活性酸素消去剤
【解決手段】学名：Acacia mearnsii De Wild.、学名：Acacia mangium Willd.、学名：Acacia dealbata Link.、学名：Acacia decurrens Willd.、及び学名：Acacia pycnantha Benth.のアカシア属植物の樹皮及び該樹皮の溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする活性酸素消去剤。
【効果】 上記のアカシア属植物の樹皮及び該樹皮の溶媒抽出物は高い活性酸素消去作用を有し、天然植物由来で安全性が高いので、食品、医薬品、化粧品等に配合して用いられる。
【効果】 上記のアカシア属植物の樹皮及び該樹皮の溶媒抽出物は高い活性酸素消去作用を有し、天然植物由来で安全性が高いので、食品、医薬品、化粧品等に配合して用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は活性酸素消去剤を特定の植物樹皮から得るもので、より詳しくは特定植物の樹皮の微粉末あるいは水／低級アルコールを溶剤として抽出して得られる抽出物を有効成分とする食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは抗酸化剤等に配合して用いられる活性酸素消去剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に大気中において、酸素は三重項酸素と呼ばれる安定な物質である。その酸素の一部が、生体内でスーパーオキシドやヒドロキシラジカル、一重項酸素、過酸化水素等の活性酸素と呼ばれる反応性の高い物質に変化すると、その一部が好中球やマクロファージで生産され異物に対する生体防御の役割を担う一方で、活性酸素が過剰に生体内に存在すると、脂質、タンパク質、酵素、核酸等を攻撃し、生体膜や組織などを損傷し、動脈硬化、脳心血管障害、肺気腫、癌、リウマチ性関節炎、白内障、高血圧、老人性痴呆、アルツハイマー病あるいはシミ・ソバカスや老化等の発症の原因にもなることが明らかにされている。
【０００３】
従って、従来からこれらの過剰な活性酸素による酸化ストレスが引き起こす上述のような各種疾病を予防するために、出発物質であるスーパーオキシド（０2−）を不均化して過酸化水素と酸素分子を生じる反応を触媒する酵素であるスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）と類似する働きをするＳＯＤ様物質や、活性酸素を捕捉する物質（活性酸素消去活性物質）を食品へ添加する抗酸化物質の探索が広く行われてきた。
【０００４】
例えば、この様な物質としては、天然物由来の物質では脂溶性のα-トコフェロール（ビタミンＥ）や水溶性のアスコルビン酸（ビタミンＣ）が挙げられ、合成物質ではＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）、ＴＢＨＱ(第三級ブチルヒドロキノン)等のフェノール性物質がある。
しかしながら、これらの物質は食品の抗酸化物質として一般的には使用されているものの、生体への活性酸素消去作用が十分ではなく、特に合成物質のＢＨＡでは発癌性の疑いが生じる等の問題もでてきている。
【０００５】
そこで、近年、動植物等の天然物から安全性の高い活性酸素消去活性物質を探索する研究開発が盛んに行われており、例えば、特許文献１、２、３、４、５等がある。また、実際に製品化まで進んだものとしては、特に、茶葉、カカオ豆エキスから抽出されるカテキン類、ブルーベリー果皮に含有されるアントシアニン系化合物、発酵大豆中から得られるイソフラボン類等、ポリフェノール系化合物が非常に高い活性酸素消去活性があることで注目を集めている。
【０００６】
これらの活性酸素消去活性が高いことが明らかになってきたポリフェノール系化合物の中でも特に茶葉に含まれる（−）エピガロカテキン、（−）エピガロカテキン−３−ガレート、（−）エピカテキン、（−）エピカテキン−３−ガレート、（＋）カテキンなど、フラバン−３−オールを基本骨格とするフラバノールであるカテキン類が、他のポリフェノール類よりも高い活性酸素消去活性があることがわかってきた。
【０００７】
一方で、アカシア属の一種である学名：Acacia mearnsii De Wild. の樹皮から水で抽出されるタンニンは古くから南アフリカやブラジルで生産されており、一般的にはワトルタンニンと呼ばれ、主に皮なめし剤や木材用接着剤として非常に安価で利用されている。また、Acacia mangium Willd.（アカシアマンギュウム）は生長が非常に早いことからも
、近年、インドネシア、マレーシアを始めとする亜熱帯〜熱帯で植林が盛んになってきている。このワルトタンニンは、縮合型タンニンに分類されるものである。
【０００８】
しかしながら、上記の学名：Acacia mearnsii De Wild.樹皮から熱水等で抽出して得られるタンニンはもとより、Acacia mangium Willd.の様なアカシア属の樹皮を粉砕して得られる樹皮微粉末について、活性酸素を消去する作用は全く知られていなかった。更に、これらを食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは抗酸化剤等へ添加、配合する等して、上述した疾患の予防や治療、老化の防止や改善のために用いる試みはされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平０１−２５７２６号公報
【特許文献２】特開平６−６５０７４号公報
【特許文献３】特開平７−３００４２２号公報
【特許文献４】特開平１１−５９７５号公報
【特許文献５】特開２００１−９８２６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記観点に着眼し、人体及び動物に対して安全性が高く、生体内で発生する過剰の活性酸素を十分に消去する作用を有する活性酸素消去剤及びこれを含有する食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは抗酸化剤等を安価に提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記観点に着眼し、活性酸素消去活性（ＳＯＳＡ；Super Oxide Scavenging Activities）を指標に鋭意研究を重ねていたところ、ある種のアカシア属の樹皮に高い活性酸素消去活性があることを見出して本発明を完成した。
アカシア属樹皮の高い活性酸素消去活性は、該樹皮中に含まれる或る一成分によるものか、種々の成分に基づく複合効果によるものか特定できないが、アカシア属樹皮によって得ることができる。
上記活性酸素消去活性は、アカシア属の樹木のうち特に、学名：Acacia mearnsii De Wild.（一般名ブラックワトル）、学名：Acacia mangium Willd.（一般名アカシアマンギュウム）、学名：Acacia dealbata Link.、学名：Acacia decurrens Willd.、及び学名：Acacia pycnantha Benth.からなる群より選ばれるものの樹皮が好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、アカシアの樹皮が活性酸素消去作用を示すことを見出して完成されたもので、樹皮を微粉砕し分級することでより活性の強い画分を得ることができ、天然植物由来のものであるため安全で安価に大量に供給できるため、健康食品や飼料等に使用できる。また、アカシアの樹皮を熱水やエタノール等の溶媒で抽出することにより高活性の成分を容易に得ることができるため、健康食品や、飼料、工業製品のみならず、医薬、化粧品等種々の分野で利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
アカシア属樹皮による活性酸素消去作用は、樹皮自体を用いても得ることができ、また、樹皮から溶媒によって抽出された抽出物によっても得ることができる。
アカシア属樹皮のうちでも、特に学名：Acacia mearnsii De Wild.（一般名ブラックワトル）、学名：Acacia mangium Willd.（一般名アカシアマンギュウム）、学名：Acacia dealbata Link.、学名：Acacia decurrens Willd.、及び学名：Acacia pycnantha Benth.
からなる群より選ばれる樹皮並びにこれら樹皮からの抽出物に非常に高い活性酸素消去作用があることを見い出したことに重要な意義がある。したがって本発明は、これら学名のアカシア樹皮を含むアカシア属樹皮に基づく活性酸素消去剤及びこれを含有する食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは抗酸化剤等の組成物からなるものである。
【００１４】
活性酸素消去活性を目的にアカシア属の樹皮を用いるときは、目的に応じて適当な大きさに破砕または粉砕して用いるとよく、特に微粉砕して用いるとよい。
樹皮は、通常、樹木として伐採したのち乾燥し、剥がして樹皮だけ採取し、その後好ましくは更に天日で乾燥するとよい。
アカシア属の樹木（以下、単にアカシアという）の樹皮は、外皮とやや繊維質の内皮とからなり、含水率２０％程度以下に乾燥するとハンマーミル等の粉砕機で容易に微粉化する。アカシア樹皮は、内皮、外皮ともに活性酸素消去成分を含み、この内皮と外皮を分離して用いてもよい。
活性酸素消去剤として、この樹皮微粉末をそのまま用いる場合には、分級して好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは有効成分（活性酸素消去成分）を８０〜９９％含有する５０ないし７０μｍ以下のものを用いるのがよい。
活性成分を多く含む微粉末の分画は、含水率２０％以下に乾燥した樹皮を適当な大きさ、例えば粒径１．６ｍｍ以下程度に粉砕し、生じた粉末を振動ふるい機等で分級して所要の微粉末を得る。
上記とは別に、アカシア樹皮を乳牛等の飼料などに用いる場合には、適当な大きさに粉砕した樹皮をそのまま用いることもできる。
【００１５】
本発明のアカシア樹皮からの抽出物としての活性酸素消去成分を得るためには、低級アルコールや極性溶媒で抽出するのが好ましい。低級アルコールとしてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール等、極性溶媒としては水、アセトン、酢酸エチル等が使用され、必要に応じて単独あるいは２種以上を併せて使用してもよい。水／アルコールの混合溶媒と使用してもよく、水又は熱水抽出物を更にアルコール等の溶媒で抽出してもよい。このように、異なる溶媒によって多段回に抽出することによって、より高い活性の成分を得ることができる。
したがって更に別の本発明は、アカシア樹皮からの水又は熱水による抽出物を更にアルコール等の溶媒で抽出した抽出物に関するものである。
【００１６】
抽出は、アカシア樹皮に溶媒を加えて必要に応じて攪拌し抽出するが、温度や時間あるいは固液比については特に限定されない。溶媒に水を用いる場合には、熱水で抽出してもよい。抽出して得られた活性酸素消去成分を含有する抽出液は、そのまま凍結乾燥あるいは噴霧乾燥してもよいし、あるいは減圧濃縮してから凍結乾燥あるいは噴霧乾燥してもよい。得られる抽出物は、抽出液、溶液、粉末、濃縮液、ペースト状物等の種々の形態とすることができ、広く必要に応じて使用できる。さらに、これらの形態で得られた本発明のアカシア樹皮抽出物はそのまま活性酸素消去成分として使用できるほか、さらに必要に応じて精製し、その精製物も活性酸素消去成分として使用することができる。
【００１７】
また、本発明の活性酸素消去成分はそのまま活性酸素消去剤として用いられるほか、食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは酸化物質捕捉剤等に適宜、目的に応じて任意の形態で配合して用いることができる。
本発明のアカシアの樹皮は、適当な大きさに粉砕して、好ましくは上記のように微粉砕してそのまま飼料又は食品組成物に配合して用いられる。また、活性成分はアカシア樹皮粉砕物から熱水で抽出できることから、ティーパック状として供給し日常の健康飲料としてたしなむこともできる。
【００１８】
先に具体的に示したアカシア樹皮の他に、同様に高い活性を示すものとして、アカシア
属のうち、学名：Acacia storyi、学名：Acacia glaucocarpa、学名：Acacia neriifolia、学名：Acacia trachyphloiaの樹皮を挙げることができ、また、アカシア樹皮と同様に活性酸素消去活性を示すものとしてユーカリ属のうち学名：Eucalyptus diversicolor（一般名カリ）の材及び樹皮やケプラコ属のケプラコ材を示すことができる。
【実施例】
【００１９】
以下、製造例、試験例、処方例を挙げて本発明を更に詳しく具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。特に、ここでは本発明のアカシア樹皮を外皮と内皮に分けないで実施例を示しているが、外皮を内皮から分離してそれぞれ使用することもできる。
以下の製造例、試験例等において、本発明の各アカシアをそれぞれの学名の後の括弧内に示した番号で示す。例えば、学名：Acacia mearnsii De Wild.のアカシアをアカシアNo.１と記す。
学名：Acacia mearnsii De Wild.（No.１）、学名：Acacia mangium Willd.（No.２）、学名：Acacia dealbata Link.（No.３）、学名： Acacia decurrens Willd.（No.４）、学名：Acacia pycnantha Benth.（No.５）。
【００２０】
製造例１
アカシアNo.１の樹皮を含水率２０％以下まで乾燥し、その乾燥樹皮をハンマーミル（Raymond社製）で１．６mm以下（１０メッシュ篩（タイラー：Tyler）通過）の粉末に粉砕した後、更に振動ふるい機で分級し、６３μm以下（２５０メッシュ篩下）の微粉末を得た。
同様にして、残り４種のアカシアNo.２〜５の樹皮を粉砕してそれぞれ６３μm以下の微粉末を得た。種類によって２５０メッシュ篩通過の微粉末の収率に多少の差はあるが、目的とする微粉末が得られた。
【００２１】
製造例２
本発明の各アカシアNo.１〜５の樹皮をそれぞれ含水率２０％以下まで乾燥し、その乾燥樹皮をハンマーミルで１．６mm以下の粉末に粉砕した後、この乾燥粉砕樹皮１００ｇに対して５倍量の熱水を加え、沸騰してから１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液をスプレードライヤで噴霧乾燥し、樹皮抽出物各３０ｇを得た。
以下、各樹皮抽出物はアカシアNo.１〜５熱水抽出物と記す。
【００２２】
製造例３
本発明の各アカシアの樹皮をそれぞれ含水率２０％以下まで乾燥し、その乾燥樹皮をハンマーミルで１．６mm以下の粉末に粉砕した後、この乾燥粉砕樹皮１００ｇに対して３倍量のメタノールを加え、沸騰させて還流させながら１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液からメタノールを蒸発させた後、濃縮液をクローズドスプレードライヤで噴霧乾燥し、樹皮抽出物４５ｇを得た。
以下、各樹皮抽出物をアカシアNo.１メタノール抽出物の如く記す。
アカシアNo.１〜５のメタノール抽出物を得た。
【００２３】
製造例４
本発明のアカシアの樹皮を含水率２０％以下まで乾燥し、その乾燥樹皮をハンマーミルで１．６mm以下の粉末に粉砕した後、この乾燥粉砕樹皮１００ｇに対して３倍量のエタノールを加え、沸騰させて還流させながら１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液からエタノールを蒸発させた後、濃縮液をクローズドスプレードライヤで噴霧乾燥し、樹皮抽出物（以下、アカシアNo.１エタノール抽出物の如く記す）４５ｇを得た。
アカシアNo.１〜５のエタノール抽出物を得た。
【００２４】
製造例５
製造例２で得られたアカシア熱水抽出物１０ｇに３倍量のメタノールを加え、沸騰させて還流させながら１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液からメタノールを蒸発させて、それに水を加えてから凍結乾燥させて９ｇの抽出物（以下、アカシアNo.１熱水抽出物メタノール画分の如く記す）を得た。
アカシアNo.１〜５の熱水抽出物メタノール画分を得た。
【００２５】
製造例６
製造例２で得られたアカシア熱水抽出物１０ｇに３倍量のエタノールを加え、沸騰させて還流させながら１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液からエタノールを蒸発させて、それに水を加えてから凍結乾燥させて９ｇの抽出物（以下、アカシアNo.１熱水抽出物エタノール画分の如く記す）を得た。
アカシアNo.１〜５の熱水抽出物エタノール画分を得た。
【００２６】
試験例1 活性酸素消去活性試験
上記製造例で調製したアカシア抽出物の活性酸素消去活性を下記図式で示す反応式に基づき、ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）系により活性酸素の一つであるスーパーオキシドアニオン（O２ー）を発生させ、発生したO２ーをスピントラップ剤（ＤＭＰＯ：5,5-Dimethyl-1-pyrroline-N-oxide）で捕捉し、ＥＳＲ（電子スピン共鳴）法を用いて測定した。
【化１】
【００２７】
試料の調製
上記製造例１〜６で得られた粉末から５ｇを秤りとり、０．１Mリン酸緩衝液５０mLを加え、攪拌子を入れ、氷冷しながら６０分間攪拌抽出する。遠心分離（3,000rpm、5分間）又はろ過(フィルターNo.１)した液を試料溶液とする。
【００２８】
測定操作
あらかじめ、小試験管に９．２M ＤＭＰＯ(5,5-Dimethyl-1-pyrroline-N-oxide、ラボテック、冷凍保存品)を１５μL、５．５mM ＤＥＴＡＰＡＣ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、シグマ、冷凍保存品）を３５μL、２mMヒポキサンチン（シグマ、冷凍保存品）を５０μL加え混合しておく。この試験管にＳＯＤ標準溶液（SOD、東洋紡、3,000単位／mgを１０mg秤り取り、０．１Mリン酸緩衝液に溶かし２００mLとしたもの）または試料溶液５０μＬを加え、次いでキサンチンオキシダーゼ溶液（キサンチンオキシダーゼ、ベーリンガー・マンハイム、２０単位／mLを２０μL取り、０．１Mリン酸緩衝液９８０μLを加えたもの）５０μLを加える時にフットスイッチを押す。試験管をボルテックス等で攪拌し、特殊偏平セル（日本電子、約130μL）に吸い取り、ＥＳＲ装置にセットする。フットスイッチを押した４０秒後に掃引を開始する。
【００２９】
活性の評価
スペクトルの読み取りは、ＤＭＰＯ−ＯＯＨシグナルの線幅が一定であるので、このシグナルの高さを、内標準として用いているMn２＋のシグナルの高さと比較する(比をとる)方法で行う。
【００３０】
ＳＯＤ標準溶液は、０〜２０単位／mL濃度で６点程度測定し、検量線を作成する。ＳＯＤが０の時の比（DMPO-OOHシグナル／Mn２＋シグナル＝Ｉ０）、及びＳＯＤ各濃度での比(Ｉｎ)を求める。検量線の縦軸は（Ｉ０／Ｉｎ）−１とし、横軸にＳＯＤ濃度をとる。
【００３１】
試料溶液の濃度は再現性を高めるため、約１０単位／mLとなるように０．１Mリン酸緩衝液で希釈してから測定する。検量線から試料溶液中のＳＯＤ濃度（ＳＯＳＡ濃度）を求める。
ＥＳＲはＪＥＳ−ＦＲ８０(日本電子)を用い、マイクロ波出力８mW、磁場掃引幅335.4mT±5mT、掃引時間２分、磁場変調100kHz、0.79×0.1mT、増幅率２×100、応答時間0.1秒の条件で測定する。
Ｄを希釈率、Ｗを試料採取量（ｇ）とし、ＳＯＳＡ（単位／ｇ）を試料溶液の活性（単位／mL）×Ｄ×（50／Ｗ）で求める。
【００３２】
結果を、比較品の測定結果と併せて表１に示す。
【表１】
【００３３】
表１から本発明の製造例１〜６で得た樹皮粉末及び抽出物の中では、熱水抽出物エタノ
ール画分が最も活性酸素消去作用が高く、アスコルビン酸（ビタミンC）及び（＋）カテキンの約７倍の効果を有することがわかる。
【００３４】
試験例２ 急性毒性試験（経口投与）
ＯＥＣＤ（Guidelines for the Testing of Chemicals 401、1987）に準拠し、マウスを用いた急性経口毒性試験を実施した。
ICR系雌雄マウスについて、雄では7,000mg／kg、雌では6,500mg／kgを上限として、公差500mg／kgで各９用量の検体（アカシアNo.１（学名：Acacia mearnsii De Wild.）熱水抽出物）を雌雄マウスに単回経口投与した。検体は、本発明品を純水に懸濁して用いた。その結果、ＬＤ５０値は雄では4,468mg／kg、雌では3,594mg／kgであり、いずれも3,000mg／kgの投与量で、死亡例を認めなかった。
上記試験をアカシアNo.２〜５の熱水抽出物について行って同様の結果を得た。これにより、本発明の活性酸素消去剤は、安全性に優れていることがわかる。
【００３５】
試験例３ 突然変異誘起性試験
労働省告示第７７号（昭和63年9月1日）に準拠し、突然変異誘起性試験を実施した。
Escherichia coli WP2 uvrA株及びSalmonella typhimurium TA株系４菌株を用いて代謝活性化を含む復帰突然変異試験を156〜5,000μg／プレートの用量の検体アカシアNo.１（学名：Acacia mearnsii De Wild.）熱水抽出物で行った。その結果、いずれの菌株についても復帰変異コロニー数の増加が見られなかったことから、本発明品の突然変異誘起性は陰性であると結論づけられ、安全性に優れていることがわかる。
【００３６】
処方例１ 内服剤の調製
製造例６のアカシア樹皮熱水抽出物エタノール画分を用い、下記に示す組成にて内服剤を調製した。
製造例６の抽出物画分 １．０（重量％）
乳糖 ３０．０
コーンスターチ ６０．０
結晶セルロース ８．０
ポリビニールピロリドン １．０
計 １００．０
【００３７】
処方例２ ペットフードの調製
製造例２のアカシア樹皮熱水抽出物を用い、下記に示す組成にてペットフードを調製した。
製造例２の抽出物 １．０（重量％）
オートミール ８８．０
でんぷん ５．０
食塩 ２．５
全卵 ３．０
調味料 ０．５
計 １００．０
【００３８】
処方例３ 錠剤（菓子）の調製
製造例６のアカシア樹皮熱水抽出物エタノール画分を用い、下記に示す組成にて錠剤（菓子）を調製した。
製造例６の抽出物画分 １．０（重量％）
クエン酸 １．０
脱脂粉乳 １５．０
ショ糖エステル １．０
フレーバー ０．５
粉糖 ２０．０
乳糖 ６１．５
計 １００．０
【００３９】
処方例４ 化粧水の調製
製造例４のアカシア樹皮エタノール抽出物を用い、下記に示す組成にて均一に攪拌、溶解し、化粧水を調製した。
製造例６の抽出物画分 １．０（重量％）
エタノール １５．０
エチルパラベン ０．１
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．３
１，３−ブチレングリコール ４．０
エデト酸二ナトリウム ０．０１
精製水 ７９．４９
計 １００．０
【技術分野】
【０００１】
本発明は活性酸素消去剤を特定の植物樹皮から得るもので、より詳しくは特定植物の樹皮の微粉末あるいは水／低級アルコールを溶剤として抽出して得られる抽出物を有効成分とする食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは抗酸化剤等に配合して用いられる活性酸素消去剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に大気中において、酸素は三重項酸素と呼ばれる安定な物質である。その酸素の一部が、生体内でスーパーオキシドやヒドロキシラジカル、一重項酸素、過酸化水素等の活性酸素と呼ばれる反応性の高い物質に変化すると、その一部が好中球やマクロファージで生産され異物に対する生体防御の役割を担う一方で、活性酸素が過剰に生体内に存在すると、脂質、タンパク質、酵素、核酸等を攻撃し、生体膜や組織などを損傷し、動脈硬化、脳心血管障害、肺気腫、癌、リウマチ性関節炎、白内障、高血圧、老人性痴呆、アルツハイマー病あるいはシミ・ソバカスや老化等の発症の原因にもなることが明らかにされている。
【０００３】
従って、従来からこれらの過剰な活性酸素による酸化ストレスが引き起こす上述のような各種疾病を予防するために、出発物質であるスーパーオキシド（０2−）を不均化して過酸化水素と酸素分子を生じる反応を触媒する酵素であるスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）と類似する働きをするＳＯＤ様物質や、活性酸素を捕捉する物質（活性酸素消去活性物質）を食品へ添加する抗酸化物質の探索が広く行われてきた。
【０００４】
例えば、この様な物質としては、天然物由来の物質では脂溶性のα-トコフェロール（ビタミンＥ）や水溶性のアスコルビン酸（ビタミンＣ）が挙げられ、合成物質ではＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）、ＴＢＨＱ(第三級ブチルヒドロキノン)等のフェノール性物質がある。
しかしながら、これらの物質は食品の抗酸化物質として一般的には使用されているものの、生体への活性酸素消去作用が十分ではなく、特に合成物質のＢＨＡでは発癌性の疑いが生じる等の問題もでてきている。
【０００５】
そこで、近年、動植物等の天然物から安全性の高い活性酸素消去活性物質を探索する研究開発が盛んに行われており、例えば、特許文献１、２、３、４、５等がある。また、実際に製品化まで進んだものとしては、特に、茶葉、カカオ豆エキスから抽出されるカテキン類、ブルーベリー果皮に含有されるアントシアニン系化合物、発酵大豆中から得られるイソフラボン類等、ポリフェノール系化合物が非常に高い活性酸素消去活性があることで注目を集めている。
【０００６】
これらの活性酸素消去活性が高いことが明らかになってきたポリフェノール系化合物の中でも特に茶葉に含まれる（−）エピガロカテキン、（−）エピガロカテキン−３−ガレート、（−）エピカテキン、（−）エピカテキン−３−ガレート、（＋）カテキンなど、フラバン−３−オールを基本骨格とするフラバノールであるカテキン類が、他のポリフェノール類よりも高い活性酸素消去活性があることがわかってきた。
【０００７】
一方で、アカシア属の一種である学名：Acacia mearnsii De Wild. の樹皮から水で抽出されるタンニンは古くから南アフリカやブラジルで生産されており、一般的にはワトルタンニンと呼ばれ、主に皮なめし剤や木材用接着剤として非常に安価で利用されている。また、Acacia mangium Willd.（アカシアマンギュウム）は生長が非常に早いことからも
、近年、インドネシア、マレーシアを始めとする亜熱帯〜熱帯で植林が盛んになってきている。このワルトタンニンは、縮合型タンニンに分類されるものである。
【０００８】
しかしながら、上記の学名：Acacia mearnsii De Wild.樹皮から熱水等で抽出して得られるタンニンはもとより、Acacia mangium Willd.の様なアカシア属の樹皮を粉砕して得られる樹皮微粉末について、活性酸素を消去する作用は全く知られていなかった。更に、これらを食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは抗酸化剤等へ添加、配合する等して、上述した疾患の予防や治療、老化の防止や改善のために用いる試みはされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平０１−２５７２６号公報
【特許文献２】特開平６−６５０７４号公報
【特許文献３】特開平７−３００４２２号公報
【特許文献４】特開平１１−５９７５号公報
【特許文献５】特開２００１−９８２６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記観点に着眼し、人体及び動物に対して安全性が高く、生体内で発生する過剰の活性酸素を十分に消去する作用を有する活性酸素消去剤及びこれを含有する食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは抗酸化剤等を安価に提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記観点に着眼し、活性酸素消去活性（ＳＯＳＡ；Super Oxide Scavenging Activities）を指標に鋭意研究を重ねていたところ、ある種のアカシア属の樹皮に高い活性酸素消去活性があることを見出して本発明を完成した。
アカシア属樹皮の高い活性酸素消去活性は、該樹皮中に含まれる或る一成分によるものか、種々の成分に基づく複合効果によるものか特定できないが、アカシア属樹皮によって得ることができる。
上記活性酸素消去活性は、アカシア属の樹木のうち特に、学名：Acacia mearnsii De Wild.（一般名ブラックワトル）、学名：Acacia mangium Willd.（一般名アカシアマンギュウム）、学名：Acacia dealbata Link.、学名：Acacia decurrens Willd.、及び学名：Acacia pycnantha Benth.からなる群より選ばれるものの樹皮が好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、アカシアの樹皮が活性酸素消去作用を示すことを見出して完成されたもので、樹皮を微粉砕し分級することでより活性の強い画分を得ることができ、天然植物由来のものであるため安全で安価に大量に供給できるため、健康食品や飼料等に使用できる。また、アカシアの樹皮を熱水やエタノール等の溶媒で抽出することにより高活性の成分を容易に得ることができるため、健康食品や、飼料、工業製品のみならず、医薬、化粧品等種々の分野で利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
アカシア属樹皮による活性酸素消去作用は、樹皮自体を用いても得ることができ、また、樹皮から溶媒によって抽出された抽出物によっても得ることができる。
アカシア属樹皮のうちでも、特に学名：Acacia mearnsii De Wild.（一般名ブラックワトル）、学名：Acacia mangium Willd.（一般名アカシアマンギュウム）、学名：Acacia dealbata Link.、学名：Acacia decurrens Willd.、及び学名：Acacia pycnantha Benth.
からなる群より選ばれる樹皮並びにこれら樹皮からの抽出物に非常に高い活性酸素消去作用があることを見い出したことに重要な意義がある。したがって本発明は、これら学名のアカシア樹皮を含むアカシア属樹皮に基づく活性酸素消去剤及びこれを含有する食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは抗酸化剤等の組成物からなるものである。
【００１４】
活性酸素消去活性を目的にアカシア属の樹皮を用いるときは、目的に応じて適当な大きさに破砕または粉砕して用いるとよく、特に微粉砕して用いるとよい。
樹皮は、通常、樹木として伐採したのち乾燥し、剥がして樹皮だけ採取し、その後好ましくは更に天日で乾燥するとよい。
アカシア属の樹木（以下、単にアカシアという）の樹皮は、外皮とやや繊維質の内皮とからなり、含水率２０％程度以下に乾燥するとハンマーミル等の粉砕機で容易に微粉化する。アカシア樹皮は、内皮、外皮ともに活性酸素消去成分を含み、この内皮と外皮を分離して用いてもよい。
活性酸素消去剤として、この樹皮微粉末をそのまま用いる場合には、分級して好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは有効成分（活性酸素消去成分）を８０〜９９％含有する５０ないし７０μｍ以下のものを用いるのがよい。
活性成分を多く含む微粉末の分画は、含水率２０％以下に乾燥した樹皮を適当な大きさ、例えば粒径１．６ｍｍ以下程度に粉砕し、生じた粉末を振動ふるい機等で分級して所要の微粉末を得る。
上記とは別に、アカシア樹皮を乳牛等の飼料などに用いる場合には、適当な大きさに粉砕した樹皮をそのまま用いることもできる。
【００１５】
本発明のアカシア樹皮からの抽出物としての活性酸素消去成分を得るためには、低級アルコールや極性溶媒で抽出するのが好ましい。低級アルコールとしてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール等、極性溶媒としては水、アセトン、酢酸エチル等が使用され、必要に応じて単独あるいは２種以上を併せて使用してもよい。水／アルコールの混合溶媒と使用してもよく、水又は熱水抽出物を更にアルコール等の溶媒で抽出してもよい。このように、異なる溶媒によって多段回に抽出することによって、より高い活性の成分を得ることができる。
したがって更に別の本発明は、アカシア樹皮からの水又は熱水による抽出物を更にアルコール等の溶媒で抽出した抽出物に関するものである。
【００１６】
抽出は、アカシア樹皮に溶媒を加えて必要に応じて攪拌し抽出するが、温度や時間あるいは固液比については特に限定されない。溶媒に水を用いる場合には、熱水で抽出してもよい。抽出して得られた活性酸素消去成分を含有する抽出液は、そのまま凍結乾燥あるいは噴霧乾燥してもよいし、あるいは減圧濃縮してから凍結乾燥あるいは噴霧乾燥してもよい。得られる抽出物は、抽出液、溶液、粉末、濃縮液、ペースト状物等の種々の形態とすることができ、広く必要に応じて使用できる。さらに、これらの形態で得られた本発明のアカシア樹皮抽出物はそのまま活性酸素消去成分として使用できるほか、さらに必要に応じて精製し、その精製物も活性酸素消去成分として使用することができる。
【００１７】
また、本発明の活性酸素消去成分はそのまま活性酸素消去剤として用いられるほか、食品、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品あるいは酸化物質捕捉剤等に適宜、目的に応じて任意の形態で配合して用いることができる。
本発明のアカシアの樹皮は、適当な大きさに粉砕して、好ましくは上記のように微粉砕してそのまま飼料又は食品組成物に配合して用いられる。また、活性成分はアカシア樹皮粉砕物から熱水で抽出できることから、ティーパック状として供給し日常の健康飲料としてたしなむこともできる。
【００１８】
先に具体的に示したアカシア樹皮の他に、同様に高い活性を示すものとして、アカシア
属のうち、学名：Acacia storyi、学名：Acacia glaucocarpa、学名：Acacia neriifolia、学名：Acacia trachyphloiaの樹皮を挙げることができ、また、アカシア樹皮と同様に活性酸素消去活性を示すものとしてユーカリ属のうち学名：Eucalyptus diversicolor（一般名カリ）の材及び樹皮やケプラコ属のケプラコ材を示すことができる。
【実施例】
【００１９】
以下、製造例、試験例、処方例を挙げて本発明を更に詳しく具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。特に、ここでは本発明のアカシア樹皮を外皮と内皮に分けないで実施例を示しているが、外皮を内皮から分離してそれぞれ使用することもできる。
以下の製造例、試験例等において、本発明の各アカシアをそれぞれの学名の後の括弧内に示した番号で示す。例えば、学名：Acacia mearnsii De Wild.のアカシアをアカシアNo.１と記す。
学名：Acacia mearnsii De Wild.（No.１）、学名：Acacia mangium Willd.（No.２）、学名：Acacia dealbata Link.（No.３）、学名： Acacia decurrens Willd.（No.４）、学名：Acacia pycnantha Benth.（No.５）。
【００２０】
製造例１
アカシアNo.１の樹皮を含水率２０％以下まで乾燥し、その乾燥樹皮をハンマーミル（Raymond社製）で１．６mm以下（１０メッシュ篩（タイラー：Tyler）通過）の粉末に粉砕した後、更に振動ふるい機で分級し、６３μm以下（２５０メッシュ篩下）の微粉末を得た。
同様にして、残り４種のアカシアNo.２〜５の樹皮を粉砕してそれぞれ６３μm以下の微粉末を得た。種類によって２５０メッシュ篩通過の微粉末の収率に多少の差はあるが、目的とする微粉末が得られた。
【００２１】
製造例２
本発明の各アカシアNo.１〜５の樹皮をそれぞれ含水率２０％以下まで乾燥し、その乾燥樹皮をハンマーミルで１．６mm以下の粉末に粉砕した後、この乾燥粉砕樹皮１００ｇに対して５倍量の熱水を加え、沸騰してから１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液をスプレードライヤで噴霧乾燥し、樹皮抽出物各３０ｇを得た。
以下、各樹皮抽出物はアカシアNo.１〜５熱水抽出物と記す。
【００２２】
製造例３
本発明の各アカシアの樹皮をそれぞれ含水率２０％以下まで乾燥し、その乾燥樹皮をハンマーミルで１．６mm以下の粉末に粉砕した後、この乾燥粉砕樹皮１００ｇに対して３倍量のメタノールを加え、沸騰させて還流させながら１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液からメタノールを蒸発させた後、濃縮液をクローズドスプレードライヤで噴霧乾燥し、樹皮抽出物４５ｇを得た。
以下、各樹皮抽出物をアカシアNo.１メタノール抽出物の如く記す。
アカシアNo.１〜５のメタノール抽出物を得た。
【００２３】
製造例４
本発明のアカシアの樹皮を含水率２０％以下まで乾燥し、その乾燥樹皮をハンマーミルで１．６mm以下の粉末に粉砕した後、この乾燥粉砕樹皮１００ｇに対して３倍量のエタノールを加え、沸騰させて還流させながら１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液からエタノールを蒸発させた後、濃縮液をクローズドスプレードライヤで噴霧乾燥し、樹皮抽出物（以下、アカシアNo.１エタノール抽出物の如く記す）４５ｇを得た。
アカシアNo.１〜５のエタノール抽出物を得た。
【００２４】
製造例５
製造例２で得られたアカシア熱水抽出物１０ｇに３倍量のメタノールを加え、沸騰させて還流させながら１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液からメタノールを蒸発させて、それに水を加えてから凍結乾燥させて９ｇの抽出物（以下、アカシアNo.１熱水抽出物メタノール画分の如く記す）を得た。
アカシアNo.１〜５の熱水抽出物メタノール画分を得た。
【００２５】
製造例６
製造例２で得られたアカシア熱水抽出物１０ｇに３倍量のエタノールを加え、沸騰させて還流させながら１５分間抽出し、１０〜２０μｍのフィルターを用いて濾過した。得られた濾液からエタノールを蒸発させて、それに水を加えてから凍結乾燥させて９ｇの抽出物（以下、アカシアNo.１熱水抽出物エタノール画分の如く記す）を得た。
アカシアNo.１〜５の熱水抽出物エタノール画分を得た。
【００２６】
試験例1 活性酸素消去活性試験
上記製造例で調製したアカシア抽出物の活性酸素消去活性を下記図式で示す反応式に基づき、ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）系により活性酸素の一つであるスーパーオキシドアニオン（O２ー）を発生させ、発生したO２ーをスピントラップ剤（ＤＭＰＯ：5,5-Dimethyl-1-pyrroline-N-oxide）で捕捉し、ＥＳＲ（電子スピン共鳴）法を用いて測定した。
【化１】
【００２７】
試料の調製
上記製造例１〜６で得られた粉末から５ｇを秤りとり、０．１Mリン酸緩衝液５０mLを加え、攪拌子を入れ、氷冷しながら６０分間攪拌抽出する。遠心分離（3,000rpm、5分間）又はろ過(フィルターNo.１)した液を試料溶液とする。
【００２８】
測定操作
あらかじめ、小試験管に９．２M ＤＭＰＯ(5,5-Dimethyl-1-pyrroline-N-oxide、ラボテック、冷凍保存品)を１５μL、５．５mM ＤＥＴＡＰＡＣ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、シグマ、冷凍保存品）を３５μL、２mMヒポキサンチン（シグマ、冷凍保存品）を５０μL加え混合しておく。この試験管にＳＯＤ標準溶液（SOD、東洋紡、3,000単位／mgを１０mg秤り取り、０．１Mリン酸緩衝液に溶かし２００mLとしたもの）または試料溶液５０μＬを加え、次いでキサンチンオキシダーゼ溶液（キサンチンオキシダーゼ、ベーリンガー・マンハイム、２０単位／mLを２０μL取り、０．１Mリン酸緩衝液９８０μLを加えたもの）５０μLを加える時にフットスイッチを押す。試験管をボルテックス等で攪拌し、特殊偏平セル（日本電子、約130μL）に吸い取り、ＥＳＲ装置にセットする。フットスイッチを押した４０秒後に掃引を開始する。
【００２９】
活性の評価
スペクトルの読み取りは、ＤＭＰＯ−ＯＯＨシグナルの線幅が一定であるので、このシグナルの高さを、内標準として用いているMn２＋のシグナルの高さと比較する(比をとる)方法で行う。
【００３０】
ＳＯＤ標準溶液は、０〜２０単位／mL濃度で６点程度測定し、検量線を作成する。ＳＯＤが０の時の比（DMPO-OOHシグナル／Mn２＋シグナル＝Ｉ０）、及びＳＯＤ各濃度での比(Ｉｎ)を求める。検量線の縦軸は（Ｉ０／Ｉｎ）−１とし、横軸にＳＯＤ濃度をとる。
【００３１】
試料溶液の濃度は再現性を高めるため、約１０単位／mLとなるように０．１Mリン酸緩衝液で希釈してから測定する。検量線から試料溶液中のＳＯＤ濃度（ＳＯＳＡ濃度）を求める。
ＥＳＲはＪＥＳ−ＦＲ８０(日本電子)を用い、マイクロ波出力８mW、磁場掃引幅335.4mT±5mT、掃引時間２分、磁場変調100kHz、0.79×0.1mT、増幅率２×100、応答時間0.1秒の条件で測定する。
Ｄを希釈率、Ｗを試料採取量（ｇ）とし、ＳＯＳＡ（単位／ｇ）を試料溶液の活性（単位／mL）×Ｄ×（50／Ｗ）で求める。
【００３２】
結果を、比較品の測定結果と併せて表１に示す。
【表１】
【００３３】
表１から本発明の製造例１〜６で得た樹皮粉末及び抽出物の中では、熱水抽出物エタノ
ール画分が最も活性酸素消去作用が高く、アスコルビン酸（ビタミンC）及び（＋）カテキンの約７倍の効果を有することがわかる。
【００３４】
試験例２ 急性毒性試験（経口投与）
ＯＥＣＤ（Guidelines for the Testing of Chemicals 401、1987）に準拠し、マウスを用いた急性経口毒性試験を実施した。
ICR系雌雄マウスについて、雄では7,000mg／kg、雌では6,500mg／kgを上限として、公差500mg／kgで各９用量の検体（アカシアNo.１（学名：Acacia mearnsii De Wild.）熱水抽出物）を雌雄マウスに単回経口投与した。検体は、本発明品を純水に懸濁して用いた。その結果、ＬＤ５０値は雄では4,468mg／kg、雌では3,594mg／kgであり、いずれも3,000mg／kgの投与量で、死亡例を認めなかった。
上記試験をアカシアNo.２〜５の熱水抽出物について行って同様の結果を得た。これにより、本発明の活性酸素消去剤は、安全性に優れていることがわかる。
【００３５】
試験例３ 突然変異誘起性試験
労働省告示第７７号（昭和63年9月1日）に準拠し、突然変異誘起性試験を実施した。
Escherichia coli WP2 uvrA株及びSalmonella typhimurium TA株系４菌株を用いて代謝活性化を含む復帰突然変異試験を156〜5,000μg／プレートの用量の検体アカシアNo.１（学名：Acacia mearnsii De Wild.）熱水抽出物で行った。その結果、いずれの菌株についても復帰変異コロニー数の増加が見られなかったことから、本発明品の突然変異誘起性は陰性であると結論づけられ、安全性に優れていることがわかる。
【００３６】
処方例１ 内服剤の調製
製造例６のアカシア樹皮熱水抽出物エタノール画分を用い、下記に示す組成にて内服剤を調製した。
製造例６の抽出物画分 １．０（重量％）
乳糖 ３０．０
コーンスターチ ６０．０
結晶セルロース ８．０
ポリビニールピロリドン １．０
計 １００．０
【００３７】
処方例２ ペットフードの調製
製造例２のアカシア樹皮熱水抽出物を用い、下記に示す組成にてペットフードを調製した。
製造例２の抽出物 １．０（重量％）
オートミール ８８．０
でんぷん ５．０
食塩 ２．５
全卵 ３．０
調味料 ０．５
計 １００．０
【００３８】
処方例３ 錠剤（菓子）の調製
製造例６のアカシア樹皮熱水抽出物エタノール画分を用い、下記に示す組成にて錠剤（菓子）を調製した。
製造例６の抽出物画分 １．０（重量％）
クエン酸 １．０
脱脂粉乳 １５．０
ショ糖エステル １．０
フレーバー ０．５
粉糖 ２０．０
乳糖 ６１．５
計 １００．０
【００３９】
処方例４ 化粧水の調製
製造例４のアカシア樹皮エタノール抽出物を用い、下記に示す組成にて均一に攪拌、溶解し、化粧水を調製した。
製造例６の抽出物画分 １．０（重量％）
エタノール １５．０
エチルパラベン ０．１
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．３
１，３−ブチレングリコール ４．０
エデト酸二ナトリウム ０．０１
精製水 ７９．４９
計 １００．０
【特許請求の範囲】
【請求項１】
学名：Acacia mearnsii De Wild.（一般名ブラックワトル）、学名：Acacia mangium Willd.（一般名アカシアマンギュウム）、学名：Acacia dealbata Link.、学名：Acacia decurrens Willd.、及び学名：Acacia pycnantha Benth.の群より選ばれる少なくとも一種以上のアカシア属樹皮を有効成分として含有することを特徴とする活性酸素消去剤。
【請求項２】
学名：Acacia mearnsii De Wild.（一般名ブラックワトル）、学名：Acacia mangium Willd.（一般名アカシアマンギュウム）、学名：Acacia dealbata Link.、学名：Acacia decurrens Willd.、及び学名：Acacia pycnantha Benth.の群より選ばれる少なくとも一種以上のアカシア属樹皮の溶媒による抽出物を有効成分として含有することを特徴とする活性酸素消去剤。
【請求項３】
抽出物が水又はアルコールにより抽出されたものであることを特徴とする請求項２記載の活性酸素消去剤。
【請求項４】
抽出物が水／アルコールの混合溶媒により抽出されたものであることを特徴とする請求項２記載の活性酸素消去剤。
【請求項１】
学名：Acacia mearnsii De Wild.（一般名ブラックワトル）、学名：Acacia mangium Willd.（一般名アカシアマンギュウム）、学名：Acacia dealbata Link.、学名：Acacia decurrens Willd.、及び学名：Acacia pycnantha Benth.の群より選ばれる少なくとも一種以上のアカシア属樹皮を有効成分として含有することを特徴とする活性酸素消去剤。
【請求項２】
学名：Acacia mearnsii De Wild.（一般名ブラックワトル）、学名：Acacia mangium Willd.（一般名アカシアマンギュウム）、学名：Acacia dealbata Link.、学名：Acacia decurrens Willd.、及び学名：Acacia pycnantha Benth.の群より選ばれる少なくとも一種以上のアカシア属樹皮の溶媒による抽出物を有効成分として含有することを特徴とする活性酸素消去剤。
【請求項３】
抽出物が水又はアルコールにより抽出されたものであることを特徴とする請求項２記載の活性酸素消去剤。
【請求項４】
抽出物が水／アルコールの混合溶媒により抽出されたものであることを特徴とする請求項２記載の活性酸素消去剤。
【公開番号】特開２０１１−５１９９２（Ｐ２０１１−５１９９２Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２５７４０（Ｐ２０１０−２２５７４０）
【出願日】平成２２年１０月５日（２０１０．１０．５）
【分割の表示】特願２００３−１５１４０１（Ｐ２００３−１５１４０１）の分割
【原出願日】平成１５年５月２８日（２００３．５．２８）
【出願人】（０００１４５４３７）株式会社ウッドワン (70)
【出願人】（５０１１８５５４５）モナシュ・ユニヴァーシティ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月５日（２０１０．１０．５）
【分割の表示】特願２００３−１５１４０１（Ｐ２００３−１５１４０１）の分割
【原出願日】平成１５年５月２８日（２００３．５．２８）
【出願人】（０００１４５４３７）株式会社ウッドワン (70)
【出願人】（５０１１８５５４５）モナシュ・ユニヴァーシティ (3)
【Ｆターム（参考）】
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