例 I
ポリ(エチレングリコール)(重量平均分子量 ３,６００) ジアクリレート(ＰＥＧ−ＤＡ)を、Cruise, G.M., et al, Biomaterials 19, 1287-1294 (1998) の方法によって製造した。
【００２９】
ＰＥＧ−ＤＡ(０.３５ｇ)およびＮ−イソプロピルアクリルアミド(ＮＩＰＡＡｍ, ０.７５ｇ)を、蒸留水(５.０ml)に溶解し、水溶液を形成した。次に、デキストラン(重量平均分子量４３,０００, ３.０g)、および無水硫酸マグネシウム(ＭｇＳＯ４, ３.０ｇ)を蒸留水(１０ ml)に溶解し、第２水溶液を形成した。２つの水溶液を３０分間撹拌速度８００rpmで激しく混合した。相分離が起り、生成した水中水型エマルジョン系を２０分間安定化させた。次にペルオキシ二硫酸アンモニウム(１５０μｌ, ５.０ｗｔ％水溶液)、およびＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン(１００μｌ)を加え、重合／架橋反応を開始させた。反応は、２２℃で３０分間撹拌することなく行い、ＮＩＰＡＡｍおよびＰＥＧ−ＤＡ中のアクリロイル部分を重合させた。最後に、生成したヒドロゲル・ミクロスフェアを回収し、蒸留水と共に反復して遠心分離することによって精製した。乾燥を上記の通りに空気中で乾燥させることによって行った。
【００３０】
ヒドロゲル・ミクロスフェアの制御放出機能を検討するために、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を、モデルの高分子量蛋白質薬として選択した。
【００３１】
乾燥したヒドロゲル・ミクロスフェアを、ＢＳＡ負荷リン酸緩衝溶液(８.０ｇのＢＳＡおよび２５mlのリン酸緩衝食塩水) (ＰＢＳ, ｐＨ ７.４)に、２２℃で２日間浸漬し、それによって、平衡分配によりヒドロゲル・ミクロスフェアにＢＳＡを負荷した。膨潤したＢＳＡ負荷ヒドロゲル・ミクロスフェアを、次のＢＳＡ放出試験に用いた。ヒドロゲル・ミクロスフェアからのＢＳＡの放出試験は、ｐＨ ７.４ リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中で、そのＬＣＳＴ以下(２２℃)もしくはそれ以上(３７℃)の温度で行った。放出プロファイルは、２７７μｍの吸光度でＵＶスペクトルによってモニターした。２２℃で、ヒドロゲル・ミクロスフェアから、ほぼ６０％のＢＳＡが、１２時間で放出された。一方、ヒドロゲル・ミクロスフェアから、３７℃で４０％ ＢＳＡが放出された。このことは、薬物放出が、環境の温度の変化によって制御され得ることを示している。全てのＢＳＡが２４時間で放出されなかったことから、この試験は、徐放性を証明している。この結果の外挿より、約１週間以上ＢＳＡの放出が持続するであろうことが示される。
【００３２】
実施例 II
ポリ(エチレングリコール) ジアクリレート(ＰＥＧ−ＤＡ)を、Cruise, G.M., et al. Biomaterials 19, 1287-1294 (1998) の方法によって、重量平均分子量８,０００のポリ(エチレングリコール) ジオールを用いて製造した。要するに、２５ｇのポリ(エチレングリコール)ジオール(８,０００)(ＰＥＧジオールと表記)を、５０mlの無水ベンゼンに溶解し、ＰＥＧ溶液を形成した。トリエチルアミン(ＰＥＧジオール末端基に対して４倍モル過剰)を、室温でＰＥＧ溶液に加え、次に塩化アクリロイル(ＰＥＧジオール末端基に対して４倍モル過剰)をＰＥＧ溶液に滴下し、ＰＥＧのアクリレート ジエステルを形成した。混合物を乾燥Ｎ２下で３５℃で終夜撹拌した。反応中に生じる不溶性トリエチルアミン塩を濾過して除き、ＰＥＧ ジアクリレート(ＰＥＧ−ＤＡ)生成物を、１.０Ｌの冷却したジエチルエーテル(４℃)を添加することによって沈殿させた。沈殿ＰＥＧ−ＤＡを集め、無水ベンゼン／冷却ジエチルエーテル中で２回再結晶することによって精製した。精製ＰＥＧ−ＤＡを集め、真空下で終夜４０℃で回収した。
【００３３】
ＰＥＧ−ＤＡ(８,０００, ０.３５ｇ)、およびＮ−イソプロピルアクリルアミド(ＮＩＰＡＡｍ, ０.７５ｇ)を、５.０mLの蒸留水に溶解し、水相を形成した。ジアクリレート基が存在するので、ＰＥＧ−ＤＡは、次の重合／架橋反応において架橋リンカーおよび前駆体として作用する。次に、デキストラン(重量平均分子量６６,０００, ３.０ｇ)および無水ＭｇＳＯ４(３.０g)を１０mLの蒸留水に溶解し、もう一方の水相を形成した。ここで、上記の２個の非混和性水相の形成を促進するために、無水ＭｇＳＯ４を用いて、ＰＥＧ−ＤＡおよびＮＩＰＡＡｍを、デキストランから塩析させた(すなわち、２つの水系：デキストランおよびＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡの間の非混和性を増大させた)。これらの２つの水溶液を撹拌速度８００rpmで６０分間激しく混合した。相分離を起こし、そして得られた水中水型エマルジョン系を３０分間安定化させた。次に、０.５mLの過硫酸アンモニウム溶液(５０mg/mL)および０.１mLのＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチレン ジアミンを加えた。
【００３４】
撹拌することなく、ＮＩＰＡＡｍおよびＰＥＧ−ＤＡ相中でアクリロイル部分を重合／架橋するために、混合物を室温で１２時間静置した。得られた架橋されたＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡ ミクロスフェアは、繰り返し遠心分離して蒸留水で洗浄することによって精製した。水中１０ｗｔ％の濃度での膨潤したミクロスフェアの懸濁液は、室温で半透明である。
【００３５】
濃縮された平衡膨潤ミクロスフェアを、バーチス凍結乾燥機(Gardiner, NY)で、真空下で、−４２℃で、少なくとも３日間、水が完全に昇華するまで乾燥した。
前駆体からの凍結乾燥したミクロスフェアの収率は、約５４％であった。
【００３６】
膨潤ヒドロゲル・ミクロスフェアの粒度は、レーザー回折によって、次のようにして決定した。凍結乾燥したミクロスフェアを、ＨＰＬＣグレードの水に懸濁(５％ vol)し、超音波処理して、均一な懸濁液を得た。レーザー回折を利用する粒度分析器(Particle Size Analyzer 2010, Brinkman Instruments, Inc., NY, USA)を用いて粒子径を測定した。約６０％の膨潤ミクロスフェアが、約５０μｍの直径を有することが分かった。
【００３７】
凍結乾燥したヒドロゲル・ミクロスフェアを、走査電子顕微鏡(Hitachi S4500 SEM, Mountain View, CA, USA)を用いて分析した。ＳＥＭ観察前に、ミクロスフェアをアルミニウムの台に固定し、金でコートした。ＳＥＭ像は直径約２５μｍの粒度を示した。
【００３８】
粒度分析器によって測定された直径と、ＳＥＭ測定による直径の間の粒度の不一致は、一方が流体力学的直径を、もう一方が非流体力学的直径を測定しているという差異による。ＳＥＭ観察に高度真空が必要なために、ＳＥＭを用いて自然の膨潤状態におけるヒドロゲル・ミクロスフェアを観察することは不可能であることが分かった。環境走査電子顕微鏡(ESEM, Phillips ElectroScan 220)、および直接観察のために室温でミクロスフェア懸濁液の液滴を顕微鏡の試料受けに採取することによって調製したサンプルの使用は、直径約２５μｍの水和したミクロスフェアの粒度を示し、これは、ＳＥＭ観察によって、凍結乾燥した粒子で得られた粒度と一致している。
【００３９】
ヒドロゲルのＬＣＳＴの挙動は、示差走査熱量分析(ＤＳＣ)(TA 2920 Modulated DSC, TA Instruments, Inc, DE, USA)を用いて観察した。それぞれのサンプルを室温で蒸留水に浸漬し、平衡に達した後、ＤＳＣ測定を行った。約１０mgの平衡膨潤サンプルを、密封用アルミニウム容器中に置き、密封用アルミニウム蓋で密封した。熱分析は、１５から５５℃で、膨潤ミクロスフェアのサンプルで、３℃/分の加熱速度で、乾燥窒素下(４０mL/分)に行った。約２９.１℃のＬＣＳＴが観察された。ＬＣＳＴの存在は、ヒドロゲル・ミクロスフェアが温度感受性である、すなわち温度の上昇が収縮および水の喪失を起こすことを示している。
【００４０】
室温(２２℃)での平衡膨潤率を次のように測定した。
前もって定められた量の凍結乾燥ミクロスフェアのサンプルを、円筒状プラスチックチューブ(４５ml)中に入れ、チューブのふたを密閉し、その重量を測定した。水(約３０ml)をチューブに加え、ミクロスフェアを室温で連続的に振盪しながら１２時間膨潤させた。膨潤ヒドロゲル・ミクロスフェアを遠心分離し、濃縮した。上部の透明な液体をピペットで注意深く除いた後、回収したミクロスフェアを素早く秤量し、プラスチックチューブに入れた。次いで、同体積の新しい水を、振盪しながら濃縮したミクロスフェアに加えた。チューブを室温で８時間インキュベートし、次に膨潤ヒドロゲル・ミクロスフェアを遠心分離し、再度濃縮した。この膨潤−遠心分離−秤量プロセスを、ミクロスフェアの重量が一定になる(これは、溶媒中で平衡膨潤状態に達したヒドロゲル・ミクロスフェアを意味する)まで、数回繰り返した。それぞれのサンプルについて、３つの平衡膨潤の間の平均値を取り、膨張率を次式により計算した：
膨張率＝(Ｗｓ−Ｗｄ)／Ｗｄ
[ここで、Ｗｓは、膨潤ヒドロゲル・ミクロスフェアの重量であり、そしてＷｄは乾燥ミクロスフェアの重量である]。計算された膨潤率は２０±４である。
【００４１】
モデルの薬物を次のように組み込む。膨潤率は、含浸させた薬物を放出する速度と量に関係する。膨潤率が大きいほど、放出速度は速くなり、かつ放出される薬物の量が多くなるのが普通の場合であると考えられている。ここで算定した膨潤率は、ヒドロゲル・ミクロスフェアの徐放有用性を示す。
【００４２】
ヒドロゲル・ミクロスフェアに含浸するためのモデル蛋白質薬物として、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を選択した。
ヒドロゲル・ミクロスフェアを製剤化する前にＢＳＡを取り込むように、前負荷法を用いた。ＢＳＡの一定量(ポリマー前駆体の３.０ｗｔ％)を、前駆体溶液(すなわちＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡ水相)に加えた。次に、ヒドロゲル・ミクロスフェアを製造するために、このＢＳＡ負荷ＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡ溶液を、デキストラン／ＭｇＳＯ４溶液に加えた。重合および架橋後、ＢＳＡ負荷ＰＮＩＰＡＡｍ／ＰＥＧ−ＤＡヒドロゲル・ミクロスフェアを、遠心分離によって素早く精製し、蒸留水で５時間洗浄した。
【００４３】
次に、薬物負荷ヒドロゲル・ミクロスフェア(１０mg)を、１.５mLのリン酸緩衝溶液(ＰＢＳ)(０.１Ｍ, ｐＨ ７.４)を含む２.０mLのバイアル中に入れた。バイアルを、前もって定められた温度(室温, すなわち２２℃か３７℃で)で、インキュベーター中に置いた。前もって定められた浸漬時間で、バイアルを１０,０００rpmで５分間遠心分離し、１.０mLの上清を除き、新しいＰＢＳに置き換えた。上清のＢＳＡ含量を、Perkin Elmer Lambda 2 UV/VIS spectrometer (Norwalk, Connecticut) によって、２７７nmで測定し、放出されたＢＳＡの濃度を、ＢＳＡ標準キャリブレーション曲線から計算した。全ての放出試験を２回行った。結果を、下記の等式：
累積放出量(％)＝(Ｍｔ／Ｍｏ)×１００
[ここで、Ｍｔは、時間ｔでのヒドロゲル・ミクロスフェアから放出されたＢＳＡの量であり、そしてＭｏは、ヒドロゲル・ミクロスフェア中に負荷したＢＳＡの初期量である]に従って、時間の関数としての累積放出量として表した。
【００４４】
２２℃(ＬＣＳＴ以下)および３７℃(ＬＣＳＴ以上)で、経時的にヒドロゲル・ミクロスフェアから放出されたＢＳＡの累積量を計算した。温度と無関係に、ヒドロゲルは、始めに比較的速く放出する時間、次にゆっくり放出する時間によって特徴付けられる、二相調節を示す。３７℃でのＢＳＡの放出速度および放出量は、２２℃のものより遅く、かつ少なかった。例えば、始めの８時間以内では、放出された累積ＢＳＡは、２２℃で約２１％であり、そして３７℃で１３％であった。２２日の試験期間中の累積ＢＳＡ放出量は、２２℃で６０％であったのに対し、３７℃で５２％であった。推測に拘束されるつもりはないが、３７℃で放出が少ないのは、ＬＣＳＴ以上で崩壊したマトリックス中にＢＳＡが捕捉されていることによると想定される。
本試験は、外温の違いによる放出速度の違いを示した。
【００４５】
変法
変法は当業者に明らかである。従って、本発明の範囲は、請求項によって定義される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ) 少なくとも１個のヒドロゲル前駆体がヒドロゲル形成において架橋リンカーおよびモノマーの両方として機能する、水に可溶なヒドロゲル前駆体の水溶液(第１水溶液という)を製造すること；
ｂ) 第１水溶液と第２水溶液を混合し、ここで、該第２水溶液は水に溶解したポリマーを含み、該ポリマーが、存在する何れかの溶解性減少剤と共に存在するポリマーの濃度で、該混合に際して、第１水溶液と非混和性の水相を形成し、該第２水溶液は、第１水溶液と、それによって第１水溶液と第２水溶液の混合によりエマルジョンを形成する際に連続相となる相対的量で混合されること；
ｃ) 第２水溶液が連続相であり、そして第１水溶液が分散相であり、そして該分散相が２５から６０μｍ(レーザー回折によって測定)の範囲の直径を有するスフェアからなるエマルジョンを形成すること；
ｄ) 該分散相のヒドロゲル前駆体を重合しヒドロゲル・ミクロスフェアを形成すること；
ｅ) ヒドロゲル・ミクロスフェアを集めること；
の段階を含む、水溶液から蛋白質を負荷するヒドロゲル・ミクロスフェアを形成する方法。
【請求項２】
ヒドロゲル形成においてモノマーおよび架橋リンカーの両方として機能する、第１水溶液の第１ヒドロゲル前駆体が、ポリ(エチレングリコール) ジアクリレートであって、ここで、ポリ(エチレングリコール)が２,０００から３５,０００の範囲の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１水溶液の第２ヒドロゲル前駆体が、臨界溶液温度(critical solution temperature)を超えたときに、得られたヒドロゲルから水を喪失させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第２ヒドロゲル前駆体が、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第２水溶液のポリマーが、水溶性多糖類である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第２水溶液のポリマーが４０,０００から８０,０００の範囲の重量平均分子量を有するデキストランである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第２水溶液がデキストランの水への溶解性を減少させる成分を含み、その結果段階(ｂ)の混合の際に２相の水系が形成され得る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
水溶液からサイトカインを負荷され得る、注射可能なミクロスフェア。
【請求項９】
ポリエチレングリコールが２,０００から３５,０００の範囲の重量平均分子量を有するポリエチレングリコール ジアクリレート、およびＮ−イソプロピルアクリルアミドを重合することによって形成されるヒドロゲルである、請求項８に記載の注射可能なミクロスフェア。
【請求項１】
ａ) 少なくとも１個のヒドロゲル前駆体がヒドロゲル形成において架橋リンカーおよびモノマーの両方として機能する、水に可溶なヒドロゲル前駆体の水溶液(第１水溶液という)を製造すること；
ｂ) 第１水溶液と第２水溶液を混合し、ここで、該第２水溶液は水に溶解したポリマーを含み、該ポリマーが、存在する何れかの溶解性減少剤と共に存在するポリマーの濃度で、該混合に際して、第１水溶液と非混和性の水相を形成し、該第２水溶液は、第１水溶液と、それによって第１水溶液と第２水溶液の混合によりエマルジョンを形成する際に連続相となる相対的量で混合されること；
ｃ) 第２水溶液が連続相であり、そして第１水溶液が分散相であり、そして該分散相が２５から６０μｍ(レーザー回折によって測定)の範囲の直径を有するスフェアからなるエマルジョンを形成すること；
ｄ) 該分散相のヒドロゲル前駆体を重合しヒドロゲル・ミクロスフェアを形成すること；
ｅ) ヒドロゲル・ミクロスフェアを集めること；
の段階を含む、水溶液から蛋白質を負荷するヒドロゲル・ミクロスフェアを形成する方法。
【請求項２】
ヒドロゲル形成においてモノマーおよび架橋リンカーの両方として機能する、第１水溶液の第１ヒドロゲル前駆体が、ポリ(エチレングリコール) ジアクリレートであって、ここで、ポリ(エチレングリコール)が２,０００から３５,０００の範囲の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１水溶液の第２ヒドロゲル前駆体が、臨界溶液温度(critical solution temperature)を超えたときに、得られたヒドロゲルから水を喪失させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第２ヒドロゲル前駆体が、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第２水溶液のポリマーが、水溶性多糖類である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第２水溶液のポリマーが４０,０００から８０,０００の範囲の重量平均分子量を有するデキストランである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第２水溶液がデキストランの水への溶解性を減少させる成分を含み、その結果段階(ｂ)の混合の際に２相の水系が形成され得る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
水溶液からサイトカインを負荷され得る、注射可能なミクロスフェア。
【請求項９】
ポリエチレングリコールが２,０００から３５,０００の範囲の重量平均分子量を有するポリエチレングリコール ジアクリレート、およびＮ−イソプロピルアクリルアミドを重合することによって形成されるヒドロゲルである、請求項８に記載の注射可能なミクロスフェア。
【公表番号】特表２００６−５１７５２３（Ｐ２００６−５１７５２３Ａ）
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６７４１０（Ｐ２００４−５６７４１０）
【出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３７０７６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６６７０４
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５９２０３５４５３）コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＮＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３７０７６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６６７０４
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５９２０３５４５３）コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＮＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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