活性リンフォトキシン−βレセプター免疫グロブリンキメラタンパク質の高レベルの発現およびそれらの精製のための方法
【課題】低親和性形態の存在を最少化する一方、高親和性で結合する形態のより高い収率を生じる方法を提供する。
【解決手段】本発明は、低温度の培養系において所望の融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養し、それにより、誤って折り畳まれたタンパク質形態または誤って架橋されたタンパク質形態の量を最少化することによって、そのリガンドへの高親和性結合を有するタンパク質−Ｉｇ融合物の形態の高い収率の発現のための方法に関する。この宿主細胞は、形質転換された哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞または細菌細胞であり得る。タンパク質−免疫グロブリン融合物は、ＴＮＦファミリーまたはＴＮＦレセプターファミリーのメンバー（例えば、リンフォトキシン−βまたはリンフォトキシン−βレセプター）を含み得る。本発明はまた、このタンパク質−免疫グロブリン融合物を含む薬学的組成物に関する。
【解決手段】本発明は、低温度の培養系において所望の融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養し、それにより、誤って折り畳まれたタンパク質形態または誤って架橋されたタンパク質形態の量を最少化することによって、そのリガンドへの高親和性結合を有するタンパク質−Ｉｇ融合物の形態の高い収率の発現のための方法に関する。この宿主細胞は、形質転換された哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞または細菌細胞であり得る。タンパク質−免疫グロブリン融合物は、ＴＮＦファミリーまたはＴＮＦレセプターファミリーのメンバー（例えば、リンフォトキシン−βまたはリンフォトキシン−βレセプター）を含み得る。本発明はまた、このタンパク質−免疫グロブリン融合物を含む薬学的組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
ＴＮＦファミリーは、ＴＮＦファミリーリガンドおよびＴＮＦファミリーレセプターといわれるリガンドおよびそれらの特異的なレセプターのペアからなる（ＢａｚｚｏｎｉおよびＢｅｕｔｌｅｒ，１９９６；ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ，１９９６）。ＴＮＦのようなリガンドは、代表的に細胞表面において膜結合形態として見出されるか、またはいくつかの場合において、ＴＮＦは、細胞表面から選択的に切断され、そして分泌される。特異的なレセプターに結合するリガンドおよび結合事象は、２つ以上のレセプターを凝集するために働く。これらのレセプターの細胞内ドメインは、この変化をいくつかの方法により検出し得、そしてこの情報をシグナル伝達機構を介して細胞に伝達し得る。このファミリーは、免疫系およびおそらく他の非免疫学的系の調節に関与する。この調節はしばしば、「マスタースイッチ（ｍａｓｔｅｒ ｓｗｉｔｃｈ）」レベルであるので、ＴＮＦファミリーシグナル伝達は、ＴＮＦに最も代表される多くの続いて起こる最善の事象を生じ得る。ＴＮＦは、細胞輸送に関与する接着分子の改変された表示、特定の区画に特定の細胞を駆動するためのケモカイン産生および種々のエフェクター細胞のプライミングに関与する外部からの侵入に対して、生物体の一般的な防御性炎症性応答を開始し得る。このように、これらの経路の調節は、臨床的な可能性を有する。
【０００２】
ＴＮＦレセプターファミリーは一般的に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインからなる、関連タンパク質のコレクションである。細胞外ドメインは、２〜６コピーの密接にジスルフィド結合したドメインで形成され、そしてシステイン残基の独特の配列に基づいて認識する（Ｂａｎｎｅｒら、１９９３）。１つのリガンドは、いくつかのレセプターを共有し得るが、各レセプターは、対応するリガンドに結合する。いくつかの場合において、膜貫通領域および／または細胞内ドメインを欠失しているレセプターの可溶性形態が天然に存在することは、明らかである。事実上、これらのレセプターの短縮型のバージョンが、直接的な生物学的な調節の役割を有し得る。このプロセスの例は、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）系によって提供される。オステオプロテゲリンは、ＲＡＮＫ−Ｌ（ＴＲＡＮＣＥとも呼ばれる）および／またはＴＲＡＩＬを介するレセプターへのシグナル伝達をブロックする分泌ＴＮＦファミリーレセプターであり、破骨細胞活性化を誘発する。これらのレセプター（おそらく、ＲＡＮＫレセプター）をブロックすることにより、骨吸収を妨害し、そして骨質量を増加する（Ｂｕｃａｙら、１９９８）。明らかに、ウイルスは、この手段を使用し、それらの宿主生物体におけるＴＮＦ活性を阻害する（Ｓｍｉｔｈら、１９９４）。これらのレセプターは、細胞分化シグナル、細胞死シグナルまたは細胞生シグナルを含む多くの事象をシグナル伝達し得る。しばしは細胞死シグナル伝達は、ＦａｓレセプターおよびＴＮＦレセプターの場合、比較的直接結びつくカスパーゼプロテアーゼのカスケードを介して、誘発される。
【０００３】
ＴＮＦレセプターは、生物学的経路を解明するための強力なツールである。なぜなら、ＴＮＦレセプターは、長い血清の半減期（ｈａｌｆｌｉｖｅ）を有する免疫グロブリン融合タンパク質に容易に変換されるからである。ダイマー可溶性レセプター形態は、天然の分泌リガンドまたは天然の表面結合リガンドのいずれかにより、媒介される事象のインヒビターであり得る。これらのリガンドに結合することにより、これらの融合タンパク質は、リガンドが細胞会合レセプターと相互作用するのを妨げ、そして会合シグナルを阻害する。これらのレセプターＩｇ融合タンパク質は、実験的な判断（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｅｎｓｅ）において有用であり、そしてまた臨床的に首尾よく用いられる。例えば、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉｇを使用して、ＯＫＴ３投与に付随する炎症腸管疾患、慢性関節リウマチおよび急性の臨床的症候群が処置される（Ｅａｓｏｎら、１９９６；Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９７；ｖａｎ Ｄｕｌｌｅｍｅｎら、１９９５）。ＴＮＦファミリーのレセプターを通じるシグナル伝達により媒介される多くの事象の処置は、免疫系の関与に起因する病理的な後遺症を有する免疫に基づく疾患ならびに広範なヒトの疾患の処置において適用を有し得る。例えば、最近記載されたレセプターである、オステオプロテゲリンの可溶性形態が、骨質量の損失をブロックすることが示された（Ｓｉｍｍｏｎｅｔら、１９９７）。従って、ＴＮＦファミリーレセプターシグナル伝達により制御された事象は、免疫系の調節に必ずしも限定されない。レセプターに対する抗体は、リガンド結合をブロックし得、従って、臨床的な適用もまた有する。このような抗体はしばしば、非常に長く生存し、そして血液中でより短い半減期を有する可溶性レセプターＩｇ融合タンパク質を超える利点を有し得る。
【０００４】
レセプター媒介経路の阻害が、これらのレセプターの最も開発された治療の適用を示す一方、本来、これは、臨床的な裏付けが示されたＴＮＦレセプターの活性化であった（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ，１９９６）。ＴＮＦレセプターの活性化は、標的細胞において、細胞死を開始し得、そしてそれ故に、腫瘍への適用は、魅力的であったし、なお魅力的である（Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔら、１９９６）。このレセプターは、リガンドの投与（すなわち、天然の経路）によるか、またはレセプターと架橋し得る抗体の投与によるかのいずれかで活性化され得る。抗体は、例えば、癌の処置に有効であり得る。なぜなら、抗体は、血液中で長期間、リガンドとは対照的に、持続し得るからである。リガンドは、一般的に、血液中で短い寿命を有する。アゴニスト抗体は、癌の処置における有用な対抗手段である。なぜなら、レセプターは、腫瘍においてより選択的に発現し得るか、またはレセプターは、腫瘍において、細胞死または分化のみシグナル伝達し得るためである。同様に、多くの陽性の免疫学的事象は、ＴＮＦファミリーレセプターにより媒介され（例えば、宿主炎症反応、抗体産生など）、従って、アゴニストの抗体は、他の非腫瘍学的な適用において、有益な効果を有し得る。
【０００５】
逆説的に、経路の阻害はまた、腫瘍の処置において、臨床学的な有益を有し得る。例えば、Ｆａｓリガンドは、いくつかの腫瘍により発現され、そしてこの発現は、Ｆａｓ陽性リンパ球の死滅を導き得、従って、腫瘍が免疫系を回避する能力を促進する。この場合、次いで、Ｆａｓ系の阻害は、接近が可能である他の方法で、免疫系が腫瘍に反応することを可能にし得る（ＧｒｅｅｎおよびＷａｒｅ，１９９７）。
【０００６】
このレセプターのファミリーの１つのメンバーである、リンフォトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）は、表面リンフォトキシン（ＬＴ）に結合する。リンフォトキシンは、リンフォトキシンα鎖およびβ鎖の三量体の複合体からなっている（Ｃｒｏｗｅら、１９９４）。このレセプター−リガンド対は、末端免疫系の発達および成熟免疫系において、リンパ節および脾臓における事象の調節に関与する（Ｗａｒｅら、１９９５；Ｍａｃｋａｙら、１９９７；Ｒｅｎｎｅｒｔら、１９９６；Ｒｅｎｎｅｒｔら、１９９７；ＣｈａｐｌｉｎおよびＦｕ，１９９８）。リンフォトキシン−βレセプター−免疫グロブリン融合タンパク質は、ＬＴβＲとＩｇＧ（ＬＴβＲ−Ｉｇ）との間で形成され得る。このＩｇＧは、表面ＬＴリガンドと、小胞樹状細胞の機能的状態に対して重要なレセプターとの間のシグナル伝達をブロックする（ＭａｃｋａｙおよびＢｒｏｗｎｉｎｇ １９９８）。このブロッキングは、齧歯動物モデルにおいて、減少した自己免疫疾患をさらに導き得る（Ｍａｃｋａｙら、１９９８、１９９５年７月２１日に出願された米国特許第０８／５０５，６０６号および１９９６年１０月２６日に出願された米国特許第６０／０２９，０６０号）。ヘルペスウイルス侵入伝達物質についてＨＶＥＭと言われるこのレセプターファミリーの第２のメンバーは、ライト（Ｌｉｇｈｔ）と言われるリガンド（Ｍａｕｒｉら、１９９８）ならびにヘテロマーの（ｈｅｒｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）ＬＴリガンドに結合する。このレセプターの機能は、現在、未知であるが、ＨＶＥＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、免疫学的疾患の処置のために有用であり得、そしてこの構築物は、インビトロで免疫機能アッセイに影響することが示された（Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａら、１９９８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記で議論したようにＴＮＦファミリーのメンバーの臨床学的進歩にもかかわらず、臨床学的セッティングにおける使用のための適切なレセプターＩｇ融合物の所望する収率を得る方法についての必要が残っている。例えば、サルＣＯＳ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞のいずれかにおいて発現される場合、ＬＴβＲ−Ｉｇタンパク質は、２つの形態で機能し得る。一方の形態は、高親和性でリガンドと結合するが、他方は結合しない。従って、低親和性形態の存在を最少化する一方、高親和性で結合する形態のより高い収率を生じる方法についての必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、そのリガンドへの高親和性結合を有するタンパク質−Ｉｇ融合物の形態の高い収率の発現のための方法に関し、低温度での培養系において所望する融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養し、それにより、誤って折り畳られたタンパク質形態または誤って架橋されたタンパク質形態の量を最少化することによって、その形態は、「活性な」形態であると本明細書中でいわれる。種々の実施形態における本発明は、約２７℃〜約３５℃の温度で、形質転換した宿主を培養することにより、哺乳動物発現系において高収率で発現する方法に関する。好ましくは、哺乳動物宿主を、約２７℃〜約３２℃の温度で培養する。
【０００９】
なお他の実施形態において、本発明は、低温度で酵母発現系において形質転換された宿主を培養することにより活性な融合タンパク質の高収率の発現のための方法に関する。所望されたタンパク質を酵母において発現する場合、好ましい温度は、約１０℃〜約２５℃であり、より好ましくは、約１５℃〜約２０℃である。
【００１０】
本願発明の特定の方法において、タンパク質−Ｉｇ融合は、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバー（例えば、リンフォトキシン−βレセプターまたはそのフラグメント）を含む。あるいは、本願方法は、低温度での任意の発現系（例えば、昆虫系または細菌系）における所望する融合タンパク質の発現を含み得る。
【００１１】
他の実施形態において、本願発明は、本願方法により得られる活性なタンパク質−Ｉｇ融合物およびそれらを含む薬学的組成物を含む。なお他の実施形態において、本発明は、約２７℃〜約３５℃、好ましくは２７℃〜３２℃の低温度を有する培養系において、所望されるタンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養して、高収率の活性融合タンパク質を発現する工程、培養系から活性なタンパク質融合物を回収する工程、および回収された活性な融合タンパク質を薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせる工程を包含する、薬学的調製物を作製する方法に関する。好ましい実施形態において、タンパク質−Ｉｇ融合物は、リンフォトキシン−βもしくはそのフラグメント、またはＨＶＥＭ、もしくはそのフラグメントを含む。
【００１２】
なお他の実施形態において、本願発明は、記載された方法を用いて得られた薬学的組成物に関する。
【００１３】
異なる実施形態において本願発明は、哺乳動物発現系ならびに他の発現系（例えば、酵母系、細菌系、または昆虫系）に関する。
【００１４】
特定の実施形態において、本発明は、約１０℃〜約２５℃、より好ましくは、約１５℃〜約２０℃の低温度で培養することにより、酵母において活性な融合タンパク質の高レベルの発現のための方法に関する。酵母における発現のこの方法によって、得られた活性な融合物、およびこれらの活性な融合物を含む薬学的組成物をまた含む。薬学的調製物を作製するための方法は、好ましくは約１０℃〜約２５℃、より好ましくは約１５℃〜約２０℃の低温度で、所望する融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された酵母細胞を培養する工程を含む活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を含む本発明の範囲内に含まれる。本発明の全ての組成物および方法の最も好ましい実施形態において、タンパク質−Ｉｇ融合物は、リンフォトキシン−βレセプター、ＨＶＥＭ、またはそのフラグメントを含む。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１） 高収率の活性なタンパク質−Ｉｇ融合物の発現のための方法であって、約２７℃〜約３５℃の低温を有する培養系において、所望のタンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養する工程を包含する、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、上記温度が約２７℃〜約３２℃である、方法。
（項目３） 項目１に記載の方法であって、上記形質転換された宿主が、まず、約３３℃より高い温度で、該宿主の増殖を可能にするに十分な期間培養される、方法。
（項目４） 項目１に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを含む、方法。
（項目５） 項目３に記載の方法であって、上記ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーが、リンフォトキシン−βレセプター、ＴＮＦＲ−５５、ＨＶＥＭまたはそれらのフラグメントである、方法。
（項目６） 項目１に記載の方法であって、該方法がさらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより上記培養系から活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を回収する工程を包含する、方法。
（項目７） 項目１に記載の方法であって、上記培養系が、昆虫細胞または細菌細胞を含有する、方法。
（項目８） 約２７℃〜約３５℃の低温を有する培養系において、融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養することにより得られる、活性なタンパク質−Ｉｇ融合物。
（項目９） ＴＮＦファミリーのメンバーを含有する、項目８に記載の融合物。
（項目１０） ＬＴ−βレセプターまたはそのフラグメントを含有する、項目９に記載の融合物。
（項目１１） ＨＶＥＭまたはそのフラグメントを含有する、項目９に記載の融合物。
（項目１２） 活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を含有する薬学的調製物を作製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）約２７℃〜約３２℃の低温を有する培養系において、該タンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養し、それにより活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を発現する、工程；
（ｂ）該培養系から活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を回収する、工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の活性なタンパク質−Ｉｇ融合物と薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせる、工程
を包含する、方法。
（項目１３） 項目１２に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＴＮＦファミリーのメンバーまたはそのフラグメントを含有する、方法。
（項目１４） 項目１３に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、リンフォトキシン−βレセプターまたはそのフラグメントを含有する、方法。
（項目１５） 項目１３に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＨＶＥＭまたはそのフラグメントを含有する、方法。
（項目１６） 薬学的調製物であって、該薬学的調製物が、以下：
（ａ）約２７℃〜約３２℃の低温を有する培養系において、タンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養し、それにより活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を発現させる、工程；
（ｂ）該培養系から活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を回収する、工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の活性なタンパク質−Ｉｇ融合物と薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせる、工程
により得られる、薬学的調製物。
（項目１７） 項目１６に記載の薬学的調製物であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＴＮＦファミリーのメンバーを含有する、薬学的調製物。
（項目１８） 項目１７に記載の薬学的調製物であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、リンフォトキシン−βレセプターまたはそのフラグメントを含有する、薬学的調製物。
（項目１９） 項目１７に記載の薬学的調製物であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＨＶＥＭまたはそのフラグメントを含有する、薬学的調製物。
（項目２０） 高収率の活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を発現するための方法であって、約１０℃〜約２５℃の低温を有する培養系において、所望のタンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された酵母を培養する工程を包含する、方法。
（項目２１） 項目２０に記載の方法であって、上記温度が、約１５℃〜約２０℃である、方法。
（項目２２） 項目２０に記載の方法であって、上記形質転換された宿主が、まず、約３０℃より高い温度で、該宿主の増殖を可能にするに十分な期間培養される、方法。
（項目２３） 項目２０に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、上記ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを含有する、方法。
（項目２４） 項目２３に記載の方法であって、上記ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーが、リンフォトキシン−βレセプターまたはそのフラグメントである、方法。
（項目２５） 項目２０に記載の方法であって、該方法がさらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより上記培養系から活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を回収する工程を包含する、方法。
（項目２６） 約１０℃〜約２５℃の低温を有する培養系において、融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された酵母を培養することにより得られる、活性なタンパク質−Ｉｇ融合物。
（項目２７） ＴＮＦファミリーのメンバーを含有する、項目２６に記載の融合物。
（項目２８） ＬＴ−βレセプターまたはそのフラグメントを含有する、項目２７に記載の融合物。
（項目２９） ＨＶＥＭまたはそのフラグメントを含有する、項目２６に記載の融合物。
（項目３０） Ｉｇ Ｆｃドメインおよびペプチド鎖を有する活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を含有する薬学的調製物であって、ここで、該Ｉｇ Ｆｃドメインが、改変され、それにより該タンパク質−Ｉｇ融合物のヒンジ領域におけるジスルフィド形成の速度を改変する、薬学的調製物。
（項目３１） 項目３０に記載の調製物であって、上記Ｉｇ Ｆｃドメインが、少なくとも１つのシステイン残基をアラニンで置換することによって改変される、調製物。
（項目３２） ＴＮＦファミリー由来のペプチドに架橋されたＩｇ−Ｆｃドメインを含有するタンパク質−Ｉｇ融合物であって、ここで、該Ｉｇ−Ｆｃドメイン上の少なくとも１つのシステイン残基がアラニンで置換される、タンパク質−Ｉｇ融合物。
（項目３３） 上記ペプチドが、リンフォトキシン−βレセプター由来である、項目３２に記載のタンパク質−Ｉｇ融合物。
（項目３４） 少なくとも１つのシステイン残基をアラニンへ変異誘発し、それにより発現された活性な形態の融合物の収率を増大させる工程により、ＴＮＦレセプターファミリー由来のペプチドに架橋されたＩｇ Ｆｃドメインを含むタンパク質−Ｉｇ融合物を作製する、方法。
（項目３５） 上記ペプチドがＬＴβＲであり、そして位置１０１および位置１０８のシステインが、アラニンへ変異誘発される、項目３４に記載の方法。
（項目３６） 上記ＬＴβＲペプチドの位置１０１および位置１０８にアラニンを含有する、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、レセプター−免疫グロブリンキメラタンパク質の概略図である。左のパネルは、代表的なＩｇＧ分子のアニメーション画像を示し、Ｆｃドメインは、黒で塗られ、重鎖可変ドメインは、灰色で塗られ、そして軽鎖は、白色のままにしてある。真中のパネルは、細胞内ドメイン（ねずみ色）および細胞外ドメイン（薄灰色）を含むＬＴβＲ分子の概略図を含む。右のパネルは、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の概略図を示す。
【図２】図２は、実際に誤って折り畳まれたアミノ酸または誤って架橋されたアミノ酸は、同定されていないが、おおよその死滅ＬＴβＲ−Ｉｇ形態の欠損を示す概念図である。
【図３】図３は、ＰＮＧａｓｅ Ｆでの処理前後のヒトＬＴβＲ−ＩｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。レーン１およびレーン２は、３７℃で増殖されたＣＨＯ細胞培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製されたヒトＬＴβＲ−Ｉｇを含む。レーン３は、ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いて処理して、全てのＮ結合型オリゴ糖を除去した後と同じ調製物を示す。レーン１は、非還元条件下で電気泳動し、レーン２およびレーン３は、還元条件下で電気泳動する。タンパク質のバンドを、クマシーブリリアントブルーを用いてゲルを染色することにより、可視化する。
【図４】図４は、ＡＧＨ１アフィニティーカラムレーンを素通りするタンパク質およびｐＨ３．５リン酸緩衝液を用いて溶出されたタンパク質の非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析である。アフィニティー精製前のタンパク質をゲルの右側のレーンに示す。クマシーブリリアントブルーを用いてゲルを染色することにより、タンパク質バンドを可視化する。
【図５】図５は、表面リンフォトキシンに結合するＡＧＨＩアフィニティーカラムから素通りしたフラクション（下）および溶出したフラクション（上）の能力である。平均蛍光強度値は、記載されたようにＦＡＣＳ分析から得た。ＦＡＣＳプロフィールの例を、右に示し、ここでＬＴβＲ−Ｉｇは、コントロールのＬＦＡ−３−Ｉｇタンパク質の結合と比較される。
【図６】図６は、ＰＯＲＯＳエーテルカラムおよび硫酸アンモニウムの減少勾配を用いる、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの分析的ＨＩＣカラムクロマトグラフィーである。ピーク１は、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの低い、不活性化形態であり、ピーク２は、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの高い、活性な形態を示す。ピーク１およびピーク２に対応するフラクションをそれぞれ収集し、そして４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分析した（挿入したパネル）。「１」と表示されたレーンは、ＨＩＣクロマトグラフィーのピーク１の「不活性な」物質を含み、レーン２は、ＨＩＣクロマトグラフィーのピーク２の「活性な」物質を含む。出発物質は、レーン「Ｌ」に示される。「Ｍ」と表示されたレーンは、分子量マーカーを含む。
【図７】図７は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｏｕｒｃｅ １５ ＰＨＥカラムを用いるヒトＬＴβＲ−Ｉｇの分離用ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）クロマトグラフィーである。ヒトＬＴβＲ−Ｉｇを含むプロテインＡ溶出物を、５Ｍ ＮａＣｌを用いて終濃度１．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調節し、そしてカラムに載せる。カラムを、５倍量の１．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄し、そして２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で溶出した。Ｘ軸は、時間（分）を示し、Ｙ軸は、２８０ｎｍの吸光度を示す。図中に示された挿入図は、素通り（ＦＴ）収集物および溶出（Ｅ）収集物のクマシーブリリアントブルーを用いて染色された非還元４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。「生存」形態および「死滅」形態の移動の位置を、矢印を用いて示す。
【図８】図８は、異なる温度で増殖されたＣＨＯ細胞から分泌されたヒトＬＴβＲ−ＩｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング分析である。ヒトＬＴβＲ−Ｉｇを含む示された培養温度で増殖されたＣＨＯ細胞上清を、４〜２０％勾配ゲルを用いる非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とそれに続く、ウエスタンブロッティングとにより、二連で分析された。
【図９】図９は、哺乳動物細胞から分泌された全量のヒトＬＴβＲ−Ｉｇ中の死滅物質のパーセンテージに対する培養温度の効果である。組換えヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞を含む二連のフラスコを示された温度で培養し、そして分泌されたヒトＬＴβＲ−ＩｇをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの「不活性」形態のパーセンテージを分析的ＨＩＣクロマトグラフィーを用いて繰り返し評価した。Ｘ軸は、培養温度を示し、Ｙ軸は、細胞により分泌された全量のヒトＬＴβＲ−Ｉｇのパーセンテージとして発現された「不活性」物質の量を示す。
【図１０】図１０は、２８℃、３２℃および３７℃で調製されたＨＶＥＭ−Ｉｇの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す：２８℃、３２℃および３７℃で培養された細胞由来のＨＶＥＭ−ＩｇのプロテインＡ精製調製物を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合して、そしてあらかじめ形成しておいた４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。タンパク質のバンドをクマシーブルーを用いて可視化した。矢印を用いて示されたバンドは、非凝集化ＨＶＥＭ−Ｉｇを示す。ゲル上に見える高分子量のバンドは、凝集形態に相当する。
【図１１】図１１は、表面に３７℃対３２℃で産生されたＨＶＥＭ−Ｉｇの結合のＦＡＣＳ分析を示す（Ｌｉｇｈｔおよび／またはＬＴα／β）。Ａ）．３２℃で産生された物質が、３７℃の物質よりもより結合することを示す、ヒトＬＩＧＨＴを用いてトランスフェクトされた２９３細胞に対する濃度の関数としてのＨＶＥＭ−Ｉｇの結合。Ｂ）．ＬＩＧＨＴをトランスフェクトされた２９３細胞に対する２μｇ／ｍｌの濃度でのＨＶＥＭ−Ｉｇ結合が観察されたＦＡＣＳプロフィールの例。Ｃ）．３２℃で産生されたＨＶＥＭ−Ｉｇの、ＬＩＧＨＴおよび表面リンフォトキシン−α／β（ＬＴα／β）複合体の両方を示すＩＩ−２３Ｔ細胞ハイブリドーマ株の表面への改善された結合のさらなる例。
【図１２】図１２は、ＬＩＧＨＴまたはリンフォトキシンα（ＬＴα）リガンドのいずれかの、３つの異なる温度で産生されたＨＶＥＭ−Ｉｇを固定化したＢＩＡ ｃｏｒｅ ｃｈｉｐへの結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析である。各々の曲線は、リガンドの１つの濃度での結合事象を示し、以下の濃度を使用した：３０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、３．７５μｇ／ｍｌ、１．８７μｇ／ｍｌ、０．９３μｇ／ｍｌ、０．４７μｇ／ｍｌ、０．２３μｇ／ｍｌ、０．１１μｇ／ｍｌおよび０．０μｇ／ｍｌ。各々のチップを、レセプターＩｇの等量が結合することを示す、同じＲＵレベルにロードした。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（詳細な説明）
ここで、本願発明に対する言及が詳細になされる。本発明は、ＴＮＦファミリーにおけるレセプターの免疫グロブリン融合タンパク質の高レベルの機能的形態または高レベルの活性化形態を生じる能力に関する。レセプター−Ｉｇ融合タンパク質を用いた臨床介入の成功は、長期間の存在および慢性的に処置する能力または疾患期間の拡大の最小化を必要とする。理想的に、ヒトの使用ためのこのような融合タンパク質の調製は、いかなる凝集体形態、不活性形態または誤って折り畳まれた形態も有さない。何故なら、そのタンパク質の存在は、薬物の効力を減少し、そして改変された構造は、薬物の除去を容易にし、それによってその効力を減少し得る抗体応答を誘発し得るためである。さらに、抗レセプター抗体は、細胞表面上の天然レセプターに直接に架橋し得、それによってそれら（すなわち、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９６，ＪＥＭに記載のようなアゴニスト抗体）を活性化する。アゴニスト抗体は、その系を活性化し、従って、さらに、レセプター−Ｉｇ処理は、より非効果的であり得または有害でさえあり得る。「免疫グロブリン融合タンパク質」によって、本発明者らは、ポリペプチドの細胞外ドメインの任意の機能的部分と免疫グロブリン定常領域の任意の部分（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン、あるいはその組み合せ）との任意の融合物をいう。好ましくは、このポリペプチドは、ＴＮＦファミリーのレセプターのメンバーである。Ｉｇ分子の部分は、種々の免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＭ、ＩｇＡなどを含む）のいずれか由来であり得る。「ＴＮＦファミリーのレセプター」によって、本発明者らは、このレセプターが、天然に膜結合されようとまたは分泌されようと（オステオプロテゲリンの場合のように）、規範的なＴＮＦファミリーシステイン架橋パターンを有する任意のレセプター、またはＴＮＦファミリーのリガンドの定義されたメンバーに結合する任意のレセプター（例えば、Ｂａｎｎｅｒら、１９９３）をいう。他の実施形態において、本願発明は、本明細書中で議論される方法によって得られたＴＮＦファミリーレセプター−Ｉｇ融合物およびそれらを含む薬学的調製物に関する。
【００１７】
ＬｔβＲ−Ｉｇタンパク質は、サルのｃｏｓ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞において２つの形態で発現される。１つの形態である「活性な」形態は、高い親和性でリガンドに結合し、一方、もう一方の形態である「不活性な」形態は、リガンドに結合しない。生存形態と死滅形態のこの混合物は、どのＴＮＦレセプター−Ｉｇ融合タンパク質についても、以前は記載されなかったが、不活性形態の性質は、明らかでない。この２つの形態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の２つのバンドの存在によって発見された。この発現された物質は、かなりのグリコシル化不均一性を含む；しかし、この不均一性は、本明細書中で記載される機能的問題をおそらく生じないだろう。例えば、このレセプターが、膜通過ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域を欠失する可溶なモノマー形態として発現される場合、非Ｎ結合グリコシル化形態、モノＮ結合グリコシル化形態およびジＮ結合グリコシル化形態が観測される。単一グリコシル化形態および二重グリコシル化形態の両方は、ＢＤＡ８（機能性形態のみを認識する抗体）によって免疫沈降され得る。さらに、アフィニティーで精製された形態は、同様なグリコシル化不均一性を有する。むしろ、本発明者らは、非膜固定形態の発現が、レセプター−Ｉｇダイマーの２つのアーム間で不適切な架橋を生じるいくつかの異常なジスルフィド結合をもたらすと予測する。
【００１８】
ＴＮＦファミリーのレセプターは、一般的に、ドメインあたり約３つのジスルフィド架橋を有する細胞外のリガンド結合部分のドメインを３〜４繰り返した。不適当な折り畳みは、ジスルフィド結合の不正確なパターンまたはジスルフィド結合のいくつかの形成の欠失のいずれかをもたらす（図２中に図解的に図示される）ことが、考えられる。レセプター−Ｉｇ融合タンパク質の場合、Ｆｃドメインの早い折り畳みが、２つのＬＴＢＲ鎖（すなわち、２つのレセプターアーム）をきわめて近接させる、引き続く２量化を可能にするようである。レセプタードメインが、折り畳みをまだ完成していない場合、遊離スルフヒドリルがこれらのアームの間で対になる（すなわち、アーム間架橋）可能性がある。このような不正確な折り畳みが起こり得るか、またはジスルフィドスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）が、すでに形成されたジスルフィド結合の隣に並んだ遊離スルフヒドリルの間で生じ得、両方の場合において、これらは、折り畳みエラーをもたらす。不正確な折り畳みは、１つのアーム内で起こる（すなわち、アーム内折り畳みエラー）こともまた可能であるが、このようなエラーは、根本的に異なる最終分子形状を生じないかもしれない。この場合、活性形態および不活性形態は、従来のサイズ化方法を用いて、容易に分散できないかもしれない。
【００１９】
最後に、ＴＮＦＲ５５レセプターにおいて、第４のドメイン（すなわち、膜貫通領域に最も近接したドメイン）は、このレセプターが、Ｉｇ融合タンパク質として発現された場合、リガンド結合のために不可欠であると実証された（Ｍａｒｓｔｅｒｓら、１９９２年）。このドメインは、多くのＴＮＦレセプターのために不可欠であり得る。ＴＮＦＲ５５５に関する別の研究は、このドメインが、Ｉｇ融合タンパク質に関連してのみ不可欠であり、この第４のドメインを欠失する膜形態が、ＴＮＦリガンドを結合する際に完全に活性であることを示唆した（Ｃｏｒｃｏｒａｎら、１９９４年）。しかし、より最近では、結晶学的分析により、第４のドメインに関してあり得る不可欠な機能が指摘された（Ｎａｉｓｍｉｔｈら、１９９６）。この第４のドメインは、リガンドとの直接の接触をなお欠く種の間で比較的に保存される（Ｂａｎｎｎｅｒら、１９９３年）。ヒンジおよびＣＨ２＋ＣＨ３ Ｆｃドメインの隣に存在する２つの第４のドメインの間のこの領域におけるアーム間架橋は、分子の全形状を認知できるほどには改変せず、それ故、サイズに基づいた分離方法において不可視であり得ることが可能である。それにもかかわらず、この分子は、損なわれたリガンド結合を示す。３つのドメインのみ有するレセプターは、同様の様式でふるまい得る。
【００２０】
細胞培養の間の温度減少は、分泌される顕著により少ない誤って折りたたまれたより小さい形態（すなわち、不活性形態）を生じた。この改善は、おそらく、ポリペプチドの折り畳み速度の減少に起因し、この速度の減少は、レセプター−Ｉｇ融合タンパク質を予期されたダイマー形態へとアセンブルする前に、ＬＴβＲ部分の個々のドメインをより時間をかけて折り畳むことを可能にする。折り畳みプロセスを遅くするために必要とされる絶対温度は、宿主依存性である。哺乳動物細胞（すなわち、ＣＨＯ）に関して、本願の方法は、好ましくは、約２７℃〜約３５℃の温度で起こり、さらに好ましくは、この温度は、約２７℃〜約３２℃である。本願の方法はまた、酵母培養系において使用され得る。酵母培養物は、有意な利益を達成するために、約１０℃〜約２５℃の温度で、好ましくは、約１５℃〜約２０℃で増殖されることを必要とする。
【００２１】
本願発明の活用は、活性タンパク質Ｉｇ融合物の正確な折り畳みを可能にする。いくつかの場合、その間に非常に低いレベルのクローニングされた遺伝子の発現しか起らない、より高い温度（例えば、約３７℃〜約４３℃）での細胞増殖を可能にすることが、望ましくあり得る。所望の増殖期間の後、この融合物は、低温度で発現され、活性融合物の増大された収率を生じ得る。哺乳動物系における低温度は、上で議論されたように、好ましくは約２７℃〜約３５℃であり、より好ましくは約２７℃〜約３２℃である。
【００２２】
従って、タンパク質−Ｉｇ融合物が発現される温度を低下させることにより、本願の方法は、当業者がそのタンパク質および所望のタンパク質のＩｇ部分の両方の折り畳みを調節することを可能にする。
【００２３】
さらに、アフィニティークロマトグラフィー技術および／または従来のクロマトグラフィー技術を含む本願の方法を用いて、当業者は、今や、種々の臨床上の状況において、免疫学的機能をブロックするキメラタンパク質を使用するのに十分活性なフラクションを精製し得る。さらに、低温（すなわち、≦３２℃（ＣＨＯについて）および≦２５℃（酵母について））細胞培養条件を有する本願の方法を用いて、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇのより大きい活性な形態で高度に濃縮された培養上清を調製することが、今や、可能である。さらに、このファミリーのレセプターの他のメンバーは、同様な問題を欠点としてもつことがあり得る。例えば、本発明者らは、ＴＮＦＲ５５−Ｉｇ（ｐ５５ ＴＮＦＲまたはｐ６０ ＴＮＦＲとも呼ばれる）についての非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で２つの類似したバンドを観察する。同様に、ＨＶＥＭと呼ばれる別のＴＮＦファミリーレセプターの特性は、より低温での分泌により改善される。このレセプターは、種々の温度で作製された物質において明らかなサイズの差異が存在しない場合、アーム内折り畳みエラーの例を形成し得る。それにもかかわらず、機構に関係なく、ＴＮＦファミリーのこれらのメンバー他のメンバーの調製において、低下された分泌温度を有する本願の方法は、より高いパーセンテージの活性な融合タンパク質を生じる。
【実施例】
【００２４】
（実施例）
（実施例１ ヒトＬＴβ−Ｉｇの生存形態を特異的に認識するｍＡｂ）
ＬＴβ−Ｉｇタンパク質（図１）は、プラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のいずれかから分泌される場合、標準的プロテイン質Ａに基づくアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて精製し得る。精製されたタンパク質は、非還元ＳＤＳアクリルアミドゲル上で約１００ｋＤａの密接な間隔の２つのバンドからなる（図３）。この２つのバンドは、見かけの大きさで約５ｋＤａ異なる。このタンパク質が、還元される場合、約５０ｋＤａの、不均一なグリコシル化から生じた本質的な２つのバンドが、分離される（図３）。しかし、非還元条件下で観測された２つのバンドは、還元されたバンドの対を生じるグリコシル化の差異から直接には生じない。ヒトＬＴβＲに対するモノクローナル抗体のパネルを用いて、本発明者らは、グループＩ由来の抗体（すなわち、ＡＧＨ１およびＢＤＡ８）がレセプターの大きいＭＷ形態のみを認識することを示した（表Ｉ；上のバンドおよび下のバンドに対する選択性を除くすべてのデータは、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９６年により得られた）。このグループ由来の抗体は、ＢＤＡ８のＦａｂフラグメントが、なおブロックし得るという観測により証明されるようにリガンド結合領域に直接結合する。グループＩＩのｍＡｂもまた、リガンド結合をブロックし得るが、生物学的アッセイにおいて、これらのｍＡｂは、混合したアゴニスト性質およびアンタゴニスト性質を示す。これらのｍＡｂ（ＡＧＨＩを、本実験において使用した）からアフィニティーカラムを作製し、そしてＬＴβＲ−Ｉｇの大きな形態および小さな形態の混合物を適用する場合、レセプターの小さい方の形態は、流れ、そして大きい方の形態は、カラムマトリクスに留まる。低ｐＨ溶出によって、大きな形態の純粋な調製物が生じる（図４）。この２つのフラクションを、表面ホルボールエステル活性化ＩＩ−２３ Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞（すなわち、表面リンフォトキシン複合体を発現する細胞）に結合する能力についてアッセイした（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９５年に記載のように）。そしてこのｍＡｂへ結合したフラクションのみが、表面のリンフォトキシンに結合し得た。フロースルーフラクション（すなわち、低い方のＭＷのバンド）は、完全に不活性であった（図５）。詳細には、ＬｔβＲ−Ｉｇ構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの上清を、このタンパク質を単離するためにプロテインＡカラムを通過させた。純粋なタンパク質を２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ２．８で溶出し、そしてこのタンパク質を含むフラクションを１／１０容量の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）を用いて中和した。免疫沈降を、３μｇのＬＴβＲ−Ｉｇおよび４μｇの抗ＬＴβＲ ｍＡｂを用いて０．２５ｍｌの容量で行い、続いて、マウスｍＡｂ上のκ鎖のみを認識し、ヒトＦｃドメインを認識しないＫａｐｐａＬｏｃｋセファロースビーズを用いてｍＡｂを捕捉した。このビーズを遠心分離により除去し、上清から、プロテインＡセファロースを用いて残存の免疫グロブリンを除去した。ビーズを、ＳＤＳ ＰＡＧＥサンプル緩衝液（非還元剤）を用いて処理し、緩衝液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上へロードした。ゲルを泳動させ、Ｈｙｂｏｎｄ上へトランスファーさせ、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントを用いてウェスターンブロットした（ＬＴβＲ ｍＡｂに続いて、抗マウスＩｇＧ−ＨＰＲを加え、そしてＨＲＰの化学発光検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ））。
【００２５】
ＬＴβＲ：Ｉｇの活性形態を排他的に認識するＡＧＨ１の能力を活用するために、ＡＧＨ１アフィニティーカラムを、製造者のプロトコルに従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、調製した。このカラムを徹底的にＰＢＳで洗浄し、プロテイン質Ａ精製したＬＴβＲ−Ｉｇを適用し、そしてフロースルーを収集した。このカラムをＰＢＳで洗浄し、次いで、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ２）を用いて溶出した。溶離液を含有するフラクションを、上記のように即座に中和した。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度により決定し、１ＯＤ溶液が１ｍｇ／ｍｌに等しいと決めた。ＬＴβＲ−Ｉｇを含有するフロースループールおよび溶出プールを、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９５年に記載のようにＦＡＣＳ分析による結合について試験した。このフロースルーフラクションは、表面ＬＴを発現する細胞を染色するＦＡＣＳを示さなかったが、一方、溶出プールは、完全な結合活性を保持した。
【００２６】
（実施例２ ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの生存成分および死滅成分の従来のクロマトグラフィー分離）
上記のように同定される大きなＭＷ成分と小さなＭＷ成分との間の潜在的な構造の差異を、従来のクロマトグラフィーの工程を用いる分離方法の設計において活用する。例として、このタンパク質を、ＰＢＳ中でゲル濾過によりサイズ分類して、大きい方の形態および小さい方の形態の部分的な分離を達成し得る。次いで、これらの調製物を、再び同じカラムへ適用し、それぞれの化合物において９０％より大きく濃縮されたヒトＬＴβＲ−Ｉｇの大きい方の形態および小さい方の形態の調製物を入手し得る。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して、同じ結果を達成し得る。このタンパク質の混合物を、硫酸アンモニウムで希釈し、ＨＩＣカラム上にロードし、そして大きい成分および小さい成分を、減少する塩勾配で示差的に溶出する。これらの条件下で、この２つのヒトＬＴβ−Ｉｇ成分のベースライン分離を達成する（図６）。これらの方法および上記のような免疫アフィニティー方法は、ｍｇ量のヒトＬＴβＲ−Ｉｇの大きな調製物および小さな調製物を調製するために有用であるが、薬学的用途のための多量のこれらの成分の調製について所望される多くの事を残す。出願者らは、このＨＩＣ方法を大量に得られる樹脂へ適応させることにより、新規の方法を発明し、そしてクロマトグラフィー条件を同定した。このクロマトグラフィー条件は、大きな成分は維持され、そして選択的に溶出され得る間、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇ物質の小さな形態がカラムを通って流れることを可能にする（図６）。溶出された物質を、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーのような最終の工程へ供して、凝集物質および他の不純物を除去し得、適切な生理学的緩衝液への処方の後、これをインビンボでの作業に使用し得る。下記の第１の実施例（Ａ）は、ＬＴβＲ−Ｉｇの調製の際に、不活性物質の量を分析的に評価するために使用した特定の条件を記載する。第２の実施例（Ｂ）は、活性成分が非常に濃縮されたＬＴβＲ−Ｉｇ調製物を生じる分離用の精製プロセスを記載する。
【００２７】
Ａ）．分析的疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を、不活性ＬＴβＲ−Ｉｇの量を評価するための定量的アッセイとして使用し得る）
組換えヒトＬＴβＲ−Ｉｇの小さい方の不活性成分および大きい方の活性成分のベースライン分離を、１．５Ｍの硫酸アンモニウムで平衡にしたＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ エーテル／ｍ カラム（４．６×１００ｍｍ、カタログ番号Ｐ０９１Ｍ５２６）、そして硫酸アンモニウムの減少勾配において引き続く溶出で達成した。このＬＴβＲ−Ｉｇ調製物を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度へ希釈し、そして１．５Ｍの硫酸アンモニウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ９）（緩衝液Ａ）の最終緩衝液組成物にした。一部（１００μｇのタンパク質を含む１ｍｌ）をＰｏｒｏｓエーテル／ｍ カラム上へロードした。このカラムを、８．３ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。活性成分および不活性成分を、１００％の緩衝液Ａから１００％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ９）までの直線勾配（全勾配容量１６．６ｍｌ）で、示差的に溶出し、続いて、緩衝液Ｂ １６．６ｍｌを用いて洗浄した。カラムの溶出物を、２１４ｎｍでの吸光度についてモニターした。全手順を、カラム流速１ｍｌ／分を用いて、周囲気温で実行した。代表的な分析的ＨＩＣクロマトグラムの溶出プロフィールが、図５中に示される。ピーク１は、ＬＴβＲ−Ｉｇの不活性フラクションを含み、そしてピーク２は、ＬＴβＲ−Ｉｇの活性フラクションを含む。この２つの形態の相対的寄与を定量するために、ピーク面積を、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ機器Ｖｉｓｏｎ積分ソフトウェアを用いて、積分した。
【００２８】
Ｂ）．ヒト組換えＬＴβＲ−Ｉｇの分離用精製）
馴化培地の清澄化および濃縮：細胞の細片を、５μのポリプロピレン ５ｓｑｆｔ． Ｃａｌｙｘフィルターカプセル（Ｍｉｃｒｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｇｈ，ＭＡ）を通すデッドエンド濾過、続いて、０．２μ Ｏｐｔｉｃａｐ ４インチフィルターカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、組換えＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞から収集した１０Ｌの馴化培地から除去した。清澄化した培地を、限外濾過により、直列に連結された３つのＳ１Ｙ３０ Ｓｐｉｒａｌ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎカートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、約１Ｌへ濃縮した。
【００２９】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー：濃縮した馴化培地を、４℃で１０ｍｌのプロテインＡセファロース速流（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを重力により通過させた。このカラムを、５０ｍｌのＰＢＳ、０．５ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍｌのＰＢＳ、そして５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。混入したウシＩｇＧを除去するために、このカラムを２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）５０ｍｌで洗浄した。結合したＬＴβＲ−Ｉｇを、３ｍｌのフラクション中で２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．８）を用いて重力により溶出し、そして即座に、０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）０．３ｍｌで中和した。タンパク質を含有するフラクションを、吸収分光法により同定し、プールし、そして−７０℃で保存した。
【００３０】
疎水性相互作用クロマトグラフィー：プロテインＡ溶出プール（２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で４０ｍｌ）を、３Ｍの塩化ナトリウム、４０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）４０ｍｌおよび１．５Ｍの塩化ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）２０ｍｌ（全ての溶液は、周囲気温であった）を用いて、希釈した。希釈したプールを、１０×１００ｍｍ（７．８ｍｌ）Ｓｏｕｒｃｅ ＰＨ１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）上へ、流速２ｍｌ／分でロードした。このカラムを１．５Ｍの塩化ナトリウム７９ｍｌ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を用いて流速２０ｍｌ／分で洗浄した。結合したタンパク質を、流速２ｍｌ／分で２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を用いて溶出した。溶出物の吸光度を、２８０ｎｍでモニターし、そして９ｍｌのフラクションを収集した。タンパク質を含有する溶出物のフラクションを、ＵＶ吸収分光法で同定し、プールし、そして−７０℃で保存した。図７は、典型的なＨＩＣ溶出のプロフィールを表す。これらの条件下で、不活性物質は、カラムを素通りし、そして活性物質は、樹脂に結合される。図７の挿入図は、フォロースルーおよび溶出プールそれぞれのクマシーブルー染色されたＮＲ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンを含む。
【００３１】
サイズ排除クロマトグラフィー：ＬＴβＲ−Ｉｇの活性成分を含有する約１００ｍｌ（１．３ｍｇ／ｍｌ）のＨＩＣ溶出プールを、セントリプレップ３０コンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、限外濾過により９ｍｌに濃縮した。この濃縮物（１０．３ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳで平衡にした１．６×１００ｃｍ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−６プレップグレードカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓ ａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上へ流速１ｍｌ／分でロードした。この溶出物を３ｍｌのフラクションに収集した。タンパク質を含有するフラクションを、ＵＶ吸収分光法で同定した。選択したフラクションを、ＮＲ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を用いて、３μｇ／レーンロードで凝集物含有量について分析した。最小の可視凝集物を有するフラクションを、プールし、そして−７０℃で凍結保存した。
【００３２】
この様式で、粗培養培地中に存在する不活性ＬＴβＲ−Ｉｇ成分の最小量を含有するＬＴβＲ−Ｉｇを、調製し得る。
【００３３】
（実施例３．低温発酵条件が、細胞培養期の間のヒトＬＴβＲ−Ｉｇの大きく活性な成分を濃縮する）
従来の哺乳動物細胞培養条件下で、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇは、約５０％の小さい成分と約５０％の大きい成分の混合物として分泌される。同じタンパク質を発現するために、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞を使用することにより、激烈に減少したレベルの小さい形態を生じる。昆虫細胞を２８℃で培養する場合に、低温で増殖した哺乳動物細胞から分泌されたヒトＬＴβＲ−Ｉｇが、大きい形態および小さい形態の変化した比を有するかどうかを、本発明者らは探究した。ウエスタンブロットによって分析された、２８℃、３０℃、３３℃、３５℃および３７℃にて、Ｔフラスコ中で培養したヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞由来の上清が、図８に示される。大きい形態および小さい形態（矢印で示される）が、３３℃、３５℃および３７℃で増殖した培養物中に存在する。小さい形態の非常にわずかな形跡が、３０℃および２８℃で増殖した細胞由来の培養上清を含むレーンにおいて、見られ得る。従って、細胞培養の間の温度の低下が、小さく不活性な形態のヒトＬＴβＲ−Ｉｇの量を劇的に減少させる。細胞培養温度と、より大きく活性な形態のヒトＬＴβＲ−Ｉｇの濃縮の程度との間の関係を定量するために、複数の培養フラスコをセットアップし、そして１℃の間隔で、２８℃〜３７℃の範囲の温度で増殖させた。プロテインＡアフィニティー精製したヒトＬＴβＲ−Ｉｇサンプルを、分析的ＨＩＣクロマトグラフィーによって分析し、異なる温度で増殖した細胞由来の調製物中に存在するヒトＬＴβＲ−Ｉｇの小さい成分および大きい成分の比を定量した。図９に図表を用いて示されるように、培養温度が、３７℃から３２℃に低下する場合に、低い方のバンドの量が、約１／５倍に急速に減少する。２８℃までの培養温度の低下は、低い方の形態の量を減少させるが、さほど劇的な様式ではない。これらの結果は、３７℃からほんのわずかだけの培養温度の低下が、劇的により小さいのｍｗ成分の量を減少させることを示し、従って、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇのより大きい活性な成分の収率が増加する。これらのデータに基づいて、これらの観察が、懸濁液中の増殖に適応している組換えヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞を用いて製造するに適した条件下で、ラージスケールで複製され得るかを試験するために、３２℃および２８℃の培養温度が選択された。これらの実験について、細胞を、３７℃で、１ｍｌ当たり約２×１０6個の細胞の密度にまで増殖させ、培養物を、細胞生存率が８０％未満に低下するまで、増殖培地の約４容量で希釈し、そして３２℃でインキュベートした。産生期の間、２８℃まで温度を低下させることにより、また、最終的な収集において、顕著により低いレベルの理想的な（ｉｄｅａｄｉ）成分を生じる。２８℃または３２℃での産生期の間に、細胞数はあまり増加しないが、３７℃で排他的に増殖した培養物に対する産生力価における数倍の増加が、収集された馴化培地において得られたことに注意することは興味深い。３２℃および２８℃でのプロセスにおいて使用された特定の条件を、以下に記載する。
【００３４】
初期のデータは、培養温度の低下が、酵母のような他の宿主系において類似の利点を生じることを示唆する。酵母において、低温産生の有益な効果が、哺乳動物細胞においてよりもさらに低い温度で観察されることは興味深い。３０℃で培養された酵母は、主に不活性な形態を産生し、２５℃で増殖した培養物は、不活性な形態および活性な形態のほぼ等しい割合の混合物を含み、そして１６℃で発酵した培養物は、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの活性な形態を主に産生する。これらの観察は、低温発酵が、任意の分泌宿主系において、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの活性な成分の顕著により高い収率を生じることを示唆する。当業者は、各々の系について、最適な産生温度を容易に決定し得る。
【００３５】
ここで本発明者らは、このプロセスが、ＬＴβＲ−Ｉｇの産生にどのように適用されたかについての詳細な例を提供する。細胞培養温度の低下が、宿主細胞から分泌されるＬＴβＲ−Ｉｇにおいて存在する不活性な成分の量を顕著に減少させるという事実を利用する、２つの細胞培養方法が開発された。さらに、低温発酵の予期しない利点は、３６℃〜３７℃で行われた伝統的な発酵作業と比較した場合の、力価における数倍の向上である。表ＩＩは、グリコシル化の程度において変化する異なるＬＴβＲ−Ｉｇ構築物でトランスフェクトされた、２つの異なる細胞株を用いて得られた、不活性なＬＴβＲ−Ｉｇ成分の比較収率および相対的な量を要約する（この実施例の趣旨と密接に関係しない）。
【００３６】
３２℃の細胞培養プロセス：懸濁液中での増殖に適応したヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ、１４０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを補充した、ＤＭＥ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ−１２増殖培地（以下の表ＩＩＩを参照のこと）中で増殖させた。スケールアップのために、２つの７５０ｍｌのスピナーフラスコを、増殖培地において、１ｍｌ当たり約２×１０5個の細胞で播種した。培養物を、３７℃で、５％ ＣＯ2雰囲気下で、１ｍｌ当たり約３×１０6個の細胞の密度まで増殖させた。両方のスピナー培養物由来の細胞懸濁液を合わせて、約１０Ｌの増殖培地を含むスケールアップバイオリアクターを播種した。培養物を、１１％ Ｏ2で酸素化し、そして１ｍｌ当たり約２×１０6個の細胞の密度まで、３７℃で３日間増殖させた。この培養物を、１ｍｌ当たり６．４×１０5個の細胞の密度で、３３Ｌの増殖培地を含む生産用バイオリアクターを播種するために用いた。次いで、生産用バイオリアクターを、８日間、３２℃の有利な温度で、１１％ Ｏ2で設定された酸素散布速度を用いて培養した。収集日（８日目）の細胞密度は、１ｍｌ当たり約２×１０6個の細胞であり、約６０％の生存率であった。これらの条件下で、１２ｍｇ／ＬのＬＴβＲ−Ｉｇの力価を達成し、この力価は、３７℃の伝統的な温度で同じ細胞を培養した場合よりも、２倍高かった。ＬＴβＲ−Ｉｇ調製物における不活性な成分の相対的な量は１７％であり、この相対的な量は、３７℃の培養から得られた産物と比較した場合に、６０％より大きな減少を表した。
【００３７】
２８℃の細胞培養プロセス：懸濁液中での増殖に適応したヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ、１４０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを補充した、ＤＭＥ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ−１２増殖培地（以下の表ＩＩＩを参照のこと）中で増殖させた。スケールアップのために、２つの８００ｍｌのスピナーフラスコを、増殖培地において、１ｍｌ当たり約２×１０5個の細胞で播種した。培養物を、３７℃で、５％ ＣＯ2において、１ｍｌ当たり約３．５×１０6個の細胞の密度まで増殖させた。両方のスピナー培養物由来の細胞懸濁液を合わせて、約１０Ｌの増殖培地を含むスケールアップバイオリアクターを播種した。培養物を、１１％ Ｏ2で酸素化し、そして１ｍｌ当たり約１．７×１０6個の細胞の密度まで、３７℃で２日間増殖させた。この培養物を、１ｍｌ当たり２．５×１０5〜３×１０5個の細胞の開始細胞密度で、１：９の分割比を用いて、２つの４０Ｌの生産用バイオリアクターおよび１つの１０Ｌの生産用バイオリアクターを播種するために用いた。生産用バイオリアクターを、１ｍｌ当たり約２×１０6個の細胞の細胞密度に達するまで（２日間）３７℃で培養し、そして１１％ Ｏ2で酸素化した。２日目の終わりに、バイオリアクターの温度を、２８℃に低下させ、そしてこのバイオリアクターを、さらに５日間培養した。７日目に、１ｍｌ当たり約３×１０6個の細胞の細胞密度および７５％を超える細胞生存率で、このバイオリアクターを収集し、そして馴化培地を上記の通りに処理した。これらの条件下で、約２０ｍｇ／ＬのＬＴβＲ−Ｉｇの最終力価が達成され、この力価は、３７℃で同じ細胞を培養した場合に得られた力価に対して３．３倍の増加を示す。不活性な成分の相対的な比率は１０％であり、この値は、３７℃で調製された物質に対して８０％の減少を示す。
【００３８】
（実施例４：産生の間の死滅形態を最小にするための、Ｆｃドメインにおける変更）
死滅した分子が、これらの調製物を生じる理由についての、本発明者らの仮定的な説明に基づいて、Ｆｃドメインが二量体化する前の時間を引き伸ばすことが、正確に折り畳まれたレセプタードメインのフラクションを増加させることが推定される。本発明者らは、この結果に達するために、いくつかの方法を探究した。異なるＩｇ Ｆｃドメインは、異なる速度で折り畳まれるが、ＩｇＧ４ドメインについてのＩｇＧ１ドメインの交換が、生死比を変化させなかったことが可能である。第２に、２つのペプチド鎖を架橋するヒンジ領域におけるシステイン残基が、変異誘発によって、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインから取り除かれた。Ｆｃドメインは、ヒンジのジスルフィド形成の非存在下において、首尾良く二量体化し得るが、この二量体化速度は、ヒンジのジスルフィド形成の非存在下において、より緩慢になり得る。アラニンによる２つのシステイン残基の置換は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＩＣクロマトグラフィーによって定量されるように、減少した量の死滅形態を生じ、その結果、野生型のＬＴβＲ−Ｉｇが、３７℃および２８℃で、５０％および５％の死滅形態を含む場合、ＩｇＧ１のヒンジからのシステインの欠失が、これらのそれぞれの温度で産生される場合に、２０％および５％の死滅形態を導く。従って、両方のシステイン残基の置換によるヒンジの改変が、調製物の質を改善し得、そしてさらに、１つのみのシステイン残基の置換が、有益な効果を有し得ることが可能である。このような遺伝的改変は、低温の産生方法によって、死滅形態のパーセンテージを減少し得る。
【００３９】
（実施例５：折り畳みの問題を補正するためのシステイン架橋の欠失）
代表的には、タンパク質によって使用される折り畳み経路を決定し、最終的な正確な形態を得ることは、非常に困難である。それにもかかわらず、ＴＮＦレセプターファミリーにおけるいくつかのジスルフィド架橋は異常であり、そして最終的に折り畳まれた状態に必要とされないかもしれない。これらの架橋は、変異誘発の良好な候補である。ＬＴβＲ−Ｉｇの３番目のドメインにおける１つのこのような架橋は、システイン１０１およびシステイン１０８（Ｗａｒｅら、１９９５において定義された配列からのナンバリングを用いて）の、アラニンへの従来の部位特異的変異誘発によって取り除かれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって証明されるように、死滅／生存の物質の改善された比を導いた。野生型では、ＬＴβＲ−Ｉｇは、それぞれ３７℃および２８℃で産生される場合に、代表的には、５０％および５％の死滅形態の存在を示す。欠失した１つのシステインジスルフィド架橋を有する変異形態は、これらの温度で産生される場合に、２０％および５％の死滅形態を有した。
【００４０】
（実施例６：ＨＶＥＭ−Ｉｇの調製物の質を改善させるためのより低い温度の使用）
ヘルペスウイルス侵入媒介物（ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）（ＨＶＥＭ）は、ＬＴβＲに関連するＴＮＦファミリーレセプターであり、そしてリガンドＬＩＧＨＴに堅固に結合し、そしてリガンドリンフォトキシン−ａ（ＬＴａ）に弱く結合する（Ｍａｕｒｉら、１９９８）。ヒトＨＶＥＭは、細胞外ドメインのＰＣＲ増幅によって、Ｉｇ融合タンパク質として調製され、そしてＬＴβＲ−Ｉｇについて記載されるように、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２領域およびヒトＩｇＧ１ ＣＨ３領域に融合された（Ｃｒｏｗｅら、１９９４）。構築物を、ＥＢＮＡ系（２９３−Ｅ細胞）を用いた高コピー数ベクター発現を伴うヒト胚性腎細胞株２９３における一過性の発現のために、ＣＨ２６９と呼ばれるベクター（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、１９９７）に挿入した。上清を収集し、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよび低ｐＨ溶出を用いて、ＨＶＥＭ−Ｉｇを精製した。組換えＬＴαを、記載されるように（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９６ａ）、昆虫細胞から調製した。組換え可溶性ヒトＬＩＧＨＴを、活性化ＩＩ２３細胞由来のＲＮＡを用いて、全体のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって調製し、Ｍａｕｒｉら、１９９８によって記載される、コード領域の配列を得た。ＬＩＧＨＴのレセプター結合ドメインを、ＰＣＲによって増幅させ、そしてα接合因子リーダー配列上で融合させ、そして他の関連したタンパク質について本質的に記載されるように、発現させた（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９６）。ＦＬＡＧタグおよび（Ｇ4Ｓ）3スペーサーアミノ酸配列を、リーダーとレセプター結合ドメインの間に挿入し、その結果、分泌されたＬＩＧＨＴが、Ｎ末端ＦＬＡＧ配列を有する。構築物は、以下の分子をコードした：
【００４１】
【化１】
ここで、２つの点は、成熟タンパク質の推定Ｎ末端を示し、この成熟タンパク質は、次の２つのアミノ酸（ＥＡ）の除去によって、さらにプロセスされ得る。このタンパク質を、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂカラム上のアフィニティークロマトグラフィー、および低ｐＨまたはカルシウムキレート化のいずれかを用いた溶出によって、上清から精製した。全長のＬＩＧＨＴをまた、記載されるように（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、１９９７）、２９３−Ｅ細胞の表面上での発現のために、ベクターＣＨ２６９に挿入した。細胞表面に対するレセプター−Ｉｇの検出のためのＦＡＣＳ結合方法、および固定化されたレセプター−Ｉｇに対する可溶性リガンドの結合を測定するためのＢＩＡｃｏｒｅ方法が、記載されている（Ｍａｃｋａｙら、１９９７）。ＢＩＡｃｏｒｅ技術は、チップ（すなわち、レセプター）に結合したタンパク質の、リアルタイムの測定をもたらす。
【００４２】
ＨＶＥＭ−Ｉｇを発現するＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳを補充された増殖培地を用いて、ローラーボトル中で３７℃で、コンフルエンシーまで増殖させた。細胞がコンフルエンスに達した時点で、使用済み培地を新鮮な増殖培地に交換し、そして培養物を、３７℃、３２℃および２８℃でインキュベートした。２８℃および３２℃の培養物を、１週間に１度収集し、３７℃の培養物を、４日ごとに収集した。分泌されたＨＶＥＭ−Ｉｇを、記載されるように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製された調製物を、分析まで−７０℃で保存した。ＨＶＥＭ−Ｉｇを、２８℃、３２℃および３７℃で産生し、そして精製した場合、すべての調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において同様に挙動し（図１０）、これは、タンパク質において大きな変化が生じなかったことを示唆する。従って、異常な折り畳み／ジスルフィド架橋が生じる場合、アーム内（ｉｎｔｒａ−ａｒｍ）またはＦｃドメインのヒンジ領域に近接して生じるかのいずれかであり（すなわち、アーム内架橋）、従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、認めうるほどに分子の全体の形状に影響を及ぼさなかった。レセプター−Ｉｇが、２９３−Ｅ細胞上で発現されるＬＩＧＨＴまたは活性化ＩＩ２３細胞上で発現されるＬＩＧＨＴに結合する能力を、ＦＡＣＳ結合アッセイにおいて評価した（図１１）。両方の細胞型に対して、ＨＶＥＭ−Ｉｇが、細胞表面リガンドを結合する能力が、３２℃での発現に対して、およそ２〜３倍改善された。ＢＩＡｃｏｒｅ技術を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅチップを、ＨＶＥＭ−Ｉｇを用いて、同様のレベルまでロードした場合（ＲＵ値は、チップにおけるタンパク質の量を反映する）、より低い温度で産生されたＨＶＥＭ−Ｉｇが、より高い温度で産生されたタンパク質よりもリガンドに結合することが観察された（図１２）。ＬＩＧＨＴまたはＬＴαのいずれがリガンドであった場合でも、この結果が得られた。ＢＩＡｃｏｒｅ結合曲線は、結合事象のリアルタイムでのオンおよびオフを示し、そして結合事象が、産生温度に関係なく類似であることが認められ得る。従って、調製物の一部（ｐｒｏｔｉｏｎ）が効率的に死滅し、そしてこの比率が、より低い産生温度によって最小化される。本発明者らは、より低い温度が、異常な折り畳み問題を補正し、そして、本発明者らは、死滅分子のフラクションを直接的に観察し得なかったが、生存分子のパーセンテージを改善したことを推測する。上記で概要を述べたように、アフィニティークロマトグラフィー技術は、低下させた増殖温度および／または不正確な折り畳みを防止するためのヒンジもしくはレセプター自体のいずれかにおける種々のシステインの変異誘発による調製物の最適化後に、生存／死滅の形態を分離するために役立ち得る。
【００４３】
（実施例７：他のＴＮＦ−ファミリーレセプター−Ｉｇ融合タンパク質の死滅形態を最小化させるための、一般的なスキーム）
ＴＮＦファミリーの大半のレセプターは、免疫グロブリン−Ｆｃドメインとの融合タンパク質構築物として調製された：
【００４４】
【数１】
いくつかの場合、最も著しくは、Ｆａｓ−ＩｇおよびＣＤ４０−Ｉｇ（例えば、Ｆａｎｓｌｏｗら、１９９２）においては、キメラは、２つのＴＮＦレセプターの可溶性のＦｃ形態と比較して活性が乏しい。これらの調製物のいくつかは、種々の比において、生存形態および死滅形態の混合物であることが可能である。死滅形態とは、単に、生存形態よりも実質的に低い親和性（１０〜１０００倍）で結合する分子をいい、すなわち、結合活性を完全には欠かなくてもよいが、その代わりに、天然に細胞上で見出された高い親和性の形態と相対的に、リガンドへの減少した親和性を有する。異常なレセプターアーム間または異常なレセプターアーム内のジスルフィド結合が生じ得、より少ない活性タンパク質（ｐｒｏｔｉｅｉｎ）を導く。
【００４５】
これらのレセプター、またはいまだ不確定の他のレセプターのいずれかを用いて、抗レセプターｍＡｂのパネルを、従来技術によって調製する。好ましくは、細胞表面上でのネイティブのレセプターに対するリガンド結合アッセイを用いて評価される場合（組換えレセプター形態を用いた他の方法が、十分であり得るとしても）、レセプターに対するリガンドの結合をブロックし得るこれらの抗体を、アフィニティーカラムを形成するために用いる。生存レセプター−Ｆｃ形態および死滅レセプター−Ｆｃ形態の混合物の調製物が、カラムを通過し、そしてフロースルーを収集する。カラムに結合した物質を、即時に中和された低ｐＨ緩衝液（代表的には、ｐＨ２．５〜ｐＨ４．０）を用いて、溶出する。２つのフラクションが、種々のタンパク質濃度で、ＦＡＣＳ結合アッセイにおける細胞（または任意の他の標準的な結合様式）またはリガンドのいずれかに結合する。これらのｍＡｂのいくつかが、選択的に生存形態に結合し、そしてフロースルー対溶出液の５０％の結合を得るために必要とされる濃度の間に差が見られる。この結果は、一線を画するｍＡｂとして、このｍＡｂを特徴づける。フロースルーに対する溶出液中のタンパク質の比は、調製物中の生存形態のパーセントを示す。
【００４６】
従って、同定されたこれらのｍＡｂは、生存形態をアフィニティー精製するために用いられ得る。さらに、種々のイムノアッセイ様式におけるこれらの使用は、所望のレセプター−Ｆｃ形態の正確な形態の発現を最適化するために、使用され得る。このアッセイは、さらに、他の従来の精製方法と組み合わせて用いられ、アフィニティー技術に頼らずに、レセプターの活性形態を精製する方法を見出し得る。生存形態および死滅形態を線引きするために、これらのＡｂを用いて、培養温度が最適化され得、そしてクロマトグラフィー方法が、生存形態を富化するために開発された。あるいは、ＨＩＣカラム方法が、生存形態および死滅形態を分離するために開発され得、そしてこの方法を用いて、培養条件を最適化し得る。同様に、これらのアッセイは、問題のジスルフィド結合を定義するために、レセプター部分のシステイン変異誘発についての基礎を形成し、除去に際してこのジスルフィド結合は、機能的に活性な物質を産出する。
【００４７】
ヒトの疾患における治療的薬剤として、多くのこれらのレセプターが適用を有し、そして患者に適切に折り畳まれた形態のみを与えることが所望されるので、調製物を定義し、そして結合の乏しい形態を除去するためのこれらの方法は、有用性を有する。
【００４８】
種々の改変および変化が、本発明の意図または範囲から逸脱することなく、本発明の方法においてなされ得ることが、当業者に明らかである。従って、本発明の改変および変化が、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内で生じるという条件で、本発明が、本発明の改変および変化を包含することが意図される。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
ＴＮＦファミリーは、ＴＮＦファミリーリガンドおよびＴＮＦファミリーレセプターといわれるリガンドおよびそれらの特異的なレセプターのペアからなる（ＢａｚｚｏｎｉおよびＢｅｕｔｌｅｒ，１９９６；ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ，１９９６）。ＴＮＦのようなリガンドは、代表的に細胞表面において膜結合形態として見出されるか、またはいくつかの場合において、ＴＮＦは、細胞表面から選択的に切断され、そして分泌される。特異的なレセプターに結合するリガンドおよび結合事象は、２つ以上のレセプターを凝集するために働く。これらのレセプターの細胞内ドメインは、この変化をいくつかの方法により検出し得、そしてこの情報をシグナル伝達機構を介して細胞に伝達し得る。このファミリーは、免疫系およびおそらく他の非免疫学的系の調節に関与する。この調節はしばしば、「マスタースイッチ（ｍａｓｔｅｒ ｓｗｉｔｃｈ）」レベルであるので、ＴＮＦファミリーシグナル伝達は、ＴＮＦに最も代表される多くの続いて起こる最善の事象を生じ得る。ＴＮＦは、細胞輸送に関与する接着分子の改変された表示、特定の区画に特定の細胞を駆動するためのケモカイン産生および種々のエフェクター細胞のプライミングに関与する外部からの侵入に対して、生物体の一般的な防御性炎症性応答を開始し得る。このように、これらの経路の調節は、臨床的な可能性を有する。
【０００２】
ＴＮＦレセプターファミリーは一般的に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインからなる、関連タンパク質のコレクションである。細胞外ドメインは、２〜６コピーの密接にジスルフィド結合したドメインで形成され、そしてシステイン残基の独特の配列に基づいて認識する（Ｂａｎｎｅｒら、１９９３）。１つのリガンドは、いくつかのレセプターを共有し得るが、各レセプターは、対応するリガンドに結合する。いくつかの場合において、膜貫通領域および／または細胞内ドメインを欠失しているレセプターの可溶性形態が天然に存在することは、明らかである。事実上、これらのレセプターの短縮型のバージョンが、直接的な生物学的な調節の役割を有し得る。このプロセスの例は、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）系によって提供される。オステオプロテゲリンは、ＲＡＮＫ−Ｌ（ＴＲＡＮＣＥとも呼ばれる）および／またはＴＲＡＩＬを介するレセプターへのシグナル伝達をブロックする分泌ＴＮＦファミリーレセプターであり、破骨細胞活性化を誘発する。これらのレセプター（おそらく、ＲＡＮＫレセプター）をブロックすることにより、骨吸収を妨害し、そして骨質量を増加する（Ｂｕｃａｙら、１９９８）。明らかに、ウイルスは、この手段を使用し、それらの宿主生物体におけるＴＮＦ活性を阻害する（Ｓｍｉｔｈら、１９９４）。これらのレセプターは、細胞分化シグナル、細胞死シグナルまたは細胞生シグナルを含む多くの事象をシグナル伝達し得る。しばしは細胞死シグナル伝達は、ＦａｓレセプターおよびＴＮＦレセプターの場合、比較的直接結びつくカスパーゼプロテアーゼのカスケードを介して、誘発される。
【０００３】
ＴＮＦレセプターは、生物学的経路を解明するための強力なツールである。なぜなら、ＴＮＦレセプターは、長い血清の半減期（ｈａｌｆｌｉｖｅ）を有する免疫グロブリン融合タンパク質に容易に変換されるからである。ダイマー可溶性レセプター形態は、天然の分泌リガンドまたは天然の表面結合リガンドのいずれかにより、媒介される事象のインヒビターであり得る。これらのリガンドに結合することにより、これらの融合タンパク質は、リガンドが細胞会合レセプターと相互作用するのを妨げ、そして会合シグナルを阻害する。これらのレセプターＩｇ融合タンパク質は、実験的な判断（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｅｎｓｅ）において有用であり、そしてまた臨床的に首尾よく用いられる。例えば、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉｇを使用して、ＯＫＴ３投与に付随する炎症腸管疾患、慢性関節リウマチおよび急性の臨床的症候群が処置される（Ｅａｓｏｎら、１９９６；Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９７；ｖａｎ Ｄｕｌｌｅｍｅｎら、１９９５）。ＴＮＦファミリーのレセプターを通じるシグナル伝達により媒介される多くの事象の処置は、免疫系の関与に起因する病理的な後遺症を有する免疫に基づく疾患ならびに広範なヒトの疾患の処置において適用を有し得る。例えば、最近記載されたレセプターである、オステオプロテゲリンの可溶性形態が、骨質量の損失をブロックすることが示された（Ｓｉｍｍｏｎｅｔら、１９９７）。従って、ＴＮＦファミリーレセプターシグナル伝達により制御された事象は、免疫系の調節に必ずしも限定されない。レセプターに対する抗体は、リガンド結合をブロックし得、従って、臨床的な適用もまた有する。このような抗体はしばしば、非常に長く生存し、そして血液中でより短い半減期を有する可溶性レセプターＩｇ融合タンパク質を超える利点を有し得る。
【０００４】
レセプター媒介経路の阻害が、これらのレセプターの最も開発された治療の適用を示す一方、本来、これは、臨床的な裏付けが示されたＴＮＦレセプターの活性化であった（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ，１９９６）。ＴＮＦレセプターの活性化は、標的細胞において、細胞死を開始し得、そしてそれ故に、腫瘍への適用は、魅力的であったし、なお魅力的である（Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔら、１９９６）。このレセプターは、リガンドの投与（すなわち、天然の経路）によるか、またはレセプターと架橋し得る抗体の投与によるかのいずれかで活性化され得る。抗体は、例えば、癌の処置に有効であり得る。なぜなら、抗体は、血液中で長期間、リガンドとは対照的に、持続し得るからである。リガンドは、一般的に、血液中で短い寿命を有する。アゴニスト抗体は、癌の処置における有用な対抗手段である。なぜなら、レセプターは、腫瘍においてより選択的に発現し得るか、またはレセプターは、腫瘍において、細胞死または分化のみシグナル伝達し得るためである。同様に、多くの陽性の免疫学的事象は、ＴＮＦファミリーレセプターにより媒介され（例えば、宿主炎症反応、抗体産生など）、従って、アゴニストの抗体は、他の非腫瘍学的な適用において、有益な効果を有し得る。
【０００５】
逆説的に、経路の阻害はまた、腫瘍の処置において、臨床学的な有益を有し得る。例えば、Ｆａｓリガンドは、いくつかの腫瘍により発現され、そしてこの発現は、Ｆａｓ陽性リンパ球の死滅を導き得、従って、腫瘍が免疫系を回避する能力を促進する。この場合、次いで、Ｆａｓ系の阻害は、接近が可能である他の方法で、免疫系が腫瘍に反応することを可能にし得る（ＧｒｅｅｎおよびＷａｒｅ，１９９７）。
【０００６】
このレセプターのファミリーの１つのメンバーである、リンフォトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）は、表面リンフォトキシン（ＬＴ）に結合する。リンフォトキシンは、リンフォトキシンα鎖およびβ鎖の三量体の複合体からなっている（Ｃｒｏｗｅら、１９９４）。このレセプター−リガンド対は、末端免疫系の発達および成熟免疫系において、リンパ節および脾臓における事象の調節に関与する（Ｗａｒｅら、１９９５；Ｍａｃｋａｙら、１９９７；Ｒｅｎｎｅｒｔら、１９９６；Ｒｅｎｎｅｒｔら、１９９７；ＣｈａｐｌｉｎおよびＦｕ，１９９８）。リンフォトキシン−βレセプター−免疫グロブリン融合タンパク質は、ＬＴβＲとＩｇＧ（ＬＴβＲ−Ｉｇ）との間で形成され得る。このＩｇＧは、表面ＬＴリガンドと、小胞樹状細胞の機能的状態に対して重要なレセプターとの間のシグナル伝達をブロックする（ＭａｃｋａｙおよびＢｒｏｗｎｉｎｇ １９９８）。このブロッキングは、齧歯動物モデルにおいて、減少した自己免疫疾患をさらに導き得る（Ｍａｃｋａｙら、１９９８、１９９５年７月２１日に出願された米国特許第０８／５０５，６０６号および１９９６年１０月２６日に出願された米国特許第６０／０２９，０６０号）。ヘルペスウイルス侵入伝達物質についてＨＶＥＭと言われるこのレセプターファミリーの第２のメンバーは、ライト（Ｌｉｇｈｔ）と言われるリガンド（Ｍａｕｒｉら、１９９８）ならびにヘテロマーの（ｈｅｒｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）ＬＴリガンドに結合する。このレセプターの機能は、現在、未知であるが、ＨＶＥＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、免疫学的疾患の処置のために有用であり得、そしてこの構築物は、インビトロで免疫機能アッセイに影響することが示された（Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａら、１９９８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記で議論したようにＴＮＦファミリーのメンバーの臨床学的進歩にもかかわらず、臨床学的セッティングにおける使用のための適切なレセプターＩｇ融合物の所望する収率を得る方法についての必要が残っている。例えば、サルＣＯＳ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞のいずれかにおいて発現される場合、ＬＴβＲ−Ｉｇタンパク質は、２つの形態で機能し得る。一方の形態は、高親和性でリガンドと結合するが、他方は結合しない。従って、低親和性形態の存在を最少化する一方、高親和性で結合する形態のより高い収率を生じる方法についての必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、そのリガンドへの高親和性結合を有するタンパク質−Ｉｇ融合物の形態の高い収率の発現のための方法に関し、低温度での培養系において所望する融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養し、それにより、誤って折り畳られたタンパク質形態または誤って架橋されたタンパク質形態の量を最少化することによって、その形態は、「活性な」形態であると本明細書中でいわれる。種々の実施形態における本発明は、約２７℃〜約３５℃の温度で、形質転換した宿主を培養することにより、哺乳動物発現系において高収率で発現する方法に関する。好ましくは、哺乳動物宿主を、約２７℃〜約３２℃の温度で培養する。
【０００９】
なお他の実施形態において、本発明は、低温度で酵母発現系において形質転換された宿主を培養することにより活性な融合タンパク質の高収率の発現のための方法に関する。所望されたタンパク質を酵母において発現する場合、好ましい温度は、約１０℃〜約２５℃であり、より好ましくは、約１５℃〜約２０℃である。
【００１０】
本願発明の特定の方法において、タンパク質−Ｉｇ融合は、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバー（例えば、リンフォトキシン−βレセプターまたはそのフラグメント）を含む。あるいは、本願方法は、低温度での任意の発現系（例えば、昆虫系または細菌系）における所望する融合タンパク質の発現を含み得る。
【００１１】
他の実施形態において、本願発明は、本願方法により得られる活性なタンパク質−Ｉｇ融合物およびそれらを含む薬学的組成物を含む。なお他の実施形態において、本発明は、約２７℃〜約３５℃、好ましくは２７℃〜３２℃の低温度を有する培養系において、所望されるタンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養して、高収率の活性融合タンパク質を発現する工程、培養系から活性なタンパク質融合物を回収する工程、および回収された活性な融合タンパク質を薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせる工程を包含する、薬学的調製物を作製する方法に関する。好ましい実施形態において、タンパク質−Ｉｇ融合物は、リンフォトキシン−βもしくはそのフラグメント、またはＨＶＥＭ、もしくはそのフラグメントを含む。
【００１２】
なお他の実施形態において、本願発明は、記載された方法を用いて得られた薬学的組成物に関する。
【００１３】
異なる実施形態において本願発明は、哺乳動物発現系ならびに他の発現系（例えば、酵母系、細菌系、または昆虫系）に関する。
【００１４】
特定の実施形態において、本発明は、約１０℃〜約２５℃、より好ましくは、約１５℃〜約２０℃の低温度で培養することにより、酵母において活性な融合タンパク質の高レベルの発現のための方法に関する。酵母における発現のこの方法によって、得られた活性な融合物、およびこれらの活性な融合物を含む薬学的組成物をまた含む。薬学的調製物を作製するための方法は、好ましくは約１０℃〜約２５℃、より好ましくは約１５℃〜約２０℃の低温度で、所望する融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された酵母細胞を培養する工程を含む活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を含む本発明の範囲内に含まれる。本発明の全ての組成物および方法の最も好ましい実施形態において、タンパク質−Ｉｇ融合物は、リンフォトキシン−βレセプター、ＨＶＥＭ、またはそのフラグメントを含む。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１） 高収率の活性なタンパク質−Ｉｇ融合物の発現のための方法であって、約２７℃〜約３５℃の低温を有する培養系において、所望のタンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養する工程を包含する、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、上記温度が約２７℃〜約３２℃である、方法。
（項目３） 項目１に記載の方法であって、上記形質転換された宿主が、まず、約３３℃より高い温度で、該宿主の増殖を可能にするに十分な期間培養される、方法。
（項目４） 項目１に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを含む、方法。
（項目５） 項目３に記載の方法であって、上記ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーが、リンフォトキシン−βレセプター、ＴＮＦＲ−５５、ＨＶＥＭまたはそれらのフラグメントである、方法。
（項目６） 項目１に記載の方法であって、該方法がさらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより上記培養系から活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を回収する工程を包含する、方法。
（項目７） 項目１に記載の方法であって、上記培養系が、昆虫細胞または細菌細胞を含有する、方法。
（項目８） 約２７℃〜約３５℃の低温を有する培養系において、融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養することにより得られる、活性なタンパク質−Ｉｇ融合物。
（項目９） ＴＮＦファミリーのメンバーを含有する、項目８に記載の融合物。
（項目１０） ＬＴ−βレセプターまたはそのフラグメントを含有する、項目９に記載の融合物。
（項目１１） ＨＶＥＭまたはそのフラグメントを含有する、項目９に記載の融合物。
（項目１２） 活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を含有する薬学的調製物を作製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）約２７℃〜約３２℃の低温を有する培養系において、該タンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養し、それにより活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を発現する、工程；
（ｂ）該培養系から活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を回収する、工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の活性なタンパク質−Ｉｇ融合物と薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせる、工程
を包含する、方法。
（項目１３） 項目１２に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＴＮＦファミリーのメンバーまたはそのフラグメントを含有する、方法。
（項目１４） 項目１３に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、リンフォトキシン−βレセプターまたはそのフラグメントを含有する、方法。
（項目１５） 項目１３に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＨＶＥＭまたはそのフラグメントを含有する、方法。
（項目１６） 薬学的調製物であって、該薬学的調製物が、以下：
（ａ）約２７℃〜約３２℃の低温を有する培養系において、タンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主を培養し、それにより活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を発現させる、工程；
（ｂ）該培養系から活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を回収する、工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の活性なタンパク質−Ｉｇ融合物と薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせる、工程
により得られる、薬学的調製物。
（項目１７） 項目１６に記載の薬学的調製物であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＴＮＦファミリーのメンバーを含有する、薬学的調製物。
（項目１８） 項目１７に記載の薬学的調製物であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、リンフォトキシン−βレセプターまたはそのフラグメントを含有する、薬学的調製物。
（項目１９） 項目１７に記載の薬学的調製物であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、ＨＶＥＭまたはそのフラグメントを含有する、薬学的調製物。
（項目２０） 高収率の活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を発現するための方法であって、約１０℃〜約２５℃の低温を有する培養系において、所望のタンパク質−Ｉｇ融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された酵母を培養する工程を包含する、方法。
（項目２１） 項目２０に記載の方法であって、上記温度が、約１５℃〜約２０℃である、方法。
（項目２２） 項目２０に記載の方法であって、上記形質転換された宿主が、まず、約３０℃より高い温度で、該宿主の増殖を可能にするに十分な期間培養される、方法。
（項目２３） 項目２０に記載の方法であって、上記タンパク質−Ｉｇ融合物が、上記ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを含有する、方法。
（項目２４） 項目２３に記載の方法であって、上記ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーが、リンフォトキシン−βレセプターまたはそのフラグメントである、方法。
（項目２５） 項目２０に記載の方法であって、該方法がさらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより上記培養系から活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を回収する工程を包含する、方法。
（項目２６） 約１０℃〜約２５℃の低温を有する培養系において、融合物をコードするＤＮＡを用いて形質転換された酵母を培養することにより得られる、活性なタンパク質−Ｉｇ融合物。
（項目２７） ＴＮＦファミリーのメンバーを含有する、項目２６に記載の融合物。
（項目２８） ＬＴ−βレセプターまたはそのフラグメントを含有する、項目２７に記載の融合物。
（項目２９） ＨＶＥＭまたはそのフラグメントを含有する、項目２６に記載の融合物。
（項目３０） Ｉｇ Ｆｃドメインおよびペプチド鎖を有する活性なタンパク質−Ｉｇ融合物を含有する薬学的調製物であって、ここで、該Ｉｇ Ｆｃドメインが、改変され、それにより該タンパク質−Ｉｇ融合物のヒンジ領域におけるジスルフィド形成の速度を改変する、薬学的調製物。
（項目３１） 項目３０に記載の調製物であって、上記Ｉｇ Ｆｃドメインが、少なくとも１つのシステイン残基をアラニンで置換することによって改変される、調製物。
（項目３２） ＴＮＦファミリー由来のペプチドに架橋されたＩｇ−Ｆｃドメインを含有するタンパク質−Ｉｇ融合物であって、ここで、該Ｉｇ−Ｆｃドメイン上の少なくとも１つのシステイン残基がアラニンで置換される、タンパク質−Ｉｇ融合物。
（項目３３） 上記ペプチドが、リンフォトキシン−βレセプター由来である、項目３２に記載のタンパク質−Ｉｇ融合物。
（項目３４） 少なくとも１つのシステイン残基をアラニンへ変異誘発し、それにより発現された活性な形態の融合物の収率を増大させる工程により、ＴＮＦレセプターファミリー由来のペプチドに架橋されたＩｇ Ｆｃドメインを含むタンパク質−Ｉｇ融合物を作製する、方法。
（項目３５） 上記ペプチドがＬＴβＲであり、そして位置１０１および位置１０８のシステインが、アラニンへ変異誘発される、項目３４に記載の方法。
（項目３６） 上記ＬＴβＲペプチドの位置１０１および位置１０８にアラニンを含有する、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、レセプター−免疫グロブリンキメラタンパク質の概略図である。左のパネルは、代表的なＩｇＧ分子のアニメーション画像を示し、Ｆｃドメインは、黒で塗られ、重鎖可変ドメインは、灰色で塗られ、そして軽鎖は、白色のままにしてある。真中のパネルは、細胞内ドメイン（ねずみ色）および細胞外ドメイン（薄灰色）を含むＬＴβＲ分子の概略図を含む。右のパネルは、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の概略図を示す。
【図２】図２は、実際に誤って折り畳まれたアミノ酸または誤って架橋されたアミノ酸は、同定されていないが、おおよその死滅ＬＴβＲ−Ｉｇ形態の欠損を示す概念図である。
【図３】図３は、ＰＮＧａｓｅ Ｆでの処理前後のヒトＬＴβＲ−ＩｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。レーン１およびレーン２は、３７℃で増殖されたＣＨＯ細胞培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製されたヒトＬＴβＲ−Ｉｇを含む。レーン３は、ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いて処理して、全てのＮ結合型オリゴ糖を除去した後と同じ調製物を示す。レーン１は、非還元条件下で電気泳動し、レーン２およびレーン３は、還元条件下で電気泳動する。タンパク質のバンドを、クマシーブリリアントブルーを用いてゲルを染色することにより、可視化する。
【図４】図４は、ＡＧＨ１アフィニティーカラムレーンを素通りするタンパク質およびｐＨ３．５リン酸緩衝液を用いて溶出されたタンパク質の非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析である。アフィニティー精製前のタンパク質をゲルの右側のレーンに示す。クマシーブリリアントブルーを用いてゲルを染色することにより、タンパク質バンドを可視化する。
【図５】図５は、表面リンフォトキシンに結合するＡＧＨＩアフィニティーカラムから素通りしたフラクション（下）および溶出したフラクション（上）の能力である。平均蛍光強度値は、記載されたようにＦＡＣＳ分析から得た。ＦＡＣＳプロフィールの例を、右に示し、ここでＬＴβＲ−Ｉｇは、コントロールのＬＦＡ−３−Ｉｇタンパク質の結合と比較される。
【図６】図６は、ＰＯＲＯＳエーテルカラムおよび硫酸アンモニウムの減少勾配を用いる、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの分析的ＨＩＣカラムクロマトグラフィーである。ピーク１は、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの低い、不活性化形態であり、ピーク２は、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの高い、活性な形態を示す。ピーク１およびピーク２に対応するフラクションをそれぞれ収集し、そして４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分析した（挿入したパネル）。「１」と表示されたレーンは、ＨＩＣクロマトグラフィーのピーク１の「不活性な」物質を含み、レーン２は、ＨＩＣクロマトグラフィーのピーク２の「活性な」物質を含む。出発物質は、レーン「Ｌ」に示される。「Ｍ」と表示されたレーンは、分子量マーカーを含む。
【図７】図７は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｏｕｒｃｅ １５ ＰＨＥカラムを用いるヒトＬＴβＲ−Ｉｇの分離用ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）クロマトグラフィーである。ヒトＬＴβＲ−Ｉｇを含むプロテインＡ溶出物を、５Ｍ ＮａＣｌを用いて終濃度１．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調節し、そしてカラムに載せる。カラムを、５倍量の１．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄し、そして２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で溶出した。Ｘ軸は、時間（分）を示し、Ｙ軸は、２８０ｎｍの吸光度を示す。図中に示された挿入図は、素通り（ＦＴ）収集物および溶出（Ｅ）収集物のクマシーブリリアントブルーを用いて染色された非還元４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。「生存」形態および「死滅」形態の移動の位置を、矢印を用いて示す。
【図８】図８は、異なる温度で増殖されたＣＨＯ細胞から分泌されたヒトＬＴβＲ−ＩｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング分析である。ヒトＬＴβＲ−Ｉｇを含む示された培養温度で増殖されたＣＨＯ細胞上清を、４〜２０％勾配ゲルを用いる非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とそれに続く、ウエスタンブロッティングとにより、二連で分析された。
【図９】図９は、哺乳動物細胞から分泌された全量のヒトＬＴβＲ−Ｉｇ中の死滅物質のパーセンテージに対する培養温度の効果である。組換えヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞を含む二連のフラスコを示された温度で培養し、そして分泌されたヒトＬＴβＲ−ＩｇをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの「不活性」形態のパーセンテージを分析的ＨＩＣクロマトグラフィーを用いて繰り返し評価した。Ｘ軸は、培養温度を示し、Ｙ軸は、細胞により分泌された全量のヒトＬＴβＲ−Ｉｇのパーセンテージとして発現された「不活性」物質の量を示す。
【図１０】図１０は、２８℃、３２℃および３７℃で調製されたＨＶＥＭ−Ｉｇの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す：２８℃、３２℃および３７℃で培養された細胞由来のＨＶＥＭ−ＩｇのプロテインＡ精製調製物を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合して、そしてあらかじめ形成しておいた４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。タンパク質のバンドをクマシーブルーを用いて可視化した。矢印を用いて示されたバンドは、非凝集化ＨＶＥＭ−Ｉｇを示す。ゲル上に見える高分子量のバンドは、凝集形態に相当する。
【図１１】図１１は、表面に３７℃対３２℃で産生されたＨＶＥＭ−Ｉｇの結合のＦＡＣＳ分析を示す（Ｌｉｇｈｔおよび／またはＬＴα／β）。Ａ）．３２℃で産生された物質が、３７℃の物質よりもより結合することを示す、ヒトＬＩＧＨＴを用いてトランスフェクトされた２９３細胞に対する濃度の関数としてのＨＶＥＭ−Ｉｇの結合。Ｂ）．ＬＩＧＨＴをトランスフェクトされた２９３細胞に対する２μｇ／ｍｌの濃度でのＨＶＥＭ−Ｉｇ結合が観察されたＦＡＣＳプロフィールの例。Ｃ）．３２℃で産生されたＨＶＥＭ−Ｉｇの、ＬＩＧＨＴおよび表面リンフォトキシン−α／β（ＬＴα／β）複合体の両方を示すＩＩ−２３Ｔ細胞ハイブリドーマ株の表面への改善された結合のさらなる例。
【図１２】図１２は、ＬＩＧＨＴまたはリンフォトキシンα（ＬＴα）リガンドのいずれかの、３つの異なる温度で産生されたＨＶＥＭ−Ｉｇを固定化したＢＩＡ ｃｏｒｅ ｃｈｉｐへの結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析である。各々の曲線は、リガンドの１つの濃度での結合事象を示し、以下の濃度を使用した：３０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、３．７５μｇ／ｍｌ、１．８７μｇ／ｍｌ、０．９３μｇ／ｍｌ、０．４７μｇ／ｍｌ、０．２３μｇ／ｍｌ、０．１１μｇ／ｍｌおよび０．０μｇ／ｍｌ。各々のチップを、レセプターＩｇの等量が結合することを示す、同じＲＵレベルにロードした。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（詳細な説明）
ここで、本願発明に対する言及が詳細になされる。本発明は、ＴＮＦファミリーにおけるレセプターの免疫グロブリン融合タンパク質の高レベルの機能的形態または高レベルの活性化形態を生じる能力に関する。レセプター−Ｉｇ融合タンパク質を用いた臨床介入の成功は、長期間の存在および慢性的に処置する能力または疾患期間の拡大の最小化を必要とする。理想的に、ヒトの使用ためのこのような融合タンパク質の調製は、いかなる凝集体形態、不活性形態または誤って折り畳まれた形態も有さない。何故なら、そのタンパク質の存在は、薬物の効力を減少し、そして改変された構造は、薬物の除去を容易にし、それによってその効力を減少し得る抗体応答を誘発し得るためである。さらに、抗レセプター抗体は、細胞表面上の天然レセプターに直接に架橋し得、それによってそれら（すなわち、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９６，ＪＥＭに記載のようなアゴニスト抗体）を活性化する。アゴニスト抗体は、その系を活性化し、従って、さらに、レセプター−Ｉｇ処理は、より非効果的であり得または有害でさえあり得る。「免疫グロブリン融合タンパク質」によって、本発明者らは、ポリペプチドの細胞外ドメインの任意の機能的部分と免疫グロブリン定常領域の任意の部分（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン、あるいはその組み合せ）との任意の融合物をいう。好ましくは、このポリペプチドは、ＴＮＦファミリーのレセプターのメンバーである。Ｉｇ分子の部分は、種々の免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＭ、ＩｇＡなどを含む）のいずれか由来であり得る。「ＴＮＦファミリーのレセプター」によって、本発明者らは、このレセプターが、天然に膜結合されようとまたは分泌されようと（オステオプロテゲリンの場合のように）、規範的なＴＮＦファミリーシステイン架橋パターンを有する任意のレセプター、またはＴＮＦファミリーのリガンドの定義されたメンバーに結合する任意のレセプター（例えば、Ｂａｎｎｅｒら、１９９３）をいう。他の実施形態において、本願発明は、本明細書中で議論される方法によって得られたＴＮＦファミリーレセプター−Ｉｇ融合物およびそれらを含む薬学的調製物に関する。
【００１７】
ＬｔβＲ−Ｉｇタンパク質は、サルのｃｏｓ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞において２つの形態で発現される。１つの形態である「活性な」形態は、高い親和性でリガンドに結合し、一方、もう一方の形態である「不活性な」形態は、リガンドに結合しない。生存形態と死滅形態のこの混合物は、どのＴＮＦレセプター−Ｉｇ融合タンパク質についても、以前は記載されなかったが、不活性形態の性質は、明らかでない。この２つの形態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の２つのバンドの存在によって発見された。この発現された物質は、かなりのグリコシル化不均一性を含む；しかし、この不均一性は、本明細書中で記載される機能的問題をおそらく生じないだろう。例えば、このレセプターが、膜通過ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域を欠失する可溶なモノマー形態として発現される場合、非Ｎ結合グリコシル化形態、モノＮ結合グリコシル化形態およびジＮ結合グリコシル化形態が観測される。単一グリコシル化形態および二重グリコシル化形態の両方は、ＢＤＡ８（機能性形態のみを認識する抗体）によって免疫沈降され得る。さらに、アフィニティーで精製された形態は、同様なグリコシル化不均一性を有する。むしろ、本発明者らは、非膜固定形態の発現が、レセプター−Ｉｇダイマーの２つのアーム間で不適切な架橋を生じるいくつかの異常なジスルフィド結合をもたらすと予測する。
【００１８】
ＴＮＦファミリーのレセプターは、一般的に、ドメインあたり約３つのジスルフィド架橋を有する細胞外のリガンド結合部分のドメインを３〜４繰り返した。不適当な折り畳みは、ジスルフィド結合の不正確なパターンまたはジスルフィド結合のいくつかの形成の欠失のいずれかをもたらす（図２中に図解的に図示される）ことが、考えられる。レセプター−Ｉｇ融合タンパク質の場合、Ｆｃドメインの早い折り畳みが、２つのＬＴＢＲ鎖（すなわち、２つのレセプターアーム）をきわめて近接させる、引き続く２量化を可能にするようである。レセプタードメインが、折り畳みをまだ完成していない場合、遊離スルフヒドリルがこれらのアームの間で対になる（すなわち、アーム間架橋）可能性がある。このような不正確な折り畳みが起こり得るか、またはジスルフィドスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）が、すでに形成されたジスルフィド結合の隣に並んだ遊離スルフヒドリルの間で生じ得、両方の場合において、これらは、折り畳みエラーをもたらす。不正確な折り畳みは、１つのアーム内で起こる（すなわち、アーム内折り畳みエラー）こともまた可能であるが、このようなエラーは、根本的に異なる最終分子形状を生じないかもしれない。この場合、活性形態および不活性形態は、従来のサイズ化方法を用いて、容易に分散できないかもしれない。
【００１９】
最後に、ＴＮＦＲ５５レセプターにおいて、第４のドメイン（すなわち、膜貫通領域に最も近接したドメイン）は、このレセプターが、Ｉｇ融合タンパク質として発現された場合、リガンド結合のために不可欠であると実証された（Ｍａｒｓｔｅｒｓら、１９９２年）。このドメインは、多くのＴＮＦレセプターのために不可欠であり得る。ＴＮＦＲ５５５に関する別の研究は、このドメインが、Ｉｇ融合タンパク質に関連してのみ不可欠であり、この第４のドメインを欠失する膜形態が、ＴＮＦリガンドを結合する際に完全に活性であることを示唆した（Ｃｏｒｃｏｒａｎら、１９９４年）。しかし、より最近では、結晶学的分析により、第４のドメインに関してあり得る不可欠な機能が指摘された（Ｎａｉｓｍｉｔｈら、１９９６）。この第４のドメインは、リガンドとの直接の接触をなお欠く種の間で比較的に保存される（Ｂａｎｎｎｅｒら、１９９３年）。ヒンジおよびＣＨ２＋ＣＨ３ Ｆｃドメインの隣に存在する２つの第４のドメインの間のこの領域におけるアーム間架橋は、分子の全形状を認知できるほどには改変せず、それ故、サイズに基づいた分離方法において不可視であり得ることが可能である。それにもかかわらず、この分子は、損なわれたリガンド結合を示す。３つのドメインのみ有するレセプターは、同様の様式でふるまい得る。
【００２０】
細胞培養の間の温度減少は、分泌される顕著により少ない誤って折りたたまれたより小さい形態（すなわち、不活性形態）を生じた。この改善は、おそらく、ポリペプチドの折り畳み速度の減少に起因し、この速度の減少は、レセプター−Ｉｇ融合タンパク質を予期されたダイマー形態へとアセンブルする前に、ＬＴβＲ部分の個々のドメインをより時間をかけて折り畳むことを可能にする。折り畳みプロセスを遅くするために必要とされる絶対温度は、宿主依存性である。哺乳動物細胞（すなわち、ＣＨＯ）に関して、本願の方法は、好ましくは、約２７℃〜約３５℃の温度で起こり、さらに好ましくは、この温度は、約２７℃〜約３２℃である。本願の方法はまた、酵母培養系において使用され得る。酵母培養物は、有意な利益を達成するために、約１０℃〜約２５℃の温度で、好ましくは、約１５℃〜約２０℃で増殖されることを必要とする。
【００２１】
本願発明の活用は、活性タンパク質Ｉｇ融合物の正確な折り畳みを可能にする。いくつかの場合、その間に非常に低いレベルのクローニングされた遺伝子の発現しか起らない、より高い温度（例えば、約３７℃〜約４３℃）での細胞増殖を可能にすることが、望ましくあり得る。所望の増殖期間の後、この融合物は、低温度で発現され、活性融合物の増大された収率を生じ得る。哺乳動物系における低温度は、上で議論されたように、好ましくは約２７℃〜約３５℃であり、より好ましくは約２７℃〜約３２℃である。
【００２２】
従って、タンパク質−Ｉｇ融合物が発現される温度を低下させることにより、本願の方法は、当業者がそのタンパク質および所望のタンパク質のＩｇ部分の両方の折り畳みを調節することを可能にする。
【００２３】
さらに、アフィニティークロマトグラフィー技術および／または従来のクロマトグラフィー技術を含む本願の方法を用いて、当業者は、今や、種々の臨床上の状況において、免疫学的機能をブロックするキメラタンパク質を使用するのに十分活性なフラクションを精製し得る。さらに、低温（すなわち、≦３２℃（ＣＨＯについて）および≦２５℃（酵母について））細胞培養条件を有する本願の方法を用いて、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇのより大きい活性な形態で高度に濃縮された培養上清を調製することが、今や、可能である。さらに、このファミリーのレセプターの他のメンバーは、同様な問題を欠点としてもつことがあり得る。例えば、本発明者らは、ＴＮＦＲ５５−Ｉｇ（ｐ５５ ＴＮＦＲまたはｐ６０ ＴＮＦＲとも呼ばれる）についての非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で２つの類似したバンドを観察する。同様に、ＨＶＥＭと呼ばれる別のＴＮＦファミリーレセプターの特性は、より低温での分泌により改善される。このレセプターは、種々の温度で作製された物質において明らかなサイズの差異が存在しない場合、アーム内折り畳みエラーの例を形成し得る。それにもかかわらず、機構に関係なく、ＴＮＦファミリーのこれらのメンバー他のメンバーの調製において、低下された分泌温度を有する本願の方法は、より高いパーセンテージの活性な融合タンパク質を生じる。
【実施例】
【００２４】
（実施例）
（実施例１ ヒトＬＴβ−Ｉｇの生存形態を特異的に認識するｍＡｂ）
ＬＴβ−Ｉｇタンパク質（図１）は、プラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のいずれかから分泌される場合、標準的プロテイン質Ａに基づくアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて精製し得る。精製されたタンパク質は、非還元ＳＤＳアクリルアミドゲル上で約１００ｋＤａの密接な間隔の２つのバンドからなる（図３）。この２つのバンドは、見かけの大きさで約５ｋＤａ異なる。このタンパク質が、還元される場合、約５０ｋＤａの、不均一なグリコシル化から生じた本質的な２つのバンドが、分離される（図３）。しかし、非還元条件下で観測された２つのバンドは、還元されたバンドの対を生じるグリコシル化の差異から直接には生じない。ヒトＬＴβＲに対するモノクローナル抗体のパネルを用いて、本発明者らは、グループＩ由来の抗体（すなわち、ＡＧＨ１およびＢＤＡ８）がレセプターの大きいＭＷ形態のみを認識することを示した（表Ｉ；上のバンドおよび下のバンドに対する選択性を除くすべてのデータは、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９６年により得られた）。このグループ由来の抗体は、ＢＤＡ８のＦａｂフラグメントが、なおブロックし得るという観測により証明されるようにリガンド結合領域に直接結合する。グループＩＩのｍＡｂもまた、リガンド結合をブロックし得るが、生物学的アッセイにおいて、これらのｍＡｂは、混合したアゴニスト性質およびアンタゴニスト性質を示す。これらのｍＡｂ（ＡＧＨＩを、本実験において使用した）からアフィニティーカラムを作製し、そしてＬＴβＲ−Ｉｇの大きな形態および小さな形態の混合物を適用する場合、レセプターの小さい方の形態は、流れ、そして大きい方の形態は、カラムマトリクスに留まる。低ｐＨ溶出によって、大きな形態の純粋な調製物が生じる（図４）。この２つのフラクションを、表面ホルボールエステル活性化ＩＩ−２３ Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞（すなわち、表面リンフォトキシン複合体を発現する細胞）に結合する能力についてアッセイした（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９５年に記載のように）。そしてこのｍＡｂへ結合したフラクションのみが、表面のリンフォトキシンに結合し得た。フロースルーフラクション（すなわち、低い方のＭＷのバンド）は、完全に不活性であった（図５）。詳細には、ＬｔβＲ−Ｉｇ構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの上清を、このタンパク質を単離するためにプロテインＡカラムを通過させた。純粋なタンパク質を２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ２．８で溶出し、そしてこのタンパク質を含むフラクションを１／１０容量の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）を用いて中和した。免疫沈降を、３μｇのＬＴβＲ−Ｉｇおよび４μｇの抗ＬＴβＲ ｍＡｂを用いて０．２５ｍｌの容量で行い、続いて、マウスｍＡｂ上のκ鎖のみを認識し、ヒトＦｃドメインを認識しないＫａｐｐａＬｏｃｋセファロースビーズを用いてｍＡｂを捕捉した。このビーズを遠心分離により除去し、上清から、プロテインＡセファロースを用いて残存の免疫グロブリンを除去した。ビーズを、ＳＤＳ ＰＡＧＥサンプル緩衝液（非還元剤）を用いて処理し、緩衝液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上へロードした。ゲルを泳動させ、Ｈｙｂｏｎｄ上へトランスファーさせ、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントを用いてウェスターンブロットした（ＬＴβＲ ｍＡｂに続いて、抗マウスＩｇＧ−ＨＰＲを加え、そしてＨＲＰの化学発光検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ））。
【００２５】
ＬＴβＲ：Ｉｇの活性形態を排他的に認識するＡＧＨ１の能力を活用するために、ＡＧＨ１アフィニティーカラムを、製造者のプロトコルに従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、調製した。このカラムを徹底的にＰＢＳで洗浄し、プロテイン質Ａ精製したＬＴβＲ−Ｉｇを適用し、そしてフロースルーを収集した。このカラムをＰＢＳで洗浄し、次いで、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ２）を用いて溶出した。溶離液を含有するフラクションを、上記のように即座に中和した。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度により決定し、１ＯＤ溶液が１ｍｇ／ｍｌに等しいと決めた。ＬＴβＲ−Ｉｇを含有するフロースループールおよび溶出プールを、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９５年に記載のようにＦＡＣＳ分析による結合について試験した。このフロースルーフラクションは、表面ＬＴを発現する細胞を染色するＦＡＣＳを示さなかったが、一方、溶出プールは、完全な結合活性を保持した。
【００２６】
（実施例２ ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの生存成分および死滅成分の従来のクロマトグラフィー分離）
上記のように同定される大きなＭＷ成分と小さなＭＷ成分との間の潜在的な構造の差異を、従来のクロマトグラフィーの工程を用いる分離方法の設計において活用する。例として、このタンパク質を、ＰＢＳ中でゲル濾過によりサイズ分類して、大きい方の形態および小さい方の形態の部分的な分離を達成し得る。次いで、これらの調製物を、再び同じカラムへ適用し、それぞれの化合物において９０％より大きく濃縮されたヒトＬＴβＲ−Ｉｇの大きい方の形態および小さい方の形態の調製物を入手し得る。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して、同じ結果を達成し得る。このタンパク質の混合物を、硫酸アンモニウムで希釈し、ＨＩＣカラム上にロードし、そして大きい成分および小さい成分を、減少する塩勾配で示差的に溶出する。これらの条件下で、この２つのヒトＬＴβ−Ｉｇ成分のベースライン分離を達成する（図６）。これらの方法および上記のような免疫アフィニティー方法は、ｍｇ量のヒトＬＴβＲ−Ｉｇの大きな調製物および小さな調製物を調製するために有用であるが、薬学的用途のための多量のこれらの成分の調製について所望される多くの事を残す。出願者らは、このＨＩＣ方法を大量に得られる樹脂へ適応させることにより、新規の方法を発明し、そしてクロマトグラフィー条件を同定した。このクロマトグラフィー条件は、大きな成分は維持され、そして選択的に溶出され得る間、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇ物質の小さな形態がカラムを通って流れることを可能にする（図６）。溶出された物質を、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーのような最終の工程へ供して、凝集物質および他の不純物を除去し得、適切な生理学的緩衝液への処方の後、これをインビンボでの作業に使用し得る。下記の第１の実施例（Ａ）は、ＬＴβＲ−Ｉｇの調製の際に、不活性物質の量を分析的に評価するために使用した特定の条件を記載する。第２の実施例（Ｂ）は、活性成分が非常に濃縮されたＬＴβＲ−Ｉｇ調製物を生じる分離用の精製プロセスを記載する。
【００２７】
Ａ）．分析的疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を、不活性ＬＴβＲ−Ｉｇの量を評価するための定量的アッセイとして使用し得る）
組換えヒトＬＴβＲ−Ｉｇの小さい方の不活性成分および大きい方の活性成分のベースライン分離を、１．５Ｍの硫酸アンモニウムで平衡にしたＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ エーテル／ｍ カラム（４．６×１００ｍｍ、カタログ番号Ｐ０９１Ｍ５２６）、そして硫酸アンモニウムの減少勾配において引き続く溶出で達成した。このＬＴβＲ−Ｉｇ調製物を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度へ希釈し、そして１．５Ｍの硫酸アンモニウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ９）（緩衝液Ａ）の最終緩衝液組成物にした。一部（１００μｇのタンパク質を含む１ｍｌ）をＰｏｒｏｓエーテル／ｍ カラム上へロードした。このカラムを、８．３ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。活性成分および不活性成分を、１００％の緩衝液Ａから１００％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ９）までの直線勾配（全勾配容量１６．６ｍｌ）で、示差的に溶出し、続いて、緩衝液Ｂ １６．６ｍｌを用いて洗浄した。カラムの溶出物を、２１４ｎｍでの吸光度についてモニターした。全手順を、カラム流速１ｍｌ／分を用いて、周囲気温で実行した。代表的な分析的ＨＩＣクロマトグラムの溶出プロフィールが、図５中に示される。ピーク１は、ＬＴβＲ−Ｉｇの不活性フラクションを含み、そしてピーク２は、ＬＴβＲ−Ｉｇの活性フラクションを含む。この２つの形態の相対的寄与を定量するために、ピーク面積を、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ機器Ｖｉｓｏｎ積分ソフトウェアを用いて、積分した。
【００２８】
Ｂ）．ヒト組換えＬＴβＲ−Ｉｇの分離用精製）
馴化培地の清澄化および濃縮：細胞の細片を、５μのポリプロピレン ５ｓｑｆｔ． Ｃａｌｙｘフィルターカプセル（Ｍｉｃｒｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｇｈ，ＭＡ）を通すデッドエンド濾過、続いて、０．２μ Ｏｐｔｉｃａｐ ４インチフィルターカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、組換えＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞から収集した１０Ｌの馴化培地から除去した。清澄化した培地を、限外濾過により、直列に連結された３つのＳ１Ｙ３０ Ｓｐｉｒａｌ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎカートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、約１Ｌへ濃縮した。
【００２９】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー：濃縮した馴化培地を、４℃で１０ｍｌのプロテインＡセファロース速流（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを重力により通過させた。このカラムを、５０ｍｌのＰＢＳ、０．５ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍｌのＰＢＳ、そして５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。混入したウシＩｇＧを除去するために、このカラムを２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）５０ｍｌで洗浄した。結合したＬＴβＲ−Ｉｇを、３ｍｌのフラクション中で２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．８）を用いて重力により溶出し、そして即座に、０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）０．３ｍｌで中和した。タンパク質を含有するフラクションを、吸収分光法により同定し、プールし、そして−７０℃で保存した。
【００３０】
疎水性相互作用クロマトグラフィー：プロテインＡ溶出プール（２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で４０ｍｌ）を、３Ｍの塩化ナトリウム、４０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）４０ｍｌおよび１．５Ｍの塩化ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）２０ｍｌ（全ての溶液は、周囲気温であった）を用いて、希釈した。希釈したプールを、１０×１００ｍｍ（７．８ｍｌ）Ｓｏｕｒｃｅ ＰＨ１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）上へ、流速２ｍｌ／分でロードした。このカラムを１．５Ｍの塩化ナトリウム７９ｍｌ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を用いて流速２０ｍｌ／分で洗浄した。結合したタンパク質を、流速２ｍｌ／分で２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を用いて溶出した。溶出物の吸光度を、２８０ｎｍでモニターし、そして９ｍｌのフラクションを収集した。タンパク質を含有する溶出物のフラクションを、ＵＶ吸収分光法で同定し、プールし、そして−７０℃で保存した。図７は、典型的なＨＩＣ溶出のプロフィールを表す。これらの条件下で、不活性物質は、カラムを素通りし、そして活性物質は、樹脂に結合される。図７の挿入図は、フォロースルーおよび溶出プールそれぞれのクマシーブルー染色されたＮＲ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンを含む。
【００３１】
サイズ排除クロマトグラフィー：ＬＴβＲ−Ｉｇの活性成分を含有する約１００ｍｌ（１．３ｍｇ／ｍｌ）のＨＩＣ溶出プールを、セントリプレップ３０コンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、限外濾過により９ｍｌに濃縮した。この濃縮物（１０．３ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳで平衡にした１．６×１００ｃｍ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−６プレップグレードカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓ ａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上へ流速１ｍｌ／分でロードした。この溶出物を３ｍｌのフラクションに収集した。タンパク質を含有するフラクションを、ＵＶ吸収分光法で同定した。選択したフラクションを、ＮＲ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を用いて、３μｇ／レーンロードで凝集物含有量について分析した。最小の可視凝集物を有するフラクションを、プールし、そして−７０℃で凍結保存した。
【００３２】
この様式で、粗培養培地中に存在する不活性ＬＴβＲ−Ｉｇ成分の最小量を含有するＬＴβＲ−Ｉｇを、調製し得る。
【００３３】
（実施例３．低温発酵条件が、細胞培養期の間のヒトＬＴβＲ−Ｉｇの大きく活性な成分を濃縮する）
従来の哺乳動物細胞培養条件下で、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇは、約５０％の小さい成分と約５０％の大きい成分の混合物として分泌される。同じタンパク質を発現するために、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞を使用することにより、激烈に減少したレベルの小さい形態を生じる。昆虫細胞を２８℃で培養する場合に、低温で増殖した哺乳動物細胞から分泌されたヒトＬＴβＲ−Ｉｇが、大きい形態および小さい形態の変化した比を有するかどうかを、本発明者らは探究した。ウエスタンブロットによって分析された、２８℃、３０℃、３３℃、３５℃および３７℃にて、Ｔフラスコ中で培養したヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞由来の上清が、図８に示される。大きい形態および小さい形態（矢印で示される）が、３３℃、３５℃および３７℃で増殖した培養物中に存在する。小さい形態の非常にわずかな形跡が、３０℃および２８℃で増殖した細胞由来の培養上清を含むレーンにおいて、見られ得る。従って、細胞培養の間の温度の低下が、小さく不活性な形態のヒトＬＴβＲ−Ｉｇの量を劇的に減少させる。細胞培養温度と、より大きく活性な形態のヒトＬＴβＲ−Ｉｇの濃縮の程度との間の関係を定量するために、複数の培養フラスコをセットアップし、そして１℃の間隔で、２８℃〜３７℃の範囲の温度で増殖させた。プロテインＡアフィニティー精製したヒトＬＴβＲ−Ｉｇサンプルを、分析的ＨＩＣクロマトグラフィーによって分析し、異なる温度で増殖した細胞由来の調製物中に存在するヒトＬＴβＲ−Ｉｇの小さい成分および大きい成分の比を定量した。図９に図表を用いて示されるように、培養温度が、３７℃から３２℃に低下する場合に、低い方のバンドの量が、約１／５倍に急速に減少する。２８℃までの培養温度の低下は、低い方の形態の量を減少させるが、さほど劇的な様式ではない。これらの結果は、３７℃からほんのわずかだけの培養温度の低下が、劇的により小さいのｍｗ成分の量を減少させることを示し、従って、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇのより大きい活性な成分の収率が増加する。これらのデータに基づいて、これらの観察が、懸濁液中の増殖に適応している組換えヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞を用いて製造するに適した条件下で、ラージスケールで複製され得るかを試験するために、３２℃および２８℃の培養温度が選択された。これらの実験について、細胞を、３７℃で、１ｍｌ当たり約２×１０6個の細胞の密度にまで増殖させ、培養物を、細胞生存率が８０％未満に低下するまで、増殖培地の約４容量で希釈し、そして３２℃でインキュベートした。産生期の間、２８℃まで温度を低下させることにより、また、最終的な収集において、顕著により低いレベルの理想的な（ｉｄｅａｄｉ）成分を生じる。２８℃または３２℃での産生期の間に、細胞数はあまり増加しないが、３７℃で排他的に増殖した培養物に対する産生力価における数倍の増加が、収集された馴化培地において得られたことに注意することは興味深い。３２℃および２８℃でのプロセスにおいて使用された特定の条件を、以下に記載する。
【００３４】
初期のデータは、培養温度の低下が、酵母のような他の宿主系において類似の利点を生じることを示唆する。酵母において、低温産生の有益な効果が、哺乳動物細胞においてよりもさらに低い温度で観察されることは興味深い。３０℃で培養された酵母は、主に不活性な形態を産生し、２５℃で増殖した培養物は、不活性な形態および活性な形態のほぼ等しい割合の混合物を含み、そして１６℃で発酵した培養物は、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの活性な形態を主に産生する。これらの観察は、低温発酵が、任意の分泌宿主系において、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの活性な成分の顕著により高い収率を生じることを示唆する。当業者は、各々の系について、最適な産生温度を容易に決定し得る。
【００３５】
ここで本発明者らは、このプロセスが、ＬＴβＲ−Ｉｇの産生にどのように適用されたかについての詳細な例を提供する。細胞培養温度の低下が、宿主細胞から分泌されるＬＴβＲ−Ｉｇにおいて存在する不活性な成分の量を顕著に減少させるという事実を利用する、２つの細胞培養方法が開発された。さらに、低温発酵の予期しない利点は、３６℃〜３７℃で行われた伝統的な発酵作業と比較した場合の、力価における数倍の向上である。表ＩＩは、グリコシル化の程度において変化する異なるＬＴβＲ−Ｉｇ構築物でトランスフェクトされた、２つの異なる細胞株を用いて得られた、不活性なＬＴβＲ−Ｉｇ成分の比較収率および相対的な量を要約する（この実施例の趣旨と密接に関係しない）。
【００３６】
３２℃の細胞培養プロセス：懸濁液中での増殖に適応したヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ、１４０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを補充した、ＤＭＥ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ−１２増殖培地（以下の表ＩＩＩを参照のこと）中で増殖させた。スケールアップのために、２つの７５０ｍｌのスピナーフラスコを、増殖培地において、１ｍｌ当たり約２×１０5個の細胞で播種した。培養物を、３７℃で、５％ ＣＯ2雰囲気下で、１ｍｌ当たり約３×１０6個の細胞の密度まで増殖させた。両方のスピナー培養物由来の細胞懸濁液を合わせて、約１０Ｌの増殖培地を含むスケールアップバイオリアクターを播種した。培養物を、１１％ Ｏ2で酸素化し、そして１ｍｌ当たり約２×１０6個の細胞の密度まで、３７℃で３日間増殖させた。この培養物を、１ｍｌ当たり６．４×１０5個の細胞の密度で、３３Ｌの増殖培地を含む生産用バイオリアクターを播種するために用いた。次いで、生産用バイオリアクターを、８日間、３２℃の有利な温度で、１１％ Ｏ2で設定された酸素散布速度を用いて培養した。収集日（８日目）の細胞密度は、１ｍｌ当たり約２×１０6個の細胞であり、約６０％の生存率であった。これらの条件下で、１２ｍｇ／ＬのＬＴβＲ−Ｉｇの力価を達成し、この力価は、３７℃の伝統的な温度で同じ細胞を培養した場合よりも、２倍高かった。ＬＴβＲ−Ｉｇ調製物における不活性な成分の相対的な量は１７％であり、この相対的な量は、３７℃の培養から得られた産物と比較した場合に、６０％より大きな減少を表した。
【００３７】
２８℃の細胞培養プロセス：懸濁液中での増殖に適応したヒトＬＴβＲ−Ｉｇを分泌するＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ、１４０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを補充した、ＤＭＥ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ−１２増殖培地（以下の表ＩＩＩを参照のこと）中で増殖させた。スケールアップのために、２つの８００ｍｌのスピナーフラスコを、増殖培地において、１ｍｌ当たり約２×１０5個の細胞で播種した。培養物を、３７℃で、５％ ＣＯ2において、１ｍｌ当たり約３．５×１０6個の細胞の密度まで増殖させた。両方のスピナー培養物由来の細胞懸濁液を合わせて、約１０Ｌの増殖培地を含むスケールアップバイオリアクターを播種した。培養物を、１１％ Ｏ2で酸素化し、そして１ｍｌ当たり約１．７×１０6個の細胞の密度まで、３７℃で２日間増殖させた。この培養物を、１ｍｌ当たり２．５×１０5〜３×１０5個の細胞の開始細胞密度で、１：９の分割比を用いて、２つの４０Ｌの生産用バイオリアクターおよび１つの１０Ｌの生産用バイオリアクターを播種するために用いた。生産用バイオリアクターを、１ｍｌ当たり約２×１０6個の細胞の細胞密度に達するまで（２日間）３７℃で培養し、そして１１％ Ｏ2で酸素化した。２日目の終わりに、バイオリアクターの温度を、２８℃に低下させ、そしてこのバイオリアクターを、さらに５日間培養した。７日目に、１ｍｌ当たり約３×１０6個の細胞の細胞密度および７５％を超える細胞生存率で、このバイオリアクターを収集し、そして馴化培地を上記の通りに処理した。これらの条件下で、約２０ｍｇ／ＬのＬＴβＲ−Ｉｇの最終力価が達成され、この力価は、３７℃で同じ細胞を培養した場合に得られた力価に対して３．３倍の増加を示す。不活性な成分の相対的な比率は１０％であり、この値は、３７℃で調製された物質に対して８０％の減少を示す。
【００３８】
（実施例４：産生の間の死滅形態を最小にするための、Ｆｃドメインにおける変更）
死滅した分子が、これらの調製物を生じる理由についての、本発明者らの仮定的な説明に基づいて、Ｆｃドメインが二量体化する前の時間を引き伸ばすことが、正確に折り畳まれたレセプタードメインのフラクションを増加させることが推定される。本発明者らは、この結果に達するために、いくつかの方法を探究した。異なるＩｇ Ｆｃドメインは、異なる速度で折り畳まれるが、ＩｇＧ４ドメインについてのＩｇＧ１ドメインの交換が、生死比を変化させなかったことが可能である。第２に、２つのペプチド鎖を架橋するヒンジ領域におけるシステイン残基が、変異誘発によって、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインから取り除かれた。Ｆｃドメインは、ヒンジのジスルフィド形成の非存在下において、首尾良く二量体化し得るが、この二量体化速度は、ヒンジのジスルフィド形成の非存在下において、より緩慢になり得る。アラニンによる２つのシステイン残基の置換は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＩＣクロマトグラフィーによって定量されるように、減少した量の死滅形態を生じ、その結果、野生型のＬＴβＲ−Ｉｇが、３７℃および２８℃で、５０％および５％の死滅形態を含む場合、ＩｇＧ１のヒンジからのシステインの欠失が、これらのそれぞれの温度で産生される場合に、２０％および５％の死滅形態を導く。従って、両方のシステイン残基の置換によるヒンジの改変が、調製物の質を改善し得、そしてさらに、１つのみのシステイン残基の置換が、有益な効果を有し得ることが可能である。このような遺伝的改変は、低温の産生方法によって、死滅形態のパーセンテージを減少し得る。
【００３９】
（実施例５：折り畳みの問題を補正するためのシステイン架橋の欠失）
代表的には、タンパク質によって使用される折り畳み経路を決定し、最終的な正確な形態を得ることは、非常に困難である。それにもかかわらず、ＴＮＦレセプターファミリーにおけるいくつかのジスルフィド架橋は異常であり、そして最終的に折り畳まれた状態に必要とされないかもしれない。これらの架橋は、変異誘発の良好な候補である。ＬＴβＲ−Ｉｇの３番目のドメインにおける１つのこのような架橋は、システイン１０１およびシステイン１０８（Ｗａｒｅら、１９９５において定義された配列からのナンバリングを用いて）の、アラニンへの従来の部位特異的変異誘発によって取り除かれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって証明されるように、死滅／生存の物質の改善された比を導いた。野生型では、ＬＴβＲ−Ｉｇは、それぞれ３７℃および２８℃で産生される場合に、代表的には、５０％および５％の死滅形態の存在を示す。欠失した１つのシステインジスルフィド架橋を有する変異形態は、これらの温度で産生される場合に、２０％および５％の死滅形態を有した。
【００４０】
（実施例６：ＨＶＥＭ−Ｉｇの調製物の質を改善させるためのより低い温度の使用）
ヘルペスウイルス侵入媒介物（ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）（ＨＶＥＭ）は、ＬＴβＲに関連するＴＮＦファミリーレセプターであり、そしてリガンドＬＩＧＨＴに堅固に結合し、そしてリガンドリンフォトキシン−ａ（ＬＴａ）に弱く結合する（Ｍａｕｒｉら、１９９８）。ヒトＨＶＥＭは、細胞外ドメインのＰＣＲ増幅によって、Ｉｇ融合タンパク質として調製され、そしてＬＴβＲ−Ｉｇについて記載されるように、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２領域およびヒトＩｇＧ１ ＣＨ３領域に融合された（Ｃｒｏｗｅら、１９９４）。構築物を、ＥＢＮＡ系（２９３−Ｅ細胞）を用いた高コピー数ベクター発現を伴うヒト胚性腎細胞株２９３における一過性の発現のために、ＣＨ２６９と呼ばれるベクター（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、１９９７）に挿入した。上清を収集し、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよび低ｐＨ溶出を用いて、ＨＶＥＭ−Ｉｇを精製した。組換えＬＴαを、記載されるように（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９６ａ）、昆虫細胞から調製した。組換え可溶性ヒトＬＩＧＨＴを、活性化ＩＩ２３細胞由来のＲＮＡを用いて、全体のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって調製し、Ｍａｕｒｉら、１９９８によって記載される、コード領域の配列を得た。ＬＩＧＨＴのレセプター結合ドメインを、ＰＣＲによって増幅させ、そしてα接合因子リーダー配列上で融合させ、そして他の関連したタンパク質について本質的に記載されるように、発現させた（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９６）。ＦＬＡＧタグおよび（Ｇ4Ｓ）3スペーサーアミノ酸配列を、リーダーとレセプター結合ドメインの間に挿入し、その結果、分泌されたＬＩＧＨＴが、Ｎ末端ＦＬＡＧ配列を有する。構築物は、以下の分子をコードした：
【００４１】
【化１】
ここで、２つの点は、成熟タンパク質の推定Ｎ末端を示し、この成熟タンパク質は、次の２つのアミノ酸（ＥＡ）の除去によって、さらにプロセスされ得る。このタンパク質を、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂカラム上のアフィニティークロマトグラフィー、および低ｐＨまたはカルシウムキレート化のいずれかを用いた溶出によって、上清から精製した。全長のＬＩＧＨＴをまた、記載されるように（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、１９９７）、２９３−Ｅ細胞の表面上での発現のために、ベクターＣＨ２６９に挿入した。細胞表面に対するレセプター−Ｉｇの検出のためのＦＡＣＳ結合方法、および固定化されたレセプター−Ｉｇに対する可溶性リガンドの結合を測定するためのＢＩＡｃｏｒｅ方法が、記載されている（Ｍａｃｋａｙら、１９９７）。ＢＩＡｃｏｒｅ技術は、チップ（すなわち、レセプター）に結合したタンパク質の、リアルタイムの測定をもたらす。
【００４２】
ＨＶＥＭ−Ｉｇを発現するＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳを補充された増殖培地を用いて、ローラーボトル中で３７℃で、コンフルエンシーまで増殖させた。細胞がコンフルエンスに達した時点で、使用済み培地を新鮮な増殖培地に交換し、そして培養物を、３７℃、３２℃および２８℃でインキュベートした。２８℃および３２℃の培養物を、１週間に１度収集し、３７℃の培養物を、４日ごとに収集した。分泌されたＨＶＥＭ−Ｉｇを、記載されるように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製された調製物を、分析まで−７０℃で保存した。ＨＶＥＭ−Ｉｇを、２８℃、３２℃および３７℃で産生し、そして精製した場合、すべての調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において同様に挙動し（図１０）、これは、タンパク質において大きな変化が生じなかったことを示唆する。従って、異常な折り畳み／ジスルフィド架橋が生じる場合、アーム内（ｉｎｔｒａ−ａｒｍ）またはＦｃドメインのヒンジ領域に近接して生じるかのいずれかであり（すなわち、アーム内架橋）、従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、認めうるほどに分子の全体の形状に影響を及ぼさなかった。レセプター−Ｉｇが、２９３−Ｅ細胞上で発現されるＬＩＧＨＴまたは活性化ＩＩ２３細胞上で発現されるＬＩＧＨＴに結合する能力を、ＦＡＣＳ結合アッセイにおいて評価した（図１１）。両方の細胞型に対して、ＨＶＥＭ−Ｉｇが、細胞表面リガンドを結合する能力が、３２℃での発現に対して、およそ２〜３倍改善された。ＢＩＡｃｏｒｅ技術を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅチップを、ＨＶＥＭ−Ｉｇを用いて、同様のレベルまでロードした場合（ＲＵ値は、チップにおけるタンパク質の量を反映する）、より低い温度で産生されたＨＶＥＭ−Ｉｇが、より高い温度で産生されたタンパク質よりもリガンドに結合することが観察された（図１２）。ＬＩＧＨＴまたはＬＴαのいずれがリガンドであった場合でも、この結果が得られた。ＢＩＡｃｏｒｅ結合曲線は、結合事象のリアルタイムでのオンおよびオフを示し、そして結合事象が、産生温度に関係なく類似であることが認められ得る。従って、調製物の一部（ｐｒｏｔｉｏｎ）が効率的に死滅し、そしてこの比率が、より低い産生温度によって最小化される。本発明者らは、より低い温度が、異常な折り畳み問題を補正し、そして、本発明者らは、死滅分子のフラクションを直接的に観察し得なかったが、生存分子のパーセンテージを改善したことを推測する。上記で概要を述べたように、アフィニティークロマトグラフィー技術は、低下させた増殖温度および／または不正確な折り畳みを防止するためのヒンジもしくはレセプター自体のいずれかにおける種々のシステインの変異誘発による調製物の最適化後に、生存／死滅の形態を分離するために役立ち得る。
【００４３】
（実施例７：他のＴＮＦ−ファミリーレセプター−Ｉｇ融合タンパク質の死滅形態を最小化させるための、一般的なスキーム）
ＴＮＦファミリーの大半のレセプターは、免疫グロブリン−Ｆｃドメインとの融合タンパク質構築物として調製された：
【００４４】
【数１】
いくつかの場合、最も著しくは、Ｆａｓ−ＩｇおよびＣＤ４０−Ｉｇ（例えば、Ｆａｎｓｌｏｗら、１９９２）においては、キメラは、２つのＴＮＦレセプターの可溶性のＦｃ形態と比較して活性が乏しい。これらの調製物のいくつかは、種々の比において、生存形態および死滅形態の混合物であることが可能である。死滅形態とは、単に、生存形態よりも実質的に低い親和性（１０〜１０００倍）で結合する分子をいい、すなわち、結合活性を完全には欠かなくてもよいが、その代わりに、天然に細胞上で見出された高い親和性の形態と相対的に、リガンドへの減少した親和性を有する。異常なレセプターアーム間または異常なレセプターアーム内のジスルフィド結合が生じ得、より少ない活性タンパク質（ｐｒｏｔｉｅｉｎ）を導く。
【００４５】
これらのレセプター、またはいまだ不確定の他のレセプターのいずれかを用いて、抗レセプターｍＡｂのパネルを、従来技術によって調製する。好ましくは、細胞表面上でのネイティブのレセプターに対するリガンド結合アッセイを用いて評価される場合（組換えレセプター形態を用いた他の方法が、十分であり得るとしても）、レセプターに対するリガンドの結合をブロックし得るこれらの抗体を、アフィニティーカラムを形成するために用いる。生存レセプター−Ｆｃ形態および死滅レセプター−Ｆｃ形態の混合物の調製物が、カラムを通過し、そしてフロースルーを収集する。カラムに結合した物質を、即時に中和された低ｐＨ緩衝液（代表的には、ｐＨ２．５〜ｐＨ４．０）を用いて、溶出する。２つのフラクションが、種々のタンパク質濃度で、ＦＡＣＳ結合アッセイにおける細胞（または任意の他の標準的な結合様式）またはリガンドのいずれかに結合する。これらのｍＡｂのいくつかが、選択的に生存形態に結合し、そしてフロースルー対溶出液の５０％の結合を得るために必要とされる濃度の間に差が見られる。この結果は、一線を画するｍＡｂとして、このｍＡｂを特徴づける。フロースルーに対する溶出液中のタンパク質の比は、調製物中の生存形態のパーセントを示す。
【００４６】
従って、同定されたこれらのｍＡｂは、生存形態をアフィニティー精製するために用いられ得る。さらに、種々のイムノアッセイ様式におけるこれらの使用は、所望のレセプター−Ｆｃ形態の正確な形態の発現を最適化するために、使用され得る。このアッセイは、さらに、他の従来の精製方法と組み合わせて用いられ、アフィニティー技術に頼らずに、レセプターの活性形態を精製する方法を見出し得る。生存形態および死滅形態を線引きするために、これらのＡｂを用いて、培養温度が最適化され得、そしてクロマトグラフィー方法が、生存形態を富化するために開発された。あるいは、ＨＩＣカラム方法が、生存形態および死滅形態を分離するために開発され得、そしてこの方法を用いて、培養条件を最適化し得る。同様に、これらのアッセイは、問題のジスルフィド結合を定義するために、レセプター部分のシステイン変異誘発についての基礎を形成し、除去に際してこのジスルフィド結合は、機能的に活性な物質を産出する。
【００４７】
ヒトの疾患における治療的薬剤として、多くのこれらのレセプターが適用を有し、そして患者に適切に折り畳まれた形態のみを与えることが所望されるので、調製物を定義し、そして結合の乏しい形態を除去するためのこれらの方法は、有用性を有する。
【００４８】
種々の改変および変化が、本発明の意図または範囲から逸脱することなく、本発明の方法においてなされ得ることが、当業者に明らかである。従って、本発明の改変および変化が、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内で生じるという条件で、本発明が、本発明の改変および変化を包含することが意図される。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−１５８２５２（Ｐ２０１０−１５８２５２Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７９８５６（Ｐ２０１０−７９８５６）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【分割の表示】特願２０００−５８８３４１（Ｐ２０００−５８８３４１）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１６日（１９９９．１２．１６）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【分割の表示】特願２０００−５８８３４１（Ｐ２０００−５８８３４１）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１６日（１９９９．１２．１６）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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