治療剤
【課題】カプシノイド化合物に種々の生理活性が存在することが知られている。例えば、血行促進作用、血圧低下作用、抗糖尿作用等である。本発明の課題は、これら以外の種々の疾病に、とりわけ顕著な効果でもって有効である、カプシノイド化合物を有効成分とする治療剤の提供。
【解決手段】カプシノイド化合物を有効成分とする、リウマチ、がん性疾患等の治療剤または予防剤。カルシウム吸収促進剤。カプシノイド化合物を有効成分とする、カルシウム吸収促進剤、抗骨粗鬆症剤、二日酔い予防又は改善剤、インフルエンザウイルス感染阻害剤、抗鬱・抗ストレス剤、薬物依存症治療薬、アディポネクチン産生促進剤。
【解決手段】カプシノイド化合物を有効成分とする、リウマチ、がん性疾患等の治療剤または予防剤。カルシウム吸収促進剤。カプシノイド化合物を有効成分とする、カルシウム吸収促進剤、抗骨粗鬆症剤、二日酔い予防又は改善剤、インフルエンザウイルス感染阻害剤、抗鬱・抗ストレス剤、薬物依存症治療薬、アディポネクチン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カプシノイド化合物を有効成分とする各種治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カプシノイド化合物に種々の生理活性が存在することが知られている。例えば、血行促進作用（特許文献１）、血圧低下作用（特許文献２）、抗糖尿作用（特許文献３）等である。しかしながら、カプシノイド化合物が、下記で説明する本発明で適用される種々の疾病に、とりわけ顕著な効果でもって有効であるとの見地はない。
【特許文献１】特開２００７−２６９７１４号公報
【特許文献２】特開２００４−１４９４９４号公報
【特許文献３】特開２００３−３４２１７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、下記で説明する本発明で適用される種々の疾病に、とりわけ顕著な効果でもって有効である各種治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
請求項１に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病、自己免疫疾患、リウマチ、がん性疾患、炎症性疾患、動脈硬化、神経疾患、虚血再潅流障害、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、血管新生を伴う疾病、肝硬変、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病に伴う関節炎、脳虚血中および再潅流後の脳組織の損傷又はウイルス性疾患治療剤または予防剤である。
請求項２に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするカルシウム吸収促進剤である。
請求項３に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする抗骨粗鬆症剤である。
請求項４に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする二日酔い予防又は改善剤である。
請求項５に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルス感染阻害剤である。
請求項６に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする抗鬱・抗ストレス剤である。
請求項７に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする薬物依存症治療薬である。
請求項８に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするアディポネクチン産生促進剤である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、下記で説明する本発明で適用される種々の疾病に、とりわけ顕著な効果でもって有効である各種治療剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明で使用されるカプシノイド化合物は公知であり、例えば上記特許文献１〜３に記載されている。
すなわち、本発明で使用されるカプシノイド化合物とは、バニリルアルコール脂肪酸エステルであり、具体的にはカプシエイト、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト[4-hydroxy-3-methoxybenzyl decanoate (caprate)]、バニリルオクタノエイト[4-hydroxy-3-methoxybenzyl octanoate]等の各種直鎖脂肪酸とバニリルアルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。
また、上記特許文献１にも記載されているように、カプシノイド化合物は下記一般式（１）のように表すこともできる。
【０００７】
【化１】
【０００８】
（上記一般式（１）においてＲ１は、炭素数５〜１０のアルキル基又は炭素数５から１０のアルケニル基を示し、置換基を有していてもよい。）
【０００９】
ここで、Ｒ１で表される炭素数５〜１０のアルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状であってもよい。分岐鎖であることが好ましい。
【００１０】
Ｒ１で表される炭素数５〜１０のアルケニル基は、直鎖状でも分岐鎖状であってもよい。二重結合の部位は、トランス型が好ましい。
【００１１】
また、これらの基は任意に１〜４の置換基によって置換されていてもよく、置換基としては、アルキル基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、アミノ基、水酸基、アシル基、ニトロ基、シアノ基、チオール基等が挙げられる。中でも、炭素数１〜４の短鎖アルキル基により置換されたものが好ましい。置換基としてとくに好ましいのはメチル基、エチル基であって、末端のメチル側から数えて２位又は３位の炭素原子上の水素原子が置換されることが好ましい。
【００１２】
中でも本発明では、カプシノイド化合物として、カプシエイト、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイトが好ましい。
【００１３】
また、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイト等も好ましい。
【００１４】
上述したカプシノイド化合物は、トウガラシ属に属する植物体に多く含まれるものであるため、特許文献１に記載されているように、「CH-19甘」のようなトウガラシ属に属する植物体（以下「トウガラシ」という。）の植物体および／または果実から抽出・分離・精製することによって調製することができる。また、合成することも可能である（特許文献１を参照）。
【００１５】
本発明のカプシノイド化合物の投与量および投与回数は、ヒトであるか、それ以外の動物であるか、またそれらの性別、年齢、体重、症状の程度等によって適宜決定すればよいが、ヒトに経口投与する場合、成人１日あたり１〜５０ｍｇ／ｋｇであるのが好適である。ヒト以外の動物も同様である。また、カプシノイド化合物の投与の形態は、とくに制限されず、例えば固体、液体、ゾル、ゲル、粉末および顆粒状であることができる。
【００１６】
本発明のカプシノイド化合物は、各種健康食品および機能性食品として摂取可能である。これらの例としては、各種のものをあげることができるが、健康食品および機能性食品の製造に関しては、通常用いられる、食品素材、食品添加物に加え、賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、分散剤、保存剤、湿潤化剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化材、カプセル基剤等の補助剤を用いた飲食品製剤形態で利用することができる。該補助剤の具体的な例示をすれば、乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはその塩、アラビアガム、ポリエチレングルコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、プルラン、カラギーナン、デキストリン、還元パラチノース、ソルビトール、キシリトール、ステビア、合成甘味料、クエン酸、アスコルビン酸、酸味料、重曹、ショ糖エステル、植物硬化油脂、塩化カリウム、サフラワー油、ミツロウ、大豆レシチン、香料等が配合できる。このような健康食品、機能性食品の製造に関しては、医薬品製剤の参考書、例えば「日本薬局方解説書（製剤総則）」（廣川書店）等を参考にすることができる。
【００１７】
上記以外にも本発明のカプシノイド化合物は飲食品として摂取することができる。具体的には、プリン、クッキー、クラッカー、ポテトチップス、ビスケット、パン、ケーキ、チョコレート、ドーナツ、ゼリーなどの洋菓子、煎餅、羊羹、大福、おはぎ、その他の饅頭、カステラなどの和菓子、冷菓（飴等）、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば、きしめん等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ハム、ソーセージ、ハンバーグ、コーンビーフ等の畜肉製品や、塩、胡椒、みそ、しょう油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、甘味料、辛味料等の調味類や、明石焼き、たこ焼き、もんじゃ焼き、お好み焼き、焼きそば、焼きうどん等の鉄板焼き食品や、チーズ、ハードタイプのヨーグルト等の乳製品や、納豆、厚揚げ、豆腐、こんにゃく、団子、漬物、佃煮、餃子、シューマイ、コロッケ、サンドイッチ、ピザ、ハンバーガー、サラダ等の各種総菜や、各種粉末（ビーフ、ポーク、チキン等畜産物、海老、帆立、蜆、昆布等水産物、野菜・果実類、植物、酵母、藻類等）や、油脂類・香料類（バニラ、柑橘類、かつお等）を粉末固形化したものや、粉末飲食品（インスタントコーヒー、インスタント紅茶、インスタントミルク、インスタントスープ、味噌汁等）等の各種食品が挙げることができるが、これらに特に制限されない。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例によってさらに説明するが、本発明は下記例に制限されない。
【００１９】
実施例１
本発明で使用されるカプシノイド化合物は、カプサイシンやバニリルアルコール等の非カプシノイド化合物に比べて顕著に優れたアポトーシス誘発活性、抗酸化活性を有すると考えられ、これにより、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病、自己免疫疾患、リウマチ、がん性疾患、炎症性疾患、動脈硬化、神経疾患、虚血再潅流障害、毒性ショックやある種のサイトカインによる治療等による全身性血圧低下、血圧応答低下、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、血管新生を伴う疾病、肝硬変、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病に伴う関節炎、脳虚血中および再潅流後の脳組織の損傷又はウイルス性疾患治療剤または予防剤として有効であると考えられる。前記各種疾病に対するカプシノイド化合物の投与形態は、現在医学的に許容されている手段であれば制限されない。また、飲食品として投与することもできる。
【００２０】
アポトーシス誘発試験
（１）５６℃、３０分間処理したウシ胎児血清（ＪＲＩＩ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）にて３７℃で培養したＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＲＰＭＩ１６４０培地にて２．５×１０５細胞／４．５ｍｌとなるように懸濁した。
この懸濁液４．５ｍｌに対し、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭのカプシエイト水溶液を５００μｌ添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で、２４時間培養した。
培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、最終濃度５０μＭ以上のカプシエイト添加培養細胞に核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお、対照の生理食塩水５００μｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
次いで、上記と同様の方法で２４時間と４８時間培養した細胞を用い、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズアポトーシス実験プロトコール（秀潤社）第１２９〜１３０頁記載の方法でＦＡＣＳｃａｎを用いたアポトーシス細胞の測定、イオマニュアルＵＰシリーズ 最新アポトーシス実験法（羊土社）第６１〜６３頁記載の方法でＤＮＡの断片化の解析を行った。その結果、最終濃度５０μＭ以上のカプシエイト添加培養細胞にアポトーシス細胞を、５０、１００μＭのカプシエイト添加培養細胞にＤＮＡの断片化を確認した。なお、対照の生理食塩水５００μｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
（２）上記（１）と同様の方法で２４時間培養した細胞を一部サンプリングし、０．４％トリパンブルーで染色後、光学顕微鏡で観察し、染色されていない生細胞と青く染色された死細胞の細胞数の測定を行い、生残率が５０％になるカプシエイトの濃度［生残率５０（μＭ）］をもとめた。その結果、８０．０μＭであった。以上のとおり、カプシエイトはアポトーシス誘発作用によるがん細胞増殖抑制活性を示した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００２１】
実施例２
過酸化脂質ラジカル産生抑制試験
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）３Ａ（ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー、ＮＣＴＣ ８３１９）を５ｍｌのブレインハートインフュージョン培地（ディフコ社製、００３７−１７−８）に接種し、３７℃で１晩培養した。遠心によって菌体を集め、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄した後、１×１０７コロニー形成単位／ｍｌになるようにリン酸緩衝食塩水に懸濁した。１００μｌの上記菌懸濁液、１００μｌの１０、１００ｍＭのカプシエイト水溶液、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌメトヘモグロビン（シグマ社製、Ｍ９２５０）水溶液および６００μｌのリン酸緩衝食塩水および１００μｌの５０ｍＭ ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（片山化学社製、０３−４ ９９０）水溶液を混合して３７℃で３０分間反応させた。１ｍｌの２×ＮＭＰ培地［８ｇのニュートリエントブロス（ディフコ社製、０００３−０１−６）、５ｇのトリプトン（ディフコ社製、０１２３−１７−３）、５ｇのＮａＣｌ、１０ｇのマンニトール（ナカライテスク社製、２１３−０３）、０．０３５ｇのフェノールレッド（ナカライテスク社製、２６８−０７）を蒸留水に溶解して５００ｍｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整後、ろ過滅菌したもの］を加えて反応を停止し、ＮＭＰ培地（２×ＮＭＰ培地を滅菌水で２倍希釈したもの）で３倍ずつ１２段階希釈したもの各１６０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れ、３７℃で１晩培養した。培地の色を肉眼で観察し、菌が生育して培地が赤色から黄色に変化したウェルが見られた試料を過酸化脂質ラジカル産生抑制活性を持つものとした。
その結果を表１に示す。表１において、＋は菌の生育したウェルが見られた試料を、−は菌の生育したウェルが見られなかった試料を示す。また、表の最上列に示した濃度はｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドおよび菌体と３７℃で３０分間反応させた反応液中のカプシエイトの濃度である。
【００２２】
【表１】
【００２３】
以上の結果、カプシエイトには過酸化脂質ラジカル産生抑制活性が見られた。ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００２４】
実施例３
ＮＯ産生抑制試験
（１）１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ライフテックオリエンタル社製、２５０３０−１４９）含有ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製、１２−９１７Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ７１）を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間培養した。各ウェルに１０μｌの２５μｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製、Ｌ−２０１２）、５００Ｕ／ｍｌインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ、コスモバイオ社販売 ＧＺＭ−ＭＧ−１ＦＮ）水溶液と１０μｌの２５０、５００μＭ カプシエイト水溶液を添加してさらに１２時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳとＩＮＦ−γを加えない区分およびカプシエイトを加えない区分を設定した。
上記培養後、１００μｌの培地に１００μｌの４％グリース試薬（シグマ社製、Ｇ４４１０）を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。測定はすべて３連で行った。
この結果、カプシエイトは濃度依存的にＬＰＳとＩＮＦ−γによるＮＯ産生誘導を抑制することが明らかとなった。
（２）１０％ウシ胎児血清含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で６時間培養した。カプシエイトを０．５ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液を、各ウェルに１０μｌずつそれぞれ添加し、さらに、０．５時間あるいは５時間培養した。その後、各ウェルに１０μｌの５μｇ／ｍｌ ＬＰＳ、２０００Ｕ／ｍｌ ＩＮＦ−γ水溶液を添加して、１２時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳ、ＩＦＮ−γを加えない区分およびカプシエイトを加えない区分を設定した。
上記培養後、１００μｌの培養上清に１００μｌの４％グリース試薬を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。
測定は全て３連で行った。
この結果、ＬＰＳ、ＩＦＮγ添加前、カプシエイト存在下０．５時間培養した区分より、５時間培養した区分で、より強いＮＯ産生抑制が認められた。
以上、カプシエイトはＮＯ産生抑制作用を示した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００２５】
実施例４
抗変異原性試験
抗変異原性試験を、変異の強さをβ−ガラクトシダーゼの活性で判定できるｕｍｕテストによる環境変異原の検出法［ミューテーション・リサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｃｈ）、第１４７巻、第２１９頁（１９８５）］に準じた方法で行った。すなわち、５０μｌの各濃度（１．０、５．０、１０、１５ｍＭ）に調製したカプシエイトに２５μｌの変異原物質［マイトマイシンＣ（ＤＮＡ架橋剤）１０μｇ／ｍｌ、４−ニトロキノリン−１−オキシド（ＮＱＯ、ＤＮＡメチル化剤）７μｇ／ｍｌ］を添加した。この混合液にあらかじめＴＧＡ培地中でＯＤ６００で０．１２まで培養しておいたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｌｉｕｍ ＴＡ１５３５／ｐＳＫ１００２を最終容量１．５ｍｌになるように加えて、３７℃で２時間振とり培養を行った。この培養液２００μｌを使用してミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）の方法［エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第３５２頁（１９７２）］に従ってβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
この表から明らかな様に、カプシエイトは抗変異原活性を表した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００２８】
実施例５
制がん活性試験
（１）日本チャールスリバー社より４週令、雄性のヌードマウス（ＳＰＦ／ＶＡＦＢａｌｂ／ｃＡｎＮＣｒｊ−ｎｕ）を購入し、１週間予備飼育した。このマウスにヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）を１．５×１０６細胞／マウスとなるように皮下移植した。
大腸がん細胞株移植２週間目から、カプシエイトを５００μｇ／ｍｌ含む飲料水を自由に摂取させた。マウス１匹当り１日平均３．５ｍｌ摂取していた。また飼育用餌としてオリエンタル酵母社製のＭＦを自由に摂取させた。
カプシエイト投与開始後４週間目にカプシエイト投与群の各マウスの固形がんを摘出し、その重量を、通常の飲料水を摂取させた対照群の固形がん重量と比較した。なお、本試験は各群１０匹で行った。
その結果、制がん試験用被検液の経口投与群において有意のがん増殖抑制が認められた。
（２）５週齢の雌性ｄｄＹ系マウス（体重約２５ｇ）１８匹を用い、エーリッヒ癌を腹腔内投与（１．２×１０６細胞／マウス）し、３０日間観察し、平均生存日数および３０日間生存数を算定した。１群６匹でコントロール群、カプシエイト２ｍｇ／ｋｇ投与群およびカプシエイト２０ｍｇ／ｋｇ投与群の３群を設定した。カプシエイトは、癌投与の翌日より４日間腹腔内投与した。
結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】
【００３０】
以上、カプシエイトは制がん活性を示した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００３１】
実施例６
メラニン産生抑制試験
６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェル／２ｍｌ培地となるように１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したマウスメラノーマ細胞Ｂ１６ＢＬ６を分注し、３７℃でインキュベートした。２日目に、１００μｌのカプシエイト溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、７日目に培地を交換し、同時に１００μｌのカプシエイト溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加した。８日目に細胞を回収し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を分解処理した後、４００ｎｍの吸光度を測定し、メラニン産生抑制作用を検定した。
すなわち、培地を吸引除去した後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に溶解した０．２５％トリプシンを１ウェル当り０．３ｍｌ添加し、３７℃で１０分インキュベートした。つぎに、２ｍｌの新しい培地を添加し、細胞を懸濁して試験管に回収した。ついで、培地を遠心除去した後、２ｍｌのＰＢＳで細胞を懸濁し、再度遠心分離した。上清を除去した後、細胞に３０μｌの５ｍＭ塩化マンガンを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）と１μｌの７００００Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）を加えて良く混合した後、３７℃で２時間インキュベートして、ＤＮＡを分解した。そして１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ加え、５０℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを分解した。最後に１００μｇ／ｍｌのプロテイネースＫ（シグマ社製）、０．１％トリトンＸおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．８）を細胞数２×１０６に対して液の総量が２００μｌとなるように加え、３７℃で１６時間インキュベートした後、４００ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、カプシエイトにメラニン産生阻害活性が認められ、その美白効果が確認された。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００３２】
実施例７
α−グルコシダーゼ阻害試験
（１）α−グルコシダーゼ発色基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドに酵母由来α−グルコシダーゼを作用させ、加水分解して遊離する４−ニトロフェノールを比色法で定量することにより、カプシエイトのα−グルコシダーゼ阻害活性を測定した。すなわち、１０μｌのα−グルコシダーゼ溶液［４０ｍＵ／ｍｌ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来、シグマ社製、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］に１０μｌの検体を含む溶液［１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］を混合した後、１．５ｍｇ／ｍｌの基質溶液［シグマ社製、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］を８０μｌ添加して反応を開始した。３７℃で４０分間反応後、４１０ｎｍ（島津ｕｖ２２００）における吸光度を測定した。その結果を表４に示す。なお、この場合の残存活性は検体を添加していないものを１００％として算出した。
【００３３】
【表４】
【００３４】
上記の結果より、カプシエイトはα−グルコシダーゼ阻害活性を示した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００３５】
実施例８
抗リウマチ試験
ヒト慢性リウマチ患者の滑膜から樹立された繊維芽細胞株であるＤＳＥＫ細胞を１０％ＦＢＳ（バイオウイタッカー社製）を含むＩｓｃｏｖ−ＭＥＭ培地（ＩＭＤＭ：ギブコＢＲＬ社製）にて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で細胞が培養器に飽和になるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（バイオウイタッカー社製）で細胞を３×１０４細胞／ｍｌとなるように上記培地に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに２００μｌずつ分注した。培養５〜７日後、ほぼ細胞が８０％飽和になった時で培地を交換し、２５、５０、７５、１００、２００、もしくは４００μＭのカプシエイトを含有する２００μｌの上記培地を加えた。
２４時間、７２時間経過時に１０μｌのプレミックスＷＳＴ−１（宝酒造社製、ＭＫ４００）を加えて３７℃で３．５時間反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）から６５０ｎｍにおける吸光度（Ａ６５０）を差し引いた値を細胞増殖度とした。
その結果を表５に示す。
【００３６】
【表５】
【００３７】
以上、イン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのリウマチモデル−ＤＳＥＫ細胞において、カプシエイトを添加した場合、ＰＢＳ添加の対照区と比べて各化合物添加区はリウマチ細胞の増殖が強く抑制された。また、経時的な観察において、これらの化合物は増殖抑制活性を継続するのみならず、経時的に活性を増強する傾向が認められた。
以上の結果によって、カプシエイトは強い抗リウマチ活性があり、慢性リウマチに対する有用な治療薬と健康食品として開発されることが期待される。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
また、ＤＳＥＫ細胞培養において、２４時間、７２時間経過時に１５０μｌ／ウェルの培養上清を回収し、この細胞由来のサイトカン（ヒトＴＧＦ−β、ヒトＦＧＦ−β、ヒトＩＬ−１αおよびヒトＩＬ−１０）産生（発現の影響）に対する、カプシエイトの影響を、それぞれのサイトカインに特異的なＥＴＩＳＡ−Ｋｉｔ（ヒトＦＧＦ−βとヒトＩＬ−１０、ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製；ヒトＩＬ−１αとヒトＴＧＦ−β、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。
その結果、カプシエイトはヒトＩＬ−１αの産生抑制作用、ヒトＩＬ−１０の産生増強作用、ヒトＦＧＦ−βの産生抑制作用、およびヒトＴＧＦ−βの産生増強作用を示した。
【００３８】
実施例９
プロスタグランジンＥ２産生抑制試験
１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で６時間培養した。カプシエイトを０．５ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液を、各ウェルに１０μｌずつ添加し、さらに、０．５時間あるいは５時間培養した。その後、各ウェルに５０μｇ／ｍｌ ＬＰＳ水溶液１０μｌを添加して、１２時間培養した後、プロスタグランジンＥ２の量を測定した。なお、対照としてＬＰＳを加えない区分およびカプシエイトを加えない区分を設定した。
上記培養後、培養上清中のプロスタグランジンＥ２量をプロスタグランジンＥ２ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ネオジェン社製、Ｃｏｄｅ．４０４１１０）を用い測定した。測定は全て３連で行った。
その結果、カプシエイトはＬＰＳによるプロスタグランジンＥ２産生誘導を抑制した。また、ＬＰＳ添加前、カプシエイト存在下０．５時間培養した区分より、５時間培養した区分で、より強いプロスタグランジンＥ２産生抑制が認められた。
【００３９】
実施例１０
カルシウム吸収促進試験
９週齢のＳＤ計雄性ラット６匹を１群とし、セルロースを１０重量％含む対照食を対照群、このセルロースの１０重量％の一部をカプシエイト（試験試料）に置き換えたものを実施例１０群とした。なお、実施例１０群において、前記カプシエイトは、摂取量として１日平均５００μｇ／ｋｇとなるように、実験飼料中の試験試料の濃度を調整した。なお、実験飼料は２時間おきに交換した。
【００４０】
【表６】
【００４１】
水と対照食あるいは実施例１０の飼料を５日間自由に摂取させ、給餌開始後３日目より２日間出納実験を行った。飼料摂取量は給餌した飼料の重量から残された飼料の重量を差し引くことにより求めた。出納実験終了後、糞を採取し、１１０℃の恒温器内で３時間乾燥させた。この糞を粉砕機で砕き、さらに乳鉢で細かくすり潰した後、３Ｎの塩酸に溶解し、カルシウムの含有量を市販のカルシウム測定キットを用いて測定し、糞中のカルシウム含有率を求めた。各実験飼料中のカルシウム含有率は０.５３６％であり、下式によりカルシウム（Ｃａ）の見かけの吸収率を算出した。
【００４２】
【数１】
【００４３】
その結果、カルシウム吸収率は対照群が４８．５０±２．５５（％）であったのに対し、実施例１０群が６１．６０±３．０９（％）であり、危険率１％で有意差が示された。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００４４】
実施例１１
骨粗鬆症改善効果試験
ＳＤ系ラット（２２週齢）メスの卵巣を外科的に取り除き、骨粗鬆症のモデルラットを作成した。卵巣摘出ラットを７匹ずつ６群に分け、３５日間の試験期間中、１日置きに（計１７回）、カプシエイトを、５００μｇ／ｋｇとなるように生理食塩水に分散させて経口投与した。飼料はオリエンタル酵母株式会社のマウス・ラット・ハムスター用固形飼料ＣＲＦ−１を用い、給餌および給水方法は自由摂取とした。試験期間中、各群間で、餌の摂取量に差は認められなかった。試験開始後３５日目にラットの体重を測定した後、大腿骨を取り出した。大腿骨は、接着組織および筋肉を取り除いて分析に使用した。大腿骨の体積を測定した後、エタノールで３回洗浄し、次にアセトンで３回洗浄したのち、一晩乾燥し、その後、重量を測定して大腿骨の乾燥重量を求めた。体積および乾燥重量から、骨密度（乾燥重量ｇ／体積ｍｍ3 ）を測定した。なお対照実験として、前記試験試料を含まない生理食塩水をラットに投与したこと以外は、上記実験を繰り返した例（比較例）も併せて、その結果を表７に示す。
【００４５】
【表７】
【００４６】
実施例１１と比較例とを対比したところ、実施例１１はp＜0.05の危険率で有意差が認められた。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００４７】
実施例１２
二日酔い改善効果試験
以下の処方にてジュースを調製した。
冷凍濃縮オレンジ果汁 ５．０質量部
果糖ブドウ糖液糖 １．０質量部
クエン酸 ０．１０質量部
Ｌ−アスコルビン酸 ０．０９質量部
カプシエイト （適当量）
【００４８】
エタノールパッチテストでアルデヒド脱水素酵素欠損型と判定された健常人５名（年齢２５〜３２才、男性３名、女性２名）をパネルとし、上記ジュースおよび上記ジュースからカプシエイトを除いた対照ジュースを用いた。なお、上記ジュースにおけるカプシエイトの量は、下記の試験において摂取量が５０ｍｇとなるようにした。
【００４９】
ジュースおよび対照ジュース服用後２０分にビール（アルコール濃度約 ５．５％）１３５ml を飲酒させて、飲酒後２０分での自覚症状を質問票で回答させた。
パネルテストは順序効果を考慮し、ブラインドで行い、同一時間帯に日を変えて実施した。
自覚症状の評価は１〜５（１：症状なし、２：やや症状あり、３：症状あり、４：ややひどい、５：ひどい）の５段階で行い、Paired-t 検定により有意差を検定した。
【００５０】
結果を以下に示す。実施例１２のジュースは、危険率 ５％で酔いの程度および顔のほてりを改善し、悪酔いを予防することが明らかになった。
【００５１】
ジュースおよび対照ジュースの悪酔い予防効果（平均値）
実施例１２のジュース：
酔いの程度２．２＊
顔のほてり２．０＊
心臓の鼓動２．５
眠気の程度３．３
対照ジュース：
酔いの程度３．５
顔のほてり３．７
心臓の鼓動３．３
眠気の程度３．４
＊：対照ジュースに比べて有意差あり（P<0.05）
また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００５２】
実施例１３
抗インフルエンザウイルス効果
カプシエイトの抗インフルエンザウイルス効果について、ＦＦＵ ａｓｓａｙ（Ｆｏｃｕｓ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ Ａｓｓａｙ）により阻害率を測定し評価した。対象としたウイルスは、Ｈ５Ｎ１のトリインフルエンザウイルス（Ａ／Ｋｙｏｔｏ／０４）を用いた。
【００５３】
まず、９６穴マイクロプレートにカプシエイトを水に分散させた１％希釈液を５０μｌ入れた。次に、トリインフルエンザウイルスを約２００ＦＦＵ／５０μｌ ＭＥＭ加え、混和し３０分静置した。そして、９６穴マイクロプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を加え、上記トリインフルエンザウイルスを感染させ、１６時間培養した。その後、細胞をエタノールで固定し、抗Ａ型ＮＰ(核蛋白質)モノクローナル抗体を用いて酵素抗体法により感染細胞（１ＦＦＵ＝１感染性ウイルス）を染色し、感染細胞数を数え、下記式により、トリインフルエンザウイルスの感染率（％）を測定した。
感染率（％）＝（カプシエイトを添加したウエルのＦＦＵ）／（カプシエイトを添加しないウエルのＦＦＵ） × １００
【００５４】
その結果、感染率は４％であり、カプシエイトのインフルエンザ感染阻害効果が確認された。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００５５】
実施例１４
マウス強制水泳試験による精神安定作用の評価
本実施例の抗鬱・抗ストレス評価は、１９７７年にPorsoltにより開発されたマウス強制水泳試験を採用した。本試験は鬱病の動物モデル実験として最も多用される方法のひとつである。本試験では、マウスをある限られたスペースの中で強制的に泳がせて「無動状態」を惹起させる。この無動状態は、ストレスを負荷された動物が水からの逃避を放棄した一種の「絶望状態」を反映するものと考えられ、ヒトにおける鬱状態、ストレス状態と関連づけられている。事実、抗鬱薬は特異的にこの状況下における無動状態の持続時間を短縮させることがわかっており、この短縮作用は臨床力価との間に有意な相関を有することが認められている。
【００５６】
本試験方法は次のとおりである。
２５℃の水を深さ１５ｃｍまで入れたプラスチック円筒中でマウスを強制水泳させる。５分間の強制水泳後、３０℃の乾燥機中で１５分間乾燥し、ホームケージに戻す。翌日マウスに試験試料を腹腔内投与して、その１時間後に再び５分間の強制水泳を課し、現れた無動状態の持続時間をストップウォッチを用いて測定する。マウスが水に浮かんで静止している状態を無動状態と判定する。無動状態持続時間については有意差検定を行い、統計学的に有意差を検定する。実験には雄のｄｄYマウスを使用し、１群６匹とする。なお、試験は全て午後１時から午後６時の間に行う。また、ポジティブコントロールとして抗鬱薬であるイミプラミンを用いた試験も行う。
【００５７】
その結果、カプシエイトを３０ｍｇ／ｋｇ投与したマウスの無動状態持続時間は、１７０．１±８．０秒であった。コントロール（生理食塩水のみ）は２１５．０±２．２秒であった。ポジティブコントロール（３０ｍｇ／ｋｇ投与）のマウスの無動状態持続時間は、１７６．５±４．０秒であった。本実施例およびポジティブコントロールの無動状態持続時間は、危険率１％で有意差を有する。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００５８】
実施例１５
アルコール依存に対するカプシエイトの効果の検討を行った。すなわち、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ，第３５巻，第４８５〜４８７頁，１９９０年に記載の方法に従って試験を行った。
【００５９】
（１）薬物用量
カプシエイトを、各試行においてエタノール投与の３０分前に１００ｍｇ／ｋｇ経口投与した。
（２）実験方法
動物はウイスター系雄性ラットの８〜９週齢のものを使用した。動物は１群１０匹とした。実験装置は幅３０ｃｍ、長さ６０ｃｍ、高さ３０ｃｍのアクリル板製の２−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｂｏｘで、区画は中央に設置されているギロチンドアにより白及び黒区画に等分割されている。さらに、その床面は白区画では滑り難く、一方黒区画では滑り易く加工した、いわゆる白、黒の視覚刺激と床面の触覚刺激の両方を兼ね備えたシャトルボックスを用いた。
条件づけは１日１回、６日間行った。ラットにエタノール（０．５あるいは１ｇ／ｋｇ）あるいは生理食塩液を処置後、一方の区画内に５０分間入れ、翌日は前日とは異なる処置をしてもう一方の区画内に５０分間入れるという試行を３回繰り返した。なお、条件づけ手順の差による結果への影響を最小限にするため、カウンターバランス方式を用い、即ちエタノール処置群、生理食塩液処置群と白あるいは黒区画との組合せについては、４通りの組合せを行った。
【００６０】
１）エタノールと白、次の日は生理食塩液と黒
２）生理食塩液と黒、次の日はエタノールと白
３）エタノールと黒、次の日は生理食塩液と白
４）生理食塩液と白、次の日はエタノールと黒
また、対照として、エタノール処置の代わりに生理食塩液を投与した群を設け同様に条件付けを行った。
【００６１】
６日間の条件づけ試行の後、１５分間、各区画における滞在時間を測定する試験試行を行った。条件づけしたラットにはエタノール、生理食塩液のいずれの投与も行わず、装置には区画分割部であるボックス中央部に、白黒の中間色である灰色の金網製プラットフォーム（幅２ｃｍ，長さ５ｃｍ）を設置した。滞在時間の測定は、プラットフォーム上にラットを乗せ、その後、ラットが床に降り、自由に白黒両区画を行き来できる状況になってから１５分間、ラットの前足と頭部が区画内に入っている時間をその区画における滞在時間として測定した。なお、薬物処置区画に対する欲求効果、即ちｐｌａｃｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅは、薬物処置区画の滞在時間から生理食塩液処置区画の滞在時間を引いた値で求めた。
【００６２】
結果を表８に示す。エタノール処置区画に対する欲求効果は用量依存的に増加した。本実施例の試験試料はエタノール依存を抑制した（表８）。本実施例の試験試料は有意な効果を示した。なお、別実験では、本発明の試験試料は用量依存的にエタノール依存を抑制できることも確認されている。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００６３】
【表８】
【００６４】
実施例１６
アディポネクチン産生上昇確認試験
正常ヒト前駆脂肪細胞を使用し、１．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはヒト前駆脂肪細胞基礎培地を用いた。２４時間後に分化誘導添加剤とカプシエイトを加えた増殖培地に交換し、さらに１週間培養した。その後、培養上清中に産生されたアディポネクチン量をＥＬＩＳＡ法により定量した。各試料の評価結果を、ブランク（試料未添加）のアディポネクチン量を１００とした場合の相対値にて下記に示す。なお、添加したカプシエイト濃度は、１０μｇ／ｍｌであった。
【００６５】
上記試験結果：相対値＝３８１。この数値は、危険率１％で有意差を有する。
【００６６】
なお、以上の各種試験において、バニリルアルコールおよびカプサイシンをカプシエイトの替わりに用いた場合、有意な効果の確認はできなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カプシノイド化合物を有効成分とする各種治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カプシノイド化合物に種々の生理活性が存在することが知られている。例えば、血行促進作用（特許文献１）、血圧低下作用（特許文献２）、抗糖尿作用（特許文献３）等である。しかしながら、カプシノイド化合物が、下記で説明する本発明で適用される種々の疾病に、とりわけ顕著な効果でもって有効であるとの見地はない。
【特許文献１】特開２００７−２６９７１４号公報
【特許文献２】特開２００４−１４９４９４号公報
【特許文献３】特開２００３−３４２１７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、下記で説明する本発明で適用される種々の疾病に、とりわけ顕著な効果でもって有効である各種治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
請求項１に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病、自己免疫疾患、リウマチ、がん性疾患、炎症性疾患、動脈硬化、神経疾患、虚血再潅流障害、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、血管新生を伴う疾病、肝硬変、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病に伴う関節炎、脳虚血中および再潅流後の脳組織の損傷又はウイルス性疾患治療剤または予防剤である。
請求項２に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするカルシウム吸収促進剤である。
請求項３に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする抗骨粗鬆症剤である。
請求項４に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする二日酔い予防又は改善剤である。
請求項５に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルス感染阻害剤である。
請求項６に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする抗鬱・抗ストレス剤である。
請求項７に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする薬物依存症治療薬である。
請求項８に記載の発明は、カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするアディポネクチン産生促進剤である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、下記で説明する本発明で適用される種々の疾病に、とりわけ顕著な効果でもって有効である各種治療剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明で使用されるカプシノイド化合物は公知であり、例えば上記特許文献１〜３に記載されている。
すなわち、本発明で使用されるカプシノイド化合物とは、バニリルアルコール脂肪酸エステルであり、具体的にはカプシエイト、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト[4-hydroxy-3-methoxybenzyl decanoate (caprate)]、バニリルオクタノエイト[4-hydroxy-3-methoxybenzyl octanoate]等の各種直鎖脂肪酸とバニリルアルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。
また、上記特許文献１にも記載されているように、カプシノイド化合物は下記一般式（１）のように表すこともできる。
【０００７】
【化１】
【０００８】
（上記一般式（１）においてＲ１は、炭素数５〜１０のアルキル基又は炭素数５から１０のアルケニル基を示し、置換基を有していてもよい。）
【０００９】
ここで、Ｒ１で表される炭素数５〜１０のアルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状であってもよい。分岐鎖であることが好ましい。
【００１０】
Ｒ１で表される炭素数５〜１０のアルケニル基は、直鎖状でも分岐鎖状であってもよい。二重結合の部位は、トランス型が好ましい。
【００１１】
また、これらの基は任意に１〜４の置換基によって置換されていてもよく、置換基としては、アルキル基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、アミノ基、水酸基、アシル基、ニトロ基、シアノ基、チオール基等が挙げられる。中でも、炭素数１〜４の短鎖アルキル基により置換されたものが好ましい。置換基としてとくに好ましいのはメチル基、エチル基であって、末端のメチル側から数えて２位又は３位の炭素原子上の水素原子が置換されることが好ましい。
【００１２】
中でも本発明では、カプシノイド化合物として、カプシエイト、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイトが好ましい。
【００１３】
また、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイト等も好ましい。
【００１４】
上述したカプシノイド化合物は、トウガラシ属に属する植物体に多く含まれるものであるため、特許文献１に記載されているように、「CH-19甘」のようなトウガラシ属に属する植物体（以下「トウガラシ」という。）の植物体および／または果実から抽出・分離・精製することによって調製することができる。また、合成することも可能である（特許文献１を参照）。
【００１５】
本発明のカプシノイド化合物の投与量および投与回数は、ヒトであるか、それ以外の動物であるか、またそれらの性別、年齢、体重、症状の程度等によって適宜決定すればよいが、ヒトに経口投与する場合、成人１日あたり１〜５０ｍｇ／ｋｇであるのが好適である。ヒト以外の動物も同様である。また、カプシノイド化合物の投与の形態は、とくに制限されず、例えば固体、液体、ゾル、ゲル、粉末および顆粒状であることができる。
【００１６】
本発明のカプシノイド化合物は、各種健康食品および機能性食品として摂取可能である。これらの例としては、各種のものをあげることができるが、健康食品および機能性食品の製造に関しては、通常用いられる、食品素材、食品添加物に加え、賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、分散剤、保存剤、湿潤化剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化材、カプセル基剤等の補助剤を用いた飲食品製剤形態で利用することができる。該補助剤の具体的な例示をすれば、乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはその塩、アラビアガム、ポリエチレングルコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、プルラン、カラギーナン、デキストリン、還元パラチノース、ソルビトール、キシリトール、ステビア、合成甘味料、クエン酸、アスコルビン酸、酸味料、重曹、ショ糖エステル、植物硬化油脂、塩化カリウム、サフラワー油、ミツロウ、大豆レシチン、香料等が配合できる。このような健康食品、機能性食品の製造に関しては、医薬品製剤の参考書、例えば「日本薬局方解説書（製剤総則）」（廣川書店）等を参考にすることができる。
【００１７】
上記以外にも本発明のカプシノイド化合物は飲食品として摂取することができる。具体的には、プリン、クッキー、クラッカー、ポテトチップス、ビスケット、パン、ケーキ、チョコレート、ドーナツ、ゼリーなどの洋菓子、煎餅、羊羹、大福、おはぎ、その他の饅頭、カステラなどの和菓子、冷菓（飴等）、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば、きしめん等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ハム、ソーセージ、ハンバーグ、コーンビーフ等の畜肉製品や、塩、胡椒、みそ、しょう油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、甘味料、辛味料等の調味類や、明石焼き、たこ焼き、もんじゃ焼き、お好み焼き、焼きそば、焼きうどん等の鉄板焼き食品や、チーズ、ハードタイプのヨーグルト等の乳製品や、納豆、厚揚げ、豆腐、こんにゃく、団子、漬物、佃煮、餃子、シューマイ、コロッケ、サンドイッチ、ピザ、ハンバーガー、サラダ等の各種総菜や、各種粉末（ビーフ、ポーク、チキン等畜産物、海老、帆立、蜆、昆布等水産物、野菜・果実類、植物、酵母、藻類等）や、油脂類・香料類（バニラ、柑橘類、かつお等）を粉末固形化したものや、粉末飲食品（インスタントコーヒー、インスタント紅茶、インスタントミルク、インスタントスープ、味噌汁等）等の各種食品が挙げることができるが、これらに特に制限されない。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例によってさらに説明するが、本発明は下記例に制限されない。
【００１９】
実施例１
本発明で使用されるカプシノイド化合物は、カプサイシンやバニリルアルコール等の非カプシノイド化合物に比べて顕著に優れたアポトーシス誘発活性、抗酸化活性を有すると考えられ、これにより、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病、自己免疫疾患、リウマチ、がん性疾患、炎症性疾患、動脈硬化、神経疾患、虚血再潅流障害、毒性ショックやある種のサイトカインによる治療等による全身性血圧低下、血圧応答低下、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、血管新生を伴う疾病、肝硬変、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病に伴う関節炎、脳虚血中および再潅流後の脳組織の損傷又はウイルス性疾患治療剤または予防剤として有効であると考えられる。前記各種疾病に対するカプシノイド化合物の投与形態は、現在医学的に許容されている手段であれば制限されない。また、飲食品として投与することもできる。
【００２０】
アポトーシス誘発試験
（１）５６℃、３０分間処理したウシ胎児血清（ＪＲＩＩ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）にて３７℃で培養したＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＲＰＭＩ１６４０培地にて２．５×１０５細胞／４．５ｍｌとなるように懸濁した。
この懸濁液４．５ｍｌに対し、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭのカプシエイト水溶液を５００μｌ添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で、２４時間培養した。
培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、最終濃度５０μＭ以上のカプシエイト添加培養細胞に核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお、対照の生理食塩水５００μｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
次いで、上記と同様の方法で２４時間と４８時間培養した細胞を用い、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズアポトーシス実験プロトコール（秀潤社）第１２９〜１３０頁記載の方法でＦＡＣＳｃａｎを用いたアポトーシス細胞の測定、イオマニュアルＵＰシリーズ 最新アポトーシス実験法（羊土社）第６１〜６３頁記載の方法でＤＮＡの断片化の解析を行った。その結果、最終濃度５０μＭ以上のカプシエイト添加培養細胞にアポトーシス細胞を、５０、１００μＭのカプシエイト添加培養細胞にＤＮＡの断片化を確認した。なお、対照の生理食塩水５００μｌ添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。
（２）上記（１）と同様の方法で２４時間培養した細胞を一部サンプリングし、０．４％トリパンブルーで染色後、光学顕微鏡で観察し、染色されていない生細胞と青く染色された死細胞の細胞数の測定を行い、生残率が５０％になるカプシエイトの濃度［生残率５０（μＭ）］をもとめた。その結果、８０．０μＭであった。以上のとおり、カプシエイトはアポトーシス誘発作用によるがん細胞増殖抑制活性を示した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００２１】
実施例２
過酸化脂質ラジカル産生抑制試験
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）３Ａ（ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー、ＮＣＴＣ ８３１９）を５ｍｌのブレインハートインフュージョン培地（ディフコ社製、００３７−１７−８）に接種し、３７℃で１晩培養した。遠心によって菌体を集め、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄した後、１×１０７コロニー形成単位／ｍｌになるようにリン酸緩衝食塩水に懸濁した。１００μｌの上記菌懸濁液、１００μｌの１０、１００ｍＭのカプシエイト水溶液、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌメトヘモグロビン（シグマ社製、Ｍ９２５０）水溶液および６００μｌのリン酸緩衝食塩水および１００μｌの５０ｍＭ ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（片山化学社製、０３−４ ９９０）水溶液を混合して３７℃で３０分間反応させた。１ｍｌの２×ＮＭＰ培地［８ｇのニュートリエントブロス（ディフコ社製、０００３−０１−６）、５ｇのトリプトン（ディフコ社製、０１２３−１７−３）、５ｇのＮａＣｌ、１０ｇのマンニトール（ナカライテスク社製、２１３−０３）、０．０３５ｇのフェノールレッド（ナカライテスク社製、２６８−０７）を蒸留水に溶解して５００ｍｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整後、ろ過滅菌したもの］を加えて反応を停止し、ＮＭＰ培地（２×ＮＭＰ培地を滅菌水で２倍希釈したもの）で３倍ずつ１２段階希釈したもの各１６０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れ、３７℃で１晩培養した。培地の色を肉眼で観察し、菌が生育して培地が赤色から黄色に変化したウェルが見られた試料を過酸化脂質ラジカル産生抑制活性を持つものとした。
その結果を表１に示す。表１において、＋は菌の生育したウェルが見られた試料を、−は菌の生育したウェルが見られなかった試料を示す。また、表の最上列に示した濃度はｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドおよび菌体と３７℃で３０分間反応させた反応液中のカプシエイトの濃度である。
【００２２】
【表１】
【００２３】
以上の結果、カプシエイトには過酸化脂質ラジカル産生抑制活性が見られた。ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００２４】
実施例３
ＮＯ産生抑制試験
（１）１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ライフテックオリエンタル社製、２５０３０−１４９）含有ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製、１２−９１７Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ７１）を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間培養した。各ウェルに１０μｌの２５μｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製、Ｌ−２０１２）、５００Ｕ／ｍｌインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ、コスモバイオ社販売 ＧＺＭ−ＭＧ−１ＦＮ）水溶液と１０μｌの２５０、５００μＭ カプシエイト水溶液を添加してさらに１２時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳとＩＮＦ−γを加えない区分およびカプシエイトを加えない区分を設定した。
上記培養後、１００μｌの培地に１００μｌの４％グリース試薬（シグマ社製、Ｇ４４１０）を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。測定はすべて３連で行った。
この結果、カプシエイトは濃度依存的にＬＰＳとＩＮＦ−γによるＮＯ産生誘導を抑制することが明らかとなった。
（２）１０％ウシ胎児血清含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で６時間培養した。カプシエイトを０．５ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液を、各ウェルに１０μｌずつそれぞれ添加し、さらに、０．５時間あるいは５時間培養した。その後、各ウェルに１０μｌの５μｇ／ｍｌ ＬＰＳ、２０００Ｕ／ｍｌ ＩＮＦ−γ水溶液を添加して、１２時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、対照としてＬＰＳ、ＩＦＮ−γを加えない区分およびカプシエイトを加えない区分を設定した。
上記培養後、１００μｌの培養上清に１００μｌの４％グリース試薬を加え、室温で１５分間放置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に溶解した既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。
測定は全て３連で行った。
この結果、ＬＰＳ、ＩＦＮγ添加前、カプシエイト存在下０．５時間培養した区分より、５時間培養した区分で、より強いＮＯ産生抑制が認められた。
以上、カプシエイトはＮＯ産生抑制作用を示した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００２５】
実施例４
抗変異原性試験
抗変異原性試験を、変異の強さをβ−ガラクトシダーゼの活性で判定できるｕｍｕテストによる環境変異原の検出法［ミューテーション・リサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｃｈ）、第１４７巻、第２１９頁（１９８５）］に準じた方法で行った。すなわち、５０μｌの各濃度（１．０、５．０、１０、１５ｍＭ）に調製したカプシエイトに２５μｌの変異原物質［マイトマイシンＣ（ＤＮＡ架橋剤）１０μｇ／ｍｌ、４−ニトロキノリン−１−オキシド（ＮＱＯ、ＤＮＡメチル化剤）７μｇ／ｍｌ］を添加した。この混合液にあらかじめＴＧＡ培地中でＯＤ６００で０．１２まで培養しておいたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｌｉｕｍ ＴＡ１５３５／ｐＳＫ１００２を最終容量１．５ｍｌになるように加えて、３７℃で２時間振とり培養を行った。この培養液２００μｌを使用してミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）の方法［エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第３５２頁（１９７２）］に従ってβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
この表から明らかな様に、カプシエイトは抗変異原活性を表した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００２８】
実施例５
制がん活性試験
（１）日本チャールスリバー社より４週令、雄性のヌードマウス（ＳＰＦ／ＶＡＦＢａｌｂ／ｃＡｎＮＣｒｊ−ｎｕ）を購入し、１週間予備飼育した。このマウスにヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）を１．５×１０６細胞／マウスとなるように皮下移植した。
大腸がん細胞株移植２週間目から、カプシエイトを５００μｇ／ｍｌ含む飲料水を自由に摂取させた。マウス１匹当り１日平均３．５ｍｌ摂取していた。また飼育用餌としてオリエンタル酵母社製のＭＦを自由に摂取させた。
カプシエイト投与開始後４週間目にカプシエイト投与群の各マウスの固形がんを摘出し、その重量を、通常の飲料水を摂取させた対照群の固形がん重量と比較した。なお、本試験は各群１０匹で行った。
その結果、制がん試験用被検液の経口投与群において有意のがん増殖抑制が認められた。
（２）５週齢の雌性ｄｄＹ系マウス（体重約２５ｇ）１８匹を用い、エーリッヒ癌を腹腔内投与（１．２×１０６細胞／マウス）し、３０日間観察し、平均生存日数および３０日間生存数を算定した。１群６匹でコントロール群、カプシエイト２ｍｇ／ｋｇ投与群およびカプシエイト２０ｍｇ／ｋｇ投与群の３群を設定した。カプシエイトは、癌投与の翌日より４日間腹腔内投与した。
結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】
【００３０】
以上、カプシエイトは制がん活性を示した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００３１】
実施例６
メラニン産生抑制試験
６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェル／２ｍｌ培地となるように１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したマウスメラノーマ細胞Ｂ１６ＢＬ６を分注し、３７℃でインキュベートした。２日目に、１００μｌのカプシエイト溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、７日目に培地を交換し、同時に１００μｌのカプシエイト溶液（２ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加した。８日目に細胞を回収し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を分解処理した後、４００ｎｍの吸光度を測定し、メラニン産生抑制作用を検定した。
すなわち、培地を吸引除去した後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に溶解した０．２５％トリプシンを１ウェル当り０．３ｍｌ添加し、３７℃で１０分インキュベートした。つぎに、２ｍｌの新しい培地を添加し、細胞を懸濁して試験管に回収した。ついで、培地を遠心除去した後、２ｍｌのＰＢＳで細胞を懸濁し、再度遠心分離した。上清を除去した後、細胞に３０μｌの５ｍＭ塩化マンガンを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）と１μｌの７００００Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）を加えて良く混合した後、３７℃で２時間インキュベートして、ＤＮＡを分解した。そして１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ加え、５０℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを分解した。最後に１００μｇ／ｍｌのプロテイネースＫ（シグマ社製）、０．１％トリトンＸおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．８）を細胞数２×１０６に対して液の総量が２００μｌとなるように加え、３７℃で１６時間インキュベートした後、４００ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、カプシエイトにメラニン産生阻害活性が認められ、その美白効果が確認された。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００３２】
実施例７
α−グルコシダーゼ阻害試験
（１）α−グルコシダーゼ発色基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドに酵母由来α−グルコシダーゼを作用させ、加水分解して遊離する４−ニトロフェノールを比色法で定量することにより、カプシエイトのα−グルコシダーゼ阻害活性を測定した。すなわち、１０μｌのα−グルコシダーゼ溶液［４０ｍＵ／ｍｌ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来、シグマ社製、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］に１０μｌの検体を含む溶液［１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］を混合した後、１．５ｍｇ／ｍｌの基質溶液［シグマ社製、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（３７℃）に溶解］を８０μｌ添加して反応を開始した。３７℃で４０分間反応後、４１０ｎｍ（島津ｕｖ２２００）における吸光度を測定した。その結果を表４に示す。なお、この場合の残存活性は検体を添加していないものを１００％として算出した。
【００３３】
【表４】
【００３４】
上記の結果より、カプシエイトはα−グルコシダーゼ阻害活性を示した。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００３５】
実施例８
抗リウマチ試験
ヒト慢性リウマチ患者の滑膜から樹立された繊維芽細胞株であるＤＳＥＫ細胞を１０％ＦＢＳ（バイオウイタッカー社製）を含むＩｓｃｏｖ−ＭＥＭ培地（ＩＭＤＭ：ギブコＢＲＬ社製）にて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で細胞が培養器に飽和になるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（バイオウイタッカー社製）で細胞を３×１０４細胞／ｍｌとなるように上記培地に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに２００μｌずつ分注した。培養５〜７日後、ほぼ細胞が８０％飽和になった時で培地を交換し、２５、５０、７５、１００、２００、もしくは４００μＭのカプシエイトを含有する２００μｌの上記培地を加えた。
２４時間、７２時間経過時に１０μｌのプレミックスＷＳＴ−１（宝酒造社製、ＭＫ４００）を加えて３７℃で３．５時間反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）から６５０ｎｍにおける吸光度（Ａ６５０）を差し引いた値を細胞増殖度とした。
その結果を表５に示す。
【００３６】
【表５】
【００３７】
以上、イン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのリウマチモデル−ＤＳＥＫ細胞において、カプシエイトを添加した場合、ＰＢＳ添加の対照区と比べて各化合物添加区はリウマチ細胞の増殖が強く抑制された。また、経時的な観察において、これらの化合物は増殖抑制活性を継続するのみならず、経時的に活性を増強する傾向が認められた。
以上の結果によって、カプシエイトは強い抗リウマチ活性があり、慢性リウマチに対する有用な治療薬と健康食品として開発されることが期待される。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
また、ＤＳＥＫ細胞培養において、２４時間、７２時間経過時に１５０μｌ／ウェルの培養上清を回収し、この細胞由来のサイトカン（ヒトＴＧＦ−β、ヒトＦＧＦ−β、ヒトＩＬ−１αおよびヒトＩＬ−１０）産生（発現の影響）に対する、カプシエイトの影響を、それぞれのサイトカインに特異的なＥＴＩＳＡ−Ｋｉｔ（ヒトＦＧＦ−βとヒトＩＬ−１０、ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製；ヒトＩＬ−１αとヒトＴＧＦ−β、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。
その結果、カプシエイトはヒトＩＬ−１αの産生抑制作用、ヒトＩＬ−１０の産生増強作用、ヒトＦＧＦ−βの産生抑制作用、およびヒトＴＧＦ−βの産生増強作用を示した。
【００３８】
実施例９
プロスタグランジンＥ２産生抑制試験
１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改良イーグル培地にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、４８ウェルマイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で６時間培養した。カプシエイトを０．５ｍＭとなるように水に溶解し、ろ過滅菌した水溶液を、各ウェルに１０μｌずつ添加し、さらに、０．５時間あるいは５時間培養した。その後、各ウェルに５０μｇ／ｍｌ ＬＰＳ水溶液１０μｌを添加して、１２時間培養した後、プロスタグランジンＥ２の量を測定した。なお、対照としてＬＰＳを加えない区分およびカプシエイトを加えない区分を設定した。
上記培養後、培養上清中のプロスタグランジンＥ２量をプロスタグランジンＥ２ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（ネオジェン社製、Ｃｏｄｅ．４０４１１０）を用い測定した。測定は全て３連で行った。
その結果、カプシエイトはＬＰＳによるプロスタグランジンＥ２産生誘導を抑制した。また、ＬＰＳ添加前、カプシエイト存在下０．５時間培養した区分より、５時間培養した区分で、より強いプロスタグランジンＥ２産生抑制が認められた。
【００３９】
実施例１０
カルシウム吸収促進試験
９週齢のＳＤ計雄性ラット６匹を１群とし、セルロースを１０重量％含む対照食を対照群、このセルロースの１０重量％の一部をカプシエイト（試験試料）に置き換えたものを実施例１０群とした。なお、実施例１０群において、前記カプシエイトは、摂取量として１日平均５００μｇ／ｋｇとなるように、実験飼料中の試験試料の濃度を調整した。なお、実験飼料は２時間おきに交換した。
【００４０】
【表６】
【００４１】
水と対照食あるいは実施例１０の飼料を５日間自由に摂取させ、給餌開始後３日目より２日間出納実験を行った。飼料摂取量は給餌した飼料の重量から残された飼料の重量を差し引くことにより求めた。出納実験終了後、糞を採取し、１１０℃の恒温器内で３時間乾燥させた。この糞を粉砕機で砕き、さらに乳鉢で細かくすり潰した後、３Ｎの塩酸に溶解し、カルシウムの含有量を市販のカルシウム測定キットを用いて測定し、糞中のカルシウム含有率を求めた。各実験飼料中のカルシウム含有率は０.５３６％であり、下式によりカルシウム（Ｃａ）の見かけの吸収率を算出した。
【００４２】
【数１】
【００４３】
その結果、カルシウム吸収率は対照群が４８．５０±２．５５（％）であったのに対し、実施例１０群が６１．６０±３．０９（％）であり、危険率１％で有意差が示された。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００４４】
実施例１１
骨粗鬆症改善効果試験
ＳＤ系ラット（２２週齢）メスの卵巣を外科的に取り除き、骨粗鬆症のモデルラットを作成した。卵巣摘出ラットを７匹ずつ６群に分け、３５日間の試験期間中、１日置きに（計１７回）、カプシエイトを、５００μｇ／ｋｇとなるように生理食塩水に分散させて経口投与した。飼料はオリエンタル酵母株式会社のマウス・ラット・ハムスター用固形飼料ＣＲＦ−１を用い、給餌および給水方法は自由摂取とした。試験期間中、各群間で、餌の摂取量に差は認められなかった。試験開始後３５日目にラットの体重を測定した後、大腿骨を取り出した。大腿骨は、接着組織および筋肉を取り除いて分析に使用した。大腿骨の体積を測定した後、エタノールで３回洗浄し、次にアセトンで３回洗浄したのち、一晩乾燥し、その後、重量を測定して大腿骨の乾燥重量を求めた。体積および乾燥重量から、骨密度（乾燥重量ｇ／体積ｍｍ3 ）を測定した。なお対照実験として、前記試験試料を含まない生理食塩水をラットに投与したこと以外は、上記実験を繰り返した例（比較例）も併せて、その結果を表７に示す。
【００４５】
【表７】
【００４６】
実施例１１と比較例とを対比したところ、実施例１１はp＜0.05の危険率で有意差が認められた。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００４７】
実施例１２
二日酔い改善効果試験
以下の処方にてジュースを調製した。
冷凍濃縮オレンジ果汁 ５．０質量部
果糖ブドウ糖液糖 １．０質量部
クエン酸 ０．１０質量部
Ｌ−アスコルビン酸 ０．０９質量部
カプシエイト （適当量）
【００４８】
エタノールパッチテストでアルデヒド脱水素酵素欠損型と判定された健常人５名（年齢２５〜３２才、男性３名、女性２名）をパネルとし、上記ジュースおよび上記ジュースからカプシエイトを除いた対照ジュースを用いた。なお、上記ジュースにおけるカプシエイトの量は、下記の試験において摂取量が５０ｍｇとなるようにした。
【００４９】
ジュースおよび対照ジュース服用後２０分にビール（アルコール濃度約 ５．５％）１３５ml を飲酒させて、飲酒後２０分での自覚症状を質問票で回答させた。
パネルテストは順序効果を考慮し、ブラインドで行い、同一時間帯に日を変えて実施した。
自覚症状の評価は１〜５（１：症状なし、２：やや症状あり、３：症状あり、４：ややひどい、５：ひどい）の５段階で行い、Paired-t 検定により有意差を検定した。
【００５０】
結果を以下に示す。実施例１２のジュースは、危険率 ５％で酔いの程度および顔のほてりを改善し、悪酔いを予防することが明らかになった。
【００５１】
ジュースおよび対照ジュースの悪酔い予防効果（平均値）
実施例１２のジュース：
酔いの程度２．２＊
顔のほてり２．０＊
心臓の鼓動２．５
眠気の程度３．３
対照ジュース：
酔いの程度３．５
顔のほてり３．７
心臓の鼓動３．３
眠気の程度３．４
＊：対照ジュースに比べて有意差あり（P<0.05）
また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００５２】
実施例１３
抗インフルエンザウイルス効果
カプシエイトの抗インフルエンザウイルス効果について、ＦＦＵ ａｓｓａｙ（Ｆｏｃｕｓ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ Ａｓｓａｙ）により阻害率を測定し評価した。対象としたウイルスは、Ｈ５Ｎ１のトリインフルエンザウイルス（Ａ／Ｋｙｏｔｏ／０４）を用いた。
【００５３】
まず、９６穴マイクロプレートにカプシエイトを水に分散させた１％希釈液を５０μｌ入れた。次に、トリインフルエンザウイルスを約２００ＦＦＵ／５０μｌ ＭＥＭ加え、混和し３０分静置した。そして、９６穴マイクロプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を加え、上記トリインフルエンザウイルスを感染させ、１６時間培養した。その後、細胞をエタノールで固定し、抗Ａ型ＮＰ(核蛋白質)モノクローナル抗体を用いて酵素抗体法により感染細胞（１ＦＦＵ＝１感染性ウイルス）を染色し、感染細胞数を数え、下記式により、トリインフルエンザウイルスの感染率（％）を測定した。
感染率（％）＝（カプシエイトを添加したウエルのＦＦＵ）／（カプシエイトを添加しないウエルのＦＦＵ） × １００
【００５４】
その結果、感染率は４％であり、カプシエイトのインフルエンザ感染阻害効果が確認された。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００５５】
実施例１４
マウス強制水泳試験による精神安定作用の評価
本実施例の抗鬱・抗ストレス評価は、１９７７年にPorsoltにより開発されたマウス強制水泳試験を採用した。本試験は鬱病の動物モデル実験として最も多用される方法のひとつである。本試験では、マウスをある限られたスペースの中で強制的に泳がせて「無動状態」を惹起させる。この無動状態は、ストレスを負荷された動物が水からの逃避を放棄した一種の「絶望状態」を反映するものと考えられ、ヒトにおける鬱状態、ストレス状態と関連づけられている。事実、抗鬱薬は特異的にこの状況下における無動状態の持続時間を短縮させることがわかっており、この短縮作用は臨床力価との間に有意な相関を有することが認められている。
【００５６】
本試験方法は次のとおりである。
２５℃の水を深さ１５ｃｍまで入れたプラスチック円筒中でマウスを強制水泳させる。５分間の強制水泳後、３０℃の乾燥機中で１５分間乾燥し、ホームケージに戻す。翌日マウスに試験試料を腹腔内投与して、その１時間後に再び５分間の強制水泳を課し、現れた無動状態の持続時間をストップウォッチを用いて測定する。マウスが水に浮かんで静止している状態を無動状態と判定する。無動状態持続時間については有意差検定を行い、統計学的に有意差を検定する。実験には雄のｄｄYマウスを使用し、１群６匹とする。なお、試験は全て午後１時から午後６時の間に行う。また、ポジティブコントロールとして抗鬱薬であるイミプラミンを用いた試験も行う。
【００５７】
その結果、カプシエイトを３０ｍｇ／ｋｇ投与したマウスの無動状態持続時間は、１７０．１±８．０秒であった。コントロール（生理食塩水のみ）は２１５．０±２．２秒であった。ポジティブコントロール（３０ｍｇ／ｋｇ投与）のマウスの無動状態持続時間は、１７６．５±４．０秒であった。本実施例およびポジティブコントロールの無動状態持続時間は、危険率１％で有意差を有する。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００５８】
実施例１５
アルコール依存に対するカプシエイトの効果の検討を行った。すなわち、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ，第３５巻，第４８５〜４８７頁，１９９０年に記載の方法に従って試験を行った。
【００５９】
（１）薬物用量
カプシエイトを、各試行においてエタノール投与の３０分前に１００ｍｇ／ｋｇ経口投与した。
（２）実験方法
動物はウイスター系雄性ラットの８〜９週齢のものを使用した。動物は１群１０匹とした。実験装置は幅３０ｃｍ、長さ６０ｃｍ、高さ３０ｃｍのアクリル板製の２−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｂｏｘで、区画は中央に設置されているギロチンドアにより白及び黒区画に等分割されている。さらに、その床面は白区画では滑り難く、一方黒区画では滑り易く加工した、いわゆる白、黒の視覚刺激と床面の触覚刺激の両方を兼ね備えたシャトルボックスを用いた。
条件づけは１日１回、６日間行った。ラットにエタノール（０．５あるいは１ｇ／ｋｇ）あるいは生理食塩液を処置後、一方の区画内に５０分間入れ、翌日は前日とは異なる処置をしてもう一方の区画内に５０分間入れるという試行を３回繰り返した。なお、条件づけ手順の差による結果への影響を最小限にするため、カウンターバランス方式を用い、即ちエタノール処置群、生理食塩液処置群と白あるいは黒区画との組合せについては、４通りの組合せを行った。
【００６０】
１）エタノールと白、次の日は生理食塩液と黒
２）生理食塩液と黒、次の日はエタノールと白
３）エタノールと黒、次の日は生理食塩液と白
４）生理食塩液と白、次の日はエタノールと黒
また、対照として、エタノール処置の代わりに生理食塩液を投与した群を設け同様に条件付けを行った。
【００６１】
６日間の条件づけ試行の後、１５分間、各区画における滞在時間を測定する試験試行を行った。条件づけしたラットにはエタノール、生理食塩液のいずれの投与も行わず、装置には区画分割部であるボックス中央部に、白黒の中間色である灰色の金網製プラットフォーム（幅２ｃｍ，長さ５ｃｍ）を設置した。滞在時間の測定は、プラットフォーム上にラットを乗せ、その後、ラットが床に降り、自由に白黒両区画を行き来できる状況になってから１５分間、ラットの前足と頭部が区画内に入っている時間をその区画における滞在時間として測定した。なお、薬物処置区画に対する欲求効果、即ちｐｌａｃｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅは、薬物処置区画の滞在時間から生理食塩液処置区画の滞在時間を引いた値で求めた。
【００６２】
結果を表８に示す。エタノール処置区画に対する欲求効果は用量依存的に増加した。本実施例の試験試料はエタノール依存を抑制した（表８）。本実施例の試験試料は有意な効果を示した。なお、別実験では、本発明の試験試料は用量依存的にエタノール依存を抑制できることも確認されている。また、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイト、バニリルデカノエイト、バニリルオクタノエイト、バニリルウンデカノエイト、バニリル９−メチルデカノエイト、バニリル６−メチルオクタノエイト、バニリル７−メチルノナノエイト、バニリル８−メチルデカノエイトも同様の活性を示した。
【００６３】
【表８】
【００６４】
実施例１６
アディポネクチン産生上昇確認試験
正常ヒト前駆脂肪細胞を使用し、１．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはヒト前駆脂肪細胞基礎培地を用いた。２４時間後に分化誘導添加剤とカプシエイトを加えた増殖培地に交換し、さらに１週間培養した。その後、培養上清中に産生されたアディポネクチン量をＥＬＩＳＡ法により定量した。各試料の評価結果を、ブランク（試料未添加）のアディポネクチン量を１００とした場合の相対値にて下記に示す。なお、添加したカプシエイト濃度は、１０μｇ／ｍｌであった。
【００６５】
上記試験結果：相対値＝３８１。この数値は、危険率１％で有意差を有する。
【００６６】
なお、以上の各種試験において、バニリルアルコールおよびカプサイシンをカプシエイトの替わりに用いた場合、有意な効果の確認はできなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病、自己免疫疾患、リウマチ、がん性疾患、炎症性疾患、動脈硬化、神経疾患、虚血再潅流障害、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、血管新生を伴う疾病、肝硬変、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病に伴う関節炎、脳虚血中および再潅流後の脳組織の損傷又はウイルス性疾患治療剤または予防剤。
【請求項２】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするカルシウム吸収促進剤。
【請求項３】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする抗骨粗鬆症剤。
【請求項４】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする二日酔い予防又は改善剤。
【請求項５】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項６】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする抗鬱・抗ストレス剤。
【請求項７】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする薬物依存症治療薬。
【請求項８】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするアディポネクチン産生促進剤。
【請求項１】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病、自己免疫疾患、リウマチ、がん性疾患、炎症性疾患、動脈硬化、神経疾患、虚血再潅流障害、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、血管新生を伴う疾病、肝硬変、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病に伴う関節炎、脳虚血中および再潅流後の脳組織の損傷又はウイルス性疾患治療剤または予防剤。
【請求項２】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするカルシウム吸収促進剤。
【請求項３】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする抗骨粗鬆症剤。
【請求項４】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする二日酔い予防又は改善剤。
【請求項５】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項６】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする抗鬱・抗ストレス剤。
【請求項７】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とする薬物依存症治療薬。
【請求項８】
カプシノイド化合物を有効成分とすることを特徴とするアディポネクチン産生促進剤。
【公開番号】特開２００９−１２０５４４（Ｐ２００９−１２０５４４Ａ）
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９６６３８（Ｐ２００７−２９６６３８）
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（７０７０００６９１）辻堂化学株式会社 (104)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（７０７０００６９１）辻堂化学株式会社 (104)
【Ｆターム（参考）】
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