温度感応性及び生体適合性を有する両親媒性環状ホスファゼン三量体及びその製造方法
【課題】温度感応性及び生体適合性を有する両親媒性環状ホスファゼン三量体及びその製造方法を提供する。
【解決手段】下記式で表す環状ホスファゼン三量体。
式中、ｘは３、４、７、１２、１６から選択される数、Ｒはメチル、エチル又はベンジル基、Ｒ1はＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ3からなる群より選択され、Ｒ2はＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3からなる群より選択され、Ｒ3及びＲ4はＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、Ｈからなる群より選択されるもので、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4におけるＲはメチル、エチル又はベンジル基であり、ａ＝ｂ＝ｃ＝１、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１である。
【解決手段】下記式で表す環状ホスファゼン三量体。
式中、ｘは３、４、７、１２、１６から選択される数、Ｒはメチル、エチル又はベンジル基、Ｒ1はＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ3からなる群より選択され、Ｒ2はＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3からなる群より選択され、Ｒ3及びＲ4はＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、Ｈからなる群より選択されるもので、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4におけるＲはメチル、エチル又はベンジル基であり、ａ＝ｂ＝ｃ＝１、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度感応性及び生体適合性を有する、新規な両親媒性環状有機ホスファゼン三量体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、サイエンス紙に発表された論文（非特許文献１）には、ミセルを利用して体内の特定部位に薬物を選択して送達することにより、薬物の毒性問題を効果的に緩和させることができると報告されている。特に、最近、既存の界面活性剤を利用した不安定なミセルの欠点を克服し、生体内における安定性、及び高い封入度を有し、多様に変形され得る新しい素材のミセルが、薬物担体（drug delivery system）として開発されている。特に、親水性高分子ブロックと親油性高分子ブロックとを結合させたブロック共重合体を利用したミセルが、多く研究されている。これらは、両親媒性高分子からなる球形の超分子集合体であって、球形の内部（core）には疏水性の医薬物質を担持できる空間を有し、外部は親水性基で覆われた構造を有しており、ミセルを親水性にするため、水溶性の低い疏水性薬物を体内で効率的に送達できるという利点がある。
【０００３】
一般に、ミセルは、親水性ブロックと疏水性ブロックとが交互に共重合された、ジブロック共重合体又はトリブロック共重合体を用いて形成される。代表的な親水性ブロック高分子としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も多く利用されており、疏水性ブロック高分子としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリアスパラギン酸（ＰＡＡ）のような多様な疏水性有機酸高分子が活用されている（非特許文献２）。
【０００４】
ところが、これら疏水性有機酸高分子が骨格を形成するブロック重合による高分子は、生分解性はあるが、生分解の際に有機酸が生成して、酸性化をもたらすため、タンパク質のような、酸性に敏感なバイオ医薬品用の薬物担体としては、使用することができない。また、このような従来のブロック高分子は、大部分が単純な分子構造を有しているので、高分子骨格に標的指向剤のような新しい機能性基を導入するか、又は分子を修飾する場合、物性の変化が激しく、物性の設計に多くの制約が伴う。のみならず、これらブロック共重合体から形成される大部分のミセルは、温度感応性がない。
【０００５】
一般に、薬物担体が備えるべき基本条件は、難溶性薬物の可溶化、薬物の放出速度調節の可能化、薬物の生体内安定性の向上、薬物の標的細胞に対する効率的な送達、及び薬物の副作用の最小化などの、多様な機能を有するものであり、薬物担体自体の生分解性も必須条件である。
【０００６】
しかしながら、従来の有機高分子は、大部分が生分解性に欠けており、前述したように、ポリ乳酸などのいくつかの生分解性高分子は、生分解により酸性化され、物性設計の限界などにより、前記の基本条件を同時に満たすことができない。特に、今後のプロテオミクス及びゲノミクスの研究により開発されるタンパク質系及び核酸系などのバイオ医薬品用の薬物担体としては適していない。したがって、新規な薬物担体の開発が、至急に望まれている。
【０００７】
本発明者らは、親水性基としてポリエチレングリコールが、疏水性基としてアミノ酸が置換されている温度感応性ホスファゼン系三量体について発表した（非特許文献３）。しかしながら、アミノ酸を疏水性基として使用したこれら三量体は、温度感応性はあるが、アミノ酸の低い疏水性によりミセルが形成されず、末端のカルボン酸基がホスファゼン骨格に近接して存在しているため、水溶液内における安定性が悪い。
【０００８】
【非特許文献１】Radoslav Savicら, Science 300, 615-618(2003)
【非特許文献２】V. P. Torchilin, J. Control. Release, 73, 137-172(2001)
【非特許文献３】Youn Soo Sohnら、J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8315
【非特許文献４】Kathryn E. Uhrich, Chem. Rev., 1999, 99, 3198
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明の目的は、ホスファゼン骨格に、親水性基として、ポリエチレングリコールが、疏水性基として、アミノ酸より疏水性が強く酵素分解性のあるオリゴペプチドエステル基が導入されていて、水溶液中で温度感応性ミセルを形成し、薬物担体としての使用に適した相転移温度を有する、温度感応性及び生体適合性を有する環状有機ホスファゼン三量体、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、このような目的を達成するために、環状ホスファゼン三量体骨格に、親水性基としては、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から承認された、分子量１００以上のポリエチレングリコールを導入し、疏水性基としては、アミノ酸の代わりに、疏水性の範囲がより広くて強く、細胞内酵素による生分解性を付与できるオリゴペプチドエステルを導入することにより、水溶液中で１０〜１００nmサイズのミセルを形成し、体温近くの温度（３１〜４２℃）でナノ又はマイクロ粒子状の沈殿を形成する、温度感応性の有機／無機ハイブリッド型ホスファゼン三量体を合成できることを見出した。
【００１１】
また、本発明者らは、環状ホスファゼン三量体であるヘキサクロロシクロトリホスファゼン（Ｎ3Ｐ3Ｃｌ6）の塩素原子を、親水性置換基であるポリエチレングリコールと、疏水性（親油性）置換基であるオリゴペプチドエステルで置換して、ホスファゼン三量体に両親媒性を付与し、これら親水性基と親油性基の種類を変えて組み合わせて、水溶液中で体温近くの温度を含む広範囲な温度で温度感応性を示すミセルを形成することにより、タンパク質及びペプチド系の薬物と、タクソールのような難溶性薬物の担体としての使用に理想的な、新規な薬物担体を見出すに至った。
【００１２】
したがって、本発明は、下記化学式１で表され、親水／親油の両親媒性を有することにより水溶液で温度感応性ミセルを形成する環状ホスファゼン系三量体及びその製造方法に関する。
【００１３】
【化６】
【００１４】
（式中、ｘは、オキシエチレン繰返し単位の数として、３、４、７、１２、１６から選択される数であり、Ｒは、メチル、エチル又はベンジル基であり、Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3及びＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ3及びＲ4は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、Ｈからなる群より選択される基であり、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4におけるＲは、メチル、エチル又はベンジル基であり、ａ＝ｂ＝ｃ＝１、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１である。
【００１５】
本発明による化学式１の環状ホスファゼン三量体は、親油性基と親水性基を共に有する両親媒性オリゴマーである。本発明において、温度感応性とは、分子間の相互作用により、親油性基が内部に集まり、外部は親水性基で覆われたミセルを形成することによって、ある温度以下では、外部の親水性基が水分子と水素結合して水に溶解してナノメートルサイズのミセルを形成し、ある温度以上では、水分子との水素結合が切れて溶解度が急激に減少し、ミセルが互いに凝集して固形物質（microsphere/ nanosphere）を形成することをいう。このように相転移が起こる温度を低臨界溶液温度（Lower Critical Solution Temperature：ＬＣＳＴ）という。本発明による両親媒性ホスファゼン三量体分子の自己集合（self-assembly）により形成されるミセルは、１０nmから数百nmサイズの粒子であり、これら粒子の内部は親油性（疏水性）基から構成されているので、水溶性の低い疏水性薬物を覆うのに利用することができ、タンパク質又はタクソールのような難溶性薬物の担体としての使用に適している。
【００１６】
また、本発明の環状ホスファゼン三量体は、一種のオリゴマーであるが、分子量が正確な単量体のような分子構造をなし、化学式１から分かるように、リン原子と窒素原子とが交互に共役結合をして六角平面をなし、３個の親水性基（ＰＥＧ）と３個の疏水性基であるオリゴペプチドエステル基が、前記平面の両側にそれぞれ集まるように設計されているため、分子の親水性と疏水性が極大化される。したがって、従来のブロック共重合体に比べて水溶液中で安定なミセルを形成することができ、これらミセルは、体温の近くでも温度感応性を示すため、皮下注射や生体組織への局部送達用など、多様な薬物担体として適している。例えば、体温以下の低臨界溶液温度を示す本発明の環状ホスファゼン三量体の水溶液に成長ホルモンのようなタンパク質医薬品を均一に溶解し、この溶液の温度を３７℃に昇温させると、タンパク質薬物の大部分がホスファゼン薬物担体のミセル内に捕集されたまま沈殿する。したがって、このような方法で調製された薬物溶液を皮下注射で人体に投与する場合、薬物は体内の血液全体に広がることなく、投与部位で沈殿して、その部位からのみ徐々に放出されるので、薬物の生体利用率の極大化及び副作用の最小化を図ることができる。
【００１７】
なお、本発明のホスファゼン三量体は、動物試験結果、生体適合性に優れることが確認された。これは、これらが体内で分解されるとき、ホスファゼン骨格が、人体に無害な中性リン酸アンモニウムに転換され（非特許文献４）、親水性基であるポリエチレングリコールは、分子量が１００以上の場合に安全であると認められて、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により使用が承認されており、オリゴペプチドは、体内に存在するアミノ酸成分であるためである。
【００１８】
さらに、本発明のホスファゼン三量体に結合されているオリゴペプチドエステルは、加水分解した後で機能基化することができるため、目標指向剤や薬物をこれら機能基に直接結合させることにより、複合体（conjugate）状の薬物担体として活用することができるなど、親水／親油性を大幅に変化させなくても、多様な物性を有するように設計できるという利点を有する。
【００１９】
以下、化学式１で表す本発明の環状ホスファゼン三量体の製造方法を説明する。化学式１の最終産物は空気中で安定であるが、中間体は全て空気中で非常に不安定である。したがって、全ての製造工程は、水分が入らないようにアルゴンラインを利用して行わなければならず、試薬と溶媒は、すべて水分を十分に除去した後に使用する。
【００２０】
まず、下記化学式２：
【００２１】
【化７】
【００２２】
で示されるメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の水分を真空乾燥法で除去し、十分に乾燥したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した後、この溶液を７０℃の油浴で１．０〜１．１当量のナトリウム（Ｎａ）又は水素化ナトリウム（ＮａＨ）と１０〜２４時間反応させて、化学式３：
【００２３】
【化８】
【００２４】
で表すポリエチレングリコールのナトリウム塩を得る。
化学式２及び３において、ｘは、化学式１で定義したものと同じである。
【００２５】
その後、下記化学式４：
【００２６】
【化９】
【００２７】
で表す乾燥したヘキサクロロシクロトリホスファゼンを、テトラヒドロフランに溶解し、この溶液をドライアイス−アセトン浴に入れて−７８℃に冷却する。その後、ヘキサクロロシクロトリホスファゼン１モルに対し、前述のように製造された化学式３のポリエチレングリコールのナトリウム塩３．０〜３．３モルを、３０分〜１時間にわたって徐々に滴下し、さらに３０分〜１時間攪拌する。その後、ドライアイス−アセトン浴を除去し、さらに常温で８〜１２時間反応させる。
【００２８】
次に、分離／精製工程を経ることなく、この反応混合物に、ヘキサクロロシクロトリホスファゼン１モルを基準として、下記化学式５：
【００２９】
【化１０】
【００３０】
で表されるオリゴペプチドエステル３．３〜３．９モルと、過剰量（６〜１２モル）のトリエチルアミンを溶解したクロロホルム溶液を加え、１〜３日間還流反応させて、化学式１の化合物を得る。
【００３１】
化学式４及び５において、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ化学式１で定義されたものと同じである。以上の反応において、反応溶媒としては、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又はこれらの混合物を使用することができる。
【００３２】
前記置換反応が進む間、リン（31Ｐ）核磁気共鳴スペクトルを随時測定して、置換反応の進行程度を判断する。反応が完了すると、反応溶液を濾過して、副産物として、生成する沈殿物（ＮａＣｌ及びＮＥｔ3・ＨＣｌ）を除去し、濾液を減圧濃縮する。濃縮液をテトラヒドロフランに溶解し、過量のエチルエーテル又はヘキサンを加えて沈殿させる工程を２回以上繰返して精製した後、最小量の蒸留水に溶かした溶液を透析膜（通過分子量：１，０００）に入れ、１２〜２４時間透析した後に凍結乾燥すると、粘性の強い褐色の環状ホスファゼン三量体が、６０％以上の収率で得られる。以上の反応工程を要約すると、下記反応式１で表すとおりである。
【００３３】
【化１１】
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、ホスファゼン骨格に、親水性基として、ポリエチレングリコールが、疏水性基として、アミノ酸より疏水性が強く酵素分解性のあるオリゴペプチドエステル基が導入されており、水溶液中で温度感応性ミセルを形成し、薬物担体としての使用に適した相転移温度を有する、生体適合性環状ホスファゼン薬物担体及びその製造方法が提供される。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。しかしながら、本発明の範囲は、特許請求の範囲を外れない限り、これらの実施例に限定されない。
【００３６】
本発明の化合物に対する炭素、水素、窒素元素の分析は、Perkin-Elmer Ｃ、Ｈ、Ｎ分析器により行った。一方、水素核磁気共鳴スペクトルは、Bruker DPX-250 ＮＭＲ分光器を使用して測定し、リン核磁気共鳴スペクトルは、Varian Gemini-400 ＮＭＲ分光器を使用して測定した。
【００３７】
実施例１
分子量３５０のメトキシポリエチレングリコール（３．６２ｇ、１０．３mmol）とナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）を、乾燥したテトラヒドロフラン溶媒に入れ、アルゴン気流下で２４時間還流させて、メトキシポリエチレングリコールのナトリウム塩を製造した。ヘキサクロロシクロトリホスファゼン（１．００ｇ、２．８８mmol）を、乾燥したテトラヒドロフランに溶解し、この溶液をドライアイス−アセトン浴（−７８℃）に入れて冷却した後、先に製造したメトキシポリエチレングリコールのナトリウム塩溶液を３０分かけて滴下した。３０分後にドライアイス−アセトン浴を除去し、常温で８時間反応させた。この溶液に、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）とテトラペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＥｔ、すなわちグリシルフェニルアラニルロイシルグリシンエチルエステル）（５．４４ｇ、１２．９mmol）を溶解したクロロホルム溶液（１００ml）を加え、５０℃に昇温して１２時間反応させた。反応液を濾過し、生成された塩（ＮＥｔ3・ＨＣｌとＮａＣｌ）を１次除去して、減圧濃縮した。この濃縮液をテトラヒドロフランに再び溶解した後、過剰量のエーテルとヘキサンを加えて沈殿させた。この工程を２回繰返し、少量の蒸留水（２０ml）に溶解した後、透析膜（ＭＷＣＯ：１０００）を使用して、外部の水を４回交換して２４時間透析した後、凍結乾燥してホスファゼン三量体（［ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＥｔ）］3）（収率７４％）を得た。このように得られた固体生成物を、再び水に溶解して１０％の溶液にした後、低臨界溶液温度で沈殿させて、遠心分離後に上層の溶液を除去した。この工程を３回繰返した後に凍結乾燥して、最終生成物（収率６４％）を得た。
組成式：Ｃ36Ｈ62Ｎ5Ｏ13Ｐ1
理論値：Ｃ，５３．７９；Ｈ，７．７７；Ｎ，８．７１
元素分析値：Ｃ，５３．２３；Ｈ，７．９１；Ｎ，８．６０
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，３Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１２（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．２−１．３（ｍ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2（ＣＨ3）2
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，３０Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．８３（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．８２（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．１（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４２（ｔ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ），
低臨界溶液温度：３６℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００３８】
実施例２
分子量３５０のメトキシポリエチレングリコール（３．６２ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びテトラペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ2、すなわちグリシルフェニルアラニルロイシルアスパラギン酸ジエチルエステル）（６．５６ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ３５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ2）3（収率６４％）を得た。
組成式：Ｃ120Ｈ204Ｎ15Ｏ45Ｐ3
理論値：Ｃ，５３．９８；Ｈ，７．７０；Ｎ，７．８７
元素分析値：Ｃ，５３．７７；Ｈ，７．８５；Ｎ，７．８６
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１２（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．２−１．３（ｍ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，３０Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．１（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．２（ｄ，２Ｈ，Ａｓｐ−ＣＨ2）
δ ４．４２（ｔ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：３３℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００３９】
実施例３
分子量３５０のメトキシポリエチレングリコール（３．６２ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びテトラペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｕＥｔ2）（６．７３ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ３５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｕ（Ｅｔ）2）3（収率６７％）を得た。
組成式：Ｃ123Ｈ210Ｎ15Ｏ45Ｐ3
理論値：Ｃ，５４．４７；Ｈ，７．８０；Ｎ，７．７５
元素分析値：Ｃ，５４．５１；Ｈ，７．９４；Ｎ，７．８２
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１１−１．２１（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．２−１．３（ｍ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ3）
δ １．８−２．０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＮＨＣＨＣＯＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ−）
δ ２．０−２．２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，３０Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．７（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：３１℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００４０】
実施例４
分子量５５０のメトキシポリエチレングリコール（５．６７ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びテトラペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ2）（６．５６ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ５５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ2）3（収率６１％）を得た。
組成式：Ｃ150Ｈ237Ｎ15Ｏ48Ｐ3
理論値：Ｃ，５７．１３；Ｈ，７．５８；Ｎ，７．９９
元素分析値：Ｃ，５７．２６；Ｈ，７．５７；Ｎ，７．６６
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１２（ｔ，６Ｈ，Ａｓｐ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．４７−１．８０（ｍ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，４８Ｈ，ＭＰＥＧ５５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．８２（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．１２−４．２１（ｍ，４Ｈ，Ａｓｐ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．５３（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ４．８−４．９（ｍ，１Ｈ，Ａｓｐ−ＣＨ）
δ ７．１４ −７．２９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：５３℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００４１】
実施例５
分子量３５０のメトキシポリエチレングリコール（３．６２ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びトリペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ、すなわちグリシルフェニルアラニルロイシンエチルエステル）（４．７０ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ３５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）3（収率６４％）を得た。
組成式：Ｃ108Ｈ195Ｎ12Ｏ36Ｐ3
理論値：Ｃ，５５．６６；Ｈ，８．４３；Ｎ，７．２１
元素分析値：Ｃ，５３．９５；Ｈ，８．０７；Ｎ，６．８４
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８６−０．９０（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．２５（ｔ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．５０−１．６５（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2）
δ ３．０５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．３１（ｓ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．３５（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．３５−３．６（ｂ，３０Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．４８（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ７．１９−７．３１（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：４１℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ １８．９６
【００４２】
実施例６
メトキシテトラエチレングリコール（２．１４ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びトリペプチド（ＧｌｙＰｈｅＧｌｙＥｔ）（３．９８ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＴｅｔＥＧ）3（ＧｌｙＰｈｅＧｌｙＥｔ）（収率７１％）を得た。
組成式：Ｃ66Ｈ105Ｎ12Ｏ24Ｐ3
理論値：Ｃ，５１．３６；Ｈ，６．８６；Ｎ，１０．８９
元素分析値：Ｃ，５０．３３ ；Ｈ，７．１０ ；Ｎ，９．８６
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ １．３３（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，１８Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2，ＴｅｔＥＧ−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．９４（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ４．８２（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：３４℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２１．７１
【００４３】
実施例７
メトキシトリエチレングリコール（１．６９ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．３mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びトリペプチド（ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＥｔ）（３．５３ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＴｒｉＥＧ）3（ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＥｔ）3（収率７１％）を得た。
組成式：Ｃ63Ｈ123Ｎ12Ｏ27Ｐ3
理論値：Ｃ，４８．０８；Ｈ，７．８８；Ｎ，１０．６８
元素分析値：Ｃ，４８．１２；Ｈ，７．９２；Ｎ，１０．５０
水素核磁気共鳴スペクトル（Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８３（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．２２（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2 ＣＨ3）
δ １．５７−１．７２（ｓ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2）
δ ３．２５−３．６（ｂ，１４Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2，ＴＥＧ−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．８５−３．９８（ｄ，４Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．１６（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．４７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
低臨界溶液温度：＞１００℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ3，ｐｐｍ）：δ ２１．３１
【００４４】
実施例８
分子量５５０のメトキシポリエチレングリコール（５．６７ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びペンタペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＰｈｅＧｌｕＥｔ2、すなわちグリシルフェニルアラニルロイシルフェニルアラニルグルタミン酸ジエチルエステル）（８．２８ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ５５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＰｈｅＧｌｕ（Ｅｔ））3（収率６２％）を得た。
組成式：Ｃ120Ｈ297Ｎ18Ｏ63Ｐ3
理論値：Ｃ，５６．６８；Ｈ，７．８５；Ｎ，６．６１
元素分析値：Ｃ，５７，３２ ；Ｈ，８．０２；Ｎ，６．５０
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．７６−０．９０（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2
δ １．１１−１．２１（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．８−２．０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．０−２．２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，４８Ｈ，ＭＰＥＧ５５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．６８（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ４．８２（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：３５℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．１３
【００４５】
実施例９
分子量５５０のメトキシポリエチレングリコール（５．４４ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びペンタペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＧｌｕＥｔ2）（７．４８ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ５５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＧｌｕＥｔ2）3（収率６０％）を得た。
組成式：Ｃ159Ｈ279Ｎ18Ｏ63Ｐ3
理論値：Ｃ，５３．８９；Ｈ，７．９４；Ｎ，７．１１；Ｏ，２８．４４；Ｐ，２．６２
元素分析値：Ｃ，５４．２１ ；Ｈ，８．２２；Ｎ，６．９８
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１１−１．２１（ｔ，６Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．８−２．０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．０−２．２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，４８Ｈ，ＭＰＥＧ５５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．８５−３．９８（ｄ，４Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ）
δ ４．６８（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：４２℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００４６】
実施例１０
分子量７５０のメトキシポリエチレングリコール（７．７４ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びペンタペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＰｈｅＧｌｕＥｔ2）（８．２８ｇ、１２．９４mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ７５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＰｈｅＧｌｕＥｔ2）3（収率５８％）を得た。
組成式：Ｃ204Ｈ345Ｎ18Ｏ75Ｐ3
元素分析値：Ｃ，５５．９２；Ｈ，７．９０；Ｎ，５．５１
理論値：Ｃ，５６．４２；Ｈ，８．０１；Ｎ，５．８１
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８０−１．０（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ3）
δ １．１１−１．２１（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．２−１．３（ｍ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2
δ １．８−２．０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．０−２．２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ７５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，６４Ｈ，ＭＰＥＧ７５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，４Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．６８（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ４．８２（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：４５℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００４７】
実施例１１
分子サイズの測定及び脂溶性医薬物質の担持の確認
本発明により合成した両親媒性ホスファゼン三量体が、水溶液中で親油性基の相互作用により凝集してミセルを形成するか否かを、以下の手順に従ってＤＬＳ（Dynamic Light Scattering）法で決定した。
【００４８】
実施例２の三量体を蒸留水に０．１〜０．５％溶解した水溶液と、この溶液にタクソール（三量体の３重量％）を溶かした溶液との粒度を測定した。図１及び２に示すように、直径５０±２nmサイズのミセルが形成されたことが確認された。
すなわち、０．２％未滿の低い濃度の溶液では、低臨界溶液温度が観測できなかったが、５０nm程度の一定のサイズを有するミセルを形成した。
一方、０．２％以上の濃度の溶液では、ＵＶスペクトルにより確認した結果、低臨界溶液温度が観測できた。ＤＬＳを利用して粒径を観測したが、低い濃度の場合とは異なって、０．２％以上の濃度の溶液で、ホスファゼン三量体は、低臨界溶液温度の近くで２次構造を形成して、直径が２００nm±１０以上の一定のサイズを有する巨大分子構造（molecular structure）を形成することが確認された。これは、低い濃度でミセル構造を形成していたホスファゼン三量体が、低臨界溶液温度の近くではさらに凝集して２次構造を形成することにより、粒径が突然大きくなるためであると判断される。
【００４９】
以上の結果から、本発明によるホスファゼン三量体は、低い濃度（０．１％）ではミセル構造を形成し、高濃度（０．２％以上）ではナノ粒子ないしミクロ粒子（nanoparticle/ microparticle）を形成することを確認した。したがって、このような構造内に薬物体が吸着できることが確認された。
【００５０】
実施例１２
環状ホスファゼン三量体の剤形に関する薬物放出試験
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含有するホスファゼン三量体に対する試験管内（in vitro）放出実験を実施した。その結果を図３に示す。
図３は、実施例３で製造されたホスファゼン三量体の１２．５％水溶液に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が１mg/mlの濃度になるように混合し、３７℃で沈殿させた後、ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）中に放出されるヒト成長ホルモンの量をサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）で測定した、ヒト成長ホルモン累積放出プロファイルを示す。
【００５１】
図３から分かるように、初期の０．２５日間に緩衝液中に放出されたヒト成長ホルモンは、約３０．８％で、それほど高くない初期放出を示し、初期過剰放出の恐れがないことが確認された。その後、１次（1st order）に近い累積放出曲線を示し、７日間の総累積放出量は１００％であった。したがって、実施例３のホスファゼン三量体は、１週剤形に適した生体外（in vitro）放出挙動を示すと判断される。
【００５２】
実施例１３
ホスファゼン三量体を使用した薬物担体の局所刺激性試験の結果
ホスファゼン三量体と薬物（ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ））との混合による薬物安定性の変化、及び局所刺激性を試験した。
まず、実施例３で製造されたホスファゼン三量体の１２．５％水溶液に、薬物を混合（７．５mg/ml）し、薬物とホスファゼン三量体との反応の有無を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で確認した。その結果を図４に示す。
【００５３】
図４から分かるように、ホスファゼン三量体と薬物とが混合される前の薬物のクロマトグラムと、薬物を実施例３で製造されたホスファゼン三量体と混合した後の薬物のクロマトグラムとを比較した結果、本発明によるホスファゼン三量体は、薬物の安定性に影響を及ぼさない。
【００５４】
また、前記の調剤薬物をウサギの肩に皮下注射で１mlずつ投与した後、皮膚局所刺激性の有無を観察した。その結果を下記の表１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１から分かるように、薬物であるヒト成長ホルモンの含有有無に関係なく、皮膚反応（紅斑、出血、硬結、浮腫など）が現れず、剖検所見でも刺激に関連した変化（変色、癒着、斑点など）は認められなかった。したがって、本発明による有機ホスファゼン三量体は、局所刺激性がないことが、すなわち、生体適合性を有することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】実施例２で製造した環状有機ホスファゼン三量体ミセルの粒径分布図である。
【図２】実施例２で製造した環状有機ホスファゼン三量体＋タクソールミセルの粒径分布図である。
【図３】実施例３で製造した環状有機ホスファゼン三量体の薬物放出試験結果を示す図である。
【図４】本発明の環状有機ホスファゼン三量体と薬物との混合による、安定性の変化を観察したクロマトグラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度感応性及び生体適合性を有する、新規な両親媒性環状有機ホスファゼン三量体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、サイエンス紙に発表された論文（非特許文献１）には、ミセルを利用して体内の特定部位に薬物を選択して送達することにより、薬物の毒性問題を効果的に緩和させることができると報告されている。特に、最近、既存の界面活性剤を利用した不安定なミセルの欠点を克服し、生体内における安定性、及び高い封入度を有し、多様に変形され得る新しい素材のミセルが、薬物担体（drug delivery system）として開発されている。特に、親水性高分子ブロックと親油性高分子ブロックとを結合させたブロック共重合体を利用したミセルが、多く研究されている。これらは、両親媒性高分子からなる球形の超分子集合体であって、球形の内部（core）には疏水性の医薬物質を担持できる空間を有し、外部は親水性基で覆われた構造を有しており、ミセルを親水性にするため、水溶性の低い疏水性薬物を体内で効率的に送達できるという利点がある。
【０００３】
一般に、ミセルは、親水性ブロックと疏水性ブロックとが交互に共重合された、ジブロック共重合体又はトリブロック共重合体を用いて形成される。代表的な親水性ブロック高分子としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も多く利用されており、疏水性ブロック高分子としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリアスパラギン酸（ＰＡＡ）のような多様な疏水性有機酸高分子が活用されている（非特許文献２）。
【０００４】
ところが、これら疏水性有機酸高分子が骨格を形成するブロック重合による高分子は、生分解性はあるが、生分解の際に有機酸が生成して、酸性化をもたらすため、タンパク質のような、酸性に敏感なバイオ医薬品用の薬物担体としては、使用することができない。また、このような従来のブロック高分子は、大部分が単純な分子構造を有しているので、高分子骨格に標的指向剤のような新しい機能性基を導入するか、又は分子を修飾する場合、物性の変化が激しく、物性の設計に多くの制約が伴う。のみならず、これらブロック共重合体から形成される大部分のミセルは、温度感応性がない。
【０００５】
一般に、薬物担体が備えるべき基本条件は、難溶性薬物の可溶化、薬物の放出速度調節の可能化、薬物の生体内安定性の向上、薬物の標的細胞に対する効率的な送達、及び薬物の副作用の最小化などの、多様な機能を有するものであり、薬物担体自体の生分解性も必須条件である。
【０００６】
しかしながら、従来の有機高分子は、大部分が生分解性に欠けており、前述したように、ポリ乳酸などのいくつかの生分解性高分子は、生分解により酸性化され、物性設計の限界などにより、前記の基本条件を同時に満たすことができない。特に、今後のプロテオミクス及びゲノミクスの研究により開発されるタンパク質系及び核酸系などのバイオ医薬品用の薬物担体としては適していない。したがって、新規な薬物担体の開発が、至急に望まれている。
【０００７】
本発明者らは、親水性基としてポリエチレングリコールが、疏水性基としてアミノ酸が置換されている温度感応性ホスファゼン系三量体について発表した（非特許文献３）。しかしながら、アミノ酸を疏水性基として使用したこれら三量体は、温度感応性はあるが、アミノ酸の低い疏水性によりミセルが形成されず、末端のカルボン酸基がホスファゼン骨格に近接して存在しているため、水溶液内における安定性が悪い。
【０００８】
【非特許文献１】Radoslav Savicら, Science 300, 615-618(2003)
【非特許文献２】V. P. Torchilin, J. Control. Release, 73, 137-172(2001)
【非特許文献３】Youn Soo Sohnら、J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8315
【非特許文献４】Kathryn E. Uhrich, Chem. Rev., 1999, 99, 3198
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明の目的は、ホスファゼン骨格に、親水性基として、ポリエチレングリコールが、疏水性基として、アミノ酸より疏水性が強く酵素分解性のあるオリゴペプチドエステル基が導入されていて、水溶液中で温度感応性ミセルを形成し、薬物担体としての使用に適した相転移温度を有する、温度感応性及び生体適合性を有する環状有機ホスファゼン三量体、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、このような目的を達成するために、環状ホスファゼン三量体骨格に、親水性基としては、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から承認された、分子量１００以上のポリエチレングリコールを導入し、疏水性基としては、アミノ酸の代わりに、疏水性の範囲がより広くて強く、細胞内酵素による生分解性を付与できるオリゴペプチドエステルを導入することにより、水溶液中で１０〜１００nmサイズのミセルを形成し、体温近くの温度（３１〜４２℃）でナノ又はマイクロ粒子状の沈殿を形成する、温度感応性の有機／無機ハイブリッド型ホスファゼン三量体を合成できることを見出した。
【００１１】
また、本発明者らは、環状ホスファゼン三量体であるヘキサクロロシクロトリホスファゼン（Ｎ3Ｐ3Ｃｌ6）の塩素原子を、親水性置換基であるポリエチレングリコールと、疏水性（親油性）置換基であるオリゴペプチドエステルで置換して、ホスファゼン三量体に両親媒性を付与し、これら親水性基と親油性基の種類を変えて組み合わせて、水溶液中で体温近くの温度を含む広範囲な温度で温度感応性を示すミセルを形成することにより、タンパク質及びペプチド系の薬物と、タクソールのような難溶性薬物の担体としての使用に理想的な、新規な薬物担体を見出すに至った。
【００１２】
したがって、本発明は、下記化学式１で表され、親水／親油の両親媒性を有することにより水溶液で温度感応性ミセルを形成する環状ホスファゼン系三量体及びその製造方法に関する。
【００１３】
【化６】
【００１４】
（式中、ｘは、オキシエチレン繰返し単位の数として、３、４、７、１２、１６から選択される数であり、Ｒは、メチル、エチル又はベンジル基であり、Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3及びＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ3及びＲ4は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、Ｈからなる群より選択される基であり、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4におけるＲは、メチル、エチル又はベンジル基であり、ａ＝ｂ＝ｃ＝１、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１である。
【００１５】
本発明による化学式１の環状ホスファゼン三量体は、親油性基と親水性基を共に有する両親媒性オリゴマーである。本発明において、温度感応性とは、分子間の相互作用により、親油性基が内部に集まり、外部は親水性基で覆われたミセルを形成することによって、ある温度以下では、外部の親水性基が水分子と水素結合して水に溶解してナノメートルサイズのミセルを形成し、ある温度以上では、水分子との水素結合が切れて溶解度が急激に減少し、ミセルが互いに凝集して固形物質（microsphere/ nanosphere）を形成することをいう。このように相転移が起こる温度を低臨界溶液温度（Lower Critical Solution Temperature：ＬＣＳＴ）という。本発明による両親媒性ホスファゼン三量体分子の自己集合（self-assembly）により形成されるミセルは、１０nmから数百nmサイズの粒子であり、これら粒子の内部は親油性（疏水性）基から構成されているので、水溶性の低い疏水性薬物を覆うのに利用することができ、タンパク質又はタクソールのような難溶性薬物の担体としての使用に適している。
【００１６】
また、本発明の環状ホスファゼン三量体は、一種のオリゴマーであるが、分子量が正確な単量体のような分子構造をなし、化学式１から分かるように、リン原子と窒素原子とが交互に共役結合をして六角平面をなし、３個の親水性基（ＰＥＧ）と３個の疏水性基であるオリゴペプチドエステル基が、前記平面の両側にそれぞれ集まるように設計されているため、分子の親水性と疏水性が極大化される。したがって、従来のブロック共重合体に比べて水溶液中で安定なミセルを形成することができ、これらミセルは、体温の近くでも温度感応性を示すため、皮下注射や生体組織への局部送達用など、多様な薬物担体として適している。例えば、体温以下の低臨界溶液温度を示す本発明の環状ホスファゼン三量体の水溶液に成長ホルモンのようなタンパク質医薬品を均一に溶解し、この溶液の温度を３７℃に昇温させると、タンパク質薬物の大部分がホスファゼン薬物担体のミセル内に捕集されたまま沈殿する。したがって、このような方法で調製された薬物溶液を皮下注射で人体に投与する場合、薬物は体内の血液全体に広がることなく、投与部位で沈殿して、その部位からのみ徐々に放出されるので、薬物の生体利用率の極大化及び副作用の最小化を図ることができる。
【００１７】
なお、本発明のホスファゼン三量体は、動物試験結果、生体適合性に優れることが確認された。これは、これらが体内で分解されるとき、ホスファゼン骨格が、人体に無害な中性リン酸アンモニウムに転換され（非特許文献４）、親水性基であるポリエチレングリコールは、分子量が１００以上の場合に安全であると認められて、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により使用が承認されており、オリゴペプチドは、体内に存在するアミノ酸成分であるためである。
【００１８】
さらに、本発明のホスファゼン三量体に結合されているオリゴペプチドエステルは、加水分解した後で機能基化することができるため、目標指向剤や薬物をこれら機能基に直接結合させることにより、複合体（conjugate）状の薬物担体として活用することができるなど、親水／親油性を大幅に変化させなくても、多様な物性を有するように設計できるという利点を有する。
【００１９】
以下、化学式１で表す本発明の環状ホスファゼン三量体の製造方法を説明する。化学式１の最終産物は空気中で安定であるが、中間体は全て空気中で非常に不安定である。したがって、全ての製造工程は、水分が入らないようにアルゴンラインを利用して行わなければならず、試薬と溶媒は、すべて水分を十分に除去した後に使用する。
【００２０】
まず、下記化学式２：
【００２１】
【化７】
【００２２】
で示されるメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の水分を真空乾燥法で除去し、十分に乾燥したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した後、この溶液を７０℃の油浴で１．０〜１．１当量のナトリウム（Ｎａ）又は水素化ナトリウム（ＮａＨ）と１０〜２４時間反応させて、化学式３：
【００２３】
【化８】
【００２４】
で表すポリエチレングリコールのナトリウム塩を得る。
化学式２及び３において、ｘは、化学式１で定義したものと同じである。
【００２５】
その後、下記化学式４：
【００２６】
【化９】
【００２７】
で表す乾燥したヘキサクロロシクロトリホスファゼンを、テトラヒドロフランに溶解し、この溶液をドライアイス−アセトン浴に入れて−７８℃に冷却する。その後、ヘキサクロロシクロトリホスファゼン１モルに対し、前述のように製造された化学式３のポリエチレングリコールのナトリウム塩３．０〜３．３モルを、３０分〜１時間にわたって徐々に滴下し、さらに３０分〜１時間攪拌する。その後、ドライアイス−アセトン浴を除去し、さらに常温で８〜１２時間反応させる。
【００２８】
次に、分離／精製工程を経ることなく、この反応混合物に、ヘキサクロロシクロトリホスファゼン１モルを基準として、下記化学式５：
【００２９】
【化１０】
【００３０】
で表されるオリゴペプチドエステル３．３〜３．９モルと、過剰量（６〜１２モル）のトリエチルアミンを溶解したクロロホルム溶液を加え、１〜３日間還流反応させて、化学式１の化合物を得る。
【００３１】
化学式４及び５において、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ化学式１で定義されたものと同じである。以上の反応において、反応溶媒としては、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又はこれらの混合物を使用することができる。
【００３２】
前記置換反応が進む間、リン（31Ｐ）核磁気共鳴スペクトルを随時測定して、置換反応の進行程度を判断する。反応が完了すると、反応溶液を濾過して、副産物として、生成する沈殿物（ＮａＣｌ及びＮＥｔ3・ＨＣｌ）を除去し、濾液を減圧濃縮する。濃縮液をテトラヒドロフランに溶解し、過量のエチルエーテル又はヘキサンを加えて沈殿させる工程を２回以上繰返して精製した後、最小量の蒸留水に溶かした溶液を透析膜（通過分子量：１，０００）に入れ、１２〜２４時間透析した後に凍結乾燥すると、粘性の強い褐色の環状ホスファゼン三量体が、６０％以上の収率で得られる。以上の反応工程を要約すると、下記反応式１で表すとおりである。
【００３３】
【化１１】
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、ホスファゼン骨格に、親水性基として、ポリエチレングリコールが、疏水性基として、アミノ酸より疏水性が強く酵素分解性のあるオリゴペプチドエステル基が導入されており、水溶液中で温度感応性ミセルを形成し、薬物担体としての使用に適した相転移温度を有する、生体適合性環状ホスファゼン薬物担体及びその製造方法が提供される。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。しかしながら、本発明の範囲は、特許請求の範囲を外れない限り、これらの実施例に限定されない。
【００３６】
本発明の化合物に対する炭素、水素、窒素元素の分析は、Perkin-Elmer Ｃ、Ｈ、Ｎ分析器により行った。一方、水素核磁気共鳴スペクトルは、Bruker DPX-250 ＮＭＲ分光器を使用して測定し、リン核磁気共鳴スペクトルは、Varian Gemini-400 ＮＭＲ分光器を使用して測定した。
【００３７】
実施例１
分子量３５０のメトキシポリエチレングリコール（３．６２ｇ、１０．３mmol）とナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）を、乾燥したテトラヒドロフラン溶媒に入れ、アルゴン気流下で２４時間還流させて、メトキシポリエチレングリコールのナトリウム塩を製造した。ヘキサクロロシクロトリホスファゼン（１．００ｇ、２．８８mmol）を、乾燥したテトラヒドロフランに溶解し、この溶液をドライアイス−アセトン浴（−７８℃）に入れて冷却した後、先に製造したメトキシポリエチレングリコールのナトリウム塩溶液を３０分かけて滴下した。３０分後にドライアイス−アセトン浴を除去し、常温で８時間反応させた。この溶液に、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）とテトラペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＥｔ、すなわちグリシルフェニルアラニルロイシルグリシンエチルエステル）（５．４４ｇ、１２．９mmol）を溶解したクロロホルム溶液（１００ml）を加え、５０℃に昇温して１２時間反応させた。反応液を濾過し、生成された塩（ＮＥｔ3・ＨＣｌとＮａＣｌ）を１次除去して、減圧濃縮した。この濃縮液をテトラヒドロフランに再び溶解した後、過剰量のエーテルとヘキサンを加えて沈殿させた。この工程を２回繰返し、少量の蒸留水（２０ml）に溶解した後、透析膜（ＭＷＣＯ：１０００）を使用して、外部の水を４回交換して２４時間透析した後、凍結乾燥してホスファゼン三量体（［ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＥｔ）］3）（収率７４％）を得た。このように得られた固体生成物を、再び水に溶解して１０％の溶液にした後、低臨界溶液温度で沈殿させて、遠心分離後に上層の溶液を除去した。この工程を３回繰返した後に凍結乾燥して、最終生成物（収率６４％）を得た。
組成式：Ｃ36Ｈ62Ｎ5Ｏ13Ｐ1
理論値：Ｃ，５３．７９；Ｈ，７．７７；Ｎ，８．７１
元素分析値：Ｃ，５３．２３；Ｈ，７．９１；Ｎ，８．６０
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，３Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１２（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．２−１．３（ｍ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2（ＣＨ3）2
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，３０Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．８３（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．８２（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．１（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４２（ｔ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ），
低臨界溶液温度：３６℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００３８】
実施例２
分子量３５０のメトキシポリエチレングリコール（３．６２ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びテトラペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ2、すなわちグリシルフェニルアラニルロイシルアスパラギン酸ジエチルエステル）（６．５６ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ３５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ2）3（収率６４％）を得た。
組成式：Ｃ120Ｈ204Ｎ15Ｏ45Ｐ3
理論値：Ｃ，５３．９８；Ｈ，７．７０；Ｎ，７．８７
元素分析値：Ｃ，５３．７７；Ｈ，７．８５；Ｎ，７．８６
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１２（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．２−１．３（ｍ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，３０Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．１（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．２（ｄ，２Ｈ，Ａｓｐ−ＣＨ2）
δ ４．４２（ｔ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：３３℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００３９】
実施例３
分子量３５０のメトキシポリエチレングリコール（３．６２ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びテトラペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｕＥｔ2）（６．７３ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ３５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｕ（Ｅｔ）2）3（収率６７％）を得た。
組成式：Ｃ123Ｈ210Ｎ15Ｏ45Ｐ3
理論値：Ｃ，５４．４７；Ｈ，７．８０；Ｎ，７．７５
元素分析値：Ｃ，５４．５１；Ｈ，７．９４；Ｎ，７．８２
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１１−１．２１（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．２−１．３（ｍ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ3）
δ １．８−２．０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＮＨＣＨＣＯＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ−）
δ ２．０−２．２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，３０Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．７（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：３１℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００４０】
実施例４
分子量５５０のメトキシポリエチレングリコール（５．６７ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びテトラペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ2）（６．５６ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ５５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ2）3（収率６１％）を得た。
組成式：Ｃ150Ｈ237Ｎ15Ｏ48Ｐ3
理論値：Ｃ，５７．１３；Ｈ，７．５８；Ｎ，７．９９
元素分析値：Ｃ，５７．２６；Ｈ，７．５７；Ｎ，７．６６
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１２（ｔ，６Ｈ，Ａｓｐ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．４７−１．８０（ｍ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，４８Ｈ，ＭＰＥＧ５５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．８２（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．１２−４．２１（ｍ，４Ｈ，Ａｓｐ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．５３（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ４．８−４．９（ｍ，１Ｈ，Ａｓｐ−ＣＨ）
δ ７．１４ −７．２９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：５３℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００４１】
実施例５
分子量３５０のメトキシポリエチレングリコール（３．６２ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びトリペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ、すなわちグリシルフェニルアラニルロイシンエチルエステル）（４．７０ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ３５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＥｔ）3（収率６４％）を得た。
組成式：Ｃ108Ｈ195Ｎ12Ｏ36Ｐ3
理論値：Ｃ，５５．６６；Ｈ，８．４３；Ｎ，７．２１
元素分析値：Ｃ，５３．９５；Ｈ，８．０７；Ｎ，６．８４
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８６−０．９０（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．２５（ｔ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．５０−１．６５（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2）
δ ３．０５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．３１（ｓ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．３５（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．３５−３．６（ｂ，３０Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．４８（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ７．１９−７．３１（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：４１℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ １８．９６
【００４２】
実施例６
メトキシテトラエチレングリコール（２．１４ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びトリペプチド（ＧｌｙＰｈｅＧｌｙＥｔ）（３．９８ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＴｅｔＥＧ）3（ＧｌｙＰｈｅＧｌｙＥｔ）（収率７１％）を得た。
組成式：Ｃ66Ｈ105Ｎ12Ｏ24Ｐ3
理論値：Ｃ，５１．３６；Ｈ，６．８６；Ｎ，１０．８９
元素分析値：Ｃ，５０．３３ ；Ｈ，７．１０ ；Ｎ，９．８６
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ １．３３（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，１８Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2，ＴｅｔＥＧ−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．９４（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ４．８２（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：３４℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２１．７１
【００４３】
実施例７
メトキシトリエチレングリコール（１．６９ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．３mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びトリペプチド（ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＥｔ）（３．５３ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＴｒｉＥＧ）3（ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＥｔ）3（収率７１％）を得た。
組成式：Ｃ63Ｈ123Ｎ12Ｏ27Ｐ3
理論値：Ｃ，４８．０８；Ｈ，７．８８；Ｎ，１０．６８
元素分析値：Ｃ，４８．１２；Ｈ，７．９２；Ｎ，１０．５０
水素核磁気共鳴スペクトル（Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８３（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．２２（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2 ＣＨ3）
δ １．５７−１．７２（ｓ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2）
δ ３．２５−３．６（ｂ，１４Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2，ＴＥＧ−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．８５−３．９８（ｄ，４Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．１６（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．４７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
低臨界溶液温度：＞１００℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ3，ｐｐｍ）：δ ２１．３１
【００４４】
実施例８
分子量５５０のメトキシポリエチレングリコール（５．６７ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びペンタペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＰｈｅＧｌｕＥｔ2、すなわちグリシルフェニルアラニルロイシルフェニルアラニルグルタミン酸ジエチルエステル）（８．２８ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ５５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＰｈｅＧｌｕ（Ｅｔ））3（収率６２％）を得た。
組成式：Ｃ120Ｈ297Ｎ18Ｏ63Ｐ3
理論値：Ｃ，５６．６８；Ｈ，７．８５；Ｎ，６．６１
元素分析値：Ｃ，５７，３２ ；Ｈ，８．０２；Ｎ，６．５０
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．７６−０．９０（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2
δ １．１１−１．２１（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．８−２．０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．０−２．２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，４８Ｈ，ＭＰＥＧ５５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．６８（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ４．８２（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：３５℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．１３
【００４５】
実施例９
分子量５５０のメトキシポリエチレングリコール（５．４４ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びペンタペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＧｌｕＥｔ2）（７．４８ｇ、１２．９mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ５５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙＧｌｕＥｔ2）3（収率６０％）を得た。
組成式：Ｃ159Ｈ279Ｎ18Ｏ63Ｐ3
理論値：Ｃ，５３．８９；Ｈ，７．９４；Ｎ，７．１１；Ｏ，２８．４４；Ｐ，２．６２
元素分析値：Ｃ，５４．２１ ；Ｈ，８．２２；Ｎ，６．９８
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−（ＣＨ3）2）
δ １．１１−１．２１（ｔ，６Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．８−２．０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．０−２．２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ３５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，４８Ｈ，ＭＰＥＧ５５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，２Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ３．８５−３．９８（ｄ，４Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ ４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ）
δ ４．６８（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：４２℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００４６】
実施例１０
分子量７５０のメトキシポリエチレングリコール（７．７４ｇ、１０．３mmol）、ナトリウム片（０．２４ｇ、１０．４mmol）、トリエチルアミン（２．６１ｇ、２５．８０mmol）及びペンタペプチド（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＰｈｅＧｌｕＥｔ2）（８．２８ｇ、１２．９４mmol）を使用して、実施例１と同様の方法で、最終のホスファゼン三量体生成物Ｎ3Ｐ3（ＭＰＥＧ７５０）3（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＰｈｅＧｌｕＥｔ2）3（収率５８％）を得た。
組成式：Ｃ204Ｈ345Ｎ18Ｏ75Ｐ3
元素分析値：Ｃ，５５．９２；Ｈ，７．９０；Ｎ，５．５１
理論値：Ｃ，５６．４２；Ｈ，８．０１；Ｎ，５．８１
水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：
δ ０．８０−１．０（ｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ3）
δ １．１１−１．２１（ｔ，３Ｈ，Ｇｌｕ−ＯＣＨ2ＣＨ3）
δ １．２−１．３（ｍ，３Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ2
δ １．８−２．０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．０−２．２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ2）
δ ３．２０（ｓ，３Ｈ，ＭＰＥＧ７５０−ＯＣＨ3）
δ ３．２５−３．６（ｂ，６４Ｈ，ＭＰＥＧ７５０−ＯＣＨ2ＣＨ2）
δ ３．６５（ｄ，４Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ2）
δ ４．００−４．１１（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ2）
δ ４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ）
δ ４．４１−４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）
δ ４．６８（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ４．８２（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）
δ ７．１４（ｍ，５Ｈ，Ｐｈｅ−ａｒｏｍ）
低臨界溶液温度：４５℃
リン核磁気共鳴スペクトル（ｉｎ Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：δ ２２．０３
【００４７】
実施例１１
分子サイズの測定及び脂溶性医薬物質の担持の確認
本発明により合成した両親媒性ホスファゼン三量体が、水溶液中で親油性基の相互作用により凝集してミセルを形成するか否かを、以下の手順に従ってＤＬＳ（Dynamic Light Scattering）法で決定した。
【００４８】
実施例２の三量体を蒸留水に０．１〜０．５％溶解した水溶液と、この溶液にタクソール（三量体の３重量％）を溶かした溶液との粒度を測定した。図１及び２に示すように、直径５０±２nmサイズのミセルが形成されたことが確認された。
すなわち、０．２％未滿の低い濃度の溶液では、低臨界溶液温度が観測できなかったが、５０nm程度の一定のサイズを有するミセルを形成した。
一方、０．２％以上の濃度の溶液では、ＵＶスペクトルにより確認した結果、低臨界溶液温度が観測できた。ＤＬＳを利用して粒径を観測したが、低い濃度の場合とは異なって、０．２％以上の濃度の溶液で、ホスファゼン三量体は、低臨界溶液温度の近くで２次構造を形成して、直径が２００nm±１０以上の一定のサイズを有する巨大分子構造（molecular structure）を形成することが確認された。これは、低い濃度でミセル構造を形成していたホスファゼン三量体が、低臨界溶液温度の近くではさらに凝集して２次構造を形成することにより、粒径が突然大きくなるためであると判断される。
【００４９】
以上の結果から、本発明によるホスファゼン三量体は、低い濃度（０．１％）ではミセル構造を形成し、高濃度（０．２％以上）ではナノ粒子ないしミクロ粒子（nanoparticle/ microparticle）を形成することを確認した。したがって、このような構造内に薬物体が吸着できることが確認された。
【００５０】
実施例１２
環状ホスファゼン三量体の剤形に関する薬物放出試験
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含有するホスファゼン三量体に対する試験管内（in vitro）放出実験を実施した。その結果を図３に示す。
図３は、実施例３で製造されたホスファゼン三量体の１２．５％水溶液に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が１mg/mlの濃度になるように混合し、３７℃で沈殿させた後、ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）中に放出されるヒト成長ホルモンの量をサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）で測定した、ヒト成長ホルモン累積放出プロファイルを示す。
【００５１】
図３から分かるように、初期の０．２５日間に緩衝液中に放出されたヒト成長ホルモンは、約３０．８％で、それほど高くない初期放出を示し、初期過剰放出の恐れがないことが確認された。その後、１次（1st order）に近い累積放出曲線を示し、７日間の総累積放出量は１００％であった。したがって、実施例３のホスファゼン三量体は、１週剤形に適した生体外（in vitro）放出挙動を示すと判断される。
【００５２】
実施例１３
ホスファゼン三量体を使用した薬物担体の局所刺激性試験の結果
ホスファゼン三量体と薬物（ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ））との混合による薬物安定性の変化、及び局所刺激性を試験した。
まず、実施例３で製造されたホスファゼン三量体の１２．５％水溶液に、薬物を混合（７．５mg/ml）し、薬物とホスファゼン三量体との反応の有無を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で確認した。その結果を図４に示す。
【００５３】
図４から分かるように、ホスファゼン三量体と薬物とが混合される前の薬物のクロマトグラムと、薬物を実施例３で製造されたホスファゼン三量体と混合した後の薬物のクロマトグラムとを比較した結果、本発明によるホスファゼン三量体は、薬物の安定性に影響を及ぼさない。
【００５４】
また、前記の調剤薬物をウサギの肩に皮下注射で１mlずつ投与した後、皮膚局所刺激性の有無を観察した。その結果を下記の表１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１から分かるように、薬物であるヒト成長ホルモンの含有有無に関係なく、皮膚反応（紅斑、出血、硬結、浮腫など）が現れず、剖検所見でも刺激に関連した変化（変色、癒着、斑点など）は認められなかった。したがって、本発明による有機ホスファゼン三量体は、局所刺激性がないことが、すなわち、生体適合性を有することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】実施例２で製造した環状有機ホスファゼン三量体ミセルの粒径分布図である。
【図２】実施例２で製造した環状有機ホスファゼン三量体＋タクソールミセルの粒径分布図である。
【図３】実施例３で製造した環状有機ホスファゼン三量体の薬物放出試験結果を示す図である。
【図４】本発明の環状有機ホスファゼン三量体と薬物との混合による、安定性の変化を観察したクロマトグラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１：
【化１】
（式中、ｘは、３、４、７、１２、１６から選択される数であり、Ｒは、メチル、エチル又はベンジル基であり、Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3及びＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2及びＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ3及びＲ4は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、Ｈからなる群より選択される基であり、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4におけるＲは、メチル、エチル又はベンジル基であり、ａ＝ｂ＝ｃ＝１、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１である）
で示される環状有機ホスファゼン三量体。
【請求項２】
（１）化学式３：
【化２】
で示されるポリエチレングリコールのナトリウム塩を、化学式４：
【化３】
で示されるヘキサクロロシクロトリホスファゼンと反応させる工程と、
（２）前記工程（１）の生成物を、化学式５：
【化４】
（式中、ｘは、３、４、７、１２、１６から選択される数であり、Ｒは、メチル、エチル又はベンジル基であり、Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ3及びＲ4は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、Ｈからなる群より選択される基であり、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4におけるＲは、メチル、エチル又はベンジル基であり、ａ＝ｂ＝ｃ＝１、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１である）
で示されるオリゴペプチドエステルと反応させる工程と
を含む、化学式１：
【化５】
で示される環状有機ホスファゼン三量体の製造方法。
【請求項３】
前記工程（２）の反応を、トリエチルアミンの存在下で行う、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（１）及び（２）の反応溶媒が、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程（１）で、ヘキサクロロシクロトリホスファゼン１モルに対し、ポリエチレングリコールのナトリウム塩を３．０〜３．３モル使用する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記工程（２）で、前記工程（１）の生成物１モルに対し、オリゴペプチドを３．３〜３．９モル使用する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程（１）の生成物１モルに対し、トリエチルアミンを６〜１２モル使用する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程（２）の反応完了後、反応混合物を濾過して濾液を濃縮し、残留物をテトラヒドロフランに再び溶解した後、これにエチルエーテル又はヘキサンを加えて生成物の沈殿を形成し、この沈殿物を濾過して蒸留水に溶解した後に透析して、精製された化学式１の環状ホスファゼン三量体を得る工程をさらに含む、請求項２に記載の製造方法。
【請求項１】
下記化学式１：
【化１】
（式中、ｘは、３、４、７、１２、１６から選択される数であり、Ｒは、メチル、エチル又はベンジル基であり、Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3及びＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2及びＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ3及びＲ4は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、Ｈからなる群より選択される基であり、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4におけるＲは、メチル、エチル又はベンジル基であり、ａ＝ｂ＝ｃ＝１、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１である）
で示される環状有機ホスファゼン三量体。
【請求項２】
（１）化学式３：
【化２】
で示されるポリエチレングリコールのナトリウム塩を、化学式４：
【化３】
で示されるヘキサクロロシクロトリホスファゼンと反応させる工程と、
（２）前記工程（１）の生成物を、化学式５：
【化４】
（式中、ｘは、３、４、７、１２、１６から選択される数であり、Ｒは、メチル、エチル又はベンジル基であり、Ｒ1は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3からなる群より選択される基であり、Ｒ3及びＲ4は、ＣＨ2ＣＯＯＲ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＲ、Ｈからなる群より選択される基であり、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4におけるＲは、メチル、エチル又はベンジル基であり、ａ＝ｂ＝ｃ＝１、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１である）
で示されるオリゴペプチドエステルと反応させる工程と
を含む、化学式１：
【化５】
で示される環状有機ホスファゼン三量体の製造方法。
【請求項３】
前記工程（２）の反応を、トリエチルアミンの存在下で行う、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（１）及び（２）の反応溶媒が、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程（１）で、ヘキサクロロシクロトリホスファゼン１モルに対し、ポリエチレングリコールのナトリウム塩を３．０〜３．３モル使用する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記工程（２）で、前記工程（１）の生成物１モルに対し、オリゴペプチドを３．３〜３．９モル使用する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程（１）の生成物１モルに対し、トリエチルアミンを６〜１２モル使用する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程（２）の反応完了後、反応混合物を濾過して濾液を濃縮し、残留物をテトラヒドロフランに再び溶解した後、これにエチルエーテル又はヘキサンを加えて生成物の沈殿を形成し、この沈殿物を濾過して蒸留水に溶解した後に透析して、精製された化学式１の環状ホスファゼン三量体を得る工程をさらに含む、請求項２に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１１７６７４（Ｐ２００６−１１７６７４Ａ）
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３０４３７０（Ｐ２００５−３０４３７０）
【出願日】平成１７年１０月１９日（２００５．１０．１９）
【出願人】（５０５３５８３４７）イファ・ユニバーシティー−インダストリー・コラボレーション・ファウンデーション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＥＷＨＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ−ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１９日（２００５．１０．１９）
【出願人】（５０５３５８３４７）イファ・ユニバーシティー−インダストリー・コラボレーション・ファウンデーション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＥＷＨＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ−ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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