海産および淡水産動物の組織から脂質を抽出する方法
【課題】海産および淡水産動物由来の原料から、脂質画分を抽出する方法の提供。
【解決手段】海産および淡水産動物由来の原料をケトン溶媒にて抽出を行い、リン脂質含有脂質画分の第一の液体成分および第一の固体成分を得、該固体成分をさらにアルコールまたは酢酸エステル（好ましくは酢酸エチル）を用いる溶媒抽出に付し、残存する可溶性脂質画分の抽出を行う。尚、残った不溶性の粒子状成分は、タンパク質が富化され、有用な量の活性を有する酵素を含むのでこれも回収する。
【解決手段】海産および淡水産動物由来の原料をケトン溶媒にて抽出を行い、リン脂質含有脂質画分の第一の液体成分および第一の固体成分を得、該固体成分をさらにアルコールまたは酢酸エステル（好ましくは酢酸エチル）を用いる溶媒抽出に付し、残存する可溶性脂質画分の抽出を行う。尚、残った不溶性の粒子状成分は、タンパク質が富化され、有用な量の活性を有する酵素を含むのでこれも回収する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、海産（marine）および淡水産（aquatic）動物、例えばオキアミ（krill）、カラヌス（Calanus）、魚類、海産哺乳類などからの脂質画分の抽出に関する。より詳細には、本発明は、溶媒によって脱水された、活性を有する酵素を豊富に含む固形残渣をも回収しうる点において改良されている、脂質画分の抽出方法に関する。
オキアミ、カラヌス、魚類、海産哺乳類などの海産および淡水産動物から得られる脂質画分は、以下のような種々の用途に適用することができる。
【０００２】
・医療への適用
海産および淡水産動物から得られる脂肪油やそれを含む脂質画分は、治療効果を有する種々の物質を含む。例えば、種々の海産および淡水産動物から得られる油は抗炎症作用を示すことが報告されている。また、海産および淡水産動物から得られる油は、心血管系疾患の発生率を低下させる上で有益であるとの報告もある。さらに、海産および淡水産動物から得られる油の中には、ある種の狼瘡（lupus）や腎疾患の進行を抑えるものもあることが報告されている。また、オキアミは潰瘍や創傷の除去に関与する酵素や、食物の消化を促進する酵素の原料となりうる生物である。さらに、海産および淡水産動物から得られる油には種々の酸化防止剤が含まれており、それらは治療効果を有する可能性がある。
【０００３】
・栄養補給食品（Nutraceuticals）
ω−３系脂肪酸（omega-3 fatty acids）の有益な作用を考慮すると、オキアミ、カラヌスおよび魚類から得られる油は、ヒトの食物における補助食（dietary supplements）として使用し得る。これらの脂肪酸は、脳や目の正常な発生に必須である。また、海産および淡水産動物から得られる油は、脂溶性ビタミンであるビタミンＡ、ＤおよびＥや、カロテノイド類を豊富に含んでいる。
【０００４】
・化粧品
種々の海産および淡水産動物から得られる油が、モイスチャライジングクリーム（moisturizing cream）の製造に用いられている。
【０００５】
・魚類の養殖
オキアミ、カラヌスおよび魚類から得られる油には、高濃度の２０：５（エイコサペンタエン酸）や２２：６（ドコサヘキサエン酸）が含まれている。これらの脂肪酸は必須栄養素であり、魚類の飼料として有益である。その上、そのような飼料を与えられて育った魚類を摂取することにより、これらの必須栄養素がヒトの食物中に取り込まれる。
【０００６】
・動物用飼料
ω−３系脂肪酸に富む動物用飼料を用いると、食肉中の不飽和脂肪酸レベルを向上し、且つコレステロールレベルを低下しうる。このような特性は、家禽養殖業（poultry industry）において卵の品質を向上させる目的で既に活用されている。
【０００７】
海産および淡水産動物から油を抽出する方法としては、種々のものが知られている。例えば、ヘキサンやエタノールなどの有機溶媒を用いて魚油を抽出することが知られている。またアセトンなどの溶媒を用いて、魚類の筋肉組織における脂肪含有量を測定することが知られている。
【０００８】
米国特許第４，３３１，６９５号公報には、プロパン、ブタン、ヘキサンなどの、室温ではガス状となる溶媒を加圧下で用いる方法が記載されている。この方法では、植物や動物を細切したものを、好ましくは１５〜８０℃で抽出に付す。抽出された油を、高圧下、温度を５０〜２００℃まで上昇させることにより沈殿させる。しかし、オキアミのような海産動物が原料である場合、ヘキサンは抽出力の乏しい溶媒（poor extraction solvent）である。その上、沈殿の段階における高温は脂質に悪影響を及ぼす。
【０００９】
カナダ国特許出願第２，１１５，５７１号公報には、種々の褐藻および紅藻から油を抽出する方法が記載されている。ここでは、例えばほぼ純粋なエタノールを用いて、４０時間ソックスレー抽出を行う方法が提供されている。
【００１０】
米国特許第５，００６，２８１号公報には、魚類などの、海産および淡水産動物から油を抽出する方法が記載されている。この方法では、海産および淡水産動物を酸化防止剤化合物で処理した後細切し、遠心分離に付して水相および固体相から油相を分離する。得られた油相をさらに酸化防止剤化合物で処理し、不快な匂いや味を除去する。
【００１１】
カナダ国特許第２，１１５，５７１号公報には、オキアミから油を抽出する方法が記載されている。この方法では、新鮮な、または解凍したオキアミを水性媒体中に分散させて乳液状にする。油画分は遠心分離によって回収する。
【００１２】
フォルチ（Folch）は、１９５７年に発行された論文（J. Biol. Chem. 226: 497-509 “A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues”）中において、クロロホルムとメタノールを用いる抽出法を提案している。この方法は、溶媒の毒性のため工業的に実施することはできない。
【００１３】
従来の方法は、通常工業的に実施することができないか、脂質の収率が低い。従って本発明の目的は、海産および淡水産動物の油を抽出する方法であって、有用な脂質画分と共に、タンパク質が豊富で、活性を有する酵素を含む有用な固形残渣を別途回収することが可能な方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の諸目的および本発明の更なる適用範囲に関しては、以下の詳細な説明の記載から明らかになる。ただし、本発明の意図および範囲内での種々の変更・修正は当業者にとって明白である。従って、詳細な説明において本発明の好ましい態様が示されるが、それらは単なる例示と理解されるべきものである。
【００１５】
本発明の好ましい態様に関する詳細な説明
以降、本発明に関し詳細に説明するが、その前に、本発明は、以下に詳述する方法に対してのみ適用されるものではないと理解されねばならない。本発明は下記以外の種々の態様によって実施可能である。また、以下の記述において用いられる表現法または用語は、表記のために用いられるものであり、制限のために用いられるものではないと理解されねばならない
【００１６】
本発明は、新たに採集された海産または淡水産動物をアセトン中に懸濁させることを含む。脂質はアセトンなどのケトンによって抽出される。このことにより、動物の組織は脱水され、また脂質画分は溶媒（ケトン）中に移行する。乾燥（脱水）された残渣は、活性を有する酵素を豊富に含む有用な産物である。
【００１７】
本発明の好ましい態様においては、抽出はアセトンの後アルコールを用いて行う。アルコールとしては、イソプロパノールおよびｔ−ブタノールが好ましい。また、アルコールに代えて酢酸エチルなどの酢酸エステルを用いてもよい。この手順によれば、２種類の脂質画分が相次いで得られると共に、タンパク質に富み、活性を有する酵素を含む乾燥残渣が得られる。総脂質の回収率は、「発明の背景」の項で述べたフォルチらの方法（１９５７）に匹敵する。この手順を、オキアミ、カラヌス、魚類およびサメの組織を用いて試行した。
【００１８】
驚くべきことに、本発明において提案される連続的な抽出処理は、単一の溶媒系を用いる抽出処理に比して、脂質抽出における収率が優れていることが判明した。２種類の溶媒を用いて連続して抽出を行い、その抽出をアセトンなどのケトンによる抽出から開始するこの方法は、アセトンが動物の組織を脱水する作用を有しているので特に好ましい。動物の組織が脱水されていることにより、第二の溶媒、即ちアルコールまたは酢酸エステル（酢酸エチルなど）による抽出が大いに促進される。
【００１９】
オキアミ、カラヌスなどの動物プランクトンや、魚類解体時に生じる副生物、例えば魚の内臓を用いる場合、高い費用対効果をもって脂質画分を回収すると共に、タンパク質に富み、活性を有する酵素を含む乾燥残渣を別に得るためには、アセトンによる抽出を一回行うのみで充分である。
【００２０】
以降、本発明における一般的な抽出方法について記載する。新たに採集され、好ましくは細切された海産または淡水産動物由来の原料よりなる出発物質を約２時間、好ましくは一晩アセトン抽出に付す。しかし、脂質抽出における収率に対し、抽出時間に臨界性はない。抽出を促進させるためには、出発物質を直径約５ｍｍ未満の粒子状とすることが好ましい。また、抽出は不活性ガス雰囲気下、約５℃またはそれ以下の温度で行うことが好ましい。
【００２１】
抽出の開始から１０〜４０分間、好ましくは２０分間にわたり、攪拌を行うことが好ましい。また、海産または淡水産動物由来の原料の体積に対するアセトンの体積を６：１とし、２時間にわたって抽出することが最も適切であることが判明した。ただし、抽出時間に臨界性はない。
【００２２】
可溶化された脂質画分は、通常の方法、例えば濾過、遠心分離、沈降などの方法により固形の原料（残渣）から分離する。これらの方法のうち、濾過による分離が好ましい。
【００２３】
残渣は、有機溶媒耐性の（すなわち、金属、ガラスまたは紙製の）フィルターを用いて濾別した後、純粋なアセトンで洗浄し、残渣中に残留する脂質を回収することが好ましい。このとき純アセトンの使用量は、原料の元の体積の２倍とすることが好ましい。洗浄により得られた洗液を濾液と混合し、減圧下で溶媒を留去する。溶媒の除去はフラッシュ蒸発や噴霧乾燥によって行ってもよい。溶媒を留去した後に残る水性の残留物は、低温下で放置することにより油相（以降「画分Ｉ」とする）から分離することができる。
【００２４】
フィルター上に回収された固形の残渣を、エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール等のアルコールまたは酢酸エチル中に懸濁させて抽出する。このときアルコールまたは酢酸エチルの使用量は、原料の元の体積の２倍とすることが好ましい。
【００２５】
得られた濾液の溶媒を留去することにより、第二の脂質画分（以降「画分ＩＩ」とする）が得られる。抽出時間は約３０分で充分であることが判明した。ただし、抽出時間に臨界性はない。
【００２６】
上記の有機溶媒（ｔ−ブタノールを除く）および試料の温度は臨界性のあるパラメーターではないが、できるだけ低温にすることが好ましい。しかし、室温では固体であるｔ−ブタノールを用いる場合には、ｔ−ブタノールを使用前に加温しておき、抽出を２５℃で手早く行うことが重要である。
【００２７】
比較例
抽出の効率を比較するため、クロロホルムとメタノールを用いる従来の方法（フォルチら、１９５７）をオキアミに対して適用した。この方法を、抽出工程の効率を求める際の参照とした。また、ヘキサンを抽出溶媒として用いる方法とも比較を行った。脂質の回収率は、脂質画分を少量の元の（抽出に用いた）溶媒に懸濁させ、得られた懸濁液の一部を少量とって溶媒留去し、重量を測定することにより求めた。
【００２８】
ここで示される実施例の全てに関し、アセトン抽出とそれに続く第２の溶媒（例えば酢酸エチル）による抽出を行なう本発明の方法により得られる脂肪油は、半透明で、従来のフォルチらの方法（１９５７）により得られる脂肪油に比して魅力ある特性を有している。
【００２９】
脂質の組成分析は、７８０μｇの抽出物を薄層クロマトグラフィー（TLC）用シリカゲルプレートに付着させ、次のような展開溶媒を用いて分画することにより行なった（Bowyerら、１９６２）。
中性脂質：ヘキサン：エチルエーテル：酢酸＝９０：１０：１（ｖ／ｖ）
リン脂質：クロロホルム：メタノール：水＝８０：２５：２（ｖ／ｖ）
【００３０】
E.pacificaにおける脂肪酸組成は、原報（Bowyerら、１９６２）に記載の方法を若干変更（１時間、８０℃のところを２時間、６５℃、ヘキサンにて３回洗浄するところを２回洗浄、水による洗浄を省略）し、気液クロマトグラフィー（GLC）により行なった。
【００３１】
痕跡量の有機溶媒を除去するため、脂質画分ＩおよびＩＩは不活性ガス雰囲気下１２５℃で１５分間加熱した。
【００３２】
脂肪の分析は、米国油化学会（American Oil Chemist’s Society, AOCS）の方法に従って行なった。抽出された脂質の分析においては、けん化価、ウィイス（Wijs）ヨウ素価、水分−揮発性物質含量（moisture-volatile matter levels）を基準として用いた。また、コレステロール含量をPlummerの方法（１９８７）により測定した。
【００３３】
またこれとは独立に、ロバート アックマン（Robert Ackman）教授の監督下、上記およびその他の分析を、ダルハウジー大学 ダルテックのカナダ漁業技術研究所（所在地：カナダ国ノバスコシア州ハリファックス市）（Canadian Institute of Fisheries Technology, Daltech, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada）において行なった。これには、ウィイスヨウ素価、過酸化物価、アニシジン価、脂質クラス組成、脂肪酸組成、並びに遊離脂肪酸、ＦＡＭＥ（脂肪酸メチルエステル）、コレステロール、トコフェロール、全トランス−レチノール、コレカルシフェロール、アスタキサンチンおよびカンタキサンチンの含量が含まれる。
【００３４】
表１は、アセトン処理してからエタノール処理することにより、フォルチら（１９５７）の従来の方法よりも多量の脂質を乾燥オキアミから抽出できることを示す。
【００３５】
表２は、冷凍したEuphausia pacifica（太平洋産のオキアミの１種）からの脂質抽出の結果を示す。冷凍オキアミの水分含量を８０％と仮定すると、その脂質含量は表１に示す乾燥オキアミについての結果に匹敵する。イソプロパノール、ｔ−ブタノール又は酢酸エチルを第２抽出の溶媒に用いると、収率はエタノールには及ばないが、エタノールを用いるとイソプロパノール、ｔ−ブタノール又は酢酸エチルに比べて不純物が多くなるので、脂質回収におけるイソプロパノール、ｔ−ブタノール又は酢酸エチルの効果が必ずしもエタノールより劣るとはいえない。また、これらは、アセトンの後に第２溶媒としても使用できる。
【００３６】
アセトン抽出の結果にばらつきがあるのは、主に水−油分離工程によるものである。水−油分離工程は、アセトン蒸発後の水−油溶液中の残留アセトンの量に影響される。この残留アセトン量は実験の度に異なるが、その理由は、小さなスケールで用いられる蒸発系は再現性が低いからである（工業的スケールでは、蒸発工程が最適化された条件下で行なわれる）。単独の溶媒を用いてオキアミから全脂質を抽出する実験も行なった。その結果、酢酸エチル（抽出率１.３７％）やへキサン（抽出率０.２３％）は、アセトン単独と比較して、良溶媒ではないことがわかる（アセトン単独での抽出率は１.８６％で、効率的なアセトン蒸発系を用いると抽出率は更に向上する）。
【００３７】
本発明の方法の主な利点の１つは、抽出物（脂質画分と、高タンパク含量の固形物）からのバクテリアの除去である。E.pacificaを種々の量のアセトン中、４℃で１１２時間インキュベートして得られるサンプルを、BactoTM牛肉抽出物０.３％、BactoTMペプトン０.５％及びBactoTM寒天１.５％を含むＮＡ培地（Difco Laboratories社、米国デトロイト市）に接種して、室温又は４℃で１８日間インキュベートした。その結果、オキアミ１グラム当たりアセトン１容量を用いた場合には、細菌の有意な増殖は見られなかった。アセトンの量がそれより大きい場合（２容量や５容量）は、細菌の増殖は全く見られなかった。このことは、アセトンでオキアミのサンプルを保存できるということを意味する。アセトンは、効率的な殺菌・殺ウイルス剤として知られている（Goodmann et al., 1980）。
【００３８】
表３は、M.norvegicaからの脂質の収率を示す。その脂質の％値（３.６７％）は、表２に示すE. pacificaについての値（３.１１％）に匹敵するものである。値の違いは、両種のオキアミの餌や採取時期（季節）の違いによるものと考えられる。
【００３９】
表４は、M.norvegicaからの脂質の抽出効率において、試料の磨砕が与える影響を示す。これらの抽出実験は最適条件下で行なわれたもので、本発明の方法が従来の方法より明確に優れていることを示す（本発明の方法が４.４６％であるのに対し、従来の方法では３.３０％）。表４はまた、大型種のオキアミでは磨砕が重要な要素であることを示す（４.４６％対３.５３％）。
【００４０】
表５は、カラヌス（Calanus）からの脂質抽出の結果を報告するものである。相当な量の脂質が得られた。実験１と実験２の間に見られる結果のばらつき（新鮮重量の８.２２％と１０.９０％）は、カラヌス種における組成の何らかのばらつきによるものであろう。
【００４１】
表６〜８は、魚の組織からの抽出した脂質の合計量を報告するものである。本発明の方法を、サバ、マスおよびニシンについて実施した。実験に用いたのは、周辺組織（主に筋肉）と内臓である。好ましいことに、魚から身を取った後の、通常は廃棄される不使用部分から貴重な脂質画分を回収できるので、有利である。本発明の方法により、人間の消費用に魚を加工した後に残る上記の不使用部分をアセトン中に保存し、それから脂質を抽出することができる。
【００４２】
このときフォルチの方法（１９５７）を用いると、本発明の方法よりも多量の脂質を回収できるかもしれない。実際、アセトンとエタノールを用いて本発明の方法で抽出を行った後、フォルチの方法を実施することにより、サバから少量（内臓から０.５２％、組織から１.４５％）の脂質を抽出することができた。また、マスとニシンについて本発明の方法による抽出とフォルチの方法による抽出の比較実験を行なうと、後者の方が優れた回収率を示す。しかしフォルチの方法は、（毒性のために）商業目的での脂質抽出には利用できない、という点に注目すべきである。
【００４３】
表９〜１１は、サメの肝臓からの脂質の抽出結果を示す。同一種については、抽出法が違っても結果に顕著な差は見られない。
【００４４】
表１２は、オキアミ（E.pacifica）油の画分Ｉ（アセトン）と画分ＩＩ（アルコール又は酢酸エチル）の特徴の一部を示す。まず、画分Ｉのけん化価（１３０.６）から、画分Ｉが、画分ＩＩ（１８５.７）よりも鎖長の長い脂肪酸を含有することがわかる。画分Ｉのウィイスヨウ素価からは、この画分が、ウィイスヨウ素価が８１.１であるオリーブ油と比較して、高度不飽和脂肪酸含量が高いことがわかる。このことが、画分Ｉが室温で液状である理由である。不飽和脂肪酸の融点が飽和のホモローグ（対応する飽和脂肪酸）の融点よりも低いことは周知である。同じことが、ヨウ素価が１２７.２である画分ＩＩについてもいえる。表１４に示す脂肪酸組成はこれらのヨウ素価を裏付けるものである。即ち、画分Ｉは高度不飽和脂肪酸（ペンタエン類＋へキサエン類）の比率が高く（３０.２４％）、画分ＩＩも同様である（２２.９８％）。
【００４５】
最後に、表１２はまた、画分ＩＩは溶媒蒸発後に１０.０％の揮発性物質と水分を含有することを示す。画分ＩＩについては、この値は６.８％である。痕跡量の溶媒を除去するためには、油を窒素雰囲気下で短時間加熱（約１２５℃で約１５分）することが重要である。
【００４６】
本発明の方法を用いて得られたオキアミ油（画分Ｉはアセトン抽出、画分ＩＩは酢酸エチル抽出により得られた）についての分析結果を表１２、１３、１４、１５、１６及び１７に示す。注目すべき点として、表１８に示すように、２種類のカロテノイド、即ちアスタキサンチンとカンタキサンチンに関して測定したカロテノイド含量が有意に高かったことに言及することができる。実際、二種の画分の分析の結果、アスタキサンチン含量は９２および１２４μｇ／ｇ（脂質画分）、カンタキサンチン含量は２６２および７３４μｇ／ｇ（脂質画分）であった。従って、本発明の意図するところにおいて、上記のようなオキアミ抽出物はアスタキサンチンを少なくとも７５μｇ／ｇ、好ましくは少なくとも９０μｇ／ｇ含むといえる。またカンタキサンチンについては、少なくとも２５０μｇ／ｇ、好ましくは少なくとも２７０μｇ／ｇ含むといえる。
【００４７】
過酸化物価やアニシジン価が低いことも好ましいことであり、これは天然の酸化防止剤（即ちアスタキサンチンとカンタキサンチン）を高濃度で含有することによるものである。高濃度のカロテノイド類は、経皮的移行に関する特性を良好にすることから、これらの物質は、上記のようなオキアミ抽出物は薬学的または化粧品学的に好ましい特性を有することを示している。従って、オキアミ抽出物は薬物の経皮的送達のために好ましく用いうるものである。
【００４８】
表１８は、本発明の水性動物から脂質を抽出する方法における、最も好ましい態様を示す。
【００４９】
表１９は、本発明の方法によれば、固体画分における酵素活性が維持されることを示すものである。これを実証するため、アセトン、次いで酢酸エチルによる抽出を行った後の固形のオキアミ残渣に関して実験を行なった。
【００５０】
ｏ−フタルジアルデヒドを試薬として用い、遊離したアミノ基の量を分光光度法によって測定することにより、タンパク質加水分解活性を測定した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Bradford）法により測定した。
【００５１】
可溶性タンパク質を水で抽出し、限外濾過により得られた１０％乳漿タンパク質濃縮物（10 % lactoserum protein concentrate obtained by ultrafiltration）に添加した。これを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中３７℃でインキュベートし、最後にトリクロロ酢酸を添加し、Churchらの方法（1983, J Dairy Sci 66: 1219-1227）により上清中のＮＨ3基の量を測定した。
【００５２】
図１〜６は、E.pacificaの脂質の脂肪酸組成のクロマトグラムを示す。各々のクロマトグラムにおいて、２０：５脂肪酸と２２：６脂肪酸の比率が高い（海産及び淡水産動物油に特徴的である）ことが顕著であり、２つの明確なピークで表わされている。
【００５３】
動物種の違いによる中性脂質の脂質パターンの変異（図７〜１１）は、栄養源の違いによるものである。同一種内（例えばE.pacifica）では、脂質抽出方法を変えて得た脂質パターンの間に顕著な差異は見られない。リン脂質（図１２〜１６）については、正反対の結果が観察される。即ち、同一種において脂質パターンが同じにならないことから、脂質パターンの差異は脂質の抽出方法の違いによるものであることになる。サメから得られる脂質（上記の方法により抽出）と市販のタラ肝油（サンプルはカナダ国ケベック州のUniprixドラッグストアーズから入手可能）は、主として中性脂質からなり、リン脂質ではない。
【００５４】
溶媒の容量とインキュベーション時間がE.pacificaからのアセトンによる脂質抽出の効率に与える影響を、図１７と図１８にそれぞれ示す。比率１：６（ｗ/ｖ）において最適の収率となり、２時間でほぼ完全に抽出できる。第２抽出工程の実験にはエタノールを用いた。エタノールの容量を変えても収率が変わらないので、この溶媒の容量には臨界性が無いようである（図１９）が、図２０に示す結果から分かるように、エタノール中でのインキュベーション時間は少なくとも３０分は必要である。
【００５５】
本発明者らの一人であるアドリアン ボドワン博士は、種々のオキアミ脂質画分を摂取したが、副作用は見られなかった。
【００５６】
本発明を特定の態様について説明してきたが、この態様は様々なやり方で改変や改良が可能であることは当業者には明らかである。従って、本発明の範囲は、本願の特許請求の範囲の記載によって定義される以外には何ら限定されないことを理解されたい。
【００５７】
アセトンと酢酸エチルによる抽出を行なった後に得られるオキアミの残渣はタンパク質分解酵素活性を有する。タンパク質分解活性は、ｏ-フタルジアルデヒドを試薬として用いる分光光度法によりアミノ基の遊離を測定することによって調べた。タンパク質濃度はブラッドフォード法により測定した。
【００５８】
酵素源として、アセトンと酢酸エチルによる脂質抽出を行なった後に得られる残渣を用いた。可溶性タンパク質を水で抽出し、限外濾過により得られた１０％乳漿タンパク質濃縮物に加えた。
【００５９】
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中３７℃でインキュベートし、最後にトリクロロ酢酸を加えてから、上清中のＮＨ3基の量をChurchらの方法（1983）により測定した。
【００６０】
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【００６５】
【表６】
【００６６】
【表７】
【００６７】
【表８】
【００６８】
【表９】
【００６９】
【表１０】
【００７０】
【表１１】
【００７１】
【表１２】
【００７２】
【表１３】
【００７３】
【表１４】
【００７４】
【表１５】
【００７５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、乾燥オキアミから抽出（溶媒：クロロホルム−メタノール）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図２】図２は、乾燥オキアミから抽出（溶媒：アセトン）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図３】図３は、凍結オキアミから抽出（溶媒：アセトン）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図４】図４は、凍結オキアミから抽出（溶媒：エタノール）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図５】図５は、凍結オキアミから抽出（溶媒：ｔ−ブタノール）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図６】図６は、凍結オキアミから抽出（溶媒：酢酸エチル）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図７】図７は、カラヌス種（Calanus sp.）およびM.norvegicaの中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図８】図８は、オキアミE.pacificaの中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図９】図９は、サメM.schmittiの中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１０】図１０は、サメG.galeusの中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１１】図１１は、カスザメ（Angel shark）の中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１２】図１２は、カラヌス種（Calanus sp.）およびM.norvegicaのリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１３】図１３は、オキアミE.pacificaのリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１４】図１４は、サメM.schmittiのリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１５】図１５は、サメG.galeusのリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１６】図１６は、カスザメ（Angel shark）のリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１７】図１７は、脂質抽出（原料：E.pacifica）に対するアセトン使用量の影響を示すグラフである。
【図１８】図１８は、脂質抽出（原料：E.pacifica）に対するアセトン中でのインキュベーション時間の影響を示すグラフである。
【図１９】図１９は、脂質抽出（原料：E.pacifica）に対するエタノール使用量の影響を示すグラフである。
【図２０】図２０は、脂質抽出（原料：T. raschii）に対するエタノール中でのインキュベーション時間の影響を示すグラフである。
【背景技術】
【０００１】
本発明は、海産（marine）および淡水産（aquatic）動物、例えばオキアミ（krill）、カラヌス（Calanus）、魚類、海産哺乳類などからの脂質画分の抽出に関する。より詳細には、本発明は、溶媒によって脱水された、活性を有する酵素を豊富に含む固形残渣をも回収しうる点において改良されている、脂質画分の抽出方法に関する。
オキアミ、カラヌス、魚類、海産哺乳類などの海産および淡水産動物から得られる脂質画分は、以下のような種々の用途に適用することができる。
【０００２】
・医療への適用
海産および淡水産動物から得られる脂肪油やそれを含む脂質画分は、治療効果を有する種々の物質を含む。例えば、種々の海産および淡水産動物から得られる油は抗炎症作用を示すことが報告されている。また、海産および淡水産動物から得られる油は、心血管系疾患の発生率を低下させる上で有益であるとの報告もある。さらに、海産および淡水産動物から得られる油の中には、ある種の狼瘡（lupus）や腎疾患の進行を抑えるものもあることが報告されている。また、オキアミは潰瘍や創傷の除去に関与する酵素や、食物の消化を促進する酵素の原料となりうる生物である。さらに、海産および淡水産動物から得られる油には種々の酸化防止剤が含まれており、それらは治療効果を有する可能性がある。
【０００３】
・栄養補給食品（Nutraceuticals）
ω−３系脂肪酸（omega-3 fatty acids）の有益な作用を考慮すると、オキアミ、カラヌスおよび魚類から得られる油は、ヒトの食物における補助食（dietary supplements）として使用し得る。これらの脂肪酸は、脳や目の正常な発生に必須である。また、海産および淡水産動物から得られる油は、脂溶性ビタミンであるビタミンＡ、ＤおよびＥや、カロテノイド類を豊富に含んでいる。
【０００４】
・化粧品
種々の海産および淡水産動物から得られる油が、モイスチャライジングクリーム（moisturizing cream）の製造に用いられている。
【０００５】
・魚類の養殖
オキアミ、カラヌスおよび魚類から得られる油には、高濃度の２０：５（エイコサペンタエン酸）や２２：６（ドコサヘキサエン酸）が含まれている。これらの脂肪酸は必須栄養素であり、魚類の飼料として有益である。その上、そのような飼料を与えられて育った魚類を摂取することにより、これらの必須栄養素がヒトの食物中に取り込まれる。
【０００６】
・動物用飼料
ω−３系脂肪酸に富む動物用飼料を用いると、食肉中の不飽和脂肪酸レベルを向上し、且つコレステロールレベルを低下しうる。このような特性は、家禽養殖業（poultry industry）において卵の品質を向上させる目的で既に活用されている。
【０００７】
海産および淡水産動物から油を抽出する方法としては、種々のものが知られている。例えば、ヘキサンやエタノールなどの有機溶媒を用いて魚油を抽出することが知られている。またアセトンなどの溶媒を用いて、魚類の筋肉組織における脂肪含有量を測定することが知られている。
【０００８】
米国特許第４，３３１，６９５号公報には、プロパン、ブタン、ヘキサンなどの、室温ではガス状となる溶媒を加圧下で用いる方法が記載されている。この方法では、植物や動物を細切したものを、好ましくは１５〜８０℃で抽出に付す。抽出された油を、高圧下、温度を５０〜２００℃まで上昇させることにより沈殿させる。しかし、オキアミのような海産動物が原料である場合、ヘキサンは抽出力の乏しい溶媒（poor extraction solvent）である。その上、沈殿の段階における高温は脂質に悪影響を及ぼす。
【０００９】
カナダ国特許出願第２，１１５，５７１号公報には、種々の褐藻および紅藻から油を抽出する方法が記載されている。ここでは、例えばほぼ純粋なエタノールを用いて、４０時間ソックスレー抽出を行う方法が提供されている。
【００１０】
米国特許第５，００６，２８１号公報には、魚類などの、海産および淡水産動物から油を抽出する方法が記載されている。この方法では、海産および淡水産動物を酸化防止剤化合物で処理した後細切し、遠心分離に付して水相および固体相から油相を分離する。得られた油相をさらに酸化防止剤化合物で処理し、不快な匂いや味を除去する。
【００１１】
カナダ国特許第２，１１５，５７１号公報には、オキアミから油を抽出する方法が記載されている。この方法では、新鮮な、または解凍したオキアミを水性媒体中に分散させて乳液状にする。油画分は遠心分離によって回収する。
【００１２】
フォルチ（Folch）は、１９５７年に発行された論文（J. Biol. Chem. 226: 497-509 “A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues”）中において、クロロホルムとメタノールを用いる抽出法を提案している。この方法は、溶媒の毒性のため工業的に実施することはできない。
【００１３】
従来の方法は、通常工業的に実施することができないか、脂質の収率が低い。従って本発明の目的は、海産および淡水産動物の油を抽出する方法であって、有用な脂質画分と共に、タンパク質が豊富で、活性を有する酵素を含む有用な固形残渣を別途回収することが可能な方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の諸目的および本発明の更なる適用範囲に関しては、以下の詳細な説明の記載から明らかになる。ただし、本発明の意図および範囲内での種々の変更・修正は当業者にとって明白である。従って、詳細な説明において本発明の好ましい態様が示されるが、それらは単なる例示と理解されるべきものである。
【００１５】
本発明の好ましい態様に関する詳細な説明
以降、本発明に関し詳細に説明するが、その前に、本発明は、以下に詳述する方法に対してのみ適用されるものではないと理解されねばならない。本発明は下記以外の種々の態様によって実施可能である。また、以下の記述において用いられる表現法または用語は、表記のために用いられるものであり、制限のために用いられるものではないと理解されねばならない
【００１６】
本発明は、新たに採集された海産または淡水産動物をアセトン中に懸濁させることを含む。脂質はアセトンなどのケトンによって抽出される。このことにより、動物の組織は脱水され、また脂質画分は溶媒（ケトン）中に移行する。乾燥（脱水）された残渣は、活性を有する酵素を豊富に含む有用な産物である。
【００１７】
本発明の好ましい態様においては、抽出はアセトンの後アルコールを用いて行う。アルコールとしては、イソプロパノールおよびｔ−ブタノールが好ましい。また、アルコールに代えて酢酸エチルなどの酢酸エステルを用いてもよい。この手順によれば、２種類の脂質画分が相次いで得られると共に、タンパク質に富み、活性を有する酵素を含む乾燥残渣が得られる。総脂質の回収率は、「発明の背景」の項で述べたフォルチらの方法（１９５７）に匹敵する。この手順を、オキアミ、カラヌス、魚類およびサメの組織を用いて試行した。
【００１８】
驚くべきことに、本発明において提案される連続的な抽出処理は、単一の溶媒系を用いる抽出処理に比して、脂質抽出における収率が優れていることが判明した。２種類の溶媒を用いて連続して抽出を行い、その抽出をアセトンなどのケトンによる抽出から開始するこの方法は、アセトンが動物の組織を脱水する作用を有しているので特に好ましい。動物の組織が脱水されていることにより、第二の溶媒、即ちアルコールまたは酢酸エステル（酢酸エチルなど）による抽出が大いに促進される。
【００１９】
オキアミ、カラヌスなどの動物プランクトンや、魚類解体時に生じる副生物、例えば魚の内臓を用いる場合、高い費用対効果をもって脂質画分を回収すると共に、タンパク質に富み、活性を有する酵素を含む乾燥残渣を別に得るためには、アセトンによる抽出を一回行うのみで充分である。
【００２０】
以降、本発明における一般的な抽出方法について記載する。新たに採集され、好ましくは細切された海産または淡水産動物由来の原料よりなる出発物質を約２時間、好ましくは一晩アセトン抽出に付す。しかし、脂質抽出における収率に対し、抽出時間に臨界性はない。抽出を促進させるためには、出発物質を直径約５ｍｍ未満の粒子状とすることが好ましい。また、抽出は不活性ガス雰囲気下、約５℃またはそれ以下の温度で行うことが好ましい。
【００２１】
抽出の開始から１０〜４０分間、好ましくは２０分間にわたり、攪拌を行うことが好ましい。また、海産または淡水産動物由来の原料の体積に対するアセトンの体積を６：１とし、２時間にわたって抽出することが最も適切であることが判明した。ただし、抽出時間に臨界性はない。
【００２２】
可溶化された脂質画分は、通常の方法、例えば濾過、遠心分離、沈降などの方法により固形の原料（残渣）から分離する。これらの方法のうち、濾過による分離が好ましい。
【００２３】
残渣は、有機溶媒耐性の（すなわち、金属、ガラスまたは紙製の）フィルターを用いて濾別した後、純粋なアセトンで洗浄し、残渣中に残留する脂質を回収することが好ましい。このとき純アセトンの使用量は、原料の元の体積の２倍とすることが好ましい。洗浄により得られた洗液を濾液と混合し、減圧下で溶媒を留去する。溶媒の除去はフラッシュ蒸発や噴霧乾燥によって行ってもよい。溶媒を留去した後に残る水性の残留物は、低温下で放置することにより油相（以降「画分Ｉ」とする）から分離することができる。
【００２４】
フィルター上に回収された固形の残渣を、エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール等のアルコールまたは酢酸エチル中に懸濁させて抽出する。このときアルコールまたは酢酸エチルの使用量は、原料の元の体積の２倍とすることが好ましい。
【００２５】
得られた濾液の溶媒を留去することにより、第二の脂質画分（以降「画分ＩＩ」とする）が得られる。抽出時間は約３０分で充分であることが判明した。ただし、抽出時間に臨界性はない。
【００２６】
上記の有機溶媒（ｔ−ブタノールを除く）および試料の温度は臨界性のあるパラメーターではないが、できるだけ低温にすることが好ましい。しかし、室温では固体であるｔ−ブタノールを用いる場合には、ｔ−ブタノールを使用前に加温しておき、抽出を２５℃で手早く行うことが重要である。
【００２７】
比較例
抽出の効率を比較するため、クロロホルムとメタノールを用いる従来の方法（フォルチら、１９５７）をオキアミに対して適用した。この方法を、抽出工程の効率を求める際の参照とした。また、ヘキサンを抽出溶媒として用いる方法とも比較を行った。脂質の回収率は、脂質画分を少量の元の（抽出に用いた）溶媒に懸濁させ、得られた懸濁液の一部を少量とって溶媒留去し、重量を測定することにより求めた。
【００２８】
ここで示される実施例の全てに関し、アセトン抽出とそれに続く第２の溶媒（例えば酢酸エチル）による抽出を行なう本発明の方法により得られる脂肪油は、半透明で、従来のフォルチらの方法（１９５７）により得られる脂肪油に比して魅力ある特性を有している。
【００２９】
脂質の組成分析は、７８０μｇの抽出物を薄層クロマトグラフィー（TLC）用シリカゲルプレートに付着させ、次のような展開溶媒を用いて分画することにより行なった（Bowyerら、１９６２）。
中性脂質：ヘキサン：エチルエーテル：酢酸＝９０：１０：１（ｖ／ｖ）
リン脂質：クロロホルム：メタノール：水＝８０：２５：２（ｖ／ｖ）
【００３０】
E.pacificaにおける脂肪酸組成は、原報（Bowyerら、１９６２）に記載の方法を若干変更（１時間、８０℃のところを２時間、６５℃、ヘキサンにて３回洗浄するところを２回洗浄、水による洗浄を省略）し、気液クロマトグラフィー（GLC）により行なった。
【００３１】
痕跡量の有機溶媒を除去するため、脂質画分ＩおよびＩＩは不活性ガス雰囲気下１２５℃で１５分間加熱した。
【００３２】
脂肪の分析は、米国油化学会（American Oil Chemist’s Society, AOCS）の方法に従って行なった。抽出された脂質の分析においては、けん化価、ウィイス（Wijs）ヨウ素価、水分−揮発性物質含量（moisture-volatile matter levels）を基準として用いた。また、コレステロール含量をPlummerの方法（１９８７）により測定した。
【００３３】
またこれとは独立に、ロバート アックマン（Robert Ackman）教授の監督下、上記およびその他の分析を、ダルハウジー大学 ダルテックのカナダ漁業技術研究所（所在地：カナダ国ノバスコシア州ハリファックス市）（Canadian Institute of Fisheries Technology, Daltech, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada）において行なった。これには、ウィイスヨウ素価、過酸化物価、アニシジン価、脂質クラス組成、脂肪酸組成、並びに遊離脂肪酸、ＦＡＭＥ（脂肪酸メチルエステル）、コレステロール、トコフェロール、全トランス−レチノール、コレカルシフェロール、アスタキサンチンおよびカンタキサンチンの含量が含まれる。
【００３４】
表１は、アセトン処理してからエタノール処理することにより、フォルチら（１９５７）の従来の方法よりも多量の脂質を乾燥オキアミから抽出できることを示す。
【００３５】
表２は、冷凍したEuphausia pacifica（太平洋産のオキアミの１種）からの脂質抽出の結果を示す。冷凍オキアミの水分含量を８０％と仮定すると、その脂質含量は表１に示す乾燥オキアミについての結果に匹敵する。イソプロパノール、ｔ−ブタノール又は酢酸エチルを第２抽出の溶媒に用いると、収率はエタノールには及ばないが、エタノールを用いるとイソプロパノール、ｔ−ブタノール又は酢酸エチルに比べて不純物が多くなるので、脂質回収におけるイソプロパノール、ｔ−ブタノール又は酢酸エチルの効果が必ずしもエタノールより劣るとはいえない。また、これらは、アセトンの後に第２溶媒としても使用できる。
【００３６】
アセトン抽出の結果にばらつきがあるのは、主に水−油分離工程によるものである。水−油分離工程は、アセトン蒸発後の水−油溶液中の残留アセトンの量に影響される。この残留アセトン量は実験の度に異なるが、その理由は、小さなスケールで用いられる蒸発系は再現性が低いからである（工業的スケールでは、蒸発工程が最適化された条件下で行なわれる）。単独の溶媒を用いてオキアミから全脂質を抽出する実験も行なった。その結果、酢酸エチル（抽出率１.３７％）やへキサン（抽出率０.２３％）は、アセトン単独と比較して、良溶媒ではないことがわかる（アセトン単独での抽出率は１.８６％で、効率的なアセトン蒸発系を用いると抽出率は更に向上する）。
【００３７】
本発明の方法の主な利点の１つは、抽出物（脂質画分と、高タンパク含量の固形物）からのバクテリアの除去である。E.pacificaを種々の量のアセトン中、４℃で１１２時間インキュベートして得られるサンプルを、BactoTM牛肉抽出物０.３％、BactoTMペプトン０.５％及びBactoTM寒天１.５％を含むＮＡ培地（Difco Laboratories社、米国デトロイト市）に接種して、室温又は４℃で１８日間インキュベートした。その結果、オキアミ１グラム当たりアセトン１容量を用いた場合には、細菌の有意な増殖は見られなかった。アセトンの量がそれより大きい場合（２容量や５容量）は、細菌の増殖は全く見られなかった。このことは、アセトンでオキアミのサンプルを保存できるということを意味する。アセトンは、効率的な殺菌・殺ウイルス剤として知られている（Goodmann et al., 1980）。
【００３８】
表３は、M.norvegicaからの脂質の収率を示す。その脂質の％値（３.６７％）は、表２に示すE. pacificaについての値（３.１１％）に匹敵するものである。値の違いは、両種のオキアミの餌や採取時期（季節）の違いによるものと考えられる。
【００３９】
表４は、M.norvegicaからの脂質の抽出効率において、試料の磨砕が与える影響を示す。これらの抽出実験は最適条件下で行なわれたもので、本発明の方法が従来の方法より明確に優れていることを示す（本発明の方法が４.４６％であるのに対し、従来の方法では３.３０％）。表４はまた、大型種のオキアミでは磨砕が重要な要素であることを示す（４.４６％対３.５３％）。
【００４０】
表５は、カラヌス（Calanus）からの脂質抽出の結果を報告するものである。相当な量の脂質が得られた。実験１と実験２の間に見られる結果のばらつき（新鮮重量の８.２２％と１０.９０％）は、カラヌス種における組成の何らかのばらつきによるものであろう。
【００４１】
表６〜８は、魚の組織からの抽出した脂質の合計量を報告するものである。本発明の方法を、サバ、マスおよびニシンについて実施した。実験に用いたのは、周辺組織（主に筋肉）と内臓である。好ましいことに、魚から身を取った後の、通常は廃棄される不使用部分から貴重な脂質画分を回収できるので、有利である。本発明の方法により、人間の消費用に魚を加工した後に残る上記の不使用部分をアセトン中に保存し、それから脂質を抽出することができる。
【００４２】
このときフォルチの方法（１９５７）を用いると、本発明の方法よりも多量の脂質を回収できるかもしれない。実際、アセトンとエタノールを用いて本発明の方法で抽出を行った後、フォルチの方法を実施することにより、サバから少量（内臓から０.５２％、組織から１.４５％）の脂質を抽出することができた。また、マスとニシンについて本発明の方法による抽出とフォルチの方法による抽出の比較実験を行なうと、後者の方が優れた回収率を示す。しかしフォルチの方法は、（毒性のために）商業目的での脂質抽出には利用できない、という点に注目すべきである。
【００４３】
表９〜１１は、サメの肝臓からの脂質の抽出結果を示す。同一種については、抽出法が違っても結果に顕著な差は見られない。
【００４４】
表１２は、オキアミ（E.pacifica）油の画分Ｉ（アセトン）と画分ＩＩ（アルコール又は酢酸エチル）の特徴の一部を示す。まず、画分Ｉのけん化価（１３０.６）から、画分Ｉが、画分ＩＩ（１８５.７）よりも鎖長の長い脂肪酸を含有することがわかる。画分Ｉのウィイスヨウ素価からは、この画分が、ウィイスヨウ素価が８１.１であるオリーブ油と比較して、高度不飽和脂肪酸含量が高いことがわかる。このことが、画分Ｉが室温で液状である理由である。不飽和脂肪酸の融点が飽和のホモローグ（対応する飽和脂肪酸）の融点よりも低いことは周知である。同じことが、ヨウ素価が１２７.２である画分ＩＩについてもいえる。表１４に示す脂肪酸組成はこれらのヨウ素価を裏付けるものである。即ち、画分Ｉは高度不飽和脂肪酸（ペンタエン類＋へキサエン類）の比率が高く（３０.２４％）、画分ＩＩも同様である（２２.９８％）。
【００４５】
最後に、表１２はまた、画分ＩＩは溶媒蒸発後に１０.０％の揮発性物質と水分を含有することを示す。画分ＩＩについては、この値は６.８％である。痕跡量の溶媒を除去するためには、油を窒素雰囲気下で短時間加熱（約１２５℃で約１５分）することが重要である。
【００４６】
本発明の方法を用いて得られたオキアミ油（画分Ｉはアセトン抽出、画分ＩＩは酢酸エチル抽出により得られた）についての分析結果を表１２、１３、１４、１５、１６及び１７に示す。注目すべき点として、表１８に示すように、２種類のカロテノイド、即ちアスタキサンチンとカンタキサンチンに関して測定したカロテノイド含量が有意に高かったことに言及することができる。実際、二種の画分の分析の結果、アスタキサンチン含量は９２および１２４μｇ／ｇ（脂質画分）、カンタキサンチン含量は２６２および７３４μｇ／ｇ（脂質画分）であった。従って、本発明の意図するところにおいて、上記のようなオキアミ抽出物はアスタキサンチンを少なくとも７５μｇ／ｇ、好ましくは少なくとも９０μｇ／ｇ含むといえる。またカンタキサンチンについては、少なくとも２５０μｇ／ｇ、好ましくは少なくとも２７０μｇ／ｇ含むといえる。
【００４７】
過酸化物価やアニシジン価が低いことも好ましいことであり、これは天然の酸化防止剤（即ちアスタキサンチンとカンタキサンチン）を高濃度で含有することによるものである。高濃度のカロテノイド類は、経皮的移行に関する特性を良好にすることから、これらの物質は、上記のようなオキアミ抽出物は薬学的または化粧品学的に好ましい特性を有することを示している。従って、オキアミ抽出物は薬物の経皮的送達のために好ましく用いうるものである。
【００４８】
表１８は、本発明の水性動物から脂質を抽出する方法における、最も好ましい態様を示す。
【００４９】
表１９は、本発明の方法によれば、固体画分における酵素活性が維持されることを示すものである。これを実証するため、アセトン、次いで酢酸エチルによる抽出を行った後の固形のオキアミ残渣に関して実験を行なった。
【００５０】
ｏ−フタルジアルデヒドを試薬として用い、遊離したアミノ基の量を分光光度法によって測定することにより、タンパク質加水分解活性を測定した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Bradford）法により測定した。
【００５１】
可溶性タンパク質を水で抽出し、限外濾過により得られた１０％乳漿タンパク質濃縮物（10 % lactoserum protein concentrate obtained by ultrafiltration）に添加した。これを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中３７℃でインキュベートし、最後にトリクロロ酢酸を添加し、Churchらの方法（1983, J Dairy Sci 66: 1219-1227）により上清中のＮＨ3基の量を測定した。
【００５２】
図１〜６は、E.pacificaの脂質の脂肪酸組成のクロマトグラムを示す。各々のクロマトグラムにおいて、２０：５脂肪酸と２２：６脂肪酸の比率が高い（海産及び淡水産動物油に特徴的である）ことが顕著であり、２つの明確なピークで表わされている。
【００５３】
動物種の違いによる中性脂質の脂質パターンの変異（図７〜１１）は、栄養源の違いによるものである。同一種内（例えばE.pacifica）では、脂質抽出方法を変えて得た脂質パターンの間に顕著な差異は見られない。リン脂質（図１２〜１６）については、正反対の結果が観察される。即ち、同一種において脂質パターンが同じにならないことから、脂質パターンの差異は脂質の抽出方法の違いによるものであることになる。サメから得られる脂質（上記の方法により抽出）と市販のタラ肝油（サンプルはカナダ国ケベック州のUniprixドラッグストアーズから入手可能）は、主として中性脂質からなり、リン脂質ではない。
【００５４】
溶媒の容量とインキュベーション時間がE.pacificaからのアセトンによる脂質抽出の効率に与える影響を、図１７と図１８にそれぞれ示す。比率１：６（ｗ/ｖ）において最適の収率となり、２時間でほぼ完全に抽出できる。第２抽出工程の実験にはエタノールを用いた。エタノールの容量を変えても収率が変わらないので、この溶媒の容量には臨界性が無いようである（図１９）が、図２０に示す結果から分かるように、エタノール中でのインキュベーション時間は少なくとも３０分は必要である。
【００５５】
本発明者らの一人であるアドリアン ボドワン博士は、種々のオキアミ脂質画分を摂取したが、副作用は見られなかった。
【００５６】
本発明を特定の態様について説明してきたが、この態様は様々なやり方で改変や改良が可能であることは当業者には明らかである。従って、本発明の範囲は、本願の特許請求の範囲の記載によって定義される以外には何ら限定されないことを理解されたい。
【００５７】
アセトンと酢酸エチルによる抽出を行なった後に得られるオキアミの残渣はタンパク質分解酵素活性を有する。タンパク質分解活性は、ｏ-フタルジアルデヒドを試薬として用いる分光光度法によりアミノ基の遊離を測定することによって調べた。タンパク質濃度はブラッドフォード法により測定した。
【００５８】
酵素源として、アセトンと酢酸エチルによる脂質抽出を行なった後に得られる残渣を用いた。可溶性タンパク質を水で抽出し、限外濾過により得られた１０％乳漿タンパク質濃縮物に加えた。
【００５９】
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中３７℃でインキュベートし、最後にトリクロロ酢酸を加えてから、上清中のＮＨ3基の量をChurchらの方法（1983）により測定した。
【００６０】
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【００６５】
【表６】
【００６６】
【表７】
【００６７】
【表８】
【００６８】
【表９】
【００６９】
【表１０】
【００７０】
【表１１】
【００７１】
【表１２】
【００７２】
【表１３】
【００７３】
【表１４】
【００７４】
【表１５】
【００７５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、乾燥オキアミから抽出（溶媒：クロロホルム−メタノール）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図２】図２は、乾燥オキアミから抽出（溶媒：アセトン）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図３】図３は、凍結オキアミから抽出（溶媒：アセトン）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図４】図４は、凍結オキアミから抽出（溶媒：エタノール）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図５】図５は、凍結オキアミから抽出（溶媒：ｔ−ブタノール）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図６】図６は、凍結オキアミから抽出（溶媒：酢酸エチル）された脂肪酸の気液クロマトグラムである。
【図７】図７は、カラヌス種（Calanus sp.）およびM.norvegicaの中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図８】図８は、オキアミE.pacificaの中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図９】図９は、サメM.schmittiの中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１０】図１０は、サメG.galeusの中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１１】図１１は、カスザメ（Angel shark）の中性脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１２】図１２は、カラヌス種（Calanus sp.）およびM.norvegicaのリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１３】図１３は、オキアミE.pacificaのリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１４】図１４は、サメM.schmittiのリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１５】図１５は、サメG.galeusのリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１６】図１６は、カスザメ（Angel shark）のリン脂質の薄層クロマトグラムである。
【図１７】図１７は、脂質抽出（原料：E.pacifica）に対するアセトン使用量の影響を示すグラフである。
【図１８】図１８は、脂質抽出（原料：E.pacifica）に対するアセトン中でのインキュベーション時間の影響を示すグラフである。
【図１９】図１９は、脂質抽出（原料：E.pacifica）に対するエタノール使用量の影響を示すグラフである。
【図２０】図２０は、脂質抽出（原料：T. raschii）に対するエタノール中でのインキュベーション時間の影響を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階（ａ）〜（ｆ）を含むことを特徴とする、海産および淡水産動物由来の原料から、該原料中に存在する脂質をまとめて含有する、リン脂質含有脂質画分を抽出する方法。
（ａ）海産または淡水産動物由来の原料をケトン溶媒中に入れて、該原料から可溶性脂質画分の抽出を行うことにより、第一の液体成分および第一の固体成分を得、
（ｂ）該第一の液体成分を該第一の固体成分から分離し、
（ｃ）段階（ｂ）で分離された該第一の液体成分に含まれる該ケトン溶媒を留去することにより、油相を第一のリン脂質含有脂質画分として回収し、
（ｄ）該第一の固体成分をアルコール、酢酸エステルおよびアセトンよりなる群から選ばれる有機溶媒中に入れて、該第一の固体成分中に残存する可溶性脂質画分の抽出を行うことにより、第二の液体成分および第二の固体成分を得、
（ｅ）該第二の液体成分を該第二の固体成分から分離し、
（ｆ）段階（ｅ）で分離された該第二の液体成分に含まれる該有機溶媒を留去することにより、油相を第二のリン脂質含有脂質画分として回収する。
【請求項２】
段階（ａ）で行う抽出を、該原料の磨砕後に撹拌下で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｄ）で行う抽出を、該原料の磨砕後に撹拌下で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階（ａ）および（ｄ）を不活性ガス雰囲気下で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
段階（ｂ）および（ｅ）を濾過、遠心分離、沈降のいずれかにより行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
段階（ｃ）および（ｆ）を減圧下での蒸発、フラッシュ蒸発、噴霧乾燥のいずれかにより行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
段階（ｂ）の後、段階（ｃ）に入る前に、該第一の固体成分を該ケトン溶媒で洗浄し、得られた洗液を段階（ｂ）で得られた該第一の液体成分に添加することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
段階（ｅ）の後、段階（ｆ）に入る前に、該第二の固体成分を、段階（ｄ）において用いられた該有機溶媒で洗浄することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
段階（ａ）に入る前に、該原料を細分することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
段階（ａ）および（ｂ）を、該ケトン溶媒の温度を５℃またはそれ以下として行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該原料が動物プランクトンであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該動物プランクトンがオキアミであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該動物プランクトンがカラヌスであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該原料が魚類であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
分離した固体成分が回収され、該固体成分が活性な酵素を含有する脱水残渣からなることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
下記の段階（ａ）〜（ｆ）を含むことを特徴とする、海産および淡水産動物由来の原料から、該原料中に存在する脂質をまとめて含有する、リン脂質含有脂質画分を抽出する方法。
（ａ）海産または淡水産動物由来の原料をアセトン中に入れて、該原料から可溶性脂質画分の抽出を行うことにより、第一の液体成分および第一の固体成分を得、
（ｂ）該第一の液体成分を該第一の固体成分から分離し、
（ｃ）段階（ｂ）で分離された該第一の液体成分に含まれる該アセトンを留去することにより、油相を第一のリン脂質含有脂質画分として回収し、
（ｄ）該第一の固体成分をアルコール中に入れて、該第一の固体成分中に残存する可溶性脂質画分の抽出を行うことにより、第二の液体成分および第二の固体成分を得、
（ｅ）該第二の液体成分を該第二の固体成分から分離し、
（ｆ）段階（ｅ）で分離された該第二の液体成分に含まれる該有機溶媒を留去することにより、油相を第二のリン脂質含有脂質画分として回収する。
【請求項１７】
分離した固体成分が回収され、該固体成分が活性な酵素を含有する脱水残渣からなることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法により得られる、リン脂質含有脂質抽出物。
【請求項１９】
医療への適用、栄養補給食品としての適用、化粧品としての適用、魚類の養殖への適用および動物用飼料としての適用よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１８に記載のリン脂質含有脂質抽出物の用途。
【請求項２０】
医薬品、栄養補給食品、化粧品、魚類養殖用製品および動物用飼料よりなる群から選ばれる製品の製造における、請求項１８に記載のリン脂質含有脂質抽出物の用途。
【請求項２１】
該ケトン溶媒がアセトンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該有機溶媒がエタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノールおよび酢酸エステルよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該有機溶媒が酢酸エチルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該原料を平均粒子径が５ｍｍ以下に細分することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
下記の段階（ａ）〜（ｆ）を含むことを特徴とする、海産および淡水産動物由来の原料から、該原料中に存在する脂質をまとめて含有する、リン脂質含有脂質画分を抽出する方法。
（ａ）海産または淡水産動物由来の原料をケトン溶媒中に入れて、該原料から可溶性脂質画分の抽出を行うことにより、第一の液体成分および第一の固体成分を得、
（ｂ）該第一の液体成分を該第一の固体成分から分離し、
（ｃ）段階（ｂ）で分離された該第一の液体成分に含まれる該ケトン溶媒を留去することにより、油相を第一のリン脂質含有脂質画分として回収し、
（ｄ）該第一の固体成分をアルコール、酢酸エステルおよびアセトンよりなる群から選ばれる有機溶媒中に入れて、該第一の固体成分中に残存する可溶性脂質画分の抽出を行うことにより、第二の液体成分および第二の固体成分を得、
（ｅ）該第二の液体成分を該第二の固体成分から分離し、
（ｆ）段階（ｅ）で分離された該第二の液体成分に含まれる該有機溶媒を留去することにより、油相を第二のリン脂質含有脂質画分として回収する。
【請求項２】
段階（ａ）で行う抽出を、該原料の磨砕後に撹拌下で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｄ）で行う抽出を、該原料の磨砕後に撹拌下で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階（ａ）および（ｄ）を不活性ガス雰囲気下で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
段階（ｂ）および（ｅ）を濾過、遠心分離、沈降のいずれかにより行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
段階（ｃ）および（ｆ）を減圧下での蒸発、フラッシュ蒸発、噴霧乾燥のいずれかにより行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
段階（ｂ）の後、段階（ｃ）に入る前に、該第一の固体成分を該ケトン溶媒で洗浄し、得られた洗液を段階（ｂ）で得られた該第一の液体成分に添加することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
段階（ｅ）の後、段階（ｆ）に入る前に、該第二の固体成分を、段階（ｄ）において用いられた該有機溶媒で洗浄することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
段階（ａ）に入る前に、該原料を細分することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
段階（ａ）および（ｂ）を、該ケトン溶媒の温度を５℃またはそれ以下として行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該原料が動物プランクトンであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該動物プランクトンがオキアミであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該動物プランクトンがカラヌスであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該原料が魚類であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
分離した固体成分が回収され、該固体成分が活性な酵素を含有する脱水残渣からなることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
下記の段階（ａ）〜（ｆ）を含むことを特徴とする、海産および淡水産動物由来の原料から、該原料中に存在する脂質をまとめて含有する、リン脂質含有脂質画分を抽出する方法。
（ａ）海産または淡水産動物由来の原料をアセトン中に入れて、該原料から可溶性脂質画分の抽出を行うことにより、第一の液体成分および第一の固体成分を得、
（ｂ）該第一の液体成分を該第一の固体成分から分離し、
（ｃ）段階（ｂ）で分離された該第一の液体成分に含まれる該アセトンを留去することにより、油相を第一のリン脂質含有脂質画分として回収し、
（ｄ）該第一の固体成分をアルコール中に入れて、該第一の固体成分中に残存する可溶性脂質画分の抽出を行うことにより、第二の液体成分および第二の固体成分を得、
（ｅ）該第二の液体成分を該第二の固体成分から分離し、
（ｆ）段階（ｅ）で分離された該第二の液体成分に含まれる該有機溶媒を留去することにより、油相を第二のリン脂質含有脂質画分として回収する。
【請求項１７】
分離した固体成分が回収され、該固体成分が活性な酵素を含有する脱水残渣からなることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法により得られる、リン脂質含有脂質抽出物。
【請求項１９】
医療への適用、栄養補給食品としての適用、化粧品としての適用、魚類の養殖への適用および動物用飼料としての適用よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１８に記載のリン脂質含有脂質抽出物の用途。
【請求項２０】
医薬品、栄養補給食品、化粧品、魚類養殖用製品および動物用飼料よりなる群から選ばれる製品の製造における、請求項１８に記載のリン脂質含有脂質抽出物の用途。
【請求項２１】
該ケトン溶媒がアセトンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該有機溶媒がエタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノールおよび酢酸エステルよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該有機溶媒が酢酸エチルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該原料を平均粒子径が５ｍｍ以下に細分することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００８−１５０５８６（Ｐ２００８−１５０５８６Ａ）
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２８５９８０（Ｐ２００７−２８５９８０）
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【分割の表示】特願２０００−５７７２６１（Ｐ２０００−５７７２６１）の分割
【原出願日】平成１１年１０月２１日（１９９９．１０．２１）
【出願人】（５０１１６１３７６）シャーブルック大学 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【分割の表示】特願２０００−５７７２６１（Ｐ２０００−５７７２６１）の分割
【原出願日】平成１１年１０月２１日（１９９９．１０．２１）
【出願人】（５０１１６１３７６）シャーブルック大学 (1)
【Ｆターム（参考）】
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