淡水性発光細菌の培地液及び毒性検査方法並びにバイオセンサー
【課題】塩分を必要とせず、生育ｐＨ範囲が広い淡水性発光細菌に注目し、その発光強度を制御する培地液及びこれを用いた毒性検査方法並びにバイオセンサーを提供する。
【解決手段】淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、水溶液中に、カリウムイオンを０．００１〜１．５ｇ／Ｌ、マグネウシムイオンを０．１〜１ｇ／Ｌ、及び炭酸水素イオンを０．０５〜０．１ｇ／Ｌ含む。特に、淡水性発光細菌を用いて重金属やＢＯＤなどの検査が可能となり、この培地液で培養された淡水性発光細菌を担持膜に担持させることによって、バイオセンサーが形成できる。
【解決手段】淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、水溶液中に、カリウムイオンを０．００１〜１．５ｇ／Ｌ、マグネウシムイオンを０．１〜１ｇ／Ｌ、及び炭酸水素イオンを０．０５〜０．１ｇ／Ｌ含む。特に、淡水性発光細菌を用いて重金属やＢＯＤなどの検査が可能となり、この培地液で培養された淡水性発光細菌を担持膜に担持させることによって、バイオセンサーが形成できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、淡水性発光細菌（例えば、フォトラブドゥス・ルミネセンス、Photorhabdus luminescens）の発光増大に対して、ＮＨ４＋、ＰＯ３−が負の影響を、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｈ＋、ＣＯ３２−が正の影響を与えることを見いだし、一般的培地（例えば、Nutrient Broth）を用いて、又はこれらの培地無しで、淡水性発光細菌を発光させる淡水性発光細菌の培地液及びこれらを用いた毒性検査方法並びに毒性検査具（バイオセンサー）に関する。
【背景技術】
【０００２】
発光細菌は生物発光を行う細菌のことをいい、迅速簡便な毒性評価等のバイオアッセイ(生物検定や生物学的試験)やバイオセンサーに利用され、比較的容易に発光量を高めることが可能なことから、一般には海洋性のビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)等が広く使用されている。なお、発光細菌は以上の毒性評価の他、ＦＭＮ又はＦＡＤ（Ｐ）Ｈを軸とする酵素系の定量、ＡＴＰの測定にも応用されている。
【０００３】
このビブリオ・フィシェリの培養方法としては、ニュトリエントブロス(Nutrient Broth３％ＮａＣｌを含む）、マリンブロス（Marine Broth)等の栄養の富んだ液体培地が使用されている。これは、生物発光に、培地の栄養が富んだ状態で菌数が高密度に増殖した場合により強い発光が現れるクオラムセンシング(quorum sensing)が関与しているからである。
特許文献１には、このような目的に使用される発光細菌(ビブリオ・フィシェリ、フォトバクテリウム・レイオグナチ、フォトバクテリウム・フォスフォレウム、フォトラブドゥス・ルミネセンス)が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３１０２９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１は、効果のクロマトグラフィーによる検出の実用についての従来技術の限界を克服する生物活性物質を検出するための方法及びキットを提供することを目的としており、更に、使用する培地として、ジペプチド、オリゴペプチド、ホウ酸ジエステル等ＦＦのホウ素化合物、キノロン又はＮ−アシルホモセリンラクトンあるいはそれらの生化学的前駆物質が使用されており、本願発明とは課題が異なると共に、使用する物質についても異なる。更に、特許文献１では、確かにフォトラブドゥス・ルミネセンスの記載はあるが、実施の好適な態様においては、海洋性の発光細菌であるビブリオ・フィシェリが使用されており、淡水性の発光細菌や、この一例であるフォトラブドゥス・ルミネセンスについての具体的な記載はない。
【０００６】
更に、ビブリオ・フィシェリは、生育ｐＨ範囲が狭いこと、海洋性であるので２〜３質量％の塩分（ＮａＣｌ）を必要とし、測定する物質の状態（即ち、工場排水等の淡水性の場合）によって、正確な毒性評価が困難であるとういう問題がある。一方、フォトラブドゥス・ルミネセンス等の淡水性発光細菌は、生育に塩分は必要とせず、取り扱いが容易であるものの、発光量がやや低いことに起因して一般にはバイオセンサーの開発は行われていない。また、フォトラブドゥス・ルミネセンス等で代表される淡水性発光バクテリアの実験を種々行った結果、菌濃度の増加は必ずしも発光性の増大に繋がるものではなく、十分な菌濃度が得られても発光強度が低い場合があることや、逆に菌濃度は低くても培養液の状態によっては、発光強度が高い場合があることを知見して、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、かかる事情に鑑みてなされたもので、塩分を必要とせず、生育ｐＨ範囲が広い淡水性発光細菌に注目し、その発光強度を制御する培地液及びこれらを用いた毒性検査方法並びにバイオセンサーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の発明に係る淡水性発光細菌の培地液は、淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、水溶液中に、カリウムイオンを０．００１〜１．５ｇ／Ｌ、マグネウシムイオンを０．１〜１ｇ／Ｌ、及び炭酸水素イオンを０．０５〜０．１ｇ／Ｌ含む。
【０００９】
第１の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、１）前記カリウムイオン源は塩化カリウム、臭化カリウム、及び硝酸カリウムのいずれか１又は２以上、２）前記マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、酢酸マグネシウム、及び三塩化カリウムマグネシウムのいずれか１又は２以上、３）前記炭酸水素イオン源は炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、及び炭酸水素カリウムのいずれか１又は２以上を使用するのが一般的であるが、淡水性発光細菌に害を有されない化合物であれば、他の化合物であってもよい。なお、カリウムイオン源として、ＫＨＣＯ３を使用すると、カリウムイオンが適正値であっても、炭酸水素イオンが規定値をオーバーする場合は、発光量が低下する。また、淡水性発光細菌に対して毒性を有する他の化合物を混合しないことは当然である。
【００１０】
また、本発明の第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液は、淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、１０００ｍＬの水溶液中に、カリウムイオンを０．０５〜５０ｍＭ、マグネウシムイオンを０．０５〜５０ｍＭ、ナトリウムイオン及び炭酸水素イオンをそれぞれ０．０１〜５０ｍＭ含み、ｐＨが３〜８の範囲にある。なお、１０００ｍＬの水溶液中に、カリウムイオンを０．０５〜５０ｍＭは、０．００２ｇ〜２ｇ／Ｌを、マグネウシムイオンを０．０５〜５０ｍＭは０．００１２〜１．２ｇ／Ｌを、ナトリウムイオン及び炭酸水素イオンをそれぞれ０．０１〜５０ｍＭは、０．００２３〜１．２ｇ／Ｌ（Ｎａ＋）、０．０００６２〜３．１ｇ／Ｌ（ＨＣＯ３−）をいう。
【００１１】
第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、前記カリウムイオン源は塩化カリウム、前記マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、前記炭酸水素イオン源は、炭酸水素ナトリウムを用いるのが好ましいが、淡水性発光細菌に害を有されない化合物であれば、他の化合物であってもよい。
【００１２】
第１、第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、前記水溶液には前記淡水性発光細菌の栄養源（例えば、Nutrient broth）が添加されているのが好ましい。これによって、淡水性発光細菌は菌数を保持又は増加させることができる。
【００１３】
第１、第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、前記淡水性発光細菌はフォトラブドゥス・ルミネセンスであるのが好ましいが、他の淡水性発光細菌であってもよい。
【００１４】
そして、第３の発明に係る淡水性発光細菌を用いた毒性検査方法は、第１、第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液に淡水性発光細菌を含ませて、該淡水性発光細菌の発光強度を増加させて、試験対象物の試験液として使用する。この毒性検査方法は、比較的安価で容易に入手できる化合物を用いて、培地液を構成でき、しかも、この培地液を用いて淡水性発光細菌の発光強度を高めることができる。更に、淡水性発光細菌は、海洋性発光細菌とは異なり、塩分（ＮａＣｌ）を必要とせず、ｐＨ範囲も広いので、より多くの試験対象物に対応でき、毒性試験の対象物を広げることができる。
【００１５】
第４の発明に係るバイオセンサーは、第１の発明に係る淡水性発光細菌の培地液に、淡水性発光細菌及び栄養源を加えて、前記淡水性発光細菌を培養した培養液を、透明容器の内側に設けられた担持膜に含ませ無水処理を行っている。
また、第５の発明に係るバイオセンサーは、淡水性発光細菌が担持された担持膜を透明容器の内側底部に設けて構成されている。
【００１６】
第４、第５の発明に係るバイオセンサーにおいて、前記担持膜はフィブロイン、アルギン酸、寒天、ゼラチン、又はその他の多孔性で粘性を有する物質からなるのが好ましい。
なお、バイオセンサーの用途としては、例えば淡水での重金属量（例えば、水銀、ニッケル等）又は淡水でのＢＯＤの測定に利用できる。
【発明の効果】
【００１７】
第１、第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液及びこれを用いた第３の発明に係る毒性検査方法並び第４、第５の発明に係るバイオセンサーは、比較的安価で容易に入手できる化合物を用いて、培地液を構成でき、しかも、この培地液を用いて淡水性発光細菌の発光強度を高めることができる。
更に、淡水性発光細菌は、海洋性発光細菌とは異なり、塩分（ＮａＣｌ）を必要とせず、ｐＨ範囲も広いので、第３の発明に係る毒性検査方法及び第４、第５の発明に係るバイオセンサーは、工場排水や下水処理場等、より多くの試験対象物に対応でき、毒性試験の対象物を広げることができる。
【００１８】
特に、第１の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、１）カリウムイオン源は塩化カリウム、臭化カリウム、及び硝酸カリウムのいずれか１又は２以上、２）マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、酢酸マグネシウム、及び三塩化カリウムマグネシウムのいずれか１又は２以上、３）炭酸水素イオン源は炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、及び炭酸水素カリウムのいずれか１又は２以上を使用した場合には、比較的安価に淡水性発光細菌の培地液を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ培地液の５つの成分のうち１を欠如させた場合の淡水性発光細菌の菌体量と発光量を示すグラフである。
【図２】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ培地液の５つの成分のうち２を欠如させた場合の淡水性発光細菌の菌体量と発光量を示すグラフである。
【図３】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ培地液の５つの成分のうち３を欠如させた場合の淡水性発光細菌の菌体量と発光量を示すグラフである。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ培地液の５つの成分の各々の淡水性発光細菌の菌体量と発光量を示すグラフである。
【図５】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれＮＢ培地液を用いた場合の菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の推移を示すグラフである。
【図６】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれ３エレメント（ＫＣｌ：０．７７ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３：０．１１ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：４．８ｇ／Ｌ）の培地液を用いた場合の菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の推移を示すグラフである。
【図７】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれ更にＮＢを加えた培地液を用いた場合の菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の推移を示すグラフである。
【図８】Ｋ＋の濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【図９】Ｍｇ２＋濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【図１０】マグネシウム化合物の濃度と発光量の関係を示すグラフである。
【図１１】ＨＣＯ３−濃度と発光量の関係を示すグラフである。
【図１２】（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれＫ、Ｍｇ、ＨＣＯ３化合物の種類と発光量との関係を示すグラフである。
【図１３】バイオセンサーの説明図である。
【図１４】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれバイオセンサーの毒性評価を示すグラフである。
【図１５】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれバイオセンサーのＢＯＤ検査評価を示すグラフである。
【図１６】バイオセンサーのＢＯＤ検査評価を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
続いて、添付した図面を参照しながら、本発明を具体化した実施の形態について説明する。
本発明者らは、先に出願した特願２０１０−２６８６２３号において海洋性発光バクテリアの発光制御方法で、海水に含まれるＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏについて如何なる成分が発光性に寄与するかを実験して調べた。しかしながら、海洋性発光バクテリアは前述のように、塩分（ＮａＣｌ）を必須の成分とし、生存するｐＨ範囲が狭いので、実施上支障がある場合があり、塩分を必要としない淡水性発光バクテリアに注目し、如何なる成分が淡水性発光バクテリアの発光度に寄与するかを研究した。
【００２１】
実験に当たっては、海水に含まれる成分を参照して選んだ結果、淡水であることから塩分（ＮａＣｌ）を除く、１）ＫＣｌ、２）ＣａＣｌ２、３）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、４）ＮａＨＣＯ３、５）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの５成分が有効であると推定し、更にこの中でどの成分が淡水性発光バクテリア(細菌)の発光に寄与するかを実験した。
【００２２】
この実験液には、１）ＫＣｌを０．７７ｇ／Ｌ（１０．３ｍＭ）、２）ＣａＣｌ２を１．２１ｇ／Ｌ（１０．９ｍＭ）、３）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを４．８ｇ／Ｌ（２３．６ｍＭ）、４）ＮａＨＣＯ３を０．１１ｇ／Ｌ（１．３ｍＭ）、５）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを３．５０ｇ／Ｌ（１４．２ｍＭ）をそれぞれ単位として、これらの１〜５を欠如させて、欠如させた培地（培地液に同じ）における淡水性発光細菌の菌体量（菌の数）と発光量を測定した。なお、培養時間は１８時間とし、以下の実験においては、淡水性発光細菌として、フォトラブドゥス・ルミネセンスを用い、菌体量として、液の濁り（ＯＤ）を測定し、発光量については、５分間の積算値で１ｍＬ中の発光量をルミノメータで測定した。なお、ここで、「ｍＭ」は水１Ｌに対するモル数を示す。
【００２３】
なお、１）ＫＣｌを０．７７ｇ／Ｌは、Ｋ＋イオンに換算して０．４ｇ／Ｌ、２）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏの４．８ｇは、Ｍｇ２＋イオンに換算して０．６ｇ／Ｌ、３）ＮａＨＣＯ３の０．１１ｇ／ＬはＨＣＯ３−に換算して０．０８ｇ／Ｌ、４）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの３．５ｇ／ＬはＭｇ２＋イオンに換算して０．３ｇ／Ｌとなる（以下、この溶液を「ＩＳＳ培地」という）。
【００２４】
図１（Ａ）、（Ｂ）は５成分の１を欠如させたもので、いずれもバクテリアの増殖はみられないが、（３）のＮａＨＣＯ３欠如、（４）のＭｇＣｌ２欠如、（６）のＫＣｌ欠如のものでは、発光量が他のものより減少していることが判る。
【００２５】
図２（Ａ）、（Ｂ）は５成分の２を欠如させたもの（即ち、３成分）で、いずれもバクテリアの増殖はみられないが、（４）のＫＣｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３を含むものについては、発光量が他のものより多いことが判る。
【００２６】
図３（Ａ）、（Ｂ）は５成分の３を欠如させたもの（即ち、２成分）で、いずれもバクテリアの増殖はみられない。また、発光量も（１）の全てを含むものに対して、いずれもかなり低くなっている。
【００２７】
図４（Ａ）、（Ｂ）は５成分の４を欠如させたもの（即ち、１成分）で、いずれもバクテリアの増殖はみられない。また、発光量も（１）の全てを含むものに対して、いずれもかなり低くなっている。
【００２８】
図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は市販のＮＢ培地（Nutrient broth）を用いて、菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の時間的推移を詳細に測定したものである。菌体量の増加に伴って、クオラムセンシングにより一時（例えば１０〜２０時間）は発光量と細胞（菌）の１個当たりの発光量の増加が認められるが、その後は発光量が減少し、その発光量の増加に対して細胞（菌）の１個当たりの発光量が減少していることが判る。
【００２９】
図６（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、ＫＣｌ（０．７７ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（４．８ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．１１ｇ／Ｌ）のみを培地に溶解させたものを用いて、菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の時間的推移を測定したものであるが、栄養素が培地にないので、菌体量の増加はない。発光量は１５時間経過後位から増加し、細胞１個当たりの発光量も増加している。以上の実験から、フォトラブドゥス・ルミネセンスは栄養源がなく、従って菌体量の増加がない場合であっても、少量のＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３ が存在すれば、発光することが分かる。
【００３０】
図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれＮＢ培地の場合と、ＮＢ培地に更にＫＣｌ（０．７７ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（ ４．８ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．１１ｇ／Ｌ）を加えた場合との菌体量、発光量、及び細胞１個当たりの発光量の時間的変化を示すが、ＮＢ培地に更にＫＣｌ（０．７７ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（ ４．８ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．１１ｇ／Ｌ）を加えた場合（即ち、栄養源に３エレメントが添加されている場合）の方が、発光量が増すことが判る。
【００３１】
以上の実験から以下のことが判る。
（１）カリウムイオン源となるＫＣｌ、マグネシウムイオン源となるＭｇＣｌ２、ナトリウムイオン源及び炭酸水素イオン源となるＮａＨＣＯ３が欠乏すると、発光量が低下する。
（２）ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３の３成分で、５成分（ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＳＯ４）の発光量と同程度の発光量がある。
（３）ＮＢ培地に３成分（ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３）を添加することによって菌体量、発光量、細胞１つ当たりの発光量が増加する。
（４）以上のことから、３成分（ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３）が淡水性発光細菌の発光ファクターであるのが判る。なお、この実験では、ＮａＨＣＯ３を使っているので、ナトリウムイオン及び炭酸水素ナトリウムのイオンのいずれか、又は双方が必要であるかについては分からない。
【００３２】
上の実験において、カリウムイオン源、マグネシウムイオン源、ナトリウムイオン源、炭酸水素イオン源として、１）ＫＣｌを０．７７ｇ／Ｌ（１０．３ｍＭ）、２）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを４．８ｇ／Ｌ（２３．６ｍＭ）、３）ＮａＨＣＯ３を０．１１ｇ／Ｌ（１．３ｍＭ）としたが、ＫＣｌについては、０．０５〜５０ｍＭ（より好ましくは、０．１〜１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２については、０．０５〜５０ｍＭ（より好ましくは０．１〜１０ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３については０．０１〜５０ｍＭ（より好ましくは、０．１〜５ｍＭ）とすることもできる。
【００３３】
ここで、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３の量が前記した下限値より小さくなると、これらが有効に淡水性発光細菌に作用せず、発光量が下がる。また、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３が前記した上限値を超えると、細胞膜に対する浸透圧が高まり、淡水性発光細菌が弱り、発光量が下がる。マグネシウムイオンが過剰であると、淡水性発光細菌に対して毒性がある。炭酸水素ナトリウムが過剰であると、培地液がアルカリ性となる。更に、培地液のｐＨは３〜８に調整する必要があるが、３成分のみでこのｐＨ範囲に入る。
【００３４】
次に、以上の実験に使用したＫＣｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３について、更にそのうち、どの成分が有効にフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量に寄与しているかと、それらの成分の適正量を実験を行って調査した。
【００３５】
まず、図８に示すように、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（ ４．８ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．１１ｇ／Ｌ）は一定にして、かつＭｇＳＯ４は使用しないで、ＫＣｌの濃度を変えた場合のＫＣｌの濃度と発光量との関係を調べた。実験によると、Ｋ＋の濃度が微小でもフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光性に寄与し、０．００１〜１．５ｇ／Ｌ（ＫＣｌ換算で０．００１９〜３．６２ｇ／Ｌ）で発光性が認められた。なお、好ましくはＫ＋の濃度が０．０１〜１ｇ／Ｌある場合、より発光量が増加することが確認されている。
【００３６】
そして、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３ のうち、Ｍｇ２＋の濃度を変えて、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量を調査した結果を図９に示す。Ｍｇ２＋が、０．１〜１ｇ／Ｌ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏに換算すると、０．６９〜６．９ｇ／Ｌ）の範囲で十分な発光量がある。なお、Ｍｇ２＋ 濃度が０．８６ｇ／Ｌ以上では、発光量がやや低下するが１ｇ／Ｌ以下であれば使用可能であることが分かった。
【００３７】
次に、Ｍｇ２＋源として、ＭｇＣｌ２ とＭｇＳＯ４を用いた場合の、濃度と発光量との関係を図１０に示す。図１０に示すように、ＭｇＣｌ２が５．７４ｇ／Ｌ（Ｍｇ２＋換算で、２．３ｇ／Ｌ）の場合は、発光量が落ちている。また、ＭｇＳＯ４が同じく５．７４ｇ／Ｌ（Ｍｇ２＋換算で１．１５ｇ／Ｌ）でも発光量が落ちている。なお、同一Ｍｇ２＋量であっても、硫酸イオンの方が発光量は低い。従って、Ｍｇ＋イオンが過剰にあるとフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量は減少するものと思慮される。
【００３８】
図１１には、ＮａＨＣＯ３の量を変えた場合のフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量の変化を示すが、ＨＣＯ３−が低濃度（０．００８〜０．１ｇ／Ｌ、より好ましくは、０．０５〜０．１ｇ／Ｌ）では高い発光を示すが、ＨＣＯ３−が高濃度（０．１２ｇ／Ｌ以上）では発光誘導を示さなかった。溶液のｐＨの影響ではなく、ＨＣＯ３−の濃度に依存して発光している。
【００３９】
図１２（Ａ）には、Ｋ＋イオンに換算して０．４ｇ／Ｌとして、カリウム源をＫＮＯ３、ＫＢｒ、ＫＨＣＯ３にした場合のフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量を測定した結果を示す。この結果から、Ｋ＋イオンと結合する陰イオン成分は、ＮＯ３、Ｂｒ等他の成分でもよいことが分かる。ここで、その他の成分については、ＩＳＳ標準培地（なお、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは除去している）と同じである。
【００４０】
なお、図１２（Ａ）において、ＫＨＣＯ３の場合は発光量が減っているが、これはＫ＋イオンを基準とすると、ＨＣＯ３−イオンが多すぎて、フォトラブドゥス・ルミネセンスに対して発光量を阻外する成分となるからである。ここで、Ｋ＋イオンの量は低くても発光性があるので、ＨＣＯ３−イオンを適正値（例えば、０．１２ｇ／Ｌ未満）とすることによって、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量は増加する。ここで、ネガティブ(Negative)は、これらのイオンを含まないこと（即ち、ＩＳＳ標準培地ではない）を意味し、ポジティブ(Positive)はＩＳＳ標準培地液であることを示す。
【００４１】
図１２（Ｂ）は、他の成分については、ＩＳＳ標準培地と同一にして、Ｍｇ２＋と対となる陰イオンの成分を変えた場合の、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量を示すが、Ｍｇ２＋と対となる陰イオンが変わった場合、ＭｇＢｒ２、Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＭｇＫＣｌ３でも高い発光量を示す。
【００４２】
図１２（Ｃ）は、ＨＣＯ３−イオンについて、対となる陽イオンの成分を変えた場合の、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量を示すが、陽イオンの種類が変わっても、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光性が維持されることが分かる（例えば、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３）。
従って、以上の実験から、フォトラブドゥス・ルミネセンスの細胞密度非依存型の発光誘導においては、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、ＨＣＯ３−が必要であることが分かる。
【００４３】
淡水性発光細菌を用いた毒性試験を行う場合は、試験液として以上で説明した淡水性発光細菌の培地液（カリウムイオン源、マグネシウムイオン源、炭酸水素イオン源を含む）に淡水性発光細菌を含ませて、淡水性発光細菌の発光強度を増加させて、適当濃度に希釈した試験対象物（例えば、重金属類）を入れ、発光度を測定することによって、試験対象物の毒性が検査できる。この場合、塩分を必要としないこと、ｐＨ範囲が広いことから、試験対象物の適用範囲が広がることになる。また、この培地液に適当量の栄養源（例えば、ＮＢ）を入れることもできる。
【００４４】
続いて、本発明の一実施の形態に係るバイオセンサーについて図１３、図１４を参照しながら説明する。
図１３に示すような、透明の容器の一例である試験管２０を用意し、その内側底部に担持膜２１を形成する。この担持膜２１にはこの実施の形態ではフィブロイン膜を使用しているが、アルギン酸、寒天、ゼラチン又は他の有機性又は無機性の担持膜（多孔性及び粘性を有するもの）を使用することができる。
【００４５】
次に、市販のＮＢ液に、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３を入れて、カリウムイオンを０．００１〜１．５ｇ／Ｌ（より好ましくは、０．１〜０．８ｇ／Ｌ）、マグネウシムイオンを０．１〜１ｇ／Ｌ（より好ましくは、０．０６〜０．５７ｇ／Ｌ）、及び炭酸水素イオンを０．０５〜０．１ｇ／Ｌ（より好ましくは、０．００８〜０．０８ｇ／Ｌ）含むようにした培地液を作り、これにフォトラブドゥス・ルミネセンス（淡水性発光細菌の一例）を少量入れて、温度３０℃、攪拌速度７０ｒｐｍ、２０時間保持し、フォトラブドゥス・ルミネセンスを一定濃度含むフォトラブドゥス・ルミネセンス試験液（培養液）を作る。
【００４６】
このフォトラブドゥス・ルミネセンス試験液２ｍＬを試験管２０に入れて、温度３０℃で、そのまま３時間放置し、フォトラブドゥス・ルミネセンス試験液を担持膜２１に含ませる。この後、イオン交換水２ｍＬで３回洗浄し、水分をキムワイプ（紙製のウエス）で拭き無水処理を行う。これによってバイオセンサー２２が完成する。なお、保存する場合は、−３０℃以下の冷凍庫に保存する。
【００４７】
このバイオセンサー２２を使用する場合は、バイオセンサー２２を常温（約３０℃）に戻した後、対象となる被検査液を入れて、一定時間保持することによって行う。このバイオセンサー２２の作用を確認するために、図１４（Ａ）に示すように、ＨｇＣｌ２（重金属の一例であるＨｇイオンを含む）を１００ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ含む液（２ｍＬ）を試験した。そして、５分後と１５分後の発光度をルミノメータで確認したが、水銀イオンの検知ができることが分かる。
【００４８】
次に、図１４（Ｂ）に示すように、ＮｉＣｌ２（重金属の一例であるＮｉイオンを含む）を１００００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１０ｐｐｍ含む液（２ｍＬ）を試験した。そして、５分後と１５分後の発光度をルミノメータで確認したが、Ｎｉイオンの検知ができることが分かる
【００４９】
図１５（Ａ）は、同一のバイオセンサー２２を用いて、ＢＯＤの毒性評価を行った結果を示す。まずは、Ｄ（＋）−グルコース：１５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸：１５０ｍｇ／Ｌ含み、ＢＯＤが２２０±１０ｍｇ／Ｌ含まれているＧＧＡ標準液を用いて、濃度と時間（５分と１５分）を変えた場合の発光量を確認した。なお、図１５（Ｂ）に示すように、ＧＧＡの濃度を１１０ｐｐｍ〜２２００ｐｐｍとすると、ＧＧＡの濃度に比例してフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量が変わる。従って、このバイオセンサー２２で、１００〜２０００ｐｐｍのＢＯＤの検出がより正確に測定できることかわかる。
【００５０】
次に、ニトロフミン酸：４．２４６ｍｇ／Ｌ、タンニン酸：４．１７５ｍｇ／Ｌ、リグニルスルホン酸ナトリウム：２．４２７ｍｇ／Ｌ、アラビアゴム：４．６９５ｍｇ／Ｌ、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸：０．９４２ｍｇ／Ｌ含み、ＢＯＤが３．７７ｍｇ／ＬのＡＷＷ標準液を用いて、バイオセンサー２２の作用効果を実験した例を図１６に示す。これよっても、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量が濃度によって異なり、ＢＯＤの検査にバイオセンサー２２が適用できることが分かる。
【００５１】
本発明は前記した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲でその構成を変更することもできる。例えば、淡水性発光細菌として、フォトラブドゥス・ルミネセンス以外の淡水性発光細菌を使用することもできる。
前記実施の形態においては、透明の容器として試験管を用いたが、透光性を有する他の容器（例えば、アンプル等）によって代用できる。
【符号の説明】
【００５２】
２０：試験管、２１：担持膜、２２：バイオセンサー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、淡水性発光細菌（例えば、フォトラブドゥス・ルミネセンス、Photorhabdus luminescens）の発光増大に対して、ＮＨ４＋、ＰＯ３−が負の影響を、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｈ＋、ＣＯ３２−が正の影響を与えることを見いだし、一般的培地（例えば、Nutrient Broth）を用いて、又はこれらの培地無しで、淡水性発光細菌を発光させる淡水性発光細菌の培地液及びこれらを用いた毒性検査方法並びに毒性検査具（バイオセンサー）に関する。
【背景技術】
【０００２】
発光細菌は生物発光を行う細菌のことをいい、迅速簡便な毒性評価等のバイオアッセイ(生物検定や生物学的試験)やバイオセンサーに利用され、比較的容易に発光量を高めることが可能なことから、一般には海洋性のビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)等が広く使用されている。なお、発光細菌は以上の毒性評価の他、ＦＭＮ又はＦＡＤ（Ｐ）Ｈを軸とする酵素系の定量、ＡＴＰの測定にも応用されている。
【０００３】
このビブリオ・フィシェリの培養方法としては、ニュトリエントブロス(Nutrient Broth３％ＮａＣｌを含む）、マリンブロス（Marine Broth)等の栄養の富んだ液体培地が使用されている。これは、生物発光に、培地の栄養が富んだ状態で菌数が高密度に増殖した場合により強い発光が現れるクオラムセンシング(quorum sensing)が関与しているからである。
特許文献１には、このような目的に使用される発光細菌(ビブリオ・フィシェリ、フォトバクテリウム・レイオグナチ、フォトバクテリウム・フォスフォレウム、フォトラブドゥス・ルミネセンス)が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３１０２９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１は、効果のクロマトグラフィーによる検出の実用についての従来技術の限界を克服する生物活性物質を検出するための方法及びキットを提供することを目的としており、更に、使用する培地として、ジペプチド、オリゴペプチド、ホウ酸ジエステル等ＦＦのホウ素化合物、キノロン又はＮ−アシルホモセリンラクトンあるいはそれらの生化学的前駆物質が使用されており、本願発明とは課題が異なると共に、使用する物質についても異なる。更に、特許文献１では、確かにフォトラブドゥス・ルミネセンスの記載はあるが、実施の好適な態様においては、海洋性の発光細菌であるビブリオ・フィシェリが使用されており、淡水性の発光細菌や、この一例であるフォトラブドゥス・ルミネセンスについての具体的な記載はない。
【０００６】
更に、ビブリオ・フィシェリは、生育ｐＨ範囲が狭いこと、海洋性であるので２〜３質量％の塩分（ＮａＣｌ）を必要とし、測定する物質の状態（即ち、工場排水等の淡水性の場合）によって、正確な毒性評価が困難であるとういう問題がある。一方、フォトラブドゥス・ルミネセンス等の淡水性発光細菌は、生育に塩分は必要とせず、取り扱いが容易であるものの、発光量がやや低いことに起因して一般にはバイオセンサーの開発は行われていない。また、フォトラブドゥス・ルミネセンス等で代表される淡水性発光バクテリアの実験を種々行った結果、菌濃度の増加は必ずしも発光性の増大に繋がるものではなく、十分な菌濃度が得られても発光強度が低い場合があることや、逆に菌濃度は低くても培養液の状態によっては、発光強度が高い場合があることを知見して、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、かかる事情に鑑みてなされたもので、塩分を必要とせず、生育ｐＨ範囲が広い淡水性発光細菌に注目し、その発光強度を制御する培地液及びこれらを用いた毒性検査方法並びにバイオセンサーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の発明に係る淡水性発光細菌の培地液は、淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、水溶液中に、カリウムイオンを０．００１〜１．５ｇ／Ｌ、マグネウシムイオンを０．１〜１ｇ／Ｌ、及び炭酸水素イオンを０．０５〜０．１ｇ／Ｌ含む。
【０００９】
第１の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、１）前記カリウムイオン源は塩化カリウム、臭化カリウム、及び硝酸カリウムのいずれか１又は２以上、２）前記マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、酢酸マグネシウム、及び三塩化カリウムマグネシウムのいずれか１又は２以上、３）前記炭酸水素イオン源は炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、及び炭酸水素カリウムのいずれか１又は２以上を使用するのが一般的であるが、淡水性発光細菌に害を有されない化合物であれば、他の化合物であってもよい。なお、カリウムイオン源として、ＫＨＣＯ３を使用すると、カリウムイオンが適正値であっても、炭酸水素イオンが規定値をオーバーする場合は、発光量が低下する。また、淡水性発光細菌に対して毒性を有する他の化合物を混合しないことは当然である。
【００１０】
また、本発明の第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液は、淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、１０００ｍＬの水溶液中に、カリウムイオンを０．０５〜５０ｍＭ、マグネウシムイオンを０．０５〜５０ｍＭ、ナトリウムイオン及び炭酸水素イオンをそれぞれ０．０１〜５０ｍＭ含み、ｐＨが３〜８の範囲にある。なお、１０００ｍＬの水溶液中に、カリウムイオンを０．０５〜５０ｍＭは、０．００２ｇ〜２ｇ／Ｌを、マグネウシムイオンを０．０５〜５０ｍＭは０．００１２〜１．２ｇ／Ｌを、ナトリウムイオン及び炭酸水素イオンをそれぞれ０．０１〜５０ｍＭは、０．００２３〜１．２ｇ／Ｌ（Ｎａ＋）、０．０００６２〜３．１ｇ／Ｌ（ＨＣＯ３−）をいう。
【００１１】
第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、前記カリウムイオン源は塩化カリウム、前記マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、前記炭酸水素イオン源は、炭酸水素ナトリウムを用いるのが好ましいが、淡水性発光細菌に害を有されない化合物であれば、他の化合物であってもよい。
【００１２】
第１、第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、前記水溶液には前記淡水性発光細菌の栄養源（例えば、Nutrient broth）が添加されているのが好ましい。これによって、淡水性発光細菌は菌数を保持又は増加させることができる。
【００１３】
第１、第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、前記淡水性発光細菌はフォトラブドゥス・ルミネセンスであるのが好ましいが、他の淡水性発光細菌であってもよい。
【００１４】
そして、第３の発明に係る淡水性発光細菌を用いた毒性検査方法は、第１、第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液に淡水性発光細菌を含ませて、該淡水性発光細菌の発光強度を増加させて、試験対象物の試験液として使用する。この毒性検査方法は、比較的安価で容易に入手できる化合物を用いて、培地液を構成でき、しかも、この培地液を用いて淡水性発光細菌の発光強度を高めることができる。更に、淡水性発光細菌は、海洋性発光細菌とは異なり、塩分（ＮａＣｌ）を必要とせず、ｐＨ範囲も広いので、より多くの試験対象物に対応でき、毒性試験の対象物を広げることができる。
【００１５】
第４の発明に係るバイオセンサーは、第１の発明に係る淡水性発光細菌の培地液に、淡水性発光細菌及び栄養源を加えて、前記淡水性発光細菌を培養した培養液を、透明容器の内側に設けられた担持膜に含ませ無水処理を行っている。
また、第５の発明に係るバイオセンサーは、淡水性発光細菌が担持された担持膜を透明容器の内側底部に設けて構成されている。
【００１６】
第４、第５の発明に係るバイオセンサーにおいて、前記担持膜はフィブロイン、アルギン酸、寒天、ゼラチン、又はその他の多孔性で粘性を有する物質からなるのが好ましい。
なお、バイオセンサーの用途としては、例えば淡水での重金属量（例えば、水銀、ニッケル等）又は淡水でのＢＯＤの測定に利用できる。
【発明の効果】
【００１７】
第１、第２の発明に係る淡水性発光細菌の培地液及びこれを用いた第３の発明に係る毒性検査方法並び第４、第５の発明に係るバイオセンサーは、比較的安価で容易に入手できる化合物を用いて、培地液を構成でき、しかも、この培地液を用いて淡水性発光細菌の発光強度を高めることができる。
更に、淡水性発光細菌は、海洋性発光細菌とは異なり、塩分（ＮａＣｌ）を必要とせず、ｐＨ範囲も広いので、第３の発明に係る毒性検査方法及び第４、第５の発明に係るバイオセンサーは、工場排水や下水処理場等、より多くの試験対象物に対応でき、毒性試験の対象物を広げることができる。
【００１８】
特に、第１の発明に係る淡水性発光細菌の培地液において、１）カリウムイオン源は塩化カリウム、臭化カリウム、及び硝酸カリウムのいずれか１又は２以上、２）マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、酢酸マグネシウム、及び三塩化カリウムマグネシウムのいずれか１又は２以上、３）炭酸水素イオン源は炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、及び炭酸水素カリウムのいずれか１又は２以上を使用した場合には、比較的安価に淡水性発光細菌の培地液を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ培地液の５つの成分のうち１を欠如させた場合の淡水性発光細菌の菌体量と発光量を示すグラフである。
【図２】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ培地液の５つの成分のうち２を欠如させた場合の淡水性発光細菌の菌体量と発光量を示すグラフである。
【図３】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ培地液の５つの成分のうち３を欠如させた場合の淡水性発光細菌の菌体量と発光量を示すグラフである。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれ培地液の５つの成分の各々の淡水性発光細菌の菌体量と発光量を示すグラフである。
【図５】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれＮＢ培地液を用いた場合の菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の推移を示すグラフである。
【図６】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれ３エレメント（ＫＣｌ：０．７７ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３：０．１１ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：４．８ｇ／Ｌ）の培地液を用いた場合の菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の推移を示すグラフである。
【図７】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれ更にＮＢを加えた培地液を用いた場合の菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の推移を示すグラフである。
【図８】Ｋ＋の濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【図９】Ｍｇ２＋濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【図１０】マグネシウム化合物の濃度と発光量の関係を示すグラフである。
【図１１】ＨＣＯ３−濃度と発光量の関係を示すグラフである。
【図１２】（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれＫ、Ｍｇ、ＨＣＯ３化合物の種類と発光量との関係を示すグラフである。
【図１３】バイオセンサーの説明図である。
【図１４】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれバイオセンサーの毒性評価を示すグラフである。
【図１５】（Ａ）、（Ｂ）はそれぞれバイオセンサーのＢＯＤ検査評価を示すグラフである。
【図１６】バイオセンサーのＢＯＤ検査評価を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
続いて、添付した図面を参照しながら、本発明を具体化した実施の形態について説明する。
本発明者らは、先に出願した特願２０１０−２６８６２３号において海洋性発光バクテリアの発光制御方法で、海水に含まれるＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏについて如何なる成分が発光性に寄与するかを実験して調べた。しかしながら、海洋性発光バクテリアは前述のように、塩分（ＮａＣｌ）を必須の成分とし、生存するｐＨ範囲が狭いので、実施上支障がある場合があり、塩分を必要としない淡水性発光バクテリアに注目し、如何なる成分が淡水性発光バクテリアの発光度に寄与するかを研究した。
【００２１】
実験に当たっては、海水に含まれる成分を参照して選んだ結果、淡水であることから塩分（ＮａＣｌ）を除く、１）ＫＣｌ、２）ＣａＣｌ２、３）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、４）ＮａＨＣＯ３、５）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの５成分が有効であると推定し、更にこの中でどの成分が淡水性発光バクテリア(細菌)の発光に寄与するかを実験した。
【００２２】
この実験液には、１）ＫＣｌを０．７７ｇ／Ｌ（１０．３ｍＭ）、２）ＣａＣｌ２を１．２１ｇ／Ｌ（１０．９ｍＭ）、３）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを４．８ｇ／Ｌ（２３．６ｍＭ）、４）ＮａＨＣＯ３を０．１１ｇ／Ｌ（１．３ｍＭ）、５）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを３．５０ｇ／Ｌ（１４．２ｍＭ）をそれぞれ単位として、これらの１〜５を欠如させて、欠如させた培地（培地液に同じ）における淡水性発光細菌の菌体量（菌の数）と発光量を測定した。なお、培養時間は１８時間とし、以下の実験においては、淡水性発光細菌として、フォトラブドゥス・ルミネセンスを用い、菌体量として、液の濁り（ＯＤ）を測定し、発光量については、５分間の積算値で１ｍＬ中の発光量をルミノメータで測定した。なお、ここで、「ｍＭ」は水１Ｌに対するモル数を示す。
【００２３】
なお、１）ＫＣｌを０．７７ｇ／Ｌは、Ｋ＋イオンに換算して０．４ｇ／Ｌ、２）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏの４．８ｇは、Ｍｇ２＋イオンに換算して０．６ｇ／Ｌ、３）ＮａＨＣＯ３の０．１１ｇ／ＬはＨＣＯ３−に換算して０．０８ｇ／Ｌ、４）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの３．５ｇ／ＬはＭｇ２＋イオンに換算して０．３ｇ／Ｌとなる（以下、この溶液を「ＩＳＳ培地」という）。
【００２４】
図１（Ａ）、（Ｂ）は５成分の１を欠如させたもので、いずれもバクテリアの増殖はみられないが、（３）のＮａＨＣＯ３欠如、（４）のＭｇＣｌ２欠如、（６）のＫＣｌ欠如のものでは、発光量が他のものより減少していることが判る。
【００２５】
図２（Ａ）、（Ｂ）は５成分の２を欠如させたもの（即ち、３成分）で、いずれもバクテリアの増殖はみられないが、（４）のＫＣｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３を含むものについては、発光量が他のものより多いことが判る。
【００２６】
図３（Ａ）、（Ｂ）は５成分の３を欠如させたもの（即ち、２成分）で、いずれもバクテリアの増殖はみられない。また、発光量も（１）の全てを含むものに対して、いずれもかなり低くなっている。
【００２７】
図４（Ａ）、（Ｂ）は５成分の４を欠如させたもの（即ち、１成分）で、いずれもバクテリアの増殖はみられない。また、発光量も（１）の全てを含むものに対して、いずれもかなり低くなっている。
【００２８】
図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は市販のＮＢ培地（Nutrient broth）を用いて、菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の時間的推移を詳細に測定したものである。菌体量の増加に伴って、クオラムセンシングにより一時（例えば１０〜２０時間）は発光量と細胞（菌）の１個当たりの発光量の増加が認められるが、その後は発光量が減少し、その発光量の増加に対して細胞（菌）の１個当たりの発光量が減少していることが判る。
【００２９】
図６（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、ＫＣｌ（０．７７ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（４．８ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．１１ｇ／Ｌ）のみを培地に溶解させたものを用いて、菌体量、発光量、細胞１個当たりの発光量の時間的推移を測定したものであるが、栄養素が培地にないので、菌体量の増加はない。発光量は１５時間経過後位から増加し、細胞１個当たりの発光量も増加している。以上の実験から、フォトラブドゥス・ルミネセンスは栄養源がなく、従って菌体量の増加がない場合であっても、少量のＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３ が存在すれば、発光することが分かる。
【００３０】
図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はそれぞれＮＢ培地の場合と、ＮＢ培地に更にＫＣｌ（０．７７ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（ ４．８ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．１１ｇ／Ｌ）を加えた場合との菌体量、発光量、及び細胞１個当たりの発光量の時間的変化を示すが、ＮＢ培地に更にＫＣｌ（０．７７ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（ ４．８ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．１１ｇ／Ｌ）を加えた場合（即ち、栄養源に３エレメントが添加されている場合）の方が、発光量が増すことが判る。
【００３１】
以上の実験から以下のことが判る。
（１）カリウムイオン源となるＫＣｌ、マグネシウムイオン源となるＭｇＣｌ２、ナトリウムイオン源及び炭酸水素イオン源となるＮａＨＣＯ３が欠乏すると、発光量が低下する。
（２）ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３の３成分で、５成分（ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＳＯ４）の発光量と同程度の発光量がある。
（３）ＮＢ培地に３成分（ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３）を添加することによって菌体量、発光量、細胞１つ当たりの発光量が増加する。
（４）以上のことから、３成分（ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３）が淡水性発光細菌の発光ファクターであるのが判る。なお、この実験では、ＮａＨＣＯ３を使っているので、ナトリウムイオン及び炭酸水素ナトリウムのイオンのいずれか、又は双方が必要であるかについては分からない。
【００３２】
上の実験において、カリウムイオン源、マグネシウムイオン源、ナトリウムイオン源、炭酸水素イオン源として、１）ＫＣｌを０．７７ｇ／Ｌ（１０．３ｍＭ）、２）ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを４．８ｇ／Ｌ（２３．６ｍＭ）、３）ＮａＨＣＯ３を０．１１ｇ／Ｌ（１．３ｍＭ）としたが、ＫＣｌについては、０．０５〜５０ｍＭ（より好ましくは、０．１〜１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２については、０．０５〜５０ｍＭ（より好ましくは０．１〜１０ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３については０．０１〜５０ｍＭ（より好ましくは、０．１〜５ｍＭ）とすることもできる。
【００３３】
ここで、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３の量が前記した下限値より小さくなると、これらが有効に淡水性発光細菌に作用せず、発光量が下がる。また、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨＣＯ３が前記した上限値を超えると、細胞膜に対する浸透圧が高まり、淡水性発光細菌が弱り、発光量が下がる。マグネシウムイオンが過剰であると、淡水性発光細菌に対して毒性がある。炭酸水素ナトリウムが過剰であると、培地液がアルカリ性となる。更に、培地液のｐＨは３〜８に調整する必要があるが、３成分のみでこのｐＨ範囲に入る。
【００３４】
次に、以上の実験に使用したＫＣｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３について、更にそのうち、どの成分が有効にフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量に寄与しているかと、それらの成分の適正量を実験を行って調査した。
【００３５】
まず、図８に示すように、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（ ４．８ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．１１ｇ／Ｌ）は一定にして、かつＭｇＳＯ４は使用しないで、ＫＣｌの濃度を変えた場合のＫＣｌの濃度と発光量との関係を調べた。実験によると、Ｋ＋の濃度が微小でもフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光性に寄与し、０．００１〜１．５ｇ／Ｌ（ＫＣｌ換算で０．００１９〜３．６２ｇ／Ｌ）で発光性が認められた。なお、好ましくはＫ＋の濃度が０．０１〜１ｇ／Ｌある場合、より発光量が増加することが確認されている。
【００３６】
そして、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３ のうち、Ｍｇ２＋の濃度を変えて、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量を調査した結果を図９に示す。Ｍｇ２＋が、０．１〜１ｇ／Ｌ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏに換算すると、０．６９〜６．９ｇ／Ｌ）の範囲で十分な発光量がある。なお、Ｍｇ２＋ 濃度が０．８６ｇ／Ｌ以上では、発光量がやや低下するが１ｇ／Ｌ以下であれば使用可能であることが分かった。
【００３７】
次に、Ｍｇ２＋源として、ＭｇＣｌ２ とＭｇＳＯ４を用いた場合の、濃度と発光量との関係を図１０に示す。図１０に示すように、ＭｇＣｌ２が５．７４ｇ／Ｌ（Ｍｇ２＋換算で、２．３ｇ／Ｌ）の場合は、発光量が落ちている。また、ＭｇＳＯ４が同じく５．７４ｇ／Ｌ（Ｍｇ２＋換算で１．１５ｇ／Ｌ）でも発光量が落ちている。なお、同一Ｍｇ２＋量であっても、硫酸イオンの方が発光量は低い。従って、Ｍｇ＋イオンが過剰にあるとフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量は減少するものと思慮される。
【００３８】
図１１には、ＮａＨＣＯ３の量を変えた場合のフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量の変化を示すが、ＨＣＯ３−が低濃度（０．００８〜０．１ｇ／Ｌ、より好ましくは、０．０５〜０．１ｇ／Ｌ）では高い発光を示すが、ＨＣＯ３−が高濃度（０．１２ｇ／Ｌ以上）では発光誘導を示さなかった。溶液のｐＨの影響ではなく、ＨＣＯ３−の濃度に依存して発光している。
【００３９】
図１２（Ａ）には、Ｋ＋イオンに換算して０．４ｇ／Ｌとして、カリウム源をＫＮＯ３、ＫＢｒ、ＫＨＣＯ３にした場合のフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量を測定した結果を示す。この結果から、Ｋ＋イオンと結合する陰イオン成分は、ＮＯ３、Ｂｒ等他の成分でもよいことが分かる。ここで、その他の成分については、ＩＳＳ標準培地（なお、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは除去している）と同じである。
【００４０】
なお、図１２（Ａ）において、ＫＨＣＯ３の場合は発光量が減っているが、これはＫ＋イオンを基準とすると、ＨＣＯ３−イオンが多すぎて、フォトラブドゥス・ルミネセンスに対して発光量を阻外する成分となるからである。ここで、Ｋ＋イオンの量は低くても発光性があるので、ＨＣＯ３−イオンを適正値（例えば、０．１２ｇ／Ｌ未満）とすることによって、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量は増加する。ここで、ネガティブ(Negative)は、これらのイオンを含まないこと（即ち、ＩＳＳ標準培地ではない）を意味し、ポジティブ(Positive)はＩＳＳ標準培地液であることを示す。
【００４１】
図１２（Ｂ）は、他の成分については、ＩＳＳ標準培地と同一にして、Ｍｇ２＋と対となる陰イオンの成分を変えた場合の、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量を示すが、Ｍｇ２＋と対となる陰イオンが変わった場合、ＭｇＢｒ２、Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＭｇＫＣｌ３でも高い発光量を示す。
【００４２】
図１２（Ｃ）は、ＨＣＯ３−イオンについて、対となる陽イオンの成分を変えた場合の、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量を示すが、陽イオンの種類が変わっても、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光性が維持されることが分かる（例えば、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３）。
従って、以上の実験から、フォトラブドゥス・ルミネセンスの細胞密度非依存型の発光誘導においては、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、ＨＣＯ３−が必要であることが分かる。
【００４３】
淡水性発光細菌を用いた毒性試験を行う場合は、試験液として以上で説明した淡水性発光細菌の培地液（カリウムイオン源、マグネシウムイオン源、炭酸水素イオン源を含む）に淡水性発光細菌を含ませて、淡水性発光細菌の発光強度を増加させて、適当濃度に希釈した試験対象物（例えば、重金属類）を入れ、発光度を測定することによって、試験対象物の毒性が検査できる。この場合、塩分を必要としないこと、ｐＨ範囲が広いことから、試験対象物の適用範囲が広がることになる。また、この培地液に適当量の栄養源（例えば、ＮＢ）を入れることもできる。
【００４４】
続いて、本発明の一実施の形態に係るバイオセンサーについて図１３、図１４を参照しながら説明する。
図１３に示すような、透明の容器の一例である試験管２０を用意し、その内側底部に担持膜２１を形成する。この担持膜２１にはこの実施の形態ではフィブロイン膜を使用しているが、アルギン酸、寒天、ゼラチン又は他の有機性又は無機性の担持膜（多孔性及び粘性を有するもの）を使用することができる。
【００４５】
次に、市販のＮＢ液に、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３を入れて、カリウムイオンを０．００１〜１．５ｇ／Ｌ（より好ましくは、０．１〜０．８ｇ／Ｌ）、マグネウシムイオンを０．１〜１ｇ／Ｌ（より好ましくは、０．０６〜０．５７ｇ／Ｌ）、及び炭酸水素イオンを０．０５〜０．１ｇ／Ｌ（より好ましくは、０．００８〜０．０８ｇ／Ｌ）含むようにした培地液を作り、これにフォトラブドゥス・ルミネセンス（淡水性発光細菌の一例）を少量入れて、温度３０℃、攪拌速度７０ｒｐｍ、２０時間保持し、フォトラブドゥス・ルミネセンスを一定濃度含むフォトラブドゥス・ルミネセンス試験液（培養液）を作る。
【００４６】
このフォトラブドゥス・ルミネセンス試験液２ｍＬを試験管２０に入れて、温度３０℃で、そのまま３時間放置し、フォトラブドゥス・ルミネセンス試験液を担持膜２１に含ませる。この後、イオン交換水２ｍＬで３回洗浄し、水分をキムワイプ（紙製のウエス）で拭き無水処理を行う。これによってバイオセンサー２２が完成する。なお、保存する場合は、−３０℃以下の冷凍庫に保存する。
【００４７】
このバイオセンサー２２を使用する場合は、バイオセンサー２２を常温（約３０℃）に戻した後、対象となる被検査液を入れて、一定時間保持することによって行う。このバイオセンサー２２の作用を確認するために、図１４（Ａ）に示すように、ＨｇＣｌ２（重金属の一例であるＨｇイオンを含む）を１００ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ含む液（２ｍＬ）を試験した。そして、５分後と１５分後の発光度をルミノメータで確認したが、水銀イオンの検知ができることが分かる。
【００４８】
次に、図１４（Ｂ）に示すように、ＮｉＣｌ２（重金属の一例であるＮｉイオンを含む）を１００００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１０ｐｐｍ含む液（２ｍＬ）を試験した。そして、５分後と１５分後の発光度をルミノメータで確認したが、Ｎｉイオンの検知ができることが分かる
【００４９】
図１５（Ａ）は、同一のバイオセンサー２２を用いて、ＢＯＤの毒性評価を行った結果を示す。まずは、Ｄ（＋）−グルコース：１５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸：１５０ｍｇ／Ｌ含み、ＢＯＤが２２０±１０ｍｇ／Ｌ含まれているＧＧＡ標準液を用いて、濃度と時間（５分と１５分）を変えた場合の発光量を確認した。なお、図１５（Ｂ）に示すように、ＧＧＡの濃度を１１０ｐｐｍ〜２２００ｐｐｍとすると、ＧＧＡの濃度に比例してフォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量が変わる。従って、このバイオセンサー２２で、１００〜２０００ｐｐｍのＢＯＤの検出がより正確に測定できることかわかる。
【００５０】
次に、ニトロフミン酸：４．２４６ｍｇ／Ｌ、タンニン酸：４．１７５ｍｇ／Ｌ、リグニルスルホン酸ナトリウム：２．４２７ｍｇ／Ｌ、アラビアゴム：４．６９５ｍｇ／Ｌ、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸：０．９４２ｍｇ／Ｌ含み、ＢＯＤが３．７７ｍｇ／ＬのＡＷＷ標準液を用いて、バイオセンサー２２の作用効果を実験した例を図１６に示す。これよっても、フォトラブドゥス・ルミネセンスの発光量が濃度によって異なり、ＢＯＤの検査にバイオセンサー２２が適用できることが分かる。
【００５１】
本発明は前記した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲でその構成を変更することもできる。例えば、淡水性発光細菌として、フォトラブドゥス・ルミネセンス以外の淡水性発光細菌を使用することもできる。
前記実施の形態においては、透明の容器として試験管を用いたが、透光性を有する他の容器（例えば、アンプル等）によって代用できる。
【符号の説明】
【００５２】
２０：試験管、２１：担持膜、２２：バイオセンサー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、水溶液中に、カリウムイオンを０．００１〜１．５ｇ／Ｌ、マグネウシムイオンを０．１〜１ｇ／Ｌ、及び炭酸水素イオンを０．０５〜０．１ｇ／Ｌ含むことを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項２】
請求項１記載の培地液において、１）前記カリウムイオン源は塩化カリウム、臭化カリウム、及び硝酸カリウムのいずれか１又は２以上、２）前記マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、酢酸マグネシウム、及び三塩化カリウムマグネシウムのいずれか１又は２以上、３）前記炭酸水素イオン源は炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、及び炭酸水素カリウムのいずれか１又は２以上を使用することを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項３】
淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、１０００ｍＬの水溶液中に、カリウムイオンを０．０５〜５０ｍＭ、マグネウシムイオンを０．０５〜５０ｍＭ、ナトリウムイオン及び炭酸水素イオンをそれぞれ０．０１〜５０ｍＭ含み、ｐＨが３〜８の範囲にあることを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項４】
請求項３記載の培地液において、前記カリウムイオン源は塩化カリウム、前記マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、前記ナトリウムイオン源と前記炭酸水素イオン源は、炭酸水素ナトリウムを用いることを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１記載の培地液において、前記水溶液には前記淡水性発光細菌の栄養源が添加されていることを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１記載の培地液において、前記淡水性発光細菌はフォトラブドゥス・ルミネセンスであることを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１記載の淡水性発光細菌の培地液に淡水性発光細菌を含ませて、該淡水性発光細菌の発光強度を増加させて、試験対象物の試験液として使用することを特徴とする淡水性発光細菌を用いた毒性検査方法。
【請求項８】
請求項１又は２記載の淡水性発光細菌の培地液に、淡水性発光細菌及び栄養源を加えて、前記淡水性発光細菌を培養した培養液を、透明容器の内側に設けられた担持膜に含ませ無水処理を行ったことを特徴とするバイオセンサー。
【請求項９】
淡水性発光細菌が担持された担持膜を透明容器の内側底部に設けたことを特徴とするバイオセンサー。
【請求項１０】
請求項８又は９記載のバイオセンサーにおいて、前記担持膜はフィブロイン、アルギン酸、寒天、ゼラチン、又はその他の多孔性で粘性を有する物質からなることを特徴とするバイオセンサー。
【請求項１】
淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、水溶液中に、カリウムイオンを０．００１〜１．５ｇ／Ｌ、マグネウシムイオンを０．１〜１ｇ／Ｌ、及び炭酸水素イオンを０．０５〜０．１ｇ／Ｌ含むことを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項２】
請求項１記載の培地液において、１）前記カリウムイオン源は塩化カリウム、臭化カリウム、及び硝酸カリウムのいずれか１又は２以上、２）前記マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、酢酸マグネシウム、及び三塩化カリウムマグネシウムのいずれか１又は２以上、３）前記炭酸水素イオン源は炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、及び炭酸水素カリウムのいずれか１又は２以上を使用することを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項３】
淡水性発光細菌の発光強度を増加させる培地液であって、１０００ｍＬの水溶液中に、カリウムイオンを０．０５〜５０ｍＭ、マグネウシムイオンを０．０５〜５０ｍＭ、ナトリウムイオン及び炭酸水素イオンをそれぞれ０．０１〜５０ｍＭ含み、ｐＨが３〜８の範囲にあることを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項４】
請求項３記載の培地液において、前記カリウムイオン源は塩化カリウム、前記マグネシウムイオン源は塩化マグネシウム、前記ナトリウムイオン源と前記炭酸水素イオン源は、炭酸水素ナトリウムを用いることを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１記載の培地液において、前記水溶液には前記淡水性発光細菌の栄養源が添加されていることを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１記載の培地液において、前記淡水性発光細菌はフォトラブドゥス・ルミネセンスであることを特徴とする淡水性発光細菌の培地液。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１記載の淡水性発光細菌の培地液に淡水性発光細菌を含ませて、該淡水性発光細菌の発光強度を増加させて、試験対象物の試験液として使用することを特徴とする淡水性発光細菌を用いた毒性検査方法。
【請求項８】
請求項１又は２記載の淡水性発光細菌の培地液に、淡水性発光細菌及び栄養源を加えて、前記淡水性発光細菌を培養した培養液を、透明容器の内側に設けられた担持膜に含ませ無水処理を行ったことを特徴とするバイオセンサー。
【請求項９】
淡水性発光細菌が担持された担持膜を透明容器の内側底部に設けたことを特徴とするバイオセンサー。
【請求項１０】
請求項８又は９記載のバイオセンサーにおいて、前記担持膜はフィブロイン、アルギン酸、寒天、ゼラチン、又はその他の多孔性で粘性を有する物質からなることを特徴とするバイオセンサー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１３−９６６６（Ｐ２０１３−９６６６Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１１８８６４（Ｐ２０１２−１１８８６４）
【出願日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年１２月４日 社団法人日本生物工学会主催の「第１７回 日本生物工学会九州支部 沖縄大会 ２０１０」において文書をもって発表
【出願人】（８０２００００３１）公益財団法人北九州産業学術推進機構 (187)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年１２月４日 社団法人日本生物工学会主催の「第１７回 日本生物工学会九州支部 沖縄大会 ２０１０」において文書をもって発表
【出願人】（８０２００００３１）公益財団法人北九州産業学術推進機構 (187)
【Ｆターム（参考）】
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