活性なｓｃＦｖ抗体及びそのライブラリーを生産する方法
本開示は、ｓｃＦｖ抗体ライブラリー、このライブラリーから単離された抗体、それを生産及び使用する方法を記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組換え一本鎖抗体、及びこのような抗体を生産及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的アプローチは、特定の結合特異性、特定のドメイン構造、他の所望の特性を有する組換え抗体の生産を可能にしてきた。ある種の遺伝子工学的に操作された抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。一本鎖Ｆｖフラグメントは、遺伝子工学的に操作されたポリペプチドであって、柔軟なペプチドリンカーを介して、軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。各ＶＨ及びＶＬドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは短いアミノ酸配列であり、抗体分子間で非常に変化し、したがって、抗体結合特異性の大きな多様性を生じさせる原因となる。ＶＨのＣＤＲ及びＶＬのＣＤＲの組み合わせは、任意の所定の抗体の結合特異性を決定する。
【０００３】
一本鎖Ｆｖフラグメントは、完全な大きさの抗体の結合特異性及び一価結合親和性を示し、遺伝子操作及び発現の相対的な容易性の付加された利点を与える（これは、ｓｃＦｖが、完全な大きさの抗体である場合のように、別々のコーディング配列というよりはむしろ、単一のコーディング配列によってコードされ、そこから発現されるためである）。一本鎖Ｆｖフラグメント及び他の組換え抗体は、幅広い用途、例えば、医療用診断試験、基礎研究、種々の疾患に対する治療用抗体処置において使用される。
【０００４】
細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）は、細胞内で異所的に発現される遺伝子操作された抗体分子である。細胞内発現抗体は、生存細胞内で標的抗原の機能を視覚化するか又は調節するために使用可能である。例えば、細胞内発現抗体の使用は、標的化された抗原の機能を直接的に阻害することによって、又は正常な細胞内位置から標的化された抗原を転用することによって表現型ノックアウトを誘導することができる（例えば、細胞内発現抗体は、分解機構にその標的抗原を変更することができる）。また、細胞内発現抗体は、それらの標的抗原の機能を増加させるか又は変化させることができる。タンパク質標的については、細胞内発現抗体は、特定の翻訳後修飾又は特定の抗原立体構造に標的化され得る。さらに、細胞内発現抗体によって誘導された表現型ノックアウトは、アドレス指定（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ）シグナル（例えば、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、又は小胞体シグナル）を用いて、特定の細胞内コンパートメントに細胞を標的化することによって、特定の細胞コンパートメントに限定することができる。また、細胞内発現抗体は、標的のオリゴマー構造を修飾することによって、標的機能を調節することができる。
【０００５】
細胞内発現抗体による表現型ノックアウトは、その標的への抗体分子の結合能力にだけ依存するため、細胞内で完全な抗体分子を発現させる必要がなく、可変領域（Ｆｖ）内に完全に位置されるその結合部位だけを必要とする。単一のポリペプチド鎖内に含まれる小さな大きさ及び抗原特異性のそれらの利点が与えられると、ｓｃＦｖは、細胞内の抗体発現のために使用される組換え抗体フラグメントの最も共通した型である。
【０００６】
細胞内発現抗体の使用についての一連の制限は、大部分のｓｃＦｖが、細胞質ゾル及び核の還元条件下ではフォールディングできないということである。このような条件下では、ｓｃＦｖの２つの保存されたジスルフィド架橋が減少し、それによって、不安定となり、多数のｓｃＦｖの結合活性を不活性化する。インビトロでは、大部分のｓｃＦｖは、還元条件下で復元することができない。ｓｃＦｖ配列の統計学的分析によれば、１％よりも少ないｓｃＦｖがジスルフィド結合形成がない場合に発現され、活性であるには十分に安定であることが示されている。さらに、ｓｃＦｖタンパク質がインビボにおいて発現され、活性であるには、その還元形態において確かに十分に安定であるとしても、プロテアーゼ感受性又はフォールディング動力学などの他のパラメータもまた、細胞内発現抗体の最終的インビボでの宿命に影響を与える可能性があり、したがって、最終的な細胞内発現抗体の発現及び活性に重要である。
【０００７】
活性な細胞内発現抗体を得るために、現在のアプローチは、多くの場合、２つの連続工程を伴う。第１に、対象の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ又はＦａｂ抗体の一団が同定される（例えば、ファージディスプレイライブラリーによる）。第２に、特異的に結合する抗体は、インビボにおいて標的抗原に結合及び／又は阻害するそれらの能力について試験される。１％よりも少ないｓｃＦｖは、細胞内発現抗体として潜在的に有用であるため（それらは、細胞内に存在する還元条件下で発現されず、及び／又は適切にフォールドすることができないため）、細胞内発現抗体として使用可能である単一のｓｃＦｖの同定は、１００個を超えるｓｃＦｖクローンの同定を必要として、その数は、大部分の場合では得ることができないものである。
【０００８】
医療及び研究用途での使用のために、細胞内発現抗体として用いることができる抗体を生産し、同定することの前述の困難性を考慮して、必要とされるのは、細胞内発現抗体として使用することができる抗体を生産及び選択するより効果的な方法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の局面では、少なくとも１０6個の固有の（ｕｎｉｑｕｅ）ｓｃＦｖクローンを含む抗体ライブラリーが本明細書に記載され、ここで、ｓｃＦｖクローンによってコードされる抗体が細胞内で発現される場合、少なくとも約２０％のｓｃＦｖクローンは、細胞内で標的抗原と検出可能に特異的に結合することができる抗体をコードする。
【００１０】
第２の局面では、抗体ライブラリーが本明細書に記載され、ここで、抗体ライブラリーは、少なくとも約１０6個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含み、少なくとも約２０％のｓｃＦｖ抗体クローンが、大腸菌細胞内で発現することができ、大腸菌細胞１リットルあたり少なくとも約５ｍｇのレベルで可溶性抗体を生成し、ここで、大腸菌細胞は、ＯＤ600nmが約５になるまで増殖される。
【００１１】
第３の局面では、少なくとも約１０6個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含む抗体ライブラリーが本明細書に記載され、ここで、各固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列及び固有のＣＤＲ３ＶＬ配列の少なくとも１つを含む固有のｓｃＦｖ抗体をコードし、固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、ｓｃＦｖ１３Ｒ４によってコードされるフレームワーク配列と実質的に同一であるフレームワーク配列をコードする。
【００１２】
上記抗体ライブラリーのいずれかにおいて、固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードすることができる。
【００１３】
上記抗体ライブラリーのいずれかにおいて、固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、固有のＣＤＲ３ＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードすることができる。
【００１４】
上記抗体ライブラリーのいずれかにおいて、固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列及び固有のＣＤＲ３ＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードすることができる。
【００１５】
第４の局面では、還元条件下で実質的に可溶性タンパク質として発現可能なｓｃＦｖ抗体が本明細書に記載され、ここで、ｓｃＦｖ抗体は、第３の局面において、上記されるライブラリーから単離される。ｓｃＦｖ抗体は、還元条件下で標的抗原に特異的に結合することができる。
【００１６】
第５の局面では、細胞内で第４の局面において上述されるｓｃＦｖ抗体を発現させ、それによって、ｓｃＦｖ抗体を生産することを含むｓｃＦｖ抗体を生産する方法が本明細書に記載される。この方法は、細胞からｓｃＦｖ抗体をさらに精製することを含むことができる。
【００１７】
第６の局面では、細胞内で発現可能なｓｃＦｖ抗体クローンに富んだｓｃＦｖ抗体を調製する方法であって、ａ）ｓｃＦｖ抗体クローンの第１の回収物を用意し、ここで、第１の回収物が、ＶＨのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第１の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るｓｃＦｖ抗体に富んでいて；ｂ）ｓｃＦｖ抗体クローンの第２の回収物を用意し、ここで、第２の回収物が、ＶＬのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第２の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るｓｃＦｖ抗体に富んでいて；ｃ）第１の回収物のｓｃＦｖ抗体クローン由来のＶＨドメインと、第２の回収物のｓｃＦｖ抗体クローン由来のＶＬドメインとを接合して、ｓｃＦｖ抗体クローンの第３の回収物を得て、ここで、第３の回収物が、ＶＨのＣＤＲ３ループ内の固有の配列、及びＶＬのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む、を含み、それにより、細胞内で発現され得るｓｃＦｖ抗体クローンに富んだｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製する。
【００１８】
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調節するための上記方法において、前記第１の回収物が、第１の回収物に含まれる他のｓｃＦｖ抗体クローンと比較して、実質的に同一のＶＬを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、第２の回収物に含まれる他のｓｃＦｖ抗体クローンと比較して、実質的に同一のＶＨ配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む。
【００１９】
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調節するための上記方法において、前記第１の回収物が、ｓｃＦｖ１３Ｒ４ＶＬ配列に実質的に同一であるＶＬを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、ｓｃＦｖ１３Ｒ４ＶＨ配列に実質的に同一であるＶＨを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む。
【００２０】
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調節するための上記方法において、前記第１の回収物が、ＶＨドメインと同一なＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、ＶＬドメインと同一なＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む。
【００２１】
第７の局面では、第６の局面において上記される方法によって製造される抗体ライブラリーが本明細書に記載される。
【００２２】
第８の局面では、第６の局面において上記される方法によって製造される抗体ライブラリーから選択される抗体が本明細書に記載される。
【００２３】
第９の局面では、本発明は、抗体ライブラリーを構築する方法を特徴とし、ａ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークを選択し；ｂ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークのＶＨ ＣＤＲ３領域に配列多様性を導入して、固有のＶＨ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む第１のライブラリーを生じさせ；ｃ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークのＶＬ ＣＤＲ３領域に配列多様性を導入して、固有のＶＬ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む第２のライブラリーを生じされ；ｄ）第１のライブラリーから、ｓｃＦｖ抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し；ｅ）第２のライブラリーから、ｓｃＦｖ抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し；ｆ）第１及び第２のライブラリーを再結合させて、固有のＶＨ ＣＤＲ３領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体ライブラリーを含む第１のライブラリーを生じさせることを含み、それにより、抗体ライブラリーを構築する。
【００２４】
上記の方法において、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ１３Ｒ４であってもよい。
【００２５】
細胞内発現抗体として使用されてもよい、細胞質において発現されるｓｃＦｖを単離するための新規な抗体ライブラリーを提供することが本発明の目的である。
【００２６】
単一フレームワークに基づき、細胞内発現を最適化された新規な抗体ライブラリーを提供することが本発明の別の目的である。
【００２７】
本発明の更なる目的は、細胞内発現抗体として使用されてもよい細胞質において発現されるｓｃＦｖを単離するための新規な抗体ライブラリーを構築及び評価するための新規な方法を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、単一のフレームワークに基づき、細胞内発現を最適化した新規な抗体ライブラリーを構築及び評価する新規な方法を提供することである。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、細胞内発現抗体として使用されてもよい高発現するｓｃＦｖを生産するために、抗体ライブラリーを用いる新規な方法を提供することである。
【００３０】
本発明のなお別の目的は、単一のフレームワークに基づき、細胞内発現を最適化したｓｃＦｖを生産するために、抗体ライブラリーを試料する新規な方法を提供することである。
【００３１】
本発明のこれら及び他の目的、特徴、利点は、開示された態様の下記の詳細な説明の考察後に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（ａ）ライブラリー構築中の工程の図式的アウトライン。重要な工程は固有のヒトｓｃＦｖフレームワークへの調整されたＣＤＲ３ループの導入；ＣＡＴ酵素との融合及びＣＡＭプレート上での選択による発現していないクローンの除去；１３個のＶＨライブラリー及び５個のＶＬライブラリーの再結合、ファージ上の提示である。（ｂ）データベースで回収されたＣＤＲ３ループの概要。（ｃ）５５個の再配列されたヒト抗体由来の５個のアミノ酸の長さのＶＨ ＣＤＲ３の各位置でのアミノ酸の分布。
【図２】ＣＤＲ３の長さ分布の略図。データベース、及びライブラリーからの１１８個の配列決定されたクローンにおけるＣＤＲ３の長さの分布。
【図３】細胞質発現ベクターにおいてクローニングされ、Ｔ７プロモーターの調節下で大腸菌に発現されたライブラリー由来の２０個のクローンのウェスタンブロット分析。ライブラリーからの２０個のクローンは、細胞質発現ベクターにおいてクローニングされ、Ｔ７プロモーターの調節下で大腸菌に発現された。可溶性抽出物が調製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、９Ｅ１０及びアルカリホスファターゼ結合した抗マウスＩｇＧ抗体（基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いた、クーマシー染色（ａ）又はウェスタンブロット（ｂ）によって分析された。各レーンは、２×１０7個（２×１０の７乗）の細胞に対応する。左の矢印は、ｓｃＦｖの位置を示す。
【図４】ＨｅＬａ細胞において無作為に採取したｓｃＦｖ発現の選択された蛍光顕微鏡写真。細胞は、指示されたｓｃＦｖ−ＥＧＰ構築物を用いてトランスフェクトされた。１３Ｒ４及び１Ｆ４は、それぞれ、正及び負の対照を示す。トランスフェクションの２４時間後、細胞を固定し、蛍光性イソチオシアネートフィルターセットを用いた蛍光顕微鏡下で視覚化された。顕微鏡写真は、各場合において同数の細胞を含む代表的なフィールドを示す。倍率：×４００。
【図５】５つの精製されたタンパク質に対する結合剤の選択。（ａ）各ラウンドの選択由来の２．５×１０10個のファージは、それらのそれぞれの抗原に対して、ＥＬＩＳＡによって試験され、抗Ｍ１３ＨＲＰ結合したモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて曝露した。Ｒ０は選択されていないライブラリーであり、Ｒｎは、第ｎラウンドの選択後に得られたストックである。特異性は、第３ラウンドの選択についてＢＳＡに基づいて試験された（Ａ４５０ｎｍ 約０．１−０．３）。（ｂ）ＧＳＴ：Ｓｙｋタンパク質に対する各ラウンドの選択からのモノクローナルファージは、（ａ）におけるＥＬＩＳＡによって試験された。可溶性であり活性なｓｃＦｖの割合（吸光度＞０．１）は指示されたタンパク質に対して３ラウンド後に選択され、ペリプラズム（グレイ）又は細胞質（ブラック）のいずれかにおいて発現された。
【図６】ＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＰに融合した抗ヒストンｓｃＦｖの発現の顕微鏡写真。細胞は、図４の説明に示されるようにトランスフェクトされ、処置された。写真は、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、３つの代表的な抗ヒストンクローン（２、５及び１０）を用いてトランスフェクトされた典型的な細胞を示す。Ｄ、ＤＡＰＩ染色（青色）であり、ＧＦＰシグナルと重なる。
【図７】還元条件下で選択されたｓｃＦｖの活性の発現のグラフ表示。細胞質におけるｓｃＦｖを発現する細胞の抽出物は、１０ｍＭのＤＴＴの有無により、図３に示されるように調製された。したがって、ＥＬＩＳＡは、ＤＴＴの有無により行った。ｘ軸：ウェルあたりの抽出物の量。ｙ軸：４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡシグナル。
【図８】細胞内発現抗体を用いてＨｅＬａ細胞の二重染色及び免疫蛍光法による顕微鏡写真。ｄｓＲｅｄ−モノマーＧＦＰに融合された抗ヒストンクローン５（図６）を用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。微小管は、抗チューブリンｓｃＦｖ ２Ｆ１２Ｃ（表３）を用いてＩＦによってトランスフェクトされた細胞において表された。細胞は、視覚化するために適切な波長で観察された：（Ａ）２Ｆ１２Ｃ ｓｃＦｖ（微小管単独）；（Ｂ）クローン５細胞内発現抗体（ヒストン単独）；（Ｃ）２Ｆ１２Ｃ及びクローン５（微小管及びヒストン）；（Ｄ）ＤＡＰＩを用いて染色するＣプラス核。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
原核細胞又は真核細胞内で発現することができるｓｃＦｖに富んだｓｃＦｖライブラリーを構築するための方法が本明細書に提供される。ｓｃＦｖは、細胞内に存在する還元条件下でそれらの構造を維持し、細胞内の標的抗原に特異的に結合する能力を保持し、したがって、種々の治療及び研究アプローチにおける細胞内発現抗体として使用することができる。本明細書に記載される方法は、還元条件下で安定であるｓｃＦｖのライブラリーを生産するために使用されるので、これらのライブラリーもまた原核細胞又は真核細胞によって発現し、及びそれらから精製され得るｓｃＦｖの生産に有用である（例えば、細胞を溶解し、周知な技術によって所望のｓｃＦｖを精製することによる）。このように精製されたｓｃＦｖは、研究における使用、診断試験、疾患治療のための抗体として有用である。
【００３４】
インビボにおいて使用されるべきｓｃＦｖを安定化させるための改善されたストラテジーは、細胞内発現のために調整されたｓｃＦｖライブラリーを構築することである。理想的には、このようなライブラリーは、細胞の細胞質に見出されるものなどの、還元条件下でフォールドすることができるｓｃＦｖだけを含むべきである。別のストラテジーは、細胞内発現抗体の選択のために単一の最適化された抗体フレームワークに基づいてｓｃＦｖライブラリーを構築することである。
【００３５】
単一の最適化された抗体フレームワークに基づき、細胞内発現のために調整されている新規な抗体ライブラリーを構築する方法が本明細書に記載されている。分子進化を通じて、本発明者らは、大腸菌の細胞質に高レベルで発現する、ｓｃＦｖ１３Ｒ４と呼ばれるヒトｓｃＦｖを得た。さらに、このｓｃＦｖは、非常に発現され、可溶的であり、酵母及び哺乳動物細胞において標的抗原に特異的な結合活性を提示する。このｓｃＦｖは、インビトロにおいて非常に安定であり、還元剤の存在下で復元可能である。さらに、そのフォールディング動力学の分析は、親ｓｃＦｖよりも速くフォールディングし、インビトロではよりゆっくりと凝集することを示した。
【００３６】
最適化されたｓｃＦｖ１３Ｒ４のフレームワークに基づくヒトｓｃＦｖライブラリーは、１０億個を超えるクローンを含み、それらは、１０7〜１０8の従来のライブラリーと比べて大きい。本発明者らは、種々の異なる長さのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ３ループをコードするように本ライブラリーを設計したため、本ヒトｓｃＦｖライブラリーの多様性は、従来のライブラリーよりもはるかに大きい。さらに、本発明者らは、ヒトＣＤＲ３を模倣するＣＤＲ３ループをコードする変性オリゴヌクレオチド配列の偏向混合物を使用した。最適化されたＣＤＲ３ループ、発現していないクローンを排除するためのろ過工程を用いると、本発明者らは、発現していないｓｃＦｖのライブラリーを取り除き、クローンの多様性を損なうことなしに細胞質で発現したｓｃＦｖを保持し、これは、抗原として使用されるいくつかのタンパク質を用いた試験を通じて確認された。前述されたｓｃＦｖライブラリーに反して、ライブラリー中の大部分のｓｃＦｖは、大腸菌及び哺乳動物の細胞質において十分に発現する。
【００３７】
ｓｃＦｖライブラリーを構築するためのこの新しいアプローチは、機能的な細胞内発現抗体の容易かつ大規模な選択を可能にする。例えば、異なるタンパク質に対するいくつかの強力な結合剤は、Ｓｙｋ及びＡｕｒｏｒａ−Ａタンパク質キナーゼ、αβチューブリン二量体、パピローマウイルスＥ６タンパク質、コアヒストン、ガンキリン（ｇａｎｋｙｒｉｎ）、ＭＡＰＫ１１−１４を含み、ライブラリーから単離されている。選択されたｓｃＦｖのいくつかは、細菌の細胞質において非常に高レベルで発現し、ほんの２０ｍｌの培養物から１ｍｇ以上の活性なｓｃＦｖの精製を可能にする。さらに、標的抗原としてのコアヒストンに対する３ラウンドの選択後、半分を超える選択されたｓｃＦｖが、インビボでヒト細胞において発現されると活性となり、基本的に核に局在した。こん新しいタイプのライブラリー、このようなライブラリーを創作及び用いる方法、このようなライブラリーから単離された抗体は、機能的な細胞内発現抗体の単純かつ大規模な選択のためだけでなく、多数のバイオテクノロジー、診断、治療用途において使用可能である高発現したｓｃＦｖの発現及び精製のためにも有用である。
【００３８】
細胞内発現抗体
細胞内発現抗体は、細胞内で異所的に発現される遺伝子工学的に操作された抗体分子である。細胞内発現抗体は、生存細胞において標的化された抗原を視覚化又は阻害するために使用することができ、したがって、種々の研究及び医学的（例えば、診断及び治療的）用途における使用を見出す。しかしながら、細胞内発現抗体技術は、典型的な抗体発現ライブラリー中のほんの１％未満のｓｃＦｖがインビボにおいて発現及び／又は活性となるには十分に安定であるという事実によって制限されている。これは、細胞内環境が、非常に多くのｓｃＦｖが安定性のために必要とする２つの保存されたジスルフィド結合を減少するためである。還元条件下で安定であり、したがって、細胞内発現抗体としての使用に適しているｓｃＦｖに非常に富んだｓｃＦｖのライブラリーを生産する方法が本明細書に記載されている。細胞内発現抗体は、細胞内発現抗体を使用する種々の研究、診断、及び治療的アプローチのために用いることができる。
【００３９】
大部分の場合において、効果的な細胞内発現抗体を得るために、２つの連続工程を現在必要とする。第１に、標的抗原に対する一団の抗体が単離されなければならない。ファージに提示される非常に高い質であって、未使用の抗体の利用性により、この工程は、現在、同時にいくつかのタンパク質に対する結合剤を単離するために、ファージディスプレイによって容易に達成され、自動化され得る。第２工程では、これらの抗体フラグメント（ｓｃＦｖ又はＦａｂ）は、それらの標的を阻害する能力について、インビボにおいて試験されなければならない。しかしながら、大部分のｓｃＦｖは、大部分の関心のある標的が局在する細胞質及び細胞の核において見出される還元条件下で適切にフォールディングしない。これは、ｓｃＦｖの凝集及び不活性化をもたらす可能性があり、それらの標的と相互作用することができない。１％未満のｓｃＦｖは細胞内発現抗体として効果的であるため、タンパク質に対する単一の結合剤を得ることは、１００個のｓｃＦｖの単離を必要とし、この数は、多くの場合において得られる可能性がない。これは、２ハイブリッド又は同等のシステムを用いてインビボで行われるときでさえ、標準のｓｃＦｖライブラリーからの細胞内発現抗体を同定するプロセスを異なる手法にする。さらに、現在のライブラリーに含まれる低い割合の活性なｓｃＦｖは、スクリーニングされた潜在的なレパートリーの１００倍の減少をもたらし、同じタンパク質の異なるエピトープに対する細胞内発現抗体の単離を不可能にする。
【００４０】
ライブラリー
細胞内発現のために最適化されたｓｃＦｖの新規なファージディスプレイライブラリー、このライブラリーを構築及び使用する新規な方法が本明細書に記載されている。ライブラリーは、細胞質内で改善された活性のために選択される親ｓｃＦｖの単一の抗体フラグメントに基づいて構築される。親ｓｃＦｖは非常に安定であり、好ましいフォールディング及び凝集動力学を有し、全ての試験された細胞型において非常に高レベルで発現される。ライブラリーの構築のために単一のフレームワークを有することは、それらの配列の大部分が保存されているので、クローン間でより匹敵する発現レベルを可能にしなければならない。
【００４１】
しかしながら、ＣＤＲ配列はまた、ｓｃＦｖフォールディング及び発現において役割を果たすので、本発明者らは、クローンの発現レベルはさらにいくつかの変動性をさらに示す。これらの相違を最小限にするため、本発明者らは、ＣＤＲ３ループ内にのみ変動性を導入し、それは、これらのループが、抗体において最も可変的であり、したがって、配列及び長さのバリエーションに非常に寛容である可能性がより高いためである。ＣＤＲ３における変動性の導入は、大部分のタンパク質に対する抗体を生じさせるには十分である。さらに、本発明者らは、天然のヒト配列中に観察された分布を回復するようにこれらのループ内のアミノ酸の頻度を注意深く偏らせた。無作為に選択されたクローンの発現レベルが細胞質において比較されると、いくつかの明確な相違にかかわらずに、高い割合のものが大腸菌及び哺乳動物細胞において正確に発現された。細胞内に発現されたｓｃＦｖのこの比率は、前述のライブラリーにおけるものよりも非常に高い。
【００４２】
また、本発明者らは、５つの異なるタンパク質（Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＧＳＴ：Ｓｙｋ、チューブリン、ヒストン、及びパピローマウイルスＨＰＢ１６由来のＥ６タンパク質）に対する結合剤（即ち、選択された標的抗原に特異的に結合する抗体）を選択することができた。その後の研究では、本発明者らはまた、ガンキリン及びＭＡＰＫ１１−１４を含む新しい標的に対する結合剤を有する。ＭＡＰＫ１１−１４については、関与する４つのタンパク質は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの４つの異性体である。これらのタンパク質は、非常に相同（約６０〜７４％の同一性）である。全てのケースにおいて、本発明者らは、選択のために使用されるアイソフォームに特異的なｓｃＦｖを単離することができた。これは、このライブラリーから単離することができたｓｃＦｖの特異性を強調する。
【００４３】
ｓｃＦｖライブラリーを構築する際の度重なる関心事は、ライブラリーの多様性及びサイズの同時の最適化である。一般に、このようなライブラリーの大きさは、約１０10個のクローンに対する形質転換効率によって制限される。この制限された数のクローンにより、したがって、発現していないｓｃＦｖ又は二重を避けることは、非常に重要である。この問題を解決するために、本発明者らは、第１に、細胞内発現のために絶えず最適化された抗体フレームワークを選択し、次に、２工程の手法を用いて、ライブラリーをさらに最適化した。
【００４４】
第１に、本発明者らは、ｓｃＦｖライブラリー（下記の実施例１を参照）を構築するために使用される、各ＣＤＲ３の長さ（１３ＶＨ ＣＤＲ３の長さ、５ＶＬ ＣＤＲ３の長さ）について１８個の「小さな」ライブラリーを構築した。これらの１８個のライブラリーの各々は、無作為化されたＣＤＲ３によって、親ｓｃＦｖ１３Ｒ４の対応するＣＤＲ３を置換することによって作製された。次に、１個及びたった１個の無作為化されたＣＤＲ３を有する得られたライブラリーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子に融合され、本発明者らは、選択可能なマーカーとしてしたものである。各ＣＤＲ３ライブラリーの大腸菌へのトランスフェクション後、ライブラリーは、大腸菌の細胞質において発現されたＣＤＲ３−ＣＡＴ融合体について選択するためのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）含有培地に置かれた。この工程は、約１０〜３０％によって各ライブラリーの多様性を減少させた。
【００４５】
ＣＡＴ遺伝子は本明細書において与えられた実施例において使用されるが、当業者は、任意の適切な選択可能なマーカーをコードする核酸は、ＣＤＲ３をコードする核酸と融合され、原核細胞又は真核細胞で発現されるｓｃＦｖのためのｓｃＦｖライブラリーを豊富にするために本明細書に与えられた方法に使用され得ることを理解する。例えば、細菌細胞における使用のための適切な選択可能なマーカーには、限定されないが、カナマイシン耐性遺伝子が含まれる。哺乳動物における使用のための選択可能なマーカーの例には、限定されないが、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。酵母細胞のための選択可能なマーカーの例には、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、及びｐｕｒＥが挙げられる。さらに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその誘導体、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、又は他のルミネッセント、蛍光分析、及び／又は比色分析用マーカーなどのマーカーは、全ての細胞型において、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて使用され、発現され得るｓｃＦｖをコードするクローンに対するｓｃＦｖライブラリーに富んでいる。当業者は、本明細書に記載されているｓｃＦｖライブラリーを構築するための適切な選択可能なマーカー及び適切な選択スキームを選択するために、本明細書に記載の技術をどのように使用するか、さらに、当該技術分野において何が知られているかを理解する。
【００４６】
第２の工程では、本発明者らは、ＶＬ領域及びｓｃＦｖ１３Ｒ４の元々のＶＬにおける新しいＣＤＲ３配列を含む新たに生じたｓｃＦｖクローンが発現され、ＶＬ領域及びｓｃＦｖ１３Ｒ４の元々のＶＨ領域における新しいＣＤＲ配列を含む新たに生じたｓｃＦｖクローンが発現される場合に、ＶＨ領域における新しいＣＤＲ３配列及びＶＬ領域における新しいＣＤＲ３配列を含む組換えｓｃＦｖクローンもまた発現され、それによって、発現されただけのｓｃＦｖを含むライブラリーを生じるという仮説に基づいて、最終の多様性を生じさせるために選択されたＶＨ及びＶＬライブラリーを無作為にアセンブルさせるためにＰＣＲを使用した。無作為に選択された２０個のクローンのうちの１９個が、大腸菌の細胞質において可溶性形態で少なくとも部分的に発現されたため、これはそのケースであった。重要なことには、この選択工程は、ライブラリー構築中の初期に行われるので、最終のライブラリーの多様性は、最終の形質転換によって限定されるだけであった。この最終の組換え工程は、高い多様性によって生じることによって、全てのクローンが最終ライブラリーにおいて固有となることを確認した。要するに、このアプローチは、１５億個の発現した異なるｓｃＦｖのライブラリーをもたらした。
【００４７】
大規模での細胞内発現抗体としてのｓｃＦｖの成功使用は、ライブラリーによって実行されるためのいくつかの本質的なポイントを必要とする。第１に、ｓｃＦｖは、単離が容易でなければならない。これは、現に記載された方法についてのケースであり、本発明者らは、試験した全てのタンパク質に対する結合剤を単離することができただけでなく、単一サイクルの選択が１００％に近い結合剤を得るには十分でもあった。この非常に高い濃縮率は、十分に発現したｓｃＦｖのみを含む、高い質の偏ったライブラリー、及びトリプシン感受性のヘルパーファージＫＭ１３の使用に起因して推定される。これは非常に重要なことであり、細胞内発現抗体としてのｓｃＦｖのインビボでの試験前に、単一のパンニングサイクルを使用することが可能であり、標的化されたエピトープのより良好な多様性を可能にする。また、この高い濃縮率は、パンニング工程に必要とされる精製された抗原の量を大量に低減する。本発明者らは、ウェルあたり１μｇ程度のタンパク質を用いて、マイクロタイタープレートに選択することができた。ＥＬＩＳＡによる結合活性の更なる選択及び確認は、結合剤の非常に高い比率のために必要ではないため、現に、非常に少量の抗原を用いて良好な細胞内発現抗体を単離することができる。第２に、ｓｃＦｖは、全ての細胞コンパートメントにおいて、特に細胞質及び核などの還元部分においてフォールディングできなければならない。再度、これは、試験された８０％を超えるクローンが、細胞内で少なくとも部分的に可溶であるため、本明細書に記載されたｓｃＦｖライブラリーに対するケースである。さらに、本発明者らは、良好な細胞質結合剤が、大腸菌及び真核細胞においてｓｃＦｖを選択したファージにおいて得ることができたことを示した。
【００４８】
少なくとも約：１０6、５×１０6、１０7、５×１０7、１０8、５×１０8、１０9、１．５×１０9、５×１０9、１０10、５×１０10、１０11、５×１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、又は１０16個の固有のｓｃＦｖクローンを含む抗体ライブラリーが本明細書に提供され、ここで、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、又はそれを超えるｓｃＦｖクローンは、そのｓｃＦｖクローンによってコードされた抗体が細胞内で（細胞内発現抗体として）発現される場合、標的抗原に検出可能に特異的に決グリコサミノグリカンすることができる抗体をコードする。本明細書に記載のｓｃＦｖは、標的抗原に検出可能に特異的に結合することが望まれる任意の原核細胞又は真核細胞（例えば、限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、トリ細胞、哺乳動物細胞など）において標的抗原に検出可能に特異的に結合するために発現可能である。
【００４９】
「特異的に結合する」とは、ｓｃＦｖ抗体が、別の抗原よりもむしろ標的抗原に優先的に結合することを意味する。「検出可能に特異的に結合する」とは、その標的抗原へのｓｃＦｖ抗体の特異的結合が観察されることを意味し、例えば、限定されないが、ｓｃＦｖ抗体がその標的抗原に結合する細胞内での表現型の変化、又はｓｃＦｖ抗体とその標的抗原との間の相互作用の減少（例えば、ｓｃＦｖ抗体とその標的抗原の細胞内での同時局在化）が挙げられる。
【００５０】
典型的な使用
本明細書に記載のライブラリーは細胞内発現抗体の単離のために最適化されているが、ライブラリーもまた、診断及び治療用途のためにｓｃＦｖを選択することができる。さらに、本発明者らは、発現されたヒト配列を用いてＣＤＲ３多様性を設計したので、ライブラリーに存在するｓｃＦｖは、完全なヒトであり、患者の抗ｓｃＦｖ抗体応答を誘導してはならない。
【００５１】
本明細書に記載のライブラリー、及びそれによって生産される抗体は、機能的な細胞内発現抗体を同定するためだけでなく、多数のバイオテクノロジー及び治療用途において使用され得る高度に発現したｓｃＦｖの単離のためにも有用である。例えば、ライブラリー及びそれによって生産される抗体は、遺伝子送達ストラテジー治療薬、創薬ツール、望ましくない標的分子の凝集を妨げること、ミスフォールドしたタンパク質障害に関連した疾患状態に対抗すること、癌関連の標的に結合し、中和し、その機能を調節することに可憐した使用を有し、限定されないが、それらを含んでもよい。
【００５２】
例えば、本明細書に記載の細胞内発現抗体は、ｓｙｋチロシンキナーゼ、及びアレルギー性障害に関わる他のタンパク質の活性を調節するために使用することができる（例えば、ＷＯ２００５１０６４８１を参照；また、Ｕｌａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００５，９：９０１−９２１も参照。ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）は細胞増殖の主要なメディエーターであり、多くの場合、癌治療における阻害のために標的化される（例えば、Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ ＪＳ ａｎｄ Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｒ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，４：９３７−９４７（２００４）を参照）。他の関心の高い標的は、微小管、及び関連タンパク質である（Ｊｏｒｄａｎ ＭＡ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，４：２５３−２６５（２００４）を参照）。
【００５３】
免疫抗体は、例えばＶｉｌｌａｎｉ，ＭＥら（Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ａ ｓｔａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５８（３）：３０５（２００５））に記載の方法を用いて、作物などの市販用に価値のある植物の疾患を処置又は予防するために使用可能である。
【００５４】
本明細書に記載の細胞内発現抗体は、ヒト又は動物細胞における感染を治療又は予防するために使用することができる。例えば、細胞内発現抗体は、例えば、Ｓｗａｎ，ＣＨ ｅｔ ａｌ，Ｔ−ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ＣＣＲ５ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１４８０−１４９２に記載の方法を用いて、ヒト免疫不全ウイルスによる細胞の感染を治療、改善、又は予防するために使用可能である。
【００５５】
本明細書に記載の細胞内発現抗体は、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，ＴＷら（Ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｉｎｔｒａｂｏｄｙ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ’ｓ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｔｒｉａｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ｄｉｓ．１９：４７−５６（２００５））及びＭｉｌｌｅｒ及びＭｅｓｓｅｒ（Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：３９４−４０１（２００５）に記載される神経障害に関与するタンパク質を標的化するために使用することができる。
【００５６】
本明細書に記載の細胞内発現抗体は、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＢＲ及びＺｈｕ，Ｚ（Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３：１４７３−１４８０（２００６）、並びにＤｏｏｒｂａｒ Ｊ．及びＧｒｉｆｆｉｎ Ｈ．（２００７）Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７（５），６７７−６８９に記載されるような癌タンパク質などの癌に関連したタンパク質を標的化することによって癌治療に使用することができる。
【００５７】
本明細書に記載の細胞内発現抗体は、例えば、Ｆａｎｇ ＣＹら（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥｐｓｔｅｉｎＯ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ５０：２５４−２６３（２００７））に記載の感染原によって発現されたタンパク質を標的化することによって感染（例えば、限定されないが、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）を治療するための使用可能である。
【００５８】
本明細書に記載されるように、細胞内発現抗体は、対象とする細胞内発現抗体をコードする発現ベクターを細胞に投与することによって細胞に投与し得る。細胞内発現抗体の発現に適切な発現ベクターは、当該技術分野において周知である。本明細書に記載の細胞内発現抗体をコードする発現ベクターの投与は、多数の周知なアプローチのいずれか１つ、例えば、限定されないが、単独でのプラスミド又はウイルス発現への核酸の直接的な転移、又は陽イオン性リポソームなどの担体との組み合わせによって達成することができる。このような発現ベクター（発現ベクターが細胞内に導入された場合に操作可能に連結されたコーディング配列を発現するのに適切であるプロモーター及びエンハンサー配列を含む）、このようなベクターの作製、使用、及び細胞への送達する方法は、当該技術分野において周知であり、細胞への細胞内発現抗体を投与するための使用に容易に適合され得る。
【００５９】
ベクターは、細胞に遺伝子を送達するための任意のヌクレオチド構築体であってもよく、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージすることができるレトロウイルスベクターが挙げられる（例えば、Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６を参照）。次に、組換えレトロウイルスを使用して感染させ、それによって、感染した細胞に本発明の核酸を送達することができる。変更した核酸を哺乳動物に導入する正確な方法は、当然に、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。他の技術は、この手法に幅広く利用可能である。例えば、アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：９４１−９４８，１９９４）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４：１４９２−１５００，１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７，１９９６）、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７，１９９６）の使用が挙げられる。また、物理学的な遺伝子導入技術を使用することができ、リポソーム送達、受容体を媒介した他のエンドサイトーシス機構が挙げられる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：４７２−４７８，１９９６を参照）。本発明は、これらの又は他の通常使用される遺伝子導入法のいずれかと組み合わせて使用可能である。トランスフェクションのための適切な手段には、ウイルスベクター、化学的形質転換体、又は物理機械的な方法、例えば、エレクトロポレーション及びＤＮＡの直接的な分散が挙げられ、例えば、ＷｏｌｆＦ，Ｊ．Ａ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載されている。
【００６０】
細胞透過性細胞内発現抗体（トランスボディ）は、ｓｃＦｖ抗体と、例えば、Ｈｅｎｇ，ＢＣ及びＣａｏ，Ｔ（Ｍａｋｉｎｇ ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｔｒａｎｓｂｏｄｙ）ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ（ＰＴＤ）ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｖｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ），Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ６４：１１０５−１１０８（２００５））に記載される方法に従って、細胞透過性抗体が細胞膜を通過し、細胞に入るのを可能にするタンパク質遺伝子導入ドメイン（ＰＴＤ）とを融合することによって細胞に投与可能である。あるいは、ｓｃＦｖは、完全抗体（Ｃｏｕｒｔｅｔｅ Ｊ．，Ｓｉｂｌｅｒ Ａ．Ｐ．，Ｚｅｄｅｒ−Ｌｕｔｚ Ｇ．，Ｄａｌｋａｒａ Ｄ．，Ｚｕｂｅｒ Ｇ．＆Ｗｅｉｓｓ Ｅ．（２００７）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ６ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．６，１７２８−３６）を用いた場合に示されるように、陽イオン性脂質と混合し、効率的に細胞に送達可能である。このような細胞透過性細胞内発現抗体は、細胞培養において（例えば、研究目的で）使用可能であり、研究目的で使用可能である（例えば、感染原を有することが疑われるヒト、動物、又は植物由来の細胞の試料中のウイルス又は微生物を検出することを目的とする）。このような細胞透過性細胞内発現抗体は、特定の標的抗原の活性を調節し、それによって動物における表現型を変更するために研究動物に投与することができる（例えば、限定されないが、全身投与、例えば、研究動物への細胞内発現抗体を静脈内に投与することによる、又は局所投与による）。また、このような細胞透過性細胞内発現抗体は、ヒト又はヒト以外の動物患者に投与し、上述される疾患又は感染を治療又は予防することができる。例えば、細胞透過性細胞内発現抗体は、静脈内、局所、経口、又は他の周知な方法によって投与することができ、当業者に承認される。
【００６１】
大規模な抗体生産のための本ｓｃＦｖ抗体の使用
ｓｃＦｖ抗体クローンは還元条件下でフォールドする抗体をコードするので、本明細書に記載のライブラリーもまた、細胞（例えば、細菌細胞などの原核細胞、又は酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの真核細胞など）内にｓｃＦｖ抗体を発現させることによって大量に生産され得るｓｃＦｖ抗体を同定し、細胞からｓｃＦｖ抗体を単離するために有用である。大量の抗体を精製することが望まれる一本鎖ｓｃＦｖ抗体は、限定されないが、例えば、実験室研究において有用であるｓｃＦｖ抗体が含まれ、医学的診断試験用、市販の診断試験又は他の種類の診断試験用（飲料水又は食物における汚染した微生物を検出するため）、抗体治療用（癌を治療するため、又は抗体が疾患を治療するために使用可能である感染又は他の種類の疾患を治療するため）が挙げられる。
【００６２】
発現したｓｃＦｖ抗体の単離のための抗体ライブラリーが本明細書に提供され、ここで、抗体ライブラリーには、少なくとも約：１０6、５×１０6、１０7、５×１０7、１０8、５×１０8、１０9、１．５×１０9、５×１０9、１０10、５×１０10、１０11、５×１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、又は１０16個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含み、ここで、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、又はそれを超えるｓｃＦｖ抗体クローンは、細胞内で発現することができ、ＯＤ６００ｎｍが約５となるまで増殖させたフラスコ内の細胞１リットルあたり、少なくとも５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、又は５０ｍｇを超えるレベルで可溶性抗体を生産する。
【００６３】
細胞由来の発現したｓｃＦｖ抗体などのタンパク質を発現及び精製するための多くの十分に許容されるアプローチがあり、当業者は、ｓｃＦｖ抗体を発現及び精製する細胞発現系の最も適切なタイプをどのように選択するのかを理解する。タンパク質発現のための方法を記載する多くのマニュアルが当該技術分野において周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００６を参照されたい。
【００６４】
定義
「固有の配列」とは、ｓｃＦｖ抗体クローンの回収の中で、ｓｃＦｖ抗体クローンの回収に含まれる他のクローンのＣＤＲ３配列とは異なるＣＤＲ３配列を含む少なくとも１０6個のクローンが存在することを意味する。ｓｃＦｖ抗体クローン又はこのようなクローンのライブラリーに関して、「固有の配列」は、ｓｃＦｖ１３Ｒ４内の対応する位置に存在する配列とは異なっている。
【００６５】
用語「抗体フラグメント」及び「フレーム配列」とは、ｓｃＦｖ抗体クローンの任意の固有でない位置、例えば、固有のＣＤＲ３ ＶＨ領域及び／又は固有のＣＤＲ３ ＶＬ領域でないｓｃＦｖ抗体の任意の位置を意味する。本明細書において言及されるように、抗体フレーム又はフレームワーク配列は、本ライブラリーが基礎とする親ｓｃＦｖクローンであるｓｃＦｖ１３Ｒ４のものである。
【００６６】
「実質的に同一」とは、比較される２以上のアミノ酸配列が、少なくとも９８％、９８．５％、９９％、又は９９．５％同一であるか、あるいは比較される２以上の核酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸残基は、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％同一であるアミノ酸配列をコードすることを意味する。
【００６７】
「共通配列」は、ｓｃＦｖクローンの間で共有するヌクレオチド又はアミノ酸配列を意味する。
【００６８】
「ｓｃＦｖ抗体クローン」とは、ＶＨ ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ ＣＤＲ３ドメイン内、又はＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ３ドメイン内の固有の配列を含むｓｃＦｖ抗体の個々の種をコードする核酸分子を意味する。
【００６９】
「標的抗原」とは、標的抗原ではない別の抗原への特定抗体の結合と比較して、特定の抗体によって優先的に結合される抗原を意味する。
【００７０】
「特異的に結合する」とは、抗体が、他の抗原に対する抗体の結合と比較して、特定の標的抗原に強力にかつ優先的に結合することを意味する。
【００７１】
「異所的に発現される」とは、対象とする抗原の発現が特定種の細胞内に自然には発現しないことを意味し、この場合、抗体が発現し、即ち、抗体が、細胞内に発現される。これは、抗体をコードする発現構築物は、細胞内に導入されている。
【００７２】
「単離された」又は「精製された」とは、ｓｃＦＶ抗体が、生成された細胞内の他の生物学的成分とは実質的に分離され、そこから分離して生成され、又はそこから分離して精製され、即ち、他の細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質などの他の細胞成分とは実質的に分離されていることを意味する。用語「単離された」又は「精製された」は、完全な精製を必要としない；むしろ、相対的な用語として意図される。好ましくは、ｓｃＦｖ抗体は、他の細胞成分とは分離された精製されるか又は単離され、その結果、ｓｃＦｖ抗体は、ｓｃＦｖ抗体調製物の全含有量の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれを超えて示される。
【００７３】
「可溶性」抗体は、抗体分子が凝集形態ではないことを意味する。可溶性抗体は、その標的抗原に特異的に結合する能力を有する。
【００７４】
「実質的に可溶性」とは、本明細書に記載される少なくとも２０％、例えば、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれを超えるｓｃＦｖ抗体が適切にフォールドされ、したがって、その標的抗原に特異的に結合することができる。
【実施例】
【００７５】
実施例１：細胞内発現のために最適化されたｓｃＦｖライブラリーの構築
材料
細菌株、化合物及び酵素
ＬＢ及び２×ＹＴ培地は、前述される（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９９２）。菌株Ｃ−Ｍａｘ５Ｆ’（Ｂｉｏ−ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、大腸菌Ｋ−１２，［Ｆ’ｌａｃｆq Ｔｎ１０］ψ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５デルタ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒk-ｍk+）ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１である。ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ ＃５３３３８）は、大腸菌Ｋ−１２、Ｆ−λ−ｈｓｄＲ２ ｈｓｄＭ＋ ｈｓｄＳ＋ ｍｃｒＡ ｍｃｒＢ１ ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９６Δ（ｌａｃＩＰＯＺＹ）Ｘ７４ ｇａｌＥ１５ ｇａｌＵ ｇａｌＫｌ６ ｒｐｓＬ ｔｈｉである。非サプレッサー菌株ＨＢ２１５１は、大腸菌Ｋ−１２［Ｆ’ｐｒｏＡ+Ｂ+ ｌａｃｌq ｌａｃＺΔＭ１５］ａｒａΔ（ｌａｃ−ｐｒｏ）ｔｈｉである。化合物はＳｉｇｍａから購入した。制限酵素及びクローニングされたＴａｑポリメラーゼはＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入した。ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、それぞれＱｉａｇｅｎ及びＰｒｏｍｅｇａから購入した。プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ及びアガロース分離したＤＮＡは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎキットを用いて精製した。
【００７６】
オリゴヌクレオチド
変性ＣＤＲ３ループを導入するために使用される１８個のスパイクされたオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＢＡ ＧｍｂＨ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＳ）を用いて精製した。１８個のスパイクされたオリゴヌクレオチドの配列は下記の通りである。Ｈ３ ｎ＝ｎ個のアミノ酸の長さＶＨ ＣＤＲ３ループ；Ｋ３ ｎ＝ｎ個のアミノ酸の長さＶＬカッパ（κ）ＣＤＲ３ループ；Ｌ３ ｎ＝ｎ個のアミノ酸の長さＶＬラムダ（λ）ＣＤＲ３ループ。変性位置に関して、４塩基の割合は、Ｎ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）として与えられる。各スパイクされた（変性された）位置で使用される各ヌクレオチドの割合は、下記の表１に示されている。
【００７７】
【化１】
【００７８】
【化２】
【００７９】
【化３】
【００８０】
表１．
＊変性した位置に関して、４塩基の割合はＮ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）として与えられる。
【００８１】
【化４】
【００８２】
【化５】
【００８３】
【化６】
【００８４】
【化７】
【００８５】
【化８】
【００８６】
ライブラリーを構築するために使用される他のオリゴヌクレオチドは、ＭＷＧによって合成され、下記の配列を有する：
【００８７】
【化９】
【００８８】
プラスミド
ファージミドベクターＰｈａｇｅｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＮＴＡＢ６（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９４，４７：１５７−１７１）は、線状ファージＭ１３のマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−ｓｃＦｖフラグメントのＮ末端融合のために使用された。このファージミドは、ｐＵＣ１１９由来であり、下記の順番で下記の配列を含む：ｌａｃプロモーター、ｐｅｌＢリーダー配列、ｓｃＦｖクローニングのためのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位、９Ｅ１０モノクローナル抗体によって認識されるＨｉｓ６及びｃ−ｍｙｃタグ、アンバーコドン及びｐＩＩＩ遺伝子配列。
【００８９】
大腸菌におけるｓｃＦｖの細胞質発現のために、本発明者らは、プラスミドｐＥＴ２３ＮＮを使用した。このプラスミドは、ｐＥＴ２３ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）由来であり、Ｔ７プロモーター、その後、ＡＴＧ開始を含むＮｃｏＩ部位、ＮｏｔＩ部位、その後、ｃ−ｍｙｃ及びＨｉｓ６タグを含む。
【００９０】
プラスミドｐｓｃＦｖ ＣＡＴはｐＴｒｃ９９Ａ由来であり、ｔａｃプロモーター、その後、フレーム外のｓｃＦｖのＡＴＧ開始を含むＮｃｏＩ部位、ＮｏｔＩ部位、その後のＣＡＴ遺伝子を含む。ｓｃＦｖがＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ部位内に挿入されると、ｓｃＦｖは、ＣＡＴタンパク質との融合体として発現される。構築は下記の通り行った：第１に、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ａ１３０３８）の固有のＢｓｔＥＩＩ部位は、消化、その後、平滑末端を形成するための５’突出の埋め、連結によって除去される。得られるプラスミドは、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩにより消化され、４２１０ｂｐのフラグメントが精製された（フラグメントＩ）。第２に、ＣＡＴ遺伝子内に位置したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｘ０６４０４３）は、部位特異的突然変異によって除去され、ＡＣＣのＴｈｒ１７２からＡＣＧに変更した。次に、ＣＡＴ遺伝子はＣＡＴ−ＮｏｔＩ．ｆｏｒ（ＴＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧ；配列番号２８）及びＣＡＴ−ＨｉｎｄＩＩＩ．ｂａｃｋ（ＡＣＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣ；配列番号２９）を用いたＰＣＲによって増幅させた。オリゴヌクレオチド配列では、導入された制限部位に下線を引き、ＣＡＴ遺伝子の開始及び終止をボールド・イタリックとした。６６０ｂｐのＰＣＲフラグメントは、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、精製した（フラグメントＩＩ）。第３に、７５０ｂｐのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ ｓｃＦｖ１３Ｅ６フラグメント（抗Ｅ６モノクローナル抗体のＣＤＲループを含むｓｃＦｖ１３Ｒ４のグラフトされたバージョン。Ｐｈｉｌｉｂｅｒｔらにより公開）を精製した（フラグメントＩＩＩ）。第４に、３つのフラグメントＩ、ＩＩ及びＩＩＩを連結し、プラスミドｐｓｃＦｖＣＡＴを得た。最後に、１６５ｂｐの内部欠失は、この遺伝子の２つのＰｓｔＩ部位の間のフラグメントを除去することによってｓｃＦｖに導入された。得られたプラスミドは、ｐｓｃＦｖＣＡＴと呼ばれ、ＡｍｐR及びＣＡＭSである。これは、ＰｓｔＩフラグメントの欠失は、ｓｃＦｖにおけるフレームシフトをもたらすためである。
【００９１】
プラスミドｐ５１３−ＥＧＦＰは、ｐＳＧ５の誘導体（Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８８，１６：３６９）、ＳＶ４０初期プロモーターの調節下で、ＥＧＦＰコーディング領域（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を囲む。ｐ５１３−ｓｃＦｖ−ＥＧＦＰ構築物は、１０残基のリンカーを有するｓｃＦｖ及びＥＧＦＰコーディング領域コーディング領域のフレーム融合体に対応する。
【００９２】
ｓｃＦｖコーディング領域はオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣ（配列番号３０）及び５’−ＴＴＧＡＴＴＡＣＴＡＧＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣ（配列番号３１）を用いて増幅させ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩ消化したｐ５１ ３−ＥＧＦＰベクターに挿入した。
【００９３】
最適化された抗体フレームワーク
ｓｃＦＶライブラリーの効果を最大限にするために、ライブラリーの構築は、細胞内発現抗体の選択のための単一の最適化された抗体フレームワークの選択から開始した。分子進化を通じて、ｓｃＦｖ１３Ｒ４と呼ばれるヒトｓｃＦｖを得て、それは、大腸菌の細胞質に高レベルで発現する。また、このｓｃＦｖが発現し、酵母及び哺乳動物細胞の両方において可溶性であり活性な構造を有する。このｓｃＦｖは、インビトロでは非常に安定であり、還元剤の存在下において復元することができる。さらに、そのフォールディングの分析は、親ｓｃＦｖよりも速くフォールディングし、インビトロではよりゆっくりと凝集することを示す。単離された変異体は、主に、ＶＨドメインに局在化し、この特定のｓｃＦｖに非常に特異的であるように見え、それは、それらが非常に相同なＶＨドメインに転移することができないためである。ｓｃＦｖ１３Ｒ４のヌクレオチド及びアミノ酸配列を下記に示す。
【００９４】
【化１０】
【００９５】
方法
ＣＤＲ３配列のデータベース
ＫａｂａｔデータベースのＲｅｌｅａｓｅ ５（１９９２年８月）を用い（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，及びＷｕ，Ｔ．Ｔ．：Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：３０ ｙｅａｒｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００，２８：２１４−２１８）。このデータセットには４４９９０配列が含まれる。第１に、４６４３個のヒトＶＨ配列は、偽遺伝子ではなく、ヒト化されておらず、抽出された。次に、Ｈ３配列は、このデータセットから抽出され、最初に、存在する場合にはヌクレオチド配列を考慮し、次にアミノ酸を考慮する。最後に、僅か２０個の標準のアミノ酸を含む３４６９個の完全なＨ３配列が、２７０３個が固有である中で維持された。同じ手法は、それぞれλ及びκ軽鎖のために行われ、７７５個及び８２８個が固有である１０４４及び１２９１個の配列をもたらした。
【００９６】
２００３年１１月２７日に既存のＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢデータベースからのＣＤＲ３配列も抽出された（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ，ｔｈｅ ＩＭＧＴ（Ｒ） ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００６，３４：Ｄ７８１−７８４）。「生産的／標準の／ヒト／ｃＤＮＡ＋ＲＮＡ／再配列された」遺伝子が考慮された。５１９Ｈ３、１４３２Ｋ３、及び１１３１Ｌ３配列が得られ、そのうち、４３２３Ｈ３、９７４Ｋ３、及び８１２Ｌ３配列は固有であった。
【００９７】
また、１２７個の追加のヒト抗体配列は、タンパク質データベース（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００，２８：２３５−２４２．）から回収した。この目的で、本発明者らは、２００３年８月１９日にＡｎｄｒｅｗ Ｍａｒｔｉｎによって既にコンパイルされた５１０個の配列のファイルを使用した（Ａｌｌｃｏｒｎ，Ｌ．Ｃ．及びＭａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．ＳＡＣＳ−ｓｅｌｆ−ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００２，１８：１７５−１８１）。
【００９８】
スパイクされたオリゴヌクレオチド設計
アミノ酸の表示を偏らせることにおいて、３つのコドン位置の各々でのヌクレオチドの最適化された混合物が前述のように設計された（Ｗａｎｇ，Ｗ．，及びＳａｖｅｎ，Ｊ．Ｇ．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００２，３０：ｅｌ２０；Ｐａｒｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ ２００５，２９：４０７−４２１）。タンパク質配列の未成熟終了は、停止コドンを実現する可能性に上界の０．０５を課すことによって制限された。アミノ酸の所望の可能性を十分に回収しなかった３４個の位置については、第２の最適化が同じ方法でなされたが、停止コドン頻度に制限を課さなかった。オリゴヌクレオチド合成に関して、計算された頻度は、下記の通り、５％増加の範囲内であった：０％〜５％の間の全ての頻度は、５％の概数で表された；他の頻度は、最も近似の５％の概数で表された；得られた合計が１００％を超える場合、５％は、５％を超える概数で表されたアミノ酸頻度から除去され、概数で表された頻度と標的頻度との間の相違は最大であり、合計まで累次積分されたプロセスは１００％であった；この合計が１００％を下回る場合、５％は、９５％を下回る概数で表された頻度に添加され、概数で表された頻度と標的頻度との間の相違は最大となり、合計まで累次積分されたプロセスは１００％であった。
【００９９】
ＶＨ及びＶＬライブラリーの構築
可変ＣＤＲ３配列は、鋳型プラスミドｐＡＢ１−ｓｃＦｖ１３Ｒ４ｐ（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｐ．，及びＢｅｔｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９９，２９２：９２１−９２９．）を用いたホットスタートプルーフリーディングポリメラーゼ（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ，Ｑｉａｇｅｎ）によりＰＣＲアセンブリによってｓｃＦｖ１３Ｒ４に導入された。ランダムＨ３ループを導入するために、ランダムＨ３配列を有する５’の遺伝子が、オリゴヌクレオチドＭ１３ｒｅｖ−４９及び１３個の変性オリゴヌクレオチドの１つを用いて得られ、３’は、ＰｌｉａｉｓｏｎＨ３及びＭ１３ｕｎｉ−４３（５５℃で２０サイクルについて）で得られた。このようにして、２つの精製されたバンドは、Ｍ１３ｒｅｖ−４９及びＭ１３ｕｎｉ−４３を用いたＰＣＲ（３０サイクル、５５℃）によってアセンブリされた。得られたＰＣＲは、市販のキット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製され、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ酵素を用いて１６時間、３７℃で設計され、次にゲル上で精製された。同じ手法は、使用されたプライマー対が５’端についてはＭ１３ｒｅｖ−４９／ＰｌｉａｉｓｏｎＬ３であり、その遺伝子の３’部分については、Ｍ１３ｕｎｉ−４３を含むＬ３／Ｋ３ループ（Ｋ３ ｎ又はＬ３ ｎ）をコードする変性オリゴヌクレオチドの１つであることを除いては、ランダムＬ３及びＫ３ループを導入するために行われた。
【０１００】
各々の消化されたバンドは、１００μｌの１μｇのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ消化され、精製されたｐｓｃＦｖΔＣＡＴに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの１０Ｗｅｉｓｓ単位を用いて１６時間、１６℃で連結された。連結は、熱処理による不活性化され、市販のキット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ）を用いて精製された。次に、連結は、３００μｌのＭＣ１０６１コンピーテント細胞（Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０００，３２８：３３３−３６３）に電気泳動され、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢの６００ｃｍ2の正方形プレート上に撒かれ、次に１６時間３℃でインキュベートした。１８個のライブラリー（１３ＢＨ及び５ＶＬ）は、１０％グリセロールを含む１０ｍｌのＬＢに播種され、１０9個の細菌は、即座に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧ及び３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含むＬＢの６００ｃｍ2の正方形プレート上に撒かれ、１６時間３７℃でインキュベートされた。その後、ライブラリーは、１０％グリセロールを含む１０ｍｌのＬＢに播種され、−８０℃で凍結された。アリコートを用いて、ライブラリーアセンブリーのためにＤＮＡを調製した。
【０１０１】
ライブラリーアセンブリー
１３個のＶＨライブラリーは、Ｐｆｕポリメラーゼ及びプライマーＭ１３ｒｅｖ−４９／ＰｌｉａｉｓｏｎＨ３．ｂａｃｋを用いて増幅させ、５ＶＬライブラリーは、ｓｃＦｖＣＡＴ．ｒｅｖ／Ｈ３ Ｌｉａｉｓｏｎを用いて増幅させた（３０サイクル、５５℃）。１８個のＰＣＲバンドを最初に精製し、次に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてゲル上で注意深く定量した。１３個のＶＨライブラリーは、ヒトＨ３におけるそれらの頻度に比例した量でプールされた。このミックスは、ＶＨプールと呼ばれた。２個のＶＬκバンドは、７５％の９アミノ酸長のループ、２５％の１０アミノ酸長のループを得るためにプールされた。ＶＬλバンドは、３０％の９アミノ酸長のループ、３０％の１０アミノ酸長のループ、４０％の１１アミノ酸長のループを得るためにプールされた。最後に、κ及びλミックスは、ＶＬプールと呼ばれる最終のミックスに各クラスの５０％を得るためにプールされた。
【０１０２】
ＶＨプール及びＶＬプールは、５００μｌ中で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＭ１３ｒｅｖ−４９／ｓｃＦｖＣＡＴ２．ｒｅｖを用いたＰＣＲによってアセンブリされた（３０サイクル、５５℃）。ＰＣＲは、少なくとも各々６時間、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩの２０ユニットを用いて首尾よく消化し、精製し、その後、ゲル上で定量した。５０μｇのベクターｐＣＡＮＴＡＢ６は、各々少なくとも６時間、８０ユニットのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで首尾よく消化され、精製され、次に、ゲル上で定量された。５μｇの直線化されたｐＣＡＮＴＡＢ６は、５０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で５００μｌにおいて、等モル量のインサート（０．８４μｇ）と連結された。連結は熱により不活性化され、市販のキット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ）を用いて精製された。次に、精製された連結は、１０×３００μｌのＣ−Ｍａｘ５αＦ’コンピーテント細胞においてエレクトロポレートされ（Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０００，３２８：３３３−３６３）、１％のグルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢの１０個の６００ｃｍ2の正方形プレート上に播種された。１６時間３７℃でのインキュベーション後、細胞は、１０％グリセロールを含む２×ＹＴに集められ、２０倍の多様性に対応するアリコートにおいて−８０℃で凍結維持された。
【０１０３】
抗原
Ａｕｒｏｒａ−Ａは、Ｈｉｓタグ化されたタンパク質であり、大腸菌で生産された。ＧＳＴ：Ｓｙｋは、大腸菌で発現させた（Ｄａｕｖｉｌｌｉｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｓｙｋ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｆｃ ｅｐｓｉｌｏｎ ＲＩ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ＲＢＬ−２Ｈ３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２ １６９：２２７４ ２２８３）。パピローマウイルスＨＰＢ１６由来のＥ６タンパク質は、シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑら、公開）において発現された。ヒストン（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３及びＨ４のミックス）をＳｉｇｍａ（タイプＩＩ−ＡＳ、＃Ｈ７７５５）から購入した。チューブリンをブタ脳から精製した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｃ．Ｊ．，及びＬｅｅ，Ｊ．Ｃ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｕｌｉｎ ｆｒｏｍ ｂｒａｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８２，８５（Ｐｔ Ｂ）：３７６−３８５）。
【０１０４】
ライブラリー救出及び選択
ライブラリー救出は、トリプトン感受性ヘルパーファージを用いて、基本的には、前述されるように行った（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．，及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ １９９８，３：３２１−３２８）。要約すると、１０〜２０倍過剰である多様性（２〜３×１０10個の細菌）に対応するライブラリーのアリコートは、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％グルコースを含む１０００ｍｌの２×ＹＴに撒かれ、ＯＤ６００nmが０．７になるまで３７℃で振とうしながら増殖させた。２００ｍｌ（約３×１０10細胞）は５×１０１１ヘルパーファージＫＭ１３（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．，及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．ＦｏｌｄＤｅｓ １９９８，３：３２１−３２８）で感染され、振とうなしに３０分間３７℃でインキュベートされた。細胞をペレットにし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１０００ｍｌの２×ＹＴに再懸濁させ、激しく振とうしながら３０℃で一晩インキュベートされた。ファージを含む上清は、５分の１量のＰＥＧ−８０００ ２０％、ＮａＣｌ ２．５Ｍを添加することによって沈殿させ、１５％グリセロールを補足されたＰＢＳに再懸濁させた。１０11〜１０12のファージを含むアリコートを−８０℃で保存した。
【０１０５】
結合剤の選択のために、１００μｌの精製抗原が、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルプレートにコートされた。第１ラウンドでは、１０〜１００μｇ／ｍｌの抗原濃度を使用した。その後のラウンドについては、１〜１０μｇ／ｍｌの抗原濃度を使用した。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を用いてプレートを３回洗浄し、２％脂肪を含まないミルク（ＭＢＰＳ）を用いて２時間室温で飽和した。１０11〜１０12のファージが、２％ＭＰＢＤＳでウェルあたりに添加され、２時間室温でインキュベートされた。プレートをＰＢＳＴで２０回（第１ラウンド）又は４０回（第２及び第３ラウンド）洗浄し、次にＰＢＳで３回洗浄した。過剰なＰＢＳを除去し、ファージは、１０分間室温で、１００μｌの１００ｍＭトリエチルアミンの添加によって溶出された。溶出されたファージ懸濁液は、５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４を用いて中和され、次に、１．５μｌの０．１Ｍ ＣａＣｌ2、１５μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理したトリプシン（Ｓｉｇｍａ）の添加によって、トリプシンで１５分間室温で消化された。２×ＹＴ中の３７℃で指数関数的に増殖しているＣｍａｘ５αＦ’菌株の１ｍｌに４０μｌのトリプシン処理したファージを感染させ、振とうせずに３０分間、３７℃でインキュベートし、次に、１５ｃｍの丸いペトリ皿上に播種した（ＬＢ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコース）。３７℃で一晩インキュベーション後、プレートから細菌を回収し、ＫＭ１３ヘルパーファージを用いたファージの新しいストックを調製するために用いた。このストックの１０11〜１０12のファージを次の選択のためのラウンドに使用した。
【０１０６】
ペリプラスム及び細胞質スクリーニング
ペリプラスムスクリーニングに関して、ラウンド３のファージを用いて、非サプレッシブ菌株ＨＢ２１５１に感染させた。個々のクローンは、（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９９６，２６７：８３−１０９）に記載されるように、抗原をコートした９６ウェルのマイクロタイタープレートによってｓｃＦｖ発現について試験された。細胞質スクリーニングに関して、プラスミドは、第２又は第３の選択ラウンドの細菌プールから調製し、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、７５０ｂｐバンドが、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ消化され、脱リン酸化されたプラスミドｐＥＴ２３ＮＮにクローニングされた。連結は、Ｃ−Ｍａｘ５αＦ’に形質転換され、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢに細胞を蒔き、１６時間３７℃でインキュベートした。細胞を回収し、プラスミドＤＮＡを調製し、これを用いて化学的にコンピーテントなＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した。個々のクローンは、１００μｌの２×ＹＴ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む９６ウェルマイクロタイタープレート中で激しく振とうしながら、３７℃で、ＯＤ６００nmが０．６に到達するまで増殖させた。ＩＰＴＧを最終０．４ｍＭまで添加し、マイクロタイタープレートを湿気雰囲気下で激しく振とうしながら、２４〜３０℃で１６時間インキュベートした。遠心分離後、細胞を１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、凍結／融解し、氷上で１時間インキュベートした。ＭｇＣｌ2を最大１０ｍＭ添加し、ＤＮＡを１０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩで消化した。５〜２０μｌは、抗原をコートした９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ）上でＥＬＩＳＡに使用された。暴露は、９Ｅ１０モノクローナル抗体、その後、ＨＲＰ結合させた抗マウスＩｇＧ抗体を用いて行われた。
【０１０７】
ｓｃＦｖの精製
プラスミドｐＥＴ２３ＮＮにクローニングされたｓｃＦｖは、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの細胞質から精製され、親ｓｃＦｖ１３Ｒ４（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９８，２８０：１１７−１２７）について記載されるように、Ｎｉ−ＮＴＡカラムで精製した。
【０１０８】
細胞トランスフェクション及び免疫蛍光
ＨｅＬａ細胞は、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）及び１０％熱不活性化したウシ胎児血清を補足したダルベッコ変法イーグル組織培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃、湿度５％、ＣＯ2雰囲気下で維持した。一時的なトランスフェクションは、製造業者の使用説明書に従ってＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ脂質試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。トランスフェクションの前日に、６ウェルプレートのカバースリップ上に２．５×１０5細胞／ウェルで細胞を播種した。１μｇのＤＡＮ、１００μｌのＤＭＥＭに希釈した２μｌの試薬を混合し、室温で２０分間放置した。混合物を添加してから２４時間、３７℃で細胞を増殖させた。発現されたＧＦＰタグ化したタンパク質は４５分間室温で、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いてトランスフェクトした細胞の固定後に視覚化された。ＰＢＳで過剰に洗浄後、細胞を死滅させ、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）でマウントした。処置された細胞は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ５０カメラを搭載したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡を用いて試験した。Ｚｅｉｓｓ４０×ｐｌａｎ−ｎｅｏｆｌｕａｒ対物で画像を回収し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ５．５を用いて加工した。図８に関して、ＨｅＬａは、ｄｓＲｅｄモノマーＧＦＰに融合した抗ヒストンクローン５でトランスフェクトされ、上述されるように固定され、Ｔｒｉｔｏ Ｘ−１００（０．２％、５分）で透過された。微小管ネットワークは、９Ｅ１０抗ｍｙｃ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、３μｇ／ｍｌで２Ｆ１２Ｃ ｓｃＦｖ（表３）を用いて示された。細胞は、共焦点顕微鏡によって観察された（×６３）。
【０１０９】
結果
工程１：抗体フレームワークの選択
ｓｃＦｖライブラリーの有効性を最大限にするために、ライブラリーの構築は、細胞内発現抗体の選択のために単一の最適化された抗体フレームワークの選択から開始した。分子進化を通じて、ｓｃＦｖ１３Ｒ４と呼ばれるヒトｓｃＦｖを得て、これは、大腸菌の細胞質に高レベルで発現する。また、このｓｃＦｖは、酵母及び哺乳動物細胞において発現され、可溶性及び安定な構造を有する。このｓｃＦｖは、インビトロでは非常に安定であり、還元剤の存在下で復元可能である。さらに、そのフォールディング動力学の分析は、それが親ｓｃＦｖよりも速くフォールディングし、インビトロではよりゆっくりと凝集することを示した。単離された突然変異体は、主にＶＨドメインに局在化し、この特定のｓｃＦｖに非常に特異的であるようである。ｓｃＦｖ１３Ｒ４のヌクレオチド及びアミノ酸配列を下記に示す。
【０１１０】
工程２：ＣＤＲ３配列への多様性の導入
ａ）ヒトＣＤｒ３配列のデータベース
ヒトＣＤＲ３配列は、３つの主要な供給源からコンパイルされた：Ｋａｂａｔデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．及びＷｕ，Ｔ．Ｔ．Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：３０ ｙｅａｒｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００，２８：２１４−２１８）、ＩＭＧＴデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ，ｔｈｅ ＩＭＧＴ（Ｒ）ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００６，３４：Ｄ７８１−７８４）、及びＲＣＳＢ ＰＤＢ（Ｂｅｒｍａｎ， ＨＭ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００，２８：２３５−２４２）。二重を取り出した後、データベースは、５１７９Ｈ３、１４３２Ｋ３、及び１１３１Ｌ３ＣＤＲ３固有の配列を含んでいた。大部分のＨ３配列は固有であることを気付くことができ、それは、例えば、Ｋａｂａｔデータベースでは、２３６８Ｈ３配列（８８％）は、２７０３の完全なＨ３配列のうちのただ一度であったためである。結果は、Ｌ３及びＫ３の場合において同等であり、それは、それぞれ８７％及び８２％の配列がＫａｂａｔデータベースにおいて固有であったためである。これは、ヒトＣＤＲ３配列の非常に高い可変性を強調する。
【０１１１】
しかしながら、この可変性は、ループにおいて均一に分布されておらず、各アミノ酸の頻度は、各ループに対して、１つの位置から別の位置へと変化する。さらに、アミノ酸分布は、抗体配列の起源に依存する。この偏りは、例えば、終わりから３番目の残基の場合として構造的制約に起因する可能性があり、それは、しばしば、アスパラギン酸塩（Ｋａｂａｔ番号付けスキームを用いるとＤ１０１）であり、Ｈ３の拡張した構造と屈折した構造との間のスイッチにおいて重要な役割を果たす。他の場合には、このバイアスは、Ｄ及びＪセグメントに対して利用可能な配列の制限された数に起因するだけであってもよく、天然の抗体に見出されたもの以外のアミノ酸が容認されてもよい。
【０１１２】
ライブラリーの構築に関して、天然の分布を模倣するＣＤＲ３を作製することが決定され、それには２つの主な理由がある：ｉ）１つの目的は、ヒトの治療における可能な使用に対してできるだけヒトとなるようにｓｃＦｖを生じさせることである；ｉｉ）天然のアミノ酸分布を維持することが機能的抗体をより可能にもたらす。
【０１１３】
データベースからのＣＤＲ３配列は、長さによって整列され、各位置での各々の２０個の可能なアミノ酸の頻度、各ループ長の頻度を計算した。軽鎖ＣＤＲ３の場合には、配列は、各クラスについて独立して分析された。Ｈ３配列の場合には、これは、結果として３５個の表に示され、１と３４とのアミノ酸の間の各Ｈ３長さについての１つである。長さｎのループに関しては、この表は２０ｎ頻度を含んでいた。
【０１１４】
ｂ）ＣＤＲ３ループをコードするためのオリゴヌクレオチド設計
１８個のオリゴヌクレオチドは、コンパイルされたＣＤＲ３データベースに見出されたアミノ酸分布に従うように設計された。コドンの各位置での４つのヌクレオチドの１９２個の最適化されたミックスを用いて、所望のアミノ酸分布を用いてできるだけ十分に合致させた。このアプローチの腫瘍な利点は、より良好なオリゴヌクレオチドの質をもたらす伝統的なオリゴヌクレオチド合成を必要とするだけであるということである。しかしながら、遺伝コードの制限のために、任意のアミノ酸分布を正確に従うことができない。さらに、ライブラリーは天然のアミノ酸分布を厳格に従わない場合、これは、ＣＤＲ３ループにおける対象とする非天然の多様性を誘導する場合がある。
【０１１５】
２４９個の可変位置について最適化されたミックスを最初に計算し、終止コドンの最少頻度とこの分布を合致させ、次に、標的分布とは非常に離れ過ぎている３４個の位置は、この最後の制限を緩和することによってさらに最適化された。遺伝コードの制限のために、ある位置は、完全には最適化されなかった。例えば、位置３では、アラニン及びグリシンは、本発明者らのミックスにおいて表されないままであり、他のアミノ酸頻度と合致させるために、天然には見出されない、システイン様のいくつかのアミノ酸の実質的な量を誘導することが必要であった。しかしながら、データベースとオリゴヌクレオチドをコードした頻度との間には良好な全体の承知があり、これは、大部分のよく見られるアミノ酸がライブラリーにおいて最大の比率で示され、まれなアミノ酸は、通常、低い頻度で存在していた。ＣＤＲ３ループを構築するために使用された１８個の変性オリゴヌクレオチドの配列は、上記で提供される。
【０１１６】
ｃ）ＶＨ及びＶＬ鎖のためのＣＤＲ３ループライブラリーの構築
各ＣＤＲ３ループ長についての独立したライブラリーを構築した。これは、重鎖及び２種の軽鎖の各々について独立してなされた。各ライブラリーに関して、ランダムＣＤＲ３ループは、ＰＣＲによって導入され、次に、得られたライブラリーは、ｓｃＦｖ１３Ｒ遺伝子に戻ってクローニングされ、それは、ベクターｐｓｃＦｖＣＡＴのＣＡＴ遺伝子に融合された。これは、１つ及びただ１つの無作為化されたＣＤＲ３ループを有するｓｃＦｖ１３Ｒ４クローンのライブラリーをもたらした。
【０１１７】
５アミノ酸長のＨ３ループライブラリーを最初に構築した。４３個の無作為に選択されたクローンを配列決定した。いくつかの位置は、２０アミノ酸についての頻度の期待された値と異なるが、平均して、ライブラリーにおけるアミノ酸の分布は期待された分布と合致していた。これは、オリゴヌクレオチドの質が良好であり、得られたライブラリーがヒトＨ３ループにおけるアミノ酸の天然の分布に従っていたことを示した。
【０１１８】
【化１１】
【０１１９】
aＣＡＴとの融合としてクローニングされ、アンピシリン上で選択されたライブラリーの最初の多様性。これは、形質転換後に得られたクローン数である。
b形質転換からの１２〜２０クローンがＣＡＭプレート上で検査された。プレートは、１６時間３７℃でインキュベートされ、コロニーサイズを推定した。カラム＋＋、＋及び−は、それぞれ、正常に増殖され、小さなコロニーを提供し、全く成長しなかったコロニーの分画を示す。
cＣＡＭ上で選択されたライブラリーの多様性。多様性は、最後の多様性が（最初の多様性）×（ＣＡＭ表現型＋＋）に近いことを想定することによって、カラム「最初の多様性」及び「ＣＡＭ表現型」あら推定される。現実の多様性はより高いかもしれないが、これは、カラム「ＣＡＭ表現型」において＋で記されたクローンのいくつかが低い量で存在していたかもしれないためである。
【０１２０】
工程３：発現しない配列の除去
期待されるように、ＶＨ及びＶＬライブラリーの構築から形成されたクローンの全てが、３つの主要な理由のために本質的であったわけではない：ｉ）多様性を導入するために使用されたオリゴヌクレオチドは終止コドンを含む場合がある；ｉｉ）終止コドン又はフレームシフトはＰＣＲ及びクローン工程によって導入されてもよい；又は（ｉｉｉ）ｓｃＦｖは細胞質ではあまり発現しない。これらの機能的ではないｓｃＦｖクローンを除去するために、発現したクローンは、下記に記載されるようなＭａｘｗｅｌｌ ＫＬら（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １９９９；８：１９０８−１９１１）の方法を用いて、ｓｃＦｖ遺伝子とクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素とを誘導させることによって選択された。
【０１２１】
ｓｃＦＶ−ＣＡＴ融合タンパク質の創作
要約すると、ｓｃＦｖライブラリーは、ｔａｃプロモーターの調節下でベクターｐｓｃＦｖ−ＣＡＴのＮｃｏＩとＮｏｔＩ部位との間で独立して、下流の遺伝子とフレームを合わせてクローニングされた。したがって、ｓｃＦｖ−ＣＡＴ融合タンパク質は細胞質で発現した。ｓｃＦｖが終止コドンの封入又はフレームシフト変異のために適切に発現されない場合、あるいは細胞質でフォールディングができない場合、得られたｓｃＦｖ−ＣＡＴタンパク質は、発現されないか又は活性でなく、その結果としてクロラムフェニコール感受性（ＣＡＭS）表現型となる。他方、ｓｃＦｖが適切に発現されると、得られるｓｃＦｖ−ＣＡＴタンパク質は、細胞質で十分に発現され、細菌は、クロラムフェニコール耐性（ＣＡＭR）となる。クロラムフェニコール（ＣＡＭ）濃度を調整することによって、異なる可溶性レベルのｓｃＦｖ−ＣＡＴタンパク質の発現を選択さえ可能となる。
【０１２２】
異なるＣＡＭ濃度は、１５〜２００μｇ／ｍｌの範囲のこの選択工程について試験した。最高濃度のＣＡＭでは、ライブラリーは、十分に発現したｓｃＦｖに富んでいた。また、ｓｃＦｖ遺伝子の部分的又は完全な欠失を有する組換えファージミドをクローンは含んでいた。次に、ライブラリーは、培地ＣＡＭ濃度（３０μｇ／ｍｌ）上で播種された。この濃度は、全ての発現していないか又は強力に凝集しているｓｃＦｖを除去するには十分に高いが、ｓｃＦｖ欠失を有する検出な可能なプラスミドには至らなかった。
【０１２３】
ライブラリーの最終サイズを見積もるために、少なくとも１２クローンが画ライブラリーから単離され、ＣＡＭＲクローンの分画を測定するためにアンピシリン及びＣＡＭ上で選択された。あるクローンは、アンピシリン／ＣＡＭ／ＩＰＴＧプレート上で素早く成長し形質転換された（表２、カラム＋＋）、あるものはゆっくりと増殖し（カラム＋）、あるものは全く増殖しなかった（カラム−）。発現したｓｃＦｖのライブラリーのサイズは、したがって、ＣＡＭRクローンの頻度によって、元々のライブラリーサイズ（アンピシリン上で選択される）の生産物として見積もられた。１８ライブラリーのサイズは、表２の最終カラムに提供され、２．５×１０6〜１．９×１０8の範囲であった。
【０１２４】
工程４：ＣＡＭ選択されたライブラリーのアセンブリ
最終ライブラリーは、５ＣＡＭ選択されたＢＬライブラリーを用いた１３ＣＡＭ選択されたＶＨライブラリーを再度組み合わせることによってアセンブリされた。理論的に可能な多様性は、１０15（約１３ＶＨ×１０7×５ＶＬ×１０6）である。これは、エレクトロポレーションによって得ることができたライブラリーよりも非常に大きい。つまり、最終ライブラリーにおいて同じクローンを２回得る可能性は非常に小さい。
【０１２５】
１３個のＶＨライブラリー及び５個のＶＬライブラリーは、１７ヌクレオチドの重複配列を用いたＰＣＲによって増幅し、次に精製し、アガロースゲル上で定量した。その後、ＢＨ及びＶＬ精製フラグメントは、ヒト抗体のＣＤＲ３ループ長の天然の部分に比例した量でプールされた（図３ａ）。最後に、ＶＨ及びＶＬミックスは、ＰＣＲによってアセンブリされ、消化され、ファージディスプレイに安定なベクターにクローニングされた。ライブラリーは、菌株Ｃｍａｘ５αＦ’にエレクトロポレートされ、１００個の無作為に拾い上げられたコロニーについてＰＣＲにより検査されたように、ｓｃＦｖインサートを含む１．５×１０9個のクローンのライブラリーを得た。１８個のＣＡＭ選択されたライブラリーは、ヒト抗体のＣＤＲ３ループ長の天然の分布に比例した量でアセンブリされ、１０億個を超えるクローンの最終ライブラリーを形成した。
【０１２６】
１１８個のクローンは、ループ長及び配列を決定するために配列決定された。ほぼ全てのループ長がライブラリーに見出された。また、１１及び１６個のアミノ酸長のループは、ライブラリーにおいて少数派であった。これは、恐らくは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｉｚｅｒに関するそれらのプロフィールによって示されるように、これらのオリゴヌクレオチドの貧弱な質に起因するためである。７〜１２の範囲にあるループ長は、ライブラリーにおいて多数派であって、ヒト抗体において最も頻繁に見出され、ライブラリーに全て存在する。配列決定されたクローン数は、非常に少なく、ＣＤＲ３ループに見出されたアミノ酸の頻度を分析することができなかった。元々のｓｃＦｖ１３Ｒ４配列によるいくつかの汚染を除いて、ＣＤＲ３配列はライブラリーに２倍見出されなかった。
【０１２７】
細胞におけるｓｃＦｖの発現
ＣＡＭ選択工程の新規な使用のため、ＶＨ及びＶＬライブラリーは、独立して、細胞における発現のために最適化された。ＶＨ及びＶＬライブラリーのこの最適化のため、結果は、発現されたｓｃＦｖ１３Ｒ４だけでなければならない。さらに、ＣＤＲ３ループだけが、元々のｓｃＦｖ抗体フレームワークと得られたｓｃＦｖライブラリーとの間で修飾されるので、２つのドメイン間の大部分の接合部分は、クローン間で保存されている。したがって、任意のＶＨは、任意のＶＬと正確にアセンブリされ、得られるｓｃＦｖの発現レベルは、ＣＡＭにおいて選択されるＶＨ及びＶＬライブラリーからの両方のクローンのものに近いこと考えられる。換言すれば、ＶＨは、修飾されたＨ３ループを有し、ＶＬ１３Ｒ４に融合されると十分に発現される場合、修飾されたＣＦＲ３ループを有するＶＬと結合し、ＶＨ１３Ｒ４との融合体として選択される場合に十分に発現する。この仮説は、最終のライブラリー由来のランダムクローンを拾い上げ、大腸菌の細胞質及び哺乳動物の細胞質ゾルにおいてそれらを発現させることによって試験された。
【０１２８】
ＤＮＡは、最終ライブラリー、及び強力なＴ７プロモーターの調節下で細胞質発現のためのプラスミドにおいてクローニングされたｓｃＦｖ遺伝子から調製された。このような強力なプロモーター下で得られる非常に高発現レベルは、凝集プロセスの高い動力学オーダーのために可溶性発現を超えた凝集を支持することが気付くべきである。したがって、この試験のストリンジェンシーが高く、より弱いプロモーターを用いることによって可溶性対不溶性の比を増加させることが可能である。２０個のクローンが大腸菌において試験され、それらのうちの１９個が細胞質において少なくとも幾分可溶的発現を示した（図３）。クローンの４分の１（５／２０；クローン３、１０、１１、１６、１９）は、ｓｃＦｖがクーマシー染色されたゲル上で明確に視覚可能であるため、非常に高レベルで発現された。大腸菌における可溶性発現レベルのより全体的な見解を得るために、ライブラリーは、Ｔ７プロモーターの調節下でＧＦＰｕｖ遺伝子の前でクローニングされた。ｓｃＦｖは可溶性であり、細胞質において発現される場合、これは、ＵＶトランスイルミネーターで直接的にモニターされ得る緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）活性をもたらすべきである。約１０００個のクローンは、検出可能なＧＦＰ活性の存在について試験され、約６０％がＧＦＰ+を示し、それは、再度、最終ライブラリー由来のｓｃＦｖの大部分が大腸菌の細胞質に正確に発現されることを示した。これらの２つの試験は、上述されるｓｃＦｖライブラリーを構築する新規な方法が大腸菌における細胞質発現したｓｃＦｖを非常に首尾よく生じさせることを示した。
【０１２９】
次に、哺乳動物におけるライブラリーの発現を試験した。１５個のｓｃＦｖは、ＥＧＦＰ遺伝子との融合体として、ＳＶ４０初期プロモーターの調節下で哺乳動物発現ベクターにクローニングされた。典型的な結果を図４に示す。３つのクローンは、高い可溶性レベルで発現され、親ｓｃＦｖ１３Ｒ４（クローン１５）のものに匹敵し、１０ｓｃＦｖは主に可溶性であることが見出されたが、いくつかの凝集した材料はなお細胞（クローン３３及び３６）に存在し、２つのクローンは、細胞質凝集体として本質的に体積し（クローン２４）、ハイブリドーマ誘導の抗癌タンパク質Ｅ６ｓｃＦｖ１Ｆ４を用いて観察された（図４）。結論として、試験された１５個のｓｃＦｖのうち１３個が、トランスフェクトされた細胞の細胞質及び核において容易に検出可能である可溶性タンパク質として発現された。
【０１３０】
同時に、これらの結果は、最終ライブラリー由来の８５％を超えるクローンが大腸菌（１６／２０）、哺乳動物細胞質（１３／１５）において可溶性ｓｃＦｖを発現し、一方、それらの約２０％が非常に高レベルでｓｃＦｖを発現した（大腸菌では５／２０、真核細胞では３／１５）。全体として、大部分のクローンは、細菌及び真核細胞質の還元条件下で十分に発現した。これは、最適化されていないｓｃＦｖライブラリーを用いて以前に得られた結果と比較して非常な改善である。
【０１３１】
結合剤の検出
上記で示されるように、ライブラリーは、非常に高い比率の発現されたクローンを含む。次の工程は、特定のタンパク質に対して、ライブラリーから抗体を選択することである。したがって、ファージディスプレイライブラリーは、マイクロタイタープレートに吸着した精製されたタンパク質を用いた５つの異なる抗原に対する結合剤について選択した。選択の３ラウンドを行い、溶出したファージは、固相化された抗原に対してＥＬＩＳＡによって試験された。全ての場合において、陽性シグナルは、１回のラウンドの選択後に得られた。このシグナルは２回のラウンド後に増強されたが、第３ラウンドの選択中にさらに増加することはなかった。この非常に早い選択プロセスは、恐らくは、低いバックグラウンドをもたらす発現されたｓｃＦｖだけを含むフォーカスされたライブラリー自体、並びにバックグラウンドレベルをさらに減少させたトリプシン感受性ヘルパーファージの使用に起因する。
【０１３２】
選択プロセスを特徴付けるために、６０個のクローンは、ＧＳＴ：Ｓｙｋ融合に対する３つの選択ラウンドから選択された。これらのクローンを用いて、モノクローナルファージを調製し、次に、ＥＬＩＳＡによって抗原への結合について試験した。図７は、各選択ラウンドについて得られたＥＬＩＳＡ値の分布を示す。この分布は正常であり、各選択のラウンドにおいてシグナルが非常に均一であった。これは、半分を超えるクローンが、０．１のピーク値内のＥＬＩＳＡシグナルを示したためである。選択プロセス中、１回のラウンド後の０．４〜０．５から、ラウンド２後の０．２、ラウンド３の１．０にピークシグナルが増加し、ポリクローナルファージを用いて得られた結果と良好な相関を示した。さらに、選択の１回のラウンド後、ほぼ１００％のクローンは、既に抗原を認識した。これは、トリプシン感受性ヘルパーファージと組み合わせた最適化されたライブラリーの使用が、結果として、選択プロセス中にバックグラウンドのほぼ全体的に存在しないことを示した。
【０１３３】
次に、ライブラリーがペリプラズムにおいて可溶性ｓｃＦｖを発現しているクローンを含むかどうかを試験した。非サプレッシブＨＢ２１５１菌株は、チューブリン、ＧＳＴ：Ｓｙｋ及びコアヒストンに対する第３ラウンドの選択後に溶出されたファージで感染させた。ペリプラズム抽出物を調製し、ＥＬＩＳＡによって結合活性を試験した。３つの場合において、１２〜２０％のクローンが、０．５（バックグラウンドの１０倍）よりも高い吸光度値を有する強力なシグナルを与え、約３０％が明らかに陽性であり、０．１（バックグラウンドの２倍）よりも高い吸光度値を有した。これらの結果は、他のｓｃＦｖライブラリーを用いて報告されたものと有利に比較され、ライブラリーに存在する、高比率の十分に発現されたクローンに対して強調する。さらに、これは、ＣＡＭ選択アプローチがオリゴヌクレオチドに存在する終止コドンを含まない構築物について効率的に選択されることを示した。これは、ファージディスプレイされたライブラリーから可溶性ｓｃＦｖを単離する非常な重要性が確かであり、ＣＤＲのアンバー終止コドンが合成及び半合成ライブラリーのパンニング中に頻繁に選択されるためである。
【０１３４】
従来の特徴付けの両方において、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合体又は可溶性タンパク質として大腸菌ペリプラズムにおける酸化条件下で発現された。さらに、パンニングは、酸化条件下で再度ファージで行われた。ｓｃＦｖがまた細胞質で確実に発現されるかどうかを試験するために、同じプールのクローン（ラウンド３）が、強力なＴ７プロモーターの調節下で細胞質発現ベクターにサブクローニングされた。各抗原に対して、９５個のクローンが、それらのそれぞれの抗原への結合についてＥＬＩＳＡによって試験された。各場合において、陽性クローンの数は、ペリプラズムでのスクリーニングと同程度であるか、又はさらには良好であった。例えば、ＧＳＴ：Ｓｙｋの場合には、８０％の試験されたクローンが、３ラウンドの選択後に陽性であった。これは、ペリプラズム選択工程が細胞質の可溶性ｓｃＦｖの比率を減少しなかったことを示した。さらに、上述される最適化されたライブラリーを用いると、選択中の偏りの導入を避けるために、細胞質内で直接的に選択することは必要でない。
【０１３５】
チューブリンに対する第２及び第３ラウンドの選択からの個々のクローンが配列決定された。配列を表３に示す。
【０１３６】
【化１２】
【０１３７】
第２（５クローン）及び第３（６クローン）ラウンドの選択由来の細胞質発現されたｓｃＦｖを用いたＥＬＩＳＡにおける最良の陽性クローンのＣＤＲ３の配列（表３）。a同じラウンドの配列決定されたクローンの間のｓｃＦｖの出現の頻度。b収率：フラスコ内で増殖させた１リットルの細胞から精製したｓｃＦｖのｍｇ（ＯＤ600＝５）。cＷＢ：ウェスタンブロットによる脳抽出物に含まれるチューブリンの検出。dＩＦ：＋は、ｓｃＦｖが免疫蛍光によって微小管ネットワークを表すことができることを意味する（図８）。クローン２Ｃ１Ｃ、２Ｅ１１Ｃ、２Ｆ１２Ｃ、２Ｇ４Ｃ及び２Ｇ９Ｃの配列は、ＥＭＢＬデータベースに提出され、それらの受け入れ番号は、それぞれ、ＡＭ８８６２８０、ＡＭ８８６２８１、ＡＭ８８６２８２、ＡＭ８８６２８３及びＡＭ８８６２８４である。
【０１３８】
全ての場合において、配列決定されたクローンは、細胞質に発現されたｓｃＦｖを用いて行ったＥＬＳＩＡにおいて最良のシグナルを与えるものであった。第２ラウンドからのたった１つのクローン、第３ラウンドからの１つが２倍であることが見出されたので、大部分のクローンは異なっていた。これは、高い多様性が３ラウンドの選択後でさえも存在していることを示した。抗チューブリンｓｃＦｖのうち８個が、細胞質からアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。全ての場合において、８ｍｇを超えるｓｃＦｖは、フラスコ内で増殖させて１リットルの細胞から精製され（ＯＤ600＝５）、あるｓｃＦｖは、大腸菌ペリプラズムの抗ＨＥＲ２について報告された非常に高発現レベルに匹敵する細胞あたりのレベルで発現された。
【０１３９】
細胞内発現抗体としてのｓｃＦｖの機能性
単離されたｓｃＦｖがインビボでそれらの標的に結合するか否かを測定するために、ヒト細胞において発現した抗ヒストンｓｃＦｖが特徴付けられた。第３ラウンドの選択は、ベクターｐ５１３−ＥＧＦＰにクローニングされ、１０個の無作為に選択されたクローンをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされた。ｓｃＦｖ−ＥＧＦＰ融合体を発現している細胞の、蛍光顕微鏡によって観察された典型的な結果を図６に示す。１つのｓｃＦｖは、細胞質凝集体として発現された。４つのｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ１３Ｒ４の同程度のレベルで、細胞の均一な染色によって判断されるように、可溶性細胞質タンパク質として発現された。最後に、３つのｓｃＦｖの発現は、核のより強力な染色を生じさせ（図６、クローン２）、２つのｓｃＦｖは、核に排他的に局在化された（図６、クローン５及び１０）。これらのｓｃＦｖ−ＥＧＦＰ融合タンパク質が細胞の細胞質に発現され、核局在化シグナルを含まなかったので、これは、ヒストンとインビボで相互することができ、したがって、細胞内で活性であることを示唆する。この分析は、コアヒストンに対する第３ラウンドの選択後に存在する約半分のクローンがインビボでそれらの核標的に結合することを示した。これは、インビトロにおいて、精製されたｓｃＦｖを用いたウェスタン及びドットブロットによって確認された。さらに、これらのクローンの配列決定により、それらが、異なる重及び軽ＣＤＲ３領域を含むことを示した。
【０１４０】
抗チューブリンｓｃＦｖのインビトロでの特徴付け
細胞の細胞質における還元条件下で抗チューブリンｓｃＦｖの活性を証明するために、ｓｃＦｖは、還元剤の存在下で抽出され、ＥＬＩＳＡシグナルと、還元条件下で抽出されたｓｃＦｖを用いて得られたものとを比較した。図７に示されるように、試験された５個のｓｃＦｖは、両方の条件下で同じＥＬＩＳＡシグナルを与え、ｓｃＦＶが、ジスルフィド結合形成がない場合でさえも、還元条件下で十分に活性を保持することを示す。５個のｓｃＦｖは、競合ＥＬＩＳＡにおいて、脳抽出物及び天然のタンパク質のウェスタンブロットによるフォールディングしていないチューブリンを認識することができた。細胞内で微小管と相互作用する５つのｓｃＦｖの能力は、ＩＦによって試験された。クローン２Ｆ１２Ｃ及び２Ｇ４Ｃは、細胞内の微小管ネットワークを表した。
【０１４１】
図８は、インビトロ及びインビボのプロテオーム研究のための供給源としてライブラリーの有用性を例証する：ＨｅＬａ細胞は、赤色−ＧＦＰに融合した抗ヒストンクローン５でトランスフェクトされ、微小管ネットワークは、２Ｆ１２ＣｓｃＦｖを用いたＩＦによって表された。
【０１４２】
結局は、本発明者らの結果は、この報告書に記載されるライブラリーが非常に多様性かつ機能性であり、インビボで活性な完全なヒト細胞内発現抗体の迅速かつ容易な単離を可能にすることを示す。
【０１４３】
上記で引用された全ての特許、刊行物及び要約は、全体として参照により本明細書に援用される。本発明のいくつかの態様だけが本明細書に記載されているが、本発明が本明細書に請求される発明の精神及び範囲から逸脱せずに、多くの他の特定の形態で具現され得ることが理解されなければならない。したがって、本実施例及び態様は、例示であると考えなければならず、制限してはならず、本発明は、本明細書に与えられた主催に限定されるべきではない。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組換え一本鎖抗体、及びこのような抗体を生産及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的アプローチは、特定の結合特異性、特定のドメイン構造、他の所望の特性を有する組換え抗体の生産を可能にしてきた。ある種の遺伝子工学的に操作された抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。一本鎖Ｆｖフラグメントは、遺伝子工学的に操作されたポリペプチドであって、柔軟なペプチドリンカーを介して、軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。各ＶＨ及びＶＬドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは短いアミノ酸配列であり、抗体分子間で非常に変化し、したがって、抗体結合特異性の大きな多様性を生じさせる原因となる。ＶＨのＣＤＲ及びＶＬのＣＤＲの組み合わせは、任意の所定の抗体の結合特異性を決定する。
【０００３】
一本鎖Ｆｖフラグメントは、完全な大きさの抗体の結合特異性及び一価結合親和性を示し、遺伝子操作及び発現の相対的な容易性の付加された利点を与える（これは、ｓｃＦｖが、完全な大きさの抗体である場合のように、別々のコーディング配列というよりはむしろ、単一のコーディング配列によってコードされ、そこから発現されるためである）。一本鎖Ｆｖフラグメント及び他の組換え抗体は、幅広い用途、例えば、医療用診断試験、基礎研究、種々の疾患に対する治療用抗体処置において使用される。
【０００４】
細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）は、細胞内で異所的に発現される遺伝子操作された抗体分子である。細胞内発現抗体は、生存細胞内で標的抗原の機能を視覚化するか又は調節するために使用可能である。例えば、細胞内発現抗体の使用は、標的化された抗原の機能を直接的に阻害することによって、又は正常な細胞内位置から標的化された抗原を転用することによって表現型ノックアウトを誘導することができる（例えば、細胞内発現抗体は、分解機構にその標的抗原を変更することができる）。また、細胞内発現抗体は、それらの標的抗原の機能を増加させるか又は変化させることができる。タンパク質標的については、細胞内発現抗体は、特定の翻訳後修飾又は特定の抗原立体構造に標的化され得る。さらに、細胞内発現抗体によって誘導された表現型ノックアウトは、アドレス指定（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ）シグナル（例えば、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、又は小胞体シグナル）を用いて、特定の細胞内コンパートメントに細胞を標的化することによって、特定の細胞コンパートメントに限定することができる。また、細胞内発現抗体は、標的のオリゴマー構造を修飾することによって、標的機能を調節することができる。
【０００５】
細胞内発現抗体による表現型ノックアウトは、その標的への抗体分子の結合能力にだけ依存するため、細胞内で完全な抗体分子を発現させる必要がなく、可変領域（Ｆｖ）内に完全に位置されるその結合部位だけを必要とする。単一のポリペプチド鎖内に含まれる小さな大きさ及び抗原特異性のそれらの利点が与えられると、ｓｃＦｖは、細胞内の抗体発現のために使用される組換え抗体フラグメントの最も共通した型である。
【０００６】
細胞内発現抗体の使用についての一連の制限は、大部分のｓｃＦｖが、細胞質ゾル及び核の還元条件下ではフォールディングできないということである。このような条件下では、ｓｃＦｖの２つの保存されたジスルフィド架橋が減少し、それによって、不安定となり、多数のｓｃＦｖの結合活性を不活性化する。インビトロでは、大部分のｓｃＦｖは、還元条件下で復元することができない。ｓｃＦｖ配列の統計学的分析によれば、１％よりも少ないｓｃＦｖがジスルフィド結合形成がない場合に発現され、活性であるには十分に安定であることが示されている。さらに、ｓｃＦｖタンパク質がインビボにおいて発現され、活性であるには、その還元形態において確かに十分に安定であるとしても、プロテアーゼ感受性又はフォールディング動力学などの他のパラメータもまた、細胞内発現抗体の最終的インビボでの宿命に影響を与える可能性があり、したがって、最終的な細胞内発現抗体の発現及び活性に重要である。
【０００７】
活性な細胞内発現抗体を得るために、現在のアプローチは、多くの場合、２つの連続工程を伴う。第１に、対象の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ又はＦａｂ抗体の一団が同定される（例えば、ファージディスプレイライブラリーによる）。第２に、特異的に結合する抗体は、インビボにおいて標的抗原に結合及び／又は阻害するそれらの能力について試験される。１％よりも少ないｓｃＦｖは、細胞内発現抗体として潜在的に有用であるため（それらは、細胞内に存在する還元条件下で発現されず、及び／又は適切にフォールドすることができないため）、細胞内発現抗体として使用可能である単一のｓｃＦｖの同定は、１００個を超えるｓｃＦｖクローンの同定を必要として、その数は、大部分の場合では得ることができないものである。
【０００８】
医療及び研究用途での使用のために、細胞内発現抗体として用いることができる抗体を生産し、同定することの前述の困難性を考慮して、必要とされるのは、細胞内発現抗体として使用することができる抗体を生産及び選択するより効果的な方法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の局面では、少なくとも１０6個の固有の（ｕｎｉｑｕｅ）ｓｃＦｖクローンを含む抗体ライブラリーが本明細書に記載され、ここで、ｓｃＦｖクローンによってコードされる抗体が細胞内で発現される場合、少なくとも約２０％のｓｃＦｖクローンは、細胞内で標的抗原と検出可能に特異的に結合することができる抗体をコードする。
【００１０】
第２の局面では、抗体ライブラリーが本明細書に記載され、ここで、抗体ライブラリーは、少なくとも約１０6個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含み、少なくとも約２０％のｓｃＦｖ抗体クローンが、大腸菌細胞内で発現することができ、大腸菌細胞１リットルあたり少なくとも約５ｍｇのレベルで可溶性抗体を生成し、ここで、大腸菌細胞は、ＯＤ600nmが約５になるまで増殖される。
【００１１】
第３の局面では、少なくとも約１０6個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含む抗体ライブラリーが本明細書に記載され、ここで、各固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列及び固有のＣＤＲ３ＶＬ配列の少なくとも１つを含む固有のｓｃＦｖ抗体をコードし、固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、ｓｃＦｖ１３Ｒ４によってコードされるフレームワーク配列と実質的に同一であるフレームワーク配列をコードする。
【００１２】
上記抗体ライブラリーのいずれかにおいて、固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードすることができる。
【００１３】
上記抗体ライブラリーのいずれかにおいて、固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、固有のＣＤＲ３ＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードすることができる。
【００１４】
上記抗体ライブラリーのいずれかにおいて、固有のｓｃＦｖ抗体クローンは、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列及び固有のＣＤＲ３ＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードすることができる。
【００１５】
第４の局面では、還元条件下で実質的に可溶性タンパク質として発現可能なｓｃＦｖ抗体が本明細書に記載され、ここで、ｓｃＦｖ抗体は、第３の局面において、上記されるライブラリーから単離される。ｓｃＦｖ抗体は、還元条件下で標的抗原に特異的に結合することができる。
【００１６】
第５の局面では、細胞内で第４の局面において上述されるｓｃＦｖ抗体を発現させ、それによって、ｓｃＦｖ抗体を生産することを含むｓｃＦｖ抗体を生産する方法が本明細書に記載される。この方法は、細胞からｓｃＦｖ抗体をさらに精製することを含むことができる。
【００１７】
第６の局面では、細胞内で発現可能なｓｃＦｖ抗体クローンに富んだｓｃＦｖ抗体を調製する方法であって、ａ）ｓｃＦｖ抗体クローンの第１の回収物を用意し、ここで、第１の回収物が、ＶＨのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第１の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るｓｃＦｖ抗体に富んでいて；ｂ）ｓｃＦｖ抗体クローンの第２の回収物を用意し、ここで、第２の回収物が、ＶＬのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第２の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るｓｃＦｖ抗体に富んでいて；ｃ）第１の回収物のｓｃＦｖ抗体クローン由来のＶＨドメインと、第２の回収物のｓｃＦｖ抗体クローン由来のＶＬドメインとを接合して、ｓｃＦｖ抗体クローンの第３の回収物を得て、ここで、第３の回収物が、ＶＨのＣＤＲ３ループ内の固有の配列、及びＶＬのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む、を含み、それにより、細胞内で発現され得るｓｃＦｖ抗体クローンに富んだｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製する。
【００１８】
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調節するための上記方法において、前記第１の回収物が、第１の回収物に含まれる他のｓｃＦｖ抗体クローンと比較して、実質的に同一のＶＬを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、第２の回収物に含まれる他のｓｃＦｖ抗体クローンと比較して、実質的に同一のＶＨ配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む。
【００１９】
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調節するための上記方法において、前記第１の回収物が、ｓｃＦｖ１３Ｒ４ＶＬ配列に実質的に同一であるＶＬを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、ｓｃＦｖ１３Ｒ４ＶＨ配列に実質的に同一であるＶＨを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む。
【００２０】
ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調節するための上記方法において、前記第１の回収物が、ＶＨドメインと同一なＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、ＶＬドメインと同一なＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む。
【００２１】
第７の局面では、第６の局面において上記される方法によって製造される抗体ライブラリーが本明細書に記載される。
【００２２】
第８の局面では、第６の局面において上記される方法によって製造される抗体ライブラリーから選択される抗体が本明細書に記載される。
【００２３】
第９の局面では、本発明は、抗体ライブラリーを構築する方法を特徴とし、ａ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークを選択し；ｂ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークのＶＨ ＣＤＲ３領域に配列多様性を導入して、固有のＶＨ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む第１のライブラリーを生じさせ；ｃ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークのＶＬ ＣＤＲ３領域に配列多様性を導入して、固有のＶＬ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む第２のライブラリーを生じされ；ｄ）第１のライブラリーから、ｓｃＦｖ抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し；ｅ）第２のライブラリーから、ｓｃＦｖ抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し；ｆ）第１及び第２のライブラリーを再結合させて、固有のＶＨ ＣＤＲ３領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体ライブラリーを含む第１のライブラリーを生じさせることを含み、それにより、抗体ライブラリーを構築する。
【００２４】
上記の方法において、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ１３Ｒ４であってもよい。
【００２５】
細胞内発現抗体として使用されてもよい、細胞質において発現されるｓｃＦｖを単離するための新規な抗体ライブラリーを提供することが本発明の目的である。
【００２６】
単一フレームワークに基づき、細胞内発現を最適化された新規な抗体ライブラリーを提供することが本発明の別の目的である。
【００２７】
本発明の更なる目的は、細胞内発現抗体として使用されてもよい細胞質において発現されるｓｃＦｖを単離するための新規な抗体ライブラリーを構築及び評価するための新規な方法を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、単一のフレームワークに基づき、細胞内発現を最適化した新規な抗体ライブラリーを構築及び評価する新規な方法を提供することである。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、細胞内発現抗体として使用されてもよい高発現するｓｃＦｖを生産するために、抗体ライブラリーを用いる新規な方法を提供することである。
【００３０】
本発明のなお別の目的は、単一のフレームワークに基づき、細胞内発現を最適化したｓｃＦｖを生産するために、抗体ライブラリーを試料する新規な方法を提供することである。
【００３１】
本発明のこれら及び他の目的、特徴、利点は、開示された態様の下記の詳細な説明の考察後に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（ａ）ライブラリー構築中の工程の図式的アウトライン。重要な工程は固有のヒトｓｃＦｖフレームワークへの調整されたＣＤＲ３ループの導入；ＣＡＴ酵素との融合及びＣＡＭプレート上での選択による発現していないクローンの除去；１３個のＶＨライブラリー及び５個のＶＬライブラリーの再結合、ファージ上の提示である。（ｂ）データベースで回収されたＣＤＲ３ループの概要。（ｃ）５５個の再配列されたヒト抗体由来の５個のアミノ酸の長さのＶＨ ＣＤＲ３の各位置でのアミノ酸の分布。
【図２】ＣＤＲ３の長さ分布の略図。データベース、及びライブラリーからの１１８個の配列決定されたクローンにおけるＣＤＲ３の長さの分布。
【図３】細胞質発現ベクターにおいてクローニングされ、Ｔ７プロモーターの調節下で大腸菌に発現されたライブラリー由来の２０個のクローンのウェスタンブロット分析。ライブラリーからの２０個のクローンは、細胞質発現ベクターにおいてクローニングされ、Ｔ７プロモーターの調節下で大腸菌に発現された。可溶性抽出物が調製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、９Ｅ１０及びアルカリホスファターゼ結合した抗マウスＩｇＧ抗体（基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いた、クーマシー染色（ａ）又はウェスタンブロット（ｂ）によって分析された。各レーンは、２×１０7個（２×１０の７乗）の細胞に対応する。左の矢印は、ｓｃＦｖの位置を示す。
【図４】ＨｅＬａ細胞において無作為に採取したｓｃＦｖ発現の選択された蛍光顕微鏡写真。細胞は、指示されたｓｃＦｖ−ＥＧＰ構築物を用いてトランスフェクトされた。１３Ｒ４及び１Ｆ４は、それぞれ、正及び負の対照を示す。トランスフェクションの２４時間後、細胞を固定し、蛍光性イソチオシアネートフィルターセットを用いた蛍光顕微鏡下で視覚化された。顕微鏡写真は、各場合において同数の細胞を含む代表的なフィールドを示す。倍率：×４００。
【図５】５つの精製されたタンパク質に対する結合剤の選択。（ａ）各ラウンドの選択由来の２．５×１０10個のファージは、それらのそれぞれの抗原に対して、ＥＬＩＳＡによって試験され、抗Ｍ１３ＨＲＰ結合したモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて曝露した。Ｒ０は選択されていないライブラリーであり、Ｒｎは、第ｎラウンドの選択後に得られたストックである。特異性は、第３ラウンドの選択についてＢＳＡに基づいて試験された（Ａ４５０ｎｍ 約０．１−０．３）。（ｂ）ＧＳＴ：Ｓｙｋタンパク質に対する各ラウンドの選択からのモノクローナルファージは、（ａ）におけるＥＬＩＳＡによって試験された。可溶性であり活性なｓｃＦｖの割合（吸光度＞０．１）は指示されたタンパク質に対して３ラウンド後に選択され、ペリプラズム（グレイ）又は細胞質（ブラック）のいずれかにおいて発現された。
【図６】ＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＰに融合した抗ヒストンｓｃＦｖの発現の顕微鏡写真。細胞は、図４の説明に示されるようにトランスフェクトされ、処置された。写真は、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、３つの代表的な抗ヒストンクローン（２、５及び１０）を用いてトランスフェクトされた典型的な細胞を示す。Ｄ、ＤＡＰＩ染色（青色）であり、ＧＦＰシグナルと重なる。
【図７】還元条件下で選択されたｓｃＦｖの活性の発現のグラフ表示。細胞質におけるｓｃＦｖを発現する細胞の抽出物は、１０ｍＭのＤＴＴの有無により、図３に示されるように調製された。したがって、ＥＬＩＳＡは、ＤＴＴの有無により行った。ｘ軸：ウェルあたりの抽出物の量。ｙ軸：４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡシグナル。
【図８】細胞内発現抗体を用いてＨｅＬａ細胞の二重染色及び免疫蛍光法による顕微鏡写真。ｄｓＲｅｄ−モノマーＧＦＰに融合された抗ヒストンクローン５（図６）を用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。微小管は、抗チューブリンｓｃＦｖ ２Ｆ１２Ｃ（表３）を用いてＩＦによってトランスフェクトされた細胞において表された。細胞は、視覚化するために適切な波長で観察された：（Ａ）２Ｆ１２Ｃ ｓｃＦｖ（微小管単独）；（Ｂ）クローン５細胞内発現抗体（ヒストン単独）；（Ｃ）２Ｆ１２Ｃ及びクローン５（微小管及びヒストン）；（Ｄ）ＤＡＰＩを用いて染色するＣプラス核。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
原核細胞又は真核細胞内で発現することができるｓｃＦｖに富んだｓｃＦｖライブラリーを構築するための方法が本明細書に提供される。ｓｃＦｖは、細胞内に存在する還元条件下でそれらの構造を維持し、細胞内の標的抗原に特異的に結合する能力を保持し、したがって、種々の治療及び研究アプローチにおける細胞内発現抗体として使用することができる。本明細書に記載される方法は、還元条件下で安定であるｓｃＦｖのライブラリーを生産するために使用されるので、これらのライブラリーもまた原核細胞又は真核細胞によって発現し、及びそれらから精製され得るｓｃＦｖの生産に有用である（例えば、細胞を溶解し、周知な技術によって所望のｓｃＦｖを精製することによる）。このように精製されたｓｃＦｖは、研究における使用、診断試験、疾患治療のための抗体として有用である。
【００３４】
インビボにおいて使用されるべきｓｃＦｖを安定化させるための改善されたストラテジーは、細胞内発現のために調整されたｓｃＦｖライブラリーを構築することである。理想的には、このようなライブラリーは、細胞の細胞質に見出されるものなどの、還元条件下でフォールドすることができるｓｃＦｖだけを含むべきである。別のストラテジーは、細胞内発現抗体の選択のために単一の最適化された抗体フレームワークに基づいてｓｃＦｖライブラリーを構築することである。
【００３５】
単一の最適化された抗体フレームワークに基づき、細胞内発現のために調整されている新規な抗体ライブラリーを構築する方法が本明細書に記載されている。分子進化を通じて、本発明者らは、大腸菌の細胞質に高レベルで発現する、ｓｃＦｖ１３Ｒ４と呼ばれるヒトｓｃＦｖを得た。さらに、このｓｃＦｖは、非常に発現され、可溶的であり、酵母及び哺乳動物細胞において標的抗原に特異的な結合活性を提示する。このｓｃＦｖは、インビトロにおいて非常に安定であり、還元剤の存在下で復元可能である。さらに、そのフォールディング動力学の分析は、親ｓｃＦｖよりも速くフォールディングし、インビトロではよりゆっくりと凝集することを示した。
【００３６】
最適化されたｓｃＦｖ１３Ｒ４のフレームワークに基づくヒトｓｃＦｖライブラリーは、１０億個を超えるクローンを含み、それらは、１０7〜１０8の従来のライブラリーと比べて大きい。本発明者らは、種々の異なる長さのＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ３ループをコードするように本ライブラリーを設計したため、本ヒトｓｃＦｖライブラリーの多様性は、従来のライブラリーよりもはるかに大きい。さらに、本発明者らは、ヒトＣＤＲ３を模倣するＣＤＲ３ループをコードする変性オリゴヌクレオチド配列の偏向混合物を使用した。最適化されたＣＤＲ３ループ、発現していないクローンを排除するためのろ過工程を用いると、本発明者らは、発現していないｓｃＦｖのライブラリーを取り除き、クローンの多様性を損なうことなしに細胞質で発現したｓｃＦｖを保持し、これは、抗原として使用されるいくつかのタンパク質を用いた試験を通じて確認された。前述されたｓｃＦｖライブラリーに反して、ライブラリー中の大部分のｓｃＦｖは、大腸菌及び哺乳動物の細胞質において十分に発現する。
【００３７】
ｓｃＦｖライブラリーを構築するためのこの新しいアプローチは、機能的な細胞内発現抗体の容易かつ大規模な選択を可能にする。例えば、異なるタンパク質に対するいくつかの強力な結合剤は、Ｓｙｋ及びＡｕｒｏｒａ−Ａタンパク質キナーゼ、αβチューブリン二量体、パピローマウイルスＥ６タンパク質、コアヒストン、ガンキリン（ｇａｎｋｙｒｉｎ）、ＭＡＰＫ１１−１４を含み、ライブラリーから単離されている。選択されたｓｃＦｖのいくつかは、細菌の細胞質において非常に高レベルで発現し、ほんの２０ｍｌの培養物から１ｍｇ以上の活性なｓｃＦｖの精製を可能にする。さらに、標的抗原としてのコアヒストンに対する３ラウンドの選択後、半分を超える選択されたｓｃＦｖが、インビボでヒト細胞において発現されると活性となり、基本的に核に局在した。こん新しいタイプのライブラリー、このようなライブラリーを創作及び用いる方法、このようなライブラリーから単離された抗体は、機能的な細胞内発現抗体の単純かつ大規模な選択のためだけでなく、多数のバイオテクノロジー、診断、治療用途において使用可能である高発現したｓｃＦｖの発現及び精製のためにも有用である。
【００３８】
細胞内発現抗体
細胞内発現抗体は、細胞内で異所的に発現される遺伝子工学的に操作された抗体分子である。細胞内発現抗体は、生存細胞において標的化された抗原を視覚化又は阻害するために使用することができ、したがって、種々の研究及び医学的（例えば、診断及び治療的）用途における使用を見出す。しかしながら、細胞内発現抗体技術は、典型的な抗体発現ライブラリー中のほんの１％未満のｓｃＦｖがインビボにおいて発現及び／又は活性となるには十分に安定であるという事実によって制限されている。これは、細胞内環境が、非常に多くのｓｃＦｖが安定性のために必要とする２つの保存されたジスルフィド結合を減少するためである。還元条件下で安定であり、したがって、細胞内発現抗体としての使用に適しているｓｃＦｖに非常に富んだｓｃＦｖのライブラリーを生産する方法が本明細書に記載されている。細胞内発現抗体は、細胞内発現抗体を使用する種々の研究、診断、及び治療的アプローチのために用いることができる。
【００３９】
大部分の場合において、効果的な細胞内発現抗体を得るために、２つの連続工程を現在必要とする。第１に、標的抗原に対する一団の抗体が単離されなければならない。ファージに提示される非常に高い質であって、未使用の抗体の利用性により、この工程は、現在、同時にいくつかのタンパク質に対する結合剤を単離するために、ファージディスプレイによって容易に達成され、自動化され得る。第２工程では、これらの抗体フラグメント（ｓｃＦｖ又はＦａｂ）は、それらの標的を阻害する能力について、インビボにおいて試験されなければならない。しかしながら、大部分のｓｃＦｖは、大部分の関心のある標的が局在する細胞質及び細胞の核において見出される還元条件下で適切にフォールディングしない。これは、ｓｃＦｖの凝集及び不活性化をもたらす可能性があり、それらの標的と相互作用することができない。１％未満のｓｃＦｖは細胞内発現抗体として効果的であるため、タンパク質に対する単一の結合剤を得ることは、１００個のｓｃＦｖの単離を必要とし、この数は、多くの場合において得られる可能性がない。これは、２ハイブリッド又は同等のシステムを用いてインビボで行われるときでさえ、標準のｓｃＦｖライブラリーからの細胞内発現抗体を同定するプロセスを異なる手法にする。さらに、現在のライブラリーに含まれる低い割合の活性なｓｃＦｖは、スクリーニングされた潜在的なレパートリーの１００倍の減少をもたらし、同じタンパク質の異なるエピトープに対する細胞内発現抗体の単離を不可能にする。
【００４０】
ライブラリー
細胞内発現のために最適化されたｓｃＦｖの新規なファージディスプレイライブラリー、このライブラリーを構築及び使用する新規な方法が本明細書に記載されている。ライブラリーは、細胞質内で改善された活性のために選択される親ｓｃＦｖの単一の抗体フラグメントに基づいて構築される。親ｓｃＦｖは非常に安定であり、好ましいフォールディング及び凝集動力学を有し、全ての試験された細胞型において非常に高レベルで発現される。ライブラリーの構築のために単一のフレームワークを有することは、それらの配列の大部分が保存されているので、クローン間でより匹敵する発現レベルを可能にしなければならない。
【００４１】
しかしながら、ＣＤＲ配列はまた、ｓｃＦｖフォールディング及び発現において役割を果たすので、本発明者らは、クローンの発現レベルはさらにいくつかの変動性をさらに示す。これらの相違を最小限にするため、本発明者らは、ＣＤＲ３ループ内にのみ変動性を導入し、それは、これらのループが、抗体において最も可変的であり、したがって、配列及び長さのバリエーションに非常に寛容である可能性がより高いためである。ＣＤＲ３における変動性の導入は、大部分のタンパク質に対する抗体を生じさせるには十分である。さらに、本発明者らは、天然のヒト配列中に観察された分布を回復するようにこれらのループ内のアミノ酸の頻度を注意深く偏らせた。無作為に選択されたクローンの発現レベルが細胞質において比較されると、いくつかの明確な相違にかかわらずに、高い割合のものが大腸菌及び哺乳動物細胞において正確に発現された。細胞内に発現されたｓｃＦｖのこの比率は、前述のライブラリーにおけるものよりも非常に高い。
【００４２】
また、本発明者らは、５つの異なるタンパク質（Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＧＳＴ：Ｓｙｋ、チューブリン、ヒストン、及びパピローマウイルスＨＰＢ１６由来のＥ６タンパク質）に対する結合剤（即ち、選択された標的抗原に特異的に結合する抗体）を選択することができた。その後の研究では、本発明者らはまた、ガンキリン及びＭＡＰＫ１１−１４を含む新しい標的に対する結合剤を有する。ＭＡＰＫ１１−１４については、関与する４つのタンパク質は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの４つの異性体である。これらのタンパク質は、非常に相同（約６０〜７４％の同一性）である。全てのケースにおいて、本発明者らは、選択のために使用されるアイソフォームに特異的なｓｃＦｖを単離することができた。これは、このライブラリーから単離することができたｓｃＦｖの特異性を強調する。
【００４３】
ｓｃＦｖライブラリーを構築する際の度重なる関心事は、ライブラリーの多様性及びサイズの同時の最適化である。一般に、このようなライブラリーの大きさは、約１０10個のクローンに対する形質転換効率によって制限される。この制限された数のクローンにより、したがって、発現していないｓｃＦｖ又は二重を避けることは、非常に重要である。この問題を解決するために、本発明者らは、第１に、細胞内発現のために絶えず最適化された抗体フレームワークを選択し、次に、２工程の手法を用いて、ライブラリーをさらに最適化した。
【００４４】
第１に、本発明者らは、ｓｃＦｖライブラリー（下記の実施例１を参照）を構築するために使用される、各ＣＤＲ３の長さ（１３ＶＨ ＣＤＲ３の長さ、５ＶＬ ＣＤＲ３の長さ）について１８個の「小さな」ライブラリーを構築した。これらの１８個のライブラリーの各々は、無作為化されたＣＤＲ３によって、親ｓｃＦｖ１３Ｒ４の対応するＣＤＲ３を置換することによって作製された。次に、１個及びたった１個の無作為化されたＣＤＲ３を有する得られたライブラリーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子に融合され、本発明者らは、選択可能なマーカーとしてしたものである。各ＣＤＲ３ライブラリーの大腸菌へのトランスフェクション後、ライブラリーは、大腸菌の細胞質において発現されたＣＤＲ３−ＣＡＴ融合体について選択するためのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）含有培地に置かれた。この工程は、約１０〜３０％によって各ライブラリーの多様性を減少させた。
【００４５】
ＣＡＴ遺伝子は本明細書において与えられた実施例において使用されるが、当業者は、任意の適切な選択可能なマーカーをコードする核酸は、ＣＤＲ３をコードする核酸と融合され、原核細胞又は真核細胞で発現されるｓｃＦｖのためのｓｃＦｖライブラリーを豊富にするために本明細書に与えられた方法に使用され得ることを理解する。例えば、細菌細胞における使用のための適切な選択可能なマーカーには、限定されないが、カナマイシン耐性遺伝子が含まれる。哺乳動物における使用のための選択可能なマーカーの例には、限定されないが、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。酵母細胞のための選択可能なマーカーの例には、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、及びｐｕｒＥが挙げられる。さらに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその誘導体、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、又は他のルミネッセント、蛍光分析、及び／又は比色分析用マーカーなどのマーカーは、全ての細胞型において、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて使用され、発現され得るｓｃＦｖをコードするクローンに対するｓｃＦｖライブラリーに富んでいる。当業者は、本明細書に記載されているｓｃＦｖライブラリーを構築するための適切な選択可能なマーカー及び適切な選択スキームを選択するために、本明細書に記載の技術をどのように使用するか、さらに、当該技術分野において何が知られているかを理解する。
【００４６】
第２の工程では、本発明者らは、ＶＬ領域及びｓｃＦｖ１３Ｒ４の元々のＶＬにおける新しいＣＤＲ３配列を含む新たに生じたｓｃＦｖクローンが発現され、ＶＬ領域及びｓｃＦｖ１３Ｒ４の元々のＶＨ領域における新しいＣＤＲ配列を含む新たに生じたｓｃＦｖクローンが発現される場合に、ＶＨ領域における新しいＣＤＲ３配列及びＶＬ領域における新しいＣＤＲ３配列を含む組換えｓｃＦｖクローンもまた発現され、それによって、発現されただけのｓｃＦｖを含むライブラリーを生じるという仮説に基づいて、最終の多様性を生じさせるために選択されたＶＨ及びＶＬライブラリーを無作為にアセンブルさせるためにＰＣＲを使用した。無作為に選択された２０個のクローンのうちの１９個が、大腸菌の細胞質において可溶性形態で少なくとも部分的に発現されたため、これはそのケースであった。重要なことには、この選択工程は、ライブラリー構築中の初期に行われるので、最終のライブラリーの多様性は、最終の形質転換によって限定されるだけであった。この最終の組換え工程は、高い多様性によって生じることによって、全てのクローンが最終ライブラリーにおいて固有となることを確認した。要するに、このアプローチは、１５億個の発現した異なるｓｃＦｖのライブラリーをもたらした。
【００４７】
大規模での細胞内発現抗体としてのｓｃＦｖの成功使用は、ライブラリーによって実行されるためのいくつかの本質的なポイントを必要とする。第１に、ｓｃＦｖは、単離が容易でなければならない。これは、現に記載された方法についてのケースであり、本発明者らは、試験した全てのタンパク質に対する結合剤を単離することができただけでなく、単一サイクルの選択が１００％に近い結合剤を得るには十分でもあった。この非常に高い濃縮率は、十分に発現したｓｃＦｖのみを含む、高い質の偏ったライブラリー、及びトリプシン感受性のヘルパーファージＫＭ１３の使用に起因して推定される。これは非常に重要なことであり、細胞内発現抗体としてのｓｃＦｖのインビボでの試験前に、単一のパンニングサイクルを使用することが可能であり、標的化されたエピトープのより良好な多様性を可能にする。また、この高い濃縮率は、パンニング工程に必要とされる精製された抗原の量を大量に低減する。本発明者らは、ウェルあたり１μｇ程度のタンパク質を用いて、マイクロタイタープレートに選択することができた。ＥＬＩＳＡによる結合活性の更なる選択及び確認は、結合剤の非常に高い比率のために必要ではないため、現に、非常に少量の抗原を用いて良好な細胞内発現抗体を単離することができる。第２に、ｓｃＦｖは、全ての細胞コンパートメントにおいて、特に細胞質及び核などの還元部分においてフォールディングできなければならない。再度、これは、試験された８０％を超えるクローンが、細胞内で少なくとも部分的に可溶であるため、本明細書に記載されたｓｃＦｖライブラリーに対するケースである。さらに、本発明者らは、良好な細胞質結合剤が、大腸菌及び真核細胞においてｓｃＦｖを選択したファージにおいて得ることができたことを示した。
【００４８】
少なくとも約：１０6、５×１０6、１０7、５×１０7、１０8、５×１０8、１０9、１．５×１０9、５×１０9、１０10、５×１０10、１０11、５×１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、又は１０16個の固有のｓｃＦｖクローンを含む抗体ライブラリーが本明細書に提供され、ここで、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、又はそれを超えるｓｃＦｖクローンは、そのｓｃＦｖクローンによってコードされた抗体が細胞内で（細胞内発現抗体として）発現される場合、標的抗原に検出可能に特異的に決グリコサミノグリカンすることができる抗体をコードする。本明細書に記載のｓｃＦｖは、標的抗原に検出可能に特異的に結合することが望まれる任意の原核細胞又は真核細胞（例えば、限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、トリ細胞、哺乳動物細胞など）において標的抗原に検出可能に特異的に結合するために発現可能である。
【００４９】
「特異的に結合する」とは、ｓｃＦｖ抗体が、別の抗原よりもむしろ標的抗原に優先的に結合することを意味する。「検出可能に特異的に結合する」とは、その標的抗原へのｓｃＦｖ抗体の特異的結合が観察されることを意味し、例えば、限定されないが、ｓｃＦｖ抗体がその標的抗原に結合する細胞内での表現型の変化、又はｓｃＦｖ抗体とその標的抗原との間の相互作用の減少（例えば、ｓｃＦｖ抗体とその標的抗原の細胞内での同時局在化）が挙げられる。
【００５０】
典型的な使用
本明細書に記載のライブラリーは細胞内発現抗体の単離のために最適化されているが、ライブラリーもまた、診断及び治療用途のためにｓｃＦｖを選択することができる。さらに、本発明者らは、発現されたヒト配列を用いてＣＤＲ３多様性を設計したので、ライブラリーに存在するｓｃＦｖは、完全なヒトであり、患者の抗ｓｃＦｖ抗体応答を誘導してはならない。
【００５１】
本明細書に記載のライブラリー、及びそれによって生産される抗体は、機能的な細胞内発現抗体を同定するためだけでなく、多数のバイオテクノロジー及び治療用途において使用され得る高度に発現したｓｃＦｖの単離のためにも有用である。例えば、ライブラリー及びそれによって生産される抗体は、遺伝子送達ストラテジー治療薬、創薬ツール、望ましくない標的分子の凝集を妨げること、ミスフォールドしたタンパク質障害に関連した疾患状態に対抗すること、癌関連の標的に結合し、中和し、その機能を調節することに可憐した使用を有し、限定されないが、それらを含んでもよい。
【００５２】
例えば、本明細書に記載の細胞内発現抗体は、ｓｙｋチロシンキナーゼ、及びアレルギー性障害に関わる他のタンパク質の活性を調節するために使用することができる（例えば、ＷＯ２００５１０６４８１を参照；また、Ｕｌａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００５，９：９０１−９２１も参照。ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）は細胞増殖の主要なメディエーターであり、多くの場合、癌治療における阻害のために標的化される（例えば、Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ ＪＳ ａｎｄ Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｒ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，４：９３７−９４７（２００４）を参照）。他の関心の高い標的は、微小管、及び関連タンパク質である（Ｊｏｒｄａｎ ＭＡ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，４：２５３−２６５（２００４）を参照）。
【００５３】
免疫抗体は、例えばＶｉｌｌａｎｉ，ＭＥら（Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ａ ｓｔａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５８（３）：３０５（２００５））に記載の方法を用いて、作物などの市販用に価値のある植物の疾患を処置又は予防するために使用可能である。
【００５４】
本明細書に記載の細胞内発現抗体は、ヒト又は動物細胞における感染を治療又は予防するために使用することができる。例えば、細胞内発現抗体は、例えば、Ｓｗａｎ，ＣＨ ｅｔ ａｌ，Ｔ−ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ＣＣＲ５ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１４８０−１４９２に記載の方法を用いて、ヒト免疫不全ウイルスによる細胞の感染を治療、改善、又は予防するために使用可能である。
【００５５】
本明細書に記載の細胞内発現抗体は、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，ＴＷら（Ａ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｉｎｔｒａｂｏｄｙ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ’ｓ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｔｒｉａｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ｄｉｓ．１９：４７−５６（２００５））及びＭｉｌｌｅｒ及びＭｅｓｓｅｒ（Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：３９４−４０１（２００５）に記載される神経障害に関与するタンパク質を標的化するために使用することができる。
【００５６】
本明細書に記載の細胞内発現抗体は、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＢＲ及びＺｈｕ，Ｚ（Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３：１４７３−１４８０（２００６）、並びにＤｏｏｒｂａｒ Ｊ．及びＧｒｉｆｆｉｎ Ｈ．（２００７）Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７（５），６７７−６８９に記載されるような癌タンパク質などの癌に関連したタンパク質を標的化することによって癌治療に使用することができる。
【００５７】
本明細書に記載の細胞内発現抗体は、例えば、Ｆａｎｇ ＣＹら（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥｐｓｔｅｉｎＯ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ５０：２５４−２６３（２００７））に記載の感染原によって発現されたタンパク質を標的化することによって感染（例えば、限定されないが、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）を治療するための使用可能である。
【００５８】
本明細書に記載されるように、細胞内発現抗体は、対象とする細胞内発現抗体をコードする発現ベクターを細胞に投与することによって細胞に投与し得る。細胞内発現抗体の発現に適切な発現ベクターは、当該技術分野において周知である。本明細書に記載の細胞内発現抗体をコードする発現ベクターの投与は、多数の周知なアプローチのいずれか１つ、例えば、限定されないが、単独でのプラスミド又はウイルス発現への核酸の直接的な転移、又は陽イオン性リポソームなどの担体との組み合わせによって達成することができる。このような発現ベクター（発現ベクターが細胞内に導入された場合に操作可能に連結されたコーディング配列を発現するのに適切であるプロモーター及びエンハンサー配列を含む）、このようなベクターの作製、使用、及び細胞への送達する方法は、当該技術分野において周知であり、細胞への細胞内発現抗体を投与するための使用に容易に適合され得る。
【００５９】
ベクターは、細胞に遺伝子を送達するための任意のヌクレオチド構築体であってもよく、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージすることができるレトロウイルスベクターが挙げられる（例えば、Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６を参照）。次に、組換えレトロウイルスを使用して感染させ、それによって、感染した細胞に本発明の核酸を送達することができる。変更した核酸を哺乳動物に導入する正確な方法は、当然に、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。他の技術は、この手法に幅広く利用可能である。例えば、アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：９４１−９４８，１９９４）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４：１４９２−１５００，１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７，１９９６）、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７，１９９６）の使用が挙げられる。また、物理学的な遺伝子導入技術を使用することができ、リポソーム送達、受容体を媒介した他のエンドサイトーシス機構が挙げられる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：４７２−４７８，１９９６を参照）。本発明は、これらの又は他の通常使用される遺伝子導入法のいずれかと組み合わせて使用可能である。トランスフェクションのための適切な手段には、ウイルスベクター、化学的形質転換体、又は物理機械的な方法、例えば、エレクトロポレーション及びＤＮＡの直接的な分散が挙げられ、例えば、ＷｏｌｆＦ，Ｊ．Ａ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載されている。
【００６０】
細胞透過性細胞内発現抗体（トランスボディ）は、ｓｃＦｖ抗体と、例えば、Ｈｅｎｇ，ＢＣ及びＣａｏ，Ｔ（Ｍａｋｉｎｇ ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｔｒａｎｓｂｏｄｙ）ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ（ＰＴＤ）ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｖｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ），Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ６４：１１０５−１１０８（２００５））に記載される方法に従って、細胞透過性抗体が細胞膜を通過し、細胞に入るのを可能にするタンパク質遺伝子導入ドメイン（ＰＴＤ）とを融合することによって細胞に投与可能である。あるいは、ｓｃＦｖは、完全抗体（Ｃｏｕｒｔｅｔｅ Ｊ．，Ｓｉｂｌｅｒ Ａ．Ｐ．，Ｚｅｄｅｒ−Ｌｕｔｚ Ｇ．，Ｄａｌｋａｒａ Ｄ．，Ｚｕｂｅｒ Ｇ．＆Ｗｅｉｓｓ Ｅ．（２００７）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ６ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．６，１７２８−３６）を用いた場合に示されるように、陽イオン性脂質と混合し、効率的に細胞に送達可能である。このような細胞透過性細胞内発現抗体は、細胞培養において（例えば、研究目的で）使用可能であり、研究目的で使用可能である（例えば、感染原を有することが疑われるヒト、動物、又は植物由来の細胞の試料中のウイルス又は微生物を検出することを目的とする）。このような細胞透過性細胞内発現抗体は、特定の標的抗原の活性を調節し、それによって動物における表現型を変更するために研究動物に投与することができる（例えば、限定されないが、全身投与、例えば、研究動物への細胞内発現抗体を静脈内に投与することによる、又は局所投与による）。また、このような細胞透過性細胞内発現抗体は、ヒト又はヒト以外の動物患者に投与し、上述される疾患又は感染を治療又は予防することができる。例えば、細胞透過性細胞内発現抗体は、静脈内、局所、経口、又は他の周知な方法によって投与することができ、当業者に承認される。
【００６１】
大規模な抗体生産のための本ｓｃＦｖ抗体の使用
ｓｃＦｖ抗体クローンは還元条件下でフォールドする抗体をコードするので、本明細書に記載のライブラリーもまた、細胞（例えば、細菌細胞などの原核細胞、又は酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの真核細胞など）内にｓｃＦｖ抗体を発現させることによって大量に生産され得るｓｃＦｖ抗体を同定し、細胞からｓｃＦｖ抗体を単離するために有用である。大量の抗体を精製することが望まれる一本鎖ｓｃＦｖ抗体は、限定されないが、例えば、実験室研究において有用であるｓｃＦｖ抗体が含まれ、医学的診断試験用、市販の診断試験又は他の種類の診断試験用（飲料水又は食物における汚染した微生物を検出するため）、抗体治療用（癌を治療するため、又は抗体が疾患を治療するために使用可能である感染又は他の種類の疾患を治療するため）が挙げられる。
【００６２】
発現したｓｃＦｖ抗体の単離のための抗体ライブラリーが本明細書に提供され、ここで、抗体ライブラリーには、少なくとも約：１０6、５×１０6、１０7、５×１０7、１０8、５×１０8、１０9、１．５×１０9、５×１０9、１０10、５×１０10、１０11、５×１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、又は１０16個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含み、ここで、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、又はそれを超えるｓｃＦｖ抗体クローンは、細胞内で発現することができ、ＯＤ６００ｎｍが約５となるまで増殖させたフラスコ内の細胞１リットルあたり、少なくとも５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、又は５０ｍｇを超えるレベルで可溶性抗体を生産する。
【００６３】
細胞由来の発現したｓｃＦｖ抗体などのタンパク質を発現及び精製するための多くの十分に許容されるアプローチがあり、当業者は、ｓｃＦｖ抗体を発現及び精製する細胞発現系の最も適切なタイプをどのように選択するのかを理解する。タンパク質発現のための方法を記載する多くのマニュアルが当該技術分野において周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００６を参照されたい。
【００６４】
定義
「固有の配列」とは、ｓｃＦｖ抗体クローンの回収の中で、ｓｃＦｖ抗体クローンの回収に含まれる他のクローンのＣＤＲ３配列とは異なるＣＤＲ３配列を含む少なくとも１０6個のクローンが存在することを意味する。ｓｃＦｖ抗体クローン又はこのようなクローンのライブラリーに関して、「固有の配列」は、ｓｃＦｖ１３Ｒ４内の対応する位置に存在する配列とは異なっている。
【００６５】
用語「抗体フラグメント」及び「フレーム配列」とは、ｓｃＦｖ抗体クローンの任意の固有でない位置、例えば、固有のＣＤＲ３ ＶＨ領域及び／又は固有のＣＤＲ３ ＶＬ領域でないｓｃＦｖ抗体の任意の位置を意味する。本明細書において言及されるように、抗体フレーム又はフレームワーク配列は、本ライブラリーが基礎とする親ｓｃＦｖクローンであるｓｃＦｖ１３Ｒ４のものである。
【００６６】
「実質的に同一」とは、比較される２以上のアミノ酸配列が、少なくとも９８％、９８．５％、９９％、又は９９．５％同一であるか、あるいは比較される２以上の核酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸残基は、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％同一であるアミノ酸配列をコードすることを意味する。
【００６７】
「共通配列」は、ｓｃＦｖクローンの間で共有するヌクレオチド又はアミノ酸配列を意味する。
【００６８】
「ｓｃＦｖ抗体クローン」とは、ＶＨ ＣＤＲ３ドメイン、ＶＬ ＣＤＲ３ドメイン内、又はＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ３ドメイン内の固有の配列を含むｓｃＦｖ抗体の個々の種をコードする核酸分子を意味する。
【００６９】
「標的抗原」とは、標的抗原ではない別の抗原への特定抗体の結合と比較して、特定の抗体によって優先的に結合される抗原を意味する。
【００７０】
「特異的に結合する」とは、抗体が、他の抗原に対する抗体の結合と比較して、特定の標的抗原に強力にかつ優先的に結合することを意味する。
【００７１】
「異所的に発現される」とは、対象とする抗原の発現が特定種の細胞内に自然には発現しないことを意味し、この場合、抗体が発現し、即ち、抗体が、細胞内に発現される。これは、抗体をコードする発現構築物は、細胞内に導入されている。
【００７２】
「単離された」又は「精製された」とは、ｓｃＦＶ抗体が、生成された細胞内の他の生物学的成分とは実質的に分離され、そこから分離して生成され、又はそこから分離して精製され、即ち、他の細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質などの他の細胞成分とは実質的に分離されていることを意味する。用語「単離された」又は「精製された」は、完全な精製を必要としない；むしろ、相対的な用語として意図される。好ましくは、ｓｃＦｖ抗体は、他の細胞成分とは分離された精製されるか又は単離され、その結果、ｓｃＦｖ抗体は、ｓｃＦｖ抗体調製物の全含有量の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれを超えて示される。
【００７３】
「可溶性」抗体は、抗体分子が凝集形態ではないことを意味する。可溶性抗体は、その標的抗原に特異的に結合する能力を有する。
【００７４】
「実質的に可溶性」とは、本明細書に記載される少なくとも２０％、例えば、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれを超えるｓｃＦｖ抗体が適切にフォールドされ、したがって、その標的抗原に特異的に結合することができる。
【実施例】
【００７５】
実施例１：細胞内発現のために最適化されたｓｃＦｖライブラリーの構築
材料
細菌株、化合物及び酵素
ＬＢ及び２×ＹＴ培地は、前述される（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９９２）。菌株Ｃ−Ｍａｘ５Ｆ’（Ｂｉｏ−ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、大腸菌Ｋ−１２，［Ｆ’ｌａｃｆq Ｔｎ１０］ψ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５デルタ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒk-ｍk+）ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１である。ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ ＃５３３３８）は、大腸菌Ｋ−１２、Ｆ−λ−ｈｓｄＲ２ ｈｓｄＭ＋ ｈｓｄＳ＋ ｍｃｒＡ ｍｃｒＢ１ ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９６Δ（ｌａｃＩＰＯＺＹ）Ｘ７４ ｇａｌＥ１５ ｇａｌＵ ｇａｌＫｌ６ ｒｐｓＬ ｔｈｉである。非サプレッサー菌株ＨＢ２１５１は、大腸菌Ｋ−１２［Ｆ’ｐｒｏＡ+Ｂ+ ｌａｃｌq ｌａｃＺΔＭ１５］ａｒａΔ（ｌａｃ−ｐｒｏ）ｔｈｉである。化合物はＳｉｇｍａから購入した。制限酵素及びクローニングされたＴａｑポリメラーゼはＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入した。ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、それぞれＱｉａｇｅｎ及びＰｒｏｍｅｇａから購入した。プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ及びアガロース分離したＤＮＡは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎキットを用いて精製した。
【００７６】
オリゴヌクレオチド
変性ＣＤＲ３ループを導入するために使用される１８個のスパイクされたオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＢＡ ＧｍｂＨ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＳ）を用いて精製した。１８個のスパイクされたオリゴヌクレオチドの配列は下記の通りである。Ｈ３ ｎ＝ｎ個のアミノ酸の長さＶＨ ＣＤＲ３ループ；Ｋ３ ｎ＝ｎ個のアミノ酸の長さＶＬカッパ（κ）ＣＤＲ３ループ；Ｌ３ ｎ＝ｎ個のアミノ酸の長さＶＬラムダ（λ）ＣＤＲ３ループ。変性位置に関して、４塩基の割合は、Ｎ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）として与えられる。各スパイクされた（変性された）位置で使用される各ヌクレオチドの割合は、下記の表１に示されている。
【００７７】
【化１】
【００７８】
【化２】
【００７９】
【化３】
【００８０】
表１．
＊変性した位置に関して、４塩基の割合はＮ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）として与えられる。
【００８１】
【化４】
【００８２】
【化５】
【００８３】
【化６】
【００８４】
【化７】
【００８５】
【化８】
【００８６】
ライブラリーを構築するために使用される他のオリゴヌクレオチドは、ＭＷＧによって合成され、下記の配列を有する：
【００８７】
【化９】
【００８８】
プラスミド
ファージミドベクターＰｈａｇｅｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＮＴＡＢ６（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９４，４７：１５７−１７１）は、線状ファージＭ１３のマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−ｓｃＦｖフラグメントのＮ末端融合のために使用された。このファージミドは、ｐＵＣ１１９由来であり、下記の順番で下記の配列を含む：ｌａｃプロモーター、ｐｅｌＢリーダー配列、ｓｃＦｖクローニングのためのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位、９Ｅ１０モノクローナル抗体によって認識されるＨｉｓ６及びｃ−ｍｙｃタグ、アンバーコドン及びｐＩＩＩ遺伝子配列。
【００８９】
大腸菌におけるｓｃＦｖの細胞質発現のために、本発明者らは、プラスミドｐＥＴ２３ＮＮを使用した。このプラスミドは、ｐＥＴ２３ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）由来であり、Ｔ７プロモーター、その後、ＡＴＧ開始を含むＮｃｏＩ部位、ＮｏｔＩ部位、その後、ｃ−ｍｙｃ及びＨｉｓ６タグを含む。
【００９０】
プラスミドｐｓｃＦｖ ＣＡＴはｐＴｒｃ９９Ａ由来であり、ｔａｃプロモーター、その後、フレーム外のｓｃＦｖのＡＴＧ開始を含むＮｃｏＩ部位、ＮｏｔＩ部位、その後のＣＡＴ遺伝子を含む。ｓｃＦｖがＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ部位内に挿入されると、ｓｃＦｖは、ＣＡＴタンパク質との融合体として発現される。構築は下記の通り行った：第１に、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ａ１３０３８）の固有のＢｓｔＥＩＩ部位は、消化、その後、平滑末端を形成するための５’突出の埋め、連結によって除去される。得られるプラスミドは、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩにより消化され、４２１０ｂｐのフラグメントが精製された（フラグメントＩ）。第２に、ＣＡＴ遺伝子内に位置したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｘ０６４０４３）は、部位特異的突然変異によって除去され、ＡＣＣのＴｈｒ１７２からＡＣＧに変更した。次に、ＣＡＴ遺伝子はＣＡＴ−ＮｏｔＩ．ｆｏｒ（ＴＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧ；配列番号２８）及びＣＡＴ−ＨｉｎｄＩＩＩ．ｂａｃｋ（ＡＣＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣ；配列番号２９）を用いたＰＣＲによって増幅させた。オリゴヌクレオチド配列では、導入された制限部位に下線を引き、ＣＡＴ遺伝子の開始及び終止をボールド・イタリックとした。６６０ｂｐのＰＣＲフラグメントは、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、精製した（フラグメントＩＩ）。第３に、７５０ｂｐのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ ｓｃＦｖ１３Ｅ６フラグメント（抗Ｅ６モノクローナル抗体のＣＤＲループを含むｓｃＦｖ１３Ｒ４のグラフトされたバージョン。Ｐｈｉｌｉｂｅｒｔらにより公開）を精製した（フラグメントＩＩＩ）。第４に、３つのフラグメントＩ、ＩＩ及びＩＩＩを連結し、プラスミドｐｓｃＦｖＣＡＴを得た。最後に、１６５ｂｐの内部欠失は、この遺伝子の２つのＰｓｔＩ部位の間のフラグメントを除去することによってｓｃＦｖに導入された。得られたプラスミドは、ｐｓｃＦｖＣＡＴと呼ばれ、ＡｍｐR及びＣＡＭSである。これは、ＰｓｔＩフラグメントの欠失は、ｓｃＦｖにおけるフレームシフトをもたらすためである。
【００９１】
プラスミドｐ５１３−ＥＧＦＰは、ｐＳＧ５の誘導体（Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８８，１６：３６９）、ＳＶ４０初期プロモーターの調節下で、ＥＧＦＰコーディング領域（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を囲む。ｐ５１３−ｓｃＦｖ−ＥＧＦＰ構築物は、１０残基のリンカーを有するｓｃＦｖ及びＥＧＦＰコーディング領域コーディング領域のフレーム融合体に対応する。
【００９２】
ｓｃＦｖコーディング領域はオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣ（配列番号３０）及び５’−ＴＴＧＡＴＴＡＣＴＡＧＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣ（配列番号３１）を用いて増幅させ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩ消化したｐ５１ ３−ＥＧＦＰベクターに挿入した。
【００９３】
最適化された抗体フレームワーク
ｓｃＦＶライブラリーの効果を最大限にするために、ライブラリーの構築は、細胞内発現抗体の選択のための単一の最適化された抗体フレームワークの選択から開始した。分子進化を通じて、ｓｃＦｖ１３Ｒ４と呼ばれるヒトｓｃＦｖを得て、それは、大腸菌の細胞質に高レベルで発現する。また、このｓｃＦｖが発現し、酵母及び哺乳動物細胞の両方において可溶性であり活性な構造を有する。このｓｃＦｖは、インビトロでは非常に安定であり、還元剤の存在下において復元することができる。さらに、そのフォールディングの分析は、親ｓｃＦｖよりも速くフォールディングし、インビトロではよりゆっくりと凝集することを示す。単離された変異体は、主に、ＶＨドメインに局在化し、この特定のｓｃＦｖに非常に特異的であるように見え、それは、それらが非常に相同なＶＨドメインに転移することができないためである。ｓｃＦｖ１３Ｒ４のヌクレオチド及びアミノ酸配列を下記に示す。
【００９４】
【化１０】
【００９５】
方法
ＣＤＲ３配列のデータベース
ＫａｂａｔデータベースのＲｅｌｅａｓｅ ５（１９９２年８月）を用い（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，及びＷｕ，Ｔ．Ｔ．：Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：３０ ｙｅａｒｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００，２８：２１４−２１８）。このデータセットには４４９９０配列が含まれる。第１に、４６４３個のヒトＶＨ配列は、偽遺伝子ではなく、ヒト化されておらず、抽出された。次に、Ｈ３配列は、このデータセットから抽出され、最初に、存在する場合にはヌクレオチド配列を考慮し、次にアミノ酸を考慮する。最後に、僅か２０個の標準のアミノ酸を含む３４６９個の完全なＨ３配列が、２７０３個が固有である中で維持された。同じ手法は、それぞれλ及びκ軽鎖のために行われ、７７５個及び８２８個が固有である１０４４及び１２９１個の配列をもたらした。
【００９６】
２００３年１１月２７日に既存のＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢデータベースからのＣＤＲ３配列も抽出された（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ，ｔｈｅ ＩＭＧＴ（Ｒ） ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００６，３４：Ｄ７８１−７８４）。「生産的／標準の／ヒト／ｃＤＮＡ＋ＲＮＡ／再配列された」遺伝子が考慮された。５１９Ｈ３、１４３２Ｋ３、及び１１３１Ｌ３配列が得られ、そのうち、４３２３Ｈ３、９７４Ｋ３、及び８１２Ｌ３配列は固有であった。
【００９７】
また、１２７個の追加のヒト抗体配列は、タンパク質データベース（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００，２８：２３５−２４２．）から回収した。この目的で、本発明者らは、２００３年８月１９日にＡｎｄｒｅｗ Ｍａｒｔｉｎによって既にコンパイルされた５１０個の配列のファイルを使用した（Ａｌｌｃｏｒｎ，Ｌ．Ｃ．及びＭａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．ＳＡＣＳ−ｓｅｌｆ−ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００２，１８：１７５−１８１）。
【００９８】
スパイクされたオリゴヌクレオチド設計
アミノ酸の表示を偏らせることにおいて、３つのコドン位置の各々でのヌクレオチドの最適化された混合物が前述のように設計された（Ｗａｎｇ，Ｗ．，及びＳａｖｅｎ，Ｊ．Ｇ．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００２，３０：ｅｌ２０；Ｐａｒｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ ２００５，２９：４０７−４２１）。タンパク質配列の未成熟終了は、停止コドンを実現する可能性に上界の０．０５を課すことによって制限された。アミノ酸の所望の可能性を十分に回収しなかった３４個の位置については、第２の最適化が同じ方法でなされたが、停止コドン頻度に制限を課さなかった。オリゴヌクレオチド合成に関して、計算された頻度は、下記の通り、５％増加の範囲内であった：０％〜５％の間の全ての頻度は、５％の概数で表された；他の頻度は、最も近似の５％の概数で表された；得られた合計が１００％を超える場合、５％は、５％を超える概数で表されたアミノ酸頻度から除去され、概数で表された頻度と標的頻度との間の相違は最大であり、合計まで累次積分されたプロセスは１００％であった；この合計が１００％を下回る場合、５％は、９５％を下回る概数で表された頻度に添加され、概数で表された頻度と標的頻度との間の相違は最大となり、合計まで累次積分されたプロセスは１００％であった。
【００９９】
ＶＨ及びＶＬライブラリーの構築
可変ＣＤＲ３配列は、鋳型プラスミドｐＡＢ１−ｓｃＦｖ１３Ｒ４ｐ（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｐ．，及びＢｅｔｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９９，２９２：９２１−９２９．）を用いたホットスタートプルーフリーディングポリメラーゼ（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ，Ｑｉａｇｅｎ）によりＰＣＲアセンブリによってｓｃＦｖ１３Ｒ４に導入された。ランダムＨ３ループを導入するために、ランダムＨ３配列を有する５’の遺伝子が、オリゴヌクレオチドＭ１３ｒｅｖ−４９及び１３個の変性オリゴヌクレオチドの１つを用いて得られ、３’は、ＰｌｉａｉｓｏｎＨ３及びＭ１３ｕｎｉ−４３（５５℃で２０サイクルについて）で得られた。このようにして、２つの精製されたバンドは、Ｍ１３ｒｅｖ−４９及びＭ１３ｕｎｉ−４３を用いたＰＣＲ（３０サイクル、５５℃）によってアセンブリされた。得られたＰＣＲは、市販のキット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製され、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ酵素を用いて１６時間、３７℃で設計され、次にゲル上で精製された。同じ手法は、使用されたプライマー対が５’端についてはＭ１３ｒｅｖ−４９／ＰｌｉａｉｓｏｎＬ３であり、その遺伝子の３’部分については、Ｍ１３ｕｎｉ−４３を含むＬ３／Ｋ３ループ（Ｋ３ ｎ又はＬ３ ｎ）をコードする変性オリゴヌクレオチドの１つであることを除いては、ランダムＬ３及びＫ３ループを導入するために行われた。
【０１００】
各々の消化されたバンドは、１００μｌの１μｇのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ消化され、精製されたｐｓｃＦｖΔＣＡＴに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの１０Ｗｅｉｓｓ単位を用いて１６時間、１６℃で連結された。連結は、熱処理による不活性化され、市販のキット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ）を用いて精製された。次に、連結は、３００μｌのＭＣ１０６１コンピーテント細胞（Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０００，３２８：３３３−３６３）に電気泳動され、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢの６００ｃｍ2の正方形プレート上に撒かれ、次に１６時間３℃でインキュベートした。１８個のライブラリー（１３ＢＨ及び５ＶＬ）は、１０％グリセロールを含む１０ｍｌのＬＢに播種され、１０9個の細菌は、即座に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧ及び３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含むＬＢの６００ｃｍ2の正方形プレート上に撒かれ、１６時間３７℃でインキュベートされた。その後、ライブラリーは、１０％グリセロールを含む１０ｍｌのＬＢに播種され、−８０℃で凍結された。アリコートを用いて、ライブラリーアセンブリーのためにＤＮＡを調製した。
【０１０１】
ライブラリーアセンブリー
１３個のＶＨライブラリーは、Ｐｆｕポリメラーゼ及びプライマーＭ１３ｒｅｖ−４９／ＰｌｉａｉｓｏｎＨ３．ｂａｃｋを用いて増幅させ、５ＶＬライブラリーは、ｓｃＦｖＣＡＴ．ｒｅｖ／Ｈ３ Ｌｉａｉｓｏｎを用いて増幅させた（３０サイクル、５５℃）。１８個のＰＣＲバンドを最初に精製し、次に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてゲル上で注意深く定量した。１３個のＶＨライブラリーは、ヒトＨ３におけるそれらの頻度に比例した量でプールされた。このミックスは、ＶＨプールと呼ばれた。２個のＶＬκバンドは、７５％の９アミノ酸長のループ、２５％の１０アミノ酸長のループを得るためにプールされた。ＶＬλバンドは、３０％の９アミノ酸長のループ、３０％の１０アミノ酸長のループ、４０％の１１アミノ酸長のループを得るためにプールされた。最後に、κ及びλミックスは、ＶＬプールと呼ばれる最終のミックスに各クラスの５０％を得るためにプールされた。
【０１０２】
ＶＨプール及びＶＬプールは、５００μｌ中で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーＭ１３ｒｅｖ−４９／ｓｃＦｖＣＡＴ２．ｒｅｖを用いたＰＣＲによってアセンブリされた（３０サイクル、５５℃）。ＰＣＲは、少なくとも各々６時間、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩの２０ユニットを用いて首尾よく消化し、精製し、その後、ゲル上で定量した。５０μｇのベクターｐＣＡＮＴＡＢ６は、各々少なくとも６時間、８０ユニットのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで首尾よく消化され、精製され、次に、ゲル上で定量された。５μｇの直線化されたｐＣＡＮＴＡＢ６は、５０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で５００μｌにおいて、等モル量のインサート（０．８４μｇ）と連結された。連結は熱により不活性化され、市販のキット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ）を用いて精製された。次に、精製された連結は、１０×３００μｌのＣ−Ｍａｘ５αＦ’コンピーテント細胞においてエレクトロポレートされ（Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０００，３２８：３３３−３６３）、１％のグルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢの１０個の６００ｃｍ2の正方形プレート上に播種された。１６時間３７℃でのインキュベーション後、細胞は、１０％グリセロールを含む２×ＹＴに集められ、２０倍の多様性に対応するアリコートにおいて−８０℃で凍結維持された。
【０１０３】
抗原
Ａｕｒｏｒａ−Ａは、Ｈｉｓタグ化されたタンパク質であり、大腸菌で生産された。ＧＳＴ：Ｓｙｋは、大腸菌で発現させた（Ｄａｕｖｉｌｌｉｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｓｙｋ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｆｃ ｅｐｓｉｌｏｎ ＲＩ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ＲＢＬ−２Ｈ３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２ １６９：２２７４ ２２８３）。パピローマウイルスＨＰＢ１６由来のＥ６タンパク質は、シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑら、公開）において発現された。ヒストン（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３及びＨ４のミックス）をＳｉｇｍａ（タイプＩＩ−ＡＳ、＃Ｈ７７５５）から購入した。チューブリンをブタ脳から精製した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｃ．Ｊ．，及びＬｅｅ，Ｊ．Ｃ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｕｌｉｎ ｆｒｏｍ ｂｒａｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８２，８５（Ｐｔ Ｂ）：３７６−３８５）。
【０１０４】
ライブラリー救出及び選択
ライブラリー救出は、トリプトン感受性ヘルパーファージを用いて、基本的には、前述されるように行った（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．，及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ １９９８，３：３２１−３２８）。要約すると、１０〜２０倍過剰である多様性（２〜３×１０10個の細菌）に対応するライブラリーのアリコートは、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％グルコースを含む１０００ｍｌの２×ＹＴに撒かれ、ＯＤ６００nmが０．７になるまで３７℃で振とうしながら増殖させた。２００ｍｌ（約３×１０10細胞）は５×１０１１ヘルパーファージＫＭ１３（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．，及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．ＦｏｌｄＤｅｓ １９９８，３：３２１−３２８）で感染され、振とうなしに３０分間３７℃でインキュベートされた。細胞をペレットにし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１０００ｍｌの２×ＹＴに再懸濁させ、激しく振とうしながら３０℃で一晩インキュベートされた。ファージを含む上清は、５分の１量のＰＥＧ−８０００ ２０％、ＮａＣｌ ２．５Ｍを添加することによって沈殿させ、１５％グリセロールを補足されたＰＢＳに再懸濁させた。１０11〜１０12のファージを含むアリコートを−８０℃で保存した。
【０１０５】
結合剤の選択のために、１００μｌの精製抗原が、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルプレートにコートされた。第１ラウンドでは、１０〜１００μｇ／ｍｌの抗原濃度を使用した。その後のラウンドについては、１〜１０μｇ／ｍｌの抗原濃度を使用した。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を用いてプレートを３回洗浄し、２％脂肪を含まないミルク（ＭＢＰＳ）を用いて２時間室温で飽和した。１０11〜１０12のファージが、２％ＭＰＢＤＳでウェルあたりに添加され、２時間室温でインキュベートされた。プレートをＰＢＳＴで２０回（第１ラウンド）又は４０回（第２及び第３ラウンド）洗浄し、次にＰＢＳで３回洗浄した。過剰なＰＢＳを除去し、ファージは、１０分間室温で、１００μｌの１００ｍＭトリエチルアミンの添加によって溶出された。溶出されたファージ懸濁液は、５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４を用いて中和され、次に、１．５μｌの０．１Ｍ ＣａＣｌ2、１５μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理したトリプシン（Ｓｉｇｍａ）の添加によって、トリプシンで１５分間室温で消化された。２×ＹＴ中の３７℃で指数関数的に増殖しているＣｍａｘ５αＦ’菌株の１ｍｌに４０μｌのトリプシン処理したファージを感染させ、振とうせずに３０分間、３７℃でインキュベートし、次に、１５ｃｍの丸いペトリ皿上に播種した（ＬＢ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコース）。３７℃で一晩インキュベーション後、プレートから細菌を回収し、ＫＭ１３ヘルパーファージを用いたファージの新しいストックを調製するために用いた。このストックの１０11〜１０12のファージを次の選択のためのラウンドに使用した。
【０１０６】
ペリプラスム及び細胞質スクリーニング
ペリプラスムスクリーニングに関して、ラウンド３のファージを用いて、非サプレッシブ菌株ＨＢ２１５１に感染させた。個々のクローンは、（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９９６，２６７：８３−１０９）に記載されるように、抗原をコートした９６ウェルのマイクロタイタープレートによってｓｃＦｖ発現について試験された。細胞質スクリーニングに関して、プラスミドは、第２又は第３の選択ラウンドの細菌プールから調製し、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、７５０ｂｐバンドが、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ消化され、脱リン酸化されたプラスミドｐＥＴ２３ＮＮにクローニングされた。連結は、Ｃ−Ｍａｘ５αＦ’に形質転換され、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢに細胞を蒔き、１６時間３７℃でインキュベートした。細胞を回収し、プラスミドＤＮＡを調製し、これを用いて化学的にコンピーテントなＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した。個々のクローンは、１００μｌの２×ＹＴ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む９６ウェルマイクロタイタープレート中で激しく振とうしながら、３７℃で、ＯＤ６００nmが０．６に到達するまで増殖させた。ＩＰＴＧを最終０．４ｍＭまで添加し、マイクロタイタープレートを湿気雰囲気下で激しく振とうしながら、２４〜３０℃で１６時間インキュベートした。遠心分離後、細胞を１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、凍結／融解し、氷上で１時間インキュベートした。ＭｇＣｌ2を最大１０ｍＭ添加し、ＤＮＡを１０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩで消化した。５〜２０μｌは、抗原をコートした９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ）上でＥＬＩＳＡに使用された。暴露は、９Ｅ１０モノクローナル抗体、その後、ＨＲＰ結合させた抗マウスＩｇＧ抗体を用いて行われた。
【０１０７】
ｓｃＦｖの精製
プラスミドｐＥＴ２３ＮＮにクローニングされたｓｃＦｖは、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの細胞質から精製され、親ｓｃＦｖ１３Ｒ４（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９８，２８０：１１７−１２７）について記載されるように、Ｎｉ−ＮＴＡカラムで精製した。
【０１０８】
細胞トランスフェクション及び免疫蛍光
ＨｅＬａ細胞は、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）及び１０％熱不活性化したウシ胎児血清を補足したダルベッコ変法イーグル組織培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃、湿度５％、ＣＯ2雰囲気下で維持した。一時的なトランスフェクションは、製造業者の使用説明書に従ってＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ脂質試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。トランスフェクションの前日に、６ウェルプレートのカバースリップ上に２．５×１０5細胞／ウェルで細胞を播種した。１μｇのＤＡＮ、１００μｌのＤＭＥＭに希釈した２μｌの試薬を混合し、室温で２０分間放置した。混合物を添加してから２４時間、３７℃で細胞を増殖させた。発現されたＧＦＰタグ化したタンパク質は４５分間室温で、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いてトランスフェクトした細胞の固定後に視覚化された。ＰＢＳで過剰に洗浄後、細胞を死滅させ、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）でマウントした。処置された細胞は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ５０カメラを搭載したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡を用いて試験した。Ｚｅｉｓｓ４０×ｐｌａｎ−ｎｅｏｆｌｕａｒ対物で画像を回収し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ５．５を用いて加工した。図８に関して、ＨｅＬａは、ｄｓＲｅｄモノマーＧＦＰに融合した抗ヒストンクローン５でトランスフェクトされ、上述されるように固定され、Ｔｒｉｔｏ Ｘ−１００（０．２％、５分）で透過された。微小管ネットワークは、９Ｅ１０抗ｍｙｃ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、３μｇ／ｍｌで２Ｆ１２Ｃ ｓｃＦｖ（表３）を用いて示された。細胞は、共焦点顕微鏡によって観察された（×６３）。
【０１０９】
結果
工程１：抗体フレームワークの選択
ｓｃＦｖライブラリーの有効性を最大限にするために、ライブラリーの構築は、細胞内発現抗体の選択のために単一の最適化された抗体フレームワークの選択から開始した。分子進化を通じて、ｓｃＦｖ１３Ｒ４と呼ばれるヒトｓｃＦｖを得て、これは、大腸菌の細胞質に高レベルで発現する。また、このｓｃＦｖは、酵母及び哺乳動物細胞において発現され、可溶性及び安定な構造を有する。このｓｃＦｖは、インビトロでは非常に安定であり、還元剤の存在下で復元可能である。さらに、そのフォールディング動力学の分析は、それが親ｓｃＦｖよりも速くフォールディングし、インビトロではよりゆっくりと凝集することを示した。単離された突然変異体は、主にＶＨドメインに局在化し、この特定のｓｃＦｖに非常に特異的であるようである。ｓｃＦｖ１３Ｒ４のヌクレオチド及びアミノ酸配列を下記に示す。
【０１１０】
工程２：ＣＤＲ３配列への多様性の導入
ａ）ヒトＣＤｒ３配列のデータベース
ヒトＣＤＲ３配列は、３つの主要な供給源からコンパイルされた：Ｋａｂａｔデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．及びＷｕ，Ｔ．Ｔ．Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：３０ ｙｅａｒｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００，２８：２１４−２１８）、ＩＭＧＴデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ，ｔｈｅ ＩＭＧＴ（Ｒ）ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００６，３４：Ｄ７８１−７８４）、及びＲＣＳＢ ＰＤＢ（Ｂｅｒｍａｎ， ＨＭ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００，２８：２３５−２４２）。二重を取り出した後、データベースは、５１７９Ｈ３、１４３２Ｋ３、及び１１３１Ｌ３ＣＤＲ３固有の配列を含んでいた。大部分のＨ３配列は固有であることを気付くことができ、それは、例えば、Ｋａｂａｔデータベースでは、２３６８Ｈ３配列（８８％）は、２７０３の完全なＨ３配列のうちのただ一度であったためである。結果は、Ｌ３及びＫ３の場合において同等であり、それは、それぞれ８７％及び８２％の配列がＫａｂａｔデータベースにおいて固有であったためである。これは、ヒトＣＤＲ３配列の非常に高い可変性を強調する。
【０１１１】
しかしながら、この可変性は、ループにおいて均一に分布されておらず、各アミノ酸の頻度は、各ループに対して、１つの位置から別の位置へと変化する。さらに、アミノ酸分布は、抗体配列の起源に依存する。この偏りは、例えば、終わりから３番目の残基の場合として構造的制約に起因する可能性があり、それは、しばしば、アスパラギン酸塩（Ｋａｂａｔ番号付けスキームを用いるとＤ１０１）であり、Ｈ３の拡張した構造と屈折した構造との間のスイッチにおいて重要な役割を果たす。他の場合には、このバイアスは、Ｄ及びＪセグメントに対して利用可能な配列の制限された数に起因するだけであってもよく、天然の抗体に見出されたもの以外のアミノ酸が容認されてもよい。
【０１１２】
ライブラリーの構築に関して、天然の分布を模倣するＣＤＲ３を作製することが決定され、それには２つの主な理由がある：ｉ）１つの目的は、ヒトの治療における可能な使用に対してできるだけヒトとなるようにｓｃＦｖを生じさせることである；ｉｉ）天然のアミノ酸分布を維持することが機能的抗体をより可能にもたらす。
【０１１３】
データベースからのＣＤＲ３配列は、長さによって整列され、各位置での各々の２０個の可能なアミノ酸の頻度、各ループ長の頻度を計算した。軽鎖ＣＤＲ３の場合には、配列は、各クラスについて独立して分析された。Ｈ３配列の場合には、これは、結果として３５個の表に示され、１と３４とのアミノ酸の間の各Ｈ３長さについての１つである。長さｎのループに関しては、この表は２０ｎ頻度を含んでいた。
【０１１４】
ｂ）ＣＤＲ３ループをコードするためのオリゴヌクレオチド設計
１８個のオリゴヌクレオチドは、コンパイルされたＣＤＲ３データベースに見出されたアミノ酸分布に従うように設計された。コドンの各位置での４つのヌクレオチドの１９２個の最適化されたミックスを用いて、所望のアミノ酸分布を用いてできるだけ十分に合致させた。このアプローチの腫瘍な利点は、より良好なオリゴヌクレオチドの質をもたらす伝統的なオリゴヌクレオチド合成を必要とするだけであるということである。しかしながら、遺伝コードの制限のために、任意のアミノ酸分布を正確に従うことができない。さらに、ライブラリーは天然のアミノ酸分布を厳格に従わない場合、これは、ＣＤＲ３ループにおける対象とする非天然の多様性を誘導する場合がある。
【０１１５】
２４９個の可変位置について最適化されたミックスを最初に計算し、終止コドンの最少頻度とこの分布を合致させ、次に、標的分布とは非常に離れ過ぎている３４個の位置は、この最後の制限を緩和することによってさらに最適化された。遺伝コードの制限のために、ある位置は、完全には最適化されなかった。例えば、位置３では、アラニン及びグリシンは、本発明者らのミックスにおいて表されないままであり、他のアミノ酸頻度と合致させるために、天然には見出されない、システイン様のいくつかのアミノ酸の実質的な量を誘導することが必要であった。しかしながら、データベースとオリゴヌクレオチドをコードした頻度との間には良好な全体の承知があり、これは、大部分のよく見られるアミノ酸がライブラリーにおいて最大の比率で示され、まれなアミノ酸は、通常、低い頻度で存在していた。ＣＤＲ３ループを構築するために使用された１８個の変性オリゴヌクレオチドの配列は、上記で提供される。
【０１１６】
ｃ）ＶＨ及びＶＬ鎖のためのＣＤＲ３ループライブラリーの構築
各ＣＤＲ３ループ長についての独立したライブラリーを構築した。これは、重鎖及び２種の軽鎖の各々について独立してなされた。各ライブラリーに関して、ランダムＣＤＲ３ループは、ＰＣＲによって導入され、次に、得られたライブラリーは、ｓｃＦｖ１３Ｒ遺伝子に戻ってクローニングされ、それは、ベクターｐｓｃＦｖＣＡＴのＣＡＴ遺伝子に融合された。これは、１つ及びただ１つの無作為化されたＣＤＲ３ループを有するｓｃＦｖ１３Ｒ４クローンのライブラリーをもたらした。
【０１１７】
５アミノ酸長のＨ３ループライブラリーを最初に構築した。４３個の無作為に選択されたクローンを配列決定した。いくつかの位置は、２０アミノ酸についての頻度の期待された値と異なるが、平均して、ライブラリーにおけるアミノ酸の分布は期待された分布と合致していた。これは、オリゴヌクレオチドの質が良好であり、得られたライブラリーがヒトＨ３ループにおけるアミノ酸の天然の分布に従っていたことを示した。
【０１１８】
【化１１】
【０１１９】
aＣＡＴとの融合としてクローニングされ、アンピシリン上で選択されたライブラリーの最初の多様性。これは、形質転換後に得られたクローン数である。
b形質転換からの１２〜２０クローンがＣＡＭプレート上で検査された。プレートは、１６時間３７℃でインキュベートされ、コロニーサイズを推定した。カラム＋＋、＋及び−は、それぞれ、正常に増殖され、小さなコロニーを提供し、全く成長しなかったコロニーの分画を示す。
cＣＡＭ上で選択されたライブラリーの多様性。多様性は、最後の多様性が（最初の多様性）×（ＣＡＭ表現型＋＋）に近いことを想定することによって、カラム「最初の多様性」及び「ＣＡＭ表現型」あら推定される。現実の多様性はより高いかもしれないが、これは、カラム「ＣＡＭ表現型」において＋で記されたクローンのいくつかが低い量で存在していたかもしれないためである。
【０１２０】
工程３：発現しない配列の除去
期待されるように、ＶＨ及びＶＬライブラリーの構築から形成されたクローンの全てが、３つの主要な理由のために本質的であったわけではない：ｉ）多様性を導入するために使用されたオリゴヌクレオチドは終止コドンを含む場合がある；ｉｉ）終止コドン又はフレームシフトはＰＣＲ及びクローン工程によって導入されてもよい；又は（ｉｉｉ）ｓｃＦｖは細胞質ではあまり発現しない。これらの機能的ではないｓｃＦｖクローンを除去するために、発現したクローンは、下記に記載されるようなＭａｘｗｅｌｌ ＫＬら（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １９９９；８：１９０８−１９１１）の方法を用いて、ｓｃＦｖ遺伝子とクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素とを誘導させることによって選択された。
【０１２１】
ｓｃＦＶ−ＣＡＴ融合タンパク質の創作
要約すると、ｓｃＦｖライブラリーは、ｔａｃプロモーターの調節下でベクターｐｓｃＦｖ−ＣＡＴのＮｃｏＩとＮｏｔＩ部位との間で独立して、下流の遺伝子とフレームを合わせてクローニングされた。したがって、ｓｃＦｖ−ＣＡＴ融合タンパク質は細胞質で発現した。ｓｃＦｖが終止コドンの封入又はフレームシフト変異のために適切に発現されない場合、あるいは細胞質でフォールディングができない場合、得られたｓｃＦｖ−ＣＡＴタンパク質は、発現されないか又は活性でなく、その結果としてクロラムフェニコール感受性（ＣＡＭS）表現型となる。他方、ｓｃＦｖが適切に発現されると、得られるｓｃＦｖ−ＣＡＴタンパク質は、細胞質で十分に発現され、細菌は、クロラムフェニコール耐性（ＣＡＭR）となる。クロラムフェニコール（ＣＡＭ）濃度を調整することによって、異なる可溶性レベルのｓｃＦｖ−ＣＡＴタンパク質の発現を選択さえ可能となる。
【０１２２】
異なるＣＡＭ濃度は、１５〜２００μｇ／ｍｌの範囲のこの選択工程について試験した。最高濃度のＣＡＭでは、ライブラリーは、十分に発現したｓｃＦｖに富んでいた。また、ｓｃＦｖ遺伝子の部分的又は完全な欠失を有する組換えファージミドをクローンは含んでいた。次に、ライブラリーは、培地ＣＡＭ濃度（３０μｇ／ｍｌ）上で播種された。この濃度は、全ての発現していないか又は強力に凝集しているｓｃＦｖを除去するには十分に高いが、ｓｃＦｖ欠失を有する検出な可能なプラスミドには至らなかった。
【０１２３】
ライブラリーの最終サイズを見積もるために、少なくとも１２クローンが画ライブラリーから単離され、ＣＡＭＲクローンの分画を測定するためにアンピシリン及びＣＡＭ上で選択された。あるクローンは、アンピシリン／ＣＡＭ／ＩＰＴＧプレート上で素早く成長し形質転換された（表２、カラム＋＋）、あるものはゆっくりと増殖し（カラム＋）、あるものは全く増殖しなかった（カラム−）。発現したｓｃＦｖのライブラリーのサイズは、したがって、ＣＡＭRクローンの頻度によって、元々のライブラリーサイズ（アンピシリン上で選択される）の生産物として見積もられた。１８ライブラリーのサイズは、表２の最終カラムに提供され、２．５×１０6〜１．９×１０8の範囲であった。
【０１２４】
工程４：ＣＡＭ選択されたライブラリーのアセンブリ
最終ライブラリーは、５ＣＡＭ選択されたＢＬライブラリーを用いた１３ＣＡＭ選択されたＶＨライブラリーを再度組み合わせることによってアセンブリされた。理論的に可能な多様性は、１０15（約１３ＶＨ×１０7×５ＶＬ×１０6）である。これは、エレクトロポレーションによって得ることができたライブラリーよりも非常に大きい。つまり、最終ライブラリーにおいて同じクローンを２回得る可能性は非常に小さい。
【０１２５】
１３個のＶＨライブラリー及び５個のＶＬライブラリーは、１７ヌクレオチドの重複配列を用いたＰＣＲによって増幅し、次に精製し、アガロースゲル上で定量した。その後、ＢＨ及びＶＬ精製フラグメントは、ヒト抗体のＣＤＲ３ループ長の天然の部分に比例した量でプールされた（図３ａ）。最後に、ＶＨ及びＶＬミックスは、ＰＣＲによってアセンブリされ、消化され、ファージディスプレイに安定なベクターにクローニングされた。ライブラリーは、菌株Ｃｍａｘ５αＦ’にエレクトロポレートされ、１００個の無作為に拾い上げられたコロニーについてＰＣＲにより検査されたように、ｓｃＦｖインサートを含む１．５×１０9個のクローンのライブラリーを得た。１８個のＣＡＭ選択されたライブラリーは、ヒト抗体のＣＤＲ３ループ長の天然の分布に比例した量でアセンブリされ、１０億個を超えるクローンの最終ライブラリーを形成した。
【０１２６】
１１８個のクローンは、ループ長及び配列を決定するために配列決定された。ほぼ全てのループ長がライブラリーに見出された。また、１１及び１６個のアミノ酸長のループは、ライブラリーにおいて少数派であった。これは、恐らくは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｉｚｅｒに関するそれらのプロフィールによって示されるように、これらのオリゴヌクレオチドの貧弱な質に起因するためである。７〜１２の範囲にあるループ長は、ライブラリーにおいて多数派であって、ヒト抗体において最も頻繁に見出され、ライブラリーに全て存在する。配列決定されたクローン数は、非常に少なく、ＣＤＲ３ループに見出されたアミノ酸の頻度を分析することができなかった。元々のｓｃＦｖ１３Ｒ４配列によるいくつかの汚染を除いて、ＣＤＲ３配列はライブラリーに２倍見出されなかった。
【０１２７】
細胞におけるｓｃＦｖの発現
ＣＡＭ選択工程の新規な使用のため、ＶＨ及びＶＬライブラリーは、独立して、細胞における発現のために最適化された。ＶＨ及びＶＬライブラリーのこの最適化のため、結果は、発現されたｓｃＦｖ１３Ｒ４だけでなければならない。さらに、ＣＤＲ３ループだけが、元々のｓｃＦｖ抗体フレームワークと得られたｓｃＦｖライブラリーとの間で修飾されるので、２つのドメイン間の大部分の接合部分は、クローン間で保存されている。したがって、任意のＶＨは、任意のＶＬと正確にアセンブリされ、得られるｓｃＦｖの発現レベルは、ＣＡＭにおいて選択されるＶＨ及びＶＬライブラリーからの両方のクローンのものに近いこと考えられる。換言すれば、ＶＨは、修飾されたＨ３ループを有し、ＶＬ１３Ｒ４に融合されると十分に発現される場合、修飾されたＣＦＲ３ループを有するＶＬと結合し、ＶＨ１３Ｒ４との融合体として選択される場合に十分に発現する。この仮説は、最終のライブラリー由来のランダムクローンを拾い上げ、大腸菌の細胞質及び哺乳動物の細胞質ゾルにおいてそれらを発現させることによって試験された。
【０１２８】
ＤＮＡは、最終ライブラリー、及び強力なＴ７プロモーターの調節下で細胞質発現のためのプラスミドにおいてクローニングされたｓｃＦｖ遺伝子から調製された。このような強力なプロモーター下で得られる非常に高発現レベルは、凝集プロセスの高い動力学オーダーのために可溶性発現を超えた凝集を支持することが気付くべきである。したがって、この試験のストリンジェンシーが高く、より弱いプロモーターを用いることによって可溶性対不溶性の比を増加させることが可能である。２０個のクローンが大腸菌において試験され、それらのうちの１９個が細胞質において少なくとも幾分可溶的発現を示した（図３）。クローンの４分の１（５／２０；クローン３、１０、１１、１６、１９）は、ｓｃＦｖがクーマシー染色されたゲル上で明確に視覚可能であるため、非常に高レベルで発現された。大腸菌における可溶性発現レベルのより全体的な見解を得るために、ライブラリーは、Ｔ７プロモーターの調節下でＧＦＰｕｖ遺伝子の前でクローニングされた。ｓｃＦｖは可溶性であり、細胞質において発現される場合、これは、ＵＶトランスイルミネーターで直接的にモニターされ得る緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）活性をもたらすべきである。約１０００個のクローンは、検出可能なＧＦＰ活性の存在について試験され、約６０％がＧＦＰ+を示し、それは、再度、最終ライブラリー由来のｓｃＦｖの大部分が大腸菌の細胞質に正確に発現されることを示した。これらの２つの試験は、上述されるｓｃＦｖライブラリーを構築する新規な方法が大腸菌における細胞質発現したｓｃＦｖを非常に首尾よく生じさせることを示した。
【０１２９】
次に、哺乳動物におけるライブラリーの発現を試験した。１５個のｓｃＦｖは、ＥＧＦＰ遺伝子との融合体として、ＳＶ４０初期プロモーターの調節下で哺乳動物発現ベクターにクローニングされた。典型的な結果を図４に示す。３つのクローンは、高い可溶性レベルで発現され、親ｓｃＦｖ１３Ｒ４（クローン１５）のものに匹敵し、１０ｓｃＦｖは主に可溶性であることが見出されたが、いくつかの凝集した材料はなお細胞（クローン３３及び３６）に存在し、２つのクローンは、細胞質凝集体として本質的に体積し（クローン２４）、ハイブリドーマ誘導の抗癌タンパク質Ｅ６ｓｃＦｖ１Ｆ４を用いて観察された（図４）。結論として、試験された１５個のｓｃＦｖのうち１３個が、トランスフェクトされた細胞の細胞質及び核において容易に検出可能である可溶性タンパク質として発現された。
【０１３０】
同時に、これらの結果は、最終ライブラリー由来の８５％を超えるクローンが大腸菌（１６／２０）、哺乳動物細胞質（１３／１５）において可溶性ｓｃＦｖを発現し、一方、それらの約２０％が非常に高レベルでｓｃＦｖを発現した（大腸菌では５／２０、真核細胞では３／１５）。全体として、大部分のクローンは、細菌及び真核細胞質の還元条件下で十分に発現した。これは、最適化されていないｓｃＦｖライブラリーを用いて以前に得られた結果と比較して非常な改善である。
【０１３１】
結合剤の検出
上記で示されるように、ライブラリーは、非常に高い比率の発現されたクローンを含む。次の工程は、特定のタンパク質に対して、ライブラリーから抗体を選択することである。したがって、ファージディスプレイライブラリーは、マイクロタイタープレートに吸着した精製されたタンパク質を用いた５つの異なる抗原に対する結合剤について選択した。選択の３ラウンドを行い、溶出したファージは、固相化された抗原に対してＥＬＩＳＡによって試験された。全ての場合において、陽性シグナルは、１回のラウンドの選択後に得られた。このシグナルは２回のラウンド後に増強されたが、第３ラウンドの選択中にさらに増加することはなかった。この非常に早い選択プロセスは、恐らくは、低いバックグラウンドをもたらす発現されたｓｃＦｖだけを含むフォーカスされたライブラリー自体、並びにバックグラウンドレベルをさらに減少させたトリプシン感受性ヘルパーファージの使用に起因する。
【０１３２】
選択プロセスを特徴付けるために、６０個のクローンは、ＧＳＴ：Ｓｙｋ融合に対する３つの選択ラウンドから選択された。これらのクローンを用いて、モノクローナルファージを調製し、次に、ＥＬＩＳＡによって抗原への結合について試験した。図７は、各選択ラウンドについて得られたＥＬＩＳＡ値の分布を示す。この分布は正常であり、各選択のラウンドにおいてシグナルが非常に均一であった。これは、半分を超えるクローンが、０．１のピーク値内のＥＬＩＳＡシグナルを示したためである。選択プロセス中、１回のラウンド後の０．４〜０．５から、ラウンド２後の０．２、ラウンド３の１．０にピークシグナルが増加し、ポリクローナルファージを用いて得られた結果と良好な相関を示した。さらに、選択の１回のラウンド後、ほぼ１００％のクローンは、既に抗原を認識した。これは、トリプシン感受性ヘルパーファージと組み合わせた最適化されたライブラリーの使用が、結果として、選択プロセス中にバックグラウンドのほぼ全体的に存在しないことを示した。
【０１３３】
次に、ライブラリーがペリプラズムにおいて可溶性ｓｃＦｖを発現しているクローンを含むかどうかを試験した。非サプレッシブＨＢ２１５１菌株は、チューブリン、ＧＳＴ：Ｓｙｋ及びコアヒストンに対する第３ラウンドの選択後に溶出されたファージで感染させた。ペリプラズム抽出物を調製し、ＥＬＩＳＡによって結合活性を試験した。３つの場合において、１２〜２０％のクローンが、０．５（バックグラウンドの１０倍）よりも高い吸光度値を有する強力なシグナルを与え、約３０％が明らかに陽性であり、０．１（バックグラウンドの２倍）よりも高い吸光度値を有した。これらの結果は、他のｓｃＦｖライブラリーを用いて報告されたものと有利に比較され、ライブラリーに存在する、高比率の十分に発現されたクローンに対して強調する。さらに、これは、ＣＡＭ選択アプローチがオリゴヌクレオチドに存在する終止コドンを含まない構築物について効率的に選択されることを示した。これは、ファージディスプレイされたライブラリーから可溶性ｓｃＦｖを単離する非常な重要性が確かであり、ＣＤＲのアンバー終止コドンが合成及び半合成ライブラリーのパンニング中に頻繁に選択されるためである。
【０１３４】
従来の特徴付けの両方において、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合体又は可溶性タンパク質として大腸菌ペリプラズムにおける酸化条件下で発現された。さらに、パンニングは、酸化条件下で再度ファージで行われた。ｓｃＦｖがまた細胞質で確実に発現されるかどうかを試験するために、同じプールのクローン（ラウンド３）が、強力なＴ７プロモーターの調節下で細胞質発現ベクターにサブクローニングされた。各抗原に対して、９５個のクローンが、それらのそれぞれの抗原への結合についてＥＬＩＳＡによって試験された。各場合において、陽性クローンの数は、ペリプラズムでのスクリーニングと同程度であるか、又はさらには良好であった。例えば、ＧＳＴ：Ｓｙｋの場合には、８０％の試験されたクローンが、３ラウンドの選択後に陽性であった。これは、ペリプラズム選択工程が細胞質の可溶性ｓｃＦｖの比率を減少しなかったことを示した。さらに、上述される最適化されたライブラリーを用いると、選択中の偏りの導入を避けるために、細胞質内で直接的に選択することは必要でない。
【０１３５】
チューブリンに対する第２及び第３ラウンドの選択からの個々のクローンが配列決定された。配列を表３に示す。
【０１３６】
【化１２】
【０１３７】
第２（５クローン）及び第３（６クローン）ラウンドの選択由来の細胞質発現されたｓｃＦｖを用いたＥＬＩＳＡにおける最良の陽性クローンのＣＤＲ３の配列（表３）。a同じラウンドの配列決定されたクローンの間のｓｃＦｖの出現の頻度。b収率：フラスコ内で増殖させた１リットルの細胞から精製したｓｃＦｖのｍｇ（ＯＤ600＝５）。cＷＢ：ウェスタンブロットによる脳抽出物に含まれるチューブリンの検出。dＩＦ：＋は、ｓｃＦｖが免疫蛍光によって微小管ネットワークを表すことができることを意味する（図８）。クローン２Ｃ１Ｃ、２Ｅ１１Ｃ、２Ｆ１２Ｃ、２Ｇ４Ｃ及び２Ｇ９Ｃの配列は、ＥＭＢＬデータベースに提出され、それらの受け入れ番号は、それぞれ、ＡＭ８８６２８０、ＡＭ８８６２８１、ＡＭ８８６２８２、ＡＭ８８６２８３及びＡＭ８８６２８４である。
【０１３８】
全ての場合において、配列決定されたクローンは、細胞質に発現されたｓｃＦｖを用いて行ったＥＬＳＩＡにおいて最良のシグナルを与えるものであった。第２ラウンドからのたった１つのクローン、第３ラウンドからの１つが２倍であることが見出されたので、大部分のクローンは異なっていた。これは、高い多様性が３ラウンドの選択後でさえも存在していることを示した。抗チューブリンｓｃＦｖのうち８個が、細胞質からアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。全ての場合において、８ｍｇを超えるｓｃＦｖは、フラスコ内で増殖させて１リットルの細胞から精製され（ＯＤ600＝５）、あるｓｃＦｖは、大腸菌ペリプラズムの抗ＨＥＲ２について報告された非常に高発現レベルに匹敵する細胞あたりのレベルで発現された。
【０１３９】
細胞内発現抗体としてのｓｃＦｖの機能性
単離されたｓｃＦｖがインビボでそれらの標的に結合するか否かを測定するために、ヒト細胞において発現した抗ヒストンｓｃＦｖが特徴付けられた。第３ラウンドの選択は、ベクターｐ５１３−ＥＧＦＰにクローニングされ、１０個の無作為に選択されたクローンをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされた。ｓｃＦｖ−ＥＧＦＰ融合体を発現している細胞の、蛍光顕微鏡によって観察された典型的な結果を図６に示す。１つのｓｃＦｖは、細胞質凝集体として発現された。４つのｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ１３Ｒ４の同程度のレベルで、細胞の均一な染色によって判断されるように、可溶性細胞質タンパク質として発現された。最後に、３つのｓｃＦｖの発現は、核のより強力な染色を生じさせ（図６、クローン２）、２つのｓｃＦｖは、核に排他的に局在化された（図６、クローン５及び１０）。これらのｓｃＦｖ−ＥＧＦＰ融合タンパク質が細胞の細胞質に発現され、核局在化シグナルを含まなかったので、これは、ヒストンとインビボで相互することができ、したがって、細胞内で活性であることを示唆する。この分析は、コアヒストンに対する第３ラウンドの選択後に存在する約半分のクローンがインビボでそれらの核標的に結合することを示した。これは、インビトロにおいて、精製されたｓｃＦｖを用いたウェスタン及びドットブロットによって確認された。さらに、これらのクローンの配列決定により、それらが、異なる重及び軽ＣＤＲ３領域を含むことを示した。
【０１４０】
抗チューブリンｓｃＦｖのインビトロでの特徴付け
細胞の細胞質における還元条件下で抗チューブリンｓｃＦｖの活性を証明するために、ｓｃＦｖは、還元剤の存在下で抽出され、ＥＬＩＳＡシグナルと、還元条件下で抽出されたｓｃＦｖを用いて得られたものとを比較した。図７に示されるように、試験された５個のｓｃＦｖは、両方の条件下で同じＥＬＩＳＡシグナルを与え、ｓｃＦＶが、ジスルフィド結合形成がない場合でさえも、還元条件下で十分に活性を保持することを示す。５個のｓｃＦｖは、競合ＥＬＩＳＡにおいて、脳抽出物及び天然のタンパク質のウェスタンブロットによるフォールディングしていないチューブリンを認識することができた。細胞内で微小管と相互作用する５つのｓｃＦｖの能力は、ＩＦによって試験された。クローン２Ｆ１２Ｃ及び２Ｇ４Ｃは、細胞内の微小管ネットワークを表した。
【０１４１】
図８は、インビトロ及びインビボのプロテオーム研究のための供給源としてライブラリーの有用性を例証する：ＨｅＬａ細胞は、赤色−ＧＦＰに融合した抗ヒストンクローン５でトランスフェクトされ、微小管ネットワークは、２Ｆ１２ＣｓｃＦｖを用いたＩＦによって表された。
【０１４２】
結局は、本発明者らの結果は、この報告書に記載されるライブラリーが非常に多様性かつ機能性であり、インビボで活性な完全なヒト細胞内発現抗体の迅速かつ容易な単離を可能にすることを示す。
【０１４３】
上記で引用された全ての特許、刊行物及び要約は、全体として参照により本明細書に援用される。本発明のいくつかの態様だけが本明細書に記載されているが、本発明が本明細書に請求される発明の精神及び範囲から逸脱せずに、多くの他の特定の形態で具現され得ることが理解されなければならない。したがって、本実施例及び態様は、例示であると考えなければならず、制限してはならず、本発明は、本明細書に与えられた主催に限定されるべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約１０6個の固有の（ｕｎｉｑｕｅ）ｓｃＦｖクローンを含む抗体ライブラリーであって、ｓｃＦｖクローンによってコードされる抗体が細胞内で発現される場合、少なくとも約２０％のｓｃＦｖクローンが、細胞内の標的抗原と検出可能に特異的に結合し得る抗体をコードする前記抗体ライブラリー。
【請求項２】
少なくとも約１０6個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含む抗体ライブラリーであって、少なくとも約２０％のｓｃＦｖ抗体クローンが、大腸菌細胞１リットルあたり少なくとも約５ｍｇのレベルで可溶性抗体を生産するために大腸菌細胞内で発現することができ、ここで、大腸菌細胞はＯＤ600nmが約５になるまで増殖させる前記抗体ライブラリー。
【請求項３】
少なくとも約１０6個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含む抗体ライブラリーであって、各固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列及び固有のＣＤＲ３ＶＬ配列の少なくとも１つを含む固有のｓｃＦｖ抗体をコードし、ここで、固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、ｓｃＦｖ１３Ｒ４によってコードされるフレームワーク配列と実質的に同一なフレームワーク配列をコードする前記抗体ライブラリー。
【請求項４】
前記固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードする、請求項３に記載の抗体ライブラリー。
【請求項５】
前記固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、固有のＣＤＲ３ＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードする、請求項３に記載の抗体ライブラリー。
【請求項６】
前記固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列及び固有のＣＤＲ３ＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードする、請求項３に記載の抗体ライブラリー。
【請求項７】
請求項３に記載のライブラリーから単離された、還元条件下で実質的に可溶性タンパク質として発現され得るｓｃＦｖ抗体。
【請求項８】
前記ｓｃＦｖ抗体が、還元条件下で標的抗原に特異的に結合し得る、請求項７に記載のｓｃＦｖ抗体。
【請求項９】
細胞内で請求項７に記載のｓｃＦｖ抗体を発現し、それによりｓｃＦｖ個体を生産することを含む、ｓｃＦｖ抗体を生産する方法。
【請求項１０】
細胞からｓｃＦｖ抗体を精製することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞内で発現可能なｓｃＦｖ抗体クローンに富んだｓｃＦｖ抗体を調製する方法であって、
ａ）ｓｃＦｖ抗体クローンの第１の回収物を用意し、ここで、第１の回収物が、ＶＨのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第１の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るｓｃＦｖ抗体に富んでいて；
ｂ）ｓｃＦｖ抗体クローンの第２の回収物を用意し、ここで、第２の回収物が、ＶＬのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第２の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るｓｃＦｖ抗体に富んでいて；
ｃ）第１の回収物のｓｃＦｖ抗体クローン由来のＶＨドメインと、第２の回収物のｓｃＦｖ抗体クローン由来のＶＬドメインとを接合して、ｓｃＦｖ抗体クローンの第３の回収物を得て、ここで、第３の回収物が、ＶＨのＣＤＲ３ループ内の固有の配列、及びＶＬのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む
を含み、それにより、細胞内で発現され得るｓｃＦｖ抗体クローンに富んだｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製する前記方法。
【請求項１２】
前記第１の回収物が、第１の回収物に含まれる他のｓｃＦｖ抗体クローンと比較して、実質的に同一のＶＬを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、第２の回収物に含まれる他のｓｃＦｖ抗体クローンと比較して、実質的に同一のＶＨ配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の回収物が、ｓｃＦｖ１３Ｒ４ＶＬ配列に実質的に同一であるＶＬを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、ｓｃＦｖ１３Ｒ４ＶＨ配列に実質的に同一であるＶＨを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の回収物が、ＶＨドメインと同一であるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、ＶＬドメインと同一であるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法によって製造される抗体ライブラリー。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法によって製造される抗体ライブラリーから選択される抗体。
【請求項１７】
抗体ライブラリーを構築する方法であって、
ａ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークを選択し；
ｂ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークのＶＨ ＣＤＲ３領域に配列多様性を導入して、固有のＶＨ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む第１のライブラリーを生じさせ；
ｃ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークのＶＬ ＣＤＲ３領域に配列多様性を導入して、固有のＶＬ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む第２のライブラリーを生じされ；
ｄ）第１のライブラリーから、ｓｃＦｖ抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し；
ｅ）第２のライブラリーから、ｓｃＦｖ抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し；
ｆ）第１及び第２のライブラリーを再結合させて、固有のＶＨ ＣＤＲ３領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体ライブラリーを含む第１のライブラリーを生じさせる
ことを含み、
それにより、抗体ライブラリーを構築する前記方法。
【請求項１８】
前記ｓｃＦｖがｓｃＦｖ１３Ｒ４である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも約１０6個の固有の（ｕｎｉｑｕｅ）ｓｃＦｖクローンを含む抗体ライブラリーであって、ｓｃＦｖクローンによってコードされる抗体が細胞内で発現される場合、少なくとも約２０％のｓｃＦｖクローンが、細胞内の標的抗原と検出可能に特異的に結合し得る抗体をコードする前記抗体ライブラリー。
【請求項２】
少なくとも約１０6個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含む抗体ライブラリーであって、少なくとも約２０％のｓｃＦｖ抗体クローンが、大腸菌細胞１リットルあたり少なくとも約５ｍｇのレベルで可溶性抗体を生産するために大腸菌細胞内で発現することができ、ここで、大腸菌細胞はＯＤ600nmが約５になるまで増殖させる前記抗体ライブラリー。
【請求項３】
少なくとも約１０6個の固有のｓｃＦｖ抗体クローンを含む抗体ライブラリーであって、各固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列及び固有のＣＤＲ３ＶＬ配列の少なくとも１つを含む固有のｓｃＦｖ抗体をコードし、ここで、固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、ｓｃＦｖ１３Ｒ４によってコードされるフレームワーク配列と実質的に同一なフレームワーク配列をコードする前記抗体ライブラリー。
【請求項４】
前記固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードする、請求項３に記載の抗体ライブラリー。
【請求項５】
前記固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、固有のＣＤＲ３ＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードする、請求項３に記載の抗体ライブラリー。
【請求項６】
前記固有のｓｃＦｖ抗体クローンが、固有のＣＤＲ３ＶＨ配列及び固有のＣＤＲ３ＶＬ配列を含むｓｃＦｖ抗体をコードする、請求項３に記載の抗体ライブラリー。
【請求項７】
請求項３に記載のライブラリーから単離された、還元条件下で実質的に可溶性タンパク質として発現され得るｓｃＦｖ抗体。
【請求項８】
前記ｓｃＦｖ抗体が、還元条件下で標的抗原に特異的に結合し得る、請求項７に記載のｓｃＦｖ抗体。
【請求項９】
細胞内で請求項７に記載のｓｃＦｖ抗体を発現し、それによりｓｃＦｖ個体を生産することを含む、ｓｃＦｖ抗体を生産する方法。
【請求項１０】
細胞からｓｃＦｖ抗体を精製することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞内で発現可能なｓｃＦｖ抗体クローンに富んだｓｃＦｖ抗体を調製する方法であって、
ａ）ｓｃＦｖ抗体クローンの第１の回収物を用意し、ここで、第１の回収物が、ＶＨのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第１の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るｓｃＦｖ抗体に富んでいて；
ｂ）ｓｃＦｖ抗体クローンの第２の回収物を用意し、ここで、第２の回収物が、ＶＬのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むクローンを含み、前記第２の回収物が、細胞内に導入されると検出可能に発現され得るｓｃＦｖ抗体に富んでいて；
ｃ）第１の回収物のｓｃＦｖ抗体クローン由来のＶＨドメインと、第２の回収物のｓｃＦｖ抗体クローン由来のＶＬドメインとを接合して、ｓｃＦｖ抗体クローンの第３の回収物を得て、ここで、第３の回収物が、ＶＨのＣＤＲ３ループ内の固有の配列、及びＶＬのＣＤＲ３ループ内の固有の配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む
を含み、それにより、細胞内で発現され得るｓｃＦｖ抗体クローンに富んだｓｃＦｖ抗体ライブラリーを調製する前記方法。
【請求項１２】
前記第１の回収物が、第１の回収物に含まれる他のｓｃＦｖ抗体クローンと比較して、実質的に同一のＶＬを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、第２の回収物に含まれる他のｓｃＦｖ抗体クローンと比較して、実質的に同一のＶＨ配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の回収物が、ｓｃＦｖ１３Ｒ４ＶＬ配列に実質的に同一であるＶＬを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、ｓｃＦｖ１３Ｒ４ＶＨ配列に実質的に同一であるＶＨを含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の回収物が、ＶＨドメインと同一であるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含み、前記第２の回収物が、ＶＬドメインと同一であるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法によって製造される抗体ライブラリー。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法によって製造される抗体ライブラリーから選択される抗体。
【請求項１７】
抗体ライブラリーを構築する方法であって、
ａ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークを選択し；
ｂ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークのＶＨ ＣＤＲ３領域に配列多様性を導入して、固有のＶＨ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む第１のライブラリーを生じさせ；
ｃ）ｓｃＦｖ抗体フレームワークのＶＬ ＣＤＲ３領域に配列多様性を導入して、固有のＶＬ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体クローンを含む第２のライブラリーを生じされ；
ｄ）第１のライブラリーから、ｓｃＦｖ抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し；
ｅ）第２のライブラリーから、ｓｃＦｖ抗体を検出可能に発現しないクローンを除去し；
ｆ）第１及び第２のライブラリーを再結合させて、固有のＶＨ ＣＤＲ３領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含むｓｃＦｖ抗体ライブラリーを含む第１のライブラリーを生じさせる
ことを含み、
それにより、抗体ライブラリーを構築する前記方法。
【請求項１８】
前記ｓｃＦｖがｓｃＦｖ１３Ｒ４である、請求項１７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【公表番号】特表２０１０−５２１４４７（Ｐ２０１０−５２１４４７Ａ）
【公表日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５３２３１（Ｐ２００９−５５３２３１）
【出願日】平成２０年３月１７日（２００８．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００６２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１０９１４
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５００２４８４６７）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム） (19)
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【出願人】（５０９２５７６８４）ユニベルシテ ドゥ ストラスブール (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１７日（２００８．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００６２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１０９１４
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５００２４８４６７）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム） (19)
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【出願人】（５０９２５７６８４）ユニベルシテ ドゥ ストラスブール (2)
【Ｆターム（参考）】
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