液体ジメチルエーテルによる高度不飽和脂質の抽出
植物又は動物材料から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得る方法であって、該材料を液体ジメチルエーテルと接触させて、脂質を含有するジメチルエーテル溶液と植物又は動物材料の残渣を得る工程、該溶液を植物又は動物材料の残渣から分離する工程、並びに該溶液から脂質を回収する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離技術に関する。特に、本発明は、液体ジメチルエーテル（ＤＭＥ）によって、さらに、場合によっては、近臨界二酸化炭素によって、例えば、乾燥した若しくは部分的に乾燥した植物若しくは種子（海洋若しくは陸生の種を包含する）又は動物物品(animal products)（海洋若しくは陸生の種を包含する）のような物質を抽出して、高度不飽和脂質、特に高度不飽和複合脂質に富んだ抽出物と、場合によっては、ニュートラシューティカル(nutraceutical)として有用である又は水溶性酵素及び／又はタンパク質の抽出のために有用である残渣を得ることに関する。
【０００２】
背景
高度不飽和脂質（脂肪酸鎖中に３つ以上の不飽和部位と１８個以上の炭素を有する脂質）は、人体内で多様な代謝性役割を有する。これらは、新生児の脳及び視力の発達に重要であり、さらに、心臓血管系的健康、精神的健康、免疫状態及び炎症性状態のためにも有利でありうる。これらの脂質の生物学的性質は、存在する脂肪酸の種類に通常依存し、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質が最もバイオアクティブである。一般に、これらの高度不飽和脂肪酸は陸生植物及び動物では複合脂質中にのみ有意な量で見出されるが、海洋動物の中性脂質及び複合脂質中の両方にも出現する可能性がある。
【０００３】
リン脂質は、複合脂質のサブセットである。リン脂質は、あらゆる哺乳動物の細胞膜の必須成分であり、細胞膜の流動性及び該膜を通る分子の通過の維持に重要な役割を果たしている。高度不飽和アラキドン酸（Ｃ２０：４．ｗ−６）は動物由来の二次産物（例えば、非ヒト乳からのリン脂質）には存在しないか、又はごく低濃度で存在する。アラキドン酸は、新生児の発達のために極めて重要であり、そのため、非ヒト乳から製造された新生児用処方にはこの脂肪酸が補充される。それ故、この目的のためにこの脂肪酸の供給源を確保する必要性が存在する。多くの動物組織（特に、器官及び腺）の複合脂質は、卵と同様に、アラキドン酸に富んでいる。
【０００４】
苔とシダも、複合脂質形で高レベルのアラキドン酸を含有することが知られている。それ故、特に、該脂肪酸の複合脂質形は酸化に対する保護を与えるので、この高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）を複合脂質形で回収することができる抽出技術を発見することが望ましい。
【０００５】
海洋生物（ミクロ及びマクロ藻類、魚の身、卵及び肝臓、軟体動物、無脊椎動物）は、中性及び／又は複合脂質形でのＨＵＦＡｓエイコサペンタン酸（Ｃ２０：５．ｗ−３）及びドコサヘキサン酸（Ｃ２０：６．ｗ−３）の豊富な供給源である。これらの脂肪酸は、新生児処方の補充のために、並びに神経疾患、心臓血管系疾患、炎症、及び血液中の脂質含有量の制御に用いるためにも必要である。これらのポリ不飽和脂肪酸を回収することができる抽出技術を発見することも望ましい。
【０００６】
同様に、或る一定の植物からの種子、特に、黒松(pinus)及び槙(podocarp)の樹からの種子は、非メチレン中断(non-methylene interrupted)ポリ不飽和脂肪酸（Ｃ２０：３とＣ２０：４）に富んだ複合脂質を含有する。非メチレン中断脂肪酸は、満腹を制御するために(for controlling satiety)及び可能な抗炎症薬として用いられる。それ故、これらのポリ不飽和脂肪酸を回収することができる抽出技術を発見する必要性がある。
【０００７】
超臨界ＣＯ２を用いる中性脂質の抽出は、特に種子油の抽出において、周知である。これらの方法の欠点は、一般に、原材料を入れるために大型高圧容器（典型的に、３００bar以上の圧力を用いる）が必要であることであり、このことが生産プラントを非常に費用のかかるものにする。さらに、該油は超臨界ＣＯ２中に非常に低い溶解度（通常、溶媒１００ｇにつき油１ｇ）を有するので、高い流速度及び長い抽出時間も必要である。海洋種からの脂質の抽出に関する刊行物(publications)はごく僅かである。米国特許6,083,536は、炎症状態の治療に有用な非極性脂質画分を得るための、粗凍結乾燥イガイ類粉末からの非極性脂質の抽出方法を述べている。新鮮なイガイ類を、凍結乾燥及びＣＯ２抽出の前に、酒石酸で安定化させる。抽出物の組成データは記載されていず、複合脂質はＣＯ２中に不溶であるので、複合脂質は抽出されない。
【０００８】
米国特許4,367,178は、超臨界ＣＯ２を用いて、中性脂質を抽出し、不溶性リン脂質を残し、それによって、レシチン中のリン脂質を濃縮することによる粗大豆レシチンの精製方法を述べている。粗レシチンは、大豆油の慣用的なデガミング(degumming)によって生産されている。ＣＯ２の限界を克服するために、超臨界ＣＯ２の溶解力(solvent power)を高めるための例えばエタノールのような共溶媒の使用が提案されている。
【０００９】
ＥＰ1,004,245 A2は、乾燥した卵を最初に超臨界ＣＯ２によって抽出して、中性脂質を除去し、次に、超臨界ＣＯ２と室温において液体である有機共溶媒（エタノール）によって、又は有機溶媒（ＣＯ２なし）によってのいずれかで抽出して、リン脂質を抽出する方法を述べている。両方のオプションは、リン脂質の抽出が不完全だという欠点を有する。さらに、両方は、脱脂卵粉末中に溶媒残渣を残し、これはタンパク質の変性をもたらす。超臨界ＣＯ２抽出によって得られる中性卵脂質は、実施例３に示すように、高度不飽和脂肪酸の無視できるほどのレベルを有する。
【００１０】
Arntfield et al.(JAOCS, 69, 1992, 823-825)は、卵タンパク質がＣＯ２と共溶媒としてのメタノールによる抽出後に実質的に変性することを示している。超臨界ＣＯ２と共にエタノールを用いると、リン脂質の不完全な抽出が生じる。ホスファチジルコリンは最も容易に抽出されるリン脂質であるが、他の全てのリン脂質は非常に低い溶解度を有するか若しくは溶解度を全く有さず、抽出されない（Teberliker et al., JAOCS, 78, 2002, 115-119）。Schriener et al.(Journal of Food Lipids, 13, 2006, 36-56)は、卵黄脂質中の高度不飽和脂肪酸の大部分が、この方法では抽出されないホスファチジルエタノールアミン中に存在することを示している。
【００１１】
PCT公開WO 02/092540は、ＨＵＦＡｓを含有する極性脂質の医療的使用と、極性脂質と他の油とのブレンドを開示している。該抽出方法は、アルコールと遠心分離を用いるものとして開示されているが、さらなる詳細は記載されていない。デガミングの工業的方法による食用種子油抽出の副産物として、極性脂質富化画分を得ることができることも開示されている。
【００１２】
湿ったリン脂質含有物質からのＨＵＦＡ含有リン脂質の抽出方法は、ＰＣＴ公開WO 2005/072477に開示されている。脂肪族アルコール、特に、イソプロパノール及び／又はｎ−プロパノールが用いられる。リン脂質を含有する物質を水溶性脂肪族アルコールと、該リン脂質が溶媒中に溶解するほど充分に高い温度において接触させる、この間に、変性するタンパク質は該溶液から沈殿する。
【００１３】
粗卵黄から(米国特許4,157,404)及び乾燥卵粉末から（米国特許4,234,619）の脂質の抽出には、これまではＤＭＥが用いられていた。該方法は、脂質成分とタンパク質成分を別々の流れに分画させる。米国特許4,157,404は、粗卵黄（水分含量５０〜５５％）からの脂質の抽出を述べているが、この方法ではタンパク質は変性する。上記方法はまた、回収された脂質と水との混合物を２０％以下の水分含量までに脱水して、その後に中性富化相と複合脂質／水富化相の相分離を生じさせることを必要とする。米国特許4,234,619は、卵が乾燥している場合にはタンパク質は変性しないが、この場合に、リン脂質は部分的にのみ抽出されうることを開示している。上記方法では、ＤＭＥを−３０℃〜４０℃の温度範囲内で用い、噴霧乾燥した全卵粉末を用いて、最大で７０％収率のみのリン脂質が得られた。本発明の所望の生成物は、少なくとも３０％のその本来のリン脂質含量を含有し、コレステロールを含有しない卵粉末であった。高度不飽和脂肪酸の回収及び濃縮の方法は開示されていない。さらに、用いた抽出及び分離温度が低いために、総脂質抽出物中の中性脂質と複合脂質を別々の画分に分離することは思い付かれなかった。
【００１４】
PCT公開WO2004/066744は、DMEが溶媒である場合に近臨界抽出を用いて、水性乳流(aqueous dairy stream)から脂質を抽出することを述べている。この公開はさらに、超臨界CO2も液体DMEも乾燥ホウェイタンパク質濃縮物（WPC）乳粉末から有用な収率で脂質を抽出することができないことも開示している。該方法は、乾燥した動物又は植物組織からHUFA極性脂質を抽出する方法を開示していない。ホウェイタンパク質は動物又は植物組織中に見出されず、得られた脂質は高度不飽和脂肪酸を含有しない。
【００１５】
ＮＺ535894は、脱脂乳粉末の製造から生じる乳リポタンパク質／ラクトース混合物である乳脂球状膜タンパク質を含有する噴霧乾燥酪農産物からの脂質の抽出を開示している。このタンパク質は、乳のクリーム画分に付随しており、動物又は植物の組織には見出さない。液体DMEを用いた抽出によって、高ラクトース含量（この場合、高ラクトース含量は総粉末の少なくとも３０質量％を意味する）を有するこの乳粉末流から脂質を抽出する試みは不成功であり、粉末の製造の前にラクトース含量を減ずることが必要であった。該脂質はＨＵＦＡｓを含有しないので、乾燥した動物又は植物の組織からHUFA脂質を抽出する方法の開示は存在しない。抽出後の残留粉末は約６〜８％の複合脂質をなおも含有する。
【００１６】
ＰＣＴ公開WO2006/058382は、液体ＤＭＥを用いて、或る範囲の物質から抽出物を得る方法を大ざっぱに述べている。しかし、ＨＵＦＡｓの抽出は記載されていず、中性脂質からの複合脂質の分離も記載されていない。記載されている方法は、液体ＤＭＥを用いる、簡単な慣用的方法である。実際に、幾らか詳細に記載されている唯一の方法は、ＨＵＦＡｓを含有しないホホバ種子から抽出物を得るための、液体ＤＭＥを用いる方法である。
【００１７】
動物及び植物材料に由来する産物中に存在するタンパク質及び他の複合炭水化物の種類（及び該材料を乾燥させる方法）が、脂質を上首尾に抽出することができるか否かを決定することは、明らかである。植物又は動物組織中に存在するタンパク質及び複合炭水化物は、例えば乳のような、動物に由来する二次産物中に見出されるものとは実質的に異なる。それ故、脂質の抽出、特に、高度不飽和脂肪酸を含有する複合脂質の抽出が、細胞及び組織に関連してタンパク質及び複合炭水化物を含有する植物又は動物組織から、ジメチルエーテルを用いて可能であるかどうかを、何らかの確実性で予測することは一般に不可能である。
【００１８】
意外にも、本出願人は、液体ＤＭＥを植物又は動物材料からＨＵＦＡｓを得るための効果的な抽出剤として用いることができること、及び特に、中性脂質及び複合脂質から成る液体抽出物中の残留ＤＭＥが複合脂質を含有するガム状相の形成を可能にし、該ガム状相はその後容易に中性脂質から分離されることを発見している。
【００１９】
高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得るための方法を提供すること、又は少なくとも、他の方法の有用な代替手段を提供することが、本発明の目的である。
発明の説明
本発明は、第１態様では、植物又は動物材料から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得る方法であって、（ｉ）該材料を液体ジメチルエーテルと接触させて、脂質を含有するジメチルエーテル溶液と、植物又は動物材料の残渣を得る工程；（ｉｉ）該溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及び（ｉｉｉ）該溶液から脂質を回収する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の或る一定の好ましい実施態様では、工程（ｉ）で該材料との接触後に形成される該溶液は、中性脂質と複合脂質を含有する。
好ましくは、中性脂質を該溶液から、複合脂質と一緒に回収する。その後に、好ましくは、中性脂質を複合脂質から分離する。
【００２１】
該複合脂質は、回収工程（ｉｉｉ）中に溶解ジメチルエーテルとガム相を形成することができる。好ましくは、複合脂質を含有するガム相を、中性脂質を含有する溶液から分離する。
【００２２】
好ましくは、中性脂質を複合脂質から、相分離によって分離する。分離を助けるために、遠心分離を用いることもできる。遠心分離の前に、加熱を利用することもできる。次に、好ましくは、複合脂質を真空乾燥によって乾燥させる。
【００２３】
本発明の方法は、好ましくは、工程（ｉｉｉ）において溶液から回収された脂質を超臨界ＣＯ２によって、下記工程：（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において溶液から回収した脂質を超臨界ＣＯ２と接触させて、中性脂質を含有するＣＯ２溶液と、複合脂質の残渣を得る工程；（ｖ）中性脂質を含有する該ＣＯ2溶液を複合脂質の該残渣から分離する工程；及び（ｖｉ）該ＣＯ２溶液から該中性脂質を回収する工程に従って処理することをさらに含む。
【００２４】
本発明の或る一定の実施態様では、工程（ｉ）において液体ジメチルエーテルと接触させるべき植物又は動物材料を最初に、近臨界ＣＯ２によって、下記工程：ａ．該材料を近臨界ＣＯ２と接触させて、中性脂質を含有するＣＯ２溶液と植物又は動物材料の残渣を得る工程；ｂ．該ＣＯ２溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及びｃ．該中性脂質を該ＣＯ２溶液から回収する工程に従って処理する。
【００２５】
本発明の好ましい方法では、該植物又は動物材料を、使用前に、乾燥させる又は部分的に乾燥させる。好ましくは、該植物又は動物材料を、該材料中の水分が３０重量％未満になるまで、より好ましくは、該材料中の水分が５重量％以上であるように、乾燥させる。好ましくは、該植物又は動物材料を凍結乾燥によって又は噴霧乾燥によって乾燥させる。
【００２６】
本発明の或る一定の実施態様では、該植物又は動物材料が、凍結されている湿潤バイオマスである。典型的には、凍結した湿潤バイオマスを抽出の前に摩砕する。
好ましくは、複合脂質の１種類以上が、リン脂質、ガングリオシド、糖脂質、セレブロシド、又はスフィンゴ脂質であり、典型的にはリン脂質である。該リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、プラズマローゲン、アルキルアシルリン脂質、ホスホノ脂質、リゾリン脂質、セラミド・アミノエチルホスホネート、及びホスファチジン酸のいずれか１つ以上を含むことができる。該糖脂質は、ガラクト脂質、ガングリオ脂質、スルホキノボイスルジアシルグリセリド(sulphoquinovoysldiacylglycerides)、タウロ糖脂質、グリコスフィンゴリン脂質、及びマンノシル脂質を包含することができる。
【００２７】
該複合脂質中に含有される高度不飽和脂肪酸は、好ましくは、非限定的に、アラキドン酸（ＡＡ）、α−及びγ−リノレン酸、ピノレン酸、シアドン酸、コランビン酸(columbinic acid)、ジホモリノレン酸、エイコサテトラエン酸、ジュニペロン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のいずれか１つ以上を含む。
【００２８】
さらに、該植物又は動物材料を、動物の器官、動物の腺、海洋マクロ−及びミクロ−藻類、発酵によって培養される脂質含有微生物（特に、糸状菌、藻類、酵母及び細菌）、貝類、魚類、海洋無脊椎動物、卵、植物の種子、植物の葉、植物の針、シダの葉、苔、及び地衣類から成る群のいずれか１種類から得ることも好ましい。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、該液体ジメチルエーテルは近臨界ジメチルエーテルである。
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を提供する。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる複合脂質を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる中性脂質を提供する。
さらに他の態様では、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質が本発明の方法によって抽出されている植物又は動物材料を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、高度不飽和脂肪酸を含有する複合脂質が本発明の方法によって抽出されている植物又は動物材料の、ニュートラシューティカル(nutraceutical)、食品サプルメントとして、又は酵素供給源としての使用を提供する。
【００３２】
詳細な説明
定義
脂肪酸とは、典型的に炭素原子６個以上の炭化水素鎖を有する、任意の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸を意味する。脂肪酸は、炭素原子数（例えば、Ｃ２０）、不飽和結合部位の数（例えば、Ｃ２０：４）、脂肪酸のメチル末端からの第１不飽和結合部位の位置（例えば、Ｃ２０：４ ｗ−３）、及び不飽和結合部位を分離する炭素数に従って分類される。通常は、１個の炭素が不飽和結合部位を分離する（“メチレン中断型(methylene interrupted)”として知られる）、そして共役している（不飽和結合部位を分離する炭素が存在しない）場合のみ、短縮命名法で略称される、又は２個以上の炭素(more than one carbon)によって分離されている場合（“非メチレン中断型(non-methylene interrupted)”として知られる）には、脂肪酸のメチル末端からの該炭素の位置が記録される（例えば、５、１１、１４ Ｃ２０：３）。脂肪酸は、中性脂質と複合脂質の両方の構成要素である。中性脂質では、脂肪酸のみがエステル結合又はエーテル結合を介してグリセロールに結合する。脂肪酸は、非結合状態で存在することもでき、その場合には、“遊離脂肪酸”と呼ばれる。複合脂質では、脂肪酸とその他の（極性）構成要素がグリセロールに結合する。
【００３３】
多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、２個以上の不飽和結合部位を有する脂肪酸を意味する。
高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）は、脂肪酸鎖中に３個以上の不飽和結合部位と、１８個以上の炭素原子を有する脂肪酸を意味する。例には、アラキドン酸（ＡＡ）、α−（ＡＬＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ピノレン酸、シアドン酸、コランビン酸、ジホモリノレン酸、ジホモピノレン酸、ジュニペロン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が包含される。
【００３４】
複合脂質は、脂肪酸（及び密接に関連したエーテル、アミン及び炭化水素誘導体）；極性リン基（通常、リン酸エステル若しくはリン酸）、及び／又はアミノアルコール、及び／又は炭水化物；並びにグリセロールを含めた、少なくとも３種類の構築ブロックから成る脂質である。複合脂質は、リン脂質、ガングリオシド、糖脂質、セレブロシド、及びスフィンゴリン脂質を包含するが、これらに限定される訳ではない。リン脂質の例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、カルジオリピン（ＣＬ）、プラズマローゲン、リゾリン脂質、及びホスファチジン酸を包含する。
【００３５】
中性脂質は、１個若しくは２個の構築ブロック（いずれも極性リン基も炭水化物も含有しない）から成る脂質である。該構築ブロックは、脂肪酸、グリセロール、ステロール、脂肪アルコール、アミン、カロテノイド、及び自然発生炭水化物を包含する。中性脂質は、非限定的に、脂肪酸、モノ−、ジ−及びトリアシルグリセリド、セラミド、Ｎ−アシルエタノールアミン、ステロールとステロールエステル、カロテノイドとカロテノイドエステルを包含する。
【００３６】
ＤＭＥ水和複合脂質とは、水分子で水和された脂質に類似して、ＤＭＥとの弱い結合を形成している複合脂質を意味する。
臨界点とは、物質の液体と水蒸気の状態が同一になる点を意味する。
【００３７】
超臨界とは、物質の臨界点を超える圧力−温度領域を意味する。物質の臨界点を超えると（但し、臨界点に近接して(but close to the critical point)）、該物質は、液体と気体の両方の性質を有する流体状態になる。該流体は、液体に類似した密度と、気体に類似した粘度及び拡散率(diffusivity)を有する。
【００３８】
臨界未満とは、物質の蒸気圧に等しいか又は蒸気圧を超える圧力−温度領域（但し、臨界温度未満である）を意味する。“液化ガス”及び“圧縮液化ガス”なる用語は、該ガスの蒸気圧が抽出温度(extraction temperature)において少なくとも３barである、同一の領域を表すために用いることができる。
【００３９】
近臨界とは、物質の臨界点に近接した圧力−温度領域を意味する、したがって、臨界未満と超臨界の両方を包含する。近臨界は、換算温度範囲０．７０≦Ｔｒ≦１．２５（この場合、Ｔｒは、ＤＭＥの臨界温度Ｔｃによって割った温度である）；及びＴ＜Ｔｃに対する圧力範囲Ｐ＞Ｐｖ（この場合、Ｐｖは蒸気圧である）とＴ≧Ｔｃに対する圧力範囲Ｐ＞Ｐｃ（この場合、Ｐｃは臨界圧である）を包含する。
【００４０】
ニュートラシューティカルとは、食物から単離若しくは精製され、通常、食物とは関係しない医薬品形態で販売され、生理的利益を有し、慢性疾患に対する保護を与えることが実証された製品を意味する。
【００４１】
本発明
本発明は、植物又は動物材料から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得る方法であって、（ｉ）該材料を液体ジメチルエーテルと接触させて、脂質を含有するジメチルエーテル溶液と、植物又は動物材料の残渣を得る工程；（ｉｉ）該溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及び（ｉｉｉ）該溶液から脂質を回収する工程を含む方法を提供する。
【００４２】
該植物又は動物材料は、ＨＵＦＡｓを有する脂質を含有する、任意の動物組織又は植物組織であることができる。特に、該方法は、動物の器官及び腺、海洋マクロ−及びミクロ−藻類、発酵によって培養される脂質含有微生物、特に、糸状菌、藻類、酵母及び細菌；小海洋動物（貝類及び無脊椎動物）、卵、並びに植物の種子に関する。該植物又は動物組織は、細胞に関する物質(cellular materials)、タンパク質、脂質及び炭水化物を含めた、植物又は動物の部分又は全体物質を包含しうるが、植物又は動物に由来する二次産物（例えば、乳）を包含しない。
【００４３】
ＤＭＥは、標準室温及び圧において気体であるが、液体形では、自然産物から物質を抽出するための有効な溶媒であることが知られている。本発明の方法に用いる液体ＤＭＥは、典型的に、近臨界ＤＭＥである。好ましくは、液体ＤＭＥの圧力は、少なくとも、抽出の温度における蒸気圧に等しく、より好ましくは、該蒸気圧よりも少なくとも１０bar高い。温度は、好ましくは、２７３〜３７３Ｋの範囲内であり、より好ましくは、３１３〜３５３Ｋの範囲内である。抽出温度が高ければ高いほど、高度不飽和脂肪酸に富む複合脂質の収率が高くなる。典型的な抽出温度は約３３３Ｋである。この温度における典型的な抽出圧力は４０barであり、この圧力はＤＭＥの蒸気圧を充分に超える圧力であり、バイオマスが湿潤している場合に水分の最大の抽出を保証する。
【００４４】
該方法によって得られる脂質は、一般に、或る範囲の結合ＨＵＦＡｓを有する複合脂質の混合物である。該混合物の組成は、用いた植物又は動物材料の供給源に大きく依存するであろう。該植物又は動物材料が中性脂質をも含有する場合には、該中性脂質も該方法において抽出されるであろう。
【００４５】
出願人は、中性脂質と複合脂質から成る脂質抽出物中の残留ＤＭＥが、複合脂質含有ガム状相と中性脂質含有液体相の形成を生じる（但し、該中性脂質が高濃度（５質量％を超える）の遊離脂肪酸及び／又は部分的グリセリドを含有しない場合には）ことを発見している。該ガム相は、該中性脂質含有液体相よりも高い密度の半固溶体(semi-solid liquid)である。ＤＭＥが、水とリン脂質との間に形成される結合と同様に、複合脂質（特に、リン脂質）との弱い結合を形成しうることが前提とされる。ガム状相中のいわゆるＤＭＥ水和複合脂質(DME-hydrated complex lipids)は、中性脂質から容易に分離することができる。
【００４６】
該抽出物の回収中の熱の使用、該脂質混合物中の中性脂質対複合脂質の比率、及び該中性脂質の組成が、ＤＭＥ水和複合脂質の形成を促進するための重要な要因である。総脂質混合物が、高レベルの遊離脂肪酸及び／又は部分的グリコシドを有さない中性脂質約５０〜９０％を含有し、該脂質混合物が室温において液体である場合には、該抽出物の回収方法と、その後の圧力損失及び／又は加熱による該抽出物からのＤＭＥの脱ガスが、該複合体の形成を招来することができる。該ガム状相と液体相との分離は、加熱及び／又は遠心分離の使用によって促進される。このようにして得られたＤＭＥ水和複合脂質相は、若干の中性脂質をまだ含有するが、該中性脂質相は複合脂質を全く有さない。この発見は、卵脂質及び魚頭部脂質に特に該当する。
【００４７】
液体ＤＭＥを用いて、湿潤バイオマスと乾燥バイオマスの両方から中性脂質と複合脂質の両方を抽出して、ＤＭＥからの分離後に混合抽出物を得ることができる。バイオマスが湿潤している場合には、水分も抽出され、例えば、真空下での蒸発、膜分離、又は特に遠心分離による相分離のような、慣用的な手段によって脂質から分離される。次に、近臨界二酸化炭素を用いて該混合抽出物をさらに抽出して、中性脂質を分離及び回収して、ＨＵＦＡｓを含有する複合脂質にさらに富んだ抽出物を得るという選択肢がある。該複合脂質は水和されていず、水又はＤＭＥを除去するためにさらに処理することを必要としない。
【００４８】
植物又は動物材料を、液体ＤＭＥによる抽出の前に、近臨界二酸化炭素によって抽出して、中性脂質を取り出すことができる。処理工程のこの順序は、複合脂質に富んだ抽出物を得ることも可能にする。
【００４９】
好ましくは、該近臨界二酸化炭素の圧力は少なくとも７３．２barであり、温度は３０４．２〜３７３Ｋの範囲（超臨界領域）内である；又は該近臨界二酸化炭素の圧力は蒸気圧以上であり、温度は２７３〜３０４．１Ｋの範囲（臨界未満領域）内である。より好ましくは、該二酸化炭素の圧力は少なくとも２５０barであり、温度は３１３〜３５３Ｋの範囲内である。
【００５０】
本発明の或る一定の実施態様の重要な要素は、液体ＤＭＥによる抽出前に植物又は動物材料の乾燥若しくは部分的乾燥である。植物及び動物材料は、典型的に、材料全体の６０〜８０重量％の水分含量を有する。抽出前に該水分の少なくとも一部を除去することは、一定量の材料に関して、水分の量が減少しているので、脂質の収率が大きくなるという実用面での利点を有する。それ故、大容量の処理装置の必要性は減少する、又は一定容量の処理プラントに関してスループット及び脂質収率は大きくなる。しかし、この方法は湿潤バイオマスにも適用可能であり、このことは、乾燥費用を回避する点と、脂質を分解する可能性があるか、又は脂質の抽出を妨げる乾燥バイオマス・マトリックス内への脂質封入を生じる可能性がある酵素を不活性化する点で有利でありうる。
【００５１】
出願人はさらに、重要なことには、植物又は動物材料を乾燥させるが、水分を完全には除去しないことが有利であることも発見している。抽出されるべき材料の水分含量を材料全体の３０重量％レベルまでに減ずる場合には、本発明の方法を、該材料中に存在する酵素及び他のタンパク質を有意に分解も変性もさせずに行うことができる。それ故、抽出後の植物又は動物材料の残渣は、種々な用途（例えば、タンパク質に富み、脂肪の少ない栄養サプルメント、例えば脱脂ウシ肝臓のような身体構成製品(body building products)）に、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、トランスグルタミナーゼのような酵素の供給源として、特に有用でありうる。これらの酵素の分解は、該残渣の有用性を制限すると考えられる。
【００５２】
複合脂質類は、それらの極性において、広範囲に変化するので、植物又は動物の組織中に存在するリン脂質の大部分を抽出することができる溶媒又は溶媒混合物を見出すことは困難である。脱脂残留物質を用いて、例えば酵素のような非脂質成分を抽出して、脱脂残留物質をニュートラシューティカルとして用いることができるように、抽出プロセス中に残留タンパク質及び／又は複合非脂質分子を変性させない溶媒系を見出すことは、さらにいっそう困難である。意外にも、少なくとも４０℃の温度において用いられた液体ＤＭＥを用いて、該物質を抽出前に乾燥させた場合には該残留脱脂物質を変性させることなく、複合脂質と中性脂質の全ての高収率を得ることができることを、出願人は発見している。
【００５３】
一般的手段
下記の４つの非限定的な一般的手段は、本発明の方法をどのように実施することができるかを示す。
【００５４】
１．ＤＭＥ抽出
ａ．植物又は動物組織を３０％以下の水分含量にまで乾燥させる、水分含量は、必要に応じてＤＭＥが水も含有することを保証するように選択する。
ｂ．該植物材料を、２ｍｍ以下の粒度にまで摩砕する。
ｃ．該植物又は動物材料を特定の条件において液体ＤＭＥと接触させる。
ｄ．該植物又は動物材料から負荷ＤＭＥ(laden DME)を分離する。
ｅ．該ＤＭＥからＨＵＦＡ富化脂質抽出物を回収する。
【００５５】
該脂質抽出物が中性脂質をも含有する場合には、次の追加工程を行うこともできる：
ｆ．中性脂質から相分離によってＤＭＥ水和複合脂質を分離する。
ｇ．水和複合脂質からＤＭＥを除去する。
【００５６】
場合によっては、該残留脱脂動物材料をさらに水溶液によって抽出して、酵素を得ることができる。
２．ＤＭＥ抽出後のＣＯ２抽出
ａ．該植物又は動物組織を１０%以下の水分含量にまで乾燥させる。
ｂ．該植物材料を、２ｍｍ以下の粒度にまで摩砕する。
ｃ．該植物又は動物材料を特定の条件において液体ＤＭＥと接触させる。
ｄ．該植物又は動物材料から負荷ＤＭＥを分離する。
ｅ．該ＤＭＥからＨＵＦＡ富化複合及び中性脂質抽出物を回収する。
ｆ．ＨＵＦＡ富化複合脂質抽出物を超臨界ＣＯ２と接触させる。
ｇ．超臨界ＣＯ２と溶解中性脂質から中性脂質減損ＨＵＦＡ富化複合脂質を分離し、回収する。
ｈ．該ＣＯ２から中性脂質を回収する。
【００５７】
３．ＣＯ２抽出後のＤＭＥ抽出
ａ．該植物又は動物組織を１０%以下の水分含量にまで乾燥させる。
ｂ．該植物材料を、２ｍｍ以下の粒度にまで摩砕する。
ｃ．該植物又は動物材料を特定の条件において超臨界ＣＯ２と接触させる。
ｄ．該中性脂質減損植物又は動物材料から超臨界ＣＯ２を分離する。
ｅ．該ＣＯ２から中性脂質を回収する。
ｆ．植物又は動物材料を液体ＤＭＥと特定の条件において接触させる。
ｇ．該植物又は動物材料から負荷ＤＭＥを分離する。
ｈ．該ＤＭＥからＨＵＦＡ富化複合脂質抽出物を回収する。
【００５８】
４．湿潤バイオマスのＤＭＥ抽出
ａ．該バイオマスを必要に応じて凍結する。
ｂ．凍結した植物又は動物材料を、必要に応じて、５ｍｍ以下の粒度にまで摩砕する。
ｃ．該植物又は動物材料を特定の条件において液体ＤＭＥと接触させる。
ｄ．該植物又は動物材料から負荷ＤＭＥを分離する。
ｅ．該ＤＭＥからＨＵＦＡ富化脂質抽出物と水分を回収する。
ｆ．該脂質から水分を分離する。
【００５９】
該脂質抽出物が中性脂質をも含有する場合には、次の追加工程を行うこともできる：
ｇ．ＨＵＦＡ富化脂質物質を特定の条件において超臨界ＣＯ２と接触させる。
ｈ．超臨界ＣＯ２と溶解中性脂質から、該中性脂質減損ＨＵＦＡ富化複合脂質(neutral-lipid depleted HUFA-rich complex lipid )を分離し、回収する。
ｉ．該ＣＯ２から該中性脂質を回収する。
【００６０】
上記一般的手段において、一般的手段１〜３において工程ｂが不必要になるように、工程ａから得られる噴霧乾燥粉末（例えば、卵黄粉末）を用いることができる。
【実施例】
【００６１】
実施例１：乾燥ウシ肝臓の抽出
新鮮なウシ肝臓全体約８ｋｇを地元の食肉加工プラントから入手した。該肝臓から、皮膚脂肪沈着物(cutaneous fat deposits)、軟骨及び皮膚を除去して、次に、該肝臓を複数の大きなチャンク(chunks)に切断した。これらのチャンクをミンチング・デバイス(mincing device)に通して、チャンキー・ペーストを得た。次に、肝臓ミンチ(minced liver)７９１３．５ｇを凍結乾燥トレーに載せて、これらのトレーを次に、固体が完全に凍結するまで、フリーザーに入れた。該トレーを次に凍結乾燥器に入れて、約２〜５％の水分含量になるまで乾燥させた。３１．９％の固体収率が得られ、抽出前の摩砕のための材料２５２６．７ｇが得られた。トレーからの固体を、〜１ｍｍのホールサイズを有するシーブ・プレートを備えたナイフミルで摩砕した。細かく摩砕した固体を次に、近臨界ＤＭＥによって４０bar及び３１３Ｋにおいて抽出した。近臨界ＤＭＥ２９．３１６ｋｇを該固体（２４７２．６ｇ）に一定の流速で９０分間、連続的に通した。該ＤＭＥを、固体に通した後に、減圧バルブ及び熱交換器に連続的に通して、分離容器に入れた、ここで直ちにＤＭＥはガスに転化した。脂質が該ガスから沈殿し、該分離容器から回収された。該ＤＭＥは、コンデンサー／サブクーラー熱交換器とポンプを介して該抽出容器に再循環させた。脂質３６３．６９ｇが１３．９６％の収率で得られた。該脂質はリン脂質５３％を含有し、該リン脂質のうち、４６．２％はホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、１０．２％は. ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）であり、２．３％はホスファチジルセリン（ＰＳ）であり、１６．６％はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、３．９％はスフィンゴミエリン（ＳＭ）であり、６．６％はカルディオリピン（ＣＬ）であり、そして８％は同定されなかった。全脂質はアラキドン酸（ＡＡ）４．５％、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）７．４％、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）２．１％、及びα−リノレン酸（ＡＡ）５．９％を含有した。該脱脂肝臓は、スポーツ栄養サプルメントとして使用可能である。
【００６２】
実施例２：ウシ心臓の抽出
新鮮なウシ心臓全体約８ｋｇを地元の食肉加工プラントから入手した。該心臓から、皮膚脂肪沈着物及び軟骨を除去して、次に、該肝臓を複数の大きなチャンクに切断した。これらのチャンクをミンチング・デバイスに通した。次に、心臓ミンチ(minced heart)を凍結乾燥トレーに載せて、これらのトレーを次に、固体が完全に凍結するまで、フリーザーに入れた。該トレーを次に凍結乾燥器に入れて、約２〜５％の水分含量になるまで乾燥させた。２２．７％の固体収率が得られ、抽出前の摩砕のための材料１７２５．７ｇが得られた。トレーからの固体を、〜１ｍｍのホールサイズを有するシーブ・プレートを備えたナイフミルで摩砕した。細かく摩砕した固体を次に、近臨界ＤＭＥによって４０bar及び３１３Ｋにおいて抽出した。近臨界ＤＭＥ２９．５２ｋｇを該固体に９０分間の期間にわたって連続的に通した。該ＤＭＥを、固体に通した後に、減圧バルブ及び熱交換器に連続的に通して、分離容器に入れた、ここで直ちにＤＭＥはガスに転化した。脂質が該ガスから沈殿し、該分離容器から回収された。該ＤＭＥは、コンデンサー／サブクーラー熱交換器とポンプを介して該抽出容器に再循環させた。脂質２０２．７１ｇが１２．３％の収率で得られた。該脂質はリン脂質３０．０％を含有し、該リン脂質のうち、２８．３％はホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、４．４％はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）であり、０％はホスファチジルセリン（ＰＳ）であり、１３．７％はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、６．６％はスフィンゴミエリン（ＳＭ）であり、２７．９％はカルディオリピン（ＣＬ）であり、そして１２．２％は同定されなかった。全脂質はアラキドン酸（ＡＡ）５．６％、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）２．０％、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）２．８％、及びα−リノレン酸（ＡＡ）５．９％を含有した。
【００６３】
実施例３：ＣＯ２と、続いてのＤＭＥとによる噴霧乾燥卵黄の抽出
この実施例は、固体原料物質から中性脂質を最初に抽出してから、ＤＭＥによって再抽出して、ＨＵＦＡに富んだ複合脂質濃縮物を得ることができることを示す。この実施例はさらに、噴霧乾燥粉末からの複合脂質の高い収率を得るためには高い抽出温度を用いなければならないことも示す。噴霧乾燥卵黄粉末１０．６７ｋｇを超臨界ＣＯ２によって３００bar及び３１３Ｋにおいて抽出した。超臨界ＣＯ２５３０．３４ｋｇを該固体に連続的に通して、次に続いて、２つの減圧段階に通して、圧力を最初に３１３Ｋにおいて９０barに下げて、中性脂質のみを含有する卵油（４．２６ｋｇ、収率４０．０質量％）を回収し、次に３２３Ｋにおいて５８barに下げて、少量の中性脂質画分（０．２６ｋｇ、収率２．４質量％）を回収した。該中性脂質はアラキドン酸とドコサヘキサエン酸の各々１％未満を含有した。次に、実施例１及び２と同様に、中性脂質減損卵黄粉末２．９８ｋｇを液体ＤＭＥ１６．２４ｋｇによって、２９３Ｋ、４０barにおいて６０分間抽出した。中性脂質を含まない複合脂質抽出物２８３．４ｇが、全脂卵黄粉末の６．８質量％の収率に相当して得られた。該粉末を液体ＤＭＥ１３．１ｋｇによって、３１３Ｋにおいて上記と同様に５０分間再抽出した。中性脂質を含まない複合脂質抽出物さらに１９１．３ｇが、全脂卵黄粉末の４．６質量％の追加収率に相当して得られた。したがって、総脂質収率は５３．８％であった。中性脂質を含まない複合脂質抽出物の高い収率を得るためには、該粉末を少なくとも３１３Ｋの温度で抽出することが必要である。この脱脂卵黄粉末は、低脂肪であることが要求されるベーキング用途に使用可能である。
【００６４】
実施例４：ＤＭＥによる噴霧乾燥卵黄の抽出
この実施例は、抽出物相中の少量のＤＭＥを用いて、ＤＭＥ抽出後の複合脂質から中性脂質を分離できることを示す。噴霧乾燥卵黄粉末４．１１９ｋｇを液体ＤＭＥによって、３２３Ｋ及び４０barにおいて抽出した。近臨界ＤＭＥ８．５１７ｋｇを該固体に連続的に通した。該固体に通した後に、該ＤＭＥを減圧バルブ及び熱交換器に連続的に通して、加熱分離容器に入れた、ここで直ちにＤＭＥはガスに転化した。脂質が該ガスから沈殿し、該分離容器から加熱バルブを通して回収された。該ＤＭＥは、コンデンサー／サブクーラー熱交換器とポンプを介して該抽出容器に再循環させた。該分離容器から回収された液体（２１９７．８６ｇ、収率５３．３％）を加熱して、残留ＤＭＥの大部分を駆除してから、該液体を遠心分離して、脂質を中性脂質富化相とＤＭＥ水和複合脂質富化相に分けた。該中性脂質富化相は、総脂質の７５．３％から成り、１質量％未満の複合脂質を含有するが、アラキドン酸又はＤＨＡのいずれも含有しない。極性脂質富化相は、総脂質の２４．７％から成り、９５％を超える極性脂質を含有した。該極性脂質はアラキドン酸含量５．８９％とＤＨＡ含量２．４６％を含有した。
【００６５】
実施例５：凍結乾燥卵黄の抽出
この実施例は、卵黄を凍結乾燥すると、抽出に対する脂質のアベイラビリティ(availability)が改良されることを示す。新鮮な卵は、地元の商店から購入し、次に、手動で卵黄と卵白に分離した。卵白は廃棄した。卵黄は室温において混合してから、丸底真空フラスコに加えて、凍結し、次に凍結乾燥させた。次に、凍結乾燥卵黄７３．０５ｇを液体ＤＭＥ５９８．１ｇによって４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。アラキドン酸２％とＤＨＡ１％を含有する黄色液体抽出物４７．０１ｇが６４質量％の収率で得られた、この収率は、卵黄粉末に対する理論的総脂質収率と同じである。残留卵黄粉末と非抽出凍結乾燥卵黄粉末の水溶性を噴霧乾燥卵黄粉末（脱脂卵黄粉末と非抽出卵黄粉末の両方）と比較した。新鮮噴霧乾燥卵黄粉末と抽出済み噴霧乾燥卵黄粉末の両方は水に不溶性であり、このことは、噴霧乾燥プロセスが変性を生じることを示唆した。凍結乾燥タンパク質（抽出前と後）は、水中で２２％溶解性を有したが、新鮮な卵黄タンパク質は５８％溶解性であった。該抽出済みタンパク質は低脂肪栄養サプルメントとして使用可能であった。
【００６６】
実施例６：ＤＭＥとＣＯ２を用いた凍結乾燥イガイ粉末の抽出
この実施例は、脱脂イガイ固体中の酵素活性が、脂質の抽出後も保持されることを示す
。凍結した緑イガイ(green-lipped mussel)スラリーを部分的に解凍して、デジューシング装置(dejuicing apparatus)に通して、大きいチャンク(固体)から微細な固体と液体（スラリージュース）を分離する。該スラリーの一部を、実施例１２に記載するように加工するために取り分けた。残りのスラリージュースと固体とを別々に凍結乾燥して、次に、最初にＤＭＥで抽出した。得られた粗抽出物を次に、超臨界ＣＯ２によって再抽出した。直接凍結させてから、凍結乾燥させたスラリー（表１における全粉末）に対しても、比較のためのＤＭＥ抽出を行った。幾らかの酵素活性を生じた、磨耗工程及び脱水工程による収率には幾らかの変動性が存在した。乾燥粉末の質量％としての脂質収率、該抽出物複合脂質含量、及び最終生成物のＥＰＡとＤＨＡ含量を表１に示す。
【００６７】
表１：緑イガイからのＨＵＦＡ含有複合脂質の抽出
【００６８】
【表１】
【００６９】
該抽出物のリン脂質プロフィルは次のとおりである：ホスファチジルコリン３１．９％、ホスファチジルエタノールアミン２４．５％、ホスファチジルイノシトール３．９％、ホスファチジルセリン３．１％、ホスホノ脂質１．１％、セラミド２−アミノエチルホスホネート１７．０％。ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの数値はプラズマローゲンをも包含する。
【００７０】
脂質取り出し後の該イガイ粉末のホスホリパーゼ活性を次のように測定した：脱脂緑イガイ粉末（８ｇ）固体に蒸留水４０ｍｌを混合して、次に遠心分離した。上清イガイ調製物のアリコート（２０ｍｌ）をＰＣ〜２４％、ＰＥ３４％及びＰＳ１２％を含有するリン脂質混合物モデル１ｇに加えて、４０℃において乳化させてから、この温度に１６時間維持した。該反応混合物のサンプル（０．２ｍｌ）を３１Ｐ−ＮＭＲによってリン脂質組成に関して分析した。リン脂質の加水分解度を表２に示す、表２では、Ｌはリゾ−（親リン脂質から加水分解される、１つの脂肪酸）を意味し、Ｇはグリセロ−（親リン脂質から加水分解される、両方の脂肪酸）を意味し、ｔｏｔは総計の完全及び加水分解リン脂質を意味する。ＰＣとＰＥに関しては、大きい加水分解度がはっきりと認められた。しかし、主要なクラスの総加水分解プラス完全リン脂質プロフィルは、出発物質の同プロフィルとはかなり変化しており、このことは、他の反応が行われたことを示唆した。３１Ｐ ＮＭＲスペクトルには、ホスホリパーゼＣ活性を有する生成物を暗示することができる、幾つかの新しい同定されないピークが形成されており、この不一致を説明することができた。
【００７１】
表２：イガイ酵素抽出物を用いたリン脂質加水分解
【００７２】
【表２】
【００７３】
実施例７：ＤＭＥを用いたホキ頭部の抽出
この実施例は、ＤＭＥ抽出後にＤＭＥとリン脂質との間に一時的な複合体が形成される(ＤＭＥ−水和)ために、海洋に基づく(marine-based)複合脂質から中性脂質が分離されうることを示す。凍結したホキ魚頭部をミンチング装置(mincer)に通した。この頭部ミンチ(minced heads)を次に、凍結乾燥機トレーに載せ、凍結させ、その後凍結乾燥させた。次に、乾燥した頭部ミンチをナイフミルでさらに摩砕して、粉末にしてから、ＤＭＥを用いて４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。実施例４に記載した一般的方法を用いて、粉末１９７０．６ｇをＤＭＥ１５．４０８ｋｇによって抽出した。褐色液体の脂質富化抽出物が得られ、これは、放置すると(upon standing)、中性脂質富化相とリン脂質富化相とに分離し始めた。相分離を促進するために、該抽出物を遠心分離した。上部の中性脂質相は僅か２．５％のリン脂質を含有した。下部の“ガム”相はＤＭＥ水和リン脂質を１９．２質量％で含有した。次に、下部相中のＤＭＥを真空下で取り出し、リン脂質３３．２％とガングリオシド０．５％を含有する抽出物を得た。この複合脂質濃縮物はＥＰＡ５．８％、ＤＨＡ１２．７％及び他のＨＵＦＡ３．６％を含有した。
【００７４】
実施例８：ＤＭＥを用いたレモン魚(lemon fish)肉の抽出
この実施例は、ＨＵＦＡに非常に富んだ複合脂質が魚肉から抽出されうることを示す。新鮮なレモン魚肉を複数個のキューブにカットしてから、凍結乾燥させた。乾燥した魚肉キューブを次にナイフミルでさらに摩砕して、粉末にしてから、ＤＭＥを用いて４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。実施例１と２に記載した一般的方法を用いて、粉末１３５．９５ｇをＤＭＥ８８６．７ｇによって抽出した。リン脂質に非常に富んだ（６４質量％）黄色半固体の抽出物が２．６％の収率で得られた。該抽出物のリン脂質画分は、ＰＣ４６．２％、ＰＩ７．９％、ＰＳ３．５％、ＰＥ２５．０％、ＳＭ５．２％及びＣＬ７．９％を含有した。該抽出物は、特にＤＨＡに富んでおり、ＤＨＡは総脂肪酸の２４．９％であった。複合脂質抽出物はさらに、ＤＰＡ４．５％、ＥＰＡ５．３％及びＡＡ６．７％をも含有した。非変性魚タンパク質は食品サプルメントとして使用可能である。
【００７５】
実施例９：ＤＭＥによるヒツジ及びブタ膵臓の抽出と、超臨界ＣＯ２による該脂質抽出物の再抽出
この実施例は、超臨界ＣＯ２を用いて、粗ＤＭＥ抽出物から中性脂質を再抽出することができることと、残留固体から活性ホスホリパーゼ酵素とタンパク質分解酵素の両方を抽出することができることを示す。凍結乾燥したウシ及びブタ膵臓サンプルを液体ＤＭＥを用いて、４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。実施例１と２に記載した一般的方法を用いて、ウシ膵臓１２０．７２ｇをＤＭＥ１１９３．４ｇによって抽出した。中性脂質に非常に富んだ、黄色／緑色半固体の抽出物が４４．８％の収率で得られた。該抽出物は僅か１９％のリン脂質、ＡＡ０．７％及びＤＰＡ０．７％を含有した。実施例１と２に記載した一般的方法を用いて、ブタ膵臓１２０．１８ｇをＤＭＥ１２４０．２ｇによって抽出した。中性脂質に非常に富んだ、黄色半固体の抽出物が２４．０％の収率で得られた。該抽出物は、僅か１３％のリン脂質、ＡＡ１．５％を含有したが、ＥＰＡ又はＤＰＡのいずれも含有しなかった。次に、ウシ及びブタの粗膵臓抽出物を超臨界ＣＯ２によって３００bar及び３３３Ｋにおいて、中性脂質が抽出物としてもはや回収されなくなるまで、再抽出した。その後に、該抽出物と残留複合脂質濃縮物とを再分析した。該ウシ複合脂質は、ＡＡ２．３％、ＥＰＡ１．４％及びＡＬＡ１．８％を含有した。ブタ複合脂質は、ＡＡ４．８％と、ＥＰＡ及びＤＰＡ各１％未満を含有した。次に、ヒツジ及びブタの残留脱脂膵臓固体をそれらのタンパク質分解活性とホスホリパーゼ活性に関して試験した。
【００７６】
ホスホリパーゼ活性は、次のように測定した：脱脂ウシ膵臓（０．６５ｇ）と脱脂ブタ膵臓（０．９８ｇ）固体を蒸留水（２０ｍｌ）中で混合してから、遠心分離した。上清膵臓調製物アリコート（２ｍｌ）を、水（１０ｍｌ）中のＰＣ〜２４％、ＰＥ３４％及びＰＳ１２％を含有するリン脂質混合物モデル（１ｇ）のエマルジョンに加えて、４０℃に１６時間維持した。該反応混合物のサンプル（０．２ｍｌ）を３１Ｐ−ＮＭＲによってリン脂質組成に関して分析した。リン脂質の加水分解度を表３に示す、表３では、Ｌはリゾ−（親リン脂質から加水分解される、１つの脂肪酸）を意味し、Ｇはグリセロ−（親リン脂質から加水分解される、両方の脂肪酸）を意味する。ブタ膵臓は、顕著なホスホリパーゼＡ２活性を示し、ＰＥ＞ＰＳ＞ＰＣの優先的加水分解であった。ウシ膵臓は、ブタ膵臓に比べて非常に低い、ＰＥ及びＰＣに対するホスホリパーゼＡ２活性を示したが、ＰＳの同様な加水分解レベルを示した。
【００７７】
表３：ホスホリパーゼＡ２活性
【００７８】
【表３】
【００７９】
ＤＭＥ抽出後に残留するプロテアーゼ活性を次のように測定した。ＤＭＥ抽出したブタ膵臓の凍結乾燥粉末（０．９８３４ｇ）を１００ｍＭＣａＣｌ２（３９ｍｇ／ｍｌ）２５ｍｌによって抽出して、ＤＭＥ抽出したウシ膵臓（０．６５ｇ）を１００ｍＭＣａＣｌ２（２６ｍｇ／ｍｌ）２５ｍｌによって抽出した。該抽出物を酵素の自己活性化の前後に試験して、ブタ及びヒツジの凍結膵臓から調製した標準膵臓抽出物に比較した。収率は、ＤＭＥ抽出粉末に関しては表４に、凍結した基準サンプルに関しては表５に示す。
【００８０】
表４：ＤＭＥ抽出した凍結乾燥膵臓粉末からの膵臓プロテアーゼ収率
【００８１】
【表４】
【００８２】
表５：凍結したブタ及びヒツジ膵臓から抽出し、活性化した標準プロテアーゼレベル
【００８３】
【表５】
【００８４】
データは、標準条件を用いた、ヒツジ及びブタ膵臓２５ｇの抽出に基づくものである。活性化が完了した後に酵素活性を測定した、該活性化完了は、トリプシン活性が最大レベルに達した後にトリプシン活性の僅かな低下によって判断した。エラスターゼＩＩ活性の検出に用いた基質ＳＡＡＰＬｐＮＡは、エラスターゼＩ及びキモトリプシンによっても加水分解される。それ故、エラスターゼＩＩ活性はこの基質を用いて推定した。
【００８５】
ＤＭＥによる凍結乾燥膵臓の抽出は、ブタ膵臓の総プロテアーゼ含量を殆ど減少させていない。予めＤＭＥによって抽出された凍結乾燥ウシ膵臓中で検出された低レベルの酵素活性は、膵臓を採取した動物の種変化(species variation)及び／又は年齢に帰することができる。ｐＨ調節によって誘導される酵素前駆体活性化の前に、比較的高いプロテアーゼレベルが最初に検出されたことで判断されるように、ＤＭＥ処理粉末ではかなりのレベルの自己活性化が観察された。検出された初期トリプシン活性は、抽出物ｐＨを活性化により適した値（例えば、ｐＨ８．５）に調節すると、酵素前駆体の完全な活性化のために充分であった。対照的に、凍結膵臓からの膵臓酵素前駆体の活性化は、外因性トリプシンの添加を必要とする。
【００８６】
活性化した凍結膵臓とＤＭＥ抽出した凍結乾燥膵臓とから得られるタンパク質分解プロフィルの比較は、ＤＭＥ抽出後にかなりの酵素活性が保持されることを示す。凍結膵臓からのエラスターゼＩの典型的な抽出効率は、０．６７μｍｏｌ／分／組織ｇの収量を生じたが、ＤＭＥ抽出した凍結乾燥ブタ膵臓から得たエラスターゼＩの該抽出効率は６７．４μｍｏｌ／分／組織ｇの収量を生じた。トリプシン収量は、予想値より低いように思われるが、これは、トリプシン仲介加水分解を受ける他のプロテアーゼ（凍結膵臓からの抽出中にそれらの活性を低下させる）の予想よりも高い収量を説明することができる。
【００８７】
実施例１０：ＤＭＥによるホキ肝臓の抽出
この実施例は、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質が湿潤バイオマスから直接抽出されうることを示す。商業的に入手した凍結全ホキ魚肝臓を、大きい全体サイズでUrschelグラインダーに通して、該肝臓を複数個のチャンクに切断した。次に、浸軟した肝臓をＤＭＥによって、６０℃及び４０barにおいて２時間抽出した。ＤＭＥ３１．９９６ｋｇを湿潤肝臓６．７４２７ｋｇに通した。水分と、高度不飽和脂肪酸含有脂質から成る抽出物２．２３４ｋｇを入手した。部分的に抽出した残留固体を次に再混合して、ＤＭＥによって同じ条件において３時間再抽出した。ＤＭＥ４８．４６ｋｇを該肝臓に通して、さらに抽出物１．８３４ｋｇを回収した、これは殆ど水であった。水の蒸発後に、全体で２．３０８２ｋｇの油が得られた。この油は、ＤＨＡ９．３５％、ＤＰＡ１．４３％、ＥＰＡ４．９１％、Ｃ２０：４ｗ−３ １．３％、ＡＡ０．６％及びＣ１８：３とＣ１８：４ｗ−３ １．９％を含有した。残留固体をトランス−グルタミナーゼ活性に関して試験したが、該酵素はこの抽出プロセスによって不活性化されていた。
【００８８】
実施例１１：非メチレン中断脂肪酸に富んだ脂質を得るためのＤＭＥによる松の木種子の抽出
この実施例は、松種子をＤＭＥで抽出して、非メチレン中断脂肪酸に富んだ脂質抽出物を得ることができることを示す。松種ビオタ・オリエンタルス（Biota Orientalis）の商業的に入手可能な種子を、ＤＭＥによる抽出前に部分的に低温圧縮した（cold-pressed）。残留した低温圧縮種子ケーキは約３５質量％の中性油（プレ圧縮基準で(on a prepressed basis)２６％）を含有した。圧縮種子ケーキをＤＭＥによって、６０℃及び４０barにおいて１５０分間抽出した。ＤＭＥ３７．０６ｋｇを部分的圧縮種子１４．０３８５ｋｇに通した。抽出物５．９４２ｋｇが得られた、これは中性脂質、複合脂質及び水の混合物であった。該抽出物を遠心分離によって相に分離した。中性脂質油４．８４７ｋｇが上部相として単離された。この油は、ジュニペロン酸（Ｃ２０：４非メチレン中断脂肪酸）９．９％、シアドン酸（Ｃ２０：３非メチレン中断脂肪酸）４．３％及びα−リノレン酸３３．２％を含有した。同定されない複合脂質０．４８８ｇが中間相として単離された。これは、主要脂質生成物と同様な脂肪酸組成を有した。
【００８９】
実施例１２：ＤＭＥによる緑イガイスラリーの抽出と、続いての超臨界ＣＯ２抽出による中性脂質と複合脂質の分離
この実施例は、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を動物組織のスラリーから抽出することができることを示す。実施例６で製造された、緑イガイ固体のスラリーを乾燥させずに抽出した。この場合には、微細なイガイ固体(finely divided mussel solids)含有スラリーを高圧において抽出容器中に供給して、同時に該容器内側の縦型静的ミキサー中で４０barの圧力及び６０℃の抽出温度においてＤＭＥと接触させた。抽出された固体は、該抽出容器の底部上に沈着した。ＤＭＥと、溶解した脂質及び水を該容器の頂部から出して、前記実施例に記載したように分離容器につながる、減圧バルブ及び熱交換器に通した。ＤＭＥ５２．９０６ｋｇを３３３Ｋ及び４０barにおいて、イガイスラリー溶液６．１３５９ｋｇと接触させて、真空下で水分の除去後に、ＨＵＦＡに富んだ（Ｃ１８：３とＣ１８：４ｗ−３ ３．４％；ＥＰＡ１８．７％、ＤＨＡ１１．１％）複合脂質及び中性脂質を含有する抽出物８０．４ｇを得た。残留固体を凍結乾燥させて、乾燥基準で脂質収率を測定して、９．０質量％であることを見出した。次に、凍結乾燥固体を摩砕して、実施例６と同じ方法によって再抽出したが、僅か０．３質量％のさらなる収率が得られたにすぎず、このことは、該スラリーからの抽出が殆ど完了していることを示す。次に、脂質抽出物４９．７４ｇを超臨界ＣＯ２によって３３３Ｋ及び３００barにおいて再抽出して、２９．１０ｇの中性脂質を得た（総脂質基準で５８．４％収率）。該抽出物はＨＵＦＡに富んでいた（Ｃ１８：３とＣ１８：４ｗ−３ ４．０％；ＥＰＡ２０．２％、ＤＨＡ１１．０％）。殆ど全てが実施例６に記載した種類の複合脂質である残渣も、ＨＵＦＡに富んでいた（Ｃ１８：３とＣ１８：４ｗ−３ ２．４％；ＥＰＡ１７．２％、ＤＨＡ１２．６％）。
【００９０】
実施例１３：超臨界ＣＯ２とその後のＤＭＥによる凍結乾燥オキアミの抽出と、ＤＭＥ抽出に続いての超臨界ＣＯ２再抽出による、ＨＵＦＡに富んだ複合脂質からの中性脂質の分離
この実施例は、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質が凍結乾燥オキアミから、最初にＣＯ２による抽出によって中性脂質を抽出し、次にＤＭＥによる抽出によって、ＨＵＦＡに富んだ複合脂質を抽出することによって、又はＤＭＥを用いてオキアミから総脂質を抽出し、次に、総脂質抽出物を超臨界ＣＯ２によって再抽出して、中性脂質を取り出すことによって抽出されうることを示す。１２．２％脂質を含有する凍結乾燥オキアミ粉末１８０．１２ｇを超臨界ＣＯ２によって３００bar及び３１４Ｋにおいて抽出して、脂質１１．２８ｇを得た。次に、残留オキアミ粉末をＤＭＥによって４０bar及び３３２Ｋにおいて抽出して、ＥＰＡ２０％、ＤＨＡ１５．６％及び総ＨＵＦＡ３８％を含有する、リン脂質に富んだ脂質３．３０ｇを得た。脂質２１．４％を含有する第２オキアミ粉末３．０６０３ｋｇをパイロット規模でＤＭＥ１７．２７１ｋｇを用いて、４０bar及び３５７Ｋにおいて抽出して、脂質富化抽出物６５２．１ｇを得た、これは、存在する総脂肪酸のうちＥＰＡ１４．０％及びＤＨＡ９．０％を含有した。次に、この脂質富化抽出物１００．３２ｇを超臨界ＣＯ２２６．２１ｋｇを用いて３００bar及び３１４Ｋにおいて再抽出して、リン脂質に非常に富んだ（７６．６％）（ＥＰＡ２８．８％、ＤＨＡ２１．９％及び総ＨＵＦＡ５５．６％を含有する）非抽出脂質残渣３３．０４ｇを得た。
【００９１】
実施例１４：ＤＭＥを用いた、湿潤及び乾燥モルチエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)バイオマスからの脂質の抽出
この実施例では、微生物モルチエレラ・アルピナ（strain IRL176）を発酵させて、アラキドン酸に富んだ脂質を得た。次に、該バイオマスを湿潤バイオマスとして又は乾燥物質としてのいずれかで抽出して、アラキドン酸に非常に富んだ抽出物を得た。ポテト・デキストロース寒天（ＰＤＡ）２５ｍｌによって、１５０ｍｌルー・フラスコ(roux flask)を作製した。このルー・フラスコに胞子ストック(spore stock)０．１ｍｌを接種して、室温において１ヶ月間インキュベートした。濃厚な胞子ストックをＰＤＡルー・フラスコの表面からすくい取って、ポテト・デキストロース培地２００ｍｌを有する５００ｍｌバッフルなし振とうフラスコ中に接種した。シード振とうフラスコ(seed shake flask)を回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）上で２５℃において９６時間インキュベートした。該シード振とうフラスコの１５ｍｌサンプルを、グルコース４０ｇ／Ｌ及び酵母１０ｇ／Ｌを含有する、１３ｘ５００ｍｌ（全体で２０００ｍｌ）バッフルなし振とうフラスコ中に接種した。生産用振とうフラスコを回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）上で２５℃において７日間インキュベートした。培養物を収穫して、バイオマスを濾過によって回収した（濾紙Ｎｏ．１）。回収した細胞を６０℃水で１：１（vol/vol）の濃度において洗浄した。乾燥した細胞重量は１２．２ｇ／Ｌであった。新鮮な湿潤バイオマス２１８．８５ｇをＤＭＥによって抽出したが、低レベルの脂質を有する、僅か１．８９ｇの抽出物が回収されたに過ぎなかった。このことは、細胞が破裂されなかったことを示唆した。次に、新鮮な湿潤バイオマスの第２バッチ１５０．１４ｇを凍結させ、続いて摩砕してから、ＤＭＥ２．４１６ｋｇによって３３３Ｋ及び４０barにおいて抽出した。凍結と次の摩砕は細胞を破裂させて、油の抽出を可能にした。油（６．５１ｇ）と水（９９．５３ｇ）の混合物が抽出された。該油は、アラキドン酸３１．８％、ＧＬＡ１３．８％及び総ＰＵＦＡ５５．９％を含有した。次に、抽出後の残留バイオマス（３７．３４ｇ）を強制対流オーブン内で３１３Ｋにおいて一晩乾燥させて、最終乾燥質量３０．０２ｇを得た。次に、この乾燥バイオマスを乳鉢と乳棒で摩砕した。次に、この乾燥バイオマス２７．６１ｇをＤＭＥ０．８４０ｋｇによって３３３Ｋ及び４０barにおいて抽出して、さらに３．８７ｇの脂質を回収した、これはアラキドン酸３３．２％、ＧＬＡ１４．１％及び総ＰＵＦＡ５７．３％を含有した。
【００９２】
実施例１５：ＤＭＥを用いた、高度不飽和藻類脂質の抽出
ニツシア・レビス(Nitzschia Laevis)の混合栄養的及び有機栄養的発酵で得られた湿潤バイオマス５８．２９ｇを凍結させてから、ＤＭＥ１５８４ｇによって、４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。総抽出物５３．１０ｇが得られた、これは、水４３．５５ｇと、中性及び複合脂質（ＡＡ２．２％、ＥＰＡ１１．８％及びＤＨＡ２．８％を含有した）９．５５ｇから成るものであった。該脂質混合物を真空下での蒸発によって該水から分離した。乾燥脂質混合物２．１６１ｇを、超臨界ＣＯ２１０８ｇを用いて、３００bar及び３３３Ｋにおいて抽出して、ＡＡ１．４％、ＥＰＡ８．２％及びＤＨＡ２．２％のみを含有する中性脂質０．５６０ｇを得た。抽出後の残留複合脂質物質は、ＡＡ４．２％、ＥＰＡ２０．０％及びＤＨＡ３．４％を含有した。
【００９３】
産業上の利用可能性
本発明の方法は、例えば、乾燥した若しくは部分的に乾燥した植物若しくは種子（海洋種若しくは陸生種を包含する）或いは動物物品（海洋若しくは陸生種又は微生物を包含する）のような物質から高度不飽和脂質（脂肪酸）を抽出するために有用である。高度不飽和脂質は、幼児の脳及び視力の発達に極めて重要であり、心臓血管系健康、精神的健康、免疫及び炎症状態に対しても有益でありうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離技術に関する。特に、本発明は、液体ジメチルエーテル（ＤＭＥ）によって、さらに、場合によっては、近臨界二酸化炭素によって、例えば、乾燥した若しくは部分的に乾燥した植物若しくは種子（海洋若しくは陸生の種を包含する）又は動物物品(animal products)（海洋若しくは陸生の種を包含する）のような物質を抽出して、高度不飽和脂質、特に高度不飽和複合脂質に富んだ抽出物と、場合によっては、ニュートラシューティカル(nutraceutical)として有用である又は水溶性酵素及び／又はタンパク質の抽出のために有用である残渣を得ることに関する。
【０００２】
背景
高度不飽和脂質（脂肪酸鎖中に３つ以上の不飽和部位と１８個以上の炭素を有する脂質）は、人体内で多様な代謝性役割を有する。これらは、新生児の脳及び視力の発達に重要であり、さらに、心臓血管系的健康、精神的健康、免疫状態及び炎症性状態のためにも有利でありうる。これらの脂質の生物学的性質は、存在する脂肪酸の種類に通常依存し、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質が最もバイオアクティブである。一般に、これらの高度不飽和脂肪酸は陸生植物及び動物では複合脂質中にのみ有意な量で見出されるが、海洋動物の中性脂質及び複合脂質中の両方にも出現する可能性がある。
【０００３】
リン脂質は、複合脂質のサブセットである。リン脂質は、あらゆる哺乳動物の細胞膜の必須成分であり、細胞膜の流動性及び該膜を通る分子の通過の維持に重要な役割を果たしている。高度不飽和アラキドン酸（Ｃ２０：４．ｗ−６）は動物由来の二次産物（例えば、非ヒト乳からのリン脂質）には存在しないか、又はごく低濃度で存在する。アラキドン酸は、新生児の発達のために極めて重要であり、そのため、非ヒト乳から製造された新生児用処方にはこの脂肪酸が補充される。それ故、この目的のためにこの脂肪酸の供給源を確保する必要性が存在する。多くの動物組織（特に、器官及び腺）の複合脂質は、卵と同様に、アラキドン酸に富んでいる。
【０００４】
苔とシダも、複合脂質形で高レベルのアラキドン酸を含有することが知られている。それ故、特に、該脂肪酸の複合脂質形は酸化に対する保護を与えるので、この高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）を複合脂質形で回収することができる抽出技術を発見することが望ましい。
【０００５】
海洋生物（ミクロ及びマクロ藻類、魚の身、卵及び肝臓、軟体動物、無脊椎動物）は、中性及び／又は複合脂質形でのＨＵＦＡｓエイコサペンタン酸（Ｃ２０：５．ｗ−３）及びドコサヘキサン酸（Ｃ２０：６．ｗ−３）の豊富な供給源である。これらの脂肪酸は、新生児処方の補充のために、並びに神経疾患、心臓血管系疾患、炎症、及び血液中の脂質含有量の制御に用いるためにも必要である。これらのポリ不飽和脂肪酸を回収することができる抽出技術を発見することも望ましい。
【０００６】
同様に、或る一定の植物からの種子、特に、黒松(pinus)及び槙(podocarp)の樹からの種子は、非メチレン中断(non-methylene interrupted)ポリ不飽和脂肪酸（Ｃ２０：３とＣ２０：４）に富んだ複合脂質を含有する。非メチレン中断脂肪酸は、満腹を制御するために(for controlling satiety)及び可能な抗炎症薬として用いられる。それ故、これらのポリ不飽和脂肪酸を回収することができる抽出技術を発見する必要性がある。
【０００７】
超臨界ＣＯ２を用いる中性脂質の抽出は、特に種子油の抽出において、周知である。これらの方法の欠点は、一般に、原材料を入れるために大型高圧容器（典型的に、３００bar以上の圧力を用いる）が必要であることであり、このことが生産プラントを非常に費用のかかるものにする。さらに、該油は超臨界ＣＯ２中に非常に低い溶解度（通常、溶媒１００ｇにつき油１ｇ）を有するので、高い流速度及び長い抽出時間も必要である。海洋種からの脂質の抽出に関する刊行物(publications)はごく僅かである。米国特許6,083,536は、炎症状態の治療に有用な非極性脂質画分を得るための、粗凍結乾燥イガイ類粉末からの非極性脂質の抽出方法を述べている。新鮮なイガイ類を、凍結乾燥及びＣＯ２抽出の前に、酒石酸で安定化させる。抽出物の組成データは記載されていず、複合脂質はＣＯ２中に不溶であるので、複合脂質は抽出されない。
【０００８】
米国特許4,367,178は、超臨界ＣＯ２を用いて、中性脂質を抽出し、不溶性リン脂質を残し、それによって、レシチン中のリン脂質を濃縮することによる粗大豆レシチンの精製方法を述べている。粗レシチンは、大豆油の慣用的なデガミング(degumming)によって生産されている。ＣＯ２の限界を克服するために、超臨界ＣＯ２の溶解力(solvent power)を高めるための例えばエタノールのような共溶媒の使用が提案されている。
【０００９】
ＥＰ1,004,245 A2は、乾燥した卵を最初に超臨界ＣＯ２によって抽出して、中性脂質を除去し、次に、超臨界ＣＯ２と室温において液体である有機共溶媒（エタノール）によって、又は有機溶媒（ＣＯ２なし）によってのいずれかで抽出して、リン脂質を抽出する方法を述べている。両方のオプションは、リン脂質の抽出が不完全だという欠点を有する。さらに、両方は、脱脂卵粉末中に溶媒残渣を残し、これはタンパク質の変性をもたらす。超臨界ＣＯ２抽出によって得られる中性卵脂質は、実施例３に示すように、高度不飽和脂肪酸の無視できるほどのレベルを有する。
【００１０】
Arntfield et al.(JAOCS, 69, 1992, 823-825)は、卵タンパク質がＣＯ２と共溶媒としてのメタノールによる抽出後に実質的に変性することを示している。超臨界ＣＯ２と共にエタノールを用いると、リン脂質の不完全な抽出が生じる。ホスファチジルコリンは最も容易に抽出されるリン脂質であるが、他の全てのリン脂質は非常に低い溶解度を有するか若しくは溶解度を全く有さず、抽出されない（Teberliker et al., JAOCS, 78, 2002, 115-119）。Schriener et al.(Journal of Food Lipids, 13, 2006, 36-56)は、卵黄脂質中の高度不飽和脂肪酸の大部分が、この方法では抽出されないホスファチジルエタノールアミン中に存在することを示している。
【００１１】
PCT公開WO 02/092540は、ＨＵＦＡｓを含有する極性脂質の医療的使用と、極性脂質と他の油とのブレンドを開示している。該抽出方法は、アルコールと遠心分離を用いるものとして開示されているが、さらなる詳細は記載されていない。デガミングの工業的方法による食用種子油抽出の副産物として、極性脂質富化画分を得ることができることも開示されている。
【００１２】
湿ったリン脂質含有物質からのＨＵＦＡ含有リン脂質の抽出方法は、ＰＣＴ公開WO 2005/072477に開示されている。脂肪族アルコール、特に、イソプロパノール及び／又はｎ−プロパノールが用いられる。リン脂質を含有する物質を水溶性脂肪族アルコールと、該リン脂質が溶媒中に溶解するほど充分に高い温度において接触させる、この間に、変性するタンパク質は該溶液から沈殿する。
【００１３】
粗卵黄から(米国特許4,157,404)及び乾燥卵粉末から（米国特許4,234,619）の脂質の抽出には、これまではＤＭＥが用いられていた。該方法は、脂質成分とタンパク質成分を別々の流れに分画させる。米国特許4,157,404は、粗卵黄（水分含量５０〜５５％）からの脂質の抽出を述べているが、この方法ではタンパク質は変性する。上記方法はまた、回収された脂質と水との混合物を２０％以下の水分含量までに脱水して、その後に中性富化相と複合脂質／水富化相の相分離を生じさせることを必要とする。米国特許4,234,619は、卵が乾燥している場合にはタンパク質は変性しないが、この場合に、リン脂質は部分的にのみ抽出されうることを開示している。上記方法では、ＤＭＥを−３０℃〜４０℃の温度範囲内で用い、噴霧乾燥した全卵粉末を用いて、最大で７０％収率のみのリン脂質が得られた。本発明の所望の生成物は、少なくとも３０％のその本来のリン脂質含量を含有し、コレステロールを含有しない卵粉末であった。高度不飽和脂肪酸の回収及び濃縮の方法は開示されていない。さらに、用いた抽出及び分離温度が低いために、総脂質抽出物中の中性脂質と複合脂質を別々の画分に分離することは思い付かれなかった。
【００１４】
PCT公開WO2004/066744は、DMEが溶媒である場合に近臨界抽出を用いて、水性乳流(aqueous dairy stream)から脂質を抽出することを述べている。この公開はさらに、超臨界CO2も液体DMEも乾燥ホウェイタンパク質濃縮物（WPC）乳粉末から有用な収率で脂質を抽出することができないことも開示している。該方法は、乾燥した動物又は植物組織からHUFA極性脂質を抽出する方法を開示していない。ホウェイタンパク質は動物又は植物組織中に見出されず、得られた脂質は高度不飽和脂肪酸を含有しない。
【００１５】
ＮＺ535894は、脱脂乳粉末の製造から生じる乳リポタンパク質／ラクトース混合物である乳脂球状膜タンパク質を含有する噴霧乾燥酪農産物からの脂質の抽出を開示している。このタンパク質は、乳のクリーム画分に付随しており、動物又は植物の組織には見出さない。液体DMEを用いた抽出によって、高ラクトース含量（この場合、高ラクトース含量は総粉末の少なくとも３０質量％を意味する）を有するこの乳粉末流から脂質を抽出する試みは不成功であり、粉末の製造の前にラクトース含量を減ずることが必要であった。該脂質はＨＵＦＡｓを含有しないので、乾燥した動物又は植物の組織からHUFA脂質を抽出する方法の開示は存在しない。抽出後の残留粉末は約６〜８％の複合脂質をなおも含有する。
【００１６】
ＰＣＴ公開WO2006/058382は、液体ＤＭＥを用いて、或る範囲の物質から抽出物を得る方法を大ざっぱに述べている。しかし、ＨＵＦＡｓの抽出は記載されていず、中性脂質からの複合脂質の分離も記載されていない。記載されている方法は、液体ＤＭＥを用いる、簡単な慣用的方法である。実際に、幾らか詳細に記載されている唯一の方法は、ＨＵＦＡｓを含有しないホホバ種子から抽出物を得るための、液体ＤＭＥを用いる方法である。
【００１７】
動物及び植物材料に由来する産物中に存在するタンパク質及び他の複合炭水化物の種類（及び該材料を乾燥させる方法）が、脂質を上首尾に抽出することができるか否かを決定することは、明らかである。植物又は動物組織中に存在するタンパク質及び複合炭水化物は、例えば乳のような、動物に由来する二次産物中に見出されるものとは実質的に異なる。それ故、脂質の抽出、特に、高度不飽和脂肪酸を含有する複合脂質の抽出が、細胞及び組織に関連してタンパク質及び複合炭水化物を含有する植物又は動物組織から、ジメチルエーテルを用いて可能であるかどうかを、何らかの確実性で予測することは一般に不可能である。
【００１８】
意外にも、本出願人は、液体ＤＭＥを植物又は動物材料からＨＵＦＡｓを得るための効果的な抽出剤として用いることができること、及び特に、中性脂質及び複合脂質から成る液体抽出物中の残留ＤＭＥが複合脂質を含有するガム状相の形成を可能にし、該ガム状相はその後容易に中性脂質から分離されることを発見している。
【００１９】
高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得るための方法を提供すること、又は少なくとも、他の方法の有用な代替手段を提供することが、本発明の目的である。
発明の説明
本発明は、第１態様では、植物又は動物材料から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得る方法であって、（ｉ）該材料を液体ジメチルエーテルと接触させて、脂質を含有するジメチルエーテル溶液と、植物又は動物材料の残渣を得る工程；（ｉｉ）該溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及び（ｉｉｉ）該溶液から脂質を回収する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の或る一定の好ましい実施態様では、工程（ｉ）で該材料との接触後に形成される該溶液は、中性脂質と複合脂質を含有する。
好ましくは、中性脂質を該溶液から、複合脂質と一緒に回収する。その後に、好ましくは、中性脂質を複合脂質から分離する。
【００２１】
該複合脂質は、回収工程（ｉｉｉ）中に溶解ジメチルエーテルとガム相を形成することができる。好ましくは、複合脂質を含有するガム相を、中性脂質を含有する溶液から分離する。
【００２２】
好ましくは、中性脂質を複合脂質から、相分離によって分離する。分離を助けるために、遠心分離を用いることもできる。遠心分離の前に、加熱を利用することもできる。次に、好ましくは、複合脂質を真空乾燥によって乾燥させる。
【００２３】
本発明の方法は、好ましくは、工程（ｉｉｉ）において溶液から回収された脂質を超臨界ＣＯ２によって、下記工程：（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において溶液から回収した脂質を超臨界ＣＯ２と接触させて、中性脂質を含有するＣＯ２溶液と、複合脂質の残渣を得る工程；（ｖ）中性脂質を含有する該ＣＯ2溶液を複合脂質の該残渣から分離する工程；及び（ｖｉ）該ＣＯ２溶液から該中性脂質を回収する工程に従って処理することをさらに含む。
【００２４】
本発明の或る一定の実施態様では、工程（ｉ）において液体ジメチルエーテルと接触させるべき植物又は動物材料を最初に、近臨界ＣＯ２によって、下記工程：ａ．該材料を近臨界ＣＯ２と接触させて、中性脂質を含有するＣＯ２溶液と植物又は動物材料の残渣を得る工程；ｂ．該ＣＯ２溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及びｃ．該中性脂質を該ＣＯ２溶液から回収する工程に従って処理する。
【００２５】
本発明の好ましい方法では、該植物又は動物材料を、使用前に、乾燥させる又は部分的に乾燥させる。好ましくは、該植物又は動物材料を、該材料中の水分が３０重量％未満になるまで、より好ましくは、該材料中の水分が５重量％以上であるように、乾燥させる。好ましくは、該植物又は動物材料を凍結乾燥によって又は噴霧乾燥によって乾燥させる。
【００２６】
本発明の或る一定の実施態様では、該植物又は動物材料が、凍結されている湿潤バイオマスである。典型的には、凍結した湿潤バイオマスを抽出の前に摩砕する。
好ましくは、複合脂質の１種類以上が、リン脂質、ガングリオシド、糖脂質、セレブロシド、又はスフィンゴ脂質であり、典型的にはリン脂質である。該リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、プラズマローゲン、アルキルアシルリン脂質、ホスホノ脂質、リゾリン脂質、セラミド・アミノエチルホスホネート、及びホスファチジン酸のいずれか１つ以上を含むことができる。該糖脂質は、ガラクト脂質、ガングリオ脂質、スルホキノボイスルジアシルグリセリド(sulphoquinovoysldiacylglycerides)、タウロ糖脂質、グリコスフィンゴリン脂質、及びマンノシル脂質を包含することができる。
【００２７】
該複合脂質中に含有される高度不飽和脂肪酸は、好ましくは、非限定的に、アラキドン酸（ＡＡ）、α−及びγ−リノレン酸、ピノレン酸、シアドン酸、コランビン酸(columbinic acid)、ジホモリノレン酸、エイコサテトラエン酸、ジュニペロン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のいずれか１つ以上を含む。
【００２８】
さらに、該植物又は動物材料を、動物の器官、動物の腺、海洋マクロ−及びミクロ−藻類、発酵によって培養される脂質含有微生物（特に、糸状菌、藻類、酵母及び細菌）、貝類、魚類、海洋無脊椎動物、卵、植物の種子、植物の葉、植物の針、シダの葉、苔、及び地衣類から成る群のいずれか１種類から得ることも好ましい。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、該液体ジメチルエーテルは近臨界ジメチルエーテルである。
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を提供する。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる複合脂質を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる中性脂質を提供する。
さらに他の態様では、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質が本発明の方法によって抽出されている植物又は動物材料を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、高度不飽和脂肪酸を含有する複合脂質が本発明の方法によって抽出されている植物又は動物材料の、ニュートラシューティカル(nutraceutical)、食品サプルメントとして、又は酵素供給源としての使用を提供する。
【００３２】
詳細な説明
定義
脂肪酸とは、典型的に炭素原子６個以上の炭化水素鎖を有する、任意の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸を意味する。脂肪酸は、炭素原子数（例えば、Ｃ２０）、不飽和結合部位の数（例えば、Ｃ２０：４）、脂肪酸のメチル末端からの第１不飽和結合部位の位置（例えば、Ｃ２０：４ ｗ−３）、及び不飽和結合部位を分離する炭素数に従って分類される。通常は、１個の炭素が不飽和結合部位を分離する（“メチレン中断型(methylene interrupted)”として知られる）、そして共役している（不飽和結合部位を分離する炭素が存在しない）場合のみ、短縮命名法で略称される、又は２個以上の炭素(more than one carbon)によって分離されている場合（“非メチレン中断型(non-methylene interrupted)”として知られる）には、脂肪酸のメチル末端からの該炭素の位置が記録される（例えば、５、１１、１４ Ｃ２０：３）。脂肪酸は、中性脂質と複合脂質の両方の構成要素である。中性脂質では、脂肪酸のみがエステル結合又はエーテル結合を介してグリセロールに結合する。脂肪酸は、非結合状態で存在することもでき、その場合には、“遊離脂肪酸”と呼ばれる。複合脂質では、脂肪酸とその他の（極性）構成要素がグリセロールに結合する。
【００３３】
多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、２個以上の不飽和結合部位を有する脂肪酸を意味する。
高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）は、脂肪酸鎖中に３個以上の不飽和結合部位と、１８個以上の炭素原子を有する脂肪酸を意味する。例には、アラキドン酸（ＡＡ）、α−（ＡＬＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ピノレン酸、シアドン酸、コランビン酸、ジホモリノレン酸、ジホモピノレン酸、ジュニペロン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が包含される。
【００３４】
複合脂質は、脂肪酸（及び密接に関連したエーテル、アミン及び炭化水素誘導体）；極性リン基（通常、リン酸エステル若しくはリン酸）、及び／又はアミノアルコール、及び／又は炭水化物；並びにグリセロールを含めた、少なくとも３種類の構築ブロックから成る脂質である。複合脂質は、リン脂質、ガングリオシド、糖脂質、セレブロシド、及びスフィンゴリン脂質を包含するが、これらに限定される訳ではない。リン脂質の例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、カルジオリピン（ＣＬ）、プラズマローゲン、リゾリン脂質、及びホスファチジン酸を包含する。
【００３５】
中性脂質は、１個若しくは２個の構築ブロック（いずれも極性リン基も炭水化物も含有しない）から成る脂質である。該構築ブロックは、脂肪酸、グリセロール、ステロール、脂肪アルコール、アミン、カロテノイド、及び自然発生炭水化物を包含する。中性脂質は、非限定的に、脂肪酸、モノ−、ジ−及びトリアシルグリセリド、セラミド、Ｎ−アシルエタノールアミン、ステロールとステロールエステル、カロテノイドとカロテノイドエステルを包含する。
【００３６】
ＤＭＥ水和複合脂質とは、水分子で水和された脂質に類似して、ＤＭＥとの弱い結合を形成している複合脂質を意味する。
臨界点とは、物質の液体と水蒸気の状態が同一になる点を意味する。
【００３７】
超臨界とは、物質の臨界点を超える圧力−温度領域を意味する。物質の臨界点を超えると（但し、臨界点に近接して(but close to the critical point)）、該物質は、液体と気体の両方の性質を有する流体状態になる。該流体は、液体に類似した密度と、気体に類似した粘度及び拡散率(diffusivity)を有する。
【００３８】
臨界未満とは、物質の蒸気圧に等しいか又は蒸気圧を超える圧力−温度領域（但し、臨界温度未満である）を意味する。“液化ガス”及び“圧縮液化ガス”なる用語は、該ガスの蒸気圧が抽出温度(extraction temperature)において少なくとも３barである、同一の領域を表すために用いることができる。
【００３９】
近臨界とは、物質の臨界点に近接した圧力−温度領域を意味する、したがって、臨界未満と超臨界の両方を包含する。近臨界は、換算温度範囲０．７０≦Ｔｒ≦１．２５（この場合、Ｔｒは、ＤＭＥの臨界温度Ｔｃによって割った温度である）；及びＴ＜Ｔｃに対する圧力範囲Ｐ＞Ｐｖ（この場合、Ｐｖは蒸気圧である）とＴ≧Ｔｃに対する圧力範囲Ｐ＞Ｐｃ（この場合、Ｐｃは臨界圧である）を包含する。
【００４０】
ニュートラシューティカルとは、食物から単離若しくは精製され、通常、食物とは関係しない医薬品形態で販売され、生理的利益を有し、慢性疾患に対する保護を与えることが実証された製品を意味する。
【００４１】
本発明
本発明は、植物又は動物材料から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得る方法であって、（ｉ）該材料を液体ジメチルエーテルと接触させて、脂質を含有するジメチルエーテル溶液と、植物又は動物材料の残渣を得る工程；（ｉｉ）該溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及び（ｉｉｉ）該溶液から脂質を回収する工程を含む方法を提供する。
【００４２】
該植物又は動物材料は、ＨＵＦＡｓを有する脂質を含有する、任意の動物組織又は植物組織であることができる。特に、該方法は、動物の器官及び腺、海洋マクロ−及びミクロ−藻類、発酵によって培養される脂質含有微生物、特に、糸状菌、藻類、酵母及び細菌；小海洋動物（貝類及び無脊椎動物）、卵、並びに植物の種子に関する。該植物又は動物組織は、細胞に関する物質(cellular materials)、タンパク質、脂質及び炭水化物を含めた、植物又は動物の部分又は全体物質を包含しうるが、植物又は動物に由来する二次産物（例えば、乳）を包含しない。
【００４３】
ＤＭＥは、標準室温及び圧において気体であるが、液体形では、自然産物から物質を抽出するための有効な溶媒であることが知られている。本発明の方法に用いる液体ＤＭＥは、典型的に、近臨界ＤＭＥである。好ましくは、液体ＤＭＥの圧力は、少なくとも、抽出の温度における蒸気圧に等しく、より好ましくは、該蒸気圧よりも少なくとも１０bar高い。温度は、好ましくは、２７３〜３７３Ｋの範囲内であり、より好ましくは、３１３〜３５３Ｋの範囲内である。抽出温度が高ければ高いほど、高度不飽和脂肪酸に富む複合脂質の収率が高くなる。典型的な抽出温度は約３３３Ｋである。この温度における典型的な抽出圧力は４０barであり、この圧力はＤＭＥの蒸気圧を充分に超える圧力であり、バイオマスが湿潤している場合に水分の最大の抽出を保証する。
【００４４】
該方法によって得られる脂質は、一般に、或る範囲の結合ＨＵＦＡｓを有する複合脂質の混合物である。該混合物の組成は、用いた植物又は動物材料の供給源に大きく依存するであろう。該植物又は動物材料が中性脂質をも含有する場合には、該中性脂質も該方法において抽出されるであろう。
【００４５】
出願人は、中性脂質と複合脂質から成る脂質抽出物中の残留ＤＭＥが、複合脂質含有ガム状相と中性脂質含有液体相の形成を生じる（但し、該中性脂質が高濃度（５質量％を超える）の遊離脂肪酸及び／又は部分的グリセリドを含有しない場合には）ことを発見している。該ガム相は、該中性脂質含有液体相よりも高い密度の半固溶体(semi-solid liquid)である。ＤＭＥが、水とリン脂質との間に形成される結合と同様に、複合脂質（特に、リン脂質）との弱い結合を形成しうることが前提とされる。ガム状相中のいわゆるＤＭＥ水和複合脂質(DME-hydrated complex lipids)は、中性脂質から容易に分離することができる。
【００４６】
該抽出物の回収中の熱の使用、該脂質混合物中の中性脂質対複合脂質の比率、及び該中性脂質の組成が、ＤＭＥ水和複合脂質の形成を促進するための重要な要因である。総脂質混合物が、高レベルの遊離脂肪酸及び／又は部分的グリコシドを有さない中性脂質約５０〜９０％を含有し、該脂質混合物が室温において液体である場合には、該抽出物の回収方法と、その後の圧力損失及び／又は加熱による該抽出物からのＤＭＥの脱ガスが、該複合体の形成を招来することができる。該ガム状相と液体相との分離は、加熱及び／又は遠心分離の使用によって促進される。このようにして得られたＤＭＥ水和複合脂質相は、若干の中性脂質をまだ含有するが、該中性脂質相は複合脂質を全く有さない。この発見は、卵脂質及び魚頭部脂質に特に該当する。
【００４７】
液体ＤＭＥを用いて、湿潤バイオマスと乾燥バイオマスの両方から中性脂質と複合脂質の両方を抽出して、ＤＭＥからの分離後に混合抽出物を得ることができる。バイオマスが湿潤している場合には、水分も抽出され、例えば、真空下での蒸発、膜分離、又は特に遠心分離による相分離のような、慣用的な手段によって脂質から分離される。次に、近臨界二酸化炭素を用いて該混合抽出物をさらに抽出して、中性脂質を分離及び回収して、ＨＵＦＡｓを含有する複合脂質にさらに富んだ抽出物を得るという選択肢がある。該複合脂質は水和されていず、水又はＤＭＥを除去するためにさらに処理することを必要としない。
【００４８】
植物又は動物材料を、液体ＤＭＥによる抽出の前に、近臨界二酸化炭素によって抽出して、中性脂質を取り出すことができる。処理工程のこの順序は、複合脂質に富んだ抽出物を得ることも可能にする。
【００４９】
好ましくは、該近臨界二酸化炭素の圧力は少なくとも７３．２barであり、温度は３０４．２〜３７３Ｋの範囲（超臨界領域）内である；又は該近臨界二酸化炭素の圧力は蒸気圧以上であり、温度は２７３〜３０４．１Ｋの範囲（臨界未満領域）内である。より好ましくは、該二酸化炭素の圧力は少なくとも２５０barであり、温度は３１３〜３５３Ｋの範囲内である。
【００５０】
本発明の或る一定の実施態様の重要な要素は、液体ＤＭＥによる抽出前に植物又は動物材料の乾燥若しくは部分的乾燥である。植物及び動物材料は、典型的に、材料全体の６０〜８０重量％の水分含量を有する。抽出前に該水分の少なくとも一部を除去することは、一定量の材料に関して、水分の量が減少しているので、脂質の収率が大きくなるという実用面での利点を有する。それ故、大容量の処理装置の必要性は減少する、又は一定容量の処理プラントに関してスループット及び脂質収率は大きくなる。しかし、この方法は湿潤バイオマスにも適用可能であり、このことは、乾燥費用を回避する点と、脂質を分解する可能性があるか、又は脂質の抽出を妨げる乾燥バイオマス・マトリックス内への脂質封入を生じる可能性がある酵素を不活性化する点で有利でありうる。
【００５１】
出願人はさらに、重要なことには、植物又は動物材料を乾燥させるが、水分を完全には除去しないことが有利であることも発見している。抽出されるべき材料の水分含量を材料全体の３０重量％レベルまでに減ずる場合には、本発明の方法を、該材料中に存在する酵素及び他のタンパク質を有意に分解も変性もさせずに行うことができる。それ故、抽出後の植物又は動物材料の残渣は、種々な用途（例えば、タンパク質に富み、脂肪の少ない栄養サプルメント、例えば脱脂ウシ肝臓のような身体構成製品(body building products)）に、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、トランスグルタミナーゼのような酵素の供給源として、特に有用でありうる。これらの酵素の分解は、該残渣の有用性を制限すると考えられる。
【００５２】
複合脂質類は、それらの極性において、広範囲に変化するので、植物又は動物の組織中に存在するリン脂質の大部分を抽出することができる溶媒又は溶媒混合物を見出すことは困難である。脱脂残留物質を用いて、例えば酵素のような非脂質成分を抽出して、脱脂残留物質をニュートラシューティカルとして用いることができるように、抽出プロセス中に残留タンパク質及び／又は複合非脂質分子を変性させない溶媒系を見出すことは、さらにいっそう困難である。意外にも、少なくとも４０℃の温度において用いられた液体ＤＭＥを用いて、該物質を抽出前に乾燥させた場合には該残留脱脂物質を変性させることなく、複合脂質と中性脂質の全ての高収率を得ることができることを、出願人は発見している。
【００５３】
一般的手段
下記の４つの非限定的な一般的手段は、本発明の方法をどのように実施することができるかを示す。
【００５４】
１．ＤＭＥ抽出
ａ．植物又は動物組織を３０％以下の水分含量にまで乾燥させる、水分含量は、必要に応じてＤＭＥが水も含有することを保証するように選択する。
ｂ．該植物材料を、２ｍｍ以下の粒度にまで摩砕する。
ｃ．該植物又は動物材料を特定の条件において液体ＤＭＥと接触させる。
ｄ．該植物又は動物材料から負荷ＤＭＥ(laden DME)を分離する。
ｅ．該ＤＭＥからＨＵＦＡ富化脂質抽出物を回収する。
【００５５】
該脂質抽出物が中性脂質をも含有する場合には、次の追加工程を行うこともできる：
ｆ．中性脂質から相分離によってＤＭＥ水和複合脂質を分離する。
ｇ．水和複合脂質からＤＭＥを除去する。
【００５６】
場合によっては、該残留脱脂動物材料をさらに水溶液によって抽出して、酵素を得ることができる。
２．ＤＭＥ抽出後のＣＯ２抽出
ａ．該植物又は動物組織を１０%以下の水分含量にまで乾燥させる。
ｂ．該植物材料を、２ｍｍ以下の粒度にまで摩砕する。
ｃ．該植物又は動物材料を特定の条件において液体ＤＭＥと接触させる。
ｄ．該植物又は動物材料から負荷ＤＭＥを分離する。
ｅ．該ＤＭＥからＨＵＦＡ富化複合及び中性脂質抽出物を回収する。
ｆ．ＨＵＦＡ富化複合脂質抽出物を超臨界ＣＯ２と接触させる。
ｇ．超臨界ＣＯ２と溶解中性脂質から中性脂質減損ＨＵＦＡ富化複合脂質を分離し、回収する。
ｈ．該ＣＯ２から中性脂質を回収する。
【００５７】
３．ＣＯ２抽出後のＤＭＥ抽出
ａ．該植物又は動物組織を１０%以下の水分含量にまで乾燥させる。
ｂ．該植物材料を、２ｍｍ以下の粒度にまで摩砕する。
ｃ．該植物又は動物材料を特定の条件において超臨界ＣＯ２と接触させる。
ｄ．該中性脂質減損植物又は動物材料から超臨界ＣＯ２を分離する。
ｅ．該ＣＯ２から中性脂質を回収する。
ｆ．植物又は動物材料を液体ＤＭＥと特定の条件において接触させる。
ｇ．該植物又は動物材料から負荷ＤＭＥを分離する。
ｈ．該ＤＭＥからＨＵＦＡ富化複合脂質抽出物を回収する。
【００５８】
４．湿潤バイオマスのＤＭＥ抽出
ａ．該バイオマスを必要に応じて凍結する。
ｂ．凍結した植物又は動物材料を、必要に応じて、５ｍｍ以下の粒度にまで摩砕する。
ｃ．該植物又は動物材料を特定の条件において液体ＤＭＥと接触させる。
ｄ．該植物又は動物材料から負荷ＤＭＥを分離する。
ｅ．該ＤＭＥからＨＵＦＡ富化脂質抽出物と水分を回収する。
ｆ．該脂質から水分を分離する。
【００５９】
該脂質抽出物が中性脂質をも含有する場合には、次の追加工程を行うこともできる：
ｇ．ＨＵＦＡ富化脂質物質を特定の条件において超臨界ＣＯ２と接触させる。
ｈ．超臨界ＣＯ２と溶解中性脂質から、該中性脂質減損ＨＵＦＡ富化複合脂質(neutral-lipid depleted HUFA-rich complex lipid )を分離し、回収する。
ｉ．該ＣＯ２から該中性脂質を回収する。
【００６０】
上記一般的手段において、一般的手段１〜３において工程ｂが不必要になるように、工程ａから得られる噴霧乾燥粉末（例えば、卵黄粉末）を用いることができる。
【実施例】
【００６１】
実施例１：乾燥ウシ肝臓の抽出
新鮮なウシ肝臓全体約８ｋｇを地元の食肉加工プラントから入手した。該肝臓から、皮膚脂肪沈着物(cutaneous fat deposits)、軟骨及び皮膚を除去して、次に、該肝臓を複数の大きなチャンク(chunks)に切断した。これらのチャンクをミンチング・デバイス(mincing device)に通して、チャンキー・ペーストを得た。次に、肝臓ミンチ(minced liver)７９１３．５ｇを凍結乾燥トレーに載せて、これらのトレーを次に、固体が完全に凍結するまで、フリーザーに入れた。該トレーを次に凍結乾燥器に入れて、約２〜５％の水分含量になるまで乾燥させた。３１．９％の固体収率が得られ、抽出前の摩砕のための材料２５２６．７ｇが得られた。トレーからの固体を、〜１ｍｍのホールサイズを有するシーブ・プレートを備えたナイフミルで摩砕した。細かく摩砕した固体を次に、近臨界ＤＭＥによって４０bar及び３１３Ｋにおいて抽出した。近臨界ＤＭＥ２９．３１６ｋｇを該固体（２４７２．６ｇ）に一定の流速で９０分間、連続的に通した。該ＤＭＥを、固体に通した後に、減圧バルブ及び熱交換器に連続的に通して、分離容器に入れた、ここで直ちにＤＭＥはガスに転化した。脂質が該ガスから沈殿し、該分離容器から回収された。該ＤＭＥは、コンデンサー／サブクーラー熱交換器とポンプを介して該抽出容器に再循環させた。脂質３６３．６９ｇが１３．９６％の収率で得られた。該脂質はリン脂質５３％を含有し、該リン脂質のうち、４６．２％はホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、１０．２％は. ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）であり、２．３％はホスファチジルセリン（ＰＳ）であり、１６．６％はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、３．９％はスフィンゴミエリン（ＳＭ）であり、６．６％はカルディオリピン（ＣＬ）であり、そして８％は同定されなかった。全脂質はアラキドン酸（ＡＡ）４．５％、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）７．４％、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）２．１％、及びα−リノレン酸（ＡＡ）５．９％を含有した。該脱脂肝臓は、スポーツ栄養サプルメントとして使用可能である。
【００６２】
実施例２：ウシ心臓の抽出
新鮮なウシ心臓全体約８ｋｇを地元の食肉加工プラントから入手した。該心臓から、皮膚脂肪沈着物及び軟骨を除去して、次に、該肝臓を複数の大きなチャンクに切断した。これらのチャンクをミンチング・デバイスに通した。次に、心臓ミンチ(minced heart)を凍結乾燥トレーに載せて、これらのトレーを次に、固体が完全に凍結するまで、フリーザーに入れた。該トレーを次に凍結乾燥器に入れて、約２〜５％の水分含量になるまで乾燥させた。２２．７％の固体収率が得られ、抽出前の摩砕のための材料１７２５．７ｇが得られた。トレーからの固体を、〜１ｍｍのホールサイズを有するシーブ・プレートを備えたナイフミルで摩砕した。細かく摩砕した固体を次に、近臨界ＤＭＥによって４０bar及び３１３Ｋにおいて抽出した。近臨界ＤＭＥ２９．５２ｋｇを該固体に９０分間の期間にわたって連続的に通した。該ＤＭＥを、固体に通した後に、減圧バルブ及び熱交換器に連続的に通して、分離容器に入れた、ここで直ちにＤＭＥはガスに転化した。脂質が該ガスから沈殿し、該分離容器から回収された。該ＤＭＥは、コンデンサー／サブクーラー熱交換器とポンプを介して該抽出容器に再循環させた。脂質２０２．７１ｇが１２．３％の収率で得られた。該脂質はリン脂質３０．０％を含有し、該リン脂質のうち、２８．３％はホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、４．４％はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）であり、０％はホスファチジルセリン（ＰＳ）であり、１３．７％はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、６．６％はスフィンゴミエリン（ＳＭ）であり、２７．９％はカルディオリピン（ＣＬ）であり、そして１２．２％は同定されなかった。全脂質はアラキドン酸（ＡＡ）５．６％、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）２．０％、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）２．８％、及びα−リノレン酸（ＡＡ）５．９％を含有した。
【００６３】
実施例３：ＣＯ２と、続いてのＤＭＥとによる噴霧乾燥卵黄の抽出
この実施例は、固体原料物質から中性脂質を最初に抽出してから、ＤＭＥによって再抽出して、ＨＵＦＡに富んだ複合脂質濃縮物を得ることができることを示す。この実施例はさらに、噴霧乾燥粉末からの複合脂質の高い収率を得るためには高い抽出温度を用いなければならないことも示す。噴霧乾燥卵黄粉末１０．６７ｋｇを超臨界ＣＯ２によって３００bar及び３１３Ｋにおいて抽出した。超臨界ＣＯ２５３０．３４ｋｇを該固体に連続的に通して、次に続いて、２つの減圧段階に通して、圧力を最初に３１３Ｋにおいて９０barに下げて、中性脂質のみを含有する卵油（４．２６ｋｇ、収率４０．０質量％）を回収し、次に３２３Ｋにおいて５８barに下げて、少量の中性脂質画分（０．２６ｋｇ、収率２．４質量％）を回収した。該中性脂質はアラキドン酸とドコサヘキサエン酸の各々１％未満を含有した。次に、実施例１及び２と同様に、中性脂質減損卵黄粉末２．９８ｋｇを液体ＤＭＥ１６．２４ｋｇによって、２９３Ｋ、４０barにおいて６０分間抽出した。中性脂質を含まない複合脂質抽出物２８３．４ｇが、全脂卵黄粉末の６．８質量％の収率に相当して得られた。該粉末を液体ＤＭＥ１３．１ｋｇによって、３１３Ｋにおいて上記と同様に５０分間再抽出した。中性脂質を含まない複合脂質抽出物さらに１９１．３ｇが、全脂卵黄粉末の４．６質量％の追加収率に相当して得られた。したがって、総脂質収率は５３．８％であった。中性脂質を含まない複合脂質抽出物の高い収率を得るためには、該粉末を少なくとも３１３Ｋの温度で抽出することが必要である。この脱脂卵黄粉末は、低脂肪であることが要求されるベーキング用途に使用可能である。
【００６４】
実施例４：ＤＭＥによる噴霧乾燥卵黄の抽出
この実施例は、抽出物相中の少量のＤＭＥを用いて、ＤＭＥ抽出後の複合脂質から中性脂質を分離できることを示す。噴霧乾燥卵黄粉末４．１１９ｋｇを液体ＤＭＥによって、３２３Ｋ及び４０barにおいて抽出した。近臨界ＤＭＥ８．５１７ｋｇを該固体に連続的に通した。該固体に通した後に、該ＤＭＥを減圧バルブ及び熱交換器に連続的に通して、加熱分離容器に入れた、ここで直ちにＤＭＥはガスに転化した。脂質が該ガスから沈殿し、該分離容器から加熱バルブを通して回収された。該ＤＭＥは、コンデンサー／サブクーラー熱交換器とポンプを介して該抽出容器に再循環させた。該分離容器から回収された液体（２１９７．８６ｇ、収率５３．３％）を加熱して、残留ＤＭＥの大部分を駆除してから、該液体を遠心分離して、脂質を中性脂質富化相とＤＭＥ水和複合脂質富化相に分けた。該中性脂質富化相は、総脂質の７５．３％から成り、１質量％未満の複合脂質を含有するが、アラキドン酸又はＤＨＡのいずれも含有しない。極性脂質富化相は、総脂質の２４．７％から成り、９５％を超える極性脂質を含有した。該極性脂質はアラキドン酸含量５．８９％とＤＨＡ含量２．４６％を含有した。
【００６５】
実施例５：凍結乾燥卵黄の抽出
この実施例は、卵黄を凍結乾燥すると、抽出に対する脂質のアベイラビリティ(availability)が改良されることを示す。新鮮な卵は、地元の商店から購入し、次に、手動で卵黄と卵白に分離した。卵白は廃棄した。卵黄は室温において混合してから、丸底真空フラスコに加えて、凍結し、次に凍結乾燥させた。次に、凍結乾燥卵黄７３．０５ｇを液体ＤＭＥ５９８．１ｇによって４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。アラキドン酸２％とＤＨＡ１％を含有する黄色液体抽出物４７．０１ｇが６４質量％の収率で得られた、この収率は、卵黄粉末に対する理論的総脂質収率と同じである。残留卵黄粉末と非抽出凍結乾燥卵黄粉末の水溶性を噴霧乾燥卵黄粉末（脱脂卵黄粉末と非抽出卵黄粉末の両方）と比較した。新鮮噴霧乾燥卵黄粉末と抽出済み噴霧乾燥卵黄粉末の両方は水に不溶性であり、このことは、噴霧乾燥プロセスが変性を生じることを示唆した。凍結乾燥タンパク質（抽出前と後）は、水中で２２％溶解性を有したが、新鮮な卵黄タンパク質は５８％溶解性であった。該抽出済みタンパク質は低脂肪栄養サプルメントとして使用可能であった。
【００６６】
実施例６：ＤＭＥとＣＯ２を用いた凍結乾燥イガイ粉末の抽出
この実施例は、脱脂イガイ固体中の酵素活性が、脂質の抽出後も保持されることを示す
。凍結した緑イガイ(green-lipped mussel)スラリーを部分的に解凍して、デジューシング装置(dejuicing apparatus)に通して、大きいチャンク(固体)から微細な固体と液体（スラリージュース）を分離する。該スラリーの一部を、実施例１２に記載するように加工するために取り分けた。残りのスラリージュースと固体とを別々に凍結乾燥して、次に、最初にＤＭＥで抽出した。得られた粗抽出物を次に、超臨界ＣＯ２によって再抽出した。直接凍結させてから、凍結乾燥させたスラリー（表１における全粉末）に対しても、比較のためのＤＭＥ抽出を行った。幾らかの酵素活性を生じた、磨耗工程及び脱水工程による収率には幾らかの変動性が存在した。乾燥粉末の質量％としての脂質収率、該抽出物複合脂質含量、及び最終生成物のＥＰＡとＤＨＡ含量を表１に示す。
【００６７】
表１：緑イガイからのＨＵＦＡ含有複合脂質の抽出
【００６８】
【表１】
【００６９】
該抽出物のリン脂質プロフィルは次のとおりである：ホスファチジルコリン３１．９％、ホスファチジルエタノールアミン２４．５％、ホスファチジルイノシトール３．９％、ホスファチジルセリン３．１％、ホスホノ脂質１．１％、セラミド２−アミノエチルホスホネート１７．０％。ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの数値はプラズマローゲンをも包含する。
【００７０】
脂質取り出し後の該イガイ粉末のホスホリパーゼ活性を次のように測定した：脱脂緑イガイ粉末（８ｇ）固体に蒸留水４０ｍｌを混合して、次に遠心分離した。上清イガイ調製物のアリコート（２０ｍｌ）をＰＣ〜２４％、ＰＥ３４％及びＰＳ１２％を含有するリン脂質混合物モデル１ｇに加えて、４０℃において乳化させてから、この温度に１６時間維持した。該反応混合物のサンプル（０．２ｍｌ）を３１Ｐ−ＮＭＲによってリン脂質組成に関して分析した。リン脂質の加水分解度を表２に示す、表２では、Ｌはリゾ−（親リン脂質から加水分解される、１つの脂肪酸）を意味し、Ｇはグリセロ−（親リン脂質から加水分解される、両方の脂肪酸）を意味し、ｔｏｔは総計の完全及び加水分解リン脂質を意味する。ＰＣとＰＥに関しては、大きい加水分解度がはっきりと認められた。しかし、主要なクラスの総加水分解プラス完全リン脂質プロフィルは、出発物質の同プロフィルとはかなり変化しており、このことは、他の反応が行われたことを示唆した。３１Ｐ ＮＭＲスペクトルには、ホスホリパーゼＣ活性を有する生成物を暗示することができる、幾つかの新しい同定されないピークが形成されており、この不一致を説明することができた。
【００７１】
表２：イガイ酵素抽出物を用いたリン脂質加水分解
【００７２】
【表２】
【００７３】
実施例７：ＤＭＥを用いたホキ頭部の抽出
この実施例は、ＤＭＥ抽出後にＤＭＥとリン脂質との間に一時的な複合体が形成される(ＤＭＥ−水和)ために、海洋に基づく(marine-based)複合脂質から中性脂質が分離されうることを示す。凍結したホキ魚頭部をミンチング装置(mincer)に通した。この頭部ミンチ(minced heads)を次に、凍結乾燥機トレーに載せ、凍結させ、その後凍結乾燥させた。次に、乾燥した頭部ミンチをナイフミルでさらに摩砕して、粉末にしてから、ＤＭＥを用いて４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。実施例４に記載した一般的方法を用いて、粉末１９７０．６ｇをＤＭＥ１５．４０８ｋｇによって抽出した。褐色液体の脂質富化抽出物が得られ、これは、放置すると(upon standing)、中性脂質富化相とリン脂質富化相とに分離し始めた。相分離を促進するために、該抽出物を遠心分離した。上部の中性脂質相は僅か２．５％のリン脂質を含有した。下部の“ガム”相はＤＭＥ水和リン脂質を１９．２質量％で含有した。次に、下部相中のＤＭＥを真空下で取り出し、リン脂質３３．２％とガングリオシド０．５％を含有する抽出物を得た。この複合脂質濃縮物はＥＰＡ５．８％、ＤＨＡ１２．７％及び他のＨＵＦＡ３．６％を含有した。
【００７４】
実施例８：ＤＭＥを用いたレモン魚(lemon fish)肉の抽出
この実施例は、ＨＵＦＡに非常に富んだ複合脂質が魚肉から抽出されうることを示す。新鮮なレモン魚肉を複数個のキューブにカットしてから、凍結乾燥させた。乾燥した魚肉キューブを次にナイフミルでさらに摩砕して、粉末にしてから、ＤＭＥを用いて４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。実施例１と２に記載した一般的方法を用いて、粉末１３５．９５ｇをＤＭＥ８８６．７ｇによって抽出した。リン脂質に非常に富んだ（６４質量％）黄色半固体の抽出物が２．６％の収率で得られた。該抽出物のリン脂質画分は、ＰＣ４６．２％、ＰＩ７．９％、ＰＳ３．５％、ＰＥ２５．０％、ＳＭ５．２％及びＣＬ７．９％を含有した。該抽出物は、特にＤＨＡに富んでおり、ＤＨＡは総脂肪酸の２４．９％であった。複合脂質抽出物はさらに、ＤＰＡ４．５％、ＥＰＡ５．３％及びＡＡ６．７％をも含有した。非変性魚タンパク質は食品サプルメントとして使用可能である。
【００７５】
実施例９：ＤＭＥによるヒツジ及びブタ膵臓の抽出と、超臨界ＣＯ２による該脂質抽出物の再抽出
この実施例は、超臨界ＣＯ２を用いて、粗ＤＭＥ抽出物から中性脂質を再抽出することができることと、残留固体から活性ホスホリパーゼ酵素とタンパク質分解酵素の両方を抽出することができることを示す。凍結乾燥したウシ及びブタ膵臓サンプルを液体ＤＭＥを用いて、４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。実施例１と２に記載した一般的方法を用いて、ウシ膵臓１２０．７２ｇをＤＭＥ１１９３．４ｇによって抽出した。中性脂質に非常に富んだ、黄色／緑色半固体の抽出物が４４．８％の収率で得られた。該抽出物は僅か１９％のリン脂質、ＡＡ０．７％及びＤＰＡ０．７％を含有した。実施例１と２に記載した一般的方法を用いて、ブタ膵臓１２０．１８ｇをＤＭＥ１２４０．２ｇによって抽出した。中性脂質に非常に富んだ、黄色半固体の抽出物が２４．０％の収率で得られた。該抽出物は、僅か１３％のリン脂質、ＡＡ１．５％を含有したが、ＥＰＡ又はＤＰＡのいずれも含有しなかった。次に、ウシ及びブタの粗膵臓抽出物を超臨界ＣＯ２によって３００bar及び３３３Ｋにおいて、中性脂質が抽出物としてもはや回収されなくなるまで、再抽出した。その後に、該抽出物と残留複合脂質濃縮物とを再分析した。該ウシ複合脂質は、ＡＡ２．３％、ＥＰＡ１．４％及びＡＬＡ１．８％を含有した。ブタ複合脂質は、ＡＡ４．８％と、ＥＰＡ及びＤＰＡ各１％未満を含有した。次に、ヒツジ及びブタの残留脱脂膵臓固体をそれらのタンパク質分解活性とホスホリパーゼ活性に関して試験した。
【００７６】
ホスホリパーゼ活性は、次のように測定した：脱脂ウシ膵臓（０．６５ｇ）と脱脂ブタ膵臓（０．９８ｇ）固体を蒸留水（２０ｍｌ）中で混合してから、遠心分離した。上清膵臓調製物アリコート（２ｍｌ）を、水（１０ｍｌ）中のＰＣ〜２４％、ＰＥ３４％及びＰＳ１２％を含有するリン脂質混合物モデル（１ｇ）のエマルジョンに加えて、４０℃に１６時間維持した。該反応混合物のサンプル（０．２ｍｌ）を３１Ｐ−ＮＭＲによってリン脂質組成に関して分析した。リン脂質の加水分解度を表３に示す、表３では、Ｌはリゾ−（親リン脂質から加水分解される、１つの脂肪酸）を意味し、Ｇはグリセロ−（親リン脂質から加水分解される、両方の脂肪酸）を意味する。ブタ膵臓は、顕著なホスホリパーゼＡ２活性を示し、ＰＥ＞ＰＳ＞ＰＣの優先的加水分解であった。ウシ膵臓は、ブタ膵臓に比べて非常に低い、ＰＥ及びＰＣに対するホスホリパーゼＡ２活性を示したが、ＰＳの同様な加水分解レベルを示した。
【００７７】
表３：ホスホリパーゼＡ２活性
【００７８】
【表３】
【００７９】
ＤＭＥ抽出後に残留するプロテアーゼ活性を次のように測定した。ＤＭＥ抽出したブタ膵臓の凍結乾燥粉末（０．９８３４ｇ）を１００ｍＭＣａＣｌ２（３９ｍｇ／ｍｌ）２５ｍｌによって抽出して、ＤＭＥ抽出したウシ膵臓（０．６５ｇ）を１００ｍＭＣａＣｌ２（２６ｍｇ／ｍｌ）２５ｍｌによって抽出した。該抽出物を酵素の自己活性化の前後に試験して、ブタ及びヒツジの凍結膵臓から調製した標準膵臓抽出物に比較した。収率は、ＤＭＥ抽出粉末に関しては表４に、凍結した基準サンプルに関しては表５に示す。
【００８０】
表４：ＤＭＥ抽出した凍結乾燥膵臓粉末からの膵臓プロテアーゼ収率
【００８１】
【表４】
【００８２】
表５：凍結したブタ及びヒツジ膵臓から抽出し、活性化した標準プロテアーゼレベル
【００８３】
【表５】
【００８４】
データは、標準条件を用いた、ヒツジ及びブタ膵臓２５ｇの抽出に基づくものである。活性化が完了した後に酵素活性を測定した、該活性化完了は、トリプシン活性が最大レベルに達した後にトリプシン活性の僅かな低下によって判断した。エラスターゼＩＩ活性の検出に用いた基質ＳＡＡＰＬｐＮＡは、エラスターゼＩ及びキモトリプシンによっても加水分解される。それ故、エラスターゼＩＩ活性はこの基質を用いて推定した。
【００８５】
ＤＭＥによる凍結乾燥膵臓の抽出は、ブタ膵臓の総プロテアーゼ含量を殆ど減少させていない。予めＤＭＥによって抽出された凍結乾燥ウシ膵臓中で検出された低レベルの酵素活性は、膵臓を採取した動物の種変化(species variation)及び／又は年齢に帰することができる。ｐＨ調節によって誘導される酵素前駆体活性化の前に、比較的高いプロテアーゼレベルが最初に検出されたことで判断されるように、ＤＭＥ処理粉末ではかなりのレベルの自己活性化が観察された。検出された初期トリプシン活性は、抽出物ｐＨを活性化により適した値（例えば、ｐＨ８．５）に調節すると、酵素前駆体の完全な活性化のために充分であった。対照的に、凍結膵臓からの膵臓酵素前駆体の活性化は、外因性トリプシンの添加を必要とする。
【００８６】
活性化した凍結膵臓とＤＭＥ抽出した凍結乾燥膵臓とから得られるタンパク質分解プロフィルの比較は、ＤＭＥ抽出後にかなりの酵素活性が保持されることを示す。凍結膵臓からのエラスターゼＩの典型的な抽出効率は、０．６７μｍｏｌ／分／組織ｇの収量を生じたが、ＤＭＥ抽出した凍結乾燥ブタ膵臓から得たエラスターゼＩの該抽出効率は６７．４μｍｏｌ／分／組織ｇの収量を生じた。トリプシン収量は、予想値より低いように思われるが、これは、トリプシン仲介加水分解を受ける他のプロテアーゼ（凍結膵臓からの抽出中にそれらの活性を低下させる）の予想よりも高い収量を説明することができる。
【００８７】
実施例１０：ＤＭＥによるホキ肝臓の抽出
この実施例は、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質が湿潤バイオマスから直接抽出されうることを示す。商業的に入手した凍結全ホキ魚肝臓を、大きい全体サイズでUrschelグラインダーに通して、該肝臓を複数個のチャンクに切断した。次に、浸軟した肝臓をＤＭＥによって、６０℃及び４０barにおいて２時間抽出した。ＤＭＥ３１．９９６ｋｇを湿潤肝臓６．７４２７ｋｇに通した。水分と、高度不飽和脂肪酸含有脂質から成る抽出物２．２３４ｋｇを入手した。部分的に抽出した残留固体を次に再混合して、ＤＭＥによって同じ条件において３時間再抽出した。ＤＭＥ４８．４６ｋｇを該肝臓に通して、さらに抽出物１．８３４ｋｇを回収した、これは殆ど水であった。水の蒸発後に、全体で２．３０８２ｋｇの油が得られた。この油は、ＤＨＡ９．３５％、ＤＰＡ１．４３％、ＥＰＡ４．９１％、Ｃ２０：４ｗ−３ １．３％、ＡＡ０．６％及びＣ１８：３とＣ１８：４ｗ−３ １．９％を含有した。残留固体をトランス−グルタミナーゼ活性に関して試験したが、該酵素はこの抽出プロセスによって不活性化されていた。
【００８８】
実施例１１：非メチレン中断脂肪酸に富んだ脂質を得るためのＤＭＥによる松の木種子の抽出
この実施例は、松種子をＤＭＥで抽出して、非メチレン中断脂肪酸に富んだ脂質抽出物を得ることができることを示す。松種ビオタ・オリエンタルス（Biota Orientalis）の商業的に入手可能な種子を、ＤＭＥによる抽出前に部分的に低温圧縮した（cold-pressed）。残留した低温圧縮種子ケーキは約３５質量％の中性油（プレ圧縮基準で(on a prepressed basis)２６％）を含有した。圧縮種子ケーキをＤＭＥによって、６０℃及び４０barにおいて１５０分間抽出した。ＤＭＥ３７．０６ｋｇを部分的圧縮種子１４．０３８５ｋｇに通した。抽出物５．９４２ｋｇが得られた、これは中性脂質、複合脂質及び水の混合物であった。該抽出物を遠心分離によって相に分離した。中性脂質油４．８４７ｋｇが上部相として単離された。この油は、ジュニペロン酸（Ｃ２０：４非メチレン中断脂肪酸）９．９％、シアドン酸（Ｃ２０：３非メチレン中断脂肪酸）４．３％及びα−リノレン酸３３．２％を含有した。同定されない複合脂質０．４８８ｇが中間相として単離された。これは、主要脂質生成物と同様な脂肪酸組成を有した。
【００８９】
実施例１２：ＤＭＥによる緑イガイスラリーの抽出と、続いての超臨界ＣＯ２抽出による中性脂質と複合脂質の分離
この実施例は、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を動物組織のスラリーから抽出することができることを示す。実施例６で製造された、緑イガイ固体のスラリーを乾燥させずに抽出した。この場合には、微細なイガイ固体(finely divided mussel solids)含有スラリーを高圧において抽出容器中に供給して、同時に該容器内側の縦型静的ミキサー中で４０barの圧力及び６０℃の抽出温度においてＤＭＥと接触させた。抽出された固体は、該抽出容器の底部上に沈着した。ＤＭＥと、溶解した脂質及び水を該容器の頂部から出して、前記実施例に記載したように分離容器につながる、減圧バルブ及び熱交換器に通した。ＤＭＥ５２．９０６ｋｇを３３３Ｋ及び４０barにおいて、イガイスラリー溶液６．１３５９ｋｇと接触させて、真空下で水分の除去後に、ＨＵＦＡに富んだ（Ｃ１８：３とＣ１８：４ｗ−３ ３．４％；ＥＰＡ１８．７％、ＤＨＡ１１．１％）複合脂質及び中性脂質を含有する抽出物８０．４ｇを得た。残留固体を凍結乾燥させて、乾燥基準で脂質収率を測定して、９．０質量％であることを見出した。次に、凍結乾燥固体を摩砕して、実施例６と同じ方法によって再抽出したが、僅か０．３質量％のさらなる収率が得られたにすぎず、このことは、該スラリーからの抽出が殆ど完了していることを示す。次に、脂質抽出物４９．７４ｇを超臨界ＣＯ２によって３３３Ｋ及び３００barにおいて再抽出して、２９．１０ｇの中性脂質を得た（総脂質基準で５８．４％収率）。該抽出物はＨＵＦＡに富んでいた（Ｃ１８：３とＣ１８：４ｗ−３ ４．０％；ＥＰＡ２０．２％、ＤＨＡ１１．０％）。殆ど全てが実施例６に記載した種類の複合脂質である残渣も、ＨＵＦＡに富んでいた（Ｃ１８：３とＣ１８：４ｗ−３ ２．４％；ＥＰＡ１７．２％、ＤＨＡ１２．６％）。
【００９０】
実施例１３：超臨界ＣＯ２とその後のＤＭＥによる凍結乾燥オキアミの抽出と、ＤＭＥ抽出に続いての超臨界ＣＯ２再抽出による、ＨＵＦＡに富んだ複合脂質からの中性脂質の分離
この実施例は、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質が凍結乾燥オキアミから、最初にＣＯ２による抽出によって中性脂質を抽出し、次にＤＭＥによる抽出によって、ＨＵＦＡに富んだ複合脂質を抽出することによって、又はＤＭＥを用いてオキアミから総脂質を抽出し、次に、総脂質抽出物を超臨界ＣＯ２によって再抽出して、中性脂質を取り出すことによって抽出されうることを示す。１２．２％脂質を含有する凍結乾燥オキアミ粉末１８０．１２ｇを超臨界ＣＯ２によって３００bar及び３１４Ｋにおいて抽出して、脂質１１．２８ｇを得た。次に、残留オキアミ粉末をＤＭＥによって４０bar及び３３２Ｋにおいて抽出して、ＥＰＡ２０％、ＤＨＡ１５．６％及び総ＨＵＦＡ３８％を含有する、リン脂質に富んだ脂質３．３０ｇを得た。脂質２１．４％を含有する第２オキアミ粉末３．０６０３ｋｇをパイロット規模でＤＭＥ１７．２７１ｋｇを用いて、４０bar及び３５７Ｋにおいて抽出して、脂質富化抽出物６５２．１ｇを得た、これは、存在する総脂肪酸のうちＥＰＡ１４．０％及びＤＨＡ９．０％を含有した。次に、この脂質富化抽出物１００．３２ｇを超臨界ＣＯ２２６．２１ｋｇを用いて３００bar及び３１４Ｋにおいて再抽出して、リン脂質に非常に富んだ（７６．６％）（ＥＰＡ２８．８％、ＤＨＡ２１．９％及び総ＨＵＦＡ５５．６％を含有する）非抽出脂質残渣３３．０４ｇを得た。
【００９１】
実施例１４：ＤＭＥを用いた、湿潤及び乾燥モルチエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)バイオマスからの脂質の抽出
この実施例では、微生物モルチエレラ・アルピナ（strain IRL176）を発酵させて、アラキドン酸に富んだ脂質を得た。次に、該バイオマスを湿潤バイオマスとして又は乾燥物質としてのいずれかで抽出して、アラキドン酸に非常に富んだ抽出物を得た。ポテト・デキストロース寒天（ＰＤＡ）２５ｍｌによって、１５０ｍｌルー・フラスコ(roux flask)を作製した。このルー・フラスコに胞子ストック(spore stock)０．１ｍｌを接種して、室温において１ヶ月間インキュベートした。濃厚な胞子ストックをＰＤＡルー・フラスコの表面からすくい取って、ポテト・デキストロース培地２００ｍｌを有する５００ｍｌバッフルなし振とうフラスコ中に接種した。シード振とうフラスコ(seed shake flask)を回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）上で２５℃において９６時間インキュベートした。該シード振とうフラスコの１５ｍｌサンプルを、グルコース４０ｇ／Ｌ及び酵母１０ｇ／Ｌを含有する、１３ｘ５００ｍｌ（全体で２０００ｍｌ）バッフルなし振とうフラスコ中に接種した。生産用振とうフラスコを回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）上で２５℃において７日間インキュベートした。培養物を収穫して、バイオマスを濾過によって回収した（濾紙Ｎｏ．１）。回収した細胞を６０℃水で１：１（vol/vol）の濃度において洗浄した。乾燥した細胞重量は１２．２ｇ／Ｌであった。新鮮な湿潤バイオマス２１８．８５ｇをＤＭＥによって抽出したが、低レベルの脂質を有する、僅か１．８９ｇの抽出物が回収されたに過ぎなかった。このことは、細胞が破裂されなかったことを示唆した。次に、新鮮な湿潤バイオマスの第２バッチ１５０．１４ｇを凍結させ、続いて摩砕してから、ＤＭＥ２．４１６ｋｇによって３３３Ｋ及び４０barにおいて抽出した。凍結と次の摩砕は細胞を破裂させて、油の抽出を可能にした。油（６．５１ｇ）と水（９９．５３ｇ）の混合物が抽出された。該油は、アラキドン酸３１．８％、ＧＬＡ１３．８％及び総ＰＵＦＡ５５．９％を含有した。次に、抽出後の残留バイオマス（３７．３４ｇ）を強制対流オーブン内で３１３Ｋにおいて一晩乾燥させて、最終乾燥質量３０．０２ｇを得た。次に、この乾燥バイオマスを乳鉢と乳棒で摩砕した。次に、この乾燥バイオマス２７．６１ｇをＤＭＥ０．８４０ｋｇによって３３３Ｋ及び４０barにおいて抽出して、さらに３．８７ｇの脂質を回収した、これはアラキドン酸３３．２％、ＧＬＡ１４．１％及び総ＰＵＦＡ５７．３％を含有した。
【００９２】
実施例１５：ＤＭＥを用いた、高度不飽和藻類脂質の抽出
ニツシア・レビス(Nitzschia Laevis)の混合栄養的及び有機栄養的発酵で得られた湿潤バイオマス５８．２９ｇを凍結させてから、ＤＭＥ１５８４ｇによって、４０bar及び３３３Ｋにおいて抽出した。総抽出物５３．１０ｇが得られた、これは、水４３．５５ｇと、中性及び複合脂質（ＡＡ２．２％、ＥＰＡ１１．８％及びＤＨＡ２．８％を含有した）９．５５ｇから成るものであった。該脂質混合物を真空下での蒸発によって該水から分離した。乾燥脂質混合物２．１６１ｇを、超臨界ＣＯ２１０８ｇを用いて、３００bar及び３３３Ｋにおいて抽出して、ＡＡ１．４％、ＥＰＡ８．２％及びＤＨＡ２．２％のみを含有する中性脂質０．５６０ｇを得た。抽出後の残留複合脂質物質は、ＡＡ４．２％、ＥＰＡ２０．０％及びＤＨＡ３．４％を含有した。
【００９３】
産業上の利用可能性
本発明の方法は、例えば、乾燥した若しくは部分的に乾燥した植物若しくは種子（海洋種若しくは陸生種を包含する）或いは動物物品（海洋若しくは陸生種又は微生物を包含する）のような物質から高度不飽和脂質（脂肪酸）を抽出するために有用である。高度不飽和脂質は、幼児の脳及び視力の発達に極めて重要であり、心臓血管系健康、精神的健康、免疫及び炎症状態に対しても有益でありうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物又は動物材料から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得る方法であって、
（ｉ）該材料を液体ジメチルエーテルと接触させて、脂質を含有するジメチルエーテル溶液と、植物又は動物材料の残渣を得る工程；
（ｉｉ）該溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及び
（ｉｉｉ）該溶液から脂質を回収する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｉ）において該材料との接触後に形成された該溶液が、中性脂質及び複合脂質を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該中性脂質を該溶液から該複合脂質と共に回収する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該中性脂質を該複合脂質から分離する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該複合脂質が、回収工程（ｉｉｉ）中に溶解ジメチルエーテルと共にガム相を形成する、請求項２記載の方法。
【請求項６】
複合脂質を含有する該ガム相を、中性脂質を含有する該溶液から分離する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
中性脂質を複合脂質から相分離によって分離する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
中性脂質を複合脂質から遠心分離によって分離する、請求項６記載の方法。
【請求項９】
遠心分離の前に加熱を用いる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
複合脂質を真空乾燥によって乾燥させる、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉｉｉ）において該溶液から回収された脂質を近臨界ＣＯ２によって、下記工程：
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において溶液から回収した脂質を近臨界ＣＯ２と接触させて、中性脂質を含有するＣＯ２溶液と、複合脂質の残渣を得る工程；
（ｖ）中性脂質を含有する該ＣＯ２溶液を複合脂質の該残渣から分離する工程；及び
（ｖｉ）該ＣＯ２溶液から該中性脂質を回収する工程
に従って処理することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉ）において液体ジメチルエーテルと接触させるべき植物又は動物材料を、最初に、近臨界ＣＯ２によって、下記工程：
ａ．該材料を近臨界ＣＯ２と接触させて、中性脂質を含有するＣＯ２溶液と植物又は動物材料の残渣を得る工程；
ｂ．該ＣＯ２溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及び
ｃ．該ＣＯ２溶液から中性脂質を回収する工程
に従って処理する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該植物又は動物材料を、使用前に、乾燥させる又は部分的に乾燥させる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該植物又は動物材料を、該材料中の水分が３０重量％未満になるまで、乾燥させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該植物又は動物材料を、該材料中の水分が５重量％以上であるように、乾燥させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該植物又は動物材料を、凍結乾燥によって又は噴霧乾燥によって乾燥させる、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該植物又は動物材料が、凍結されている湿潤バイオマスである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
凍結した湿潤バイオマスを工程（ｉ）の前に摩砕する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
１種類以上の複合脂質が、リン脂質、ガングリオシド、糖脂質、セレブロシド、又はスフィンゴ脂質である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
１種類以上の複合脂質がリン脂質である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
該リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、プラズマローゲン、アルキルアシル型リン脂質、ホスホノ脂質、リゾリン脂質、セラミド・アミノエチルホスホネート、及びホスファチジン酸のいずれか１つ以上を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該糖脂質が、ガラクト脂質、ガングリオシド、スルホキノボイスルジアシルグリセリド、タウロ糖脂質、グリコスフィンゴリン脂質、及びマンノシル脂質を包含する、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
該脂質中に含有される高度不飽和脂肪酸が、非限定的に、アラキドン酸、α−及びγ−リノレン酸、ピノレン酸、シアドン酸、コランビン酸、ジホモリノレン酸、エイコサテトラエン酸、ジュニペロン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸のいずれか１つ以上を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
該植物又は動物材料が、動物の器官、動物の腺、海洋マクロ−及びミクロ−藻類、糸状菌、細菌、酵母、貝類、魚類、海洋無脊椎動物、卵、植物の種子、植物の葉、植物の針、シダの葉、苔、及び地衣類から成る群のいずれか１種類から得られる、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
該液体ジメチルエーテルが近臨界ジメチルエーテルである、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法によって得られる、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質。
【請求項２７】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法によって得られる複合脂質。
【請求項２８】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法によって得られる中性脂質。
【請求項２９】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法によって、高度不飽和脂肪酸含有脂質が抽出された植物又は動物材料。
【請求項３０】
請求項２９記載の植物又は動物材料の、ニュートラシューティカルとしての使用。
【請求項３１】
請求項２９記載の植物又は動物材料の、食品サプルメントとしての使用。
【請求項３２】
請求項２９記載の植物又は動物材料の、酵素の供給材料としての使用。
【請求項１】
植物又は動物材料から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得る方法であって、
（ｉ）該材料を液体ジメチルエーテルと接触させて、脂質を含有するジメチルエーテル溶液と、植物又は動物材料の残渣を得る工程；
（ｉｉ）該溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及び
（ｉｉｉ）該溶液から脂質を回収する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｉ）において該材料との接触後に形成された該溶液が、中性脂質及び複合脂質を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該中性脂質を該溶液から該複合脂質と共に回収する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該中性脂質を該複合脂質から分離する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該複合脂質が、回収工程（ｉｉｉ）中に溶解ジメチルエーテルと共にガム相を形成する、請求項２記載の方法。
【請求項６】
複合脂質を含有する該ガム相を、中性脂質を含有する該溶液から分離する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
中性脂質を複合脂質から相分離によって分離する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
中性脂質を複合脂質から遠心分離によって分離する、請求項６記載の方法。
【請求項９】
遠心分離の前に加熱を用いる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
複合脂質を真空乾燥によって乾燥させる、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉｉｉ）において該溶液から回収された脂質を近臨界ＣＯ２によって、下記工程：
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において溶液から回収した脂質を近臨界ＣＯ２と接触させて、中性脂質を含有するＣＯ２溶液と、複合脂質の残渣を得る工程；
（ｖ）中性脂質を含有する該ＣＯ２溶液を複合脂質の該残渣から分離する工程；及び
（ｖｉ）該ＣＯ２溶液から該中性脂質を回収する工程
に従って処理することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉ）において液体ジメチルエーテルと接触させるべき植物又は動物材料を、最初に、近臨界ＣＯ２によって、下記工程：
ａ．該材料を近臨界ＣＯ２と接触させて、中性脂質を含有するＣＯ２溶液と植物又は動物材料の残渣を得る工程；
ｂ．該ＣＯ２溶液を植物又は動物材料の該残渣から分離する工程；及び
ｃ．該ＣＯ２溶液から中性脂質を回収する工程
に従って処理する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該植物又は動物材料を、使用前に、乾燥させる又は部分的に乾燥させる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該植物又は動物材料を、該材料中の水分が３０重量％未満になるまで、乾燥させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該植物又は動物材料を、該材料中の水分が５重量％以上であるように、乾燥させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該植物又は動物材料を、凍結乾燥によって又は噴霧乾燥によって乾燥させる、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該植物又は動物材料が、凍結されている湿潤バイオマスである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
凍結した湿潤バイオマスを工程（ｉ）の前に摩砕する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
１種類以上の複合脂質が、リン脂質、ガングリオシド、糖脂質、セレブロシド、又はスフィンゴ脂質である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
１種類以上の複合脂質がリン脂質である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
該リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、プラズマローゲン、アルキルアシル型リン脂質、ホスホノ脂質、リゾリン脂質、セラミド・アミノエチルホスホネート、及びホスファチジン酸のいずれか１つ以上を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該糖脂質が、ガラクト脂質、ガングリオシド、スルホキノボイスルジアシルグリセリド、タウロ糖脂質、グリコスフィンゴリン脂質、及びマンノシル脂質を包含する、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
該脂質中に含有される高度不飽和脂肪酸が、非限定的に、アラキドン酸、α−及びγ−リノレン酸、ピノレン酸、シアドン酸、コランビン酸、ジホモリノレン酸、エイコサテトラエン酸、ジュニペロン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸のいずれか１つ以上を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
該植物又は動物材料が、動物の器官、動物の腺、海洋マクロ−及びミクロ−藻類、糸状菌、細菌、酵母、貝類、魚類、海洋無脊椎動物、卵、植物の種子、植物の葉、植物の針、シダの葉、苔、及び地衣類から成る群のいずれか１種類から得られる、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
該液体ジメチルエーテルが近臨界ジメチルエーテルである、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法によって得られる、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質。
【請求項２７】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法によって得られる複合脂質。
【請求項２８】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法によって得られる中性脂質。
【請求項２９】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法によって、高度不飽和脂肪酸含有脂質が抽出された植物又は動物材料。
【請求項３０】
請求項２９記載の植物又は動物材料の、ニュートラシューティカルとしての使用。
【請求項３１】
請求項２９記載の植物又は動物材料の、食品サプルメントとしての使用。
【請求項３２】
請求項２９記載の植物又は動物材料の、酵素の供給材料としての使用。
【公表番号】特表２００９−５３８３６６（Ｐ２００９−５３８３６６Ａ）
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１１９７４（Ｐ２００９−５１１９７４）
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００７／０００１２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３６２８１
【国際公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（５０６３６４９２７）インダストリアル リサーチ リミテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００７／０００１２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３６２８１
【国際公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（５０６３６４９２７）インダストリアル リサーチ リミテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
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