治療用エピトープ及びそれらの使用
【課題】初期段階でセリアック病を診断するのに使用できる試験を開発することである。
【解決手段】個体においてセリアック病を診断するか又はセリアック病に対する感受性を診断する方法を提供し、
（ａ）宿主からのサンプルを、（ｉ）配列番号：１（ＰＱＰＥＬＰＹ）又は配列番号：２（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ）である配列、又は配列番号：３により表されるグリアジンの天然に生じる相同体からの均等な配列を含むエピトープ、（ｉｉ）グリアジン蛋白質由来の単離されたオリゴペプチドである、配列番号：１を含むか又は配列番号：３により表されるグリアジンの天然に生じる相同体からの均等な配列（表１に示される）を含むエピトープ、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識され得る（ｉ）又は（ｉｉ）の類似体であって、ペプチドの場合は類似体が５０アミノ酸の長さを超えない上記類似体、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）において定義された２つ又はそれより多い薬剤（ａｇｅｎｔ）を含む生成物からなる群から選択される薬剤と接触させ、そして（ｂ）サンプル中のＴ細胞が薬剤を認識するか否かをインビトロにて決定して、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示す
ことを含む。
【解決手段】個体においてセリアック病を診断するか又はセリアック病に対する感受性を診断する方法を提供し、
（ａ）宿主からのサンプルを、（ｉ）配列番号：１（ＰＱＰＥＬＰＹ）又は配列番号：２（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ）である配列、又は配列番号：３により表されるグリアジンの天然に生じる相同体からの均等な配列を含むエピトープ、（ｉｉ）グリアジン蛋白質由来の単離されたオリゴペプチドである、配列番号：１を含むか又は配列番号：３により表されるグリアジンの天然に生じる相同体からの均等な配列（表１に示される）を含むエピトープ、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識され得る（ｉ）又は（ｉｉ）の類似体であって、ペプチドの場合は類似体が５０アミノ酸の長さを超えない上記類似体、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）において定義された２つ又はそれより多い薬剤（ａｇｅｎｔ）を含む生成物からなる群から選択される薬剤と接触させ、そして（ｂ）サンプル中のＴ細胞が薬剤を認識するか否かをインビトロにて決定して、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示す
ことを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリアック病の診断及び治療に有用なエピトープに関し、診断剤、治療剤、キット、及び前記の使用方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
ダイエット中のグリアジン（グルテンの成分）に対する免疫反応がセリアック病を引き起こす。腸組織中の免疫応答は腸のトランスグルタミナーゼにより修飾されたグリアジンに優先的に応答する。セリアック病は抗−筋内膜抗体の検出により診断されるが、これは腸の生検内のリンパ球の炎症の発見による確認を必要とする。そのような生検の取得は患者にとって快適ではない。
【０００３】
研究者は、腸のＴ細胞応答のみがグリアジンに対する免疫応答の正確な指標を提供すると、以前に仮定した。よって、彼らは、腸の組織内のＴ細胞の応答の研究に集中してきた１。トランスグルタミナーゼの修飾を必要とする（それらが免疫系により認識される前に）グリアジンエピトープは公知である２。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】1. MolbergO, etal. NatureMed.4, 713-717 (1998).
【非特許文献２】2. Quarsten H, et al. Eur. J. Immunol. 29, 2506-2514 (1999).
【非特許文献３】3. Greenberg CS et al. FASEB 5, 3071-3077 (1991).
【非特許文献４】4. Mantzaris G, Jewell D. Scand. J. Gastroenterol. 26, 392-398 (1991).
【非特許文献５】5.Mauri L, et al. Scand. J. Gastroenterol. 31, 247-253 (1996).
【非特許文献６】6. BuncoM, et al. Tissue Antigens 46, 355-367 (1995).
【非特許文献７】7. OlerupO, etal. Tissueantigens 41, 119-134 (1993).
【非特許文献８】8. Mullighan CG, et al. Tissue-Antigens. 50, 688-92 (1997).
【非特許文献９】9. PlebanskiM et al. Eur. J. Immunol. 28, 4345-4355 (1998).
【非特許文献１０】10. Anderson DO, Greene FC. The alpha-gliadin gene family. II. DNA and protein sequence variation, subfamily structure, and origins of pseudogenes. Theor Appl Genet (1997) 95 : 59-65.
【非特許文献１１】11. Arentz-HansenH, Korner R, Molberg O,Quarsten H, Van der Wal Y, Kooy YMC, Lundin KEA, Koning F, Roepstorff P, Sollid LM, McAdam SN. The intestinal T cell response to alpha-gliadin in adult celiac disease is focused on a single deamidated glutamine targeted by tissue transglutaminase. J Exp Med. 2000 ; 191 : 603-12.
【非特許文献１２】12. Vader LW, de Ru A, van der Wal, Kooy YMC, Benckhuijsen W, Mearin ML, DrijfhoutJW, van Veelen P, Koning F. Specificity of tissue transglutaminase explains cereal toxicity in celiac disease. J Exp Med 2002 ; 195 : 643-649.
【非特許文献１３】13. van der Wal Y, Kooy Y, van Veelan P, Pena S, Mearin L, Papadopoulos G, Koning F. Selective deamidation by tissue transglutaminase strongly enhances gliadin-specific T cell reactivity. J Immunol. 1998 ; 161 : 1585-8.
【非特許文献１４】14. van der Wal Y, Kooy Y, van Veelan P, Pena S, Mearin L, Molberg O,Lundin KEA, Sollid L, Mutis T, BenckhuijsenWE, Drijfhout JW, Koning F. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95 : 10050-10054.
【非特許文献１５】15. Vader W, Kooy Y, Van Veelen Petal. The gluten response in children with celiac disease is directed toward multiple gliadin and glutenin peptides. Gastroenterology2002, 122 : 1729-37 16. Arentz-Hansen H, McAdam SN, Molberg O, et al. Celiac lesion T cells recognize epitopes that cluster in regions of gliadin rich in proline residues. Gastroenterology 2002, 123 : 803-809.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、セリアック病において免疫系により認識される免疫上優勢なＴ細胞Ａ−グリアジンエピトープを発見し、そしてこれがセリアック病の個体の末梢血内でＴ細胞により認識されることを示した（ＷＯ ０１／２５７９３）。そのようなＴ細胞は、再刺激無しに検出可能なほど十分高い頻度で存在することを発見した（即ち、「フレッシュな応答」検出系が使用できた）。上記エピトープは非Ｔ細胞クローニングに基づく方法を用いて同定され、上記エピトープのより正確な反射（ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）が認識された。上記の免疫上優勢なエピトープは免疫系が認識する前にトランスグルタミナーゼの修飾を必要とする（特定のグルタミンのグルタミン酸への置換を引き起こす）。
【０００６】
この研究に基づいて、本発明者らは、初期段階でセリアック病を診断するのに使用できる試験を開発した。当該試験は、末梢血からのサンプル上で実施してよく、よって、腸の生検は必要ない。当該試験は現在使用されている抗体試験よりも感度が高い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明は、即ち、個体においてセリアック病を診断するか又はセリアック病に対する感受性を診断する方法を提供し、
（ａ）宿主からのサンプルを、（ｉ）配列番号：１（ＰＱＰＥＬＰＹ）又は配列番号：２（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ）である配列、又は配列番号：３により表されるグリアジンの天然に生じる相同体からの均等な配列を含むエピトープ、（ｉｉ）グリアジン蛋白質由来の単離されたオリゴペプチドである、配列番号：１を含むか又は配列番号：３により表されるグリアジンの天然に生じる相同体からの均等な配列（表１に示される）を含むエピトープ、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識され得る（ｉ）又は（ｉｉ）の類似体であって、ペプチドの場合は類似体が５０アミノ酸の長さを超えない上記類似体、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）において定義された２つ又はそれより多い薬剤（ａｇｅｎｔ）を含む生成物からなる群から選択される薬剤と接触させ、そして（ｂ）サンプル中のＴ細胞が薬剤を認識するか否かをインビトロにて決定して、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示す
ことを含む。
【０００８】
コムギのグリアジンＴ細胞のエピトープの包括的なマッピングを通して（実施例１３参照）、本発明者らは、類似のコア配列（例えば、配列番号：１８−２２）及び類似の完全長配列（例えば、配列番号：３１−３６）を有する他のコムギグリアジン中のセリアック病のＨＬＡ−ＤＱ２＋患者において、並びにライムギのセカリン及びオオムギのホールダイン（配列番号：３９−４１）の生物学上活性なエピトープをも発見した；表２０及び２１も参照。さらに、セリアック病においてＨＬＡ−ＤＱ８＋患者にて生物学上活性な幾つかのエピトープが同定された（配列番号４２−４４、４６）。この包括的なマッピングは、即ち、セリアック病の患者においてＴ細胞により認識される優勢なエピトープを提供する。即ち、上記の方法及び本明細書に記載される他の方法は、これらの追加の同定されたエピトープ、それらの類似体及び均等物の何れかを使用して実施してよい；本明細書の（ｉ）及び（ｉｉ）はこれらの追加のエピトープを含む。即ち、本発明の薬剤は新規なエピトープも含む。
【０００９】
本発明は、個体において、セリアック病又はセリアック病に対する感受性を診断する方法における使用のための診断手段の製造のための薬剤の使用を提供し、当該方法は、当該個体のＴ細胞が薬剤を認識するか否かを決定することを含み、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示す。
【００１０】
トランスグルタミナーゼにより修飾された免疫上優勢なエピトープ（並びに本明細書において定義された追加の他のエピトープ）の発見は、このエピトープに対する他の種類の免疫応答が存在するか否かを決定することに基づいたセリアック病の診断も可能にする。即ち、本発明は、個体において、セリアック病又はセリアック病に対する感受性を診断する方法も提供し、当該個体からのサンプル中のエピトープに結合する抗体の存在を決定することを含み、抗体の存在が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示す。
【００１１】
本発明は、さらに、上記薬剤を認識するＴ細胞を寛容にするセリアック病を治療又は予防する方法における使用のための上記薬剤を、任意にキャリアーと共に提供する。また、Ｔ細胞と拮抗することによりセリアック病を治療又は予防する方法における使用のための、（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニストを、任意にキャリアーと共に提供する。さらに、抗体の生産を阻害するために個体を寛容にすることにより個体においてセリアック病を治療又は予防する方法における使用のための、抗体（上記薬剤に結合する）を結合する薬剤又は類似体が提供される。
【００１２】
本発明は、組成物がセリアック病を引き起こすか否かを決定する方法を提供し、トランスグルタミナーゼにより上で定義されたオリゴペプチド配列へ修飾される蛋白質が組成物中に存在するか否かを決定することを含み、蛋白質の存在が、組成物がセリアック病を引き起こし得ることを示す。
【００１３】
本発明は、その野生型配列がトランスグルタミナーゼにより上で定義された配列を含むエピトープを含む配列に修飾され得る変異体グリアジン蛋白質も提供するが、しかし、当該変異体グリアジン蛋白質は、そのようなエピトープを含む配列を含む配列へトランスグルタミナーゼにより修飾され得る配列を含まない様式にて修飾されており；又は、本発明は、上記の様式により修飾されたそのような変異体グリアジン蛋白質の断片も提供する。
【００１４】
本発明は、Ｔ細胞受容体へ結合することができる配列を含む蛋白質も提供し、但し、Ｔ細胞受容体は上記の薬剤を認識し、そして上記配列はそのようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞の拮抗作用を引き起こすことができる。
【００１５】
さらに、本発明は、上で定義された蛋白質を含む食品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１は、最初のうちはグルテンフリーダイエットのあとに緩解して、次に１日目から３日間２００ｇのパン（ｂｒｅａｄ）で毎日チャレンジされた、セリアック病被験者１における、Ａ−グリアジン５１−８５にわたる５つのオーバーラップする１５マーを含むトランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）−処理されたものと処理されないペプチドプール３（各ペプチド１０μｇ／ｍｌ）（表１参照）及びキモトリプシン−消化されたグリアジン（４０μｇ／ｍｌ）に対する、新たに単離されたＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答（垂直軸は１０６ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞を示す）を示す（ａ）。
【図１Ｂ】１０日間の間のパンチャレンジの間の全Ａ−グリアジン蛋白質にわたるｔＴＧ−処理されたＡ−グリアジンペプチドプール１−１０に対する被験者２によるＰＢＭＣ ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答（ｂ）。水平軸はパン開始後の日にちを示す。
【図２】図２は、最初のうちはグルテンフリーダイエットのあとに緩解して、次に３日間パンでチャレンジされた、セリアック病の７人の被験者における、ｔＴＧ−処理されたペプチドプール３（Ａ−グリアジン５１−８５にわたる）に対する、ＰＢＭＣ ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答（垂直軸は１０６ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞を示す）を示す（１から３日）。垂直軸はパンを初めた後の日にちを示す。（ａ）。プール３中に含まれるｔＴＧ処理のオーバーラップ１５マーに対する応答；バーは６日目又は７日目の６人のセリアック病の被験者の個々のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）に対する、平均（±ＳＥＭ）の応答を表す（ｂ）。（個々の被験者において、ペプチドに対するＥＬＩＳＰＯＴ応答はペプチド１２により導かれた応答の％として計算された−水平軸により示されるとおり。）
【図３】図３は、Ａ−グリアジン５６−７５のｔＴＧ−処理された末端削除体（０．１μＭ）に対するＰＢＭＣ ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。バーは５人のセリアック病被験者の平均（±ＳＥＭ）を表す。）。（個々の被験者において、応答は試験されたペプチドにより導かれた最大応答の％として計算された−水平軸により示されるとおり。）
【図４】図４は、優勢なＡ−グリアジンエピトープの最小構造が如何にしてｔＴＧ−処理された７−１７マーのＡ−グリアジンペプチド（０．１μＭ）を用いてマップされたかを示し、配列ＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号：４）（Ａ−グリアジン６２−６８）（ａ）、及びｔＴＧ処理しなかったがＱ→Ｅ６５の置換を伴う同じペプチドを含む（ｂ）。各線はパンを１−３日目に摂取してから６又は７日目の３人のセリアック病被験者におけるＰＢＭＣ ＩγＥＬＩＳＰＯＴ応答を表す。）。（個々の被験者において、ＥＬＩＳＰＯＴ応答は１７マー、Ａ−グリアジン５７−７３により導かれた応答の％として計算された。）
【図５】図５はｔＴＧにより脱アミド化されたアミノ酸を示す。Ａ−グリアジン５６−７５ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＳＦＰ（配列番号：５）（０．１μＭ）をｔＴＧ（５０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃において２時間インキュベートした。逆相ＨＰＬＣにより単一の生成物が同定されて精製された。アミノ酸分析により、ｔＴＧに帰し得るＡ−グリアジン５６−７５内の各Ｇｌｎ残基の％脱アミド化（Ｑ→Ｅ）の計算が可能になった（水平軸）。
【図６】図６は、パンを１−３日目に摂取してから６又は７日目の３人のセリアック病被験者における、１７マー：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＳ（配列番号：６）（Ｅ５７，６５），ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＳ（配列番号：７）（Ｅ６５，７２），ＥＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＳ（配列番号：８）（Ｅ５７，６５，７２），及びＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：９）（Ｅ６５）を用いた、Ａグリアジン５７−７３中のＱ６５に加えた他の位置においてＱ→Ｅを置換した効果を示す。水平軸はＥ６５応答の％を示す。
【図７】図７は、ｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン５６−７５（０．１μＭ）が（ａ）ＣＤ４及びＣＤ８の磁気ビーズ除去した（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＰＢＭＣにおいてＩＦＮ−ｇＥＬＩＳＰＯＴ応答を導いたことを示す。（バーはＣＤ４除去ＰＢＭＣ応答をＣＤ８除去ＰＢＭＣ応答の％として表す；百万のＣＤ８除去ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞は：被験者４：２９、及び被験者６：５３５であった。）（ｂ）ＨＬＡ−ＤＱａＩ＊０５０１，ｂＩ＊０２０１に関して同型接合体の２人のセリアック病被験者における、ｔＴＧ−処理５６−７５（０．１μＭ）の１時間前の、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３），−ＤＱ（Ｌ２）及び−ＤＰ（Ｂ７．２１）（１０μｇ／ｍｌ）に対するモノクローナル抗体とのインキュベーション後のＰＢＭＣ ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答（スポット形成細胞／百万ＰＢＭＣ）。
【図８】図８は、免疫上優勢なエピトープ内の６５位における他のアミノ酸のＧｌｕによる置換の効果を示す。水平軸は免疫上優勢なエピトープに関しての３人の被験者における％応答を示す。
【図９】図９は、トランスグルタミナーゼ処理を伴う場合（影）及び伴わない場合（透明）の配列ＰＱＬＰＹ（配列番号：１２）を含む、天然に存在するグリアジンペプチドの免疫反応性を示す（３人の被験者の応答を測定）。
【図１０】図１０は、グルテンチャレンジを開始して、次にインターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔを行ってから６日後の２人のセリアック病被験者からの末梢血単核細胞のＣＤ８，ＣＤ４，β７，及びαＥ−特異的免疫磁気ビーズ除去を示す。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（２５ｍｃｇ／ｍｌ），ｔＴＧ−処理されたキモトリプシン−消化グリアジン（１００ｍｃｇ／ｍｌ）又はＰＰＤ（１０ｍｃｇ／ｍｌ）を抗原として用いた。
【図１１】図１１は、最適なＴ細胞エピトープの長さを示す。
【図１２Ａ】図１２ａは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｂ】図１２ｂは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｃ】図１２ｃは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｄ】図１２ｄは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｅ】図１２ｅは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｆ】図１２ｆは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｇ】図１２ｇは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｈ】図１２Ｈは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１３Ａ】図１３ａは、グリアジンとＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５特異的応答の比較を示す。
【図１３Ｂ】図１３ｂは、グリアジンとＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５特異的応答の比較を示す。
【図１３Ｃ】図１３ｃは、グリアジンとＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５特異的応答の比較を示す。
【図１４Ａ】図１４ａは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１４Ｂ】図１４ｂは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１４Ｃ】図１４ｃは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１４Ｄ】図１４ｄは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１４Ｅ】図１４ｅは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１５】図１５は、コアエピトープ配列の定義を示す。
【図１６】図１６は、コアエピトープ配列の定義を示す。
【図１７】図１７は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図１８】図１８は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図１９】図１９は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２０】図２０は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２１】図２１は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２２】図２２は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２３】図２３は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２４】図２４は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２５】図２５は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２６】図２６は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２７】図２７は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２８Ａ】図２８ａは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｂ】図２８ｂは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｃ】図２８ｃは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｄ】図２８ｄは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｅ】図２８ｅは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｆ】図２８ｆは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｇ】図２８ｇは、異なる患者群における応答を示す。
【図２９】図２９は、Ａ−グリアジン５７−７３のプロラミン相同体の生物活性を示す。
【図３０】図３０は、健康なＨＬＡ−ＤＱ２被験者についての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対するＥＬＩＳｐｏｔ応答の変化を示す。
【図３１】図３１は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ２被験者についての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対するＥＬＩＳｐｏｔ応答の変化を示す。
【図３２】図３２は、「要約された」グリアジンペプチド応答に対する個々のペプチドの寄与を示す。
【図３３】図３３は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ２／８被験者Ｃ０８に関しての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対する、グルテンチャレンジが導いたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。
【図３４】図３４は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ２／８被験者Ｃ０７に関しての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対する、グルテンチャレンジが導いたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。
【図３５】図３５は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ８／７被験者Ｃ１２に関しての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対する、グルテンチャレンジが導いたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。
【図３６】図３６は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ６／８被験者Ｃ１１に関しての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対する、グルテンチャレンジが導いたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明はセリアック病を治療又は予防する方法を提供し、ａ）配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６、及びそれらの均等物からなる群から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチド；及びｂ）ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることができ、且つ５０アミノ酸の長さを超えない、ａ）の類似体；及びｃ）配列番号：１及び配列番号：２から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチドから選択される少なくとも一つの薬剤を個体に投与することを含む。幾つかの態様において、上記薬剤は、ＨＬＡ−ＤＱ２−制限されるか、ＨＬＡ−ＤＱ８−制限されるか、又は一つの薬剤がＨＬＡ−ＤＱ２−制限されており、そして第２の薬剤がＨＬＡ−ＤＱ８−制限されている。幾つかの態様において、上記薬剤は、コムギのエピトープ、ライムギのエピトープ、オオムギのエピトープ又はそれらの組み合わせの何れかを、単一の薬剤として又は複数の薬剤として含む。
【００１８】
本発明は、上記の薬剤及び薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤を含む薬学組成物を個体に投与することを含む、セリアック病を予防又は治療する方法も提供する。
【００１９】
本発明は、上で定義されたＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニスト及び薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤を含む薬学組成物を個体に投与することを含む、セリアック病を予防又は治療する方法も提供する。
【００２０】
本発明は、Ｔ細胞の生産又は上で定義された薬剤に対する抗体応答を抑圧するために個体をグリアジン蛋白質に対して寛容にするための組成物を個体に投与することを含む、セリアック病を予防又は治療する方法も提供する。
【００２１】
本発明は、１）ａ）ｉ）配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６、及びそれらの均等物からなる群から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチド；及びｉｉ）ｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識されることができ、且つ５０アミノ酸の長さを超えない、ｉ）の類似体；及びｉｉｉ）任意に、ｉ）及びｉｉ）から選択される薬剤に加えて、配列番号：１及び配列番号：２から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチドから選択される少なくとも一つの薬剤を、宿主からのサンプルに接触させ；そしてサンプル中のＴ細胞が上記薬剤を認識するか否かをインビトロにて決定するが、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示すか；又はｂ）上で定義された薬剤を投与し、そして個体中のＴ細胞が上記薬剤を認識するか否かをインビボにて決定するが、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示すかの何れかにより、個体においてセリアック病を診断し；そして２）セリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であると診断された個体に、セリアック病を予防又は治療するための治療用薬剤を投与する
ことによりセリアック病を予防するか又は治療する方法も提供する。
【００２２】
本発明は、上記薬剤を認識するＴ細胞を寛容にすることによりセリアック病を予防又は治療する方法における使用のための、上で定義された薬剤も、任意にキャリアーと共に、提供する。
【００２３】
本発明は、Ｔ細胞と拮抗することによりセリアック病気を予防又は治療する方法における使用のための、上で定義されたＴ細胞受容体を認識するＴ細胞のアンタゴニストも、任意にキャリアーと共に、提供する。
【００２４】
本発明は、Ｔ細胞受容体へ結合することができる配列を含む蛋白質も提供し、但し、Ｔ細胞受容体は上で定義された薬剤を認識し、そして上記配列はそのようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞の拮抗作用を引き起こすことができる。
【００２５】
本発明は、上で定義された薬剤又はアンタゴニスト及び薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤を含む薬学組成物も提供する。
【００２６】
本発明は、Ｔ細胞の生産又は上で定義された薬剤に対する抗体応答を抑圧するために個体をグリアジン蛋白質に対して寛容にするための組成物も提供し、当該組成物は上で定義された薬剤を含む。
【００２７】
本発明は、上で定義された薬剤に対するＴ細胞応答に拮抗するための組成物も提供し、当該組成物は上で定義されたアンタゴニストを含む。
【００２８】
本発明は、その野生型配列がトランスグルタミナーゼにより請求項１において定義された薬剤である配列に修飾され得る変異体グリアジン蛋白質も提供し、当該変異体グリアジン蛋白質は、上で定義された薬剤である配列へのトランスグルタミナーゼによるそれの修飾を阻害する変異を含み；又は、本発明は少なくとも１５アミノ酸の長さであり、且つ上記変異を含む、そのような変異体グリアジン蛋白質の断片を提供する。
【００２９】
本発明は、上で定義された蛋白質又は断片をコードするコーディング配列を含むポリヌクレオチドも提供する。
【００３０】
本発明は、上で定義されたポリヌクレオチドを含む細胞又はそのようなポリヌクレオチドにより形質転換された細胞も提供する。
【００３１】
本発明は、上で定義されたＴ細胞受容体を発現する哺乳類も提供する。
【００３２】
本発明は、個体においてセリアック病を診断するか又はセリアック病に対する感受性を診断する方法も提供し、ａ）ｉ）配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６、及びそれらの均等物からなる群から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチド；及びｉｉ）ｉ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることができ、且つ５０アミノ酸の長さを超えない、ｉ）の類似体；及びｉｉｉ）任意に、ｉ）及びｉｉ）から選択される薬剤に加えて、配列番号：１及び配列番号：２から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチドから選択される少なくとも一つの薬剤を宿主に投与し；そしてｂ）サンプル中のＴ細胞が薬剤を認識するか否かをインビトロにて決定して、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示すことを含む。
【００３３】
本発明は、組成物がセリアック病を引き起こすことができるか否かを決定する方法も提供し、トランスグルタミナーゼによりオリゴペプチド配列に修飾され得る蛋白質が組成物中に存在するか否かを決定することを含み、蛋白質の存在が、組成物がセリアック病を引き起こし得ることを示す。
【００３４】
本発明は、上で定義された薬剤を認識するＴ細胞のアンタゴニストを同定する方法も提供し、候補物質をＴ細胞と接触させ、そして当該物質がＴ細胞が抗原特異的応答を受ける能力の低下を引き起こすか否かを決定することを含み、上記能力のそのようなあらゆる低下の検出が、上記物質がアンタゴニストであることを示す。
【００３５】
本発明は、上記の方法の何れかを実施するためのキットも提供し、上で定義された薬剤及びＴ細胞によるペプチドの認識を検出する手段を含む。
【００３６】
本発明は、セリアック病の治療用の生成物を同定する方法も提供し、セリアック病を有するか又はセリアック病に感受性の候補物質を哺乳類に投与し、そして物質が哺乳類においてセリアック病を予防又は治療するか否かを決定することを含み、セリアック病の予防又は治療が、当該物質が治療用生成物であることを示す。
【００３７】
本発明は、上で定義されたコーディング配列によりコードされる蛋白質の生産のためのプロセスも提供し、ａ）上記蛋白質の発現を可能にする条件下で上記細胞を培養し；そして、ｂ）発現された蛋白質を回収することを含む。
【００３８】
本発明は、トランスジェニック植物細胞を得るための方法も提供し、トランスジェニック植物細胞を供給するために上で定義されたベクターにより植物を形質転換することを含む。
【００３９】
本発明は、初代トランスジェニック植物を得るための方法も提供し、トランスジェニック植物を提供するために上で定義されたベクターにより形質転換されたトランスジェニック植物細胞を再生することを含む。
【００４０】
本発明は、トランスジェニック植物の種子を得るための方法も提供し、上で定義されたとおりに取得可能なトランスジェニック植物からトランスジェニック種子を得ることを含む。
【００４１】
本発明は、トランスジェニック子孫植物を得るための方法も提供し、上で定義された方法により取得可能な初代トランスジェニック植物から第２世代のトランスジェニック子孫植物を得て、そして任意に、そうして得られた第２世代の子孫から一つ又はそれ以上の世代のトランスジェニック植物を得ることを含む。
【００４２】
本発明は、上記の方法の何れかにより取得可能な、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子又は子孫植物も提供する。
【００４３】
本発明は、上記の植物細胞を含むトランスジェニック植物又は植物種子も提供する。
【００４４】
本発明は、上で定義されたトランスジェニック植物細胞、初代植物、植物種子又は子孫から取得可能な上記植物細胞を含む、トランスジェニック植物細胞カルスも提供する。
【００４５】
本発明は、収穫生成物を得るための方法も提供し、上記の方法の何れかに従い植物から収穫生成物を回収し、そして任意にさらに回収された生成物を加工することを含む。
【００４６】
本発明は、上で定義された蛋白質を含む食物も提供する。
発明の詳細な説明
用語「セリアック病」は、グルテンの感度を変更することにより引き起こされる症状の範囲を包含し、小腸の粘膜により特徴付けられる重度の形態（過形成絨毛萎縮）及び温和な兆候により特徴付けされる他の形態を含む。
【００４７】
上で言及された個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）（診断又は治療のコンテクストにおいて）はヒトである。彼らはセリアック病を有するか（兆候があるか又は無兆候）又はそれを有する疑いがある。彼らはグルテンダイエット中であってよい。彼らは急性の相の応答にあってよい（例えば、彼らはセリアック病を有してよいが、彼らがグルテンフリーダイエットを１４から２８日間行って最後の２４時間はグルテンのみを摂取した）。
【００４８】
個体は、セリアック病に感受性であってよく、例えば遺伝的に感受性であってよい（例えば、セリアック病の親戚を有するか又はセリアック病に対する疾病素因を引き起こす遺伝子を所有する個体により決定される）。
薬品
薬品は、典型的にはペプチドであり、例えば７から５０アミノ酸の長さ、例えば１０から４０、又は１５から３０アミノ酸の長さである。
【００４９】
配列番号：１はＰＱＰＥＬＰＹである。配列番号：２はＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＳである。配列番号：３は表１に示され、そしてＡ−グリアジンの全配列である。配列番号：１の４位（配列番号：２の９位に均等）のグルタミン酸は、Ａ−グリアジンのトランスグルタミナーゼ処理により生成される。
【００５０】
薬品は、配列番号：１又は２により表されるペプチド又はグリアジン蛋白質由来の単離されたオリゴペプチドである配列番号：１を含む配列を含むエピトープ；又は配列番号：３の相同体である天然のグリアジン蛋白質からのこれら配列の均等物であってよい。即ち、上記エピトープは配列番号：３により表される蛋白質の誘導体であってよい。そのような誘導体は、典型的には、グリアジンの断片、又は蛋白質全体又は断片の変異誘導体である。よって、発明のエピトープは、この天然のグリアジン蛋白質全体を含まず、そして他の天然のグリアジン全体を含まない。
【００５１】
上記エピトープは、即ち、Ａ−グリアジンの断片（例えば、配列番号：３）であり、配列番号：１の配列を含み、トランスグルタミナーゼにより処理すること（完全又は部分的）により得られるものであって、即ち、１、２、３又はそれ以上のグルタミンがグルタミン酸に置換されている（配列番号：１内での置換を含む）。
【００５２】
そのような断片は、表１に示す配列番号：３の５５から７０、５８から７３、６１から７７位により表される配列であるか又はそれらの配列を含んでよい。典型的には、そのような断片は、配列番号：１又は２により表されるペプチドがセリアック病の患者からのサンプルを用いて本明細書にて記載されたアッセイの何れかにおいて認識されるのと少なくとも同じ程度にてＴ細胞により認識される。
【００５３】
さらに、上記薬品は、配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６の何れかにより表されるペプチド、又は配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６の何れかに相当する配列を含む蛋白質（例えば、グリアジンをトランスグルタミナーゼで処理した後に配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６の何れかを含むグリアジンの断片）。そのような配列の生物学上活性な断片も発明の薬品である。配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６又はこれらの配列の類似体の何れかの配列均等物も、発明の薬品である。
【００５４】
上記エピトープが別のグリアジン（例えば、本明細書にて言及されたグリアジン蛋白質の何れか又はセリアック病を引き起こす何れかのグリアジン）由来の上記エピトープ（断片を含む）に均等な配列を含む場合、そのような均等配列は、トランスグルタミナーゼにより典型的に処理された（完全又は部分的）グリアジン蛋白質の断片に相当する。他のグリアジン蛋白質の配列を、オリジナルのエピトープが由来するグリアジン、例えば、配列番号：３と整列させる（ａｌｉｇｎｉｎｇ）ことにより（例えば、本明細書にて言及されたプログラムの何れかを用いて）、そのような均等ペプチドを決定することができる。トランスグルタミナーゼは市販されている（Ｓｉｇｍａ Ｔ−５３９８）。表４は、適当な均等配列の僅かな例を提供する。
【００５５】
類似体である薬品は、（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴＣＲにより認識され得る。よって、一般には、上記類似体が（ｉ）又は（ｉｉ）の存在下、典型的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、本明細書にて言及されたＡＰＣｓの何れか）の存在下でも、Ｔ細胞に添加された場合、当該類似体は（ｉ）又は（ｉｉ）とそのような系において競合し得る。
【００５６】
上記類似体は（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴＣＲを結合することができるものであってよい。そのような結合は、標準の技術により試験することができる。そのようなＴＣＲｓは（例えば、本発明の方法を用いて）（ｉ）又は（ｉｉ）を認識することが示されたＴ細胞から単離することができる。上記類似体のＴＣＲｓへの結合の証明は、類似体に結合する物質、例えば類似体に対する抗体への類似体の結合をＴＣＲｓが阻害するか否かを決定することにより、のちに示すことができる。典型的には、上記類似体は、結合アッセイのそのような阻害においてクラスＩＩ ＭＨＣ分子（例えば、ＨＬＡ−ＤＱ２）に結合する。
【００５７】
典型的には、上記類似体は（ｉ）又は（ｉｉ）のＴＣＲへの結合を阻害する。この場合、類似体存在下でＴＣＲを結合できる（ｉ）又は（ｉｉ）の量は低下する。これは、類似体がＴＣＲを結合し、よってＴＣＲへの結合に関して（ｉ）又は（ｉｉ）と競合するためである。
【００５８】
上記の結合実験に使用するための細胞は、セリアック病の患者から、例えば本発明の方法を用いて単離することができる。
【００５９】
類似体の他の結合特性は（ｉ）又は（ｉｉ）のそれと同じであってよく、即ち典型的には、類似体はペプチドが結合するのと同じＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する（ＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８）。類似体は、典型的には（ｉ）又は（ｉｉ）に特異的な抗体に結合し、即ち、（ｉ）又は（ｉｉ）のそのような抗体への結合を阻害する。
【００６０】
類似体は、典型的にはペプチドである。それは、（ｉ）又は（ｉｉ）と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を、例えば少なくとも１５又はそれ以上（例えば類似体及び／又は（ｉ）又は（ｉｉ）の完全長、又はＴＣＲに接触するか又はＭＨＣ分子を結合する領域にわたり）連続するアミノ酸の領域にわたり有してよい。蛋白質の相同性を測定する方法は当業界公知であり、当業者には本コンテクストにおいて、相同性がアミノ酸同一性に基づいて計算されることが理解される（ときに、「ハードな相同性」と呼ばれる）。
【００６１】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは相同性を計算するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している（例えば、そのデフォルトセッティングに使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは相同性を計算するか又は配列をラインアップするのに使用することができ（典型的にはそれらのデフォルトセッティング上で）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ ２１５：４０３−１０に記載されるとおりである
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、例えば、「ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／」においてインターネットを通して全世界のウエブ上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中で同じ長さのワードと並べられたときに幾つかの正の値の閾値スコアに適合するか又は当該値を満たす質問配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高いスコアリングの配列対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値を意味する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，前出）。これらの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含むＨＳＰｓを見つけるための検索を始めるための種として作用する。蓄積したアラインメントスコアがその最大に達成された値から量Ｘだけ低下する場合；一つ又は複数の負のスコアリング剰余アラインメントの蓄積のため、蓄積したスコアがゼロ又はそれ以下になった場合；又は何れかの配列の末端に到達した場合、各方向におけるワードヒットに関する延長が停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ，Ｔ及びＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして１１のワードの長さ（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１を参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ），Ｍ＝５，Ｎ＝４，及び両方の鎖の比較を用いる。
【００６２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列の間の類似性の統計分析を実施する；例えば、Ｌａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間で偶然に適合する確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比較において最小合計確率が約１より低く、好ましくは約０．１より低く、より好ましくは約０．０１より低く、そしてもっと好ましくは約０．００１より低いなら、配列が他方の配列に類似であると考えられる。
【００６３】
相同なペプチド類似体は、（ｉ）又は（ｉｉ）と１、２、３、４、５、６、７、８又はそれより多い変異だけ異なるのが典型である（置換、欠失又は挿入であってよい）。これらの変異は、相同性を計算することに関して上記の領域の何れかを横切って測定されてよい。置換は、好ましくは「保存的」である。これらは以下の表により定義される。第２列の同じブロックのアミノ酸、及び好ましくは第３の列の同じラインのアミノ酸を、互いに置換してよい。
【００６４】
【表１】
【００６５】
典型的には、ＭＨＣ分子を結合するのに寄与するか又はＴＣＲによる認識に必須の、（ｉ）又は（ｉｉ）中のアミノ酸に均等な位置における類似体中のアミノ酸は同じか又は保存されている。
【００６６】
典型的には、類似体ペプチドは一つ又は複数の修飾を含み、天然の翻訳後修飾又は人工修飾であってよい。修飾は科学的なモイエティ（典型的には、例えばＣ−Ｈ結合の水素の置換による）、例えばアミノ、アセチル、ヒドロキシ又はハロゲン（例えば、フッ素）基又は糖質基を提供してよい。典型的には、修飾はＮ又はＣ末端上に存在する。
【００６７】
類似体は、一つ又は複数の天然アミノ酸、例えば天然アミノ酸とは側鎖が異なるアミノ酸を含んでよい。一般に、非天然アミノ酸はＮ末端及び／又はＣ末端を有する。非天然アミノ酸はＬ−又はＤ−アミノ酸であってよい。
【００６８】
類似体は、典型的には、（ｉ）又は（ｉｉ）と実質類似の形態、サイズ、柔軟性又は電子配置を有する。それは、典型的には、（ｉ）又は（ｉｉ）の誘導体である。一つの態様において、類似体は、配列番号：１又は２の配列を含む融合蛋白質であるか又は本明細書にて言及された他のペプチドの何れか；及び非グリアジン配列である。
【００６９】
一つの態様において、類似体は、ＭＨＣクラス分子に結合した（ｉ）又は（ｉｉ）であるか、又は、を模倣する。２、３、４、又はそれ以上のそのような複合体を、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンに基づく系を用いて互いに対合させるか又は結合させてよく、典型的には２、３、又は４つのビオチン標識ＭＨＣ分子がストレプトアビジンモイエティに結合する。この類似体は、典型的には、（ｉ）又は（ｉｉ）／ＭＨＣクラスＩＩ分子のＴＣＲ又は当該複合体に特異的な抗体への結合を阻害する。
【００７０】
類似体は、典型的には、抗体又は抗体の断片、例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ）２断片である。類似体は固相上に固定化され、特に、ＭＨＣ分子に結合したペプチドを模倣する類似体の場合である。
【００７１】
類似体は、典型的には、コンピューター手段によりデザインされて、当業界公知の方法を用いて合成される。或いは、類似体は、化合物のライブラリーから選択できる。ライブラリーはコンビナトリアルライブラリー、ディスプレイライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーであってよい。化合物のライブラリーはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した形態、例えばＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８においてディスプレイライブラリー中で発現されてよい。類似体は、一般に、結合特性（ｉ）又は（ｉｉ）を模倣するそれらの能力に基づいてライブラリーから選択される。即ち、それらはＴＣＲ又は（ｉ）又は（ｉｉ）を認識する抗体を結合する能力に基づいて選択してよい。
【００７２】
典型的には、類似体は、薬剤（ｉ）又は（ｉｉ）の何れかと少なくとも同じ程度、例えば均等なエピトープと少なくとも同じ程度まで、好ましくは配列番号：２により表されるペプチドと同じ程度までＴ細胞により認識され、本明細書にて記載されたアッセイの何れかにおいて認識され、典型的には、セリアック病の患者由来の細胞を用いる。類似体は、インビボにおいてこれらの程度まで認識されてよく、即ち、本明細書にて言及された薬剤の何れかと少なくとも同じ程度までセリアック病の兆候を誘導することができてよい（例えば、ヒト患者又は動物モデルにおいて）。
【００７３】
類似体は、発明のエピトープを認識するＴ細胞受容体により候補の物質が認識されるか否かを決定することを含み、物質の認識が物質が類似体を認識することを示す方法において同定されてよい。そのようなＴＣＲｓは本明細書にて言及されたＴＣＲｓの何れかであってよく、Ｔ細胞上に存在してよい。本明細書にて言及された如何なる適切なアッセイも類似体を同定するのに使用することができる。一つの態様において、この方法はインビボにおいて実施される。上記のとおり、好ましい類似体はペプチド配列番号：２と少なくとも同じ程度まで認識され、よって、上記の方法はこの程度まで認識される類似体を同定するのに使用してよい。
【００７４】
一つの態様において、上記方法は、発明のエピトープの認識を候補配列が阻害するか否かを決定することを含み、認識の阻害が、物質が類似体であることを示す。
【００７５】
上記薬剤は、（ｉ），（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）により定義される少なくとも２、５、１０又は２０の薬剤を含む生成物であってよい。典型的には、上記組成物は、異なるグリアジン、例えば本明細書にて言及されたグリアジンの種又はバラエティ又は種類の何れかからの発明のエピトープ（又は均等な類似体）を含む。好ましい組成物は、本明細書にて言及された種又はバラエティの何れかの中に存在するグリアジンのすべて、又は２、３、４、又はそれ以上の本明細書にて言及された種からの（コムギ、ライムギ、オオムギ、エンバク、及びライコムギからなる群から選択される種のパネルから）、発明の少なくとも一つのエピトープ、又は均等類似体を含む。即ち、薬剤は単価又は多価であってよい。
診断
上記のとおり、発明の診断方法は、薬剤を結合するＴ細胞の検出又は薬剤を認識する抗体の検出に基づいてよい。
【００７６】
上記の方法（上記の使用を含む）において薬剤を認識するＴ細胞は、一般に、インビボにおいて予めグリアジンに対して感作されたＴ細胞である。上記のとおり、そのような抗原−経験Ｔ細胞は、末梢血中に存在することがわかった。
【００７７】
上記の方法において、Ｔ細胞はインビトロ又はインビボにおいて薬剤と接触させることができ、そしてＴ細胞が薬剤を認識するか否かを決定することをインビトロ又はインビボにて実施することができる。即ち、発明は、ヒトのからだで実施される診断方法においての使用のための薬剤を提供する。異なる薬剤が、そのような方法における、同時、別々、又は連続の使用のために提供される。
【００７８】
インビトロの方法は、薬剤が添加された水性溶液内で実施されるのが典型である。当該溶液はＴ細胞も含む（及び特定の態様においては、以下に論じられるＡＰＣｓも）。本明細書にて使用される用語「接触させる」は、特定の物質を溶液に加えることを含む。
【００７９】
Ｔ細胞が薬剤を認識するか否かを決定することは、一般には、薬剤の存在下でＴ細胞の状態の変化を検出するか、又はＴ細胞が薬剤を結合するか否かを決定することにより、達成される。状態の変化は、一般に、ＴＣＲが薬剤に結合した後に、Ｔ細胞の抗原特異的機能活性により引き起こされる。状態の変化は、Ｔ細胞の内部（例えば、蛋白質の細胞内発現の変化）又は外部（例えば、分泌された配列の検出）で測定してよい。
【００８０】
Ｔ細胞の状態の変化は、Ｔ細胞からの物質、例えばサイトカイン、特にＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＴＮＦ−αの分泌の開始又は増加であってよい。ＩＦＮ−γの分泌の決定が特に好ましい。当該物質は、特異的結合薬剤へのそれの結合を可能にさせ、次に特異的結合薬剤／物質の複合体の存在を測定することにより検出されるのが典型である。特異的結合薬剤は、典型的には、抗体、例えばモノクローナル抗体である。サイトカインに対する抗体は、市販されており、或いは標準技術を用いて作成することができる。
【００８１】
典型的には、特異的結合薬剤は、固相支持体上に固定化される。物質を固相支持体上に固定化させた後に、任意に洗浄することにより、薬剤に非特異的に結合した物質を除去することができる。薬剤／物質複合体は複合体を結合する第２の結合薬剤を用いることにより検出してよい。典型的には、第２薬剤は、第１薬剤を結合する部位とは異なる部位において物質を結合する。第２薬剤は、好ましくは抗体であり、そして、検出可能な標識により直接又は間接に標識される。
【００８２】
即ち、第２薬剤は、検出可能な標識により直接又は間接に典型的には標識された第３薬剤により検出してよい。例えば、第２薬剤はビオチンモイエティを含んでよく、ストレプトアビジンモイエティ及び典型的にはアルカリホスファターゼを検出可能な標識として含む第３の薬剤による検出を可能にさせる。
【００８３】
一つの態様において、使用される検出系は、ＷＯ９８／２３９６０に記載されたエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。そのアッセイにおいて、Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮ−γは、固相支持体に固定化された第１のＩＦＮ−γ特異的抗体により結合される。結合されたＩＦＮ−γは、次に、検出可能な標識により標識された第２のＩＦＮ−γ特異的抗体を用いて検出される。そのような標識された抗体はＭＡＢＴＥＣＨ（ストックホルム、スエーデン）から得ることができる。使用可能な他の検出可能な標識は以下に論じられる。
【００８４】
測定され得るＴ細胞の状態の変化は、Ｔ細胞による物質の取り込み、例えばチミジンの取り込みの増加であってよい。状態の変化は、Ｔ細胞のサイズ、又はＴ細胞の増殖の増加、又はＴ細胞上の細胞表面マーカーの変化であってよい。
【００８５】
一つの態様において、状態の変化は、蛋白質の細胞内発現の変化、例えば上記サイトカインの何れかの細胞内発現の増加を測定することにより、検出される。そのような細胞内変化は、特定の様式にて発現された蛋白質を結合するモイエティにＴ細胞内部を接触させることにより検出してよく、フローサイトメトリーによるＴ細胞の分離を可能にさせる。
【００８６】
一つの態様において、ＴＣＲを結合するとき、薬剤はＭＨＣクラスＩＩ分子（典型的にはＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８）に結合し、典型的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に存在する。しかしながら、本明細書にて言及されたとおり、他の薬剤はＭＨＣ分子にも結合する要求なしにＴＣＲを結合することができる。
【００８７】
一般に、上記の方法において接触させたＴ細胞は固体の血液から採取されるが、Ｔ細胞を含む他の種類のＴ細胞を使用することができる。サンプルは、直接アッセイに添加するか又は最初に加工してよい。典型的には、加工は、例えば、水又はバッファーによるサンプルの希釈を含んでよい。典型的には、サンプルを１．５から１００倍、例えば２から５０倍又は５から１０倍希釈する。
【００８８】
加工は、サンプルの成分の分離を含んでよい。典型的には、単核細胞（ＭＣｓ）をサンプルから分離する。ＭＣｓはＴ細胞とＡＰＣｓを含むことになる。即ち、上記の方法において、分離されたＭＣｓ内に存在するＡＰＣｓは上記ペプチドをＴ細胞上に提示し得る。別の態様においては、Ｔ細胞のみ、例えばＣＤ４ Ｔ細胞のみがサンプルから精製され得る。ＰＢＭＣｓ，ＭＣｓ、及びＴ細胞は、当業界公知の技術、例えばＬａｌｖａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６，ｐ８５９−８６５に記載された技術を用いてサンプルから分離することができる。
【００８９】
一つの態様において、上記のアッセイにおいて使用されるＴ細胞は、未加工の形態であるか、又は希釈されたサンプルであるか、又は新たに単離されたＴ細胞であり（例えば、新たに単離されたＭＣｓ又はＰＢＭＣｓの形態）、エクスビボにて直接使用され、即ち、それらは上記方法において使用される前に培養されない。即ち、Ｔ細胞は抗原特異的様式にてインビトロにおいて再刺激されなかった。しかしながら、Ｔ細胞は、使用の前に、例えば一つ又は複数の薬剤及び一般には外来の成長促進サイトカインの存在下で培養することができる。培養の間、薬剤は典型的にはＡＰＣｓ，例えば上記方法で使用されるＡＰＣの表面上に存在する。Ｔ細胞の前培養は上記方法の感度の増加を導くかもしれない。即ち、Ｔ細胞は、細胞系、例えば短期間の細胞系に変換することができる（例えば、Ｏｔａ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６，ｐ１８３−１８７に記載されたとおり）。
上記の方法に典型的に存在するＡＰＣはＴ細胞と同じ個体から又は別の宿主からであってよい。ＡＰＣは天然のＡＰＣ又は人工のＡＰＣであってよい。ＡＰＣは上記ペプチドを細胞に提示することができる細胞である。それは典型的にはＢ細胞、樹状細胞又はマクロファージである。それは典型的にはＴ細胞と同じサンプルから分離され、典型的にはＴ細胞と同時精製される。即ち、ＡＰＣはＭＣｓ又はＰＢＭＣｓ上に存在してよい。ＡＰＣは典型的には新たに単離されたエクスビボ細胞又は培養細胞である。それは細胞系の形態、例えば短期間細胞系又は不死の細胞系であってよい。ＡＰＣはその表面上に空のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現してよい。
【００９０】
上記の方法において、一つ又は複数の（異なる）薬剤を使用してよい。典型的には、サンプル由来のＴ細胞をアッセイ中において試験を意図する全ての薬剤と共に置くことができるか、又は各々が一つ又は複数の薬剤を含む別々のアッセイ中に分配して置くことができる。
【００９１】
本発明は、同時、分離又は連続用途のための（例えばインビボ用途）本明細書にて言及された薬剤の何れか２つ又はそれ以上のような薬剤も提供する（例えば、上で論じられた組成物中に存在する薬剤の組み合わせ）。
【００９２】
一つの態様においては、薬剤それ自体を直接Ｔ細胞及びＡＰＣｓを含むアッセイに加える。上で論じられたとおり、そのようなアッセイにおいてＴ細胞とＡＰＣｓはＭＣｓの形態であり得る。ＡＰＣｓによる提示に関する要求なしにＴ細胞により認識され得る薬剤を用いる場合、ＡＰＣｓは必要ない。ＭＨＣ分子に結合させたオリジナルの（ｉ）又は（ｉｉ）を模倣した類似体がそのような薬剤の例である。
【００９３】
一つの態様において、上記薬剤はＴ細胞の不在下でＡＰＣに提供される。ＡＰＣは次に、典型的には薬剤をその表面に提示させた後に、Ｔ細胞に提供される。上記ペプチドはＡＰＣの内部に拾い上げられて提示されるか、又はＡＰＣの内部に入り込まずに単に表面上に拾い上げられる。
【００９４】
薬剤がＴ細胞と接触する期間は、ペプチドの認識を決定するのに使用される方法しだいで変更される。典型的には１０５から１０７、好ましくは５ｘ１０５から１０６のＰＢＭＣを各アッセイに添加する。薬剤を直接アッセイに添加する場合、その濃度は１０−１から１０−３μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から５０μｇ／ｍｌ又は１から１０μｇ／ｍｌである。
【００９５】
典型的には、Ｔ細胞を薬剤とインキュベートする時間の長さは、４から２４時間、好ましくは６から１６時間である。エクスビボにてＰＢＭＣを使用する場合、０．３ｘ１０６のＰＢＭＣｓを１０μｇ／ｍｌのペプチド中で１２時間３７℃においてインキュベートできることを発見した。
【００９６】
Ｔ細胞による薬剤の認識の決定は、薬剤のＴ細胞への結合を測定することにより行ってよい（これは本明細書にて論じられる何れかの適当な結合アッセイを用いて実施できる）。典型的には、薬剤を結合するＴ細胞は、例えばＦＡＣＳマシンを用いてこの結合に基づいて細胞を分離することができる。薬剤を認識するＴ細胞の存在は、薬剤を用いて分離される細胞の頻度が「対照」値を超える場合に生じるとみなされる。抗原を経験したＴ細胞の頻度は１０６中１から１０３中１であり、よって、分離された細胞が抗原経験Ｔ細胞であるか否かを決定することができる。
【００９７】
Ｔ細胞による薬剤の認識の決定はインビボにおいて測定してよい。典型的には、薬剤を宿に投与して、次に、薬剤の認識を示す応答を測定してよい。薬剤は、典型的には、皮内又は表皮投与である。薬剤は、典型的には、皮膚の外部に接触させることにより投与され、そしてプラスター又は包帯の補助により当該部位に保持されてよい。或いは、薬剤は針により、例えば注射により投与してよいが、他の方法、例えば弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｓ）（例えば、核酸をデリバリーするために使用される弾道技術）により投与することもできる。ＥＰ−Ａ−０６９３１１９は、薬剤を投与するために典型的に使用できる技術を記載する。典型的には、０．００１から１０００μｇ、例えば０．０１から１００μｇ又は０．１から１０μｇの薬剤を投与する。
【００９８】
一つの態様において、インビボにおいて薬剤を提供することができる生成物を投与できる。即ち、薬剤を発現できるポリヌクレオチドを投与することができ、典型的には、薬剤の投与のための上で記載された様式の何れかによる。ポリヌクレオチドは、典型的には、以下に論じられる、発明により提供されるポリヌクレオチドの特性の何れかを有する。典型的には、０．００１から１０００μｇ、例えば０．０１から１００μｇ又は０．１から１０μｇのポリヌクレオチドを投与する。
【００９９】
皮膚に投与される薬剤の認識は、典型的には、投与部位における炎症の発症により示唆される（例えば、硬化、紅斑又は浮腫）。これは、一般に、当該部位における目視試験により判断される。
【０１００】
薬剤を結合する抗体の検出に基づく診断法は、典型的には、個体からのサンプル（本明細書にて言及されたサンプルの何れかで、任意に本明細書にて言及された様式の何れかにより加工された）を薬剤と接触させ、そしてサンプル中の抗体が薬剤を結合するか否かを決定することにより実施され、そのような結合が、個体がセリアック病を有するか又は感受性であるかを示す。結合アッセイのあらゆる適当なフォーマット、例えば本明細書にて言及されたあらゆるそのようなフォーマットを使用してよい。
治療
本明細書にて記載された免疫上優勢なエピトープ及び他のエピトープの同定は、このエピトープを認識するＴ細胞を標的とする治療用生成物が作成されるのを可能にさせる（そのようなＴ細胞はグリアジンに対する免疫応答に参加するものである）。これらの発見は、抗体又はエピトープに対するＴ細胞応答を抑圧（寛容）することによりセリアック病の予防又は治療を可能にもする。
【０１０１】
発明の特定の薬剤は、発明のエピトープを認識するＴＣＲを結合し（上で論じられた結合アッセイの何れかを用いて測定されるとおり）、そしてＴＣＲを有するＴ細胞の寛容を導く。そのような薬剤は、任意にキャリアーと共に、従ってセリアック病を予防又は治療するのに使用することができる。
【０１０２】
一般に、寛容は、（ＴＣＲによりされた後に）Ｔ細胞の抗原特異的機能活性を導き得る同じペプチドにより導かれ得る（例えば、本明細書にて言及されたそのような活性、例えばサイトカインの分泌）。そのような薬剤は「寛容」コンテクストにおいて免疫系に対して提示される時に寛容を導く。
【０１０３】
寛容は免疫系によるＴ細胞又は抗体エピトープの認識の低下を導く。Ｔ細胞エピトープの場合、これは、エピトープを認識するＴ細胞の欠失又はアネルギーにより導かれ得る。即ち、エピトープに応答するＴ細胞活性（例えば、本明細書にて言及された適当なアッセイにおいて測定されたとおり）が低下する。抗体応答の寛容は、エピトープが投与されたときに、エピトープに対する特異的抗体の量の低下が生じることを意味する。
【０１０４】
そのようなコンテクストにおいて免疫系に対して抗原を提示する方法は公知であり、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ８２，２０７−２１５（１９９７），Ｔｈｕａｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９，３７０−６（１９９７）、及びＷｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，５２８−３３（１９９７）に記載されている。特に、特別の投与経路が寛容を導き得て、例えば、経口、鼻内又は腹膜内である。寛容は樹状細胞及びテトラマー提示ペプチドにより達成してもよい。寛容を導く特定の生成物を個体に投与してよい（例えば、薬剤も含む組成物中で）。そのような生成物は、サイトカイン、例えばＴｈ２応答を好むサイトカインを含む（例えば、ＩＬ−４，ＴＧＦ−β又はＩＬ−１０）。生成物又は薬剤は、寛容を導く用量にて投与してよい。
【０１０５】
発明は、Ｔ細胞のアンタゴニストとして作用することができる配列を含む蛋白質を提供する（そのＴ細胞は薬剤を認識する）。そのような蛋白質及びそのようなアンタゴニストはセリアック病を予防又は治療するのに使用することもできる。アンタゴニストはＴ細胞応答の低下を導く。一つの態様において、アンタゴニストはＴ細胞のＴＣＲに結合する（一般に、ＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８との複合体の形態にて）が、正常な機能活性化を導く代わりに、Ｔ細胞内シグナリングカスケードを通して異常なシグナルを通過させることを導き、Ｔ細胞が低下した機能活性を持つように導く（例えば、エピトープの認識に応答して、典型的には本明細書にて言及された適当なアンタゴニストの何れかにより測定される）。
【０１０６】
一つの態様において、アンタゴニストはエピトープとＭＨＣプロセシング及び提示の経路の成分への結合、例えばＭＨＣ分子（典型的には、ＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８）に関して競合する。即ち、アンタゴニストは、ＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８（即ち、このＭＨＣ分子により提示されるペプチドである）、例えばペプチドＴＰ（表１０）又はその相同体を結合してよい。
【０１０７】
拮抗作用を導く方法は、当業界公知である。一つの態様において、アンタゴニストは上で言及されたエピトープの相同体であり、そして配列の何れか、結合又は薬剤の他の特性を有してよい（特に、類似体）。アンタゴニストは、典型的には、上記のエピトープの何れかとは（Ｔ細胞内で正常な抗原特異的機能を導くことができる）、１、２、３、４又はそれ以上の変異だけ（各々は置換、挿入又は欠失であってよい）異なる。そのようなアンタゴニストは当業界において「変更されたペプチドリガンド」又は「ＡＰＬ」と呼ばれる。変異は、典型的には、ＴＣＲに接触するアミノ酸位置においてである。
【０１０８】
アンタゴニストはＡ−グリアジンのアミノ酸６５から６７により表される配列に均等な配列内の置換によりエピトープと異なってよい（表９に示すようなアンタゴニスト）。即ち、好ましくは、アンタゴニストは６４、６５又は６７位の均等なものにおいて置換を有する。好ましくは、置換は、６４Ｗ，６７Ｗ，６７Ｍ又は６５Ｔである。
【０１０９】
個体における発明のエピトープに対するＴ細胞の免疫応答はポリクローナルであるから、１より多いアンタゴニストが投与されることにより、異なるＴＣＲｓを有する応答のＴ細胞の拮抗作用を導いてよい。よって、アンタゴニストは少なくとも２、４、６又はそれより多いアンタゴニストを含む組成物中で投与されてよく、各々が異なるＴ細胞と拮抗する。
【０１１０】
発明は、（上記薬剤を認識する）Ｔ細胞のアンタゴニストを同定する方法も提供し、候補物質をＴ細胞と接触させ、そしてＴ細胞が抗原特異的応答を経る能力の低下を当該物質が導くか否かを検出することを含み（例えば、本明細書にて言及された何れかの適当なアンタゴニストを用いて）、上記能力のあらゆるそのような低下の検出が物質がアンタゴニストであることを示す。
【０１１１】
一つの態様において、アンタゴニスト（特定のエピトープに対する複数のアンタゴニストの組み合わせを含む）又は寛容（Ｔ細胞及び抗体寛容）薬剤は、発明の異なるエピトープに対して、例えば１より多い物質を含む生成物である薬剤に関して上で論じられたエピトープの組み合わせに対して、拮抗するか又は寛容する少なくとも２、４、６又はそれより多いアンタゴニスト又は薬剤を含む組成物中に存在する。
組成物がセリアック病を引き起こすか否かを試験する
上で論じられたとおり、発明は、組成物がセリアック病を引き起こすことができるか否かを決定する方法を提供し、トランスグルタミナーゼにより発明の薬剤又はエピトープを含む配列に修飾され得る蛋白質配列の存在を検出することを含む（そのようなトランスグルタミナーゼ活性はヒトの腸のトランスグルタミナーゼ活性であってよい）。典型的には、これは、特定の様式にて配列に結合するモイエティを組成物に接触させる結合アッセイを用いて実施され、そして配列／モイエティ複合体の形成を検出して薬剤の存在を確認するのに使用する。そのようなモイエティは、本明細書にて言及された何れかの適当な物質（又は物質の種類）であってよく、そして典型的には特異的抗体である。結合アッセイのあらゆる適当なフォーマットを使用することができる（例えば、本明細書にて言及されたもの）。
【０１１２】
一つの態様において、上記組成物を、異なるグリアジン由来の発明のエピトープに特異的な少なくとも２、５、１０又はそれより多い抗体、例えば、１よりも多い物質を含む生成物である発明の薬剤に関して上で論じられたエピトープの組み合わせを認識することができる抗体のパネルに接触させる。
【０１１３】
上記組成物は、典型的には、セリアック病を引き起こし得るグリアジンを発現する植物由来の材料を含む（例えば、本明細書にて言及されたグリアジン又は植物の何れも）。そのような材料は植物の一部、例えば収穫された作物（例えば、種子）であってよい。材料は植物材料の加工された生成物（例えば、本明細書にて言及されたあらゆるそのような生成物）、例えばグリアジンを含む穀粉又は食物であってよい。食物材料の加工及び適当な結合アッセイにおける試験は日常的であり、例えばＫｒｉｃｋａ ＬＪ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．１３，１８９−９３（１９９８）に言及されたとおりである。
結合アッセイ
本明細書にて言及された２つの物質間の結合の決定は、結合に際して変化する一方又は両方の物質の特性、例えば分光学上の変化を測定することにより実施してよい。
【０１１４】
結合アッセイフォーマットは「バンドシフト」系であってよい。これは、一つの物質（例えば、候補物質）の存在がゲル電気泳動の間に他の物質の進行を進めさせるか又は遅らせるかを決定することを含む。
【０１１５】
上記フォーマットは、一つの物質が他の物質、例えば特異的抗体に結合することが知られている薬剤に対する他の物質の結合を阻害できるか否かを決定する、競合結合法であってよい。
変異体グリアジン蛋白質
発明は、本発明の配列又はそのような配列を提供するためにトランスグルタミナーゼにより修飾され得る配列が変異することによりもはやエピトープを認識するＴ細胞応答を導かないか又はエピトープを認識するＴ細胞応答により認識されないような、グリアジン蛋白質を提供する。このコンテクストにおいて、用語認識はＴ細胞の正常な（非拮抗）抗原−特異的機能活性が生じるような様式におけるエピトープのＴＣＲ結合を意味する。
【０１１６】
他のグリアジンにおいて均等なエピトープを同定する方法は、上で論じられている。変異したグリアジンの野生型は、セリアック病を引き起こすものである。そのようなグリアジンは、例えば配列番号：３の全域又は配列番号：３の１５、３０、６０、１００又は２００の連続するアミノ酸にわたり上記の程度（類似体に関して）、配列番号：３に相同性を有してよい。同様に、他の非−Ａ−グリアジンに関しては、そのグリアジンの変異体と天然形態の間に相同性が存在することになる。他の天然グリアジン蛋白質の配列は当業界公知である。
【０１１７】
変異したグリアジンはセリアック病を引き起こさないか、又はセリアック病の兆候の低下を導く。典型的には、エピトープがＴ細胞応答を誘導する能力を変異が低下させる。変異したエピトープはＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８に対する低下した結合、ＡＰＣにより提示される能力の低下、又は薬剤を認識するＴ細胞に結合するか又は当該Ｔ細胞により認識される能力（即ち、抗原−特異的機能活性）の低下を有してよい。変異したグリアジン又はエピトープは、よって、発明の診断の側面に関して、本明細書にて言及されたアッセイの何れかにおいて認識を示さないか又は低下した認識を示すことになる。
【０１１８】
上記変異は、上記エピトープ中の１から３、４から６、６から１０、１１から１５又はそれより長い長さの一つ又はそれより多い欠失、付加又は置換であってよく、例えば、配列番号：２の配列にわたるか、配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４及び４６の何れかにわたるか、又はそれらの均等物にわたる。好ましくは、上記変異グリアジンは、配列番号：１の配列内に少なくとも一つの変異を有する。好ましい変異は、Ａ−グリアジン中の６５位である（又は他のグリアジン中の均等な位置）。典型的には、この位置において天然に生じるグルタミンは、表３に示されるアミノ酸の何れか、好ましくはヒスチジン、チロシン、トリプトファン、リジン、プロリン又はアルギニンにより置換される。
【０１１９】
発明は、即ち、グリアジン蛋白質のエピトープ内の変異（本明細書にて論じられる何れかの配列中の変異のそのような変異）の用途も提供し、当該エピトープは本発明のエピトープであり、グリアジン蛋白質がセリアック病を引き起こす能力を低下させる。
【０１２０】
一つの態様において、変異した配列はアンタゴニストとして作用することができる。即ち、発明は、Ｔ細胞受容体に結合することができる配列を含む蛋白質を提供し、Ｔ細胞受容体は発明の薬剤を認識し、そして配列はそのようなＴ細胞受容体を認識するＴ細胞の拮抗作用を導くことができる。
【０１２１】
発明は、上記変異グリアジン蛋白質の断片である蛋白質も提供し、それらは少なくとも１５アミノ酸の長さ（例えば、少なくとも３０、６０、１００、１５０、２００又は２５０アミノ酸長）であり、そしてグリアジンが認識される能力を低下させる上で論じられた変異を含む。上で言及された変異蛋白質の何れも（断片を含む）、例えば他のグリアジン又は非グリアジン蛋白質と融合蛋白質の形態で存在してもよい。
【０１２２】
変異グリアジン蛋白質に対する均等な野生型蛋白質は、典型的には、イネ科の単子葉植物、例えばコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属の植物、例えば、コムギ、ライムギ、オオムギ、エンバク又はライコムギに由来する。蛋白質は、典型的には、α、αβ、γ又はωグリアジンである。グリアジンはＡ−グリアジンであってよい。
キット
発明は、一つ又はそれより多い薬剤、及び任意にＴ細胞による薬剤の検出のための手段を含む、上記方法を実施するためのキットも提供する。典型的には、異なる薬剤を、同時、別々又は連続する使用のために提供する。提供、認識を検出する手段は、上で論じられた技術に基づいて検出を可能にするか又は補助する。
【０１２３】
即ち、上記手段は、認識後にＴ細胞により分泌された物質の検出を可能にしてよい。上記キットは、即ち、物質、例えば抗体のための特異的結合モイエティをさらに含んでよい。当該モイエティは、典型的には、ＩＦＮ−γに特異的である。当該モイエティは典型的には固相支持体に固定化される。これは、モイエティを結合した後に、上記物質がそれを分泌するＴ細胞の付近に残ることを意味する。即ち、物質／モイエティ複合体の「スポット」が支持体上に形成され、各スポットが物質を分泌するＴ細胞を表す。スポットを定量し、そして典型的には対照に対して比較することにより、薬剤の認識の決定を可能にする。
【０１２４】
上記キットは、物質／モイエティ複合体を検出する手段も含む。検出可能な変化、例えば色の変化が、物質を結合後にモイエティ自身に生じる。或いは、第２のモイエティが直接又は間接に検出のために標識され、スポットの決定を可能にするように物質／モイエティ複合体を結合することを可能にしてよい。上で論じられたとおり、第２モイエティは物質に対して特異的であってよいが、第１モイエティとは上記物質に対して異なる部位において結合する。
【０１２５】
固定化された支持体はウエルを有するプレート、例えばマイクロタイタープレートであってよい。各アッセイは、よって、プレート中の別々のウエル内で実施され得る。
【０１２６】
上記キットは、さらに、Ｔ細胞のための培地、検出モイエティ又は検出工程において使用される洗浄バッファーを含んでよい。上記キットは、さらに、サンプルからの分離に適した試薬、例えばサンプルからのＰＢＭＣｓ又はＴ細胞の分離に適した試薬を含んでよい。上記キットは、サンプルの成分の如何なる分離も無しに、サンプルからのＴ細胞の直接の同定を可能にするようにデザインしてよい。
【０１２７】
上記キットは、対照、例えば陽性対照又は陰性対照も含んでよい。陽性対照は検出系が試験されるのを可能にしてよい。即ち、陽性対照は、典型的には、上記方法の何れかにおいて薬剤の認識を模倣する。典型的には、インビトロにおいて認識を決定するためにデザインされたキットにおいては、陽性対照はサイトカインである。薬剤のインビボの認識を検出するためにデザインされたキットにおいては、陽性対照はほとんどの個体が認識すべき抗原であってよい。
【０１２８】
上記キットは、宿主からのＴ細胞を含むサンプル、例えば血液サンプルを採取するための手段も含んでよい。上記キットは、宿主からのサンプルから単核細胞又はＴ細胞を分離するための手段を含んでよい。
ポリヌクレオチド、細胞、トランスジェニック哺乳類及び抗体
発明は、薬剤又は変異グリアジン蛋白質を提供するための発現可能なポリヌクレオチドも提供する。典型的には、当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡで、単鎖又は二重鎖である。当該ポリヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも５０塩基又は塩基対、例えば５０から１００、１００から５００、５００から１０００又は１０００から２０００又はそれより多い塩基又は塩基対を含むことになる。当該ポリヌクレオチドは、よって、配列番号：１又は２又は本明細書にて言及された他の薬剤の何れかの配列をコードする配列を含む。このコーディング配列の５’及び３’に、発明のポリヌクレオチドは対応するグリアジン遺伝子内のこれら配列に対して５’及び３’の配列又はコドンと異なる配列又はコドンを有する。
【０１２９】
上記ペプチドをコードする配列に対して５’及び／又は３’に、上記ポリヌクレオチドはコーディング配列又は非コーディング配列を有する。コーディング配列に対して５’及び／又は３’の配列は、上記薬剤をコードする配列の発現、例えば、転写及び／又は翻訳を助ける配列を含んでよい。上記ポリヌクレオチドは、原核又は真核細胞において上記薬剤を発現することができてよい。一つの態様において、上記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞、例えばヒト、霊長類又は齧歯類（例えば、マウス又はラット）細胞内で上記薬剤を発現することができる。
【０１３０】
発明のポリヌクレオチドは、バックグラウンドを顕著に超えるレベルで配列番号：３をコードするポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズしてよい。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、中から高いストリンジェンシー（例えば、０．０３Ｍ 塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃から約６０℃において）の条件下で達成される。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは当業界公知のあらゆる適切な条件下で実施してよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照）。例えば、高いストリンジェンシーが必要なら、適切な条件は０．２ｘＳＳＣ、６０℃を含む。低いストリンジェンシーが必要なら、適切な条件は２ｘＳＳＣ、６０℃を含む。
【０１３１】
発明の薬剤又は蛋白質は、本明細書にて記載されるポリヌクレオチドによりコードされてよい。
【０１３２】
当該ポリヌクレオチドは、複製可能なベクターを形成するか又はベクターに取り込まれてよい。そのようなベクターは、適当な細胞中で複製することができる。当該ベクターは、発現ベクターであってよい。そのようなベクターにおいて、発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現を提供することができる制御配列に作動可能に連結される。当該ベクターは、選択可能なマーカー、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでよい。
【０１３３】
上記ポリヌクレオチド又はベクターは細胞中に存在してよい。そのような細胞は上記ポリヌクレオチド又はベクターにより形質転換されていてよい。当該細胞は上記薬剤を発現してよい。当該細胞は上記ベクターに適合可能なように選択され、そして、例えば、原核（細菌）、酵母、昆虫又は哺乳類の細胞であってよい。当該ポリヌクレオチド又はベクターは、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、又はエレクトロポレーションを含む慣用技術を用いて宿主細胞に導入されてよい。
【０１３４】
発明は、組換え手段による発明の蛋白質の生産のためのプロセスを提供する。これは、（ａ）蛋白質の発現を可能にさせる条件下で上で定義された形質転換細胞を培養し；そして好ましくは（ｂ）発現されたポリペプチドを回収することを含んでよい。任意に、上記ポリペプチドは、当業界公知の技術により単離され、及び／又は、精製されてよい。
【０１３５】
発明は、そのような認識（又は結合）が可能な薬剤又はその断片を認識する（又は結合する）ＴＣＲｓも提供する。これらは、発明の蛋白質に関して本明細書にて論じられた本明細書にて言及された如何なる形態でも存在し得る（例えば、精製度）。発明は、発明の細胞に関して本明細書にて論じられた如何なる形態でも存在し得る（例えば、精製度）そのようなＴＣＲｓを発現するＴ細胞も提供する。
【０１３６】
発明は、薬剤（例えば、発明のエピトープ）を特異的に認識しそして発明の変異グリアジン蛋白質を認識する（そして典型的には均等な野生型グリアジンを認識しない）薬剤を特異的に認識するモノクローナル又はポリクローナル抗体、及びそのような抗体を作成する方法も提供する。発明の抗体は発明のこれらの物質に特異的に結合する。
【０１３７】
この発明のために、用語「抗体」は、抗体断片、例えば、Ｆｖ，Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ）２断片、並びに一本鎖抗体を含む。
【０１３８】
ポリクローナル抗体を生産する方法は、適当な宿主動物、例えば実験動物を免疫源で免疫し、そして血清からイムノグロブリンを単離することを含む。上記動物は、よって、免疫源を接種されてよく、次に血液を当該動物から採取し、そしてＩｇＧ分画を精製する。モノクローナル抗体を生産する方法は、所望の抗体を生産する細胞を不死にすることを含む。ハイブリドーマ細胞は、接種された実験動物からの脾臓細胞を腫瘍細胞と融合することにより生産してよい（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７）。
【０１３９】
所望の抗体を生産する不死の細胞を慣用の手法により選択してよい。ハイブリドーマは、培養液中で培養されるか、又は腹水液の形成のために腹膜内に注射されるか、又は同種の宿主又は免疫上無防備状態の宿主の血流に注射されてよい。ヒトの抗体は、ヒトリンパ球のインビトロ免疫、続くエプスタイン−バールウイルスによるリンパ球の形質転換により製造してよい。
【０１４０】
モノクローナル抗体は及びポリクローナル抗体はの両方の生産のためには、実験動物は、ヤギ、ウサギ、ラット又はマウスが適している。所望なら、免疫源は、例えばアミノ酸残基の一つの側鎖を通して免疫源が適当なキャリアーにカップリングされるようにコンジュゲートとして投与してよい。得られた抗体は、単離し、そして所望なら精製してよい。
【０１４１】
発明のポリヌクレオチド、薬剤、蛋白質、又は抗体は、検出可能な標識を有してよい。分泌された物質を可視検査により、任意に光学拡大手段の補助により、分泌された物質の検出を可能にする検出可能な手段は、好ましい。そのような系は、典型的には、基質中の色の変化を導く酵素標識に基づき、例えば、基質中の色の変化を導くアルカリホスファターゼである。そのような基質は市販されており、例えば、ＢｉｏＲａｄからである。他の適当な標識は、他の酵素、例えばペルオキシダーゼ、又は蛋白質標識、例えばビオチン；又は放射性標識、例えば３２Ｐ又は３５Ｓを含む。上記の標識は、公知の技術を用いて検出してよい。
【０１４２】
発明のポリヌクレオチド、薬剤、蛋白質、又は抗体は、実質上精製形態であってよい。それらは、製造物中のポリヌクレオチド、ペプチド抗体、細胞又は乾燥塊（ｄｒｙ ｍａｓｓ）の少なくとも８０％、例えば少なくとも９０、９５、９７又は９９％を一般に含む、実質上の単離された形態にあってよい。ポリヌクレオチド、薬剤、蛋白質又は抗体は、典型的には、他の細胞成分を実質上含まない。当該ポリヌクレオチド、薬剤、蛋白質又は抗体は、そのような実質上単離されたか、精製されたか、又は遊離の形態にて上記方法において使用されるか、又はそのような形態で容器キット中に存在してよい。
【０１４３】
発明は、発明のＴＣＲを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類も提供する。これは、本明細書にて論じられた哺乳類の何れかであってよい（例えば、上記抗体の生産に関して）。好ましくは、当該哺乳類は、セリアック病を有するか又は感受性である。当該哺乳類はＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８又はＨＬＡ−ＤＲ３−ＤＱ２を発現してもよく、及び／又は、セリアック病を引き起こすグリアジンを含むダイエットを与えられてよい（例えば、本明細書にて言及されたグリアジン蛋白質の何れか）。即ち、上記哺乳類はセリアック病の動物モデルとして機能してよい。
【０１４４】
発明は、セリアック病の治療用の生成物を同定する方法も提供し、セリアック病を有するか又は感受性の発明の動物に候補物質を投与し、そして当該哺乳類において物質がセリアック病を予防するか又は治療するか否かを決定することを含み、セリアック病の予防又は治療が、上記物質が治療用生成物であることを示す。そのような生成物はセリアック病を予防又は治療するのに使用してよい。
【０１４５】
発明は、治療用（予防用を含む）薬剤又は診断用（発明の薬剤、蛋白質及びポリヌクレオチド）薬剤を提供する。これらの物質は、薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤とそれらを混合することにより臨床投与のために製剤化される。例えば、それらは、局所、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、眼球内、皮膚内、表皮内、経皮投与のために製剤化され得る。上記物質は、薬学上受容可能であって且つ所望の投与経路のために適切なあらゆる媒体と混合してよい。注射のための薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤は、例えば滅菌又は等張溶液、例えば注射用の水又は生理食塩水、又は弾道デリバリー用のキャリアー粒子であってよい。
【０１４６】
物質の用量は、様々なパラメーターに従い、特に使用される薬剤；処置される患者の年齢、体重及び状態；使用される投与様式；処置される症状の重度；及び要求される臨床上の養生法に従い調節してよい。規準として、注射により投与される物質の量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇが適している。
【０１４７】
記載された投与経路及び用量は規準としてのみ意図されるが、何故ならば熟練した開業医はあらゆる特定の患者及び症状に関して投与の最適な経路及び用量を決定することができるからである。
【０１４８】
発明の物質は、即ちヒト又は動物の身体の治療方法、又はヒト身体に実施される診断法において使用してよい。特に、それらは、セリアック病を治療又は予防する方法において使用してよい。発明は、セリアック病を治療又は予防するための医薬の製造法における使用のための薬剤も提供する。即ち、発明は、その要求のあるヒトへ発明の物質を投与することを含むセリアック病の予防又は治療法を提供する（典型的には、その非毒性有効量）。
【０１４９】
発明の薬剤は、標準の合成価額技術、例えば自動化された合成器の使用により作成することができる。上記薬剤は、より長いポリペプチド、例えば融合蛋白質から作成してよく、そのようなポリペプチドは上記ペプチドの配列を含む。当該ペプチドは、例えばポリペプチドを加水分解することにより、例えばプロテアーゼの使用により；又は物理的にポリペプチドを破壊することにより、ポリペプチドに由来し得る。発明のポリヌクレオチドは標準の技術、例えば合成器を使用することにより、作成することができる。
変異グリアジン蛋白質を発現するか又はアンタゴニストとして作用し得る配列を含む蛋白質を発現する植物細胞又は植物
発明の細胞は、植物細胞、例えばイネ科の単子葉植物種の細胞であってよい。当該種は、その野生型形態がグリアジン、本明細書にて言及されたグリアジン蛋白質の何れかを発現する種であってよい（配列番号：３に対して何れかの程度の相同性を有するグリアジンを含む）。そのようなグリアジンはヒトにおいてセリアック病を引き起こすかもしれない。上記細胞は、コムギ、トウモロコシ、エンバク、ライムギ、イネ、オオムギ、ライコムギ、モロコシ、又はサトウキビの細胞であってよい。典型的には、上記細胞は、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属、例えばパンコムギ（ａｅｓｔｉｖｕｍ）、スペルトコムギ（ｓｐｅｌｔａ）、ポーランドコムギ（ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ）又はヒトツブコムギ（ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）の細胞である。
【０１５０】
発明の植物細胞は、典型的には、野生型グリアジンを発現しない（例えば、セリアック病を引き起こすかもしれない本明細書にて言及された何れかのグリアジン）か、又は薬剤を認識するＴ細胞により認識され得る配列を含むグリアジンを発現しないものである。即ち、野生型植物細胞がそのようなグリアジンを発現するなら、そのときは、そのようなグリアジンの発現を阻害するか低下させるか又はもはやセリアック病を引き起こさないようにグリアジンのアミノ酸配列を変化させるように操作してよい（典型的には、発明のエピトープをもはや発現させないことにより）。
【０１５１】
これは、変異を、例えば１、２、３又はそれより多いか又は全てのそのようなグリアジン遺伝子へ細胞内で導入すること、例えばコーディング又は非コーディング（例えば、プロモーター）へ導入することにより実施することができる。そのような変異は、本明細書にて論じられた変異の種類又は長さの何れかであり得る（例えば、相同蛋白質に関して）。上記変異は、直接様式（例えば、部位特異的変異導入又は相同組換え技術を用いて）又はランダムな様式（例えば、変異源を用い、次に典型的にはグリアジン（又はセリアック病を引き起こすグリアジン配列）をもはや発現しない変異導入された細胞を選択することにより）にて導入することができる。
【０１５２】
アンタゴニストとして作用し得る配列を含む蛋白質を発現する植物又は植物細胞の場合、そのような植物又は植物細胞は野生型グリアジン蛋白質を発現してよい（例えば、セリアック病を引き起こすもの）。好ましくは、アンタゴニスト配列の存在は、上記植物又は植物細胞由来の蛋白質を含む食物を摂取した個体において低下した兆候（例えば兆候なし）のセリアック病を引き起こす。
【０１５３】
植物細胞内に存在する（か又はに形質転換された）ポリヌクレオチドは、一般に、植物細胞内で変異グリアジン蛋白質を発現できるプロモーターを含む。所望の発現のパターンに依存して、上記プロモーターは、構成的、組織特異的、ステージ特異的；及び／又は誘導可能性であってよい。例えば、植物における強い構成的発現は、ＣＡＭＶ３５Ｓ，Ｒｕｂｉｓｃｏ ｓｓｕ又はヒストンプロモーターにより得ることができる。また、組織特異的又はステージ特異的プロモーターは、トランスジェニック植物において特定の組織へ又はその発生において特定のステージへ、発明の蛋白質の発現を標的化するために使用してよい。即ち、例えば、種子特異的、根特異的、葉特異的、花特異的等のプロモーターを使用してよい。種子特異的プロモーターは、Ｄａｌｔａ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．（１９９７），３，ｐｐ．２６９−２９６）に記載されたものを含む。種子特異的プロモーターの特定の例は、ｎａｐｉｎプロモーター（ＥＰ−Ａ−０ ２５５，３７８）、ファセオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンセニンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）及びＡＴＳ１及びＡＴＳ３プロモーター（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０６７９８）を含む。
【０１５４】
上記細胞はあらゆる形態であってよい。例えば、単離された細胞、例えばプロトプラストであってよいか、又は植物組織の一部、例えばカルス又は植物から切り出された組織であってよいか、又は植物全体の一部であってよい。上記細胞はあらゆる種類の細胞であってよい（例えば、植物の部分のあらゆる種類）。例えば、分化しない細胞、例えばカルス細胞；又は分化した細胞、胚、花粉、根、若枝（ｓｈｏｏｔｓ）又は葉に見いだされる種類の細胞。植物の部分は、根；若枝；葉及び生殖に関与する部分、例えば、花粉、卵、おしべ、葯、花弁、萼片、及び他の花の部分を含む。
【０１５５】
発明は、トランスジェニック植物細胞を提供するように発明のポリヌクレオチド又はベクターにより植物細胞を形質転換することを含む、トランスジェニック植物細胞を得るための方法を提供する。あらゆる適切な形質転換方法を使用してよい（コムギの場合、Ｖａｓｉｌ Ｖ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，６６７−６７４（１９９２）に開示された技術を使用してよい）。好ましい形質転換技術は、植物プロトプラストのエレクトロポレーション及び粒子の砲撃を含む。形質転換は、即ち、幾つかの細胞がトランスジェニックで幾つかはそうでないようなキメラ組織又は植物を生じてよい。
【０１５６】
発明の細胞又はそうして得られた細胞は、当業界公知の技術によりトランスジェニック植物へ再生されてよい。これらは、トランスジェニック細胞の生育及び／又は分割を刺激するための、オーキシン、ジベレリン及び／又はサイトキニンのような植物成長物質の使用を含んでよい。同様に、体性胚形成及び分裂組織培養のような技術を使用してよい。再生技術は当業界にて公知であり、例えば、米国特許第４，４５９，３５５号、米国特許第４，５３６，４７５号、米国特許第５，４６４，７６３号、米国特許第５，１７７，０１０号、米国特許第５，１８７，０７３号、欧州特許２６７，１５９，欧州特許６０４，６６２，欧州特許６７２，７５２、米国特許第４，９４５，０５０号、米国特許第５，０３６，００６号、米国特許第５，１００，７９２号、米国特許第５，３７１，０１４号、米国特許第５，４７８，７４４号、米国特許第５，１７９，０２２号、米国特許第５，５６５，３４６号、米国特許第５，４８４，９５６号、米国特許第５，５０８，４６８号、米国特許第５，５３８，８７７号、米国特許第５，５５４，７９８号、米国特許第５，４８９，５２０号、米国特許第５，５１０，３１８号、米国特許第５，２０４，２５３号、米国特許第５，４０５，７６５号、欧州特許４４２，１７４，欧州特許４８６，２３３、欧州特許４８６，２３４、欧州特許５３９，５６３、欧州特許６７４，７２５、ＷＯ９１／０２０７１及びＷＯ９５／０６１２８に見いだすことができる。
【０１５７】
そのような多くの技術において、一つの工程は、細胞を膨張させる及び／又は分割することを含む、カルス、即ち細胞組織の形成である。そのようなカルスは他の種類の植物細胞培養物及び植物の部分であるように、発明の別の側面である。即ち、例えば、発明は、トランスジェニック植物組織及び部分を提供するが、胚、分裂組織、種子、若枝、根、幹、葉及び花の部分を含む。これらは、それらの細胞の幾つかが発明の細胞であり幾つかはそうでない感覚において、キメラであってよい。発明のトランスジェニック植物部分及び組織、植物及び／又は種子は、本明細書にて言及された植物種の何れかのものであってよい。
【０１５８】
再生手法は、典型的には、マーカー遺伝子による、形質転換された細胞の選択を含む。
【０１５９】
再生工程は、第１世代のトランスジェニック植物を生じる。発明は、この第１世代植物からのさらなる再生のトランスジェニック植物を得るための方法も提供する。これらは子孫トランスジェニック植物として知られる。第２、第３、第４、第５、第６及びさらなる世代の子孫植物は、当業界公知のあらゆる手段により第１世代のトランスジェニック植物から得てよい。
【０１６０】
即ち、発明は、トランスジェニック子孫植物を得る方法を提供し、発明の第１世代のトランスジェニック植物から第２世代のトランスジェニック子孫植物を得て、そして任意に第２世代のトランスジェニック子孫植物から一つ又はそれより多い世代のトランスジェニック植物を得ることを含む。
【０１６１】
子孫植物はあらゆる公知の技術による前の世代のそれらの先祖から生じさせてよい。特に、子孫植物は：
前の世代に属する発明のトランスジェニック植物からトランスジェニック種子を得て、次にトランスジェニック種子を成長させることにより新世代の発明のトランスジェニック子孫植物を得て；そして／又は
前の世代に属する発明のトランスジェニック植物をクローンとして増殖させることにより新世代に属する発明のトランスジェニック子孫植物を提供し；そして／又は
前の世代に属する発明の第１世代のトランスジェニック植物を別の匹敵する植物と交配することにより、新世代に属する発明のトランスジェニック子孫植物を提供し；そして／任意に
そうして得られた子孫から一つ又はそれより多いさらなる世代のトランスジェニック子孫植物を得ること
により生産してよい。
【０１６２】
これらの技術はあらゆる組み合わせにおいて使用してよい。例えば、クローンとしての増殖及び有性増殖を、別の点において、培養のために適したトランスジェニック植物を生じるプロセスにおいて、使用してよい。特に、農業経済学上望まれる特性を有する植物分類群との繰り返しの戻し交配を企ててよい。植物及びそれから再生した新規な植物からの細胞の取り出しの別の工程も実施してよい。
【０１６３】
また、細胞、植物組織、植物又は種子をあらゆる適切なステージにおいて、さらに望まれる特性を導入することにより、発明のポリヌクレオチド以外の所望のコーディング配列を導入してよい。これは、発明のポリヌクレオチドの導入のために本明細書にて記載された技術により実施してよい。
【０１６４】
例えば、他の除草剤耐性特性、例えばグリフォセート（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）に対する寛容（例えば、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（例えば、ＥＰ−Ａ−０２９３，３５８）又はグリフォセートオキシドレダクターゼ（ＷＯ９２／０００３７７）遺伝子）をコードするトランス遺伝子から；又は、フォサメチン；ジハロベンゾニトリル；グルフォシネートに対する寛容をコードするトランス遺伝子から、例えばホスフィノチリシナセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）又はグルタミンシンターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−０２４２，２３６参照）を用いて；アスラム、例えば、ジヒドロプテロエートシンターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−０ ３６９，３６７参照）；又はスルフォニルウレア、例えば、ＡＬＳ遺伝子を用いて；ジフェニルエーテル、例えば、アシフルオルフェン又はオキサジアゾン、例えば、プロトポルフィロジェンオキシダーゼ遺伝子；環状イミド、例えば、クロロフサリム；フェニルピラゾール、例えば、ＴＮＰ、又はフェノピレート又はそのカルバメート類似体；さらなるトランス遺伝子を選択してよい。
【０１６５】
同様に、除草剤寛容以外の有益な特性に関する遺伝子を導入してよい。例えば、昆虫耐性遺伝子を導入してよく、注目に値するのはバチルスサリンジェネシス（Ｂｔ）の毒素をコードする遺伝子である。同様に、疾患耐性遺伝子を導入してよく、例えば、ＷＯ９１／０２７０１又はＷＯ９５／０６１２８におけるとおりである。
【０１６６】
典型的には、発明の蛋白質を発明の植物内で発現させる。使用されるプロモーターにより、この発現は構成的又は誘導可能であってよい。同様に、組織特異的か又はステージ特異的であってよく、即ち、特定の植物の組織（例えば、本明細書にて言及された組織の何れか）又は植物の発生におけるステージに直接向けられる。
【０１６７】
発明は、作物を得るための方法も提供し、発明のトランスジェニック植物を収穫し、そして任意にさらに加工することを含む。作物は、作物植物から得ることができるあらゆる有用な生成物を意味する。
変異グリアジン蛋白質又はアンタゴニストとして作用することができる配列を含む蛋白質を含む生成物
発明は、変異グリアジン蛋白質又はアンタゴニストとして作用することができる配列を含む蛋白質を含む生成物を提供する。これは、典型的には、そのような蛋白質を発現する本明細書にて言及された植物に由来するか又は植物の部分を含む。そのような生成物は、発明の植物を直接収穫するか又は間接に収穫し、そしてさらに加工することにより得ることが可能であってよい。直接に得ることが可能な生成物は穀物を含む。あるいは、そのような生成物は、回収してさらに加工することにより間接に得ることが可能であってよい。さらに加工することにより得ることが可能な生成物の例は、小麦粉又は蒸留されたアルコール飲料；直接得ることができるか又はさらに加工した材料、例えば小麦粉から作られた焼いた製品（例えば、パン）から作られる食物製品である。典型的には、そのような食物製品はヒト個体により摂取可能であって消化可能である（即ち、非毒性であって栄養価値がある）。
【０１６８】
アンタゴニスト配列を含む蛋白質を含む食物製品の場合、食物製品は野生型グリアジンを含んでもよいが、好ましくは当該アンタゴニストはそのような食物を摂取した後にセリアック病の兆候の低下（又は完全に）を導くことができる。
【０１６９】
発明は、以下の非限定実施例により例示される。
【実施例】
【０１７０】
実施例１
我々は、完全に特性決定されたグリアジン、「Ａ−グリアジン」の全配列にわたる５１セットの合成１５マーペプチドを使用することによりセリアック病のエピトープマッピングを実施した（表１参照）。Ａ−グリアジンペプチドはｔＴＧにより個々に処理されることにより、インビボで生成したものを模倣したかもしれない生成物を生成した３。我々は、実験上の感染及び自己免疫疾患において記載されたとおり、エピトープの「拡散」又は「消費」が起きたかもしれない可能性を避けるために、疾患の消滅の開始点においてセリアック病患者を研究しようとも努めた。
３日及び１０日のパンチャレンジによる臨床上及びＡ−グリアジン特異的なＴ細胞応答
パイロット研究において、セリアック病の２人の患者が緩解したが、血清の抗−筋内膜抗体（ＥＭＡ）の不在により定義され、グルテンフリーダイエットは彼らの通常のグルテンフリーダイエットに加えて、標準のグルテン含有白パン４スライスを毎日給仕された。被験者１は３日後に腹痛、口の潰瘍及びゆるい下痢のためにパンを停止したが、被験者２は１週間目に軽い吐き気があっただけで１０日間継続した。ＥＭＡは被験者２においてパンチャレンジの１週間後に陽性になったことから、使用したパンがセリアック病の再発を導いたことを示す。しかし、被験者１においては、ＥＭＡはパンチャレンジから２カ月まで陰性のままであった。両被験者において、パンチャレンジにより出現した兆候はグルテンフリーダイエットに戻って２日以内に解消した。
【０１７１】
ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイのＡ−グリアジンに対するＰＢＭＣ応答は、パンチャレンジの前と間に見いだされなかった。しかし、被験者１においてはパンの消費の１日後に（４日目）、ｔＴＧにより処理したＡ−グリアジン５１−８５にわたる５つのオーバーラップするペプチドの単一のプール（プール３）が有力なＩＦＮγ応答を示した（図１ａ参照）。被験者１においては、Ａ−グリアジンペプチドに対するＰＢＭＣ ＩＦＮγ応答はプール３単独に標的化されたままであり、８日目に最大であった。プール３に対する応答の動力学及び大きさは、α−キモトリプシン消化されたグリアジンにより導かれるのと同様であった。ｔＴＧ処理したプール３に対するＰＢＭＣ ＩＦＮγ応答はｔＴＧ処理されなかったプール３より５から１２倍の大きさに一貫し、そしてα−キモトリプシン消化したグリアジンに対する応答はｔＴＧ処理した場合の３から１０倍大きかった。被験者２においては、ｔＴＧ処理されたプール３も、８日目にＡ−グリアジンペプチドの免疫源セットのみであったが、この応答は被験者１よりも弱く、４日目には観察されず、１１日目にはプール３に対する応答は減少し、そしてＡ−グリアジンペプチドの他のｔＴＧ処理プールがより強いＩＦＮγ応答を導いた（図１ｂ参照）。
【０１７２】
パイロット研究は、これらのセリアック病被験者における初期Ｔ細胞応答が５つのペプチドの単一のｔＴＧ処理Ａ−グリアジンプールに対してであったこと、及び末梢血において容易に測定されたことを示した。抗原暴露が３日ではなく１０日間続いたなら、他のＡ−グリアジンペプチドに対するＴ細胞応答が、エピトープの拡散に一致して、出現する。
ｔＴＧ処理されたＡ−グリアジンペプチドによるセリアック病特異的ＩＦＮ−ｇ誘導
グルテンフリーダイエットの別の６人のセリアック病被験者の内の５人において（表１参照）、３日間のパンチャレンジはｔＴＧ処理されたペプチドをプール３に同定し、特に、ＰＢＭＣからＩＦＮγを導く唯一のＡ−グリアジン成分としての５６−７０（１２）及び６０−７５（１３）に相当するペプチドであった（図２参照）。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴと平行して流したＩＬ−１０ ＥＬＩＳＰＯＴは、ｔＴＧ処理されたペプチド１２又は１３に対してＩＬ−１０の応答を示さなかった。一人の被験者においては、パンチャレンジの４日前、４日間又は４日目まで、あらゆるＡ−グリアジンペプチド又はα−キモトリプシン消化されたグリアジンに対してＩＦＮγ応答はなかった。パンチャレンジの２カ月後まで測定した場合に、これらのセリアック病被験者の誰にも基底ラインからＥＭＡ状態が変化しなかった。
【０１７３】
ＨＬＡ−ＤＱ対立遺伝子α１＊０５０１，β１＊０２０１（２８−５２歳、２人は女性）を有し、３日間パンチャレンジを受けて１カ月間グルテンフリーダイエットを受けた、４人の健康なＥＭＡ陰性被験者からのＰＢＭＣは、ｔＴＧ処理をしてもしなくても、何れのＡ−グリアジンペプチドに対しても陰性対照を超えるＩＦＮγ応答を示さなかった。即ち、ＰＢＭＣ中のＩＦＮγのｔＴＧ処理プール３及びＡ−グリアジンペプチド５６−７０（１２）及び６０−７５（１３）への誘導は、セリアック病特異的であった（７／８対０／４、ｐ＜０．０１，カイ２乗分析による）。
最小のＡ−グリアジンＴ細胞エピトープのファインマッピング
Ａ−グリアジン５６−７５の末端削除に相当するｔＴＧ処理したペプチドは、同じコアペプチド配列ＱＰＱＬＰ（配列番号：９）が評価された５人のセリアック病被験者の全てにおいて抗原性に必須であったことを明らかにした（図３参照）。ＰＢＭＣ ＩＦＮγは、７マーのＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号：４）で始まるこのコア配列にわたり、長さを伸ばしたｔＴＧ処理ペプチドに応答することから、ｔＴＧ処理された１７マーのＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：１９）（Ａ−グリアジン５７−７３）がＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて最大の活性を所有したことを示した（図４参照）。
ｔＴＧによるＱ６５の脱アミド化はＡ−グリアジン中の免疫上優勢なＴ細胞エピトープを生じる
ＨＰＬＣ分析は、Ａ−グリアジンのｔＴＧ処理が、親ペプチドにおいてあとで隣接して溶出した単一の生成物を生じたことを証明した。アミノ酸配列決定は、Ａ−グリアジン５６−７５中に含まれる６つのグルタミン（Ｑ）残基の中から選択的にｔＴＧにより脱アミド化されたことを示した（図５参照）。グルタミン酸（Ｅ）置換されたＱ６５のコアＡ−グリアジン６２−６８からの連続伸長物（ｓｅｒｉａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ）に相当するペプチドの生物活性は、ｔＴＧ処理後のＱ６５を有する同じペプチドと均等であった（図４ａ参照）。Ｑ５７及びＱ７２のＥによる両方又は単独の置換にＥ６５が伴うと、調査された３人のセリアック病被験者において、上記１７マーの抗原性を増強しなかった（図６参照）。グリアジンペプチドにおいてグルタミン残基にプロリンが続くと、インビトロにおいてｔＴＧにより脱アミド化されないため、Ｑ５７及びＱ７２を調査した（Ｗ．Ｖａｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｃｏｅｌｉａｃ Ｄｉｓｅａｓｅ）。よって、免疫上優勢なＴ細胞エピトープをＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：２）と定義した。
免疫上優勢なＴ細胞エピトープ応答はＤＱ−２制限され且つＣＤ４依存性である
ＨＬＡ−ＤＱα１＊０５０１，β１＊０２０１に関して同型接合の（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）２人のセリアック病被験者において、抗−ＤＱモノクローナル抗体がｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン５６−７５に対するＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ応答をブロックしたが、抗−ＤＰ及び−ＤＲ抗体はブロックしなかった（図７参照）。２人のセリアック病被験者からのＰＢＭＣの抗−ＣＤ４及び−ＣＤ８磁気ビーズ除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）は、ｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン５６−７５に対するＩＦＮγ応答がＣＤ４ Ｔ細胞媒介性であることを示した。
考察
この研究において、我々は、配列：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：２）（残基５７−７３）のｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン１７マーに応答性のセリアック病被験者の末梢血においてＣＤ４ Ｔ細胞の一過性集団を誘導するために、普通の白パンを用いたむしろ単純なダイエット抗原チャレンジを記載した。Ａ−グリアジン（Ｑ→Ｅ６５）に対する免疫応答はセリアック病関連対立遺伝子ＤＱα１＊０５０１，β１＊０２０１に限定される。インビトロにおける組織のトランスグルタミナーゼ作用はＱ６５を選択的に脱アミド化する。置換Ｑ→Ｅ６５を有する合成Ａ−グリアジンペプチドに対する誘導された末梢血ＩＦＮｇの応答は、ｔＴＧ処理されたＱ６５ Ａ−グリアジンペプチドに均等であり；両者は未修飾のＱ６５ Ａ−グリアジンペプチドよりもＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて１０倍にまで、より多くのＴ細胞を刺激する。
【０１７４】
我々は、エピトープマッピングにおけるＴ細胞クローンの使用により生じるかもしれない方法論上の人工物の可能性を回避するため、インビボ抗原チャレンジ及び短期間エクスビボ免疫アッセイを用いて、このセリアック病特異的Ｔ細胞エピトープを慎重に定義した。我々の発見は、グルテンの摂取に対する末梢血のＴ細胞応答が迅速であるが短命であり、且つエピトープマッピングに利用可能であることを示す。インビボ抗原チャレンジは、Ａ−グリアジンペプチドに対する免疫応答の時間の経過順の階層（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ）が存在することを示し；ｔＴＧにより修飾されたＡ−グリアジン５７−７３はＰ中のもっとも強いＩＦＮｇ応答を誘導するのみならず、第１のＩＦＮｇ応答も出現する。
【０１７５】
我々はＡ−グリアジンにわたるペプチドしか評価しなかったので、セリアック病の病因において等しいか又はより重要な他のグリアジン内の別のエピトープが存在するかもしれない。事実、我々が同定したＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号：４）であるＡ−グリアジン内のコアエピトープにおけるペプチド配列は幾つかのべつのグリアジンに共通する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ａｎｄ Ｔｒｅｍｂｌ受け入れ番号：Ｐ０２８６３，Ｑ４１５２８，Ｑ４１５３１，Ｑ４１５３３，Ｑ９ＺＰ０９，Ｐ０４７２２，Ｐ０４７２４，Ｐ１８５７３）。しかしながら、生検チャレンジ及びインビボ研究において生物活性を所有することが以前に示されたＡ−グリアジンペプチド（例えば：３１−４３、４４−５５及び２０６−２１７）４，５は、セリアック病被験者において３日間のパンチャレンジ後にＰＢＭＣにおいてＩＦＮｇ応答を誘導しなかった。これらのペプチドは、免疫応答の拡散を伴って現れる「二次」Ｔ細胞エピトープであるかもしれない。
実施例２
免疫上優勢なエピトープ内の置換に対するＴ細胞認識の効果
５７−７３Ａ−グリアジンエピトープにおける６５位のグルタミンの置換の効果を、合成ペプチドを用いてＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて置換されたエピトープに対する末梢血応答を測定することにより決定した（５０μｇ／ｍｌにおいて）。応答は３人のセリアック病患者においてグルテンチャレンジを始めて６日後に測定した（３日間４スライスのパンを毎日）。結果を表３及び図８に示す。グルタミン酸から、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、リジン、プロリン又はアルギニンへの置換において観察され得るように、免疫上優勢なエピトープに対する応答の大きさの１０％より低い大きさの応答を刺激した。即ち、この位置におけるＡ−グリアジンの変異は、免疫反応性を低下させるか又は不在にする変異グリアジンを生成するのに使用することができた。
実施例３
他の天然に生じるグリアジンからの均等なペプチドの免疫反応性の試験
他の天然に生じるコムギのグリアジン由来の均等なペプチドの免疫反応性を、天然に生じる配列に相当する合成ペプチドをトランスグルタミナーゼにより処理して使用することにより、評価した。これらのペプチドは、ＥＬＩＳＰＯＴにおいて、実施例２に記載されたのと同じ被験者からのＰＢＭＣを用いて同じ様式にて試験した。少なくとも５つのペプチドがＡ−グリアジン５７−７３ Ｅ６５ペプチドに匹敵する免疫反応性を示す（トランスグルタミナーゼ処理後）ことから、コムギ中の他のグリアジン蛋白質も同ようにこのセリアック病特異的免疫応答を誘導することを示唆する（表４及び図９）。
方法
被験者：研究において使用した患者は、英国のオックスフォードにおいてセリアック病クリニックにかかっている。セリアック病は、特有の小腸の組織構造、及び兆候の標準化及びグルテンフリーダイエットの小腸組織構造に基づいて診断された。
組織型判定：組織型判定は、ＥＤＴＡ抗凝血末梢血から抽出されたＤＮＡを用いて実施した。ＨＬＡ−ＤＱＡ及びＤＱＢ遺伝子型判定は、ＰＣＲにより配列特異的プライマーミックスを用いて実施した６−８。
抗筋内膜抗体アッセイ：ＥＭＡは、サルの食道（ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓ）を用いて１：５に希釈された患者の血清を用い、続いてＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＡを用いた間接免疫蛍光により検出した。ＩｇＡをＥＭＡの前に定量したが、どの被験者もＩｇＡ欠損ではなかった。
抗原チャレンジ：グルテンフリーダイエット後のセリアック病被験者に、４スライスのグルテン含有パンを毎日３又は１０日間食べ尽くさせた（セインズベリーズの標準の「白サンドイッチパン」）。パンチャレンジを始める前の週及び２カ月後まで、ＥＭＡを査定した。グルテンフリーダイエットを４週間経験した健康な被験者は、３日間グルテン含有パン４スライスを含む彼らの通常のダイエットを食べつくし、そして次にさらに４日間グルテンフリーダイエットに戻った。
ＩＦＮγ及びＩＬ−１０ ＥＬＩＳＰＯＴ：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離により５０−１００ｍｌの静脈血からＰＢＭＣを調製した。３回洗浄後に、ＰＢＭＣを再度、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清を含む完全ＲＰＭＩに懸濁した。ＩＦＮγ及びＩＬ−１０の単一細胞の分泌に関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、市販のキット（Ｍａｂｔｅｃｈ；ストックホルム、スエーデン）を用いて９６−ウエルプレート（ＭＡＩＰ−Ｓ−４５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ベッドフォード、ＭＡ）により、製造者の指示書（ほかで記載されたとおり９）に従い、２−５ｘ１０５（ＩＦＮγ）又は二重のウエルにて査定し、そしてミコバクテリウムツベルクロシスの精製された蛋白質誘導体（ＰＰＤ ＲＴ４９）（Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；コペンハーゲン、デンマーク）（２０μｇ／ｍｌ）を全てのアッセイにおいて陽性対照として含ませた。
ペプチド：合成ペプチドはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ハンツビル、アラバマ）から購入し、質量分光分析及びＨＰＬＣにより確認されたペプチドの真正度は７０％＞精製度であった。グリアジン（Ｓｉｇｍａ；Ｇ−３３７５）（１００ｍｇ／ｍｌ）のα−キモトリプシン（Ｓｉｇｍａ；Ｃ−３１４２）２００：１（ｗ／ｗ）による消化は、０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３中で２Ｍ尿素と共に室温において実施し、９８℃において１０分間加熱することにより２４時間後に中止した。遠心分離（１３，０００ｇ，１０分間）後に、グリアジン消化上清をフィルター滅菌した（０．２ｍｍ）。グルテンの消化をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認して、蛋白質濃度を査定した。α−キモトリプシン−消化されたグリアジン（６４０μｇ／ｍｌ）及び合成グリアジンペプチド（１５マー：１６０μｇ／ｍｌ，他のペプチド：０．１ｍＭ）を個別にｔＴＧ（Ｓｉｇｍａ；Ｔ−５３９８）（５０μｇ／ｍｌ）によりＰＢＳ中にてＣａＣｌ２を１ｍＭ加えて、２時間３７℃において処理した。ペプチド及びペプチドプールを滅菌９６−ウエルプレートに分配して、使用まで−２０℃に凍結保存した。
ペプチドのアミノ酸配列決定：逆相ＨＰＬＣを使用して、Ａ−グリアジン５６−７５のｔＴＧ処理によるペプチドを精製した。単一生成物を同定して、アミノ酸配列決定（自動化配列決定機モデル４９４Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー、カリフォルニア）に供した。未修飾のＧ５６−７５の配列はＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＳＦＰ（配列番号：５）と確認され、そしてｔＴＧ処理されたＧ５６−７５はＬＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳＦＰ（配列番号：１１）と確認された。グルタミン残基の脱アミド化は、アミノ酸配列決定のサイクル２、４、８、１０、１５及び１７において回収されたグルタミン及びグルタミン酸の合わせた量のパーセントとして表された、回収されたグルタミン酸の量（ｐｍｏｌ）として定義された。ｔＴＧに帰する脱アミド化は、（ｔＴＧ処理されたペプチド中のグルタミンの脱アミド化の％−未処理のペプチド中の脱アミド化の％）／（１００−未処理のペプチド中の脱アミド化の％）として定義された。
ＣＤ４／ＣＤ８及びＨＬＡクラスＩＩ制限：抗−ＣＤ４又は抗−ＣＤ８コートされた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ，オスロ、ノルウエー）をＲＰＭＩにより４回洗浄し、次に１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清を含む完全ＲＰＭＩ中のＰＢＭＣと共に、３０分間氷の上でインキュベートした。ビーズを磁石により取り出して、残る細胞を計数した。ｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン５６−７５に対する免疫応答のインビボのＨＬＡ−クラスＩＩ制限は、ＰＢＭＣ（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）を抗−ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３），−ＤＲ（Ｌ２），及び−ＤＰ（Ｂ７．２１）モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と、室温において、ペプチドの添加前に１時間インキュベートすることにより、確立した。
実施例４
グリアジン−特異的末梢血リンパ球による粘膜インテグリンの発現
内皮とリンパ球のアドレシンの間の相互作用は、器官特異的なリンパ球のホーミングを促進させる。多数のアドレシンが公知である。ヘテロダイマーα４β７は粘膜固有層消化管及び他の粘膜リンパ球に特異的であり、そしてαＥβ７は消化管及び皮膚において内皮リンパ球内に特異的である。末梢血ＣＤ４ Ｔ細胞の約３０％がα４β７を発現し、そして粘膜部位へ移動中であると推定され、末梢血ＣＤ４ Ｔ細胞の５％がαＥβ７を発現する。αＥ又はβ７特異的な抗体をコートされた免疫磁気ビーズは、それぞれ、αＥβ７又はαＥβ７及びα４β７を発現する細胞のＰＢＭＣを除去する。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイとの組み合わせにより、免疫磁気ビーズの除去は、これらの細胞を粘膜表面へのホーミングとして同定するかもしれないグリアジン特異的Ｔ細胞のアドレシン発現の決定を可能にする。おもしろいことに、インビボのグルテンチャレンジは小腸の粘膜固有層へのＣＤ４ Ｔ細胞の迅速な流入に関連しており（内皮部位内ではなく）、９０％を超えるリンパ球がα４β７を発現する。
【０１７６】
免疫磁気ビーズを製造して、３日間のグルテンチャレンジの後で６日目又は７日目にセリアック病被験者からのＰＢＭＣを除去するのに使用した。ＦＡＣＳ分析は、αＥビーズが約５０％の陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を除去し、一方β７ビーズは全てのβ７陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を除去した。ＣＤ４−又はβ７−ビーズを用いたがＣＤ８−又はαＥビーズを用いないＰＢＭＣ除去はインターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔにおいて応答を完全に破壊した。ｔＴＧグリアジン及びＰＰＤ応答はＣＤ４除去により完全に破壊されたが、インテグリン特異的ビーズ除去により一貫して影響された。
【０１７７】
即ち、セリアック病においてグルテンチャレンジ後に誘導されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５特異的Ｔ細胞は、小腸中の粘膜固有層ＣＤ４ Ｔ細胞上に存在するインテグリンα４β７を発現する。
実施例５
最適なＴ細胞エピトープの長さ
Ａ−グリアジン中の優勢なＴ細胞エピトープのコアにわたる７から１７の長さのアミノ酸からのペプチドを試験する以前のデータは、３日間のグルテンチャレンジ開始から６日後にセリアック病のボランティアからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたインターフェロンガンマＥｌｉｓｐｏｔにおいて１７マーのＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（配列番号：２）が最大の応答を誘導したことを示した。
【０１７８】
Ａ−グリアジン中の優勢なＴ細胞エピトープのコア配列からの伸長を示すペプチドを、３日間のグルテンチャレンジ開始から６日後にセリアック病のボランティアからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにおいて査定した（ｎ＝４）。ペプチド１３：Ａ−グリアジン５９−７１ ＱＥ６５（１３マー）、ペプチド１５：５８−７２ ＱＥ６５（１５マー）、．．．、ペプチド２７：５２−７８ ＳＥ６５（２７マー）。
【０１７９】
図１１に示すとおり、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の伸長はＩＦＮガンマＥｌｉｓｐｏｔにおいて応答を実質上は増強しない。次の実施例は、１７マーペプチドを用いたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のアゴニスト及びアンタゴニスト活性を特性決定する。
実施例６
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５とセリアック病における他のＤＱ２−制限されるＴ細胞エピトープの比較
セリアック病の腸の生検からのグルテン特異的Ｔ細胞クローン及び系列のＴ細胞エピトープに相当する未修飾及びトランスグルタミナーゼ処理ペプチドに相当するペプチドを用いて、用量応答研究を実施した。ペプチドに対する応答はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する応答のパーセントとして表現した。全ての被験者はＨＬＡ−ＤＱ２＋であった（誰もＤＱ８＋でなかった）。
【０１８０】
上記の研究は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５が、グルテンチャレンジ後にセリアック病のＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてインターフェロンガンマの誘導に関してもっとも有効性のあるグリアジンペプチドであることを示す（図１２ａ−ｈ，及び表５及び６を参照）。第２及び第３のエピトープは、より大きなペプチド、即ちＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＧＤＡ４ ＷＨＥＡＴ Ｐ０４７２４−８４−１００ ＱＥ９２の準最適断片である。上記エピトープは適度に生物活性であるにすぎない（ブランクを差し引いた後ではＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５より約１／２０活性）。
【０１８１】
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５はセリアック病において他の公知のＴ細胞エピトープよりも有効性がある。配列決定されたグリアジン遺伝子の間でＡ−グリアジン５７−７３（配列ＰＱＬＰＹ（配列番号：１２）を含む）の１６の多型が存在し、それらの生物活性を次で査定する。
実施例７
末梢血中でのグリアジン−及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の比較
セリアック病におけるグリアジンに対する全Ｔ細胞応答に対しての、優勢なエピトープＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の相対的な寄与は重大な問題である。ペプシン−トリプシン及びキモトリプシンにより消化されたグリアジンが、セリアック病におけるＴ細胞系列及びクローンの分化のための抗原として伝統的に使用されてきた。しかしながら、これらのプロテアーゼは特定のペプチドエピトープを分断するかもしれないと言える。事実、組換えα９−グリアジンのキモトリプシン消化はペプチドＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号：１３）を生じるが、最適エピトープ配列ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：２）の末端削除体である（上を参照）。トランスグルタミナーゼ処理は、実質上、グリアジン特異的Ｔ細胞クローン及び系列の増殖アッセイにおいて、キモトリプシン消化されたグリアジンの能力を増加させる。よって、トランスグルタミナーゼ処理されたキモトリプシンで消化されたグリアジン（ｔＴＧグリアジン）は理想的な抗原ではないかもしれないが、この混合物に対する応答はグリアジンに特異的な末梢血リンパ球の「全」数に近似するかもしれない。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおけるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びｔＴＧグリアジンに対する応答の比較は、セリアック病におけるグリアジンに対する全免疫応答へのこの優勢なエピトープの寄与の指標を提供し、またエピトープ拡散の基準でもある。
【０１８２】
４人のセリアック病被験者においてグルテンチャレンジを開始して６日目又は７日目に回収されたＰＢＭＣを、キモトリプシン消化されたグリアジン＋／−ｔＴＧ処理を用いた用量応答研究において査定し、そして最適濃度のＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（２５ｍｃｇ／ｍｌ）に対するＥＬＩＳｐｏｔ応答と比較した。グリアジンのｔＴＧ処理はＥＬＩＳｐｏｔにおいて約１０倍ＰＢＭＣ応答を増強した（単独で査定した場合にｔＴＧはブランクと同等であった）（図１３ａ−ｃ参照）。研究した４人のセリアック病被験者において、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（２５ｍｃｇ／ｍｌ）はｔＴＧグリアジン（５００ｍｃｇ／ｍｌ）の１４から１１５％の間の応答を誘導し、そしてＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する応答が大きければ大きいほど、ｔＴＧグリアジン応答を表した比率が大きくなった。
【０１８３】
相対的に限られたデータから、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答が幾つかの被験者においてｔＴＧグリアジンと同等であることが示唆される。より進化した抗−グリアジンＴ細胞応答に関連したエピトープ拡散は、幾つかの個体において末梢血の「全」応答へのＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の僅かな寄与の説明となるかもしれない。エピトープ拡散はさほど厳しくないグルテンフリーダイエットを受けた個体において保持されるかもしれない。
実施例８
セリアック病において生物活性なグリアジンペプチドの定義：Ａ−グリアジン５７−７３の多型
Ａ−グリアジンの全配列にわたるオーバーラップする１５マーのペプチドを査定することにより、セリアック病の免疫上優勢な配列を同定した。Ａ−グリアジンは最初に全配列を決定されたアルファグリアジン蛋白質及び遺伝子であったが、コムギにおいて約３０−５０の関連するアルファグリアジン蛋白質のひとつである。蛋白質データベースＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ及びＴＲＥＭＢＬを検索することにより、２５の別々のアルファ−グリアジン遺伝子が同定され、さらに８つのアルファグリアジンを記述した。これら２５のアルファグリアジンに含まれたのは、Ａ−グリアジン５７−７３に相当する１６の異なる多型である（表７参照）。
【０１８４】
トランスグルタミナーゼによるインビトロにおける処理、並びに１０位において置換されたグルタミン酸による処理後、未修飾形態でのこれらの１６の多型に相当する合成ペプチドを、通常のグルテンフリーダイエット後の、インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおけるグルテンチャレンジの６日又は７日後に、セリアック病の被験者からのＰＢＭＣを用いて査定した。グルタミン酸置換したペプチドを３つの濃度において（２．５、２５及び２５０ｍｃｇ／ｍｌ）査定し、未修飾のペプチド及びトランスグルタミナーゼ処理されたペプチドを２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度のみにて査定した。生物活性は、個々の被験者においてＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５ ２５ｍｃｇ／ｍｌに付随した応答の％として表現した（ｎ＝４）（図１４参照）。
「野生型」ペプチドの生物活性はトランスグルタミナーゼ処理により実質増加した（＞５倍）。野生型ペプチドのトランスグルタミナーゼ処理は１０位においてグルタミン酸により置換された同じペプチドの生物活性と同ような生物活性をもたらした。５つのグルタミン酸置換ペプチド（Ｂ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ）の生物活性はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の＞７０％であったが、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５よりも顕著に高い生物活性のものはなかった。２．５及び２５０ｍｃｇ／ｍｌの濃度においてグルタミン酸置換されたペプチドに対するＰＢＭＣ応答は２５ｍｃｇ／ｍｌにおけるのと同等であった。６つのグルタミン酸置換グリアジンペプチド（Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｎ，Ｏ，Ｐ）は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の生物活性の＜１５％であった。他のペプチドは生物活性において中間であった。
【０１８５】
少なくとも６つのグリアジン由来のペプチドがトランスグルタミナーゼによる修飾語にＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する有効性が均等である。相対的に非生物活性のＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の多型も存在する。これらのデータは、トリチカムエステビウム、トリチカムウアルツ、トリチカムスペルタの幾つかのグリアジン由来のペプチドのトランスグルタミナーゼ修飾がセリアック病において免疫上優勢なＴ細胞エピトープを生成できるかもしれないことを示す。
【０１８６】
非−セリアック病−毒性コムギを生成するコムギの遺伝子修飾は、複数のグリアジン遺伝子の除去又は修飾を必要とするかもしれない。Ａ−グリアジン５７−７３の変更されたペプチドリガンドアンタゴニストを定義する配列を取り込んだグリアジン又は他の蛋白質又はペプチドを含むコムギの生産は、セリアック病において「非毒性」よりむしろ治療用である遺伝学上修飾されたコムギを生成するための別の戦略である。
実施例９
コアエピトープ配列の定義：
Ｎ−末端又はＣ−末端からのＡ−グリアジン５６−７５の末端削除に相当するペプチドの比較は、Ｔ細胞エピトープのコア配列がＰＥＬＰＹ（Ａ−グリアジン６４−６８）であることを示した。非アゴニスト及びアンタゴニストを定義する試みは、その生物活性に実質貢献する残基において置換されたＡ−グリアジンのバリアントに焦点を注ぐことになる。
【０１８７】
残基５７から７３を置換したアラニン（図１５）又はリジン（図１６）を有するＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に相当するペプチドを、３日間のグルテンチャレンジ開始から６日後にセリアック病のボランティアからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにおいて比較した（ｎ＝８）。（ＢＬはブランク、ＥはＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：２））。
【０１８８】
Ａ−グリアジン６０−７０ ＱＥ６５（ＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号：１４）に相当する残基はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のにおいて生物活性に実質貢献することを見いだした。６０−７０位において置換されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のバリアントは２段階の手法により査定する。最初に、対照的な特性を有する、１０の異なるアミノ酸を用いて６０−７０位において置換されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５を査定した。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のバリアントの第２群（全ての他の天然に生じるアミノ酸により置換されているが、修飾に敏感であると証明された位置のシステインを除く）を第２ラウンドにおいて査定した。
実施例１０
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の置換されたバリアントのアゴニスト活性
Ａ−グリアジン６０−７０ ＱＥ６５は、Ａ−グリアジンにおいて優勢なＴ細胞エピトープのコア配列である。このエピトープのアンタゴニスト及び非アゴニストペプチドバリアントは、このコア配列の修飾により生成されるらしい。最初に、対照的な特性を有する、１０の異なるアミノ酸を用いて６０−７０位において置換されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５を、３日間のグルテンチャレンジ開始から６日後にセリアック病の被験者からのＰＢＭＣを用いたＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにおいて査定する。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のバリアントの第２群（システイン以外、全ての他の天然に生じるアミノ酸により置換されている）も第２ラウンドにおいて査定した。両群のペプチド（全て５０ｍｃｇ／ｍｌにおいて、二重）を８人の被験者からのＰＢＭＣを用いて査定して、未修飾のペプチドと比較した（アッセイあたり２０反復）。様々な研究が、このアッセイにおけるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の最適な濃度が１０から１００ｍｃｇ／ｍｌの間であることを示す。
【０１８９】
結果を、スポット形成細胞（９５％コンフルエントの間隔）の平均応答として、個々の個体の％Ａ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５平均応答として表現する。対になっていないｔ−試験を使用することにより、修飾されたペプチドのＥＬＩＳＰＯＴ応答をＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５と比較する。スーパー−アゴニストを、ｐ＜０．０１の有意性のレベルにおいてＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５よりも高い応答を有するものとして定義し；部分アゴニストはｐ＜０．０１の有意性のレベルにおいてＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５よりも低い応答を有するものとして定義し、そして非アゴニストはブランク（ペプチド無しのバッファー）と顕著に異ならないものと定義した。Ａ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５のアゴニスト活性の３０％又はそれ未満のアゴニスト活性を有するペプチドは、アンタゴニスト活性を評価するための「適切な」部分アンタゴニスト又は非アンタゴニストと考えた（表８及び図１７−２７参照）。
【０１９０】
ＰＢＭＣのＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴ応答は分子レベルにおいて特異性が高い。６４位のプロリン（Ｐ６４）、６５位のグルタミン酸（Ｅ６５）及び６６位のロイシン（Ｌ６６）、及び程度は劣るがＱ６３，Ｐ６７，Ｙ６８及びＰ６９が修飾に対して特に感受性である。Ｙ６１及びＹ７０の置換は共に親ペプチドより３０％高い生物活性のスーパー−アゴニストを生じ、おそらくは、ＨＬＡ−ＤＱ２への結合を増強するためであるが、何故ならば、このＨＬＡ分子のモチーフが１位及び９位の巨大な疎水性残基に関する選択性を示すからである。１８の非アゴニストペプチドを同定した。バリアントの生物活性（５０ｍｃｇ／ｍｌ）：Ｐ６５，Ｋ６４，Ｋ６５及びＹ６５（生物活性７−８％）はブランク（７％）と同等であった。全部で、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の５７の変異バリアントがＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の３０％又はそれ未満の生物活性であった。
【０１９１】
優勢なエピトープ、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）Ｔ細胞応答の分子特異性は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者の間で一貫して再現性があり、そして上記７アミノ酸の中の限定された数のアミノ酸に特異性が高い。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の特定の単一アミノ酸バリアントは、全てのＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者において一貫して非アゴニストである。
実施例１１
置換されたバリアントのアンタゴニスト活性
ＨＬＡ−ＤＱ２＋被験者におけるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＰＢＬ Ｔ細胞応答の均質性は、ＰＢＬ Ｔ細胞応答がポリクローナル又はオリゴクローナルであるらしいとしても、ＰＢＭＣにおいてか又はエクスビボにおいて拮抗可能な変更されたペプチドリガンド（ＡＰＬ）が存在するかもしれないことを示唆する。ＡＰＬアンタゴニストは一般に弱いアゴニストである。３０％又はそれ未満のアゴニスト活性のＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の５７の単一アミノ酸置換バリアントが同定されて、ＡＰＬアンタゴニストとしての適切な候補である。さらに、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の特定の弱い生物活性の天然に生じる多型も同定されて（以下参照）、「天然に生じる」ＡＰＬアンタゴニストかもしれない。また、ＭＨＣへの結合が抗原特異的Ｔ細胞免疫とも拮抗するかもしれないことが示唆された。よって、グルテンチャレンジ後にセリアックＰＢＭＣにおいてＩＦＮガンマ応答を誘導しないがＨＬＡ−ＤＱ２に結合することが知られている非グリアジンペプチドは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５により誘導されるＴ細胞応答を低下させることができるかもしれない。ＨＬＡ−ＤＱ２へ貪欲に結合する２つのペプチドはＨＬＡクラス１α４６−６０（ＨＬＡ １ａ）（ＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷ（配列番号：１５））及びチロイドペルオキシダーゼ（ｔｐ）６３２−６４５Ｙ（ＩＤＶＷＬＧＧＬＬＡＥＮＦＬＰＹ（配列番号：１６））である。
【０１９２】
３日間のグルテンチャレンジを開始後のセリアックボランティア６人からのＰＢＭＣを用いたＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにおけるペプチド（５０μｇ／ｍｌ）又はバッファー及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（１０μｇ／ｍｌ）の同時添加（ｎ＝５）。結果は、ペプチドプラスＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５による応答として（二重の平均）、バッファープラスＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５による応答（２０反復の平均）の％応答として表した（表９参照）。
【０１９３】
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の４つの単一アミノ酸置換バリアントは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するインターフェロンガンマＰＢＭＣ ＥＬＩＳＰＯＴ応答（ｐ＜０．０１）を２５％から２８％低下させ、別の１３のペプチドバリアントはＥＬＩＳＰＯＴ応答を１８％から２４％低下させた（ｐ＜０．０６）。ＨＬＡ−ＤＱ２バインダー、チロイドペプチド（ｔｐ）６３２−６４５Ｙは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＰＢＭＣインターフェロンガンマ応答を３１％低下させる（ｐ＜０．０００１）が、他のＨＬＡ−ＤＱ２バインダー、ＨＬＡクラス１ａ４６−６０は応答を変化させない（表９及び１０参照）。Ａ−グリアジン５７−７３のトランスグルタミナーゼ修飾された多型に相当するペプチド、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受け入れ番号Ｐ０４７２５ ８２−９８ ＱＥ９０（ＰＱＰＱＰＦＰＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：１７））は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する応答を１９％低下させる（ｐ＜０．００９）（表１１参照）。
【０１９４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてのＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＰＢＭＣのインターフェロンガンマ応答は、特定の単一アミノ酸Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアント、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の多型、及び５倍過剰にＨＬＡ−ＤＱ２を結合することが公知の非関連ペプチドの同時投与により低下する。これらの発見は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の変更されたペプチドリガンドアンタゴニストが存在することを示唆する。仮想上のＡＰＬのみならず、ＨＬＡ−ＤＱ２を結合する特定のペプチドも、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＰＢＬ Ｔ細胞応答を有効に低下させる。
【０１９５】
これらの発見は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病において優勢なＡ−グリアジンエピトープに対するＴ細胞応答を破壊する２つの戦略を支持する。
【０１９６】
１．「伝統的な」ペプチド薬剤としての使用のため又はコムギにおけるグリアジン遺伝子の特異的遺伝的修飾のための、一つの位置より多い位置において（６４−６７）アミノ酸を置換することによる、ＡＰＬアンタゴニストの最適化。
【０１９７】
２．ＨＬＡ−ＤＱ２に付随してＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の提示を競合阻害するための、高親和性ＨＬＡ−ＤＱ２結合ペプチドの使用。
【０１９８】
これらの２つのアプローチは相互に両立可能かもしれない。Ｆ６１及びＱ７０をチロシン残基で置き換えることにより、スーパー−アゴニストを生成した。これらのスーパー−アゴニストはＴ細胞受容体との増強された接触よりむしろＨＬＡ−ＤＱ２への結合の改善によりもたらされたらしい。これらの修飾を適度に有効なＡＰＬアンタゴニストを生成する他の置換と組み合わせることにより、置換されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントの阻害効果を実質上増強するかもしれない。
実施例１２
ＰＢＭＣ及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＰ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２をセリアック病の診断法として使用したインターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔの開発：新たに診断されたセリアック病における免疫応答の定義
インターフェロン番号ＥＬＩＳｐｏｔにおいて測定されたＰＢＭＣ中の優勢なＡ−グリアジンＴ細胞エピトープに対する応答性の誘導を、長期間の厳格なグルテンフリーダイエット（ＧＦＤ）を受けたほとんど全てのＤＱ２＋セリアック病被験者においてはグルテンチャレンジに続いて行ったが、厳格なＧＦＤを受けて４週間後の健康なＤＱ２＋被験者においては続いて行わなかった。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答はグルテンチャレンジ前のセリアック病被験者のＰＢＭＣにおいて測定不可能であり、そしてパイロットデータはこれらの応答が未処理の被験者のＰＢＭＣにおいて測定できなかったことを示唆した。これらのデータは、セリアック病において、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する免疫応答性が抗原排除（ＧＦＤ）後に復元することを示唆する。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及びＰＢＭＣを用いて診断試験が開発されるとしたら、グルテンチャレンジが
血液中のＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及び他の免疫反応性グリアジンペプチドに対する応答を誘導できる前に必要とされるＧＦＤの期間を定義することが望まれる。
【０１９９】
新たに診断されたＤＱ２＋セリアック病被験者を、胃腸学の外来患者サービスから補充した。ＰＢＭＣを調製して、被験者がＧＦＤを始める前及びＧＦＤを初めて１週間又は２週間後に、インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて試験した。さらに、グルテンチャレンジ（３日間は４スライスの標準の白パンを摂取、２００ｇ／日）を、ＧＦＤ開始の１又２週間後に実施した。ＰＢＭＣを調製し、そしてグルテンチャレンジを開始して６日後にアッセイした。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（Ａ），Ｐ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２（Ｂ）（単独及び化合して）及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＰ６５（Ｐ６５）（非生物活性バリアント、上記参照）（全て２５ｍｃｇ／ｍｌ）を査定した。
【０２００】
１人の患者を除いて皆、新たに診断されたセリアック病患者はＤＱ２＋であった（一人はＤＱ８＋であった）（ｎ＝１１）。未処置か又はＧＦＤの１又は２週間後の新たに診断されたセリアック病患者からのＰＢＭＣは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＰ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２（単独及び化合して）に対する応答を示さずブランク又は及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＰ６５と顕著な差異はなかった（ｎ＝９）（図２８参照）。たった１週間しかＧＦＤを受けなかったセリアック病患者におけるグルテンチャレンジは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＰ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２（単独及び化合して）に対する応答を実質上増強しなかった。しかし、ＧＦＤを開始して２週間後のグルテンチャレンジは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＰ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２（単独及び化合して）に対する応答を誘導し、非生物活性バリアントＡ−グリアジン５７−７３ ＱＰ６５及びブランクより顕著に高かった。グルテンチャレンジ２週間後のこれらの応答は価値のあることであるが、ＧＦＤ開始後＞２カ月の被験者よりは低いらしい。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５単独に対する応答は、Ｐ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２単独に対する応答又はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と混合した場合の応答と等しいか又はより大きかった。被験者のだれもがグルテンチャレンジの苦痛の兆候を経験しなかった。
【０２０１】
Ａ−グリアジンに対する免疫応答性（グルテンチャレンジ後にＰＢＭＣ中で測定）はＧＦＤを開始して２週間後に部分的に回復したことから、この優勢なＴ細胞エピトープに対する「免疫非応答性」は、未処置のセリアック病患者において且つＧＦＤ開始後の少なくとも１週間は優勢であることを示唆する。グルテンチャレンジ及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおけるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する応答の測定を用いたセリアック病の診断試験のタイミングは、ＧＦＤを開始して少なくとも２週間後である。
【０２０２】
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に特異的なインターフェロンガンマ分泌Ｔ細胞は未処置のセリアック病患者においては末梢血中にて測定できず、ＧＦＤの少なくとも２週間後のグルテンチャレンジにより誘導することができる（抗原排除）。よって、この方法論を用いた診断試験のタイミングは非常に重大であり、そしてその最適化にはさらなる研究が必要である。これらの発見は、抗原排除により逆転した優勢なエピトープ、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に特異的なＴ細胞の機能アネルギーと一致する。この現象は、ヒト疾患において以前には証明されておらず、Ｔ細胞アネルギーがセリアック病においてはペプチド治療により誘導可能かもしれないという可能性を支持する。
実施例１３
コムギグリアジンＴ細胞エピトープの包括的マッピング
抗原チャレンジは末梢血中で抗原特異的Ｔ細胞を誘導する。セリアック病においては、グルテンがこの免疫媒介性疾患を維持する抗原である。グルテンフリーダイエットで処置されたセリアック病のグルテンチャレンジは末梢血中のグルテン特異的Ｔ細胞の出現を導き、グルテンＴ細胞エピトープの分子特異性の決定を可能にさせる。上記のとおり、我々はモデルグルテン蛋白質中の単一の優勢なエピトープ、Ａ−グリアジン（Ｑ６５において脱アミド化された５７−７３）を同定した。この実施例においては、セリアック病患者のグルテンチャレンジを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ中の１１１エントリーに由来する各公知のコムギグリアジン蛋白質中の全ての有力な１２のアミノ酸配列を試験した。全部で、６５２の２０マーペプチドをＨＬＡ−ＤＱ２及びＨＬＡ−ＤＱ８関連のセリアック病において試験した。セリアック病において９０％を超えて存在する古典的なＨＬＡ−ＤＱ２複合体（ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０５，ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２）のセリアック病被験者９人のうちの７人は、末梢血中に誘導可能なＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５−及びグリアジン−特異的Ｔ細胞応答を有した。Ａ−グリアジン５７−７３は、ＨＬＡ−ＤＱ２関連セリアック病において、唯一の重要なα−グルテンＴ細胞エピトープであり、並びにもっとも有力なグリアジンＴ細胞エピトープであった。さらに、インターフェロン−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＡ−グリアジン５７−７３ほど有効性のある１０％から７０％の構造上関連したペプチドの５ファミリーほど存在した。これらの新規なＴ細胞エピトープは、γ−及びω−グリアジンに由来しており、そしてＡ−グリアジン５７−７３のコア配列（コア配列：ＦＰＱＰＱＬＰＹＰ（配列番号：１８））、例えばＦＰＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：１９）及びＰＱＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：２０）と構造上極めて類似しているが同一ではない共通配列を含んだ。Ａ−グリアジン５７−７３の相同体はライムギ又はオオムギにおいて見いだされなかったが、他の２つの穀類はセリアック病において毒性であり、γ−及びω−グリアジン中の新たに定義されたＴ細胞エピトープはライムギ及びオオムギの保存蛋白質において完全に適合した（それぞれ、セカリン（ｓｅｃａｌｉｎｓ）及びホルデイン（ｈｏｒｄｅｉｎｓ））。
【０２０３】
ＨＬＡ−ＤＱ２に関連しないセリアック病はほとんど常にＨＬＡ−ＤＱ８と関連していた。７人のＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病被験者のだれもが、彼らが完全なＨＬＡ−ＤＱ２複合体も所有していないなら、誘導可能なＡ−グリアジン５７−７３−特異的Ｔ細胞応答をグルテンチャレンジ後に有さなかった。完全なＨＬＡ−ＤＱ２複合体を有さない４人のＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病被験者のうちの２人は、誘導可能なグリアジンペプチド特異的Ｔ細胞応答をグルテンチャレンジ後に有した。一人のＨＬＡ−ＤＱ８被験者においては、新規な優勢Ｔ細胞エピトープが、コア配列ＬＱＰＱＮＰＳＱＱＱＰＱ（配列番号：２１）を用いて同定された。このペプチドのトランスグルタミナーゼによる脱アミド化バージョンは非脱アミド化ペプチドよりも有効性であった。以前の研究は、トランスグルタミナーゼにより脱アミド化したペプチドが配列ＬＱＰＥＮＰＳＱＥＱＰＥ（配列番号：２２）を有するはずであることを示唆したが；この配列を確認するためには、さらなる研究が必要である。１カ月の間グルテンフリーダイエットを受けた健康なＨＬＡ−ＤＱ２（１０）及びＨＬＡ−ＤＱ８（１）の被験者の間で、グリアジンペプチド特異的Ｔ細胞応答は不変であり、グルテンチャレンジによりほとんど変わらず、そして、セリアック病の被験者においてグルテンチャレンジにより明らかにされた有効性Ｔ細胞エピトープでは決してなかった。結論として、ＨＬＡ−ＤＱ２関連セリアック病において６より多い重要なＴ細胞エピトープが存在するらしく、そのうち、Ａ−グリアジン５７−７３がもっと有効性である。ＨＬＡ−ＤＱ２−及びＨＬＡ−ＤＱ８−関連セリアック病は同じＴ細胞特異性を共有しない。
【０２０４】
我々は、グルテンフリーダイエット後のセリアック病の個体の短期間のグルテンチャレンジが末梢血中にてグリアジン特異的Ｔ細胞を誘導することを示した。これらのＴ細胞の頻度は末梢血中で６日目に最大であり、続いて、次の週を通して迅速に弱まる。末梢血のグリアジン特異的Ｔ細胞は消化管の粘膜固有層へのホーミングに関連するインテグリンα４７を発現する。我々は、原型的なグルテンα−グリアジン蛋白質、Ａ−グリアジンにおいてセリアック病に関連したＴ細胞エピトープをマップするためにこのヒト抗原−チャレンジデザインを開発した。トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）による脱アミド化が有る場合も無い場合も１０アミノ酸がオーバーラップする１５マーのペプチドを用いて、我々は、末梢血中で誘導されたＴ細胞が、６５位のグルタミン酸が脱アミド化されたひとつのＡ−グリアジンペプチドの残基５７−７３を最初に標的化することを証明した。当該エピトープはＨＬＡ−ＤＱ２−制限されており、ＨＬＡ−ＤＱ２のセリアック病との密接な関連と一致する。
【０２０５】
コムギ、ライムギ、及びオオムギの暴露によりセリアック病は再活性化される。コムギのグルテンのα／β−グリアジン画分はセリアック病においては一致して毒性であり、そしてほとんどの研究はこれらの蛋白質に焦点を合わせてきた。α／β−グリアジンをコードする遺伝子クラスターはコムギ染色体の６Ｃ上に位置する。ライムギ又はオオムギにはα／β−グリアジンの相同物がない。しかしながら、コムギのグリアジンサブタイプの３つ全て（α／β、γ、及びω）がセリアック病において毒性である。γ−及びω−グリアジン遺伝子はコムギでは染色体１ＡＰＬ上に位置しており、ライムギ及びオオムギのセカリン及びホルデインに相同である。
【０２０６】
パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）においては６１のα−グリアジンに関して同定された遺伝子が今存在する。α−グルテン配列は密接に相同であるが、Ａ−グリアジンにおいて優勢なエピトープは、α−グリアジン配列においてほとんど多型性の領域に由来する。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）は、パンコムギ（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）中に全部で約１５０の異なるα−グリアジン遺伝子が存在するが、多くは偽遺伝子であると見積もった。よって、セリアック病に関連するＴ−細胞のエピトープが公知のα−グリアジン配列中に含まれないことは、ありそうもない。
【０２０７】
我々の研究は、セリアック病に特異的な有効性のＴ細胞エピトープとしてＡ−グリアジン５７−７３にほとんど同一の、脱アミド化されたα−グリアジンペプチドのグループを同定した。９０％を超えるセリアック病患者はＨＬＡ−ＤＱ２＋であり、これまで、我々はグルテンチャレンジ後のＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者のみを査定してきた。しかしながら、ＨＬＡ−ＤＱ２を発現しないセリアック病患者がほとんど皆ＨＬＡ−ＤＱ８を有する。よって、他のコムギ、ライムギ及びオオムギグルテン蛋白質中のＡ−グリアジン５７−７３及びその相同体が、ＨＬＡ−ＤＱ２＋及びＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病の両方においてグルテンチャレンジにより誘導されるＴ細胞により認識される唯一のＴ細胞エピトープであるか否かを知ることは非常に不可欠である。これが事実なら、セリアック病のための治療用のペプチドのデザインは、たった一つのペプチドのみしか必要としないかもしれない。
Ａ−グリアジン５７−７３のＴ細胞エピトープとしての相同体
Ａ−グリアジン５７−７３（ＰＱＬＰＹ＜配列番号：１２＞）のコア配列をコードする穀物遺伝子に関するＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＴｒｅｍｂｌ遺伝子データベースの最初の検索は、α／β−グリアジンを明らかにしただけであった。しかしながら、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５エピトープの我々の初期のマッピング研究は、コア領域（ＰＱＬＰ）中の許容可能な点の置換が限定された数であることを明らかにした（Ｑ６５はエピトープ中で実際に脱アミド化されている）。よって、我々は、配列ＸＸＸＸＸＸＸＰＱ［ＩＬＭＰ］［ＰＳＴ］ＸＸＸＸＸＸ（配列番号：２３）を有するペプチドをコードするＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＴｒｅｍｂｌデータベースの中の遺伝子に我々の検索を拡大した。相同体は、γ−グリアジン、グルテニン、ホルデイン及びセカリンの間に同定された（表１２参照）。さらなる相同体は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて３つのω−グリアジンエントリーの可視検索によりω−グリアジン中に同定された。
【０２０８】
Ａ−グリアジン５７−７３のこれらの相同体は、ｔＴＧによる脱アミド化（又は４つの密接な相同体中のグルタミン酸（ＱＥ）−置換されたバリアントの合成）の後に、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、末梢血単核細胞を用いて、セリアック病の被験者においてグルテンチャレンジ後に査定した。ω−グリアジン配列（ＡＡＧ１７７０２ １４１−１５７）は唯一の生物活性ペプチドであり、約半分がＡ−グリアジン５７−７３として有効である（表１２、及び図２９参照）。よって、優勢なＡ−グリアジンエピトープの相同体の検索は、γ−グリアジン、セカリン、及びホルデインの毒性に関して考慮することを怠った。
方法
全ての可能性のあるコムギグリアジンＴ−細胞エピトープにわたるペプチドのセットのデザイン
公知のパンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）のグリアジン遺伝子又は遺伝子断片によりコードされた全ての可能なＴ細胞エピトープを同定するため（ＧｅｎＢａｎｋ中の６１α／β−，４７γ−，及び３ω−グリアジンエントリー）、遺伝子由来の蛋白質配列を、ＣｕｓｔａｌＷソフトウエア（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）を用いてアラインメントを行い、そして分類することにより系統発生グループ化した（表２２参照）。多くのエントリーは、より長い配列の末端削除を表し、そして多くの遺伝子セグメントは、ポリグルタミン繰り返しの長さ又は稀な置換を除いて同一であった。よって、公知のコムギ遺伝子によりコードされる全ての有力な１２アミノ酸配列を有理化して（ｒａｔｉｏｎａｌｉｚｅ）６５２の２０マーペプチドのセットに含ませることができた。（シグナルペプチド配列は含まれなかった）。ペプチド配列を表２３に掲載する。
包括的エピトープマッピング
４週間グルテンフリーダイエットを受けた健康な対照（ＨＬＡ−ＤＱ２＋ ｎ＝１０，及びＨＬＡ−ＤＱ８＋ ｎ＝１）、及び長期間のグルテンフリーダイエットを受けたセリアック病の被験者（６人のＨＬＡ−ＤＱ２，４人の複合同型接合ＨＬＡ−ＤＱ２／８、及び３人のＨＬＡ−ＤＱ８／Ｘ）（表１３参照）を、グルテンチャレンジの前及び後の６及び７日目に調査した（標準の白パン５０ｇスライス４切れ−セインズベリーズサンドイッチパン、毎日）。末梢血（７日間にわたり全部で３００ｇ）を採血して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配により分離した。ＰＢＭＣを６又は８の２０マーペプチド、又はｔＴＧにより脱アミド化されたか又はされていない単一のペプチドのプールと、一晩、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてインキュベートした。
【０２０９】
ペプチドはＰｅｐｓｅｔｓ（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ Ｉｎｃ．，メルボルン、オーストラリア）において９６のバッチ中で合成した。約０．６マイクロモルの各６５１の２０マーを提供した。２つのマーカー２０マーペプチドを９６の各セットに含ませ（ＶＬＱＱＨＮＩＡＨＧＳＳＱＶＬＱＥＳＴＹ）−ペプチド１６１（配列番号：２４）、そしてＩＫＤＦＨＶＹＦＲＥＳＲＤＡＬＷＫＧＰＧ（配列番号：２５）を逆相−ＨＰＬＣ及びアミノ酸配列分析により特性決定した。これらのマーカーペプチドの平均純度はそれぞれ５０％及び１９％であった。ペプチドを最初にアセトニトリル（１０％）及びＨｅｐｅｓ １００ｍＭから１０ｍｇ／ｍｌに溶解した。
【０２１０】
ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイのためにＰＢＭＣとインキュベートされたプール（又は単独）中の個々のペプチドの最終濃度は２０μｇ／ｍｌであった。ペプチドの５倍濃縮した溶液及び１ｍＭの塩化カルシウムを含むＰＢＳ中のプールを分配して、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて後に使用されるテンプレートに従い９６ウエルプレート中に保存した。モルモット組織ｔＴＧ（Ｓｉｇｍａ Ｔ５３９８）との１００：３２の比における２時間３７℃のインキュベーションにより、脱アミド化されたペプチド及びペプチドのプールを調製した。ペプチド溶液を−２０℃において保存して、使用前に新たに解凍した。
【０２１１】
エンドトキシンフリーの水及び２Ｍ尿素中のグリアジン（Ｓｉｇｍａ Ｇ３３７５）（１００ｍｇ／ｍｌ）を１０分間ボイルし、室温に冷却し、そしてフィルター（０．２μｍ）−滅菌されたＨＣｌ ０．０２Ｍ中のペプシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ６８８７）（２ｍｇ／ｍｌ）又は重炭酸アンモニウム中のキモトリプシン（Ｃ３１４２）（４ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートした。４時間のインキュベーション後に、ペプシン消化されたグリアジンを水酸化ナトリウムにより中和し、そして次にペプシン−消化グリアジン及びキモトリプシン−消化グリアジンの両方を１５分間ボイルした。グリアジンを除いたプロテアーゼとの同一のインキュベーションも実施した。サンプルを１５ ０００ｇにおいて遠心分離し、次に、蛋白質濃度を上清中でＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により見積もった。ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおける最終的な使用の前に、グリアジン−プロテアーゼのアリコートをｔＴＧと共に比率２５００：６４μｇ／ｍｌにてインキュベートした。
【０２１２】
ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｍａｂｔｅｃｈ，スエーデン）を９６−ウエルプレート（ＭＡＩＰ Ｓ−４５，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で、各ウエルが２５μｌのペプチド溶液及び１００μｌのＰＢＭＣ（２−８１０５／ウエル）を、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ中に含むように、実施した。脱アミド化されたペプチドプールを一つの９６−ウエルＥＬＩＳｐｏｔプレート中で査定し、そして第２プレート上で脱アミド化なしのペプチドプール（同一のレイアウト）を０日目及び６日目に査定した。脱アミド化されたペプチドを含むプレート中の全てのウエルがｔＴＧを含んだ（６４μｇ／ｍｌ）。各ＥＬＩＳｐｏｔプレート中に、ペプチドプールを含む８３のウエルが存在し（各ウエル中唯一のプール）、そして「対照」ペプチドのウエルのシリーズ（ペプチドは全て＞９０％の純度、ＭＳ及びＨＰＬＣにより特性決定された、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）：Ｐ０４７２２ ７７−９３（ＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰ（配列番号：２６）、Ｐ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５（二重）（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰ（配列番号：２７）、Ｐ０２８６３ ７７−９３（ＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＳＱＰＱＰ（配列番号：２８）、Ｐ０２８６３ ７７−９３ ＱＥ８５（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＳＱＰＱＰ（配列番号：２９）、及びキモトリプシン消化されたグリアジン（５００μｇ／ｍｌ）、ペプシン消化されたグリアジン（５００μｇ／ｍｌ）、キモトリプシン（２０μｇ／ｍｌ）単独、ペプシン（１０μｇ／ｍｌ）単独、及びブランク（ＰＢＳ＋／−ｔＴＧ）（二重）。
【０２１３】
展開及び乾燥後に、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔプレートをＭＡＩＰ自動化スポット形成ＥＬＩＳｐｏｔカウンターを用いて査定した。ＨＬＡ−ＤＱ２の健康被験者及びセリアック病被験者において、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてペプチドプールによりスポット形成細胞（ｓｆｃ）の誘導を、１００万ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞（ｓｆｃ）マイナスブランクに適用した、一方をつないだ（ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ）Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｍａｔｃｈｅｄ−Ｐａｉｒｓ Ｓｉｇｎｅｄ−Ｒａｎｋｓ試験（ＳＰＳＳソフトウエア）を用いて、６日目体０日目（「正味の応答」）にて試験した。インビボグルテンチャレンジによるＰＢＭＣ中のペプチドプールに対するＩＦＮγ応答の顕著な誘導を、少なくとも１０ｓｆｃ／１００万ＰＢＭＣ及び有意性レベルｐ＜０．０５の中央値の「正味の応答」として定義した。６日目のペプチドの特定のプールに対する顕著な応答に、同日又は７日目に採られたＰＢＭＣを使用して各プール内において個々のペプチドの評価を続けた。
【０２１４】
個々のペプチドのＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイに関して、生物活性を同じＥＬＩＳｐｏｔプレート中で査定されたＰ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５に対する応答のパーセントとして表現した。３６万（範囲：０．３−０．７２）、ＰＢＭＣの中央値を用いて、ブランクに対する中央値の応答（ＰＢＳ単独）はウエルあたり０．２ｓｆｃ（範囲０−５）であり、そしてウエルあたり陽性対照（Ｐ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５）７６．５（範囲２５−３８３）ｓｆｃであった。よって、Ｐ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ６５のパーセンテージとして表現されたブランクに対する中央値の応答は０．２％（範囲：０−６．７）であった。Ｐ０４７２２ ＱＥ８５のそれより１０％高い平均生物活性を有する個々のペプチドを共通の構造上のモチーフに関して分析した。
結果
健康なＨＬＡ−ＤＱ２被験者
１カ月グルテンフリーダイエットを受けた健康なＨＬＡ−ＤＱ２＋被験者の誰も、グルテンチャレンジの前又は後にＡ−グリアジン５７−７３の相同体に対してＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を有さなかった。しかしながら、１０人の健康な被験者のうち９人において、グルテンチャレンジが、グリアジンのペプシン消化及びキモトリプシン消化の両方に対するＩＦＮγ応答の顕著な増加を伴い、０日目の０−４ｓｆｃの中央値／百万から１６−２９ｓｆｃの中央値／百万であった（表１４参照）。健康な被験者のグリアジン応答は脱アミド化により影響されなかった（表１５参照）。健康な被験者のうち、特定のグリアジンペプチドプールに対するＩＦＮγ応答の、グルテンチャレンジとの一致した誘導はなかった（図３０、及び表１６参照）。ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答は場合によりみられたが、弱く、そして脱アミド化により影響されなかった。プールに対するもっとも強い応答の多くも０日目には存在しなかった（表１７、被験者Ｈ２，Ｈ８及びＨ９参照）。４人の健康な被験者はプール５０に対して明確な応答を示し、６日目にもっとも強い応答をもった２人は０日目にも応答を有した。両被験者において、プール５０に対するチャレンジ後の応答はペプチド３９０（ＱＱＴＹＰＱＲＰＱＱＰＦＰＱＴＱＱＰＱＱ（配列番号：３０））によった。
ＨＬＡ−ＤＱ２セリアック病被験者
ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者におけるグルテンチャレンジの後、Ｐ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５に対する中央値のＩＦＮγＥＬＩＳＰｐｏｔ応答は０から１３３ｓｆｃ／百万の中央値から上がった（表４参照）。６人のセリアック病被験者のうちの一人（Ｃ０６）はＰ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５（２ｓｆｃ／百万）に応答せず、そしてグリアジンペプチドプールに弱く応答しただけであった（最大：プール５０＋ｔＴＧ ２７ｓｆｃ／百万）。前の研究に一致して、野生型Ｐ０４７２２の生物活性はｔＴＧによる脱アミド化により６．５倍上昇した（表１５参照）。グリアジン消化に対するインターフェロンガンマ応答はベースラインに存在したが、キモトリプシン−グリアジンに関しては２０から９２ｓｆｃの中央値／百万まで、そしてペプシン−グリアジンに関しては４４から１７６ｓｆｃの中央値／百万まで、グルテンチャレンジにより実質上は増加した。グリアジンの脱アミド化は、キモトリプシン−グリアジンに関して３．２倍の中央値、そしてペプシン−グリアジンに関して１．９倍の中央値だけ生物活性を増加させた（表１５参照）。（ペプシンによる消化に要求される酸性度はグリアジンの部分脱アミド化をもたらすらしい。）
健康な被験者とは対照的に、グルテンチャレンジは、α−，γ−、及びω−グリアジンを含む８３の処理されたプールのうちの２２に対してＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を誘導した（図３１及び表１７参照）。プールの生物活性は被験者間で一致していた（表１８参照）。ペプチドプールにより誘導されたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答は脱アミド化によりほとんどいつも増加した（表１７参照）。だが、脱アミド化によるプールの生物活性の増強は、Ａ−グリアジン５７−７３の相同体を含むプールに関してさえ、Ｐ０４７２２ ７７−７３ ＱＥ８５ほど顕著ではなかった。これは、Ｐｅｐｓｅｔペプチドが合成又は調製の間に部分的に脱アミド化されていたことを示唆し、例えばＰｅｐｓｅｔペプチドはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の塩としてＴＦＡ溶液からの凍結乾燥後にデリバリーされる。
【０２１５】
２１のもっとも生物活性なプールからの１７０の個々のｔＴＧ脱アミド化ペプチドを別々に査定した。７２の脱アミド化ペプチドは均等な濃度においてＰ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５より１０％生物活性が高かった（２０μｇ／ｍｌ）（表１９参照）。５つのもっとも有効なペプチド（Ｐ０４７２２ ＱＥ８５の８５−９４％の生物活性）は、以前にα−グリアジン相同Ａ−グリアジン５７−７３として同定された。５０の生物活性ペプチドはＡ−グリアジン５７−７３と相同でなかったが、構造上関連する配列の６ファミリーに分類できた（表２０参照）。各々のペプチドファミリーのもっとも生物活性な配列は：ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ（配列番号：３１）（ペプチド６２６、Ｐ０４７２２ ＱＥ８５の中央値７２％生物活性）、ＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＯＬＰＦＰＱＱ（配列番号：３２）（３４３、３４％）、ＱＡＦＰＱＰＱＱＴＦＰＨＱＰＱＱＱＦＰＱ（配列番号：３３）（３５５、２７％）、ＴＱＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＴＱ（配列番号：３４）（３９６、２３％）、ＰＩＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：３５）（６２５、２２％）、ＰＱＱＳＦＳＹＱＱＱＰＦＰＱＱＰＹＰＱＱ（配列番号：３６）（６１８、１８％）（コア配列に下線を引く）であった。これらの配列の全ては、トランスグルタミナーゼによる脱アミド化に感受性であると予測されたグルタミン残基を含む（例えば、ＱＸＰ，ＱＸＰＦ（配列番号：３７），ＱＸＸ［ＦＹ］（配列番号：３８））（Ｖａｄｅｒ ｅｔ ａｌ ２００２参照）。幾つかの生物活性ペプチドは異なるファミリーからの２つのコア配列を含む。
【０２１６】
異なるＴ細胞集団が別のコア配列を有するエピトープに応答するという可能性と一致して、異なるファミリーからのペプチドの生物活性は付加的らしい。例えば、ｔＴＧ処理されたプール８１の中央値生物活性はＰ０４７２２ ＱＥ８５の１４１％であったが、個々のペプチドの生物活性は：ペプチド６３１（Ａ−グリアジン５７−７３の相同体）６１％、６３６（６２６の相同体）５１％、そして６３５ １９％、６２９ １６％、そして６３４ １３％（全て３９６の相同体）の順位の序列であった。
【０２１７】
単純化しすぎたかもしれないが、グリアジンペプチドに対する合計のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答に対する各「ペプチドファミリー」の貢献をＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者において比較した（図３２参照）。従って、グリアジンペプチドに対する合計の応答に対するＰ０４７２２ ７７−７３ Ｅ８５の貢献は、１／５と２／３の間であった。
【０２１８】
インターネットのワールドワイドウエブ、例えば「ｃｂｒｇ．ｉｎｆ．ｅｔｈｚ．ｃｈ／ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ３＿１＿５．ｈｔｍｌ」を通してアクセス可能な、ペプチド相同性検索プログラム、ＷＷＷ ＰｅｐＰｅｐＳｅａｒｃｈを用いて、及びライムギのセカリンのＧｅｎＢａｎｋ配列との直接の比較により、厳密な適合が、オオムギのホルデイン（ＨＯＲ８）及びライムギセカリン（Ａ２３２７７，ＣＡＡ２６４９９，ＡＡＧ３５５９８）中にコア配列：ＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：３９）及びオオムギホルデイン（ＨＯＧ１及びＨＯＲ８）中にコア配列：ＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：４０）に関して厳密な適合が発見され、そしてＰＩＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰ（配列番号：４１）に関して、オオムギホルデイン（ＨＯＲ８）中に発見された。
ＨＬＡ−ＤＱ８関連セリアック病
７人のＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病被験者をグルテンチャレンジの前と後に研究した。これらのＨＬＡ−ＤＱ８＋（ＨＬＡ−ＤＱＡ０＊０３０１−３，ＨＬＡ−ＤＱＢ０＊０３０２）被験者のうちの５人も、セリアック病関連ＨＬＡ−ＤＱ２複合体（ＤＱＡ０＊０５，ＤＱＢ０＊０２）の一方又は両方を有した。両方のセリアック病関連ＨＬＡ−ＤＱ複合体を有する３人の被験者のうちの２人は、質的及び量的にＨＬＡ−ＤＱ２セリアック病被験者と同一であったグリアジンペプチドプール（及びＰ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５を含む個々のペプチド）に対して有効な応答性を有した（図３３及び３４、及び表１８を参照）。脱アミド化されたペプチドプール７４は両ＨＬＡ−ＤＱ２／８被験者において生物活性であったが、６人のＨＬＡ−ＤＱ２／Ｘ被験者の一人においてのみであった。プール７４のｔＴＧによる前処理は生物活性を３．８倍から２２倍増強し、そして３人の応答者におけるｔＴＧ処理されたプール７４の生物活性は、Ｐ０４７２２ ７７−９３ Ｅ８５の生物活性の７８％及び３５０％の間に等しい。現在、何れのペプチドが被験者Ｃ０２，Ｃ０７及びＣ０８においてプール７４において生物活性であるかわかっていない。
【０２１９】
セリアック病に関連したＨＬＡ−ＤＱ２対立遺伝子の両方又は一方を欠く４人のＨＬＡ−ＤＱ８セリアック病被験者のうちの２人はグリアジンペプチドプールに対して極めて弱いＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答しか示さなかったが、残りの２人はプロテアーゼ−消化されたグリアジン及び特異的ペプチドプールの両方に応答した。被験者Ｃ１２（ＨＬＡ−ＤＱ７／８）は、脱アミド化されたプール１−３に対して激しく応答した（図３５参照）。これらのプールにおける個々のペプチドの評価は、コア配列ＬＱＰＱＮＰＳＱＱＱＰＱ（配列番号：４２）を含む一連の密接に関連した生物活性ペプチドを同定した（表２０参照）。以前の研究（我々による）は、この配列中の３つのグルタミン残基がｔＴＧ媒介脱アミド化に感受性であることを証明した（下線）。ＷＷＷ ＰｅｐＰｅｐＳｅａｒｃｈを用いた相同性検索は、コムギα−グリアジンにおいてのみＬＱＰＱＮＰＳＱＱＱＰＱ（配列番号：４３）に対して密接な適合を同定した。
【０２２０】
４人のＨＬＡ−ＤＱ８被験者（Ｃ１１）は、ｔＴＧ処理されたプール３３に対して誘導可能なＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を有した（図３６参照）。プール３２及び３３はｔＴＧによる脱アミド化後に活性な以前に定義されたＨＬＡ−ＤＱ８制限されたグリアジンエピトープ（ＱＱＹＰＳＧＱＧＳＦＱＰＳＱＱＮＰＱ（配列番号：４４））の多型を含む（下線を引かれたＧｌｎは脱アミド化されて生物活性を運ぶ）（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌ ｅｔ ａｌ １９９８）。現在、何れのペプチドがプール３３において被験者Ｃ１１において生物活性であるか分かっていない。
【０２２１】
インビボグルテンチャレンジ及びコムギグリアジン中の全ての公知の１２アミノ酸配列にわたる６５２ペプチドのセットを使用した、ＨＬＡ−ＤＱ２関連セリアック病における包括的Ｔ細胞エピトープマッピングは、即ち、公知のα−グリアジンエピトープ、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の１０％の生物活性の少なくとも７２のペプチドを同定した。しかしながら、これらの生物活性ペプチドはほんの５つほどの異なるが密接に関連したペプチドファミリーのセットに減らされ得る。ほとんど全てのこれらペプチドは、プロリン、グルタミン、フェニルアラニン、及び／又はチロシンが豊富であり、そして配列ＰＱ（ＱＬ）Ｐ（ＦＹ）Ｐ（配列番号：４５）を含む。この配列はｔＴＧによる２位のＱの脱アミド化を促進させる。Ａ−グリアジン５７−６８の脱アミド化による類推により（Ａｒｅｎｔｚ−Ｈａｎｓｅｎ ２０００）、ｔＴＧによる脱アミド化により広く見いだされたこれらのペプチドの増強された生物活性は、ＨＬＡ−ＤＱ２に関する結合の親和性の増加よるかもしれない。
【０２２２】
これらの生物活性グリアジンペプチドの一つより多くをインビボにおいて認識するＴ細胞の間の交差反応性は起こり得る。しかしながら、関連するペプチドの各セットが別のＴ細胞集団をインビボにおいて活性化するなら、Ａ−グリアジン５７−７３ Ｅ６５に相当するエピトープはもっとも有効であり、そしてグルテンチャレンジの後のグリアジンに対する応答においてＩＦＮγを分泌する末梢血Ｔ細胞の少なくとも４０％により広く認識される。
【０２２３】
非グリアジン−ペプチド特異的応答が、ＨＬＡ−ＤＱ２／Ｘ関連のセリアック病におけるものと質的に異なったＨＬＡ−ＤＱ２／８セリアック病において見いだされた。しかしながら、ＨＬＡ−ＤＱ２対立遺伝子の両方を持たないＨＬＡ−ＤＱ８＋のセリアック病被験者の末梢血Ｔ細胞は、Ａ−グリアジン５７−７３ Ｅ６５相同体を認識しなかった。２つの異なるエピトープが２つのＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病において優勢であった。れらのＨＬＡ−ＤＱ８＋の個体における優勢なエピトープは以前に同定されていなかった（ＬＱＰＱＮＰＳＱＱＱＰＱ（配列番号：４６））。
【０２２４】
本明細書中の教示を仮定すれば、共通に認識されるＴ細胞エピトープの全てを利用してセリアック病のための免疫治療のデザインが実用的になり、６より少ない異なるペプチドを含むかもしれない。コムギのγ−及びω−グリアジン中のエピトープは、オオムギホルデイン及びライムギセカリン中にも存在する。
実施例１４
幾つかのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを前記のとおりに実施して、以下の結果及び／又は結論を生じた：
ＰＱＬＰＹによる複数のα−グリアジン多型の拡大
Ａ−グリアジン５７−７３ＱＥの有効なアゴニスト（Ｇ０１）は、ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（Ｇ０１），ＰＱＬ−Ｙ−−−−−−−−−−−−−−Ｐ（Ｇ１０），及びＰＱＰＱＰＦＬ−−−−−−−−−−−−−（Ｇ１２）を含む。有効性が劣るのは、−−−−−−−−−−−−Ｌ−−−−−−−−Ｐ（Ｇ０４），−−−−−−−−−−−−−Ｒ−−−−−−−−−−−Ｐ（Ｇ０５），及び−−−−−−−−−−−−Ｓ−−−−−Ｐ（Ｇ０６）を含む。有効性がさらに劣るのは、−−−−−−Ｌ−−−−−−−−Ｓ−−−−−Ｐ（Ｇ０７），−−−−−Ｓ−−−−−−−−−−Ｓ−−−−−−−−−Ｐ（Ｇ０８）−−−−−−−−−−−−−−−Ｓ−−Ｓ−−−−−Ｐ（Ｇ０９），及びＰＱＰＱＰＦＰ−−−−−−−−−−−−−−−−−（Ｇ１３）を含む。ダッシュは特定の位置におけるＧ０１配列との同一性を示す。
グルテンチャレンジは新たに診断されたセリアック病においてたった２週間のグルテンフリーダイエット後にＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５ Ｔ細胞を含む
追加の分析は、ｔＴＧ脱アミド化されたグリアジン応答が新たに診断されたセリアック病において２週間後に変化することを示した。他の分析は、脱アミド化されたグリアジン特異的Ｔ細胞がＣＤ４＋α４β７＋ＨＬＡ−ＤＱ２制限されることを示した。
最適なエピトープ（クローン対グルテンチャレンジ）
「優勢な」エピトープがγＩＦＮ ＥＬＩＳｐｏｔによりグルテンチャレンジ後に定義される。ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（１００％ＥＬＩＳｐｏｔ応答）。腸のＴ細胞クローンにより定義されたエピトープ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（２７％），ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹ（５２％），及びＯＯＬＰＱＰＥＱＰＱＱＳＦＰＥＱＥＲＰＦ（９％）。
個々のペプチド配列間の順位
順位はコムギ又はライムギに依存する。コムギに関して、優勢なペプチドは、ペプチド番号８９、９０及び９１を含む（表２３における番号を参照）。ライムギに関して、優勢なペプチドは、ペプチド番号３６８、３６９、３７０、３７１、及び３７２を含む（表２３における番号を参照）。６３５及び６３６（表２３における番号を参照）を含む幾つかのペプチドは、ライムギ及びコムギの両方において活性を示した。
インビボグルテンチャレンジはＴ細胞エピトープのヒエラルキーがセリアック病に関して定義されることを可能にする
エピトープのヒエラルキーはＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病の間で一致しているが、ＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病に関しては異なる。ヒエラルキーはコムギ穀物が消費されることに依存する。脱アミド化はほとんど全てのグリアジンエピトープを生成する。ＨＬＡ−ＤＱ２，ＤＱ８及びＤＲ４が脱アミド化されたペプチドを提示する。ＨＬＡ−ＤＱ２／８−関連のセリアック病は優先的にＤＱ２−関連グリアジンエピトープを提示する。グリアジンエピトープは、エピトープに基づく治療剤の開発を正当であると理由付けするのに十分制限される。
【０２２５】
他の分析は以下を示した：ＨＬＡ−ＤＲ３−ＤＱ２（８５−９５％）及びＨＬＡ−ＤＲ４−ＤＱ８（５−１５％）。
【０２２６】
他の分析は以下を示した：
【０２２７】
【表２】
【０２２８】
被験者１２のプール１−３において個々のｔＴＧ−脱アミド化されたペプチドの生物活性を測定するために、別の分析を実施した。結果は次のとおりである（配列の番号は表２３に掲載されたペプチドを指す）：配列８（１００％），配列５（８５％）、配列６（８２％）、配列３（７７％）、配列１（６７％）、配列２（５９％）、配列９（４９％）、配列７（４９％）、配列１０（３３％）、配列４（１５％）、配列１２（８％）、配列１１（０％）、配列２３（２６％）、配列１４（１８％）、配列１５（１８％）、配列１７（１８％）、配列１６（１３％）、配列１４（８％）、配列２２（５％）、配列１８（３％）、配列１９（３％）、配列２０（０％）、配列２１（０％）。予測された脱アミド化配列はＬＱＰＥＮＰＳＱＥＱＰＥである。
ＰＢＭＣによる個々のＥＬＩＳｐｏｔ応答（ＥＬＩＳｐｏｔリーダーにより測定されたスポット形成細胞）
【０２２９】
【表３】
【０２３０】
交差反応性
２９人の被験者の６５２のペプチドからのデータを扱うため、又は特定の応答が真実の陽性のペプチド特異的Ｔ細胞応答であるかを決定するため、又はペプチドに対する応答が別の構造上関連するペプチドとの交差反応性によるかを決定するために、特定のペプチド応答の発現を「優勢な」ペプチド応答のパーセンテージとすることができる。或いは、当該発現はペプチド応答間の相関係数としての「遅延（ｒｅｔａｒｄｎｅｓｓ）」とし得るか、又はバイオインフォマティックスにより得る。
追加のエピトープ
代表的な結果は次の通りである：
ペプチドのＰ０４７２２Ｅとの組み合わせ（全て２０ｍｃｇ／ｍｌ）（ｎ＝４）
単独 Ｐ０４７２２Ｅ＋
Ｐｅｐ６２６ ６０ １３５
Ｐ０４７２２Ｅ １００ １１０
ＨＬＡａ ０ ８５
（Ｐ０４７２２Ｅのパーセントとして表された）
６２６＋ｔＴ：ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ
０４７２２Ｅ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＬ
ペプチド６２６のｔＴＧ脱アミド化（ｎ＝１２）
ｔＴＧなし＝１００％
ｔＴＧ＝１７０％
特定の位置における置換
ペプチド６２６ＰＱＱＰ［Ｑ１］ＱＰ［Ｑ２］ＱＰＦＰＱＰ［Ｑ３］ＱＰＦＰＶの置換（ｎ＝１２）
Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｑ１ ９５ ９０
Ｑ２ １４５ ８０
Ｑ３ １５５ １０
（野生型ペプチドのパーセントとして表された）
ｔＴＧ処理された１５マーに及ぶペプチド６２６／６２７（ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷＱＰ）（ｎ＝８）
Ｐ１−１５ ５
Ｐ２−１６ ４
Ｐ３−１７ ３
Ｐ４−１８ ３８
Ｐ５−１９ ６５
Ｐ６−２０ ９５
Ｐ７−２１ ６５
Ｐ８−２２ ９０
（最大の１５マー応答のパーセントとして表された）
複数エピトープ：
Ｐ０４７２２Ｅ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬ
６２６＋ｔＴＧ：ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ
最小エピトープ：ＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ
抗−ＣＤ４によりコードされたビーズ及び抗インテグリンβ７によるＰＢＭＣの免疫磁気除去はＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を除去させたが、抗−ＣＤ８によりコードされたビーズ又は抗アルファＥインテグリンによるＰＢＭＣの免疫磁気除去はそうでなかった。即ち、ＩＦＮγを分泌するＰＢＭＣはＣＤ４＋及びα４β７＋であり、消化管内の粘膜固有層へのホーミングに関連した。
【０２３１】
ＨＬＡ−ＤＱ２に関して異型接合及び同型接合においては、抗−ＤＱ抗体によりブロックされたが抗−ＤＲ抗体によりブロックされなかった。これは一つの配列中の複数のエピトープを暗示するかもしれない。
セリアック病のＴ細胞エピトープ
他の研究者らは、特定の腸Ｔ細胞クローンエピトープを特性決定した。例えば、Ｖａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２，１２２：１７２９−３７；Ａｒｅｎｔｚ−Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２，１２３：８０３−８０９を参照。これらは、Ｔ細胞をクローン化するために使用されたインビトロ技術のためにその関係がいくらよく見ても不明であるエピトープの例である。
腸対末梢血クローン
腸：１）腸生検、２）グルテンのペプシン−トリプシン消化に対して生じさせたＴ細胞クローン、３）全てＨＬＡ−ＤＱ２制限される、４）クローンはトランスグルタミナーゼにより脱アミド化されたグリアジンに応答する。
末梢血：グルテンに対して生じさせたＴ細胞クローンはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＱ及びＤＰ制限される。結果：腸Ｔ細胞クローンはセリアック病関連エピトープをマップするのに限定的に使用することができる。
ＧＤＡ＿９コムギ３０７ａａ定義アルファ／ベータ−グリアジンＭＭ１前駆体（プロラミン）受け入れ番号Ｐ１８５７３−−ＧｅｎＢａｎｋ（その全体を引用により本明細書に編入する）
腸Ｔ細胞クローンエピトープ
腸Ｔ細胞クローンエピトープの定義は、例えば、Ａｒｅｎｔｚ−Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０００，１９１：６０３−１２に見いだすことができる。また、腸Ｔ細胞クローンに関するグルテンエピトープも開示されている。脱アミド化されたＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹがエピトープであり、ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹの脱アミド化配列もある。ＨＬＡ−ＤＱ２制限がある。相同性検索は他の生物活性γアルファ−グリアジンがＰＱＰＱＬＰＹを単独又は二重に含むことを示す。大多数のＴ細胞クローンはＤＱ２−αＩ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ ＤＱ２−αＩＩ：ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹの何れかに応答する。
優勢なグリアジンＴ細胞エピトープ
全てトランスグルタミナーゼにより脱アミド化される。
グルテンチャレンジ６日後の末梢血：Ａ−グリアジン５７−７３：
ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ
腸Ｔ細胞クローン：ＤＱ２−αＩ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ ＤＱ２−αＩＩ：ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹ
腸Ｔ細胞クローンエピトープマッピング
【０２３２】
【表４】
【０２３３】
末梢血におけるＩＦＮγ−分泌Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５−特異的Ｔ細胞のグルテン暴露及び誘導
未処理のセリアック病を１、２又は８週間グルテンフリーダイエットさせ、次にグルテン暴露し（３日 パン２００ｇ／日）、次にグルテンフリーダイエットをさせた。
【０２３４】
結果１：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（０）、１週（１）、２週（２）、８週（１）
６日目：なし（０）、１週（４）、２週（２８）、８週（４８）
結果２：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：ｔＴＧ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（４５）、１週（６２）、２週（５）、８週（５）
６日目：なし（０）、１週（６７）、２週（４０）、８週（６０）
結果３：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：Ａ−グリアジン５７−７３ Ｐ６５（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（１）、１週（２）、２週（１）、８週（１）
６日目：なし（０）、１週（０）、２週（０）、８週（０）
結果４：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：ＰＰＤ（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（９０）、１週（８８）、２週（２１０）、８週（１５０）
６日目：なし（０）、１週（１００）、２週（２１０）、８週（１００）
結果５：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：ｔＴＧ（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（５）、１週（４）、２週（３）、８週（２）
６日目：なし（０）、１週（４）、２週（１）、８週（２）
長期間のグルテンに対するＨＬＡ−ＤＱ２セリアック病におけるグルテンチャレンジ
抗グリアジンＴ細胞応答の特性決定を、末梢血において、３日間のグルテンチャレンジの６−８日後に実施した。
結果１：ＰＢＭＣ ６日目長期間グルテンフリーダイエット（抗ＨＬＡ−ＤＲ及び−ＤＱ抗体と前インキュベーション）（％阻害として表現）
ＤＲ−：ｔＴＧ−グリアジン１００ｍｃｇ／ｍｌ（１０５），Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５ ５０ｍｃｇ／ｍｌ（９０），ＰＰＤ ５ｍｃｇ／ｍｌ（３０）
ＤＱ−：ｔＴＧ−グリアジン １００ｍｃｇ／ｍｌ（５），Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５ ５０ｍｃｇ／ｍｌ（２２），ＰＰＤ ５ｍｃｇ／ｍｌ（７８）。
【０２３５】
結果２：ＰＢＭＣ ６日目長期間グルテンフリーダイエット（％ＣＤ８−除去ＰＢＭＣ応答として表現）
Ｂ７除去：ｔＴＧ−グリアジン ｎ＝６（７），Ａ−グリアジン５７−７３ ｎ＝９（６），ＰＰＤ ｎ＝８（６２）
ＡＥ除去：ｔＴＧ−グリアジン ｎ＝６（１２０），Ａ−グリアジン５７−７３ ん＝９（８０）、ＰＰＤ ｎ＝８（１１０）。
【０２３６】
ＣＤ４除去：ｔＴＧ−グリアジン ｎ＝６（１０），Ａ−グリアジン５７−７３ ｎ＝９（９），ＰＰＤ ｎ＝８（１０）。
治療用ペプチドは限定ではないが以下を含む
【０２３７】
【表５】
【０２３８】
簡単には、経口の抗原チャレンジ後に、末梢血Ｔ細胞の特異性が腸のＴ細胞クローンの特異性を反映する。末梢血においては、腸Ｔ細胞クローンのエピトープは、最適なα−グリアジンエピトープであるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に比較して準最適である。
実施例１５
以下のとおりのマッピング目的のためにもＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。
優勢なＤＱ−８関連エピトープのファインマッピング
【０２３９】
【表６】
【０２４０】
優勢なエピトープのファインマッピング（２）
【０２４１】
【表７】
【０２４２】
実施例１６
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔにおけるグリアジンエピトープの生物活性（２５ｍｃｇ／ｍｌ，ｎ＝６）（Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％として表された）
ＤＱ２−ＡＩＩ：野生型（ＷＴ）（４），ＷＴ＋ｔＴＧ（５２），Ｇｌｕ−置換された（５２）
ＤＱ２−ＡＩ：野生型（ＷＴ）（２），ＷＴ＋ｔＴＧ（２２），Ｇｌｕ−置換された（２８）
ＧＤＡ０９：野生型（ＷＴ）（１），ｔＴＧ（７），Ｇｌｕ−置換された（８）
Ａ−Ｇ３１−４９：野生型（ＷＴ）（２），ｔＴＧ（３），Ｇｌｕ−置換された（０）
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（Ｇ０１Ｅ）の用量応答（ｎ＝８）（Ｇ０１Ｅの最大応答の％として表された）
０．０２５ｍｃｇ／ｍｌ（１），０．０５ｍｃｇ／ｍｌ（８），０．１ｍｃｇ／ｍｌ（１０），０．２５ｍｃｇ／ｍｌ（２２），０．５ｍｃｇ／ｍｌ（３８）＜１ｍｃｇ／ｍｌ（４３），２．５ｍｃｇ／ｍｌ（５２），５ｍｃｇ／ｍｌ（７０），１０ｍｃｇ／ｍｌ（８１），２５ｍｃｇ／ｍｌ（９５），５０ｍｃｇ／ｍｌ（９０），１００ｍｃｇ／ｍｌ（８５）。
【０２４３】
単独又はＡ−グリアジン５７−７５（Ｇ０１Ｅ）と混合されたグリアジンエピトープに対するＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答（全て５０ｍｃｇ／ｍｌ，ｔＴＧ−グリアジン１００ｍｃｇ／ｍｌ，ＰＰＤ ５ｍｃｇ／ｍｌ；ｎ＝９）（Ｇ０１Ｅ応答の％として表された）
単独：ＤＱ２−Ａ１（２０），ＤＱ２−Ａ２（５５），オメガＧ１（５０），ｔＴＧグリアジン（８０）、ＰＰＤ（２２０），ＤＱ２バインダー（０）
Ｇ０１Ｅ＋：ＤＱ２−Ａ１（９０），ＤＱ２−Ａ２（９５），オメガＧ１（１００），ｔＴＧグリアジン（１２０）、ＰＰＤ（２８０），ＤＱ２バインダー（８０）
個々のセリアック病被験者におけるＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答に対するＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のアラニン及びリジン置換の効果（ｎ＝８）
エピトープ配列：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ
５７−５９位及び７２−７３位におけるアラニンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において、ほとんど又は全く低下を示さなかった。６０−６２位及び６８−７１位におけるアラニンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において穏やかな低下を示した。６３−６７位におけるアラニンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において最大の低下を示した。
個々のセリアック病被験者におけるＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答に対するＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のリジン置換の効果（ｎ＝８）
エピトープ配列：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ
５７−５９位及び７１−７３位におけるリジンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において、ほとんど又は全く低下を示さなかった。６０−６１位及び６９−７０位におけるリジンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において穏やかな低下を示した。６２−６８位におけるリジンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において最大の低下を示した。
実施例１７
表２４は、コムギ又はライムギでチャレンジした数人の患者を用いた６５２のペプチドを試験する分析の結果を示す。
【０２４４】
【表８】
【０２４５】
本明細書において引用されたか又は言及されたＰＣＴの公表、合衆国特許、他の特許、定期刊行物、及びあらゆるその他の刊行物はそれらの全体を引用により本明細書に編入する。
【０２４６】
【表９】
【０２４７】
【表１０】
【０２４８】
【表１１】
【０２４９】
【表１２】
【０２５０】
【表１３】
【０２５１】
【表１４】
【０２５２】
【表１５】
【０２５３】
【表１６】
【０２５４】
【表１７】
【０２５５】
【表１８】
【０２５６】
【表１９】
【０２５７】
【表２０】
【０２５８】
【表２１】
【０２５９】
【表２２】
【０２６０】
【表２３】
【０２６１】
【表２４】
【０２６２】
【表２５】
【０２６３】
【表２６】
【０２６４】
【表２７】
【０２６５】
【表２８】
【０２６６】
【表２９】
【０２６７】
【表３０】
【０２６８】
【表３１】
【０２６９】
【表３２】
【０２７０】
【表３３】
【０２７１】
【表３４】
【０２７２】
【表３５】
【０２７３】
【表３６】
【０２７４】
【表３７】
【０２７５】
【表３８】
【０２７６】
【表３９】
【０２７７】
【表４０】
【０２７８】
【表４１】
【０２７９】
【表４２】
【０２８０】
【表４３】
【０２８１】
【表４４】
【０２８２】
【表４５】
【０２８３】
【表４６】
【０２８４】
【表４７】
【０２８５】
【表４８】
【０２８６】
配列表
【０２８７】
【表４９−１】
【０２８８】
【表４９−２】
【０２８９】
【表４９−３】
【０２９０】
【表４９−４】
【０２９１】
【表４９−５】
【０２９２】
【表４９−６】
【０２９３】
【表４９−７】
【０２９４】
【表４９−８】
【０２９５】
【表４９−９】
【０２９６】
【表４９−１０】
【０２９７】
【表４９−１１】
【０２９８】
【表４９−１２】
【０２９９】
【表４９−１３】
【０３００】
【表４９−１４】
【０３０１】
【表４９−１５】
【０３０２】
【表４９−１６】
【０３０３】
【表４９−１７】
【０３０４】
【表４９−１８】
【０３０５】
【表４９−１９】
【０３０６】
【表４９−２０】
【０３０７】
【表４９−２１】
【０３０８】
【表４９−２２】
【０３０９】
【表４９−２３】
【０３１０】
【表４９−２４】
【０３１１】
【表４９−２５】
【０３１２】
【表４９−２６】
【０３１３】
【表４９−２７】
【０３１４】
【表４９−２８】
【０３１５】
【表４９−２９】
【０３１６】
【表４９−３０】
【０３１７】
【表４９−３１】
【０３１８】
【表４９−３２】
【０３１９】
【表４９−３３】
【０３２０】
【表４９−３４】
【０３２１】
【表４９−３５】
【０３２２】
【表４９−３６】
【０３２３】
【表４９−３７】
【０３２４】
【表４９−３８】
【０３２５】
【表４９−３９】
【０３２６】
【表４９−４０】
【０３２７】
【表４９−４１】
【０３２８】
【表４９−４２】
【０３２９】
【表４９−４３】
【０３３０】
【表４９−４４】
【０３３１】
【表４９−４５】
【０３３２】
【表４９−４６】
【０３３３】
【表４９−４７】
【０３３４】
【表４９−４８】
【０３３５】
【表４９−４９】
【０３３６】
【表４９−５０】
【０３３７】
【表４９−５１】
【０３３８】
【表４９−５２】
【０３３９】
【表４９−５３】
【０３４０】
【表４９−５４】
【０３４１】
【表４９−５５】
【０３４２】
【表４９−５６】
【０３４３】
【表４９−５７】
【０３４４】
【表４９−５８】
【０３４５】
【表４９−５９】
【０３４６】
【表４９−６０】
【０３４７】
【表４９−６１】
【０３４８】
【表４９−６２】
【０３４９】
【表４９−６３】
【０３５０】
【表４９−６４】
【０３５１】
【表４９−６５】
【０３５２】
【表４９−６６】
【０３５３】
【表４９−６７】
【０３５４】
【表４９−６８】
【０３５５】
【表４９−６９】
【０３５６】
【表４９−７０】
【０３５７】
【表４９−７１】
【０３５８】
【表４９−７２】
【０３５９】
【表４９−７３】
【０３６０】
【表４９−７４】
【０３６１】
【表４９−７５】
【０３６２】
【表４９−７６】
【０３６３】
【表４９−７７】
【０３６４】
【表４９−７８】
【０３６５】
【表４９−７９】
【０３６６】
【表４９−８０】
【０３６７】
【表４９−８１】
【０３６８】
【表４９−８２】
【０３６９】
【表４９−８３】
【０３７０】
【表４９−８４】
【０３７１】
【表４９−８５】
【０３７２】
【表４９−８６】
【０３７３】
【表４９−８７】
【０３７４】
【表４９−８８】
【０３７５】
【表４９−８９】
【０３７６】
【表４９−９０】
【０３７７】
【表４９−９１】
【０３７８】
【表４９−９２】
【０３７９】
【表４９−９３】
【０３８０】
【表４９−９４】
【０３８１】
【表４９−９５】
【０３８２】
【表４９−９６】
【０３８３】
【表４９−９７】
【０３８４】
【表４９−９８】
【０３８５】
【表４９−９９】
【０３８６】
【表４９−１００】
【０３８７】
【表４９−１０１】
【０３８８】
【表４９−１０２】
【０３８９】
【表４９−１０３】
【０３９０】
【表４９−１０４】
【０３９１】
【表４９−１０５】
【０３９２】
【表４９−１０６】
【０３９３】
【表４９−１０７】
【０３９４】
【表４９−１０８】
【０３９５】
【表４９−１０９】
【０３９６】
【表４９−１１０】
【０３９７】
【表４９−１１１】
【０３９８】
【表４９−１１２】
【０３９９】
【表４９−１１３】
【０４００】
【表４９−１１４】
【０４０１】
【表４９−１１５】
【０４０２】
【表４９−１１６】
【０４０３】
【表４９−１１７】
【０４０４】
【表４９−１１８】
【０４０５】
【表４９−１１９】
【０４０６】
【表４９−１２０】
【０４０７】
【表４９−１２１】
【０４０８】
【表４９−１２２】
【０４０９】
【表４９−１２３】
【０４１０】
【表４９−１２４】
【０４１１】
【表４９−１２５】
【０４１２】
【表４９−１２６】
【０４１３】
【表４９−１２７】
【０４１４】
【表４９−１２８】
【０４１５】
【表４９−１２９】
【０４１６】
【表４９−１３０】
【０４１７】
【表４９−１３１】
【０４１８】
【表４９−１３２】
【０４１９】
【表４９−１３３】
【０４２０】
【表４９−１３４】
【０４２１】
【表４９−１３５】
【０４２２】
【表４９−１３６】
【０４２３】
【表４９−１３７】
【０４２４】
【表４９−１３８】
【０４２５】
【表４９−１３９】
【０４２６】
【表４９−１４０】
【０４２７】
【表４９−１４１】
【０４２８】
【表４９−１４２】
【０４２９】
【表４９−１４３】
【０４３０】
【表４９−１４４】
【０４３１】
【表４９−１４５】
【０４３２】
【表４９−１４６】
【０４３３】
【表４９−１４７】
【０４３４】
【表４９−１４８】
【０４３５】
【表４９−１４９】
【０４３６】
【表４９−１５０】
【０４３７】
【表４９−１５１】
【０４３８】
【表４９−１５２】
【０４３９】
【表４９−１５３】
【０４４０】
【表４９−１５４】
【０４４１】
【表４９−１５５】
【０４４２】
【表４９−１５６】
【０４４３】
【表４９−１５７】
【０４４４】
【表４９−１５８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリアック病の診断及び治療に有用なエピトープに関し、診断剤、治療剤、キット、及び前記の使用方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
ダイエット中のグリアジン（グルテンの成分）に対する免疫反応がセリアック病を引き起こす。腸組織中の免疫応答は腸のトランスグルタミナーゼにより修飾されたグリアジンに優先的に応答する。セリアック病は抗−筋内膜抗体の検出により診断されるが、これは腸の生検内のリンパ球の炎症の発見による確認を必要とする。そのような生検の取得は患者にとって快適ではない。
【０００３】
研究者は、腸のＴ細胞応答のみがグリアジンに対する免疫応答の正確な指標を提供すると、以前に仮定した。よって、彼らは、腸の組織内のＴ細胞の応答の研究に集中してきた１。トランスグルタミナーゼの修飾を必要とする（それらが免疫系により認識される前に）グリアジンエピトープは公知である２。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】1. MolbergO, etal. NatureMed.4, 713-717 (1998).
【非特許文献２】2. Quarsten H, et al. Eur. J. Immunol. 29, 2506-2514 (1999).
【非特許文献３】3. Greenberg CS et al. FASEB 5, 3071-3077 (1991).
【非特許文献４】4. Mantzaris G, Jewell D. Scand. J. Gastroenterol. 26, 392-398 (1991).
【非特許文献５】5.Mauri L, et al. Scand. J. Gastroenterol. 31, 247-253 (1996).
【非特許文献６】6. BuncoM, et al. Tissue Antigens 46, 355-367 (1995).
【非特許文献７】7. OlerupO, etal. Tissueantigens 41, 119-134 (1993).
【非特許文献８】8. Mullighan CG, et al. Tissue-Antigens. 50, 688-92 (1997).
【非特許文献９】9. PlebanskiM et al. Eur. J. Immunol. 28, 4345-4355 (1998).
【非特許文献１０】10. Anderson DO, Greene FC. The alpha-gliadin gene family. II. DNA and protein sequence variation, subfamily structure, and origins of pseudogenes. Theor Appl Genet (1997) 95 : 59-65.
【非特許文献１１】11. Arentz-HansenH, Korner R, Molberg O,Quarsten H, Van der Wal Y, Kooy YMC, Lundin KEA, Koning F, Roepstorff P, Sollid LM, McAdam SN. The intestinal T cell response to alpha-gliadin in adult celiac disease is focused on a single deamidated glutamine targeted by tissue transglutaminase. J Exp Med. 2000 ; 191 : 603-12.
【非特許文献１２】12. Vader LW, de Ru A, van der Wal, Kooy YMC, Benckhuijsen W, Mearin ML, DrijfhoutJW, van Veelen P, Koning F. Specificity of tissue transglutaminase explains cereal toxicity in celiac disease. J Exp Med 2002 ; 195 : 643-649.
【非特許文献１３】13. van der Wal Y, Kooy Y, van Veelan P, Pena S, Mearin L, Papadopoulos G, Koning F. Selective deamidation by tissue transglutaminase strongly enhances gliadin-specific T cell reactivity. J Immunol. 1998 ; 161 : 1585-8.
【非特許文献１４】14. van der Wal Y, Kooy Y, van Veelan P, Pena S, Mearin L, Molberg O,Lundin KEA, Sollid L, Mutis T, BenckhuijsenWE, Drijfhout JW, Koning F. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95 : 10050-10054.
【非特許文献１５】15. Vader W, Kooy Y, Van Veelen Petal. The gluten response in children with celiac disease is directed toward multiple gliadin and glutenin peptides. Gastroenterology2002, 122 : 1729-37 16. Arentz-Hansen H, McAdam SN, Molberg O, et al. Celiac lesion T cells recognize epitopes that cluster in regions of gliadin rich in proline residues. Gastroenterology 2002, 123 : 803-809.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、セリアック病において免疫系により認識される免疫上優勢なＴ細胞Ａ−グリアジンエピトープを発見し、そしてこれがセリアック病の個体の末梢血内でＴ細胞により認識されることを示した（ＷＯ ０１／２５７９３）。そのようなＴ細胞は、再刺激無しに検出可能なほど十分高い頻度で存在することを発見した（即ち、「フレッシュな応答」検出系が使用できた）。上記エピトープは非Ｔ細胞クローニングに基づく方法を用いて同定され、上記エピトープのより正確な反射（ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）が認識された。上記の免疫上優勢なエピトープは免疫系が認識する前にトランスグルタミナーゼの修飾を必要とする（特定のグルタミンのグルタミン酸への置換を引き起こす）。
【０００６】
この研究に基づいて、本発明者らは、初期段階でセリアック病を診断するのに使用できる試験を開発した。当該試験は、末梢血からのサンプル上で実施してよく、よって、腸の生検は必要ない。当該試験は現在使用されている抗体試験よりも感度が高い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明は、即ち、個体においてセリアック病を診断するか又はセリアック病に対する感受性を診断する方法を提供し、
（ａ）宿主からのサンプルを、（ｉ）配列番号：１（ＰＱＰＥＬＰＹ）又は配列番号：２（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ）である配列、又は配列番号：３により表されるグリアジンの天然に生じる相同体からの均等な配列を含むエピトープ、（ｉｉ）グリアジン蛋白質由来の単離されたオリゴペプチドである、配列番号：１を含むか又は配列番号：３により表されるグリアジンの天然に生じる相同体からの均等な配列（表１に示される）を含むエピトープ、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識され得る（ｉ）又は（ｉｉ）の類似体であって、ペプチドの場合は類似体が５０アミノ酸の長さを超えない上記類似体、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）において定義された２つ又はそれより多い薬剤（ａｇｅｎｔ）を含む生成物からなる群から選択される薬剤と接触させ、そして（ｂ）サンプル中のＴ細胞が薬剤を認識するか否かをインビトロにて決定して、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示す
ことを含む。
【０００８】
コムギのグリアジンＴ細胞のエピトープの包括的なマッピングを通して（実施例１３参照）、本発明者らは、類似のコア配列（例えば、配列番号：１８−２２）及び類似の完全長配列（例えば、配列番号：３１−３６）を有する他のコムギグリアジン中のセリアック病のＨＬＡ−ＤＱ２＋患者において、並びにライムギのセカリン及びオオムギのホールダイン（配列番号：３９−４１）の生物学上活性なエピトープをも発見した；表２０及び２１も参照。さらに、セリアック病においてＨＬＡ−ＤＱ８＋患者にて生物学上活性な幾つかのエピトープが同定された（配列番号４２−４４、４６）。この包括的なマッピングは、即ち、セリアック病の患者においてＴ細胞により認識される優勢なエピトープを提供する。即ち、上記の方法及び本明細書に記載される他の方法は、これらの追加の同定されたエピトープ、それらの類似体及び均等物の何れかを使用して実施してよい；本明細書の（ｉ）及び（ｉｉ）はこれらの追加のエピトープを含む。即ち、本発明の薬剤は新規なエピトープも含む。
【０００９】
本発明は、個体において、セリアック病又はセリアック病に対する感受性を診断する方法における使用のための診断手段の製造のための薬剤の使用を提供し、当該方法は、当該個体のＴ細胞が薬剤を認識するか否かを決定することを含み、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示す。
【００１０】
トランスグルタミナーゼにより修飾された免疫上優勢なエピトープ（並びに本明細書において定義された追加の他のエピトープ）の発見は、このエピトープに対する他の種類の免疫応答が存在するか否かを決定することに基づいたセリアック病の診断も可能にする。即ち、本発明は、個体において、セリアック病又はセリアック病に対する感受性を診断する方法も提供し、当該個体からのサンプル中のエピトープに結合する抗体の存在を決定することを含み、抗体の存在が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示す。
【００１１】
本発明は、さらに、上記薬剤を認識するＴ細胞を寛容にするセリアック病を治療又は予防する方法における使用のための上記薬剤を、任意にキャリアーと共に提供する。また、Ｔ細胞と拮抗することによりセリアック病を治療又は予防する方法における使用のための、（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニストを、任意にキャリアーと共に提供する。さらに、抗体の生産を阻害するために個体を寛容にすることにより個体においてセリアック病を治療又は予防する方法における使用のための、抗体（上記薬剤に結合する）を結合する薬剤又は類似体が提供される。
【００１２】
本発明は、組成物がセリアック病を引き起こすか否かを決定する方法を提供し、トランスグルタミナーゼにより上で定義されたオリゴペプチド配列へ修飾される蛋白質が組成物中に存在するか否かを決定することを含み、蛋白質の存在が、組成物がセリアック病を引き起こし得ることを示す。
【００１３】
本発明は、その野生型配列がトランスグルタミナーゼにより上で定義された配列を含むエピトープを含む配列に修飾され得る変異体グリアジン蛋白質も提供するが、しかし、当該変異体グリアジン蛋白質は、そのようなエピトープを含む配列を含む配列へトランスグルタミナーゼにより修飾され得る配列を含まない様式にて修飾されており；又は、本発明は、上記の様式により修飾されたそのような変異体グリアジン蛋白質の断片も提供する。
【００１４】
本発明は、Ｔ細胞受容体へ結合することができる配列を含む蛋白質も提供し、但し、Ｔ細胞受容体は上記の薬剤を認識し、そして上記配列はそのようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞の拮抗作用を引き起こすことができる。
【００１５】
さらに、本発明は、上で定義された蛋白質を含む食品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１は、最初のうちはグルテンフリーダイエットのあとに緩解して、次に１日目から３日間２００ｇのパン（ｂｒｅａｄ）で毎日チャレンジされた、セリアック病被験者１における、Ａ−グリアジン５１−８５にわたる５つのオーバーラップする１５マーを含むトランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）−処理されたものと処理されないペプチドプール３（各ペプチド１０μｇ／ｍｌ）（表１参照）及びキモトリプシン−消化されたグリアジン（４０μｇ／ｍｌ）に対する、新たに単離されたＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答（垂直軸は１０６ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞を示す）を示す（ａ）。
【図１Ｂ】１０日間の間のパンチャレンジの間の全Ａ−グリアジン蛋白質にわたるｔＴＧ−処理されたＡ−グリアジンペプチドプール１−１０に対する被験者２によるＰＢＭＣ ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答（ｂ）。水平軸はパン開始後の日にちを示す。
【図２】図２は、最初のうちはグルテンフリーダイエットのあとに緩解して、次に３日間パンでチャレンジされた、セリアック病の７人の被験者における、ｔＴＧ−処理されたペプチドプール３（Ａ−グリアジン５１−８５にわたる）に対する、ＰＢＭＣ ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答（垂直軸は１０６ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞を示す）を示す（１から３日）。垂直軸はパンを初めた後の日にちを示す。（ａ）。プール３中に含まれるｔＴＧ処理のオーバーラップ１５マーに対する応答；バーは６日目又は７日目の６人のセリアック病の被験者の個々のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）に対する、平均（±ＳＥＭ）の応答を表す（ｂ）。（個々の被験者において、ペプチドに対するＥＬＩＳＰＯＴ応答はペプチド１２により導かれた応答の％として計算された−水平軸により示されるとおり。）
【図３】図３は、Ａ−グリアジン５６−７５のｔＴＧ−処理された末端削除体（０．１μＭ）に対するＰＢＭＣ ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。バーは５人のセリアック病被験者の平均（±ＳＥＭ）を表す。）。（個々の被験者において、応答は試験されたペプチドにより導かれた最大応答の％として計算された−水平軸により示されるとおり。）
【図４】図４は、優勢なＡ−グリアジンエピトープの最小構造が如何にしてｔＴＧ−処理された７−１７マーのＡ−グリアジンペプチド（０．１μＭ）を用いてマップされたかを示し、配列ＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号：４）（Ａ−グリアジン６２−６８）（ａ）、及びｔＴＧ処理しなかったがＱ→Ｅ６５の置換を伴う同じペプチドを含む（ｂ）。各線はパンを１−３日目に摂取してから６又は７日目の３人のセリアック病被験者におけるＰＢＭＣ ＩγＥＬＩＳＰＯＴ応答を表す。）。（個々の被験者において、ＥＬＩＳＰＯＴ応答は１７マー、Ａ−グリアジン５７−７３により導かれた応答の％として計算された。）
【図５】図５はｔＴＧにより脱アミド化されたアミノ酸を示す。Ａ−グリアジン５６−７５ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＳＦＰ（配列番号：５）（０．１μＭ）をｔＴＧ（５０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃において２時間インキュベートした。逆相ＨＰＬＣにより単一の生成物が同定されて精製された。アミノ酸分析により、ｔＴＧに帰し得るＡ−グリアジン５６−７５内の各Ｇｌｎ残基の％脱アミド化（Ｑ→Ｅ）の計算が可能になった（水平軸）。
【図６】図６は、パンを１−３日目に摂取してから６又は７日目の３人のセリアック病被験者における、１７マー：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＳ（配列番号：６）（Ｅ５７，６５），ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＳ（配列番号：７）（Ｅ６５，７２），ＥＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＳ（配列番号：８）（Ｅ５７，６５，７２），及びＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：９）（Ｅ６５）を用いた、Ａグリアジン５７−７３中のＱ６５に加えた他の位置においてＱ→Ｅを置換した効果を示す。水平軸はＥ６５応答の％を示す。
【図７】図７は、ｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン５６−７５（０．１μＭ）が（ａ）ＣＤ４及びＣＤ８の磁気ビーズ除去した（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＰＢＭＣにおいてＩＦＮ−ｇＥＬＩＳＰＯＴ応答を導いたことを示す。（バーはＣＤ４除去ＰＢＭＣ応答をＣＤ８除去ＰＢＭＣ応答の％として表す；百万のＣＤ８除去ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞は：被験者４：２９、及び被験者６：５３５であった。）（ｂ）ＨＬＡ−ＤＱａＩ＊０５０１，ｂＩ＊０２０１に関して同型接合体の２人のセリアック病被験者における、ｔＴＧ−処理５６−７５（０．１μＭ）の１時間前の、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３），−ＤＱ（Ｌ２）及び−ＤＰ（Ｂ７．２１）（１０μｇ／ｍｌ）に対するモノクローナル抗体とのインキュベーション後のＰＢＭＣ ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答（スポット形成細胞／百万ＰＢＭＣ）。
【図８】図８は、免疫上優勢なエピトープ内の６５位における他のアミノ酸のＧｌｕによる置換の効果を示す。水平軸は免疫上優勢なエピトープに関しての３人の被験者における％応答を示す。
【図９】図９は、トランスグルタミナーゼ処理を伴う場合（影）及び伴わない場合（透明）の配列ＰＱＬＰＹ（配列番号：１２）を含む、天然に存在するグリアジンペプチドの免疫反応性を示す（３人の被験者の応答を測定）。
【図１０】図１０は、グルテンチャレンジを開始して、次にインターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔを行ってから６日後の２人のセリアック病被験者からの末梢血単核細胞のＣＤ８，ＣＤ４，β７，及びαＥ−特異的免疫磁気ビーズ除去を示す。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（２５ｍｃｇ／ｍｌ），ｔＴＧ−処理されたキモトリプシン−消化グリアジン（１００ｍｃｇ／ｍｌ）又はＰＰＤ（１０ｍｃｇ／ｍｌ）を抗原として用いた。
【図１１】図１１は、最適なＴ細胞エピトープの長さを示す。
【図１２Ａ】図１２ａは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｂ】図１２ｂは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｃ】図１２ｃは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｄ】図１２ｄは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｅ】図１２ｅは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｆ】図１２ｆは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｇ】図１２ｇは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１２Ｈ】図１２Ｈは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と他のペプチドとの用量応答研究における比較を示す。
【図１３Ａ】図１３ａは、グリアジンとＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５特異的応答の比較を示す。
【図１３Ｂ】図１３ｂは、グリアジンとＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５特異的応答の比較を示す。
【図１３Ｃ】図１３ｃは、グリアジンとＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５特異的応答の比較を示す。
【図１４Ａ】図１４ａは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１４Ｂ】図１４ｂは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１４Ｃ】図１４ｃは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１４Ｄ】図１４ｄは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１４Ｅ】図１４ｅは、セリアック病被験者におけるグリアジンの多型の生物活性を示す。
【図１５】図１５は、コアエピトープ配列の定義を示す。
【図１６】図１６は、コアエピトープ配列の定義を示す。
【図１７】図１７は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図１８】図１８は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図１９】図１９は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２０】図２０は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２１】図２１は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２２】図２２は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２３】図２３は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２４】図２４は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２５】図２５は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２６】図２６は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２７】図２７は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントのアゴニスト活性を示す。
【図２８Ａ】図２８ａは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｂ】図２８ｂは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｃ】図２８ｃは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｄ】図２８ｄは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｅ】図２８ｅは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｆ】図２８ｆは、異なる患者群における応答を示す。
【図２８Ｇ】図２８ｇは、異なる患者群における応答を示す。
【図２９】図２９は、Ａ−グリアジン５７−７３のプロラミン相同体の生物活性を示す。
【図３０】図３０は、健康なＨＬＡ−ＤＱ２被験者についての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対するＥＬＩＳｐｏｔ応答の変化を示す。
【図３１】図３１は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ２被験者についての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対するＥＬＩＳｐｏｔ応答の変化を示す。
【図３２】図３２は、「要約された」グリアジンペプチド応答に対する個々のペプチドの寄与を示す。
【図３３】図３３は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ２／８被験者Ｃ０８に関しての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対する、グルテンチャレンジが導いたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。
【図３４】図３４は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ２／８被験者Ｃ０７に関しての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対する、グルテンチャレンジが導いたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。
【図３５】図３５は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ８／７被験者Ｃ１２に関しての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対する、グルテンチャレンジが導いたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。
【図３６】図３６は、セリアック病のＨＬＡ−ＤＱ６／８被験者Ｃ１１に関しての、ｔＴＧ−脱アミド化されたグリアジンペプチドプールに対する、グルテンチャレンジが導いたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明はセリアック病を治療又は予防する方法を提供し、ａ）配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６、及びそれらの均等物からなる群から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチド；及びｂ）ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることができ、且つ５０アミノ酸の長さを超えない、ａ）の類似体；及びｃ）配列番号：１及び配列番号：２から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチドから選択される少なくとも一つの薬剤を個体に投与することを含む。幾つかの態様において、上記薬剤は、ＨＬＡ−ＤＱ２−制限されるか、ＨＬＡ−ＤＱ８−制限されるか、又は一つの薬剤がＨＬＡ−ＤＱ２−制限されており、そして第２の薬剤がＨＬＡ−ＤＱ８−制限されている。幾つかの態様において、上記薬剤は、コムギのエピトープ、ライムギのエピトープ、オオムギのエピトープ又はそれらの組み合わせの何れかを、単一の薬剤として又は複数の薬剤として含む。
【００１８】
本発明は、上記の薬剤及び薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤を含む薬学組成物を個体に投与することを含む、セリアック病を予防又は治療する方法も提供する。
【００１９】
本発明は、上で定義されたＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニスト及び薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤を含む薬学組成物を個体に投与することを含む、セリアック病を予防又は治療する方法も提供する。
【００２０】
本発明は、Ｔ細胞の生産又は上で定義された薬剤に対する抗体応答を抑圧するために個体をグリアジン蛋白質に対して寛容にするための組成物を個体に投与することを含む、セリアック病を予防又は治療する方法も提供する。
【００２１】
本発明は、１）ａ）ｉ）配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６、及びそれらの均等物からなる群から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチド；及びｉｉ）ｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識されることができ、且つ５０アミノ酸の長さを超えない、ｉ）の類似体；及びｉｉｉ）任意に、ｉ）及びｉｉ）から選択される薬剤に加えて、配列番号：１及び配列番号：２から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチドから選択される少なくとも一つの薬剤を、宿主からのサンプルに接触させ；そしてサンプル中のＴ細胞が上記薬剤を認識するか否かをインビトロにて決定するが、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示すか；又はｂ）上で定義された薬剤を投与し、そして個体中のＴ細胞が上記薬剤を認識するか否かをインビボにて決定するが、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示すかの何れかにより、個体においてセリアック病を診断し；そして２）セリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であると診断された個体に、セリアック病を予防又は治療するための治療用薬剤を投与する
ことによりセリアック病を予防するか又は治療する方法も提供する。
【００２２】
本発明は、上記薬剤を認識するＴ細胞を寛容にすることによりセリアック病を予防又は治療する方法における使用のための、上で定義された薬剤も、任意にキャリアーと共に、提供する。
【００２３】
本発明は、Ｔ細胞と拮抗することによりセリアック病気を予防又は治療する方法における使用のための、上で定義されたＴ細胞受容体を認識するＴ細胞のアンタゴニストも、任意にキャリアーと共に、提供する。
【００２４】
本発明は、Ｔ細胞受容体へ結合することができる配列を含む蛋白質も提供し、但し、Ｔ細胞受容体は上で定義された薬剤を認識し、そして上記配列はそのようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞の拮抗作用を引き起こすことができる。
【００２５】
本発明は、上で定義された薬剤又はアンタゴニスト及び薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤を含む薬学組成物も提供する。
【００２６】
本発明は、Ｔ細胞の生産又は上で定義された薬剤に対する抗体応答を抑圧するために個体をグリアジン蛋白質に対して寛容にするための組成物も提供し、当該組成物は上で定義された薬剤を含む。
【００２７】
本発明は、上で定義された薬剤に対するＴ細胞応答に拮抗するための組成物も提供し、当該組成物は上で定義されたアンタゴニストを含む。
【００２８】
本発明は、その野生型配列がトランスグルタミナーゼにより請求項１において定義された薬剤である配列に修飾され得る変異体グリアジン蛋白質も提供し、当該変異体グリアジン蛋白質は、上で定義された薬剤である配列へのトランスグルタミナーゼによるそれの修飾を阻害する変異を含み；又は、本発明は少なくとも１５アミノ酸の長さであり、且つ上記変異を含む、そのような変異体グリアジン蛋白質の断片を提供する。
【００２９】
本発明は、上で定義された蛋白質又は断片をコードするコーディング配列を含むポリヌクレオチドも提供する。
【００３０】
本発明は、上で定義されたポリヌクレオチドを含む細胞又はそのようなポリヌクレオチドにより形質転換された細胞も提供する。
【００３１】
本発明は、上で定義されたＴ細胞受容体を発現する哺乳類も提供する。
【００３２】
本発明は、個体においてセリアック病を診断するか又はセリアック病に対する感受性を診断する方法も提供し、ａ）ｉ）配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６、及びそれらの均等物からなる群から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチド；及びｉｉ）ｉ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることができ、且つ５０アミノ酸の長さを超えない、ｉ）の類似体；及びｉｉｉ）任意に、ｉ）及びｉｉ）から選択される薬剤に加えて、配列番号：１及び配列番号：２から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチドから選択される少なくとも一つの薬剤を宿主に投与し；そしてｂ）サンプル中のＴ細胞が薬剤を認識するか否かをインビトロにて決定して、Ｔ細胞による認識が、個体がセリアック病を有するか又はセリアック病に感受性であることを示すことを含む。
【００３３】
本発明は、組成物がセリアック病を引き起こすことができるか否かを決定する方法も提供し、トランスグルタミナーゼによりオリゴペプチド配列に修飾され得る蛋白質が組成物中に存在するか否かを決定することを含み、蛋白質の存在が、組成物がセリアック病を引き起こし得ることを示す。
【００３４】
本発明は、上で定義された薬剤を認識するＴ細胞のアンタゴニストを同定する方法も提供し、候補物質をＴ細胞と接触させ、そして当該物質がＴ細胞が抗原特異的応答を受ける能力の低下を引き起こすか否かを決定することを含み、上記能力のそのようなあらゆる低下の検出が、上記物質がアンタゴニストであることを示す。
【００３５】
本発明は、上記の方法の何れかを実施するためのキットも提供し、上で定義された薬剤及びＴ細胞によるペプチドの認識を検出する手段を含む。
【００３６】
本発明は、セリアック病の治療用の生成物を同定する方法も提供し、セリアック病を有するか又はセリアック病に感受性の候補物質を哺乳類に投与し、そして物質が哺乳類においてセリアック病を予防又は治療するか否かを決定することを含み、セリアック病の予防又は治療が、当該物質が治療用生成物であることを示す。
【００３７】
本発明は、上で定義されたコーディング配列によりコードされる蛋白質の生産のためのプロセスも提供し、ａ）上記蛋白質の発現を可能にする条件下で上記細胞を培養し；そして、ｂ）発現された蛋白質を回収することを含む。
【００３８】
本発明は、トランスジェニック植物細胞を得るための方法も提供し、トランスジェニック植物細胞を供給するために上で定義されたベクターにより植物を形質転換することを含む。
【００３９】
本発明は、初代トランスジェニック植物を得るための方法も提供し、トランスジェニック植物を提供するために上で定義されたベクターにより形質転換されたトランスジェニック植物細胞を再生することを含む。
【００４０】
本発明は、トランスジェニック植物の種子を得るための方法も提供し、上で定義されたとおりに取得可能なトランスジェニック植物からトランスジェニック種子を得ることを含む。
【００４１】
本発明は、トランスジェニック子孫植物を得るための方法も提供し、上で定義された方法により取得可能な初代トランスジェニック植物から第２世代のトランスジェニック子孫植物を得て、そして任意に、そうして得られた第２世代の子孫から一つ又はそれ以上の世代のトランスジェニック植物を得ることを含む。
【００４２】
本発明は、上記の方法の何れかにより取得可能な、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子又は子孫植物も提供する。
【００４３】
本発明は、上記の植物細胞を含むトランスジェニック植物又は植物種子も提供する。
【００４４】
本発明は、上で定義されたトランスジェニック植物細胞、初代植物、植物種子又は子孫から取得可能な上記植物細胞を含む、トランスジェニック植物細胞カルスも提供する。
【００４５】
本発明は、収穫生成物を得るための方法も提供し、上記の方法の何れかに従い植物から収穫生成物を回収し、そして任意にさらに回収された生成物を加工することを含む。
【００４６】
本発明は、上で定義された蛋白質を含む食物も提供する。
発明の詳細な説明
用語「セリアック病」は、グルテンの感度を変更することにより引き起こされる症状の範囲を包含し、小腸の粘膜により特徴付けられる重度の形態（過形成絨毛萎縮）及び温和な兆候により特徴付けされる他の形態を含む。
【００４７】
上で言及された個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）（診断又は治療のコンテクストにおいて）はヒトである。彼らはセリアック病を有するか（兆候があるか又は無兆候）又はそれを有する疑いがある。彼らはグルテンダイエット中であってよい。彼らは急性の相の応答にあってよい（例えば、彼らはセリアック病を有してよいが、彼らがグルテンフリーダイエットを１４から２８日間行って最後の２４時間はグルテンのみを摂取した）。
【００４８】
個体は、セリアック病に感受性であってよく、例えば遺伝的に感受性であってよい（例えば、セリアック病の親戚を有するか又はセリアック病に対する疾病素因を引き起こす遺伝子を所有する個体により決定される）。
薬品
薬品は、典型的にはペプチドであり、例えば７から５０アミノ酸の長さ、例えば１０から４０、又は１５から３０アミノ酸の長さである。
【００４９】
配列番号：１はＰＱＰＥＬＰＹである。配列番号：２はＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＳである。配列番号：３は表１に示され、そしてＡ−グリアジンの全配列である。配列番号：１の４位（配列番号：２の９位に均等）のグルタミン酸は、Ａ−グリアジンのトランスグルタミナーゼ処理により生成される。
【００５０】
薬品は、配列番号：１又は２により表されるペプチド又はグリアジン蛋白質由来の単離されたオリゴペプチドである配列番号：１を含む配列を含むエピトープ；又は配列番号：３の相同体である天然のグリアジン蛋白質からのこれら配列の均等物であってよい。即ち、上記エピトープは配列番号：３により表される蛋白質の誘導体であってよい。そのような誘導体は、典型的には、グリアジンの断片、又は蛋白質全体又は断片の変異誘導体である。よって、発明のエピトープは、この天然のグリアジン蛋白質全体を含まず、そして他の天然のグリアジン全体を含まない。
【００５１】
上記エピトープは、即ち、Ａ−グリアジンの断片（例えば、配列番号：３）であり、配列番号：１の配列を含み、トランスグルタミナーゼにより処理すること（完全又は部分的）により得られるものであって、即ち、１、２、３又はそれ以上のグルタミンがグルタミン酸に置換されている（配列番号：１内での置換を含む）。
【００５２】
そのような断片は、表１に示す配列番号：３の５５から７０、５８から７３、６１から７７位により表される配列であるか又はそれらの配列を含んでよい。典型的には、そのような断片は、配列番号：１又は２により表されるペプチドがセリアック病の患者からのサンプルを用いて本明細書にて記載されたアッセイの何れかにおいて認識されるのと少なくとも同じ程度にてＴ細胞により認識される。
【００５３】
さらに、上記薬品は、配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６の何れかにより表されるペプチド、又は配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６の何れかに相当する配列を含む蛋白質（例えば、グリアジンをトランスグルタミナーゼで処理した後に配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６の何れかを含むグリアジンの断片）。そのような配列の生物学上活性な断片も発明の薬品である。配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６又はこれらの配列の類似体の何れかの配列均等物も、発明の薬品である。
【００５４】
上記エピトープが別のグリアジン（例えば、本明細書にて言及されたグリアジン蛋白質の何れか又はセリアック病を引き起こす何れかのグリアジン）由来の上記エピトープ（断片を含む）に均等な配列を含む場合、そのような均等配列は、トランスグルタミナーゼにより典型的に処理された（完全又は部分的）グリアジン蛋白質の断片に相当する。他のグリアジン蛋白質の配列を、オリジナルのエピトープが由来するグリアジン、例えば、配列番号：３と整列させる（ａｌｉｇｎｉｎｇ）ことにより（例えば、本明細書にて言及されたプログラムの何れかを用いて）、そのような均等ペプチドを決定することができる。トランスグルタミナーゼは市販されている（Ｓｉｇｍａ Ｔ−５３９８）。表４は、適当な均等配列の僅かな例を提供する。
【００５５】
類似体である薬品は、（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴＣＲにより認識され得る。よって、一般には、上記類似体が（ｉ）又は（ｉｉ）の存在下、典型的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、本明細書にて言及されたＡＰＣｓの何れか）の存在下でも、Ｔ細胞に添加された場合、当該類似体は（ｉ）又は（ｉｉ）とそのような系において競合し得る。
【００５６】
上記類似体は（ｉ）又は（ｉｉ）を認識するＴＣＲを結合することができるものであってよい。そのような結合は、標準の技術により試験することができる。そのようなＴＣＲｓは（例えば、本発明の方法を用いて）（ｉ）又は（ｉｉ）を認識することが示されたＴ細胞から単離することができる。上記類似体のＴＣＲｓへの結合の証明は、類似体に結合する物質、例えば類似体に対する抗体への類似体の結合をＴＣＲｓが阻害するか否かを決定することにより、のちに示すことができる。典型的には、上記類似体は、結合アッセイのそのような阻害においてクラスＩＩ ＭＨＣ分子（例えば、ＨＬＡ−ＤＱ２）に結合する。
【００５７】
典型的には、上記類似体は（ｉ）又は（ｉｉ）のＴＣＲへの結合を阻害する。この場合、類似体存在下でＴＣＲを結合できる（ｉ）又は（ｉｉ）の量は低下する。これは、類似体がＴＣＲを結合し、よってＴＣＲへの結合に関して（ｉ）又は（ｉｉ）と競合するためである。
【００５８】
上記の結合実験に使用するための細胞は、セリアック病の患者から、例えば本発明の方法を用いて単離することができる。
【００５９】
類似体の他の結合特性は（ｉ）又は（ｉｉ）のそれと同じであってよく、即ち典型的には、類似体はペプチドが結合するのと同じＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する（ＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８）。類似体は、典型的には（ｉ）又は（ｉｉ）に特異的な抗体に結合し、即ち、（ｉ）又は（ｉｉ）のそのような抗体への結合を阻害する。
【００６０】
類似体は、典型的にはペプチドである。それは、（ｉ）又は（ｉｉ）と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を、例えば少なくとも１５又はそれ以上（例えば類似体及び／又は（ｉ）又は（ｉｉ）の完全長、又はＴＣＲに接触するか又はＭＨＣ分子を結合する領域にわたり）連続するアミノ酸の領域にわたり有してよい。蛋白質の相同性を測定する方法は当業界公知であり、当業者には本コンテクストにおいて、相同性がアミノ酸同一性に基づいて計算されることが理解される（ときに、「ハードな相同性」と呼ばれる）。
【００６１】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは相同性を計算するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している（例えば、そのデフォルトセッティングに使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは相同性を計算するか又は配列をラインアップするのに使用することができ（典型的にはそれらのデフォルトセッティング上で）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ ２１５：４０３−１０に記載されるとおりである
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、例えば、「ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／」においてインターネットを通して全世界のウエブ上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中で同じ長さのワードと並べられたときに幾つかの正の値の閾値スコアに適合するか又は当該値を満たす質問配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高いスコアリングの配列対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値を意味する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，前出）。これらの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含むＨＳＰｓを見つけるための検索を始めるための種として作用する。蓄積したアラインメントスコアがその最大に達成された値から量Ｘだけ低下する場合；一つ又は複数の負のスコアリング剰余アラインメントの蓄積のため、蓄積したスコアがゼロ又はそれ以下になった場合；又は何れかの配列の末端に到達した場合、各方向におけるワードヒットに関する延長が停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ，Ｔ及びＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして１１のワードの長さ（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１を参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ），Ｍ＝５，Ｎ＝４，及び両方の鎖の比較を用いる。
【００６２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列の間の類似性の統計分析を実施する；例えば、Ｌａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間で偶然に適合する確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比較において最小合計確率が約１より低く、好ましくは約０．１より低く、より好ましくは約０．０１より低く、そしてもっと好ましくは約０．００１より低いなら、配列が他方の配列に類似であると考えられる。
【００６３】
相同なペプチド類似体は、（ｉ）又は（ｉｉ）と１、２、３、４、５、６、７、８又はそれより多い変異だけ異なるのが典型である（置換、欠失又は挿入であってよい）。これらの変異は、相同性を計算することに関して上記の領域の何れかを横切って測定されてよい。置換は、好ましくは「保存的」である。これらは以下の表により定義される。第２列の同じブロックのアミノ酸、及び好ましくは第３の列の同じラインのアミノ酸を、互いに置換してよい。
【００６４】
【表１】
【００６５】
典型的には、ＭＨＣ分子を結合するのに寄与するか又はＴＣＲによる認識に必須の、（ｉ）又は（ｉｉ）中のアミノ酸に均等な位置における類似体中のアミノ酸は同じか又は保存されている。
【００６６】
典型的には、類似体ペプチドは一つ又は複数の修飾を含み、天然の翻訳後修飾又は人工修飾であってよい。修飾は科学的なモイエティ（典型的には、例えばＣ−Ｈ結合の水素の置換による）、例えばアミノ、アセチル、ヒドロキシ又はハロゲン（例えば、フッ素）基又は糖質基を提供してよい。典型的には、修飾はＮ又はＣ末端上に存在する。
【００６７】
類似体は、一つ又は複数の天然アミノ酸、例えば天然アミノ酸とは側鎖が異なるアミノ酸を含んでよい。一般に、非天然アミノ酸はＮ末端及び／又はＣ末端を有する。非天然アミノ酸はＬ−又はＤ−アミノ酸であってよい。
【００６８】
類似体は、典型的には、（ｉ）又は（ｉｉ）と実質類似の形態、サイズ、柔軟性又は電子配置を有する。それは、典型的には、（ｉ）又は（ｉｉ）の誘導体である。一つの態様において、類似体は、配列番号：１又は２の配列を含む融合蛋白質であるか又は本明細書にて言及された他のペプチドの何れか；及び非グリアジン配列である。
【００６９】
一つの態様において、類似体は、ＭＨＣクラス分子に結合した（ｉ）又は（ｉｉ）であるか、又は、を模倣する。２、３、４、又はそれ以上のそのような複合体を、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンに基づく系を用いて互いに対合させるか又は結合させてよく、典型的には２、３、又は４つのビオチン標識ＭＨＣ分子がストレプトアビジンモイエティに結合する。この類似体は、典型的には、（ｉ）又は（ｉｉ）／ＭＨＣクラスＩＩ分子のＴＣＲ又は当該複合体に特異的な抗体への結合を阻害する。
【００７０】
類似体は、典型的には、抗体又は抗体の断片、例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ）２断片である。類似体は固相上に固定化され、特に、ＭＨＣ分子に結合したペプチドを模倣する類似体の場合である。
【００７１】
類似体は、典型的には、コンピューター手段によりデザインされて、当業界公知の方法を用いて合成される。或いは、類似体は、化合物のライブラリーから選択できる。ライブラリーはコンビナトリアルライブラリー、ディスプレイライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーであってよい。化合物のライブラリーはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した形態、例えばＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８においてディスプレイライブラリー中で発現されてよい。類似体は、一般に、結合特性（ｉ）又は（ｉｉ）を模倣するそれらの能力に基づいてライブラリーから選択される。即ち、それらはＴＣＲ又は（ｉ）又は（ｉｉ）を認識する抗体を結合する能力に基づいて選択してよい。
【００７２】
典型的には、類似体は、薬剤（ｉ）又は（ｉｉ）の何れかと少なくとも同じ程度、例えば均等なエピトープと少なくとも同じ程度まで、好ましくは配列番号：２により表されるペプチドと同じ程度までＴ細胞により認識され、本明細書にて記載されたアッセイの何れかにおいて認識され、典型的には、セリアック病の患者由来の細胞を用いる。類似体は、インビボにおいてこれらの程度まで認識されてよく、即ち、本明細書にて言及された薬剤の何れかと少なくとも同じ程度までセリアック病の兆候を誘導することができてよい（例えば、ヒト患者又は動物モデルにおいて）。
【００７３】
類似体は、発明のエピトープを認識するＴ細胞受容体により候補の物質が認識されるか否かを決定することを含み、物質の認識が物質が類似体を認識することを示す方法において同定されてよい。そのようなＴＣＲｓは本明細書にて言及されたＴＣＲｓの何れかであってよく、Ｔ細胞上に存在してよい。本明細書にて言及された如何なる適切なアッセイも類似体を同定するのに使用することができる。一つの態様において、この方法はインビボにおいて実施される。上記のとおり、好ましい類似体はペプチド配列番号：２と少なくとも同じ程度まで認識され、よって、上記の方法はこの程度まで認識される類似体を同定するのに使用してよい。
【００７４】
一つの態様において、上記方法は、発明のエピトープの認識を候補配列が阻害するか否かを決定することを含み、認識の阻害が、物質が類似体であることを示す。
【００７５】
上記薬剤は、（ｉ），（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）により定義される少なくとも２、５、１０又は２０の薬剤を含む生成物であってよい。典型的には、上記組成物は、異なるグリアジン、例えば本明細書にて言及されたグリアジンの種又はバラエティ又は種類の何れかからの発明のエピトープ（又は均等な類似体）を含む。好ましい組成物は、本明細書にて言及された種又はバラエティの何れかの中に存在するグリアジンのすべて、又は２、３、４、又はそれ以上の本明細書にて言及された種からの（コムギ、ライムギ、オオムギ、エンバク、及びライコムギからなる群から選択される種のパネルから）、発明の少なくとも一つのエピトープ、又は均等類似体を含む。即ち、薬剤は単価又は多価であってよい。
診断
上記のとおり、発明の診断方法は、薬剤を結合するＴ細胞の検出又は薬剤を認識する抗体の検出に基づいてよい。
【００７６】
上記の方法（上記の使用を含む）において薬剤を認識するＴ細胞は、一般に、インビボにおいて予めグリアジンに対して感作されたＴ細胞である。上記のとおり、そのような抗原−経験Ｔ細胞は、末梢血中に存在することがわかった。
【００７７】
上記の方法において、Ｔ細胞はインビトロ又はインビボにおいて薬剤と接触させることができ、そしてＴ細胞が薬剤を認識するか否かを決定することをインビトロ又はインビボにて実施することができる。即ち、発明は、ヒトのからだで実施される診断方法においての使用のための薬剤を提供する。異なる薬剤が、そのような方法における、同時、別々、又は連続の使用のために提供される。
【００７８】
インビトロの方法は、薬剤が添加された水性溶液内で実施されるのが典型である。当該溶液はＴ細胞も含む（及び特定の態様においては、以下に論じられるＡＰＣｓも）。本明細書にて使用される用語「接触させる」は、特定の物質を溶液に加えることを含む。
【００７９】
Ｔ細胞が薬剤を認識するか否かを決定することは、一般には、薬剤の存在下でＴ細胞の状態の変化を検出するか、又はＴ細胞が薬剤を結合するか否かを決定することにより、達成される。状態の変化は、一般に、ＴＣＲが薬剤に結合した後に、Ｔ細胞の抗原特異的機能活性により引き起こされる。状態の変化は、Ｔ細胞の内部（例えば、蛋白質の細胞内発現の変化）又は外部（例えば、分泌された配列の検出）で測定してよい。
【００８０】
Ｔ細胞の状態の変化は、Ｔ細胞からの物質、例えばサイトカイン、特にＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＴＮＦ−αの分泌の開始又は増加であってよい。ＩＦＮ−γの分泌の決定が特に好ましい。当該物質は、特異的結合薬剤へのそれの結合を可能にさせ、次に特異的結合薬剤／物質の複合体の存在を測定することにより検出されるのが典型である。特異的結合薬剤は、典型的には、抗体、例えばモノクローナル抗体である。サイトカインに対する抗体は、市販されており、或いは標準技術を用いて作成することができる。
【００８１】
典型的には、特異的結合薬剤は、固相支持体上に固定化される。物質を固相支持体上に固定化させた後に、任意に洗浄することにより、薬剤に非特異的に結合した物質を除去することができる。薬剤／物質複合体は複合体を結合する第２の結合薬剤を用いることにより検出してよい。典型的には、第２薬剤は、第１薬剤を結合する部位とは異なる部位において物質を結合する。第２薬剤は、好ましくは抗体であり、そして、検出可能な標識により直接又は間接に標識される。
【００８２】
即ち、第２薬剤は、検出可能な標識により直接又は間接に典型的には標識された第３薬剤により検出してよい。例えば、第２薬剤はビオチンモイエティを含んでよく、ストレプトアビジンモイエティ及び典型的にはアルカリホスファターゼを検出可能な標識として含む第３の薬剤による検出を可能にさせる。
【００８３】
一つの態様において、使用される検出系は、ＷＯ９８／２３９６０に記載されたエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。そのアッセイにおいて、Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮ−γは、固相支持体に固定化された第１のＩＦＮ−γ特異的抗体により結合される。結合されたＩＦＮ−γは、次に、検出可能な標識により標識された第２のＩＦＮ−γ特異的抗体を用いて検出される。そのような標識された抗体はＭＡＢＴＥＣＨ（ストックホルム、スエーデン）から得ることができる。使用可能な他の検出可能な標識は以下に論じられる。
【００８４】
測定され得るＴ細胞の状態の変化は、Ｔ細胞による物質の取り込み、例えばチミジンの取り込みの増加であってよい。状態の変化は、Ｔ細胞のサイズ、又はＴ細胞の増殖の増加、又はＴ細胞上の細胞表面マーカーの変化であってよい。
【００８５】
一つの態様において、状態の変化は、蛋白質の細胞内発現の変化、例えば上記サイトカインの何れかの細胞内発現の増加を測定することにより、検出される。そのような細胞内変化は、特定の様式にて発現された蛋白質を結合するモイエティにＴ細胞内部を接触させることにより検出してよく、フローサイトメトリーによるＴ細胞の分離を可能にさせる。
【００８６】
一つの態様において、ＴＣＲを結合するとき、薬剤はＭＨＣクラスＩＩ分子（典型的にはＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８）に結合し、典型的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に存在する。しかしながら、本明細書にて言及されたとおり、他の薬剤はＭＨＣ分子にも結合する要求なしにＴＣＲを結合することができる。
【００８７】
一般に、上記の方法において接触させたＴ細胞は固体の血液から採取されるが、Ｔ細胞を含む他の種類のＴ細胞を使用することができる。サンプルは、直接アッセイに添加するか又は最初に加工してよい。典型的には、加工は、例えば、水又はバッファーによるサンプルの希釈を含んでよい。典型的には、サンプルを１．５から１００倍、例えば２から５０倍又は５から１０倍希釈する。
【００８８】
加工は、サンプルの成分の分離を含んでよい。典型的には、単核細胞（ＭＣｓ）をサンプルから分離する。ＭＣｓはＴ細胞とＡＰＣｓを含むことになる。即ち、上記の方法において、分離されたＭＣｓ内に存在するＡＰＣｓは上記ペプチドをＴ細胞上に提示し得る。別の態様においては、Ｔ細胞のみ、例えばＣＤ４ Ｔ細胞のみがサンプルから精製され得る。ＰＢＭＣｓ，ＭＣｓ、及びＴ細胞は、当業界公知の技術、例えばＬａｌｖａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６，ｐ８５９−８６５に記載された技術を用いてサンプルから分離することができる。
【００８９】
一つの態様において、上記のアッセイにおいて使用されるＴ細胞は、未加工の形態であるか、又は希釈されたサンプルであるか、又は新たに単離されたＴ細胞であり（例えば、新たに単離されたＭＣｓ又はＰＢＭＣｓの形態）、エクスビボにて直接使用され、即ち、それらは上記方法において使用される前に培養されない。即ち、Ｔ細胞は抗原特異的様式にてインビトロにおいて再刺激されなかった。しかしながら、Ｔ細胞は、使用の前に、例えば一つ又は複数の薬剤及び一般には外来の成長促進サイトカインの存在下で培養することができる。培養の間、薬剤は典型的にはＡＰＣｓ，例えば上記方法で使用されるＡＰＣの表面上に存在する。Ｔ細胞の前培養は上記方法の感度の増加を導くかもしれない。即ち、Ｔ細胞は、細胞系、例えば短期間の細胞系に変換することができる（例えば、Ｏｔａ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６，ｐ１８３−１８７に記載されたとおり）。
上記の方法に典型的に存在するＡＰＣはＴ細胞と同じ個体から又は別の宿主からであってよい。ＡＰＣは天然のＡＰＣ又は人工のＡＰＣであってよい。ＡＰＣは上記ペプチドを細胞に提示することができる細胞である。それは典型的にはＢ細胞、樹状細胞又はマクロファージである。それは典型的にはＴ細胞と同じサンプルから分離され、典型的にはＴ細胞と同時精製される。即ち、ＡＰＣはＭＣｓ又はＰＢＭＣｓ上に存在してよい。ＡＰＣは典型的には新たに単離されたエクスビボ細胞又は培養細胞である。それは細胞系の形態、例えば短期間細胞系又は不死の細胞系であってよい。ＡＰＣはその表面上に空のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現してよい。
【００９０】
上記の方法において、一つ又は複数の（異なる）薬剤を使用してよい。典型的には、サンプル由来のＴ細胞をアッセイ中において試験を意図する全ての薬剤と共に置くことができるか、又は各々が一つ又は複数の薬剤を含む別々のアッセイ中に分配して置くことができる。
【００９１】
本発明は、同時、分離又は連続用途のための（例えばインビボ用途）本明細書にて言及された薬剤の何れか２つ又はそれ以上のような薬剤も提供する（例えば、上で論じられた組成物中に存在する薬剤の組み合わせ）。
【００９２】
一つの態様においては、薬剤それ自体を直接Ｔ細胞及びＡＰＣｓを含むアッセイに加える。上で論じられたとおり、そのようなアッセイにおいてＴ細胞とＡＰＣｓはＭＣｓの形態であり得る。ＡＰＣｓによる提示に関する要求なしにＴ細胞により認識され得る薬剤を用いる場合、ＡＰＣｓは必要ない。ＭＨＣ分子に結合させたオリジナルの（ｉ）又は（ｉｉ）を模倣した類似体がそのような薬剤の例である。
【００９３】
一つの態様において、上記薬剤はＴ細胞の不在下でＡＰＣに提供される。ＡＰＣは次に、典型的には薬剤をその表面に提示させた後に、Ｔ細胞に提供される。上記ペプチドはＡＰＣの内部に拾い上げられて提示されるか、又はＡＰＣの内部に入り込まずに単に表面上に拾い上げられる。
【００９４】
薬剤がＴ細胞と接触する期間は、ペプチドの認識を決定するのに使用される方法しだいで変更される。典型的には１０５から１０７、好ましくは５ｘ１０５から１０６のＰＢＭＣを各アッセイに添加する。薬剤を直接アッセイに添加する場合、その濃度は１０−１から１０−３μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から５０μｇ／ｍｌ又は１から１０μｇ／ｍｌである。
【００９５】
典型的には、Ｔ細胞を薬剤とインキュベートする時間の長さは、４から２４時間、好ましくは６から１６時間である。エクスビボにてＰＢＭＣを使用する場合、０．３ｘ１０６のＰＢＭＣｓを１０μｇ／ｍｌのペプチド中で１２時間３７℃においてインキュベートできることを発見した。
【００９６】
Ｔ細胞による薬剤の認識の決定は、薬剤のＴ細胞への結合を測定することにより行ってよい（これは本明細書にて論じられる何れかの適当な結合アッセイを用いて実施できる）。典型的には、薬剤を結合するＴ細胞は、例えばＦＡＣＳマシンを用いてこの結合に基づいて細胞を分離することができる。薬剤を認識するＴ細胞の存在は、薬剤を用いて分離される細胞の頻度が「対照」値を超える場合に生じるとみなされる。抗原を経験したＴ細胞の頻度は１０６中１から１０３中１であり、よって、分離された細胞が抗原経験Ｔ細胞であるか否かを決定することができる。
【００９７】
Ｔ細胞による薬剤の認識の決定はインビボにおいて測定してよい。典型的には、薬剤を宿に投与して、次に、薬剤の認識を示す応答を測定してよい。薬剤は、典型的には、皮内又は表皮投与である。薬剤は、典型的には、皮膚の外部に接触させることにより投与され、そしてプラスター又は包帯の補助により当該部位に保持されてよい。或いは、薬剤は針により、例えば注射により投与してよいが、他の方法、例えば弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｓ）（例えば、核酸をデリバリーするために使用される弾道技術）により投与することもできる。ＥＰ−Ａ−０６９３１１９は、薬剤を投与するために典型的に使用できる技術を記載する。典型的には、０．００１から１０００μｇ、例えば０．０１から１００μｇ又は０．１から１０μｇの薬剤を投与する。
【００９８】
一つの態様において、インビボにおいて薬剤を提供することができる生成物を投与できる。即ち、薬剤を発現できるポリヌクレオチドを投与することができ、典型的には、薬剤の投与のための上で記載された様式の何れかによる。ポリヌクレオチドは、典型的には、以下に論じられる、発明により提供されるポリヌクレオチドの特性の何れかを有する。典型的には、０．００１から１０００μｇ、例えば０．０１から１００μｇ又は０．１から１０μｇのポリヌクレオチドを投与する。
【００９９】
皮膚に投与される薬剤の認識は、典型的には、投与部位における炎症の発症により示唆される（例えば、硬化、紅斑又は浮腫）。これは、一般に、当該部位における目視試験により判断される。
【０１００】
薬剤を結合する抗体の検出に基づく診断法は、典型的には、個体からのサンプル（本明細書にて言及されたサンプルの何れかで、任意に本明細書にて言及された様式の何れかにより加工された）を薬剤と接触させ、そしてサンプル中の抗体が薬剤を結合するか否かを決定することにより実施され、そのような結合が、個体がセリアック病を有するか又は感受性であるかを示す。結合アッセイのあらゆる適当なフォーマット、例えば本明細書にて言及されたあらゆるそのようなフォーマットを使用してよい。
治療
本明細書にて記載された免疫上優勢なエピトープ及び他のエピトープの同定は、このエピトープを認識するＴ細胞を標的とする治療用生成物が作成されるのを可能にさせる（そのようなＴ細胞はグリアジンに対する免疫応答に参加するものである）。これらの発見は、抗体又はエピトープに対するＴ細胞応答を抑圧（寛容）することによりセリアック病の予防又は治療を可能にもする。
【０１０１】
発明の特定の薬剤は、発明のエピトープを認識するＴＣＲを結合し（上で論じられた結合アッセイの何れかを用いて測定されるとおり）、そしてＴＣＲを有するＴ細胞の寛容を導く。そのような薬剤は、任意にキャリアーと共に、従ってセリアック病を予防又は治療するのに使用することができる。
【０１０２】
一般に、寛容は、（ＴＣＲによりされた後に）Ｔ細胞の抗原特異的機能活性を導き得る同じペプチドにより導かれ得る（例えば、本明細書にて言及されたそのような活性、例えばサイトカインの分泌）。そのような薬剤は「寛容」コンテクストにおいて免疫系に対して提示される時に寛容を導く。
【０１０３】
寛容は免疫系によるＴ細胞又は抗体エピトープの認識の低下を導く。Ｔ細胞エピトープの場合、これは、エピトープを認識するＴ細胞の欠失又はアネルギーにより導かれ得る。即ち、エピトープに応答するＴ細胞活性（例えば、本明細書にて言及された適当なアッセイにおいて測定されたとおり）が低下する。抗体応答の寛容は、エピトープが投与されたときに、エピトープに対する特異的抗体の量の低下が生じることを意味する。
【０１０４】
そのようなコンテクストにおいて免疫系に対して抗原を提示する方法は公知であり、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ８２，２０７−２１５（１９９７），Ｔｈｕａｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９，３７０−６（１９９７）、及びＷｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，５２８−３３（１９９７）に記載されている。特に、特別の投与経路が寛容を導き得て、例えば、経口、鼻内又は腹膜内である。寛容は樹状細胞及びテトラマー提示ペプチドにより達成してもよい。寛容を導く特定の生成物を個体に投与してよい（例えば、薬剤も含む組成物中で）。そのような生成物は、サイトカイン、例えばＴｈ２応答を好むサイトカインを含む（例えば、ＩＬ−４，ＴＧＦ−β又はＩＬ−１０）。生成物又は薬剤は、寛容を導く用量にて投与してよい。
【０１０５】
発明は、Ｔ細胞のアンタゴニストとして作用することができる配列を含む蛋白質を提供する（そのＴ細胞は薬剤を認識する）。そのような蛋白質及びそのようなアンタゴニストはセリアック病を予防又は治療するのに使用することもできる。アンタゴニストはＴ細胞応答の低下を導く。一つの態様において、アンタゴニストはＴ細胞のＴＣＲに結合する（一般に、ＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８との複合体の形態にて）が、正常な機能活性化を導く代わりに、Ｔ細胞内シグナリングカスケードを通して異常なシグナルを通過させることを導き、Ｔ細胞が低下した機能活性を持つように導く（例えば、エピトープの認識に応答して、典型的には本明細書にて言及された適当なアンタゴニストの何れかにより測定される）。
【０１０６】
一つの態様において、アンタゴニストはエピトープとＭＨＣプロセシング及び提示の経路の成分への結合、例えばＭＨＣ分子（典型的には、ＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８）に関して競合する。即ち、アンタゴニストは、ＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８（即ち、このＭＨＣ分子により提示されるペプチドである）、例えばペプチドＴＰ（表１０）又はその相同体を結合してよい。
【０１０７】
拮抗作用を導く方法は、当業界公知である。一つの態様において、アンタゴニストは上で言及されたエピトープの相同体であり、そして配列の何れか、結合又は薬剤の他の特性を有してよい（特に、類似体）。アンタゴニストは、典型的には、上記のエピトープの何れかとは（Ｔ細胞内で正常な抗原特異的機能を導くことができる）、１、２、３、４又はそれ以上の変異だけ（各々は置換、挿入又は欠失であってよい）異なる。そのようなアンタゴニストは当業界において「変更されたペプチドリガンド」又は「ＡＰＬ」と呼ばれる。変異は、典型的には、ＴＣＲに接触するアミノ酸位置においてである。
【０１０８】
アンタゴニストはＡ−グリアジンのアミノ酸６５から６７により表される配列に均等な配列内の置換によりエピトープと異なってよい（表９に示すようなアンタゴニスト）。即ち、好ましくは、アンタゴニストは６４、６５又は６７位の均等なものにおいて置換を有する。好ましくは、置換は、６４Ｗ，６７Ｗ，６７Ｍ又は６５Ｔである。
【０１０９】
個体における発明のエピトープに対するＴ細胞の免疫応答はポリクローナルであるから、１より多いアンタゴニストが投与されることにより、異なるＴＣＲｓを有する応答のＴ細胞の拮抗作用を導いてよい。よって、アンタゴニストは少なくとも２、４、６又はそれより多いアンタゴニストを含む組成物中で投与されてよく、各々が異なるＴ細胞と拮抗する。
【０１１０】
発明は、（上記薬剤を認識する）Ｔ細胞のアンタゴニストを同定する方法も提供し、候補物質をＴ細胞と接触させ、そしてＴ細胞が抗原特異的応答を経る能力の低下を当該物質が導くか否かを検出することを含み（例えば、本明細書にて言及された何れかの適当なアンタゴニストを用いて）、上記能力のあらゆるそのような低下の検出が物質がアンタゴニストであることを示す。
【０１１１】
一つの態様において、アンタゴニスト（特定のエピトープに対する複数のアンタゴニストの組み合わせを含む）又は寛容（Ｔ細胞及び抗体寛容）薬剤は、発明の異なるエピトープに対して、例えば１より多い物質を含む生成物である薬剤に関して上で論じられたエピトープの組み合わせに対して、拮抗するか又は寛容する少なくとも２、４、６又はそれより多いアンタゴニスト又は薬剤を含む組成物中に存在する。
組成物がセリアック病を引き起こすか否かを試験する
上で論じられたとおり、発明は、組成物がセリアック病を引き起こすことができるか否かを決定する方法を提供し、トランスグルタミナーゼにより発明の薬剤又はエピトープを含む配列に修飾され得る蛋白質配列の存在を検出することを含む（そのようなトランスグルタミナーゼ活性はヒトの腸のトランスグルタミナーゼ活性であってよい）。典型的には、これは、特定の様式にて配列に結合するモイエティを組成物に接触させる結合アッセイを用いて実施され、そして配列／モイエティ複合体の形成を検出して薬剤の存在を確認するのに使用する。そのようなモイエティは、本明細書にて言及された何れかの適当な物質（又は物質の種類）であってよく、そして典型的には特異的抗体である。結合アッセイのあらゆる適当なフォーマットを使用することができる（例えば、本明細書にて言及されたもの）。
【０１１２】
一つの態様において、上記組成物を、異なるグリアジン由来の発明のエピトープに特異的な少なくとも２、５、１０又はそれより多い抗体、例えば、１よりも多い物質を含む生成物である発明の薬剤に関して上で論じられたエピトープの組み合わせを認識することができる抗体のパネルに接触させる。
【０１１３】
上記組成物は、典型的には、セリアック病を引き起こし得るグリアジンを発現する植物由来の材料を含む（例えば、本明細書にて言及されたグリアジン又は植物の何れも）。そのような材料は植物の一部、例えば収穫された作物（例えば、種子）であってよい。材料は植物材料の加工された生成物（例えば、本明細書にて言及されたあらゆるそのような生成物）、例えばグリアジンを含む穀粉又は食物であってよい。食物材料の加工及び適当な結合アッセイにおける試験は日常的であり、例えばＫｒｉｃｋａ ＬＪ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．１３，１８９−９３（１９９８）に言及されたとおりである。
結合アッセイ
本明細書にて言及された２つの物質間の結合の決定は、結合に際して変化する一方又は両方の物質の特性、例えば分光学上の変化を測定することにより実施してよい。
【０１１４】
結合アッセイフォーマットは「バンドシフト」系であってよい。これは、一つの物質（例えば、候補物質）の存在がゲル電気泳動の間に他の物質の進行を進めさせるか又は遅らせるかを決定することを含む。
【０１１５】
上記フォーマットは、一つの物質が他の物質、例えば特異的抗体に結合することが知られている薬剤に対する他の物質の結合を阻害できるか否かを決定する、競合結合法であってよい。
変異体グリアジン蛋白質
発明は、本発明の配列又はそのような配列を提供するためにトランスグルタミナーゼにより修飾され得る配列が変異することによりもはやエピトープを認識するＴ細胞応答を導かないか又はエピトープを認識するＴ細胞応答により認識されないような、グリアジン蛋白質を提供する。このコンテクストにおいて、用語認識はＴ細胞の正常な（非拮抗）抗原−特異的機能活性が生じるような様式におけるエピトープのＴＣＲ結合を意味する。
【０１１６】
他のグリアジンにおいて均等なエピトープを同定する方法は、上で論じられている。変異したグリアジンの野生型は、セリアック病を引き起こすものである。そのようなグリアジンは、例えば配列番号：３の全域又は配列番号：３の１５、３０、６０、１００又は２００の連続するアミノ酸にわたり上記の程度（類似体に関して）、配列番号：３に相同性を有してよい。同様に、他の非−Ａ−グリアジンに関しては、そのグリアジンの変異体と天然形態の間に相同性が存在することになる。他の天然グリアジン蛋白質の配列は当業界公知である。
【０１１７】
変異したグリアジンはセリアック病を引き起こさないか、又はセリアック病の兆候の低下を導く。典型的には、エピトープがＴ細胞応答を誘導する能力を変異が低下させる。変異したエピトープはＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８に対する低下した結合、ＡＰＣにより提示される能力の低下、又は薬剤を認識するＴ細胞に結合するか又は当該Ｔ細胞により認識される能力（即ち、抗原−特異的機能活性）の低下を有してよい。変異したグリアジン又はエピトープは、よって、発明の診断の側面に関して、本明細書にて言及されたアッセイの何れかにおいて認識を示さないか又は低下した認識を示すことになる。
【０１１８】
上記変異は、上記エピトープ中の１から３、４から６、６から１０、１１から１５又はそれより長い長さの一つ又はそれより多い欠失、付加又は置換であってよく、例えば、配列番号：２の配列にわたるか、配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４及び４６の何れかにわたるか、又はそれらの均等物にわたる。好ましくは、上記変異グリアジンは、配列番号：１の配列内に少なくとも一つの変異を有する。好ましい変異は、Ａ−グリアジン中の６５位である（又は他のグリアジン中の均等な位置）。典型的には、この位置において天然に生じるグルタミンは、表３に示されるアミノ酸の何れか、好ましくはヒスチジン、チロシン、トリプトファン、リジン、プロリン又はアルギニンにより置換される。
【０１１９】
発明は、即ち、グリアジン蛋白質のエピトープ内の変異（本明細書にて論じられる何れかの配列中の変異のそのような変異）の用途も提供し、当該エピトープは本発明のエピトープであり、グリアジン蛋白質がセリアック病を引き起こす能力を低下させる。
【０１２０】
一つの態様において、変異した配列はアンタゴニストとして作用することができる。即ち、発明は、Ｔ細胞受容体に結合することができる配列を含む蛋白質を提供し、Ｔ細胞受容体は発明の薬剤を認識し、そして配列はそのようなＴ細胞受容体を認識するＴ細胞の拮抗作用を導くことができる。
【０１２１】
発明は、上記変異グリアジン蛋白質の断片である蛋白質も提供し、それらは少なくとも１５アミノ酸の長さ（例えば、少なくとも３０、６０、１００、１５０、２００又は２５０アミノ酸長）であり、そしてグリアジンが認識される能力を低下させる上で論じられた変異を含む。上で言及された変異蛋白質の何れも（断片を含む）、例えば他のグリアジン又は非グリアジン蛋白質と融合蛋白質の形態で存在してもよい。
【０１２２】
変異グリアジン蛋白質に対する均等な野生型蛋白質は、典型的には、イネ科の単子葉植物、例えばコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属の植物、例えば、コムギ、ライムギ、オオムギ、エンバク又はライコムギに由来する。蛋白質は、典型的には、α、αβ、γ又はωグリアジンである。グリアジンはＡ−グリアジンであってよい。
キット
発明は、一つ又はそれより多い薬剤、及び任意にＴ細胞による薬剤の検出のための手段を含む、上記方法を実施するためのキットも提供する。典型的には、異なる薬剤を、同時、別々又は連続する使用のために提供する。提供、認識を検出する手段は、上で論じられた技術に基づいて検出を可能にするか又は補助する。
【０１２３】
即ち、上記手段は、認識後にＴ細胞により分泌された物質の検出を可能にしてよい。上記キットは、即ち、物質、例えば抗体のための特異的結合モイエティをさらに含んでよい。当該モイエティは、典型的には、ＩＦＮ−γに特異的である。当該モイエティは典型的には固相支持体に固定化される。これは、モイエティを結合した後に、上記物質がそれを分泌するＴ細胞の付近に残ることを意味する。即ち、物質／モイエティ複合体の「スポット」が支持体上に形成され、各スポットが物質を分泌するＴ細胞を表す。スポットを定量し、そして典型的には対照に対して比較することにより、薬剤の認識の決定を可能にする。
【０１２４】
上記キットは、物質／モイエティ複合体を検出する手段も含む。検出可能な変化、例えば色の変化が、物質を結合後にモイエティ自身に生じる。或いは、第２のモイエティが直接又は間接に検出のために標識され、スポットの決定を可能にするように物質／モイエティ複合体を結合することを可能にしてよい。上で論じられたとおり、第２モイエティは物質に対して特異的であってよいが、第１モイエティとは上記物質に対して異なる部位において結合する。
【０１２５】
固定化された支持体はウエルを有するプレート、例えばマイクロタイタープレートであってよい。各アッセイは、よって、プレート中の別々のウエル内で実施され得る。
【０１２６】
上記キットは、さらに、Ｔ細胞のための培地、検出モイエティ又は検出工程において使用される洗浄バッファーを含んでよい。上記キットは、さらに、サンプルからの分離に適した試薬、例えばサンプルからのＰＢＭＣｓ又はＴ細胞の分離に適した試薬を含んでよい。上記キットは、サンプルの成分の如何なる分離も無しに、サンプルからのＴ細胞の直接の同定を可能にするようにデザインしてよい。
【０１２７】
上記キットは、対照、例えば陽性対照又は陰性対照も含んでよい。陽性対照は検出系が試験されるのを可能にしてよい。即ち、陽性対照は、典型的には、上記方法の何れかにおいて薬剤の認識を模倣する。典型的には、インビトロにおいて認識を決定するためにデザインされたキットにおいては、陽性対照はサイトカインである。薬剤のインビボの認識を検出するためにデザインされたキットにおいては、陽性対照はほとんどの個体が認識すべき抗原であってよい。
【０１２８】
上記キットは、宿主からのＴ細胞を含むサンプル、例えば血液サンプルを採取するための手段も含んでよい。上記キットは、宿主からのサンプルから単核細胞又はＴ細胞を分離するための手段を含んでよい。
ポリヌクレオチド、細胞、トランスジェニック哺乳類及び抗体
発明は、薬剤又は変異グリアジン蛋白質を提供するための発現可能なポリヌクレオチドも提供する。典型的には、当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡで、単鎖又は二重鎖である。当該ポリヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも５０塩基又は塩基対、例えば５０から１００、１００から５００、５００から１０００又は１０００から２０００又はそれより多い塩基又は塩基対を含むことになる。当該ポリヌクレオチドは、よって、配列番号：１又は２又は本明細書にて言及された他の薬剤の何れかの配列をコードする配列を含む。このコーディング配列の５’及び３’に、発明のポリヌクレオチドは対応するグリアジン遺伝子内のこれら配列に対して５’及び３’の配列又はコドンと異なる配列又はコドンを有する。
【０１２９】
上記ペプチドをコードする配列に対して５’及び／又は３’に、上記ポリヌクレオチドはコーディング配列又は非コーディング配列を有する。コーディング配列に対して５’及び／又は３’の配列は、上記薬剤をコードする配列の発現、例えば、転写及び／又は翻訳を助ける配列を含んでよい。上記ポリヌクレオチドは、原核又は真核細胞において上記薬剤を発現することができてよい。一つの態様において、上記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞、例えばヒト、霊長類又は齧歯類（例えば、マウス又はラット）細胞内で上記薬剤を発現することができる。
【０１３０】
発明のポリヌクレオチドは、バックグラウンドを顕著に超えるレベルで配列番号：３をコードするポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズしてよい。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、中から高いストリンジェンシー（例えば、０．０３Ｍ 塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃から約６０℃において）の条件下で達成される。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは当業界公知のあらゆる適切な条件下で実施してよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照）。例えば、高いストリンジェンシーが必要なら、適切な条件は０．２ｘＳＳＣ、６０℃を含む。低いストリンジェンシーが必要なら、適切な条件は２ｘＳＳＣ、６０℃を含む。
【０１３１】
発明の薬剤又は蛋白質は、本明細書にて記載されるポリヌクレオチドによりコードされてよい。
【０１３２】
当該ポリヌクレオチドは、複製可能なベクターを形成するか又はベクターに取り込まれてよい。そのようなベクターは、適当な細胞中で複製することができる。当該ベクターは、発現ベクターであってよい。そのようなベクターにおいて、発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現を提供することができる制御配列に作動可能に連結される。当該ベクターは、選択可能なマーカー、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでよい。
【０１３３】
上記ポリヌクレオチド又はベクターは細胞中に存在してよい。そのような細胞は上記ポリヌクレオチド又はベクターにより形質転換されていてよい。当該細胞は上記薬剤を発現してよい。当該細胞は上記ベクターに適合可能なように選択され、そして、例えば、原核（細菌）、酵母、昆虫又は哺乳類の細胞であってよい。当該ポリヌクレオチド又はベクターは、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、又はエレクトロポレーションを含む慣用技術を用いて宿主細胞に導入されてよい。
【０１３４】
発明は、組換え手段による発明の蛋白質の生産のためのプロセスを提供する。これは、（ａ）蛋白質の発現を可能にさせる条件下で上で定義された形質転換細胞を培養し；そして好ましくは（ｂ）発現されたポリペプチドを回収することを含んでよい。任意に、上記ポリペプチドは、当業界公知の技術により単離され、及び／又は、精製されてよい。
【０１３５】
発明は、そのような認識（又は結合）が可能な薬剤又はその断片を認識する（又は結合する）ＴＣＲｓも提供する。これらは、発明の蛋白質に関して本明細書にて論じられた本明細書にて言及された如何なる形態でも存在し得る（例えば、精製度）。発明は、発明の細胞に関して本明細書にて論じられた如何なる形態でも存在し得る（例えば、精製度）そのようなＴＣＲｓを発現するＴ細胞も提供する。
【０１３６】
発明は、薬剤（例えば、発明のエピトープ）を特異的に認識しそして発明の変異グリアジン蛋白質を認識する（そして典型的には均等な野生型グリアジンを認識しない）薬剤を特異的に認識するモノクローナル又はポリクローナル抗体、及びそのような抗体を作成する方法も提供する。発明の抗体は発明のこれらの物質に特異的に結合する。
【０１３７】
この発明のために、用語「抗体」は、抗体断片、例えば、Ｆｖ，Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ）２断片、並びに一本鎖抗体を含む。
【０１３８】
ポリクローナル抗体を生産する方法は、適当な宿主動物、例えば実験動物を免疫源で免疫し、そして血清からイムノグロブリンを単離することを含む。上記動物は、よって、免疫源を接種されてよく、次に血液を当該動物から採取し、そしてＩｇＧ分画を精製する。モノクローナル抗体を生産する方法は、所望の抗体を生産する細胞を不死にすることを含む。ハイブリドーマ細胞は、接種された実験動物からの脾臓細胞を腫瘍細胞と融合することにより生産してよい（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７）。
【０１３９】
所望の抗体を生産する不死の細胞を慣用の手法により選択してよい。ハイブリドーマは、培養液中で培養されるか、又は腹水液の形成のために腹膜内に注射されるか、又は同種の宿主又は免疫上無防備状態の宿主の血流に注射されてよい。ヒトの抗体は、ヒトリンパ球のインビトロ免疫、続くエプスタイン−バールウイルスによるリンパ球の形質転換により製造してよい。
【０１４０】
モノクローナル抗体は及びポリクローナル抗体はの両方の生産のためには、実験動物は、ヤギ、ウサギ、ラット又はマウスが適している。所望なら、免疫源は、例えばアミノ酸残基の一つの側鎖を通して免疫源が適当なキャリアーにカップリングされるようにコンジュゲートとして投与してよい。得られた抗体は、単離し、そして所望なら精製してよい。
【０１４１】
発明のポリヌクレオチド、薬剤、蛋白質、又は抗体は、検出可能な標識を有してよい。分泌された物質を可視検査により、任意に光学拡大手段の補助により、分泌された物質の検出を可能にする検出可能な手段は、好ましい。そのような系は、典型的には、基質中の色の変化を導く酵素標識に基づき、例えば、基質中の色の変化を導くアルカリホスファターゼである。そのような基質は市販されており、例えば、ＢｉｏＲａｄからである。他の適当な標識は、他の酵素、例えばペルオキシダーゼ、又は蛋白質標識、例えばビオチン；又は放射性標識、例えば３２Ｐ又は３５Ｓを含む。上記の標識は、公知の技術を用いて検出してよい。
【０１４２】
発明のポリヌクレオチド、薬剤、蛋白質、又は抗体は、実質上精製形態であってよい。それらは、製造物中のポリヌクレオチド、ペプチド抗体、細胞又は乾燥塊（ｄｒｙ ｍａｓｓ）の少なくとも８０％、例えば少なくとも９０、９５、９７又は９９％を一般に含む、実質上の単離された形態にあってよい。ポリヌクレオチド、薬剤、蛋白質又は抗体は、典型的には、他の細胞成分を実質上含まない。当該ポリヌクレオチド、薬剤、蛋白質又は抗体は、そのような実質上単離されたか、精製されたか、又は遊離の形態にて上記方法において使用されるか、又はそのような形態で容器キット中に存在してよい。
【０１４３】
発明は、発明のＴＣＲを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類も提供する。これは、本明細書にて論じられた哺乳類の何れかであってよい（例えば、上記抗体の生産に関して）。好ましくは、当該哺乳類は、セリアック病を有するか又は感受性である。当該哺乳類はＨＬＡ−ＤＱ２又は−ＤＱ８又はＨＬＡ−ＤＲ３−ＤＱ２を発現してもよく、及び／又は、セリアック病を引き起こすグリアジンを含むダイエットを与えられてよい（例えば、本明細書にて言及されたグリアジン蛋白質の何れか）。即ち、上記哺乳類はセリアック病の動物モデルとして機能してよい。
【０１４４】
発明は、セリアック病の治療用の生成物を同定する方法も提供し、セリアック病を有するか又は感受性の発明の動物に候補物質を投与し、そして当該哺乳類において物質がセリアック病を予防するか又は治療するか否かを決定することを含み、セリアック病の予防又は治療が、上記物質が治療用生成物であることを示す。そのような生成物はセリアック病を予防又は治療するのに使用してよい。
【０１４５】
発明は、治療用（予防用を含む）薬剤又は診断用（発明の薬剤、蛋白質及びポリヌクレオチド）薬剤を提供する。これらの物質は、薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤とそれらを混合することにより臨床投与のために製剤化される。例えば、それらは、局所、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、眼球内、皮膚内、表皮内、経皮投与のために製剤化され得る。上記物質は、薬学上受容可能であって且つ所望の投与経路のために適切なあらゆる媒体と混合してよい。注射のための薬学上受容可能なキャリアー又は希釈剤は、例えば滅菌又は等張溶液、例えば注射用の水又は生理食塩水、又は弾道デリバリー用のキャリアー粒子であってよい。
【０１４６】
物質の用量は、様々なパラメーターに従い、特に使用される薬剤；処置される患者の年齢、体重及び状態；使用される投与様式；処置される症状の重度；及び要求される臨床上の養生法に従い調節してよい。規準として、注射により投与される物質の量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇが適している。
【０１４７】
記載された投与経路及び用量は規準としてのみ意図されるが、何故ならば熟練した開業医はあらゆる特定の患者及び症状に関して投与の最適な経路及び用量を決定することができるからである。
【０１４８】
発明の物質は、即ちヒト又は動物の身体の治療方法、又はヒト身体に実施される診断法において使用してよい。特に、それらは、セリアック病を治療又は予防する方法において使用してよい。発明は、セリアック病を治療又は予防するための医薬の製造法における使用のための薬剤も提供する。即ち、発明は、その要求のあるヒトへ発明の物質を投与することを含むセリアック病の予防又は治療法を提供する（典型的には、その非毒性有効量）。
【０１４９】
発明の薬剤は、標準の合成価額技術、例えば自動化された合成器の使用により作成することができる。上記薬剤は、より長いポリペプチド、例えば融合蛋白質から作成してよく、そのようなポリペプチドは上記ペプチドの配列を含む。当該ペプチドは、例えばポリペプチドを加水分解することにより、例えばプロテアーゼの使用により；又は物理的にポリペプチドを破壊することにより、ポリペプチドに由来し得る。発明のポリヌクレオチドは標準の技術、例えば合成器を使用することにより、作成することができる。
変異グリアジン蛋白質を発現するか又はアンタゴニストとして作用し得る配列を含む蛋白質を発現する植物細胞又は植物
発明の細胞は、植物細胞、例えばイネ科の単子葉植物種の細胞であってよい。当該種は、その野生型形態がグリアジン、本明細書にて言及されたグリアジン蛋白質の何れかを発現する種であってよい（配列番号：３に対して何れかの程度の相同性を有するグリアジンを含む）。そのようなグリアジンはヒトにおいてセリアック病を引き起こすかもしれない。上記細胞は、コムギ、トウモロコシ、エンバク、ライムギ、イネ、オオムギ、ライコムギ、モロコシ、又はサトウキビの細胞であってよい。典型的には、上記細胞は、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属、例えばパンコムギ（ａｅｓｔｉｖｕｍ）、スペルトコムギ（ｓｐｅｌｔａ）、ポーランドコムギ（ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ）又はヒトツブコムギ（ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）の細胞である。
【０１５０】
発明の植物細胞は、典型的には、野生型グリアジンを発現しない（例えば、セリアック病を引き起こすかもしれない本明細書にて言及された何れかのグリアジン）か、又は薬剤を認識するＴ細胞により認識され得る配列を含むグリアジンを発現しないものである。即ち、野生型植物細胞がそのようなグリアジンを発現するなら、そのときは、そのようなグリアジンの発現を阻害するか低下させるか又はもはやセリアック病を引き起こさないようにグリアジンのアミノ酸配列を変化させるように操作してよい（典型的には、発明のエピトープをもはや発現させないことにより）。
【０１５１】
これは、変異を、例えば１、２、３又はそれより多いか又は全てのそのようなグリアジン遺伝子へ細胞内で導入すること、例えばコーディング又は非コーディング（例えば、プロモーター）へ導入することにより実施することができる。そのような変異は、本明細書にて論じられた変異の種類又は長さの何れかであり得る（例えば、相同蛋白質に関して）。上記変異は、直接様式（例えば、部位特異的変異導入又は相同組換え技術を用いて）又はランダムな様式（例えば、変異源を用い、次に典型的にはグリアジン（又はセリアック病を引き起こすグリアジン配列）をもはや発現しない変異導入された細胞を選択することにより）にて導入することができる。
【０１５２】
アンタゴニストとして作用し得る配列を含む蛋白質を発現する植物又は植物細胞の場合、そのような植物又は植物細胞は野生型グリアジン蛋白質を発現してよい（例えば、セリアック病を引き起こすもの）。好ましくは、アンタゴニスト配列の存在は、上記植物又は植物細胞由来の蛋白質を含む食物を摂取した個体において低下した兆候（例えば兆候なし）のセリアック病を引き起こす。
【０１５３】
植物細胞内に存在する（か又はに形質転換された）ポリヌクレオチドは、一般に、植物細胞内で変異グリアジン蛋白質を発現できるプロモーターを含む。所望の発現のパターンに依存して、上記プロモーターは、構成的、組織特異的、ステージ特異的；及び／又は誘導可能性であってよい。例えば、植物における強い構成的発現は、ＣＡＭＶ３５Ｓ，Ｒｕｂｉｓｃｏ ｓｓｕ又はヒストンプロモーターにより得ることができる。また、組織特異的又はステージ特異的プロモーターは、トランスジェニック植物において特定の組織へ又はその発生において特定のステージへ、発明の蛋白質の発現を標的化するために使用してよい。即ち、例えば、種子特異的、根特異的、葉特異的、花特異的等のプロモーターを使用してよい。種子特異的プロモーターは、Ｄａｌｔａ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．（１９９７），３，ｐｐ．２６９−２９６）に記載されたものを含む。種子特異的プロモーターの特定の例は、ｎａｐｉｎプロモーター（ＥＰ−Ａ−０ ２５５，３７８）、ファセオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンセニンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）及びＡＴＳ１及びＡＴＳ３プロモーター（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０６７９８）を含む。
【０１５４】
上記細胞はあらゆる形態であってよい。例えば、単離された細胞、例えばプロトプラストであってよいか、又は植物組織の一部、例えばカルス又は植物から切り出された組織であってよいか、又は植物全体の一部であってよい。上記細胞はあらゆる種類の細胞であってよい（例えば、植物の部分のあらゆる種類）。例えば、分化しない細胞、例えばカルス細胞；又は分化した細胞、胚、花粉、根、若枝（ｓｈｏｏｔｓ）又は葉に見いだされる種類の細胞。植物の部分は、根；若枝；葉及び生殖に関与する部分、例えば、花粉、卵、おしべ、葯、花弁、萼片、及び他の花の部分を含む。
【０１５５】
発明は、トランスジェニック植物細胞を提供するように発明のポリヌクレオチド又はベクターにより植物細胞を形質転換することを含む、トランスジェニック植物細胞を得るための方法を提供する。あらゆる適切な形質転換方法を使用してよい（コムギの場合、Ｖａｓｉｌ Ｖ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，６６７−６７４（１９９２）に開示された技術を使用してよい）。好ましい形質転換技術は、植物プロトプラストのエレクトロポレーション及び粒子の砲撃を含む。形質転換は、即ち、幾つかの細胞がトランスジェニックで幾つかはそうでないようなキメラ組織又は植物を生じてよい。
【０１５６】
発明の細胞又はそうして得られた細胞は、当業界公知の技術によりトランスジェニック植物へ再生されてよい。これらは、トランスジェニック細胞の生育及び／又は分割を刺激するための、オーキシン、ジベレリン及び／又はサイトキニンのような植物成長物質の使用を含んでよい。同様に、体性胚形成及び分裂組織培養のような技術を使用してよい。再生技術は当業界にて公知であり、例えば、米国特許第４，４５９，３５５号、米国特許第４，５３６，４７５号、米国特許第５，４６４，７６３号、米国特許第５，１７７，０１０号、米国特許第５，１８７，０７３号、欧州特許２６７，１５９，欧州特許６０４，６６２，欧州特許６７２，７５２、米国特許第４，９４５，０５０号、米国特許第５，０３６，００６号、米国特許第５，１００，７９２号、米国特許第５，３７１，０１４号、米国特許第５，４７８，７４４号、米国特許第５，１７９，０２２号、米国特許第５，５６５，３４６号、米国特許第５，４８４，９５６号、米国特許第５，５０８，４６８号、米国特許第５，５３８，８７７号、米国特許第５，５５４，７９８号、米国特許第５，４８９，５２０号、米国特許第５，５１０，３１８号、米国特許第５，２０４，２５３号、米国特許第５，４０５，７６５号、欧州特許４４２，１７４，欧州特許４８６，２３３、欧州特許４８６，２３４、欧州特許５３９，５６３、欧州特許６７４，７２５、ＷＯ９１／０２０７１及びＷＯ９５／０６１２８に見いだすことができる。
【０１５７】
そのような多くの技術において、一つの工程は、細胞を膨張させる及び／又は分割することを含む、カルス、即ち細胞組織の形成である。そのようなカルスは他の種類の植物細胞培養物及び植物の部分であるように、発明の別の側面である。即ち、例えば、発明は、トランスジェニック植物組織及び部分を提供するが、胚、分裂組織、種子、若枝、根、幹、葉及び花の部分を含む。これらは、それらの細胞の幾つかが発明の細胞であり幾つかはそうでない感覚において、キメラであってよい。発明のトランスジェニック植物部分及び組織、植物及び／又は種子は、本明細書にて言及された植物種の何れかのものであってよい。
【０１５８】
再生手法は、典型的には、マーカー遺伝子による、形質転換された細胞の選択を含む。
【０１５９】
再生工程は、第１世代のトランスジェニック植物を生じる。発明は、この第１世代植物からのさらなる再生のトランスジェニック植物を得るための方法も提供する。これらは子孫トランスジェニック植物として知られる。第２、第３、第４、第５、第６及びさらなる世代の子孫植物は、当業界公知のあらゆる手段により第１世代のトランスジェニック植物から得てよい。
【０１６０】
即ち、発明は、トランスジェニック子孫植物を得る方法を提供し、発明の第１世代のトランスジェニック植物から第２世代のトランスジェニック子孫植物を得て、そして任意に第２世代のトランスジェニック子孫植物から一つ又はそれより多い世代のトランスジェニック植物を得ることを含む。
【０１６１】
子孫植物はあらゆる公知の技術による前の世代のそれらの先祖から生じさせてよい。特に、子孫植物は：
前の世代に属する発明のトランスジェニック植物からトランスジェニック種子を得て、次にトランスジェニック種子を成長させることにより新世代の発明のトランスジェニック子孫植物を得て；そして／又は
前の世代に属する発明のトランスジェニック植物をクローンとして増殖させることにより新世代に属する発明のトランスジェニック子孫植物を提供し；そして／又は
前の世代に属する発明の第１世代のトランスジェニック植物を別の匹敵する植物と交配することにより、新世代に属する発明のトランスジェニック子孫植物を提供し；そして／任意に
そうして得られた子孫から一つ又はそれより多いさらなる世代のトランスジェニック子孫植物を得ること
により生産してよい。
【０１６２】
これらの技術はあらゆる組み合わせにおいて使用してよい。例えば、クローンとしての増殖及び有性増殖を、別の点において、培養のために適したトランスジェニック植物を生じるプロセスにおいて、使用してよい。特に、農業経済学上望まれる特性を有する植物分類群との繰り返しの戻し交配を企ててよい。植物及びそれから再生した新規な植物からの細胞の取り出しの別の工程も実施してよい。
【０１６３】
また、細胞、植物組織、植物又は種子をあらゆる適切なステージにおいて、さらに望まれる特性を導入することにより、発明のポリヌクレオチド以外の所望のコーディング配列を導入してよい。これは、発明のポリヌクレオチドの導入のために本明細書にて記載された技術により実施してよい。
【０１６４】
例えば、他の除草剤耐性特性、例えばグリフォセート（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）に対する寛容（例えば、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（例えば、ＥＰ−Ａ−０２９３，３５８）又はグリフォセートオキシドレダクターゼ（ＷＯ９２／０００３７７）遺伝子）をコードするトランス遺伝子から；又は、フォサメチン；ジハロベンゾニトリル；グルフォシネートに対する寛容をコードするトランス遺伝子から、例えばホスフィノチリシナセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）又はグルタミンシンターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−０２４２，２３６参照）を用いて；アスラム、例えば、ジヒドロプテロエートシンターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−０ ３６９，３６７参照）；又はスルフォニルウレア、例えば、ＡＬＳ遺伝子を用いて；ジフェニルエーテル、例えば、アシフルオルフェン又はオキサジアゾン、例えば、プロトポルフィロジェンオキシダーゼ遺伝子；環状イミド、例えば、クロロフサリム；フェニルピラゾール、例えば、ＴＮＰ、又はフェノピレート又はそのカルバメート類似体；さらなるトランス遺伝子を選択してよい。
【０１６５】
同様に、除草剤寛容以外の有益な特性に関する遺伝子を導入してよい。例えば、昆虫耐性遺伝子を導入してよく、注目に値するのはバチルスサリンジェネシス（Ｂｔ）の毒素をコードする遺伝子である。同様に、疾患耐性遺伝子を導入してよく、例えば、ＷＯ９１／０２７０１又はＷＯ９５／０６１２８におけるとおりである。
【０１６６】
典型的には、発明の蛋白質を発明の植物内で発現させる。使用されるプロモーターにより、この発現は構成的又は誘導可能であってよい。同様に、組織特異的か又はステージ特異的であってよく、即ち、特定の植物の組織（例えば、本明細書にて言及された組織の何れか）又は植物の発生におけるステージに直接向けられる。
【０１６７】
発明は、作物を得るための方法も提供し、発明のトランスジェニック植物を収穫し、そして任意にさらに加工することを含む。作物は、作物植物から得ることができるあらゆる有用な生成物を意味する。
変異グリアジン蛋白質又はアンタゴニストとして作用することができる配列を含む蛋白質を含む生成物
発明は、変異グリアジン蛋白質又はアンタゴニストとして作用することができる配列を含む蛋白質を含む生成物を提供する。これは、典型的には、そのような蛋白質を発現する本明細書にて言及された植物に由来するか又は植物の部分を含む。そのような生成物は、発明の植物を直接収穫するか又は間接に収穫し、そしてさらに加工することにより得ることが可能であってよい。直接に得ることが可能な生成物は穀物を含む。あるいは、そのような生成物は、回収してさらに加工することにより間接に得ることが可能であってよい。さらに加工することにより得ることが可能な生成物の例は、小麦粉又は蒸留されたアルコール飲料；直接得ることができるか又はさらに加工した材料、例えば小麦粉から作られた焼いた製品（例えば、パン）から作られる食物製品である。典型的には、そのような食物製品はヒト個体により摂取可能であって消化可能である（即ち、非毒性であって栄養価値がある）。
【０１６８】
アンタゴニスト配列を含む蛋白質を含む食物製品の場合、食物製品は野生型グリアジンを含んでもよいが、好ましくは当該アンタゴニストはそのような食物を摂取した後にセリアック病の兆候の低下（又は完全に）を導くことができる。
【０１６９】
発明は、以下の非限定実施例により例示される。
【実施例】
【０１７０】
実施例１
我々は、完全に特性決定されたグリアジン、「Ａ−グリアジン」の全配列にわたる５１セットの合成１５マーペプチドを使用することによりセリアック病のエピトープマッピングを実施した（表１参照）。Ａ−グリアジンペプチドはｔＴＧにより個々に処理されることにより、インビボで生成したものを模倣したかもしれない生成物を生成した３。我々は、実験上の感染及び自己免疫疾患において記載されたとおり、エピトープの「拡散」又は「消費」が起きたかもしれない可能性を避けるために、疾患の消滅の開始点においてセリアック病患者を研究しようとも努めた。
３日及び１０日のパンチャレンジによる臨床上及びＡ−グリアジン特異的なＴ細胞応答
パイロット研究において、セリアック病の２人の患者が緩解したが、血清の抗−筋内膜抗体（ＥＭＡ）の不在により定義され、グルテンフリーダイエットは彼らの通常のグルテンフリーダイエットに加えて、標準のグルテン含有白パン４スライスを毎日給仕された。被験者１は３日後に腹痛、口の潰瘍及びゆるい下痢のためにパンを停止したが、被験者２は１週間目に軽い吐き気があっただけで１０日間継続した。ＥＭＡは被験者２においてパンチャレンジの１週間後に陽性になったことから、使用したパンがセリアック病の再発を導いたことを示す。しかし、被験者１においては、ＥＭＡはパンチャレンジから２カ月まで陰性のままであった。両被験者において、パンチャレンジにより出現した兆候はグルテンフリーダイエットに戻って２日以内に解消した。
【０１７１】
ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイのＡ−グリアジンに対するＰＢＭＣ応答は、パンチャレンジの前と間に見いだされなかった。しかし、被験者１においてはパンの消費の１日後に（４日目）、ｔＴＧにより処理したＡ−グリアジン５１−８５にわたる５つのオーバーラップするペプチドの単一のプール（プール３）が有力なＩＦＮγ応答を示した（図１ａ参照）。被験者１においては、Ａ−グリアジンペプチドに対するＰＢＭＣ ＩＦＮγ応答はプール３単独に標的化されたままであり、８日目に最大であった。プール３に対する応答の動力学及び大きさは、α−キモトリプシン消化されたグリアジンにより導かれるのと同様であった。ｔＴＧ処理したプール３に対するＰＢＭＣ ＩＦＮγ応答はｔＴＧ処理されなかったプール３より５から１２倍の大きさに一貫し、そしてα−キモトリプシン消化したグリアジンに対する応答はｔＴＧ処理した場合の３から１０倍大きかった。被験者２においては、ｔＴＧ処理されたプール３も、８日目にＡ−グリアジンペプチドの免疫源セットのみであったが、この応答は被験者１よりも弱く、４日目には観察されず、１１日目にはプール３に対する応答は減少し、そしてＡ−グリアジンペプチドの他のｔＴＧ処理プールがより強いＩＦＮγ応答を導いた（図１ｂ参照）。
【０１７２】
パイロット研究は、これらのセリアック病被験者における初期Ｔ細胞応答が５つのペプチドの単一のｔＴＧ処理Ａ−グリアジンプールに対してであったこと、及び末梢血において容易に測定されたことを示した。抗原暴露が３日ではなく１０日間続いたなら、他のＡ−グリアジンペプチドに対するＴ細胞応答が、エピトープの拡散に一致して、出現する。
ｔＴＧ処理されたＡ−グリアジンペプチドによるセリアック病特異的ＩＦＮ−ｇ誘導
グルテンフリーダイエットの別の６人のセリアック病被験者の内の５人において（表１参照）、３日間のパンチャレンジはｔＴＧ処理されたペプチドをプール３に同定し、特に、ＰＢＭＣからＩＦＮγを導く唯一のＡ−グリアジン成分としての５６−７０（１２）及び６０−７５（１３）に相当するペプチドであった（図２参照）。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴと平行して流したＩＬ−１０ ＥＬＩＳＰＯＴは、ｔＴＧ処理されたペプチド１２又は１３に対してＩＬ−１０の応答を示さなかった。一人の被験者においては、パンチャレンジの４日前、４日間又は４日目まで、あらゆるＡ−グリアジンペプチド又はα−キモトリプシン消化されたグリアジンに対してＩＦＮγ応答はなかった。パンチャレンジの２カ月後まで測定した場合に、これらのセリアック病被験者の誰にも基底ラインからＥＭＡ状態が変化しなかった。
【０１７３】
ＨＬＡ−ＤＱ対立遺伝子α１＊０５０１，β１＊０２０１（２８−５２歳、２人は女性）を有し、３日間パンチャレンジを受けて１カ月間グルテンフリーダイエットを受けた、４人の健康なＥＭＡ陰性被験者からのＰＢＭＣは、ｔＴＧ処理をしてもしなくても、何れのＡ−グリアジンペプチドに対しても陰性対照を超えるＩＦＮγ応答を示さなかった。即ち、ＰＢＭＣ中のＩＦＮγのｔＴＧ処理プール３及びＡ−グリアジンペプチド５６−７０（１２）及び６０−７５（１３）への誘導は、セリアック病特異的であった（７／８対０／４、ｐ＜０．０１，カイ２乗分析による）。
最小のＡ−グリアジンＴ細胞エピトープのファインマッピング
Ａ−グリアジン５６−７５の末端削除に相当するｔＴＧ処理したペプチドは、同じコアペプチド配列ＱＰＱＬＰ（配列番号：９）が評価された５人のセリアック病被験者の全てにおいて抗原性に必須であったことを明らかにした（図３参照）。ＰＢＭＣ ＩＦＮγは、７マーのＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号：４）で始まるこのコア配列にわたり、長さを伸ばしたｔＴＧ処理ペプチドに応答することから、ｔＴＧ処理された１７マーのＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：１９）（Ａ−グリアジン５７−７３）がＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて最大の活性を所有したことを示した（図４参照）。
ｔＴＧによるＱ６５の脱アミド化はＡ−グリアジン中の免疫上優勢なＴ細胞エピトープを生じる
ＨＰＬＣ分析は、Ａ−グリアジンのｔＴＧ処理が、親ペプチドにおいてあとで隣接して溶出した単一の生成物を生じたことを証明した。アミノ酸配列決定は、Ａ−グリアジン５６−７５中に含まれる６つのグルタミン（Ｑ）残基の中から選択的にｔＴＧにより脱アミド化されたことを示した（図５参照）。グルタミン酸（Ｅ）置換されたＱ６５のコアＡ−グリアジン６２−６８からの連続伸長物（ｓｅｒｉａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ）に相当するペプチドの生物活性は、ｔＴＧ処理後のＱ６５を有する同じペプチドと均等であった（図４ａ参照）。Ｑ５７及びＱ７２のＥによる両方又は単独の置換にＥ６５が伴うと、調査された３人のセリアック病被験者において、上記１７マーの抗原性を増強しなかった（図６参照）。グリアジンペプチドにおいてグルタミン残基にプロリンが続くと、インビトロにおいてｔＴＧにより脱アミド化されないため、Ｑ５７及びＱ７２を調査した（Ｗ．Ｖａｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｃｏｅｌｉａｃ Ｄｉｓｅａｓｅ）。よって、免疫上優勢なＴ細胞エピトープをＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：２）と定義した。
免疫上優勢なＴ細胞エピトープ応答はＤＱ−２制限され且つＣＤ４依存性である
ＨＬＡ−ＤＱα１＊０５０１，β１＊０２０１に関して同型接合の（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）２人のセリアック病被験者において、抗−ＤＱモノクローナル抗体がｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン５６−７５に対するＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ応答をブロックしたが、抗−ＤＰ及び−ＤＲ抗体はブロックしなかった（図７参照）。２人のセリアック病被験者からのＰＢＭＣの抗−ＣＤ４及び−ＣＤ８磁気ビーズ除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）は、ｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン５６−７５に対するＩＦＮγ応答がＣＤ４ Ｔ細胞媒介性であることを示した。
考察
この研究において、我々は、配列：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：２）（残基５７−７３）のｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン１７マーに応答性のセリアック病被験者の末梢血においてＣＤ４ Ｔ細胞の一過性集団を誘導するために、普通の白パンを用いたむしろ単純なダイエット抗原チャレンジを記載した。Ａ−グリアジン（Ｑ→Ｅ６５）に対する免疫応答はセリアック病関連対立遺伝子ＤＱα１＊０５０１，β１＊０２０１に限定される。インビトロにおける組織のトランスグルタミナーゼ作用はＱ６５を選択的に脱アミド化する。置換Ｑ→Ｅ６５を有する合成Ａ−グリアジンペプチドに対する誘導された末梢血ＩＦＮｇの応答は、ｔＴＧ処理されたＱ６５ Ａ−グリアジンペプチドに均等であり；両者は未修飾のＱ６５ Ａ−グリアジンペプチドよりもＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて１０倍にまで、より多くのＴ細胞を刺激する。
【０１７４】
我々は、エピトープマッピングにおけるＴ細胞クローンの使用により生じるかもしれない方法論上の人工物の可能性を回避するため、インビボ抗原チャレンジ及び短期間エクスビボ免疫アッセイを用いて、このセリアック病特異的Ｔ細胞エピトープを慎重に定義した。我々の発見は、グルテンの摂取に対する末梢血のＴ細胞応答が迅速であるが短命であり、且つエピトープマッピングに利用可能であることを示す。インビボ抗原チャレンジは、Ａ−グリアジンペプチドに対する免疫応答の時間の経過順の階層（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ）が存在することを示し；ｔＴＧにより修飾されたＡ−グリアジン５７−７３はＰ中のもっとも強いＩＦＮｇ応答を誘導するのみならず、第１のＩＦＮｇ応答も出現する。
【０１７５】
我々はＡ−グリアジンにわたるペプチドしか評価しなかったので、セリアック病の病因において等しいか又はより重要な他のグリアジン内の別のエピトープが存在するかもしれない。事実、我々が同定したＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号：４）であるＡ−グリアジン内のコアエピトープにおけるペプチド配列は幾つかのべつのグリアジンに共通する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ａｎｄ Ｔｒｅｍｂｌ受け入れ番号：Ｐ０２８６３，Ｑ４１５２８，Ｑ４１５３１，Ｑ４１５３３，Ｑ９ＺＰ０９，Ｐ０４７２２，Ｐ０４７２４，Ｐ１８５７３）。しかしながら、生検チャレンジ及びインビボ研究において生物活性を所有することが以前に示されたＡ−グリアジンペプチド（例えば：３１−４３、４４−５５及び２０６−２１７）４，５は、セリアック病被験者において３日間のパンチャレンジ後にＰＢＭＣにおいてＩＦＮｇ応答を誘導しなかった。これらのペプチドは、免疫応答の拡散を伴って現れる「二次」Ｔ細胞エピトープであるかもしれない。
実施例２
免疫上優勢なエピトープ内の置換に対するＴ細胞認識の効果
５７−７３Ａ−グリアジンエピトープにおける６５位のグルタミンの置換の効果を、合成ペプチドを用いてＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて置換されたエピトープに対する末梢血応答を測定することにより決定した（５０μｇ／ｍｌにおいて）。応答は３人のセリアック病患者においてグルテンチャレンジを始めて６日後に測定した（３日間４スライスのパンを毎日）。結果を表３及び図８に示す。グルタミン酸から、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、リジン、プロリン又はアルギニンへの置換において観察され得るように、免疫上優勢なエピトープに対する応答の大きさの１０％より低い大きさの応答を刺激した。即ち、この位置におけるＡ−グリアジンの変異は、免疫反応性を低下させるか又は不在にする変異グリアジンを生成するのに使用することができた。
実施例３
他の天然に生じるグリアジンからの均等なペプチドの免疫反応性の試験
他の天然に生じるコムギのグリアジン由来の均等なペプチドの免疫反応性を、天然に生じる配列に相当する合成ペプチドをトランスグルタミナーゼにより処理して使用することにより、評価した。これらのペプチドは、ＥＬＩＳＰＯＴにおいて、実施例２に記載されたのと同じ被験者からのＰＢＭＣを用いて同じ様式にて試験した。少なくとも５つのペプチドがＡ−グリアジン５７−７３ Ｅ６５ペプチドに匹敵する免疫反応性を示す（トランスグルタミナーゼ処理後）ことから、コムギ中の他のグリアジン蛋白質も同ようにこのセリアック病特異的免疫応答を誘導することを示唆する（表４及び図９）。
方法
被験者：研究において使用した患者は、英国のオックスフォードにおいてセリアック病クリニックにかかっている。セリアック病は、特有の小腸の組織構造、及び兆候の標準化及びグルテンフリーダイエットの小腸組織構造に基づいて診断された。
組織型判定：組織型判定は、ＥＤＴＡ抗凝血末梢血から抽出されたＤＮＡを用いて実施した。ＨＬＡ−ＤＱＡ及びＤＱＢ遺伝子型判定は、ＰＣＲにより配列特異的プライマーミックスを用いて実施した６−８。
抗筋内膜抗体アッセイ：ＥＭＡは、サルの食道（ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓ）を用いて１：５に希釈された患者の血清を用い、続いてＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＡを用いた間接免疫蛍光により検出した。ＩｇＡをＥＭＡの前に定量したが、どの被験者もＩｇＡ欠損ではなかった。
抗原チャレンジ：グルテンフリーダイエット後のセリアック病被験者に、４スライスのグルテン含有パンを毎日３又は１０日間食べ尽くさせた（セインズベリーズの標準の「白サンドイッチパン」）。パンチャレンジを始める前の週及び２カ月後まで、ＥＭＡを査定した。グルテンフリーダイエットを４週間経験した健康な被験者は、３日間グルテン含有パン４スライスを含む彼らの通常のダイエットを食べつくし、そして次にさらに４日間グルテンフリーダイエットに戻った。
ＩＦＮγ及びＩＬ−１０ ＥＬＩＳＰＯＴ：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離により５０−１００ｍｌの静脈血からＰＢＭＣを調製した。３回洗浄後に、ＰＢＭＣを再度、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清を含む完全ＲＰＭＩに懸濁した。ＩＦＮγ及びＩＬ−１０の単一細胞の分泌に関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、市販のキット（Ｍａｂｔｅｃｈ；ストックホルム、スエーデン）を用いて９６−ウエルプレート（ＭＡＩＰ−Ｓ−４５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ベッドフォード、ＭＡ）により、製造者の指示書（ほかで記載されたとおり９）に従い、２−５ｘ１０５（ＩＦＮγ）又は二重のウエルにて査定し、そしてミコバクテリウムツベルクロシスの精製された蛋白質誘導体（ＰＰＤ ＲＴ４９）（Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；コペンハーゲン、デンマーク）（２０μｇ／ｍｌ）を全てのアッセイにおいて陽性対照として含ませた。
ペプチド：合成ペプチドはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ハンツビル、アラバマ）から購入し、質量分光分析及びＨＰＬＣにより確認されたペプチドの真正度は７０％＞精製度であった。グリアジン（Ｓｉｇｍａ；Ｇ−３３７５）（１００ｍｇ／ｍｌ）のα−キモトリプシン（Ｓｉｇｍａ；Ｃ−３１４２）２００：１（ｗ／ｗ）による消化は、０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３中で２Ｍ尿素と共に室温において実施し、９８℃において１０分間加熱することにより２４時間後に中止した。遠心分離（１３，０００ｇ，１０分間）後に、グリアジン消化上清をフィルター滅菌した（０．２ｍｍ）。グルテンの消化をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認して、蛋白質濃度を査定した。α−キモトリプシン−消化されたグリアジン（６４０μｇ／ｍｌ）及び合成グリアジンペプチド（１５マー：１６０μｇ／ｍｌ，他のペプチド：０．１ｍＭ）を個別にｔＴＧ（Ｓｉｇｍａ；Ｔ−５３９８）（５０μｇ／ｍｌ）によりＰＢＳ中にてＣａＣｌ２を１ｍＭ加えて、２時間３７℃において処理した。ペプチド及びペプチドプールを滅菌９６−ウエルプレートに分配して、使用まで−２０℃に凍結保存した。
ペプチドのアミノ酸配列決定：逆相ＨＰＬＣを使用して、Ａ−グリアジン５６−７５のｔＴＧ処理によるペプチドを精製した。単一生成物を同定して、アミノ酸配列決定（自動化配列決定機モデル４９４Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー、カリフォルニア）に供した。未修飾のＧ５６−７５の配列はＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＳＦＰ（配列番号：５）と確認され、そしてｔＴＧ処理されたＧ５６−７５はＬＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳＦＰ（配列番号：１１）と確認された。グルタミン残基の脱アミド化は、アミノ酸配列決定のサイクル２、４、８、１０、１５及び１７において回収されたグルタミン及びグルタミン酸の合わせた量のパーセントとして表された、回収されたグルタミン酸の量（ｐｍｏｌ）として定義された。ｔＴＧに帰する脱アミド化は、（ｔＴＧ処理されたペプチド中のグルタミンの脱アミド化の％−未処理のペプチド中の脱アミド化の％）／（１００−未処理のペプチド中の脱アミド化の％）として定義された。
ＣＤ４／ＣＤ８及びＨＬＡクラスＩＩ制限：抗−ＣＤ４又は抗−ＣＤ８コートされた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ，オスロ、ノルウエー）をＲＰＭＩにより４回洗浄し、次に１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清を含む完全ＲＰＭＩ中のＰＢＭＣと共に、３０分間氷の上でインキュベートした。ビーズを磁石により取り出して、残る細胞を計数した。ｔＴＧ処理されたＡ−グリアジン５６−７５に対する免疫応答のインビボのＨＬＡ−クラスＩＩ制限は、ＰＢＭＣ（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）を抗−ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３），−ＤＲ（Ｌ２），及び−ＤＰ（Ｂ７．２１）モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と、室温において、ペプチドの添加前に１時間インキュベートすることにより、確立した。
実施例４
グリアジン−特異的末梢血リンパ球による粘膜インテグリンの発現
内皮とリンパ球のアドレシンの間の相互作用は、器官特異的なリンパ球のホーミングを促進させる。多数のアドレシンが公知である。ヘテロダイマーα４β７は粘膜固有層消化管及び他の粘膜リンパ球に特異的であり、そしてαＥβ７は消化管及び皮膚において内皮リンパ球内に特異的である。末梢血ＣＤ４ Ｔ細胞の約３０％がα４β７を発現し、そして粘膜部位へ移動中であると推定され、末梢血ＣＤ４ Ｔ細胞の５％がαＥβ７を発現する。αＥ又はβ７特異的な抗体をコートされた免疫磁気ビーズは、それぞれ、αＥβ７又はαＥβ７及びα４β７を発現する細胞のＰＢＭＣを除去する。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイとの組み合わせにより、免疫磁気ビーズの除去は、これらの細胞を粘膜表面へのホーミングとして同定するかもしれないグリアジン特異的Ｔ細胞のアドレシン発現の決定を可能にする。おもしろいことに、インビボのグルテンチャレンジは小腸の粘膜固有層へのＣＤ４ Ｔ細胞の迅速な流入に関連しており（内皮部位内ではなく）、９０％を超えるリンパ球がα４β７を発現する。
【０１７６】
免疫磁気ビーズを製造して、３日間のグルテンチャレンジの後で６日目又は７日目にセリアック病被験者からのＰＢＭＣを除去するのに使用した。ＦＡＣＳ分析は、αＥビーズが約５０％の陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を除去し、一方β７ビーズは全てのβ７陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を除去した。ＣＤ４−又はβ７−ビーズを用いたがＣＤ８−又はαＥビーズを用いないＰＢＭＣ除去はインターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔにおいて応答を完全に破壊した。ｔＴＧグリアジン及びＰＰＤ応答はＣＤ４除去により完全に破壊されたが、インテグリン特異的ビーズ除去により一貫して影響された。
【０１７７】
即ち、セリアック病においてグルテンチャレンジ後に誘導されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５特異的Ｔ細胞は、小腸中の粘膜固有層ＣＤ４ Ｔ細胞上に存在するインテグリンα４β７を発現する。
実施例５
最適なＴ細胞エピトープの長さ
Ａ−グリアジン中の優勢なＴ細胞エピトープのコアにわたる７から１７の長さのアミノ酸からのペプチドを試験する以前のデータは、３日間のグルテンチャレンジ開始から６日後にセリアック病のボランティアからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたインターフェロンガンマＥｌｉｓｐｏｔにおいて１７マーのＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（配列番号：２）が最大の応答を誘導したことを示した。
【０１７８】
Ａ−グリアジン中の優勢なＴ細胞エピトープのコア配列からの伸長を示すペプチドを、３日間のグルテンチャレンジ開始から６日後にセリアック病のボランティアからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにおいて査定した（ｎ＝４）。ペプチド１３：Ａ−グリアジン５９−７１ ＱＥ６５（１３マー）、ペプチド１５：５８−７２ ＱＥ６５（１５マー）、．．．、ペプチド２７：５２−７８ ＳＥ６５（２７マー）。
【０１７９】
図１１に示すとおり、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の伸長はＩＦＮガンマＥｌｉｓｐｏｔにおいて応答を実質上は増強しない。次の実施例は、１７マーペプチドを用いたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のアゴニスト及びアンタゴニスト活性を特性決定する。
実施例６
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５とセリアック病における他のＤＱ２−制限されるＴ細胞エピトープの比較
セリアック病の腸の生検からのグルテン特異的Ｔ細胞クローン及び系列のＴ細胞エピトープに相当する未修飾及びトランスグルタミナーゼ処理ペプチドに相当するペプチドを用いて、用量応答研究を実施した。ペプチドに対する応答はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する応答のパーセントとして表現した。全ての被験者はＨＬＡ−ＤＱ２＋であった（誰もＤＱ８＋でなかった）。
【０１８０】
上記の研究は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５が、グルテンチャレンジ後にセリアック病のＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてインターフェロンガンマの誘導に関してもっとも有効性のあるグリアジンペプチドであることを示す（図１２ａ−ｈ，及び表５及び６を参照）。第２及び第３のエピトープは、より大きなペプチド、即ちＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＧＤＡ４ ＷＨＥＡＴ Ｐ０４７２４−８４−１００ ＱＥ９２の準最適断片である。上記エピトープは適度に生物活性であるにすぎない（ブランクを差し引いた後ではＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５より約１／２０活性）。
【０１８１】
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５はセリアック病において他の公知のＴ細胞エピトープよりも有効性がある。配列決定されたグリアジン遺伝子の間でＡ−グリアジン５７−７３（配列ＰＱＬＰＹ（配列番号：１２）を含む）の１６の多型が存在し、それらの生物活性を次で査定する。
実施例７
末梢血中でのグリアジン−及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の比較
セリアック病におけるグリアジンに対する全Ｔ細胞応答に対しての、優勢なエピトープＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の相対的な寄与は重大な問題である。ペプシン−トリプシン及びキモトリプシンにより消化されたグリアジンが、セリアック病におけるＴ細胞系列及びクローンの分化のための抗原として伝統的に使用されてきた。しかしながら、これらのプロテアーゼは特定のペプチドエピトープを分断するかもしれないと言える。事実、組換えα９−グリアジンのキモトリプシン消化はペプチドＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（配列番号：１３）を生じるが、最適エピトープ配列ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：２）の末端削除体である（上を参照）。トランスグルタミナーゼ処理は、実質上、グリアジン特異的Ｔ細胞クローン及び系列の増殖アッセイにおいて、キモトリプシン消化されたグリアジンの能力を増加させる。よって、トランスグルタミナーゼ処理されたキモトリプシンで消化されたグリアジン（ｔＴＧグリアジン）は理想的な抗原ではないかもしれないが、この混合物に対する応答はグリアジンに特異的な末梢血リンパ球の「全」数に近似するかもしれない。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおけるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びｔＴＧグリアジンに対する応答の比較は、セリアック病におけるグリアジンに対する全免疫応答へのこの優勢なエピトープの寄与の指標を提供し、またエピトープ拡散の基準でもある。
【０１８２】
４人のセリアック病被験者においてグルテンチャレンジを開始して６日目又は７日目に回収されたＰＢＭＣを、キモトリプシン消化されたグリアジン＋／−ｔＴＧ処理を用いた用量応答研究において査定し、そして最適濃度のＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（２５ｍｃｇ／ｍｌ）に対するＥＬＩＳｐｏｔ応答と比較した。グリアジンのｔＴＧ処理はＥＬＩＳｐｏｔにおいて約１０倍ＰＢＭＣ応答を増強した（単独で査定した場合にｔＴＧはブランクと同等であった）（図１３ａ−ｃ参照）。研究した４人のセリアック病被験者において、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（２５ｍｃｇ／ｍｌ）はｔＴＧグリアジン（５００ｍｃｇ／ｍｌ）の１４から１１５％の間の応答を誘導し、そしてＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する応答が大きければ大きいほど、ｔＴＧグリアジン応答を表した比率が大きくなった。
【０１８３】
相対的に限られたデータから、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答が幾つかの被験者においてｔＴＧグリアジンと同等であることが示唆される。より進化した抗−グリアジンＴ細胞応答に関連したエピトープ拡散は、幾つかの個体において末梢血の「全」応答へのＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の僅かな寄与の説明となるかもしれない。エピトープ拡散はさほど厳しくないグルテンフリーダイエットを受けた個体において保持されるかもしれない。
実施例８
セリアック病において生物活性なグリアジンペプチドの定義：Ａ−グリアジン５７−７３の多型
Ａ−グリアジンの全配列にわたるオーバーラップする１５マーのペプチドを査定することにより、セリアック病の免疫上優勢な配列を同定した。Ａ−グリアジンは最初に全配列を決定されたアルファグリアジン蛋白質及び遺伝子であったが、コムギにおいて約３０−５０の関連するアルファグリアジン蛋白質のひとつである。蛋白質データベースＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ及びＴＲＥＭＢＬを検索することにより、２５の別々のアルファ−グリアジン遺伝子が同定され、さらに８つのアルファグリアジンを記述した。これら２５のアルファグリアジンに含まれたのは、Ａ−グリアジン５７−７３に相当する１６の異なる多型である（表７参照）。
【０１８４】
トランスグルタミナーゼによるインビトロにおける処理、並びに１０位において置換されたグルタミン酸による処理後、未修飾形態でのこれらの１６の多型に相当する合成ペプチドを、通常のグルテンフリーダイエット後の、インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおけるグルテンチャレンジの６日又は７日後に、セリアック病の被験者からのＰＢＭＣを用いて査定した。グルタミン酸置換したペプチドを３つの濃度において（２．５、２５及び２５０ｍｃｇ／ｍｌ）査定し、未修飾のペプチド及びトランスグルタミナーゼ処理されたペプチドを２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度のみにて査定した。生物活性は、個々の被験者においてＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５ ２５ｍｃｇ／ｍｌに付随した応答の％として表現した（ｎ＝４）（図１４参照）。
「野生型」ペプチドの生物活性はトランスグルタミナーゼ処理により実質増加した（＞５倍）。野生型ペプチドのトランスグルタミナーゼ処理は１０位においてグルタミン酸により置換された同じペプチドの生物活性と同ような生物活性をもたらした。５つのグルタミン酸置換ペプチド（Ｂ，Ｃ，Ｋ，Ｌ，Ｍ）の生物活性はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の＞７０％であったが、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５よりも顕著に高い生物活性のものはなかった。２．５及び２５０ｍｃｇ／ｍｌの濃度においてグルタミン酸置換されたペプチドに対するＰＢＭＣ応答は２５ｍｃｇ／ｍｌにおけるのと同等であった。６つのグルタミン酸置換グリアジンペプチド（Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｎ，Ｏ，Ｐ）は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の生物活性の＜１５％であった。他のペプチドは生物活性において中間であった。
【０１８５】
少なくとも６つのグリアジン由来のペプチドがトランスグルタミナーゼによる修飾語にＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する有効性が均等である。相対的に非生物活性のＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の多型も存在する。これらのデータは、トリチカムエステビウム、トリチカムウアルツ、トリチカムスペルタの幾つかのグリアジン由来のペプチドのトランスグルタミナーゼ修飾がセリアック病において免疫上優勢なＴ細胞エピトープを生成できるかもしれないことを示す。
【０１８６】
非−セリアック病−毒性コムギを生成するコムギの遺伝子修飾は、複数のグリアジン遺伝子の除去又は修飾を必要とするかもしれない。Ａ−グリアジン５７−７３の変更されたペプチドリガンドアンタゴニストを定義する配列を取り込んだグリアジン又は他の蛋白質又はペプチドを含むコムギの生産は、セリアック病において「非毒性」よりむしろ治療用である遺伝学上修飾されたコムギを生成するための別の戦略である。
実施例９
コアエピトープ配列の定義：
Ｎ−末端又はＣ−末端からのＡ−グリアジン５６−７５の末端削除に相当するペプチドの比較は、Ｔ細胞エピトープのコア配列がＰＥＬＰＹ（Ａ−グリアジン６４−６８）であることを示した。非アゴニスト及びアンタゴニストを定義する試みは、その生物活性に実質貢献する残基において置換されたＡ−グリアジンのバリアントに焦点を注ぐことになる。
【０１８７】
残基５７から７３を置換したアラニン（図１５）又はリジン（図１６）を有するＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に相当するペプチドを、３日間のグルテンチャレンジ開始から６日後にセリアック病のボランティアからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにおいて比較した（ｎ＝８）。（ＢＬはブランク、ＥはＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：２））。
【０１８８】
Ａ−グリアジン６０−７０ ＱＥ６５（ＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱ（配列番号：１４）に相当する残基はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のにおいて生物活性に実質貢献することを見いだした。６０−７０位において置換されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のバリアントは２段階の手法により査定する。最初に、対照的な特性を有する、１０の異なるアミノ酸を用いて６０−７０位において置換されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５を査定した。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のバリアントの第２群（全ての他の天然に生じるアミノ酸により置換されているが、修飾に敏感であると証明された位置のシステインを除く）を第２ラウンドにおいて査定した。
実施例１０
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の置換されたバリアントのアゴニスト活性
Ａ−グリアジン６０−７０ ＱＥ６５は、Ａ−グリアジンにおいて優勢なＴ細胞エピトープのコア配列である。このエピトープのアンタゴニスト及び非アゴニストペプチドバリアントは、このコア配列の修飾により生成されるらしい。最初に、対照的な特性を有する、１０の異なるアミノ酸を用いて６０−７０位において置換されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５を、３日間のグルテンチャレンジ開始から６日後にセリアック病の被験者からのＰＢＭＣを用いたＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにおいて査定する。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のバリアントの第２群（システイン以外、全ての他の天然に生じるアミノ酸により置換されている）も第２ラウンドにおいて査定した。両群のペプチド（全て５０ｍｃｇ／ｍｌにおいて、二重）を８人の被験者からのＰＢＭＣを用いて査定して、未修飾のペプチドと比較した（アッセイあたり２０反復）。様々な研究が、このアッセイにおけるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の最適な濃度が１０から１００ｍｃｇ／ｍｌの間であることを示す。
【０１８９】
結果を、スポット形成細胞（９５％コンフルエントの間隔）の平均応答として、個々の個体の％Ａ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５平均応答として表現する。対になっていないｔ−試験を使用することにより、修飾されたペプチドのＥＬＩＳＰＯＴ応答をＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５と比較する。スーパー−アゴニストを、ｐ＜０．０１の有意性のレベルにおいてＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５よりも高い応答を有するものとして定義し；部分アゴニストはｐ＜０．０１の有意性のレベルにおいてＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５よりも低い応答を有するものとして定義し、そして非アゴニストはブランク（ペプチド無しのバッファー）と顕著に異ならないものと定義した。Ａ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５のアゴニスト活性の３０％又はそれ未満のアゴニスト活性を有するペプチドは、アンタゴニスト活性を評価するための「適切な」部分アンタゴニスト又は非アンタゴニストと考えた（表８及び図１７−２７参照）。
【０１９０】
ＰＢＭＣのＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴ応答は分子レベルにおいて特異性が高い。６４位のプロリン（Ｐ６４）、６５位のグルタミン酸（Ｅ６５）及び６６位のロイシン（Ｌ６６）、及び程度は劣るがＱ６３，Ｐ６７，Ｙ６８及びＰ６９が修飾に対して特に感受性である。Ｙ６１及びＹ７０の置換は共に親ペプチドより３０％高い生物活性のスーパー−アゴニストを生じ、おそらくは、ＨＬＡ−ＤＱ２への結合を増強するためであるが、何故ならば、このＨＬＡ分子のモチーフが１位及び９位の巨大な疎水性残基に関する選択性を示すからである。１８の非アゴニストペプチドを同定した。バリアントの生物活性（５０ｍｃｇ／ｍｌ）：Ｐ６５，Ｋ６４，Ｋ６５及びＹ６５（生物活性７−８％）はブランク（７％）と同等であった。全部で、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の５７の変異バリアントがＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の３０％又はそれ未満の生物活性であった。
【０１９１】
優勢なエピトープ、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）Ｔ細胞応答の分子特異性は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者の間で一貫して再現性があり、そして上記７アミノ酸の中の限定された数のアミノ酸に特異性が高い。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の特定の単一アミノ酸バリアントは、全てのＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者において一貫して非アゴニストである。
実施例１１
置換されたバリアントのアンタゴニスト活性
ＨＬＡ−ＤＱ２＋被験者におけるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＰＢＬ Ｔ細胞応答の均質性は、ＰＢＬ Ｔ細胞応答がポリクローナル又はオリゴクローナルであるらしいとしても、ＰＢＭＣにおいてか又はエクスビボにおいて拮抗可能な変更されたペプチドリガンド（ＡＰＬ）が存在するかもしれないことを示唆する。ＡＰＬアンタゴニストは一般に弱いアゴニストである。３０％又はそれ未満のアゴニスト活性のＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の５７の単一アミノ酸置換バリアントが同定されて、ＡＰＬアンタゴニストとしての適切な候補である。さらに、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の特定の弱い生物活性の天然に生じる多型も同定されて（以下参照）、「天然に生じる」ＡＰＬアンタゴニストかもしれない。また、ＭＨＣへの結合が抗原特異的Ｔ細胞免疫とも拮抗するかもしれないことが示唆された。よって、グルテンチャレンジ後にセリアックＰＢＭＣにおいてＩＦＮガンマ応答を誘導しないがＨＬＡ−ＤＱ２に結合することが知られている非グリアジンペプチドは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５により誘導されるＴ細胞応答を低下させることができるかもしれない。ＨＬＡ−ＤＱ２へ貪欲に結合する２つのペプチドはＨＬＡクラス１α４６−６０（ＨＬＡ １ａ）（ＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷ（配列番号：１５））及びチロイドペルオキシダーゼ（ｔｐ）６３２−６４５Ｙ（ＩＤＶＷＬＧＧＬＬＡＥＮＦＬＰＹ（配列番号：１６））である。
【０１９２】
３日間のグルテンチャレンジを開始後のセリアックボランティア６人からのＰＢＭＣを用いたＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにおけるペプチド（５０μｇ／ｍｌ）又はバッファー及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（１０μｇ／ｍｌ）の同時添加（ｎ＝５）。結果は、ペプチドプラスＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５による応答として（二重の平均）、バッファープラスＡ−Ｇ ５７−７３ ＱＥ６５による応答（２０反復の平均）の％応答として表した（表９参照）。
【０１９３】
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の４つの単一アミノ酸置換バリアントは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するインターフェロンガンマＰＢＭＣ ＥＬＩＳＰＯＴ応答（ｐ＜０．０１）を２５％から２８％低下させ、別の１３のペプチドバリアントはＥＬＩＳＰＯＴ応答を１８％から２４％低下させた（ｐ＜０．０６）。ＨＬＡ−ＤＱ２バインダー、チロイドペプチド（ｔｐ）６３２−６４５Ｙは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＰＢＭＣインターフェロンガンマ応答を３１％低下させる（ｐ＜０．０００１）が、他のＨＬＡ−ＤＱ２バインダー、ＨＬＡクラス１ａ４６−６０は応答を変化させない（表９及び１０参照）。Ａ−グリアジン５７−７３のトランスグルタミナーゼ修飾された多型に相当するペプチド、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受け入れ番号Ｐ０４７２５ ８２−９８ ＱＥ９０（ＰＱＰＱＰＦＰＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（配列番号：１７））は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する応答を１９％低下させる（ｐ＜０．００９）（表１１参照）。
【０１９４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてのＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＰＢＭＣのインターフェロンガンマ応答は、特定の単一アミノ酸Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアント、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の多型、及び５倍過剰にＨＬＡ−ＤＱ２を結合することが公知の非関連ペプチドの同時投与により低下する。これらの発見は、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の変更されたペプチドリガンドアンタゴニストが存在することを示唆する。仮想上のＡＰＬのみならず、ＨＬＡ−ＤＱ２を結合する特定のペプチドも、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対するＰＢＬ Ｔ細胞応答を有効に低下させる。
【０１９５】
これらの発見は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病において優勢なＡ−グリアジンエピトープに対するＴ細胞応答を破壊する２つの戦略を支持する。
【０１９６】
１．「伝統的な」ペプチド薬剤としての使用のため又はコムギにおけるグリアジン遺伝子の特異的遺伝的修飾のための、一つの位置より多い位置において（６４−６７）アミノ酸を置換することによる、ＡＰＬアンタゴニストの最適化。
【０１９７】
２．ＨＬＡ−ＤＱ２に付随してＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の提示を競合阻害するための、高親和性ＨＬＡ−ＤＱ２結合ペプチドの使用。
【０１９８】
これらの２つのアプローチは相互に両立可能かもしれない。Ｆ６１及びＱ７０をチロシン残基で置き換えることにより、スーパー−アゴニストを生成した。これらのスーパー−アゴニストはＴ細胞受容体との増強された接触よりむしろＨＬＡ−ＤＱ２への結合の改善によりもたらされたらしい。これらの修飾を適度に有効なＡＰＬアンタゴニストを生成する他の置換と組み合わせることにより、置換されたＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５バリアントの阻害効果を実質上増強するかもしれない。
実施例１２
ＰＢＭＣ及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＰ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２をセリアック病の診断法として使用したインターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔの開発：新たに診断されたセリアック病における免疫応答の定義
インターフェロン番号ＥＬＩＳｐｏｔにおいて測定されたＰＢＭＣ中の優勢なＡ−グリアジンＴ細胞エピトープに対する応答性の誘導を、長期間の厳格なグルテンフリーダイエット（ＧＦＤ）を受けたほとんど全てのＤＱ２＋セリアック病被験者においてはグルテンチャレンジに続いて行ったが、厳格なＧＦＤを受けて４週間後の健康なＤＱ２＋被験者においては続いて行わなかった。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答はグルテンチャレンジ前のセリアック病被験者のＰＢＭＣにおいて測定不可能であり、そしてパイロットデータはこれらの応答が未処理の被験者のＰＢＭＣにおいて測定できなかったことを示唆した。これらのデータは、セリアック病において、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する免疫応答性が抗原排除（ＧＦＤ）後に復元することを示唆する。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及びＰＢＭＣを用いて診断試験が開発されるとしたら、グルテンチャレンジが
血液中のＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及び他の免疫反応性グリアジンペプチドに対する応答を誘導できる前に必要とされるＧＦＤの期間を定義することが望まれる。
【０１９９】
新たに診断されたＤＱ２＋セリアック病被験者を、胃腸学の外来患者サービスから補充した。ＰＢＭＣを調製して、被験者がＧＦＤを始める前及びＧＦＤを初めて１週間又は２週間後に、インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて試験した。さらに、グルテンチャレンジ（３日間は４スライスの標準の白パンを摂取、２００ｇ／日）を、ＧＦＤ開始の１又２週間後に実施した。ＰＢＭＣを調製し、そしてグルテンチャレンジを開始して６日後にアッセイした。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（Ａ），Ｐ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２（Ｂ）（単独及び化合して）及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＰ６５（Ｐ６５）（非生物活性バリアント、上記参照）（全て２５ｍｃｇ／ｍｌ）を査定した。
【０２００】
１人の患者を除いて皆、新たに診断されたセリアック病患者はＤＱ２＋であった（一人はＤＱ８＋であった）（ｎ＝１１）。未処置か又はＧＦＤの１又は２週間後の新たに診断されたセリアック病患者からのＰＢＭＣは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＰ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２（単独及び化合して）に対する応答を示さずブランク又は及びＡ−グリアジン５７−７３ ＱＰ６５と顕著な差異はなかった（ｎ＝９）（図２８参照）。たった１週間しかＧＦＤを受けなかったセリアック病患者におけるグルテンチャレンジは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＰ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２（単独及び化合して）に対する応答を実質上増強しなかった。しかし、ＧＦＤを開始して２週間後のグルテンチャレンジは、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５及びＰ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２（単独及び化合して）に対する応答を誘導し、非生物活性バリアントＡ−グリアジン５７−７３ ＱＰ６５及びブランクより顕著に高かった。グルテンチャレンジ２週間後のこれらの応答は価値のあることであるが、ＧＦＤ開始後＞２カ月の被験者よりは低いらしい。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５単独に対する応答は、Ｐ０４７２４ ８４−１００ ＱＥ９２単独に対する応答又はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５と混合した場合の応答と等しいか又はより大きかった。被験者のだれもがグルテンチャレンジの苦痛の兆候を経験しなかった。
【０２０１】
Ａ−グリアジンに対する免疫応答性（グルテンチャレンジ後にＰＢＭＣ中で測定）はＧＦＤを開始して２週間後に部分的に回復したことから、この優勢なＴ細胞エピトープに対する「免疫非応答性」は、未処置のセリアック病患者において且つＧＦＤ開始後の少なくとも１週間は優勢であることを示唆する。グルテンチャレンジ及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおけるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に対する応答の測定を用いたセリアック病の診断試験のタイミングは、ＧＦＤを開始して少なくとも２週間後である。
【０２０２】
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に特異的なインターフェロンガンマ分泌Ｔ細胞は未処置のセリアック病患者においては末梢血中にて測定できず、ＧＦＤの少なくとも２週間後のグルテンチャレンジにより誘導することができる（抗原排除）。よって、この方法論を用いた診断試験のタイミングは非常に重大であり、そしてその最適化にはさらなる研究が必要である。これらの発見は、抗原排除により逆転した優勢なエピトープ、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に特異的なＴ細胞の機能アネルギーと一致する。この現象は、ヒト疾患において以前には証明されておらず、Ｔ細胞アネルギーがセリアック病においてはペプチド治療により誘導可能かもしれないという可能性を支持する。
実施例１３
コムギグリアジンＴ細胞エピトープの包括的マッピング
抗原チャレンジは末梢血中で抗原特異的Ｔ細胞を誘導する。セリアック病においては、グルテンがこの免疫媒介性疾患を維持する抗原である。グルテンフリーダイエットで処置されたセリアック病のグルテンチャレンジは末梢血中のグルテン特異的Ｔ細胞の出現を導き、グルテンＴ細胞エピトープの分子特異性の決定を可能にさせる。上記のとおり、我々はモデルグルテン蛋白質中の単一の優勢なエピトープ、Ａ−グリアジン（Ｑ６５において脱アミド化された５７−７３）を同定した。この実施例においては、セリアック病患者のグルテンチャレンジを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ中の１１１エントリーに由来する各公知のコムギグリアジン蛋白質中の全ての有力な１２のアミノ酸配列を試験した。全部で、６５２の２０マーペプチドをＨＬＡ−ＤＱ２及びＨＬＡ−ＤＱ８関連のセリアック病において試験した。セリアック病において９０％を超えて存在する古典的なＨＬＡ−ＤＱ２複合体（ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０５，ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２）のセリアック病被験者９人のうちの７人は、末梢血中に誘導可能なＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５−及びグリアジン−特異的Ｔ細胞応答を有した。Ａ−グリアジン５７−７３は、ＨＬＡ−ＤＱ２関連セリアック病において、唯一の重要なα−グルテンＴ細胞エピトープであり、並びにもっとも有力なグリアジンＴ細胞エピトープであった。さらに、インターフェロン−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＡ−グリアジン５７−７３ほど有効性のある１０％から７０％の構造上関連したペプチドの５ファミリーほど存在した。これらの新規なＴ細胞エピトープは、γ−及びω−グリアジンに由来しており、そしてＡ−グリアジン５７−７３のコア配列（コア配列：ＦＰＱＰＱＬＰＹＰ（配列番号：１８））、例えばＦＰＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：１９）及びＰＱＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：２０）と構造上極めて類似しているが同一ではない共通配列を含んだ。Ａ−グリアジン５７−７３の相同体はライムギ又はオオムギにおいて見いだされなかったが、他の２つの穀類はセリアック病において毒性であり、γ−及びω−グリアジン中の新たに定義されたＴ細胞エピトープはライムギ及びオオムギの保存蛋白質において完全に適合した（それぞれ、セカリン（ｓｅｃａｌｉｎｓ）及びホルデイン（ｈｏｒｄｅｉｎｓ））。
【０２０３】
ＨＬＡ−ＤＱ２に関連しないセリアック病はほとんど常にＨＬＡ−ＤＱ８と関連していた。７人のＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病被験者のだれもが、彼らが完全なＨＬＡ−ＤＱ２複合体も所有していないなら、誘導可能なＡ−グリアジン５７−７３−特異的Ｔ細胞応答をグルテンチャレンジ後に有さなかった。完全なＨＬＡ−ＤＱ２複合体を有さない４人のＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病被験者のうちの２人は、誘導可能なグリアジンペプチド特異的Ｔ細胞応答をグルテンチャレンジ後に有した。一人のＨＬＡ−ＤＱ８被験者においては、新規な優勢Ｔ細胞エピトープが、コア配列ＬＱＰＱＮＰＳＱＱＱＰＱ（配列番号：２１）を用いて同定された。このペプチドのトランスグルタミナーゼによる脱アミド化バージョンは非脱アミド化ペプチドよりも有効性であった。以前の研究は、トランスグルタミナーゼにより脱アミド化したペプチドが配列ＬＱＰＥＮＰＳＱＥＱＰＥ（配列番号：２２）を有するはずであることを示唆したが；この配列を確認するためには、さらなる研究が必要である。１カ月の間グルテンフリーダイエットを受けた健康なＨＬＡ−ＤＱ２（１０）及びＨＬＡ−ＤＱ８（１）の被験者の間で、グリアジンペプチド特異的Ｔ細胞応答は不変であり、グルテンチャレンジによりほとんど変わらず、そして、セリアック病の被験者においてグルテンチャレンジにより明らかにされた有効性Ｔ細胞エピトープでは決してなかった。結論として、ＨＬＡ−ＤＱ２関連セリアック病において６より多い重要なＴ細胞エピトープが存在するらしく、そのうち、Ａ−グリアジン５７−７３がもっと有効性である。ＨＬＡ−ＤＱ２−及びＨＬＡ−ＤＱ８−関連セリアック病は同じＴ細胞特異性を共有しない。
【０２０４】
我々は、グルテンフリーダイエット後のセリアック病の個体の短期間のグルテンチャレンジが末梢血中にてグリアジン特異的Ｔ細胞を誘導することを示した。これらのＴ細胞の頻度は末梢血中で６日目に最大であり、続いて、次の週を通して迅速に弱まる。末梢血のグリアジン特異的Ｔ細胞は消化管の粘膜固有層へのホーミングに関連するインテグリンα４７を発現する。我々は、原型的なグルテンα−グリアジン蛋白質、Ａ−グリアジンにおいてセリアック病に関連したＴ細胞エピトープをマップするためにこのヒト抗原−チャレンジデザインを開発した。トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）による脱アミド化が有る場合も無い場合も１０アミノ酸がオーバーラップする１５マーのペプチドを用いて、我々は、末梢血中で誘導されたＴ細胞が、６５位のグルタミン酸が脱アミド化されたひとつのＡ−グリアジンペプチドの残基５７−７３を最初に標的化することを証明した。当該エピトープはＨＬＡ−ＤＱ２−制限されており、ＨＬＡ−ＤＱ２のセリアック病との密接な関連と一致する。
【０２０５】
コムギ、ライムギ、及びオオムギの暴露によりセリアック病は再活性化される。コムギのグルテンのα／β−グリアジン画分はセリアック病においては一致して毒性であり、そしてほとんどの研究はこれらの蛋白質に焦点を合わせてきた。α／β−グリアジンをコードする遺伝子クラスターはコムギ染色体の６Ｃ上に位置する。ライムギ又はオオムギにはα／β−グリアジンの相同物がない。しかしながら、コムギのグリアジンサブタイプの３つ全て（α／β、γ、及びω）がセリアック病において毒性である。γ−及びω−グリアジン遺伝子はコムギでは染色体１ＡＰＬ上に位置しており、ライムギ及びオオムギのセカリン及びホルデインに相同である。
【０２０６】
パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）においては６１のα−グリアジンに関して同定された遺伝子が今存在する。α−グルテン配列は密接に相同であるが、Ａ−グリアジンにおいて優勢なエピトープは、α−グリアジン配列においてほとんど多型性の領域に由来する。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）は、パンコムギ（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）中に全部で約１５０の異なるα−グリアジン遺伝子が存在するが、多くは偽遺伝子であると見積もった。よって、セリアック病に関連するＴ−細胞のエピトープが公知のα−グリアジン配列中に含まれないことは、ありそうもない。
【０２０７】
我々の研究は、セリアック病に特異的な有効性のＴ細胞エピトープとしてＡ−グリアジン５７−７３にほとんど同一の、脱アミド化されたα−グリアジンペプチドのグループを同定した。９０％を超えるセリアック病患者はＨＬＡ−ＤＱ２＋であり、これまで、我々はグルテンチャレンジ後のＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者のみを査定してきた。しかしながら、ＨＬＡ−ＤＱ２を発現しないセリアック病患者がほとんど皆ＨＬＡ−ＤＱ８を有する。よって、他のコムギ、ライムギ及びオオムギグルテン蛋白質中のＡ−グリアジン５７−７３及びその相同体が、ＨＬＡ−ＤＱ２＋及びＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病の両方においてグルテンチャレンジにより誘導されるＴ細胞により認識される唯一のＴ細胞エピトープであるか否かを知ることは非常に不可欠である。これが事実なら、セリアック病のための治療用のペプチドのデザインは、たった一つのペプチドのみしか必要としないかもしれない。
Ａ−グリアジン５７−７３のＴ細胞エピトープとしての相同体
Ａ−グリアジン５７−７３（ＰＱＬＰＹ＜配列番号：１２＞）のコア配列をコードする穀物遺伝子に関するＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＴｒｅｍｂｌ遺伝子データベースの最初の検索は、α／β−グリアジンを明らかにしただけであった。しかしながら、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５エピトープの我々の初期のマッピング研究は、コア領域（ＰＱＬＰ）中の許容可能な点の置換が限定された数であることを明らかにした（Ｑ６５はエピトープ中で実際に脱アミド化されている）。よって、我々は、配列ＸＸＸＸＸＸＸＰＱ［ＩＬＭＰ］［ＰＳＴ］ＸＸＸＸＸＸ（配列番号：２３）を有するペプチドをコードするＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＴｒｅｍｂｌデータベースの中の遺伝子に我々の検索を拡大した。相同体は、γ−グリアジン、グルテニン、ホルデイン及びセカリンの間に同定された（表１２参照）。さらなる相同体は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて３つのω−グリアジンエントリーの可視検索によりω−グリアジン中に同定された。
【０２０８】
Ａ−グリアジン５７−７３のこれらの相同体は、ｔＴＧによる脱アミド化（又は４つの密接な相同体中のグルタミン酸（ＱＥ）−置換されたバリアントの合成）の後に、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、末梢血単核細胞を用いて、セリアック病の被験者においてグルテンチャレンジ後に査定した。ω−グリアジン配列（ＡＡＧ１７７０２ １４１−１５７）は唯一の生物活性ペプチドであり、約半分がＡ−グリアジン５７−７３として有効である（表１２、及び図２９参照）。よって、優勢なＡ−グリアジンエピトープの相同体の検索は、γ−グリアジン、セカリン、及びホルデインの毒性に関して考慮することを怠った。
方法
全ての可能性のあるコムギグリアジンＴ−細胞エピトープにわたるペプチドのセットのデザイン
公知のパンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）のグリアジン遺伝子又は遺伝子断片によりコードされた全ての可能なＴ細胞エピトープを同定するため（ＧｅｎＢａｎｋ中の６１α／β−，４７γ−，及び３ω−グリアジンエントリー）、遺伝子由来の蛋白質配列を、ＣｕｓｔａｌＷソフトウエア（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）を用いてアラインメントを行い、そして分類することにより系統発生グループ化した（表２２参照）。多くのエントリーは、より長い配列の末端削除を表し、そして多くの遺伝子セグメントは、ポリグルタミン繰り返しの長さ又は稀な置換を除いて同一であった。よって、公知のコムギ遺伝子によりコードされる全ての有力な１２アミノ酸配列を有理化して（ｒａｔｉｏｎａｌｉｚｅ）６５２の２０マーペプチドのセットに含ませることができた。（シグナルペプチド配列は含まれなかった）。ペプチド配列を表２３に掲載する。
包括的エピトープマッピング
４週間グルテンフリーダイエットを受けた健康な対照（ＨＬＡ−ＤＱ２＋ ｎ＝１０，及びＨＬＡ−ＤＱ８＋ ｎ＝１）、及び長期間のグルテンフリーダイエットを受けたセリアック病の被験者（６人のＨＬＡ−ＤＱ２，４人の複合同型接合ＨＬＡ−ＤＱ２／８、及び３人のＨＬＡ−ＤＱ８／Ｘ）（表１３参照）を、グルテンチャレンジの前及び後の６及び７日目に調査した（標準の白パン５０ｇスライス４切れ−セインズベリーズサンドイッチパン、毎日）。末梢血（７日間にわたり全部で３００ｇ）を採血して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配により分離した。ＰＢＭＣを６又は８の２０マーペプチド、又はｔＴＧにより脱アミド化されたか又はされていない単一のペプチドのプールと、一晩、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてインキュベートした。
【０２０９】
ペプチドはＰｅｐｓｅｔｓ（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ Ｉｎｃ．，メルボルン、オーストラリア）において９６のバッチ中で合成した。約０．６マイクロモルの各６５１の２０マーを提供した。２つのマーカー２０マーペプチドを９６の各セットに含ませ（ＶＬＱＱＨＮＩＡＨＧＳＳＱＶＬＱＥＳＴＹ）−ペプチド１６１（配列番号：２４）、そしてＩＫＤＦＨＶＹＦＲＥＳＲＤＡＬＷＫＧＰＧ（配列番号：２５）を逆相−ＨＰＬＣ及びアミノ酸配列分析により特性決定した。これらのマーカーペプチドの平均純度はそれぞれ５０％及び１９％であった。ペプチドを最初にアセトニトリル（１０％）及びＨｅｐｅｓ １００ｍＭから１０ｍｇ／ｍｌに溶解した。
【０２１０】
ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイのためにＰＢＭＣとインキュベートされたプール（又は単独）中の個々のペプチドの最終濃度は２０μｇ／ｍｌであった。ペプチドの５倍濃縮した溶液及び１ｍＭの塩化カルシウムを含むＰＢＳ中のプールを分配して、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて後に使用されるテンプレートに従い９６ウエルプレート中に保存した。モルモット組織ｔＴＧ（Ｓｉｇｍａ Ｔ５３９８）との１００：３２の比における２時間３７℃のインキュベーションにより、脱アミド化されたペプチド及びペプチドのプールを調製した。ペプチド溶液を−２０℃において保存して、使用前に新たに解凍した。
【０２１１】
エンドトキシンフリーの水及び２Ｍ尿素中のグリアジン（Ｓｉｇｍａ Ｇ３３７５）（１００ｍｇ／ｍｌ）を１０分間ボイルし、室温に冷却し、そしてフィルター（０．２μｍ）−滅菌されたＨＣｌ ０．０２Ｍ中のペプシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ６８８７）（２ｍｇ／ｍｌ）又は重炭酸アンモニウム中のキモトリプシン（Ｃ３１４２）（４ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートした。４時間のインキュベーション後に、ペプシン消化されたグリアジンを水酸化ナトリウムにより中和し、そして次にペプシン−消化グリアジン及びキモトリプシン−消化グリアジンの両方を１５分間ボイルした。グリアジンを除いたプロテアーゼとの同一のインキュベーションも実施した。サンプルを１５ ０００ｇにおいて遠心分離し、次に、蛋白質濃度を上清中でＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により見積もった。ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおける最終的な使用の前に、グリアジン−プロテアーゼのアリコートをｔＴＧと共に比率２５００：６４μｇ／ｍｌにてインキュベートした。
【０２１２】
ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｍａｂｔｅｃｈ，スエーデン）を９６−ウエルプレート（ＭＡＩＰ Ｓ−４５，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で、各ウエルが２５μｌのペプチド溶液及び１００μｌのＰＢＭＣ（２−８１０５／ウエル）を、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ中に含むように、実施した。脱アミド化されたペプチドプールを一つの９６−ウエルＥＬＩＳｐｏｔプレート中で査定し、そして第２プレート上で脱アミド化なしのペプチドプール（同一のレイアウト）を０日目及び６日目に査定した。脱アミド化されたペプチドを含むプレート中の全てのウエルがｔＴＧを含んだ（６４μｇ／ｍｌ）。各ＥＬＩＳｐｏｔプレート中に、ペプチドプールを含む８３のウエルが存在し（各ウエル中唯一のプール）、そして「対照」ペプチドのウエルのシリーズ（ペプチドは全て＞９０％の純度、ＭＳ及びＨＰＬＣにより特性決定された、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）：Ｐ０４７２２ ７７−９３（ＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰ（配列番号：２６）、Ｐ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５（二重）（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰ（配列番号：２７）、Ｐ０２８６３ ７７−９３（ＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＳＱＰＱＰ（配列番号：２８）、Ｐ０２８６３ ７７−９３ ＱＥ８５（ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＳＱＰＱＰ（配列番号：２９）、及びキモトリプシン消化されたグリアジン（５００μｇ／ｍｌ）、ペプシン消化されたグリアジン（５００μｇ／ｍｌ）、キモトリプシン（２０μｇ／ｍｌ）単独、ペプシン（１０μｇ／ｍｌ）単独、及びブランク（ＰＢＳ＋／−ｔＴＧ）（二重）。
【０２１３】
展開及び乾燥後に、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔプレートをＭＡＩＰ自動化スポット形成ＥＬＩＳｐｏｔカウンターを用いて査定した。ＨＬＡ−ＤＱ２の健康被験者及びセリアック病被験者において、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてペプチドプールによりスポット形成細胞（ｓｆｃ）の誘導を、１００万ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞（ｓｆｃ）マイナスブランクに適用した、一方をつないだ（ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ）Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｍａｔｃｈｅｄ−Ｐａｉｒｓ Ｓｉｇｎｅｄ−Ｒａｎｋｓ試験（ＳＰＳＳソフトウエア）を用いて、６日目体０日目（「正味の応答」）にて試験した。インビボグルテンチャレンジによるＰＢＭＣ中のペプチドプールに対するＩＦＮγ応答の顕著な誘導を、少なくとも１０ｓｆｃ／１００万ＰＢＭＣ及び有意性レベルｐ＜０．０５の中央値の「正味の応答」として定義した。６日目のペプチドの特定のプールに対する顕著な応答に、同日又は７日目に採られたＰＢＭＣを使用して各プール内において個々のペプチドの評価を続けた。
【０２１４】
個々のペプチドのＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイに関して、生物活性を同じＥＬＩＳｐｏｔプレート中で査定されたＰ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５に対する応答のパーセントとして表現した。３６万（範囲：０．３−０．７２）、ＰＢＭＣの中央値を用いて、ブランクに対する中央値の応答（ＰＢＳ単独）はウエルあたり０．２ｓｆｃ（範囲０−５）であり、そしてウエルあたり陽性対照（Ｐ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５）７６．５（範囲２５−３８３）ｓｆｃであった。よって、Ｐ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ６５のパーセンテージとして表現されたブランクに対する中央値の応答は０．２％（範囲：０−６．７）であった。Ｐ０４７２２ ＱＥ８５のそれより１０％高い平均生物活性を有する個々のペプチドを共通の構造上のモチーフに関して分析した。
結果
健康なＨＬＡ−ＤＱ２被験者
１カ月グルテンフリーダイエットを受けた健康なＨＬＡ−ＤＱ２＋被験者の誰も、グルテンチャレンジの前又は後にＡ−グリアジン５７−７３の相同体に対してＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を有さなかった。しかしながら、１０人の健康な被験者のうち９人において、グルテンチャレンジが、グリアジンのペプシン消化及びキモトリプシン消化の両方に対するＩＦＮγ応答の顕著な増加を伴い、０日目の０−４ｓｆｃの中央値／百万から１６−２９ｓｆｃの中央値／百万であった（表１４参照）。健康な被験者のグリアジン応答は脱アミド化により影響されなかった（表１５参照）。健康な被験者のうち、特定のグリアジンペプチドプールに対するＩＦＮγ応答の、グルテンチャレンジとの一致した誘導はなかった（図３０、及び表１６参照）。ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答は場合によりみられたが、弱く、そして脱アミド化により影響されなかった。プールに対するもっとも強い応答の多くも０日目には存在しなかった（表１７、被験者Ｈ２，Ｈ８及びＨ９参照）。４人の健康な被験者はプール５０に対して明確な応答を示し、６日目にもっとも強い応答をもった２人は０日目にも応答を有した。両被験者において、プール５０に対するチャレンジ後の応答はペプチド３９０（ＱＱＴＹＰＱＲＰＱＱＰＦＰＱＴＱＱＰＱＱ（配列番号：３０））によった。
ＨＬＡ−ＤＱ２セリアック病被験者
ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者におけるグルテンチャレンジの後、Ｐ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５に対する中央値のＩＦＮγＥＬＩＳＰｐｏｔ応答は０から１３３ｓｆｃ／百万の中央値から上がった（表４参照）。６人のセリアック病被験者のうちの一人（Ｃ０６）はＰ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５（２ｓｆｃ／百万）に応答せず、そしてグリアジンペプチドプールに弱く応答しただけであった（最大：プール５０＋ｔＴＧ ２７ｓｆｃ／百万）。前の研究に一致して、野生型Ｐ０４７２２の生物活性はｔＴＧによる脱アミド化により６．５倍上昇した（表１５参照）。グリアジン消化に対するインターフェロンガンマ応答はベースラインに存在したが、キモトリプシン−グリアジンに関しては２０から９２ｓｆｃの中央値／百万まで、そしてペプシン−グリアジンに関しては４４から１７６ｓｆｃの中央値／百万まで、グルテンチャレンジにより実質上は増加した。グリアジンの脱アミド化は、キモトリプシン−グリアジンに関して３．２倍の中央値、そしてペプシン−グリアジンに関して１．９倍の中央値だけ生物活性を増加させた（表１５参照）。（ペプシンによる消化に要求される酸性度はグリアジンの部分脱アミド化をもたらすらしい。）
健康な被験者とは対照的に、グルテンチャレンジは、α−，γ−、及びω−グリアジンを含む８３の処理されたプールのうちの２２に対してＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を誘導した（図３１及び表１７参照）。プールの生物活性は被験者間で一致していた（表１８参照）。ペプチドプールにより誘導されたＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答は脱アミド化によりほとんどいつも増加した（表１７参照）。だが、脱アミド化によるプールの生物活性の増強は、Ａ−グリアジン５７−７３の相同体を含むプールに関してさえ、Ｐ０４７２２ ７７−７３ ＱＥ８５ほど顕著ではなかった。これは、Ｐｅｐｓｅｔペプチドが合成又は調製の間に部分的に脱アミド化されていたことを示唆し、例えばＰｅｐｓｅｔペプチドはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の塩としてＴＦＡ溶液からの凍結乾燥後にデリバリーされる。
【０２１５】
２１のもっとも生物活性なプールからの１７０の個々のｔＴＧ脱アミド化ペプチドを別々に査定した。７２の脱アミド化ペプチドは均等な濃度においてＰ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５より１０％生物活性が高かった（２０μｇ／ｍｌ）（表１９参照）。５つのもっとも有効なペプチド（Ｐ０４７２２ ＱＥ８５の８５−９４％の生物活性）は、以前にα−グリアジン相同Ａ−グリアジン５７−７３として同定された。５０の生物活性ペプチドはＡ−グリアジン５７−７３と相同でなかったが、構造上関連する配列の６ファミリーに分類できた（表２０参照）。各々のペプチドファミリーのもっとも生物活性な配列は：ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ（配列番号：３１）（ペプチド６２６、Ｐ０４７２２ ＱＥ８５の中央値７２％生物活性）、ＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＯＬＰＦＰＱＱ（配列番号：３２）（３４３、３４％）、ＱＡＦＰＱＰＱＱＴＦＰＨＱＰＱＱＱＦＰＱ（配列番号：３３）（３５５、２７％）、ＴＱＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＴＱ（配列番号：３４）（３９６、２３％）、ＰＩＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：３５）（６２５、２２％）、ＰＱＱＳＦＳＹＱＱＱＰＦＰＱＱＰＹＰＱＱ（配列番号：３６）（６１８、１８％）（コア配列に下線を引く）であった。これらの配列の全ては、トランスグルタミナーゼによる脱アミド化に感受性であると予測されたグルタミン残基を含む（例えば、ＱＸＰ，ＱＸＰＦ（配列番号：３７），ＱＸＸ［ＦＹ］（配列番号：３８））（Ｖａｄｅｒ ｅｔ ａｌ ２００２参照）。幾つかの生物活性ペプチドは異なるファミリーからの２つのコア配列を含む。
【０２１６】
異なるＴ細胞集団が別のコア配列を有するエピトープに応答するという可能性と一致して、異なるファミリーからのペプチドの生物活性は付加的らしい。例えば、ｔＴＧ処理されたプール８１の中央値生物活性はＰ０４７２２ ＱＥ８５の１４１％であったが、個々のペプチドの生物活性は：ペプチド６３１（Ａ−グリアジン５７−７３の相同体）６１％、６３６（６２６の相同体）５１％、そして６３５ １９％、６２９ １６％、そして６３４ １３％（全て３９６の相同体）の順位の序列であった。
【０２１７】
単純化しすぎたかもしれないが、グリアジンペプチドに対する合計のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答に対する各「ペプチドファミリー」の貢献をＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病被験者において比較した（図３２参照）。従って、グリアジンペプチドに対する合計の応答に対するＰ０４７２２ ７７−７３ Ｅ８５の貢献は、１／５と２／３の間であった。
【０２１８】
インターネットのワールドワイドウエブ、例えば「ｃｂｒｇ．ｉｎｆ．ｅｔｈｚ．ｃｈ／ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ３＿１＿５．ｈｔｍｌ」を通してアクセス可能な、ペプチド相同性検索プログラム、ＷＷＷ ＰｅｐＰｅｐＳｅａｒｃｈを用いて、及びライムギのセカリンのＧｅｎＢａｎｋ配列との直接の比較により、厳密な適合が、オオムギのホルデイン（ＨＯＲ８）及びライムギセカリン（Ａ２３２７７，ＣＡＡ２６４９９，ＡＡＧ３５５９８）中にコア配列：ＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：３９）及びオオムギホルデイン（ＨＯＧ１及びＨＯＲ８）中にコア配列：ＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＦＰ（配列番号：４０）に関して厳密な適合が発見され、そしてＰＩＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰ（配列番号：４１）に関して、オオムギホルデイン（ＨＯＲ８）中に発見された。
ＨＬＡ−ＤＱ８関連セリアック病
７人のＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病被験者をグルテンチャレンジの前と後に研究した。これらのＨＬＡ−ＤＱ８＋（ＨＬＡ−ＤＱＡ０＊０３０１−３，ＨＬＡ−ＤＱＢ０＊０３０２）被験者のうちの５人も、セリアック病関連ＨＬＡ−ＤＱ２複合体（ＤＱＡ０＊０５，ＤＱＢ０＊０２）の一方又は両方を有した。両方のセリアック病関連ＨＬＡ−ＤＱ複合体を有する３人の被験者のうちの２人は、質的及び量的にＨＬＡ−ＤＱ２セリアック病被験者と同一であったグリアジンペプチドプール（及びＰ０４７２２ ７７−９３ ＱＥ８５を含む個々のペプチド）に対して有効な応答性を有した（図３３及び３４、及び表１８を参照）。脱アミド化されたペプチドプール７４は両ＨＬＡ−ＤＱ２／８被験者において生物活性であったが、６人のＨＬＡ−ＤＱ２／Ｘ被験者の一人においてのみであった。プール７４のｔＴＧによる前処理は生物活性を３．８倍から２２倍増強し、そして３人の応答者におけるｔＴＧ処理されたプール７４の生物活性は、Ｐ０４７２２ ７７−９３ Ｅ８５の生物活性の７８％及び３５０％の間に等しい。現在、何れのペプチドが被験者Ｃ０２，Ｃ０７及びＣ０８においてプール７４において生物活性であるかわかっていない。
【０２１９】
セリアック病に関連したＨＬＡ−ＤＱ２対立遺伝子の両方又は一方を欠く４人のＨＬＡ−ＤＱ８セリアック病被験者のうちの２人はグリアジンペプチドプールに対して極めて弱いＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答しか示さなかったが、残りの２人はプロテアーゼ−消化されたグリアジン及び特異的ペプチドプールの両方に応答した。被験者Ｃ１２（ＨＬＡ−ＤＱ７／８）は、脱アミド化されたプール１−３に対して激しく応答した（図３５参照）。これらのプールにおける個々のペプチドの評価は、コア配列ＬＱＰＱＮＰＳＱＱＱＰＱ（配列番号：４２）を含む一連の密接に関連した生物活性ペプチドを同定した（表２０参照）。以前の研究（我々による）は、この配列中の３つのグルタミン残基がｔＴＧ媒介脱アミド化に感受性であることを証明した（下線）。ＷＷＷ ＰｅｐＰｅｐＳｅａｒｃｈを用いた相同性検索は、コムギα−グリアジンにおいてのみＬＱＰＱＮＰＳＱＱＱＰＱ（配列番号：４３）に対して密接な適合を同定した。
【０２２０】
４人のＨＬＡ−ＤＱ８被験者（Ｃ１１）は、ｔＴＧ処理されたプール３３に対して誘導可能なＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を有した（図３６参照）。プール３２及び３３はｔＴＧによる脱アミド化後に活性な以前に定義されたＨＬＡ−ＤＱ８制限されたグリアジンエピトープ（ＱＱＹＰＳＧＱＧＳＦＱＰＳＱＱＮＰＱ（配列番号：４４））の多型を含む（下線を引かれたＧｌｎは脱アミド化されて生物活性を運ぶ）（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌ ｅｔ ａｌ １９９８）。現在、何れのペプチドがプール３３において被験者Ｃ１１において生物活性であるか分かっていない。
【０２２１】
インビボグルテンチャレンジ及びコムギグリアジン中の全ての公知の１２アミノ酸配列にわたる６５２ペプチドのセットを使用した、ＨＬＡ−ＤＱ２関連セリアック病における包括的Ｔ細胞エピトープマッピングは、即ち、公知のα−グリアジンエピトープ、Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５の１０％の生物活性の少なくとも７２のペプチドを同定した。しかしながら、これらの生物活性ペプチドはほんの５つほどの異なるが密接に関連したペプチドファミリーのセットに減らされ得る。ほとんど全てのこれらペプチドは、プロリン、グルタミン、フェニルアラニン、及び／又はチロシンが豊富であり、そして配列ＰＱ（ＱＬ）Ｐ（ＦＹ）Ｐ（配列番号：４５）を含む。この配列はｔＴＧによる２位のＱの脱アミド化を促進させる。Ａ−グリアジン５７−６８の脱アミド化による類推により（Ａｒｅｎｔｚ−Ｈａｎｓｅｎ ２０００）、ｔＴＧによる脱アミド化により広く見いだされたこれらのペプチドの増強された生物活性は、ＨＬＡ−ＤＱ２に関する結合の親和性の増加よるかもしれない。
【０２２２】
これらの生物活性グリアジンペプチドの一つより多くをインビボにおいて認識するＴ細胞の間の交差反応性は起こり得る。しかしながら、関連するペプチドの各セットが別のＴ細胞集団をインビボにおいて活性化するなら、Ａ−グリアジン５７−７３ Ｅ６５に相当するエピトープはもっとも有効であり、そしてグルテンチャレンジの後のグリアジンに対する応答においてＩＦＮγを分泌する末梢血Ｔ細胞の少なくとも４０％により広く認識される。
【０２２３】
非グリアジン−ペプチド特異的応答が、ＨＬＡ−ＤＱ２／Ｘ関連のセリアック病におけるものと質的に異なったＨＬＡ−ＤＱ２／８セリアック病において見いだされた。しかしながら、ＨＬＡ−ＤＱ２対立遺伝子の両方を持たないＨＬＡ−ＤＱ８＋のセリアック病被験者の末梢血Ｔ細胞は、Ａ−グリアジン５７−７３ Ｅ６５相同体を認識しなかった。２つの異なるエピトープが２つのＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病において優勢であった。れらのＨＬＡ−ＤＱ８＋の個体における優勢なエピトープは以前に同定されていなかった（ＬＱＰＱＮＰＳＱＱＱＰＱ（配列番号：４６））。
【０２２４】
本明細書中の教示を仮定すれば、共通に認識されるＴ細胞エピトープの全てを利用してセリアック病のための免疫治療のデザインが実用的になり、６より少ない異なるペプチドを含むかもしれない。コムギのγ−及びω−グリアジン中のエピトープは、オオムギホルデイン及びライムギセカリン中にも存在する。
実施例１４
幾つかのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを前記のとおりに実施して、以下の結果及び／又は結論を生じた：
ＰＱＬＰＹによる複数のα−グリアジン多型の拡大
Ａ−グリアジン５７−７３ＱＥの有効なアゴニスト（Ｇ０１）は、ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（Ｇ０１），ＰＱＬ−Ｙ−−−−−−−−−−−−−−Ｐ（Ｇ１０），及びＰＱＰＱＰＦＬ−−−−−−−−−−−−−（Ｇ１２）を含む。有効性が劣るのは、−−−−−−−−−−−−Ｌ−−−−−−−−Ｐ（Ｇ０４），−−−−−−−−−−−−−Ｒ−−−−−−−−−−−Ｐ（Ｇ０５），及び−−−−−−−−−−−−Ｓ−−−−−Ｐ（Ｇ０６）を含む。有効性がさらに劣るのは、−−−−−−Ｌ−−−−−−−−Ｓ−−−−−Ｐ（Ｇ０７），−−−−−Ｓ−−−−−−−−−−Ｓ−−−−−−−−−Ｐ（Ｇ０８）−−−−−−−−−−−−−−−Ｓ−−Ｓ−−−−−Ｐ（Ｇ０９），及びＰＱＰＱＰＦＰ−−−−−−−−−−−−−−−−−（Ｇ１３）を含む。ダッシュは特定の位置におけるＧ０１配列との同一性を示す。
グルテンチャレンジは新たに診断されたセリアック病においてたった２週間のグルテンフリーダイエット後にＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５ Ｔ細胞を含む
追加の分析は、ｔＴＧ脱アミド化されたグリアジン応答が新たに診断されたセリアック病において２週間後に変化することを示した。他の分析は、脱アミド化されたグリアジン特異的Ｔ細胞がＣＤ４＋α４β７＋ＨＬＡ−ＤＱ２制限されることを示した。
最適なエピトープ（クローン対グルテンチャレンジ）
「優勢な」エピトープがγＩＦＮ ＥＬＩＳｐｏｔによりグルテンチャレンジ後に定義される。ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ（１００％ＥＬＩＳｐｏｔ応答）。腸のＴ細胞クローンにより定義されたエピトープ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（２７％），ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹ（５２％），及びＯＯＬＰＱＰＥＱＰＱＱＳＦＰＥＱＥＲＰＦ（９％）。
個々のペプチド配列間の順位
順位はコムギ又はライムギに依存する。コムギに関して、優勢なペプチドは、ペプチド番号８９、９０及び９１を含む（表２３における番号を参照）。ライムギに関して、優勢なペプチドは、ペプチド番号３６８、３６９、３７０、３７１、及び３７２を含む（表２３における番号を参照）。６３５及び６３６（表２３における番号を参照）を含む幾つかのペプチドは、ライムギ及びコムギの両方において活性を示した。
インビボグルテンチャレンジはＴ細胞エピトープのヒエラルキーがセリアック病に関して定義されることを可能にする
エピトープのヒエラルキーはＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病の間で一致しているが、ＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病に関しては異なる。ヒエラルキーはコムギ穀物が消費されることに依存する。脱アミド化はほとんど全てのグリアジンエピトープを生成する。ＨＬＡ−ＤＱ２，ＤＱ８及びＤＲ４が脱アミド化されたペプチドを提示する。ＨＬＡ−ＤＱ２／８−関連のセリアック病は優先的にＤＱ２−関連グリアジンエピトープを提示する。グリアジンエピトープは、エピトープに基づく治療剤の開発を正当であると理由付けするのに十分制限される。
【０２２５】
他の分析は以下を示した：ＨＬＡ−ＤＲ３−ＤＱ２（８５−９５％）及びＨＬＡ−ＤＲ４−ＤＱ８（５−１５％）。
【０２２６】
他の分析は以下を示した：
【０２２７】
【表２】
【０２２８】
被験者１２のプール１−３において個々のｔＴＧ−脱アミド化されたペプチドの生物活性を測定するために、別の分析を実施した。結果は次のとおりである（配列の番号は表２３に掲載されたペプチドを指す）：配列８（１００％），配列５（８５％）、配列６（８２％）、配列３（７７％）、配列１（６７％）、配列２（５９％）、配列９（４９％）、配列７（４９％）、配列１０（３３％）、配列４（１５％）、配列１２（８％）、配列１１（０％）、配列２３（２６％）、配列１４（１８％）、配列１５（１８％）、配列１７（１８％）、配列１６（１３％）、配列１４（８％）、配列２２（５％）、配列１８（３％）、配列１９（３％）、配列２０（０％）、配列２１（０％）。予測された脱アミド化配列はＬＱＰＥＮＰＳＱＥＱＰＥである。
ＰＢＭＣによる個々のＥＬＩＳｐｏｔ応答（ＥＬＩＳｐｏｔリーダーにより測定されたスポット形成細胞）
【０２２９】
【表３】
【０２３０】
交差反応性
２９人の被験者の６５２のペプチドからのデータを扱うため、又は特定の応答が真実の陽性のペプチド特異的Ｔ細胞応答であるかを決定するため、又はペプチドに対する応答が別の構造上関連するペプチドとの交差反応性によるかを決定するために、特定のペプチド応答の発現を「優勢な」ペプチド応答のパーセンテージとすることができる。或いは、当該発現はペプチド応答間の相関係数としての「遅延（ｒｅｔａｒｄｎｅｓｓ）」とし得るか、又はバイオインフォマティックスにより得る。
追加のエピトープ
代表的な結果は次の通りである：
ペプチドのＰ０４７２２Ｅとの組み合わせ（全て２０ｍｃｇ／ｍｌ）（ｎ＝４）
単独 Ｐ０４７２２Ｅ＋
Ｐｅｐ６２６ ６０ １３５
Ｐ０４７２２Ｅ １００ １１０
ＨＬＡａ ０ ８５
（Ｐ０４７２２Ｅのパーセントとして表された）
６２６＋ｔＴ：ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ
０４７２２Ｅ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＬ
ペプチド６２６のｔＴＧ脱アミド化（ｎ＝１２）
ｔＴＧなし＝１００％
ｔＴＧ＝１７０％
特定の位置における置換
ペプチド６２６ＰＱＱＰ［Ｑ１］ＱＰ［Ｑ２］ＱＰＦＰＱＰ［Ｑ３］ＱＰＦＰＶの置換（ｎ＝１２）
Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｑ１ ９５ ９０
Ｑ２ １４５ ８０
Ｑ３ １５５ １０
（野生型ペプチドのパーセントとして表された）
ｔＴＧ処理された１５マーに及ぶペプチド６２６／６２７（ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷＱＰ）（ｎ＝８）
Ｐ１−１５ ５
Ｐ２−１６ ４
Ｐ３−１７ ３
Ｐ４−１８ ３８
Ｐ５−１９ ６５
Ｐ６−２０ ９５
Ｐ７−２１ ６５
Ｐ８−２２ ９０
（最大の１５マー応答のパーセントとして表された）
複数エピトープ：
Ｐ０４７２２Ｅ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬ
６２６＋ｔＴＧ：ＰＱＱＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ
最小エピトープ：ＱＰＱＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷ
抗−ＣＤ４によりコードされたビーズ及び抗インテグリンβ７によるＰＢＭＣの免疫磁気除去はＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を除去させたが、抗−ＣＤ８によりコードされたビーズ又は抗アルファＥインテグリンによるＰＢＭＣの免疫磁気除去はそうでなかった。即ち、ＩＦＮγを分泌するＰＢＭＣはＣＤ４＋及びα４β７＋であり、消化管内の粘膜固有層へのホーミングに関連した。
【０２３１】
ＨＬＡ−ＤＱ２に関して異型接合及び同型接合においては、抗−ＤＱ抗体によりブロックされたが抗−ＤＲ抗体によりブロックされなかった。これは一つの配列中の複数のエピトープを暗示するかもしれない。
セリアック病のＴ細胞エピトープ
他の研究者らは、特定の腸Ｔ細胞クローンエピトープを特性決定した。例えば、Ｖａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２，１２２：１７２９−３７；Ａｒｅｎｔｚ−Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２，１２３：８０３−８０９を参照。これらは、Ｔ細胞をクローン化するために使用されたインビトロ技術のためにその関係がいくらよく見ても不明であるエピトープの例である。
腸対末梢血クローン
腸：１）腸生検、２）グルテンのペプシン−トリプシン消化に対して生じさせたＴ細胞クローン、３）全てＨＬＡ−ＤＱ２制限される、４）クローンはトランスグルタミナーゼにより脱アミド化されたグリアジンに応答する。
末梢血：グルテンに対して生じさせたＴ細胞クローンはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＱ及びＤＰ制限される。結果：腸Ｔ細胞クローンはセリアック病関連エピトープをマップするのに限定的に使用することができる。
ＧＤＡ＿９コムギ３０７ａａ定義アルファ／ベータ−グリアジンＭＭ１前駆体（プロラミン）受け入れ番号Ｐ１８５７３−−ＧｅｎＢａｎｋ（その全体を引用により本明細書に編入する）
腸Ｔ細胞クローンエピトープ
腸Ｔ細胞クローンエピトープの定義は、例えば、Ａｒｅｎｔｚ−Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０００，１９１：６０３−１２に見いだすことができる。また、腸Ｔ細胞クローンに関するグルテンエピトープも開示されている。脱アミド化されたＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹがエピトープであり、ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹの脱アミド化配列もある。ＨＬＡ−ＤＱ２制限がある。相同性検索は他の生物活性γアルファ−グリアジンがＰＱＰＱＬＰＹを単独又は二重に含むことを示す。大多数のＴ細胞クローンはＤＱ２−αＩ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ ＤＱ２−αＩＩ：ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹの何れかに応答する。
優勢なグリアジンＴ細胞エピトープ
全てトランスグルタミナーゼにより脱アミド化される。
グルテンチャレンジ６日後の末梢血：Ａ−グリアジン５７−７３：
ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ
腸Ｔ細胞クローン：ＤＱ２−αＩ：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ ＤＱ２−αＩＩ：ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹ
腸Ｔ細胞クローンエピトープマッピング
【０２３２】
【表４】
【０２３３】
末梢血におけるＩＦＮγ−分泌Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５−特異的Ｔ細胞のグルテン暴露及び誘導
未処理のセリアック病を１、２又は８週間グルテンフリーダイエットさせ、次にグルテン暴露し（３日 パン２００ｇ／日）、次にグルテンフリーダイエットをさせた。
【０２３４】
結果１：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（０）、１週（１）、２週（２）、８週（１）
６日目：なし（０）、１週（４）、２週（２８）、８週（４８）
結果２：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：ｔＴＧ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（４５）、１週（６２）、２週（５）、８週（５）
６日目：なし（０）、１週（６７）、２週（４０）、８週（６０）
結果３：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：Ａ−グリアジン５７−７３ Ｐ６５（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（１）、１週（２）、２週（１）、８週（１）
６日目：なし（０）、１週（０）、２週（０）、８週（０）
結果４：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：ＰＰＤ（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（９０）、１週（８８）、２週（２１０）、８週（１５０）
６日目：なし（０）、１週（１００）、２週（２１０）、８週（１００）
結果５：グルテンフリーダイエットの期間及びグルテンチャレンジの０日目及び６日目のＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答：ｔＴＧ（ＩＦＮγ特異的スポット／百万ＰＰＢＭＣとして表された結果）
０日目：なし（５）、１週（４）、２週（３）、８週（２）
６日目：なし（０）、１週（４）、２週（１）、８週（２）
長期間のグルテンに対するＨＬＡ−ＤＱ２セリアック病におけるグルテンチャレンジ
抗グリアジンＴ細胞応答の特性決定を、末梢血において、３日間のグルテンチャレンジの６−８日後に実施した。
結果１：ＰＢＭＣ ６日目長期間グルテンフリーダイエット（抗ＨＬＡ−ＤＲ及び−ＤＱ抗体と前インキュベーション）（％阻害として表現）
ＤＲ−：ｔＴＧ−グリアジン１００ｍｃｇ／ｍｌ（１０５），Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５ ５０ｍｃｇ／ｍｌ（９０），ＰＰＤ ５ｍｃｇ／ｍｌ（３０）
ＤＱ−：ｔＴＧ−グリアジン １００ｍｃｇ／ｍｌ（５），Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５ ５０ｍｃｇ／ｍｌ（２２），ＰＰＤ ５ｍｃｇ／ｍｌ（７８）。
【０２３５】
結果２：ＰＢＭＣ ６日目長期間グルテンフリーダイエット（％ＣＤ８−除去ＰＢＭＣ応答として表現）
Ｂ７除去：ｔＴＧ−グリアジン ｎ＝６（７），Ａ−グリアジン５７−７３ ｎ＝９（６），ＰＰＤ ｎ＝８（６２）
ＡＥ除去：ｔＴＧ−グリアジン ｎ＝６（１２０），Ａ−グリアジン５７−７３ ん＝９（８０）、ＰＰＤ ｎ＝８（１１０）。
【０２３６】
ＣＤ４除去：ｔＴＧ−グリアジン ｎ＝６（１０），Ａ−グリアジン５７−７３ ｎ＝９（９），ＰＰＤ ｎ＝８（１０）。
治療用ペプチドは限定ではないが以下を含む
【０２３７】
【表５】
【０２３８】
簡単には、経口の抗原チャレンジ後に、末梢血Ｔ細胞の特異性が腸のＴ細胞クローンの特異性を反映する。末梢血においては、腸Ｔ細胞クローンのエピトープは、最適なα−グリアジンエピトープであるＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５に比較して準最適である。
実施例１５
以下のとおりのマッピング目的のためにもＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。
優勢なＤＱ−８関連エピトープのファインマッピング
【０２３９】
【表６】
【０２４０】
優勢なエピトープのファインマッピング（２）
【０２４１】
【表７】
【０２４２】
実施例１６
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔにおけるグリアジンエピトープの生物活性（２５ｍｃｇ／ｍｌ，ｎ＝６）（Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％として表された）
ＤＱ２−ＡＩＩ：野生型（ＷＴ）（４），ＷＴ＋ｔＴＧ（５２），Ｇｌｕ−置換された（５２）
ＤＱ２−ＡＩ：野生型（ＷＴ）（２），ＷＴ＋ｔＴＧ（２２），Ｇｌｕ−置換された（２８）
ＧＤＡ０９：野生型（ＷＴ）（１），ｔＴＧ（７），Ｇｌｕ−置換された（８）
Ａ−Ｇ３１−４９：野生型（ＷＴ）（２），ｔＴＧ（３），Ｇｌｕ−置換された（０）
Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５（Ｇ０１Ｅ）の用量応答（ｎ＝８）（Ｇ０１Ｅの最大応答の％として表された）
０．０２５ｍｃｇ／ｍｌ（１），０．０５ｍｃｇ／ｍｌ（８），０．１ｍｃｇ／ｍｌ（１０），０．２５ｍｃｇ／ｍｌ（２２），０．５ｍｃｇ／ｍｌ（３８）＜１ｍｃｇ／ｍｌ（４３），２．５ｍｃｇ／ｍｌ（５２），５ｍｃｇ／ｍｌ（７０），１０ｍｃｇ／ｍｌ（８１），２５ｍｃｇ／ｍｌ（９５），５０ｍｃｇ／ｍｌ（９０），１００ｍｃｇ／ｍｌ（８５）。
【０２４３】
単独又はＡ−グリアジン５７−７５（Ｇ０１Ｅ）と混合されたグリアジンエピトープに対するＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答（全て５０ｍｃｇ／ｍｌ，ｔＴＧ−グリアジン１００ｍｃｇ／ｍｌ，ＰＰＤ ５ｍｃｇ／ｍｌ；ｎ＝９）（Ｇ０１Ｅ応答の％として表された）
単独：ＤＱ２−Ａ１（２０），ＤＱ２−Ａ２（５５），オメガＧ１（５０），ｔＴＧグリアジン（８０）、ＰＰＤ（２２０），ＤＱ２バインダー（０）
Ｇ０１Ｅ＋：ＤＱ２−Ａ１（９０），ＤＱ２−Ａ２（９５），オメガＧ１（１００），ｔＴＧグリアジン（１２０）、ＰＰＤ（２８０），ＤＱ２バインダー（８０）
個々のセリアック病被験者におけるＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答に対するＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のアラニン及びリジン置換の効果（ｎ＝８）
エピトープ配列：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ
５７−５９位及び７２−７３位におけるアラニンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において、ほとんど又は全く低下を示さなかった。６０−６２位及び６８−７１位におけるアラニンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において穏やかな低下を示した。６３−６７位におけるアラニンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において最大の低下を示した。
個々のセリアック病被験者におけるＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答に対するＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５のリジン置換の効果（ｎ＝８）
エピトープ配列：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＳ
５７−５９位及び７１−７３位におけるリジンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において、ほとんど又は全く低下を示さなかった。６０−６１位及び６９−７０位におけるリジンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において穏やかな低下を示した。６２−６８位におけるリジンの置換はＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５応答の％において最大の低下を示した。
実施例１７
表２４は、コムギ又はライムギでチャレンジした数人の患者を用いた６５２のペプチドを試験する分析の結果を示す。
【０２４４】
【表８】
【０２４５】
本明細書において引用されたか又は言及されたＰＣＴの公表、合衆国特許、他の特許、定期刊行物、及びあらゆるその他の刊行物はそれらの全体を引用により本明細書に編入する。
【０２４６】
【表９】
【０２４７】
【表１０】
【０２４８】
【表１１】
【０２４９】
【表１２】
【０２５０】
【表１３】
【０２５１】
【表１４】
【０２５２】
【表１５】
【０２５３】
【表１６】
【０２５４】
【表１７】
【０２５５】
【表１８】
【０２５６】
【表１９】
【０２５７】
【表２０】
【０２５８】
【表２１】
【０２５９】
【表２２】
【０２６０】
【表２３】
【０２６１】
【表２４】
【０２６２】
【表２５】
【０２６３】
【表２６】
【０２６４】
【表２７】
【０２６５】
【表２８】
【０２６６】
【表２９】
【０２６７】
【表３０】
【０２６８】
【表３１】
【０２６９】
【表３２】
【０２７０】
【表３３】
【０２７１】
【表３４】
【０２７２】
【表３５】
【０２７３】
【表３６】
【０２７４】
【表３７】
【０２７５】
【表３８】
【０２７６】
【表３９】
【０２７７】
【表４０】
【０２７８】
【表４１】
【０２７９】
【表４２】
【０２８０】
【表４３】
【０２８１】
【表４４】
【０２８２】
【表４５】
【０２８３】
【表４６】
【０２８４】
【表４７】
【０２８５】
【表４８】
【０２８６】
配列表
【０２８７】
【表４９−１】
【０２８８】
【表４９−２】
【０２８９】
【表４９−３】
【０２９０】
【表４９−４】
【０２９１】
【表４９−５】
【０２９２】
【表４９−６】
【０２９３】
【表４９−７】
【０２９４】
【表４９−８】
【０２９５】
【表４９−９】
【０２９６】
【表４９−１０】
【０２９７】
【表４９−１１】
【０２９８】
【表４９−１２】
【０２９９】
【表４９−１３】
【０３００】
【表４９−１４】
【０３０１】
【表４９−１５】
【０３０２】
【表４９−１６】
【０３０３】
【表４９−１７】
【０３０４】
【表４９−１８】
【０３０５】
【表４９−１９】
【０３０６】
【表４９−２０】
【０３０７】
【表４９−２１】
【０３０８】
【表４９−２２】
【０３０９】
【表４９−２３】
【０３１０】
【表４９−２４】
【０３１１】
【表４９−２５】
【０３１２】
【表４９−２６】
【０３１３】
【表４９−２７】
【０３１４】
【表４９−２８】
【０３１５】
【表４９−２９】
【０３１６】
【表４９−３０】
【０３１７】
【表４９−３１】
【０３１８】
【表４９−３２】
【０３１９】
【表４９−３３】
【０３２０】
【表４９−３４】
【０３２１】
【表４９−３５】
【０３２２】
【表４９−３６】
【０３２３】
【表４９−３７】
【０３２４】
【表４９−３８】
【０３２５】
【表４９−３９】
【０３２６】
【表４９−４０】
【０３２７】
【表４９−４１】
【０３２８】
【表４９−４２】
【０３２９】
【表４９−４３】
【０３３０】
【表４９−４４】
【０３３１】
【表４９−４５】
【０３３２】
【表４９−４６】
【０３３３】
【表４９−４７】
【０３３４】
【表４９−４８】
【０３３５】
【表４９−４９】
【０３３６】
【表４９−５０】
【０３３７】
【表４９−５１】
【０３３８】
【表４９−５２】
【０３３９】
【表４９−５３】
【０３４０】
【表４９−５４】
【０３４１】
【表４９−５５】
【０３４２】
【表４９−５６】
【０３４３】
【表４９−５７】
【０３４４】
【表４９−５８】
【０３４５】
【表４９−５９】
【０３４６】
【表４９−６０】
【０３４７】
【表４９−６１】
【０３４８】
【表４９−６２】
【０３４９】
【表４９−６３】
【０３５０】
【表４９−６４】
【０３５１】
【表４９−６５】
【０３５２】
【表４９−６６】
【０３５３】
【表４９−６７】
【０３５４】
【表４９−６８】
【０３５５】
【表４９−６９】
【０３５６】
【表４９−７０】
【０３５７】
【表４９−７１】
【０３５８】
【表４９−７２】
【０３５９】
【表４９−７３】
【０３６０】
【表４９−７４】
【０３６１】
【表４９−７５】
【０３６２】
【表４９−７６】
【０３６３】
【表４９−７７】
【０３６４】
【表４９−７８】
【０３６５】
【表４９−７９】
【０３６６】
【表４９−８０】
【０３６７】
【表４９−８１】
【０３６８】
【表４９−８２】
【０３６９】
【表４９−８３】
【０３７０】
【表４９−８４】
【０３７１】
【表４９−８５】
【０３７２】
【表４９−８６】
【０３７３】
【表４９−８７】
【０３７４】
【表４９−８８】
【０３７５】
【表４９−８９】
【０３７６】
【表４９−９０】
【０３７７】
【表４９−９１】
【０３７８】
【表４９−９２】
【０３７９】
【表４９−９３】
【０３８０】
【表４９−９４】
【０３８１】
【表４９−９５】
【０３８２】
【表４９−９６】
【０３８３】
【表４９−９７】
【０３８４】
【表４９−９８】
【０３８５】
【表４９−９９】
【０３８６】
【表４９−１００】
【０３８７】
【表４９−１０１】
【０３８８】
【表４９−１０２】
【０３８９】
【表４９−１０３】
【０３９０】
【表４９−１０４】
【０３９１】
【表４９−１０５】
【０３９２】
【表４９−１０６】
【０３９３】
【表４９−１０７】
【０３９４】
【表４９−１０８】
【０３９５】
【表４９−１０９】
【０３９６】
【表４９−１１０】
【０３９７】
【表４９−１１１】
【０３９８】
【表４９−１１２】
【０３９９】
【表４９−１１３】
【０４００】
【表４９−１１４】
【０４０１】
【表４９−１１５】
【０４０２】
【表４９−１１６】
【０４０３】
【表４９−１１７】
【０４０４】
【表４９−１１８】
【０４０５】
【表４９−１１９】
【０４０６】
【表４９−１２０】
【０４０７】
【表４９−１２１】
【０４０８】
【表４９−１２２】
【０４０９】
【表４９−１２３】
【０４１０】
【表４９−１２４】
【０４１１】
【表４９−１２５】
【０４１２】
【表４９−１２６】
【０４１３】
【表４９−１２７】
【０４１４】
【表４９−１２８】
【０４１５】
【表４９−１２９】
【０４１６】
【表４９−１３０】
【０４１７】
【表４９−１３１】
【０４１８】
【表４９−１３２】
【０４１９】
【表４９−１３３】
【０４２０】
【表４９−１３４】
【０４２１】
【表４９−１３５】
【０４２２】
【表４９−１３６】
【０４２３】
【表４９−１３７】
【０４２４】
【表４９−１３８】
【０４２５】
【表４９−１３９】
【０４２６】
【表４９−１４０】
【０４２７】
【表４９−１４１】
【０４２８】
【表４９−１４２】
【０４２９】
【表４９−１４３】
【０４３０】
【表４９−１４４】
【０４３１】
【表４９−１４５】
【０４３２】
【表４９−１４６】
【０４３３】
【表４９−１４７】
【０４３４】
【表４９−１４８】
【０４３５】
【表４９−１４９】
【０４３６】
【表４９−１５０】
【０４３７】
【表４９−１５１】
【０４３８】
【表４９−１５２】
【０４３９】
【表４９−１５３】
【０４４０】
【表４９−１５４】
【０４４１】
【表４９−１５５】
【０４４２】
【表４９−１５６】
【０４４３】
【表４９−１５７】
【０４４４】
【表４９−１５８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリアック病を治療又は予防する方法であって、
（ａ）配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６、及びそれらの均等物からなる群から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチド；及び
（ｂ）（ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることができ、且つ５０アミノ酸の長さを超えない、（ａ）の類似体；及び
（ｃ）配列番号：１及び配列番号：２から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチドから選択される少なくとも一つの薬剤を個体に投与する
ことを含む方法。
【請求項１】
セリアック病を治療又は予防する方法であって、
（ａ）配列番号：１８−２２、３１−３６、３９−４４、及び４６、及びそれらの均等物からなる群から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチド；及び
（ｂ）（ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることができ、且つ５０アミノ酸の長さを超えない、（ａ）の類似体；及び
（ｃ）配列番号：１及び配列番号：２から選択される配列を含む少なくとも一つのエピトープを含むペプチドから選択される少なくとも一つの薬剤を個体に投与する
ことを含む方法。
【図１Ａ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図１２Ｈ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２８Ｄ】
【図２８Ｅ】
【図２８Ｆ】
【図２８Ｇ】
【図３０】
【図３１】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図１Ｂ】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図２９】
【図３２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図１２Ｈ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２８Ｄ】
【図２８Ｅ】
【図２８Ｆ】
【図２８Ｇ】
【図３０】
【図３１】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図１Ｂ】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図２９】
【図３２】
【公開番号】特開２０１０−２２９１３８（Ｐ２０１０−２２９１３８Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１０６８３（Ｐ２０１０−１１０６８３）
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【分割の表示】特願２００４−５１１３４１（Ｐ２００４−５１１３４１）の分割
【原出願日】平成１５年６月５日（２００３．６．５）
【出願人】（５０００５６２３１）アイシス・イノベーション・リミテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＳＩＳ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【分割の表示】特願２００４−５１１３４１（Ｐ２００４−５１１３４１）の分割
【原出願日】平成１５年６月５日（２００３．６．５）
【出願人】（５０００５６２３１）アイシス・イノベーション・リミテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＳＩＳ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]