治療用アピラ−ゼ構築物、アピラ−ゼ作用物質、及び製造方法
本発明は、優れた薬物動態学的、薬力学的及び薬化学的性質を有し、かつ簡略化された手順を用いて精製することができる、改良型アピラ−ゼ（ＥＮ−アピラ−ゼ）の新しいクラスを提供する。本発明はさらに、このようなＥＮ−アピラ−ゼを生産するために細胞を形質転換するための核酸構築物を提供する。ＥＮ−アピラ−ゼ構築物は、シグナル配列、リンカ−、及び可溶性アピラ−ゼをコ−ドする配列を含む。また、アピラ−ゼの調製物、並びに培養細胞でのアピラ−ゼの生産方法及びその精製方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１月１３日に出願された米国特許出願第６１／２９４，６９５号の優先権を主張するものである。この文書の内容は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、新規なアピラ−ゼ類並びに血栓性疾患又は炎症関連疾患を治療するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アピラ−ゼ類（エクトＡＴＰジホスホヒドロラ−ゼ）は、ＡＴＰからＡＤＰへの、及びＡＤＰからＡＭＰへの代謝を触媒する一群の酵素である。最初に知られたヒトアピラ−ゼであるＣＤ３９は、もともとは活性型リンパ球及び内皮細胞の細胞表面タンパク質として同定された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験の両方において、ＣＤ３９はＡＤＰのレベルを調節することから心血管の健康において重要なアピラ−ゼであることが明示された。例えば、アピラ−ゼは、細胞外ＡＤＰを代謝することによって血小板凝集を阻害することが知られている。血小板上のＡＤＰ受容体と不可逆的に結合するクロピドグレル（Ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）（プラビックス（Ｐｌａｖｉｘ））とは異なり、ヒトアピラ−ゼは、血小板それ自体に損傷を与えたり、通常の血小板機能を妨げたりすることがなく、過度の血小板活性化を示す患者へのより安全なアプロ−チを提供する。
【０００４】
既知のヒトＣＤ３９ファミリ−の中で、ＣＤ３９Ｌ３は、ＣＤ３９（エクトＡＴＤＰ’ア−ゼ）とＣＤ３９Ｌ１（エクトＡＴＰ’ア−ゼ）の中間の生化学的活性をもつエクトアピラ−ゼ（エクトＡＴＰＤア−ゼ）として知られている。ＳｍｉｔｈとＫｉｒｌｅｙ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（１９９８）１３８６：６５−７８）によって、ＣＤ３９Ｌ３は主にヒト脳組織中に存在することが確認された。
【０００５】
具体的には、ヒトＣＤ３９Ｌ３は、配列番号１に示される５２９アミノ酸のタンパク質であり、５９１３２．４２ダルトンの推定分子量を有する。ＣＤ３９Ｌ３の等電点は６．２３３である。７つの推定グリコシル化部位と１３個のシステイン残基が存在する。配列番号１に基づいた、Ｎ末端の４３残基とＣ末端の４４残基は、膜貫通ドメインの一部であると考えられる。この酵素の触媒コアは凡そ４４番目のアミノ酸と２３８番目のアミノ酸の間にあり、これらの残基を含む、このタンパク質及び関連アピラ−ゼの可溶性形態がＣｈｅｎらによって調製され、記載されている（米国特許第７，２４７，３００号）。さらに、６７番目の残基アルギニンをグリシンで、及び／又は６９番目の残基トレオニンをアルギニンで置換することにより、米国特許第７，３９０，４８５号に記載されるように、ＡＤＰ’ア−ゼ活性の増強を含む、さらなる望ましい特性を付与することが明らかになっている（ここで、残基番号は配列番号１として示される野生型ヒトＣＤ３９Ｌ３における番号を指す）。
【０００６】
ＰｒｏｔＰａｒａｍ解析から、ＣＤ３９Ｌ３とＣＤ３９はどちらも約５２０個のアミノ酸から成り、約６．０のｐＩをもつことが示されている。ＣＤ３９Ｌ３とＣＤ３９はまた、互いに類似したアミノ酸組成を共有し、また、Ｎ末端及びＣ末端の膜貫通領域の間にある細胞外ＡＴＰ／ＡＤＰア−ゼ部分の約４４０アミノ酸残基を含む、共通の構造モチ−フをもっている。ＣＤ３９Ｌ３は３番染色体に、そしてＣＤ３９は１０番染色体に存在するが、それらの全体的なイントロン及びエクソンの構造は同一であって、それぞれエクソンが１０個存在する。
【０００７】
バイオインフォマティクス解析から、ＣＤ３９Ｌ３はＣＤ３９の脳に特異的なアイソザイム又はアイソエンザイムであることが示唆されている。アイソザイム又はアイソエンザイムはそれぞれの対応する酵素と同じ調節特性を持たないこともあり、むしろそれがさらされている厳密な環境に最適となるようにその酵素的性質を調整している。ノ−ザンブロット試験では、ＣＤ３９Ｌ３が脳と腎臓で高度に発現されているのに対し、ＣＤ３９は胎盤と脾臓で発現していることが示されている。この解析結果は、ヒト脳におけるアイソエンザイムＣＤ３９Ｌ３の発現が、主要な血栓調節因子としてのＣＤ３９の活性を補完していることを示唆している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、より長い半減期、より高い安定性、より高い溶解性、又はより高い純度などの改良された治療特性を示す、新しいクラスのアピラ−ゼ化合物、及びそれらの調製物を提供する。また、高濃度のそのような改善された調製物であって実質的に同質なものに容易に精製できる形態を調製する方法も開示される。
【０００９】
発明の開示
優れた薬物動態学的特性を有しかつ培養液から比較的容易に精製される、新しいクラスのアピラ−ゼ（「ＥＮ−アピラ−ゼ」又は「改良型アピラ−ゼ」）を調製した。
【００１０】
ＣＤ３９Ｌ３糖タンパク質の可溶性形態をコ−ドするヌクレオチド配列をシグナル配列に適切に連結し、かつ、チャイニ−ズハムスタ−卵巣細胞において適切な条件下で発現される発現ベクタ−を適切にデザインすることによって、アピラ−ゼの改良形態が得られることを見いだした。このような改良型アピラ−ゼは、増加したグリコシル化及びシアル化によると思われる低い等電点、及び、精製を容易にし、より均質なサンプルを与えるＮ末端での均一な切断により特徴づけられる。一般的に、ＥＮ−アピラ−ゼは、６７番目及び／又は６９番目における変異体を含み、配列番号１の可溶性形態である。可溶性形態は、前述の変異体、及び、配列番号１のおよそ４９番目から４８５番目の長さを有するものである。通常、それらは３〜４．５の範囲の等電点を有し、かつ高度にグリコシル化されている。
【００１１】
したがって、一態様において、本発明はＥＮ−アピラ−ゼに関し、ここで当該ＥＮ−アピラ−ゼは可溶性ＣＤ３９Ｌ３又はそのホモログであり、同様なＮ末端を有し、かつ約３．０〜約４．５の範囲の平均等電点を有する；及び／又は、ここで当該ＥＮ−アピラ−ゼは、アピラ−ゼアッセイによる測定で、ウサギ又はブタのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＥＫ ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１の半減期の少なくとも２倍の半減期を有する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、シグナル配列、リンカ−、及び可溶性アピラ−ゼをコ−ドするヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関し、ここで、リンカ−はそのＣ末端にＥＶＬＰ配列を有し、かつ、前記リンカ−又はその一部は天然の可溶性アピラ−ゼ中に存在する配列であってもよい。本発明はまた、この構築物を含有するＣＨＯ細胞、並びにこれらの細胞を培養することによるＥＮ−アピラ−ゼの生産方法に関する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、ＥＮ−アピラ−ゼを取得するためのＣＨＯ細胞培養システムに関し、前記培養システムは、培養の間、約２ｍＭのグルタミン濃度及び７．４のｐＨを維持する培地を調整すること、並びに、培養５日目に培養物の温度を３７℃から３４℃にシフトさせること、を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３ Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒ発現用のｐＡＰＴ８７４２のマップである。
【図２】図２は、発現レトロベクタ−構築物ｐＣＳ−ＡＰＴ−ＷＰＲＥ（ｎｅｗ ｏｒｉ）を示す。
【図３】図３は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＰＦＣＨＯ ＬＳ培地における生存細胞密度を示す。
【図４】図４は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＰＦＣＨＯ ＬＳ培地における細胞の生存率を示す。
【図５】図５は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＰＦＣＨＯ ＬＳ培地における発現レベルを示す。
【図６】図６は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地における生存細胞密度を示す。
【図７】図７は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地における細胞生存率を示す。
【図８】図８は、ＰＦＣＨＯ ＬＳにおける発現レベルを示す。
【図９】図９は、クロ−ン３５０の２５世代にわたるＥＮ−アピラ−ゼ産生の安定性を示す。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１及びＥＮ−アピラ−ゼの等電点を示す。
【図１１】図１１は、２つのイオン交換クロマトグラフィ−を用いたＥＮ−アピラ−ゼの精製方法が進行していることを示す。
【図１２】図１２は、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１のウサギを用いたｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の測定結果を示す。
【図１３】図１３は、ＥＮ−アピラ−ゼの半減期と比較した、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１のウサギにおける半減期を示す。
【図１４】図１４は、図１３の結果を、血小板凝集を阻害する能力についてｅｘ ｖｉｖｏ試験で示したものである。
【図１５】図１５は、ブタで行ったことを除いて図１３の結果に相当する結果を示す。
【図１６】図１６は、ブタで行ったことを除いて図１４の結果に相当する結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本出願人らは、特別にデザインした組換え材料及び方法を用いることによって、グリコシル化が増加したことに起因すると考えられる優れた薬物動態学的特性を示すＥＮ−アピラ−ゼの調製物を取得できることを見いだした。得られたＥＮ−アピラ−ゼは、低い等電点、均質なＮ末端、増加したグリコシル化、及び、長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有している。
【００１６】
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは可溶性ＣＤ３９Ｌ３又はそのホモログである。可溶性ＣＤ３９Ｌ３は、配列番号１において、膜貫通ドメインに相当するＮ末端の少なくとも約４３アミノ酸及びＣ末端の少なくとも約４４アミノ酸が欠失した配列により表される。アピラ−ゼは、可溶性ＣＤ３９Ｌ３又はＪｅｏｎｇら（米国特許第７，３９０，４８５号）により教示されたＡＤＰア−ゼ増強型アピラ−ゼ、すなわち、６７番目のアルギニン残基がグリシンで、及び／又は、６９番目のトレオニン残基がアルギニンで置換されたものであってもよい（ここで、残基番号は配列番号１で表されるＣＤ３９Ｌ３における番号を指す）。
【００１７】
可溶性ＣＤ３９Ｌ３の「ホモログ」には、ＡＤＰ’ア−ゼ及びＡＴＰ’ア−ゼ活性を保持し、かつ／又は、配列番号１の４９−４８５番目のアミノ酸と８０％又は９０％又は９５％相同である、１〜５個の保存的置換を有する配列を含む。一実施形態において、ホモログは配列番号１で表されるＣＤ３９Ｌ３の５２番目及び５３番目に該当するタンデム・プロリン残基を含んでなる。
【００１８】
代表的な可溶性ＣＤ３９Ｌ３アピラ−ゼホモログは、配列番号１において以下の置換を有する配列番号１の４９−４８５番目のアミノ酸残基を含む：Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒ；Ｔ６９Ｒ；Ｒ６７Ｇ；Ｒ６９Ａ Ｔ６９Ｒ；Ｒ６７Ａ Ｔ６９Ｈ；Ｒ６７Ａ Ｐ６９Ｋ；Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｈ；Ｒ６９Ｇ Ｔ６９Ｋ；Ｔ６９Ｈ；Ｔ６９Ｋ；及びＲ６９Ａ。ホモログには、５２番目からのＰＰＧ残基より始まる配列を含む、配列番号１の一部又は上述の変異体が含まれていてもよい。
【００１９】
ＣＤ３９Ｌ３をコ−ドするヌクレオチド配列を配列番号２に示す。可溶性ＣＤ３９Ｌ３のアミノ酸配列を配列番号３に示し、それをコ−ドするヌクレオチド配列を配列番号４に示す。Ｔ６７Ｇ Ｔ６９Ｒ変異体である可溶性ＣＤ３９Ｌ３のアミノ酸配列を配列番号５に、それをコ−ドする配列を配列番号６に示す。非改良型のアピラ−ゼであるＨＥＫ−ＳＯＬ−ＣＤ３９Ｌ３−０１を調製するために用いた核酸構築物によりコ−ドされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に、それに対応するコ−ドを有するヌクレオチド配列を配列番号８に示す。一実施形態であるＥＮ−アピラ−ゼを産生する核酸構築物によりコ−ドされるアミノ酸配列を配列番号９に、それをコ−ドするヌクレオチド配列を配列番号１０に示す。
【００２０】
分泌シグナル配列
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは培地に分泌される形で生産され、したがって、それらの生産用の核酸構築物にはシグナル配列が含まれる。
【００２１】
本発明のシグナル配列は、適切な細胞系においてタンパク質の分泌をもたらすことが知られている任意のシグナル配列であり得る。さらに、例えば、Ｏｔｓｕｋｉら，ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）１２：１１７−１２６，“Ｓｉｇｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｋｅｙｗｏｒｄ Ｔｒａｐ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｏｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｅｄ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”に記載されているように、分泌シグナル配列として機能する配列を同定及び予測するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法が存在している。
【００２２】
例として、分泌シグナル配列は表１に記載の配列のいずれかであり得る。
【００２３】
【表１】
【００２４】
リンカ−部分
配列ＥＶＬＰを有するアピラ−ゼの所望のＮ末端の配列を提供することによって、Ｅで表されるグルタミン酸残基のすぐ上流に均一なＮ末端が生成されるように、チャイニ−ズハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）細胞内で切断されることを見いだした。しかし、この配列において、グルタミン酸残基はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換されていてもよい。このような配列で表される連結はＣＨＯ細胞内のプロテア−ゼに対して耐性である。
【００２５】
以下の実施例に示す核酸構築物のように、実際には、リンカ−配列はアピラ−ゼ配列の一部であり得る。よって、ＥＶＬＰ配列は、産生されたＥＮ−アピラ−ゼのＮ末端となる。このようなものも例示的核酸構築物によりコ−ドされたアピラ−ゼのアミノ酸配列に含まれる。
【００２６】
可溶性アピラ−ゼのアミノ酸配列にかかわらず、上述のようにリンカ−配列をカルボキシ末端に含むことにより、アピラ−ゼが培養培地に分泌されるときにＥ、Ｄ、Ｑ又はＮ残基の上流で確実に切断される。Ｅ、Ｄ、Ｑ又はＮ残基の上流に０〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜５個のアミノ酸を含むシグナル配列の下流の追加の配列が存在してもよい。
【００２７】
したがって、シグナル配列及びリンカ−部分と適切に組み合わせることにより、アピラ−ゼ核酸構築物は、ＣＨＯ細胞に形質転換されたとき、単一の強力なシグナルペプチダ−ゼ切断部位をもつ翻訳産物を産生し、そして均質なＮ末端をもつアピラ−ゼを分泌する。「均質」は「実質的に均質」を含み、例えば、ＥＮ−アピラ−ゼ分子の約８０％、又は９０％、９５％もしくは９９％以上が同じＮ末端をもつようにプロセシングされることを含む。
【００２８】
ＥＮ−アピラ−ゼは、配列番号７をコ−ドする核酸構築物で形質転換されたＨＥＫ細胞により産生されたアピラ−ゼ（すなわち、調製Ａに記載されるＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１）よりも、かなり多くの糖鎖を含んでいる。ＥＮ−アピラ−ゼは、約３．０〜約４．５の範囲のｐＩを有する哺乳動物細胞培養液中で産生され、分泌される。理論に縛られることなく、本出願人は次のように考える：Ｎ末端アミノ酸配列の変更はＮ末端のエンドペプチダ−ゼプロセシングを変化をさせ、結果としてグリコシル化を変更するのに十分な構造的変化をもたらす。さらに、構造的変化とグリコシル化の組合せは、ＥＮ−アピラ−ゼの予期せぬ薬物動態学的特性に寄与する。等電点の低下は、増加したグリコシル化においてシアル酸含量が増加したことによると考えられる。
【００２９】
本発明のＥＮ−アピラ−ゼの優れた、予期しない特性の一つは、イオン交換クロマトグラフィ−によって容易に精製することができる糖タンパク質産物である。以下に示すように、ＥＮ−アピラ−ゼは２ステップのイオン交換プロトコルにより約９０％又はそれ以上に精製することができる。
【００３０】
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは、以下に示すように、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１と比較して、長い循環半減期を有する。ＥＮ−アピラ−ゼは、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１の半減期の少なくとも約２倍又は少なくとも約４倍又は少なくとも約５倍又は少なくとも約８倍のウサギ又はブタにおける半減期（Ｔ１／２）を有する。このような半減期の増加は、一般に非経口投与されるＥＮ−アピラ−ゼなどの治療薬にとって特に有用である。
【００３１】
ＥＮ−アピラ−ゼの生産方法
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは、上述のようなシグナル配列の制御下、改良された性質をもたらす培養条件で、ＣＨＯ細胞を用いて生産することができる。このような条件として適したものには、培地中で約２ｍＭのグルタミン含量を維持すること、約７．４のｐＨを維持すること、及び培養５日後に温度を３７℃から３４℃に変更することが含まれる。これらのパラメ−タは変動してもよいが、最適なＥＮ−アピラ−ゼの生産のためには、これらの条件が確実に成功をもたらす。例えば、グルタミン含量は約１．５ｍＭと４ｍＭの間、好ましくは２〜３ｍＭを維持すべきである。ｐＨは約７．０と７．８の間、好ましくは７．２と７．６の間を維持すべきである。温度は約３１〜３６℃、好ましくは３３〜３５℃に下げるべきである。これは培養開始後４〜６日の間に行うことができる。
【００３２】
用途
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは、少なくとも一般的なアピラ−ゼの用途、より具体的にはＣＤ３９化合物、ＣＤ３９Ｌ１〜８のいずれか（例えば、ＣＤ３９Ｌ３化合物）の用途として有用な治療薬である。ＥＮ−アピラ−ゼは抗血小板薬、抗血栓薬として、また、抗炎症性タンパク質及び内皮細胞（ＥＣ）保護タンパク質として有用である。さらに、ＥＮ−アピラ−ゼは、２０１０年１月１３日出願の「Ａｐｙｒａｓｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｂｌｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」と題する米国仮特許出願第６１／２９４，７２５号（その全体が参照により本明細書に援用される）に教示される症状に対して治療上有用である。ＥＮ−アピラ−ゼによって効果的に治療される症状には、機械的又は薬理的傷害により引き起こされた損傷からの出血の症状が含まれる。
【００３３】
いくつかの生物学的状態では、本発明のＥＮ−アピラ−ゼは複数の機能により治療的な役割を果たす。例えば、ＥＮ−アピラ−ゼの抗炎症及び抗血栓機能は様々な症状において予期しない治療効果をもたらす。
【００３４】
また、血栓症においては炎症誘発性の成分が関与し、そのために生物学的に機能性の物質が血小板と好中球との相互作用によって合成される（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ，第３版，Ｇａｌｌｉｎ，Ｊ．Ｉ．，及びＳｎｙｄｅｒｍａｎ，Ｒ．（１９９９）ｐｐ．７７−９５参照）。血小板の活性化はＡＤＰ及びＡＴＰを放出させる。細胞外ＡＴＰは炎症誘発性のインタ−フェロン−γ及びＩＬ−２の分泌を誘導することが実証されている（Ｌａｎｇｓｔｏｎ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０：２９６２−２９７０）。最近の研究では、ランゲルハンス細胞上のＣＤ３９は皮膚における炎症と免疫を調節していることが明らかになっている（Ｇｒａｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００２）８：３３６−３３８）。したがって、ＥＮ−アピラ−ゼとその生物学的活性誘導体のＡＴＰ’ア−ゼ活性は、血管損傷部位での炎症及び／又は免疫反応を間接的に低下させ、当該治療を受けている患者に臨床的有効性をもたらすと考えられる。
【００３５】
アドレナリン作動性神経では、ＡＴＰとノルエピネフリンが小胞内に一緒に貯蔵されており、神経伝達時に双方が同時に放出される。過度のノルエピネフリン放出は、心臓突然死を引き起こすことがある虚血性心不全と再灌流不整脈の主な原因である（Ｌｅｖｉ，Ｒ．及びＳｍｉｔｈ，Ｎ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２０００）２９２：８２５−８３０）。交感神経終末で放出されたＡＴＰの加水分解はノルエピネフリン放出の抑制につながる（Ｓｅｓｔｉ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２００２）３００：６０５−６１１）。よって、ＥＮ−アピラ−ゼのＡＴＰ’ア−ゼ活性は、心臓保護効果を示し、治療を受けた患者の致命的不整脈を予防すると考えられる。
【００３６】
特定の臨床状況では、生物学的に活性なＥＮ−アピラ−ゼ又はその生物学的誘導体の遅い速度で長期間放出する必要があることがある。このような状況においては、例えばヒドロゲル又は他の薬学的に許容可能な重合性ゲル中に、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的誘導体を封入する必要がある。さらに、可溶性ＥＮ−アピラ−ゼの血中半減期を長引かせて、その有効性を高めるために、ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）を付加することが可能である。これにより、ＥＮ−アピラ−ゼを予防薬として用いる場合、単回のボ−ラス投与において、ＥＮ−アピラ−ゼの保護効果を長期間にわたって維持することを可能にすると考えられる。タンパク質の半減期を変更するための、その他のタンパク質修飾には、例えば、アルブミンコンジュゲ−ト化、ＩｇＧ融合分子、及びタンパク質のグリコシル化パタ−ンの変更が含まれる。
【００３７】
また、本発明においては、特定の医療処置又は事例で、循環する本発明のアピラ−ゼ活性を阻害することが必要となりうることが想定される。そのような阻害剤は、例えば、薬学的に許容される酵素阻害剤（例えば、ＡＤＰ類似体）、薬学的に許容されるカルシウムキレ−ト剤、本発明のアピラ−ゼに特異的な抗体であり得る。他の医療処置として、例えば、輸血又は血小板輸血が含まれる。
【００３８】
ＥＮ−アピラ−ゼ及びその生物学的活性誘導体は、ＡＴＰ及び／又はＡＤＰのＡＭＰへの加水分解が臨床的に良い結果を生むような臨床状況（ＡＴＰ及び／又はＡＤＰ濃度が異常に高い疾患状態を含む）において有用である。ＥＮ−アピラ−ゼとその生物学的活性誘導体は、血小板又は活性型血小板が疾患の進行において重要な役割を果たしている臨床状況（例えば、腫瘍の転移）で効果的である（Ｂａｋｅｗｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．ら，ＰＮＡＳ（２００３）１００：１４２０５−１４２１０）。
【００３９】
投与されたＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的誘導体の臨床上及び生物学上の有効性は、投与後所定の時間間隔をおいて容易に評価することができる。例えば、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的誘導体の投与は、血小板数に変化がない設定で、出血時間の延長を促進する。さらに、ＥＮ−アピラ−ゼの酵素活性又は代謝産物について、血液サンプルを直接測定することにより、循環血液中の該分子の存在を知ることができる。ＥＮ−アピラ−ゼの生化学的機能を評価するための当技術分野で公知の方法と組み合わせた、血液サンプルの精密なサンプリングに基づいて、このタンパク質の半減期を推定することが可能である。生物学的に活性なＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的に活性な誘導体の存在についての他の臨床的に関連するアッセイも利用することができる。
【００４０】
本発明アピラ−ゼの有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ検証方法
ＥＮ−アピラ−ゼの生化学的機能は、当業者に利用可能な多数の方法により評価することができる。例えば、精製されたＥＮ−アピラ−ゼのＡＴＰ’ア−ゼ及びＡＤＰ’ア−ゼ酵素活性は、８ｍＭ ＣａＣｌ２、２００μＭ 基質（ＡＴＰ’ア−ゼに対してはＡＴＰ、ＡＤＰ’ア−ゼに対してはＡＤＰ）、５０ｍＭ イミダゾ−ル、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５を含有する１ｍＬ溶液中３７℃で測定可能である（Ｐｉｃｈｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８８）５１：１４５３）。この反応を停止させ、０．２５ｍｌのマラカイトグリ−ン試薬を添加することにより遊離の無機リン酸を測定することができる（Ｂａｙｋｏｖら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１７１：２６６）。６３０ｎｍでの分光光度分析に基づき、１単位のＡＴＰ’ア−ゼ（又はＡＤＰ’ア−ゼ）は３７℃で毎分１μモルの無機リン酸の遊離に相当する。Ｋｍ及びｋｃａｔなどの、この酵素の主要な速度定数は、例えばミカエリス・メンテンの式に、デ−タを当てはめることによって取得できる。生化学的機能のモニタリングに有用なその他のアッセイは、これに限定するものではないが、放射分析アッセイ、ＨＰＬＣアッセイ（両方ともＧａｙｌｅ ＩＩＩら， Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９８）１０１：１８５１−１８５９に記載されている）、又は放射ＴＬＣアッセイ（Ｍａｒｃｕｓ，Ａ． Ｊ．ら， Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１）８８：１６９０−１６９６に記載されている）を含む。
【００４１】
ＥＮ−アピラ−ゼ又は誘導体の生物学的機能は、ｅｘ ｖｉｖｏ方法でもｉｎ ｖｉｖｏ方法でも評価することができる。ＥＮ−アピラ−ゼ及び誘導体の生物学的機能をモニタリングするのに有用なｅｘ ｖｉｖｏ方法としては、例えば、血小板凝集アッセイが挙げられる（Ｐｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２００２）１０９：１０３１−１０４０；Ｏｚａｋｉ，Ｙ，Ｓｙｓｍｅｘ Ｊ．Ｉｎｔ．（１９９８）８：１５−２２）。
【００４２】
ＥＮ−アピラ−ゼ及び誘導体の生物学的機能を評価するのに有用なｉｎ ｖｉｖｏ方法としては、以下が挙げられる：マウス脳梗塞モデル、このモデルでは出血時間、梗塞体積、血流、神経学的欠損、脳内出血、及び死亡が測定される（Ｐｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．ら，前掲；Ｃｈｏｕｄｈｒｉ，Ｔ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９９）９０：９１−９９）、マウス肺虚血／再灌流モデル（Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．（２００１）７：５９８−６０４）、再灌流脳梗塞のヒヒモデル（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ら，Ｓｔｒｏｋｅ（２０００）３１：３０５４−３０６３）、Ｃｄ３９−／−マウス（Ｐｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２００２）１０９：１０３１−１０４０）、並びにＰＣＩのヨ−クシャ−・ハンプシャ−ブタモデル（Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｃ．Ｒ．ら，ＰＣＴ ＷＯ００／２３０９４（２０００））及びウサギモデル（Ｈｅｒｂｅｒｔｍ，Ｊ−Ｍ．ら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ（１９９８）８０：５１２−５１８；Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｊ．ら，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ（１９７５）３２：３３９−３５１；Ｓａｒｅｍｂｏｃｋら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９８９）８０：１０２９−１０４０）。その他の方法が、血栓調節因子としてのＡＤＰ’ア−ゼ増強型アピラ−ゼ及び誘導体の生物学的機能を評価するために、当業者に公知であり得る。
【００４３】
ＥＮ−アピラ−ゼの治療用組成物
本発明は、生物学的に有効な量のＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体を薬学的に許容される投与量で含む組成物を提供する。ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の治療用組成物は、症状発症前、症状発症中又は症状発症後の患者に臨床的に投与することができる。ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の症状発症後投与は、例えば、脳梗塞の発症後０〜４８時間の間に行うことができる。治療効果を達成するためのＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の投与は、例えば、ボ−ラス注射、筋肉内、皮下、吸入、連続注入、持続放出、又は他の薬学的に許容される技術により実施し得る。特定の臨床状況では、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体を単回の有効量として投与する必要があり、または、最大１週間もしくは１ヶ月以上の間、毎日投与してもよい。理想的には、ＥＮ−アピラ−ゼは、生理学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する薬学的に許容される形態で患者に投与される。そのような希釈剤及び賦形剤には、中性緩衝食塩水、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド（例えば、１０アミノ酸以下のポリペプチド）、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコ−ス、デキストロ−ス、スクロ−ス、又はデキストラン）、キレ−ト剤（例えば、ＥＤＴＡ）、安定剤（例えば、グルタチオン）が含まれる。さらに、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の補基質、例えばカルシウム（Ｃａ２＋）を、該酵素の活性を最大化するために投薬時に投与してもよい。このような担体及び希釈剤は、推奨される投与量及び濃度で患者に無毒性であるように選択される。本発明ではまた、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体は、単独でのＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の効果を相乗的に高める他の薬剤と一緒に投与することが想定される。例えば、アスピリン、ヘパリンもしくはビバリルジンなどの他の抗血小板薬又は抗凝固剤をＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体と一緒に投与することにより、再灌流の改善、治療時間枠の拡張、再閉塞の防止、及び微小血管の血栓症の防止といった追加の効果が想定される。さらに、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の投与は、血栓溶解薬（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）、ＴＮＫａｓｅ（商標）、吸血コウモリプラスミノ−ゲン活性化因子、ウロキナ−ゼ、ストレプトキナ−ゼ、スタフィロキナ−ゼ、及びアンクロッド）の効力を改善しかつその有効投与量を低下させると想定される。さらにまた、本発明において、例えばＡＤＰ増強型アピラ−ゼと血栓溶解薬（例えば、ＴＮＫａｓｅ）との操作可能な融合ポリペプチドは、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）及び急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）のための理想的な治療上の解決策を提供すると想定される。
【００４４】
ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の投与量は、年齢、人種、体重、身長、性別、治療期間、投与方法、ＥＮ−アピラ−ゼの生物学的活性、及び症状又は他の臨床的変数の重症度に応じて大幅に変化しうる。有効投与量は、熟練した医師や他の医療関係者によって決定され得る。
【００４５】
本明細書で引用する刊行物は、引用した主題について参照することにより本明細書に援用される。
【００４６】
調製Ａ
ヒト腎細胞由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのｓｏｌ ＣＤ３９Ｌ３の生産
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株を、配列番号７の発現をもたらす核酸構築物で安定的に形質転換した。この配列は、マウスＩｇＧκ由来のシグナル配列（下線）に連結された可溶性ＣＤ３９Ｌ３ Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒ変異体を示す。この配列を挿入して、図１に示したプラスミドｐＡＰＴ８７４２を得た。分泌されたタンパク質産物を本明細書では「ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１」と呼ぶ。
【００４７】
形質転換体を無血清懸濁培養に順応させて、３Ｌスピナ−フラスコに接種するまで継続的により大きなフラスコに分割した。細胞を３〜４日ごとに分割し、順化培地中のアピラ−ゼを回収した。前臨床検証のために十分な量のタンパク質を生産し、かつ商業規模でのアピラ−ゼ製造の実現可能性を判断するために、パイロット研究を３０Ｌバイオリアクタ−で実施した。典型的な３０Ｌバイオリアクタ−に０．５×１０６細胞／ｍＬの細胞を接種すると、５〜６日間でＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は典型的には３．５×１０６細胞／ｍＬ以上に増殖し、２〜３ｍｇ／Ｌのアピラ−ゼを産生した。ＤＥＡＥ、サイズ排除及びヘパリンアフィニティ−カラムを含む精製プロセスを開発し、これによりアピラ−ゼの回収率を３０％とするに至った。
【００４８】
形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養物から回収した順化培地は、バッファ−を平衡化バッファ−に交換した後に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で平衡化したＤＥＡＥカラムにかけた。アピラ−ゼ画分は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／１００ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出した。平衡化バッファ−にバッファ−を交換後、溶出画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．４で平衡化したヘパリンカラムにかけた。アピラ−ゼを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／３０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、Ａｍｉｃｏｎ撹拌式セル濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した。
【００４９】
精製アピラ−ゼのＮ末端解析をエドマン分解で実施したところ、３種類の異なるＮ末端欠失を示した。シグナルから予測された切断は、配列番号７の２１番目であるａｓｐをＮ末端として生じさせるはずである。回収されたタンパク質は、ｌｙｓ（３０番目）をＮ末端とするものが２７％、ｇｌｕ（３２番目）をＮ末端とするものが４０％、及びｖａｌ（３３番目）をＮ末端とするものが３３％であった。
【実施例】
【００５０】
実施例１
改良型アピラ−ゼの生産のための核酸構築物
アピラ−ゼ核酸構築物は、ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３ Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒに基づくＥＮ−アピラ−ゼをコ−ドするようにデザインした。シグナル配列はウシα−ラクトアルブミンのシグナルペプチドを用いた。アピラ−ゼ部分は配列番号１の４９番目の残基から開始しており、そのコ−ドされたシグナル−アピラ−ゼ融合体を配列番号９に示す。
【００５１】
最後の発現レトロベクタ−プラスミドに挿入されたＥＮ−アピラ−ゼ核酸構築物の配列を、以下の表２に示す。この核酸構築物をレトロウイルスベクタ−に挿入した。その結果得られた図２に示すベクタ−において、この核酸構築物を「ＡＰＴ」で示す。
【００５２】
ＤＮＡ断片を宿主プラスミドにクロ−ニングするために用いたＭｆｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の位置を示す。最初の１９コドンはシグナルペプチドをコ−ドしている。最終核酸構築物のＤＮＡ配列決定時に、サイレント変異が２８７９番目の位置で検出された（予測されるＡＡＴの代わりにＡＡＣ）。このコドンには二重下線を引いた。最終的なベクタ−はｐＣＳ−ＡＰＴ−ＷＰＲＥ（ｎｅｗ ｏｒｉ）とした（図２）。
【００５３】
【表２Ａ】
【００５４】
【表２Ｂ】
【００５５】
実施例２
ｐＣＳ−ＡＰＴ−ＷＰＲＥ（ｎｅｗ ｏｒｉ）によるＣＨＯ細胞の形質転換
チャイニ−ズハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）生産細胞株は、実施例１で構築したレトロベクタ−によるＣＨＯ親細胞株の形質導入を２ラウンド行うことによって作製した。プ−ルした形質導入細胞の集団をｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘと命名した。プ−ルした集団細胞株のサンプルを各形質導入後に凍結保存した。プ−ルしたｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘ細胞の集団を極めて低い細胞密度（培地２００μＬあたり約０．５又は０．７５個の生存細胞）に希釈して９６ウェルマイクロタイタ−プレ−トに播種し、単一細胞を起源とするクロ−ン細胞株を確立した。合計５６０個のクロ−ンを１４日間培養後、マラカイトグリ−ンアッセイによりＥＮ−アピラ−ゼの産生についてのスクリ−ニングを行った。ＥＮ−アピラ−ゼ産生に基づく上位２４クロ−ンを９６ウェルプレ−トから２４ウェルプレ−トに移して拡大培養した。２４個のうち２０個のクロ−ンが拡大培養においても生存しており、これを凍結保存した。
【００５６】
２０個のクロ−ンを、Ｔ１７５フラスコを用いた３重試験（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で生産性についてスクリ−ニングした。選ばれた上位５個のクロ−ンは、クロ−ン１７６、２４８、２９０、３５０及び３７２であった。選択されたｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘ細胞のクロ−ン株は、自律複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）、マイコプラズマ汚染、及びバイオバ−デンについて陰性結果となるか試験した。
【００５７】
上述で作製された細胞株は、以下に概説するすべての試験のために指数増殖期の間、３〜４日ごとに継代され、ＰＦＣＨＯ ＬＳ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及びＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の両方で９０％以上の生存率を維持していた。細胞を各培地に３００，０００細胞／ｍｌの細胞密度で播種して、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ振とう培養器内で１５０ｒｐｍの速度で培養した。初期温度の設定を３７℃とした。温度は、条件２及び４においては、５日目に３１℃にシフトした。ＣＯ２の設定は５％とし、供給添加物はＨｙＣｌｏｎｅサプリメントＲ１５．４及びＰＳ３０７、並びにグルタミンとした。
【００５８】
以下に概説する４つの異なる条件で、各クロ−ンにつき１２５ｍＬ振とうフラスコ（全容量５０ｍＬ）を用いた２重試験を行った。ＰＦＣＨＯ ＬＳ中のクロ−ン番号２４８の細胞は、条件１及び２で試験するのに十分な細胞数しかなかった。振とう物を１４日目に回収した。
条件１
０日目：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７
２日目：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ３ｍＭ グルタミン
４日目：３ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
６日目：１２ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
条件２
０日目：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７
２日目：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ３ｍＭ グルタミン
４日目：３ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
５日目：３１℃に温度シフト
６日目：１２ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
条件３
０日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
２日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
４日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
６日目：５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
条件４
０日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
２日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
４日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
５日目：３１℃に温度シフト
６日目：５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
【００５９】
各種条件及び培地から得られた結果を図３〜図８に示す。細胞密度はＰＦＣＨＯ ＬＳ培地（クロ−ン番号１７６）では６０×１０５細胞／ｍＬで、ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地（クロ−ン番号１７６）では１６０×１０５細胞／ｍＬでピ−クに達した。
【００６０】
これらの結果は、ＥＮ−アピラ−ゼを生産するためにＣＨＯ細胞を培養する上で有用な種々の条件を示している。これらの結果はまた、生産性が細胞密度に直接関連しないことを示している。
【００６１】
ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培養物における温度シフトの追加は、全体的な力価の大幅な増加を生じさせた。これにより、クロ−ン番号３５０の好ましい培養方法としてＯｐｔｉＣＨＯ（商標）での条件２又は４のいずれかを選択することとした。
【００６２】
実施例３
１０Ｌバイオリアクタ−でのタンパク質収量を増やすための細胞培養条件の改善
背景： 予備実験において、ＰｏｗｅｒＣＨＯ（登録商標）−２培地が振とうフラスコにおけるＥＮ−アピラ−ゼの高い収率と良好なグリコシル化をもたらすことが示されている。２つの異なる条件について、ｐＨを７．４に維持した１０Ｌバイオリアクタ−（容器１及び２）で実施した。別の１０Ｌバイオリアクタ−（容器３）では、容器２と同じ条件で、ｐＨを７．０まで自然に低下させて実施した。
【００６３】
材料及び方法： 細胞株ＣＨＯ−Ｓ−ＡＰＴ−Ｒクロ−ン番号３５０を、１０Ｌ Ｂｒａｕｎバイオリアクタ−へのスケ−ルアップのために、指数増殖期の間、３〜４日ごとに継代した。細胞を３つの１０Ｌバイオリアクタ−内のＰｏｗｅｒＣＨＯ（登録商標）−２培地（Ｌｏｎｚａ社）に約３００，０００〜４００，０００細胞／ｍｌの細胞密度で播種した。本実験においては、フェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）サプリメントとして、ＨｙＣｌｏｎｅ ＰＳ３０７（１２％（ｗ／ｖ）溶液）、ＡＧＴ ＣＤ ＣＨＯ ５Ｘ Ｆｅｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＡＧＴ ＣＤ ＣＨＯ ５Ｘ Ｆｅｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ＋１２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、４５％グルコ−ス溶液、２０％グルコ−ス／ガラクト−ス溶液、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン（１５ｇ／Ｌ）／Ｌ−セリン（１０ｇ／Ｌ）の５０Ｘ溶液、Ｌ−チロシン（４ｇ／Ｌ）／Ｌ−シスチン（２ｇ／Ｌ）の５０Ｘ溶液を用いた。
条件１
Ｄ０：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ２ｍＭ グルタミン
Ｄ１：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを５ｇ／Ｌに維持
Ｄ２：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ グルコ−ス（５ｇ／Ｌに）＋ グルタミン（２ｍＭに）
Ｄ３：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを５ｇ／Ｌに維持
Ｄ４：３ｇ／Ｌ Ｒ１５．４／ＰＳ３０７（１：１）＋ グルタミン（２ｍＭに）＋ グルコ−ス（５ｇ／Ｌに）
Ｄ５：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを５ｇ／Ｌに維持
Ｄ５：３４℃に温度シフト
Ｄ６：１２ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
Ｄ６：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを４ｇ／Ｌに維持
Ｄ７〜Ｄ１６：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを４ｇ／Ｌに維持
実験を通してｐＨ７．４に維持する。
条件２
Ｄ０：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７
Ｄ１：グルタミンを２ｍＭに維持
Ｄ３：３０％ｖ／ｖ（ＡＧＴ ＣＤ ５Ｘ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＋ １２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス）＋ １Ｘ Ｌ−アスパラギン（０．３ｇ／Ｌ）／Ｌ−セリン（０．２ｇ／Ｌ）＋ １Ｘ Ｌ−チロシン（８０ｍｇ／Ｌ）／Ｌ−シスチン（４０ｍｇ／Ｌ）＋ ３ｍＭ グルタミン（初期設定により、２日目又は３日目にＶＣＤ＞１０×１０５細胞／ｍｌのとき）
Ｄ４〜Ｄ５：グルタミンを２ｍＭに維持
Ｄ５：３４℃に温度シフト
Ｄ６〜Ｄ１６：グルコ−スレベルが〜５ｇ／Ｌであるとき、１０％（ｖ／ｖ）（ＡＧＴ ＣＤ ５Ｘ Ｆｅｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＋ １２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス）を供給
Ｄ６〜Ｄ１６ １０％ ５Ｘ Ｆｅｅｄ後：グルコ−スレベルが〜３ｇ／Ｌであるとき３ｇ／Ｌ グルコ−ス／ガラクト−スを供給
実験を通してｐＨ７．４に維持する。
条件３
Ｄ０：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７
Ｄ１：グルタミンを２ｍＭに維持
Ｄ３：３０％ｖ／ｖ（ＡＧＴ ＣＤ ５Ｘ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＋ １２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス）＋ １Ｘ Ｌ−アスパラギン（０．３ｇ／Ｌ）／Ｌ−セリン（０．２ｇ／Ｌ）＋ １Ｘ Ｌ−チロシン（８０ｍｇ／Ｌ）／Ｌ−シスチン（４０ｍｇ／Ｌ）＋ ３ｍＭ グルタミン
Ｄ４〜Ｄ５：グルタミンを２ｍＭに維持
Ｄ５：３４℃に温度シフト
Ｄ６〜Ｄ１６：グルコ−スレベルが〜５ｇ／Ｌであるとき、１０％（ｖ／ｖ）（ＡＧＴ ＣＤ ５Ｘ Ｆｅｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＋ １２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス）を供給
Ｄ６〜Ｄ１６ １０％ ５Ｘ Ｆｅｅｄ後：グルコ−スレベルが〜３ｇ／Ｌであるとき、３ｇ／Ｌ グルコ−ス／ガラクト−スを供給
ｐＨを７．０±０．０５に自然に移行させる
【００６４】
結果： 容器３では、細胞密度が最高のピ−クに達した（７０×１０５細胞／ｍＬ）。容器１及び２では、４８×１０５細胞／ｍＬでピ−クに達した。容器１は１４日目に、容器２は１６日目に、容器３は１５日目に回収した。すべての容器の回収時の生存率は＜５０％であった。容器２及び３の最大タンパク質レベル（活性アッセイ）は回収時に５５ｍｇ／Ｌであった。容器１は回収時のタンパク質レベルが５１ｍｇ／Ｌであった。グルコ−スはいずれの容器においても律速要因とはならなかった。容器２及び３では運転終了時のグルタミンレベルは低かった。乳酸レベルは、容器１及び２では高かった（〜６ｇ／Ｌ）一方、容器３では＜２．５ｇ／Ｌであった。アンモニウムレベルは容器１及び２では１０ｍＭ以下にとどまり、容器３では〜１６ｍＭであった。
【００６５】
結論： 全体的に、タンパク質レベルは条件２及び３で良好であった。乳酸レベルは容器１及び２でかなり高く、その結果ｐＨを維持するために１Ｌを超える塩基を添加した。容器３では実験全体を通して、ｐＨを維持するために２００ｍＬの塩基しか必要としなかった。塩基の添加はまた、浸透圧（デ−タは示さず）を容器３（〜３６５ｍｍｏｌ／ｋｇ）よりかなり高くさせた（容器１では〜５４０ｍｍｏｌ／ｋｇ、及び容器２では〜５００ｍｍｏｌ／ｋｇ）。タンパク質解析から、タンパク質の品質は本研究で用いた３つの条件間で差がないと考えられる。
【００６６】
実施例４
ＥＮ−アピラ−ゼを発現する形質転換ＣＨＯ細胞の安定性
実施例２の方法で作製したＣＨＯ細胞株を解凍し、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地を用いて１２５ｍｌ振とうフラスコで培養した。このＣＨＯ細胞は、これまでＰＦ ＣＨＯ ＬＳ培地で増殖させていたため、その培養物を新しい培地に順応させるため、振とうフラスコで５回の継代培養を行った。本実験においては、順応後の細胞を世代０とした。細胞を連続継代により継続培養した。本実験では、約１０、１５及び２０世代の連続培養後の細胞を比較することを計画した。世代９、１７及び２４で、細胞のサンプルを凍結させた。培養の終了時に、世代０、９、１７及び２４からの細胞のサンプルを解凍し、そのサンプルを用いて最終バッチ培養を行って、同じ実験における異なる世代の細胞株のＥＮ−アピラ−ゼ産生を比較した。最終培養では、プロセス開発中に行ったような添加及び温度シフトは行わなかった。マラカイトグリ−ンＡＤＰ加水分解活性アッセイによって測定されたアピラ−ゼの発現レベルは、それぞれ世代０及び２４に関して同程度であることが示された。
【００６７】
挿入遺伝子の安定性を比較するために、０、９、１７又は２４世代後のＣＨＯ細胞のサンプルをＤＮＡ単離のために使用した。ゲノムＤＮＡについてリアルタイムＰＣＲを行ったところ、挿入遺伝子の数は、次の４０世代を超えてその細胞株において維持されていた。異なる世代のコピ−数のＰＣＲに基づいた指数は、異なる世代間で大きな差がなかった。
【００６８】
実施例５
細胞培養におけるタンパク質生産の安定性
実施例２の培養物を１２５ｍｌ振とうフラスコの５０ｍＬの培地中で培養した。６ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００３４．０１、ロット０６２６３００３）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２６８１−０１１、ロット０６２９１００４、有効期限０８／３０／０７）を、全体を通して使用した。細胞株（継代６）を解凍し、これを用いて培養を開始した。細胞株はこれまでＰＦ ＣＨＯ ＬＳ培地で培養されていたため、細胞を新しい培地に順応させるためＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地で５回継代して培養した。最初に培養物を２．５×１０５生存細胞／ｍＬの標的密度で播種した。細胞数をＣｅｄｅｘ（商標）計測器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ社、ドイツ）を用いて計測し、培養物を新鮮な培地で標的密度に希釈することによって、週に２回細胞を継代した。リサ−チセルバンクサンプルのための毎週の細胞数デ−タを表３に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
計算：
世代数（Ｇ）：Ｇ＝ＬＮ（総細胞数÷播種した総細胞数）０．６９
【００７１】
世代０、１０、１５及び２０の直接比較：上述のように約０、１０、１５又は２０世代の培養後に、各振とうフラスコからの細胞を凍結培地（４６．２５％ 順化培地、４６．２５％ 新鮮培地、７．５％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ２６５０、ロット４６Ｋ２３８１））中で凍結させた。バイアルは、−８０℃に１〜７日間置いた後、貯蔵用の液体窒素に移した。
【００７２】
２０世代にわたる培養が完了したとき、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地に順応させた後の出発細胞株（世代０）、世代９、世代１７及び世代２４のバイアルから得た凍結細胞を解凍した。それぞれのサンプルについて、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地を用いて、約２５０，０００細胞／ｍＬから開始するように１２５ｍＬ振とうフラスコに３重試験で接種した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、１４０ｒｐｍで振とうしながら増殖させた。タンパク質解析のため培養１４日目にサンプルを回収した。アピラ−ゼの生産レベルは、前述したマラカイトグリ−ン活性アッセイを用いて推量した。
【００７３】
結果
世代０、９、１７及び２４の細胞を用いた最終培養：以下の結果は、出発細胞株（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地に順応させた後の世代０のリサ−チセルバンクサンプル）と９、１７及び２４世代後の細胞株とを対照比較した、サンプルのアピラ−ゼ発現についての解析結果を示す。各世代のサンプは３重試験で培養し、結果の平均値を計算した。エラ−バは各世代のサンプルの標準偏差を示す。図９は、４つの世代レベルそれぞれの１４日目のタンパク質生産の平均値を示す。
【００７４】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ解析：ＥＮ−アピラ−ゼタンパク質を含む培地のサンプルを、生産性試験の１４日目に回収した。タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。簡単に説明すると、培地サンプル（２０μＬ）を還元サンプルバッファ−中に調製し、７０℃で５分間加熱した。サイズ標準として、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ ２タンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号ＬＣ５９２５）を用いた。サンプルを４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅ（登録商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号ＮＰ０３２１）にロ−ドし、２００Ｖで６０分間電気泳動した。そのゲルを、Ｇｅｌｃｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ染料（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ番号２４５９２）を用いて室温で４５分間染色した。ＥＮ−アピラ−ゼの生産は２４世代にわたって維持されていた。
【００７５】
様々な世代の細胞からにおける挿入遺伝子の安定性を、遺伝子コピ−指数アッセイを用いて比較した。
【００７６】
リサ−チセルバンクからのＥＮ−アピラ−ゼ産生ＣＨＯ細胞株クロ−ン番号３５０のサンプルを、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地に順応させた後、世代０サンプルのゲノムＤＮＡを単離するために使用した。クロ−ン番号３５０の世代９、１７及び２４のＥＮ−アピラ−ゼ産生ＣＨＯ細胞株のサンプルもまた、ゲノムＤＮＡを単離するために用いた。対照であるβ１，４ガラクトシルトランスフェラ−ゼに対するＥＰＲの遺伝子コピ−指数を、リアルタイムＰＣＲにより測定した。以下に示した結果は、２０世代にわたって遺伝子コピ−指数値に大きな変化がないことを実証している。これは、挿入遺伝子の数が長期にわたる細胞株の継代を通して変化しないことを示している。
【００７７】
【表４】
【００７８】
数値は３重試験の平均値と標準偏差を表す。
【００７９】
実施例６
ＥＮ−アピラ−ゼの均質なＮ末端アミノ酸配列
ＣＨＯ細胞株からＥＮ−アピラ−ゼを生産するため、上位５個のクロ−ンからクロ−ン３５０を選択した。ｐＣＳ−ＡＰＴ−ＷＰＲＥ（ｎｅｗ ｏｒｉ）を保有するクロ−ン３５０のｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘ細胞培養物から順化培地を回収し、ＥＮ−アピラ−ゼを精製した。精製は、調製Ａと同様にＤＥＡＥ及びヘパリンクロマトグラフィ−を用いて実施した。精製したＥＮ−アピラ−ゼを２−メルカプトエタノ−ルの存在下で４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供し、アピラ−ゼ活性に関連付けられる７０ｋＤａの単一バンドを得た。電気泳動の完了後、ゲルを転写バッファ−（２５ｍＭ ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭ クロロブタノ−ル、１０％ メタノ−ル、ｐＨ７．２）中に５分間浸漬し、事前に１００％メタノ−ルと転写バッファ−に順次浸漬しておいたＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｖｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と重ね合わせ、ＸＣｅｌｌ ＩＩ（商標）Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて１６０ｍＡで１時間タンパク質を転写させた。転写後のＰＶＤＦ膜を水で洗浄し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０染色溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて１分間染色し、蒸留水で洗浄した。
【００８０】
染色された７０ｋＤａのバンドを切り出し、その膜切片をエドマン配列解析により解析した。Ｎ末端のアミノ酸配列は単一の種であり、そのＮ末端アミノ酸残基は次のように決定された：Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ；よって、切断は配列番号９の２８番目の位置で起こる。ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１を産生するＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、これは産物の４０％しかない。
【００８１】
実施例７
ＥＮ−アピラ−ゼの糖鎖解析
ＥＮ−アピラ−ゼとｓｏｌ ＣＤ３９Ｌ３（ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１）からの糖鎖を等電点電気泳動により解析した。ＥＮ−アピラ−ゼは実質的により多いグリコシル化を示した。また、ＣＤ３９Ｌ３−０１では約５．０〜約６．０の範囲のｐＩであるのに対して、ＥＮ−アピラ−ゼでは約３．０〜４．５の範囲のｐＩであったことから実証されるとおり、ＥＮ−アピラ−ゼはより低い不均一性を示した。図１０Ａ及びＢを参照されたい。グリコシル化の増加に起因する、より高い分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認された。
【００８２】
実施例８
精製プロトコルの改良
改良された精製プロトコルを、ＥＮ−アピラ−ゼの新しい性質に基づいて開発した。調製Ａ及び実施例６で用いたイオン交換（ＤＥＡＥ）及びアフィニティ−クロマトグラフィ−（ヘパリン）の代わりに、２イオン交換クロマトグラフィ−（ＡＮＸ及びＳＰ）プロトコルを採用した。
【００８３】
配列番号１０を含むＥＮ−アピラ−ゼ核酸構築物で形質転換したＣＨＯ細胞を、上述したような一般的な方法で培養し、培養液を１．４平方フィ−トの６０Ｍ０２ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｃｕｎｏ社，ＣＴ）を通して回収した。フィルタ−は使用前にＷＦＩ水で洗浄し、容積回収を最大化するために圧縮空気を吹き付けた。その後、澄んだ培養液を０．２μｍフィルタ−で濾過して滅菌バッグに回収した。
【００８４】
ウイルスを不活化するため、負荷量（１．６Ｌの澄んだ培養液、Ｖ１７）を等量（１．６Ｌ）のＷＦＩ水で希釈した。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００の溶液（１１％を３２０ｍＬ）を添加し（最終濃度１％）、得られた溶液を周囲温度で３０分間静置した。
【００８５】
アニオン交換クロマトグラフィ−：ウイルス不活化培養液（３．５２Ｌ）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で平衡化した８０ｍＬ ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムに１３ｍｌ／分の流速でアプライした。負荷量をカラムにアプライし、洗浄液を含めたフロ−スル−液を収集した（３．７Ｌ）。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４で２回目の洗浄を実施して、洗浄液を回収した（５８０ｍＬ）。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２３０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４でタンパク質を溶出し、回収した（５００ｍＬ）。最後に、１Ｍ ＮａＣｌを用いて残りのタンパク質をカラムから取り出し、回収した（４５０ｍＬ）。
【００８６】
バッファ−交換及びカチオン交換クロマトグラフィ−：回収されたＡＮＸ １４０ｍＭ−２３０ｍＭ溶出物は、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｍａｘ ３０（５０ｃｍ２）を用い、連続モ−ドで２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．８０にバッファ−交換した（〜１０倍量）。バッファ−交換した負荷量（１．０Ｌ）を、２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．８０で平衡化した８０ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムにアプライし、フロ−スル−液及び洗浄液を回収した（１．２Ｌ）。洗浄段階は、２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ５．１０で行い、回収した（２２０ｍＬ）。２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ６．０を用いて残りのタンパク質をカラムから取り出し、これも回収した（２００ｍＬ）。
【００８７】
収率及び純度解析：ＥＮ−アピラ−ゼの収率は、以下に示すように、紫外／可視吸収及びＥＬＩＳＡにより８０％を超えると計算された。
【００８８】
【表５】
【００８９】
各精製段階でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した（図１１）。ＹＭ−３０（２ｍｌ）遠心濃縮機を用いて２０倍に濃縮した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで純度を解析した。
【００９０】
実施例９
不均一にグリコシル化されたＥＮ−アピラ−ゼの回収率を改善したＥＮ−アピラ−ゼの精製
実施例２に記載された方法で培養した細胞からの培養液を、１．４平方フィ−トの６０Ｍ０２ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｃｕｎｏ社，ＣＴ）を通して回収した。フィルタ−は使用前にＷＦＩ水で洗浄し、容積回収を最大化するために圧縮空気を吹き付けた。その後、澄んだ培養液を０．２μｍフィルタ−で濾過して滅菌バッグに回収した。
【００９１】
ウイルスの不活化のために、負荷量（１００ｍＬの澄んだ培養液、Ｖ１９）を等量（１００ｍＬ）のＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈した。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００の溶液（１１％を２０ｍＬ）を添加し（最終濃度１％）、得られた溶液を周囲温度で３０分間静置した。
【００９２】
アニオン交換クロマトグラフィ−：ＥＮ−アピラ−ゼのウイルス不活化培養液（２２０ｍＬ）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で平衡化した５ｍＬ ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムに５ｍｌ／分の流速でアプライした。負荷量をカラムにアプライし、フロ−スル−液及び洗浄液を回収した（２６０ｍＬ）。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２３０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４でタンパク質を溶出させ、回収した（５０ｍＬ）。洗浄段階を省略し、直接２３０ｍＭ ＮａＣｌで溶出すると、アニオン交換クロマトグラフィ−からのアピラ−ゼの大きな損失はなかった。最後に、１Ｍ ＮａＣｌを用いて残りのタンパク質をカラムから取り出し、これも回収した（３０ｍＬ）。１Ｍ ＮａＣｌ溶出物のウェスタンブロット解析から、この画分中にアピラ−ゼがほとんど検出されないことが示された。
【００９３】
バッファ−交換及びカチオン交換クロマトグラフィ−：回収されたＡＮＸ ２３０ｍＭ溶出物は、１Ｌ Ｇ２５カラムを通して２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．６にバッファ−交換した（〜３倍量）。
バッファ−交換された負荷量（１５０ｍＬ）を、２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．６で平衡化した５ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムにアプライし、フロ−スル−液及び洗浄液を回収した（１７０ｍＬ）。洗浄を２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．８で行い、回収した（４０ｍＬ）。さらなる成果として、フロ−スル−液のｐＨを４．８から４．６に下げることによって低分子量の不純物が取り除かれた。アピラ−ゼの一部はｐＨ４．８溶出液中に存在したが、その総量はｐＨ４．６のフロ−スル−液の１０％未満であった。別の洗浄を２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ５．１で実施して、回収した（４０ｍＬ）。２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ６．０を用いて残りのタンパク質をカラムから取り出し、これも回収した（４０ｍＬ）。
【００９４】
純度は、Ｏｍｅｇａ ３ｋＤａ ２ｍｌ遠心濃縮機を用いて２０倍に濃縮した後に４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで解析した。
【００９５】
この精製スキ−ムを用いて、１２０ｍＭ及び／又は１４０ｍＭ ＮａＣｌ洗浄段階を省くことによってＡＮＸクロマトグラフィ−から、不均一にグリコシル化されたＥＮ−アピラ−ゼのほぼ全部が回収された。また、加えて、ＳＰクロマトグラフィ−で０．２ｐＨ単位下げることにより、アピラ−ゼのより高い純度（＞９５％）が達成された。この２ステップ精製により回収されたアピラ−ゼの全体的な回収率は９０％を上回った。
【００９６】
実施例１０
ＥＮ−アピラ−ゼは長い半減期及び改善された薬効を示す
ｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘ細胞を４ｇ／Ｌのグルコ−スと２ｍＭのグルタミンの存在下、ｐＨ７．４、３４℃で培養した。ＥＮ−アピラ−ゼを実施例９の２ステップイオン交換プロセスで精製した。ＥＮ−アピラ−ゼは、より豊富なグリコシル化の結果、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１と比較して高い平均分子量を示した。
【００９７】
対照として、ＨＥＫ細胞で発現させたｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３の単回ボ−ラスを静脈内に注射した（０．７５ｍｇ／ｋｇ、時点あたりｎ＝３）薬物動態試験をラットで実施した。血清サンプルのＡＤＰア−ゼ及びＡＴＰア−ゼ活性を試験した。実験デ−タはいずれの酵素活性の二相性指数曲線にも最適に適合する。このアピラ−ゼの分布相の半減期（Ｔ１／２）は４０分と計算された（図１２）。アピラ−ゼ活性の約５０％がこの相の間に循環から排除された。このアピラ−ゼの血漿消失Ｔ１／２は２０時間である。対照的に、ＥＮ−アピラ−ゼ（０．２５ｍｇ／ｋｇで投与）は２４時間で初期活性の＞５０％を保持しており、図１３に示すように、有効ｉｎ ｖｉｖｏ活性が＞１０倍増加した。
【００９８】
多血小板血漿のＡＤＰ誘発性血小板凝集に及ぼすＥＮ−アピラ−ゼとＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１の効果により測定される活性アピラ−ゼのレベルを、ウサギへの単回ボ−ラス投与（ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１及びＥＮ−アピラ−ゼをそれぞれ０．７５ｍｇ／ｋｇ及び０．２５ｍｇ／ｋｇ）後に、様々な時点で測定した。アピラ−ゼによる血小板凝集の阻害をより正確に推量するために、生理的カルシウム濃度を維持する目的で、血液サンプルにクエン酸ではなくヘパリンを添加した。図１４に示すように、可溶性ＣＤ３９Ｌ３（例えば、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１）が６時間でＡＤＰ誘発性血小板凝集の５０％阻害をしか保持なかったのに対し、３分の１の濃度（０．７５ｍｇ／ｋｇに対して０．２５ｍｇ／ｋｇ）のＥＮ−アピラ−ゼは６時間でＡＤＰ誘発性血小板凝集の９０％阻害を保持したことをデ−タが実証している。
【００９９】
ＥＮ−アピラ−ゼによる薬物動態の同様の改善は、図１５及び１６に示すように、ブタにおいても観察された。ＥＮ−アピラ−ゼの薬物動態の１０倍を超える改善は、その有効量を減らすものと考えられる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１月１３日に出願された米国特許出願第６１／２９４，６９５号の優先権を主張するものである。この文書の内容は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、新規なアピラ−ゼ類並びに血栓性疾患又は炎症関連疾患を治療するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アピラ−ゼ類（エクトＡＴＰジホスホヒドロラ−ゼ）は、ＡＴＰからＡＤＰへの、及びＡＤＰからＡＭＰへの代謝を触媒する一群の酵素である。最初に知られたヒトアピラ−ゼであるＣＤ３９は、もともとは活性型リンパ球及び内皮細胞の細胞表面タンパク質として同定された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験の両方において、ＣＤ３９はＡＤＰのレベルを調節することから心血管の健康において重要なアピラ−ゼであることが明示された。例えば、アピラ−ゼは、細胞外ＡＤＰを代謝することによって血小板凝集を阻害することが知られている。血小板上のＡＤＰ受容体と不可逆的に結合するクロピドグレル（Ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）（プラビックス（Ｐｌａｖｉｘ））とは異なり、ヒトアピラ−ゼは、血小板それ自体に損傷を与えたり、通常の血小板機能を妨げたりすることがなく、過度の血小板活性化を示す患者へのより安全なアプロ−チを提供する。
【０００４】
既知のヒトＣＤ３９ファミリ−の中で、ＣＤ３９Ｌ３は、ＣＤ３９（エクトＡＴＤＰ’ア−ゼ）とＣＤ３９Ｌ１（エクトＡＴＰ’ア−ゼ）の中間の生化学的活性をもつエクトアピラ−ゼ（エクトＡＴＰＤア−ゼ）として知られている。ＳｍｉｔｈとＫｉｒｌｅｙ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（１９９８）１３８６：６５−７８）によって、ＣＤ３９Ｌ３は主にヒト脳組織中に存在することが確認された。
【０００５】
具体的には、ヒトＣＤ３９Ｌ３は、配列番号１に示される５２９アミノ酸のタンパク質であり、５９１３２．４２ダルトンの推定分子量を有する。ＣＤ３９Ｌ３の等電点は６．２３３である。７つの推定グリコシル化部位と１３個のシステイン残基が存在する。配列番号１に基づいた、Ｎ末端の４３残基とＣ末端の４４残基は、膜貫通ドメインの一部であると考えられる。この酵素の触媒コアは凡そ４４番目のアミノ酸と２３８番目のアミノ酸の間にあり、これらの残基を含む、このタンパク質及び関連アピラ−ゼの可溶性形態がＣｈｅｎらによって調製され、記載されている（米国特許第７，２４７，３００号）。さらに、６７番目の残基アルギニンをグリシンで、及び／又は６９番目の残基トレオニンをアルギニンで置換することにより、米国特許第７，３９０，４８５号に記載されるように、ＡＤＰ’ア−ゼ活性の増強を含む、さらなる望ましい特性を付与することが明らかになっている（ここで、残基番号は配列番号１として示される野生型ヒトＣＤ３９Ｌ３における番号を指す）。
【０００６】
ＰｒｏｔＰａｒａｍ解析から、ＣＤ３９Ｌ３とＣＤ３９はどちらも約５２０個のアミノ酸から成り、約６．０のｐＩをもつことが示されている。ＣＤ３９Ｌ３とＣＤ３９はまた、互いに類似したアミノ酸組成を共有し、また、Ｎ末端及びＣ末端の膜貫通領域の間にある細胞外ＡＴＰ／ＡＤＰア−ゼ部分の約４４０アミノ酸残基を含む、共通の構造モチ−フをもっている。ＣＤ３９Ｌ３は３番染色体に、そしてＣＤ３９は１０番染色体に存在するが、それらの全体的なイントロン及びエクソンの構造は同一であって、それぞれエクソンが１０個存在する。
【０００７】
バイオインフォマティクス解析から、ＣＤ３９Ｌ３はＣＤ３９の脳に特異的なアイソザイム又はアイソエンザイムであることが示唆されている。アイソザイム又はアイソエンザイムはそれぞれの対応する酵素と同じ調節特性を持たないこともあり、むしろそれがさらされている厳密な環境に最適となるようにその酵素的性質を調整している。ノ−ザンブロット試験では、ＣＤ３９Ｌ３が脳と腎臓で高度に発現されているのに対し、ＣＤ３９は胎盤と脾臓で発現していることが示されている。この解析結果は、ヒト脳におけるアイソエンザイムＣＤ３９Ｌ３の発現が、主要な血栓調節因子としてのＣＤ３９の活性を補完していることを示唆している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、より長い半減期、より高い安定性、より高い溶解性、又はより高い純度などの改良された治療特性を示す、新しいクラスのアピラ−ゼ化合物、及びそれらの調製物を提供する。また、高濃度のそのような改善された調製物であって実質的に同質なものに容易に精製できる形態を調製する方法も開示される。
【０００９】
発明の開示
優れた薬物動態学的特性を有しかつ培養液から比較的容易に精製される、新しいクラスのアピラ−ゼ（「ＥＮ−アピラ−ゼ」又は「改良型アピラ−ゼ」）を調製した。
【００１０】
ＣＤ３９Ｌ３糖タンパク質の可溶性形態をコ−ドするヌクレオチド配列をシグナル配列に適切に連結し、かつ、チャイニ−ズハムスタ−卵巣細胞において適切な条件下で発現される発現ベクタ−を適切にデザインすることによって、アピラ−ゼの改良形態が得られることを見いだした。このような改良型アピラ−ゼは、増加したグリコシル化及びシアル化によると思われる低い等電点、及び、精製を容易にし、より均質なサンプルを与えるＮ末端での均一な切断により特徴づけられる。一般的に、ＥＮ−アピラ−ゼは、６７番目及び／又は６９番目における変異体を含み、配列番号１の可溶性形態である。可溶性形態は、前述の変異体、及び、配列番号１のおよそ４９番目から４８５番目の長さを有するものである。通常、それらは３〜４．５の範囲の等電点を有し、かつ高度にグリコシル化されている。
【００１１】
したがって、一態様において、本発明はＥＮ−アピラ−ゼに関し、ここで当該ＥＮ−アピラ−ゼは可溶性ＣＤ３９Ｌ３又はそのホモログであり、同様なＮ末端を有し、かつ約３．０〜約４．５の範囲の平均等電点を有する；及び／又は、ここで当該ＥＮ−アピラ−ゼは、アピラ−ゼアッセイによる測定で、ウサギ又はブタのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＥＫ ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１の半減期の少なくとも２倍の半減期を有する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、シグナル配列、リンカ−、及び可溶性アピラ−ゼをコ−ドするヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関し、ここで、リンカ−はそのＣ末端にＥＶＬＰ配列を有し、かつ、前記リンカ−又はその一部は天然の可溶性アピラ−ゼ中に存在する配列であってもよい。本発明はまた、この構築物を含有するＣＨＯ細胞、並びにこれらの細胞を培養することによるＥＮ−アピラ−ゼの生産方法に関する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、ＥＮ−アピラ−ゼを取得するためのＣＨＯ細胞培養システムに関し、前記培養システムは、培養の間、約２ｍＭのグルタミン濃度及び７．４のｐＨを維持する培地を調整すること、並びに、培養５日目に培養物の温度を３７℃から３４℃にシフトさせること、を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３ Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒ発現用のｐＡＰＴ８７４２のマップである。
【図２】図２は、発現レトロベクタ−構築物ｐＣＳ−ＡＰＴ−ＷＰＲＥ（ｎｅｗ ｏｒｉ）を示す。
【図３】図３は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＰＦＣＨＯ ＬＳ培地における生存細胞密度を示す。
【図４】図４は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＰＦＣＨＯ ＬＳ培地における細胞の生存率を示す。
【図５】図５は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＰＦＣＨＯ ＬＳ培地における発現レベルを示す。
【図６】図６は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地における生存細胞密度を示す。
【図７】図７は、様々なアピラ−ゼ産生クロ−ンのＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地における細胞生存率を示す。
【図８】図８は、ＰＦＣＨＯ ＬＳにおける発現レベルを示す。
【図９】図９は、クロ−ン３５０の２５世代にわたるＥＮ−アピラ−ゼ産生の安定性を示す。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１及びＥＮ−アピラ−ゼの等電点を示す。
【図１１】図１１は、２つのイオン交換クロマトグラフィ−を用いたＥＮ−アピラ−ゼの精製方法が進行していることを示す。
【図１２】図１２は、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１のウサギを用いたｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の測定結果を示す。
【図１３】図１３は、ＥＮ−アピラ−ゼの半減期と比較した、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１のウサギにおける半減期を示す。
【図１４】図１４は、図１３の結果を、血小板凝集を阻害する能力についてｅｘ ｖｉｖｏ試験で示したものである。
【図１５】図１５は、ブタで行ったことを除いて図１３の結果に相当する結果を示す。
【図１６】図１６は、ブタで行ったことを除いて図１４の結果に相当する結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本出願人らは、特別にデザインした組換え材料及び方法を用いることによって、グリコシル化が増加したことに起因すると考えられる優れた薬物動態学的特性を示すＥＮ−アピラ−ゼの調製物を取得できることを見いだした。得られたＥＮ−アピラ−ゼは、低い等電点、均質なＮ末端、増加したグリコシル化、及び、長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有している。
【００１６】
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは可溶性ＣＤ３９Ｌ３又はそのホモログである。可溶性ＣＤ３９Ｌ３は、配列番号１において、膜貫通ドメインに相当するＮ末端の少なくとも約４３アミノ酸及びＣ末端の少なくとも約４４アミノ酸が欠失した配列により表される。アピラ−ゼは、可溶性ＣＤ３９Ｌ３又はＪｅｏｎｇら（米国特許第７，３９０，４８５号）により教示されたＡＤＰア−ゼ増強型アピラ−ゼ、すなわち、６７番目のアルギニン残基がグリシンで、及び／又は、６９番目のトレオニン残基がアルギニンで置換されたものであってもよい（ここで、残基番号は配列番号１で表されるＣＤ３９Ｌ３における番号を指す）。
【００１７】
可溶性ＣＤ３９Ｌ３の「ホモログ」には、ＡＤＰ’ア−ゼ及びＡＴＰ’ア−ゼ活性を保持し、かつ／又は、配列番号１の４９−４８５番目のアミノ酸と８０％又は９０％又は９５％相同である、１〜５個の保存的置換を有する配列を含む。一実施形態において、ホモログは配列番号１で表されるＣＤ３９Ｌ３の５２番目及び５３番目に該当するタンデム・プロリン残基を含んでなる。
【００１８】
代表的な可溶性ＣＤ３９Ｌ３アピラ−ゼホモログは、配列番号１において以下の置換を有する配列番号１の４９−４８５番目のアミノ酸残基を含む：Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒ；Ｔ６９Ｒ；Ｒ６７Ｇ；Ｒ６９Ａ Ｔ６９Ｒ；Ｒ６７Ａ Ｔ６９Ｈ；Ｒ６７Ａ Ｐ６９Ｋ；Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｈ；Ｒ６９Ｇ Ｔ６９Ｋ；Ｔ６９Ｈ；Ｔ６９Ｋ；及びＲ６９Ａ。ホモログには、５２番目からのＰＰＧ残基より始まる配列を含む、配列番号１の一部又は上述の変異体が含まれていてもよい。
【００１９】
ＣＤ３９Ｌ３をコ−ドするヌクレオチド配列を配列番号２に示す。可溶性ＣＤ３９Ｌ３のアミノ酸配列を配列番号３に示し、それをコ−ドするヌクレオチド配列を配列番号４に示す。Ｔ６７Ｇ Ｔ６９Ｒ変異体である可溶性ＣＤ３９Ｌ３のアミノ酸配列を配列番号５に、それをコ−ドする配列を配列番号６に示す。非改良型のアピラ−ゼであるＨＥＫ−ＳＯＬ−ＣＤ３９Ｌ３−０１を調製するために用いた核酸構築物によりコ−ドされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に、それに対応するコ−ドを有するヌクレオチド配列を配列番号８に示す。一実施形態であるＥＮ−アピラ−ゼを産生する核酸構築物によりコ−ドされるアミノ酸配列を配列番号９に、それをコ−ドするヌクレオチド配列を配列番号１０に示す。
【００２０】
分泌シグナル配列
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは培地に分泌される形で生産され、したがって、それらの生産用の核酸構築物にはシグナル配列が含まれる。
【００２１】
本発明のシグナル配列は、適切な細胞系においてタンパク質の分泌をもたらすことが知られている任意のシグナル配列であり得る。さらに、例えば、Ｏｔｓｕｋｉら，ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）１２：１１７−１２６，“Ｓｉｇｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｋｅｙｗｏｒｄ Ｔｒａｐ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｏｌｉｇｏ−Ｃａｐｐｅｄ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”に記載されているように、分泌シグナル配列として機能する配列を同定及び予測するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法が存在している。
【００２２】
例として、分泌シグナル配列は表１に記載の配列のいずれかであり得る。
【００２３】
【表１】
【００２４】
リンカ−部分
配列ＥＶＬＰを有するアピラ−ゼの所望のＮ末端の配列を提供することによって、Ｅで表されるグルタミン酸残基のすぐ上流に均一なＮ末端が生成されるように、チャイニ−ズハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）細胞内で切断されることを見いだした。しかし、この配列において、グルタミン酸残基はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換されていてもよい。このような配列で表される連結はＣＨＯ細胞内のプロテア−ゼに対して耐性である。
【００２５】
以下の実施例に示す核酸構築物のように、実際には、リンカ−配列はアピラ−ゼ配列の一部であり得る。よって、ＥＶＬＰ配列は、産生されたＥＮ−アピラ−ゼのＮ末端となる。このようなものも例示的核酸構築物によりコ−ドされたアピラ−ゼのアミノ酸配列に含まれる。
【００２６】
可溶性アピラ−ゼのアミノ酸配列にかかわらず、上述のようにリンカ−配列をカルボキシ末端に含むことにより、アピラ−ゼが培養培地に分泌されるときにＥ、Ｄ、Ｑ又はＮ残基の上流で確実に切断される。Ｅ、Ｄ、Ｑ又はＮ残基の上流に０〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜５個のアミノ酸を含むシグナル配列の下流の追加の配列が存在してもよい。
【００２７】
したがって、シグナル配列及びリンカ−部分と適切に組み合わせることにより、アピラ−ゼ核酸構築物は、ＣＨＯ細胞に形質転換されたとき、単一の強力なシグナルペプチダ−ゼ切断部位をもつ翻訳産物を産生し、そして均質なＮ末端をもつアピラ−ゼを分泌する。「均質」は「実質的に均質」を含み、例えば、ＥＮ−アピラ−ゼ分子の約８０％、又は９０％、９５％もしくは９９％以上が同じＮ末端をもつようにプロセシングされることを含む。
【００２８】
ＥＮ−アピラ−ゼは、配列番号７をコ−ドする核酸構築物で形質転換されたＨＥＫ細胞により産生されたアピラ−ゼ（すなわち、調製Ａに記載されるＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１）よりも、かなり多くの糖鎖を含んでいる。ＥＮ−アピラ−ゼは、約３．０〜約４．５の範囲のｐＩを有する哺乳動物細胞培養液中で産生され、分泌される。理論に縛られることなく、本出願人は次のように考える：Ｎ末端アミノ酸配列の変更はＮ末端のエンドペプチダ−ゼプロセシングを変化をさせ、結果としてグリコシル化を変更するのに十分な構造的変化をもたらす。さらに、構造的変化とグリコシル化の組合せは、ＥＮ−アピラ−ゼの予期せぬ薬物動態学的特性に寄与する。等電点の低下は、増加したグリコシル化においてシアル酸含量が増加したことによると考えられる。
【００２９】
本発明のＥＮ−アピラ−ゼの優れた、予期しない特性の一つは、イオン交換クロマトグラフィ−によって容易に精製することができる糖タンパク質産物である。以下に示すように、ＥＮ−アピラ−ゼは２ステップのイオン交換プロトコルにより約９０％又はそれ以上に精製することができる。
【００３０】
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは、以下に示すように、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１と比較して、長い循環半減期を有する。ＥＮ−アピラ−ゼは、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１の半減期の少なくとも約２倍又は少なくとも約４倍又は少なくとも約５倍又は少なくとも約８倍のウサギ又はブタにおける半減期（Ｔ１／２）を有する。このような半減期の増加は、一般に非経口投与されるＥＮ−アピラ−ゼなどの治療薬にとって特に有用である。
【００３１】
ＥＮ−アピラ−ゼの生産方法
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは、上述のようなシグナル配列の制御下、改良された性質をもたらす培養条件で、ＣＨＯ細胞を用いて生産することができる。このような条件として適したものには、培地中で約２ｍＭのグルタミン含量を維持すること、約７．４のｐＨを維持すること、及び培養５日後に温度を３７℃から３４℃に変更することが含まれる。これらのパラメ−タは変動してもよいが、最適なＥＮ−アピラ−ゼの生産のためには、これらの条件が確実に成功をもたらす。例えば、グルタミン含量は約１．５ｍＭと４ｍＭの間、好ましくは２〜３ｍＭを維持すべきである。ｐＨは約７．０と７．８の間、好ましくは７．２と７．６の間を維持すべきである。温度は約３１〜３６℃、好ましくは３３〜３５℃に下げるべきである。これは培養開始後４〜６日の間に行うことができる。
【００３２】
用途
本発明のＥＮ−アピラ−ゼは、少なくとも一般的なアピラ−ゼの用途、より具体的にはＣＤ３９化合物、ＣＤ３９Ｌ１〜８のいずれか（例えば、ＣＤ３９Ｌ３化合物）の用途として有用な治療薬である。ＥＮ−アピラ−ゼは抗血小板薬、抗血栓薬として、また、抗炎症性タンパク質及び内皮細胞（ＥＣ）保護タンパク質として有用である。さらに、ＥＮ−アピラ−ゼは、２０１０年１月１３日出願の「Ａｐｙｒａｓｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｂｌｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」と題する米国仮特許出願第６１／２９４，７２５号（その全体が参照により本明細書に援用される）に教示される症状に対して治療上有用である。ＥＮ−アピラ−ゼによって効果的に治療される症状には、機械的又は薬理的傷害により引き起こされた損傷からの出血の症状が含まれる。
【００３３】
いくつかの生物学的状態では、本発明のＥＮ−アピラ−ゼは複数の機能により治療的な役割を果たす。例えば、ＥＮ−アピラ−ゼの抗炎症及び抗血栓機能は様々な症状において予期しない治療効果をもたらす。
【００３４】
また、血栓症においては炎症誘発性の成分が関与し、そのために生物学的に機能性の物質が血小板と好中球との相互作用によって合成される（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ，第３版，Ｇａｌｌｉｎ，Ｊ．Ｉ．，及びＳｎｙｄｅｒｍａｎ，Ｒ．（１９９９）ｐｐ．７７−９５参照）。血小板の活性化はＡＤＰ及びＡＴＰを放出させる。細胞外ＡＴＰは炎症誘発性のインタ−フェロン−γ及びＩＬ−２の分泌を誘導することが実証されている（Ｌａｎｇｓｔｏｎ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０：２９６２−２９７０）。最近の研究では、ランゲルハンス細胞上のＣＤ３９は皮膚における炎症と免疫を調節していることが明らかになっている（Ｇｒａｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００２）８：３３６−３３８）。したがって、ＥＮ−アピラ−ゼとその生物学的活性誘導体のＡＴＰ’ア−ゼ活性は、血管損傷部位での炎症及び／又は免疫反応を間接的に低下させ、当該治療を受けている患者に臨床的有効性をもたらすと考えられる。
【００３５】
アドレナリン作動性神経では、ＡＴＰとノルエピネフリンが小胞内に一緒に貯蔵されており、神経伝達時に双方が同時に放出される。過度のノルエピネフリン放出は、心臓突然死を引き起こすことがある虚血性心不全と再灌流不整脈の主な原因である（Ｌｅｖｉ，Ｒ．及びＳｍｉｔｈ，Ｎ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２０００）２９２：８２５−８３０）。交感神経終末で放出されたＡＴＰの加水分解はノルエピネフリン放出の抑制につながる（Ｓｅｓｔｉ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２００２）３００：６０５−６１１）。よって、ＥＮ−アピラ−ゼのＡＴＰ’ア−ゼ活性は、心臓保護効果を示し、治療を受けた患者の致命的不整脈を予防すると考えられる。
【００３６】
特定の臨床状況では、生物学的に活性なＥＮ−アピラ−ゼ又はその生物学的誘導体の遅い速度で長期間放出する必要があることがある。このような状況においては、例えばヒドロゲル又は他の薬学的に許容可能な重合性ゲル中に、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的誘導体を封入する必要がある。さらに、可溶性ＥＮ−アピラ−ゼの血中半減期を長引かせて、その有効性を高めるために、ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）を付加することが可能である。これにより、ＥＮ−アピラ−ゼを予防薬として用いる場合、単回のボ−ラス投与において、ＥＮ−アピラ−ゼの保護効果を長期間にわたって維持することを可能にすると考えられる。タンパク質の半減期を変更するための、その他のタンパク質修飾には、例えば、アルブミンコンジュゲ−ト化、ＩｇＧ融合分子、及びタンパク質のグリコシル化パタ−ンの変更が含まれる。
【００３７】
また、本発明においては、特定の医療処置又は事例で、循環する本発明のアピラ−ゼ活性を阻害することが必要となりうることが想定される。そのような阻害剤は、例えば、薬学的に許容される酵素阻害剤（例えば、ＡＤＰ類似体）、薬学的に許容されるカルシウムキレ−ト剤、本発明のアピラ−ゼに特異的な抗体であり得る。他の医療処置として、例えば、輸血又は血小板輸血が含まれる。
【００３８】
ＥＮ−アピラ−ゼ及びその生物学的活性誘導体は、ＡＴＰ及び／又はＡＤＰのＡＭＰへの加水分解が臨床的に良い結果を生むような臨床状況（ＡＴＰ及び／又はＡＤＰ濃度が異常に高い疾患状態を含む）において有用である。ＥＮ−アピラ−ゼとその生物学的活性誘導体は、血小板又は活性型血小板が疾患の進行において重要な役割を果たしている臨床状況（例えば、腫瘍の転移）で効果的である（Ｂａｋｅｗｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．ら，ＰＮＡＳ（２００３）１００：１４２０５−１４２１０）。
【００３９】
投与されたＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的誘導体の臨床上及び生物学上の有効性は、投与後所定の時間間隔をおいて容易に評価することができる。例えば、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的誘導体の投与は、血小板数に変化がない設定で、出血時間の延長を促進する。さらに、ＥＮ−アピラ−ゼの酵素活性又は代謝産物について、血液サンプルを直接測定することにより、循環血液中の該分子の存在を知ることができる。ＥＮ−アピラ−ゼの生化学的機能を評価するための当技術分野で公知の方法と組み合わせた、血液サンプルの精密なサンプリングに基づいて、このタンパク質の半減期を推定することが可能である。生物学的に活性なＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的に活性な誘導体の存在についての他の臨床的に関連するアッセイも利用することができる。
【００４０】
本発明アピラ−ゼの有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ検証方法
ＥＮ−アピラ−ゼの生化学的機能は、当業者に利用可能な多数の方法により評価することができる。例えば、精製されたＥＮ−アピラ−ゼのＡＴＰ’ア−ゼ及びＡＤＰ’ア−ゼ酵素活性は、８ｍＭ ＣａＣｌ２、２００μＭ 基質（ＡＴＰ’ア−ゼに対してはＡＴＰ、ＡＤＰ’ア−ゼに対してはＡＤＰ）、５０ｍＭ イミダゾ−ル、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５を含有する１ｍＬ溶液中３７℃で測定可能である（Ｐｉｃｈｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８８）５１：１４５３）。この反応を停止させ、０．２５ｍｌのマラカイトグリ−ン試薬を添加することにより遊離の無機リン酸を測定することができる（Ｂａｙｋｏｖら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１７１：２６６）。６３０ｎｍでの分光光度分析に基づき、１単位のＡＴＰ’ア−ゼ（又はＡＤＰ’ア−ゼ）は３７℃で毎分１μモルの無機リン酸の遊離に相当する。Ｋｍ及びｋｃａｔなどの、この酵素の主要な速度定数は、例えばミカエリス・メンテンの式に、デ−タを当てはめることによって取得できる。生化学的機能のモニタリングに有用なその他のアッセイは、これに限定するものではないが、放射分析アッセイ、ＨＰＬＣアッセイ（両方ともＧａｙｌｅ ＩＩＩら， Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９８）１０１：１８５１−１８５９に記載されている）、又は放射ＴＬＣアッセイ（Ｍａｒｃｕｓ，Ａ． Ｊ．ら， Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１）８８：１６９０−１６９６に記載されている）を含む。
【００４１】
ＥＮ−アピラ−ゼ又は誘導体の生物学的機能は、ｅｘ ｖｉｖｏ方法でもｉｎ ｖｉｖｏ方法でも評価することができる。ＥＮ−アピラ−ゼ及び誘導体の生物学的機能をモニタリングするのに有用なｅｘ ｖｉｖｏ方法としては、例えば、血小板凝集アッセイが挙げられる（Ｐｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２００２）１０９：１０３１−１０４０；Ｏｚａｋｉ，Ｙ，Ｓｙｓｍｅｘ Ｊ．Ｉｎｔ．（１９９８）８：１５−２２）。
【００４２】
ＥＮ−アピラ−ゼ及び誘導体の生物学的機能を評価するのに有用なｉｎ ｖｉｖｏ方法としては、以下が挙げられる：マウス脳梗塞モデル、このモデルでは出血時間、梗塞体積、血流、神経学的欠損、脳内出血、及び死亡が測定される（Ｐｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．ら，前掲；Ｃｈｏｕｄｈｒｉ，Ｔ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９９）９０：９１−９９）、マウス肺虚血／再灌流モデル（Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．（２００１）７：５９８−６０４）、再灌流脳梗塞のヒヒモデル（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ら，Ｓｔｒｏｋｅ（２０００）３１：３０５４−３０６３）、Ｃｄ３９−／−マウス（Ｐｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２００２）１０９：１０３１−１０４０）、並びにＰＣＩのヨ−クシャ−・ハンプシャ−ブタモデル（Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｃ．Ｒ．ら，ＰＣＴ ＷＯ００／２３０９４（２０００））及びウサギモデル（Ｈｅｒｂｅｒｔｍ，Ｊ−Ｍ．ら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ（１９９８）８０：５１２−５１８；Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｊ．ら，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ（１９７５）３２：３３９−３５１；Ｓａｒｅｍｂｏｃｋら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９８９）８０：１０２９−１０４０）。その他の方法が、血栓調節因子としてのＡＤＰ’ア−ゼ増強型アピラ−ゼ及び誘導体の生物学的機能を評価するために、当業者に公知であり得る。
【００４３】
ＥＮ−アピラ−ゼの治療用組成物
本発明は、生物学的に有効な量のＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体を薬学的に許容される投与量で含む組成物を提供する。ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の治療用組成物は、症状発症前、症状発症中又は症状発症後の患者に臨床的に投与することができる。ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の症状発症後投与は、例えば、脳梗塞の発症後０〜４８時間の間に行うことができる。治療効果を達成するためのＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の投与は、例えば、ボ−ラス注射、筋肉内、皮下、吸入、連続注入、持続放出、又は他の薬学的に許容される技術により実施し得る。特定の臨床状況では、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体を単回の有効量として投与する必要があり、または、最大１週間もしくは１ヶ月以上の間、毎日投与してもよい。理想的には、ＥＮ−アピラ−ゼは、生理学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する薬学的に許容される形態で患者に投与される。そのような希釈剤及び賦形剤には、中性緩衝食塩水、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド（例えば、１０アミノ酸以下のポリペプチド）、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコ−ス、デキストロ−ス、スクロ−ス、又はデキストラン）、キレ−ト剤（例えば、ＥＤＴＡ）、安定剤（例えば、グルタチオン）が含まれる。さらに、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の補基質、例えばカルシウム（Ｃａ２＋）を、該酵素の活性を最大化するために投薬時に投与してもよい。このような担体及び希釈剤は、推奨される投与量及び濃度で患者に無毒性であるように選択される。本発明ではまた、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体は、単独でのＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の効果を相乗的に高める他の薬剤と一緒に投与することが想定される。例えば、アスピリン、ヘパリンもしくはビバリルジンなどの他の抗血小板薬又は抗凝固剤をＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体と一緒に投与することにより、再灌流の改善、治療時間枠の拡張、再閉塞の防止、及び微小血管の血栓症の防止といった追加の効果が想定される。さらに、ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の投与は、血栓溶解薬（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）、ＴＮＫａｓｅ（商標）、吸血コウモリプラスミノ−ゲン活性化因子、ウロキナ−ゼ、ストレプトキナ−ゼ、スタフィロキナ−ゼ、及びアンクロッド）の効力を改善しかつその有効投与量を低下させると想定される。さらにまた、本発明において、例えばＡＤＰ増強型アピラ−ゼと血栓溶解薬（例えば、ＴＮＫａｓｅ）との操作可能な融合ポリペプチドは、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）及び急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）のための理想的な治療上の解決策を提供すると想定される。
【００４４】
ＥＮ−アピラ−ゼ又は生物学的活性誘導体の投与量は、年齢、人種、体重、身長、性別、治療期間、投与方法、ＥＮ−アピラ−ゼの生物学的活性、及び症状又は他の臨床的変数の重症度に応じて大幅に変化しうる。有効投与量は、熟練した医師や他の医療関係者によって決定され得る。
【００４５】
本明細書で引用する刊行物は、引用した主題について参照することにより本明細書に援用される。
【００４６】
調製Ａ
ヒト腎細胞由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのｓｏｌ ＣＤ３９Ｌ３の生産
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株を、配列番号７の発現をもたらす核酸構築物で安定的に形質転換した。この配列は、マウスＩｇＧκ由来のシグナル配列（下線）に連結された可溶性ＣＤ３９Ｌ３ Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒ変異体を示す。この配列を挿入して、図１に示したプラスミドｐＡＰＴ８７４２を得た。分泌されたタンパク質産物を本明細書では「ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１」と呼ぶ。
【００４７】
形質転換体を無血清懸濁培養に順応させて、３Ｌスピナ−フラスコに接種するまで継続的により大きなフラスコに分割した。細胞を３〜４日ごとに分割し、順化培地中のアピラ−ゼを回収した。前臨床検証のために十分な量のタンパク質を生産し、かつ商業規模でのアピラ−ゼ製造の実現可能性を判断するために、パイロット研究を３０Ｌバイオリアクタ−で実施した。典型的な３０Ｌバイオリアクタ−に０．５×１０６細胞／ｍＬの細胞を接種すると、５〜６日間でＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は典型的には３．５×１０６細胞／ｍＬ以上に増殖し、２〜３ｍｇ／Ｌのアピラ−ゼを産生した。ＤＥＡＥ、サイズ排除及びヘパリンアフィニティ−カラムを含む精製プロセスを開発し、これによりアピラ−ゼの回収率を３０％とするに至った。
【００４８】
形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養物から回収した順化培地は、バッファ−を平衡化バッファ−に交換した後に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で平衡化したＤＥＡＥカラムにかけた。アピラ−ゼ画分は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／１００ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出した。平衡化バッファ−にバッファ−を交換後、溶出画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．４で平衡化したヘパリンカラムにかけた。アピラ−ゼを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／３０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、Ａｍｉｃｏｎ撹拌式セル濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した。
【００４９】
精製アピラ−ゼのＮ末端解析をエドマン分解で実施したところ、３種類の異なるＮ末端欠失を示した。シグナルから予測された切断は、配列番号７の２１番目であるａｓｐをＮ末端として生じさせるはずである。回収されたタンパク質は、ｌｙｓ（３０番目）をＮ末端とするものが２７％、ｇｌｕ（３２番目）をＮ末端とするものが４０％、及びｖａｌ（３３番目）をＮ末端とするものが３３％であった。
【実施例】
【００５０】
実施例１
改良型アピラ−ゼの生産のための核酸構築物
アピラ−ゼ核酸構築物は、ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３ Ｒ６７Ｇ Ｔ６９Ｒに基づくＥＮ−アピラ−ゼをコ−ドするようにデザインした。シグナル配列はウシα−ラクトアルブミンのシグナルペプチドを用いた。アピラ−ゼ部分は配列番号１の４９番目の残基から開始しており、そのコ−ドされたシグナル−アピラ−ゼ融合体を配列番号９に示す。
【００５１】
最後の発現レトロベクタ−プラスミドに挿入されたＥＮ−アピラ−ゼ核酸構築物の配列を、以下の表２に示す。この核酸構築物をレトロウイルスベクタ−に挿入した。その結果得られた図２に示すベクタ−において、この核酸構築物を「ＡＰＴ」で示す。
【００５２】
ＤＮＡ断片を宿主プラスミドにクロ−ニングするために用いたＭｆｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位の位置を示す。最初の１９コドンはシグナルペプチドをコ−ドしている。最終核酸構築物のＤＮＡ配列決定時に、サイレント変異が２８７９番目の位置で検出された（予測されるＡＡＴの代わりにＡＡＣ）。このコドンには二重下線を引いた。最終的なベクタ−はｐＣＳ−ＡＰＴ−ＷＰＲＥ（ｎｅｗ ｏｒｉ）とした（図２）。
【００５３】
【表２Ａ】
【００５４】
【表２Ｂ】
【００５５】
実施例２
ｐＣＳ−ＡＰＴ−ＷＰＲＥ（ｎｅｗ ｏｒｉ）によるＣＨＯ細胞の形質転換
チャイニ−ズハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）生産細胞株は、実施例１で構築したレトロベクタ−によるＣＨＯ親細胞株の形質導入を２ラウンド行うことによって作製した。プ−ルした形質導入細胞の集団をｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘと命名した。プ−ルした集団細胞株のサンプルを各形質導入後に凍結保存した。プ−ルしたｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘ細胞の集団を極めて低い細胞密度（培地２００μＬあたり約０．５又は０．７５個の生存細胞）に希釈して９６ウェルマイクロタイタ−プレ−トに播種し、単一細胞を起源とするクロ−ン細胞株を確立した。合計５６０個のクロ−ンを１４日間培養後、マラカイトグリ−ンアッセイによりＥＮ−アピラ−ゼの産生についてのスクリ−ニングを行った。ＥＮ−アピラ−ゼ産生に基づく上位２４クロ−ンを９６ウェルプレ−トから２４ウェルプレ−トに移して拡大培養した。２４個のうち２０個のクロ−ンが拡大培養においても生存しており、これを凍結保存した。
【００５６】
２０個のクロ−ンを、Ｔ１７５フラスコを用いた３重試験（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で生産性についてスクリ−ニングした。選ばれた上位５個のクロ−ンは、クロ−ン１７６、２４８、２９０、３５０及び３７２であった。選択されたｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘ細胞のクロ−ン株は、自律複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）、マイコプラズマ汚染、及びバイオバ−デンについて陰性結果となるか試験した。
【００５７】
上述で作製された細胞株は、以下に概説するすべての試験のために指数増殖期の間、３〜４日ごとに継代され、ＰＦＣＨＯ ＬＳ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及びＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の両方で９０％以上の生存率を維持していた。細胞を各培地に３００，０００細胞／ｍｌの細胞密度で播種して、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ振とう培養器内で１５０ｒｐｍの速度で培養した。初期温度の設定を３７℃とした。温度は、条件２及び４においては、５日目に３１℃にシフトした。ＣＯ２の設定は５％とし、供給添加物はＨｙＣｌｏｎｅサプリメントＲ１５．４及びＰＳ３０７、並びにグルタミンとした。
【００５８】
以下に概説する４つの異なる条件で、各クロ−ンにつき１２５ｍＬ振とうフラスコ（全容量５０ｍＬ）を用いた２重試験を行った。ＰＦＣＨＯ ＬＳ中のクロ−ン番号２４８の細胞は、条件１及び２で試験するのに十分な細胞数しかなかった。振とう物を１４日目に回収した。
条件１
０日目：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７
２日目：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ３ｍＭ グルタミン
４日目：３ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
６日目：１２ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
条件２
０日目：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７
２日目：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ３ｍＭ グルタミン
４日目：３ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
５日目：３１℃に温度シフト
６日目：１２ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
条件３
０日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
２日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
４日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
６日目：５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
条件４
０日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
２日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
４日目：１．５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ １．５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４ ＋ ３ｍＭ グルタミン
５日目：３１℃に温度シフト
６日目：５ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ５ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
【００５９】
各種条件及び培地から得られた結果を図３〜図８に示す。細胞密度はＰＦＣＨＯ ＬＳ培地（クロ−ン番号１７６）では６０×１０５細胞／ｍＬで、ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地（クロ−ン番号１７６）では１６０×１０５細胞／ｍＬでピ−クに達した。
【００６０】
これらの結果は、ＥＮ−アピラ−ゼを生産するためにＣＨＯ細胞を培養する上で有用な種々の条件を示している。これらの結果はまた、生産性が細胞密度に直接関連しないことを示している。
【００６１】
ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培養物における温度シフトの追加は、全体的な力価の大幅な増加を生じさせた。これにより、クロ−ン番号３５０の好ましい培養方法としてＯｐｔｉＣＨＯ（商標）での条件２又は４のいずれかを選択することとした。
【００６２】
実施例３
１０Ｌバイオリアクタ−でのタンパク質収量を増やすための細胞培養条件の改善
背景： 予備実験において、ＰｏｗｅｒＣＨＯ（登録商標）−２培地が振とうフラスコにおけるＥＮ−アピラ−ゼの高い収率と良好なグリコシル化をもたらすことが示されている。２つの異なる条件について、ｐＨを７．４に維持した１０Ｌバイオリアクタ−（容器１及び２）で実施した。別の１０Ｌバイオリアクタ−（容器３）では、容器２と同じ条件で、ｐＨを７．０まで自然に低下させて実施した。
【００６３】
材料及び方法： 細胞株ＣＨＯ−Ｓ−ＡＰＴ−Ｒクロ−ン番号３５０を、１０Ｌ Ｂｒａｕｎバイオリアクタ−へのスケ−ルアップのために、指数増殖期の間、３〜４日ごとに継代した。細胞を３つの１０Ｌバイオリアクタ−内のＰｏｗｅｒＣＨＯ（登録商標）−２培地（Ｌｏｎｚａ社）に約３００，０００〜４００，０００細胞／ｍｌの細胞密度で播種した。本実験においては、フェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）サプリメントとして、ＨｙＣｌｏｎｅ ＰＳ３０７（１２％（ｗ／ｖ）溶液）、ＡＧＴ ＣＤ ＣＨＯ ５Ｘ Ｆｅｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＡＧＴ ＣＤ ＣＨＯ ５Ｘ Ｆｅｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ＋１２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、４５％グルコ−ス溶液、２０％グルコ−ス／ガラクト−ス溶液、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン（１５ｇ／Ｌ）／Ｌ−セリン（１０ｇ／Ｌ）の５０Ｘ溶液、Ｌ−チロシン（４ｇ／Ｌ）／Ｌ−シスチン（２ｇ／Ｌ）の５０Ｘ溶液を用いた。
条件１
Ｄ０：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ ２ｍＭ グルタミン
Ｄ１：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを５ｇ／Ｌに維持
Ｄ２：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７ ＋ グルコ−ス（５ｇ／Ｌに）＋ グルタミン（２ｍＭに）
Ｄ３：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを５ｇ／Ｌに維持
Ｄ４：３ｇ／Ｌ Ｒ１５．４／ＰＳ３０７（１：１）＋ グルタミン（２ｍＭに）＋ グルコ−ス（５ｇ／Ｌに）
Ｄ５：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを５ｇ／Ｌに維持
Ｄ５：３４℃に温度シフト
Ｄ６：１２ｇ／Ｌ Ｒ１５．４
Ｄ６：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを４ｇ／Ｌに維持
Ｄ７〜Ｄ１６：グルタミンを２ｍＭに維持；グルコ−スを４ｇ／Ｌに維持
実験を通してｐＨ７．４に維持する。
条件２
Ｄ０：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７
Ｄ１：グルタミンを２ｍＭに維持
Ｄ３：３０％ｖ／ｖ（ＡＧＴ ＣＤ ５Ｘ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＋ １２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス）＋ １Ｘ Ｌ−アスパラギン（０．３ｇ／Ｌ）／Ｌ−セリン（０．２ｇ／Ｌ）＋ １Ｘ Ｌ−チロシン（８０ｍｇ／Ｌ）／Ｌ−シスチン（４０ｍｇ／Ｌ）＋ ３ｍＭ グルタミン（初期設定により、２日目又は３日目にＶＣＤ＞１０×１０５細胞／ｍｌのとき）
Ｄ４〜Ｄ５：グルタミンを２ｍＭに維持
Ｄ５：３４℃に温度シフト
Ｄ６〜Ｄ１６：グルコ−スレベルが〜５ｇ／Ｌであるとき、１０％（ｖ／ｖ）（ＡＧＴ ＣＤ ５Ｘ Ｆｅｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＋ １２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス）を供給
Ｄ６〜Ｄ１６ １０％ ５Ｘ Ｆｅｅｄ後：グルコ−スレベルが〜３ｇ／Ｌであるとき３ｇ／Ｌ グルコ−ス／ガラクト−スを供給
実験を通してｐＨ７．４に維持する。
条件３
Ｄ０：３ｇ／Ｌ ＰＳ３０７
Ｄ１：グルタミンを２ｍＭに維持
Ｄ３：３０％ｖ／ｖ（ＡＧＴ ＣＤ ５Ｘ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＋ １２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス）＋ １Ｘ Ｌ−アスパラギン（０．３ｇ／Ｌ）／Ｌ−セリン（０．２ｇ／Ｌ）＋ １Ｘ Ｌ−チロシン（８０ｍｇ／Ｌ）／Ｌ−シスチン（４０ｍｇ／Ｌ）＋ ３ｍＭ グルタミン
Ｄ４〜Ｄ５：グルタミンを２ｍＭに維持
Ｄ５：３４℃に温度シフト
Ｄ６〜Ｄ１６：グルコ−スレベルが〜５ｇ／Ｌであるとき、１０％（ｖ／ｖ）（ＡＧＴ ＣＤ ５Ｘ Ｆｅｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＋ １２．５ｇ／Ｌ ガラクト−ス）を供給
Ｄ６〜Ｄ１６ １０％ ５Ｘ Ｆｅｅｄ後：グルコ−スレベルが〜３ｇ／Ｌであるとき、３ｇ／Ｌ グルコ−ス／ガラクト−スを供給
ｐＨを７．０±０．０５に自然に移行させる
【００６４】
結果： 容器３では、細胞密度が最高のピ−クに達した（７０×１０５細胞／ｍＬ）。容器１及び２では、４８×１０５細胞／ｍＬでピ−クに達した。容器１は１４日目に、容器２は１６日目に、容器３は１５日目に回収した。すべての容器の回収時の生存率は＜５０％であった。容器２及び３の最大タンパク質レベル（活性アッセイ）は回収時に５５ｍｇ／Ｌであった。容器１は回収時のタンパク質レベルが５１ｍｇ／Ｌであった。グルコ−スはいずれの容器においても律速要因とはならなかった。容器２及び３では運転終了時のグルタミンレベルは低かった。乳酸レベルは、容器１及び２では高かった（〜６ｇ／Ｌ）一方、容器３では＜２．５ｇ／Ｌであった。アンモニウムレベルは容器１及び２では１０ｍＭ以下にとどまり、容器３では〜１６ｍＭであった。
【００６５】
結論： 全体的に、タンパク質レベルは条件２及び３で良好であった。乳酸レベルは容器１及び２でかなり高く、その結果ｐＨを維持するために１Ｌを超える塩基を添加した。容器３では実験全体を通して、ｐＨを維持するために２００ｍＬの塩基しか必要としなかった。塩基の添加はまた、浸透圧（デ−タは示さず）を容器３（〜３６５ｍｍｏｌ／ｋｇ）よりかなり高くさせた（容器１では〜５４０ｍｍｏｌ／ｋｇ、及び容器２では〜５００ｍｍｏｌ／ｋｇ）。タンパク質解析から、タンパク質の品質は本研究で用いた３つの条件間で差がないと考えられる。
【００６６】
実施例４
ＥＮ−アピラ−ゼを発現する形質転換ＣＨＯ細胞の安定性
実施例２の方法で作製したＣＨＯ細胞株を解凍し、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地を用いて１２５ｍｌ振とうフラスコで培養した。このＣＨＯ細胞は、これまでＰＦ ＣＨＯ ＬＳ培地で増殖させていたため、その培養物を新しい培地に順応させるため、振とうフラスコで５回の継代培養を行った。本実験においては、順応後の細胞を世代０とした。細胞を連続継代により継続培養した。本実験では、約１０、１５及び２０世代の連続培養後の細胞を比較することを計画した。世代９、１７及び２４で、細胞のサンプルを凍結させた。培養の終了時に、世代０、９、１７及び２４からの細胞のサンプルを解凍し、そのサンプルを用いて最終バッチ培養を行って、同じ実験における異なる世代の細胞株のＥＮ−アピラ−ゼ産生を比較した。最終培養では、プロセス開発中に行ったような添加及び温度シフトは行わなかった。マラカイトグリ−ンＡＤＰ加水分解活性アッセイによって測定されたアピラ−ゼの発現レベルは、それぞれ世代０及び２４に関して同程度であることが示された。
【００６７】
挿入遺伝子の安定性を比較するために、０、９、１７又は２４世代後のＣＨＯ細胞のサンプルをＤＮＡ単離のために使用した。ゲノムＤＮＡについてリアルタイムＰＣＲを行ったところ、挿入遺伝子の数は、次の４０世代を超えてその細胞株において維持されていた。異なる世代のコピ−数のＰＣＲに基づいた指数は、異なる世代間で大きな差がなかった。
【００６８】
実施例５
細胞培養におけるタンパク質生産の安定性
実施例２の培養物を１２５ｍｌ振とうフラスコの５０ｍＬの培地中で培養した。６ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００３４．０１、ロット０６２６３００３）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２６８１−０１１、ロット０６２９１００４、有効期限０８／３０／０７）を、全体を通して使用した。細胞株（継代６）を解凍し、これを用いて培養を開始した。細胞株はこれまでＰＦ ＣＨＯ ＬＳ培地で培養されていたため、細胞を新しい培地に順応させるためＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地で５回継代して培養した。最初に培養物を２．５×１０５生存細胞／ｍＬの標的密度で播種した。細胞数をＣｅｄｅｘ（商標）計測器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ社、ドイツ）を用いて計測し、培養物を新鮮な培地で標的密度に希釈することによって、週に２回細胞を継代した。リサ−チセルバンクサンプルのための毎週の細胞数デ−タを表３に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
計算：
世代数（Ｇ）：Ｇ＝ＬＮ（総細胞数÷播種した総細胞数）０．６９
【００７１】
世代０、１０、１５及び２０の直接比較：上述のように約０、１０、１５又は２０世代の培養後に、各振とうフラスコからの細胞を凍結培地（４６．２５％ 順化培地、４６．２５％ 新鮮培地、７．５％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ２６５０、ロット４６Ｋ２３８１））中で凍結させた。バイアルは、−８０℃に１〜７日間置いた後、貯蔵用の液体窒素に移した。
【００７２】
２０世代にわたる培養が完了したとき、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地に順応させた後の出発細胞株（世代０）、世代９、世代１７及び世代２４のバイアルから得た凍結細胞を解凍した。それぞれのサンプルについて、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地を用いて、約２５０，０００細胞／ｍＬから開始するように１２５ｍＬ振とうフラスコに３重試験で接種した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、１４０ｒｐｍで振とうしながら増殖させた。タンパク質解析のため培養１４日目にサンプルを回収した。アピラ−ゼの生産レベルは、前述したマラカイトグリ−ン活性アッセイを用いて推量した。
【００７３】
結果
世代０、９、１７及び２４の細胞を用いた最終培養：以下の結果は、出発細胞株（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地に順応させた後の世代０のリサ−チセルバンクサンプル）と９、１７及び２４世代後の細胞株とを対照比較した、サンプルのアピラ−ゼ発現についての解析結果を示す。各世代のサンプは３重試験で培養し、結果の平均値を計算した。エラ−バは各世代のサンプルの標準偏差を示す。図９は、４つの世代レベルそれぞれの１４日目のタンパク質生産の平均値を示す。
【００７４】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ解析：ＥＮ−アピラ−ゼタンパク質を含む培地のサンプルを、生産性試験の１４日目に回収した。タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。簡単に説明すると、培地サンプル（２０μＬ）を還元サンプルバッファ−中に調製し、７０℃で５分間加熱した。サイズ標準として、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ ２タンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号ＬＣ５９２５）を用いた。サンプルを４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅ（登録商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号ＮＰ０３２１）にロ−ドし、２００Ｖで６０分間電気泳動した。そのゲルを、Ｇｅｌｃｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ染料（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ番号２４５９２）を用いて室温で４５分間染色した。ＥＮ−アピラ−ゼの生産は２４世代にわたって維持されていた。
【００７５】
様々な世代の細胞からにおける挿入遺伝子の安定性を、遺伝子コピ−指数アッセイを用いて比較した。
【００７６】
リサ−チセルバンクからのＥＮ−アピラ−ゼ産生ＣＨＯ細胞株クロ−ン番号３５０のサンプルを、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地に順応させた後、世代０サンプルのゲノムＤＮＡを単離するために使用した。クロ−ン番号３５０の世代９、１７及び２４のＥＮ−アピラ−ゼ産生ＣＨＯ細胞株のサンプルもまた、ゲノムＤＮＡを単離するために用いた。対照であるβ１，４ガラクトシルトランスフェラ−ゼに対するＥＰＲの遺伝子コピ−指数を、リアルタイムＰＣＲにより測定した。以下に示した結果は、２０世代にわたって遺伝子コピ−指数値に大きな変化がないことを実証している。これは、挿入遺伝子の数が長期にわたる細胞株の継代を通して変化しないことを示している。
【００７７】
【表４】
【００７８】
数値は３重試験の平均値と標準偏差を表す。
【００７９】
実施例６
ＥＮ−アピラ−ゼの均質なＮ末端アミノ酸配列
ＣＨＯ細胞株からＥＮ−アピラ−ゼを生産するため、上位５個のクロ−ンからクロ−ン３５０を選択した。ｐＣＳ−ＡＰＴ−ＷＰＲＥ（ｎｅｗ ｏｒｉ）を保有するクロ−ン３５０のｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘ細胞培養物から順化培地を回収し、ＥＮ−アピラ−ゼを精製した。精製は、調製Ａと同様にＤＥＡＥ及びヘパリンクロマトグラフィ−を用いて実施した。精製したＥＮ−アピラ−ゼを２−メルカプトエタノ−ルの存在下で４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供し、アピラ−ゼ活性に関連付けられる７０ｋＤａの単一バンドを得た。電気泳動の完了後、ゲルを転写バッファ−（２５ｍＭ ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭ クロロブタノ−ル、１０％ メタノ−ル、ｐＨ７．２）中に５分間浸漬し、事前に１００％メタノ−ルと転写バッファ−に順次浸漬しておいたＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｖｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と重ね合わせ、ＸＣｅｌｌ ＩＩ（商標）Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて１６０ｍＡで１時間タンパク質を転写させた。転写後のＰＶＤＦ膜を水で洗浄し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０染色溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて１分間染色し、蒸留水で洗浄した。
【００８０】
染色された７０ｋＤａのバンドを切り出し、その膜切片をエドマン配列解析により解析した。Ｎ末端のアミノ酸配列は単一の種であり、そのＮ末端アミノ酸残基は次のように決定された：Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ；よって、切断は配列番号９の２８番目の位置で起こる。ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１を産生するＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、これは産物の４０％しかない。
【００８１】
実施例７
ＥＮ−アピラ−ゼの糖鎖解析
ＥＮ−アピラ−ゼとｓｏｌ ＣＤ３９Ｌ３（ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１）からの糖鎖を等電点電気泳動により解析した。ＥＮ−アピラ−ゼは実質的により多いグリコシル化を示した。また、ＣＤ３９Ｌ３−０１では約５．０〜約６．０の範囲のｐＩであるのに対して、ＥＮ−アピラ−ゼでは約３．０〜４．５の範囲のｐＩであったことから実証されるとおり、ＥＮ−アピラ−ゼはより低い不均一性を示した。図１０Ａ及びＢを参照されたい。グリコシル化の増加に起因する、より高い分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認された。
【００８２】
実施例８
精製プロトコルの改良
改良された精製プロトコルを、ＥＮ−アピラ−ゼの新しい性質に基づいて開発した。調製Ａ及び実施例６で用いたイオン交換（ＤＥＡＥ）及びアフィニティ−クロマトグラフィ−（ヘパリン）の代わりに、２イオン交換クロマトグラフィ−（ＡＮＸ及びＳＰ）プロトコルを採用した。
【００８３】
配列番号１０を含むＥＮ−アピラ−ゼ核酸構築物で形質転換したＣＨＯ細胞を、上述したような一般的な方法で培養し、培養液を１．４平方フィ−トの６０Ｍ０２ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｃｕｎｏ社，ＣＴ）を通して回収した。フィルタ−は使用前にＷＦＩ水で洗浄し、容積回収を最大化するために圧縮空気を吹き付けた。その後、澄んだ培養液を０．２μｍフィルタ−で濾過して滅菌バッグに回収した。
【００８４】
ウイルスを不活化するため、負荷量（１．６Ｌの澄んだ培養液、Ｖ１７）を等量（１．６Ｌ）のＷＦＩ水で希釈した。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００の溶液（１１％を３２０ｍＬ）を添加し（最終濃度１％）、得られた溶液を周囲温度で３０分間静置した。
【００８５】
アニオン交換クロマトグラフィ−：ウイルス不活化培養液（３．５２Ｌ）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で平衡化した８０ｍＬ ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムに１３ｍｌ／分の流速でアプライした。負荷量をカラムにアプライし、洗浄液を含めたフロ−スル−液を収集した（３．７Ｌ）。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４で２回目の洗浄を実施して、洗浄液を回収した（５８０ｍＬ）。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２３０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４でタンパク質を溶出し、回収した（５００ｍＬ）。最後に、１Ｍ ＮａＣｌを用いて残りのタンパク質をカラムから取り出し、回収した（４５０ｍＬ）。
【００８６】
バッファ−交換及びカチオン交換クロマトグラフィ−：回収されたＡＮＸ １４０ｍＭ−２３０ｍＭ溶出物は、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｍａｘ ３０（５０ｃｍ２）を用い、連続モ−ドで２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．８０にバッファ−交換した（〜１０倍量）。バッファ−交換した負荷量（１．０Ｌ）を、２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．８０で平衡化した８０ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムにアプライし、フロ−スル−液及び洗浄液を回収した（１．２Ｌ）。洗浄段階は、２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ５．１０で行い、回収した（２２０ｍＬ）。２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ６．０を用いて残りのタンパク質をカラムから取り出し、これも回収した（２００ｍＬ）。
【００８７】
収率及び純度解析：ＥＮ−アピラ−ゼの収率は、以下に示すように、紫外／可視吸収及びＥＬＩＳＡにより８０％を超えると計算された。
【００８８】
【表５】
【００８９】
各精製段階でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した（図１１）。ＹＭ−３０（２ｍｌ）遠心濃縮機を用いて２０倍に濃縮した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで純度を解析した。
【００９０】
実施例９
不均一にグリコシル化されたＥＮ−アピラ−ゼの回収率を改善したＥＮ−アピラ−ゼの精製
実施例２に記載された方法で培養した細胞からの培養液を、１．４平方フィ−トの６０Ｍ０２ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｃｕｎｏ社，ＣＴ）を通して回収した。フィルタ−は使用前にＷＦＩ水で洗浄し、容積回収を最大化するために圧縮空気を吹き付けた。その後、澄んだ培養液を０．２μｍフィルタ−で濾過して滅菌バッグに回収した。
【００９１】
ウイルスの不活化のために、負荷量（１００ｍＬの澄んだ培養液、Ｖ１９）を等量（１００ｍＬ）のＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈した。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００の溶液（１１％を２０ｍＬ）を添加し（最終濃度１％）、得られた溶液を周囲温度で３０分間静置した。
【００９２】
アニオン交換クロマトグラフィ−：ＥＮ−アピラ−ゼのウイルス不活化培養液（２２０ｍＬ）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で平衡化した５ｍＬ ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムに５ｍｌ／分の流速でアプライした。負荷量をカラムにアプライし、フロ−スル−液及び洗浄液を回収した（２６０ｍＬ）。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２３０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４でタンパク質を溶出させ、回収した（５０ｍＬ）。洗浄段階を省略し、直接２３０ｍＭ ＮａＣｌで溶出すると、アニオン交換クロマトグラフィ−からのアピラ−ゼの大きな損失はなかった。最後に、１Ｍ ＮａＣｌを用いて残りのタンパク質をカラムから取り出し、これも回収した（３０ｍＬ）。１Ｍ ＮａＣｌ溶出物のウェスタンブロット解析から、この画分中にアピラ−ゼがほとんど検出されないことが示された。
【００９３】
バッファ−交換及びカチオン交換クロマトグラフィ−：回収されたＡＮＸ ２３０ｍＭ溶出物は、１Ｌ Ｇ２５カラムを通して２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．６にバッファ−交換した（〜３倍量）。
バッファ−交換された負荷量（１５０ｍＬ）を、２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．６で平衡化した５ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムにアプライし、フロ−スル−液及び洗浄液を回収した（１７０ｍＬ）。洗浄を２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ４．８で行い、回収した（４０ｍＬ）。さらなる成果として、フロ−スル−液のｐＨを４．８から４．６に下げることによって低分子量の不純物が取り除かれた。アピラ−ゼの一部はｐＨ４．８溶出液中に存在したが、その総量はｐＨ４．６のフロ−スル−液の１０％未満であった。別の洗浄を２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ５．１で実施して、回収した（４０ｍＬ）。２０ｍＭクエン酸塩，ｐＨ６．０を用いて残りのタンパク質をカラムから取り出し、これも回収した（４０ｍＬ）。
【００９４】
純度は、Ｏｍｅｇａ ３ｋＤａ ２ｍｌ遠心濃縮機を用いて２０倍に濃縮した後に４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで解析した。
【００９５】
この精製スキ−ムを用いて、１２０ｍＭ及び／又は１４０ｍＭ ＮａＣｌ洗浄段階を省くことによってＡＮＸクロマトグラフィ−から、不均一にグリコシル化されたＥＮ−アピラ−ゼのほぼ全部が回収された。また、加えて、ＳＰクロマトグラフィ−で０．２ｐＨ単位下げることにより、アピラ−ゼのより高い純度（＞９５％）が達成された。この２ステップ精製により回収されたアピラ−ゼの全体的な回収率は９０％を上回った。
【００９６】
実施例１０
ＥＮ−アピラ−ゼは長い半減期及び改善された薬効を示す
ｓＣＨＯ−Ｓ／ｓＣ−ＡＰＴ−Ｒ ２Ｘ細胞を４ｇ／Ｌのグルコ−スと２ｍＭのグルタミンの存在下、ｐＨ７．４、３４℃で培養した。ＥＮ−アピラ−ゼを実施例９の２ステップイオン交換プロセスで精製した。ＥＮ−アピラ−ゼは、より豊富なグリコシル化の結果、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１と比較して高い平均分子量を示した。
【００９７】
対照として、ＨＥＫ細胞で発現させたｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３の単回ボ−ラスを静脈内に注射した（０．７５ｍｇ／ｋｇ、時点あたりｎ＝３）薬物動態試験をラットで実施した。血清サンプルのＡＤＰア−ゼ及びＡＴＰア−ゼ活性を試験した。実験デ−タはいずれの酵素活性の二相性指数曲線にも最適に適合する。このアピラ−ゼの分布相の半減期（Ｔ１／２）は４０分と計算された（図１２）。アピラ−ゼ活性の約５０％がこの相の間に循環から排除された。このアピラ−ゼの血漿消失Ｔ１／２は２０時間である。対照的に、ＥＮ−アピラ−ゼ（０．２５ｍｇ／ｋｇで投与）は２４時間で初期活性の＞５０％を保持しており、図１３に示すように、有効ｉｎ ｖｉｖｏ活性が＞１０倍増加した。
【００９８】
多血小板血漿のＡＤＰ誘発性血小板凝集に及ぼすＥＮ−アピラ−ゼとＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１の効果により測定される活性アピラ−ゼのレベルを、ウサギへの単回ボ−ラス投与（ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１及びＥＮ−アピラ−ゼをそれぞれ０．７５ｍｇ／ｋｇ及び０．２５ｍｇ／ｋｇ）後に、様々な時点で測定した。アピラ−ゼによる血小板凝集の阻害をより正確に推量するために、生理的カルシウム濃度を維持する目的で、血液サンプルにクエン酸ではなくヘパリンを添加した。図１４に示すように、可溶性ＣＤ３９Ｌ３（例えば、ＨＥＫ−ｓｏｌ−ＣＤ３９Ｌ３−０１）が６時間でＡＤＰ誘発性血小板凝集の５０％阻害をしか保持なかったのに対し、３分の１の濃度（０．７５ｍｇ／ｋｇに対して０．２５ｍｇ／ｋｇ）のＥＮ−アピラ−ゼは６時間でＡＤＰ誘発性血小板凝集の９０％阻害を保持したことをデ−タが実証している。
【００９９】
ＥＮ−アピラ−ゼによる薬物動態の同様の改善は、図１５及び１６に示すように、ブタにおいても観察された。ＥＮ−アピラ−ゼの薬物動態の１０倍を超える改善は、その有効量を減らすものと考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＮ−アピラ−ゼであって、
該ＥＮ−アピラ−ゼが、可溶性ＣＤ３９Ｌ３もしくはそのホモログであり、均質なＮ末端を有し、かつ約３．０〜約４．５の範囲の平均等電点を有すること；及び／又は
該ＥＮ−アピラ−ゼが、ウサギもしくはブタのｉｎ ｖｉｖｏにおける、アピラ−ゼアッセイで測定された半減期が、ＨＥＫ ｓｏｌ−ＣＤＥ３９Ｌ３−０１の半減期の少なくとも２倍であること
を特徴とするＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項２】
形質転換ＣＨＯ細胞株により産生される、請求項１に記載のＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項３】
Ｎ末端が配列ＥＶＬＰを有する、請求項１又は２に記載のＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項４】
７番目の位置で開始する配列番号５からなる又はそのホモログである、請求項３に記載のＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項５】
シグナル配列、リンカ−、及び可溶性アピラ−ゼをコ−ドするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、該リンカ−がそのＣ末端として配列ＥＶＬＰを有し、かつ該リンカ−又はその一部が天然の可溶性アピラ−ゼ中に存在する配列を表している、核酸構築物。
【請求項６】
作動可能に連結された、ＣＨＯ細胞内で機能するプロモ−タ−をさらに含む、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
可溶性アピラ−ゼが可溶性ＣＤ３９Ｌ３又はそのホモログである、請求項５又は６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
可溶性アピラ−ゼが７番目の位置で開始する配列番号５からなる、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むように改変されたＣＨＯ細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞を培養し、その培養培地を回収することを含んでなる、ＥＮ−アピラ−ゼの調製方法。
【請求項１１】
培養の間、培地が約１．５〜４ｍＭのグルタミン濃度及び７．０〜７．８のｐＨを維持し、かつ、培養４〜６日目に温度が３７℃から３１〜３５℃にシフトする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
培養の間、培地が約２ｍＭのグルタミン濃度及び７．４のｐＨを維持し、かつ、培養５日目に温度が３７℃から３４℃にシフトする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法により調製されるＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項１４】
請求項１に記載のＥＮ−アピラ−ゼを含有する医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＥＮ−アピラ−ゼを含有する医薬組成物。
【請求項１６】
アピラ−ゼ活性によって恩恵を受ける症状の治療方法であって、そのような治療を必要とする被験者に、有効量の請求項１４又は１５に記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、治療方法。
【請求項１７】
請求項１〜４又は１３のいずれか１項に記載のＥＮ−アピラ−ゼの精製方法であって、該ＥＮ−アピラ−ゼを含む培養培地をアニオン交換クロマトグラフィ−に供すること、続いて該アニオン交換クロマトグラフィ−からのＥＮ−アピラ−ゼ含有溶出液をカチオン交換クロマトグラフィ−で処理して精製することを含んでなる、精製方法。
【請求項１】
ＥＮ−アピラ−ゼであって、
該ＥＮ−アピラ−ゼが、可溶性ＣＤ３９Ｌ３もしくはそのホモログであり、均質なＮ末端を有し、かつ約３．０〜約４．５の範囲の平均等電点を有すること；及び／又は
該ＥＮ−アピラ−ゼが、ウサギもしくはブタのｉｎ ｖｉｖｏにおける、アピラ−ゼアッセイで測定された半減期が、ＨＥＫ ｓｏｌ−ＣＤＥ３９Ｌ３−０１の半減期の少なくとも２倍であること
を特徴とするＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項２】
形質転換ＣＨＯ細胞株により産生される、請求項１に記載のＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項３】
Ｎ末端が配列ＥＶＬＰを有する、請求項１又は２に記載のＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項４】
７番目の位置で開始する配列番号５からなる又はそのホモログである、請求項３に記載のＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項５】
シグナル配列、リンカ−、及び可溶性アピラ−ゼをコ−ドするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、該リンカ−がそのＣ末端として配列ＥＶＬＰを有し、かつ該リンカ−又はその一部が天然の可溶性アピラ−ゼ中に存在する配列を表している、核酸構築物。
【請求項６】
作動可能に連結された、ＣＨＯ細胞内で機能するプロモ−タ−をさらに含む、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
可溶性アピラ−ゼが可溶性ＣＤ３９Ｌ３又はそのホモログである、請求項５又は６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
可溶性アピラ−ゼが７番目の位置で開始する配列番号５からなる、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むように改変されたＣＨＯ細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞を培養し、その培養培地を回収することを含んでなる、ＥＮ−アピラ−ゼの調製方法。
【請求項１１】
培養の間、培地が約１．５〜４ｍＭのグルタミン濃度及び７．０〜７．８のｐＨを維持し、かつ、培養４〜６日目に温度が３７℃から３１〜３５℃にシフトする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
培養の間、培地が約２ｍＭのグルタミン濃度及び７．４のｐＨを維持し、かつ、培養５日目に温度が３７℃から３４℃にシフトする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法により調製されるＥＮ−アピラ−ゼ。
【請求項１４】
請求項１に記載のＥＮ−アピラ−ゼを含有する医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＥＮ−アピラ−ゼを含有する医薬組成物。
【請求項１６】
アピラ−ゼ活性によって恩恵を受ける症状の治療方法であって、そのような治療を必要とする被験者に、有効量の請求項１４又は１５に記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、治療方法。
【請求項１７】
請求項１〜４又は１３のいずれか１項に記載のＥＮ−アピラ−ゼの精製方法であって、該ＥＮ−アピラ−ゼを含む培養培地をアニオン交換クロマトグラフィ−に供すること、続いて該アニオン交換クロマトグラフィ−からのＥＮ−アピラ−ゼ含有溶出液をカチオン交換クロマトグラフィ−で処理して精製することを含んでなる、精製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１３−５１６９９１（Ｐ２０１３−５１６９９１Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４９０８９（Ｐ２０１２−５４９０８９）
【出願日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１１８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８８２４４
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５１２１８０８０５）エイピーティー セラピューティックス，インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１１８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８８２４４
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５１２１８０８０５）エイピーティー セラピューティックス，インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]