水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法
【課題】水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法を提供する。
【解決手段】アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤の存在下反応させる工程を含む水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法。アルデヒド基を有する水溶性ポリマーの水溶性ポリマー部分が、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択されるポリマーである上記製造方法。
【解決手段】アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤の存在下反応させる工程を含む水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法。アルデヒド基を有する水溶性ポリマーの水溶性ポリマー部分が、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択されるポリマーである上記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルデヒド基を有する水溶性ポリマーと生理活性ポリペプチドを、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤の存在下反応させることを特徴とする水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生理活性ポリペプチドが特定の疾病に対する治療薬として有用であることが知られている。しかしながら、血中では、その不安定性のために十分な薬理効果が期待できない場合が多い。例えば、分子量約６０，０００以下のポリペプチドは、血中に投与されても腎臓の糸球体によりろ過され、大部分が尿中に排泄される。このため、満足行く治療効果が得られず、繰り返し投与が必要になる場合が多い。また、血中に存在する加水分解酵素などによっても分解され、その作用を失うこともある。外因性のポリペプチドや遺伝子組換えなどによって製造されたポリペプチドの場合は、内因性のポリペプチドと構造が異なるため、血中に投与された場合には免疫反応を誘発し、アナフィラキシーショックなどの重篤な副作用を起こす可能性のあることが知られている。さらに、生理活性ポリペプチドによってはそれが治療剤として用いられる際に、溶解性が悪いなどの物性が問題になることも多い。
【０００３】
生理活性ポリペプチドを治療剤として用いる場合のこれらの問題を解決する方法の一つとして、１分子以上の不活性型ポリマー鎖で生理活性ポリペプチドを化学的に修飾する方法が知られている。多くの場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール類でポリペプチドを化学的に修飾することによって、ポリペプチドに望ましい特性を付与することができる。
【０００４】
例えば、ポリオキシエチレングリコールで修飾されたスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）は、血中の半減期が著しく延長され、作用が持続すること知られている（ファーマシューティカル リサーチ コミュニケーション（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９巻、２８７頁、１９８７年）。また、ポリエチレングリコールで修飾した顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に関する報告もある（ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊ．ＢｉｏＣｈｅｍ．）、１１５巻、８１４頁、１９９４年）。さらに、アスパラギナーゼ、グルタミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ウロキナーゼなどのポリペプチドをポリエチレングリコールで修飾（ＰＥＧ化）した修飾ポリペプチドの例がまとめられている（ファーマシューティカル バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．）、３巻、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｐａｒｔ Ｂ、２３５頁、１９９２年）。また、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコールで修飾することで得られる効果として、熱安定性が高まること（生物物理、３８巻、２０８頁、１９９８年）、有機溶媒に可溶になること（バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．：ＢＢＲＣ）、１２２巻、８４５頁、１９８４年）などが知られている。
【０００５】
一方、ポリアルキレングリコールなどの水溶性ポリマーでポリペプチドを化学的に修飾する方法、即ち水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法としては、各種の方法が知られている。例えば、特許文献１には、ポリエチレングリコール分子を酵素と結合させる方法として、還元的アルキル化反応を用いる方法が記載されている。特許文献７には、還元剤として水素化ホウ素化ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的アルキル化反応を利用したリンホカインをアルデヒド基を有するポリエチレングリコールで化学修飾（ＰＥＧ化）したポリペプチドの製造方法が記載されている。特許文献８には、Ｇ−ＣＳＦ組成物およびコンセンサスインターフェロンのＮ末端に選択的にポリエチレングリコール分子を導入する方法として、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素化ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ酸トリメチルアミンおよびホウ酸ピリジンから選択される還元剤を用いた還元的アルキル化反応による製造方法が記載されている。さらに各種の製造方法が知られている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６）。
【０００６】
生理活性ポリペプチドとアルデヒド基を有する水溶性ポリマーを還元的アルキル化反応を利用して結合させる場合、該ポリペプチドや該水溶性ポリマーの性質を考慮すると、水中で、または水を含む溶媒中で反応を行うことが望ましい。上記で記載したように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた方法がよく知られているが、シアノ水素化ホウ素ナトリウムは強い毒性を有し、取り扱いが難しいこともよく知られている。
【０００７】
一方、水中で使用できる還元剤として、ピリジンボランが知られている。ピリジンボランは常温では液体（融点：１０−１１℃）で、様々な官能基を還元する緩和な還元剤である（Ｃ．Ｆ．Ｌａｎｅ，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９７３，６，５１−５８．）が、加熱条件など条件によっては不安定であることが知られている（Ｇ．Ｅ．Ｒｙｓｃｈｋｅｗｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｅ．Ｒ．Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６５，４，５７５−５７８．；Ｈ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｌ．Ｄｏｍａｓｈ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５６，７８，５３８４−５３８６；Ｒ．Ａ．Ｂａｌｄｗｉｎ ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｗａｓｈｂｕｒｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６１，２６，３５４９−３５５０．）。
【０００８】
特許文献９には、長期間安定に保存することができる還元剤として２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランが記載されている。これらの還元剤を用いた、イミン類からアミン類を得る方法や低分子化合物に関する還元的アルキル化反応も記載されている。
【特許文献１】米国特許第４００２５３１号
【特許文献２】ヨーロッパ特許第０５３９１６７号
【特許文献３】米国特許第４９０４５８４号
【特許文献４】ヨーロッパ特許第０４０１３８４号
【特許文献５】ヨーロッパ特許０４７３２６８号
【特許文献６】ヨーロッパ特許第０４４２７２４号
【特許文献７】ヨーロッパ特許第０１５４３１６号
【特許文献８】特開平１１−３１０６００号公報
【特許文献９】特開２００４−２５６５１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランから選ばれる還元剤を用いた還元的アルキル化反応による簡便な水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１） アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤の存在下反応させる工程を含む水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法。
（２） アルデヒド基を有する水溶性ポリマーの水溶性ポリマー部分が、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択されるポリマーである（１）記載の方法。
（３） 水溶性ポリマーがポリエチレングリコール類である（１）記載の方法。
（４） ２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤をアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを含む混合物に添加し、反応させる工程を含む（１）記載の方法。
（５） 還元剤が有機溶媒に溶解した２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤である（４）記載の方法。
（６） ポリペプチドが生理活性ポリペプチドである（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） ポリペプチドが、組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体または組換え型ヒトインターフェロン−β（ｒｈＩＦＮ−β）である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、生理活性ポリペプチドの活性を低下させることなく、好ましくは該ポリペプチドのＮ末端を選択的に水溶性ポリマーで修飾するための、水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法が提供される。該製造方法として、生理活性ポリペプチドとアルデヒド基を有する水溶性ポリマーを２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランから選ばれる還元剤の存在下反応させる簡便な製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法について説明する。
本発明の製造方法は、例えば（ｉ）アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを適当な溶媒に溶解する工程、（ｉｉ）２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランから選ばれる還元剤をアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを含む溶液に添加し、反応させる工程、（ｉｉｉ）得られた混合物を精製し水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドを単離する工程からなる。本発明の製造方法により、生理活性ポリペプチド分子に存在するアミノ基（例えばＮ末のα−アミノ基、リジン残基のε−アミノ基など）、好ましくはＮ末のα−アミノ基を水溶性ポリマーで修飾することができる。
（ｉ）アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを適当な溶媒に溶解する工程
本工程で用いられるアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとしては、水溶性ポリマー１分子にアルデヒド基が好ましくは１個存在する水溶性ポリマーであり、該アルデヒド基はアミノ基などと反応性を有していることが好ましい。アルデヒド基を有する水溶性ポリマーの水溶性ポリマー部分としては、分岐状または直鎖状の水溶性ポリマーであればいずれでもよいが、薬学的に許容されるものがより好ましい。例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリエチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールなどがあげられ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールなどが好ましく、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマーなどのポリアルキレングリコールがより好ましく、ポリエチレングリコールなどがさらに好ましい。該水溶性ポリマーの分子量は特に限定されないが、例えばポリアルキレングリコールの場合は、好ましくは約２，０００〜約２０，０００である。これらアルデヒド基を有する水溶性ポリマーは、市販品などとして得ることができる。
【００１３】
本工程で用いられるポリペプチドとしては、例えば生理活性ポリペプチドなどがあげられ、医薬品として用いられる生理活性ポリペプチドが好ましい。具体的には、例えば、アスパルギナーゼ、アモドキソビル（ＤＡＰＤ）、アンタイド、ベカプレルミン、カルシトニン、シアノビリン、デニロイキンジフチトックス、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯアゴニスト（例えば、約１０〜４０アミノ酸の長さで、ＷＯ９６／４０７４９に記載されているような特定のコア配列を含むペプチド）、ドルナーゼアルファ、造血刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）、凝固因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォンウィルブラント因子）、セレダーゼ、セレザイム、アルファ−グルコシダーゼ、コラーゲン、シクロスポリン、アルファデフェンシン、ベータデフェンシン、エキセジン−４、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アルファ−Ｉプロテイナーゼインヒビター、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、フィブリノゲン、フィルグラスチム、成長ホルモンヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ＧＲＯ−ベータ、ＧＲＯ−ベータ抗体、骨形成蛋白質（例えば、骨形成蛋白質−２、骨形成蛋白質−６、ＯＰ−１）、酸性繊維芽細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、ＣＤ−４０リガンド、ヘパリン、ヒト血清アルブミン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンオメガ、インターフェロンタウ、コンセンサスインターフェロン）、インターロイキンとインターロイキン受容体（例えば、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２、インターロイキン−２融合タンパク質、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−４受容体、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３受容体、インターロイキン−１７受容体）、ラクトフェリンとラクトフェリン断片、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、インスリン、プロインスリン、インスリン類似体（例えば、モノアシル化インスリン（米国特許第５，９２２，６７５号））、アミリン、Ｃ−ペプチド、ソマトスタチン、ソマトスタチン類似体（オクトレオチドを含む）、バソプレシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インフルエンザワクチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリントロピン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、およびテネテプラーゼ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、オスエオテゲリン、血小板由来増殖因子、組織増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−１、血管内皮増殖因子、白血病阻害因子、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、グリア増殖因子（ＧＧＦ）、Ｔ細胞受容体、ＣＤ分子／抗原、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、単球化学誘因タンパク質−１、内皮増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチド、ソマトトロピン、サイモシンアルファ１、サイモシンアルファ１ ＩＩｂ／ＩＩＩａインヒビター、サイモシンベータ１０、サイモシンベータ９、サイモシンベータ４、アルファ−１アンチトリプシン、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）化合物、ＶＬＡ−４（超後期抗原−４）、ＶＬＡ−４インヒビター、ビスホスホネート、ＲＳウイルス抗体、嚢胞性繊維症トランスメンブランレギュレーター（ＣＦＴＲ）遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、殺菌性／透過性上昇タンパク質（ＢＰＩ）、抗ＣＭＶ抗体、モノクローナル抗体などがあげられる。モノクローナル抗体としては、例えばエタネルセプト（ＩｇＧ１のＦｃ部分に結合したヒト７５ｋＤ ＴＮＦ受容体の細胞外リガンド結合部分からなるダイマー性融合タンパク質）、アブシキシマブ、アフェリオモマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、インフリキシマブ、イブリツモマブチウエキセタン、ミツモマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ヨウ素１３１トシツモマブ結合体、オリズマブ、リツキシマブ、トラツズマブ（ヘルセプチン）などがあげられる。より好ましくは、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）、組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体（例えば、配列番号１に示したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、組換え型ヒトインターフェロン−β（ｒｈＩＦＮ−β）などがあげられる。これら生理活性を有するポリペプチドは従来より公知の方法によって得ることができる。例えば組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体は、哺乳類動物から単離された形態であるか、または化学合成により得られたものであるか、またはゲノムまたはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成によって得られる外来性ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物の宿主発現による産物であってよい。適当な原核生物宿主には、種々の細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が包含され、適当な真核生物宿主には酵母（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）および哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）が包含される。使用する宿主に応じて、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は、哺乳類またはその他の真核生物炭水化物によりグルコシル化されていてもよいし、またはグルコシル化されてなくてもよい。また、ＩＦＮ−βは、哺乳類動物から単離された形態であるか、または化学合成により得られたものであるか、またはゲノムまたはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成によって得られる外来性ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物の宿主発現による産物であってよい。適当な原核生物宿主には、種々の細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が包含され、適当な真核生物宿主には酵母（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）および哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）が包含される。使用する宿主に応じて、ＩＦＮ−β発現産物は、哺乳類またはその他の真核生物炭水化物によりグルコシル化されていてもよいし、またはグルコシル化されてなくてもよい。
【００１４】
本工程に使用する、アルデヒド基を有する水溶性ポリマーおよびポリペプチドの使用量の比率は、それぞれを溶解した場合の溶液中でのそれぞれのモル濃度に応じて適宜選択すればよい。一般に、最適な比率（未反応のポリペプチドまたはポリマーが過剰に存在しないという反応の効率の点で）は選択されたアルデヒド基を有する水溶性ポリマーの分子量によって決定される。またポリペプチド自身が含有するアミノ基の個数にもよる。
【００１５】
本工程で用いられる適当な溶媒としては、アルデヒド基を有する水溶性ポリマーおよびポリペプチドが溶解する溶液であれば特に限定されないが、好ましくは水または水を含む溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１，４−ジオキサン、アセトニトリルなどの有機溶媒と水との混合溶媒など）などがあげられる。また、溶液のｐＨを適宜調節できるようリン酸緩衝液などの各種緩衝液を用いることもできる。更に、塩化ナトリウムなどの塩類などを含有していても良い。次工程（ｉｉ）での反応を促進させるために、また後述するように、ポリペプチドのα−アミノ基のみが修飾されるよう、用いる溶媒のｐＨは適当な値を選択することが好ましい。
【００１６】
上記の溶媒は、上記のアルデヒド基を有する水溶性ポリマーと上記のポリペプチドが共に溶解する量を適宜選択し使用することができる。
アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを上記の溶媒に溶解させるためには、そのまま混合し撹拌することで溶解することもあるが、溶解し難い場合には、例えば混合液に超音波による振動を与えるか、基質が分解しない温度までの範囲で混合液を加熱することより溶解させることができる。
【００１７】
また、溶液のｐＨは、ポリペプチドのＮ末端のみに選択的な化学修飾が可能となるよう、好ましくはポリペプチド中のリジン残基のε−アミノ基とα−アミノ基のｐＫａの差を利用できるようなｐＨであることが好ましい。このような条件を選択することで、Ｎ末端へのポリマー結合の選択性を優位に増加することができる。従って、この目的のためには、本工程で用いられる溶媒は例えば緩衝液であることが好ましく、溶液に酸または塩基を加えて適切なｐＨに調整することができる。
（ｉｉ）２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランから選ばれる還元剤をアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを含む溶液に添加し、反応させる工程
本工程で用いられる２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランは、例えば市販品として得ることができる。用いる還元剤としては、２−ピコリンボランがより好ましい。
【００１８】
本工程の還元剤の添加方法は、上記（ｉ）で得られた溶液を撹拌しながら、−２０℃と６０℃の間の温度で、好ましくは０℃と１０℃の間の温度で、還元剤をそのまま添加するか、好ましくは還元剤を適当な量の溶媒に溶解または懸濁させゆっくり添加する。還元剤を溶解または懸濁させる溶媒としては、例えば水または有機溶媒、好ましくは有機溶媒があげられ、具体的には、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ＤＭＦ、ＤＭＡ、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ピリジンなどがあげられ、好ましくはＤＭＦなどがあげられる。
【００１９】
本工程における反応は、還元剤を添加した混合物を、好ましくは撹拌しながら、−２０℃と６０℃の間の温度で、好ましくは０℃と１０℃の間の温度で、５分間〜１００時間（好ましくは反応の進行が終了するまで）実施することが好ましい。
なお、反応の進行はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析などにより確認できる。
（ｉｉｉ）得られた混合物を精製し水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドを単離する工程
上記（ｉｉ）で得られた反応混合物を、通常ペプチド化学で用いられるよく知られた手法を用い精製することにより、該混合物中に存在する水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドを単離することができる。通常ペプチド化学で用いられるよく知られた手法としては、例えば、上記（ｉｉ）で得られた反応混合物をＣＭ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆカラムなど各種クロマトグラフィーに通塔する方法などがあげられる。
【００２０】
本発明において、調製された水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドは医薬品などとしての使用が可能である。
医薬品として使用する場合は、水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドをそのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物または人に使用されるものである。
【００２１】
本発明に係わる医薬製剤は、活性成分として水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドを単独で、または任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬学的に許容される一種またはそれ以上の担体（例えば、希釈剤、溶剤、賦形剤など）、および必要により例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸、リン酸のような緩衝成分、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、洗剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０のような可溶化剤、例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、例えばチメルソール、ベンジルアルコールのような保存料、増量剤などと一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００２２】
投与経路としては、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤などがあげられる。
経口投与に適当な、例えば錠剤などは、乳糖などの賦形剤、澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤などを用いて製造できる。
【００２３】
非経口投与に適当な、例えば注射剤などは、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合液などの希釈剤または溶剤などを用いて製造できる。
以下の実施例は本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＮ末端選択的ＰＥＧ化
参考例１で調整したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、これにｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１モル当たり５モルのメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（日本油脂製，ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−２００ＡＬ，平均分子量 ２０ｋＤａ）を加え、溶解した。次に、１.０ｍｏｌ／Ｌに調製した２−ピコリンボランのＤＭＦ溶液を、上記で調整した溶液に、２−ピコリンボランの濃度が２０ｍＭになるよう添加し、４℃で２０時間反応させた。
【００２５】
反応終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行ったところ、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の８８．７％がＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体に変換されていることがわかった。
得られた反応混合物を濃縮フィルターデバイス（アミコンウルトラ−１５、１０，０００ ＭＷＣＯ、ミリポア社製）を用いて、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、精製前の反応液を回収した。
【００２６】
これをＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、カラムサイズの約５倍量の２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄し、５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液を０〜１００％の直線３００分勾配で目的物を溶出し、ＰＥＧ化されたｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を含む画分を分取した。分取した画分を濃縮フィルターデバイス（アミコンウルトラ−１５、１０，０００ ＭＷＣＯ、ミリポア社製）を用いて濃縮および５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に緩衝液交換し、１．８ｍｇ／ｍＬのＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体溶液を得た。
【００２７】
次に得られたＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分析試験を実施した。
（１）下記の条件で電気泳動試験を実施した。分子量約４０，０００の誘導体のみが得られたことを確認した。
（２）下記の条件でゲルろ過ＨＰＬＣ分析を実施した。１１．５２分のピークのみが得られ、未反応のｒｈＧ−ＣＳＦがないことを確認した。
（３）下記の条件でマトリックスアシステッドレーザーデソープション質量分析を実施した。分子量は３９，９６８．０であった。ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体にＰＥＧ鎖が１本だけ導入されていることがわかった。
（４）下記の条件で末端のポリペプチドシーケンシングを実施した。１残基目のメチオニンは確認できず、２残基目のアラニンから確認できた。Ｎ末端が選択的に修飾されていることがわかった。
【００２８】
以上（１）〜（４）の分析結果から、ＰＥＧ鎖がＮ末端に１本だけ導入されたことが証明できた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノールの存在下、以下の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
ゲル：ＰＡＧＥＬ ＳＰＧ ５２０Ｌ（アトー社製）
染色：ＲＡＰＩＤ ＳＴＡＩＮＴＭ （ナカライテスク社製）
分子量マーカー：Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオラッド社製）
＜ゲルろ過ＨＰＬＣ分析＞
以下の分析条件でゲルろ過ＨＰＬＣ分析を実施した。
移動相：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．７ｍＬ／分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
分離カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−３０００ＳＷＸＬ （７．８×３００ｍｍ）（東ソー社製）
＜分子量測定＞
マトリックスアシステッドレーザーデソープション質量分析（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＡＳＳ）によって求めた。
＜Ｎ末端のＰＥＧ鎖導入確認＞
調製したＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の構造は、Ｎ末端のポリペプチドシーケンシングによって確認した。
【実施例２】
【００２９】
ｒｈＩＦＮ−βのＮ末端選択的ＰＥＧ化
参考例２で調整したｒｈＩＦＮ−βを６０％ エチレングリコールおよび１ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１．１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、これに、ｒｈＩＦＮ−β１モルあたり１０モルのメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（日本油脂製，ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−２００ＡＬ，平均分子量 ２０ｋＤａ）を加え、溶解した。
【００３０】
次に、１.０ｍｏｌ／Ｌに調製した２−ピコリンボランのＤＭＦ溶液を、上記で調整した溶液に、２−ピコリンボラン濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌになるよう添加し、４℃で７２時間反応させた。
反応終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行ったところ、Ｍｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＩＦＮ−βが選択的に生成していることが分かった。
【００３１】
得られた反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５ Ｍｅｄｉｕｍを含むＮＡＰ−５カラム（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて、２０％エチレングリコールを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に緩衝液交換し、精製前の反応液を回収した。
これをＣＭ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、カラムサイズの約４倍量の２０％エチレングリコールを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄し、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液を段階的に通塔させ目的画分を溶出し、ＰＥＧ化されたｒｈＩＦＮ−βを含む画分を分取した。分取した画分を濃縮フィルターデバイス（アミコンウルトラ−１５、１０，０００ ＭＷＣＯ、ミリポア社製）を用いて濃縮し、０．４ｍｇ／ｍＬのＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＩＦＮ−β誘導体溶液を得た。
【００３２】
次に得られたＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＩＦＮ−β誘導体の分析試験を実施した。
（１）下記の条件で電気泳動を実施した。分子量約４０，０００の誘導体のみが得られたことを確認した。
（２）下記の条件でペプチドマップを実施した。Ｎ末端選択的に修飾されていることを確認した。
【００３３】
以上の分析結果から、ＰＥＧ鎖がＮ末端に１本だけ導入されたことが証明できた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノールの存在下、以下の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
ゲル：ＰＡＧＥＬ ＳＰＧ ５２０Ｌ（アトー社製）
染色：ＲＡＰＩＤ ＳＴＡＩＮＴＭ （ナカライテスク社製）
分子量マーカー：Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオラッド社製）
＜ペプチドマップ＞
ｒｈＩＦＮ−βのペプチドマップは「ジャーナル オブ ファーマコロジー アンド エクスペリメンタル セラピューティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．）」、２９７（３）巻、１０５９頁、２００１年、記載の方法に従い実施した。未修飾のｒｈＩＦＮ−βと取得したＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＩＦＮ-βのＨＰＬＣデータを比較することで、ＰＥＧ鎖の導入位置を特定した。
（参考例１） ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の調製
配列番号１に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＧＣＳＦの２番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、および１７番目のシステインをセリンにそれぞれ置換したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、特公平７−９６５５８に記載の方法により取得した。
【００３４】
上記のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌Ｗ３１１０ｓｔｒＡ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＣｆＢＤ２８ ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７９）をＬＧ培地[バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、およびグルコース１ｇを水１Ｌに溶かし、水酸化ナトリウムでｐＨを７．０とする]で３７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍＬを２５μｇ／ｍＬのトリプトファンと５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．６％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．３％、塩化ナトリウム ０．５％、サガミノ酸 ０．５％、ＭｇＳＯ４ １ｍｍｏｌ／Ｌ、ビタミンＢ１ ４μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）１００ｍＬに接種し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアクリル酸（３β−ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍＬ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍで、１０分間遠心して集菌し、３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、および３０ｍｍｏｌ／Ｌトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍＬに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＣ ＰＯＷＥＲ ＣＯＭＰＡＮＹ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ ２００、ＯＵＴＰＵＴ ＣＯＮＴＲＯＬ ２）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
【００３５】
菌体残渣からマーストンらの方法[バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、第２巻、８００頁（１９８４年）]に準じ、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
（参考例２） ｒｈＩＦＮ−βの製造
ｒｈＩＦＮ−βは、水上ら[Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ、第８巻、６０５頁（１９８６年）]および久我ら[現代化学増刊１２：医学における遺伝子工学、１３５頁（１９８６年）、東京化学同人]の方法に従って製造した。
【００３６】
ｒｈＩＦＮ−βをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＭＧ−１を保有する大腸菌Ｋ−１２株をＬＧＴｒｐＡｐ培地（バクトトリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン５０ｍｇ／Ｌ、アンピシリン５０μｇ／Ｌ）でシード培養した。ｒｈＩＦＮ−βの生産には２Ｌジャー発酵槽でＭＣＧＡｐ培地（Ｍ９培地にカザミノ酸０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを添加）を用い、グルコース濃度を１％に、ｐＨを６．５に維持して数日間２０℃で培養した。なお、培養液は７５０ｒｐｍで振とうし、毎分１Ｌでエアレーションした。培養液から凍結融解法[ＤＮＡ、２巻、２６５頁（１９８３年）]で抽出液を調製した。さらに菌体残渣から特開６１−６９７９９に開示された方法に従ってｒｈＩＦＮ−βを得た。
【配列表フリーテキスト】
【００３７】
配列番号１−人工配列の説明：変異蛋白質
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルデヒド基を有する水溶性ポリマーと生理活性ポリペプチドを、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤の存在下反応させることを特徴とする水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生理活性ポリペプチドが特定の疾病に対する治療薬として有用であることが知られている。しかしながら、血中では、その不安定性のために十分な薬理効果が期待できない場合が多い。例えば、分子量約６０，０００以下のポリペプチドは、血中に投与されても腎臓の糸球体によりろ過され、大部分が尿中に排泄される。このため、満足行く治療効果が得られず、繰り返し投与が必要になる場合が多い。また、血中に存在する加水分解酵素などによっても分解され、その作用を失うこともある。外因性のポリペプチドや遺伝子組換えなどによって製造されたポリペプチドの場合は、内因性のポリペプチドと構造が異なるため、血中に投与された場合には免疫反応を誘発し、アナフィラキシーショックなどの重篤な副作用を起こす可能性のあることが知られている。さらに、生理活性ポリペプチドによってはそれが治療剤として用いられる際に、溶解性が悪いなどの物性が問題になることも多い。
【０００３】
生理活性ポリペプチドを治療剤として用いる場合のこれらの問題を解決する方法の一つとして、１分子以上の不活性型ポリマー鎖で生理活性ポリペプチドを化学的に修飾する方法が知られている。多くの場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール類でポリペプチドを化学的に修飾することによって、ポリペプチドに望ましい特性を付与することができる。
【０００４】
例えば、ポリオキシエチレングリコールで修飾されたスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）は、血中の半減期が著しく延長され、作用が持続すること知られている（ファーマシューティカル リサーチ コミュニケーション（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９巻、２８７頁、１９８７年）。また、ポリエチレングリコールで修飾した顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に関する報告もある（ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊ．ＢｉｏＣｈｅｍ．）、１１５巻、８１４頁、１９９４年）。さらに、アスパラギナーゼ、グルタミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ウロキナーゼなどのポリペプチドをポリエチレングリコールで修飾（ＰＥＧ化）した修飾ポリペプチドの例がまとめられている（ファーマシューティカル バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．）、３巻、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｐａｒｔ Ｂ、２３５頁、１９９２年）。また、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコールで修飾することで得られる効果として、熱安定性が高まること（生物物理、３８巻、２０８頁、１９９８年）、有機溶媒に可溶になること（バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．：ＢＢＲＣ）、１２２巻、８４５頁、１９８４年）などが知られている。
【０００５】
一方、ポリアルキレングリコールなどの水溶性ポリマーでポリペプチドを化学的に修飾する方法、即ち水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法としては、各種の方法が知られている。例えば、特許文献１には、ポリエチレングリコール分子を酵素と結合させる方法として、還元的アルキル化反応を用いる方法が記載されている。特許文献７には、還元剤として水素化ホウ素化ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的アルキル化反応を利用したリンホカインをアルデヒド基を有するポリエチレングリコールで化学修飾（ＰＥＧ化）したポリペプチドの製造方法が記載されている。特許文献８には、Ｇ−ＣＳＦ組成物およびコンセンサスインターフェロンのＮ末端に選択的にポリエチレングリコール分子を導入する方法として、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素化ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ酸トリメチルアミンおよびホウ酸ピリジンから選択される還元剤を用いた還元的アルキル化反応による製造方法が記載されている。さらに各種の製造方法が知られている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６）。
【０００６】
生理活性ポリペプチドとアルデヒド基を有する水溶性ポリマーを還元的アルキル化反応を利用して結合させる場合、該ポリペプチドや該水溶性ポリマーの性質を考慮すると、水中で、または水を含む溶媒中で反応を行うことが望ましい。上記で記載したように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた方法がよく知られているが、シアノ水素化ホウ素ナトリウムは強い毒性を有し、取り扱いが難しいこともよく知られている。
【０００７】
一方、水中で使用できる還元剤として、ピリジンボランが知られている。ピリジンボランは常温では液体（融点：１０−１１℃）で、様々な官能基を還元する緩和な還元剤である（Ｃ．Ｆ．Ｌａｎｅ，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９７３，６，５１−５８．）が、加熱条件など条件によっては不安定であることが知られている（Ｇ．Ｅ．Ｒｙｓｃｈｋｅｗｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｅ．Ｒ．Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６５，４，５７５−５７８．；Ｈ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｌ．Ｄｏｍａｓｈ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５６，７８，５３８４−５３８６；Ｒ．Ａ．Ｂａｌｄｗｉｎ ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｗａｓｈｂｕｒｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６１，２６，３５４９−３５５０．）。
【０００８】
特許文献９には、長期間安定に保存することができる還元剤として２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランが記載されている。これらの還元剤を用いた、イミン類からアミン類を得る方法や低分子化合物に関する還元的アルキル化反応も記載されている。
【特許文献１】米国特許第４００２５３１号
【特許文献２】ヨーロッパ特許第０５３９１６７号
【特許文献３】米国特許第４９０４５８４号
【特許文献４】ヨーロッパ特許第０４０１３８４号
【特許文献５】ヨーロッパ特許０４７３２６８号
【特許文献６】ヨーロッパ特許第０４４２７２４号
【特許文献７】ヨーロッパ特許第０１５４３１６号
【特許文献８】特開平１１−３１０６００号公報
【特許文献９】特開２００４−２５６５１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランから選ばれる還元剤を用いた還元的アルキル化反応による簡便な水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１） アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤の存在下反応させる工程を含む水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法。
（２） アルデヒド基を有する水溶性ポリマーの水溶性ポリマー部分が、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択されるポリマーである（１）記載の方法。
（３） 水溶性ポリマーがポリエチレングリコール類である（１）記載の方法。
（４） ２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤をアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを含む混合物に添加し、反応させる工程を含む（１）記載の方法。
（５） 還元剤が有機溶媒に溶解した２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤である（４）記載の方法。
（６） ポリペプチドが生理活性ポリペプチドである（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） ポリペプチドが、組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体または組換え型ヒトインターフェロン−β（ｒｈＩＦＮ−β）である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、生理活性ポリペプチドの活性を低下させることなく、好ましくは該ポリペプチドのＮ末端を選択的に水溶性ポリマーで修飾するための、水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法が提供される。該製造方法として、生理活性ポリペプチドとアルデヒド基を有する水溶性ポリマーを２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランから選ばれる還元剤の存在下反応させる簡便な製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法について説明する。
本発明の製造方法は、例えば（ｉ）アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを適当な溶媒に溶解する工程、（ｉｉ）２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランから選ばれる還元剤をアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを含む溶液に添加し、反応させる工程、（ｉｉｉ）得られた混合物を精製し水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドを単離する工程からなる。本発明の製造方法により、生理活性ポリペプチド分子に存在するアミノ基（例えばＮ末のα−アミノ基、リジン残基のε−アミノ基など）、好ましくはＮ末のα−アミノ基を水溶性ポリマーで修飾することができる。
（ｉ）アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを適当な溶媒に溶解する工程
本工程で用いられるアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとしては、水溶性ポリマー１分子にアルデヒド基が好ましくは１個存在する水溶性ポリマーであり、該アルデヒド基はアミノ基などと反応性を有していることが好ましい。アルデヒド基を有する水溶性ポリマーの水溶性ポリマー部分としては、分岐状または直鎖状の水溶性ポリマーであればいずれでもよいが、薬学的に許容されるものがより好ましい。例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリエチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールなどがあげられ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールなどが好ましく、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマーなどのポリアルキレングリコールがより好ましく、ポリエチレングリコールなどがさらに好ましい。該水溶性ポリマーの分子量は特に限定されないが、例えばポリアルキレングリコールの場合は、好ましくは約２，０００〜約２０，０００である。これらアルデヒド基を有する水溶性ポリマーは、市販品などとして得ることができる。
【００１３】
本工程で用いられるポリペプチドとしては、例えば生理活性ポリペプチドなどがあげられ、医薬品として用いられる生理活性ポリペプチドが好ましい。具体的には、例えば、アスパルギナーゼ、アモドキソビル（ＤＡＰＤ）、アンタイド、ベカプレルミン、カルシトニン、シアノビリン、デニロイキンジフチトックス、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯアゴニスト（例えば、約１０〜４０アミノ酸の長さで、ＷＯ９６／４０７４９に記載されているような特定のコア配列を含むペプチド）、ドルナーゼアルファ、造血刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）、凝固因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォンウィルブラント因子）、セレダーゼ、セレザイム、アルファ−グルコシダーゼ、コラーゲン、シクロスポリン、アルファデフェンシン、ベータデフェンシン、エキセジン−４、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アルファ−Ｉプロテイナーゼインヒビター、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、フィブリノゲン、フィルグラスチム、成長ホルモンヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ＧＲＯ−ベータ、ＧＲＯ−ベータ抗体、骨形成蛋白質（例えば、骨形成蛋白質−２、骨形成蛋白質−６、ＯＰ−１）、酸性繊維芽細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、ＣＤ−４０リガンド、ヘパリン、ヒト血清アルブミン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンオメガ、インターフェロンタウ、コンセンサスインターフェロン）、インターロイキンとインターロイキン受容体（例えば、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２、インターロイキン−２融合タンパク質、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−４受容体、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３受容体、インターロイキン−１７受容体）、ラクトフェリンとラクトフェリン断片、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、インスリン、プロインスリン、インスリン類似体（例えば、モノアシル化インスリン（米国特許第５，９２２，６７５号））、アミリン、Ｃ−ペプチド、ソマトスタチン、ソマトスタチン類似体（オクトレオチドを含む）、バソプレシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インフルエンザワクチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリントロピン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、およびテネテプラーゼ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、オスエオテゲリン、血小板由来増殖因子、組織増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−１、血管内皮増殖因子、白血病阻害因子、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、グリア増殖因子（ＧＧＦ）、Ｔ細胞受容体、ＣＤ分子／抗原、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、単球化学誘因タンパク質−１、内皮増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチド、ソマトトロピン、サイモシンアルファ１、サイモシンアルファ１ ＩＩｂ／ＩＩＩａインヒビター、サイモシンベータ１０、サイモシンベータ９、サイモシンベータ４、アルファ−１アンチトリプシン、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）化合物、ＶＬＡ−４（超後期抗原−４）、ＶＬＡ−４インヒビター、ビスホスホネート、ＲＳウイルス抗体、嚢胞性繊維症トランスメンブランレギュレーター（ＣＦＴＲ）遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、殺菌性／透過性上昇タンパク質（ＢＰＩ）、抗ＣＭＶ抗体、モノクローナル抗体などがあげられる。モノクローナル抗体としては、例えばエタネルセプト（ＩｇＧ１のＦｃ部分に結合したヒト７５ｋＤ ＴＮＦ受容体の細胞外リガンド結合部分からなるダイマー性融合タンパク質）、アブシキシマブ、アフェリオモマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、インフリキシマブ、イブリツモマブチウエキセタン、ミツモマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ヨウ素１３１トシツモマブ結合体、オリズマブ、リツキシマブ、トラツズマブ（ヘルセプチン）などがあげられる。より好ましくは、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）、組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体（例えば、配列番号１に示したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、組換え型ヒトインターフェロン−β（ｒｈＩＦＮ−β）などがあげられる。これら生理活性を有するポリペプチドは従来より公知の方法によって得ることができる。例えば組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体は、哺乳類動物から単離された形態であるか、または化学合成により得られたものであるか、またはゲノムまたはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成によって得られる外来性ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物の宿主発現による産物であってよい。適当な原核生物宿主には、種々の細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が包含され、適当な真核生物宿主には酵母（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）および哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）が包含される。使用する宿主に応じて、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体は、哺乳類またはその他の真核生物炭水化物によりグルコシル化されていてもよいし、またはグルコシル化されてなくてもよい。また、ＩＦＮ−βは、哺乳類動物から単離された形態であるか、または化学合成により得られたものであるか、またはゲノムまたはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成によって得られる外来性ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物の宿主発現による産物であってよい。適当な原核生物宿主には、種々の細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が包含され、適当な真核生物宿主には酵母（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）および哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）が包含される。使用する宿主に応じて、ＩＦＮ−β発現産物は、哺乳類またはその他の真核生物炭水化物によりグルコシル化されていてもよいし、またはグルコシル化されてなくてもよい。
【００１４】
本工程に使用する、アルデヒド基を有する水溶性ポリマーおよびポリペプチドの使用量の比率は、それぞれを溶解した場合の溶液中でのそれぞれのモル濃度に応じて適宜選択すればよい。一般に、最適な比率（未反応のポリペプチドまたはポリマーが過剰に存在しないという反応の効率の点で）は選択されたアルデヒド基を有する水溶性ポリマーの分子量によって決定される。またポリペプチド自身が含有するアミノ基の個数にもよる。
【００１５】
本工程で用いられる適当な溶媒としては、アルデヒド基を有する水溶性ポリマーおよびポリペプチドが溶解する溶液であれば特に限定されないが、好ましくは水または水を含む溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１，４−ジオキサン、アセトニトリルなどの有機溶媒と水との混合溶媒など）などがあげられる。また、溶液のｐＨを適宜調節できるようリン酸緩衝液などの各種緩衝液を用いることもできる。更に、塩化ナトリウムなどの塩類などを含有していても良い。次工程（ｉｉ）での反応を促進させるために、また後述するように、ポリペプチドのα−アミノ基のみが修飾されるよう、用いる溶媒のｐＨは適当な値を選択することが好ましい。
【００１６】
上記の溶媒は、上記のアルデヒド基を有する水溶性ポリマーと上記のポリペプチドが共に溶解する量を適宜選択し使用することができる。
アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを上記の溶媒に溶解させるためには、そのまま混合し撹拌することで溶解することもあるが、溶解し難い場合には、例えば混合液に超音波による振動を与えるか、基質が分解しない温度までの範囲で混合液を加熱することより溶解させることができる。
【００１７】
また、溶液のｐＨは、ポリペプチドのＮ末端のみに選択的な化学修飾が可能となるよう、好ましくはポリペプチド中のリジン残基のε−アミノ基とα−アミノ基のｐＫａの差を利用できるようなｐＨであることが好ましい。このような条件を選択することで、Ｎ末端へのポリマー結合の選択性を優位に増加することができる。従って、この目的のためには、本工程で用いられる溶媒は例えば緩衝液であることが好ましく、溶液に酸または塩基を加えて適切なｐＨに調整することができる。
（ｉｉ）２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランから選ばれる還元剤をアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを含む溶液に添加し、反応させる工程
本工程で用いられる２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランは、例えば市販品として得ることができる。用いる還元剤としては、２−ピコリンボランがより好ましい。
【００１８】
本工程の還元剤の添加方法は、上記（ｉ）で得られた溶液を撹拌しながら、−２０℃と６０℃の間の温度で、好ましくは０℃と１０℃の間の温度で、還元剤をそのまま添加するか、好ましくは還元剤を適当な量の溶媒に溶解または懸濁させゆっくり添加する。還元剤を溶解または懸濁させる溶媒としては、例えば水または有機溶媒、好ましくは有機溶媒があげられ、具体的には、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ＤＭＦ、ＤＭＡ、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ピリジンなどがあげられ、好ましくはＤＭＦなどがあげられる。
【００１９】
本工程における反応は、還元剤を添加した混合物を、好ましくは撹拌しながら、−２０℃と６０℃の間の温度で、好ましくは０℃と１０℃の間の温度で、５分間〜１００時間（好ましくは反応の進行が終了するまで）実施することが好ましい。
なお、反応の進行はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析などにより確認できる。
（ｉｉｉ）得られた混合物を精製し水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドを単離する工程
上記（ｉｉ）で得られた反応混合物を、通常ペプチド化学で用いられるよく知られた手法を用い精製することにより、該混合物中に存在する水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドを単離することができる。通常ペプチド化学で用いられるよく知られた手法としては、例えば、上記（ｉｉ）で得られた反応混合物をＣＭ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆカラムなど各種クロマトグラフィーに通塔する方法などがあげられる。
【００２０】
本発明において、調製された水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドは医薬品などとしての使用が可能である。
医薬品として使用する場合は、水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドをそのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物または人に使用されるものである。
【００２１】
本発明に係わる医薬製剤は、活性成分として水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドを単独で、または任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬学的に許容される一種またはそれ以上の担体（例えば、希釈剤、溶剤、賦形剤など）、および必要により例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸、リン酸のような緩衝成分、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、洗剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０のような可溶化剤、例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、例えばチメルソール、ベンジルアルコールのような保存料、増量剤などと一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００２２】
投与経路としては、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤などがあげられる。
経口投与に適当な、例えば錠剤などは、乳糖などの賦形剤、澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤などを用いて製造できる。
【００２３】
非経口投与に適当な、例えば注射剤などは、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合液などの希釈剤または溶剤などを用いて製造できる。
以下の実施例は本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＮ末端選択的ＰＥＧ化
参考例１で調整したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、これにｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体１モル当たり５モルのメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（日本油脂製，ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−２００ＡＬ，平均分子量 ２０ｋＤａ）を加え、溶解した。次に、１.０ｍｏｌ／Ｌに調製した２−ピコリンボランのＤＭＦ溶液を、上記で調整した溶液に、２−ピコリンボランの濃度が２０ｍＭになるよう添加し、４℃で２０時間反応させた。
【００２５】
反応終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行ったところ、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の８８．７％がＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体に変換されていることがわかった。
得られた反応混合物を濃縮フィルターデバイス（アミコンウルトラ−１５、１０，０００ ＭＷＣＯ、ミリポア社製）を用いて、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、精製前の反応液を回収した。
【００２６】
これをＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、カラムサイズの約５倍量の２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄し、５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液を０〜１００％の直線３００分勾配で目的物を溶出し、ＰＥＧ化されたｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を含む画分を分取した。分取した画分を濃縮フィルターデバイス（アミコンウルトラ−１５、１０，０００ ＭＷＣＯ、ミリポア社製）を用いて濃縮および５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に緩衝液交換し、１．８ｍｇ／ｍＬのＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体溶液を得た。
【００２７】
次に得られたＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分析試験を実施した。
（１）下記の条件で電気泳動試験を実施した。分子量約４０，０００の誘導体のみが得られたことを確認した。
（２）下記の条件でゲルろ過ＨＰＬＣ分析を実施した。１１．５２分のピークのみが得られ、未反応のｒｈＧ−ＣＳＦがないことを確認した。
（３）下記の条件でマトリックスアシステッドレーザーデソープション質量分析を実施した。分子量は３９，９６８．０であった。ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体にＰＥＧ鎖が１本だけ導入されていることがわかった。
（４）下記の条件で末端のポリペプチドシーケンシングを実施した。１残基目のメチオニンは確認できず、２残基目のアラニンから確認できた。Ｎ末端が選択的に修飾されていることがわかった。
【００２８】
以上（１）〜（４）の分析結果から、ＰＥＧ鎖がＮ末端に１本だけ導入されたことが証明できた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノールの存在下、以下の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
ゲル：ＰＡＧＥＬ ＳＰＧ ５２０Ｌ（アトー社製）
染色：ＲＡＰＩＤ ＳＴＡＩＮＴＭ （ナカライテスク社製）
分子量マーカー：Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオラッド社製）
＜ゲルろ過ＨＰＬＣ分析＞
以下の分析条件でゲルろ過ＨＰＬＣ分析を実施した。
移動相：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．７ｍＬ／分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
分離カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ−３０００ＳＷＸＬ （７．８×３００ｍｍ）（東ソー社製）
＜分子量測定＞
マトリックスアシステッドレーザーデソープション質量分析（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＡＳＳ）によって求めた。
＜Ｎ末端のＰＥＧ鎖導入確認＞
調製したＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の構造は、Ｎ末端のポリペプチドシーケンシングによって確認した。
【実施例２】
【００２９】
ｒｈＩＦＮ−βのＮ末端選択的ＰＥＧ化
参考例２で調整したｒｈＩＦＮ−βを６０％ エチレングリコールおよび１ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１．１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、これに、ｒｈＩＦＮ−β１モルあたり１０モルのメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（日本油脂製，ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−２００ＡＬ，平均分子量 ２０ｋＤａ）を加え、溶解した。
【００３０】
次に、１.０ｍｏｌ／Ｌに調製した２−ピコリンボランのＤＭＦ溶液を、上記で調整した溶液に、２−ピコリンボラン濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌになるよう添加し、４℃で７２時間反応させた。
反応終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行ったところ、Ｍｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＩＦＮ−βが選択的に生成していることが分かった。
【００３１】
得られた反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５ Ｍｅｄｉｕｍを含むＮＡＰ−５カラム（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて、２０％エチレングリコールを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に緩衝液交換し、精製前の反応液を回収した。
これをＣＭ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通塔し、カラムサイズの約４倍量の２０％エチレングリコールを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄し、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液を段階的に通塔させ目的画分を溶出し、ＰＥＧ化されたｒｈＩＦＮ−βを含む画分を分取した。分取した画分を濃縮フィルターデバイス（アミコンウルトラ−１５、１０，０００ ＭＷＣＯ、ミリポア社製）を用いて濃縮し、０．４ｍｇ／ｍＬのＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＩＦＮ−β誘導体溶液を得た。
【００３２】
次に得られたＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＩＦＮ−β誘導体の分析試験を実施した。
（１）下記の条件で電気泳動を実施した。分子量約４０，０００の誘導体のみが得られたことを確認した。
（２）下記の条件でペプチドマップを実施した。Ｎ末端選択的に修飾されていることを確認した。
【００３３】
以上の分析結果から、ＰＥＧ鎖がＮ末端に１本だけ導入されたことが証明できた。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノールの存在下、以下の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
ゲル：ＰＡＧＥＬ ＳＰＧ ５２０Ｌ（アトー社製）
染色：ＲＡＰＩＤ ＳＴＡＩＮＴＭ （ナカライテスク社製）
分子量マーカー：Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオラッド社製）
＜ペプチドマップ＞
ｒｈＩＦＮ−βのペプチドマップは「ジャーナル オブ ファーマコロジー アンド エクスペリメンタル セラピューティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．）」、２９７（３）巻、１０５９頁、２００１年、記載の方法に従い実施した。未修飾のｒｈＩＦＮ−βと取得したＭｏｎｏ−ＰＥＧ−ｒｈＩＦＮ-βのＨＰＬＣデータを比較することで、ＰＥＧ鎖の導入位置を特定した。
（参考例１） ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の調製
配列番号１に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＧＣＳＦの２番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、および１７番目のシステインをセリンにそれぞれ置換したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、特公平７−９６５５８に記載の方法により取得した。
【００３４】
上記のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌Ｗ３１１０ｓｔｒＡ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＣｆＢＤ２８ ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７９）をＬＧ培地[バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、およびグルコース１ｇを水１Ｌに溶かし、水酸化ナトリウムでｐＨを７．０とする]で３７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍＬを２５μｇ／ｍＬのトリプトファンと５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．６％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．３％、塩化ナトリウム ０．５％、サガミノ酸 ０．５％、ＭｇＳＯ４ １ｍｍｏｌ／Ｌ、ビタミンＢ１ ４μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）１００ｍＬに接種し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアクリル酸（３β−ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍＬ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍで、１０分間遠心して集菌し、３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、および３０ｍｍｏｌ／Ｌトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍＬに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＣ ＰＯＷＥＲ ＣＯＭＰＡＮＹ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ ２００、ＯＵＴＰＵＴ ＣＯＮＴＲＯＬ ２）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
【００３５】
菌体残渣からマーストンらの方法[バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、第２巻、８００頁（１９８４年）]に準じ、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
（参考例２） ｒｈＩＦＮ−βの製造
ｒｈＩＦＮ−βは、水上ら[Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ、第８巻、６０５頁（１９８６年）]および久我ら[現代化学増刊１２：医学における遺伝子工学、１３５頁（１９８６年）、東京化学同人]の方法に従って製造した。
【００３６】
ｒｈＩＦＮ−βをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＭＧ−１を保有する大腸菌Ｋ−１２株をＬＧＴｒｐＡｐ培地（バクトトリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン５０ｍｇ／Ｌ、アンピシリン５０μｇ／Ｌ）でシード培養した。ｒｈＩＦＮ−βの生産には２Ｌジャー発酵槽でＭＣＧＡｐ培地（Ｍ９培地にカザミノ酸０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを添加）を用い、グルコース濃度を１％に、ｐＨを６．５に維持して数日間２０℃で培養した。なお、培養液は７５０ｒｐｍで振とうし、毎分１Ｌでエアレーションした。培養液から凍結融解法[ＤＮＡ、２巻、２６５頁（１９８３年）]で抽出液を調製した。さらに菌体残渣から特開６１−６９７９９に開示された方法に従ってｒｈＩＦＮ−βを得た。
【配列表フリーテキスト】
【００３７】
配列番号１−人工配列の説明：変異蛋白質
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤の存在下反応させる工程を含む水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
アルデヒド基を有する水溶性ポリマーの水溶性ポリマー部分が、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択されるポリマーである請求項１記載の方法。
【請求項３】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコール類である請求項１記載の方法。
【請求項４】
２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤をアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを含む混合物に添加し、反応させる工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
還元剤が有機溶媒に溶解した２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤である請求項４記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが生理活性ポリペプチドである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドが、組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体または組換え型ヒトインターフェロン−β（ｒｈＩＦＮ−β）である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
アルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを、２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤の存在下反応させる工程を含む水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
アルデヒド基を有する水溶性ポリマーの水溶性ポリマー部分が、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択されるポリマーである請求項１記載の方法。
【請求項３】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコール類である請求項１記載の方法。
【請求項４】
２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤をアルデヒド基を有する水溶性ポリマーとポリペプチドを含む混合物に添加し、反応させる工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
還元剤が有機溶媒に溶解した２−ピコリンボランおよび３−ピコリンボランからなる群から選択される還元剤である請求項４記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが生理活性ポリペプチドである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドが、組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）誘導体または組換え型ヒトインターフェロン−β（ｒｈＩＦＮ−β）である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【公開番号】特開２００８−１５６２８３（Ｐ２００８−１５６２８３Ａ）
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３４７１８３（Ｐ２００６−３４７１８３）
【出願日】平成１８年１２月２５日（２００６．１２．２５）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２５日（２００６．１２．２５）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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