液滴サイズの制御装置ならびに制御方法
【課題】液滴を用いる化学反応、液滴中に保持した細胞の培養など、容器を用いない微量反応系を実現するための新しい技術を提供する。
【解決手段】液滴を生成するための手段、前記生成された液滴を撥水性面に保持する親水性領域のパターンを配した基板、基板に接する温調装置、基板上に形成した液滴の大きさを測定する測定手段、測定した液滴の大きさをもとに、温調装置の温度を制御する制御装置からなる。
【解決手段】液滴を生成するための手段、前記生成された液滴を撥水性面に保持する親水性領域のパターンを配した基板、基板に接する温調装置、基板上に形成した液滴の大きさを測定する測定手段、測定した液滴の大きさをもとに、温調装置の温度を制御する制御装置からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴を用いる化学反応、液滴中に保持した細胞の培養など、容器を用いない微量反応系を実現するための新しい技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の生化学反応をはじめとする化学反応は、ある大きさを持つ容器の中で行うのが一般的である。たとえば、ＲＮＡライゲーション反応では、蓋のできるマイクロチューブに３’末端リン酸基を持つＲＮＡ断片、このＲＮＡに導入したい配列の合成オリゴＤＮＡ、ＲＮＡリガーゼなどの混合液を入れ、１５℃で一昼夜放置して反応を進行させる。
【０００３】
また、細胞を観察するには、一般的には、スライドガラス上に細胞を含む溶液をのせ、その上をカバーガラスで覆い、顕微鏡で観察する。あるいは、細胞培養シャーレやマイクロプレート上に所定量の培地を入れ、その中で細胞を培養し、容器の底面を通して細胞を観察するのが一般的である。細胞に対して薬効を見る場合などは、同様にマイクロプレートなどの容器に細胞を入れ、培養し、そこに、影響を見たい薬剤を添加して細胞の状態変化を観察する。
【０００４】
細胞を取り扱う技術には、空気中に液滴を形成しその中に確率的に細胞が一個入るような系を作成し、細胞を一細胞ずつ計測したり分離したりする技術がある。これはセルソーターと呼ばれる装置で行われる。セルソーターは蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である。この技術について詳しくは非特許文献１に報告されている。
【０００５】
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. 第151 巻第１５０頁から１６５頁（１９８７年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的に、生化学反応などに用いる反応体積は目的に応じて設定されるが、近年は微量反応が要求されるようになっている。特に計測を目的とした反応では、計測装置の微量化が進んでいるが、それに見合うだけの前処理反応の微量化はなされていないのが現状である。たとえば、キャピラリーＤＮＡシーケンサーでは内径が５０μｍ程度のキャピラリーを用いて試料ＤＮＡが電気泳動により分離される。この場合、計測に必要とされる試料体積は数十ｎｌであるが、試料ＤＮＡを準備する処理では、実際には、少ない場合でも５μｌ程度の試料ＤＮＡが得られる反応を行っている。ナノＬＣでも同様である。すなわち、試料を準備する反応は数十μｌの容量で行わせ、得られる試料のごく一部を計測に利用しているに過ぎない。
【０００７】
従来は、使用されなかった試料の残りはストックしておき、何か問題があるときは、ストックしている試料をもう一度分析装置にかけることが行われていた。しかし、最近、解析装置の信頼性が向上し、残存試料をストックしておく必要性が低くなくなってきていることを考えると、無駄の多い処理といえる。
【０００８】
一方、種々の化学合成やスクリーニングに関しても反応液の微量化が進んでいるが、液体ハンドリングは微量になると精度を維持しながら処理を進めることが困難になる。そのため、ビーズを使った固相と液相の界面で反応をおこない、色々な反応の組み合わせを同時に行う技術が開発されている。
【０００９】
しかし、必ずしも固相を利用した反応が万能的に使われるとは限らず、液相での反応が必要な場合も多い。それは、固相表面では、反応物の片方が固体表面に固定されているため、反応速度が遅くなり、あるいは、立体障害で反応基質そのものが固相表面の反応基に攻撃できない、ゼータ電位の問題で、不特定なものが固相表面に吸着する、静電反発力で固相表面に近寄れないなど色々な問題があるからである。
【００１０】
他方、液体での微量反応を実現するためには以下の問題をクリアーしなければならない。１）液の取り扱いが難しくなる、
２）容器を用いるため、体積に対する容器表面積が大きくなり、溶質の吸着が無視できない、
３）プラスチック容器の使用が一般的であるが、容器からの可塑剤や剥離剤が混入する、４）容器内の空隙が大きくなり液の乾燥が無視できない。
【００１１】
これは細胞を取り扱うときも同じである。従来は、少なくても数十μｌの容量の培養液中で多数の細胞を培養したりハンドリングしたりするのが一般的である。工業生産にかかわる培養では数十リットル以上のものも実用化されている。しかし、極微量の細胞、極限としては１細胞を限られたスペースで培養したり観察したりする技術の重要性が指摘され、そのための冶具も開発されているが、目的に応じては、まだ開発途上ということができる。
【００１２】
微量培養に関しては、安田らの特開２００２−１５３２６０「細胞長期培養顕微観察装置」や特開２００４−８１０８６「細胞培養マイクロチャンバー」などがある。反応液を微小な液滴として基板上で取り扱う技術に関しても特開２００４−８５３２２「液滴操作装置」がある。
【００１３】
基板上で液と基板との接触面積を極力小さくして液滴として取り扱うのは、基板表面への吸着が抑えられるので理想的であるが、気相中に液滴が露出する。このため、溶質濃度を一定にする必要のある化学反応では、液滴の体積変化に伴う速度変化や反応阻害を防ぐことが実用化の上で極めて重要である。
【００１４】
上記従来技術のうち、容器を使い微量反応を行う従来の試験管がマイクロプレートになり、更に容器の体積を小さくするといった方向では、前記したように、容器表面の問題が微量になればなるほど大きな問題となるケースが多く、解決することが難しい。そこで、本発明では、基板上における液滴で種々反応を行える信頼のできるシステムと方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では、基板上の液滴体積すなわちサイズを一定に保つことで、再現のよい反応を実現する。また、必要に応じて、基板上で液滴のサイズを実質的に非接触で自在に変化させ、液的中の器質や反応性生物の濃度をコントロールし、一連の化学反応あるいは細胞培養が滞りなく進行するようにする。
【発明の効果】
【００１６】
細胞や微生物、さらには化学物質等を含有する微量の液体を液滴として操作し、運搬、混合、観察、測定することが可能となる。とくに、液滴のサイズを一定に保つことが可能になることにより、液滴中の反応や細胞培養に携わる基質濃度をコントロールすることができるようになるため、再現のよい反応が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（実施例１）
上記のように蒸発の影響があるような長時間の反応等の操作を行う場合における液滴サイズのコントロール方法について詳しく述べる。
【００１８】
本発明の基本的なアイデアは、液滴サイズの変動が、液滴と気相の界面の微小領域における液滴からの溶媒の蒸発と、気相から液滴への凝集の差に基づくことに着目し、蒸発と凝集がバランスするようにコントロールすることにある。一般的に、溶媒である水の蒸気圧をあげれば液滴は成長し、蒸気圧を下げれば液滴が小さくなる。このため飽和蒸気圧曲線に従い、加湿したり、温度をコントロールしたりすることで液滴サイズを維持コントロールすることが可能である。
【００１９】
図１（ａ）は、実施例１に好適な細胞培養チップ１００の平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ×２０ｍｍである。シリコン基板１の上面の領域は疎水性領域３とされ、そのなかに、親水性領域４が周期的に配列される。親水性領域４の大きさは、この領域の一つに収容する細胞の大きさ、あるいは、数によって決定されるが、４００μｍ×４００μｍ程度である。親水性領域４の間隔は、細胞を含む液滴が、お互いに、接触して混ざらないだけの間隔とするが、取り扱いの便を考えると、２０００μｍ程度が良い。もちろん、液滴の径が１００μｍ以下なら親水性領域４の間隔は５００μｍ程度でよく、液滴の大きさと親水性領域のサイズや間隔は目的に応じて決められるべきものである。図1では親水性領域を等間隔で作成する例について示しているが、後に述べるように複数の液滴を基板上で混ぜ合わせて反応を行う場合などは、色々な間隔で親水性領域を作成するケースが有効である。基本的には、液滴同士の最も間隔が狭いケースで、液滴の大きさの倍以上の間隔で基板表面の親水性領域の位置を作れば良い。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。
【００２０】
親水性領域と疎水性領域の作成方法は、例えば、疎水性のシリコン基板１の上面を酸化して、一旦、全領域を親水性のＳｉＯ２薄膜とする。その後、疎水性とすべき領域のＳｉＯ２薄膜をフッ酸で溶解除去して疎水性領域を作成すれば良い。あるいは、基板１の材質が表面があらかじめＳiＯ2薄膜形成してある親水性表面の場合、フッ素系樹脂，シリコン系樹脂等の疎水性材料を、その上に配置することで、疎水性領域を形成すれば良い。この場合は、疎水性領域中に存在する親水性領域が、疎水性材料の厚さだけ低くなったものとなる。
【００２１】
あるいは、基板１には、超撥水性を有するフッ素化カーボン（フッ化ピッチ）の粉末を金属メッキするときに混ぜ込み、表面に色々な形状のフッ化ピッチを形成することで接触角１４５〜１７０°の超撥水性表面を作成する技術など表面をフラクタルな構造とすることで達成できる。この場合、親水性表面に必要な部分だけ撥水性処理してもよい。水滴を形成する部分には一般的に超親水処理といわれる技術を用いることもできる。超親水性処理としては、ＴｉＯ２多層膜表面にＳｉＯ２成分の薄い（１０−２０ｎｍ）被覆層を形成することにより、達成される。ただし、酸化チタン膜（ＴｉＯ２）を用いるために、基板１に使用前に紫外線を照射し、ＴｉＯ２表面に水酸基を導入する必要がある。これにより表面はＴｉＯＨとなり超親水性となる。この方法で、接触角１０°以下の超親水性領域を数週間保持できる。
【００２２】
図２は本発明による実施例１の液滴サイズのコントロール装置の概要を示す断面図である。図２の基板１は、上述の疎水性のシリコン基板１の上面を酸化して、一旦、全領域を親水性のＳｉＯ２薄膜とし、その後、疎水性とすべき領域のＳｉＯ２薄膜をフッ酸で溶解除去して疎水性領域を作成する方法によったものであり、基板１の親水性領域４が基板１の表面より高い形になっている。親水性領域４の周辺部は、全て、疎水性領域３である。親水性領域４には液滴１４が載置されている。１５は温調器であり、基板１の温度をコントロールするため、基板１の下面に設けられている。１８は温度センサーであり、基板１の温度のモニターのために、基板１と温調器１５の接合面に設けられる。１９，２０は加湿用の水槽であり、基板１の両側に設けられる。２１はステージであり、この上に、温調器１５と水槽１９，２０が配置される。さらに、ステージ２１の上には透明な容器を逆にした形の上蓋２２が設けられる。
【００２３】
上蓋２２で、ステージ２１の上の温調器１５、基板１、水槽１９，２０および基板１の上の液滴１４が覆われる。上蓋２２とステージ２１で囲われた空間は、密封されているわけではないが、閉ざされた空間となる。このために、内部は飽和水蒸気で満たされている。２３は駆動装置であり、パソコン４１から信号を受けステージ２１をＸＹの任意の方向に移動させることができる。
【００２４】
上記温調器１５は、例えば、ペルチェ素子が使用できる。ペルチェ素子は、加熱および冷却のいずれに対しても、素子に流す電流の向きで制御できるとともに、加熱および冷却速度を電流の大きさでコントロールすることができる。
【００２５】
３１はカメラ、例えば、ＣＣＤカメラであり、レンズ３２，３３を介して液滴１４を撮影する。この際、光源３４を用意し、レンズ３２，３３の間に設けられたハーフミラー３５を介して入れ、矢印３６の方向から照明する。なお、液滴１４の照明は、ハーフミラー３５を使用しないで、上蓋２２の上方から、直接光りを当てるものとしても良い。
【００２６】
４１は、いわゆる、パソコンであり、必要なプログラムを格納しているとともに、温度センサー１８から基板１の温度信号を、カメラ３１から液滴１４のサイズの情報を与えられる。さらに、パソコン４１は、使用者による操作信号４２が入力される。パソコン４１は、これらの情報から、液滴１４のサイズが不適当と判断したとき、あるいは、使用者がパソコン４１の表示装置（図示しない）を見て、液滴１４のサイズ修正の操作信号４２を与えたとき、温調器１５を構成するペルチェ素子に適当な電流を流す。また、使用者は、カメラ３１が見ている液滴１４を変更するときは、パソコン４１に操作信号４２を与え、パソコン４１は、駆動装置２３に駆動信号を送り、ステージ２１を移動させる。
【００２７】
図２に示す実施例１の液滴サイズのコントロール装置の操作の概要を示すと以下のようである。
【００２８】
パソコン４１はカメラ３１からの画像データを解析し、基板１上の液滴４の大きさを逐次計算する。液滴が大きくなる方向の場合には、パソコン４１は温調器１５の温度を上昇させるように指示を出す。液滴の大きさが小さくなる方向の場合は、温調器１５の温度を下げるように指示を出す。
【００２９】
基板１の温度のモニターは温度センサー１８で行い、データはパソコン４１に与えられて、カメラ３１からの液滴１４のサイズのデータとともに温度制御に用いる。親水性領域４が複数あり、液滴１４も複数ある場合は、カメラ３１の視野にすべての液滴が入らないケースもある。この場合は、代表的な液滴のみをモニターすれば良い。もちろん、より正確には、駆動装置２３を用いて基板１の載っているステージ１０を移動させ、すべての液滴の大きさを測定し、すべての液滴の平均直径と最小径、最大径を測定し、温度制御を行っても良い。このとき、最小、あるいは、最大の直径を有する液滴のサイズが制御範囲から逸脱してしまうことが予想される場合には、他の液滴の直径が少々制御範囲からずれることがあっても、最小、あるいは、最大の直径を有する液滴の直径を制御範囲内になるように温度を調整したほうが良いケースもある。
【００３０】
液滴の温度変動は液滴中の化学反応速度に影響を与えるので、大きくてもプラスマイナス３℃程度にとどめるのが良い。この場合でも、一般的に、化学反応速度が数十パーセント変動する可能性があるが、たとえば、液滴中で細胞を飼う場合に液滴径が変化して塩濃度が数十パーセント変動するより、良い結果を得られる。温調器１５としてペルチェ素子を用いることで、簡便に、加熱および冷却のいずれも任意の変化速度で制御できる。ただし、ペルチェ素子は透明でないので、透過光式の光学系を組むことができない。
【００３１】
以下は実施例１の具体的なデータ例を示す。たとえば、容器２２で囲われた空間の中を２５℃一定の水蒸気に保つ。加湿用の水槽１９，２０には十分な水を張る。容器２２で囲われた空間の容積を1辺１００ｍｍ×１００ｍｍ、高さ５０ｍｍとすると、体積は５×１０−４ｍ３となる。このときの飽和水蒸気圧は３１．７ｈＰａ、飽和水蒸気量は２３．１ｇ／ｍ３となる。よって、容器２２で囲われた空間の中には１１．６ｍｇの水が水蒸気として存在する。一方、容器２２で囲われた空間の温度が２３℃の場合は、飽和水蒸気圧は２８．１ｈＰａ、飽和水蒸気量は２０．６ｇ／ｍ３である。したがって、短時間で容器２２で囲われた空間の温度が２５℃から２３℃に低下したときは、両者の飽和水蒸気量の差の１．２５ｍｇ(何故なら（２３．１−２０．６）ｇ／ｍ３×５×１０−４ｍ３＝１．２５ｍｇ)の水が蒸発することを意味する。この結果、液滴のサイズは小さくなることになる。
【００３２】
実際、基板１の温度を２５℃に設定し、１μｌの液滴１４を４個基板上にのせる。この状態で、容器２２で囲われた空間の温度も２５℃となっているものとする。そして、この温度２５℃の飽和蒸気圧で安定していて、液滴１４の大きさも安定している。次に、基板１の温度を２３℃にする。液滴１４は基板１に接触しているので速やかに温度変化がおきるが、容器２２で囲われた空間の温度は、空気の熱伝導が低いので、ほとんど変化しない。その結果、基板１の温度変化に伴う液滴１４の温度変化により、数分で液滴１４の直径が１．２４ｍｍから１．３１ｍｍ（温度が低くなると周囲の水分が液滴１４に凝集するので大きくなる）に変化しほぼ一定を保つ。
【００３３】
すなわち、基板１の温度をコントロールしたときは、短時間で、それと接している液滴１４の温度も変化し、液滴１４の大きさを自在に変えられる。一方、上述したように、容器２２で囲われた空間の温度が急変したときにも、飽和水蒸気圧が変化することによって、液滴１４の大きさが変化するが、容器２２で囲われた空間の温度は、外的に大きな変化を与えない限り、急変することは無い。逆に言えば、外的な条件の変化により、容器２２で囲われた空間の温度が徐々に変化することにより、液滴１４のサイズに変化が現れたときには、基板１の温度をコントロールして液滴１４の温度を、液滴１４のサイズの変化の逆になるように変化させれば、液滴１４のサイズの変化を抑制することができる。
【００３４】
液滴の大きさを一定に保ちたい場合は、したがって、液滴１４の直径の変化をカメラ３１で検出し、液滴１４の大きさが大きくなる方向であるときは基板の温度を１から２℃上昇させ液滴の水分を蒸発させて液滴を小さくする。これは、容器２２で囲われた空間の温度が上昇して、飽和水蒸気圧が低下して、液滴の大きさが所定の大きさより大きくなったことを、温度の制御で打ち消すことを意味する。逆に、液滴の大きさが所定の大きさより小さくなる方向のときは、基板の温度を下げて、液滴を成長させる。すなわち、液滴の大きさを温度コントロールにフィードバックさせることで、基板１の温度を制御すれば、液滴１４の直径をほぼ一定に維持することができる。
【００３５】
一般に、顕微鏡用湿度コントロール装置としては、試料の置かれた雰囲気の温度をコントロールするが、雰囲気の温度コントロールでは追従性が悪い。これに対し、実施例１のような極微量の液滴を用い、液滴の温度を直接的に制御する系では、液滴サイズのコントロールをリアルタイムで制御することができる。
【００３６】
（実施例２）
図３は、基板１上の複数の液滴に対して、個々の液滴のサイズをコントロールする実施例２を説明する概略図である。実施例２では基板１のそれぞれの親水性領域４に対して独立の温調器１５が取り付けられ、それぞれの液滴１４の位置に温度センサー１８が設けられていること、さらに、パソコン４１からそれぞれの温調器１５に対して、個別に温度制御信号が送られる点を除けば、実施例１と同じ構成である。ただし、図３では、基板１の親水性領域４が基板１の表面より低い形になっている。親水性領域４の周辺部は、全て、疎水性領域３である。なお、各温調器１５の間は、温度伝達特性の良くない適当なスペーサで埋められる。
【００３７】
実施例２によれば、各液滴１４の大きさを常にカメラ７でモニターしている。カメラ７の画像からパソコン４１が計算した液滴径からフィードバックをかけ、各液滴１４の温調器１５を独立に制御する。個々の液滴１４近傍の温度はセンサー１８で独立にモニターする。この方法で各液滴径の変動を１０％以内に抑えることができる。
（実施例３）
図４は、基板５０上に２種の液滴を形成し、これを混合した後、所定の位置に搬送するなどの操作を容易に可能とする実施例３を説明する概略図である。
【００３８】
図４において、基板５０の一面は全体的に疎水性表面とされる一方で、基板５０上に、２種の液滴を形成するための二つの親水性領域５１，５２、２種の液滴を混合するための親水性領域５５、混合された液滴を移動後に保持するための親水性領域５7が設けられ、さらに、これらの親水性領域間を結ぶ親水性ライン５３，５４および５６が設けられている。基板５０は２０ｍｍ×２０ｍｍの超撥水性基板で、親水性領域５１，５２，５５および５７の大きさは、この領域で形成する液滴の大きさによって決定されるが、２００μｍ×２００μｍ程度である。親水性ライン５３，５４および５６の幅は２μｍである。基板５０はステージ５９上に設けられた温調器１５の上に設けられる。ステージ５９は、パソコン４１の駆動信号により動作する駆動装置２３によりＸＹの任意の方向に駆動される。ここで、温調器１５は、実施例１,２と同様に、基板５０の温度をコントロールするため、に設けられている。この場合にも基板５０の温度のモニターのために、温度センサーが必要であり、基板５０と温調器１５の接合面に設けられるが、図が煩雑になるので、表示は省略した。また、パソコン４１との信号の授受の表示も省略した。
【００３９】
３１はカメラ、例えば、ＣＣＤカメラであり、レンズ３２，３３を介して親水性領域５１，５２に形成される液滴１４を撮影する。この際、光源３４を用意し、レンズ３２，３３の間に設けられたハーフミラー３５を介して入れ、矢印３６の方向から照明する。なお、液滴１４の照明は、ハーフミラー３５を使用しないで、基板５０の上方から、直接、光を当てるものとしても良い。４１は、いわゆる、パソコンであり、必要なプログラムを格納しているとともに、カメラ３１から液滴１４のサイズの情報を与えられるとともに、使用者による操作信号４２が入力される。ここで、図示は省略したが、パソコン４１には表示装置が設けられ、カメラ３１から入力された液滴１４が表示される。
【００４０】
４６は液滴１４を形成するためのピペットである。ピペット４６には液滴を形成すべき液があらかじめ吸い上げられて保持されている。ピペット４６の根元部には、チューブ４５を介してシリンジポンプ４４が設けられ、シリンジポンプ４４には駆動装置４３が取り付けられている。使用者が、液滴の作成の指示をパソコン４１に与えると、駆動装置４３が動作し、シリンジポンプ４４が駆動装置４４により駆動され、ピペット４６内の液が押し出され、ピペット４６の先端に液滴が形成される。使用者は、ピペット４６の液滴を光学的にモニターしながら、液滴が所定の大きさになったら、液滴の形成を止める。
【００４１】
ピペット４６を基板５０の表面に接触する状態で液滴１４を形成した場合には、使用者は、ピペット４６を上げる指示をパソコン４１に与えると、ピペット４６の上下動駆動装置４７にピペット４６を上げる指示が与えられ、ピペット４６は上に動き、液滴から離れる。一点差線４８は上下動駆動装置４７とピペット４６との連係を意味する。ピペット４６を基板５０の表面から離した状態で液滴１４を形成した場合には、使用者は、一旦、ピペット４６を下げて、基板５０の表面の親水性領域に液滴を移した後、ピペット４６を上に上げ、液滴から離す。
【００４２】
次に、使用者は、他の液滴を形成するために、パソコン４１にステージの移動指示を与える。この指示に応じて、パソコン４１は駆動装置２３に駆動信号を与え、ステージ５９は駆動される。使用者は、ピペット４６の先端をモニターしておき、ピペット４６の先端が他の液滴を形成するべき親水性領域に到達したらステージ５９を止める。新しい位置で、上述したように、ピペット４６の先端に液滴を形成し、基板５０の表面の親水性領域に液滴を形成する。この場合、ピペット４６は、新しい液滴に対応した液が吸い上げられたものに交換されているのは、当然である。
【００４３】
次に、使用者は、親水性領域５１,５２に形成された液滴を、親水性領域５５に移動させて混合するが、この際、それぞれの親水性領域５１と５５、親水性領域５２と５５を結ぶ親水性ライン５３，５４を利用して移動させる。すなわち、ピペット４６の先端を液滴１４に接触させて、液滴が親水性ライン上をすべるように、ステージ５９を移動させる。その結果、液滴は親水性ライン上をスムーズに移動して、新しい親水性領域に移る。
【００４４】
親水性領域５１,５２に形成された液滴が、親水性領域５５に移動されたところで、所定の化学反応が起こることになるが、このためには、液滴の形成、移動に比べて長い時間を要する場合がある。このため、液滴の水分が蒸発してしまう可能性があるので、実施例１,２と同様に、液滴の大きさをモニターしながら、温調器１５を制御して、液滴径が一定になるように基板５０の温度をコントロールする。もちろん、この制御は、液滴の形成の際にも適用して良い。さらには、図示しないが、実施例１,２と同様に、加湿用の水槽１９，２０および透明な容器を逆にした形の上蓋２２を設けて、化学反応が起こる間の液滴の環境の変化を抑止するのが良い。
【００４５】
ここで、二つの液滴が、ＤＮＡとＤＮＡにインターカレートする蛍光色素サイバーグリーンＩである場合、例えば、それぞれの液滴を親水性領域５５に移動させ、合体させ、２分間その位置に滞在させる。その間、液滴径をモニターし、液滴径が一定になるように基板５０の温度をコントロールする。その後、親水性ライン５６に沿って液滴を親水性領域５５から親水性領域５７に移動させる。親水性ライン５６の途中、あるいは、親水性領域５７の位置で、複合され、化学反応を終了した液滴に、レーザー光源６１からハーフミラー６２を介して照射される光を照射する。液滴が発する蛍光を検出器６６で検出することで、液滴内の反応物由来の蛍光量を測定することができる。なお、６３,６４は光学系を構成するレンズである。なお、この場合も、ピペット４６の先端を、複合され、化学反応を終了した液滴に接触させて、液滴が親水性ライン上をすべるように、移動させるのが良いが、液滴径をモニターするための光学系と液滴内の反応物由来の蛍光量を測定するための光学系とを同じ場所に設けることはできないので、ピペット４６の上下動駆動装置４７が、上下動のみならず、ＸＹ方向にもピペット４６を移動できるような駆動装置とするのが良い。
【００４６】
なお、図４では、２種の液滴を形成するための二つの親水性領域５１，５２を設けるものとしたが、これは、一つでも良い。すなわち、最初に形成した液滴を２種の液滴を混合するための親水性領域５５に移した後、もう一つの液滴を最初の親水性領域に形成して、これを２種の液滴を混合するための親水性領域５５に移して混合しても良いからである。
【００４７】
合成するのが３種の液滴であれば、親水性領域５１，５２を３つの親水性領域としても良いし、一つの親水性領域に液滴を次々に作って、これを順次、次段の親水性領域に送って、合成するものとしても良い。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】（ａ）は、実施例１に好適な細胞培養チップ１００の平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。
【図２】本発明による実施例１の液滴サイズのコントロール装置の概要を示す断面図である。
【図３】基板１上の複数の液滴に対して、個々の液滴のサイズをコントロールする実施例２を説明する概略図である。
【図４】基板５０上に２種の液滴を形成し、これを混合した後、所定の位置に搬送するなどの操作を容易に可能とする実施例３を説明する概略図である。
【符号の説明】
【００４９】
１…シリコン基板、３…疎水性領域、４…親水性領域、５…位置決め用のマーカー、１４…液滴、１５…温調器、１８…温度センサー、１９，２０…加湿用の水槽、２１…ステージ、２２…上蓋、２３…駆動装置、３１…カメラ、３２，３３…レンズ、３４…光源、３５…ハーフミラー、４１…パソコン、４２…操作信号、４３…駆動装置、４４…シリンジポンプ、４５…チューブ、４６…ピペット、４７…上下動駆動装置、４８…一点差線、５０…基板、５１，５２，５５，５７…親水性領域、５３，５４，５６…親水性ライン、５９…ステージ、６１…レーザー光源、６２…ハーフミラー、６３，６４…レンズ、６６…検出器。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴を用いる化学反応、液滴中に保持した細胞の培養など、容器を用いない微量反応系を実現するための新しい技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の生化学反応をはじめとする化学反応は、ある大きさを持つ容器の中で行うのが一般的である。たとえば、ＲＮＡライゲーション反応では、蓋のできるマイクロチューブに３’末端リン酸基を持つＲＮＡ断片、このＲＮＡに導入したい配列の合成オリゴＤＮＡ、ＲＮＡリガーゼなどの混合液を入れ、１５℃で一昼夜放置して反応を進行させる。
【０００３】
また、細胞を観察するには、一般的には、スライドガラス上に細胞を含む溶液をのせ、その上をカバーガラスで覆い、顕微鏡で観察する。あるいは、細胞培養シャーレやマイクロプレート上に所定量の培地を入れ、その中で細胞を培養し、容器の底面を通して細胞を観察するのが一般的である。細胞に対して薬効を見る場合などは、同様にマイクロプレートなどの容器に細胞を入れ、培養し、そこに、影響を見たい薬剤を添加して細胞の状態変化を観察する。
【０００４】
細胞を取り扱う技術には、空気中に液滴を形成しその中に確率的に細胞が一個入るような系を作成し、細胞を一細胞ずつ計測したり分離したりする技術がある。これはセルソーターと呼ばれる装置で行われる。セルソーターは蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である。この技術について詳しくは非特許文献１に報告されている。
【０００５】
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. 第151 巻第１５０頁から１６５頁（１９８７年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的に、生化学反応などに用いる反応体積は目的に応じて設定されるが、近年は微量反応が要求されるようになっている。特に計測を目的とした反応では、計測装置の微量化が進んでいるが、それに見合うだけの前処理反応の微量化はなされていないのが現状である。たとえば、キャピラリーＤＮＡシーケンサーでは内径が５０μｍ程度のキャピラリーを用いて試料ＤＮＡが電気泳動により分離される。この場合、計測に必要とされる試料体積は数十ｎｌであるが、試料ＤＮＡを準備する処理では、実際には、少ない場合でも５μｌ程度の試料ＤＮＡが得られる反応を行っている。ナノＬＣでも同様である。すなわち、試料を準備する反応は数十μｌの容量で行わせ、得られる試料のごく一部を計測に利用しているに過ぎない。
【０００７】
従来は、使用されなかった試料の残りはストックしておき、何か問題があるときは、ストックしている試料をもう一度分析装置にかけることが行われていた。しかし、最近、解析装置の信頼性が向上し、残存試料をストックしておく必要性が低くなくなってきていることを考えると、無駄の多い処理といえる。
【０００８】
一方、種々の化学合成やスクリーニングに関しても反応液の微量化が進んでいるが、液体ハンドリングは微量になると精度を維持しながら処理を進めることが困難になる。そのため、ビーズを使った固相と液相の界面で反応をおこない、色々な反応の組み合わせを同時に行う技術が開発されている。
【０００９】
しかし、必ずしも固相を利用した反応が万能的に使われるとは限らず、液相での反応が必要な場合も多い。それは、固相表面では、反応物の片方が固体表面に固定されているため、反応速度が遅くなり、あるいは、立体障害で反応基質そのものが固相表面の反応基に攻撃できない、ゼータ電位の問題で、不特定なものが固相表面に吸着する、静電反発力で固相表面に近寄れないなど色々な問題があるからである。
【００１０】
他方、液体での微量反応を実現するためには以下の問題をクリアーしなければならない。１）液の取り扱いが難しくなる、
２）容器を用いるため、体積に対する容器表面積が大きくなり、溶質の吸着が無視できない、
３）プラスチック容器の使用が一般的であるが、容器からの可塑剤や剥離剤が混入する、４）容器内の空隙が大きくなり液の乾燥が無視できない。
【００１１】
これは細胞を取り扱うときも同じである。従来は、少なくても数十μｌの容量の培養液中で多数の細胞を培養したりハンドリングしたりするのが一般的である。工業生産にかかわる培養では数十リットル以上のものも実用化されている。しかし、極微量の細胞、極限としては１細胞を限られたスペースで培養したり観察したりする技術の重要性が指摘され、そのための冶具も開発されているが、目的に応じては、まだ開発途上ということができる。
【００１２】
微量培養に関しては、安田らの特開２００２−１５３２６０「細胞長期培養顕微観察装置」や特開２００４−８１０８６「細胞培養マイクロチャンバー」などがある。反応液を微小な液滴として基板上で取り扱う技術に関しても特開２００４−８５３２２「液滴操作装置」がある。
【００１３】
基板上で液と基板との接触面積を極力小さくして液滴として取り扱うのは、基板表面への吸着が抑えられるので理想的であるが、気相中に液滴が露出する。このため、溶質濃度を一定にする必要のある化学反応では、液滴の体積変化に伴う速度変化や反応阻害を防ぐことが実用化の上で極めて重要である。
【００１４】
上記従来技術のうち、容器を使い微量反応を行う従来の試験管がマイクロプレートになり、更に容器の体積を小さくするといった方向では、前記したように、容器表面の問題が微量になればなるほど大きな問題となるケースが多く、解決することが難しい。そこで、本発明では、基板上における液滴で種々反応を行える信頼のできるシステムと方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では、基板上の液滴体積すなわちサイズを一定に保つことで、再現のよい反応を実現する。また、必要に応じて、基板上で液滴のサイズを実質的に非接触で自在に変化させ、液的中の器質や反応性生物の濃度をコントロールし、一連の化学反応あるいは細胞培養が滞りなく進行するようにする。
【発明の効果】
【００１６】
細胞や微生物、さらには化学物質等を含有する微量の液体を液滴として操作し、運搬、混合、観察、測定することが可能となる。とくに、液滴のサイズを一定に保つことが可能になることにより、液滴中の反応や細胞培養に携わる基質濃度をコントロールすることができるようになるため、再現のよい反応が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（実施例１）
上記のように蒸発の影響があるような長時間の反応等の操作を行う場合における液滴サイズのコントロール方法について詳しく述べる。
【００１８】
本発明の基本的なアイデアは、液滴サイズの変動が、液滴と気相の界面の微小領域における液滴からの溶媒の蒸発と、気相から液滴への凝集の差に基づくことに着目し、蒸発と凝集がバランスするようにコントロールすることにある。一般的に、溶媒である水の蒸気圧をあげれば液滴は成長し、蒸気圧を下げれば液滴が小さくなる。このため飽和蒸気圧曲線に従い、加湿したり、温度をコントロールしたりすることで液滴サイズを維持コントロールすることが可能である。
【００１９】
図１（ａ）は、実施例１に好適な細胞培養チップ１００の平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ×２０ｍｍである。シリコン基板１の上面の領域は疎水性領域３とされ、そのなかに、親水性領域４が周期的に配列される。親水性領域４の大きさは、この領域の一つに収容する細胞の大きさ、あるいは、数によって決定されるが、４００μｍ×４００μｍ程度である。親水性領域４の間隔は、細胞を含む液滴が、お互いに、接触して混ざらないだけの間隔とするが、取り扱いの便を考えると、２０００μｍ程度が良い。もちろん、液滴の径が１００μｍ以下なら親水性領域４の間隔は５００μｍ程度でよく、液滴の大きさと親水性領域のサイズや間隔は目的に応じて決められるべきものである。図1では親水性領域を等間隔で作成する例について示しているが、後に述べるように複数の液滴を基板上で混ぜ合わせて反応を行う場合などは、色々な間隔で親水性領域を作成するケースが有効である。基本的には、液滴同士の最も間隔が狭いケースで、液滴の大きさの倍以上の間隔で基板表面の親水性領域の位置を作れば良い。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。
【００２０】
親水性領域と疎水性領域の作成方法は、例えば、疎水性のシリコン基板１の上面を酸化して、一旦、全領域を親水性のＳｉＯ２薄膜とする。その後、疎水性とすべき領域のＳｉＯ２薄膜をフッ酸で溶解除去して疎水性領域を作成すれば良い。あるいは、基板１の材質が表面があらかじめＳiＯ2薄膜形成してある親水性表面の場合、フッ素系樹脂，シリコン系樹脂等の疎水性材料を、その上に配置することで、疎水性領域を形成すれば良い。この場合は、疎水性領域中に存在する親水性領域が、疎水性材料の厚さだけ低くなったものとなる。
【００２１】
あるいは、基板１には、超撥水性を有するフッ素化カーボン（フッ化ピッチ）の粉末を金属メッキするときに混ぜ込み、表面に色々な形状のフッ化ピッチを形成することで接触角１４５〜１７０°の超撥水性表面を作成する技術など表面をフラクタルな構造とすることで達成できる。この場合、親水性表面に必要な部分だけ撥水性処理してもよい。水滴を形成する部分には一般的に超親水処理といわれる技術を用いることもできる。超親水性処理としては、ＴｉＯ２多層膜表面にＳｉＯ２成分の薄い（１０−２０ｎｍ）被覆層を形成することにより、達成される。ただし、酸化チタン膜（ＴｉＯ２）を用いるために、基板１に使用前に紫外線を照射し、ＴｉＯ２表面に水酸基を導入する必要がある。これにより表面はＴｉＯＨとなり超親水性となる。この方法で、接触角１０°以下の超親水性領域を数週間保持できる。
【００２２】
図２は本発明による実施例１の液滴サイズのコントロール装置の概要を示す断面図である。図２の基板１は、上述の疎水性のシリコン基板１の上面を酸化して、一旦、全領域を親水性のＳｉＯ２薄膜とし、その後、疎水性とすべき領域のＳｉＯ２薄膜をフッ酸で溶解除去して疎水性領域を作成する方法によったものであり、基板１の親水性領域４が基板１の表面より高い形になっている。親水性領域４の周辺部は、全て、疎水性領域３である。親水性領域４には液滴１４が載置されている。１５は温調器であり、基板１の温度をコントロールするため、基板１の下面に設けられている。１８は温度センサーであり、基板１の温度のモニターのために、基板１と温調器１５の接合面に設けられる。１９，２０は加湿用の水槽であり、基板１の両側に設けられる。２１はステージであり、この上に、温調器１５と水槽１９，２０が配置される。さらに、ステージ２１の上には透明な容器を逆にした形の上蓋２２が設けられる。
【００２３】
上蓋２２で、ステージ２１の上の温調器１５、基板１、水槽１９，２０および基板１の上の液滴１４が覆われる。上蓋２２とステージ２１で囲われた空間は、密封されているわけではないが、閉ざされた空間となる。このために、内部は飽和水蒸気で満たされている。２３は駆動装置であり、パソコン４１から信号を受けステージ２１をＸＹの任意の方向に移動させることができる。
【００２４】
上記温調器１５は、例えば、ペルチェ素子が使用できる。ペルチェ素子は、加熱および冷却のいずれに対しても、素子に流す電流の向きで制御できるとともに、加熱および冷却速度を電流の大きさでコントロールすることができる。
【００２５】
３１はカメラ、例えば、ＣＣＤカメラであり、レンズ３２，３３を介して液滴１４を撮影する。この際、光源３４を用意し、レンズ３２，３３の間に設けられたハーフミラー３５を介して入れ、矢印３６の方向から照明する。なお、液滴１４の照明は、ハーフミラー３５を使用しないで、上蓋２２の上方から、直接光りを当てるものとしても良い。
【００２６】
４１は、いわゆる、パソコンであり、必要なプログラムを格納しているとともに、温度センサー１８から基板１の温度信号を、カメラ３１から液滴１４のサイズの情報を与えられる。さらに、パソコン４１は、使用者による操作信号４２が入力される。パソコン４１は、これらの情報から、液滴１４のサイズが不適当と判断したとき、あるいは、使用者がパソコン４１の表示装置（図示しない）を見て、液滴１４のサイズ修正の操作信号４２を与えたとき、温調器１５を構成するペルチェ素子に適当な電流を流す。また、使用者は、カメラ３１が見ている液滴１４を変更するときは、パソコン４１に操作信号４２を与え、パソコン４１は、駆動装置２３に駆動信号を送り、ステージ２１を移動させる。
【００２７】
図２に示す実施例１の液滴サイズのコントロール装置の操作の概要を示すと以下のようである。
【００２８】
パソコン４１はカメラ３１からの画像データを解析し、基板１上の液滴４の大きさを逐次計算する。液滴が大きくなる方向の場合には、パソコン４１は温調器１５の温度を上昇させるように指示を出す。液滴の大きさが小さくなる方向の場合は、温調器１５の温度を下げるように指示を出す。
【００２９】
基板１の温度のモニターは温度センサー１８で行い、データはパソコン４１に与えられて、カメラ３１からの液滴１４のサイズのデータとともに温度制御に用いる。親水性領域４が複数あり、液滴１４も複数ある場合は、カメラ３１の視野にすべての液滴が入らないケースもある。この場合は、代表的な液滴のみをモニターすれば良い。もちろん、より正確には、駆動装置２３を用いて基板１の載っているステージ１０を移動させ、すべての液滴の大きさを測定し、すべての液滴の平均直径と最小径、最大径を測定し、温度制御を行っても良い。このとき、最小、あるいは、最大の直径を有する液滴のサイズが制御範囲から逸脱してしまうことが予想される場合には、他の液滴の直径が少々制御範囲からずれることがあっても、最小、あるいは、最大の直径を有する液滴の直径を制御範囲内になるように温度を調整したほうが良いケースもある。
【００３０】
液滴の温度変動は液滴中の化学反応速度に影響を与えるので、大きくてもプラスマイナス３℃程度にとどめるのが良い。この場合でも、一般的に、化学反応速度が数十パーセント変動する可能性があるが、たとえば、液滴中で細胞を飼う場合に液滴径が変化して塩濃度が数十パーセント変動するより、良い結果を得られる。温調器１５としてペルチェ素子を用いることで、簡便に、加熱および冷却のいずれも任意の変化速度で制御できる。ただし、ペルチェ素子は透明でないので、透過光式の光学系を組むことができない。
【００３１】
以下は実施例１の具体的なデータ例を示す。たとえば、容器２２で囲われた空間の中を２５℃一定の水蒸気に保つ。加湿用の水槽１９，２０には十分な水を張る。容器２２で囲われた空間の容積を1辺１００ｍｍ×１００ｍｍ、高さ５０ｍｍとすると、体積は５×１０−４ｍ３となる。このときの飽和水蒸気圧は３１．７ｈＰａ、飽和水蒸気量は２３．１ｇ／ｍ３となる。よって、容器２２で囲われた空間の中には１１．６ｍｇの水が水蒸気として存在する。一方、容器２２で囲われた空間の温度が２３℃の場合は、飽和水蒸気圧は２８．１ｈＰａ、飽和水蒸気量は２０．６ｇ／ｍ３である。したがって、短時間で容器２２で囲われた空間の温度が２５℃から２３℃に低下したときは、両者の飽和水蒸気量の差の１．２５ｍｇ(何故なら（２３．１−２０．６）ｇ／ｍ３×５×１０−４ｍ３＝１．２５ｍｇ)の水が蒸発することを意味する。この結果、液滴のサイズは小さくなることになる。
【００３２】
実際、基板１の温度を２５℃に設定し、１μｌの液滴１４を４個基板上にのせる。この状態で、容器２２で囲われた空間の温度も２５℃となっているものとする。そして、この温度２５℃の飽和蒸気圧で安定していて、液滴１４の大きさも安定している。次に、基板１の温度を２３℃にする。液滴１４は基板１に接触しているので速やかに温度変化がおきるが、容器２２で囲われた空間の温度は、空気の熱伝導が低いので、ほとんど変化しない。その結果、基板１の温度変化に伴う液滴１４の温度変化により、数分で液滴１４の直径が１．２４ｍｍから１．３１ｍｍ（温度が低くなると周囲の水分が液滴１４に凝集するので大きくなる）に変化しほぼ一定を保つ。
【００３３】
すなわち、基板１の温度をコントロールしたときは、短時間で、それと接している液滴１４の温度も変化し、液滴１４の大きさを自在に変えられる。一方、上述したように、容器２２で囲われた空間の温度が急変したときにも、飽和水蒸気圧が変化することによって、液滴１４の大きさが変化するが、容器２２で囲われた空間の温度は、外的に大きな変化を与えない限り、急変することは無い。逆に言えば、外的な条件の変化により、容器２２で囲われた空間の温度が徐々に変化することにより、液滴１４のサイズに変化が現れたときには、基板１の温度をコントロールして液滴１４の温度を、液滴１４のサイズの変化の逆になるように変化させれば、液滴１４のサイズの変化を抑制することができる。
【００３４】
液滴の大きさを一定に保ちたい場合は、したがって、液滴１４の直径の変化をカメラ３１で検出し、液滴１４の大きさが大きくなる方向であるときは基板の温度を１から２℃上昇させ液滴の水分を蒸発させて液滴を小さくする。これは、容器２２で囲われた空間の温度が上昇して、飽和水蒸気圧が低下して、液滴の大きさが所定の大きさより大きくなったことを、温度の制御で打ち消すことを意味する。逆に、液滴の大きさが所定の大きさより小さくなる方向のときは、基板の温度を下げて、液滴を成長させる。すなわち、液滴の大きさを温度コントロールにフィードバックさせることで、基板１の温度を制御すれば、液滴１４の直径をほぼ一定に維持することができる。
【００３５】
一般に、顕微鏡用湿度コントロール装置としては、試料の置かれた雰囲気の温度をコントロールするが、雰囲気の温度コントロールでは追従性が悪い。これに対し、実施例１のような極微量の液滴を用い、液滴の温度を直接的に制御する系では、液滴サイズのコントロールをリアルタイムで制御することができる。
【００３６】
（実施例２）
図３は、基板１上の複数の液滴に対して、個々の液滴のサイズをコントロールする実施例２を説明する概略図である。実施例２では基板１のそれぞれの親水性領域４に対して独立の温調器１５が取り付けられ、それぞれの液滴１４の位置に温度センサー１８が設けられていること、さらに、パソコン４１からそれぞれの温調器１５に対して、個別に温度制御信号が送られる点を除けば、実施例１と同じ構成である。ただし、図３では、基板１の親水性領域４が基板１の表面より低い形になっている。親水性領域４の周辺部は、全て、疎水性領域３である。なお、各温調器１５の間は、温度伝達特性の良くない適当なスペーサで埋められる。
【００３７】
実施例２によれば、各液滴１４の大きさを常にカメラ７でモニターしている。カメラ７の画像からパソコン４１が計算した液滴径からフィードバックをかけ、各液滴１４の温調器１５を独立に制御する。個々の液滴１４近傍の温度はセンサー１８で独立にモニターする。この方法で各液滴径の変動を１０％以内に抑えることができる。
（実施例３）
図４は、基板５０上に２種の液滴を形成し、これを混合した後、所定の位置に搬送するなどの操作を容易に可能とする実施例３を説明する概略図である。
【００３８】
図４において、基板５０の一面は全体的に疎水性表面とされる一方で、基板５０上に、２種の液滴を形成するための二つの親水性領域５１，５２、２種の液滴を混合するための親水性領域５５、混合された液滴を移動後に保持するための親水性領域５7が設けられ、さらに、これらの親水性領域間を結ぶ親水性ライン５３，５４および５６が設けられている。基板５０は２０ｍｍ×２０ｍｍの超撥水性基板で、親水性領域５１，５２，５５および５７の大きさは、この領域で形成する液滴の大きさによって決定されるが、２００μｍ×２００μｍ程度である。親水性ライン５３，５４および５６の幅は２μｍである。基板５０はステージ５９上に設けられた温調器１５の上に設けられる。ステージ５９は、パソコン４１の駆動信号により動作する駆動装置２３によりＸＹの任意の方向に駆動される。ここで、温調器１５は、実施例１,２と同様に、基板５０の温度をコントロールするため、に設けられている。この場合にも基板５０の温度のモニターのために、温度センサーが必要であり、基板５０と温調器１５の接合面に設けられるが、図が煩雑になるので、表示は省略した。また、パソコン４１との信号の授受の表示も省略した。
【００３９】
３１はカメラ、例えば、ＣＣＤカメラであり、レンズ３２，３３を介して親水性領域５１，５２に形成される液滴１４を撮影する。この際、光源３４を用意し、レンズ３２，３３の間に設けられたハーフミラー３５を介して入れ、矢印３６の方向から照明する。なお、液滴１４の照明は、ハーフミラー３５を使用しないで、基板５０の上方から、直接、光を当てるものとしても良い。４１は、いわゆる、パソコンであり、必要なプログラムを格納しているとともに、カメラ３１から液滴１４のサイズの情報を与えられるとともに、使用者による操作信号４２が入力される。ここで、図示は省略したが、パソコン４１には表示装置が設けられ、カメラ３１から入力された液滴１４が表示される。
【００４０】
４６は液滴１４を形成するためのピペットである。ピペット４６には液滴を形成すべき液があらかじめ吸い上げられて保持されている。ピペット４６の根元部には、チューブ４５を介してシリンジポンプ４４が設けられ、シリンジポンプ４４には駆動装置４３が取り付けられている。使用者が、液滴の作成の指示をパソコン４１に与えると、駆動装置４３が動作し、シリンジポンプ４４が駆動装置４４により駆動され、ピペット４６内の液が押し出され、ピペット４６の先端に液滴が形成される。使用者は、ピペット４６の液滴を光学的にモニターしながら、液滴が所定の大きさになったら、液滴の形成を止める。
【００４１】
ピペット４６を基板５０の表面に接触する状態で液滴１４を形成した場合には、使用者は、ピペット４６を上げる指示をパソコン４１に与えると、ピペット４６の上下動駆動装置４７にピペット４６を上げる指示が与えられ、ピペット４６は上に動き、液滴から離れる。一点差線４８は上下動駆動装置４７とピペット４６との連係を意味する。ピペット４６を基板５０の表面から離した状態で液滴１４を形成した場合には、使用者は、一旦、ピペット４６を下げて、基板５０の表面の親水性領域に液滴を移した後、ピペット４６を上に上げ、液滴から離す。
【００４２】
次に、使用者は、他の液滴を形成するために、パソコン４１にステージの移動指示を与える。この指示に応じて、パソコン４１は駆動装置２３に駆動信号を与え、ステージ５９は駆動される。使用者は、ピペット４６の先端をモニターしておき、ピペット４６の先端が他の液滴を形成するべき親水性領域に到達したらステージ５９を止める。新しい位置で、上述したように、ピペット４６の先端に液滴を形成し、基板５０の表面の親水性領域に液滴を形成する。この場合、ピペット４６は、新しい液滴に対応した液が吸い上げられたものに交換されているのは、当然である。
【００４３】
次に、使用者は、親水性領域５１,５２に形成された液滴を、親水性領域５５に移動させて混合するが、この際、それぞれの親水性領域５１と５５、親水性領域５２と５５を結ぶ親水性ライン５３，５４を利用して移動させる。すなわち、ピペット４６の先端を液滴１４に接触させて、液滴が親水性ライン上をすべるように、ステージ５９を移動させる。その結果、液滴は親水性ライン上をスムーズに移動して、新しい親水性領域に移る。
【００４４】
親水性領域５１,５２に形成された液滴が、親水性領域５５に移動されたところで、所定の化学反応が起こることになるが、このためには、液滴の形成、移動に比べて長い時間を要する場合がある。このため、液滴の水分が蒸発してしまう可能性があるので、実施例１,２と同様に、液滴の大きさをモニターしながら、温調器１５を制御して、液滴径が一定になるように基板５０の温度をコントロールする。もちろん、この制御は、液滴の形成の際にも適用して良い。さらには、図示しないが、実施例１,２と同様に、加湿用の水槽１９，２０および透明な容器を逆にした形の上蓋２２を設けて、化学反応が起こる間の液滴の環境の変化を抑止するのが良い。
【００４５】
ここで、二つの液滴が、ＤＮＡとＤＮＡにインターカレートする蛍光色素サイバーグリーンＩである場合、例えば、それぞれの液滴を親水性領域５５に移動させ、合体させ、２分間その位置に滞在させる。その間、液滴径をモニターし、液滴径が一定になるように基板５０の温度をコントロールする。その後、親水性ライン５６に沿って液滴を親水性領域５５から親水性領域５７に移動させる。親水性ライン５６の途中、あるいは、親水性領域５７の位置で、複合され、化学反応を終了した液滴に、レーザー光源６１からハーフミラー６２を介して照射される光を照射する。液滴が発する蛍光を検出器６６で検出することで、液滴内の反応物由来の蛍光量を測定することができる。なお、６３,６４は光学系を構成するレンズである。なお、この場合も、ピペット４６の先端を、複合され、化学反応を終了した液滴に接触させて、液滴が親水性ライン上をすべるように、移動させるのが良いが、液滴径をモニターするための光学系と液滴内の反応物由来の蛍光量を測定するための光学系とを同じ場所に設けることはできないので、ピペット４６の上下動駆動装置４７が、上下動のみならず、ＸＹ方向にもピペット４６を移動できるような駆動装置とするのが良い。
【００４６】
なお、図４では、２種の液滴を形成するための二つの親水性領域５１，５２を設けるものとしたが、これは、一つでも良い。すなわち、最初に形成した液滴を２種の液滴を混合するための親水性領域５５に移した後、もう一つの液滴を最初の親水性領域に形成して、これを２種の液滴を混合するための親水性領域５５に移して混合しても良いからである。
【００４７】
合成するのが３種の液滴であれば、親水性領域５１，５２を３つの親水性領域としても良いし、一つの親水性領域に液滴を次々に作って、これを順次、次段の親水性領域に送って、合成するものとしても良い。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】（ａ）は、実施例１に好適な細胞培養チップ１００の平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。
【図２】本発明による実施例１の液滴サイズのコントロール装置の概要を示す断面図である。
【図３】基板１上の複数の液滴に対して、個々の液滴のサイズをコントロールする実施例２を説明する概略図である。
【図４】基板５０上に２種の液滴を形成し、これを混合した後、所定の位置に搬送するなどの操作を容易に可能とする実施例３を説明する概略図である。
【符号の説明】
【００４９】
１…シリコン基板、３…疎水性領域、４…親水性領域、５…位置決め用のマーカー、１４…液滴、１５…温調器、１８…温度センサー、１９，２０…加湿用の水槽、２１…ステージ、２２…上蓋、２３…駆動装置、３１…カメラ、３２，３３…レンズ、３４…光源、３５…ハーフミラー、４１…パソコン、４２…操作信号、４３…駆動装置、４４…シリンジポンプ、４５…チューブ、４６…ピペット、４７…上下動駆動装置、４８…一点差線、５０…基板、５１，５２，５５，５７…親水性領域、５３，５４，５６…親水性ライン、５９…ステージ、６１…レーザー光源、６２…ハーフミラー、６３，６４…レンズ、６６…検出器。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液滴を生成するための手段、前記生成された液滴を撥水性面に保持する親水性領域のパターンを配した基板、基板に接する温調装置、基板上に形成した液滴の大きさを測定する測定手段、測定した液滴の大きさをもとに、温調装置の温度を制御する制御装置からなる液滴サイズの制御装置。
【請求項２】
前記温調装置が、複数の液滴のそれぞれに独立したものであり、液滴のそれぞれを独立に温度制御できるものである請求項１の液滴サイズの制御装置。
【請求項３】
液滴を生成するための手段、前記生成された液滴を撥水性面に保持する親水性領域のパターンを配した基板、前記親水性パターン上で一つの親水性領域から他の親水性領域に液滴を移動させる手段、基板に接する温調装置、基板上に形成した液滴の大きさを測定する測定手段、測定した液滴の大きさをもとに、温調装置の温度を制御する制御装置からなる液滴サイズの制御装置。
【請求項４】
前記親水性領域のパターンが、少なくても親水性の線分を含み、前記基板の親水性の線分からなる請求項３の液滴サイズの制御装置。
【請求項５】
前記温調装置は、前記液滴が滞在しうる基板の親水性領域ごとにそれぞれを独立に温度制御できるものである請求項３の液滴サイズの制御装置。
【請求項６】
前記液滴を移動させる手段が、液滴に接触した液滴を生成するための手段である請求項３の液滴サイズの制御装置。
【請求項７】
基板の親水性領域に形成された液滴を所定の湿度に加湿された環境下に置き、前記液滴を保持している基板の温度をコントロールして、前記液滴の大きさ制御する液滴サイズの制御方法。
【請求項１】
液滴を生成するための手段、前記生成された液滴を撥水性面に保持する親水性領域のパターンを配した基板、基板に接する温調装置、基板上に形成した液滴の大きさを測定する測定手段、測定した液滴の大きさをもとに、温調装置の温度を制御する制御装置からなる液滴サイズの制御装置。
【請求項２】
前記温調装置が、複数の液滴のそれぞれに独立したものであり、液滴のそれぞれを独立に温度制御できるものである請求項１の液滴サイズの制御装置。
【請求項３】
液滴を生成するための手段、前記生成された液滴を撥水性面に保持する親水性領域のパターンを配した基板、前記親水性パターン上で一つの親水性領域から他の親水性領域に液滴を移動させる手段、基板に接する温調装置、基板上に形成した液滴の大きさを測定する測定手段、測定した液滴の大きさをもとに、温調装置の温度を制御する制御装置からなる液滴サイズの制御装置。
【請求項４】
前記親水性領域のパターンが、少なくても親水性の線分を含み、前記基板の親水性の線分からなる請求項３の液滴サイズの制御装置。
【請求項５】
前記温調装置は、前記液滴が滞在しうる基板の親水性領域ごとにそれぞれを独立に温度制御できるものである請求項３の液滴サイズの制御装置。
【請求項６】
前記液滴を移動させる手段が、液滴に接触した液滴を生成するための手段である請求項３の液滴サイズの制御装置。
【請求項７】
基板の親水性領域に形成された液滴を所定の湿度に加湿された環境下に置き、前記液滴を保持している基板の温度をコントロールして、前記液滴の大きさ制御する液滴サイズの制御方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−８８０３４（Ｐ２００６−８８０３４Ａ）
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２７６５５８（Ｐ２００４−２７６５５８）
【出願日】平成１６年９月２４日（２００４．９．２４）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２４日（２００４．９．２４）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
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