水素の生産方法
【課題】水素を安定して得ることができ、水素の生産効率に優れた水素の生産方法を提供する。
【解決手段】水素の生産方法は、Klebsiella oxytoca（微生物の受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６３８）に属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。Klebsiella oxytocaは、通性嫌気性菌である。また、水素発生用微生物群には硝化菌が含まれ、アンモニアが栄養源となる硝酸塩に変換される。さらに、原料有機物には、糖類が含まれていることが好ましい。そして、水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させる場合の条件としてｐＨ３．５〜６及び温度３０〜５０℃であることが好ましい。
【解決手段】水素の生産方法は、Klebsiella oxytoca（微生物の受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６３８）に属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。Klebsiella oxytocaは、通性嫌気性菌である。また、水素発生用微生物群には硝化菌が含まれ、アンモニアが栄養源となる硝酸塩に変換される。さらに、原料有機物には、糖類が含まれていることが好ましい。そして、水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させる場合の条件としてｐＨ３．５〜６及び温度３０〜５０℃であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な水素発生用微生物群により、例えば牛乳、野菜類、魚類、肉類、糞尿などの原料有機物を分解して水素を発生させる水素の生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
水素は燃焼によって水を生成し、地球温暖化の原因物質である二酸化炭素や一酸化炭素を生成しないため、次世代のエネルギーとして注目されている。係る水素を発生させる方法として、水の電気分解による方法が知られている。この方法では水の電気分解装置を使用し、水に導電性の塩類を添加し、陽極及び陰極間に所定の電圧を印加することにより行われる。しかしながら、水の電気分解装置は大掛かりで、費用が嵩むと共に、家庭から排出される廃棄物などの有効利用を図ることはできない。そのため、食品残渣や家畜の排泄物を利用し、微生物の作用で水素を生産する方法が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。この水素生産方法は、有機物を原料とし、複合嫌気性微生物群の存在下に、原料を嫌気条件下において７１〜７９℃に加熱し、水素発酵によって水素を発生させるものである。
【特許文献１】特開２００７−１５９５３４号公報（第２頁及び第３頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１に記載されている水素の生産方法では、水素発生のピークを示す７５℃付近まで加熱することにより、メタン生産菌などの水素を消費する水素資化細菌の活性を抑制しつつ水素の発生を促している。このため、加熱装置によって高温に加熱しなければならず、水素の生産効率が悪くなると共に、操作も面倒であるという問題があった。従って、加熱しなくても発生した水素が消費されず、水素が安定して得られ、水素の生産効率の良い生産方法が求められている。
【０００４】
本発明は、このような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものであり、その目的とするところは、水素を安定して得ることができ、水素の生産効率に優れた水素の生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の水素の生産方法は、Klebsiella oxytoca（微生物の受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６３８）に属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする。
【０００６】
請求項２に記載の水素の生産方法は、請求項１に係る発明において、前記Klebsiella oxytocaは、通性嫌気性菌であることを特徴とする。
請求項３に記載の水素の生産方法は、請求項１又は請求項２に係る発明において、
前記水素発生用微生物群には、硝化菌が含まれていることを特徴とする。
【０００７】
請求項４に記載の水素の生産方法は、請求項１から請求項３のいずれかに係る発明において、前記水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、ｐＨ３．５〜６の条件下に原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする。
【０００８】
請求項５に記載の水素の生産方法は、請求項１から請求項４のいずれか１項に係る発明において、前記水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、３０〜５０℃に加熱し、原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする。
【０００９】
請求項６に記載の水素の生産方法は、請求項１から請求項５のいずれか１項に係る発明において、前記原料有機物には、糖類が含まれていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、次のような効果を発揮することができる。
請求項１に係る発明の水素の生産方法では、Klebsiella oxytocaに属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。このため、原料有機物が水素発生用微生物群の特にKlebsiella oxytocaにより発酵処理されて分解され、その際に竹炭が触媒作用及びスクリーニング（選別）作用を発現し、水素が継続して発生するものと考えられる。従って、水素を安定して得ることができ、水素の生産効率に優れている。
【００１１】
請求項２に係る水素の生産方法では、Klebsiella oxytocaは通性嫌気性菌である。このため、請求項１に係る発明の効果に加えて、Klebsiella oxytocaが竹炭の嫌気性領域でその機能を十分に発揮することができると共に、竹炭の好気性領域でも生育することができる。
【００１２】
請求項３に係る水素の生産方法では、水素発生用微生物群には硝化菌が含まれている。このため、請求項１又は請求項２に係る発明の効果に加えて、特にアンモニアを硝酸塩に変換させることができ、水素発生用微生物群の栄養源を得ることができる。
【００１３】
請求項４に係る水素の生産方法では、水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、ｐＨ３．５〜６の条件下に原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。従って、請求項１から請求項３のいずれかに係る発明の効果に加えて、水素発生用微生物群を優先的に増殖させることができ、水素の発生を促進させることができる。
【００１４】
請求項５に係る水素の生産方法では、水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、３０〜５０℃に加熱し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。このため、請求項１から請求項４のいずれかに係る発明の効果に加えて、水素の生産に関与する代謝物である酢酸及び酪酸の生成量を増大させることができ、ひいては水素の発生量を増大させることができる。
【００１５】
請求項６に係る水素の生産方法では、原料有機物には糖類が含まれている。このため、請求項１から請求項５のいずれかに係る発明の効果に加えて、水素発生に繋がる酢酸、酪酸等を生成させることができ、水素発生量を増大させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の最良と思われる実施形態について詳細に説明する。
本実施形態における水素の生産方法は、Klebsiella oxytocaに属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着（固定化）させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。水素発生用微生物群は、Klebsiella oxytocaを主たる微生物とし、さらに硝化菌（独立栄養菌）等の微生物を含む微生物群を意味する。この新規なKlebsiella oxytocaは、平成２０年８月２５日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている（微生物の受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６３８）。
【００１７】
ここで、Klebsiella oxytocaの性質（特性）について説明する。
(1)グラム陰性桿菌（大きさ：０．４７μｍ×２．６２μｍ）、(2)通性嫌気性菌、(3)窒素固定菌、(4)胞子形成：なし、(5)運動性：なし、(6)β−ガラクトシターゼ：＋、(7)アルギニンジヒドロラーゼ：−、(8)リジデンカルボキシラーゼ：−、(9)クエン酸利用：＋、(10)Ｈ２Ｓ産生：−、(11)ウレアーゼ：−、(12)トリプトファンデアミナーゼ：−、(13)インドール産出：−、(14)アセトイン産出：−、(15)ゼラチナーゼ：＋、(16)オキシダーゼテスト：−、(17)ＮＯ２産生：＋
Klebsiella oxytocaは上記のようにグラム陰性桿菌であり、係る桿菌は個々の細胞の形状が細長い棒状又は円筒状を示す細菌であり、一般に短径が０．２〜１μｍ、長径が１〜５μｍ程度で、短径と長径の比率は１．５〜５倍程度のものである。
【００１８】
Klebsiella oxytocaはまた通性嫌気性菌であり、係る通性嫌気性菌は嫌気性条件下すなわち竹炭の細孔内部で下式（ｉ）及び（ii）に示すように水素を発生する機能を発現すると共に、好気性条件下においても生育できるものである。
【００１９】
２Ｈ＋＋２ｅ−＋４ＡＴＰ → Ｈ２＋４ＡＤＰ＋４Ｐｉ・・・（ｉ）
但し、ＡＴＰは原料有機物に基づくアデノシン三リン酸、ＡＤＰはアデノシン二リン酸及びＰｉはリン酸を表す。
【００２０】
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋２Ｈ２Ｏ → ２ＣＨ３ＣＯＯＨ＋４Ｈ２＋４ＣＯ２・・・（ii）
但し、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６は糖類としてのグルコース、ＣＨ３ＣＯＯＨは酢酸を表す。
Klebsiella oxytocaはさらに窒素固定菌であり、該窒素固定菌は空気中の窒素（Ｎ２）を下式（iii）に示すようにアンモニア（ＮＨ３）に変換する機能を発現する。
【００２１】
Ｎ２＋６Ｈ＋＋６ｅ−＋１２ＡＴＰ→２ＮＨ３＋１２ＡＤＰ＋１２Ｐｉ・・・（iii）
また、硝化菌は好気性雰囲気下でアンモニアを、亜硝酸塩を経て硝酸塩に変換する機能を発現する。
【００２２】
一方、竹炭は多数の貫通孔よりなる細孔を有しているものと考えられ、細孔の内部は嫌気性領域であり、細孔の表面側は好気性領域である。そのため、前記Klebsiella oxytocaは竹炭の細孔の内部でその機能を発揮することができ、硝化菌は竹炭の細孔の表面側でその機能を発揮することができる。硝化菌によって生成するリン酸塩は水素発生用微生物群の栄養源となっている。また、竹炭は微細な細孔を多く有することがメタン発酵菌の固定化を防ぎ、水素発生用微生物のみを優先的に増殖させることができる。さらに、竹炭は多数の細孔により吸着性能を有しており、アンモニア等の成分を吸着して臭気の発生を抑制する。なお、水素発生用微生物群には、発生した水素を消費するメタン発酵菌等は存在しないものと考えられる。
【００２３】
水素を生産する場合、具体的には腐敗（加水分解）菌を含む竹炭に、腐敗生成物を発酵する微生物（発酵用微生物）を含有させる操作を複数回行った後、屋外に放置し、その後還元（嫌気）作用を有する微生物を加えて竹炭に定着させることにより水素発生用微生物群を調製する。得られた水素発生用微生物群を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させることにより行われる。この生産方法によれば、腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物によって得られる水素発生用微生物群の機能に基づいて、原料有機物が腐敗及び発酵され、さらに分解され、十分な水素（Ｈ２）ガスが発生すると同時に、発生した水素ガスが消費されることなく保持される。水素発生用微生物群は、前述のように複数の微生物により構成され、これら複数の微生物の機能が相俟って作用し、水素の発生が進行する。
【００２４】
原料有機物としては、ほうれん草、キャベツ、レタス等の野菜類、さば（鯖）、さんま（秋刀魚）等の魚類、豚肉、牛肉、鶏肉等の肉類、味噌、醤油等の調味料などの食品の調理屑や食べ残し屑、牛乳、ジュース等の食品などが挙げられる。そのような原料有機物は、一般家庭や飲食店において大量に作られ、飲食されず排出された食品廃棄物である。さらに、原料有機物として、生物の糞尿、河川や海のヘドロ、家庭からの雑排水等も挙げられる。
【００２５】
係る原料有機物には、炭水化物、タンパク質、脂質（油脂類）などの有機物が含まれている。炭水化物は、糖類をはじめとし、その類似構造を有する有機化合物である。基本的にはＣｎ（Ｈ２Ｏ）ｍで表される一般式を有している。タンパク質は、複数個のアミノ酸がカルボキシル基とアミノ基との間でペプチド結合を形成し、直鎖状に連なった構造を有している。脂質は脂肪酸とグリセリンのエステルなどで構成されている。
【００２６】
前記竹炭は多孔質物質で、主に腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物を担持する機能（微生物固定化担体としての機能）を有すると共に、原料有機物を分解、還元する際の触媒作用及びスクリーニング作用を示し、かつ原料有機物やアンモニア、アミン類、メタン類等を吸着する性質を有している。この竹炭は、破竹、真竹、モウソウ竹などの竹類を例えば６００〜８００℃に加熱して完全燃焼させ、炭化させることにより得られる。多孔質物質としての竹炭に、同じく多孔質物質としての木炭を混合して用いることができる。係る木炭は、ブナ、カシ、クヌギなどの木材、スギ、ヒノキなどの間伐材を竹炭と同様の条件で炭化させることにより得られる。これらの竹炭又は木炭は、平均粒子径が通常１０μｍ〜１０ｍｍ程度の粉末又は粒状として使用される。竹炭又は木炭の平均粒子径が１０μｍ未満の場合には竹炭又は木炭の製造が難しくなり、１０ｍｍを超える場合には原料有機物に対する竹炭又は木炭の分散性が低下するため好ましくない。
【００２７】
竹炭は木炭などよりも多孔性である傾向が強いが、それらの微細孔の直径は概ね１μｍ〜１００μｍ程度であり、係る微細孔は通常貫通孔である。竹炭の微細孔が貫通孔であることにより、該微細孔へ腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物が容易に出入りすることができると共に、原料有機物の分解物等も容易に出入りすることができる。しかも、その微細孔は大きさの異なるものが分布しており、腐敗菌、発酵用微生物、還元作用を有する微生物及び原料有機物の分解物等の大きさに対応しており、それらが微細孔へ出入り可能であり、水素発生用微生物群の機能がより一層効果的に発揮される。微細孔の直径が１μｍ未満の場合には微細孔に腐敗菌、発酵用微生物、還元作用を有する微生物や原料有機物の分解物等が出入りしにくくなり、一方１００μｍを超える場合には微細孔が大きくなって水素発生用微生物群の能力が発現しにくくなると共に、微細孔の数が少なくなって水素発生の効率が低下する。
【００２８】
このように水素発生用微生物群はその多くが竹炭の微細な細孔内に固定化されると共に、他の微生物の固定化が抑制され、優先的に増殖することができるものと推測され、水素発生の増大を図ることができる。なお、活性炭等の多孔質物質は細孔が内部まで分布し、貫通していないことから、水素発生用微生物群の機能が十分に発現されず、さらに他の微生物が固定化されるため不適当である。
【００２９】
続いて、腐敗菌は原料有機物を腐敗させるもので、主に竹炭の微細孔の嫌気性雰囲気下で原料有機物を腐敗（加水分解）させる機能を発揮するものである。腐敗菌は多孔質の竹炭の微細孔内に増殖しているものであることが好ましく、表面積の大きい竹炭の微細孔内で腐敗菌の働きを向上させることができる。係る腐敗菌は、竹炭を微粉末にして大気中に放置することにより多孔質の竹炭の微細孔内に増殖（発生）させることができ、増殖する腐敗菌は通常日和見菌（日和菌）である。なお、腐敗菌は、菌に応じた条件下に培養して竹炭の微細孔内に増殖させることもできる。
【００３０】
腐敗菌はいわゆる悪玉菌であり、主にタンパク質を分解してアミン化合物、アンモニア、インドール、フェノールなどの腐敗生成物を生成する。この腐敗生成物は悪臭（腐敗臭）の原因物質となる。腐敗菌としては、日和見菌のほか大腸菌、ブドウ球菌、ウェルシュ菌等が挙げられる。
【００３１】
次に、発酵用微生物は、原料有機物又は前記腐敗菌によって生成した腐敗生成物をさらに発酵させて分解する機能を発揮するものである。発酵用微生物は、約１０族８０種の有効微生物群を含み、それらを複合培養したもの（有用微生物群）である。この発酵用微生物は、光合成微生物、乳酸菌、窒素固定菌（アゾトバクタ）、菌根菌、放射菌及び酵母菌に分けられる。これらのうち、光合成微生物は嫌気性及び好気性のいずれも存在するほか、乳酸菌は嫌気性で機能する。そのほかの窒素固定菌（アゾトバクタ）、菌根菌、放射菌及び酵母菌は、いずれも好気性である。乳酸菌には、ビフィズス菌等が含まれる。有用微生物群としては、乳酸菌、光合成細菌、酵母菌、放射菌及び糸状菌を含有するものが、それらの微生物による相乗的効果を発揮することができる点から好ましい。
【００３２】
発酵用微生物としては、嫌気性の発酵用微生物及び好気性の発酵用微生物のいずれでも良い。竹炭の内部はそれらの置かれる雰囲気などの条件によって嫌気性又は好気性のいずれにもなり得ることから、嫌気性の発酵用微生物及び好気性の発酵用微生物のいずれもその機能を発揮することができる。但し、竹炭の微細孔内では嫌気性雰囲気になる傾向が強いため、発酵用微生物が原料有機物の発酵を促進させるべく、嫌気性の発酵用微生物であることが好ましい。前記光合成微生物として、代表的には光合成細菌類とラン藻類とが挙げられる。この光合成微生物の作用により、嫌気性雰囲気下で有機物が分解され、発生したメタンなどがさらに分解される。また、乳酸菌は嫌気性雰囲気下で原料有機物を分解して乳酸関連物質を生成し、その乳酸関連物質をさらに分解する。発酵用微生物による原料有機物の発酵及び分解は、直接的には発酵用微生物が分泌する炭水化物分解酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素等の酵素群の機能に基づいている。
【００３３】
前述のように腐敗菌は竹炭に簡単に増殖させることができ、それに発酵用微生物を加えることにより、竹炭に発酵用微生物を含有（増殖）させることができる。この操作は、発酵用微生物を竹炭の微細孔に十分に増殖させるために複数回行うことが必要であり、２〜６回行うことが好ましい。この操作を行う期間は特に制限されないが、例えば１〜２ヶ月である。
【００３４】
腐敗菌が増殖した竹炭と発酵用微生物との混合割合は、質量比で１：１〜１：２程度が好ましい。この質量比が１：１未満の場合には、腐敗菌の働きに比べて発酵用微生物の働きが不足し、腐敗菌によって生成した腐敗生成物が十分に分解されない傾向を示す。一方、質量比が１：２を超える場合には、発酵用微生物に比べて腐敗菌の割合が少なくなり、腐敗菌の機能が不足して原料有機物の分解速度が遅くなる傾向を示す。
【００３５】
次いで、還元作用を有する微生物は、代表的には前記発酵用微生物に対し自然界に存在する腐葉土を加えて得られるものである。自然界に存在する腐葉土には多種多様な微生物が含まれ、それらの微生物が竹炭の微細孔に保持されることにより、原料有機物の分解及び還元を促進させることができる。還元作用を有する微生物には多種多様な微生物が含まれているため、微生物の働きは複雑な発酵、改質、分解、還元などの過程を経て進行するものと考えられる。このように、雑多な微生物が混在する微生物群を利用することにより、単一な微生物を用いるよりも微生物の複合的な働きを得ることができると共に、雑菌混入があってもその影響を抑えることができる。
【００３６】
水素発生用微生物群は、前述のように腐敗菌を含む竹炭に発酵用微生物を含有させる操作を複数回行った後、屋外に放置し、その後還元作用を有する微生物を竹炭に定着させることにより得られるものである。屋外に放置する期間は６ヶ月から１年間であることが好ましい。この場合、竹炭に対して腐敗菌及び発酵用微生物を十分に定着させることができる。前記還元作用を有する微生物を、腐敗菌及び発酵用微生物が増殖した竹炭に対し、例えば５〜８回程度繰返し混合することにより、還元作用を有する微生物を竹炭に定着させることができる。このようにして、竹炭に腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物を定着させた水素発生用微生物群を得ることができる。すなわち、水素発生用微生物群は、Klebsiella oxytocaを主たる微生物とし、さらに硝化菌等の微生物を含む微生物群である。
【００３７】
この水素発生用微生物群が原料有機物に加えられると、竹炭の細孔の内部ではKlebsiella oxytocaがその機能を発現し、原料有機物が分解されて水素が発生する。同時に、Klebsiella oxytocaによって空気中の窒素がアンモニアに変換されて固定化される。一方、竹炭の細孔の表面側では硝化菌がその機能を発現し、アンモニアがリン酸塩に変換され、生成したリン酸塩が水素発生用微生物群の栄養源となる。発生した水素は、メタン生産菌等の水素資化細菌などの微生物によって消費されることなく存在することができる。
【００３８】
水素を発生させる場合、好ましくは３０〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃、特に好ましくは３５〜４０℃の温度に加熱する。加熱することにより、水素発生用微生物群の機能を高めることができ、原料有機物の分解を促進させることができ、短時間のうちに水素を発生させることができる。加熱温度が３０℃未満ではこのような促進効果が得られない場合があり、５０℃を超えると水素発生用微生物群による水素発生作用が向上せず、かえって熱エネルギーの無駄になって好ましくない。
【００３９】
また、水素を発生させる際のｐＨは、好ましくは３．５〜６、より好ましくは４〜６である。ｐＨが３．５を下回る場合又は６を上回る場合には、水素発生用微生物群の働きが低下し、水素ガスの発生量が減少する傾向を示して好ましくない。
【００４０】
水素の生産方法において、前記水素発生用微生物群と、原料有機物とに加え、さらに還元作用を有する微生物を混合することにより、原料有機物の種類や状態にもよるが、その分解を促すことができる。その場合、速やかに水素を発生させることができると共に、水素の発生量を増大させ、安定した状態で水素を得ることができる。ここで、水素発生用微生物群を用いて水素を生産するに当たり、微生物の餌となる糖蜜、甘蔗糖、精製糖等の糖類（原料有機物）などを混合し、水素発生用微生物群の働きを促して水素の生産量を増加させるように構成することもできる。また、水素発生用微生物群は、一旦生成させるとそれを種菌として継続培養することができる。例えば、水素発生用微生物群を竹炭に加え、常温で放置することにより培養を行うことができる。
【００４１】
具体的には、グルコース（ブドウ糖）又はラクトース（乳糖）の培地（嫌気性培地）に、前記水素発生用微生物群が固定化された竹炭を投入し、３０〜５０℃に加熱して発酵させることにより、培養液中に水素発生に関与する酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）及び酪酸（Ｃ３Ｈ７ＣＯＯＨ）が代謝生成物として生成する。代謝生成物としては、その他乳酸（Ｃ２Ｈ４（ＯＨ）ＣＯＯＨ）、エタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）、コハク酸（Ｃ２Ｈ４（ＣＯＯＨ）２）、プロピオン酸（Ｃ２Ｈ５ＣＯＯＨ）等が生成する。ここで、基質としてラクトースを使用した場合の発酵時における反応（代謝反応）を以下に示す。
【００４２】
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋５Ｈ２Ｏ → ４ＣＨ３ＣＯＯＨ＋４ＣＯ２＋８Ｈ２・・・（１）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋Ｈ２Ｏ → ２Ｃ３Ｈ７ＣＯＯＨ＋４ＣＯ２＋４Ｈ２・・・（２）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋Ｈ２Ｏ → ４Ｃ２Ｈ４（ＯＨ）ＣＯＯＨ・・・（３）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋Ｈ２Ｏ → ４Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋４ＣＯ２・・・（４）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋４ＣＯ２＋４Ｈ２ → ４Ｃ２Ｈ４（ＣＯＯＨ）２＋３Ｈ２Ｏ・・・（５）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋４Ｈ２ → ４Ｃ２Ｈ５ＣＯＯＨ＋３Ｈ２Ｏ・・・（６）
上記のように、代謝生成物が酢酸である場合には反応式（１）に示すように酢酸の２倍モルの水素が発生し、代謝生成物が酪酸である場合にも反応式（２）に示すように酪酸の２倍モルの水素が発生する。また、代謝生成物が乳酸及びエタノールである場合には、反応式（３）及び（４）に示すように水素は発生しない。さらに、代謝生成物がコハク酸及びプロピオン酸の場合には、反応式（５）及び（６）に示すように水素を消費（資化）する。
【００４３】
さて、水素を生産する場合には、日和見菌等の腐敗菌を含む竹炭を調製し、そこに前記有用微生物群等の発酵用微生物を含有させる操作を複数回繰り返す。それを例えば６ヶ月間屋外に放置し、その間例えば前記有用微生物群に自然界に存在する腐葉土を加えて得られる還元作用をもつ微生物を加え、竹炭に定着させる。このような手順により、水素発生用微生物群が調製される。
【００４４】
そして、得られた水素発生用微生物群を、食品残渣や糞尿等の原料有機物に混合することにより、水素発生用微生物群のもつ腐敗作用、発酵作用、続いて分解作用、竹炭のもつ触媒作用、スクリーニング作用などに基づいて、原料有機物が腐敗及び発酵され、その後分解され、水素（Ｈ２）、窒素（Ｎ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）などのガスが発生する。発生ガス中の水素の含有量は生成条件によって異なるが、例えば２５〜４０体積％に達する。
【００４５】
この場合、水素発生用微生物群の作用が有効に働くと同時に、多孔質の竹炭中の微細孔はその表面積が大きく、かつ貫通孔であることから水素発生用微生物群が竹炭の微細孔に容易に出入りすることができてその機能を十分に発現することができ、原料有機物の分解が円滑に進行する。従って、未分解のアンモニア（ＮＨ３）、メタン（ＣＨ４）などのガスは発生しない。
【００４６】
以上の実施形態によって発揮される効果について、以下にまとめて記載する。
・ 本実施形態の水素の生産方法では、Klebsiella oxytocaに属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。このため、原料有機物が水素発生用微生物群の特にKlebsiella oxytocaにより発酵処理されて分解され、その際に竹炭が触媒作用及びスクリーニング作用を発現し、水素が継続して発生するものと考えられる。従って、多量の水素を安定して得ることができ、水素の生産効率に優れている。さらに、水素発生速度が高く、水素収率も高い。
【００４７】
・ 前記Klebsiella oxytocaは通性嫌気性菌であることから、Klebsiella oxytocaが竹炭の嫌気性領域でその機能を十分に発揮することができると共に、竹炭の好気性領域でも生育することができる。
【００４８】
・ 水素発生用微生物群に硝化菌が含まれていることにより、特にアンモニアを硝酸塩に変換させることができ、水素発生用微生物群の栄養源を得ることができる。この場合、アンモニア臭の発生を抑制することができる。
【００４９】
・ 水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、ｐＨ３．５〜６の条件下に原料有機物を分解させて水素を発生させることにより、水素発生用微生物群を優先的に増殖させることができ、水素の発生を促進させることができる。
【００５０】
・ 水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、３０〜５０℃に加熱し、原料有機物を分解させて水素を発生させることにより、水素の生産に関与する代謝物である酢酸及び酪酸の生成量を増大させることができ、ひいては水素の発生量を増大させることができ、短時間で多量の水素を得ることができる。
【００５１】
・ 原料有機物にはグルコース、ラクトース等の糖類が含まれていることにより、水素発生に繋がる酢酸、酪酸等を生成させることができ、水素発生量を増大させることができる。
【実施例】
【００５２】
以下に、実施例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
水素発生用微生物群を次のような手順で操作して調製した。まず、竹炭として、破竹、真竹などの雑竹を６００〜８００℃に加熱して完全燃焼させ、炭化して得られた１０μｍ〜５ｍｍの微粉炭を用意した。この竹炭を大気中に１日放置し、腐敗菌としての日和見菌を多孔質の竹炭の微細孔内に増殖させた。一方、嫌気性の発酵用微生物として、下記に示す有用微生物群（Effective Microorganisms）を用意した。そして、前記竹炭５０ｇに発酵用微生物を７０ｍｌ（約７０ｇ）混合した。
【００５３】
有用微生物群
微生物類型 主要種
１．乳酸菌 Lactobacillus plantarum(ATCC8014)
Lactobacillus casei(ATCC7469)
Streptococcus Lactis(IFO12007)
２．光合成細菌 Rhotdopseudomonas plaustris(ATTC17001)
Rhodobacter sphaeroides(ATTC17023)
３．酵母菌 Saccharomyces cerevisiae(IFO0203)
Candida utilis(IFO0619)
４．放射菌 Steptomyces albus(ATCC3004)
Steptomyces griseus(IFO3358)
５．糸状菌 Aspergillus oryzae(IFO5770)
Mucor hiemalis(IFO8567)
６．その他 自然界に存在する有用菌群で、混合培養の過程で参画するも
ので、ｐＨ３．５以下で生存しうる有用微生物である。
【００５４】
続いて、１０日に１回（すなわち１ヶ月に３回）、発酵用微生物を７０ｍｌずつ追加した。その後、これを６ヶ月間屋外に放置した。これにより、竹炭が風雨に晒され、空気中に浮遊する微生物が竹炭の微細孔内に侵入し、定着した。さらに、次の６ヶ月の間に、前記発酵用微生物に自然に存在する腐葉土を加えて得られた土着有用微生物を繰返し添加した。このような手順を経て水素発生用微生物群を調製した。
【００５５】
次に、上記の水素発生用微生物群５００ｇ、原料有機物としての牛乳３００ｍｌ及び前記土着有用微生物２００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れて撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、２ヶ月間放置した。そして、ペットボトル内に発生したガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が２５．４体積％発生し、メタンは０．１体積％であった。前記水素発生用微生物群により、原料有機物である牛乳に含まれる特にタンパク質（アミノ酸がペプチド結合した高分子）が分解され、得られた分解生成物（窒素と水素の化合物）がさらに水素分と窒素分に分解されたものと推測される。
（実施例２）
前記実施例１と同様にして、前記水素発生用微生物群５００ｇ、原料有機物としての牛乳３００ｍｌ及び土着有用微生物２００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れて撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、１ヶ月間放置した。そして、ペットボトル内に発生したガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が３１．３体積％発生した。
（実施例３）
前記実施例１同様にして、前記水素発生用微生物群５００ｇ、原料有機物としての牛乳３００ｍｌ及び土着有用微生物２００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れて撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、放置したところ、翌日にはガスが発生した。発生したガスを水の中を通してペットボトルに回収した。発生したガスは３日間で約２Ｌであった。得られたガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が３８．７体積％、二酸化炭素１４．２体積％、窒素４０．８体積％及び酸素（アルゴンを含む）５．０体積％であった。
（実施例４）
前記実施例１の水素発生用微生物群５００ｇ及び原料有機物としての牛乳３００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れ、温度を４０℃に設定し、撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、放置したところ、数時間後にはガスが発生した。発生したガスを１Ｌ容器に回収した。発生したガスは３日間で約３Ｌであった。得られたガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が３９．６体積％であった。この実施例４では、土着有用微生物を追加しなかったが、温度を４０℃に上昇させたため、水素発生用微生物群と原料有機物の混合後、数時間で水素が発生した。
（実施例５）
前記実施例１の水素発生用微生物群５００ｇ、原料有機物としての尿３００ｍｌ及び土着有用微生物３００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れ、温度を４０℃に設定し、撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、放置したところ、数時間後にはガスが発生した。発生したガスを１Ｌ容器に回収した。発生したガスは３日間で約４Ｌであった。得られたガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が３３．５体積％、二酸化炭素２７．２体積％、窒素３０．３体積％及び酸素（アルゴンを含む）６．８体積％であった。なお、４日目に新しい尿を注入したところ、再び水素を発生した。この実施例５においても、温度を４０℃に上昇させたため、水素発生用微生物群と原料有機物の混合後、数時間で水素が発生した。原料有機物としての尿は、予め体内で腐敗、発酵処理され、窒素化合物、水素化合物等が生成されているため、水素発生の効率が良いものと考えられる。
（実施例６）
実施例１の水素発生用微生物群が固定化された竹炭１．０ｇを、試験管内の下記に示す嫌気性培地（ＹＮＵ嫌気性培地）１５ｍＬに投入し、発酵温度を３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃及び７０℃に変化させて発酵させ、水素ガスを発生させた。そして、培養後における培地の基質残渣濃度から分解率を算出すると共に、生成した酢酸及び酪酸の濃度から水素生産量を求め、基質量で除することにより水素収率を算出した。酢酸、酪酸等の成分分析は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により行った。
【００５６】
ＹＮＵ嫌気性培地の組成：
基質としてグルコース（glucose）又はラクトース（lactose）１０ｇ／Ｌ、カザミノ酸１０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、チオグリコール酸０．３ｇ／Ｌ及びＬ−システイン０．３ｇ／Ｌ。
【００５７】
そして、発酵開始から１９時間後及び４８時間後における温度（℃）と基質及び代謝物の濃度（mmol/L）との関係、温度（℃）と基質の分解率（％−ｍｏｌ）及びガス発生量（ｍｌ）との関係、温度（℃）と基質の分解率（％−ｍｏｌ）及び水素の収率（mol-H2/mol-glucose）との関係を、図１〜図８に示した。図１〜図４は嫌気性培地の基質がグルコースである場合、図５〜図８は嫌気性培地の基質がラクトースである場合を示す。また、図１及び図２は１９時間後の状態、図３及び図４は４８時間後の状態を示す。さらに、図５及び図６は１９時間後の状態、図７及び図８は４８時間後の状態を示す。
【００５８】
図１に示すように、基質としてグルコースを用いた場合には１９時間後に３０〜３５℃で水素が発生しないエタノール代謝が見られた。図２に示すように、４０℃では基質の分解率が１００％に達すると共に、発生した水素ガス発生量は８ｍＬ近くに達した。図３に示すように、４８時間後においても３０℃ではエタノール代謝が見られた。図４に示すように、４０℃では基質の分解率が１００％に達すると共に、発生した水素ガスの収率は２．５mol-H2/mol-glucose近くに達した。
【００５９】
また、図５に示すように、基質としてラクトースを用いた場合には、１９時間後にエタノール代謝は見られず、４０℃で水素発生に大きく寄与する酢酸が最も多量に生成し、次いで水素発生に寄与する酪酸が多量に生成した。図６に示すように、４０℃では基質の分解率が８０％に達すると共に、発生した水素ガス発生量は９ｍＬ近くに達した。図７に示すように、基質がラクトースの場合には４８時間後にもエタノール代謝は見られず、４０℃で水素発生に大きく寄与する酢酸が最も多量に生成し、３０℃では水素発生に寄与する酪酸が最も多量に生成した。図８に示すように、３０℃では基質の分解率が１００％に達すると共に、４０℃では発生した水素ガスの収率が４．５mol-H2/mol-lactose近くに達した。
【００６０】
これらの結果より、発酵時の温度は３０〜４５℃が好ましく、３５〜４０℃がさらに好ましいことが明らかになった。また、嫌気性培地の基質としては、グルコースよりもラクトースが好ましい結果であった。
（実施例７）
内容量１．０Ｌの培養容器を使用し、ラクトース及び牛乳を基質として半回分試験を行った。すなわち、２４時間毎に培養液の１／３程度を新しい培地に更新して発酵を半連続的に行った。実施例６で使用したＹＮＵ嫌気性培地に、ラクトース１０ｇ／Ｌ又は牛乳２５０ｍＬの３倍希釈液を基質とし（培養液体積７５０ｍＬ）、該培養液に前記水素発生用微生物群を固定化した竹炭５０ｇを添加し、２日間の発酵試験を行った。発酵条件を温度４０℃、ｐＨ６．０及び撹拌速度７５ｒｐｍで一定とした。そして、基質としてラクトースを用いた場合及び牛乳を用いた場合について、発酵時間（ｈ）と代謝物濃度（mmol/L）及び水素収率（mol-H2/mol-substrate）との関係を求めた。基質としてラクトースを用いた場合の結果を図９に示し、基質として牛乳を用いた場合の結果を図１０に示した。
【００６１】
図９及び図１０に示したように、基質がラクトース及び牛乳のいずれの場合にも酢酸及び酪酸の生成量が多いことから、水素発酵が良好に進行していることが明らかになった。また、基質として特に牛乳を用いた場合には、培地を更新した後に乳酸の生成量が増大したが、エタノールの生成量は少ない結果であった。最大水素収率は、基質がラクトースである場合には４．１７mol-H2/mol-substrateであり、基質が牛乳である場合には３．９９mol-H2/mol-milkであって、十分な水素収率が得られた。また、最大水素発生速度は、基質がラクトースである場合には０．９３L-H2/h/Lであり、基質が牛乳である場合には０．８９L-H2/h/Lであった。
（実施例８〜１５）
１Ｌの三角フラスコに基質としてスキムミルク〔森永乳業（株）製、ドライミルクはぐくみ、ＶＳ（volatile solid）／ＴＳ（total solid）＝０．９７〕及び前記水素発生用微生物群を含む竹炭を投入し、全量が１Ｌとなるように水を加えて調整した。そして、三角フラスコを密閉した後、水温を調整した３６℃のウォーターバス内に設置し、スターラーで撹拌を行った。ここで、実施例８〜１１ではスキムミルクの投入量を８０ｇとし、水素発生用微生物群を含む竹炭の投入量を変化させた。すなわち、竹炭の投入量を、実施例８では３５０ｇ、実施例９では２５０ｇ、実施例１０では１５０ｇ及び実施例１１では５０ｇとした。そして、経過日数（日）と水素発生量（ｍＬ）との関係及び経過日数（日）とｐＨとの関係を求めた。水素ガスの濃度は、ガスクロマトグラフ〔（株）島津製作所製、ＧＣ１４Ｂ、検出器ＴＣＤ、キャリアガスはアルゴン、カラムは信和化工（株）製、SHINCARBON ST、直径３ｍｍ、長さ２ｍ〕にて測定した。経過日数（日）とガス発生量（ｍＬ）との関係を図１１に示し、経過日数（日）とｐＨとの関係を図１２に示した。
【００６２】
図１１に示すように、２日目までは水素ガスの発生は急激に増大したが、３日目以降は水素ガスの発生は緩やかになった。また、竹炭が多くなるほど水素ガスの発生が継続し、総水素ガス発生量も多い結果となった。図１２に示すように、ｐＨは経過日数と共に低下する傾向を示した。さらに、竹炭が最も少ない実施例１１の場合にｐＨが最も低下したので、４日後にｐＨを６近く上昇させるように調整したが、ｐＨは急に低下し、水素ガス発生量の増加にはつながらなかった。竹炭量が最も多い実施例８では、ｐＨ低下が比較的緩やかであり、そのことが水素ガス発生量の増大につながったものと考えられる。
【００６３】
また、実施例１２〜１５では、竹炭の投入量を２５０ｇとし、スキムミルクの投入量を実施例１２では２０ｇ、実施例１３では４０ｇ、実施例１４では８０ｇ及び実施例１５では１２０ｇとした。そして、経過日数（日）とガス発生量（ｍＬ）との関係（図１３）、経過日数（日）とｐＨとの関係（図１４）及び１１日後における基質投入量（ｇ／Ｌ）とガス発生量（ｍＬ）との関係（図１５）を求めた。
【００６４】
図１３及び図１５に示すように、スキムミルクの投入量が多いほど水素ガスの発生量が多くなる結果が得られた。図１４に示すように、スキムミルクの投入量が多いほどｐＨの低下が進む傾向が見られた。
【００６５】
次に、実施例８、実施例１３及び実施例１４において、発生したガス（Ｈ２、Ｎ２、ＣＨ４及びＣＯ２）の成分分析を行った。その結果を表１に示した。
【００６６】
【表１】
表１に示した結果より、水素ガスの濃度は発生ガス中に２０〜２９％であった。なお、メタン（ＣＨ４）及びアンモニア（ＮＨ３）の発生は認められなかった。
【００６７】
また、実施例８及び１４について、基質の投入量に対する水素ガスの発生量を求めた。すなわち、実施例８では基質であるスキムミルクの投入量が８０ｇ、ガス発生量が４．３７Ｌで水素ガス含有量が２０％であるため水素ガス発生量は０．８７Ｌであることから、基質の投入量に対する水素ガスの発生量は１０．９ｍＬ／ｇであった。実施例１４では基質であるスキムミルクの投入量が８０ｇ、ガス発生量が３．５５Ｌで水素ガス含有量が２９％であるため水素ガス発生量は１．０３Ｌであることから、基質の投入量に対する水素ガスの発生量は１２．９ｍＬ／ｇであった。
（実施例１６、１７及び比較例１、２）
前記実施例８〜１５において、基質としてのスキムミルク、竹炭及び微生物培養液を次のように配合し、全量を水で０．９Ｌとした。実施例１６ではスキムミルク７２ｇ及び竹炭２２５ｇ、実施例１７ではスキムミルク７２ｇ、竹炭２２５ｇ及び微生物培養液２７０ｇとし、比較例１では竹炭２２５ｇのみ及び比較例２ではスキムミルク７２ｇ及び微生物培養液２７０ｇとした。そして、経過日数（日）とガス発生量（ｍＬ）との関係及び経過日数（日）とｐＨとの関係を求め、それぞれ図１６及び１７に示した。さらに、発生したガス（Ｈ２、Ｏ２、Ｎ２、ＣＨ４及びＣＯ２）の成分分析を行った。その結果を表２に示した。
【００６８】
【表２】
表２に示した結果より、実施例１６及び１７では水素発生用微生物群を含む竹炭を用いたことから、発生した水素ガス濃度は３９〜４６％に達した。その一方、比較例１では基質としてのスキムミルクが含まれていなかったため、ガスの発生は見られなかった。また、比較例２では竹炭が含まれていなかったことから、発生した水素ガスの濃度が低い結果であった。
（実施例１８〜２１）
前記実施例１６、１７において、基質としてのスキムミルクを７２ｇとし、竹炭の投入量を変化させ、全量を水で０．９Ｌとした。竹炭の投入量は、実施例１８では３１５ｇ、実施例１９では２２５ｇ、実施例２０では１３５ｇ及び実施例２１では４５ｇとした。また、培養温度を４０℃に設定した。そして、経過日数（日）とガス発生量（ｍＬ）との関係及び経過日数（日）とｐＨとの関係を求め、それぞれ図１８及び１９に示した。さらに、発生したガス（Ｈ２、Ｏ２、Ｎ２、ＣＨ４、ＣＯ２及びＮＨ３）の成分分析を行った。その結果を表３に示した。
【００６９】
【表３】
表３に示した結果より、実施例１８〜２１では基質としてスキムミルク及び水素発生用微生物群を含む竹炭を所定量使用し、温度を４０℃に上昇させたことから、発生したガス中の水素ガス濃度を３８．３〜５６．２％に高めることができた。この場合、竹炭の投入量が最も多い３１５ｇの場合（実施例１８）よりも竹炭の投入量が少ない場合（実施例１９〜２１）の方が発生したガス中の水素ガス濃度が高くなる結果が得られた。
（実施例２２）
実施例６及び７で用いた水素発生用微生物群が定着された竹炭を種々の培地に植菌した。そして、４０℃、２４時間培養後に形成されたコロニーから白金耳にて菌を採取し、様々な寒天培地に植菌した。これを常温にて好気性雰囲気及び嫌気性雰囲気にて培養したところ、いずれの場合にもコロニーの形成が見られた。従って、このコロニーは通性嫌気性菌であることが判明した。さらに、単離菌を電子顕微鏡で観察すると、小さな桿菌（グラム陰性桿菌）であった。そして、ＡＰＩ２０Ｅにより、単離菌の簡易同定を行った。その結果、尿素を分解する菌ではないこと、グルコースやラクトースだけではなく、マンニトールやセロビオース（セルロース由来の二糖）を分解するなど多種のバイオマスを分解する菌であることが推察できた。
【００７０】
続いて、形成された単一コロニーを培地に植え継ぎ、単離菌を増殖させた。増殖時にガスを生成し、酢酸及び酪酸が代謝産物として確認されたことから、この単離菌は水素発生用微生物であることがわかった。
【００７１】
次に、１６ＳｒＮＡ遺伝子解析により、単離菌の系統解析を行った結果、単離菌はKlebsiella oxytocaに属する新規な微生物であることが明らかになった。
なお、前記実施形態を次のように変更して実施することも可能である。
【００７２】
・ 腐敗菌を含む竹炭に発酵用微生物を含有させる操作を複数回行う際に、腐敗菌を含む竹炭を追加することもできる。
・ 還元作用を有する微生物を竹炭に定着させる際に、湿度や温度を調整して定着速度を速くするように構成することもできる。
【００７３】
・ 多孔質物質として竹炭に加えて、珪藻土等を配合することもできる。
・ 腐敗菌を含む竹炭に発酵用微生物を含有させる操作を、酸素を除去した嫌気性雰囲気下、或いは不活性ガス雰囲気下に行い、腐敗処理及び発酵処理の処理効率を向上させることも可能である。
【００７４】
・ 腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物としては、嫌気性の微生物であることが好ましいが、好気性の微生物が含まれていても差し支えない。
・ 水素の発生を促進させるために、嫌気性微生物等の種菌を併用することも可能である。
【００７５】
・ 水素発生用微生物群として、前記方法とは異なる方法で得られた桿菌、連鎖桿菌等を加えたものを使用することも可能である。
さらに、前記実施形態より把握される技術的思想について以下に記載する。
【００７６】
(1) 前記Klebsiella oxytocaは、窒素固定菌であることを特徴とする請求項１に記載の水素の生産方法。このように構成した場合、請求項１に係る発明の効果に加えて、空気中の窒素をアンモニアとして容易に固定化することができる。
【００７７】
(2) 前記糖類はグルコース又はラクトースであり、代謝生成物として酢酸又は酪酸が生成されるように構成されていることを特徴とする請求項６に記載の水素の生産方法。このように構成した場合、請求項６に係る発明の効果に加えて、酢酸又は酪酸の生成によって水素の発生量を増大させることができる。
【００７８】
(3) 腐敗菌を含む竹炭に、腐敗生成物を発酵する微生物を含有させる操作を複数回行った後、屋外に放置し、その後還元作用を有する微生物を竹炭に定着させることにより得られる水素発生用微生物群と、原料有機物とを混合し、原料有機物を分解及び還元させて水素を発生させることを特徴とする水素の生産方法。このように構成した場合、原料有機物が腐敗菌及び発酵用微生物により腐敗、発酵処理され、腐敗、発酵処理生成物が還元作用を有する微生物によって分解及び還元され、その際に竹炭が触媒作用を発現し、水素が継続して発生するものと考えられる。従って、水素を安定して得ることができ、水素の生産効率に優れている。
【００７９】
(4) 前記腐敗菌は、竹炭を微粉末にして放置することにより多孔質の竹炭の微細孔内に増殖する日和見菌であることを特徴とする上記技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。このように構成した場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、簡単な操作で腐敗菌を竹炭内に保持させることができる。
【００８０】
(5) 前記腐敗生成物を発酵する微生物は、乳酸菌、光合成細菌、酵母菌、放射菌及び糸状菌を含有する微生物群であることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合には、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、多孔質の竹炭の微細孔内で嫌気性雰囲気下において、発酵用微生物が原料有機物の発酵を促進させることができる。
【００８１】
(6) 前記還元作用を有する微生物は、自然の状態で存在する腐葉土中に含まれる微生物であることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合には、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、有効な還元作用を発現できる有用微生物により、水素の発生効率を向上させることができる。
【００８２】
(7) 前記水素発生用微生物群と、原料有機物と、さらに還元作用を有する微生物とを混合し、原料有機物を分解及び還元させて水素を発生させることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、追加される還元作用を有する微生物により還元作用がさらに高められ、一層安定した状態で水素を得ることができる。
【００８３】
(8) 前記屋外に放置する期間は６ヶ月から１年間であることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。このように構成した場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、竹炭に対して腐敗菌及び発酵用微生物を十分に定着させることができる。
【００８４】
(9) 前記腐敗菌を含む竹炭に発酵用微生物を含有させる操作を２〜６回行うことを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、竹炭に発酵用微生物を十分に定着させることができる。
【００８５】
(10) 前記腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物は、多孔質の竹炭の微細孔内で増殖していることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、表面積の大きい竹炭の微細孔内で腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物の効果を著しく向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】実施例６で基質としてグルコースを用いた場合において、１９時間後の温度と培養後の基質及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図２】実施例６で基質としてグルコースを用いた場合において、１９時間後の温度とガス発生量及び分解率との関係を示すグラフ。
【図３】実施例６で基質としてグルコースを用いた場合において、４８時間後の温度と培養後の基質及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図４】実施例６で基質としてグルコースを用いた場合において、４８時間後の温度と水素の収率及び分解率との関係を示すグラフ。
【図５】実施例６で基質としてラクトースを用いた場合において、１９時間後の温度と培養後の基質及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図６】実施例６で基質としてラクトースを用いた場合において、１９時間後の温度とガス発生量及び分解率との関係を示すグラフ。
【図７】実施例６で基質としてラクトースを用いた場合において、１９時間後の温度と培養後の基質及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図８】実施例６で基質としてラクトースを用いた場合において、１９時間後の温度とガス発生量及び分解率との関係を示すグラフ。
【図９】実施例７で基質としてラクトースを用いた場合において、発酵時間と水素収率及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図１０】実施例７で基質として牛乳を用いた場合において、発酵時間と水素収率及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図１１】実施例８〜１１において、経過日数とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１２】実施例８〜１１において、経過日数とｐＨとの関係を示すグラフ。
【図１３】実施例１２〜１５において、経過日数とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１４】実施例１２〜１５において、経過日数とｐＨとの関係を示すグラフ。
【図１５】実施例１２〜１５において、基質投入量とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１６】実施例１６、１７及び比較例１、２において、経過日数とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１７】実施例１６、１７及び比較例１、２において、経過日数とｐＨとの関係を示すグラフ。
【図１８】実施例１８〜２１において、経過日数とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１９】実施例１８〜２１において、経過日数とｐＨとの関係を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な水素発生用微生物群により、例えば牛乳、野菜類、魚類、肉類、糞尿などの原料有機物を分解して水素を発生させる水素の生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
水素は燃焼によって水を生成し、地球温暖化の原因物質である二酸化炭素や一酸化炭素を生成しないため、次世代のエネルギーとして注目されている。係る水素を発生させる方法として、水の電気分解による方法が知られている。この方法では水の電気分解装置を使用し、水に導電性の塩類を添加し、陽極及び陰極間に所定の電圧を印加することにより行われる。しかしながら、水の電気分解装置は大掛かりで、費用が嵩むと共に、家庭から排出される廃棄物などの有効利用を図ることはできない。そのため、食品残渣や家畜の排泄物を利用し、微生物の作用で水素を生産する方法が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。この水素生産方法は、有機物を原料とし、複合嫌気性微生物群の存在下に、原料を嫌気条件下において７１〜７９℃に加熱し、水素発酵によって水素を発生させるものである。
【特許文献１】特開２００７−１５９５３４号公報（第２頁及び第３頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１に記載されている水素の生産方法では、水素発生のピークを示す７５℃付近まで加熱することにより、メタン生産菌などの水素を消費する水素資化細菌の活性を抑制しつつ水素の発生を促している。このため、加熱装置によって高温に加熱しなければならず、水素の生産効率が悪くなると共に、操作も面倒であるという問題があった。従って、加熱しなくても発生した水素が消費されず、水素が安定して得られ、水素の生産効率の良い生産方法が求められている。
【０００４】
本発明は、このような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものであり、その目的とするところは、水素を安定して得ることができ、水素の生産効率に優れた水素の生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の水素の生産方法は、Klebsiella oxytoca（微生物の受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６３８）に属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする。
【０００６】
請求項２に記載の水素の生産方法は、請求項１に係る発明において、前記Klebsiella oxytocaは、通性嫌気性菌であることを特徴とする。
請求項３に記載の水素の生産方法は、請求項１又は請求項２に係る発明において、
前記水素発生用微生物群には、硝化菌が含まれていることを特徴とする。
【０００７】
請求項４に記載の水素の生産方法は、請求項１から請求項３のいずれかに係る発明において、前記水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、ｐＨ３．５〜６の条件下に原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする。
【０００８】
請求項５に記載の水素の生産方法は、請求項１から請求項４のいずれか１項に係る発明において、前記水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、３０〜５０℃に加熱し、原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする。
【０００９】
請求項６に記載の水素の生産方法は、請求項１から請求項５のいずれか１項に係る発明において、前記原料有機物には、糖類が含まれていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、次のような効果を発揮することができる。
請求項１に係る発明の水素の生産方法では、Klebsiella oxytocaに属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。このため、原料有機物が水素発生用微生物群の特にKlebsiella oxytocaにより発酵処理されて分解され、その際に竹炭が触媒作用及びスクリーニング（選別）作用を発現し、水素が継続して発生するものと考えられる。従って、水素を安定して得ることができ、水素の生産効率に優れている。
【００１１】
請求項２に係る水素の生産方法では、Klebsiella oxytocaは通性嫌気性菌である。このため、請求項１に係る発明の効果に加えて、Klebsiella oxytocaが竹炭の嫌気性領域でその機能を十分に発揮することができると共に、竹炭の好気性領域でも生育することができる。
【００１２】
請求項３に係る水素の生産方法では、水素発生用微生物群には硝化菌が含まれている。このため、請求項１又は請求項２に係る発明の効果に加えて、特にアンモニアを硝酸塩に変換させることができ、水素発生用微生物群の栄養源を得ることができる。
【００１３】
請求項４に係る水素の生産方法では、水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、ｐＨ３．５〜６の条件下に原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。従って、請求項１から請求項３のいずれかに係る発明の効果に加えて、水素発生用微生物群を優先的に増殖させることができ、水素の発生を促進させることができる。
【００１４】
請求項５に係る水素の生産方法では、水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、３０〜５０℃に加熱し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。このため、請求項１から請求項４のいずれかに係る発明の効果に加えて、水素の生産に関与する代謝物である酢酸及び酪酸の生成量を増大させることができ、ひいては水素の発生量を増大させることができる。
【００１５】
請求項６に係る水素の生産方法では、原料有機物には糖類が含まれている。このため、請求項１から請求項５のいずれかに係る発明の効果に加えて、水素発生に繋がる酢酸、酪酸等を生成させることができ、水素発生量を増大させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の最良と思われる実施形態について詳細に説明する。
本実施形態における水素の生産方法は、Klebsiella oxytocaに属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着（固定化）させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。水素発生用微生物群は、Klebsiella oxytocaを主たる微生物とし、さらに硝化菌（独立栄養菌）等の微生物を含む微生物群を意味する。この新規なKlebsiella oxytocaは、平成２０年８月２５日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている（微生物の受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６３８）。
【００１７】
ここで、Klebsiella oxytocaの性質（特性）について説明する。
(1)グラム陰性桿菌（大きさ：０．４７μｍ×２．６２μｍ）、(2)通性嫌気性菌、(3)窒素固定菌、(4)胞子形成：なし、(5)運動性：なし、(6)β−ガラクトシターゼ：＋、(7)アルギニンジヒドロラーゼ：−、(8)リジデンカルボキシラーゼ：−、(9)クエン酸利用：＋、(10)Ｈ２Ｓ産生：−、(11)ウレアーゼ：−、(12)トリプトファンデアミナーゼ：−、(13)インドール産出：−、(14)アセトイン産出：−、(15)ゼラチナーゼ：＋、(16)オキシダーゼテスト：−、(17)ＮＯ２産生：＋
Klebsiella oxytocaは上記のようにグラム陰性桿菌であり、係る桿菌は個々の細胞の形状が細長い棒状又は円筒状を示す細菌であり、一般に短径が０．２〜１μｍ、長径が１〜５μｍ程度で、短径と長径の比率は１．５〜５倍程度のものである。
【００１８】
Klebsiella oxytocaはまた通性嫌気性菌であり、係る通性嫌気性菌は嫌気性条件下すなわち竹炭の細孔内部で下式（ｉ）及び（ii）に示すように水素を発生する機能を発現すると共に、好気性条件下においても生育できるものである。
【００１９】
２Ｈ＋＋２ｅ−＋４ＡＴＰ → Ｈ２＋４ＡＤＰ＋４Ｐｉ・・・（ｉ）
但し、ＡＴＰは原料有機物に基づくアデノシン三リン酸、ＡＤＰはアデノシン二リン酸及びＰｉはリン酸を表す。
【００２０】
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋２Ｈ２Ｏ → ２ＣＨ３ＣＯＯＨ＋４Ｈ２＋４ＣＯ２・・・（ii）
但し、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６は糖類としてのグルコース、ＣＨ３ＣＯＯＨは酢酸を表す。
Klebsiella oxytocaはさらに窒素固定菌であり、該窒素固定菌は空気中の窒素（Ｎ２）を下式（iii）に示すようにアンモニア（ＮＨ３）に変換する機能を発現する。
【００２１】
Ｎ２＋６Ｈ＋＋６ｅ−＋１２ＡＴＰ→２ＮＨ３＋１２ＡＤＰ＋１２Ｐｉ・・・（iii）
また、硝化菌は好気性雰囲気下でアンモニアを、亜硝酸塩を経て硝酸塩に変換する機能を発現する。
【００２２】
一方、竹炭は多数の貫通孔よりなる細孔を有しているものと考えられ、細孔の内部は嫌気性領域であり、細孔の表面側は好気性領域である。そのため、前記Klebsiella oxytocaは竹炭の細孔の内部でその機能を発揮することができ、硝化菌は竹炭の細孔の表面側でその機能を発揮することができる。硝化菌によって生成するリン酸塩は水素発生用微生物群の栄養源となっている。また、竹炭は微細な細孔を多く有することがメタン発酵菌の固定化を防ぎ、水素発生用微生物のみを優先的に増殖させることができる。さらに、竹炭は多数の細孔により吸着性能を有しており、アンモニア等の成分を吸着して臭気の発生を抑制する。なお、水素発生用微生物群には、発生した水素を消費するメタン発酵菌等は存在しないものと考えられる。
【００２３】
水素を生産する場合、具体的には腐敗（加水分解）菌を含む竹炭に、腐敗生成物を発酵する微生物（発酵用微生物）を含有させる操作を複数回行った後、屋外に放置し、その後還元（嫌気）作用を有する微生物を加えて竹炭に定着させることにより水素発生用微生物群を調製する。得られた水素発生用微生物群を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させることにより行われる。この生産方法によれば、腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物によって得られる水素発生用微生物群の機能に基づいて、原料有機物が腐敗及び発酵され、さらに分解され、十分な水素（Ｈ２）ガスが発生すると同時に、発生した水素ガスが消費されることなく保持される。水素発生用微生物群は、前述のように複数の微生物により構成され、これら複数の微生物の機能が相俟って作用し、水素の発生が進行する。
【００２４】
原料有機物としては、ほうれん草、キャベツ、レタス等の野菜類、さば（鯖）、さんま（秋刀魚）等の魚類、豚肉、牛肉、鶏肉等の肉類、味噌、醤油等の調味料などの食品の調理屑や食べ残し屑、牛乳、ジュース等の食品などが挙げられる。そのような原料有機物は、一般家庭や飲食店において大量に作られ、飲食されず排出された食品廃棄物である。さらに、原料有機物として、生物の糞尿、河川や海のヘドロ、家庭からの雑排水等も挙げられる。
【００２５】
係る原料有機物には、炭水化物、タンパク質、脂質（油脂類）などの有機物が含まれている。炭水化物は、糖類をはじめとし、その類似構造を有する有機化合物である。基本的にはＣｎ（Ｈ２Ｏ）ｍで表される一般式を有している。タンパク質は、複数個のアミノ酸がカルボキシル基とアミノ基との間でペプチド結合を形成し、直鎖状に連なった構造を有している。脂質は脂肪酸とグリセリンのエステルなどで構成されている。
【００２６】
前記竹炭は多孔質物質で、主に腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物を担持する機能（微生物固定化担体としての機能）を有すると共に、原料有機物を分解、還元する際の触媒作用及びスクリーニング作用を示し、かつ原料有機物やアンモニア、アミン類、メタン類等を吸着する性質を有している。この竹炭は、破竹、真竹、モウソウ竹などの竹類を例えば６００〜８００℃に加熱して完全燃焼させ、炭化させることにより得られる。多孔質物質としての竹炭に、同じく多孔質物質としての木炭を混合して用いることができる。係る木炭は、ブナ、カシ、クヌギなどの木材、スギ、ヒノキなどの間伐材を竹炭と同様の条件で炭化させることにより得られる。これらの竹炭又は木炭は、平均粒子径が通常１０μｍ〜１０ｍｍ程度の粉末又は粒状として使用される。竹炭又は木炭の平均粒子径が１０μｍ未満の場合には竹炭又は木炭の製造が難しくなり、１０ｍｍを超える場合には原料有機物に対する竹炭又は木炭の分散性が低下するため好ましくない。
【００２７】
竹炭は木炭などよりも多孔性である傾向が強いが、それらの微細孔の直径は概ね１μｍ〜１００μｍ程度であり、係る微細孔は通常貫通孔である。竹炭の微細孔が貫通孔であることにより、該微細孔へ腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物が容易に出入りすることができると共に、原料有機物の分解物等も容易に出入りすることができる。しかも、その微細孔は大きさの異なるものが分布しており、腐敗菌、発酵用微生物、還元作用を有する微生物及び原料有機物の分解物等の大きさに対応しており、それらが微細孔へ出入り可能であり、水素発生用微生物群の機能がより一層効果的に発揮される。微細孔の直径が１μｍ未満の場合には微細孔に腐敗菌、発酵用微生物、還元作用を有する微生物や原料有機物の分解物等が出入りしにくくなり、一方１００μｍを超える場合には微細孔が大きくなって水素発生用微生物群の能力が発現しにくくなると共に、微細孔の数が少なくなって水素発生の効率が低下する。
【００２８】
このように水素発生用微生物群はその多くが竹炭の微細な細孔内に固定化されると共に、他の微生物の固定化が抑制され、優先的に増殖することができるものと推測され、水素発生の増大を図ることができる。なお、活性炭等の多孔質物質は細孔が内部まで分布し、貫通していないことから、水素発生用微生物群の機能が十分に発現されず、さらに他の微生物が固定化されるため不適当である。
【００２９】
続いて、腐敗菌は原料有機物を腐敗させるもので、主に竹炭の微細孔の嫌気性雰囲気下で原料有機物を腐敗（加水分解）させる機能を発揮するものである。腐敗菌は多孔質の竹炭の微細孔内に増殖しているものであることが好ましく、表面積の大きい竹炭の微細孔内で腐敗菌の働きを向上させることができる。係る腐敗菌は、竹炭を微粉末にして大気中に放置することにより多孔質の竹炭の微細孔内に増殖（発生）させることができ、増殖する腐敗菌は通常日和見菌（日和菌）である。なお、腐敗菌は、菌に応じた条件下に培養して竹炭の微細孔内に増殖させることもできる。
【００３０】
腐敗菌はいわゆる悪玉菌であり、主にタンパク質を分解してアミン化合物、アンモニア、インドール、フェノールなどの腐敗生成物を生成する。この腐敗生成物は悪臭（腐敗臭）の原因物質となる。腐敗菌としては、日和見菌のほか大腸菌、ブドウ球菌、ウェルシュ菌等が挙げられる。
【００３１】
次に、発酵用微生物は、原料有機物又は前記腐敗菌によって生成した腐敗生成物をさらに発酵させて分解する機能を発揮するものである。発酵用微生物は、約１０族８０種の有効微生物群を含み、それらを複合培養したもの（有用微生物群）である。この発酵用微生物は、光合成微生物、乳酸菌、窒素固定菌（アゾトバクタ）、菌根菌、放射菌及び酵母菌に分けられる。これらのうち、光合成微生物は嫌気性及び好気性のいずれも存在するほか、乳酸菌は嫌気性で機能する。そのほかの窒素固定菌（アゾトバクタ）、菌根菌、放射菌及び酵母菌は、いずれも好気性である。乳酸菌には、ビフィズス菌等が含まれる。有用微生物群としては、乳酸菌、光合成細菌、酵母菌、放射菌及び糸状菌を含有するものが、それらの微生物による相乗的効果を発揮することができる点から好ましい。
【００３２】
発酵用微生物としては、嫌気性の発酵用微生物及び好気性の発酵用微生物のいずれでも良い。竹炭の内部はそれらの置かれる雰囲気などの条件によって嫌気性又は好気性のいずれにもなり得ることから、嫌気性の発酵用微生物及び好気性の発酵用微生物のいずれもその機能を発揮することができる。但し、竹炭の微細孔内では嫌気性雰囲気になる傾向が強いため、発酵用微生物が原料有機物の発酵を促進させるべく、嫌気性の発酵用微生物であることが好ましい。前記光合成微生物として、代表的には光合成細菌類とラン藻類とが挙げられる。この光合成微生物の作用により、嫌気性雰囲気下で有機物が分解され、発生したメタンなどがさらに分解される。また、乳酸菌は嫌気性雰囲気下で原料有機物を分解して乳酸関連物質を生成し、その乳酸関連物質をさらに分解する。発酵用微生物による原料有機物の発酵及び分解は、直接的には発酵用微生物が分泌する炭水化物分解酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素等の酵素群の機能に基づいている。
【００３３】
前述のように腐敗菌は竹炭に簡単に増殖させることができ、それに発酵用微生物を加えることにより、竹炭に発酵用微生物を含有（増殖）させることができる。この操作は、発酵用微生物を竹炭の微細孔に十分に増殖させるために複数回行うことが必要であり、２〜６回行うことが好ましい。この操作を行う期間は特に制限されないが、例えば１〜２ヶ月である。
【００３４】
腐敗菌が増殖した竹炭と発酵用微生物との混合割合は、質量比で１：１〜１：２程度が好ましい。この質量比が１：１未満の場合には、腐敗菌の働きに比べて発酵用微生物の働きが不足し、腐敗菌によって生成した腐敗生成物が十分に分解されない傾向を示す。一方、質量比が１：２を超える場合には、発酵用微生物に比べて腐敗菌の割合が少なくなり、腐敗菌の機能が不足して原料有機物の分解速度が遅くなる傾向を示す。
【００３５】
次いで、還元作用を有する微生物は、代表的には前記発酵用微生物に対し自然界に存在する腐葉土を加えて得られるものである。自然界に存在する腐葉土には多種多様な微生物が含まれ、それらの微生物が竹炭の微細孔に保持されることにより、原料有機物の分解及び還元を促進させることができる。還元作用を有する微生物には多種多様な微生物が含まれているため、微生物の働きは複雑な発酵、改質、分解、還元などの過程を経て進行するものと考えられる。このように、雑多な微生物が混在する微生物群を利用することにより、単一な微生物を用いるよりも微生物の複合的な働きを得ることができると共に、雑菌混入があってもその影響を抑えることができる。
【００３６】
水素発生用微生物群は、前述のように腐敗菌を含む竹炭に発酵用微生物を含有させる操作を複数回行った後、屋外に放置し、その後還元作用を有する微生物を竹炭に定着させることにより得られるものである。屋外に放置する期間は６ヶ月から１年間であることが好ましい。この場合、竹炭に対して腐敗菌及び発酵用微生物を十分に定着させることができる。前記還元作用を有する微生物を、腐敗菌及び発酵用微生物が増殖した竹炭に対し、例えば５〜８回程度繰返し混合することにより、還元作用を有する微生物を竹炭に定着させることができる。このようにして、竹炭に腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物を定着させた水素発生用微生物群を得ることができる。すなわち、水素発生用微生物群は、Klebsiella oxytocaを主たる微生物とし、さらに硝化菌等の微生物を含む微生物群である。
【００３７】
この水素発生用微生物群が原料有機物に加えられると、竹炭の細孔の内部ではKlebsiella oxytocaがその機能を発現し、原料有機物が分解されて水素が発生する。同時に、Klebsiella oxytocaによって空気中の窒素がアンモニアに変換されて固定化される。一方、竹炭の細孔の表面側では硝化菌がその機能を発現し、アンモニアがリン酸塩に変換され、生成したリン酸塩が水素発生用微生物群の栄養源となる。発生した水素は、メタン生産菌等の水素資化細菌などの微生物によって消費されることなく存在することができる。
【００３８】
水素を発生させる場合、好ましくは３０〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃、特に好ましくは３５〜４０℃の温度に加熱する。加熱することにより、水素発生用微生物群の機能を高めることができ、原料有機物の分解を促進させることができ、短時間のうちに水素を発生させることができる。加熱温度が３０℃未満ではこのような促進効果が得られない場合があり、５０℃を超えると水素発生用微生物群による水素発生作用が向上せず、かえって熱エネルギーの無駄になって好ましくない。
【００３９】
また、水素を発生させる際のｐＨは、好ましくは３．５〜６、より好ましくは４〜６である。ｐＨが３．５を下回る場合又は６を上回る場合には、水素発生用微生物群の働きが低下し、水素ガスの発生量が減少する傾向を示して好ましくない。
【００４０】
水素の生産方法において、前記水素発生用微生物群と、原料有機物とに加え、さらに還元作用を有する微生物を混合することにより、原料有機物の種類や状態にもよるが、その分解を促すことができる。その場合、速やかに水素を発生させることができると共に、水素の発生量を増大させ、安定した状態で水素を得ることができる。ここで、水素発生用微生物群を用いて水素を生産するに当たり、微生物の餌となる糖蜜、甘蔗糖、精製糖等の糖類（原料有機物）などを混合し、水素発生用微生物群の働きを促して水素の生産量を増加させるように構成することもできる。また、水素発生用微生物群は、一旦生成させるとそれを種菌として継続培養することができる。例えば、水素発生用微生物群を竹炭に加え、常温で放置することにより培養を行うことができる。
【００４１】
具体的には、グルコース（ブドウ糖）又はラクトース（乳糖）の培地（嫌気性培地）に、前記水素発生用微生物群が固定化された竹炭を投入し、３０〜５０℃に加熱して発酵させることにより、培養液中に水素発生に関与する酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）及び酪酸（Ｃ３Ｈ７ＣＯＯＨ）が代謝生成物として生成する。代謝生成物としては、その他乳酸（Ｃ２Ｈ４（ＯＨ）ＣＯＯＨ）、エタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）、コハク酸（Ｃ２Ｈ４（ＣＯＯＨ）２）、プロピオン酸（Ｃ２Ｈ５ＣＯＯＨ）等が生成する。ここで、基質としてラクトースを使用した場合の発酵時における反応（代謝反応）を以下に示す。
【００４２】
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋５Ｈ２Ｏ → ４ＣＨ３ＣＯＯＨ＋４ＣＯ２＋８Ｈ２・・・（１）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋Ｈ２Ｏ → ２Ｃ３Ｈ７ＣＯＯＨ＋４ＣＯ２＋４Ｈ２・・・（２）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋Ｈ２Ｏ → ４Ｃ２Ｈ４（ＯＨ）ＣＯＯＨ・・・（３）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋Ｈ２Ｏ → ４Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋４ＣＯ２・・・（４）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋４ＣＯ２＋４Ｈ２ → ４Ｃ２Ｈ４（ＣＯＯＨ）２＋３Ｈ２Ｏ・・・（５）
Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１＋４Ｈ２ → ４Ｃ２Ｈ５ＣＯＯＨ＋３Ｈ２Ｏ・・・（６）
上記のように、代謝生成物が酢酸である場合には反応式（１）に示すように酢酸の２倍モルの水素が発生し、代謝生成物が酪酸である場合にも反応式（２）に示すように酪酸の２倍モルの水素が発生する。また、代謝生成物が乳酸及びエタノールである場合には、反応式（３）及び（４）に示すように水素は発生しない。さらに、代謝生成物がコハク酸及びプロピオン酸の場合には、反応式（５）及び（６）に示すように水素を消費（資化）する。
【００４３】
さて、水素を生産する場合には、日和見菌等の腐敗菌を含む竹炭を調製し、そこに前記有用微生物群等の発酵用微生物を含有させる操作を複数回繰り返す。それを例えば６ヶ月間屋外に放置し、その間例えば前記有用微生物群に自然界に存在する腐葉土を加えて得られる還元作用をもつ微生物を加え、竹炭に定着させる。このような手順により、水素発生用微生物群が調製される。
【００４４】
そして、得られた水素発生用微生物群を、食品残渣や糞尿等の原料有機物に混合することにより、水素発生用微生物群のもつ腐敗作用、発酵作用、続いて分解作用、竹炭のもつ触媒作用、スクリーニング作用などに基づいて、原料有機物が腐敗及び発酵され、その後分解され、水素（Ｈ２）、窒素（Ｎ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）などのガスが発生する。発生ガス中の水素の含有量は生成条件によって異なるが、例えば２５〜４０体積％に達する。
【００４５】
この場合、水素発生用微生物群の作用が有効に働くと同時に、多孔質の竹炭中の微細孔はその表面積が大きく、かつ貫通孔であることから水素発生用微生物群が竹炭の微細孔に容易に出入りすることができてその機能を十分に発現することができ、原料有機物の分解が円滑に進行する。従って、未分解のアンモニア（ＮＨ３）、メタン（ＣＨ４）などのガスは発生しない。
【００４６】
以上の実施形態によって発揮される効果について、以下にまとめて記載する。
・ 本実施形態の水素の生産方法では、Klebsiella oxytocaに属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させるものである。このため、原料有機物が水素発生用微生物群の特にKlebsiella oxytocaにより発酵処理されて分解され、その際に竹炭が触媒作用及びスクリーニング作用を発現し、水素が継続して発生するものと考えられる。従って、多量の水素を安定して得ることができ、水素の生産効率に優れている。さらに、水素発生速度が高く、水素収率も高い。
【００４７】
・ 前記Klebsiella oxytocaは通性嫌気性菌であることから、Klebsiella oxytocaが竹炭の嫌気性領域でその機能を十分に発揮することができると共に、竹炭の好気性領域でも生育することができる。
【００４８】
・ 水素発生用微生物群に硝化菌が含まれていることにより、特にアンモニアを硝酸塩に変換させることができ、水素発生用微生物群の栄養源を得ることができる。この場合、アンモニア臭の発生を抑制することができる。
【００４９】
・ 水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、ｐＨ３．５〜６の条件下に原料有機物を分解させて水素を発生させることにより、水素発生用微生物群を優先的に増殖させることができ、水素の発生を促進させることができる。
【００５０】
・ 水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、３０〜５０℃に加熱し、原料有機物を分解させて水素を発生させることにより、水素の生産に関与する代謝物である酢酸及び酪酸の生成量を増大させることができ、ひいては水素の発生量を増大させることができ、短時間で多量の水素を得ることができる。
【００５１】
・ 原料有機物にはグルコース、ラクトース等の糖類が含まれていることにより、水素発生に繋がる酢酸、酪酸等を生成させることができ、水素発生量を増大させることができる。
【実施例】
【００５２】
以下に、実施例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
水素発生用微生物群を次のような手順で操作して調製した。まず、竹炭として、破竹、真竹などの雑竹を６００〜８００℃に加熱して完全燃焼させ、炭化して得られた１０μｍ〜５ｍｍの微粉炭を用意した。この竹炭を大気中に１日放置し、腐敗菌としての日和見菌を多孔質の竹炭の微細孔内に増殖させた。一方、嫌気性の発酵用微生物として、下記に示す有用微生物群（Effective Microorganisms）を用意した。そして、前記竹炭５０ｇに発酵用微生物を７０ｍｌ（約７０ｇ）混合した。
【００５３】
有用微生物群
微生物類型 主要種
１．乳酸菌 Lactobacillus plantarum(ATCC8014)
Lactobacillus casei(ATCC7469)
Streptococcus Lactis(IFO12007)
２．光合成細菌 Rhotdopseudomonas plaustris(ATTC17001)
Rhodobacter sphaeroides(ATTC17023)
３．酵母菌 Saccharomyces cerevisiae(IFO0203)
Candida utilis(IFO0619)
４．放射菌 Steptomyces albus(ATCC3004)
Steptomyces griseus(IFO3358)
５．糸状菌 Aspergillus oryzae(IFO5770)
Mucor hiemalis(IFO8567)
６．その他 自然界に存在する有用菌群で、混合培養の過程で参画するも
ので、ｐＨ３．５以下で生存しうる有用微生物である。
【００５４】
続いて、１０日に１回（すなわち１ヶ月に３回）、発酵用微生物を７０ｍｌずつ追加した。その後、これを６ヶ月間屋外に放置した。これにより、竹炭が風雨に晒され、空気中に浮遊する微生物が竹炭の微細孔内に侵入し、定着した。さらに、次の６ヶ月の間に、前記発酵用微生物に自然に存在する腐葉土を加えて得られた土着有用微生物を繰返し添加した。このような手順を経て水素発生用微生物群を調製した。
【００５５】
次に、上記の水素発生用微生物群５００ｇ、原料有機物としての牛乳３００ｍｌ及び前記土着有用微生物２００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れて撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、２ヶ月間放置した。そして、ペットボトル内に発生したガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が２５．４体積％発生し、メタンは０．１体積％であった。前記水素発生用微生物群により、原料有機物である牛乳に含まれる特にタンパク質（アミノ酸がペプチド結合した高分子）が分解され、得られた分解生成物（窒素と水素の化合物）がさらに水素分と窒素分に分解されたものと推測される。
（実施例２）
前記実施例１と同様にして、前記水素発生用微生物群５００ｇ、原料有機物としての牛乳３００ｍｌ及び土着有用微生物２００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れて撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、１ヶ月間放置した。そして、ペットボトル内に発生したガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が３１．３体積％発生した。
（実施例３）
前記実施例１同様にして、前記水素発生用微生物群５００ｇ、原料有機物としての牛乳３００ｍｌ及び土着有用微生物２００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れて撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、放置したところ、翌日にはガスが発生した。発生したガスを水の中を通してペットボトルに回収した。発生したガスは３日間で約２Ｌであった。得られたガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が３８．７体積％、二酸化炭素１４．２体積％、窒素４０．８体積％及び酸素（アルゴンを含む）５．０体積％であった。
（実施例４）
前記実施例１の水素発生用微生物群５００ｇ及び原料有機物としての牛乳３００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れ、温度を４０℃に設定し、撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、放置したところ、数時間後にはガスが発生した。発生したガスを１Ｌ容器に回収した。発生したガスは３日間で約３Ｌであった。得られたガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が３９．６体積％であった。この実施例４では、土着有用微生物を追加しなかったが、温度を４０℃に上昇させたため、水素発生用微生物群と原料有機物の混合後、数時間で水素が発生した。
（実施例５）
前記実施例１の水素発生用微生物群５００ｇ、原料有機物としての尿３００ｍｌ及び土着有用微生物３００ｍｌを２Ｌのペットボトルに入れ、温度を４０℃に設定し、撹拌した。その後、ペットボトルのキャップを閉め、放置したところ、数時間後にはガスが発生した。発生したガスを１Ｌ容器に回収した。発生したガスは３日間で約４Ｌであった。得られたガスについて、ガスクロマトグラフ法により成分分析を行った。その結果、水素が３３．５体積％、二酸化炭素２７．２体積％、窒素３０．３体積％及び酸素（アルゴンを含む）６．８体積％であった。なお、４日目に新しい尿を注入したところ、再び水素を発生した。この実施例５においても、温度を４０℃に上昇させたため、水素発生用微生物群と原料有機物の混合後、数時間で水素が発生した。原料有機物としての尿は、予め体内で腐敗、発酵処理され、窒素化合物、水素化合物等が生成されているため、水素発生の効率が良いものと考えられる。
（実施例６）
実施例１の水素発生用微生物群が固定化された竹炭１．０ｇを、試験管内の下記に示す嫌気性培地（ＹＮＵ嫌気性培地）１５ｍＬに投入し、発酵温度を３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃及び７０℃に変化させて発酵させ、水素ガスを発生させた。そして、培養後における培地の基質残渣濃度から分解率を算出すると共に、生成した酢酸及び酪酸の濃度から水素生産量を求め、基質量で除することにより水素収率を算出した。酢酸、酪酸等の成分分析は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により行った。
【００５６】
ＹＮＵ嫌気性培地の組成：
基質としてグルコース（glucose）又はラクトース（lactose）１０ｇ／Ｌ、カザミノ酸１０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、チオグリコール酸０．３ｇ／Ｌ及びＬ−システイン０．３ｇ／Ｌ。
【００５７】
そして、発酵開始から１９時間後及び４８時間後における温度（℃）と基質及び代謝物の濃度（mmol/L）との関係、温度（℃）と基質の分解率（％−ｍｏｌ）及びガス発生量（ｍｌ）との関係、温度（℃）と基質の分解率（％−ｍｏｌ）及び水素の収率（mol-H2/mol-glucose）との関係を、図１〜図８に示した。図１〜図４は嫌気性培地の基質がグルコースである場合、図５〜図８は嫌気性培地の基質がラクトースである場合を示す。また、図１及び図２は１９時間後の状態、図３及び図４は４８時間後の状態を示す。さらに、図５及び図６は１９時間後の状態、図７及び図８は４８時間後の状態を示す。
【００５８】
図１に示すように、基質としてグルコースを用いた場合には１９時間後に３０〜３５℃で水素が発生しないエタノール代謝が見られた。図２に示すように、４０℃では基質の分解率が１００％に達すると共に、発生した水素ガス発生量は８ｍＬ近くに達した。図３に示すように、４８時間後においても３０℃ではエタノール代謝が見られた。図４に示すように、４０℃では基質の分解率が１００％に達すると共に、発生した水素ガスの収率は２．５mol-H2/mol-glucose近くに達した。
【００５９】
また、図５に示すように、基質としてラクトースを用いた場合には、１９時間後にエタノール代謝は見られず、４０℃で水素発生に大きく寄与する酢酸が最も多量に生成し、次いで水素発生に寄与する酪酸が多量に生成した。図６に示すように、４０℃では基質の分解率が８０％に達すると共に、発生した水素ガス発生量は９ｍＬ近くに達した。図７に示すように、基質がラクトースの場合には４８時間後にもエタノール代謝は見られず、４０℃で水素発生に大きく寄与する酢酸が最も多量に生成し、３０℃では水素発生に寄与する酪酸が最も多量に生成した。図８に示すように、３０℃では基質の分解率が１００％に達すると共に、４０℃では発生した水素ガスの収率が４．５mol-H2/mol-lactose近くに達した。
【００６０】
これらの結果より、発酵時の温度は３０〜４５℃が好ましく、３５〜４０℃がさらに好ましいことが明らかになった。また、嫌気性培地の基質としては、グルコースよりもラクトースが好ましい結果であった。
（実施例７）
内容量１．０Ｌの培養容器を使用し、ラクトース及び牛乳を基質として半回分試験を行った。すなわち、２４時間毎に培養液の１／３程度を新しい培地に更新して発酵を半連続的に行った。実施例６で使用したＹＮＵ嫌気性培地に、ラクトース１０ｇ／Ｌ又は牛乳２５０ｍＬの３倍希釈液を基質とし（培養液体積７５０ｍＬ）、該培養液に前記水素発生用微生物群を固定化した竹炭５０ｇを添加し、２日間の発酵試験を行った。発酵条件を温度４０℃、ｐＨ６．０及び撹拌速度７５ｒｐｍで一定とした。そして、基質としてラクトースを用いた場合及び牛乳を用いた場合について、発酵時間（ｈ）と代謝物濃度（mmol/L）及び水素収率（mol-H2/mol-substrate）との関係を求めた。基質としてラクトースを用いた場合の結果を図９に示し、基質として牛乳を用いた場合の結果を図１０に示した。
【００６１】
図９及び図１０に示したように、基質がラクトース及び牛乳のいずれの場合にも酢酸及び酪酸の生成量が多いことから、水素発酵が良好に進行していることが明らかになった。また、基質として特に牛乳を用いた場合には、培地を更新した後に乳酸の生成量が増大したが、エタノールの生成量は少ない結果であった。最大水素収率は、基質がラクトースである場合には４．１７mol-H2/mol-substrateであり、基質が牛乳である場合には３．９９mol-H2/mol-milkであって、十分な水素収率が得られた。また、最大水素発生速度は、基質がラクトースである場合には０．９３L-H2/h/Lであり、基質が牛乳である場合には０．８９L-H2/h/Lであった。
（実施例８〜１５）
１Ｌの三角フラスコに基質としてスキムミルク〔森永乳業（株）製、ドライミルクはぐくみ、ＶＳ（volatile solid）／ＴＳ（total solid）＝０．９７〕及び前記水素発生用微生物群を含む竹炭を投入し、全量が１Ｌとなるように水を加えて調整した。そして、三角フラスコを密閉した後、水温を調整した３６℃のウォーターバス内に設置し、スターラーで撹拌を行った。ここで、実施例８〜１１ではスキムミルクの投入量を８０ｇとし、水素発生用微生物群を含む竹炭の投入量を変化させた。すなわち、竹炭の投入量を、実施例８では３５０ｇ、実施例９では２５０ｇ、実施例１０では１５０ｇ及び実施例１１では５０ｇとした。そして、経過日数（日）と水素発生量（ｍＬ）との関係及び経過日数（日）とｐＨとの関係を求めた。水素ガスの濃度は、ガスクロマトグラフ〔（株）島津製作所製、ＧＣ１４Ｂ、検出器ＴＣＤ、キャリアガスはアルゴン、カラムは信和化工（株）製、SHINCARBON ST、直径３ｍｍ、長さ２ｍ〕にて測定した。経過日数（日）とガス発生量（ｍＬ）との関係を図１１に示し、経過日数（日）とｐＨとの関係を図１２に示した。
【００６２】
図１１に示すように、２日目までは水素ガスの発生は急激に増大したが、３日目以降は水素ガスの発生は緩やかになった。また、竹炭が多くなるほど水素ガスの発生が継続し、総水素ガス発生量も多い結果となった。図１２に示すように、ｐＨは経過日数と共に低下する傾向を示した。さらに、竹炭が最も少ない実施例１１の場合にｐＨが最も低下したので、４日後にｐＨを６近く上昇させるように調整したが、ｐＨは急に低下し、水素ガス発生量の増加にはつながらなかった。竹炭量が最も多い実施例８では、ｐＨ低下が比較的緩やかであり、そのことが水素ガス発生量の増大につながったものと考えられる。
【００６３】
また、実施例１２〜１５では、竹炭の投入量を２５０ｇとし、スキムミルクの投入量を実施例１２では２０ｇ、実施例１３では４０ｇ、実施例１４では８０ｇ及び実施例１５では１２０ｇとした。そして、経過日数（日）とガス発生量（ｍＬ）との関係（図１３）、経過日数（日）とｐＨとの関係（図１４）及び１１日後における基質投入量（ｇ／Ｌ）とガス発生量（ｍＬ）との関係（図１５）を求めた。
【００６４】
図１３及び図１５に示すように、スキムミルクの投入量が多いほど水素ガスの発生量が多くなる結果が得られた。図１４に示すように、スキムミルクの投入量が多いほどｐＨの低下が進む傾向が見られた。
【００６５】
次に、実施例８、実施例１３及び実施例１４において、発生したガス（Ｈ２、Ｎ２、ＣＨ４及びＣＯ２）の成分分析を行った。その結果を表１に示した。
【００６６】
【表１】
表１に示した結果より、水素ガスの濃度は発生ガス中に２０〜２９％であった。なお、メタン（ＣＨ４）及びアンモニア（ＮＨ３）の発生は認められなかった。
【００６７】
また、実施例８及び１４について、基質の投入量に対する水素ガスの発生量を求めた。すなわち、実施例８では基質であるスキムミルクの投入量が８０ｇ、ガス発生量が４．３７Ｌで水素ガス含有量が２０％であるため水素ガス発生量は０．８７Ｌであることから、基質の投入量に対する水素ガスの発生量は１０．９ｍＬ／ｇであった。実施例１４では基質であるスキムミルクの投入量が８０ｇ、ガス発生量が３．５５Ｌで水素ガス含有量が２９％であるため水素ガス発生量は１．０３Ｌであることから、基質の投入量に対する水素ガスの発生量は１２．９ｍＬ／ｇであった。
（実施例１６、１７及び比較例１、２）
前記実施例８〜１５において、基質としてのスキムミルク、竹炭及び微生物培養液を次のように配合し、全量を水で０．９Ｌとした。実施例１６ではスキムミルク７２ｇ及び竹炭２２５ｇ、実施例１７ではスキムミルク７２ｇ、竹炭２２５ｇ及び微生物培養液２７０ｇとし、比較例１では竹炭２２５ｇのみ及び比較例２ではスキムミルク７２ｇ及び微生物培養液２７０ｇとした。そして、経過日数（日）とガス発生量（ｍＬ）との関係及び経過日数（日）とｐＨとの関係を求め、それぞれ図１６及び１７に示した。さらに、発生したガス（Ｈ２、Ｏ２、Ｎ２、ＣＨ４及びＣＯ２）の成分分析を行った。その結果を表２に示した。
【００６８】
【表２】
表２に示した結果より、実施例１６及び１７では水素発生用微生物群を含む竹炭を用いたことから、発生した水素ガス濃度は３９〜４６％に達した。その一方、比較例１では基質としてのスキムミルクが含まれていなかったため、ガスの発生は見られなかった。また、比較例２では竹炭が含まれていなかったことから、発生した水素ガスの濃度が低い結果であった。
（実施例１８〜２１）
前記実施例１６、１７において、基質としてのスキムミルクを７２ｇとし、竹炭の投入量を変化させ、全量を水で０．９Ｌとした。竹炭の投入量は、実施例１８では３１５ｇ、実施例１９では２２５ｇ、実施例２０では１３５ｇ及び実施例２１では４５ｇとした。また、培養温度を４０℃に設定した。そして、経過日数（日）とガス発生量（ｍＬ）との関係及び経過日数（日）とｐＨとの関係を求め、それぞれ図１８及び１９に示した。さらに、発生したガス（Ｈ２、Ｏ２、Ｎ２、ＣＨ４、ＣＯ２及びＮＨ３）の成分分析を行った。その結果を表３に示した。
【００６９】
【表３】
表３に示した結果より、実施例１８〜２１では基質としてスキムミルク及び水素発生用微生物群を含む竹炭を所定量使用し、温度を４０℃に上昇させたことから、発生したガス中の水素ガス濃度を３８．３〜５６．２％に高めることができた。この場合、竹炭の投入量が最も多い３１５ｇの場合（実施例１８）よりも竹炭の投入量が少ない場合（実施例１９〜２１）の方が発生したガス中の水素ガス濃度が高くなる結果が得られた。
（実施例２２）
実施例６及び７で用いた水素発生用微生物群が定着された竹炭を種々の培地に植菌した。そして、４０℃、２４時間培養後に形成されたコロニーから白金耳にて菌を採取し、様々な寒天培地に植菌した。これを常温にて好気性雰囲気及び嫌気性雰囲気にて培養したところ、いずれの場合にもコロニーの形成が見られた。従って、このコロニーは通性嫌気性菌であることが判明した。さらに、単離菌を電子顕微鏡で観察すると、小さな桿菌（グラム陰性桿菌）であった。そして、ＡＰＩ２０Ｅにより、単離菌の簡易同定を行った。その結果、尿素を分解する菌ではないこと、グルコースやラクトースだけではなく、マンニトールやセロビオース（セルロース由来の二糖）を分解するなど多種のバイオマスを分解する菌であることが推察できた。
【００７０】
続いて、形成された単一コロニーを培地に植え継ぎ、単離菌を増殖させた。増殖時にガスを生成し、酢酸及び酪酸が代謝産物として確認されたことから、この単離菌は水素発生用微生物であることがわかった。
【００７１】
次に、１６ＳｒＮＡ遺伝子解析により、単離菌の系統解析を行った結果、単離菌はKlebsiella oxytocaに属する新規な微生物であることが明らかになった。
なお、前記実施形態を次のように変更して実施することも可能である。
【００７２】
・ 腐敗菌を含む竹炭に発酵用微生物を含有させる操作を複数回行う際に、腐敗菌を含む竹炭を追加することもできる。
・ 還元作用を有する微生物を竹炭に定着させる際に、湿度や温度を調整して定着速度を速くするように構成することもできる。
【００７３】
・ 多孔質物質として竹炭に加えて、珪藻土等を配合することもできる。
・ 腐敗菌を含む竹炭に発酵用微生物を含有させる操作を、酸素を除去した嫌気性雰囲気下、或いは不活性ガス雰囲気下に行い、腐敗処理及び発酵処理の処理効率を向上させることも可能である。
【００７４】
・ 腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物としては、嫌気性の微生物であることが好ましいが、好気性の微生物が含まれていても差し支えない。
・ 水素の発生を促進させるために、嫌気性微生物等の種菌を併用することも可能である。
【００７５】
・ 水素発生用微生物群として、前記方法とは異なる方法で得られた桿菌、連鎖桿菌等を加えたものを使用することも可能である。
さらに、前記実施形態より把握される技術的思想について以下に記載する。
【００７６】
(1) 前記Klebsiella oxytocaは、窒素固定菌であることを特徴とする請求項１に記載の水素の生産方法。このように構成した場合、請求項１に係る発明の効果に加えて、空気中の窒素をアンモニアとして容易に固定化することができる。
【００７７】
(2) 前記糖類はグルコース又はラクトースであり、代謝生成物として酢酸又は酪酸が生成されるように構成されていることを特徴とする請求項６に記載の水素の生産方法。このように構成した場合、請求項６に係る発明の効果に加えて、酢酸又は酪酸の生成によって水素の発生量を増大させることができる。
【００７８】
(3) 腐敗菌を含む竹炭に、腐敗生成物を発酵する微生物を含有させる操作を複数回行った後、屋外に放置し、その後還元作用を有する微生物を竹炭に定着させることにより得られる水素発生用微生物群と、原料有機物とを混合し、原料有機物を分解及び還元させて水素を発生させることを特徴とする水素の生産方法。このように構成した場合、原料有機物が腐敗菌及び発酵用微生物により腐敗、発酵処理され、腐敗、発酵処理生成物が還元作用を有する微生物によって分解及び還元され、その際に竹炭が触媒作用を発現し、水素が継続して発生するものと考えられる。従って、水素を安定して得ることができ、水素の生産効率に優れている。
【００７９】
(4) 前記腐敗菌は、竹炭を微粉末にして放置することにより多孔質の竹炭の微細孔内に増殖する日和見菌であることを特徴とする上記技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。このように構成した場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、簡単な操作で腐敗菌を竹炭内に保持させることができる。
【００８０】
(5) 前記腐敗生成物を発酵する微生物は、乳酸菌、光合成細菌、酵母菌、放射菌及び糸状菌を含有する微生物群であることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合には、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、多孔質の竹炭の微細孔内で嫌気性雰囲気下において、発酵用微生物が原料有機物の発酵を促進させることができる。
【００８１】
(6) 前記還元作用を有する微生物は、自然の状態で存在する腐葉土中に含まれる微生物であることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合には、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、有効な還元作用を発現できる有用微生物により、水素の発生効率を向上させることができる。
【００８２】
(7) 前記水素発生用微生物群と、原料有機物と、さらに還元作用を有する微生物とを混合し、原料有機物を分解及び還元させて水素を発生させることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、追加される還元作用を有する微生物により還元作用がさらに高められ、一層安定した状態で水素を得ることができる。
【００８３】
(8) 前記屋外に放置する期間は６ヶ月から１年間であることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。このように構成した場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、竹炭に対して腐敗菌及び発酵用微生物を十分に定着させることができる。
【００８４】
(9) 前記腐敗菌を含む竹炭に発酵用微生物を含有させる操作を２〜６回行うことを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、竹炭に発酵用微生物を十分に定着させることができる。
【００８５】
(10) 前記腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物は、多孔質の竹炭の微細孔内で増殖していることを特徴とする技術的思想(3)に記載の水素の生産方法。この場合、技術的思想(3)に係る発明の効果に加えて、表面積の大きい竹炭の微細孔内で腐敗菌、発酵用微生物及び還元作用を有する微生物の効果を著しく向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】実施例６で基質としてグルコースを用いた場合において、１９時間後の温度と培養後の基質及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図２】実施例６で基質としてグルコースを用いた場合において、１９時間後の温度とガス発生量及び分解率との関係を示すグラフ。
【図３】実施例６で基質としてグルコースを用いた場合において、４８時間後の温度と培養後の基質及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図４】実施例６で基質としてグルコースを用いた場合において、４８時間後の温度と水素の収率及び分解率との関係を示すグラフ。
【図５】実施例６で基質としてラクトースを用いた場合において、１９時間後の温度と培養後の基質及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図６】実施例６で基質としてラクトースを用いた場合において、１９時間後の温度とガス発生量及び分解率との関係を示すグラフ。
【図７】実施例６で基質としてラクトースを用いた場合において、１９時間後の温度と培養後の基質及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図８】実施例６で基質としてラクトースを用いた場合において、１９時間後の温度とガス発生量及び分解率との関係を示すグラフ。
【図９】実施例７で基質としてラクトースを用いた場合において、発酵時間と水素収率及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図１０】実施例７で基質として牛乳を用いた場合において、発酵時間と水素収率及び代謝物濃度との関係を示すグラフ。
【図１１】実施例８〜１１において、経過日数とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１２】実施例８〜１１において、経過日数とｐＨとの関係を示すグラフ。
【図１３】実施例１２〜１５において、経過日数とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１４】実施例１２〜１５において、経過日数とｐＨとの関係を示すグラフ。
【図１５】実施例１２〜１５において、基質投入量とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１６】実施例１６、１７及び比較例１、２において、経過日数とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１７】実施例１６、１７及び比較例１、２において、経過日数とｐＨとの関係を示すグラフ。
【図１８】実施例１８〜２１において、経過日数とガス発生量との関係を示すグラフ。
【図１９】実施例１８〜２１において、経過日数とｐＨとの関係を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Klebsiella oxytoca（微生物の受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６３８）に属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする水素の生産方法。
【請求項２】
前記Klebsiella oxytocaは、通性嫌気性菌であることを特徴とする請求項１に記載の水素の生産方法。
【請求項３】
前記水素発生用微生物群には、硝化菌が含まれていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の水素の生産方法。
【請求項４】
前記水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、ｐＨ３．５〜６の条件下に原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の水素の生産方法。
【請求項５】
前記水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、３０〜５０℃に加熱し、原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の水素の生産方法。
【請求項６】
前記原料有機物には、糖類が含まれていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の水素の生産方法。
【請求項１】
Klebsiella oxytoca（微生物の受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６３８）に属する新規な微生物を含む水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする水素の生産方法。
【請求項２】
前記Klebsiella oxytocaは、通性嫌気性菌であることを特徴とする請求項１に記載の水素の生産方法。
【請求項３】
前記水素発生用微生物群には、硝化菌が含まれていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の水素の生産方法。
【請求項４】
前記水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、ｐＨ３．５〜６の条件下に原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の水素の生産方法。
【請求項５】
前記水素発生用微生物群を定着させた竹炭を原料有機物に混合し、３０〜５０℃に加熱し、原料有機物を分解させて水素を発生させることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の水素の生産方法。
【請求項６】
前記原料有機物には、糖類が含まれていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の水素の生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１０−５１３０６（Ｐ２０１０−５１３０６Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５４９０８（Ｐ２００８−２５４９０８）
【出願日】平成２０年９月３０日（２００８．９．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００８年８月２日 ＮＰＯ法人 矢作川と三河武士フォーラム発行の「第４回 みんなで地球・愛＆あいち環境ＮＰＯ活動ワッショイ！」に発表
【出願人】（５０８００７０４２）キトー商事 株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月３０日（２００８．９．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００８年８月２日 ＮＰＯ法人 矢作川と三河武士フォーラム発行の「第４回 みんなで地球・愛＆あいち環境ＮＰＯ活動ワッショイ！」に発表
【出願人】（５０８００７０４２）キトー商事 株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]