海産魚のノカルジア症に対するＤＮＡワクチン及びＢＣＧワクチン
【課題】海産魚のノカルジア症に対する有効なワクチンを提供する。
【解決手段】前記ワクチンは、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを含む魚類用DNAワクチン、BCGワクチン、又はそれらの混合ワクチンである。
【解決手段】前記ワクチンは、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを含む魚類用DNAワクチン、BCGワクチン、又はそれらの混合ワクチンである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノカルジア・セリオレ（Nocardia seriolae）の魚類への感染症に対する防御免疫を誘導するためのDNAワクチンまたは弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）及びそれらの混合ワクチンに関する。
本明細書における「ノカルジア・セリオレ症」とは、ノカルジア・セリオレの感染により引き起こされるノカルジア症を意味し、従って、ブリ属（ブリ、カンパチ、ヒラマサ）において発症したノカルジア症が含まれるだけでなく、ブリ属以外のスズキ目（マダイ、スズキ等）又はカレイ目（ヒラメ、カレイ等）に属する魚種等において発症したノカルジア症が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
魚介類を代表とする多くの水生生物の養殖産業において、閉鎖系である養殖領域でのウイルス性疾病及び細菌性疾病は、個体が高密度に存在していることから、それらの感染の影響は大きく、養殖産業において深刻な問題となっている。
ノカルジア症は、毎年8月から11月頃発生する。いったん発生すると終息まで長期間を要し、翌年の2月まで続くことがある（非特許文献１）。
ノカルジア症の原因菌はノカルジア・セリオレ（Nocardia seriolae）である。本菌は放線菌に分類され、弱抗酸性、グラム陽性の分岐する細菌である。ノカルジア症の病徴発現には2つの型が知られている。それらは躯幹に膿瘍や結節が形成される躯幹結節型と鰓に結節が形成される鰓結節型である。後者は冬季に多発する傾向にある。躯幹結節型では脾臓、腎臓に粟粒状の結節が形成されるのが特徴であるが、多くの場合、心臓、鰾、鰓などにも形成される。また、心臓の結節や鰾内部にはかさぶた様の病巣が見られることがある。本症は１歳以上のブリに発生することが多く、慢性的病気である（非特許文献１）。
【０００３】
ほとんどの魚介類用ワクチンが細菌に対して開発されている。しかし、細菌に対するワクチンでもビブリオ症、レンサ球菌症、類結節症等に対するワクチン（特許文献１及び特許文献２）が開発されているのみでノカルジア症に対するワクチンは開発されていない。
【０００４】
海産魚類の感染症の予防又は治療には、一部の疾病でワクチンが使用されている。これらのワクチンはホルマリン不活化ワクチン（ビブリオ症、レンサ球菌症、マダイイリドウイルス症、類結節症）である。また、その他の産業動物には不活化ワクチン以外にトキソイド（破傷風、ジフテリアなど）、弱毒ワクチン（BCG、ポリオなど）、遺伝子組換えワクチン（B型肝炎ウイルスなど）などがある。不活化ワクチン及び外毒素を無毒化したトキソイドは、これらに対する抗体を誘導する比較的安全なワクチンである。遺伝子組換えワクチンは、不活化ワクチンと比較すると、不純物を含まないので、より安全なワクチンと考えられている。
【０００５】
しかしながら、これらのワクチンにおいて抗体産生は誘導することができるが、細胞性免疫は誘導されにくいのが欠点である。また、不活化ワクチン及び弱毒ワクチンは、抗原となる病原体を産業的には大量に得ることが必要であり、大量培養方法の確立、適当な細胞の確保が必須である。更に、弱毒ワクチンで獲得した免疫効果は、長期間維持される場合が多いが、一方で副作用、危険性が指摘されている。不活化ワクチン及び遺伝子組換えワクチンは、抗原の持続性が宿主内において短いと考えられており、アジュバントなどを必要とするものが多い。これら従来型のワクチンは製造から被検体に接種するまでの間、冷蔵保存する必要があるため、コストの増加と効力の低下が生じる問題点があった。
【０００６】
最近、ワクチンの研究開発が進み、免疫原性タンパク質をコードするプラスミドDNAの投与をすることにより、免疫誘発をもたらす新しいワクチン種（DNAワクチン）が開発され、次に述べるような従来型ワクチンの不備が改善されてきている。すなわち、DNAワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞性免疫を強力に誘導できるので、感染症に対する防御能を賦与することが可能となること、また、高度に純化できること、室温又は高温下でも安定であり、冷蔵保存は必須でなく長期間の貯蔵が可能であること、遺伝子工学的手法によりDNAワクチンの迅速な改良がし易いこと、及びワクチン開発に費やす時間の短縮などの利点がある。
【０００７】
ラブドウイルス（Rhabdovirus）の構成タンパク質のグリコプロテインをコードしている遺伝子を筋肉に注射することによって、ニジマスおよびヒラメの免疫応答を刺激することが知られている（非特許文献２）。また、ニジマスおよびヒラメについてはDNAワクチンの報告もある（非特許文献３）。
しかし、ノカルジア症に対するDNAワクチンの報告はない。
【０００８】
一方、BCGワクチンはウシ型結核菌の弱毒株（Mycobacterium bovis BCG）の弱毒ワクチンである。本菌はノカルジア（Nocardia）属に近縁の菌種である。BCGの魚類のノカルジア症に対する感染防御能について検討した報告はない。
【０００９】
また、DNAワクチンとBCGを混合した報告もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０６８０７７号公報
【特許文献２】特開２００６−１８４９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】畑井喜司雄 小川和夫 監修，「新魚病図鑑」,（緑書房），２００６年，ｐ．１４７
【非特許文献２】ピー・ボウディノット（Ｐ．Ｂｏｕｄｉｎｏｔ）ら，「ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」,（米国），１９９８年，２４９巻，ｐ．２９７−３０６
【非特許文献３】マクラウクラン（McLauchlan）ら，「フィッシュ・アンド・シェルフィッシュ・イムノロジー（Fish and shellfish Immunology）」,（英国），２００３年，１５巻，ｐ．３９−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、海産魚類のノカルジア症に対する防御免疫を誘導するための魚類用DNAワクチン、弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）又はそれらの混合ワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、海産魚のノカルジア症に対する有効なワクチンを鋭意研究した結果、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（fibronectin-binding protein A）をコードする遺伝子を有するプラスミドDNA（CMV-fbpA）またはBCGをそれぞれ単独で、または混合してヒラメに接種したところ、海産魚のノカルジア症に対する免疫効果を有すること、及び免疫関連遺伝子の発現量が増加することを見出し、本発明が完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、
１．ノカルジア属（Nocardia）又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）に由来する、ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原を含むことを特徴とする、魚類用ワクチン、
２．ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、魚類用DNAワクチン、
３．前記免疫原性ポリペプチドが、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（fibronectin-binding protein A）又はその部分断片である、上記２に記載の魚類用DNAワクチン、
４．前記ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片である、上記３に記載の魚類用DNAワクチン、
５．前記免疫原性ポリペプチドが、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片である、上記２に記載の魚類用DNAワクチン、
６．前記ヌクレオチド配列が、（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列である、上記２に記載の魚類用DNAワクチン、
７．ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）に由来することを特徴とする、魚類用弱毒ワクチン、
８．ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、BCGである、上記７に記載の魚類用弱毒ワクチン、
９．上記２〜６のいずれかに記載の魚類用DNAワクチンと、上記７又は８に記載の魚類用弱毒ワクチンとを含む、混合ワクチン、
１０．前記魚類がスズキ目又はカレイ目に属する魚である、上記１〜９のいずれかに記載のワクチン、
１１．上記１〜１０のいずれかに記載のワクチンを魚に投与することを特徴とする、海産魚類のノカルジア症の予防又は治療方法、
１２．上記１〜１０のいずれかに記載のワクチンの、海産魚類のノカルジア症に対する免疫応答の誘発への使用、
１３．（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、及び（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチドからなる群から選んだポリペプチド、並びに
１４．（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、及び（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる群から選んだヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
に関するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の魚類用DNAワクチン、弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）又はそれらの混合ワクチンによれば、ノカルジア・セリオレによるノカルジア症に対する免疫能を付与することができる。より詳細には、本発明の魚類用DNAワクチン、弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）又はそれらの混合ワクチンによれば、ノカルジア・セリオレの感染症、あるいは、ノカルジア・セリオレの感染に起因するノカルジア症に対する免疫応答（体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を含む）を誘導することができるので、ノカルジア・セリオレの感染の予防又は治療、あるいは、前記ノカルジア症の予防又は治療に有効である。例えば、本発明の魚類用DNAワクチンの有効成分として用いることのできるCMV-fbpA、BCG及びそれらの混合は、海産魚でのノカルジア感染防御試験の結果から、DNAワクチンの有効成分として有効であり、海産魚でのノカルジア症ウイルスの感染を予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ノカルジア（4.0×105 CFU/魚）攻撃後の累積死亡率に関して、CMV-fbpA単独処理、BCG単独処理、又はCMV-fbpA及びBCG混合処理によるヒラメの累積死亡率の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の魚類用DNAワクチンは、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA構築物である限り、特に限定されるものではないが、本発明の魚類用DNAワクチンには、例えば、
（ａ）ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は
（ｂ）前記DNA（ａ）を含む発現ベクター
が含まれる。前記DNA（ａ）は、免疫原性ポリペプチドの発現に必要な各種の調節配列を更に含むことができ、前記発現ベクター（ｂ）も、前記調節配列を含むことができる。
本明細書において「ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチド」とは、ノカルジア・セリオレに対する免疫（体液性免疫及び細胞性免疫を含む）を生体内で誘導することのできるポリペプチドを意味する。
【００１８】
ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドとしては、ノカルジア・セリオレに対する免疫（体液性免疫及び細胞性免疫を含む）を生体内で誘導することができるポリペプチドである限り、特に限定されるものではない。前記免疫原性ポリペプチドとしては、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａにコードされるポリペプチド又はその部分断片が好ましく、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片がより好ましい。
【００１９】
また、前記免疫原性ポリペプチドとしては、更に、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上（好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上）であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又は前記（１）〜（３）のポリペプチドの部分断片を挙げることができる。
【００２０】
本明細書において、改変ポリペプチドとは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上（例えば、１〜数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸の改変（例えば、欠失、置換、及び／又は付加）が生じたタンパク質であって、依然として本発明が適用される魚類に対して免疫を付与することのできるものを意味する。
【００２１】
また、本明細書において、アミノ酸配列における相同性とは、２種類のアミノ酸配列をコンピュータ解析ソフト（Genetyx；ゼネテックス社）にて比較解析し、同一種のアミノ酸が同じ位置に存在する場合にアミノ酸が２種類の配列で同一であるとして算出した同一性を意味する。
【００２２】
本発明に用いる、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列としては、これまで挙げた各免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挙げることができ、例えば、ノカルジア属（Nocardia）又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）に属する細菌（特には、ノカルジア・セリオレ）の各構造タンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、前記改変ポリペプチド、若しくは前記相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片をコードするヌクレオチド配列を挙げることができる。
【００２３】
前記ヌクレオチド配列としては、（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列が好ましい。なお、本明細書において、ヌクレオチド配列における相同性とは、２種類のヌクレオチド配列をコンピュータ解析ソフト（Genetyx）にて比較解析し、同一種のヌクレオチドが同じ位置に存在する場合にヌクレオチドが２種類の配列で同一であるとして算出した値を意味する。また、前記部分配列の長さは、その部分ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが、ノカルジア・セリオレに対する免疫（体液性免疫及び細胞性免疫を含む）を生体内で誘導することができる限り、特に限定されるものではない。
【００２４】
また、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであっても良く、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものでもよい。
【００２５】
本発明に用いる免疫原性ポリペプチド（例えば、主要キャプシッドタンパク質）をコードするヌクレオチド配列は、例えば、ノカルジア属又はマイコバクテリウム属に属する細菌、具体的にはノカルジア・セリオレから得ることができる。本発明に用いる前記ヌクレオチド配列の典型的な取得方法としては、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なDNAプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
【００２６】
本発明に用いる発現ベクターは、魚類の細胞内で発現可能なベクターである限り、特に限定されるものではない。本発明に用いる発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、前記発現ベクターは、宿主に導入されたとき、その宿主のゲノム中に取り込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明に用いることのできる発現ベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００２７】
本発明で用いることのできる転写調節配列としては、例えば、構成プロモーター、誘導性又は調節性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発現されている抗原の遺伝子由来のプロモーター等が挙げられるが、魚類の細胞内で発現可能である限り、特にそれらに限定されない。構成プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）由来のプロモーター配列、又はラウス肉腫ウイルス（RSV）、シミアンウイルス−４０（SV-40）、筋βアクチンプロモーター、又は単純ヘルペスウイルス（HSV）などの強力プロモーター等が挙げられる。組織特異的プロモーターとしては、例えば、チミヂンキナーゼプロモーター等が挙げられる。誘導性又は調節性プロモーターとしては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、lacオペロン配列の制御下にあるプロモーター、又は亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターを挙げることができる。前記転写調節配列は、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、操作可能に（すなわち、前記ヌクレオチド配列の発現を調節することができるように）結合させることができる。
【００２８】
前記調節配列は、プロモーター（例えば、前記誘導性又は構成性プロモーター）DNA配列を含む発現制御配列を含むことができ、所望により、更に、エンハンサー要素、転写又はポリアデニル化シグナル［例えば、シミアンウイルス−４０（SV-40）又はウシ成長ホルモン由来］のスプライシングのためのイントロン配列、又はCpGモチーフとして知られている免疫刺激DNA配列のうち、１つ若しくはそれ以上のコピーを含むことができる。
【００２９】
また、発現ベクターは、所望により、例えば、細菌複製起点配列、あるいは、選別させるための抗生物質耐性（例えば、カナマイシンなど）遺伝子又は非抗生物質耐性遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子など）等の選択性マーカーを含むことができる。
【００３０】
非メチル化CpGヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、免疫系を活性化することが知られている（A. Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549）。フランキング配列に依存して、或るCpGモチーフはB細胞又はT細胞応答に対してより免疫刺激的であり、優先的にある種を刺激する。DNA発現ベクターにおけるCpGモチーフのコピーは、発現タンパク質に対する免疫応答を誘発するアジュバントとして作用する。CpGモチーフ、すなわち、特異化された配列内のCpGジヌクレオチドを含むDNA伸長部は、長さが５〜４０塩基対程度から選ぶことができる。複数のCpGモチーフが、発現ベクターの非コード領域に挿入されてもよい。体液性応答が所望であるとき、好ましいCpGモチーフはCD8+ T細胞応答を刺激することが知られているサイトカインの分泌を刺激するCpGモチーフである。
【００３１】
本発明を適応することができる魚類としては、ノカルジア・セリオレが感染する可能性のある魚類である限り、特に限定されるものではないが、例えば、スズキ目に属する魚種（ブリ、カンパチ又はスズキ等）又はカレイ目に属する魚種（ヒラメ等）等が挙げられる。
【００３２】
DNAワクチンの接種法は、例えば、経口投与、筋肉内注射、腹腔内注射、遺伝子銃を用いた投与及び液浸が挙げられるが、好ましくは筋肉内注射、遺伝子銃を用いた投与である。遺伝子銃を用いた投与とは、プラスミドを1μm程の大きさの金粒子にコーティングし、高圧ヘリウムガスを用い、専用の器具で被検体の皮膚、細胞又は組織に空気銃の要領で撃ち込む方法である。この遺伝子銃による投与は、筋肉内注射と比較し、100〜1000分の1のDNA量で、同等の免疫効果を挙げることができる点、筋肉内注射と比較し再現性に優れている点などの優れた特徴を有している。
【００３３】
また、アジュバントは、免疫系を刺激して抗原に対する免疫反応を高めるものであり、主にワクチンに補助剤として添加される。代表的なアジュバントとしては、例えば、アルミニウム化合物、ポリヌクレオチド又は細菌の菌体成分などが知られているが、これらの中には本発明に適用するには充分な効果が得られないものも多い。特に、アジュバントの作用は抗原物質に広く有効であるため、抗原に含まれる不純物の抗原刺激性を増強したり、有害な副作用を生ずる危険もあり、使用する抗原の純度に充分な配慮をする必要があるなどの問題がある。そのような中で、例えばIL-1βはアジュバントとして有効であることが報告されている（J. Y. Scheerlinck, Genetic adjuvants for DNA Vaccine, 19, 2647-2656, 2001）。本発明においては、魚類（例えばヒラメなど）の体内で発現可能なようにIL-1β遺伝子を挿入したプラスミドを作製し、本発明のワクチンとともに魚類に接種することができる。
【００３４】
免疫機構は、様々な役割を担った細胞が相互に機能調節を行いながら、多様な生理機能を発揮している。生体防御に重要な役割を担っている因子であるT細胞及びB細胞の細胞表面上に存在しているT細胞抗原レセプター（TCR）、主要組織適合性複合体（MHC）、又は免疫グロブリン（Ig）の発現量を指標に、免疫システムの活性化を調べることが可能である。本発明においては、例えば、ブリのノカルジア症に対するDNAワクチンをブリに接種後、魚体内における生体防御機構の活性化について解析するため、例えば、TCR、MHC、及びIgの発現量の変化についてリアルタイムPCRを行い定量的に確認し、免疫システムの活性化を調べることができる。
【００３５】
リアルタイムPCRとは、PCRによる遺伝子の増幅の過程を蛍光検知装置により、リアルタイムで追跡し、そのPCR反応曲線をプロファイリングする検出技術である。検査対象の検体がPCRにより増幅された場合、指数増加カーブに到達するPCRサイクル数を検査すれば、正確なDNA量を計算することが可能となる。リアルタイムPCRには、例えば、Perkin-Elmer社製のTaqMan、BioRad社製のiCyclerを用い行うことができる。
【００３６】
リアルタイムPCRでは、リアルタイムPCR用（SG）及び標準DNA用（SG200）の二種類のプライマーを用いる。リアルタイムPCR用（SG）は、アンプリコンは短め（60〜100 bp）でGC含量が少なくなるよう設計する。3' UTR部分にプライマーを作製すると、比較的容易で、かつ正確に遺伝子特異的プライマーを設計することができる。また、ソフト（例えば、primer express；PEバイオシステムジャパン株式会社）を使ってコンピュータ上でも設計する方法もある。リアルタイムPCRで設計したプライマーの外側に標準DNA用プライマー（SG200）を設計する。遺伝子同士を比較したい場合、アンプリコンは揃えるのが望ましい。
【００３７】
標準DNAの調製は、まず測定したい遺伝子それぞれに対し特異的なプライマー（SG200）を用い、全量50μLのPCRをプラトーに達するまで反応させる（PCRは95℃で2分間処理後、次いで95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間を１サイクルとする処理を30回行う）。その後、PCR産物をカラム（例えば、Microcon-PCR Centrifugal Filter Devices；MILLIPORE社製）を用い余分なプライマーを除去し、濃度を測る。アボガドロ定数（1mol=6.022×1023 molecules）よりコピー数を算出する。次いで、PCR産物は21段階の希釈系列（コピー数1013〜10-7）を作り、内側に設計したプライマー（SG）を用いて再度PCRを行う。この際、増幅が指数関数的に起こる様、サイクル数は14サイクルで行う。このようにして得たPCR産物をアガロースゲル電気泳動し、バンドが全く見えなくなってからの5段階が指数関数的に増幅しているため、この5段階を標準DNAとして実際のリアルタイムPCRに用いる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
実施例１：抗原候補蛋白質ノカルジア・セリオレ由来フィブロネクチン結合タンパク質Ａ遺伝子の単離
（１）DNAワクチンの作製
ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａ［fibronectin-binding protein A（fbpA）］遺伝子をCMVプロモーターの下流に組み込んだ組換えプラスミドをDNAワクチンとして用いた。ノカルジア・セリオレfbpA遺伝子のアミノ酸コード領域をはさむように設計したPCRプライマー［フォワード：5’-GGGAAGCTTAACATGCGAGGCGATAGACGTCA-3’（配列番号３）、リバース：5’-GGGGGATCCGCCGATGTTCGTGGACAGGT-3’（配列番号４）］を用いてPCRを行い標的の配列を増幅した。次に、あらかじめプライマーの5’-側末端に付加させておいた制限酵素認識配列（フォワード：HindIII、リバース：BamHI）をそれぞれの酵素を用いて消化した後、CMVプロモーターを有する哺乳類用発現ベクターpcDNA3.1(+) myc-hisベクター（Invitrogen社）に挿入し、fbpA遺伝子のタンパク質発現プラスミド（CMV-fbpA）を作製した。これを大腸菌に形質転換し、培養することでCMV-fbpAを大量に得た。
【００４０】
実施例２：使用菌株の培養方法
弱毒ワクチン用のウシ型結核菌の弱毒株（Mycobacterium bovis BCG）の標準菌株（ヒト型結核菌青山Ｂ株）は1%小川培地に塗抹し、37℃で3週間培養したものを用いた。また、攻撃試験にはノカルジア症罹患ブリより単離されたノカルジア・セリオレを1%小川培地に塗抹し25℃で3週間培養したものを用いた。
【００４１】
実施例３：ワクチンの調製および接種
1%小川培地上に生育したウシ型結核菌の弱毒株をかきとりガラスホモジナイザーを用いリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中に分散させて、菌数が約1.0×108 CFU/mLとなるように調製したものをBCGワクチンとして用いた。また、CMV-fbpAを250μg/mLとなるようにPBSで希釈したものをDNAワクチンとして用いた。さらに、250μg/mLのCMV-fbpA DNAワクチン中にウシ型結核菌の弱毒株を約1.0×108 CFU/mLとなるように調製したものを混合ワクチンとして用いた。
体重約15g、体長約8cmのヒラメ稚魚の背筋に各ワクチンを100μL注射し、60Lの水槽で水温20℃のもと飼育し、免疫期間を4週間設けた。
【００４２】
実施例４：攻撃試験
1%小川培地上に生育したノカルジア・セリオレをかきとりガラスホモジナイザーを用いてPBS中に分散させ菌数が約4.0×105 CFU/mLとなるように調製し、それをワクチン接種魚の筋肉内に100μLずつ投与した。その後、免疫期間と同様の水槽で飼育し、攻撃開始後33日目までの累積死亡率を観察し記録した。
感染防御試験を行った区画は、次の通りである。
試験区1：(BCG 単独処理)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
試験区2：(BCG+CMV-fbpA 混合ワクチン処理)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
試験区3：(CMV-fbpA 単独処理)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
試験区4：(PBS 対照)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
試験区5：(CMVベクター 対照)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
【００４３】
その結果、試験区１、2、3、及び5は、それぞれ約42.9%、40.0%、50.0%、及び66.6%累積死亡率であるのに対して、PBS接種区の試験区4のそれは100%であった。ノカルジア・セリオレに対するCMV-fbpA、BCG、CMV-fbpA及びBCG混合の感染防御の有効性、すなわち、ワクチン効果が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のDNAワクチン、弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）、それらの混合ワクチンは、海産魚のノカルジア症の予防又は治療の用途に適用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列表の数字見出し<223>には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。
配列番号３の配列で表される塩基配列はフォワードプライマーであり、配列番号４の配列で表される塩基配列はリバースプライマーである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノカルジア・セリオレ（Nocardia seriolae）の魚類への感染症に対する防御免疫を誘導するためのDNAワクチンまたは弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）及びそれらの混合ワクチンに関する。
本明細書における「ノカルジア・セリオレ症」とは、ノカルジア・セリオレの感染により引き起こされるノカルジア症を意味し、従って、ブリ属（ブリ、カンパチ、ヒラマサ）において発症したノカルジア症が含まれるだけでなく、ブリ属以外のスズキ目（マダイ、スズキ等）又はカレイ目（ヒラメ、カレイ等）に属する魚種等において発症したノカルジア症が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
魚介類を代表とする多くの水生生物の養殖産業において、閉鎖系である養殖領域でのウイルス性疾病及び細菌性疾病は、個体が高密度に存在していることから、それらの感染の影響は大きく、養殖産業において深刻な問題となっている。
ノカルジア症は、毎年8月から11月頃発生する。いったん発生すると終息まで長期間を要し、翌年の2月まで続くことがある（非特許文献１）。
ノカルジア症の原因菌はノカルジア・セリオレ（Nocardia seriolae）である。本菌は放線菌に分類され、弱抗酸性、グラム陽性の分岐する細菌である。ノカルジア症の病徴発現には2つの型が知られている。それらは躯幹に膿瘍や結節が形成される躯幹結節型と鰓に結節が形成される鰓結節型である。後者は冬季に多発する傾向にある。躯幹結節型では脾臓、腎臓に粟粒状の結節が形成されるのが特徴であるが、多くの場合、心臓、鰾、鰓などにも形成される。また、心臓の結節や鰾内部にはかさぶた様の病巣が見られることがある。本症は１歳以上のブリに発生することが多く、慢性的病気である（非特許文献１）。
【０００３】
ほとんどの魚介類用ワクチンが細菌に対して開発されている。しかし、細菌に対するワクチンでもビブリオ症、レンサ球菌症、類結節症等に対するワクチン（特許文献１及び特許文献２）が開発されているのみでノカルジア症に対するワクチンは開発されていない。
【０００４】
海産魚類の感染症の予防又は治療には、一部の疾病でワクチンが使用されている。これらのワクチンはホルマリン不活化ワクチン（ビブリオ症、レンサ球菌症、マダイイリドウイルス症、類結節症）である。また、その他の産業動物には不活化ワクチン以外にトキソイド（破傷風、ジフテリアなど）、弱毒ワクチン（BCG、ポリオなど）、遺伝子組換えワクチン（B型肝炎ウイルスなど）などがある。不活化ワクチン及び外毒素を無毒化したトキソイドは、これらに対する抗体を誘導する比較的安全なワクチンである。遺伝子組換えワクチンは、不活化ワクチンと比較すると、不純物を含まないので、より安全なワクチンと考えられている。
【０００５】
しかしながら、これらのワクチンにおいて抗体産生は誘導することができるが、細胞性免疫は誘導されにくいのが欠点である。また、不活化ワクチン及び弱毒ワクチンは、抗原となる病原体を産業的には大量に得ることが必要であり、大量培養方法の確立、適当な細胞の確保が必須である。更に、弱毒ワクチンで獲得した免疫効果は、長期間維持される場合が多いが、一方で副作用、危険性が指摘されている。不活化ワクチン及び遺伝子組換えワクチンは、抗原の持続性が宿主内において短いと考えられており、アジュバントなどを必要とするものが多い。これら従来型のワクチンは製造から被検体に接種するまでの間、冷蔵保存する必要があるため、コストの増加と効力の低下が生じる問題点があった。
【０００６】
最近、ワクチンの研究開発が進み、免疫原性タンパク質をコードするプラスミドDNAの投与をすることにより、免疫誘発をもたらす新しいワクチン種（DNAワクチン）が開発され、次に述べるような従来型ワクチンの不備が改善されてきている。すなわち、DNAワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞性免疫を強力に誘導できるので、感染症に対する防御能を賦与することが可能となること、また、高度に純化できること、室温又は高温下でも安定であり、冷蔵保存は必須でなく長期間の貯蔵が可能であること、遺伝子工学的手法によりDNAワクチンの迅速な改良がし易いこと、及びワクチン開発に費やす時間の短縮などの利点がある。
【０００７】
ラブドウイルス（Rhabdovirus）の構成タンパク質のグリコプロテインをコードしている遺伝子を筋肉に注射することによって、ニジマスおよびヒラメの免疫応答を刺激することが知られている（非特許文献２）。また、ニジマスおよびヒラメについてはDNAワクチンの報告もある（非特許文献３）。
しかし、ノカルジア症に対するDNAワクチンの報告はない。
【０００８】
一方、BCGワクチンはウシ型結核菌の弱毒株（Mycobacterium bovis BCG）の弱毒ワクチンである。本菌はノカルジア（Nocardia）属に近縁の菌種である。BCGの魚類のノカルジア症に対する感染防御能について検討した報告はない。
【０００９】
また、DNAワクチンとBCGを混合した報告もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０６８０７７号公報
【特許文献２】特開２００６−１８４９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】畑井喜司雄 小川和夫 監修，「新魚病図鑑」,（緑書房），２００６年，ｐ．１４７
【非特許文献２】ピー・ボウディノット（Ｐ．Ｂｏｕｄｉｎｏｔ）ら，「ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」,（米国），１９９８年，２４９巻，ｐ．２９７−３０６
【非特許文献３】マクラウクラン（McLauchlan）ら，「フィッシュ・アンド・シェルフィッシュ・イムノロジー（Fish and shellfish Immunology）」,（英国），２００３年，１５巻，ｐ．３９−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、海産魚類のノカルジア症に対する防御免疫を誘導するための魚類用DNAワクチン、弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）又はそれらの混合ワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、海産魚のノカルジア症に対する有効なワクチンを鋭意研究した結果、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（fibronectin-binding protein A）をコードする遺伝子を有するプラスミドDNA（CMV-fbpA）またはBCGをそれぞれ単独で、または混合してヒラメに接種したところ、海産魚のノカルジア症に対する免疫効果を有すること、及び免疫関連遺伝子の発現量が増加することを見出し、本発明が完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、
１．ノカルジア属（Nocardia）又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）に由来する、ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原を含むことを特徴とする、魚類用ワクチン、
２．ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、魚類用DNAワクチン、
３．前記免疫原性ポリペプチドが、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（fibronectin-binding protein A）又はその部分断片である、上記２に記載の魚類用DNAワクチン、
４．前記ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片である、上記３に記載の魚類用DNAワクチン、
５．前記免疫原性ポリペプチドが、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片である、上記２に記載の魚類用DNAワクチン、
６．前記ヌクレオチド配列が、（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列である、上記２に記載の魚類用DNAワクチン、
７．ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）に由来することを特徴とする、魚類用弱毒ワクチン、
８．ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、BCGである、上記７に記載の魚類用弱毒ワクチン、
９．上記２〜６のいずれかに記載の魚類用DNAワクチンと、上記７又は８に記載の魚類用弱毒ワクチンとを含む、混合ワクチン、
１０．前記魚類がスズキ目又はカレイ目に属する魚である、上記１〜９のいずれかに記載のワクチン、
１１．上記１〜１０のいずれかに記載のワクチンを魚に投与することを特徴とする、海産魚類のノカルジア症の予防又は治療方法、
１２．上記１〜１０のいずれかに記載のワクチンの、海産魚類のノカルジア症に対する免疫応答の誘発への使用、
１３．（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、及び（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチドからなる群から選んだポリペプチド、並びに
１４．（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、及び（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる群から選んだヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
に関するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の魚類用DNAワクチン、弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）又はそれらの混合ワクチンによれば、ノカルジア・セリオレによるノカルジア症に対する免疫能を付与することができる。より詳細には、本発明の魚類用DNAワクチン、弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）又はそれらの混合ワクチンによれば、ノカルジア・セリオレの感染症、あるいは、ノカルジア・セリオレの感染に起因するノカルジア症に対する免疫応答（体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を含む）を誘導することができるので、ノカルジア・セリオレの感染の予防又は治療、あるいは、前記ノカルジア症の予防又は治療に有効である。例えば、本発明の魚類用DNAワクチンの有効成分として用いることのできるCMV-fbpA、BCG及びそれらの混合は、海産魚でのノカルジア感染防御試験の結果から、DNAワクチンの有効成分として有効であり、海産魚でのノカルジア症ウイルスの感染を予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ノカルジア（4.0×105 CFU/魚）攻撃後の累積死亡率に関して、CMV-fbpA単独処理、BCG単独処理、又はCMV-fbpA及びBCG混合処理によるヒラメの累積死亡率の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の魚類用DNAワクチンは、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA構築物である限り、特に限定されるものではないが、本発明の魚類用DNAワクチンには、例えば、
（ａ）ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は
（ｂ）前記DNA（ａ）を含む発現ベクター
が含まれる。前記DNA（ａ）は、免疫原性ポリペプチドの発現に必要な各種の調節配列を更に含むことができ、前記発現ベクター（ｂ）も、前記調節配列を含むことができる。
本明細書において「ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチド」とは、ノカルジア・セリオレに対する免疫（体液性免疫及び細胞性免疫を含む）を生体内で誘導することのできるポリペプチドを意味する。
【００１８】
ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドとしては、ノカルジア・セリオレに対する免疫（体液性免疫及び細胞性免疫を含む）を生体内で誘導することができるポリペプチドである限り、特に限定されるものではない。前記免疫原性ポリペプチドとしては、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａにコードされるポリペプチド又はその部分断片が好ましく、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片がより好ましい。
【００１９】
また、前記免疫原性ポリペプチドとしては、更に、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上（好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上）であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又は前記（１）〜（３）のポリペプチドの部分断片を挙げることができる。
【００２０】
本明細書において、改変ポリペプチドとは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上（例えば、１〜数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸の改変（例えば、欠失、置換、及び／又は付加）が生じたタンパク質であって、依然として本発明が適用される魚類に対して免疫を付与することのできるものを意味する。
【００２１】
また、本明細書において、アミノ酸配列における相同性とは、２種類のアミノ酸配列をコンピュータ解析ソフト（Genetyx；ゼネテックス社）にて比較解析し、同一種のアミノ酸が同じ位置に存在する場合にアミノ酸が２種類の配列で同一であるとして算出した同一性を意味する。
【００２２】
本発明に用いる、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列としては、これまで挙げた各免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挙げることができ、例えば、ノカルジア属（Nocardia）又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）に属する細菌（特には、ノカルジア・セリオレ）の各構造タンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、前記改変ポリペプチド、若しくは前記相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片をコードするヌクレオチド配列を挙げることができる。
【００２３】
前記ヌクレオチド配列としては、（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列が好ましい。なお、本明細書において、ヌクレオチド配列における相同性とは、２種類のヌクレオチド配列をコンピュータ解析ソフト（Genetyx）にて比較解析し、同一種のヌクレオチドが同じ位置に存在する場合にヌクレオチドが２種類の配列で同一であるとして算出した値を意味する。また、前記部分配列の長さは、その部分ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが、ノカルジア・セリオレに対する免疫（体液性免疫及び細胞性免疫を含む）を生体内で誘導することができる限り、特に限定されるものではない。
【００２４】
また、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであっても良く、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものでもよい。
【００２５】
本発明に用いる免疫原性ポリペプチド（例えば、主要キャプシッドタンパク質）をコードするヌクレオチド配列は、例えば、ノカルジア属又はマイコバクテリウム属に属する細菌、具体的にはノカルジア・セリオレから得ることができる。本発明に用いる前記ヌクレオチド配列の典型的な取得方法としては、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なDNAプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
【００２６】
本発明に用いる発現ベクターは、魚類の細胞内で発現可能なベクターである限り、特に限定されるものではない。本発明に用いる発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、前記発現ベクターは、宿主に導入されたとき、その宿主のゲノム中に取り込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明に用いることのできる発現ベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００２７】
本発明で用いることのできる転写調節配列としては、例えば、構成プロモーター、誘導性又は調節性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発現されている抗原の遺伝子由来のプロモーター等が挙げられるが、魚類の細胞内で発現可能である限り、特にそれらに限定されない。構成プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）由来のプロモーター配列、又はラウス肉腫ウイルス（RSV）、シミアンウイルス−４０（SV-40）、筋βアクチンプロモーター、又は単純ヘルペスウイルス（HSV）などの強力プロモーター等が挙げられる。組織特異的プロモーターとしては、例えば、チミヂンキナーゼプロモーター等が挙げられる。誘導性又は調節性プロモーターとしては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、lacオペロン配列の制御下にあるプロモーター、又は亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターを挙げることができる。前記転写調節配列は、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、操作可能に（すなわち、前記ヌクレオチド配列の発現を調節することができるように）結合させることができる。
【００２８】
前記調節配列は、プロモーター（例えば、前記誘導性又は構成性プロモーター）DNA配列を含む発現制御配列を含むことができ、所望により、更に、エンハンサー要素、転写又はポリアデニル化シグナル［例えば、シミアンウイルス−４０（SV-40）又はウシ成長ホルモン由来］のスプライシングのためのイントロン配列、又はCpGモチーフとして知られている免疫刺激DNA配列のうち、１つ若しくはそれ以上のコピーを含むことができる。
【００２９】
また、発現ベクターは、所望により、例えば、細菌複製起点配列、あるいは、選別させるための抗生物質耐性（例えば、カナマイシンなど）遺伝子又は非抗生物質耐性遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子など）等の選択性マーカーを含むことができる。
【００３０】
非メチル化CpGヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、免疫系を活性化することが知られている（A. Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549）。フランキング配列に依存して、或るCpGモチーフはB細胞又はT細胞応答に対してより免疫刺激的であり、優先的にある種を刺激する。DNA発現ベクターにおけるCpGモチーフのコピーは、発現タンパク質に対する免疫応答を誘発するアジュバントとして作用する。CpGモチーフ、すなわち、特異化された配列内のCpGジヌクレオチドを含むDNA伸長部は、長さが５〜４０塩基対程度から選ぶことができる。複数のCpGモチーフが、発現ベクターの非コード領域に挿入されてもよい。体液性応答が所望であるとき、好ましいCpGモチーフはCD8+ T細胞応答を刺激することが知られているサイトカインの分泌を刺激するCpGモチーフである。
【００３１】
本発明を適応することができる魚類としては、ノカルジア・セリオレが感染する可能性のある魚類である限り、特に限定されるものではないが、例えば、スズキ目に属する魚種（ブリ、カンパチ又はスズキ等）又はカレイ目に属する魚種（ヒラメ等）等が挙げられる。
【００３２】
DNAワクチンの接種法は、例えば、経口投与、筋肉内注射、腹腔内注射、遺伝子銃を用いた投与及び液浸が挙げられるが、好ましくは筋肉内注射、遺伝子銃を用いた投与である。遺伝子銃を用いた投与とは、プラスミドを1μm程の大きさの金粒子にコーティングし、高圧ヘリウムガスを用い、専用の器具で被検体の皮膚、細胞又は組織に空気銃の要領で撃ち込む方法である。この遺伝子銃による投与は、筋肉内注射と比較し、100〜1000分の1のDNA量で、同等の免疫効果を挙げることができる点、筋肉内注射と比較し再現性に優れている点などの優れた特徴を有している。
【００３３】
また、アジュバントは、免疫系を刺激して抗原に対する免疫反応を高めるものであり、主にワクチンに補助剤として添加される。代表的なアジュバントとしては、例えば、アルミニウム化合物、ポリヌクレオチド又は細菌の菌体成分などが知られているが、これらの中には本発明に適用するには充分な効果が得られないものも多い。特に、アジュバントの作用は抗原物質に広く有効であるため、抗原に含まれる不純物の抗原刺激性を増強したり、有害な副作用を生ずる危険もあり、使用する抗原の純度に充分な配慮をする必要があるなどの問題がある。そのような中で、例えばIL-1βはアジュバントとして有効であることが報告されている（J. Y. Scheerlinck, Genetic adjuvants for DNA Vaccine, 19, 2647-2656, 2001）。本発明においては、魚類（例えばヒラメなど）の体内で発現可能なようにIL-1β遺伝子を挿入したプラスミドを作製し、本発明のワクチンとともに魚類に接種することができる。
【００３４】
免疫機構は、様々な役割を担った細胞が相互に機能調節を行いながら、多様な生理機能を発揮している。生体防御に重要な役割を担っている因子であるT細胞及びB細胞の細胞表面上に存在しているT細胞抗原レセプター（TCR）、主要組織適合性複合体（MHC）、又は免疫グロブリン（Ig）の発現量を指標に、免疫システムの活性化を調べることが可能である。本発明においては、例えば、ブリのノカルジア症に対するDNAワクチンをブリに接種後、魚体内における生体防御機構の活性化について解析するため、例えば、TCR、MHC、及びIgの発現量の変化についてリアルタイムPCRを行い定量的に確認し、免疫システムの活性化を調べることができる。
【００３５】
リアルタイムPCRとは、PCRによる遺伝子の増幅の過程を蛍光検知装置により、リアルタイムで追跡し、そのPCR反応曲線をプロファイリングする検出技術である。検査対象の検体がPCRにより増幅された場合、指数増加カーブに到達するPCRサイクル数を検査すれば、正確なDNA量を計算することが可能となる。リアルタイムPCRには、例えば、Perkin-Elmer社製のTaqMan、BioRad社製のiCyclerを用い行うことができる。
【００３６】
リアルタイムPCRでは、リアルタイムPCR用（SG）及び標準DNA用（SG200）の二種類のプライマーを用いる。リアルタイムPCR用（SG）は、アンプリコンは短め（60〜100 bp）でGC含量が少なくなるよう設計する。3' UTR部分にプライマーを作製すると、比較的容易で、かつ正確に遺伝子特異的プライマーを設計することができる。また、ソフト（例えば、primer express；PEバイオシステムジャパン株式会社）を使ってコンピュータ上でも設計する方法もある。リアルタイムPCRで設計したプライマーの外側に標準DNA用プライマー（SG200）を設計する。遺伝子同士を比較したい場合、アンプリコンは揃えるのが望ましい。
【００３７】
標準DNAの調製は、まず測定したい遺伝子それぞれに対し特異的なプライマー（SG200）を用い、全量50μLのPCRをプラトーに達するまで反応させる（PCRは95℃で2分間処理後、次いで95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間を１サイクルとする処理を30回行う）。その後、PCR産物をカラム（例えば、Microcon-PCR Centrifugal Filter Devices；MILLIPORE社製）を用い余分なプライマーを除去し、濃度を測る。アボガドロ定数（1mol=6.022×1023 molecules）よりコピー数を算出する。次いで、PCR産物は21段階の希釈系列（コピー数1013〜10-7）を作り、内側に設計したプライマー（SG）を用いて再度PCRを行う。この際、増幅が指数関数的に起こる様、サイクル数は14サイクルで行う。このようにして得たPCR産物をアガロースゲル電気泳動し、バンドが全く見えなくなってからの5段階が指数関数的に増幅しているため、この5段階を標準DNAとして実際のリアルタイムPCRに用いる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
実施例１：抗原候補蛋白質ノカルジア・セリオレ由来フィブロネクチン結合タンパク質Ａ遺伝子の単離
（１）DNAワクチンの作製
ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａ［fibronectin-binding protein A（fbpA）］遺伝子をCMVプロモーターの下流に組み込んだ組換えプラスミドをDNAワクチンとして用いた。ノカルジア・セリオレfbpA遺伝子のアミノ酸コード領域をはさむように設計したPCRプライマー［フォワード：5’-GGGAAGCTTAACATGCGAGGCGATAGACGTCA-3’（配列番号３）、リバース：5’-GGGGGATCCGCCGATGTTCGTGGACAGGT-3’（配列番号４）］を用いてPCRを行い標的の配列を増幅した。次に、あらかじめプライマーの5’-側末端に付加させておいた制限酵素認識配列（フォワード：HindIII、リバース：BamHI）をそれぞれの酵素を用いて消化した後、CMVプロモーターを有する哺乳類用発現ベクターpcDNA3.1(+) myc-hisベクター（Invitrogen社）に挿入し、fbpA遺伝子のタンパク質発現プラスミド（CMV-fbpA）を作製した。これを大腸菌に形質転換し、培養することでCMV-fbpAを大量に得た。
【００４０】
実施例２：使用菌株の培養方法
弱毒ワクチン用のウシ型結核菌の弱毒株（Mycobacterium bovis BCG）の標準菌株（ヒト型結核菌青山Ｂ株）は1%小川培地に塗抹し、37℃で3週間培養したものを用いた。また、攻撃試験にはノカルジア症罹患ブリより単離されたノカルジア・セリオレを1%小川培地に塗抹し25℃で3週間培養したものを用いた。
【００４１】
実施例３：ワクチンの調製および接種
1%小川培地上に生育したウシ型結核菌の弱毒株をかきとりガラスホモジナイザーを用いリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中に分散させて、菌数が約1.0×108 CFU/mLとなるように調製したものをBCGワクチンとして用いた。また、CMV-fbpAを250μg/mLとなるようにPBSで希釈したものをDNAワクチンとして用いた。さらに、250μg/mLのCMV-fbpA DNAワクチン中にウシ型結核菌の弱毒株を約1.0×108 CFU/mLとなるように調製したものを混合ワクチンとして用いた。
体重約15g、体長約8cmのヒラメ稚魚の背筋に各ワクチンを100μL注射し、60Lの水槽で水温20℃のもと飼育し、免疫期間を4週間設けた。
【００４２】
実施例４：攻撃試験
1%小川培地上に生育したノカルジア・セリオレをかきとりガラスホモジナイザーを用いてPBS中に分散させ菌数が約4.0×105 CFU/mLとなるように調製し、それをワクチン接種魚の筋肉内に100μLずつ投与した。その後、免疫期間と同様の水槽で飼育し、攻撃開始後33日目までの累積死亡率を観察し記録した。
感染防御試験を行った区画は、次の通りである。
試験区1：(BCG 単独処理)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
試験区2：(BCG+CMV-fbpA 混合ワクチン処理)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
試験区3：(CMV-fbpA 単独処理)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
試験区4：(PBS 対照)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
試験区5：(CMVベクター 対照)＋4.0×105 CFUノカルジア・セリオレ／ヒラメ１尾
【００４３】
その結果、試験区１、2、3、及び5は、それぞれ約42.9%、40.0%、50.0%、及び66.6%累積死亡率であるのに対して、PBS接種区の試験区4のそれは100%であった。ノカルジア・セリオレに対するCMV-fbpA、BCG、CMV-fbpA及びBCG混合の感染防御の有効性、すなわち、ワクチン効果が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のDNAワクチン、弱毒ワクチン（特にBCGワクチン）、それらの混合ワクチンは、海産魚のノカルジア症の予防又は治療の用途に適用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列表の数字見出し<223>には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。
配列番号３の配列で表される塩基配列はフォワードプライマーであり、配列番号４の配列で表される塩基配列はリバースプライマーである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノカルジア属（Nocardia）又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）に由来する、ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原を含むことを特徴とする、魚類用ワクチン。
【請求項２】
ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、魚類用DNAワクチン。
【請求項３】
前記免疫原性ポリペプチドが、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａ又はその部分断片である、請求項２に記載の魚類用DNAワクチン。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片である、請求項３に記載の魚類用DNAワクチン。
【請求項５】
前記免疫原性ポリペプチドが、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片である、請求項２に記載の魚類用DNAワクチン。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列である、請求項２に記載の魚類用DNAワクチン。
【請求項７】
ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）に由来することを特徴とする、魚類用弱毒ワクチン。
【請求項８】
ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、BCGである、請求項７に記載の魚類用弱毒ワクチン。
【請求項９】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の魚類用DNAワクチンと、請求項７又は８に記載の魚類用弱毒ワクチンとを含む、混合ワクチン。
【請求項１０】
前記魚類がスズキ目又はカレイ目に属する魚である、請求項１〜９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチンを魚に投与することを特徴とする、海産魚類のノカルジア症の予防又は治療方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチンの、海産魚類のノカルジア症に対する免疫応答の誘発への使用。
【請求項１３】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、及び（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチドからなる群から選んだポリペプチド。
【請求項１４】
（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、及び（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる群から選んだヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１】
ノカルジア属（Nocardia）又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）に由来する、ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原を含むことを特徴とする、魚類用ワクチン。
【請求項２】
ノカルジア・セリオレに対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA、又は前記DNAを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、魚類用DNAワクチン。
【請求項３】
前記免疫原性ポリペプチドが、ノカルジア・セリオレのフィブロネクチン結合タンパク質Ａ又はその部分断片である、請求項２に記載の魚類用DNAワクチン。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片である、請求項３に記載の魚類用DNAワクチン。
【請求項５】
前記免疫原性ポリペプチドが、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、若しくは（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチド、又はそれらの部分断片である、請求項２に記載の魚類用DNAワクチン。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの部分配列である、請求項２に記載の魚類用DNAワクチン。
【請求項７】
ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）に由来することを特徴とする、魚類用弱毒ワクチン。
【請求項８】
ノカルジア・セリオレに対する免疫抗原が、BCGである、請求項７に記載の魚類用弱毒ワクチン。
【請求項９】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の魚類用DNAワクチンと、請求項７又は８に記載の魚類用弱毒ワクチンとを含む、混合ワクチン。
【請求項１０】
前記魚類がスズキ目又はカレイ目に属する魚である、請求項１〜９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチンを魚に投与することを特徴とする、海産魚類のノカルジア症の予防又は治療方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチンの、海産魚類のノカルジア症に対する免疫応答の誘発への使用。
【請求項１３】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する改変ポリペプチド、及び（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有する相同ポリペプチドからなる群から選んだポリペプチド。
【請求項１４】
（１）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、及び（２）配列番号１で表されるヌクレオチド配列との相同性が80%以上であり、しかも、ノカルジア・セリオレに対する免疫原性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる群から選んだヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−７３９９０（Ｐ２０１１−７３９９０Ａ）
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２５０５５（Ｐ２００９−２２５０５５）
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【出願人】（５０１３５３１００）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【出願人】（５０１３５３１００）
【Ｆターム（参考）】
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