活性酸素の定量法
【課題】 新しい活性酸素の定量法を提供する。
【解決手段】 一般式１〔Ｒ1は−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ、−ＮＨＲ又は‐ＮＨ2、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示し、前記Ｒは炭素数１〜８の炭化水素基を示し、Ｘはハロゲンを示す。〕のビタミンＢ又はその誘導体を、金属イオンと活性酸素生成物質の存在下で分解して、一般式２（Ｒ1及びＲ2は前記と同じ意味を示し、Ｒ5は−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ又は−ＣＨ2ＯＨを示す。）のプテリジン類を生成し、当該プテリジン類の蛍光強度を測定する活性酸素の定量法。
【解決手段】 一般式１〔Ｒ1は−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ、−ＮＨＲ又は‐ＮＨ2、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示し、前記Ｒは炭素数１〜８の炭化水素基を示し、Ｘはハロゲンを示す。〕のビタミンＢ又はその誘導体を、金属イオンと活性酸素生成物質の存在下で分解して、一般式２（Ｒ1及びＲ2は前記と同じ意味を示し、Ｒ5は−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ又は−ＣＨ2ＯＨを示す。）のプテリジン類を生成し、当該プテリジン類の蛍光強度を測定する活性酸素の定量法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のビタミンＢ又はその誘導体を活性酸素（例えば過酸化水素）との反応により蛍光性物質を生成させて活性酸素を定量する方法に係わる。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素は、発がん性物質の酸化還元反応、光触媒反応、光増感反応、細胞内の酸化系や還元系の還元又は励起によって生成し、細胞毒性の原因となる。また、活性酸素は蛋白質、低分子細胞成分、低分子化合物の自動酸化によっても生成することが知られている。また、活性酸素は蛋白質、低分子細胞成分、低分子化合物の自動酸化によっても生成することが知られている。
【０００３】
例えば、酸化チタンの光触媒作用で酸化された糖の酸化物と生体内金属イオンとの反応で活性酸素の一種である過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷が引き起こされることが非特許文献１に報告されている。
【０００４】
細胞毒性に関する場合、低い濃度の活性酸素でも大きな影響を示すことがある。この他、ＳＵＳ管、銅管内で活性酸素が生成すると腐食を生じ、種々の水処理上のトラブルを生じることとなる。一方、活性酸素は利用の仕方如何では殺菌剤、殺藻剤、除草剤として用いることもできる。従って、活性酸素を高い感度で容易に定量することは各種産業分野において極めて重要なことである。
【０００５】
従来、活性酸素の検出方法としては次のような方法が提案されている。
酸化還元色素であるＮＢＴ（Nitro Blue Tetrazolium）と活性酸素の反応により生じるホルマザンを銅電極と照合電極とを浸漬し、両電極間の電位差を測定して活性酸素を定量する方法が特許文献１に開示されている。しかし、１００ml程度の多量の試料が必要である。また、原理上、電極の使用が不可能な試料への適用が不可能である。
【０００６】
活性酸素によって酸化されると強い蛍光を有するフルオレセインやローダミンが生成することにより、蛍光強度の測定から活性酸素を検出する方法が、特許文献２に提案されている。しかし、これらの化合物は高価である。
【０００７】
一方、分解反応により蛍光強度が増強する化合物として、ビタミンＢの一種である葉酸が報告されている。葉酸は、プテリジン環をもち、プテリジン化合物は、強い蛍光をもつものが多いが、葉酸からの蛍光はほとんど観測されない。それは、葉酸の分子内のアミノベンゾイル残基により励起状態が失活するためである。葉酸は、紫外線の照射で分解し、強い蛍光を有するプテリン−６−カルボン酸が生成することが、非特許文献２に報告されている。
【０００８】
即ち、非特許文献２には、式（３′）：
【化９】
で示される、ビタミンＢの一種である葉酸に紫外線を作用させると、その葉酸が加水分解されて、化学式（１′）：
【化１０】
で示される、可視光の蛍光を発するプテリジン化合物が生成し、このプテリジン化合物（プテリン−６−カルボン酸）が光化学反応でＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている。
【０００９】
しかし、前記の葉酸が紫外線以外の手段によって分解されて、蛍光を有するプテリジン類を生成することについては、非特許文献２を含めこれまでまったく記載されていない。
【００１０】
また、葉酸の誘導体であるアメトプテリンが紫外線の照射で分解し、強い蛍光を有する２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシメチルプテリジンを生成することが、非特許文献３に報告されている。
【００１１】
このアメトプテリンもプテリジン環をもつが、アメトプテリンからの蛍光はほとんど観測されない。葉酸と同様にアメトプテリンの分子内のアミノベンゾイル残基により励起状態が失活するためであるが、その分解により２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシメチルプテリジンが生成すると強い蛍光を示すようになる。この非特許文献３には、アメトプテリンの紫外線による分解で生成した２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシメチルプテリジンが光化学反応でＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている。
【００１２】
即ち、非特許文献３には、化学式（４）：
【化１１】
で示されるビタミンＢの一種である葉酸の誘導体であるメトトレキサート（アメトプテリンの別名、Methotrexateともいう。）に紫外線を作用させると、化学式２：
【化１２】
で示される、可視光の蛍光を有するプテリジン化合物が生成し、このプテリジン化合物が光化学反応でＤＮＡ損傷を引き起こすことが開示されている。
【００１３】
しかし、葉酸の誘導体であるこのアメトプテリンが紫外線の照射以外で分解され、強い蛍光を有する２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシメチルプテリジンを生成することはこれまで知られていない。
【００１４】
一方、金属イオンの存在下で、過酸化水素が生成することは、発がん性物質セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応で過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷が引き起こされること（非特許文献４）、酸化チタン光触媒により酸化された糖と銅（II）イオンとの反応で過酸化水素を生成し、ＤＮＡ損傷が引き起されること（非特許文献１）、銅（II）イオンの触媒作用によるベンゼンジオールの自動酸化反応により過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている（非特許文献５）。しかし、このような過酸化水素で葉酸やアメトプテリンが分解され強い蛍光を有するプテリジン化合物が生成することや、さらにこの蛍光物質を分解に関与した過酸化水素の定量に利用できることは知られていなかった。
【００１５】
【特許文献１】特開平０７−３０１６１８号
【特許文献２】特開２０００−３２１２６２号
【非特許文献１】光化学討論会 講演要旨集 ２００３年１１月２２日（土）〜２４日（月） ３Ｄ０６
【非特許文献２】K. Hirakawa et al. Archives of Biochemistry and Biophysics 410巻, 261-268頁, 2003年.
【非特許文献３】K. Hirakawa et al. Photochemistry and Photobiology, 76巻, 467-472頁, 2002年.
【非特許文献４】K. Hirakawa, et al. Mutation Research 536巻, 91-101頁, 2003年．
【非特許文献５】K. Hirakawa et al. Chemical Research in Toxicology 15巻, 76-82頁, 2002年.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、例えば、生体内で生成する過酸化水素などの活性酸素は、ＤＮＡ損傷に関与するなど、その検出・定量は重要であることから、新しい活性酸素の定量法を提供することを目的としている。
【００１７】
上記従来法のうち、蛍光プローブの利用では、高価な試薬が必要であり、また、多量の試料が必要である。また、原理上、電極の使用が不可能な試料への適用が不可能である。
【００１８】
従って、本発明は、上記の従来の定量法における問題点を解決し、活性酸素を高価な試薬を用いることなく、容易に定量する方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（１）一般式１：
【化１３】
〔但し、式中、Ｒ1は−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ、−ＮＨＲ又は‐ＮＨ2、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕で示されるビタミンＢ又はその誘導体と金属イオンおよび活性酸素生成物質を含有する試料の存在下で、活性酸素により、当該ビタミンＢ又はその誘導体を酸化分解して、
【００２０】
【化１４】
（但し、式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ意味を示し、Ｒ5は−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ又は−ＣＨ2ＯＨを示す。）で示される可視光の蛍光を有するプテリジン類を生成させ、当該プテリジン類の蛍光強度を測定することによって活性酸素を定量することを特徴とする活性酸素の定量法に関する。
【００２１】
（２）本発明は、ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式３：
【化１５】
〔但し、式中、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であって、プテリジン類に係わる一般式２におけるＲ1が−ＯＨで示されるものである、（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２２】
（３）本発明は、ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式４：
【化１６】
〔但し、式中、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であって、プテリジン類に係わる一般式２におけるＲ1が−ＮＨ2で示されるものである（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２３】
（４）本発明は、金属イオンが二価または三価の金属イオンである（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２４】
（５）本発明は、金属イオンが二価の銅イオンである（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２５】
（６）本発明は、活性酸素が過酸化水素である（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２６】
（７）ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式５：
【化１７】
〔但し、式中、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であると共に、
【００２７】
プテリジン類が、化学式１：
【化１８】
で示される化合物である（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２８】
（８）ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式６：
【化１９】
〔但し、式中、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であると共に、
【００２９】
プテリジン類が、化学式２：
【化２０】
である（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００３０】
（９）本発明は、（１）〜（８）のいずれか一つに記載の活性酸素定量法から、活性酸素生成物質の量を測定する、活性酸素生成物質定量法に関する。
【発明の効果】
【００３１】
活性酸素を高価な試薬を用いることなく、金属イオン、特に銅（II）イオン存在下で、ビタミンＢまたはその誘導体を用いて活性酸素の定量が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、
【化２１】
〔但し、式中、Ｒ1は−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ、−ＮＨＲ又は‐ＮＨ2、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕で示されるビタミンＢ又はその誘導体を用いて、金属イオンの存在下に、活性酸素生成物質を含有する試料と反応させることによって、一般式１で示されるビタミンＢ又はその誘導体を分解して、
【００３３】
【化２２】
（但し、上記一般式２において、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ意味を示し、Ｒ5は−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ又は−ＣＨ2ＯＨを示す。）で示される可視光の蛍光を示すプテリジン類を生成させ、その蛍光の強度を測定することによって活性酸素を定量することを特徴とする活性酸素の定量法に関する。
【００３４】
即ち、本発明は、例えば、次の反応式１に示すように、ビタミンＢの一種である葉酸（化学式３′）を、二価の銅イオンの存在下に、過酸化水素を含有する水溶液（試料）に添加して、前記の葉酸を酸化分解して、強い可視光蛍光を示すプテリジン（化学式１′）を生成させるものである。この反応において、過酸化水素は、ヒドロキシルラジカルおよび銅酸素錯体（Ｃｕ（Ｉ）ＯＯＨ）を生成して、一般式１で示されるビタミンＢ又はその誘導体を酸化分解して蛍光物質を生成していると考えられる（非特許文献４および５）。
【００３５】
【化２３】
【００３６】
尚、本発明において、ビタミンＢの一種である葉酸は、次の反応式２に示すような、平衡反応により、異性体（一般式３と一般式３′で示される異性体）であっても、その混合物であってもよく、また化学式１で示されるプテリジン類も同様に異性体もしくはその混合物（化学式１と化学式１′で示される異性体）であってもよいので、本発明における一般式１で示されるビタミンＢとその誘導体及び一般式２で示されるプテリジン類もまた、Ｒ1が−ＯＨである場合には、同様な異性体、またはその混合物であってもよい。このことは、一般式５で示されるビタミンＢとその誘導体においてもいえることである。
【００３７】
【化２４】
【００３８】
本発明において用いる、上記一般式１で示されるビタミンＢ又はその誘導体とは、例えば、一般式３、一般式４で示されるものを好適に挙げることができ、特に、好ましくは、一般式５、一般式６で示されるものを挙げることができ、さらに好ましいのは、一般式５におけるＲ3が−Ｈであり、一般式６におけるＲ3が−Ｈ又は炭素数１〜３のアルキル基であるものを挙げることができ、そして、最も好ましいのは、葉酸、アメトプテリン、４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］安息香酸、アミノプテリン、Ｎ10−（トリフルオロアセチル）プテロイック酸、プテロイック酸、プテロイルアスパルチック酸などである。各一般式における置換基は一般式１と同様である。
【００３９】
本発明において用いる、上記一般式中のＲは、炭素数が１〜８、特に１〜６の炭化水素基で、例えば、アルキル基、アリル基、アルキルカルボキシル基、カルボニル基、カルバモイル基などが挙げられ、Ｘのハロゲンは，フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）ヨウ素（Ｉ）などが挙げられる。
【００４０】
本発明において用いる、金属イオンには、二価の銅イオン、二価の鉄イオン、三価のロジウムイオン、二価のパラジウムイオン、二価のニッケルイオン、二価のマンガンイオン、二価の銀イオンなどを挙げることができ、またテトラクロロ金（III）酸四水和物、ヘキサクロロ白金（IV）酸六水和物、塩化金（III）などの金化合物も含めるが、二価の銅イオン、二価の鉄イオンが好ましく、二価の銅イオンが最も好ましい。
【００４１】
本発明における活性酸素生成物質とは、上記金属イオンの存在下に活性酸素を生成させる物質であればどのような物質でも良いが、例えば、酸化されたグルコース、酸化されたガラクトース、セミカルバジド、ベンゼンジオール、ヒドラジン、ヒドララジン、メチルヒドラジン，メチルヒドロキノン、オルト−アミノフェノール、ケルセチン、イソチオシアン酸アリル、イソチオシアン酸ベンジル、イソチオシアン酸フェネチル、２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４，５−ｂ］ピリミジン、ヒドラゾベンゼン、Ｎ−ヒドロキシ−４−アミノアゾベンゼン、Ｎ−アセチルシステイン、レチノール、レチナール、没食子酸などが挙げられる。ここで、活性酸素とは、反応性の強い酸素の分子種で、過酸化水素、ヒドロキルラジカル、スーパーオキシドアニオン、一重項酸素、一酸化窒素、オゾンなどが挙げられるが、上記一般式１のビタンミンＢ又はその誘導体を酸化分解して上記一般式２の蛍光物質であるプテリジン類を生成することができれば、いずれの活性酸素の形態であってもよい。好ましい活性酸素は、過酸化水素、ヒドロキルラジカルなどである。
【００４２】
本発明において用いる、可視光の蛍光とは、人間の目に見える４００nm〜７００nmの波長の蛍光のことを意味する。
【００４３】
本発明においては、蛍光の強度の測定において、励起波長および蛍光の検出波長は、それぞれ葉酸が吸収する波長および蛍光スペクトルの範囲の波長を利用できる。本実施例では、３６０nmの励起光で試料を励起し、３８０〜６００nmの範囲で蛍光スペクトルを測定した。蛍光の極大波長である４５０nmにおける蛍光強度で評価した。この蛍光強度の測定は、通常の蛍光光度測定装置を用いて測定でき、例えば、前述のビタミンＢ又はその誘導体、金属イオン、活性酸素生成物質を含有する試料を水溶液中で混合して、試料溶液を石英製の蛍光用セルに入れ、島津ＲＦ−１５００、ＲＦ−５３００などの蛍光光度計を使用して測定できるが、これに限定されるものではない。
【００４４】
本発明において、ビタミンＢ又はその誘導体を酸化分解反応における反応温度は０℃〜５０℃程度、特に５℃〜４０℃程度であればよく、即ち、常温（２３℃）付近であればよく、圧力が常圧（１気圧）であればよい。前記酸化分解反応において、溶媒は、水溶液または水を主として（水５０重量％以上）含む溶液であることが好ましく、その溶液には、必要であれば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液が含有されていてもよい。更に、前記の酸化分解反応において、測定時間は、１分〜１００分程度、特に、５分〜６０分程度であればよい。
【００４５】
本発明において、活性酸素生成物質の定量とは、本発明の方法により定量された過酸化水素の量から金属イオンの存在下で活性酸素を生成させた物質の量を表すことが出来るということを意味する。例えば、試料中に発がん性物質セミカルバジドが含まれており、ある量の過酸化水素が発生していれば、その過酸化水素量を測定することで実施例４及び５の計算式（３）または図５の検量線より発がん性物質セミカルバジドの量を知ることが出来るという意味である。さらに、試料中の活性酸素生成物質が未知の場合であっても、その過酸化水素量を測定することでその過酸化水素量を発生させるのに必要な活性酸素生成物質の量を、例えば実施例４及び５の計算式（３）もしくは図５または図７の検量線より得られた発がん性物質セミカルバジドまたは１，４−ベンゼンジオールの量として未知の活性酸素生成物質の量を表すこともできるという意味である。必要であれば、未知の活性酸素生成物質の量を他の先に記載した活性酸素生成物質のいずれかとして表すことも出来る。
【実施例１】
【００４６】
葉酸の酸化分解前後での蛍光スペクトル
１０μM葉酸（和光純薬工業株式会社）、２０μM銅（II）イオン（塩化銅（II）二水和物（和光純薬工業株式会社））を含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を分解前の試料とした。１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオン、５０μM過酸化水素を含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を１．５mLのマイクロチューブ中、３７℃で１時間反応させたものを分解後の試料とした。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−５３００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
【００４７】
化学式１で示されるプテリジンは、図１の分解後で示すような可視光蛍光の強度を有している。
本発明におけるビタミンＢ又は誘導体は、プテリジン環をもつが、プテリジン由来の蛍光はほとんど観測されなかった（図１分解前）。酸化分解によって、プテリジン環の部分がアミノベンゾイル残基から離れることにより、強い蛍光が観測された。
【００４８】
葉酸の蛍光は、図１に示すように非常に弱いが、過酸化水素と銅（II）イオンとの反応により酸化分解するとプテリジン化合物由来の非常に強い蛍光が観測される。また、アメトプテリン（メトトレキサート（アルドリッチ））においても葉酸と同様に過酸化水素による酸化分解で強い蛍光が観察された（図には示していない）。
【実施例２】
【００４９】
銅（II）イオン存在下での過酸化水素の定量
ビタミンＢの一種である葉酸を使用し、金属イオンとして銅（II）イオンを用い、活性酸素である過酸化水素の定量を行った。
【００５０】
本実施例１において、１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオンを含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）と過酸化水素を１．５mLのマイクロチューブ中で加え、３７℃で１時間反応させた。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
過酸化水素の濃度は、０．１μMから１００μMで変化させた。
【００５１】
この実施例２において、銅（II）イオンと過酸化水素の添加により試料の蛍光強度は増大した。
蛍光スペクトルは、プテリン−６−カルボン酸の蛍光スペクトルと一致し、蛍光物質としてプテリジン化合物の生成を示している。銅（II）イオン存在下、過酸化水素濃度の増大に従って蛍光強度が増大した。
試料の蛍光強度は、図２（黒丸）に示す通りである。
【００５２】
比較におけるコントロール試料として、葉酸、銅（II）イオンを含み、過酸化水素を含まない溶液および葉酸と過酸化水素を含み、銅（II）イオンを含まない溶液を用いて、実施例２と同様に行った。
銅（II）イオンを添加していない場合には、蛍光の増強は観測されなかった。
試料の蛍光強度は、図２（白丸）に示す通りである。
【００５３】
なお、実施例２と同様の方法で過酸化水素濃度に対する葉酸の蛍光強度の検量線を作成し、濃度未知の過酸化水素水に含まれる過酸化水素濃度を求めたところ、同試料に含まれる過酸化水素濃度を過マンガン酸カリウムを用いた酸化還元滴定により求めた値と一致した。過マンガン酸カリウムを用いた酸化還元滴定は、文献（化学実験第３版、東京大学教養学部化学教室化学教育研究会編、東京大学出版会、８１〜８３頁）の方法に従った。
【実施例３】
【００５４】
他の金属イオン存在下での過酸化水素の定量
本実施例３では、葉酸、他の金属イオンを用い、活性酸素として過酸化水素の定量を行った。
即ち、本実施例３において、１０μM葉酸、金属イオンとして２０μM鉄（II）イオン（塩化鉄（II）四水和物（和光純薬工業株式会社））、２０μMテトラクロロ金（III）酸四水和物（和光純薬工業株式会社）、２０μMヘキサクロロ白金（IV）酸六水和物（和光純薬工業株式会社）、２０μM硝酸銀のいずれかひとつを含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）と過酸化水素を１．５mLのマイクロチューブ中で加え、３７℃で１時間反応した。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
【００５５】
過酸化水素の濃度は、０．１μMから５μMで変化させた。
試料の蛍光強度は、図３（黒丸）に示す通りである。
図３によれば、鉄（II）イオンにより、過酸化水素が存在しない場合にも蛍光強度が増大した。
過酸化水素との反応による葉酸の蛍光強度の増大は、銅（II）イオンを用いた場合の方が鉄（II）イオンを用いた場合よりも感度が高い。
【００５６】
比較は、コントロール試料として、葉酸、金属イオンとして鉄（II）イオン、テトラクロロ金（III）酸四水和物、ヘキサクロロ白金（IV）酸六水和物、硝酸銀のいずれかひとつを含み、過酸化水素を含まない溶液および葉酸と過酸化水素を含み、金属イオンを含まない溶液を用いて、実施例３と同様にして定量を行った。
鉄（II）イオンの結果を図３（白丸）に示す。同様に、テトラクロロ金（III）酸四水和物、ヘキサクロロ白金（IV）酸六水和物にも弱いながら効果が認められたが、硝酸銀ではその効果はほとんど認められなかった（図には示していない）。
【実施例４】
【００５７】
葉酸の蛍光強度と過酸化水素濃度との関係
この実施例においては、葉酸の蛍光強度の増大の時間変化を測定した。
１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオンを含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）と過酸化水素を１．５mLのマイクロチューブ中で加え、３７℃で反応した。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
結果は、図４に示す通りである。
【００５８】
反応時間に比例した蛍光強度の増大が観測された。蛍光強度の増大速度は、過酸化水素濃度に依存した。図４の傾きから蛍光強度の増大速度を計算すると過酸化水素濃度に比例した。
【００５９】
比較におけるコントロール試料として、葉酸、銅（II）イオンを含み、過酸化水素を含まない溶液を用いて、実施例４と同様に行った。
その結果を図４（黒三角）に示す。
【００６０】
従って、コントロール試料と過酸化水素を含む試料の蛍光強度を比較し、その増大量（ΔＩ）を反応時間で割り蛍光強度の増大速度を求めることができ、さらに過酸化水素濃度を計算で求めることができることを示している。
過酸化水素濃度を［Ｈ2Ｏ2］、比例定数をｋと表すとΔＩ／反応時間＝ｋ×［Ｈ2Ｏ2］の式（式１）で表すことができる。
図４の傾きから蛍光強度の増大速度を求め、過酸化水素濃度に対してプロットし、得られた直線の傾きからｋが求められる。
本実施例の条件では、ｋは、１．５μM-1min-1である。ｋは、使用する分光光度計の機種によっても異なり、濃度既知の過酸化水素を用いた測定によりあらかじめ求めることにより、未知濃度の過酸化水素の定量に利用できる。
【実施例５】
【００６１】
セミカルバジドにより生成する過酸化水素の定量
発がん性物質セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応で過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷が引き起こされることが報告されている（非特許文献４）。
葉酸の蛍光強度の測定により、セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応で生成する過酸化水素の定量を行った。
【００６２】
１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオンとセミカルバジド（セミカルバジド塩酸塩（和光純薬工業株式会社））含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を１．５mLのマイクロチューブ中で混合し、３７℃で１時間反応させた。
セミカルバジドの濃度は、１μMから５０μMで変化させた。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
その結果を、図５（黒丸）に示す。
【００６３】
比較において、コントロール試料として、葉酸、セミカルバジドを含み、銅（II）イオンを含まない溶液を用いて、実施例５に準じて行った。
その結果を図５（白丸）に示す。
結果は、図５に示す通り、銅（II）イオン存在下、セミカルバジドの濃度の増大に従い、蛍光強度が増大した。一方、銅（II）イオンを含まない試料では変化はなかった。
【００６４】
カタラーゼをあらかじめ添加すると蛍光の増大は完全に抑制された。カタラーゼは、過酸化水素をすみやかに水と酸素に分解する酵素であるため、葉酸の蛍光強度の増大は、過酸化水素によることが示された（図には示していない）。
比較におけるコントロール試料の蛍光強度と比較した蛍光の増大量から過酸化水素の生成速度を計算した。セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応で過酸化水素が生成し、葉酸の酸化分解が起こり、蛍光強度の増大が起こるとき、ΔＩ＝∫0Tｋ（Ｔ−ｔ）ｒH2O2ｄｔの式（式２）で蛍光強度の増大を表すことができる。
【００６５】
この式で、ΔＩおよびｋは、式１に記載のものである。Ｔは、反応時間、ｔは任意の時間、ｒH2O2は、過酸化水素の生成速度を表している。セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応時間に比例して過酸化水素が生成すると仮定すると、式２からｒH2O2＝２ΔＩ／ｋＴ2の式（式３）を求めることができる。上記の測定条件では、Ｔは、６０分、ｋは、１．５μM-1min-1であり、図５に示す蛍光強度のデータからμM min-1単位の過酸化水素生成速度を計算することができる。
計算結果は、図５（白四角）に示す通りで、過酸化水素の生成速度がセミカルバジドの濃度の増大に従って大きくなることが示された。これにより、蛍光強度から試料中の過酸化水素生成速度およびセミカルバジド濃度が明らかとなる。
【実施例６】
【００６６】
酸化された糖により生成する過酸化水素の定量
酸化チタン光触媒により酸化された糖と銅（II）イオンとの反応で過酸化水素を生成し、ＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている（非特許文献１）。
本発明を利用し、糖の酸化物から生成した過酸化水素量を求めた。
本実施例６では、１．５mLのマイクロチューブ中に酸化チタン（Degussa P-25、日本アエロジル株式会社），０．８mg mL-1）と１０mMの糖（グルコース（和光純薬工業株式会社）、ガラクトース（和光純薬工業株式会社））を含む０．２mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を調製し、光照射（３６５nm，５Ｊcm-2）で、グルコースとガラクトースの酸化物を調製した。
【００６７】
遠心分離（１０，０００回転／分、５分）で酸化チタン粒子を沈降させた後、糖の酸化物を含む上澄み液を糖濃度が図６の横軸に示す濃度になるように１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）中で１０μM葉酸と２０μM銅（II）イオンを含む溶液を調製した。３７℃で１時間反応させ、実施例１と同様に蛍光測定した。
蛍光強度は、葉酸と反応させた糖の濃度の増大に従って増大した。蛍光強度の増大は、カタラーゼの添加で完全に抑制されたことから過酸化水素の生成が確認された（図には示していない）。
【００６８】
上記と同様に式３を用いて、過酸化水素の生成速度（単位μM min-1）を計算した。さらに、過酸化水素の生成速度に反応時間をかけるとその反応時間の内に生成した過酸化水素量を計算することができる。反応時間１時間（６０分）後の過酸化水素量を求めた例を図６に示す。
【実施例７】
【００６９】
ベンゼンジオールにより生成する過酸化水素の測定
銅（II）イオンの触媒作用によるベンゼンジオールの自動酸化反応により過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている（非特許文献５）。
１，４−ベンゼンジオールの方が１，２−ベンゼンジオールよりも自動酸化速度が著しく速いことが報告されている。
本発明を利用し、葉酸の蛍光強度の増大から計算したベンゼンジオールの自動酸化による過酸化水素生成速度を求めた。
１．５mLのマイクロチューブ中で１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオン、ベンゼンジオール（１，２−ベンゼンジオールには、カテコール（和光純薬工業株式会社）を使用し、１，４−ベンゼンジオールにはヒドロキノン（和光純薬工業株式会社）を使用した）を含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を調製し、３７℃で１時間反応させた。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
銅（II）イオンを添加しない場合には、蛍光強度の増大は観測されなかった（図には示していない）。
【００７０】
図７に示す通り、銅（II）イオン存在下、１，４−ベンゼンジオールを含む試料では、蛍光強度の増大が観測された。カタラーゼの添加で蛍光強度の増大が完全に抑制されたことから、過酸化水素による葉酸の酸化分解であることが確認された（図には示していない）。
１，２−ベンゼンジオールを含む試料では、蛍光強度の増大はほとんど観測されなかった。
この結果は、これまで報告されたＤＮＡ損傷の程度および自動酸化速度の違いとよく対応している。銅（II）イオンを添加していない場合には、蛍光の増強は観測されなかった。葉酸の蛍光強度の増大量から上記と同様に式３を用いて、過酸化水素の生成速度を計算した。計算結果を図７に示す。これにより、蛍光強度から試料中の過酸化水素生成速度および１，４−ベンゼンジオール濃度が明らかとなる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の活性酸素の検出方法によれば、高価な試薬を用いることなく、安価な試薬と蛍光光度計とを用いて、高い感度で試料中の活性酸素の定量を行う検出試薬の開発が可能となる。本発明の方法によれば、活性酸素生成物質の探索及び定量、生成した活性酸素の定量を容易に実施することができる。さらに、生体内で生成する活性酸素検出用プローブとしての利用も可能である。そして、活性酸素生成物質の測定値を活性酸素生成等を介した酸化ストレスや生体分子損傷作用の簡便な評価法として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】葉酸の酸化分解前後の蛍光スペクトルである。
【図２】実施例２における銅（II）イオン存在下、葉酸の酸化分解による蛍光強度の過酸化水素濃度依存性を示す。
【図３】実施例３における鉄（II）イオン存在下、葉酸の酸化分解による蛍光強度の過酸化水素濃度依存性を示す。
【図４】実施例４における銅（II）イオン存在下、過酸化水素による葉酸の蛍光強度の時間変化を示す。
【図５】実施例５におけるセミカルバジドとの反応による葉酸の蛍光強度及び蛍光強度から計算した過酸化水素生成速度とセミカルバジドの濃度との関係を示す。
【図６】実施例６における葉酸の蛍光強度の増大から計算した糖の酸化物から生成した過酸化水素生成量との関係を示す。
【図７】実施例７におけるベンゼンジオールとの反応による葉酸の蛍光強度及び蛍光強度から計算した過酸化水素生成速度とベンゼンジオールの濃度との関係を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のビタミンＢ又はその誘導体を活性酸素（例えば過酸化水素）との反応により蛍光性物質を生成させて活性酸素を定量する方法に係わる。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素は、発がん性物質の酸化還元反応、光触媒反応、光増感反応、細胞内の酸化系や還元系の還元又は励起によって生成し、細胞毒性の原因となる。また、活性酸素は蛋白質、低分子細胞成分、低分子化合物の自動酸化によっても生成することが知られている。また、活性酸素は蛋白質、低分子細胞成分、低分子化合物の自動酸化によっても生成することが知られている。
【０００３】
例えば、酸化チタンの光触媒作用で酸化された糖の酸化物と生体内金属イオンとの反応で活性酸素の一種である過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷が引き起こされることが非特許文献１に報告されている。
【０００４】
細胞毒性に関する場合、低い濃度の活性酸素でも大きな影響を示すことがある。この他、ＳＵＳ管、銅管内で活性酸素が生成すると腐食を生じ、種々の水処理上のトラブルを生じることとなる。一方、活性酸素は利用の仕方如何では殺菌剤、殺藻剤、除草剤として用いることもできる。従って、活性酸素を高い感度で容易に定量することは各種産業分野において極めて重要なことである。
【０００５】
従来、活性酸素の検出方法としては次のような方法が提案されている。
酸化還元色素であるＮＢＴ（Nitro Blue Tetrazolium）と活性酸素の反応により生じるホルマザンを銅電極と照合電極とを浸漬し、両電極間の電位差を測定して活性酸素を定量する方法が特許文献１に開示されている。しかし、１００ml程度の多量の試料が必要である。また、原理上、電極の使用が不可能な試料への適用が不可能である。
【０００６】
活性酸素によって酸化されると強い蛍光を有するフルオレセインやローダミンが生成することにより、蛍光強度の測定から活性酸素を検出する方法が、特許文献２に提案されている。しかし、これらの化合物は高価である。
【０００７】
一方、分解反応により蛍光強度が増強する化合物として、ビタミンＢの一種である葉酸が報告されている。葉酸は、プテリジン環をもち、プテリジン化合物は、強い蛍光をもつものが多いが、葉酸からの蛍光はほとんど観測されない。それは、葉酸の分子内のアミノベンゾイル残基により励起状態が失活するためである。葉酸は、紫外線の照射で分解し、強い蛍光を有するプテリン−６−カルボン酸が生成することが、非特許文献２に報告されている。
【０００８】
即ち、非特許文献２には、式（３′）：
【化９】
で示される、ビタミンＢの一種である葉酸に紫外線を作用させると、その葉酸が加水分解されて、化学式（１′）：
【化１０】
で示される、可視光の蛍光を発するプテリジン化合物が生成し、このプテリジン化合物（プテリン−６−カルボン酸）が光化学反応でＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている。
【０００９】
しかし、前記の葉酸が紫外線以外の手段によって分解されて、蛍光を有するプテリジン類を生成することについては、非特許文献２を含めこれまでまったく記載されていない。
【００１０】
また、葉酸の誘導体であるアメトプテリンが紫外線の照射で分解し、強い蛍光を有する２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシメチルプテリジンを生成することが、非特許文献３に報告されている。
【００１１】
このアメトプテリンもプテリジン環をもつが、アメトプテリンからの蛍光はほとんど観測されない。葉酸と同様にアメトプテリンの分子内のアミノベンゾイル残基により励起状態が失活するためであるが、その分解により２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシメチルプテリジンが生成すると強い蛍光を示すようになる。この非特許文献３には、アメトプテリンの紫外線による分解で生成した２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシメチルプテリジンが光化学反応でＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている。
【００１２】
即ち、非特許文献３には、化学式（４）：
【化１１】
で示されるビタミンＢの一種である葉酸の誘導体であるメトトレキサート（アメトプテリンの別名、Methotrexateともいう。）に紫外線を作用させると、化学式２：
【化１２】
で示される、可視光の蛍光を有するプテリジン化合物が生成し、このプテリジン化合物が光化学反応でＤＮＡ損傷を引き起こすことが開示されている。
【００１３】
しかし、葉酸の誘導体であるこのアメトプテリンが紫外線の照射以外で分解され、強い蛍光を有する２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシメチルプテリジンを生成することはこれまで知られていない。
【００１４】
一方、金属イオンの存在下で、過酸化水素が生成することは、発がん性物質セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応で過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷が引き起こされること（非特許文献４）、酸化チタン光触媒により酸化された糖と銅（II）イオンとの反応で過酸化水素を生成し、ＤＮＡ損傷が引き起されること（非特許文献１）、銅（II）イオンの触媒作用によるベンゼンジオールの自動酸化反応により過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている（非特許文献５）。しかし、このような過酸化水素で葉酸やアメトプテリンが分解され強い蛍光を有するプテリジン化合物が生成することや、さらにこの蛍光物質を分解に関与した過酸化水素の定量に利用できることは知られていなかった。
【００１５】
【特許文献１】特開平０７−３０１６１８号
【特許文献２】特開２０００−３２１２６２号
【非特許文献１】光化学討論会 講演要旨集 ２００３年１１月２２日（土）〜２４日（月） ３Ｄ０６
【非特許文献２】K. Hirakawa et al. Archives of Biochemistry and Biophysics 410巻, 261-268頁, 2003年.
【非特許文献３】K. Hirakawa et al. Photochemistry and Photobiology, 76巻, 467-472頁, 2002年.
【非特許文献４】K. Hirakawa, et al. Mutation Research 536巻, 91-101頁, 2003年．
【非特許文献５】K. Hirakawa et al. Chemical Research in Toxicology 15巻, 76-82頁, 2002年.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、例えば、生体内で生成する過酸化水素などの活性酸素は、ＤＮＡ損傷に関与するなど、その検出・定量は重要であることから、新しい活性酸素の定量法を提供することを目的としている。
【００１７】
上記従来法のうち、蛍光プローブの利用では、高価な試薬が必要であり、また、多量の試料が必要である。また、原理上、電極の使用が不可能な試料への適用が不可能である。
【００１８】
従って、本発明は、上記の従来の定量法における問題点を解決し、活性酸素を高価な試薬を用いることなく、容易に定量する方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（１）一般式１：
【化１３】
〔但し、式中、Ｒ1は−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ、−ＮＨＲ又は‐ＮＨ2、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕で示されるビタミンＢ又はその誘導体と金属イオンおよび活性酸素生成物質を含有する試料の存在下で、活性酸素により、当該ビタミンＢ又はその誘導体を酸化分解して、
【００２０】
【化１４】
（但し、式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ意味を示し、Ｒ5は−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ又は−ＣＨ2ＯＨを示す。）で示される可視光の蛍光を有するプテリジン類を生成させ、当該プテリジン類の蛍光強度を測定することによって活性酸素を定量することを特徴とする活性酸素の定量法に関する。
【００２１】
（２）本発明は、ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式３：
【化１５】
〔但し、式中、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であって、プテリジン類に係わる一般式２におけるＲ1が−ＯＨで示されるものである、（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２２】
（３）本発明は、ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式４：
【化１６】
〔但し、式中、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であって、プテリジン類に係わる一般式２におけるＲ1が−ＮＨ2で示されるものである（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２３】
（４）本発明は、金属イオンが二価または三価の金属イオンである（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２４】
（５）本発明は、金属イオンが二価の銅イオンである（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２５】
（６）本発明は、活性酸素が過酸化水素である（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２６】
（７）ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式５：
【化１７】
〔但し、式中、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であると共に、
【００２７】
プテリジン類が、化学式１：
【化１８】
で示される化合物である（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００２８】
（８）ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式６：
【化１９】
〔但し、式中、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であると共に、
【００２９】
プテリジン類が、化学式２：
【化２０】
である（１）に記載の活性酸素の定量法に関する。
【００３０】
（９）本発明は、（１）〜（８）のいずれか一つに記載の活性酸素定量法から、活性酸素生成物質の量を測定する、活性酸素生成物質定量法に関する。
【発明の効果】
【００３１】
活性酸素を高価な試薬を用いることなく、金属イオン、特に銅（II）イオン存在下で、ビタミンＢまたはその誘導体を用いて活性酸素の定量が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、
【化２１】
〔但し、式中、Ｒ1は−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ、−ＮＨＲ又は‐ＮＨ2、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕で示されるビタミンＢ又はその誘導体を用いて、金属イオンの存在下に、活性酸素生成物質を含有する試料と反応させることによって、一般式１で示されるビタミンＢ又はその誘導体を分解して、
【００３３】
【化２２】
（但し、上記一般式２において、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ意味を示し、Ｒ5は−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ又は−ＣＨ2ＯＨを示す。）で示される可視光の蛍光を示すプテリジン類を生成させ、その蛍光の強度を測定することによって活性酸素を定量することを特徴とする活性酸素の定量法に関する。
【００３４】
即ち、本発明は、例えば、次の反応式１に示すように、ビタミンＢの一種である葉酸（化学式３′）を、二価の銅イオンの存在下に、過酸化水素を含有する水溶液（試料）に添加して、前記の葉酸を酸化分解して、強い可視光蛍光を示すプテリジン（化学式１′）を生成させるものである。この反応において、過酸化水素は、ヒドロキシルラジカルおよび銅酸素錯体（Ｃｕ（Ｉ）ＯＯＨ）を生成して、一般式１で示されるビタミンＢ又はその誘導体を酸化分解して蛍光物質を生成していると考えられる（非特許文献４および５）。
【００３５】
【化２３】
【００３６】
尚、本発明において、ビタミンＢの一種である葉酸は、次の反応式２に示すような、平衡反応により、異性体（一般式３と一般式３′で示される異性体）であっても、その混合物であってもよく、また化学式１で示されるプテリジン類も同様に異性体もしくはその混合物（化学式１と化学式１′で示される異性体）であってもよいので、本発明における一般式１で示されるビタミンＢとその誘導体及び一般式２で示されるプテリジン類もまた、Ｒ1が−ＯＨである場合には、同様な異性体、またはその混合物であってもよい。このことは、一般式５で示されるビタミンＢとその誘導体においてもいえることである。
【００３７】
【化２４】
【００３８】
本発明において用いる、上記一般式１で示されるビタミンＢ又はその誘導体とは、例えば、一般式３、一般式４で示されるものを好適に挙げることができ、特に、好ましくは、一般式５、一般式６で示されるものを挙げることができ、さらに好ましいのは、一般式５におけるＲ3が−Ｈであり、一般式６におけるＲ3が−Ｈ又は炭素数１〜３のアルキル基であるものを挙げることができ、そして、最も好ましいのは、葉酸、アメトプテリン、４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］安息香酸、アミノプテリン、Ｎ10−（トリフルオロアセチル）プテロイック酸、プテロイック酸、プテロイルアスパルチック酸などである。各一般式における置換基は一般式１と同様である。
【００３９】
本発明において用いる、上記一般式中のＲは、炭素数が１〜８、特に１〜６の炭化水素基で、例えば、アルキル基、アリル基、アルキルカルボキシル基、カルボニル基、カルバモイル基などが挙げられ、Ｘのハロゲンは，フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）ヨウ素（Ｉ）などが挙げられる。
【００４０】
本発明において用いる、金属イオンには、二価の銅イオン、二価の鉄イオン、三価のロジウムイオン、二価のパラジウムイオン、二価のニッケルイオン、二価のマンガンイオン、二価の銀イオンなどを挙げることができ、またテトラクロロ金（III）酸四水和物、ヘキサクロロ白金（IV）酸六水和物、塩化金（III）などの金化合物も含めるが、二価の銅イオン、二価の鉄イオンが好ましく、二価の銅イオンが最も好ましい。
【００４１】
本発明における活性酸素生成物質とは、上記金属イオンの存在下に活性酸素を生成させる物質であればどのような物質でも良いが、例えば、酸化されたグルコース、酸化されたガラクトース、セミカルバジド、ベンゼンジオール、ヒドラジン、ヒドララジン、メチルヒドラジン，メチルヒドロキノン、オルト−アミノフェノール、ケルセチン、イソチオシアン酸アリル、イソチオシアン酸ベンジル、イソチオシアン酸フェネチル、２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４，５−ｂ］ピリミジン、ヒドラゾベンゼン、Ｎ−ヒドロキシ−４−アミノアゾベンゼン、Ｎ−アセチルシステイン、レチノール、レチナール、没食子酸などが挙げられる。ここで、活性酸素とは、反応性の強い酸素の分子種で、過酸化水素、ヒドロキルラジカル、スーパーオキシドアニオン、一重項酸素、一酸化窒素、オゾンなどが挙げられるが、上記一般式１のビタンミンＢ又はその誘導体を酸化分解して上記一般式２の蛍光物質であるプテリジン類を生成することができれば、いずれの活性酸素の形態であってもよい。好ましい活性酸素は、過酸化水素、ヒドロキルラジカルなどである。
【００４２】
本発明において用いる、可視光の蛍光とは、人間の目に見える４００nm〜７００nmの波長の蛍光のことを意味する。
【００４３】
本発明においては、蛍光の強度の測定において、励起波長および蛍光の検出波長は、それぞれ葉酸が吸収する波長および蛍光スペクトルの範囲の波長を利用できる。本実施例では、３６０nmの励起光で試料を励起し、３８０〜６００nmの範囲で蛍光スペクトルを測定した。蛍光の極大波長である４５０nmにおける蛍光強度で評価した。この蛍光強度の測定は、通常の蛍光光度測定装置を用いて測定でき、例えば、前述のビタミンＢ又はその誘導体、金属イオン、活性酸素生成物質を含有する試料を水溶液中で混合して、試料溶液を石英製の蛍光用セルに入れ、島津ＲＦ−１５００、ＲＦ−５３００などの蛍光光度計を使用して測定できるが、これに限定されるものではない。
【００４４】
本発明において、ビタミンＢ又はその誘導体を酸化分解反応における反応温度は０℃〜５０℃程度、特に５℃〜４０℃程度であればよく、即ち、常温（２３℃）付近であればよく、圧力が常圧（１気圧）であればよい。前記酸化分解反応において、溶媒は、水溶液または水を主として（水５０重量％以上）含む溶液であることが好ましく、その溶液には、必要であれば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液が含有されていてもよい。更に、前記の酸化分解反応において、測定時間は、１分〜１００分程度、特に、５分〜６０分程度であればよい。
【００４５】
本発明において、活性酸素生成物質の定量とは、本発明の方法により定量された過酸化水素の量から金属イオンの存在下で活性酸素を生成させた物質の量を表すことが出来るということを意味する。例えば、試料中に発がん性物質セミカルバジドが含まれており、ある量の過酸化水素が発生していれば、その過酸化水素量を測定することで実施例４及び５の計算式（３）または図５の検量線より発がん性物質セミカルバジドの量を知ることが出来るという意味である。さらに、試料中の活性酸素生成物質が未知の場合であっても、その過酸化水素量を測定することでその過酸化水素量を発生させるのに必要な活性酸素生成物質の量を、例えば実施例４及び５の計算式（３）もしくは図５または図７の検量線より得られた発がん性物質セミカルバジドまたは１，４−ベンゼンジオールの量として未知の活性酸素生成物質の量を表すこともできるという意味である。必要であれば、未知の活性酸素生成物質の量を他の先に記載した活性酸素生成物質のいずれかとして表すことも出来る。
【実施例１】
【００４６】
葉酸の酸化分解前後での蛍光スペクトル
１０μM葉酸（和光純薬工業株式会社）、２０μM銅（II）イオン（塩化銅（II）二水和物（和光純薬工業株式会社））を含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を分解前の試料とした。１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオン、５０μM過酸化水素を含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を１．５mLのマイクロチューブ中、３７℃で１時間反応させたものを分解後の試料とした。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−５３００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
【００４７】
化学式１で示されるプテリジンは、図１の分解後で示すような可視光蛍光の強度を有している。
本発明におけるビタミンＢ又は誘導体は、プテリジン環をもつが、プテリジン由来の蛍光はほとんど観測されなかった（図１分解前）。酸化分解によって、プテリジン環の部分がアミノベンゾイル残基から離れることにより、強い蛍光が観測された。
【００４８】
葉酸の蛍光は、図１に示すように非常に弱いが、過酸化水素と銅（II）イオンとの反応により酸化分解するとプテリジン化合物由来の非常に強い蛍光が観測される。また、アメトプテリン（メトトレキサート（アルドリッチ））においても葉酸と同様に過酸化水素による酸化分解で強い蛍光が観察された（図には示していない）。
【実施例２】
【００４９】
銅（II）イオン存在下での過酸化水素の定量
ビタミンＢの一種である葉酸を使用し、金属イオンとして銅（II）イオンを用い、活性酸素である過酸化水素の定量を行った。
【００５０】
本実施例１において、１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオンを含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）と過酸化水素を１．５mLのマイクロチューブ中で加え、３７℃で１時間反応させた。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
過酸化水素の濃度は、０．１μMから１００μMで変化させた。
【００５１】
この実施例２において、銅（II）イオンと過酸化水素の添加により試料の蛍光強度は増大した。
蛍光スペクトルは、プテリン−６−カルボン酸の蛍光スペクトルと一致し、蛍光物質としてプテリジン化合物の生成を示している。銅（II）イオン存在下、過酸化水素濃度の増大に従って蛍光強度が増大した。
試料の蛍光強度は、図２（黒丸）に示す通りである。
【００５２】
比較におけるコントロール試料として、葉酸、銅（II）イオンを含み、過酸化水素を含まない溶液および葉酸と過酸化水素を含み、銅（II）イオンを含まない溶液を用いて、実施例２と同様に行った。
銅（II）イオンを添加していない場合には、蛍光の増強は観測されなかった。
試料の蛍光強度は、図２（白丸）に示す通りである。
【００５３】
なお、実施例２と同様の方法で過酸化水素濃度に対する葉酸の蛍光強度の検量線を作成し、濃度未知の過酸化水素水に含まれる過酸化水素濃度を求めたところ、同試料に含まれる過酸化水素濃度を過マンガン酸カリウムを用いた酸化還元滴定により求めた値と一致した。過マンガン酸カリウムを用いた酸化還元滴定は、文献（化学実験第３版、東京大学教養学部化学教室化学教育研究会編、東京大学出版会、８１〜８３頁）の方法に従った。
【実施例３】
【００５４】
他の金属イオン存在下での過酸化水素の定量
本実施例３では、葉酸、他の金属イオンを用い、活性酸素として過酸化水素の定量を行った。
即ち、本実施例３において、１０μM葉酸、金属イオンとして２０μM鉄（II）イオン（塩化鉄（II）四水和物（和光純薬工業株式会社））、２０μMテトラクロロ金（III）酸四水和物（和光純薬工業株式会社）、２０μMヘキサクロロ白金（IV）酸六水和物（和光純薬工業株式会社）、２０μM硝酸銀のいずれかひとつを含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）と過酸化水素を１．５mLのマイクロチューブ中で加え、３７℃で１時間反応した。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
【００５５】
過酸化水素の濃度は、０．１μMから５μMで変化させた。
試料の蛍光強度は、図３（黒丸）に示す通りである。
図３によれば、鉄（II）イオンにより、過酸化水素が存在しない場合にも蛍光強度が増大した。
過酸化水素との反応による葉酸の蛍光強度の増大は、銅（II）イオンを用いた場合の方が鉄（II）イオンを用いた場合よりも感度が高い。
【００５６】
比較は、コントロール試料として、葉酸、金属イオンとして鉄（II）イオン、テトラクロロ金（III）酸四水和物、ヘキサクロロ白金（IV）酸六水和物、硝酸銀のいずれかひとつを含み、過酸化水素を含まない溶液および葉酸と過酸化水素を含み、金属イオンを含まない溶液を用いて、実施例３と同様にして定量を行った。
鉄（II）イオンの結果を図３（白丸）に示す。同様に、テトラクロロ金（III）酸四水和物、ヘキサクロロ白金（IV）酸六水和物にも弱いながら効果が認められたが、硝酸銀ではその効果はほとんど認められなかった（図には示していない）。
【実施例４】
【００５７】
葉酸の蛍光強度と過酸化水素濃度との関係
この実施例においては、葉酸の蛍光強度の増大の時間変化を測定した。
１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオンを含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）と過酸化水素を１．５mLのマイクロチューブ中で加え、３７℃で反応した。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
結果は、図４に示す通りである。
【００５８】
反応時間に比例した蛍光強度の増大が観測された。蛍光強度の増大速度は、過酸化水素濃度に依存した。図４の傾きから蛍光強度の増大速度を計算すると過酸化水素濃度に比例した。
【００５９】
比較におけるコントロール試料として、葉酸、銅（II）イオンを含み、過酸化水素を含まない溶液を用いて、実施例４と同様に行った。
その結果を図４（黒三角）に示す。
【００６０】
従って、コントロール試料と過酸化水素を含む試料の蛍光強度を比較し、その増大量（ΔＩ）を反応時間で割り蛍光強度の増大速度を求めることができ、さらに過酸化水素濃度を計算で求めることができることを示している。
過酸化水素濃度を［Ｈ2Ｏ2］、比例定数をｋと表すとΔＩ／反応時間＝ｋ×［Ｈ2Ｏ2］の式（式１）で表すことができる。
図４の傾きから蛍光強度の増大速度を求め、過酸化水素濃度に対してプロットし、得られた直線の傾きからｋが求められる。
本実施例の条件では、ｋは、１．５μM-1min-1である。ｋは、使用する分光光度計の機種によっても異なり、濃度既知の過酸化水素を用いた測定によりあらかじめ求めることにより、未知濃度の過酸化水素の定量に利用できる。
【実施例５】
【００６１】
セミカルバジドにより生成する過酸化水素の定量
発がん性物質セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応で過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷が引き起こされることが報告されている（非特許文献４）。
葉酸の蛍光強度の測定により、セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応で生成する過酸化水素の定量を行った。
【００６２】
１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオンとセミカルバジド（セミカルバジド塩酸塩（和光純薬工業株式会社））含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を１．５mLのマイクロチューブ中で混合し、３７℃で１時間反応させた。
セミカルバジドの濃度は、１μMから５０μMで変化させた。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
その結果を、図５（黒丸）に示す。
【００６３】
比較において、コントロール試料として、葉酸、セミカルバジドを含み、銅（II）イオンを含まない溶液を用いて、実施例５に準じて行った。
その結果を図５（白丸）に示す。
結果は、図５に示す通り、銅（II）イオン存在下、セミカルバジドの濃度の増大に従い、蛍光強度が増大した。一方、銅（II）イオンを含まない試料では変化はなかった。
【００６４】
カタラーゼをあらかじめ添加すると蛍光の増大は完全に抑制された。カタラーゼは、過酸化水素をすみやかに水と酸素に分解する酵素であるため、葉酸の蛍光強度の増大は、過酸化水素によることが示された（図には示していない）。
比較におけるコントロール試料の蛍光強度と比較した蛍光の増大量から過酸化水素の生成速度を計算した。セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応で過酸化水素が生成し、葉酸の酸化分解が起こり、蛍光強度の増大が起こるとき、ΔＩ＝∫0Tｋ（Ｔ−ｔ）ｒH2O2ｄｔの式（式２）で蛍光強度の増大を表すことができる。
【００６５】
この式で、ΔＩおよびｋは、式１に記載のものである。Ｔは、反応時間、ｔは任意の時間、ｒH2O2は、過酸化水素の生成速度を表している。セミカルバジドと銅（II）イオンとの反応時間に比例して過酸化水素が生成すると仮定すると、式２からｒH2O2＝２ΔＩ／ｋＴ2の式（式３）を求めることができる。上記の測定条件では、Ｔは、６０分、ｋは、１．５μM-1min-1であり、図５に示す蛍光強度のデータからμM min-1単位の過酸化水素生成速度を計算することができる。
計算結果は、図５（白四角）に示す通りで、過酸化水素の生成速度がセミカルバジドの濃度の増大に従って大きくなることが示された。これにより、蛍光強度から試料中の過酸化水素生成速度およびセミカルバジド濃度が明らかとなる。
【実施例６】
【００６６】
酸化された糖により生成する過酸化水素の定量
酸化チタン光触媒により酸化された糖と銅（II）イオンとの反応で過酸化水素を生成し、ＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている（非特許文献１）。
本発明を利用し、糖の酸化物から生成した過酸化水素量を求めた。
本実施例６では、１．５mLのマイクロチューブ中に酸化チタン（Degussa P-25、日本アエロジル株式会社），０．８mg mL-1）と１０mMの糖（グルコース（和光純薬工業株式会社）、ガラクトース（和光純薬工業株式会社））を含む０．２mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を調製し、光照射（３６５nm，５Ｊcm-2）で、グルコースとガラクトースの酸化物を調製した。
【００６７】
遠心分離（１０，０００回転／分、５分）で酸化チタン粒子を沈降させた後、糖の酸化物を含む上澄み液を糖濃度が図６の横軸に示す濃度になるように１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）中で１０μM葉酸と２０μM銅（II）イオンを含む溶液を調製した。３７℃で１時間反応させ、実施例１と同様に蛍光測定した。
蛍光強度は、葉酸と反応させた糖の濃度の増大に従って増大した。蛍光強度の増大は、カタラーゼの添加で完全に抑制されたことから過酸化水素の生成が確認された（図には示していない）。
【００６８】
上記と同様に式３を用いて、過酸化水素の生成速度（単位μM min-1）を計算した。さらに、過酸化水素の生成速度に反応時間をかけるとその反応時間の内に生成した過酸化水素量を計算することができる。反応時間１時間（６０分）後の過酸化水素量を求めた例を図６に示す。
【実施例７】
【００６９】
ベンゼンジオールにより生成する過酸化水素の測定
銅（II）イオンの触媒作用によるベンゼンジオールの自動酸化反応により過酸化水素が生成し、ＤＮＡ損傷を引き起こすことが報告されている（非特許文献５）。
１，４−ベンゼンジオールの方が１，２−ベンゼンジオールよりも自動酸化速度が著しく速いことが報告されている。
本発明を利用し、葉酸の蛍光強度の増大から計算したベンゼンジオールの自動酸化による過酸化水素生成速度を求めた。
１．５mLのマイクロチューブ中で１０μM葉酸、２０μM銅（II）イオン、ベンゼンジオール（１，２−ベンゼンジオールには、カテコール（和光純薬工業株式会社）を使用し、１，４−ベンゼンジオールにはヒドロキノン（和光純薬工業株式会社）を使用した）を含む１．０mLの１０mMリン酸緩衝液（pH７．６）を調製し、３７℃で１時間反応させた。これらの試料の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所ＲＦ−１５００）を使用し、励起波長３６０nmで測定した。
銅（II）イオンを添加しない場合には、蛍光強度の増大は観測されなかった（図には示していない）。
【００７０】
図７に示す通り、銅（II）イオン存在下、１，４−ベンゼンジオールを含む試料では、蛍光強度の増大が観測された。カタラーゼの添加で蛍光強度の増大が完全に抑制されたことから、過酸化水素による葉酸の酸化分解であることが確認された（図には示していない）。
１，２−ベンゼンジオールを含む試料では、蛍光強度の増大はほとんど観測されなかった。
この結果は、これまで報告されたＤＮＡ損傷の程度および自動酸化速度の違いとよく対応している。銅（II）イオンを添加していない場合には、蛍光の増強は観測されなかった。葉酸の蛍光強度の増大量から上記と同様に式３を用いて、過酸化水素の生成速度を計算した。計算結果を図７に示す。これにより、蛍光強度から試料中の過酸化水素生成速度および１，４−ベンゼンジオール濃度が明らかとなる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の活性酸素の検出方法によれば、高価な試薬を用いることなく、安価な試薬と蛍光光度計とを用いて、高い感度で試料中の活性酸素の定量を行う検出試薬の開発が可能となる。本発明の方法によれば、活性酸素生成物質の探索及び定量、生成した活性酸素の定量を容易に実施することができる。さらに、生体内で生成する活性酸素検出用プローブとしての利用も可能である。そして、活性酸素生成物質の測定値を活性酸素生成等を介した酸化ストレスや生体分子損傷作用の簡便な評価法として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】葉酸の酸化分解前後の蛍光スペクトルである。
【図２】実施例２における銅（II）イオン存在下、葉酸の酸化分解による蛍光強度の過酸化水素濃度依存性を示す。
【図３】実施例３における鉄（II）イオン存在下、葉酸の酸化分解による蛍光強度の過酸化水素濃度依存性を示す。
【図４】実施例４における銅（II）イオン存在下、過酸化水素による葉酸の蛍光強度の時間変化を示す。
【図５】実施例５におけるセミカルバジドとの反応による葉酸の蛍光強度及び蛍光強度から計算した過酸化水素生成速度とセミカルバジドの濃度との関係を示す。
【図６】実施例６における葉酸の蛍光強度の増大から計算した糖の酸化物から生成した過酸化水素生成量との関係を示す。
【図７】実施例７におけるベンゼンジオールとの反応による葉酸の蛍光強度及び蛍光強度から計算した過酸化水素生成速度とベンゼンジオールの濃度との関係を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１：
【化１】
〔但し、式中、Ｒ1は−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ、−ＮＨＲ又は−ＮＨ2、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示し、Ｘはハロゲンを示す。〕で示されるビタミンＢ又はその誘導体と金属イオンおよび活性酸素生成物質を含有する試料の存在下で、活性酸素により、当該ビタミンＢ又はその誘導体を酸化分解して、
一般式２：
【化２】
（但し、式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ意味を示し、Ｒ5は−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ又は−ＣＨ2ＯＨを示す。）で示される可視光の蛍光を有するプテリジン類を生成させ、当該プテリジン類の蛍光強度を測定することによって活性酸素を定量することを特徴とする活性酸素の定量法。
【請求項２】
ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式３：
【化３】
〔但し、式中、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）、及び前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示し、Ｘはハロゲンを示す。〕であって、プテリジン類に係わる一般式２におけるＲ1が−ＯＨで示されるものである、請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項３】
ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式４：
【化４】
〔但し、式中、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）及び前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示し、Ｘはハロゲンを示す。〕であって、プテリジン類に係わる一般式２におけるＲ1が−ＮＨ2で示されるものである請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項４】
金属イオンが二価または三価の金属イオンである請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項５】
金属イオンが二価の銅イオンである請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項６】
活性酸素が過酸化水素である請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項７】
ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式５：
【化５】
〔但し、式中、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であると共に、プテリジン類が、化学式１：
【化６】
で示される化合物である請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項８】
ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式６：
【化７】
〔但し、式中、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であると共に、プテリジン類が、化学式２：
【化８】
である、請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載の活性酸素定量法から、活性酸素生成物質の量を測定する、活性酸素生成物質定量法。
【請求項１】
一般式１：
【化１】
〔但し、式中、Ｒ1は−ＯＨ、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ、−ＮＨＲ又は−ＮＨ2、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示し、Ｘはハロゲンを示す。〕で示されるビタミンＢ又はその誘導体と金属イオンおよび活性酸素生成物質を含有する試料の存在下で、活性酸素により、当該ビタミンＢ又はその誘導体を酸化分解して、
一般式２：
【化２】
（但し、式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ意味を示し、Ｒ5は−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ又は−ＣＨ2ＯＨを示す。）で示される可視光の蛍光を有するプテリジン類を生成させ、当該プテリジン類の蛍光強度を測定することによって活性酸素を定量することを特徴とする活性酸素の定量法。
【請求項２】
ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式３：
【化３】
〔但し、式中、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）、及び前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示し、Ｘはハロゲンを示す。〕であって、プテリジン類に係わる一般式２におけるＲ1が−ＯＨで示されるものである、請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項３】
ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式４：
【化４】
〔但し、式中、Ｒ2は−ＮＨ2、−ＯＲ、−Ｒ、−Ｈ又は−ＮＨＲ、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）及び前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示し、Ｘはハロゲンを示す。〕であって、プテリジン類に係わる一般式２におけるＲ1が−ＮＨ2で示されるものである請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項４】
金属イオンが二価または三価の金属イオンである請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項５】
金属イオンが二価の銅イオンである請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項６】
活性酸素が過酸化水素である請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項７】
ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式５：
【化５】
〔但し、式中、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であると共に、プテリジン類が、化学式１：
【化６】
で示される化合物である請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項８】
ビタミンＢ又はその誘導体が、一般式６：
【化７】
〔但し、式中、Ｒ3は−Ｈ、−ＣＯＲ、−ＣＯＣＸ3又は−Ｒ、Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＯＯＨ）、−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）又は−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）を示す。前記のＲは炭素数１〜８の炭化水素基を示す。Ｘはハロゲンを示す。〕であると共に、プテリジン類が、化学式２：
【化８】
である、請求項１に記載の活性酸素の定量法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載の活性酸素定量法から、活性酸素生成物質の量を測定する、活性酸素生成物質定量法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−１１９０８５（Ｐ２００６−１１９０８５Ａ）
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３０９５７３（Ｐ２００４−３０９５７３）
【出願日】平成１６年１０月２５日（２００４．１０．２５）
【出願人】（３０４０２３３１８）国立大学法人静岡大学 (416)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２５日（２００４．１０．２５）
【出願人】（３０４０２３３１８）国立大学法人静岡大学 (416)
【Ｆターム（参考）】
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