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治療法および診断法において使用される光学活性なナノ粒子
説明

治療法および診断法において使用される光学活性なナノ粒子

【課題】改良された熱の局所的送達方法および生物材料の局所的画像化方法の提供。
【解決手段】ナノ粒子を電磁放射に曝露する工程を含む細胞または組織の画像診断方法に使用されるナノ粒子製剤であって、前記ナノ粒子はコアおよびシェルを有するナノシェルを包含し、前記コア材は誘電性または半導性であり、前記シェル材は導電性であるナノ粒子製剤。
【効果】送達はインビトロでもインビボでもよく、癌、炎症または組織の過剰増殖を伴う他の障害の局所的処置に有用である。また本方法は画像診断にも有用である。本方法では、細胞または組織にナノ粒子を送達し、それらのナノ粒子が熱を放出するような条件で前記ナノ粒子を励起源に曝露することにより、前記細胞または組織で高熱を局所的に誘発する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、米国仮特許出願第60/181,109号(2000年2月8日出願)の優先権を主張する。
【0002】
米国特許出願第09/038,377号(1998年4月10日出願)、米国特許出願第60/222,437号(2000年8月1日出願)および国際特許出願PCT/US00/19268(2000年7月14日出願)は、明示的および全体的に参考として本明細書中に組み込まれる。
【0003】
本発明は政府援助によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【0004】
(発明の背景)
多くの適用において、局在化された加熱または画像化のために細胞および組織を標的化することは望ましい。治療効果は、ガン性の細胞および組織を破壊することから、良性腫瘍および他の組織の治療的除去または整形的除去にまで及ぶ。局在化された正確な加熱および照射を行う技術により、様々な治療的利益および診断的利益を享受することができ、一方で、付近の細胞および組織に対する付随的な損傷を最小限にすることができる。細胞および組織のそれぞれの誘導された高熱療法および画像化を行うインビトロおよびインビボの両方での治療的適用および診断的適用に対してそのような様々な技術を容易に実施できることが望ましい。
【0005】
そのような技術の潜在的に有用なインビボ適用はガンの処置においてである。例えば、転移性前立腺ガンはアメリカ男性の主要な死因の1つである。推定により、米国内では11人の男性のうち2人以上の割合で前立腺ガンが発症することが示されている。局所的疾患の程度を正確に決定することは困難であることが多い。局在化した前立腺疾患を正確に検出し、画像化する方法が非常に求められている。さらに、局在化した前立腺ガンは、一般に、根治的前立腺切除または放射線療法のいずれかによって処置されている。これらの手法はともに、著しい罹患率によって悩まされている。関連した罹患率が低い最小限の浸襲的処置法を実現させることが可能であるはずであり、そしてそのような方法は前立腺ガンの治療を劇的に改善するはずである。
【0006】
数多くの技術が、治療剤および診断剤を腫瘍に指向させるために研究されている。これらには、腫瘍細胞表面分子の標的化、活性化された内皮細胞の様々な領域を標的化すること、腫瘍に関連した密集した漏出しやすい血管系を利用すること、および腫瘍に関連して高まった代謝活性およびタンパク質分解活性を利用することが含まれる。抗体を標識することが、治療剤および診断剤の細胞選択的標的化を達成するために広範囲に使用されている。数多くの方法が、治療剤の抗体標的化のために採用されている。これらには、インターフェロン−α(Ozzello他、1998)、腫瘍壊死因子(Moro他、1997)およびサポリン(Sforzini他、1998)などの薬物に対して抗体をコンジュゲート化することが含まれる。抗体のコンジュゲート化はまた、放射免疫療法および放射免疫検出のための放射性同位体を腫瘍に標的化するために使用されている(Zhu他、1998)。現在、シンチグラフィー標的にコンジュゲート化された、前立腺特異的膜抗原に対する抗体である、前立腺ガンを検出するための製品(ProstaScint)が市販されている(Gregorakis他、1998)。免疫リポソームまたはアフィニティーリポソームは、抗体がその表面にコンジュゲート化されているリポソーム薬物キャリアである。これらの薬物キャリアは、ガン性細胞を破壊するためにドキソルビシンなどの細胞傷害性薬剤とともに負荷することができる。抗体の標的化はまた、現在、細胞選択的な遺伝子治療について検討中である。
【0007】
単鎖抗体をその表面に示し、非常に様々な細胞タイプの特異的な標的化を可能にするウイルス粒子が開発されている(Yang他、1998;Jiang他、1998;Chu&Dornburg、1997;Somia他、1995)。活性化された内皮細胞の様々な領域を標的化するために、E−セレクチンに対する抗体をその表面に有する免疫リポソームが作製されている。類似した標的化効率を小さい腫瘍特異的ペプチドにより達成することは可能であり得る(Pasqualini他、1997)。最近、腫瘍の画像化が、プロテアーゼによって活性化される近赤外蛍光プローブを使用して行われている(Weissleder、1999)。これらの薬剤は全身投与することができ、そして豊富に存在し、漏出しやすい血管系のために腫瘍に蓄積して、上昇したタンパク質分解酵素によって活性化された。
【0008】
本発明の主題であるナノ粒子はこれらのタイプの標的化方法論に適用することができる。ナノ粒子の表面は、抗体、ペプチドまたは他の細胞特異的成分で容易に修飾することができる。このようなナノ粒子の1つの具体的な実施形態は放射線の吸収剤として作用する。これらのナノ粒子は調節可能な励起波長を有し、そして熱の放射によって基底状態に戻る非放射性崩壊を受ける。この熱を、局所的な高熱療法を行うために使用することができる。あるいは、これらのナノ粒子は、吸収剤として作用することに加えて、光を散乱し、それにより、ナノ粒子が存在する局所的な環境を画像化する手段としての造影剤として作用し得る。同様に本発明の主題である他のナノ粒子は、強力な可視および赤外の蛍光基である。その強力な放射は画像化適用において使用される。固体金属ナノ粒子(すなわち、均一組成およびナノメーターの大きさの固体の単一金属球体)は興味深い光学的性質を有することが知られている。特に、金属ナノ粒子は顕著な光学的共鳴を示す。金属ナノ粒子は、この点で金属コロイドと類似しており、光に対する金属の集団的な電子的応答のために強い光学的吸収を示す。金属コロイドは、強い光学的吸収、および極端に大きく、速い三次の非線形光学的(NLO)偏光性を含む様々な有用な光学的性質を有する。これらの光学的性質は、電磁場に対する金属性粒子内の電子の相的応答に起因する。この集団的な電子励起はプラズモン共鳴として知られている。共鳴時に、薄い金属コロイド溶液は、既知物質の最大の電子的NLO感受性を有する。しかし、これらの溶液の利用性は、そのプラズモン共鳴が比較的狭い波長範囲に限定され、そして容易にシフトさせることができないために制限されている。例えば、直径が10nmである銀粒子は約355nmにおいて光を最大に吸収するが、類似したサイズの金粒子は約520nmにおいて最大の吸収を示す。これらの吸収最大値は、粒子サイズの変化および粒子上の様々な誘電性コーティングに対して影響されない。しかし、本発明のナノ粒子は、そのプラズモン共鳴における指向されたシフトをより受けやすく、従って、様々な吸収波長または散乱波長がこれらの固体金属ナノ粒子を褐色にする。
【0009】
励起したときに熱を発する組成物を治療的に使用するために様々な努力が以前になされていた。しかし、これらは本発明とは区別することができる。米国特許第4,983,159号において、Randは、交流磁場に供されたときに加熱ヒステリスを示す粒子を使用して高温療法を新生物に導入することを記載している。しかし、この' 159号特許において使用された粒子は、より適切にはマイクロ粒子として記載され、本明細書中で使用される類似的なナノ粒子よりもはるかに大きい。米国特許第4,106,488号および同第4,303,636号(ともにGordon)には、ナノメートルスケールの大きさの粒子が記載される。しかし、励起源が、本明細書中で使用される励起源とは異なっており、本発明の範囲には含まれない。そのため、これらのより以前の研究の基礎をなす物理的励起機構は本発明の機構とは異なると考えられる。
【0010】
固体金属ナノ粒子の多くの適用を実現することに対する一連の実際的な制限は、プラズモン共鳴を技術的に重要な波長において存在させることができないということである。例えば、直径が10nmである固体の金ナノ粒子は、プラズモン共鳴の中心が520nmにある。このプラズモン共鳴は、粒子直径または特異的な埋め込み媒体を変化させることによって約30ナノメートルよりも大きく制御可能なほどにシフトさせることができない。
【0011】
この問題を克服する1つの方法は、小さい非導電性粒子をこれらの金属でコーティングすることである。例えば、Au2 S粒子上でのAuの還元(硫化ナトリウムによるクロロ金酸の還元)により、金コロイドの吸収最大値が、Au2 Sコアに堆積した金の量およびコアサイズに依存して、520nmから約600nm〜900nmの間に赤方シフトすることが示されている。Zhou他、(1994)。コア半径対シェル厚の比は、反応物の濃度を変化させることによって、または反応を停止させることによって制御することができる。この場合、粒子コアの直径は、金のプラズモン共鳴を誘導する光の波長における赤方シフトに正比例する。しかし、硫化金粒子の直径は、薄い金のシェル(5nm未満)とともに約40nm〜45nmのサイズに制限される。Zhou他の硫化金粒子の制限されたサイズにより、吸収最大値は900nm以下の波長に制限されている(Averitt他、1997)。
【0012】
Zhou他によって規定されるような粒子のさらなる制限は、コアおよびシェルの両方が1つの化学反応の結果として成長するということであり、従って、コア材料およびシェル材料の選択がそれぞれAu2 SおよびAuに限定されるということである。さらに、コア半径対シェル厚の比のみが制御され得る。したがって、コア半径およびシェル厚の独立した制御ができない。
【0013】
NedeljkovicおよびPatel(1991)は、臭化銀、銀、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)の混合物への強いUV照射によって製造される、銀コーティングされた臭化銀粒子を開示している。Nedeljkovicの粒子は、透過電子顕微鏡によって明らかにされるように、サイズが約10nm〜40nmの範囲であり、不規則な形状である。予測されるように、これらの粒子調製物から得られるスペクトルは極端に広い。
【0014】
米国特許第5,023,139号において、Birnboim他は、金属コーティングされた、半導体性の、サイズがナノメートルの粒子を含有することにより、(局所電場増強のために)、コーティングされていない誘電性ナノ粒子に対する三次の非線形光学的感受性が示されるはずであることを示す理論的計算を開示している。その静電的計算は仮想的な組成物に基づいていた。金属の外側シェルを実際に提案するBirnboim他により理論的に提案されるそのような実施形態では、適正に機能させるために使用しなければならない特定の媒体に関する条件がさらに必要である。
【0015】
しかし、Birnboimは、開示された仮想的な組成物を調製する方法を開示していない。さらに、Birnboimの計算は、表面の電子散乱を考慮に入れていない。表面の電子散乱は、少なくとも1桁小さい見かけの電子平均自由行程(例えば、室温におけるAuでは、見かけの電子平均自由行程は約40nmである)を有するすべての金属性構造の光学的応答を強く変化させる。この影響は局所電場増強因子を低下させ、そしてこの因子により、ナノシェルの幾何構造に関連した共鳴的な三次の非線形光学的感受性が低下する。Averitt他(1997)を参照のこと。これらの組成物の典型的なシェル厚は40nm未満であるので、Bimboim他の理論的計算は、機能的な金属ナノシェルに対する光学的応答の重要な局面であるこの影響を説明することができない。
【0016】
目的とする対象体(例えば、腫瘍)から赤外光をインビボで発する蛍光プローブを使用して標的化された画像化を行うこともまた可能である(Weissleder、1999;Pathankar他、1997)。画像化するためには、蛍光基および散乱剤に注目する必要がある。散乱剤は、画像化を可能にする標的化組織における散乱係数を劇的に変化させ(従って、光学的造影剤として作用させる)ために使用することができる。吸収剤も、潜在的には、同様に、この適用に使用することができる。
【0017】
1つの非導電性または半導体性のコア層と、少なくとも1つの導電性シェル層とを含むナノ粒子であって、シェル層が前記コア層とは独立的に積層化され、前記シェル層の厚さが前記コア層の半径とは無関係であるナノ粒子を、前記シェル層の厚さが、シェル層を含む材料の見かけ誘電性関数によって記述されるプラズモン共鳴ピーク幅をナノ粒子が有するシェル層の厚さ未満であるという特徴を有するように製造できることが発見された。同様に、これらのナノ粒子は、シェル層の厚さとは無関係であるプラズモン共鳴ピーク幅を有するように製造することができる。
【0018】
ナノシェルと呼ばれる金属ナノ粒子の最大共鳴波長をシフトさせるために使用することができる様々な方法および材料が以前に開示されていた。これらの方法により、電磁波スペクトルの可視および赤外の範囲において規定された波長の吸収最大値を有する物質が製造される。特に、そのような金属ナノシェルコンポジットが、シェル材料に対するそのような判断基準とは無関係であるコアの大きさ、コアの大きさおよびコアの幾何形状を選択することを可能にする様式で組み立てられている。これらの方法によって製造された組成物は、比較的均質な構造を有しており、そしてその所望する吸収特性を示すために、特定の媒体に分散させることに依存させる必要はない。本明細書において注目すべきことに、これらのナノシェルは、上記に議論された治療的適用および診断的適用を制限している先行技術の光学的制限を克服している。そのような材料は米国特許出願第09/038,277号(1998年4月28日出願;これは明示的および全体的に参考として本明細書中に組み込まれる)に記載された。
【0019】
(発明の開示)
本発明の目的は細胞および組織療法用の材料および方法を提供することである。第1の目的は、そのような細胞および組織療法において、標的を絞った局所的高熱を誘発する方法である。本発明のもう1つの目的は画像診断用の材料および方法を提供することである。
【0020】
本発明のさらにもう1つの目的は、低侵襲性かつ有効であって全身性副作用を伴わない上記材料の使用方法を提供することである。
【0021】
治療目的の実施態様として、光に曝露するとインビトロまたはインビボで隣接環境の局所的加熱を引き起こす粒子を細胞および/または組織に投与する方法を記載する。好ましい態様では、粒子は誘電性または半導性コアおよび導電性シェルからなり、粒子の寸法は数十〜数百ナノメートル程度であり、使用する放射は赤外放射である。
【0022】
好ましい一態様では本方法を癌の治療に使用する。別の一態様では本方法を非悪性腫瘍に適用する。どちらの態様でも、本方法は唯一の方法であってもよいし、本方法を別の治療法と併用してもよい。もう1つの態様として、本方法を美容増進に使用することもできる。
【0023】
好ましい一態様では、ナノ粒子はシリカコアおよび金シェルからなる。別の一態様では、ナノ粒子は硫化金コアおよび金シェルからなる。
【0024】
上記一般方法のさらなる一態様では、適当な化学スキームを使ってナノ粒子を所望の部位にターゲティングする。好ましい態様では、抗原−抗体結合がターゲティングに使用される。
【0025】
診断目的の実施態様として、光に曝露するとインビトロまたはインビボでの隣接環境の画像化をもたらす粒子を細胞および/または組織に投与する方法を記載する。好ましい態様では、粒子が、Pr+3、Er+3およびNd+3などの希土類イオンをドープした誘電性または半導性コアからなり、粒子の寸法は数十〜数百ナノメートル程度であり、使用する放射は可視または赤外放射である。もう1つの選択肢として、粒子は誘電性または半導性コアおよび導電性シェルからなってもよい。
【0026】
好ましい一態様では、ナノ粒子はPr+3イオンをドープしたシリカナノ粒子からなる。別の一態様では、ナノ粒子はEr+3またはNd+3をドープしたシリカナノ粒子からなる。もう一つの態様では、ナノ粒子は、吸収材または散乱材として設計された金シェルを有するシリカコアからなる。
【0027】
診断目的の実施態様でも治療目的の実施態様でも、放射源は好ましくは電磁放射であるが、もう1つの選択肢として超音波放射などの非電磁放射であってもよい。
【0028】
(発明の詳細な説明)
様々な実施形態および改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本出願において開示される発明に対して行われ得ることは当業者には容易に明かである。
【0029】
本明細書中で使用される場合、「a」または「an」は1つまたは複数であることを意味し得る。請求項において使用される場合、語句「含む」とともに使用されるときには、語句「a」または「an」は、1または1を越えることを意味し得る。本明細書中で使用される「別の」は、少なくとももう1つまたはそれ以上であることを意味し得る。
【0030】
本明細書中で使用される用語の「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、相互に交換可能に使用され得る。これらの用語はすべて、任意およびすべてのその後の世代であるその子孫をも包含する。すべての子孫は、意図的な変異または故意でない変異のために同一でなくてもよいことが理解される。
【0031】
本明細書中で使用される用語「標的化された」は、抗原−抗体結合、リガンド−受容体結合、および他の化学的に結合する相互作用、ならびに直接的な注射などの非化学的手段の使用を包含する。
【0032】
本明細書中で使用される「エネルギー源」は、電磁スペクトルの任意の領域およびすべての領域からの放射、超音波、磁場、電場、マイクロ波照射、レーザー励起などを含む、励起の任意の形態およびすべての形態を包含する。
【0033】
本明細書中で使用される「光」は、電磁放射線を意味する。
【0034】
本明細書中で使用される「電磁放射線」は、電場および磁場が互いに直交して伝播する放射線として定義され、そして下記にのみさらに限定される:マイクロ波、赤外、可視、紫外、x線、ガンマ線および宇宙線。本明細書中で使用される「電磁放射線」は、無線周波数の放射線を含まない。
【0035】
本明細書中で使用される「非細胞非組織材料」は、細胞および組織ではない任意の生物学的材料であり、プラーク、ウイルス物質などを含み得る。
【0036】
本明細書中で使用される場合、ナノ粒子をある位置に「送達する」は、ナノ粒子によって生じる何らかの熱をその位置に移動させるようにナノ粒子をその位置に結合させるか、またはその近くに設置するか、またはそれに十分に接近させて設置し、そしてナノ粒子による局所的環境の何らかの画像化を行うこととして定義され、所望する位置の画像化を含む。
【0037】
本明細書中で使用される「照射する」は、対象物を隣接する対象物から弁別するか、またはそうでなければ識別し、あるいは1つの対象物内において異なる領域を弁別するような方法で、電磁放射線または他のエネルギー源を与えることとして定義される。
【0038】
本明細書中で使用される「ナノ粒子」は、1ナノメートル〜1000ナノメートルの直径を有し、任意のサイズ、形状または形態を有する粒子として定義される。本明細書中で使用される「ナノシェル」は、異なる誘電性または半導体性のコア部分が1つまたは複数の導電性シェル層によって囲まれているナノ粒子である。「ナノシェル」は、異なるコア/シェル構造を特徴とするナノ粒子の部分種である。ナノシェルおよびナノ粒子はともに、Pr+3、Er+3およびNd+3などのドーパントを含有することができる。
【0039】
本明細書中で使用される「ナノ粒子」は、1つまたは複数のナノ粒子を意味する。本明細書中で使用される「ナノシェル」は、1つまたは複数のナノシェルを意味する。本明細書中で使用される「シェル」は、1つまたは複数のシェルを意味する。
【0040】
本明細書中で使用される用語「腫瘍」は、任意の膨潤物または腫脹物を含む。本明細書中で使用される場合、腫瘍はまた新生物をも示す。
【0041】
本明細書中で使用される用語「良性腫瘍」は、転移を形成せず、そして隣接組織に侵入しないか、または隣接組織を破壊しない腫瘍として定義される。本明細書中で使用される用語「悪性腫瘍」は、周りの組織に侵入し、通常の場合には転移を生じさせることができ、除去を試みた後に再発し得る腫瘍として定義される。
【0042】
本明細書中で使用される用語「ガン」は、一般に様々な悪性の新生物として定義される。ガンは、本明細書中では、カルシノーマおよび肉腫と相互に交換可能である。
【0043】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子をいう。本明細書中で使用される場合、抗体は、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEなどの任意の免疫学的な結合性因子を広義には示すものとする。抗体は、天然源または組換え源に由来する完全な免疫グロブリンであり得るし、そして完全な免疫グロブリンの免疫反応性の部分であり得る。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)2 、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る(Harlow他、1988;Houston他、1988;Bird他、1988)。
【0044】
本明細書中で使用される「カップリング」は任意の化学的な結合を示し、共有結合的相互作用および非共有結合的相互作用の両方を含む。
【0045】
本明細書中で使用される用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答から生じる障害として定義される。自己免疫性は、自己抗原に対する不適切で、過度な応答である。例として、アジソン病、グレーヴズ病、多発性硬化症、粘液水腫、悪性貧血、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【0046】
本明細書中で使用される用語「炎症」は、肉体の傷害、感染または局所的な免疫応答によって開始される、流体、血漿タンパク質および白血球の局所的な蓄積に対する一般的な用語である。これはまた、炎症性応答として知られている。炎症性応答を受けている組織に侵入する細胞は、多くの場合、炎症性細胞または炎症性浸潤物と呼ばれる。
【0047】
本明細書中では、略号「IR」は赤外を意味し、略号「UV」は紫外を意味し、略号「VIS」は可視を意味する。
【0048】
本明細書中で使用される「局在化された」は、存在する場合には、当該領域の外側の最小限の伝搬のみを伴う所望する領域に実質的に限定されていることを意味する。
【0049】
本発明の重要な実施形態において、ナノ粒子は、標準的な方法を使用して動物に投与される。本発明の方法を使用して処置され得る動物には、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、トリ、ニワトリまたは魚類が含まれるが、これらに限定されない。
【0050】
診断的適用および治療的適用のために細胞および/または組織を選択的に画像化または殺傷する方法が開発されている。粒子は、理想的にはナノメートルスケールの大きさである。そのような方法は、特異的な化学的相互作用(例えば、抗原−抗体結合など)を伴う標的化スキームを含むことができ、または治療試薬を所望する領域に単に送達することから構成され得る。治療の方向または標的化は、対象とする細胞および/または組織の表面に対するものであり得るか、あるいは他の内部部位に対するものであり得る。近赤外光を放射または散乱し、そして抗体に容易にコンジュゲート化され得るナノ粒子に基づいて、より特異的で、正確な画像化技術を提供するいくつかの新しい種類のナノ粒子、ならびにナノ粒子との光熱的相互作用に基づく非常に局在化され、かつ標的化された最小限の浸襲的処置法が開発されている。標的化された細胞を殺傷する好ましい実施形態において、ナノ粒子はナノシェルであり、近赤外光(約800nm〜1300nm)などの放射線を使用して励起され得る非常に導電性の金属などの物質でコーティングされた、ケイ素などの誘電性材料または不活性な材料のコアを用いて形成される。励起したときに、ナノシェルは熱を放射する。ナノシェルのシェルおよびコアの合計した直径は数十ナノメートル〜数百ナノメートルの範囲である。
【0051】
重要なことに、本発明のすべての実施形態において、励起は、高熱療法が誘導され得る物質の内部にある励起源から行われ得るか、または物質の外側にある励起源によって行われ得る。インビボ適用では、励起は、身体内または身体外の励起源によって行われ得る。励起源が身体内にあるインビボ適用では、励起源は対象物内に存在し得るか、またはその外側に存在し得る。
【0052】
近赤外光は、組織に浸透するその能力のために好都合である。他のタイプの放射線もまた、ナノ粒子のコーティングおよび標的化された細胞を選択することに依存して使用することができる。例として、x線、磁場、電場および超音波が挙げられる。加熱されたプローブ、マイクロ波、超音波、レーザー、灌流、無線周波数エネルギーおよび放射加熱の使用などの、特にガンの治療において使用される高温療法に対する既存の方法に関連した様々な問題が、本明細書中に記載されるように使用される放射線のレベルは、エネルギーが誘電体上の金属表面によってより効果的に集中するナノ粒子の表面上を除き、高温療法を誘導するには不十分であるので回避される。粒子はまた、赤外拡散光子画像化方法を特に使用して、画像化を強化するために使用することができる。標的化用分子は、抗体またはそのフラグメント、特異的な受容体に対するリガンド、あるいは標的化される細胞の表面に特異的に結合するタンパク質であり得る。
【0053】
様々な材料および方法が、近赤外光を散乱し、吸収し、かつ/または放射するナノ粒子を細胞に送達するために;近IR画像化のために細胞を光学的に標識する造影剤または放出剤としてこれらを使用するために;これらの特異的に標識された細胞に基づく赤外断層画像化方法を提供するために、そして近赤外光でナノ粒子を光学的に励起させることにより個々の細胞の破壊を光熱的に標的化するために記載される。
【0054】
金属ナノシェル
金属ナノシェルは1つまたはそれ以上の金属(例えば、金)層でコーティングされた誘電性(例えば、シリカ)コアからなるナノ粒子の1つの型である。シェル層は好ましくは導電性である金属または金属様物質から形成されるが、誘電定数がコア物質よりも十分に低い物質を用いることもできる。好ましい金属には金、銀、銅、プラチナ、パラジウム、鉛および鉄などがある。金が最も好ましい。金ナノシェルは金コロイドに類似した物理学的特性、とりわけ光に対する金属の集合性電子応答による強い光吸収性を有する。金コロイドの光吸収により消費者関連の医療用製品、例えば家庭用妊娠診断試験においてかなり利用されている鮮やかな赤色を生じる。対照的に金ナノシェルの光応答性ナノ粒子コアの相対的な大きさおよび金シェルの厚みに劇的に依存する(NeevesおよびBirnboim(1989);KreibigおよびVollmer(1995))。相対的なコアおよびシェルの厚みを変化させることにより金ナノシェルの色を、可視から近赤外スペクトル領域までの光スペクトルの広い範囲にわたって変化させることができる。
【0055】
光学共鳴の光の波長に相対して粒子の大きさを変化させることにより光を優先的に吸収させるかまたは散乱させる金ナノシェルを作ることができる。図1では、40nm金/シリカナノシェルの場合に関するナノシェル組成物の関数としてナノシェルプラスモン共鳴波長シフトのミー散乱プロットを表す。この図ではナノ粒子のコアおよびシェルを対応する光学共鳴のすぐ下に直接スケールに相対して表す。図2では、コア/シェル比対シリカコア/金シェルナノ粒子の共鳴波長を示す。光学共鳴の極度に鋭敏な波長可変性は金属ナノシェルに完全に特有な特性である:他のどの分子またはナノ粒子構造も光吸収特性の共鳴を系統的にそれほど容易に「設計」できないのはもちろん、それほど大きな波長範囲を越えて「設計」することはできない。
【0056】
その他の物質を用いることもできる。有機導電性物質、例えばポリアセチレンおよびドーピングされたポリアナリンを用いることもできる。別の層、例えば非導電層、導電層、またはかかる層の配列、例えば導電および非導電層の別の配列をシェル層に結合させることができる。コアは非導電性、例えば誘電物質または半導体物質で形成されているべきである。実例にはシリコンジオキサイド、チタニウムジオキサイド、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン、金スルフィド、およびデンドリマーのごときマクロ分子などがある。半導体物質の例としては、CdSe、CdSおよびGaAsなどがある。物質の性質は粒子の特性に影響する。例えばシェル層の誘電定数が規定の誘電定数であるコアを有する粒子に相対して大きい場合、粒子の最大吸収は誘電定数が低いコアを有する粒子に相対して青色にシフトするであろう。好ましいコア物質はテトラアルコキシシランの塩基触媒反応により調製できるコロイド性シリカである。
【0057】
シェル層およびコアを、例えばイオン結合、ローンペア相互作用、水素結合、またはファンデルワールス相互作用により連結できる。リンカーの例としてはアミノプロピルトリエトキシシランがある。
【0058】
典型的な態様では、粒子は生分解性ではないが、網内皮細胞系(RES)による投与の後に一掃される傾向がある。しかしながら、ある態様では生分解性物質、例えば体内で加水分解されるポリヒドロキシ酸重合体を用いてコア、金属シェルまたは介在層に連結し、一定期間の後に粒子が除去されるのを促進するのが望ましい。
【0059】
好ましい態様では、粒子は粒度分布および形状において均質である。本明細書では球形の粒子を参考として記載しているが、同一の方法を用いてその他の形状を作製することができる。不定形な粒子の例としては、シリンダー状、ディスク状、およびその他の幾何学的形状がある。典型的には半径は1から10ナノメーターの間である。しかしながら、コアは10nmから4ミクロン以上までにわたってよく、シェル層の厚みは1から100nmにわたってよい。
【0060】
金属ナノシェルの光学特性の包括的な研究はAverittら(1997)およびAverittら(1999)により報告されている。ミー散乱理論および実験的に観察された光学共鳴特性間の量的な一致が得られている。この成功に基づいて、今では望ましい光学共鳴特性を有する金ナノシェルを予言的に設計し、次いでこれらの特性を達成するのに必要な半径およびナノスケールの耐性を有するナノシェルを作製するのが可能である(Oldenburgら(1998))。
【0061】
金属ナノシェルの調製および光物理学的特性
金ナノシェルの作製のための合成プロトコルは分子自己集合および水溶液のコロイド化学の公知の原理に基づいている。方法は概念では簡単である:
1.溶液に分散したシリカナノ粒子、例えばアルドリッヒ・ケミカル・カンパニー、ミルウォーキー、ウィスコンシン州から入手可能なLUDOX TM−50コロイドシリカ粒子のごときシリコンジオキサイド粒子を成長させるかまたは入手する。
【0062】
2.非常に小型の(1から2nm)金属「シード」コロイドを、分子結合を介してナノ粒子の表面に付着させる;これらのシードコロイドは不連続な金属コロイド層で誘電性ナノ粒子表面を被覆する。
【0063】
3.溶液中の化学的還元によりさらなる金属を「シード」金属コロイド吸着物上で成長させる。
【0064】
つなぎ留められた金属、イオンまたは原子のクラスタをリンカー分子を介してコア粒子に連結する。一般に、望ましい厚みの凝集性の金属シェルが形成されるまで、金属はつなぎ留められたクラスタ上に沈着する。これは溶液金属の還元によるか、またはコロイド基盤の沈着プロセスによるものであろう。沈着を光化学的に開始または誘導できる。この研究法を用いてシリカナノ粒子上に金および銀双方の金属性シェルを成長させている。図3aおよび3bはナノシェル合着の光学的特徴および異なる2つのナノシェルコア半径の成長を示す。
【0065】
いずれかの規定の粒子では、最大吸収は非導電層の導電シェル層に対する厚みの比率に依存する。プラスモン共鳴ピークの最大チのスペクトル位置はコア半径のシェルの厚みに対する比率およびコアおよびシェルの誘電性機能に依存する。誘電性コアの存在はプラスモン共鳴を、金属シェル物質で独占的に作られた固体ナノ粒子に相対してより長い波長にシフトさせる。規定のコア半径では、薄いシェルは厚いシェルに相対してより長い波長にシフトされたプラスモンピークを有する。金属ナノシェルは固体ナノ粒子が欠いている共鳴可変性を提供する。
【0066】
このプロトコルで達成できるコア/シェル比率に基づいて、可視領域から赤外部のおよそ3ミクロンに広がる光学共鳴を有する金ナノシェルを作製できる。このスペクトル領域には、光学バイオ撮像およびバイオ検出装置に最も適したスペクトル領域として示されている生理学的透過性の高い領域である、800から1300nmおよび1600から1850nmの近赤外部の「水の窓」を含む。
【0067】
生体適合性および生体接合の安易性と合わせた場合、金ナノシェルの光学特性により、標的化バイオ撮像および治療適用に理想的なこれらのナノ粒子が提供される。
【0068】
希土類ナノエミッター
放射性希土類(ランタニド)イオン性種をシリカナノ粒子に組み込む方法が開発されている。希土類イオン例えばネオジミウム、エルビウムおよびプラセオジミウムは強健な赤外線蛍光体であり、市販の近赤外部固体レーザーおよび増幅器の増幅率媒体として広く使用されている。シリカナノ粒子にうまく組み込まれた希土類蛍光体を表1に示す。これらのイオン種のいくつかでは励起および放射波長が双方共に近赤外部、すなわち組織を通過するハイライト透過の領域の「ウォーターウィンドウ」に在り、これによりインビボ適用が容易になる。
【0069】
ナノ粒子に組み込まれた希土類イオン種、およびその(選択された)対応する励起および放出波長
【表1】

希土類ドーピングされたシリカナノ粒子はバイオ撮像の適用において赤外蛍光体として普遍的な利用性を示すはずである。これらのシリカナノ粒子表面をより機能的にし、アミノ化または金シェル層などの種々の方法で、標的化適用に関して抗体抱合を促進するのを終わらせることができる。
【0070】
希土類の組み込みはシリカナノ粒子合成を、希土類イオンが可溶性のままであり、従ってそれが成長するときにナノ粒子に組み込まれ得る塩基性から酸性条件に変更することにより達成される。形成されたナノ粒子は高度に球形であり、大きさはおよそ100nmから2ミクロン以上の範囲である。これらのナノ粒子の単分散分布もまた達成できる。ナノ粒子マトリックスに組み込まれた希土類種全ては明るい室温の蛍光が達成された。標準的な高温拡散方法により調製されたバルクシリカにおけるPr3+放射と比較して示されるPr3+の典型的な可視領域蛍光スペクトルを図4に示す。
【0071】
希土類ナノエミッターはシェル層を欠くナノ粒子でよいか、またはコア物質および1つまたはそれ以上のシェル層を有するナノシェルを形成させることができることに留意すべきである。希土類ドーピングされた切片は典型的にはコアであるが、シェル層に存在してもよい。
【0072】
ナノシェル重合体複合物における熱移動
その共鳴波長に相対して金ナノシェルの大きさを変化させることにより、ナノシェルを選択的に、共鳴光を優先的に吸収させるかまたは優先的に散乱させることができる。これを図5で1000nmの波長でのナノシェル共鳴に関して説明する。生物学的撮像に典型的なレーザー強度では、散乱および吸収の双方が生物学的組織における標的構造の対比および解析の強化において有用であることを証明し、組織の標的構造の吸収または散乱係数を選択的に増加させる手段を提供するはずである。
【0073】
金属ナノシェルは典型的な分子蛍光体ほど光脱色または光誘起損傷の影響を受けない。ナノシェル共鳴は非放射的に消失するので(典型的な量子効率は数パーゼント)、たいていのエネルギーは光吸収のために熱に変換される。このように高度な吸収性を有する金属ナノシェルの共鳴照明はナノシェルの顕微鏡的環境に有意な局所加熱を提供し得る。我々は最近、その低い臨界溶解温度(LCST)、通常45℃を越えて上昇させる場合に、この効果を用いて有意な熱移動を提供し、相移動を誘起することができることを示した(Serxhenら(1999))。N−イソプロピル−アクリルアミド共アクリルアミド共重合体(NIPAAm−co−AAm)を吸収性金ナノシェルの同種的または異種的のいずれかでドーピングする場合、ナノシェル共鳴波長で光を照射することにより解膨潤移動が誘起される(図6)。この観察はナノシェルを含まない共重合体の対照サンプルに対して、照射波長での共重合体の弱い残留吸収が温度上昇、および結果的に解膨潤移動を誘起するのには不十分であったことが証明された。この局在性の加熱効果は、連続またはパルス化レーザー供給源のいずれかを用いて相対的な様式のパワーレベルで、バイオ撮像適用において用いられるよりも著明に弱い強度のパワーレベルで観察することができる。腫瘍細胞に標的化されたナノシェル抱合抗体の光誘起の局所加熱、局所的、特異的細胞死に導くはずの方法はこの提案の治療用分野の焦点である。
【0074】
抗体の産生
用いる抗体なる用語は抗原結合領域を有するいずれかの抗体様分子を意味し、抗体フラグメント例えばFab' 、Fab、F(ab' )2、単一ドメイン抗体(DAB)、Fv、scFv(一本鎖Fv)等を含む。種々抗体基盤の構築物およびフラグメントを調製および使用する技術は当業界で公知である。抗体を調製および特徴づけする手段もまた当業界で公知である(例えばAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988);出展明示により本明細書の一部とする)。
【0075】
モノクローナル抗体(MAb)は特定の、例えば再現性および大容量製造などの利点を有することが知られており、その使用が一般的に好まれている。従って本発明はヒト、ネズミ、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびニワトリ起源の抗体を提供する。
【0076】
しかしながら、ヒト定常および/または可変領域ドメイン、二重特異性抗体、組換えおよび操作した抗体ならびにそのフラグメントを担持するマウス、ラットまたはその他の種からのキメラ抗体のようなヒト化抗体もまた企図される。患者の疾患に「特別注文の」抗体を発達させる方法は公知のものと同様であり、特別注文の抗体もまた企図される。
【0077】
望む場合、濾過、遠心および種々のクロマトグラフィー法、例えばHPLCまたはアフィニティークロマトグラフィーを用いて抗体をさらに精製してもよい。本発明の抗体のフラグメントは酵素、例えばペプシンまたはパパインでの消化などの方法により、および/または化学的還元によりジスルフィド結合を切断することにより製造されたような抗体から得ることができる。また、本発明に包含される抗体フラグメントを自動ペプチド合成器を用いて、または全長遺伝子もしくは遺伝子フラグメントを大腸菌(E.coli)中で発現させることにより合成することができる。
【0078】
分子クローニング研究法を用いてモノクローナル抗体を作ることができることも企図される。1つの態様では、コンビナトリアル免疫グロブリンファゲミドライブラリーを免疫動物の脾臓から単離されたRNAから調製し、抗原を発現する細胞および対照細胞を用いるパニングにより適当な抗体を発現するファゲミドを選択する。この研究法が従来のハイブリドーマ技術に優る点は1ラウンドでおよそ104 倍多い抗体を産生しスクリーニングすることができ、HおよびL鎖組み合わせにより、適当な抗体を見出すチャンスをさらに増加させる新規な特異性を生じる点である。
【0079】
レポーター分子に対する抗体の連結
診断または治療剤として抗体分子の効力を増大させるために、少なくとも1つの所望の分子または部分を結合または共有結合で結合または複合させることが常套である。このような分子または部分は、それに限定されないが、少なくとも1つのエフェクターまたはレポーター分子でありうる。エフェクター分子は、所望の活性、例えば内毒素活性を示す分子を包含する。本発明のナノ外皮に加えて、抗原に引きつけられうるエフェクター分子の他の例としては、それに限定されないが、トキシン、抗−腫瘍剤、治療用酵素、放射性標識ヌクレオチド、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、成長因子、およびオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。レポーターヌクレオチドは、アッセイを用いて検出されうる任意の部位として定義される。抗原に連結されたレポーター分子の制限なしの例は、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、リン酸光分子、化学発光分子、発色団、ルミネッセント分子、光親和性分子、着色粒子またはビオチンのようなリガンドが挙げられる。
【0080】
本発明に連結される抗体の量を検出するために、数種の免疫検出方法でありうる。例えば、ある種の免疫検出方法としては、それに限定されないが、免疫吸着剤アッセイ(ELISA)に連結した酵素、放射性免疫アッセイ(RIA)、免疫ラジオメーターアッセイ、蛍光免疫アッセイ、化学発光アッセイ、バイオルミネッセントアッセイ、および少数を明記するウエスタンブロットが挙げられる。種々の有用な免疫検出法の段階は、DoolittleMHおよびBen−Zeev O、1999年;Gulbis BおよびGaland P、1993年;De Jager Rら、1993年;およびNakamuraら、1987年のような科学文献に記述されていて、そして各々は、参照してここに組込まれる。
【0081】
ナノ外皮およびナノエミッター連結抗体
金ナノ外皮の金属層は、金コロイド合成と同じ化学反応を用いて育成されるので、金ナノ外皮の表面は、生物接合用途で普遍に使用される金ナノ粒子の表面で実質的に化学的に一致する。生物学的用途での金コロイドの使用は、FaulkおよびTaylorが、免疫金染色を発明した1971年に始まった。
【0082】
希土類ドーピング化ナノ粒子は、ナノ外皮・コアとして使用されるシリカナノ粒子の合成に非常に類似に進行する。ナノ粒子合成に続いて、表面は、水酸基から構成される。これらの粒子は、アミノプロピルトリエトキシシランとの反応を介してその後活発にされ、したがって、抗体接合についてのいくつかの選択肢を可能にしうる。ある種の例では、金属シェルは、これらのドーピング化ナノ粒子で成長され、それにより放射性および散乱特性を示す構造を作成しうる。シェル成長および続く抗体の金コロイド層への付着は、ここに記述されるとおりに進行しうる。代わりに、抗体は、カルボジイミド化学、ジイソシアネートリンカー、スクシニミジルエステルなどを含めた多様な化学的模式図を介して水酸化されるかまたはアミノ化されたナノ粒子表面に共有結合で固定されうる。さらに、抗体は、高分子束縛鎖を介して固定されうる。これは、二機能性ポリエチレングリコール誘導体で達成されうる。この固定化模式図は、それらの可動性を、したがって、それらの標的リガンドとの相互作用するそれらの能力を増強することによって、固定化抗体の生物学的活性を増加させうる。抗体固定化の効率は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗体で測定されうる。ナノ粒子−接合抗体の活性は、HRP標識抗原で、そして抗原被覆表面に対するナノ粒子結合を試験することによって評価されうる。これらの表面に対するナノ粒子結合は、原子力顕微鏡(AFM)および蛍光によって定量的に評価されうる。結果は、抗原表面濃度のELISA測定と比較されうる。
【0083】
医薬組成物
本発明の水性組成物は、医薬上許容しうる担体および/または水性媒体に溶解および/または分散される本発明の有効量のナノ外皮または化学組成物を包含する。
【0084】
語句医薬上および/または薬物動態学上許容しうる、は、適切な場合、動物に投与されるときに、有害で、アレルギー性および/または他の望ましくない反応を生じない分子実体および/または組成物に該当する。
【0085】
ここで使用される場合、医薬上許容しうる担体は、任意および/または全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および/または抗真菌剤、等張および/または吸収遅延剤および/または同等物が挙げられる。このような媒体および/または医薬上活性な物質のための剤の使用は、当業者によく知られている。任意の従来の媒体および/または剤が、渇し得成分と合致しない限りを除けば、治療組成物でのそれの使用は、意図される。補足活性成分も、その組成物に組込まれうる。投与のために、製品は、生物学標準のFDA事務局によって要求されるとおり滅菌性、発熱性、全般的安全性および/または純度標準に合致しなければならない。
【0086】
生物学的材料は、集中的に透析されて、望ましくない小さな分子量の分子を除去および/または適切な場合、所望のヘビクルにいっそう容易な配合のために凍結乾燥されるべきである。活性化合物は、一般に、非蛍光のために配合され、例えば静脈内、筋肉内、皮下、病変内、および/または腹腔内経路でさえを介した注射用に調合される。活性成分および/または成分として有効量のナノ外皮組成物を含む水性組成物の製造は、本開示の点で当業者に知られている。典型的には、このような組成物は、液体溶液および/または懸濁液としてのいずれかで注射可能なものとして製造されうる;注射の前の液体の添加により、溶液および/または懸濁液を製造するために使用するための固形形態も製造されうる;および/または製品も、乳化されうる。
【0087】
注射用用途として適切な医薬形態は、滅菌水性溶液および/または分散液;ごま油、落花生油および/または水性プロピレングリコールを包含する配合;および/または滅菌注射用溶液および/または分散液の即席製品のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合に、形態は、滅菌でなければならず、および/または容易なシリンジ通過性が存在しうる範囲まで流動性でなければならない。製造および/または保存の条件下で安定性でなければならず、および/または細菌および/または真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。
【0088】
遊離塩基および/または薬理学的に許容しうる塩として活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合される水中で製造されうる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および/またはその混合物および/または油中で製造されうる。保存および/または使用のための日常的な条件下で、これらの製品は、微生物の成長を避けるために保存性のものを包含する。
【0089】
本発明のナノ外皮組成物は、中性および/または塩形態で組成物に配合されうる。医薬上許容しうる塩としては、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ酸基から形成される)および/または例えば塩酸および/またはリン酸のような無機酸、および/または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、および/または同等物のような有機酸で形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムのような無機塩基および/または硫酸第二鉄、および/または、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインおよび/または同等物のようなこのような有機塩基から誘導される。
【0090】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレン、プロピレングリコール、および/または液体ポリエチレングリコール、および/または同等物)を含む溶媒および/または分散媒体、その適切な混合物および/または植物油でもありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合では必要とされる粒子サイズの維持によって、および/または界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、および/または同等物のような種々の抗細菌および/または抗真菌剤によって起りうる。多くの場合には、等張剤、例えば糖および/または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる剤の組成物、例えばアルミニウムモノステアレートおよび/またはゼラチンでの使用により行われ得る。
【0091】
滅菌注射用溶液は、上に記述される種々の他の成分と一緒に、適切な溶媒中で、要求される量で活性化合物を組込むことによって、要求される場合、続いて濾過滅菌によって製造されうる。一般に、分散液は、基本的分散媒体および/または上に記述されるものから得られる望まれる要求される他の成分種々の滅菌活性成分を、滅菌ベヒクルに組込むことによって製造されうる。滅菌注射用溶液の製造のための本発明の滅菌粉末の場合には、好ましい製造の方法は、活性成分の粉末プラス、先に滅菌濾過されたその溶液から得られる任意の別の所望の成分を生じる真空乾燥および/または凍結乾燥技術である。溶媒としてDMSOの使用が、極端に迅速な浸透を生じ、そして小さな腫瘍領域に高濃度の活性剤を送出されることが構想されるときに、直接注射のためのいっそう多くのおよび/または高い濃度の溶液の製造も、意図される。
【0092】
配合物により、溶液は、投与量配合物に匹敵する手段で投与され、および/またはこのような量は、治療上効果がある。配合物は、上に記述される注射用溶液の型のような多様な投与形態で容易に投与されるが、しかし薬剤放出はカプセルおよび/または同等物も使用される。
【0093】
非経口投与のために、例えば溶液は、必要な場合、適切に緩衝されるべきであり、および/または液体希釈剤は、第一に、十分な整理食塩水および/またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水性溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および/または腹腔内投与に適する。この濃度で、使用されうる滅菌水性媒体は、本開示の点で、当業者に知られる。例えば、一回用量は、1mlの等張NaCl溶液に溶解されうるか、および/または1000mlの皮下注入流動体に添加するか、および/または注入の提案された部位に注射されるかのいずれかである(例えば、「レミントンの薬学化学」、15版、1035−1038頁および/または1570−1580頁参照)。投与量におけるある程度の変動は、処置されるべき対象の症状によって必然的に起る。投与に責任のあるヒトは、あらゆる場面で、個人的対象について適切な用量を決定する。
【0094】
静脈内および/または筋肉内注射のような非経口投与のために処方される成分に加えて、他の医薬上許容しうる形態としては、例えば、経口投与のための錠剤および/または他の固形、リポソーム配合物;時間放出カプセル;および/またはクリームを含めて最近使用される任意の他の形態が挙げられる。
【0095】
当業者は、本発明の鼻用溶液および/またはスプレー、エアゾルおよび/または吸入剤をも使用しうる。鼻内溶液は、液滴および/またはスプレーでの鼻内経路に投与されるべきように設計される通常の水性溶液である。鼻用溶液が、製造され、その結果、それらは、鼻用分泌に多くの点で類似であり、その結果、正常な毛様体作用が維持される。したがって、水性鼻内溶液は、一般に、5.5から6.5までのpHを維持するために、等張であり、および/またはわずかに緩衝される。さらに、眼の製品のために使用されるものに類似の抗微生物保存剤、および/または必要な適切な薬剤安定化剤は、必要である場合、その処方に含まれうる。
【0096】
投与の他の態様に適切でありうる別の処方は、膣内坐薬および/またはペッサリーを含む。直腸ペッサリーおよび/または坐剤も使用されうる。坐剤は、直腸、膣および/または尿道に挿入するための通常に投薬される種々の重量および/または形状の固形剤形である。挿入後、坐剤は、軟化し、溶融し、および/または腔分泌液に溶解される。一般に、坐剤については、従来の結合剤および/または担体は、例えば、ポリアルキレングリコール、および/またはトリグリセリドを包含しうる;このような坐剤は、0.5%から10%まで、好ましくは1%−2%までの活性成分を含む混合液から形成されうる。
【0097】
経口処方としては、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸カルシウムおよび同等物のとしてこのような正常に使用される賦形剤が挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方および粉末の形態をとりうる。特定の定義された具体例では、経口医薬組成物は、不活性希釈剤および/または同化の食用担体を包含し、および/またはそれらは、硬質および/または軟質シェルゼラチンカプセルで開示され得て、および/またはそららは、錠剤に圧縮され得て、および/またはそれらは、食事の職人に直接組込まれうる。経口治療投与については、活性化合物は、賦形剤に組込まれ得て、および/または摂取性錠剤、頬用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、スプレー、ワッフル、および/または同等物の形態で使用されうる。このような組成物および/または製品は、少なくとも0.1%の活性部位を含むにちがいない。組成物および/または製品のパーセントは、もちろん、変化しうるか、および/または都合よく、単位の約2から約75%の重量の間であり得て、および/または好ましくは、25−60%の間である。このような治療上有効な組成物の活性化合物の量は、適切な投与量が得られるようなものである。
【0098】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルおよび/または同等物は、以下のものを含みうる:トラガカントゴム、アカシア、コーンスタートのようなゴム、および/またはゼラチンのような結合剤;リン酸ジカリウムのような賦形剤;コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸および/または同等物のような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムのような滑剤;ショ糖、ラクトースおよび/またはサッカリンのような甘味料は、添加され得て、および/またはペパーミント、ウインターグリンの油、および/またはチェリー風味のような風味剤。投与量単位形状が、カプセルである場合、それは、上記型の材料に加えて、液体媒体を含みうる。種々の他の材料は、コーティングとして存在しうるか、さもなければ投与量形態の物理的形態を改質する。例えば、錠剤、丸剤、および/またはカプセルは、シェラック、糖および/または両方で被覆されうる。エリキシルのシロップは、甘味剤メチルとして活性化合物ショ糖をおよび/または保存剤としてプロピルパラベンを、チェリーおよび/またはオレンジ風味のような染料および/または風味を含みうる。
【0099】
上に記述される医薬製品の具体例としては、単に例示であって、専有的ではなく、本発明のナノ粒子は、最も一般的な医薬製品に機敏に反応する。
【0100】
脂質およびリポソーム方法
本発明の他の送出法は、少なくとも1つのナノ外皮に関連した1つまたはそれ以上の脂質を包含する新規組成物を包含する。脂質は、水に特徴的に不溶性であり、そして有機溶媒で抽出可能である物質である。脂質としては、例えば当業者によく知られる化合物のクラスと同様に、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、および無水物のような長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含む細胞質で自然に生じる脂質液滴を包含する物質を包含する。もちろん、脂質として、当業者によって理解されるここに特定に記述されるもの以外の化合物は、本発明の組成物および方法によっても包含される。本発明は、宿主細胞は、中でも、王冠エーテル、シクロデストリン、ミセルでありうるもののような他の宿主ゲズト複合化模式図をも包含する。
【0101】
脂質は、自然に生じるか、合成でありうる(すなわち、ヒトによって設計されるか、産生される)。しかし、脂質は、通常に生物学的物質である。生物学的脂質は、当業者によく知られており、そして例えば、中性脂質、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リソリピド、グリコスフィゴリピット、糖脂質、スルファチド、エーテルおよびエステル結合脂肪酸および合成可能な脂質およびその組合せが挙げられる。
【0102】
特定の具体例では、脂質は、リポソームを包含する。リポソームは、包含される脂質二層または凝集体の発生によって形成される多様な単独および多ラメラ脂質ベヒクルを包含する包括的語句である。リポソームは、二層膜を有する小胞構造を有すると特徴づけられ得て、そして一般に、リン脂質、および一般に水性組成物を包含する内部媒体を包含する。
【0103】
多ラメラリポソームは、水性媒体によって分離される多重脂質層を有する。それらは、リン脂質を含む脂質が、過剰な水性溶液に浮遊されるときに自発的に形成する。脂質濃度は、閉鎖構造の形成の前に自己転位を受け、そして水を補足し、そして脂質二層の間の溶質を溶解した(GhoshおよびBachhawat、1991年)。親油性分子または親油性領域を有する分子も、脂質二層に溶解されるか、またはに結合しうる。
【0104】
特定の具体例では、脂質および/またはナノ外皮は、例えば、リポソームの水性内部で包含されて、リポソームの脂質二層内に散在され、リポソームとナノ外皮の両方に結合される連結分子を介してリポソームに付着され、リポソームに捕捉され、リポソームと複合化されうる。
【0105】
本発明によって使用されるリポソームは、当業者に知られるものと異なる方法によって製造されうる。リン脂質は、水に分散されるときに、脂質対水のモル比によって、リポソーム以外の多様な構造を形成しうる。低い比率では、リポソームは、好ましい構造である。
【0106】
リポソームは、他の公知ライブラリー手段によって製造されうる(例えば、Banghamら、1965年;Gregoriadis、1979年;DeamerおよびUster1983、SzokaおよびPapahadjopoulos、1978年、各々、関連部分で参照してここに組込まれる。)。これらの方法は、水性材料を捕捉するそれらの各々の能力およびそれらの各々の水性空間対脂質比で異なる。
【0107】
リポソームのサイズは、合成の方法によって変化する。本発明でのリポソームは、多様なサイズでありうる。特定の具体例では、リポソームは、小型、例えば外部直径で、約100nm未満、約90nm、約80nm、約70nm、約60nm、または約50nm未満である。このようなリポソームを製造する上で、ここに記述される任意のプロトコール、または当業者に知られるとおり、使用されうる。リポソームを製造する別の制限無しの例は、米国特許番号第4,728,578号、第4,728,575号、第4,737,323号、第4,533,254号、第4,162,282号、第4,310,505号および第4,921,706号;国際出願PCT/US85/01161号およびPCT/US89/05040号;英国特許出願GB2193095A号;Mayerら,1986年;Hopeら、1985年;Mayhewら、1987年;Mayhewら、1984年;Chengら、1987年;およびLiposome Technology 1984年に記述され、各々は、参照してここに組込まれる)。
【0108】
リポソームは、4つの異なる機構を介して剤を送出する細胞と相互作用する。マクロファージおよび/または神経網のようなレチノール内皮の食作用細胞によるエンドサイトーシス;非特異的な弱い疎水性および/または静電気力によって、および/または細胞表面成分との特異的相互作用によるかのいずれかによる細胞表面の吸着;細胞質へのリポソーム内容物の同時放出を伴う、原形質膜へのリポソームの脂質二層の挿入による血漿細胞膜との融合;および/またはリポソーム内容物のあらゆる結合なしに、細胞および/または小細胞膜へのリポソーム脂質の移行により、および/またはその逆。1つ以上が、同時に操作しうるが、リポソーム形成を変化することは、その機構が操作的であるものを改変しうる。
【0109】
標的送出は、多量のナノ外皮を送出するこれらのリポソーム送出の能力を調節することなしに、リガンドの添加によって達成される。これは、特異的細胞、組織および臓器に送出できることが意図される。リガンド基本の送出系の標的特異性は、様々の細胞型でのリガンドレセプターの分布に基づく。標的リガンドは、脂質複合体と非共有結合で、または共有結合でのいずれかで結合され得て、そして多様な方法によってリポソームに接合されうる。
【0110】
標的リガンドは、複合体の疎水性部分に固定されるか、複合体の親水性部分の反応性末端基に付着されるかのいずれかでありうる。標的リガンドは、例えば、親水性高分子の遠方末端で、反応性基への連結を介して、リポソームに付着されうる。好ましい反応性基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドラジン基、およびチオール基が挙げられる。親水性高分子への標的リガンドの結合は、当業者に知られる有機化学の標準法によって行われうる。特定の具体例では、標的リガンドの総濃度は、約0.01から約10%モルまででありうる。
【0111】
標的リガンドは、標的領域の特徴的成分に特異的である任意のリガンドである。好ましい標的リガンドとしては、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体断片、またはキメラ抗体、酵素またはホルモンのようなタンパク質、またはモノ−、オリゴ−、およびポリサッカライドのような糖が挙げられる(Heathら、1986年参照)。例えば、ジスイアロガンギリオシドGD2は、神経芽腫、メラノーマ、小型細胞肺性癌腫、グリオマおよび特定の肉腫のようなニューロ外胚葉起源腫瘍を同定した腫瘍抗原である(Mujooら、1986年、Schulzら、1984年)。リポソーム含有抗ジスアロガングリオシドGD2モノクローナル抗体は、腫瘍抗原を発現する細胞へのリポソームの標的化を支援するために使用された(Montaldoら、1999年;Paganら、1999年)。別の制限なしの例では、乳癌および婦人科の癌の抗原特異的抗原は、米国特許番号第5,939,277号に記述されており、そして参照してここに組込まれる。別の制限なしの例では、精巣癌特異的抗体は、米国特許番号第6,107,090号に開示されており、参照してここに組込まれる。したがって、ここに開示されるか、または当業者に知られている抗体が、本発明の組成物および方法と組合せて、特異的組織および細胞型を標的にするために使用されうる意図される。本発明の特定の具体例では、意図される標的リガンドは、インテグリン、プロテオグリカン、糖タンパク質、レセプターまたは輸送体と相互作用する。適切なリガンドとしては、標的臓器の細胞に、または腫瘍のような局所病理学の結果として循環にさらされる標的臓器の構造に特異的であるいずれかのものが挙げられる。
【0112】
本発明の特定の具体例では、標的細胞の形質導入を増加させるか、または望ましくない細胞の形質導入を制限するかのための細胞の形質導入を増強するために、抗体または嚢性ペプチド部分(リガンド)は、脂質複合体に結合される。このような方法は、当業界で知られている。例えば、リポソームは、哺乳類中枢神経系の細胞を特異的に標的にするさらに記述された(米国特許番号第5,786,214号、参照してここに組込まれる)。リポソームは、神経膠に特異的なモノクローナル抗体が、リポソームに接合されることを特徴とする、N−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールおよびオレイン酸から基本的に構成される。モノクローナル抗体または抗体断片は、例えば脳、心臓、肺、肝臓などのような動物での細胞、組織、または臓器に特異的に標的送出するために使用されうることが意図される。
【0113】
さらになお、ナノ外皮は、レセプター介在送出を介して標的細胞に送出され、および/または脂質またはリポソームを包含するベヒクルを標的にしうる。これらは、標的細胞で起るレセプター介在エンドサイトーシスにより巨大分子の選択摂取の利点を取る。種々のレセプターの細胞型特異的分布の観点で、この送出法は、別の程度の本発明に対する特異性を加える。
【0114】
したがって、本発明の特定の態様で、リガンドは、標的細胞集団で特異的に発現されるレセプターに対応して選択される。特異的ナノ外皮送出および/または標的ベヒクルは、リポソームと組合せて、特異的結合のリガンドを包含しうる。送出されるべきナノ外皮は、リポソーム内に収納され、そして特異的結合リガンドは、リポソーム膜に機能的に組込まれる。したがって、リポソームは、標的細胞のレセプター(複数)に特異的に結合し、そして細胞に含有物を送出する。このような系は、例えば、上皮成長因子(EGF)が、EGFレセプターの上方調節を示す細胞への核酸のレセプター介在送出で使用されることを特徴とする系によって機能性であることが示された。
【0115】
さらに別の具体例では、特異的結合リガンドは、細胞特異的結合を指示する1つまたはそれ以上の脂質または糖タンパク質を包含しうる。例えば、ラクトシルセラミド、ガラクトース末端、アシアルガングリオシドは、リポソームに組込まれ、そして肝細胞によりインシュリン遺伝子の摂取における増加が観察された(Nicolanら、1987年)。末端ガラクトシル残渣を含むアシアログリコタンパク質であるアシアロフェツインも、肝臓に対する標的リポソームを示した(SpanjerおよびScherphof、1983年;Haraら、1996年)。ポリペプチドの骨格に結合した糖マンノシル、フコシルまたはN−アセチルグルコサミンは、高い親和性のマンノースレセプターを結合する(米国特許番号第5,432,260号、その全体でここに参照して組込まれる)。本発明の細胞または組織特異的形質転換構築物が、同様の手段で、標的細胞または組織に特異的に送出されうることが意図される。
【0116】
別の具体例では、アポリポタンパク質E3(「ApoE」)のようなLDLレセプター関連タンパク質を標的にするラクトシルセラミドおよびペプチドは、肝臓に対してリポソームを標的にする上で有用であった(SpanjerおよびScherphof、1983年;WO98/0748号)。
【0117】
ホレートおよびホレート・レセプターは、細胞標的のために有用であるとも記述された(米国特許番号第5,871,727号)。この実施例では、ビタミンホレートは、複合体に結合される。コレート・レセプターは、それのリガンドについての高い親和性を示し、そして肺、胸部、および脳腫瘍を含めた、数種の悪性セルラインの本発明油面に過剰発現される。メトトレキセートのような抗−ホレートも、標的リガンドとして使用されうる。トランスフェリン介在送出系は、トランスフェリンレセプターを発現する広範な置換細胞を標的にする(Gillilandら、1980年)。
【0118】
培養細胞への抱合型ナノ粒子の結合
ナノ粒子(吸収剤/散乱剤および発光射出剤)は、特定組織あるいは細胞型、特に癌性前立腺上皮細胞に対して、注射可能なナノ粒子製剤の標的結合を起こさせるために、細胞特異性抗体あるいはペプチドに結合させることができる。ナノシェルおよびナノエミッタは、前立腺特異性膜抗体に対して向けられる抗体などの界面細胞特異性抗体により調製することができる。ナノ粒子抱合型結合の標的であるか、あるいは非特異性対照として役立つかのいずれかである培養細胞は、ナノ粒子懸濁液に曝され、その後に非結合微粒子を取り除くために、完全に洗浄される。細胞表面に結合するナノ粒子は、環境制御型電子顕微鏡(ESEM)によって評価されうる。
【0119】
インビトロおよびインビボの処理手順 熟練した技術を有する同業者であれば、本発明のナノシェルは、さまざまなタイプの実験処理手順に用いることができるが、例えば、インビトロあるいはインビボの実験処理手順には限定されないことは理解されよう。
【0120】
手短に言うと、インビトロアッセイは、実施するには、速く、安価でまた簡単なアッセイである。こうしたアッセイは一般的には、細胞などの分離分子を使用し、また、素早くかつ非常に多数のもので実施することができ、それによって短い期間に得ることができる情報量を増加することができる。試験管、プレート、皿およびその他の表面を含むさまざまな容器が、そうしたアッセイを実施するのに使用されうる。
【0121】
この目的のために細胞特異的に遺伝子工学的に処理されたさまざまな細胞系統をこうしたアッセイには使用することができる。非常に数多くの細胞系統と培養培地が使用するのに入手可能であり、またそれらは、生体培養と遺伝子材料に関するアーカイブとして役立っている1つの組織である、米国菌株保存機関(ATCC)を通じて入手することができる(www.atcc.org)。ある種の実施態様では、細胞は少なくとも1つの皮膚、骨、神経単位、軸索、軟骨、血管、角膜、筋肉、顔面、脳、前立腺、乳房、子宮内膜、肺、膵臓、小腸、血液、肝臓、精巣、卵巣、子宮頸部、大腸、皮膚、胃、食道、脾臓、リンパ腺、骨髄、腎臓、末梢血、胚細胞あるいは腹水細胞、また、それらすべての癌細胞から成るが、それらには限定されない。
【0122】
そのアッセイによるが、細胞の培養が必要になることがある。細胞は異なる、数多くの生理学的アッセイのうちのいずれかを使用して調べられる。こうしたパラメータには、アポトーシス、毒性および細胞死の測定が含まれる。こうした測定は、同業者には周知のものであり、また使用されている標準的な技術を用いて実施される。代替的には、例えば、タンパク質の発現、mRNA発現(全細胞あるいはポリA RNAの較差的な表示を含む)を見て、分子分析を行いうる。
【0123】
さらなる実施態様では、組織は本発明のナノシェルにより形質転換される1つの細胞あるいは複数の細胞から成る。その組織は生物の一部かあるいは分離されたものであることが多い。ある種の実施態様では、組織は、脂肪細胞、肺胞細胞、エナメル芽細胞、軸索、基底細胞、血液(例えば、リンパ細胞)、血管、骨、骨髄、脳、乳房、軟骨、子宮頸部、大腸、角膜、胚細胞、子宮内膜、内皮細胞、上皮細胞、食道、顔面、線維芽細胞、濾胞細胞、神経節細胞、神経膠細胞、杯細胞、腎臓、肝臓、肺、リンパ腺、筋肉、神経単位、卵巣、膵臓、末梢血、前立腺、皮膚、皮膚、小腸、脾臓、幹細胞、胃、精巣、腹水組織、また、それらすべての癌細胞から成るが、それらには限定されない。
【0124】
付加的なインビボアッセイには、特定の欠陥を有するように遺伝子工学的に処理されたトランスジェニック動物を含むさまざまな動物モデル、あるいは、その生物内に異なる細胞あるいは組織を生じる本発明のナノシェルの能力を測定するのに使用することができるキャリーマーカーの使用も含まれる。その大きさ、操作性の容易さ、およびそれらの生理学的および遺伝子構造に関する情報のため、マウスは好適な実施態様であり、トランスジェニックは特にそうである。しかし、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、スナネズミ、マーモット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、およびサル(チンパンジー、テナガザル、ヒヒを含む)を含む、その他の動物もまた適当なものである。
【0125】
こうしたアッセイでは、本発明のナノシェルの1つあるいはそれ以上の成分は、動物に投与され、また、細胞増殖、細胞毒性、および/またはアポトーシスを改変するそのナノシェルの能力がそのナノシェルにより処理されていない同様の動物と比較される。
【0126】
ナノシェルによるこうした動物の処理には、その動物に対して、適切な形態でそのナノシェルを投与することが含まれる。投与は、皮内、皮下、筋内、腹腔内、あるいは静脈内注射を含む、臨床上あるいは非臨床的目的のために使用することができるいずれかの経路によるものとなるが、それらに限定されない。特に企図されている経路は、全身静脈内注射、血液あるいはリンパ供給を介した局所投与、あるいは罹患部位に直接投与である。
【0127】
治療方法
分子蛍光体とは異なり、金属ナノシェルは一般的には、光退色あるいは光に誘発される損傷を受けることはない。ナノシェル共振は、無放射的には減衰することはない(数パーセントの典型的な量子効率)ので、光吸収によるエネルギーの大半は熱に変換される。したがって、高度な吸収性を有する金属ナノシェルの共振照度は、そのナノシェルの顕微鏡的環境に対して有意な局所加熱をもたらすことができる。これに関する図示説明では、その効果は、その下限臨界溶解温度(LCST)、すなわち、45℃よりも上に上昇したときに突然収縮する転移を起こすポリマーである、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)において相転移を誘発するよう有意な熱伝達をもたらすのに使用することができる(Sershenら、1999)。そのコポリマーが、吸収性金ナノシェルにより、均質にか、あるいは不均質にかのいずれかでドープされる場合は、その収縮転移がそのナノシェル共鳴波長で光により照射されることにより誘発される(図6aと6b)。その照射波長でのコポリマーの弱い残留吸収力では温度上昇とその結果生じる収縮転移を誘発するのには不十分であったことを確認するため、この観察結果が、ナノシェルを使用しない場合のコポリマーの対照サンプルに対して証明された。この局所加熱効果は、連続レーザー源かあるいはパルスレーザー源かのいずれかを使用して比較的適度の電力レベルで、バイオイメージング適用において使用されるそうしたものよりも有意に弱い電力レベルで、観察することができる。したがって、細胞(腫瘍あるいは非腫瘍細胞など)を標的としている抗体に抱合されているナノシェルの光により誘発される局所加熱は、局所的なものであり、特異的な細胞死につながる。このタイプの阻害は、これらに限定されるわけではないが、例えば、腫瘍(悪性あるいは良性)炎症性反応あるいは自己免疫疾患、といったさまざまな臨床的な症状に有用でありうる。
【0128】
さらに一般的に言うと、本発明の本ナノシェルは、癌細胞の増殖の勢いをそぐあるいは阻害するのに効果的な用量で使用することができる。このプロセスには、所望される治療の恩恵を生み出すために、本発明の本ナノシェルを細胞(複数)、組織あるいは生物に接触させることを含めることが可能である。これは、本ナノシェルと1つあるいはそれ以上の薬剤を含む単一成分あるいは薬理学的製剤を、その細胞、組織あるいは生物に接触させることにより、あるいは、1つの成分にはナノシェルが含まれ、また他のものには1つあるいはそれ以上の薬剤が含まれている、2つあるいはそれ以上の区別の付く成分あるいは製剤をその細胞に接触させることにより、達成される可能性がある。
【0129】
細胞、組織あるいは生物に適用される場合、接触させるあるいは曝すという用語は、本明細書では、例えば、化学療法あるいは放射線療法用薬剤などの本発明および/または別の薬剤の治療用ナノシェルが、標的細胞、組織あるいは生物にデリバリーされる、あるいはその標的細胞、組織あるいは生物に直接並置して置かれる、そのプロセスを説明するのに、使用される。細胞殺傷あるいは静止を達成するためには、本ナノシェルおよび/または付加的な薬剤(複数)をその細胞(複数)を殺傷するあるいは分裂しないように防ぐのに効果的な用量で、1つあるいはそれ以上の細胞にデリバリーする。
【0130】
本ナノシェルと1つあるいはそれ以上の薬剤とのさまざまな併用療法が採用される可能性がある。成分であるナノシェルが「A」であり、また、薬剤は「B」である、こうした併用の非限定的な実施例を以下に示す。すなわち、
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
この成分ナノシェルの細胞、組織あるいは生物への投与は、もし何らの毒性があれば、その毒性を考慮に入れて、化学療法薬剤の投与に関する一般的なプロトコルに従うのが良い。その治療サイクルは、必要である場合には、繰り返されることが考えられる。特定の実施態様では、さまざまな付加的な薬剤を、本発明との何らかの併用方法において適用することが企図されている。
【0131】
本発明と併用して使用される可能性がある化学療法薬剤には、5−フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロルアンブシル、シスプラチン(CDDP)、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合薬剤、エトポシド(VP16)、ファネシルタンパク質転移酵素阻害剤、ゲンシタビン、イホスファミド、メクロエタミン、メルファラン、ミトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド(DTICの水性形態)、トランスプラチナ、ビンブラスチン、メトトレキサート、ビンクリスチン、あるいは前者の何らかの類似あるいは誘導変異体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。こうした薬剤あるいは薬物は、細胞内の活性の形態により、例えば、どの段階でその細胞サイクルに影響を与えるのかどうかにより、範疇分けされる。代替的には、薬剤は、核酸合成に影響を与えることにより、DNAに直接的に架橋結合する、DNAの中に挿入する、あるいは染色体あるいは分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられることが可能である。大部分の化学療法薬剤は、以下の範疇に入る。すなわち、アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、コルチコステロイドホルモン、分裂阻害剤、ニトロソウレア、ホルモン薬剤、その他の薬剤、およびそれらの何らかの類似あるいは誘導変異体。
【0132】
化学療法薬剤ならびに投与、用量などの諸方法は、当業者には周知のものであり(例えば、「医師机上参考書」、GoodmanとGilmanの「治療薬剤の薬理学的基礎」、「Remingtonの製薬科学」、「メルクインデックス」第11版を参照。これらは、該当箇所に参考文献として本明細書に組み込まれている)、また、本明細書の開示物に照らして、本発明と組み合わせることが可能である。用量の何らかの変動が、治療を受けている対象者の症状により、必然的に起こる。投与に責任を負っている人は、どんな事があっても、個々の対象者に対する適切な投与方法を決定することになる。特定の化学療法薬剤と投与療法計画の実施例もまた、本明細書に説明されている。もちろん、本明細書に説明されているこうした投与量と薬剤はすべて、限定的なものではなく、例示的なものであり、また、その他の投与薬剤あるいは薬剤は、特定の患者あるいは適用に対して、熟練した技術を有する者により使用されるのが良い。こうした上限下限間のいずれかの投与用量あるいはそこから推論できる投与範囲もまた、本発明のおいては用いることが考えられる。
【0133】
本明細書に説明されている一般的な方法もまた、タンパク質の標的化変性が望ましい場合には有用である。こうした適用では、本ナノシェルは論議されている標的化の諸方法のいずれかによって、関心の対象であるタンパク質に向けられる。過熱療法の局所的な誘発がその後に変性に影響を与えることになる。他のより激しい変性プロセスは加熱の程度により可能であるが、その変性は主に、水素結合の解消とその他の非共有結合相互作用により進む。その変性はインビボかあるいはインビトロかのいずれかで実施されうる。
【0134】
前述の全ての計画を吟味することができる、もう1つの治療上の適用は、高度に局在性を有する過熱療法の急速誘発である。その熱サイクルは、1回の励起照射で開始することができ、強力な高度に局所性の加熱を起こし、また、周囲の大きな組織には非常にわずかな加熱しか起こらない。このように、副次的な損傷は最少限度に押えられる。こうしたアプローチは、冠状動脈斑などの非細胞非組織物質を取り除くのに使用することができる。その一般的な方法は、美容上向上させる領域で付加的に使用されてきた。強力な局所性過熱療法は、その他の潜在的な美容上の適用の中でも、脂肪細胞を殺傷するのに使用することができ、あるいは、見苦しい皮膚形成を取り除くのに使用することができる。
【0135】
ナノシェルは、熱をデリバリーし、また、他の主療法を効果的なものにする副次的な療法として使用することができる。例えば、その箇所での加熱および加熱そのものの値が細胞死を起こすには不十分であることがある。しかし、上昇した温度により、化学療法あるいは遺伝子療法などの他の治療法を容易なものにする、あるいは一段と強める可能性がある。
【0136】
診断の諸方法
赤外線拡散光線によるバイオメディカル画像に関するさまざまな技術が模索されてきた(Hebden,1997)。弾道あるいは擬似弾道軌道を経てサンプルを横切るもの以外、すべてのフォトンを拒絶する時間ゲート制御の諸方法は、考え方として単刀直入なものであるが、それらの諸方法は厚さほんの数ミリメートルのサンプルを画像化するのには好都合である。厚さ数センチメートルの生物学的サンプルに関しては、レーザー光がその組織を通過した後に、被変調レーザー光を検出することを含む周波数領域アプローチは特に受け入れられている。その結果生じる拡散フォトン密度波(DPDW)は、変調計画を用いて検出され、分析され、広い範囲の諸方法を用いて再構築される(Jiangら、1995;Liら、1997;O' Learyら、1995;Trombergら、1997)。このタイプの画像化用サンプル検出器の幾何学的配置には、そのサンプルの断面の周囲に一定の線源検出器距離を保持している複数の線源検出器アレイが含まれる。データ取得を簡素化し、また総体的なコストを軽減する単一固定光源とスキャン検出器とから成る幾何学的配置は、このアプローチの極めて魅力的な簡素化の賜物である(Yangら、1997)。
【0137】
ナノシェルに基づく画像化
現行の赤外線拡散フォトン画像化の諸方法の感受性は、悪性と正常組織の吸収および散乱係数の間の対照的な差異に基づいている。吸収と散乱係数にみられる典型的な差異は、患者により、それぞれ33%から66%まで、また、6%から30%まで変化する(Tromberg、同上、1997)。これらの小さな差異が画像のコントラストを決め、また、したがって、画像解像度は、典型的には1cmよりもちょっと下であるが、患者により変化する。そのため、1つのタイプの組織を選択的に標的化し、また、そのコントラストを向上させ、また、したがって、その断層撮影法画像の解像度を向上させる特定の造影剤の使用に多いに関心が集まる。MRIやPETなどのバイオメディカル画像化の諸方法における通例のアプローチではあるが、近赤外線画像化には適当な造影剤が非常に数少ない。そのもっともよく知られている構成要素がインドシアニングリーン(カルディオグリーン)であるトリカルボキシシアニンのみが、ヒトへの使用を承認されている(Chance,1993)。
【0138】
インドシアニングリーンとは対照的に、金ナノシェルは、消光性では百万倍向上させた性能を有している。すなわち、ナノ粒子(100nm直径)当たり10-9〜10-10 cm2 に比較して、分子当たり10-15 〜10-16 cm2 である。さらに、インドシアニン染料に関しては、その消光性はほとんど純粋に吸収性のものであり、一方、金ナノシェルは、必要であれば、いずれにしても適切に係数を向上させるために、散乱剤としてか、あるいは吸収剤としてかのいずれかで製造することができる。
【0139】
ナノエミッタに基づく画像化
正常組織から患部組織を鑑別するため、造影剤として蛍光染料の使用にかなりの関心が集まっている。近赤外線で励起しまた射出する染料が開発されたが、それは、原則的には、体内深くにある患部組織の蛍光画像化を用にするものであったが、低い摂取と急速な光退色などの問題により、その有用性に関する問題が顕著に提示されている。しかし、組織特性と蛍光寿命を相関させる潜在能力が、結果的に生じる蛍光に基づく画像の重要な局所情報を提供する可能性があるため、これに対するかなりの関心がまだ消えずに残っている(Paithankarら、1997)。実質的には、非蛍光赤外線断層撮影法で使用されているそうしたものに類似の変調技術が許容される主に早い蛍光寿命(1〜100ナノ秒)のため、この分野での関心はすべて、分子蛍光体に集中していた。
【0140】
希土類元素でドープされたナノエミッタは、分子蛍光体とは対照的ないくつかの特性を有している。シリカナノ粒子マトリックス中の放射性イオンのカプセル化により、そのナノ粒子が存在しているその局所の環境は、遊離分子蛍光体に対する場合と同様に、そのナノエミッタ蛍光特性には影響を与えない。シリカナノ粒子内にある希土類エミッタの濃度(典型的には数パーセント)は、その濃度が蛍光体の自己消光が起こるのに十分なものになるまで、増加させることができる。その高いドーパント密度のため、そのナノエミッタは、さらに非常に輝かしい蛍光として、分離希土類イオン種に典型的なものであるものよりも、より大きな吸収力を示すことになる。
【0141】
分子蛍光体とは対照的に、希土類イオンは、極めて長い蛍光寿命を有しており、多くの場合、数百マイクロ秒を持続時間で有する。この特性によって、励起レーザーの入力ビームを変調することにより、そのナノ粒子の蛍光を変調する可能性が排除される。しかし、混濁した媒体中の散乱光の超音波変調の最近のデモンストレーションにより、ナノエミッタ蛍光を変調するための有用な方法が提示されている(L.V.Wang,1998)。超音波変調を付加したことにより、ナノシェルの実験の中で用いられている周波数変調検出の方策が、希土類ナノエミッタにより、蛍光画像化の中で使用することができる。
【0142】
標的化ナノエミッタの蛍光に基づく画像化は、従来からの赤外線断層撮影法画像化の諸方法に比して解像度の増加をもたらして然るべきものなのである。それは、実際の光源、すなわち、ナノエミッタ自体が、画像化されるべき異質性の中に、あるいはその上に存在していることになるからである。混濁媒体中の対象解像度が、その光学経路の長さにより直線的に計測されるため、そのサンプル内にその起源を発する散乱光から得られるその光学経路の長さは当然、従来の透過画像化幾何学配置における光学経路の長さよりも短い。これにより、透過性画像にわたって2倍の解像度という平均増加率という結果を生じうる。さらに、解像度の増加は、ナノエミッタが存在することによるμa およびμs における変化により、得ることが可能になる。
【0143】
シャドウィング効果を取り除くために、蛍光画像では、さまざまな方向、また、複数源、複数検出器幾何学から、サンプルの励起が必要となる。このタイプの実験的な幾何学的配置では、陽電子射出断層撮影法(PET)に通常適用される方策である発光射出性の画像と、標準的な透過性の画像の両方ともを関心の対象となっているサンプル上で行うことにより、再構築画像品質を改善することができる(Tungら、1992)。
【0144】
金ナノシェルを用いた治療方法
適度なレーザー照射の下で、金ナノシェルは、その局所環境の中で有意な温度上昇を誘発することができる。ポリNIPAAmマトリックスでは、局所加熱が、およそ8度の温度上昇に相当する、収縮転移を開始するには十分である。この温度上昇は、水の中に入れた金ナノシェルの溶液の中で直接測定されたものであり、また、図7に図示してある。この実験では、850nmで共振させた金ナノシェルのピコモル溶液が、500mWの連続発振Ti:サファイアレーザーによる共振の上、全部で20分間、照射された。照射の最初の10分間の後、9度の温度上昇が観察された。周囲に対する熱損失により、連続照射上にあるサンプルのさらなる加熱が防止された。同じやり方で照射された水性対照溶液は、検出可能な温度上昇はまったく示さなかった。
【0145】
金ナノシェルの近傍でのこの局所選択的加熱は、癌細胞の熱的破壊に適用することができる。抗c−erB−2(またはHER2)抗体を用いて特異的に癌腫細胞を標的化するために金シリカナノシェルを使用することができる実験が行われた。この抗体は、数多くのヒト乳房上皮癌腫の表面でよく発見される過剰発現HER2チロシンキナーゼ受容体を標的とする。この抗体を用いてこうした癌腫細胞に近IR吸収ナノシェルを結合させた後、われわれは、近IR光でサンプルを照射し、そのナノシェルを加熱し、また、その近傍にある癌腫を破壊する。
【0146】
以下の実施例は本発明の好適な実施態様を提示するために含められる。実施例は単に説明的なものであって、本発明の諸適用について論じ尽くすようなものではない。熟練した技術を有する当業者であれば、以下に続く実施例に開示されている技術とは、本発明の実施時にうまく機能するよう本発明者によって発見された技術のことを言っていることは理解して然るべきであり、したがって、その実施に関する好適な形態を構成するように考慮することができる。しかし、熟練した技術を有する当業者であれば、本開示に照らして、開示されている特定の実施態様では、数多くの変更例を作り出すことができ、また、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、同様のもの、あるいは同様な結果を得ることができることは、理解して然るべきである。
【0147】
実施例1
金属ナノシェルコロイドをベースとした全般的な合成方法
定められたサイズのナノ粒子コアと金属シェルを合成するための、融通性を備えた方法が開発され、それらの方法が以下で説明されている。一般的に、その方法は、以下のステップを含んだ:
1.誘電体または半導体のナノ粒子コアを得、溶液に分散させた;
2.1−2nmの金属様「シード」コロイドを、分子結合により、そのナノ粒子コアの表面に取り付け、不連続的な金属コロイド層でそのコア表面を覆った;
3.付加的な金属を、溶相化学還元反応により、その金属様吸着物質に析出させた。
【0148】
このナノ粒子構築方法は、シリカナノ粒子と金コロイドを用いて実施された。商業的に入手可能なシリカナノ粒子と、現場(in situ)で成長させたシリカナノ粒子との両者が成功裏に使用された。そのナノ粒子コアに、オルガノシラン結合分子4−アミノプロピルトリエトキシシランを吸収させた。次いで、それらのコア粒子を含有する溶液に金コロイドを導入した。それらの金コロイドナノ粒子は、上述のオルガノシランリンカー分子に結合し、不連続的な金属クラスター層でそれらのシリカコアを覆った。その後、金・金属原子を、溶液からの還元により、上述の拘束された金属クラスター上に析出させた。
【0149】
実施例2
コア粒子の合成
最初に、ナノ粒子用のコア材料を調製した。この材料は、形状が球形で、サイズは略一様であった。以下の手順で製造されたそれらのシリカ粒子は、10%未満の標準偏差を有していた(4%をルーチン的に達成可能)。
【0150】
単分散酸化ケイ素粒子コアを製造するため、そのような方法が開示されている範囲までが参照により本明細書に組み入れられる、Stoberら(1968年)の方法が用いられた。但し、他の方法も適用することができる。オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)99.999%はAldrich Chemical Co.から入手し、水酸化ナトリウムはFluka Chemical Co.から入手し、そして、高純度精製水は、「MILLIQUV」及び「MILLIQRO」フィルターを含めたMillipore「TOTALQ」システムから得た。すべてのガラス容器は、クロム酸溶液で清浄化し、「TOTALQ」水で徹底的にすすいだ。
【0151】
様々なサイズの単分散シリカ球を製造するため、水、塩基濃度、及びTEOS濃度における様々なバリエーションを用いた。温度及び電解質濃度も、それらの粒子の最終的な直径に影響を及ぼした。一般的に、以下の濃度範囲を使用した:0.1ないし0.5MのTEOS、0.5ないし17MのH2 O、及び、0.5ないし3.0Mのアンモニア。更に、溶媒として種々のアルコールを使用したが、エタノールが好適であった。アンモニアの濃度を高くすればするほど、粒子のサイズが大きくなる。
【0152】
透過型電子顕微鏡(TEM)で測定したときに120nmの直径を有する均一な粒子を以下の方法により調製した。約50ミリリットル(ml)の乾性(100%)エタノールと4mlのNH4 OH(水中における25%のNH3 )をガラス製ビーカー内で攪拌した。この溶液に、少なくとも99.999%の純度を有する、2.2mlのオルトケイ酸テトラエチルを加え、少なくとも8時間攪拌した。他の数あるファクターの中でもとりわけ、NH4 OH、水、及びケイ酸塩の濃度を変えることにより、シリカ粒子のサイズを、直径約20nmから500nmまで変えた。それより大きいコア粒子は、既に形成されているシリカ粒子に付加的なTEOSと水を加えるシード添加(seeded)成長技法を用いて成長させた。少量の付加的反応物を何回も加えることにより、単分散コア粒子を4ミクロンの大きさにまで成長させることができた。
【0153】
実施例3
リンカー分子の付着
内層の周囲に金属のシェルを構築するためには、しばしば、リンカー分子の使用を必要とした。これらの分子は、内層に化学的に結合され、導電性シェルの原子群、イオン群、及び、原子性または分子性クラスターをその内層に結合する働きをした。それらのリンカーに結合された上述の導電性シェル原子は、シェルを完成させるため、上述の付加的な原子または分子を還元するための核形成部位として使用された。金粒子を二酸化ケイ素に付着するために使用した一つの方法は、それらの粒子をアミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)で処理するものであった。APTES分子のシラノール末端基は、粒子表面の新たな末端としてそれらのアミン基を外向きに伸ばしているシリカコアに共有結合で付着する。
【0154】
この方法では、先ず、実施例IIIで調製されたもの等のシリカ粒子懸濁液10mlを、50mlのガラスビーカーに加えた。次いで、その溶液に、純粋なアミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)を加えた。見積もりに基づき、充分量のシランを加え、それらの粒子を多層のシランでコーティングした。例えば、直径が120nmの粒子の場合には、40μLの非希釈APTESを用いた。その溶液を2時間攪拌し、200mlにまで希釈した後、沸騰するまで4時間加熱した。その加熱ステップは、シラノール基のSi−O−Si結合への反応を促進し、そして、シランのシリカへの付着を強化する。この混合物を、2000×gで30分間遠心分離した。得られた上清をデカントして取り除き、そのペレットを超音波により再分散させた。この洗浄手順を5回繰り返した。
【0155】
アミノプロピルトリエトキシシラン以外の多くのリンカー分子も、この手順で使用するのに適している。例えば、アミノプロピルトリメトキシシラン、ジアミノプロピルジエトキシシラン、あるいは、4−アミノブチルジメチルメトキシシラン等を使用することができる。更に、その表面を、金属クラスターを介してではなく、その表面にある金属原子の直接的な還元が可能なリンカーで終えることもできる。他の実施態様では、テトラヒドロチオフェン(AuCl)と、ジフェニルトリエトキシシランでコーティングされたシリカコアとを反応させて、塩化金イオンで終わる表面を残し、これにより、付加的な金還元用の部位を提供することができる。また、他の実施態様では、シリカ粒子の外面に成長させた、CdSまたはCdSe等の別の非金属材料でできた薄いシェルにより、ナノ粒子の表面に金属シェルを直接還元することができる。更に、別の実施態様では、導電性ポリマーの官能基化されたオリゴマーを、コアナノ粒子の官能基化された表面、もしくは、官能基化されていない表面に、溶液中で付着させ、続いて、熱または光により誘発される化学的な方法により、橋かけすることができる。
【0156】
実施例4
金属クラスターの付着
誘導体化されたコア粒子を金属コロイド浴に浸すことにより、コア上のリンカー分子に金属クラスターを付着させた。コロイドの形態で作成できるどんな金属も、金属クラスターとして付着させることができた。例えば、銀、白金、パラジウム、鉛等を使用することができた。それらに加え、金属様有機分子も適している。そのような化合物は、ポリアセチレン及びポリアニリンを含む。そのような方法が開示されている範囲までが参照により本明細書に組み入れられる、Duffにより記述されている還元反応を用いて、直径が1−3nmの金クラスターを成長させた。45mlの水、300μLの1M・NaOH、及び、1mLの新たに希釈された塩化テトラキス(ヒドロキシメチル)ホスホニウム(THPC)の1%水溶液からなる溶液を、100mlの平底ビーカー内で、パイレックス(登録商標)コーティング磁気攪拌棒を用いて攪拌した。2分後、2mlのクロロ金酸(25mMの暗所保管(dark−aged)保存溶液、Aldrich社から入手したテトラクロロ金(III)酸三水和物99.999%)を加えた。この反応混合物を用いて、溶液中で、平均粒径が1−2nmの金粒子を形成した。それより高い濃度の塩化金を用いることにより、それらの粒子のサイズを大きくすることができた。このような仕方で調製した粒子を、超微小金粒子または(UG)と名付けた。
【0157】
一般的に、そのUG溶液は、コア粒子表面を理論的に5倍から10倍カバーすると考えられる量でシリカ粒子と混合された。その溶液を、穏やかな攪拌下において、3時間反応させた。好適な実施態様では、作成してから5−30日後にその金を使用した。
【0158】
典型的には、3時間後、1000RCFで遠心分離することにより、金装飾シリカ粒子から未反応の金コロイドを分離した。粒子のコアレッセンスを避けるため、分離を果たすのに必要な最小量の遠心力を用いた。再懸濁及び遠心分離により、粒子を2回洗った。
【0159】
本発明者らは、付加的な安定化化合物の不在下における遠心分離及び再分散後に、それらの金装飾粒子が凝集しなかった、という驚くべき発見をした。この発見により、シリカに付着した金を化学的に反応性の状態に保ったまま、コロイド状の金から上述の装飾シリカを都合よく分離することが可能になった。後に行われる粒子の再懸濁を促進するため、遠心分離の前に、種々の保護剤を加えることができた。これらの保護剤は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、またはホスフィン配位子、及び、チオールで終わるカルボン酸結合を含む。再懸濁は、上述の遠心分離ステップで最小量の力を用いたときに容易に達成され、そして、音波処理により、粒子のあらゆる凝集体を再分散させることができた。広く知られた標準的な方法に従って動的光散乱測定装置を用いることにより、それらの粒子が分散していたことを確かめた。それらの分散粒子を10mlにまで希釈し、完全な金属シェルの成長に対する保存溶液として使用した。
【0160】
実施例5
シェルの成長
塩酸ヒドロキシルアミン、水素化ホウ素ナトリウム、及びホルムアルデヒド等の様々な還元剤を用いて金を析出させることにより、それらの金属クラスターを大きくした。中でもホルムアルデヒドが好適であった。1.5mlの25mM・クロロ金酸溶液(PCG)を含有する100mlの水に、25mgの無水炭酸カリウムの溶液を加えた。この溶液を、暗所で1日間エージングした。2−5mlの金クラスター形成シリカ溶液と共に、約10ml+/−5mlのPCGを急速に攪拌した。次いで、100μLアリコートの新たに調製されたホルムアルデヒド溶液(水中における、容量で2%の溶液)をゆっくりと加えた。
【0161】
金属クラスターを大きくする前には、粒子に付着された金属クラスターは、それらの天然のコロイド状形態と同じUV−可視吸収スペクトルを有していた。それらのクラスター上に付加的な金属が析出されると、図3の下側の曲線で示されているように、その粒子の最大吸光度は長波長側へシフトした。その金シェルが完成したときには、上述の粒子の最大吸光度は、その幾何学的形状、特には、内側の非導電性層の厚みと外側の導電性層の厚みとの比率に関係した。導電性層が厚くなると、図3の上側の曲線で示されているように、その粒子の最大吸光度は短波長側へシフトした。この反応の進行度を分光測光法で追跡し、所望の最大吸光度波長が得られたときに、反応の進行を終結させた。典型的には、10分以内に色変化が生じた。直径110nmのコア粒子の場合、典型的には、仄かな褐色から紫、青、緑、または黄色への、可視の色変化が見られる。光学的な吸収スペクトルに影響を及ぼした幾つかの他のファクターは、コアのサイズ、シェルの粗さ、コアの形、還元中にコア内に組み込まれ得る、溶液中の付加的な反応物、シェルの連続性、及び、粒子の凝集度である。
【0162】
一旦、核形成部位が適所にできると、多くの異なる方法を用いて金属シェルを完成させることができる。当技術分野における熟練者であれば、ある金属コロイドをそれよりもっと大きな金属コロイドへ発達させるために使用できるあらゆる方法により、成功裏にシェルを成長させ得ることが理解されよう。例えば、Nanoprobes,Inc.から商業的に入手可能なLI銀等の銀溶液を都合よく使用することができよう。更に、拘束されるシード粒子がシェル材料と同じ材料である必要はない。一つの実施態様では、UGでコーティングされたシリカ上に硝酸銀が還元される。これは、還元剤としてのホルムアルデヒドを伴う塩基性溶液中で行われ、銀シェルをもたらす。また、調製されたナノ粒子表面への光誘導による金属シェルの析出も可能である。
【0163】
非導電性コア上への直接的な銀の還元は、CdS半導体層に直接的に銀を還元することにより果たすことができる。20nmより大きな直径を有するCdSを構築するためには、最初に、シリカコア上にCdS層を成長させることが必要であった。これは、例えば油中水型ミクロエマルジョンを用いて果たすことができる。一つの実施態様では、AgNO3 とNH4 の溶液に粒子を加え、次いで、そのシェルを発達させるため、NH3 OHCl溶液をゆっくりと加えることにより、シリカ/CdS粒子上に銀を還元させた。
【0164】
実施例6
20mLの2mM・HAuCl4 と28mLの1mM・Na2 Sを化合することにより、直径37nmの硫化金コアと厚さ4nmの金シェルを有する金ナノシェルを形成した。その反応の進行度は、UV−可視分光光度計を用いて、400−1050nmの範囲のその溶液の吸収スペクトルを観察することにより、監視することができる。ナノシェルが形成されると、その吸収スペクトルは、IRへ赤側シフトしたピークを呈し、次いで、休止した後、可視スペクトルへ青側シフトし始めた。この状況が生じると、ピークは、幅が狭くなり、大きさが増大する。ピークを為す吸収の中心が1050nm付近に位置したときに、(金シェルの成長を停止させることにより)このシフトを止めるため、メルカプトプロプリオン酸(3.5μL)を加える。次いで、その溶液を、1MのNaOHでpH10.5にし、3000RPMで20分間、4回遠心分離し、4℃で保存する。結果として得られるナノシェルのサイズ及び多分散性は、一滴のナノシェル溶液を銅格子上のカーボンフィルム上で蒸発させ、透過型電子顕微鏡でそのナノシェルを観察することにより決定することができる。
【0165】
実施例7
ナノ技術を用いた熱管理材料及びコーティング
本出願は、地表に達する太陽の最大放射力が、電磁スペクトルの可視域及び赤外域にわたって広く分配されているという事実と、ナノ粒子の混合物が、そのスペクトル全体を通じるエネルギーを吸収するか散乱するかのいずれかにより発達することができるという事実を利用するものである。本技術は、太陽の発光スペクトルの全範囲にわたる放射の吸収または散乱を系統的にコントロールするための唯一の知られた方法である。これらの粒子の混合物は、太陽のスペクトル全体にわたる放射を吸収することができる。
【0166】
そのような混合物は、当技術分野において良く知られた標準的な方法により、高分子材料や、ガラス、塗料、エポキシ樹脂、あるいは他のコーティングマトリックスに組み込むことができる。更に、これらの材料の熱特性を、その混合物の波長範囲にわたる、太陽エネルギーあるいは何らかのソースの電磁放射線の吸収及び散乱に依存する適当な適用分野で利用することができる。
【0167】
実施例8
金シリカナノシェルを使用する、ヒト乳癌細胞の光熱的誘発細胞死
ステップ1: 抗体溶液の調製
2種類の抗体をこの実験に使用する。実験処置において、HTB−30ヒト乳房上皮癌細胞系におけるオンコプロテインを標的とする抗c−erB−2抗体(Dako、A0485)を使用する。非特異性対照に関して、我々はロバ抗ヒツジIgG抗体(Sigma、S2763)を使用し、該抗体は、非特異性対照として作用しなければならず、HTB−30細胞表面に結合してはならない。両方の抗体溶液を、脱イオン水(pH7.6)中に100μg/mLの濃度で調製した。
【0168】
ステップ2: ナノシェルの製造および抗体との結合
以前に記載された方法(Oldenberg, 1998)を使用して、2.83x109 粒子/mLの濃度において、64nmコアー半径および14nm厚みの金シェルを有する、820nmにおいてピーク吸収を有するナノシェルを製造した。
【0169】
ナノシェルを脱イオン水で洗浄した後、それらは抗体との結合に使用できる。抗体のようなタンパク質は、水性条件下に金ナノ粒子表面に容易に吸収されることが充分に文書で証明されており(Horisberger, 1981)、従って、金ナノシェルと抗体との結合は、2つの成分を混合するだけでよい。
【0170】
4つの試験管に1〜4のラベルを付けた。2.7mLのナノシェル保存溶液を試験管1〜3に添加し、3.0mLのダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水(DPBS)を試験管4に添加した。300μLの抗c−erB−2ストック、抗ヒツジストックおよびDI水を、試験管1、2および3にそれぞれ添加した。全ての試験管を混合し、2〜4℃で一晩インキュベーションした。
【0171】
ナノシェル表面における付加的タンパク質吸収部位をブロックするために、試験管1および2において、ウシ血清アルブミン(BSA)を添加して、最終濃度3%(wt)にする。試験管3または処置3にはBSAを添加しない;この処置は、細胞と一緒にインキュベーションした場合に、正の対照としての役割をし;それの露出金表面は、HTP−30細胞の表面タンパク質へのナノシェルの強い吸収を生じ、その結果、細胞上に高密度のナノシェルを生じる。
【0172】
次に、DPBSを試験管1〜3に添加して、溶液を、接触する細胞試料と等浸透圧性にする。
【0173】
ステップ3: ナノシェルと細胞とのインキュベーション
10%ウシ胎児血清(FBS)を含有するMaCoy5a細胞増殖培地を使用して、HTB−30癌細胞を、2つの12穴トレーでほぼ集密に増殖させた。試験管1〜4を37℃に加熱し、細胞をDPBSで1回洗浄し、各試験管の含有物0.5mLを各トレーの3つの穴に添加した。ナノシェル処置物(treatments)を、オービタルシェーカーにおいて37℃で1時間にわたって細胞上でインキュベーションした。
【0174】
この時点以降、実験は並行した2つの分離経路をとる。1つのトレーは、銀増加染色を受け、この方法は、細胞表面に結合したナノシェル上に付加的銀を成長させて、4つの各処置におけるナノシェル結合の量を視覚化する。他のトレーは、近赤外線レーザーで処理し、次に、染色して、光熱的に誘発された細胞死を測定する。
【0175】
レーザー処置
ステップ4: 細胞表面からのナノシェルの洗浄
全ての穴をDPBSで3回洗浄し、次に、無血清McCoy5a培地と取り替える。
【0176】
ステップ5: 細胞の照射
各処置(1〜4)における3穴のうち2つを、821nmで発光するCoherentTMダイオードレーザーによって、37W/cm2 の線量で10分間にわたって照射する。照射の終了時に、細胞を37℃でさらに2時間インキュベーションする。
【0177】
ステップ6: 生存率染色の実施
生存率染料、Calcein AMは、生きた細胞において緑色の蛍光を発する(生きた細胞におけるエステラーゼ活性によって蛍光生成物に変換する)。順相対照影像(normal phase contrast images)(全細胞を観察する)とCalcein AM染料(生きた細胞のみを検出する)とを比較することによって、試料における生きた細胞と死んだ細胞とを区別することができる。
【0178】
細胞をDPBSで1回洗浄し、Calcein AMの1μM溶液と一緒に室温で45分間インキュベーションした。次に、細胞を蛍光および相対照鏡検法によって検査し、細胞の生存率を評価した。
【0179】
銀染色
ステップ4a: 細胞表面からのナノシェルの洗浄および固定
過剰のナノシェルを細胞表面から洗浄する。残留するナノシェル/細胞を、2.5%のグルタルアルデヒドを使用して15分間にわたって適所に固定する。次に、試料をDI水で洗浄して、次のステップの間に銀の発生を妨げる過剰の塩を除去する。
【0180】
ステップ5a: 銀増加
銀増加キットをSigma(SE−100)から購入した。増加試薬Aと試薬Bとを同容量で混合し、試料に添加する。ナノシェルにおける銀の発生と共に、試料が黒色になる。充分な発生が生じた際に(約20分間)、試料をDI水で洗浄し、次に、2.5%のチオ硫酸ナトリウムを添加して銀の成長を停止させる。
【0181】
ステップ6a: Mayerヘマトキシリンでの対抗染色
ヘマトキシリンは、下にある細胞を青色に染色し、それによって、ナノシェルおよび下にある細胞の位置を比較することができる。5分間で数滴を試料に添加する。次に、それらをDI水で洗浄し、37mM水酸化アンモニウムで5分間処理する。次に、細胞をDakoグリセルゲルに入れ、カバーガラスでカバーし、相対照鏡検法によって検査する。
【0182】
実施例9
生体内における、レーザー励起ナノシェル法を使用する熱誘発組織破壊
Wistarラットの腕三頭筋の腕筋肉から、皮膚を除去した。ナノシェル処置を受ける場合、生理食塩水中の金/シリカナノシェル懸濁液を筋肉注射した(1x1010/mLにおいて50μL)。対照試料は注射しなかった。次に、筋肉をダイオードレーザー(832nm発光)を使用して、3mmのスポット直径で照射した(16.7W/cm2 )。対照試料(非ナノシェル)は7分間照射した。ナノシェル処置試料は30秒間照射した。
【0183】
結果
ナノシェルの不存在下のレーザーへの暴露は、可視組織損傷を誘発しなかった。しかし、レーザー光への暴露の前にナノシェルを注射した組織は、広範囲な組織損傷を受けた。この電力において30秒以内の照射で組織は炭化し、従って、7分間の暴露目標の前に照射を停止した。図8aは、7分間のレーザー照射の暴露された対照試料を示す。図8bは、ナノシェルの存在下に近赤外線レーザーに暴露した後の、組織の肉眼外見(gross appearance)を示す。炭化し、凝固した組織の環状領域は、図8bにおいて容易に見ることができる。
【0184】
引用文献
明細書に記載した全ての特許および公表物は、本発明が関係する技術の熟練者のレベルを示すものである。各公表物が特に、および個々に、引用によって援用されるのと同じ程度に、全ての特許および公表物を引用によりここに援用する。
【0185】
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米国特許第4737323号
米国特許第4533254号
米国特許第4162282号
米国特許第4310505号
米国特許第4921706号
米国特許第5939277号
米国特許第6107090号
米国特許第5432260号
米国特許第5871727号
米国特許第5786214号
PCT/US85/01161
PCT/US89/05040
英国特許出願第GB2193095号
PCT WO 98/0748
【0186】
本発明を充分に適合させて、目的を遂行し、記載した結果および利益、ならびに本発明に本質的な結果および利益を得ることを、当業者は容易に理解する。本明細書に記載したタンパク質、ペプチドフラグメント、スプライス変形、ベクター、方法、手順および技術は、現在の好ましい実施態様の典型であり、例示することを意図するものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。それらの変更および他の使用は当業者が気付くものであり、それらは本発明の趣旨の範囲であるか、または特許請求の範囲によって限定される。
【図面の簡単な説明】
【0187】
【図1】金シェル−シリカコアナノシェルの光共鳴(吸光度、任意単位)をコア/シェル比の関数として表すグラフである。矢印はコア半径60nm、シェル厚20nmおよび5nmのナノシェルに関する値を示している。
【図2】金/シリカナノシェルに関してコア/シェル比を共鳴波長(ミクロン)の関数として表すグラフである。
【図3】直径120nm(図3a)および340nm(図3b)のシリカナノ粒子上での金シェルの成長に関する吸光度(任意単位)対波長(nm)のグラフである。金層の合着が進行するにつれて光吸収の漸進的な変化が起こり、下側のスペクトル曲線を与える。いったんシェルが完成すると、ピーク吸光度は短波長側にシフトする。対応する理論ピークを波線で示す。ピークシフトは、シェル厚が大きいものに関して機器表示領域中に認められる中央曲線部のショルダーだけをみると、さらに顕著である。
【図4】シリカナノ粒子に組み込まれたPr+3のルミネセンス(任意単位)スペクトル(可視領域)のグラフである。ナノ粒子発光;バルクPr3+:シリカ発光。
【図5】(a)コア直径1000nm、シェル4nmおよび(b)コア直径200nm、シェル11nmの寸法を持つ金ナノシェルに関して、1000nmでの総吸光度量、吸収および散乱を示す、断面積(任意単位)対波長(nm)のグラフである。
【図6】1064nmのNd:YAGレーザー(164mJ/パルス、パルス長7ns、繰返し数10Hz)による照射中および照射後のNIPAAm−co−AAmヒドロゲル(菱形)およびナノシェル複合ヒドロゲル(正方形)の崩壊および膨潤を示すグラフである。
【図7】波長850nm、出力レベル500mWでの照射による金ナノシェル溶液共鳴体(正方形)および対照水溶液(菱形)の温度上昇のグラフである。
【図8】ナノシェルを用いたインビボでの組織破壊実験の結果を表す図である。図8aは対照であり、図8bはナノシェルを使って処理した試料である。実験方法および実験結果は実施例8に記載する。
【図9】ナノシェルの存在下で近赤外光に曝露することによって誘発された熱傷を持つ組織の組織切片を示す図である。図9aは倍率200倍の組織切片を示す。図9bは倍率400倍の組織切片を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナノ粒子を電磁放射に曝露する工程を含む細胞または組織の画像診断方法に使用されるナノ粒子製剤であって、前記ナノ粒子はコアおよびシェルを有するナノシェルを包含し、前記コア材は誘電性または半導性であり、前記シェル材は導電性であるナノ粒子製剤。
【請求項2】
前記電磁放射が紫外、可視および赤外放射からなる群より選択される請求項1記載のナノ粒子製剤。
【請求項3】
前記ナノ粒子が前記放射を吸収または散乱する請求項2記載のナノ粒子製剤。
【請求項4】
前記電磁放射が赤外放射である請求項2記載のナノ粒子製剤。
【請求項5】
請求項1記載のナノ粒子製剤を含む造影剤。
【請求項6】
前記ナノ粒子が誘電性または半導性であるコアおよび導電性であるシェルを有する請求項1記載のナノ粒子製剤。
【請求項7】
前記ナノ粒子がシリカコアを有し、導電性シェルが金属である請求項6記載のナノ粒子製剤。
【請求項8】
前記ナノ粒子が硫化金を含むコアおよび金を含むシェルを有する請求項6記載のナノ粒子製剤。
【請求項9】
前記ナノ粒子が希土類発光体をドープしたシリカを含む請求項1記載のナノ粒子製剤。
【請求項10】
前記希土類発光体がPr+3、Er+3またはNd+3である請求項9記載のナノ粒子製剤。
【請求項11】
前記ナノ粒子が前記放射を吸収するか、蛍光を発するか、または散乱する請求項1記載のナノ粒子製剤。
【請求項12】
前記細胞または組織に特異的に結合する分子連結したナノ粒子を含む請求項1記載のナノ粒子製剤。
【請求項13】
前記結合が抗原抗体複合体の形成によってなされる請求項12記載のナノ粒子製剤。
【請求項14】
ナノ粒子を紫外、可視もしくは赤外放射またはそれらの任意の組み合わせに曝露する工程を含む細胞または組織の画像診断方法に使用される希土類発光体をドープしたシリカを含むナノ粒子製剤であって、前記ナノ粒子はコアおよびシェルを有するナノシェルを包含し、前記コア材は誘電性または半導性であり、前記シェル材は導電性であるナノ粒子製剤。
【請求項15】
ナノ粒子を超音波、磁場および電場からなる群より選択される放射に曝露する工程を含む細胞または組織の画像診断方法に使用されるナノ粒子製剤であって、前記ナノ粒子はコアおよびシェルを有するナノシェルを包含し、前記コア材は誘電性または半導性であり、前記シェル材は導電性であるナノ粒子製剤。
【請求項16】
ナノ粒子を超音波、磁場および電場からなる群より選択される放射に曝露する工程を含む非細胞非組織物質の画像診断方法に使用されるナノ粒子製剤であって、前記ナノ粒子はコアおよびシェルを有するナノシェルを包含し、前記コア材は誘電性または半導性であり、前記シェル材は導電性であるナノ粒子製剤。
【請求項17】
前記非細胞非組織物質がプラークである請求項16記載のナノ粒子製剤。
【請求項18】
ナノ粒子を電磁放射に曝露する工程を含む動物の細胞または組織の画像診断方法に使用されるナノ粒子製剤であって、前記ナノ粒子はコアおよびシェルを有するナノシェルを包含し、前記コア材は誘電性または半導性であり、前記シェル材は導電性であるナノ粒子製剤。
【請求項19】
前記動物がヒトである請求項18記載のナノ粒子製剤。
【請求項20】
ナノ粒子を電磁放射に曝露する工程を含む動物の非細胞非組織物質の画像診断方法に使用されるナノ粒子製剤であって、前記ナノ粒子はコアおよびシェルを有するナノシェルを包含し、前記コア材は誘電性または半導性であり、前記シェル材は導電性であるナノ粒子製剤。
【請求項21】
前記動物がヒトである請求項20記載のナノ粒子製剤。



【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9a】
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【図9b】
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【公開番号】特開2012−229252(P2012−229252A)
【公開日】平成24年11月22日(2012.11.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−157768(P2012−157768)
【出願日】平成24年7月13日(2012.7.13)
【分割の表示】特願2001−557568(P2001−557568)の分割
【原出願日】平成13年2月8日(2001.2.8)
【出願人】(501249010)ライスユニバーシティ (1)
【氏名又は名称原語表記】Rice University
【Fターム(参考)】