溶液ベースの診断のための方法
【課題】本発明は、試験試料溶液中でおこなわれる溶液ベースの生化学試験手順によって
、医学的に関連した状態を、さらに改善されたかたちで診断するための方法を提供するこ
とを課題とする。
【解決手段】本発明は、試験試料の細胞学的および／または組織学的データに含まれる細
胞ベースの形態学的な情報を上記溶液から得られる分子情報によって置換する方法であっ
て、原試験試料を溶解し、溶解された試験試料から医学的に関連した評価を正確かつ再現
可能に行うことを可能とする方法を提供する。
、医学的に関連した状態を、さらに改善されたかたちで診断するための方法を提供するこ
とを課題とする。
【解決手段】本発明は、試験試料の細胞学的および／または組織学的データに含まれる細
胞ベースの形態学的な情報を上記溶液から得られる分子情報によって置換する方法であっ
て、原試験試料を溶解し、溶解された試験試料から医学的に関連した評価を正確かつ再現
可能に行うことを可能とする方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的に関連した状態に対して特有の関連マーカーのレベルと、標準化マー
カーのレベルとを検出することで、医学的に関連した状態の診断をおこなう方法に関する
。この方法は、液相中の試料を特徴づけることに関係するもので、細胞をベースとした形
態学的な情報に依存することはない。
【背景技術】
【０００２】
現在、分子マーカーをツールとして用いて、多数の医学的に関連した状態の診断がおこ
なわれている。分子ツールは一般に、複雑な検査での１つの局面として用いられており、
検査すべき試料を特徴づける一連の異なるパラメータを考慮に入れる。
【０００３】
医学的に関連した分析では、細胞学的または組織学的手段による試料の形態学的検査が
一般に用いられている。細胞ベースの試料の形態学的特性にもとづくそのような方法は、
例えば、体液、血液、外科的摘出、分泌物、スワブ、または洗浄液等の臨床試料の分析に
、適用される。
【０００４】
子宮頸癌のスクリーニングでは、例えば、スワブを用いて子宮頸の新生物性病変の検出
がおこなわれる。このスクリーニング手順では、異なる起源の病変を区別しなければなら
ない。病原の原因は、例えば、炎症（感染因子または物理的もしくは化学的ダメージによ
る）または新生物発生前の変化および新生物性の変化であると考えられる。形態学的検査
では、特徴が異なる病変を複雑化して区別させる。したがって、スワブの検査について、
細胞学者および病理学者は、ことのほか訓練されなければならず、たとえ経験豊かな試験
官が細胞学的試料にもとづいた診断の評価における高度のオブザーバ間または内の相違を
有する。一般的に、検査の結果は、試験した病理学者／細胞学者による診断基準の主観的
な解釈にもとづく。その結果、スクリーニング試験での偽陽性の結果と偽陰性結果との割
合は、かなり満足できないままである。
【０００５】
したがって、多くのケースでは、これらの細胞学的または組織化学的検査手順が分子マ
ーカーの使用によってサポートされている。そのようなマーカーは、しばしば、免疫組織
化学的染色反応、あるいはインサイチュハイブリダイゼーション反応で使用される。形態
学的検査とマーカー分子をベースとした免疫組織化学的染色反応との従来の組み合わせは
、組織または細胞の医学的に関連した異なる状態に対して特有なものであり、強調された
結果が得られる場合がある。形態学的検査は、分子的方法によってサポートされてよりい
っそう信頼性のある結果が得られるようとしても、手間と時間とがかかり、そのため高価
なものとなる。さらに、形態学的細胞をベースとしたレベルでの診断は、分子パラメータ
によってサポートされている場合でさえ、各々の試験者による個人的な形態学的認識に支
配される。したがって、診断は検査を実行する人に左右される。
【０００６】
きわめて希なケースのみで、細胞ベースの形態学的検査によってさらにサポートされる
ことなく分子マーカーを診断用ツールとして用いることが可能である。このことは、とり
わけ、ある環境下でマーカーが検出されようとしている場合、正確に定義された条件下で
のみ生ずるケースである。したがって、細胞ベースの情報によるサポートなしで分子レベ
ルのみでの状態の診断方法は、特徴づけられる状態に対して曖昧なことなく特異的な適当
なマーカーが存在するようなケースに制限される。例えば、ウイルス感染の検出を試料溶
液中でおこなってもよい。なぜならば、組織中でのウイルスの存在に対して特有のマーカ
ーが、影響を受けていないヒト組織で生じない。
【０００７】
サポート用の分子ツールを用いることによって、検査結果の再現性を高めることができ
る。しかし、試料の保持および調製に関する問題を、単に分子マーカーをさらに使用する
ことで克服できるとは思えない。
【０００８】
細胞学的または組織化学的検査で分子ツールを使用する場合、アーチファクトおよび不
適当な試験結果にならないよう、試料を保存する際に厳しい予防策をとる必要がある。
このことは、細胞ベースの形態学的な情報が不安定であることに部分的に起因し、また検
出すべき試験中の分子マーカーの不安定性に部分的に起因する。もし試料の調製、輸送、
または保存が適切な方法でおこなわれなければ、細胞ベースの情報、または分子情報さえ
も失われるか、もしくは変えられる可能性がある。したがって、診断が不可能となるか、
アーチファクトが生じる傾向がある。例えば、生検または細胞学的調製は、細胞に傷害（
物理的または生化学的）が生ずるため、しばしば困難または不可能になる。組織試料また
は組織生検に関して、急速なターンオーバーにさらされる試料の分子構成要素の保存は、
適当な保存剤が全試料に浸透するまでの経過時間によって複雑化するように思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当該技術分野で日常的におこなわれている形態学的にサポートされた診断方法は、主な
欠点が２つある。第１に、方法が試験者の個人的な認識に大きく依存していることである
。第２に、形態学的情報は、減衰プロセスに対して感受性が高いので、試料調製後にアー
チファクトが生ずる可能性がある。両局面とも、結果の再現性が不適当なものとなる一因
となる。
【００１０】
医学的に関連した状態の診断を改善するために、細胞ベースの形態学的な情報に依存し
ない方法が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
患者の医学的に関連した状態を診断するための方法であって、
（ａ）細胞または細胞破片を含む原試料を患者から得るステップと、
（ｂ）該原試料から試料溶液を調製するステップと、
（ｃ）該試料溶液内で、該医学的に関連した状態に対して特徴的な１種類以上の関連マ
ーカーのレベルを検出するステップと、
（ｄ）以下の標準化パラメータ、すなわち、
−該試料中に示される細胞のうちの特定の細胞種類の有無、
−該試料溶液中に示される前記細胞の特定の分化様式の有無、および
−該試料溶液中に示される前記細胞の特定の増殖特性の有無、
の少なくとも１つに対して特徴的な１種類以上の標準化マーカーのレベルを決定するス
テップと、
（ｅ）該標準化パラメータの少なくとも１つに関して該１種類以上の関連マーカーの検
出されたレベルを標準化するステップと、
（ｆ）該標準化パラメータに対して該関連マーカーの標準化されたレベルにもとづいて
、前記医学的に関連した状態を診断するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
（項目２）
前記医学的に関連した状態は、試料中の特定の細胞種類の有無、該試料内の細胞に関連し
た特定の分化様式の有無、および該試料内での細胞の増殖特性の有無からなる群から選択
される特性によって特徴づけられる状態であることを特徴とする項目１に記載の方法。
（項目３）
前記医学的に関連した状態が疾患であることを特徴とする項目２に記載の方法。
（項目４）
前記疾患が、細胞増殖性疾患、癌、または前兆としての病変であることを特徴とする請求
項３に記載の方法。
（項目５）
前記癌が、頭部および頚部の癌、呼吸器官の癌、消化管の癌、皮膚およびその付属器の癌
、中枢および末梢神経系の癌、泌尿器系の癌、生殖器系の癌、肛門性器癌、内分泌系の癌
、軟組織および骨の癌、またはリンパ球産生系および造血系の癌であることを特徴とする
項目４に記載の方法。
（項目６）
前記原試料が、血液、分泌物、スワブ、吸引液、洗浄液、痰、唾液、大便、胆汁、細胞、
組織、生検採取物、または体液であることを特徴とする項目１に記載の方法。
（項目７）
前記試料が、真核生物または原核生物の細胞を含むことを特徴とする項目６に記載の方
法。
（項目８）
前記１種類以上の関連マーカーは、細胞周期調節タンパク質、メタロプロテイナーゼ、膜
貫通タンパク質、カルシウム結合タンパク質、成長因子、ウイルス感染に特徴的なマーカ
ー分子、細胞増殖マーカー、およびＤＮＡ複製に関連したマーカー、腫瘍マーカー・タン
パク質、および各々のタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される項目１に
記載の方法。
（項目９）
前記腫瘍マーカー・タンパク質は、サイクリン依存性キナーゼインヒビター、ｐ５３、ｐ
Ｒｂ、ｐ１４ＡＲＦ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、ＭＮ、ｈｅｒ２／ｎ
ｅｕ、ｍｄｍ−２、ｂｃ１−２、ＥＧＦ−受容体、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣ
Ｍ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＤＣ２、ＣＤＣ６、ＣＤＣ７プロテインキナーゼ、ＣＤＣ
１４プロテインホスファターゼ、Ｄｂｆ４、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７、ＫｉＳ１、Ｉｄ１、オ
ステオポンチン、ＧＲＰ、腎性ジペプチダーゼ、およびＴＧＦβＩＩ受容体からなる群か
ら選択されることを特徴とする項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１３．５、ｐ１４
、ｐ１５、ｐ１９、ｐ２１、およびｐ２７からなる群から選択されることを特徴とする請
求項９に記載の方法。
（項目１１）
ウイルス感染に対して特徴的な前記マーカー分子が、ウイルス・タンパク質またはウイル
ス核酸であることを特徴とする項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記ウイルス・タンパク質または前記ウイルス核酸が、ＨＰＶ Ｌ１、ＨＰＶ Ｌ２、Ｈ
ＰＶ Ｅ１、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ４、ＨＰＶ Ｅ５、ＨＰＶ Ｅ６、およびＨＰＶ
Ｅ７からなる群から選択されるＨＰＶ遺伝子に由来するＨＰＶタンパク質または核酸で
あることを特徴とする項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記１種類以上の標準化マーカーは、細胞表面タンパク質、ハウスキーピング遺伝子、受
容体タンパク質、糖タンパク質および／またはプロテオグリカン、糖タンパク質および／
またはプロテオグリカンに特異的な炭水化物構造、細胞周期調節タンパク質、メタロプロ
テイナーゼ、膜貫通タンパク質、カルシウム結合タンパク質、成長因子、細胞分化マーカ
ー、およびＤＮＡ複製に関連したタンパク質からなる群から選択されることを特徴とする
項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記１種類以上の標準化マーカーが、上皮抗原、サイトケラチン、またはＣＤ抗原である
ことを特徴とする項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記１種類以上の標準化マーカーは、糖タンパク質、プロテオグリカン、およびこれらの
分子に存在する炭水化物構造からなる群から選択されることを特徴とする項目１３に記
載の方法。
（項目１６）
前記１種類以上の標準化マーカーは、糖タンパク質および／またはプロテオグリカンの生
合成にかかわる酵素であることを特徴とする項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記関連マーカーまたは前記標準化マーカーの検出は、前記マーカー分子を特異的に認識
および結合する少なくとも１種類のプローブを用いておこなわれることを特徴とする請求
項１に記載の方法。
（項目１８）
少なくとも１種類のプローブを検出可能に標識することを特徴とする項目１７に記載の
方法。
（項目１９）
前記プローブを、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、エレクトロルミネ
センス化合物、蛍光化合物、金属キレート、酵素、または生物学的に関連した結合構造に
よって、標識することを特徴とする項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記生物学的に関連した結合構造が、ビオチン、ストレプトアビジン、またはジゴキシゲ
ニンであることを特徴とする項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記少なくとも１種類のプローブが結合剤であることを特徴とする項目１７に記載の方
法。
（項目２２）
前記結合剤がマーカー・ポリペプチドに特異的に結合する項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記結合剤が、抗体、抗体フラグメント、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含むペ
プチド模倣物であることを特徴とする項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記少なくとも１種類のプローブが、炭水化物結合部位を含むレクチン、またはレクチン
によって特異的に認識される炭水化物であることを特徴とする項目１７に記載の方法。
（項目２５）
前記少なくとも１種類のプローブは、マーカー核酸に対して相補的または逆相補的である
核酸分子であり、前記プローブが前記マーカー核酸に対して特異的にハイブリダイズして
いることを特徴とする項目１７に記載の方法。
（項目２６）
前記検出が、定量的または半定量的増幅反応を含むことを特徴とする項目２５に記載の
方法。
（項目２７）
医学的に関連した状態を診断するための試験キットであって、
（ａ）医学的に関連した状態に対して特徴的な少なくとも１種類のマーカー分子を検出
するための少なくとも１種類の試薬と、
（ｂ）以下のパラメータ、すなわち、
特定の細胞種類または分化の有無、
前記試料溶液中に示される前記細胞の様式、および
前記試料溶液中に示される前記細胞に特有な増殖特性の有無、
の少なくとも１つに対して特徴的な少なくとも１種類の標準化マーカーを検出するための
少なくとも１種類の試薬と、
（ｃ）試料を溶解するための緩衝液と、
を含むことを特徴とする試験キット。
（項目２８）
少なくとも１種類の試薬が固相に固定されていることを特徴とする項目２７に記載の試
験キット。
（項目２９）
以下の成分、すなわち、
（ａ）（ｉ）医学的に関連した状態に対して特徴的な関連マーカー分子、ならびに
（ｉｉ）以下のパラメータ、すなわち、
前記試料溶液中に示される前記細胞の特定の分化様式の有無、
前記試料溶液中に示される前記細胞の特定の増殖特性の有無、
の少なくとも１つに対して特徴的な標準化マーカー分子、
からなる群から選択される、正のコントロール反応を行うための少なくとも１種類のマ
ーカー分子と、
（ｂ）前記検出反応を実行するために一般に用いられる試薬および緩衝液と、
の少なくとも１つを、さらに含むことを特徴とする項目２７に記載の試験キット。
（項目３０）
マーカー分子を検出するための前記試薬は、前記マーカー分子および／または前記マーカ
ー分子をコードする核酸とハイブリダイズする核酸プローブに特異的な結合剤を含むこと
を特徴とする項目２７に記載の試験キット。
（項目３１）
前記結合剤が抗体、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含むペプチド模倣物であるこ
とを特徴とする項目３０に記載の試験キット。
（項目３２）
前記試験キットは、診断用試験キット、研究キット、または分析キットであることを特徴
とする項目２７に記載の試験キット。
（項目３３）
子宮頚部異形成、頚部癌、およびヒト子宮頚部試料でのそれらの各々の前駆体段階を診断
するための方法であって、
（ａ）ヒト子宮頚部試料から試料溶液を調製するステップと、
（ｂ）子宮頚部異形成の存在に対して特徴的な少なくとも１種類の関連マーカーのレベ
ルを検出するステップと、
（ｃ）上皮細胞の存在に対して特徴的な少なくとも１種類の標準化マーカーのレベルを
検出するステップと、
（ｄ）前記試料溶液中に検出される標準化マーカーのレベルに対して前記関連マーカー
のレベルを標準化するステップと、
（ｅ）前記標準化マーカーに対する前記関連マーカーの標準化レベルにもとづいて、子
宮頚部異形成を診断するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
（項目３４）
子宮頚部異形成の存在に対して特徴的な前記少なくとも１種類の関連マーカーは、ｐ１６
ＩＮＫ４ａ、ＨＰＶ関連マーカー、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐＲｂ、ｐ
５３、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、ＭＮ、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｍｄｍ−
２、ｂｃ１−２、ＥＧＦ−受容体、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６
、ＭＣＭ７、ＣＤＣ２、ＣＤＣ６、ＣＤＣ７プロテインキナーゼ、ＣＤＣ１４プロテイン
ホスファターゼ、Ｄｂｆ４、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７、ＫｉＳ１、Ｉｄ１、オステオポンチン
、クローデイン−１、ＧＲＰ、腎性ジペプチダーゼ、およびＴＧＦβＩＩ受容体からなる
群から選択されることを特徴とする項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上皮細胞の存在に対して特徴的な前記少なくとも一種類の標準化マーカーは、ガンマ・カ
テニン、Ｅｐ−Ｃａｍ、Ｅ−カドヘリン、アルファ・カテニン、ベータ・カテニン、デス
モプラキン、ｈＫＬＫ１３、ＳＣＣＡ、ｕＰＡ１、インボルクリン、ＣＫ８、ＣＫ１８、
ＣＫ１０、ＣＤＫ１３、ビメンチン、コンカナバリンＡ受容体、およびレクチンからなる
群から選択されることを特徴とする項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記方法が、子宮頚部病変の早期検出または一次スクリーニング試験で使用されることを
特徴とする項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記ヒト子宮頚部試料が、スワブ、分泌物、吸引液、洗浄液、細胞、組織、生検採取物、
または体液であることを特徴とする項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記上皮細胞が、子宮腟部または子宮頸管内の細胞であることを特徴とする項目３３に
記載の方法。
（項目３９）
子宮頸管内の細胞の存在を示す標準化マーカーは、Ｅｐ−Ｃａｍ、ＣＫ８、およびＣＫ１
８からなる群から選択されることを特徴とする項目３８に記載の方法。
（項目４０）
子宮頸管内の細胞の存在を示す標準化マーカーは、ガンマ・カテニン、Ｅ−カドヘリン、
アルファ・カテニン、ベータ・カテニン、ＣＫ１３、ｐ１２０、およびインボルクリンか
らなる群から選択されることを特徴とする項目３８に記載の方法。
（項目４１）
子宮頚部異形成を診断するための試験キットであって、
（ａ）ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ
、ＭＮ、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｍｄｍ−２、ｂｃ１−２、ＥＧＦ−受容体、ｍｃｍ−２、ｍ
ｃｍ−５、クローデイン−１、ヒト・パピローマ・ウイルス感染を示すマーカー、ｐＲｂ
、およびｐ５３からなる群から選択される子宮頚部異形成に対して特徴的な少なくとも１
種類のマーカー分子を検出するための、少なくとも１種類の試薬と、
（ｂ）ＣＫ８、Ｅｐ−Ｃａｍ、ＣＫ１３、ＣＫ８、ＣＫ１８、Ｅ−カドヘリン、アルフ
ァ・カテニン、ベータ・カテニン、ガンマ・カテニン、およびインボルクリンからなる群
から選択される、上皮細胞の有無に対して特徴的な少なくとも１種類の標準化マーカーを
検出するための、少なくとも１種類の試薬と、
を含むことを特徴とする試験キット。
（項目４２）
少なくとも１種類の試薬が固相に固定されていることを特徴とする項目４１に記載の試
験キット。
（項目４３）
以下の成分：
（ａ）以下
（ｉ）子宮頚部異形成に対して特徴的な関連マーカー分子、ならびに
（ｉｉ）以下のパラメータ、すなわち、
円柱上皮細胞の有無、
扁平上皮細胞の有無、
の少なくとも１つに対して特徴的な標準化マーカー分子、
からなる群から選択される、正のコントロール反応をおこなうための少なくとも１種類
のマーカー分子と、
（ｂ）前記検出反応を実行するために一般に用いられる試薬および緩衝液と、
の少なくとも１つを、さらに含むことを特徴とする項目４１に記載の試験キット。
（項目４４）
マーカー分子を検出するための前記試薬が、前記マーカー分子および／または前記マーカ
ー分子をコードする核酸にハイブリダイズしている核酸プローブに特異的な結合剤を含む
ことを特徴とする項目４１に記載の試験キット。
（項目４５）
前記結合剤が、抗体、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含むペプチド模倣物である
ことを特徴とする項目４４に記載の試験キット。
（項目４６）
前記試験キットが、診断用試験キット、インビトロ診断装置、研究キット、または分析キ
ットであることを特徴とする項目４１に記載の試験キット。
（項目４７）
試験キットであって、
（ａ）ｐ１６ＩＮＫ４ａを検出するための試薬と、
（ｂ）ガンマ・カテニンを検出するための試薬と、
を含むことを特徴とする試験キット。
（項目４８）
Ｅｐ−Ｃａｍを検出するための試薬を、さらに含むことを特徴とする項目４７に記載の
試験キット。
（項目４９）
試料溶解のための緩衝液を、さらに含むことを特徴とする項目４７に記載の試験キット
。
（項目５０）
ｐ１６ＩＮＫ４ａを検出するための試薬とガンマ・カテニンを検出するための試薬とが固
相に固定されていることを特徴とする項目４７に記載の試験キット。
（項目５１）
インビトロ診断装置であることを特徴とする項目４７に記載の試験キット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本特許出願は、少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面が添付されたこの特許
または特許出願公報の写しは、申請および必要な料金の支払いをおこなうことで、特許庁
から提供される。
【図１】図１は、子宮頚部切片での子宮頸管内膜および子宮膣部上皮細胞の特異的免疫化学的染色を示す。図１Ａは、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）に対する抗体を用いて、子宮頚部の円柱上皮に検出された陽性反応を示す。図１Ｂは、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）に対する抗体を用いて、子宮頚膣部の円柱上皮で特異的染色が見られないことを示す。図１Ｃは、サイトケラチン１０／１３（ＣＫ１０／１３）に対する抗体を用いて、子宮頚部の円柱上皮で特異的染色が見られないことを示す。図１Ｄは、サイトケラチン１０／１３（ＣＫ１０／１３）に対する抗体を用いて、強く染色された子宮頸膣部の扁平上皮を示す。
【図２】図２は、子宮頚部スワブから得た可溶化試料のウエスタン・ブロット分析を示す。番号１ないし４は、個々の患者から得た試料（子宮頚部スワブ）を示す。
【図３】図３は、試料の妥当性を実証するウエスタン・ブロットおよびＥＬＩＳＡ分析を示す。高度子宮頚部上皮異形成（診断を参照のこと）の４人の患者の試料を、ウエスタン・ブロット分析（図の上側パネル）を用いて分析した。この図の下側パネルは、ＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、患者の医学的に関連した状態を診断するための方法に関する。この方法は、
細胞または細胞破片を含む原試料を患者から得る工程と、試料から試料溶液を調製する工
程と、試料溶液内で、上記医学的に関連した状態に対して特有の１種類以上の関連マーカ
ーのレベルを検出する工程と、１種類以上の標準化マーカーのレベルを決定する工程と、
上記標準化パラメータに関して関連マーカーの検出されたレベルを標準化する工程と、試
料溶液中の上記関連マーカーの標準化レベルから医学的に関連した状態を診断する工程と
、を含む。標準化マーカーは、以下の標準化パラメータの少なくとも１つに対して特有で
ある。すなわち、前記試料中に示される細胞のうちの特定の細胞種類の有無、前記試料溶
液中に示される前記細胞での特有な分化様式の有無、および前記試料溶液中に示される前
記細胞に特有な増殖特性の有無である。
【００１４】
本発明の一実施形態では、医学的に関連した状態は、細胞増殖性障害、癌、または前駆
的病変である。
【００１５】
本発明は、医学的に関連した状態を診断するための試験キットにも関する。
【００１６】
本発明は、試験試料の溶液中でおこなわれる溶液ベースの生化学的試験手順によって、
医学的に関連した状態の診断を改善する方法を提供する。本発明は、溶液から得た分子情
報によって、試験試料の細胞学的および／または組織化学的データに含まれる細胞ベース
の形態学的な情報を置換する方法であって、原試験試料を溶解させることで、溶解した試
験試料から、医学的に関連した診断の正確かつ再現可能な評価を可能にする方法を提供す
る。本発明にもとづく方法は、診断すべき状態に関連した１種類以上のマーカーのレベル
を決定する工程と、細胞ベースの試験系で診断を可能に、またはサポートする試料の形態
学的局面に関連した情報の置換に適当な一組の標準化マーカーのレベルを決定する工程と
、上記マーカーのレベルに関するデータの比較および／または結合をおこなう工程と、医
学的に関連した状態の診断を評価する工程と、を含む。
【００１７】
本発明は、組織学的および／または組織学的検査手順によって、通常は（細胞ベースの
診断系で）可能に、および／またはサポートする状態の診断が、異なる特性の種々の細胞
種類を含む原試料から得た溶液で、原料を得る工程と、試料を適当な溶媒に溶解する工程
と、試料溶液内で、診断すべき状態に関連した１種類以上のマーカー、さらに加えて１種
類以上の標準化マーカーのレベルを決定する工程と、標準化マーカーと相関関係のあるデ
ータに関連した上記状態に関連したマーカーと相関関係を示すデータを標準化する工程お
よび試料にかかる状態の存在または非存在を診断する工程とを含む方法によって、おこな
うことが可能である。
【００１８】
本発明にもとづく方法は、例えば、細胞学的、組織学的、または病理学的検査が正常に
おこなわれるケースでの一次スクリーニング試験として適用可能である。本発明を用いる
ことで、診断すべき状態が試料に存在する場合、区別可能である。もし溶液ベースの診断
が特定の状態について負の結果を与えるならば、さらなる検査が省略可能である。結果が
陽性である場合、続けて古典的に適用できる方法によって確認することが可能である。し
たがって、高価で時間がかかる顕微鏡的検査または他の検査を、安価な一次スクリーニン
グ試験によって回避することができた。
【００１９】
本発明の一局面は、医学的に関連した状態の診断を向上させる方法であって、診断の評
価が、溶解した原組織試料または原細胞試料の溶液を用いて実施される方法を提供する。
本発明にもとづいて開示された診断の方法は、形態学的パラメータに依存するものではな
く、生化学的分析による診断を可能とする。
【００２０】
本発明の第２の局面は、目的とするパラメータに対して特有の分子マーカーによって、
溶液中の複合試料を特徴づけ、さもなければ細胞学的または組織化学的検査から得ること
が可能な、情報が置換される方法である。
【００２１】
本発明の第３の局面は、複合試料で医学的に関連した特定の状態の診断用に適した組み
合わせを提供する。標準化のためのマーカーは、試料を原試料に溶解することで喪失され
る診断を可能またはサポートする原試料に含まれるパラメータが置換可能である。
【００２２】
本発明の第４の局面は、本発明にもとづく診断または研究をおこなうための試験キット
である。
【００２３】
本発明は、体液、スワブ、洗浄液（例えば気管支肺胞性ラビッジ、胸部管洗浄液、その
他）、吸引液（針吸引液、細針吸引液）または複合細胞もしくは組織試料等の原試料で、
状態の診断を急速かつ簡単におこなうことを可能とする。一般に、原料に関する問題は、
いくつかの異なる細胞種類が試料に存在すること、ならびに特定の微生物および細胞外物
質が存在することである。したがって、結果としてアーチファクトを与える傾向になる細
胞と組成物との混合物を含む。原試料内の物質および生物体の増殖特性が異なる種々の細
胞種類の存在によって、マーカー分子の特定のレベルの一因となりうる多数の因子が生ず
る。１つの単一分子マーカーのレベルを単に検出するだけでは、もし原試料に関するさら
なる（形態学的な）パラメータが与えられた場合、診断に有用な情報のみが提供されるに
すぎないと思われる。原試料から得ることが可能なすべての形態学的データが、溶液に溶
解することで失われる。それにもかかわらず、組織化学的、細胞学的方法によって得るこ
とが可能な特定の形態学的または他のパラメータに対応する適当な分子マーカーがある。
【００２４】
例えば、原試料内の単一構成要素に関する情報を、顕微鏡的検査によって、古典的に得
ることが可能である。形態学的な検査によって、分化、細胞の移動、さらには細胞が出現
する環境についてのヒントが得られる。子宮頚部−スワブの細胞学的調製では、例えば、
特定の細胞が上皮細胞として同定可能であり、さらに子宮頸管内膜または子宮膣部の上皮
細胞として同定されることもある。子宮内膜細胞等の非子宮頚部細胞の存在さえも、顕微
鏡的検査によって容易に解明することが可能である。
【００２５】
本発明によれば、試料材料の同種的または異種的特徴とは独立したさらなる調製または
特徴付けをおこなうことなく、原料を適当な溶媒に直接溶解してもよい。材料溶解の過程
で失われたデータを、一連のマーカー分子のレベルによってコードされた試料溶液に加え
られ、それによって、各々の形態学的特性に対する標準化のための上記分子データを使用
して、再構成することも可能である。このことは、明確な診断に必要とされる特性パラメ
ータの各々についての適当な分子マーカーを用いることで達成される。適当なマーカー・
アレイを検出することで、原試料を特徴づける関連パラメータを評価することが可能であ
り、さらに試料の溶解を介して情報の喪失という欠点が克服される。
【００２６】
本発明にもとづく試験手順として、問題になっている細胞状態に対して特有のマーカー
特性のレベルおよび試験試料内の特定環境を特徴づけるパラメータに関してデータを標準
化するためのマーカーのレベルの検出を含む。本発明にふさわしいマーカーは、さまざま
なものに由来するものであってもよい。問題となっている状態の検出にとって適当なマー
カーの発現様式は、細胞の増殖状態、分化状態、細胞種類、または生物体に依存する。適
当なマーカーの例を以下に示す。
【００２７】
本明細書で使用される「診断」という用語には、一般に、医学的に関連した状態の有無
についてのあらゆる種類の評価が含まれる。したがって、診断は、したがって、医学的に
関連した状態の傾向（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）をスクリーニングするプロセス、
医学的に関連した状態の前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）をスクリーニングするプロセス、
医学的に関連した状態の臨床的または病理学的診断プロセス等が診断に含まれる。本明細
書で使用されるように、医学的に関連した状態の診断とは、任意の状態の検査を含むもの
であってもよく、該状態は、ヒトの健康および／または身体に関して有用と思われる細胞
学的、組織化学的、生化学的、または分子生物学的レベルで検出可能である。そのような
検査には、例えば、医学的診断法および生命化学分野での研究を含むことができる。本発
明の一実施形態では、上記方法は、疾患等の医学的に関連した状態の診断に用いられる。
そのような疾患として、細胞または組織の非野生型増殖によって特徴づけられる疾患を挙
げることができる。
【００２８】
一実施形態では、癌およびその前駆段階の診断、癌の疾病経過のモニタリング、癌の予
後評価、および微小残存病変診断の過程での播種性腫瘍細胞等の検出に関する。本発明に
もとづく方法は、例えば、癌およびその前駆段階を臨床もしくは病理学的に診断する過程
で、または癌の臨床学的診断およびその前駆段階、またはスワブの検査等、特定の癌に対
して実施されるルーチン・スクリーニング試験、例えば頚部病変のスクリーニング試験、
肺癌に関する気管支洗浄液のスクリーニング試験、または結腸直腸病変等の消化管病変に
関する便のスクリーニング試験で使用することが可能である。
【００２９】
本発明にもとづく方法は、すべての種類の医学的に関連した状態に適用可能である。
【００３０】
本発明にもとづいて用いられるように、医学的に関連した状態は、例えば、組織の組成
物、体液、分泌物、洗浄液、またはスワブであってもよい。そのような状態は、体液の細
胞性組成物、例えば血液組成物、分泌液組成物、または精液組成物であってもよい。この
文脈では、これらの組成物は、例えば、特定の細胞種類（例えば、ウイルス等の病原体、
前新生物、新生物、および／または形成異常細胞他）の有無、特定の細胞種類の分化様式
の有無、特定の細胞種類（例えば、赤血球、白血球、精子、その他）の総数、試料中に存
在または不在の任意の細胞型の全細胞または特定の他の特徴を持つ細胞分画とする。
【００３１】
さらに、医学的に関連した状態は、細胞または組織に関連した疾患も含むものであって
もよい。診断すべき上記状態は、細胞学的および組織学的組織試料に関連するパラメータ
を含むものであってもよい。上記状態は、例えば外科的切除試料、生検、スワブ、洗浄液
等の組織試料中での細胞の分化様式を含むものであってもよい。そのような状態は、例え
ば先天性疾患、炎症性疾患、機械的障害、外傷障害、血管障害、変性障害、成長障害、良
性新生生物、悪性新物を含むものであってもよい。本発明にもとづく状態の別の局面は、
増殖特性の有無によって特徴づけられる状態であってもよい。増殖特性の有無によって特
徴づけられる状態が、例えば、細胞増殖性疾患であってもよい。
【００３２】
本発明にもとづく細胞増殖性疾患は、正常制御細胞または組織の増殖特性と比較して、
細胞または組織の異常増殖によって特徴づけられた疾患を含む。細胞または組織の増殖は
、例えば、異常に加速、減速するか、もしくは異常に制御されるものが考えられる。上記
で用いたように、異常制御は、天然に生ずる増殖制御の影響に対する細胞または組織の非
野生型応答の有無の任意に形態を含むものであってもよい。細胞または組織の増殖におけ
る異常として、例えば、新生物または過形成のものが考えられる。
【００３３】
一実施形態では、細胞増殖性疾患は腫瘍である。腫瘍として、頭部および頚部の腫瘍、
呼吸器官の腫瘍、肛門性器動の腫瘍、消化管の腫瘍、泌尿器系の腫瘍、生殖器系の腫瘍、
内分泌系の腫瘍、中枢および末梢神経系の腫瘍、皮膚およびその付属器の腫瘍、軟組織お
よび骨の腫瘍、リンパ球および造血系の腫瘍、その他を挙げることができる。腫瘍は、例
えば良性および悪性腫瘍、癌種、肉腫、白血病、リンパ腫、または異形成を含むものであ
ってもよい。特定の実施形態では、腫瘍は、例えば頭部および頚部の癌、呼吸器官の癌、
肛門性器道の癌、消化管の癌、皮膚およびその付属器の癌、中枢および末梢神経系の癌、
泌尿器系の癌、生殖器系の癌、内分泌系の癌、軟組織および骨の癌、造血系およびリンパ
球生成系の癌である。
【００３４】
上記肛門性器道の癌として、会陰癌、肛門周囲癌、および陰嚢皮膚癌、子宮頚癌、陰門
癌、膣癌、陰茎癌、肛門癌等が含まれる。子宮頸癌として、鱗状病変、腺病変または他の
上皮性腫瘍が含まれる。鱗状病変として、例えば子宮頚部上皮内異常増殖（軽度、中等度
、および高度の異形成）、癌種インサイチュ、扁平上皮細胞癌（例えば、角質化、非角質
化、疣状、いぼ状、乳頭状、リンパ上皮腫様）が含まれる。腺病変として、非定型増殖、
腺癌インサイチュ、腺癌（例えば、ムチン、類子宮内膜、澄明細胞、悪性腺種、乳頭状、
漿液性、または中腎性の腺癌）が含まれる。他の上皮性腫瘍として、腺扁平上皮癌、硝子
細胞癌、腺様嚢胞癌、腺様基底癌、カルチノイド腫瘍、小細胞癌、および未分化癌腫が含
まれる。さらに詳しい情報については、「Ｋｕｒｍａｎ，Ｒ．，Ｎｏｒｒｉｓ，Ｈ．，ら
．， Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｒｖｉｘ， Ｖａｇｉｎａ，ａｎｄ Ｖｕｌｖ
ａ， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９２，ＡＦＩＰ」を参
照すること。この文献の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【００３５】
消化管の癌として、大腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ字結腸癌、直腸
癌、小腸癌、空腸癌、十二指腸癌、胃ガン、食道癌、肝臓癌、胆汁癌、胆管系癌、脾臓癌
等が含まれる。胃腸病変についての総合的な概要は、「Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｒ， Ａａ
ｌｔｏｎｅｎ ＬＡ （Ｅｄｓ．）： Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ， Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ
Ｓｙｓｔｅｍ， ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ： Ｌｙｏｎ ２０００」から得られ、本明細
書中で参考として援用される。
【００３６】
呼吸器官の腫瘍として、呼吸器官のなんらかの悪性状態が含まれ、該悪性状態として、
例えば肺、肺胞、細気管支、気管支樹および気管支、鼻咽頭空間、口腔、咽頭、鼻腔およ
び副鼻腔等の癌が挙げられる。小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌、小細胞肺
癌、肺の腺癌、大きい細胞肺癌、アデノ鱗状肺癌、肺のカルチノイド腫瘍、気管支腺腫瘍
または（悪性）または中皮腫等の肺癌。呼吸器官の腫瘍についての概要は、「Ｃｏｌｂｙ
ＴＶ，ら．：Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｏｗｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔ
ｒａｃｔ， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｔｈｉｒｄ Ｓｅ
ｒｉｅｓ， Ｆａｓｃｉｃｌｅ １３， ＡＦＩＰ： Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ １９９５
」に見いだすことができ、本明細書ではこの文献は参考として援用される。
【００３７】
泌尿器系の腫瘍として、膀胱癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、および尿道癌を挙げること
ができる。生殖器系の腫瘍として、卵巣、子宮、精巣、前立腺、精巣上体副睾丸等の癌も
しくはそれらの前駆段階を挙げることができる。
【００３８】
すべてのケースで、本発明にもとづく方法は、病変、腫瘍、または癌の前駆対段階に対
しても適用される。
【００３９】
一実施形態では、本発明にもとづく方法は、播種性腫瘍細胞または転移の検出に関する
。
【００４０】
本発明の一実施形態では、癌は、例えば子宮頚癌、大腸癌、胃癌、胸部癌、膀胱癌、肺
癌、口腔癌等である。
【００４１】
試料の分子特性を保存する強力で迅速かつ容易ないくつかの方法を提供するもので、そ
れによって試料の形態学的情報が失われる。試料は、例えば、該試料を得た後、または該
試料を得ているあいだでも、適当な溶媒に対して急激に試料の細胞性成分を溶解すること
で、再生可能かつ容易に保存および運搬できる形態に調製することができる。体液を、個
人の体から適当な界面活性剤と保存剤物質とを含む溶液へ直接移すことも可能である。さ
らに、組織試料を変性溶解状態に素早く移して（最終的には、物理的力による）保存する
ことが可能である。溶媒の適当な成分を用いて、原試料の分子構成要素を保存することが
でき、分解が生ずるようなことはないと思われる。酵素活性の低下は、例えば酵素阻害剤
を用いることで、最小限にすることが可能である。したがって、試験試料の溶液は、保存
上の予防策をさらに必要とすることなく、溶解時に試験試料の分子的特性を容易に示すこ
とが可能である。
【００４２】
原試料は、臨床試料、例えば分泌物、スワブ、洗浄液、体液、血液、尿、精液、大便、
胆汁、分泌液、骨髄、生検、細胞試料、および組織試料を含むのであってもよい。生検は
、本発明の文脈で用いられるように、腫瘍切除試料、内視鏡的手段または器官のパンチも
しくは針による生検によって調製された試料を含むものであってもよい。さらに、検出す
べきマーカー分子が含まれている可能性がある任意の試料が、本発明の試料であってもよ
い。本発明の一実施形態では、上記試料として、子宮頚部スワブ、気管支洗浄液、便等が
含まれる。本発明の文脈で使用される原試料は、固定または保存された細胞または組織試
料を含むものであってもよい。例えば、適当な溶液（アルコール等）に保存された細胞、
または固定組織試料を、本発明にもとづく方法で原試料として用いることもできる。
【００４３】
本発明の方法にもとづく原試料として、細胞または細胞破片を含む任意の試料が挙げら
れる。細胞は、例えば原核細胞または真核細胞である。
【００４４】
本発明が感染性の疾患に適用される場合、決定すべき細胞として、クラミジア、大腸菌
（Ｅ． ｃｏｌｉ）、カンジダ等の微生物が考えられる。
【００４５】
本発明によれば、原試料の分子構成要素の全部または一部は、例えば溶媒を含んでいる
適切な溶解緩衝液で可溶化される。そのような溶媒として、例えばカオトロピック剤（例
えば例えば尿素、ＧｕａＳＣＮ、ホルムアミド）、陰イオン洗浄剤（例えば、ＳＤＳ、Ｎ
−ラウリル・サルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、アルキル・アリール・スルホン
酸塩、長鎖（脂肪）アルコール硫酸塩、オレフィン硫酸塩およびスルホン酸塩、アルファ
・オレフィン硫酸塩およびスルホン酸塩、硫酸化モノグリセリド、硫酸化エーテル、スル
ホコハク酸塩、アルカン・スルホン酸塩、リン酸塩エステル、アルキル・イセチオン酸塩
、ショ糖エステル）、陽イオン性界面活性剤（例えば、セチル・トリメチルアンモニウム
塩）、非イオン性界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＮＰ−４０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、Ｎ−オクチル・グ
ルコシド）または両性界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、３−ドデシル−ジメチルアンモ
ニオ−プロパン−１−スルホネート、ラウリルジメチルアミン・オキシド）、および／ま
たはＮａＯＨもしくはＫＯＨ等のアルカリ水酸化物が挙げられる。上記溶媒は、細胞、細
胞破片、核酸、ポリペプチド、脂質、さらに原試料に存在する可能性のある他の生体分子
が溶解されるように、設計される。本発明にもとづいて原試料を溶解するための溶液は、
原試料に含まれる構成要素の分解を防ぐ１種類以上の試薬をさらに含むものであってもよ
い。そのような構成要素は、例えば酵素阻害剤（例えばタンパク質分解酵素阻害剤、ＲＮ
Ａアーゼ阻害剤、ＤＮＡアーゼ阻害剤等）から構成されるものであってもよい。本発明の
一実施形態では、試料を、被験者から得ることが可能な形態に直接溶解する。本発明の別
の実施形態では、溶解前に上記試料をさらに精製してもよい。そのような精製手順は、例
えば、粘液等の汚染物質を洗い流し、細胞性構成要素の分離または濃縮化をおこない、細
胞を保存および輸送することが可能である。したがって、原試料の細胞性構成要素が単一
の試料溶媒に含まれる。
【００４６】
本明細書に開示されたように、一方法で用いられる試料の調製もまた、該試料をさらに
調製するためのいくつかの工程を含む場合もある。例えば、不溶性成分の分離、ポリペプ
チドもしくは核酸の単離、ペプチドもしくは核酸を固定した固相の調製あるいはビーズの
調製、決定すべき分子が共有または非共有結合する膜もしくはスライド等がある。
【００４７】
本発明によれば、マーカー分子の検出は、この溶液から直接実行される。検出は、溶液
でおこなうことも可能であり、あるいは固相に固定した試薬を用いておこなうことも可能
である。本発明の特定の実施形態では、マーカー分子の検出は、溶解させた身体試料の溶
液からおこなわれる。したがって、検出は溶液でおこなうことが可能であり、あるいは固
相に固定した試薬を用いておこなうことが可能である。本発明の文脈で使用される固相は
、平面、粒子（マイクロ粒子、ナノ粒子、またはさらに小さい粒子さえも包含される）の
さまざまな実施形態を含むことが可能である。ある実施形態では、粒子をビーズ、コロイ
ド等として提供してもよい。試験キットまたはインビトロ診断装置の固相に対する試薬の
固定は、直接的固定または間接的固定を介して作用するものであってもよい。直接的固定
を、例えば表面に対する共有または非共有結合もしくは会合によっておこなうことが可能
である。間接的固定は、それ自体が固相に直接固定される試薬に対する試薬（例えば抗体
、プローブ等）の結合を介しておこなうことが可能である。そのような試薬として、抗体
、またはソトレプトアビジン、ビオチン等のような他の結合剤を含むものであってもよい
。一種類以上の分子マーカーの検出は、単一反応混合物または２つ以上の異なる反応混合
物でおこなうことが可能である。いくつかのマーカー分子に対する検出反応は、例えば、
マルチ・ウェル反応容器で、あるいは場合により単一もしくは２つ以上の異なる試験片で
、同時に実施することが可能である。細胞増殖性疾患に対して特有のマーカーは、これら
の分子を特異的に認識する試薬を用いて検出することが可能である。同時に、標準化マー
カーは該標準化マーカーを特異的に認識する試薬を用いて検出するこが可能である。各々
のクラスのマーカーに対する検出反応は、最初のマーカー分子の認識または好ましくは最
初のマーカーを認識するために用いられる一次分子の認識のいずれかをおこなう試薬を検
出する一種類以上のさらなる反応を含むものであてもよい。検出反応は、さらに、細胞増
殖性疾患または標準マーカーに対して特有のマーカーのレベルを示すレポーター反応を含
むものであってもよい。
【００４８】
用語「マーカー」または「マーカー分子」は、本発明の文脈のなかで用いられるその文
法的形態の全てにおいて、ポリペプチド分子と同様に核酸分子のことをいう。したがって
、マーカーまたはマーカー分子は、例えば、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等）、ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等）、タンパク質、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タン
パク質、およびそれらの分子の各々のフラグメントを含む。用語「関連マーカー」は、医
学的に関連した状態に対して特有のマーカー分子のことをいう。標準化マーカーという用
語は、標準化目的のために用いられるマーカーのことをいう。
【００４９】
本明細書で使用されるマーカー分子のレベルは、試料に存在する各々のマーカーの量に
関して、定量値と同様に準定量値をいう。定量値を、例えば、濃度に換算して表してもよ
い。準定量値は、複数のレベルからなる等級に換算して表すことが可能である。例えば、
検出不可能なレベル、低レベル、中間レベル、高レベル、または任意の他の適当なモード
であってもよい。マーカーのレベルを従属的パラメータに換算して表してもよい。該パラ
メータとして、例えばマーカー分子の存在に応答してアッセイ・フォーマットで発生する
信号の強度が挙げられる。
【００５０】
本発明の文脈で使用されるマーカー分子の検出のためのプローブは、該マーカー分子に
特異的に結合する任意の分子であってもよい。プローブは、抗体（モノクローン性もしく
はポリクローン性）、抗体フラグメントまたはエピトープを含む人工的分子、タンパク質
または核酸等のＤＮＡまたはＲＮＡ結合分子である。他の核酸に結合する核酸もまた、例
えば検出目的またはプライマーに関して、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはオリゴヌクレオ
チド（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、人工的核酸等）とすることができる。
【００５１】
分子が他の分子と特異的に相互作用する場合、その分子がその他の分子を認識するとい
う。特異的相互作用を、例えば、他の分子に対する特異的結合もしくは他の分子の特異的
結合とすることができる。
【００５２】
レポーター反応は、例えば着色した化合物を生ずる反応であってもよい。本発明の一実
施形態では、特定のマーカーと相関しているレポーター物質によって異なる色が生ずる。
別の実施形態では、標準化マーカー特異的レポーターは、試料に存在する標準マーカーの
レベルに依存して、医学的に関連した状態に対して特有の、マーカーに対して特異的なレ
ポーター分子によって生成されるシグナルを消す分子であってもよい。さらに別の実施形
態では、レポーター反応は、異なった波長特性を持つ蛍光色素を生ずるものであってもよ
い。本発明のさらなる実施形態では、レポーター反応は、検出すべきいずれかのマーカー
に対して特異的なレポーター物質に対して特有の異なる波長を持つ発光反応を含むもので
あってもよい。本発明の別の実施形態では、レポーター反応は、放射線の放出と、該放射
線を視覚化または定量化する追加的な方法とを含むものであってもよい。一実施形態では
、複数の異なるマーカー分子が、異なるエネルギー的特性を示す放射性核種放出放射線を
持つ複数の試薬を認識するものであってもよく、それによってマーカー分子に関するシグ
ナルが区別されるかもしれない。
【００５３】
本発明にもとづく検出反応に対して適応可能なフォーマットには、ブロッティング技術
、例えばウエスタン・ブロット、サザン・ブロット、およびノーザン・ブロットが挙げら
れる。これらのブロッティング技術は、当業者に知られており、例えば電子ブロット、半
乾燥ブロット、真空ブロット、またはドット・ブロットとして実行することが可能である
。さらに、分子を検出するための免疫学的方法は、例えば免疫沈降法または免役アッセイ
、例えばＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、側方流動アッセイ、フロー・スルー・アッセイ、
免疫クロマトグラフィー・ストリップ等を適用することが可能である。本発明で用いられ
る免疫アッセイは、サンドイッチ・アッセイ等の非競合的免疫アッセイと同様に競合的免
疫アッセイから構成されるものであってもよい。
【００５４】
本発明の特定の実施形態では、臨床検査室用の試験装置を用いて免疫化学的または核酸
ベースの試験を行うことも可能である。そのような試験装置には、免疫化学的または核酸
をベースとした試験に適した任意の装置が含まれる。例えば、任意のフォーマット、ベン
チ・トップもしくは実験装置と同様に診療現場（ポイント・オブ・ケア）検査装置が挙げ
られる。これらの装置は、例えば、オープンまたはクローズド・プラットフォーム・シス
テムとして提供される。このシステムは、任意の適当な方法論、例えばマイクロタイター
・プレート、マルチウェル・プレート、フロー・スルーもしくは側方流動システム、マイ
クロチップもしくはアレイをベースとしたシステム、またはビーズもしくは膜をベースと
したシステム等を用いる方法論に基づいたものであってもよい。使用される検出方法は、
免疫化学的または核酸ベースの検出反応にとって有用な当業者に公知の任意の方法を含む
ものであってもよい。そのような検出システムとして、例えば、発光（ルミネセンス）シ
ステム（電気発光、生物発光、光発光、放射線発光、化学発光、電気化学発光）、蛍光ベ
ースのシステム、導電性ベースの検出システム、放射線（光、ＵＶ、Ｘ線、ガンマ等）ま
たは任意の他の公知方法が可能である。
【００５５】
本発明の一実施形態でのマーカー分子レベルの検出方法は、生物学的試料中のわずかな
量の特異的分子でさえも検出するのに適した任意の方法である。さらに、感度に関係なく
マーカー分子を検出する任意の方法も適用可能である。本発明にもとづく検出反応は、例
えば、核酸のレベルでの検出反応および／またはポリペプチドのレベルでの検出反応を含
むものであってもよい。一実施形態では、マーカー分子の検出は、特定のスプライシング
変異体の検出を含むものであってもよい。本発明の別の実施形態では、検出方法は、試料
中のポリペプチドのリン酸化もしくはグリコシル化等または核酸のメチル化等、マーカー
分子の修飾を検出することを含むものであってもよい。
【００５６】
本発明の一実施形態では、マーカー分子のレベルの検出は、試料中に存在する該マーカ
ー分子またはそのフラグメントのレベルを検出することによって、おこなわれる。核酸分
子の検出手段は、当業者に知られている。核酸検出のための手順は、例えば、検出すべき
分子を相補的核酸プローブ、該核酸に対する特異的結合性を持つタンパク質、または該核
酸に対して特異的に認識および結合する任意の他の実体との結合反応によって、おこなう
ことができる。この方法は、インビトロで、例えば検出染色反応のあいだの、直接的イン
サイチュと同様に、実行することができる。本発明にもとづく方法でおこなわれる核酸の
レベル上での試料内のマーカー分子を検出する別の方法は、核酸の増幅反応であり、例え
ばポリメラーゼ鎖反応のように、定量的におこなうことができる。本発明の一実施形態で
は、例えば、リアル・タイムＲＴ・ＰＣＲを用いて、細胞増殖性疾患の試料に含まれるマ
ーカーＲＮＡのレベルを定量することが可能である。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、マーカー分子のレベルの検出は、タンパク質の発現レベル
を決定することによっておこなわれる。タンパク質レベル上でのマーカー分子の決定は、
例えば、該マーカー分子レベルの検出に対して特異的な結合剤を含む反応でおこなうこと
が可能である。これらの結合材は、例えば、抗体および抗原結合フラグメント、二官能性
ハイブリッド抗体、最小抗原結合エピトープを含むペプチド模倣薬等を含むものであって
もよい。上記結合剤は、ウエスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、フロー・
スルー・アッセイ、側方流動アッセイ、ラテックス凝集、免疫クロマトグラフィ・ストリ
ップ、または免疫沈降等における多くの異なる検出技術で用いることが可能である。通常
、結合剤ベースの検出は、インビトロと同様に直接インサイチュで、例えば免疫細胞化学
的染色反応の間、おこなうことが可能である。生物学的試料の溶液中の特定のポリペプチ
ドの量を決定するのに適した任意の他の方法を、本発明にもとづいて用いることができる
。
【００５８】
核酸分子および／またはポリペプチドの修飾状態を検出する方法は、当業者に公知であ
る。
【００５９】
核酸のメチル化を検出するための方法は当業者に公知であり、該方法は、例えば、重亜
硫酸ナトリウム、過マンガン酸塩、またはヒドラジン等による核酸の化学的前処理と、特
異的制限エンドヌクレアーゼによる、または（例えば増幅反応の過程での）特異的プロー
ブによる修飾のその後の検出とを用いる方法を含むことが可能である。メチル化の検出は
、さらに、メチル化特異的制限エンドヌクレアーゼを用いておこなうことができる。核酸
内のメチル化の状態を検出する方法は、特許出願ＥＰ０２０１０２７２．９、米国特許第
５，８５６，０９４号、ＷＯ００３１２９４、米国特許第６，３３１，３９３号等に開示
されている。これらの引用文献を本明細書で参考として援用する。
【００６０】
ポリペプチドの修飾された状態の検出は、例えば、ポリペプチドの修飾または非修飾状
態を特異的に認識する結合剤を含むものであってもよい。あるいは、ホスファターゼまた
はグリコシラーゼ等の酵素は、分子内の修飾を取り除くことに用いることが可能である。
したがって、修飾の有無は、電気泳動、クロマトグラフィ、質量スペクトロメトリ等を用
いて、各々の酵素とのインキュベーションに先だってまたはその後に、分子の質量または
電荷を決定することによって検出することができる。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態では、一連のマーカー分子の検出は、ポリペプチドのレベル
でおこなうことができ、同時にさらなる一連のマーカー分子および／または同一マーカー
分子の全てもしくは一部分の検出が核酸分子のレベルでおこなうことができる。
【００６２】
医学的に関連した細胞状態に関係するマーカーは、例えば細胞および／または組織の増
殖および／または分化に影響および／または反映する分子であってもよい。そのような分
子として、例えば細胞周期調節タンパク質、ＤＮＡ複製に関係するタンパク質、膜貫通タ
ンパク質、受容体タンパク質、シグナル伝達タンパク質、カルシウム結合タンパク質、Ｄ
ＮＡ結合ドメイン含有タンパク質、メタロプロテイナーゼ、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、
シャペロン、胚形成タンパク質、熱ショック・タンパク質、または他のタンパク質を翻訳
後修飾することで該タンパク質の活性を制御する酵素、または指定されたタンパク質をコ
ードする核酸を含むことができる。また、指定されたタンパク質をコードするｍＲＮＡも
本発明にもとづく有用なマーカー分子となり得る。一実施形態では、細胞増殖性疾患に関
係するマーカーは、例えば、疾患にかかった細胞内で独特の発現をするか、該細胞で発現
しないか、もしくは該細胞で過剰に発現するものであってもよい。
【００６３】
本発明にもとづく用途のためのマーカー分子は、ｐ１３．５、ｐ１４、ｐ１５、ｐ１６
（ｐ１６ＩＮＫ４ａともいう）、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐＲｂ、ｐ１４ＡＲ
Ｆ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＥ、ＭＤＭ−２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ５、Ｍ
ＣＭ６、ＣＤＣ２、ＣＤＣ６、Ｉｄ１、オステオポンチン、ＧＲＰ、腎性ジペプチダーゼ
、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＴＧＦＦβＩＩ受容体、例えばＨＰＶ遺伝子Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ
２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６またはＥ７から誘導されたＨＰＶ関連マーカー等から選択される１
つ以上のマーカーを含む。医学的に関連した状態の検出のための本発明の一実施形態で有
用なマーカーの選択を以下の表１に示す。
【００６４】
一実施形態において、医学的に関連する状態に対するマーカーは、腫瘍に対するマーカ
ー（腫瘍マーカー）であり得る。腫瘍に対して特有のマーカー分子は、例えば、正常制御
組織と比較して腫瘍で非野生型のかたちで発現するタンパク質であってもよい。本明細書
で用いられるように、非野生型発現とは、各々の分子の発現レベルの増減、発現の欠如、
または非野生型形態の発現が含まれると考えられる。タンパク質の非野生型形態の発現は
、挿入、欠失、置換、もしくはフレームシフト突然変異により生じるタンパク質の突然変
異形態の発現か、またはタンパク質もしくは核酸における任意の他の公知の種類の突然変
異を含む。非野生型タンパク質の発現またはタンパク質の非野生型レベルのすべての場合
において、タンパク質、ポリペプチド、もしくはそれらのフラグメント、またはそれらの
タンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸、もしくは該核酸のフラグメントを、
腫瘍に関連する分子マーカーとして使用することが可能であり、そのため本発明の文脈で
使用されるように「腫瘍マーカー（ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ）」という用語で理解する
こともできる。腫瘍に関連して非野生型発現を示すタンパク質は、例えばＷＯ９９０４２
６５Ａ２、ＷＯ０１４９７１６Ａ２、ＷＯ００５５６３３Ａ２、およびＷＯ０１４２７９
２Ａ２の文献に開示されており、本明細書ではこれらを参考として援用する。
【００６５】
本発明の一実施形態では、医学的に関連した状態に対して特有のマーカーは、細胞周期
調節蛋白質、例えばサイクリン、サイクリン依存性キナーゼまたはサイクリン依存性キナ
ーゼ阻害剤であってもよい。本発明のさらに別の実施形態では、医学的に関連した状態に
対して特有のマーカーは、一時的または持続的ウイルス感染に関係するマーカーであって
もよい。上記ウイルス感染は、ヒト・パピローマ・ウイルス（ＨＰＶ）、例えばハイリス
クまたは低リスクＨＰＶによる感染を含むものであってもよい。ハイリスクＨＰＶは、例
えばＨＰＶ １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、および５
８のようなＨＰＶサブタイプを含むものであってもよい。ＨＰＶ感染のマーカーは、例え
ばＨＰＶ遺伝子Ｌ１、Ｌ２、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、またはＥ７のＨＰＶ発現産物を含
むものであってもよい。本発明の第３の実施形態では、ウイルス感染に対して特有のマー
カーは、医学的に関連した状態の任意の他のマーカーと組み合わせて、例えば細胞周期制
御タンパク質と組み合わせて使用することが可能である。ＨＰＶ関連に関して特に興味深
いＨＰマーカー分子の組み合わせについては、例えばＷＯ０２０８７６４に開示されてお
り、本明細書ではこの文献を援用する。
【００６６】
一実施形態では、ＨＰＶマーカーと組み合わせて使用するための細胞周期調節タンパク
質は、例えば、ｐＲｂ、ｐ５３、ｐ１４ＡＲＦ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む
群から選択することができる。特定の一実施形態では、ｐ１６ＩＮＫ４ａをＨＰＶ感染の
マーカー（例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、またはＥ７）と組み合わせて
使用することが可能である。
【００６７】
状況に応じて、特定の実施形態での医学的に関連した状態に対するマーカーとして有効
なマーカーが、特定の他の実施形態での標準化のためのマーカーとして用いられ得る（逆
もまたしかり）ことを、理解しなければならない。しかし、各々の単一実施形態で、マー
カーは医学的に関連した状態のためのマーカーとして、または標準化のためのマーカーと
してのみ、用いられることができる。例えば、細胞増殖のためのマーカーとしてのＫｉ６
７は、特定の実施形態（例えばｐ１６、ｐ１４ＡＲＦ、クローデイン−１、または医学的
に関連した状態のためのマーカーとしての他のものと組み合わせたかたちで）、標準化マ
ーカーとして有効であると考えられる。別の実施形態では、Ｋｉ６７は、適当な標準化マ
ーカー（例えばサイトケラチンまたはカテニン等）と組み合わせて、医学的に関連した状
態（例えば子宮頚部上皮異形成または他の形成異常疾患のマーカーとして）のマーカーと
して用いられることが可能である。他の種々のマーカーは、同様に医学的に関連した状態
のマーカーとして用いることが可能であり、または用途の特定の実施形態に応じた標準化
のために役に立つことが可能である。
【００６８】
本発明にもとづく標準化マーカーは、例えばハウスキーピング遺伝子（例えばアクチン
、ｇａｐｄｈ、ヒストン・タンパク質、ホスホリパーゼ、β２ミクログロブリン、ｋｉ６
７、ＰＣＮＡまたはスタチン等の細胞増殖活性に関係するタンパク質、または上皮細胞の
ＣＫ２０等の特定細胞種類もしくは任意の細胞特異的細胞表面抗原に対して特有のタンパ
ク質）を含むものであってもよい。また、糖タンパク質に存在する炭水化物構造、プロテ
オグリカン、コンカナバリンＡ受容体等のレクチン受容体、ムチン、さらにＧａｌＮａｃ
トランスフェラーゼおよびオリゴサッカリルトランスフェラーゼ等のようなこれらの分子
の生合成に関わる酵素もまた、標準化マーカーとして用いることが可能である。マーカー
・タンパク質の種類は、マーカーによって提供されるべき情報にもとづいて選択されなけ
ればならない。特に、特定の医学的に関連した状態に有効なマーカーは、特定の状況下で
、標準化マーカーとして有用であると考えられる。本発明にもとづく方法を実行するのに
有用なマーカーの選択を表１に示す。
【００６９】
医学的に関連した状態に対するマーカーに関してと同様、標準化マーカーに関すること
に関して、分子（例えば、ポリペプチドおよび核酸）の修飾状態を本発明にもとづく方法
でマーカーとして用いることが可能である。例えば、リン酸化、グリコシル化、もしくは
それ以外の修正されたポリペプチドまたはメチル化された核酸は、本発明にもとづく方法
でマーカーとして対処可能である。
【００７０】
本発明にもとづいて使用されるように、標準化は、検出されたマーカーのレベルを、診
断評価に役立つパラメータに対して、関連づけることに適した任意の方法を含むものとす
る。この標準化の一局面は、試料溶液で検出可能な適当な分子マーカーによって、原試料
に含まれる関連した細胞学的および組織学的情報を再構築することが可能である。標準化
は、例えば試料に存在する細胞の合計数、試料での特定の細胞種類の有無、試料に含まれ
る生物体または生物体の細胞の有無、試料に含まれる特定の細胞種類の細胞数もしくは生
物体の数、試料に存在する細胞の増殖特性、または試料に存在する細胞の分化様式を検出
することを含むことが可能である。
【００７１】
特定の実施形態では、標準化はまた、試験の適性を証明することを含むものであっても
よく、場合によって、不適当な試験結果を破棄または無効なものとして分類することがで
きる。したがって、本発明の文脈で用いられるように、標準化は、標準化のための定量的
または半定量的方法を含むことが可能である。いくつかの実施形態では、準定量的標準化
は、標準化マーカーの閾値を決定することを含むことが可能である。一実施形態では、準
定量的標準化は、例えば以下のようにして適用してもよい。例えば、標準化マーカーのレ
ベルが所定の閾値を上回る場合だけ、関連したマーカーのために測定されるレベルは有効
な試験結果と考えられる。閾値に達しない場合、関連したマーカーの試験結果は無効と見
なされる。診断は、検査を基礎として評価される可能性はない。他の実施形態で、閾値は
、上回られる可能性がないように設定してもよい。特定の実施形態では、定量的な標準化
は、標準化マーカーの有無に関して実行することが可能である。それらのケースでは、例
えば、関連したマーカーのために測定される値は、標準化マーカーの有無と比較される。
あらかじめ定義されたように、標準化パラメータ（標準化マーカーの検出可能なレベルの
有無）が満たされる場合、値は有効である。
【００７２】
【表１−１】
【００７３】
【表１−２】
【００７４】
【表１−３】
【００７５】
本発明によれば、標準化は試料中の問題となっているいくつかの（ヒト）細胞の存在を
決定することを含むものであってもよい。このことは、本発明の重要な局面である。特に
、試験手順が検証する場合、試験の実施形態の誤った（特に偽陰性）結果のみを避けるこ
とができる。試験試料は、特定の検査を実行するために必要な材料（例えば細胞、組織生
物体等）を含む。種々の試験では、このことは、試料が細胞を含むことを確実にすること
から構成される。本発明の広範囲にわたる実施形態では、試料の適性の確認は、細胞の存
在を確かめることだけではなく、異なる起源の細胞または特定の細胞種類の存在を検出す
ることが含まれる。
【００７６】
このように、標準化はまた、例えば、特定の器官由来の細胞または特定の組織学的位置
に由来する細胞等、特定起源の細胞の決定、例えば上皮の異なった領域の細胞、または結
合組織の細胞、異質起源（例えば転移細胞）の細胞または組織の基底膜に由来する細胞の
検出、を含むことも可能である。このことは、特定の場合に必要となる可能性がある。な
ぜなら、特定の正常状態での新形成または異形成等、医学的に関連した状態の検出に用い
られるかもしれないマーカーを特定の環境下で発現する細胞が存在するかもしれないから
である。本発明にもとづいて使用されるように、標準化は、医学的に関連した状態の診断
に対して選択された特定のマーカーの全レベルの一因となる可能性がある任意の細胞種類
の有無および／またはレベルの検出を含むものであってもよい。
【００７７】
一実施形態では、方法は頚部病変の検出のために適用される可能性がある。子宮頚部病
変は、上記に定義した子宮頸癌とその前駆段階等、いかなる子宮頚部上皮異形成も含むも
のと考えられる。この検出目的に有用なマーカーおよび該マーカーの組み合わせは、例え
ば、ＷＯ０２０８７６４およびＥＰ１２１７３７７に開示されており、本明細書ではこれ
らの文献を参考として援用する。この実施形態では、試験は子宮頚部由来の任意の適当な
試料を用いて実施してもよい。試料は、例えば、子宮頚部の生検もしくは微小生検または
子宮頚部領域から得たスワブを含むことが可能である。本明細書で用いられるように、子
宮頚部スワブは、サンプリング手順の間、子宮頚部と接触する、例えば、ブラシ、タンポ
ン、またはスパーテル等の適当な手段を用いて得ることが可能な試料である。サンプリン
グ装置は、内科医によって実行される従来の試験装置またはセルフ・サンプリング装置で
用いられる任意の適当な装置を用いてもよい。
【００７８】
子宮頚部スワブの評価を向上させる見込みのある分子マーカーとして、ｐ１６ＩＮＫ４
ａ、ｐ１４ＡＲＦ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、ＭＮ、ｈｅｒ２／ｎｅ
ｕ、ｍｄｍ−２、ｂｃ１−２、ＥＧＦ−受容体、ｍｃｍ−２、ｍｃｍ−５、クローデイン
−１、ヒト・パピローマ・ウイルス感染を示すマーカー、ｐＲｂ、およびｐ５３が挙げら
れ、これらは異形性および新生物細胞の検出に用いられるかもしれない。子宮頚部スワブ
を分析する目的での本発明にもとづく標準化は、少しでもヒト細胞が存在することの検出
、子宮頚部上皮の細胞の検出、子宮膣部細胞と同様に子宮頸管内膜の存在の検出、および
子宮内膜由来の細胞の検出とを含むものであってもよい。子宮頸管内膜の上皮は、腺円柱
上皮である。したがって、円柱の上皮細胞によってまたは腺上皮の中の細胞によって選択
的に発現されるマーカーにより、子宮頚部から生じている細胞が同定可能である。子宮膣
部上皮は、扁平上皮である。子宮膣部細胞の同定は、このように扁平上皮細胞に対して特
有のマーカー特性の検出によって達成可能である。特定の実施形態では、上皮細胞（円柱
であるのと同様に扁平上皮を含む）の検出が十分である。他の実施形態では、特に子宮頸
管内の細胞の分化が重要と思われる。大部分の異形成と異常増殖が起こる子宮頚部変換帯
でとられた試料であることを確証する試料中の子宮頸管内外の細胞の存在を確かめること
は、重要なステップである。そのような細胞がない場合、試料は試験手順に適切でない。
なぜならば、それは偽陰性結果を与えやすいからである。ｐ１６ＩＮＫ４ａがｐ１６ＩＮ
Ｋ４ａの正常子宮内膜細胞標準化で発現される可能性があることから、子宮内膜細胞の数
に関する発現レベルは、必要であると考えられる。
【００７９】
信頼性のある診断を可能とするために、標準化は、さらに、試料内の指定された細胞性
構成要素の有無の検出、さらに特定の細胞種類の総レベルの検出、または特定の細胞種類
が試料中の全細胞数に関与する分画の検出を含むことが可能である。
【００８０】
したがって、一実施形態では、ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の検出されたレベルは、特
定の試料に見受けられる細胞学的状態に標準化される可能性がある。ｐ１６ＩＮＫ４ａタ
ンパク質の検出レベルがｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現している子宮頚部細胞を示す場合、
または試料に子宮内膜細胞が過剰に存在する場に、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現を模倣す
ること言われている。この点で、標準化は分子マーカーを基礎として子宮頚部試料内で子
宮内膜細胞の量の決定することを含むものであってもよい。例えば分子マーカーによって
評価される子宮内膜細胞量に対して、子宮頚部試料で決定される医学的に関連した状態の
マーカーとしてのｐ１６ＩＮＫ４ａのレベルを比較することで、ｐ１６の総量が試料溶液
内に存在する子宮内膜細胞のみから生ずるかどうかを述べることが可能である。したがっ
て、子宮内膜細胞の高レベルの存在に起因しているｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する子宮
頚部上皮異形成の診断での偽陽性結果は、除外される可能性がある。本発明の文脈で使用
されるように、量は定量的または半定量的評価のことを言及することができる。このこと
は、例えば、細胞の総数の評価または細胞総数に対する分画の評価を含むものであっても
よい。本発明の特定の実施形態では、量の決定は、特定種類の細胞に起因する全体的なマ
ーカー・レベルの分画の評価に言及することが可能である。
【００８１】
子宮頚部標本評価のための標準化マーカーを提供するために、いくつかの標準化マーカ
ーが有用であると思われ、また、例えば以下から選択してもよい。すなわち、サイトケラ
チン、Ｅ−カドヘリン、インボルクリン、ウロキナーゼ様プラスミノーゲン−アクチベー
ター、ＳＣＣＡ（扁平上皮細胞癌抗原）、カテニン（例えばアルファ・カテニン、ベータ
・カテニン、ガンマ・カテニン（プラコグロビン））、Ｅｐ−Ｃａｍ。
【００８２】
標準化マーカーのいくつかの候補を、子宮頚部標本の特徴づけでの該標準化マーカーの
特性について、調べた。その結果を表２および表３に示す。
【００８３】
【表２−１】
【００８４】
【表２−２】
【００８５】
【表３】
【００８６】
標準化のためのマーカーを、例えば特異的細胞分化パターン、例えば特異的な上皮細胞
としての分化もしくは最終分化を表すマーカーとして、適用することが可能である。特定
の実施形態では、標準化マーカーは、例えば子宮頚部試料での子宮膣部細胞の存在を示す
扁平上皮細胞に対して特有のマーカー分子であってもよい。適当なマーカーとして、例え
ばＣＫ１３、Ｅカドヘリン、ガンマ・カテニン、またはインボルクリンを挙げることが可
能である。別の実施形態では、マーカーは、標本内での子宮頸管内細胞の存在を示す円柱
上皮細胞の存在に対して特異的なものであってもよい。適当なマーカーとして、Ｅｐ−Ｃ
ａｍ、ＣＫ１８、およびＣＫ８が挙げられる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、標準化は一般に上皮細胞の検出を含むものであってもよい。
これらのケースでは、上皮細胞の検出に適した任意のマーカーを使用することが可能であ
る。マーカーとして、例えば、図２および図３に示したものを用いることが可能である。
【００８８】
本発明のさらに別の実施形態では、本明細書に開示した方法は、呼吸器官の疾患を検出
するために使用することが可能である。小細胞肺癌の診断で、ニューロン特異的エノラー
ゼ（ＮＳＥ）の検出は、用いたマーカーのうちの１つである。腫瘍標本の試料は、ブラシ
または気管支肺胞性ラビッジによる細胞を集める気管支鏡検査法によって与えられる。Ｎ
ＳＥが肺内のわずかな正常細胞でも発現されることから、溶解した試料で検出されるＮＳ
Ｅ発現のレベルは、該試料内に存在する細胞の量を検出するための標準化マーカー（例え
ば、アクチン）と関連づけられなければならない。
【００８９】
本発明の第３の実施形態は、消化管（例えば大便試料からの結腸直腸病変）の病変の発
見である。この場合、指標核酸の起源および／または大便試料で検出可能なポリペプチド
は、診断の評価のために重要であると思われる。本発明によれば、使用されたマーカー分
子の起源（細胞種類／生物体）を決定することが可能である。このように、例えば、消化
管の粘膜の病変から生ずるマーカー分子よりもむしろ、個人によって摂取される食品から
生じているマーカー分子の検出にもとづく結果を、除去することが可能である。さらに、
血液循環からマーカーの痕跡の存在によって生じたアーチファクト、あるいは嚥下された
痰から生じるアーチファクト等は、本明細書に開示した方法を用いて取り除くことが可能
である。
【００９０】
本発明の別の態様は、本発明にもとづく方法を実施するための試験キットである。この
キットは、例えば診断キット、分析キット、または研究キットとすることができる。
【００９１】
本発明にもとづいて使用されるように、キットという用語は、診断装置と同様にキット
を含むものであってもよい。キットまたは装置は、例えばＥＬＩＳＡ（例えば、サンドイ
ッチ、競合、非競合等）、ＥＩＡ（競合、非競合他）、ＲＩＡ試験、ビーズをベースとす
る試験系、ラテラルフローアッセイ、フロー・スルー・アッセイ、ストリップ試験アッセ
イ、ディップ・スティック・アッセイ、またはラボラトリー、ベンチ・トップ、もしくは
ポイント・オブ・ケア試験フォーマット用に設計されたものであってもよい。本発明にも
とづくキットは、いくつかの実施形態では、診断試験を実施するためのインビトロ診断装
置を含むものであってもよい。インビトロ診断装置は、例えば当業者に公知のいずれかの
ＥＬＩＳＡ装置であってもよい。これらの装置は、サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマット
、競合的ＥＬＩＳＡフォーマット、および他のいずれかのＥＬＩＳＡフォーマットのため
の装置を含む。別の実施形態では、インビトロ診断装置はラテラルフローアッセイ装置、
またはフロー・スルー・アッセイ装置であってもよく、例えば、医学的に関連した状態に
対して特有のマーカーに結合する少なくとも１種類の試薬と、標準化マーカーに結合する
１種類の試薬とを用いるもので、これらの試薬は両方とも固相に固定される。そのような
装置は、試験結果を視覚化するために種々のメカニズムを用いることができる。特定の実
施形態では、上記試験は検出可能な部分に結合したマーカー分子に対する二次検出試薬を
用いることが可能である。検出可能な部分とは、金コロイド、（着色）ラテックス・ビー
ズ等を用いることが可能である。
【００９２】
さらに別の実施形態では、インビトロ診断検査装置は、毛細管または多孔性部材（例え
ば膜、ビーズまたは多孔性物質からなる他の三次元配列）にもとづいたフロー・スルー・
アッセイ装置であってもよい。実施形態にもとづくと、孔または毛細管のサイズは、最適
なフロー状態を確保するように調整される必要がある。
【００９３】
本発明にもとづくキットは、
（ａ）マーカー分子を検出するための試薬と、
（ｂ）検出反応を実施するために一般に用いられる試薬および緩衝液、例えば緩衝液、
検出マーカー、担体物質、およびその他と、
（ｃ）１種類以上のマーカーならびに／またはポジティブおよび／もしくはコントロー
ル反応を実行するための、診断すべき医学的に関連した状態を代表する試料と、
（ｄ）ポジティブおよび／またはコントロール反応を実行するための１種類以上の標準
化マーカー試料と、
を含むものであってもよい。
【００９４】
試験キットは、原試料を可溶化するために、任意に溶解緩衝液を含むものであってもよ
い。通常、溶解緩衝液は当業者に公知の適当な溶媒のいずれであってもよい。上記キット
で使用する溶解緩衝液は、例えばカオトロピック剤（例えば、尿素、ＧｕａＳＣＮ、ホル
ムアミド）、陰イオン洗浄剤（例えば、ＳＤＳ、Ｎ−ラウリル・サルコシン、デオキシコ
ール酸ナトリウム、アルキル・アリール・スルホン酸塩、長鎖（脂肪）アルコール硫酸塩
、オレフィン硫酸塩およびスルホン酸塩、アルファ・オレフィン硫酸塩およびスルホン酸
塩、硫酸化モノグリセリド、硫酸化エーテル、スルホコハク酸塩、アルカン・スルホン酸
塩、リン酸塩エステル、アルキル・イセチオン酸塩、ショ糖エステル）、陽イオン性界面
活性剤（例えば、セチル・トリメチルアンモニウム塩）、非イオン性界面活性剤（例えば
Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＮＰ−４０
、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、Ｎ−オクチル・グルコシド）または両性界面活性剤（例
えば、ＣＨＡＰＳ、３−ドデシル−ジメチルアンモニア−プロパン−１−スルホネート、
ラウリルジメチルアミン・オキシド）、および／またはＮａＯＨもしくはＫＯＨ等のアル
カリ水酸化物が考えられる。溶解緩衝液の例を表４に示す。
【００９５】
（表４）
溶解緩衝液 ウエスタン・ブロットでの ELISAとの適合性
ｐ１６１ＮＫ４ａの可溶化
界面活性剤：
0.1-1% SDS ＋ ＋／−
0.2-3% SDS ＋ ＜０．５％
0.2-3% DOC ＋＋ ＋／−
0.1-1% n-オクチルグリコシド ＋ あり
0.1-3% Triton X-100 ＋ あり
0.1-1% CHAPS ＋ ｎｄ。
【００９６】
界面活性剤−混合物：
RIPA(1%NP40、0.5%DOC、 ＋＋ あり
0.1%SDS、PBS)40-100%
SOX(0.5%DOC、0.5% ＋ あり
n-オクチルグリコシド)40-100%
mtm溶解緩衝液 ＋＋ あり
(3%TritonX-100,0.4%SDS,PBS)。
【００９７】
市販の溶解緩衝液：
Dynal(Dynal,Oslo,Norway) ＋＋ あり
M-PER/B-PER ＋＋ あり
(Pierce,Rockford,IL)
その他：
０．５〜８Ｍ尿素含有ＰＢＳ ＋＋＋ 適合性＜２M
Ｌａｍｍｌｉ試料緩衝液 ＋＋＋ なし
１０〜８０％ DMSO ＋＋＋ なし
１０〜８０％ホルムアミド ｎｄ なし
５０〜７０％ギ酸 ＋＋ なし
ＰＢＳ ＋／− あり
クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０） ＋／− あり
50mMNaCl含有リン酸緩衝液 ＋／− あり
ｎｄ：決定されず ＋／−：劣、＋：良好、＋＋：非常に良好、＋＋＋：優。
【００９８】
いくつかの実施形態では、溶解緩衝液は、原試料に含まれる構成要素の分解を妨げる１
種類以上の試薬をさらに含むものであってもよい。そのような構成要素は、例えば、酵素
阻害剤であり、例えばプロテアーゼ阻害剤、ＲＮＡアーゼ阻害剤、ＤＮアーゼ阻害剤等を
挙げることが可能である。阻害剤は、例えば、表５に挙げた組成物から選択されたプロテ
アーゼ阻害剤を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、分解の阻害剤を提供
する目的で溶解緩衝液は、試料中でのｐ１６の検出を可能とする。いくつかの実施形態で
は、サイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６が可溶化試料で分解されることで、そ
れが検出されなくなる可能性がある。もし試料が溶解媒体に直接送られて一定の期間そこ
で保存される場合、このことは、特にあてはまる。
【００９９】
（表５）
インヒビター 阻害された 濃度 水への溶解度 水中安定性
プロテアーゼ
のクラス
アプロチニン セリン 0.6-2μg/ml 非常に良好 良好
ベンズアミジン セリン 0.5-4mM 良好 良好
ベスタチン アミノペプチダーゼ 1-10μM 良好 良好
カルペプチン システイン 0.3-1μM 良好 良好
シスタチン システイン 1μM 良好 良好
Ｅ−６４ システイン 1-10μM 良好 良好
ＥＤＴＡ 金属 0.5-5mM 良好 良好
(Metallo)
エラスタチナル セリン 0.5-2μg/ml 劣 良好
ＥＳＴ システイン 20-50μg/ml 不良 劣
胎児血清 子牛全クラス 10％ 良好 良好
ロイペプチン セリン/システイン 10-100μM 良好 良好
ａ２− 全クラス 1μM 良好 良好
マクログロブリン
NCO-700 システイン 0.5-100mM 劣 劣
ペファブロク セリン 0.2-10μM 良好 非常に劣る
(Pefabloc=)
ＡＥＢＳＦ
ペプスタチンA アスパラギン 1μM 不良 劣
ＰＭＳＦ セリン 0.2-10μM 不良 非常に劣る
ｏ−フェナンスロリン 金属 1-10mM 不良 劣。
【０１００】
安定化を目的として、溶解緩衝液はまた、試料タンパク質と分解で競合するために、バ
ルク・タンパク質（例えばウシ血清アルブミンまたは仔牛血清アルブミンのようなアルブ
ミン、さもなければ他のバルク・タンパク質）を含むものであってもよい。バルク・タン
パク質を、例えば、プロテアーゼ阻害剤と組み合わせて、またはプロテアーゼ阻害剤の代
わりに添加してもよい。一実施形態では、試験のパフォーマンス（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、
またはストリップ試験パフォーマンス）と適合し、その結果、可溶性試料が直接試験に供
されるように、溶媒を選択することが可能である。上記文脈で用いられるように、試験は
マーカー分子の有無および／またはレベルを検出するための任意の手順を含むことが可能
である。
【０１０１】
マーカー分子を検出するための試薬は、マーカー分子と結合することが可能な任意の薬
剤を含むことが可能である。そのような試薬として、タンパク質、（ポリ）ペプチド、核
酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、糖タンパク質、プロテオグリカン、多糖類、または脂質が
挙げられる。
【０１０２】
医学的に関連した状態に対して特有のマーカーおよび／または正のコントロールおよび
／または負のコントロールをおこなう標準化マーカー試料は、例えば、溶液または塩等の
適用可能な形態にある核酸、適用可能な形態にあるペプチド、組織切片試料、微生物、ま
たはポジティブもしくはネガティブ細胞系統を含むものであってもよい。
【０１０３】
本発明の一実施形態では、マーカー分子の検出はポリペプチドのレベル上でおこなわれ
る。この実施形態では、結合剤は、例えば、マーカー分子またはそのフラグメントに対し
て特異的な抗体であってもよい。さらに、結合剤はＦａｂフラグメント等の抗原結合フラ
グメント、単一鎖抗体、二完能性ハイブリッド抗体、最小の抗原結合エピトープを含むペ
プチド模倣薬等を含むものであってもよい。さらに、上記結合剤は、マーカー分子上の特
異的炭化水素構造に対して結合するレクチンであるかもしれない。
【０１０４】
試験キットの別の実施形態では、マーカー分子の検出は、核酸レベル上でおこなわれる
。発明のこの実施形態で、検出のための試薬は、例えば上記マーカー核酸に対する核酸プ
ローブまたは逆相補性のプライマーであってもよい。
【０１０５】
以下の実施例は、説明することのみを目的としたものであり、本明細書に開示された発
明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１）子宮頚部切片での子宮頸管内上皮細胞および子宮膣部上皮細胞の特異的免
疫組織化学的検出
子宮頚部スワブの妥当性を示しているマーカーを評価するために、子宮頚部切片（４％
のホルムアルデヒド溶液で固定して、パラフィン包埋した）を、サイトケラチン１８（子
宮頸管内膜の円柱上皮のマーカー）およびサイトケラチン１０／１３（子宮膣部扁平上皮
のマーカー）とに対する抗体で染色した。図１は、抗サイトケラチン１８抗体による子宮
頸管内膜の上皮の特異的染色と、抗サイトケラチン１０／１３抗体による子宮膣部の特異
的染色を示す。実験は以下のように実施した。すなわち、
ホルマリン固定およびパラフィン包埋した切片を、キシレン浴５分間浸すことで脱パラ
フィン化し（ステップを１回繰り返した）、過剰の液体を取り除き、スライドを９５〜９
６％エタノールに３（±１）分間、７０％エタノールに３（±１）分間置き（ステップを
１回繰り返した）、最後に蒸留水に３０秒置いた。エピトープを回収するために、スライ
ドをコプリン・ジャーに置いて、１０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ ６．０で９５〜９９℃
、４０分間沸騰させた。この緩衝液中で、スライドを室温（ＲＴ）で２０分間（±１分）
冷やした。スライドをペルオキダーゼ遮断薬（３％Ｈ２Ｏ２；ＮａＮ３１５ｍＭ）で覆い
、室温で５（±１）分間インキュベートした。洗浄緩衝液で５分間洗浄した後、スライド
を一次抗体（ＣＫ１０／１３：ＤＥ−Ｋ１３、１：５０、ＤＡＫＯ；ＣＫ１８：Ｋ１８．
７、１μｇ／ｍｌ、ｄｉａｎｏｖａ）で３０分間インキュベートした。その後、スライド
を洗浄緩衝液ですすぎ、洗浄緩衝液で室温、５分間にわたって洗浄した。その後、ＥｎＶ
ｉｓｉｏｎ（抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ複合体；ＤＡＫＯを使用する用意がで
きている）で３０分間インキュベートし、スライドを３回、５分間洗浄し、さらにＤＡＢ
基質で１０分間インキュベートし、ヘマトキシリンによる対比染色をおこない、さらにフ
ァラマウント・マウンティング媒体によりマウントした。
【０１０７】
免疫組織化学的染色手順でサイトケラチン１８（ＣＫ１８）に対する抗体を用いること
で、子宮頚管内の円柱上皮で陽性反応が検出され（図１Ａ），その一方で子宮頸膣部の扁
平上皮では特異的染色が見られなかった（図１Ｂ）。サイトケラチン１０／１３（ＣＫ１
０／１３）に対する抗体による免疫組織化学的染色は、子宮頚管内の円柱上皮では何ら染
色がみられなかった（図１Ｃ）。その一方で、子宮頸膣部の扁平上皮が強く染色された（
図１Ｄ）。したがって、ＣＫ１８は、子宮頚管内の円柱上皮細胞検出のための特異的マー
カーとして、ＣＫ１０／１３は、子宮頚膣部の扁平上皮細胞検出のための特異的マーカー
として、用いることが可能である。
【０１０８】
（実施例２）子宮頚部スワブ由来の可溶化試料のウエスタン・ブロット分析
可溶化試料のウエスタン・ブロット分析が頚部病変の診断を評価することを可能にする
かどうかの評価をおこなうために、既知の診断による臨床試料を、試料材料の溶解の後、
マーカー分子に基づいて免疫化学的分析にかけた。
【０１０９】
臨床材料（子宮頚部スワブ）試料を標準的なウェスタン分析によって、以下のようにし
て分析をおこなった。
【０１１０】
要するに、超音波処理前に、臨床材料を第１ステップでＬａｒｍｉｌｉタンパク質試料
緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ．６．８，２％ ＳＤＳ，２００ ｍＭ ＤＴＴ，
０．０５％ ＢｐＢ）で沸騰（５分、９５℃）することで、該臨床材料を可溶化させた。
第２のステップでは、タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）に再
び溶解させ、その後、タンク・ブロッティングによって、ニトロセルロース膜に移した（
Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ：７６：４３５０−
４３５４）。さらなるステップでは、上記膜をブロックさせて非特異的抗体結合（１０％
脱脂乾燥乳含有ＰＢＳ）を防ぎ、続いて特異的モノクローナル・マウス抗体（ＣＫ８：３
５βＨ１１、１：１００、ＤＡＫＯ；ｐ１６ＩＮＫ４ａ；Ｄ７Ｄ７、１：１４０、ＭＴＭ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートした。特異的抗体の結合を光子放出基質
を触媒する西洋わさびペルオキシダーゼ共役二次試薬（マーカー特異的抗体に対して結合
）によって視覚化した。
【０１１１】
サイトケラチン８（ＣＫ８）を子宮頸管内膜の細胞特異的マーカーとして使用すること
で、本実験での試料回収の妥当性を示した。特異的疾患に関連したマーカーとして、サイ
クリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６ＩＮＫ４ａを用いた。
【０１１２】
本実験の結果を図２に示す。番号１ないし４は、個々の患者から得た試料（子宮頚部ス
ワブ）を示す。免疫ブロット検出は、サイトケラチン８（ＣＫ８）に対する特異的抗体と
ｐ１６ＩＮＫ４ａ（ｐ１６）に対する特異的結合とを用いて、おこなった。患者１、２、
および３の試料ではｐ１６ＩＮＫ４ａのシグナルが見られない。このことは、これらの試
料に異形成子宮頚部細胞が存在しないことを示している。患者４の試料は、ｐ１６ＩＮＫ
４ａの強いシグナルが見られる。このことは、試料に異形性子宮頚部細胞が存在すること
を示している。上側のバンドは、サイトケラチン８の特異的シグナルを示す。試料１、３
、および４では、サイトケラチン８を検出することができ、その一方で試料２ではシグナ
ルを見ることができない。このことは、子宮頸管内膜円柱細胞が試料１、３、および４に
存在し、試料２では存在しないことを示している。子宮頸管内膜円柱上皮細胞の存在が子
宮頚部スワブの妥当性に関するパラメータの１つであることから、試料２は不適当である
と考えられ、ｐ１６ＩＮＫ４ａの負の結果からはなんら診断結果を引き出すことはできな
い。試料１、３、４は、十分であるとみなされる。そのため、ｐＫ１６ＩＮＫ４ａについ
ての試料１および３のネガティブ・シグナルに基づいて、これらの患者は子宮頚部異形形
成を持たないことがわかった。試料４は、ｐＫ１６ＩＮＫ４ａに対する正のシグナルを示
し、この患者の異形子宮部病変の存在が示されている。
【０１１３】
複数のスワブの並行細胞学的分析をおこなうことで、女性１および３について通常の細
胞組成が示される。女性２では、細胞材料が乏しいため、なんら診断を得ることができな
かった。女性４では、高度の異形成が診断された。注目すべきことに、上側バンド（ＣＫ
８）が子宮頸管内膜の細胞特異的標準化マーカーであるサイトケラチン８を意味してお
り、試料収集の妥当性が示されている。下側バンドは、特異的疾患関連マーカーｐ１６Ｉ
ＮＫ４ａを示している。ブロットは、患者４について、高度子宮頚部異形成と整合したｐ
１６ＩＮＫ４ａの陽性シグナルを示す。患者１および３の試料は、ＣＫ８特異的バンドの
みを示し、適当な試料収集が示されているが、正常かつ健康な子宮頚部上皮と整合した疾
患関連したマーカー（ｐ１６ＩＮＫ４ａ）を示さない。患者２の試料は、この試料の低細
胞数と整合したＣＫ８シグナルを示さないことから、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対する負のシグ
ナルから診断結論を出すことはできない。
【０１１４】
（実施例３） 試料の妥当性を示すためのウエスタン・ブロットおよびＥＬＩＳＡ分析
試料の診断とは異なる溶液ベースの分析の結果が試料の妥当性によるものかどうかを評
価するために、診断（ＰａｐＩＶａおよびＰａｐＩＶｂの細胞学的診断にもとづいた高度
子宮頚部上皮内異常増殖）が確かめられた４人の異なる患者の子宮頚部スワブのウエスタ
ン・ブロット分析をおこなった。異形成細胞の存在を示すために、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対
する抗体を用いて、一方、試料の妥当性を示すためにＣＫ１８およびＣＫ１０／１３に対
する抗体を用いた。
【０１１５】
ウエスタン・ブロット分析を以下のようにおこなった。すなわち、患者試料を子宮頚部
ブラシで収集し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（２％ ＳＤＳ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
．６．８、０．０１％、１００ｍＭ ＤＴＴ）に、５分間、９５℃で直接溶解（１ｘ１０
７細胞／ｍｌ）、続いて超音波処理をおこなった（５ｘ５秒パルス、最大強度）。溶解物
を微小遠心器で遠心（１６，６００ｘｇ、１２分間）し、上清を新しい試験管に移した。
プレキャスト４〜２０％線形勾配アクリルアミド・ゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｓｙｓｔ
ｅｍ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に１０μｌ（１０５細胞）の全細胞抽出物を充填し、２５ｍＡの
定常電流を４５分間かけることでタンパク質を分離した。バイオ・ラッド・クライテリオ
ン・ブロッター（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｂｌｏｔｔｅｒ）を用いて標準
タンク・ブロッティングによりタンパク質をゲルからＨｙｂｏｎｄＥＣＬニトロセルロー
ス膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した（定常１００ボルトで１５分間、続いて定常５０ボル
トで４５分間）。ニトロセルロース膜をポンソーＳ溶液で５分間染色し、タンパク質の転
移を確認した。ＰＢＳによる２ｘ１０分間の洗浄によりポンソーＳ溶液を除去した。免疫
検出のために、ブロットをブロッキング緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含む１０％粉
ミルク含有ＰＢＳ）で一晩ブロックした。一次抗体は、攪拌しながら室温で１時間にわた
りブロッキング緩衝液中で製造元にしたがって希釈してインキュベートした（ＣＫ１８：
ＭＡＢ ３２３６），１：１０００，ＣＨＥＭＩＣＯＮ；ＣＫ１０／１３：ＤＥ−Ｋ１３
，１：５００，ＤＡＫＯ，ｐ１６ＩＮＫ４ａ：Ｄ７Ｄ７，１：１４０，ＭＴＭ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）。ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１０分間にわたり６回洗浄
した後、ブロットをウサギ抗マウスＨＲＰ（ＤＡＫＯ，ブロッキング緩衝液で１：５，０
００に希釈）により室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−
２０で１０分間にわたり６回洗浄した後、膜を基質溶液で５分間インキュベートし（Ｓｕ
ｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，
Ｐｉｅｒｃｅ）、プラスチック・エンベロープで包み、さらにＸ線フィルムに１〜５分
露出した。最後に、画像形成システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、Ｘ線フィルムを現像
、固定、乾燥、および記録した。同一の試料を用いてｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＣＫ １０／１
３、およびＣＫ１８についてＥＬＩＳＡ分析をおこなった。検出されたシグナルおよび結
果はウエスタン・ブロット分析に類似しており、同じ結論が導き出された。
【０１１６】
ＥＬＩＳＡ分析を以下のようにおこなった。すなわち、平底の９６穴（ウエル）プレー
ト（ＭａｘｉＳｏｒｂ； Ｎｕｎｃ）を一晩４℃で、捕捉抗体で被覆した（ｐ１６ＩＮＫ
４ａ： ＭＴＭ−Ｅ６Ｈ４，ＰＢＳ中 ２μｇ／ｍｌ，ＭＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ；ＣＫ１０：ＭＳ４８１Ｐ１ＡＢＸ，２μｇ／ｍｌ，ｄｉａｎｏｖａ；ＣＫ１８：Ｋ１
８．７，２μｇ／ｍｌ，ｄｉａｎｏｖａ；５０μｇｌ／ウエル）。プレートをＰＢＳ／０
．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）
でブロックした。子宮頚部スワブから得られた可溶化タンパク質抽出物をインキュベーシ
ョン緩衝液（ＰＢＳ，３％ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解
し、３連で各々のウエルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢ
Ｓ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、ビオチニル化検出抗体（ｐ１６ＩＮＫ４ａ
： ＭＴＭ−Ｄ７Ｄ７ （０．２ μｇ／ｍｌ， ＭＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
ＣＫ１０： ＭＳ４８１−ＢＯ， ２００ μｇ／ｍｌ， ｄｉａｎｏｖａ； ＣＫ１
８： ＭＳ１４２−ＢＯ， ２００ μｇ／ｍｌ， ｄｉａｎｏｖａ；インキュベーショ
ン緩衝液中）と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０Ｔ
ＭＢによる洗浄を６回行った後、５０μｌのストレプトアビジン被覆アルカリ・ホスファ
ターゼ（１：１０００希釈；Ｄｉａｎｏｖａ）を３０分間にわたり加えた。その後、プレ
ートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、１００μｌのｐ−ニトロフェニ
ル・ホスファターゼ基質（ＰｎＰＰ；ジエタノール・アミン緩衝液に溶解）を各々のウェ
ルに加えた。３０分後、１時間後、および２時間後に、ＥＬＩＳＡ読取装置（Ｔｅｃａｎ
）でＯＤ４０５ｎｍ（６２０ｎｍ参照波長）を測定した。本実施例は、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡフォーマットが、本発明にもとづいた方法での使用に適している感度を示すことを
示した。本明細書に開示された方法で使用するために、この実施例で述べたように、サン
ドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを複数のマーカー分子、例えば標準化／妥当性のマーカ
ーおよび医学的に関連した状態に対して特有のマーカーに対して適用可能である。
【０１１７】
高度子宮頚部異形成（「診断」を参照のこと）にかかっている４人の患者の試料を、ウ
エスタン・ブロット分析（図面の上側パネル）を用いて分析した。免疫ブロット検出が、
左側のブロットに対してはβアクチンおよびｐ１６ＩＮＫ４ａに対して特異的な抗体を用
いておこなわれ、中間のブロットに対しては、サイトケラチン１０／１３に対して特異的
な抗体を用いておこなわれ、さらに右側のブロットに対しては、サイトケラチン１８に特
異的な抗体が用いられた。βアクチン、ＣＫ１８、およびＣＫ１０／１３を、試料の妥当
性を実証するマーカとして使用した。βアクチンは任意の細胞の存在を示し、ＣＫ１０／
１３は子宮膣部扁平上皮細胞の存在を示し、またＣＫ１８は子宮頸管内膜円柱細胞の存在
を示す。
【０１１８】
図３に示すように、患者１および２の試料について、免疫ブロット検出は、全ての適用
された妥当性マーカー（ＣＫ１０／１３、ＣＫ１８、β−アクチン）に対して、また異形
成細胞を示すマーカー（ｐ１６ＩＮＫ４ａ）に対して、正のシグナルを示す。試料３およ
び４は、ウエスタン・ブロットでのｐ１６ＩＮＫ４ａバンドに関してネガティブ（負）で
あった。しかし、これらのケースでは、βアクチンおよび２種類のサイトケラチン・マー
カーは非常に弱い（患者３、βアクチン）または負の（患者４、すべてのマーカー；患者
３、ＣＫマーカー）シグナルをウェスタンブロットにおいて示す。したがって、ｐ１６Ｉ
ＮＫ４ａに対する負のシグナルから導き出される診断結果はない。
【０１１９】
この図の下側のパネルは、ＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。妥当性マーカー（ＣＫ１０／
１３，ＣＫ１８）の正のシグナルが患者１および２の試料について検出され、一方患者３
および４の試料についてはＣＫ１０／１３およびＣＫ１８に対する信号が検出されない。
したがって、ＥＬＩＳＡ分析結果は、ウエスタン・ブロット分析結果と類似しており、同
一の結論を導き出すことができる。
【０１２０】
（実施例４）肺起源の異なる試料のウエスタン・ブロット分析
可溶化試料のウエスタン・ブロット分析が肺病変の診断を可能とするかどうかを評価す
るために、既知の診断による臨床試料を可溶化し、マーカーおよび標準化分子に基づいた
免疫化学的分析にかけた。
【０１２１】
臨床試料（ブラッシングまたは気管支肺胞洗浄液によって集められる細胞）を、次のよ
うに標準的ウエスタン・ブロットによって分析した。気管支肺胞洗浄液から得た細胞を遠
心（１０００ｒｐｍ、５分）によってペレットにし、該ペレットをＬａｍｍｌｉタンパク
質試料緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ．６．８、２％ＳＤＳ、２００ｍＭのＤＴＴ
、０．０５％のＢｐＢ）に溶かした。ブラッシングによって得られる細胞を、直接Ｌａｍ
ｍｌｉタンパク質試料緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ．６．８、２％のＳＤＳ、２
００ｍＭのＤＴＴ、０．０５％のＢｐＢ）に溶かした。材料を、超音波処理に先立って沸
騰させた５分、９５℃）。第２のステップでは、タンパク質試料のアリコートをＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）で二連に分析し、続いてタンク・ブロッティングによ
りニトロセルロース膜に移した（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ；７６：４３５０−４３５４）。さらに別のステップでは、膜をブロックし
て非特異的な抗体結合（１０％無脂肪乾燥乳 PBS中）を防ぎ、続いて１枚の膜をＮＳＥ
に対する特異的モノクローナル・マウス抗体とインキュベートした（ＤＡＫＯ Ｇｅｒｍ
ａｎｙ，クローンＢＳＳ／ＮＣ／ＶＩ−Ｈ１４，マウス・モノクローナル抗体，希釈 １
：１０００；）。さらに、一枚の膜を標準化マーカー・アクチンとインキュベートした（
ＩＣＮ，ＵＳＡ，クローンＣ４，マウス・モノクローナル，希釈１：４００）。特異的抗
体の結合は、光子放出基質を触媒する第二の試薬（マーカー特異的抗体と結合）と共役し
た西洋わさびペルオキシダーゼによって、可視化された。
【０１２２】
既知の小細胞肺癌を持つ患者の気管支肺胞内洗浄液では、アクチンの発現レベルと比較
して高いレベルのＮＳＥが検出され、一方、腫瘍のない患者ではわずかなＮＳＥも見つけ
られることができなかったが、アクチン・レベルは癌患者のレベルと同等だった（データ
示さず）。
【０１２３】
結果は、本明細書に示した方法にもとづく溶液ベースの試験手順の標準化によって、形
態学的な情報に頼ることなく、疾患の診断を評価することが可能となることを示している
。
【０１２４】
（実施例５）ＥＬＩＳＡ試験フォーマットでの子宮頚部上皮内異常増殖の検出
溶解緩衝液内で得られる３４種類の子宮頚部スワブに対して、該スワブ内に含有される
細胞から調製した溶液中の、サイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６ＩＮＫ４ａの
過剰発現のＥＬＩＳＡベースの検出をおこなった。ＥＬＩＳＡ試験は以下のように実行し
た。
【０１２５】
（Ａ）細胞溶解
・子宮頚部スワブ・ブラシを、ｍｔｍ溶解緩衝液２ｍｌを含有する１５ｍｌ容器に入れる
。該ブラシに存在する子宮頚部細胞を少なくとも２０時間溶解する。その後、子宮頚部ス
ワブ試料の溶解物を２ｍｌ管に移し、４℃で遠心する（２８，０００ｘｇ（１６，６００
ｒｐｍ Ｈｉｇｈｓｐｅｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＪＥＣ Ｍｕｌｔｉ ＲＦ）で１
５分）。上清を新たな管に移す。場合に応じて、上清を−２０℃で保存することが可能で
ある。
【０１２６】
（Ｂ）ＥＬＩＳＡの実行
（ＥＬＩＳＡプレートのコーティング）
・ｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的抗体クローンｍｔｍ Ｅ６Ｈ４、Ｅｐ−Ｃａｍ特異的抗体Ｂｅ
ｒ−Ｅｐ４、およびガンマ・カテニン特異的抗体クローン１５の原液をＰＢＳで希釈し、
即時使用可能なコーティング溶液とする。
・即時使用可能な捕捉抗体コーティング溶液をそれぞれ５０μｌずつＥＬＩＳＡプレート
に添加する。
・コーティングのために、該プレートを４℃で一晩インキュベートする。
・コーティング溶液をＥＬＩＳＡプレートから除去し、該プレートを、自動ＥＬＩＳＡ洗
浄器を用いて以下のように洗浄する。すなわち、
洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）含有ＰＢＳ）２５０μｌを用いて７回。
・洗浄緩衝液の残りを除去した後、３００μｌブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ含有ＰＢ
Ｓ）を各ウェルに添加する。振動装置上で、プレートを外界温度で１時間インキュベート
する。
【０１２７】
（試料を用いたインキュベーション）
・ブロッキング緩衝液を除去した後、溶解した細胞試料１００μｌを各ウェルに添加する
。ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびガンマ・カテニンを特異的に検出する抗体に対するポジティブ
・コントロールとしてＨｅＬａ細胞の溶解物を、Ｅｐ−Ｃａｍを特異的に検出する抗体に
対するポジティブ・コントロールとしてＨＴ２９細胞の溶解物を用いる。
・試験のキャリブレーションのために、異なる濃度の組み換え型ｐ１６タンパク質、組み
換え型ガンマ・カテニン、およびＥｐ−Ｃａｍ（０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、１００
ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ）を該試験に包含
する。
・試料を室温で１時間インキュベートする。
・その後、自動ＥＬＩＳＡ洗浄器で以下のように洗浄を実行する。すなわち、
洗浄緩衝液２５０μｌを用いて７回。残存する緩衝液を除去する。
【０１２８】
（検出用抗体を用いたインキュベーション）
・ビオチン標識２次抗体（ｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的クローンｍｔｍ Ｄ７Ｄ７、Ｅｐ−Ｃ
ａｍ特異的クローンＡ５Ｂ４、およびガンマ・カテニン特異的クローンＭＡＢ２０８３）
のワーキング溶液を原液の希釈によって調製する。
・ビオチン標識２次抗体ワーキング溶液１００μｌを、対応する抗原および捕捉抗体でイ
ンキュベートしたウェルに添加する。ＲＴでの１時間のインキュベーション後、抗体溶液
を除去して、ＥＬＩＳＡプレートを自動ＥＬＩＳＡ洗浄器によって洗浄する。
・すなわち、洗浄緩衝液２５０μｌを用いて７回。
【０１２９】
（検出）
・ストレプトアビジン・ＨＲＰ・高分子（１ｍｇ／ｍｌ）を１：１０で前希釈（４μｌ＋
３６μｌインキュベーション緩衝液）する。インキュベーション緩衝液（０．１％ＢＳＡ
含有ＰＢＳ）で１：３００の希釈によって、最終インキュベーション溶液を調製し、最終
濃度０．３３μｇ／ｍｌにする。
・この溶液の１００μｌを各ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートする。
・その後、該緩衝液を除去し、１ウェル当たり２００μｌの洗浄緩衝液を用いて、該プレ
ートを手動で５回洗浄する。
【０１３０】
（基質のインキュベーション）
・暗所で、ＴＭＢ基質を１時間２５℃に平衡させる。
・基質溶液１００μｌを各ウェルに添加する。
・暗所で、ＥＬＩＳＡプレートを２５℃で厳密に１５分間インキュベートする。２．５Ｍ
Ｈ２ＳＯ４を８０μｌ添加して、反応を停止させる。
・反応を停止して５分以内に、ＯＤ４５０ｎｍを測定する。結果を評価した後、各試料の
該ＯＤに対する値を得る。
【０１３１】
（結果の評価）
・試料の妥当性としては、最小限の細胞の適切なサンプリングを証明するために、ガンマ
・カテニン用の全ての試料のＯＤ値が所定の閾値を超えていなければならない。適切なサ
ンプリングをさらに確実にするためには、子宮頸管内膜の細胞の存在を示すＥｐ−Ｃａｍ
のＯＤ値に対する閾値を超えていなければならない。
・異形成細胞の検出のために、最小限のｐ１６陽性異形成細胞の存在を証明するために、
ｐ１６ＩＮＫ４に対するＯＤ値が所定の閾値を超えていなければならない。
・この実験結果を表６に示す。
【０１３２】
（表６）
試料数 ｐ１６ＩＮＫ４ａ ガンマ・カテニン 結論
３ ＋ ＋ 試料は妥当である
ｐ１６ＩＮＫ４ａは、異形成細胞の存在を
示す
３０ − ＋ 試料は妥当である
検出可能なｐ１６ＩＮＫ４ａの不在は、
異形成細胞の不在を示す
１ − − 試料は妥当ではない
再サンプリングが必要である。
【０１３３】
３４種類の試料のｐ１６ＩＮＫ４ａおよびガンマ・カテニンに対するＯＤ値と対応する
閾値との比較によって、３３種類の試料が妥当であり、さらに評価されうることが明らか
になった。これらの３３種類の試料のうち、３０種類の試料がｐ１６ＩＮＫ４ａに対して
陰性であり、３種類が陽性であった。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡの結果を、同患者から得たパパニコラウ試験（ＰＡＰ試験、子宮頚部細胞学
）の診断結果と比較した。Ｍｕｎｉｃｈ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＩＩ （１９
９０）に準じて、子宮頚部細胞学を評価した。イン・サイチュで、ＰａｐＩＩは、良性細
胞、子宮頸管炎、および化生を包含し、ＰａｐＩＶは、重度異形成および癌腫を包含する
。ＥＬＩＳＡで０．９より大きいｐ１６ＩＮＫ４ａに対するＯＤを得た試料は、従来の細
胞学的ＰＡＰ試験によって異型性として分類される試料に対応することが判明した。
【０１３５】
試料の評価のために、ＯＤ０．９を閾値として適用すると、ＥＬＩＳＡの結果を以下の
ように報告することが可能である。
【０１３６】
（表７）
診断／ELISA結果 ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性ELISA ｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性ELISA
ＰａｐＩＩ ０ ３０
ＰａｐＩＶ ３ ０
不十分な細胞 ０ １。
【０１３７】
ＥＬＩＳＡ試験は、重度の異形成を有する女性由来の３種類の試料全てで陽性（１００
％）であり、異形成ではない女性の３０種類の試料全てで陰性（１００％）である。１つ
の試料のみが非常に少ない細胞を含有していたため、サンプリングが妥当ではないので評
価から除外した。
【０１３８】
上皮細胞の存在に特有の標準化マーカーに対する、可溶化した患者試料内のｐ１６ＩＮ
Ｋ４ａタンパク質レベルの標準化によって、該試料由来の異形成の診断を評価することが
可能になる。この場合の標準化によって、特に、妥当ではないサンプリング（例えば、分
析を実行するために十分ではない患者材料の総量、または正しい解剖学的位置で採取され
ていない患者材料）による偽陰性結果を避けることが可能になる。ＥＬＩＳＡで測定され
たガンマ・カテニン標準化マーカーに対するＯＤの閾値を適用することによって、試験フ
ォーマットで標準化を実行する。該試料は、該閾値を超えると妥当であるとして分類され
る。特定の閾値（２００，０００個の扁平上皮子宮膣部細胞に対応）未満では、該試料は
、患者材料の妥当量を含有していない。子宮頸管内膜の細胞の存在を示す第２の標準化マ
ーカーを用いることによって、該試料の妥当性について更なる情報がもたらされる。ＥＬ
ＩＳＡで測定されたＥｐ−Ｃａｍ標準化マーカーに対するＯＤの閾値を適用することによ
って、試験フォーマットで標準化を実行する。該試料は、該閾値を超えると妥当であると
して分類される。特定の閾値（２０００個の円柱子宮頸管内膜の細胞に対応）未満では、
該試料は、子宮頸管内膜の細胞の妥当量を含有していない。（この実施例で適用する閾値
は特定の反応条件に合わせていないことが理解されなければならない。ＯＤと同様に細胞
に対する値も、反応条件によって変わり得る。したがって、本明細書での値は、条件を例
示することを意図しており、本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、特定の試
験フォーマットに対する適切な閾値をどのように確立するかについて知っている）。子宮
頸管内膜の細胞の存在によって、スワブまたはブラシが子宮頚内膜の円柱上皮と接触して
いたという情報が与えられ、したがって、子宮頚部上皮異形成が通常発生する変性地帯と
スワブまたはブラシの接触を示唆する。具体的には、特定量の子宮頸管内の細胞（Ｅｐ−
Ｃａｍ）と合わせて特定量の子宮膣部細胞（ガンマ・カテニン）を検出することによって
、患者材料が正しい解剖学的位置（子宮頚部変性地帯）で採取されたという情報が高い確
率で得られる。
【０１３９】
これらの実験で評価された閾値を用いて、３００人の患者の細胞学的標本を、提示した
ＥＬＩＳＡ試験フォーマットで試験した。この実験では、細胞学的検査によって異形成で
あると示された標本は、ＥＬＩＳＡ試験フォーマットでもまた、異形成であると示されう
る。
【０１４０】
（実施例６）ＥＬＩＳＡ試験フォーマットでの子宮頚部上皮内異常増殖の検出
溶解緩衝液内で得られる実施例５ですでに用いた３４種類の子宮頚部スワブに対して、該
スワブ内に含有される細胞から調製した溶液内で、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質および１種類
の妥当性用マーカーの過剰増殖のＥＬＩＳＡベースの検出をおこなった。ＥＬＩＳＡ試験
は以下のように実行した。
【０１４１】
（Ａ）細胞溶解
子宮頚部スワブ・ブラシを、ｍｔｍ溶解緩衝液２ｍｌを含有する１５ｍｌ容器に入れる
。該ブラシに存在する子宮頚部細胞を少なくとも２０時間溶解する。その後、子宮頚部ス
ワブ試料の溶解物を２ｍｌ管に移し、４℃で遠心する（２８，０００ｘｇ（１６，６００
ｒｐｍ Ｈｉｇｈｓｐｅｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＪＥＣ Ｍｕｌｔｉ ＲＦ）で１
５分）。上清を新たな管に移す。場合に応じて、上清を−２０℃で保存することが可能で
ある。
【０１４２】
（Ｂ）ＥＬＩＳＡの実行
・ＥＬＩＳＡプレートのコーティング
・Ｅ７特異的抗体クローンＮＭ２およびガンマ・カテニン特異的抗体クローン１５の原液
をＰＢＳで希釈し、即時使用可能なコーティング溶液とする。
・即時使用可能な捕捉抗体コーティング溶液をそれぞれ５０μｌずつＥＬＩＳＡプレート
に添加する。
・コーティングのために、該プレートを４℃で一晩インキュベートする。
・コーティング溶液をＥＬＩＳＡプレートから除去し、該プレートを、自動ＥＬＩＳＡ洗
浄器を用いて以下のように洗浄する。すなわち、
洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）含有ＰＢＳ）２５０μｌを用いて７回
。
・洗浄緩衝液の残りを除去した後、ブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）３００
μｌを各ウェルに添加する。振動装置上で、プレートを外界温度で１時間インキュベート
する。
【０１４３】
（試料とのインキュベーション）
・ブロッキング緩衝液を除去した後、溶解した細胞試料１００μｌを各ウェルに添加する
。ガンマ・カテニンを特異的に検出する抗体に対するポジティブ・コントロールとしてＨ
ｅＬａ細胞の溶解物を用いる。試験のキャリブレーションのために、異なる濃度の組み換
え型ＨＰＶ １６ Ｅ７タンパク質および組み換え型ガンマ・カテニン（０ｐｇ／ｍｌ、
５０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、８００ｐｇ
／ｍｌ）を該試験に包含する。
・試料を室温で１時間インキュベートする。
・その後、自動ＥＬＩＳＡ洗浄器で以下のように洗浄を実行する。すなわち、
・洗浄緩衝液２５０μｌを用いて７回。残存する緩衝液を除去する。
【０１４４】
（検出用抗体とのインキュベーション）
・ビオチン標識２次抗体（ＨＰＶ １６ Ｅ７タンパク質特異的クローンＮＭ１３および
ガンマ・カテニン特異的クローンＭＡＢ２０８３）のワーキング溶液を原液の希釈によっ
て調製する。
・ビオチン標識２次抗体ワーキング溶液１００μｌをウェルに添加して、対応する抗原お
よび捕捉抗体とインキュベートする。ＲＴでの１時間のインキュベーション後、抗体溶液
を除去して、ＥＬＩＳＡプレートを自動ＥＬＩＳＡ洗浄器によって洗浄する。
・すなわち、洗浄緩衝液２５０μｌを用いて７回。
【０１４５】
（検出）
・ストレプトアビジン・ＨＲＰ・高分子（１ｍｇ／ｍｌ）を１：１０で前希釈（４μｌ＋
３６μｌインキュベーション緩衝液）する。インキュベーション緩衝液（０．１％ＢＳＡ
含有ＰＢＳ）中の１：３００の希釈によって、最終インキュベーション溶液を調製し、最
終濃度０．３３μｇ／ｍｌにする。
・この溶液の１００μｌを各ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートする。
・その後、該緩衝液を除去し、１ウェル当たり２００μｌの洗浄緩衝液を用いて、該プレ
ートを手動で５回洗浄する。
【０１４６】
（基質のインキュベーション）
・暗所で、ＴＭＢ基質を１時間２５℃に平衡させる。
・基質溶液１００μｌを各ウェルに添加する。
・暗所で、ＥＬＩＳＡプレートを２５℃で厳密に１５分間インキュベートする。２．５Ｍ
Ｈ２ＳＯ４を８０μｌ添加して、反応を停止させる。
・反応を停止して５分以内に、ＯＤ４５０ｎｍを測定する。結果を評価した後、各試料の
該ＯＤに対する値を得る。
【０１４７】
（結果の評価）
・試料の妥当性としては、最小限の上皮細胞の存在を証明するために、ガンマ・カテニン
用の全ての試料のＯＤ値が所定の閾値を超えていなければならない（実施例５参照）。
・異形成細胞の検出のために、最小限の変性細胞の存在を証明するために、ＨＰＶ １６
Ｅ７に対するＯＤ値が所定の閾値を超えていなければならない。閾値は、使用したＥＬ
ＩＳＡ条件に依存し、当試験フォーマットでは、ＯＤ０．７として設定した。
・３４種類の試料のＨＰＶ １６ Ｅ７およびガンマ・カテニンに対するＯＤ値と閾値と
の比較によって、３３種類の試料が、ガンマ・カテニンの検出によって、上皮細胞を含有
することが明らかになった。
【０１４８】
ここで、好ましい実施形態によって本発明を説明してきたが、本発明の範囲から逸脱せ
ずに、様々な変更が可能であることが理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的に関連した状態に対して特有の関連マーカーのレベルと、標準化マー
カーのレベルとを検出することで、医学的に関連した状態の診断をおこなう方法に関する
。この方法は、液相中の試料を特徴づけることに関係するもので、細胞をベースとした形
態学的な情報に依存することはない。
【背景技術】
【０００２】
現在、分子マーカーをツールとして用いて、多数の医学的に関連した状態の診断がおこ
なわれている。分子ツールは一般に、複雑な検査での１つの局面として用いられており、
検査すべき試料を特徴づける一連の異なるパラメータを考慮に入れる。
【０００３】
医学的に関連した分析では、細胞学的または組織学的手段による試料の形態学的検査が
一般に用いられている。細胞ベースの試料の形態学的特性にもとづくそのような方法は、
例えば、体液、血液、外科的摘出、分泌物、スワブ、または洗浄液等の臨床試料の分析に
、適用される。
【０００４】
子宮頸癌のスクリーニングでは、例えば、スワブを用いて子宮頸の新生物性病変の検出
がおこなわれる。このスクリーニング手順では、異なる起源の病変を区別しなければなら
ない。病原の原因は、例えば、炎症（感染因子または物理的もしくは化学的ダメージによ
る）または新生物発生前の変化および新生物性の変化であると考えられる。形態学的検査
では、特徴が異なる病変を複雑化して区別させる。したがって、スワブの検査について、
細胞学者および病理学者は、ことのほか訓練されなければならず、たとえ経験豊かな試験
官が細胞学的試料にもとづいた診断の評価における高度のオブザーバ間または内の相違を
有する。一般的に、検査の結果は、試験した病理学者／細胞学者による診断基準の主観的
な解釈にもとづく。その結果、スクリーニング試験での偽陽性の結果と偽陰性結果との割
合は、かなり満足できないままである。
【０００５】
したがって、多くのケースでは、これらの細胞学的または組織化学的検査手順が分子マ
ーカーの使用によってサポートされている。そのようなマーカーは、しばしば、免疫組織
化学的染色反応、あるいはインサイチュハイブリダイゼーション反応で使用される。形態
学的検査とマーカー分子をベースとした免疫組織化学的染色反応との従来の組み合わせは
、組織または細胞の医学的に関連した異なる状態に対して特有なものであり、強調された
結果が得られる場合がある。形態学的検査は、分子的方法によってサポートされてよりい
っそう信頼性のある結果が得られるようとしても、手間と時間とがかかり、そのため高価
なものとなる。さらに、形態学的細胞をベースとしたレベルでの診断は、分子パラメータ
によってサポートされている場合でさえ、各々の試験者による個人的な形態学的認識に支
配される。したがって、診断は検査を実行する人に左右される。
【０００６】
きわめて希なケースのみで、細胞ベースの形態学的検査によってさらにサポートされる
ことなく分子マーカーを診断用ツールとして用いることが可能である。このことは、とり
わけ、ある環境下でマーカーが検出されようとしている場合、正確に定義された条件下で
のみ生ずるケースである。したがって、細胞ベースの情報によるサポートなしで分子レベ
ルのみでの状態の診断方法は、特徴づけられる状態に対して曖昧なことなく特異的な適当
なマーカーが存在するようなケースに制限される。例えば、ウイルス感染の検出を試料溶
液中でおこなってもよい。なぜならば、組織中でのウイルスの存在に対して特有のマーカ
ーが、影響を受けていないヒト組織で生じない。
【０００７】
サポート用の分子ツールを用いることによって、検査結果の再現性を高めることができ
る。しかし、試料の保持および調製に関する問題を、単に分子マーカーをさらに使用する
ことで克服できるとは思えない。
【０００８】
細胞学的または組織化学的検査で分子ツールを使用する場合、アーチファクトおよび不
適当な試験結果にならないよう、試料を保存する際に厳しい予防策をとる必要がある。
このことは、細胞ベースの形態学的な情報が不安定であることに部分的に起因し、また検
出すべき試験中の分子マーカーの不安定性に部分的に起因する。もし試料の調製、輸送、
または保存が適切な方法でおこなわれなければ、細胞ベースの情報、または分子情報さえ
も失われるか、もしくは変えられる可能性がある。したがって、診断が不可能となるか、
アーチファクトが生じる傾向がある。例えば、生検または細胞学的調製は、細胞に傷害（
物理的または生化学的）が生ずるため、しばしば困難または不可能になる。組織試料また
は組織生検に関して、急速なターンオーバーにさらされる試料の分子構成要素の保存は、
適当な保存剤が全試料に浸透するまでの経過時間によって複雑化するように思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当該技術分野で日常的におこなわれている形態学的にサポートされた診断方法は、主な
欠点が２つある。第１に、方法が試験者の個人的な認識に大きく依存していることである
。第２に、形態学的情報は、減衰プロセスに対して感受性が高いので、試料調製後にアー
チファクトが生ずる可能性がある。両局面とも、結果の再現性が不適当なものとなる一因
となる。
【００１０】
医学的に関連した状態の診断を改善するために、細胞ベースの形態学的な情報に依存し
ない方法が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
患者の医学的に関連した状態を診断するための方法であって、
（ａ）細胞または細胞破片を含む原試料を患者から得るステップと、
（ｂ）該原試料から試料溶液を調製するステップと、
（ｃ）該試料溶液内で、該医学的に関連した状態に対して特徴的な１種類以上の関連マ
ーカーのレベルを検出するステップと、
（ｄ）以下の標準化パラメータ、すなわち、
−該試料中に示される細胞のうちの特定の細胞種類の有無、
−該試料溶液中に示される前記細胞の特定の分化様式の有無、および
−該試料溶液中に示される前記細胞の特定の増殖特性の有無、
の少なくとも１つに対して特徴的な１種類以上の標準化マーカーのレベルを決定するス
テップと、
（ｅ）該標準化パラメータの少なくとも１つに関して該１種類以上の関連マーカーの検
出されたレベルを標準化するステップと、
（ｆ）該標準化パラメータに対して該関連マーカーの標準化されたレベルにもとづいて
、前記医学的に関連した状態を診断するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
（項目２）
前記医学的に関連した状態は、試料中の特定の細胞種類の有無、該試料内の細胞に関連し
た特定の分化様式の有無、および該試料内での細胞の増殖特性の有無からなる群から選択
される特性によって特徴づけられる状態であることを特徴とする項目１に記載の方法。
（項目３）
前記医学的に関連した状態が疾患であることを特徴とする項目２に記載の方法。
（項目４）
前記疾患が、細胞増殖性疾患、癌、または前兆としての病変であることを特徴とする請求
項３に記載の方法。
（項目５）
前記癌が、頭部および頚部の癌、呼吸器官の癌、消化管の癌、皮膚およびその付属器の癌
、中枢および末梢神経系の癌、泌尿器系の癌、生殖器系の癌、肛門性器癌、内分泌系の癌
、軟組織および骨の癌、またはリンパ球産生系および造血系の癌であることを特徴とする
項目４に記載の方法。
（項目６）
前記原試料が、血液、分泌物、スワブ、吸引液、洗浄液、痰、唾液、大便、胆汁、細胞、
組織、生検採取物、または体液であることを特徴とする項目１に記載の方法。
（項目７）
前記試料が、真核生物または原核生物の細胞を含むことを特徴とする項目６に記載の方
法。
（項目８）
前記１種類以上の関連マーカーは、細胞周期調節タンパク質、メタロプロテイナーゼ、膜
貫通タンパク質、カルシウム結合タンパク質、成長因子、ウイルス感染に特徴的なマーカ
ー分子、細胞増殖マーカー、およびＤＮＡ複製に関連したマーカー、腫瘍マーカー・タン
パク質、および各々のタンパク質をコードする核酸からなる群から選択される項目１に
記載の方法。
（項目９）
前記腫瘍マーカー・タンパク質は、サイクリン依存性キナーゼインヒビター、ｐ５３、ｐ
Ｒｂ、ｐ１４ＡＲＦ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、ＭＮ、ｈｅｒ２／ｎ
ｅｕ、ｍｄｍ−２、ｂｃ１−２、ＥＧＦ−受容体、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣ
Ｍ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＤＣ２、ＣＤＣ６、ＣＤＣ７プロテインキナーゼ、ＣＤＣ
１４プロテインホスファターゼ、Ｄｂｆ４、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７、ＫｉＳ１、Ｉｄ１、オ
ステオポンチン、ＧＲＰ、腎性ジペプチダーゼ、およびＴＧＦβＩＩ受容体からなる群か
ら選択されることを特徴とする項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１３．５、ｐ１４
、ｐ１５、ｐ１９、ｐ２１、およびｐ２７からなる群から選択されることを特徴とする請
求項９に記載の方法。
（項目１１）
ウイルス感染に対して特徴的な前記マーカー分子が、ウイルス・タンパク質またはウイル
ス核酸であることを特徴とする項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記ウイルス・タンパク質または前記ウイルス核酸が、ＨＰＶ Ｌ１、ＨＰＶ Ｌ２、Ｈ
ＰＶ Ｅ１、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ４、ＨＰＶ Ｅ５、ＨＰＶ Ｅ６、およびＨＰＶ
Ｅ７からなる群から選択されるＨＰＶ遺伝子に由来するＨＰＶタンパク質または核酸で
あることを特徴とする項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記１種類以上の標準化マーカーは、細胞表面タンパク質、ハウスキーピング遺伝子、受
容体タンパク質、糖タンパク質および／またはプロテオグリカン、糖タンパク質および／
またはプロテオグリカンに特異的な炭水化物構造、細胞周期調節タンパク質、メタロプロ
テイナーゼ、膜貫通タンパク質、カルシウム結合タンパク質、成長因子、細胞分化マーカ
ー、およびＤＮＡ複製に関連したタンパク質からなる群から選択されることを特徴とする
項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記１種類以上の標準化マーカーが、上皮抗原、サイトケラチン、またはＣＤ抗原である
ことを特徴とする項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記１種類以上の標準化マーカーは、糖タンパク質、プロテオグリカン、およびこれらの
分子に存在する炭水化物構造からなる群から選択されることを特徴とする項目１３に記
載の方法。
（項目１６）
前記１種類以上の標準化マーカーは、糖タンパク質および／またはプロテオグリカンの生
合成にかかわる酵素であることを特徴とする項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記関連マーカーまたは前記標準化マーカーの検出は、前記マーカー分子を特異的に認識
および結合する少なくとも１種類のプローブを用いておこなわれることを特徴とする請求
項１に記載の方法。
（項目１８）
少なくとも１種類のプローブを検出可能に標識することを特徴とする項目１７に記載の
方法。
（項目１９）
前記プローブを、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、エレクトロルミネ
センス化合物、蛍光化合物、金属キレート、酵素、または生物学的に関連した結合構造に
よって、標識することを特徴とする項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記生物学的に関連した結合構造が、ビオチン、ストレプトアビジン、またはジゴキシゲ
ニンであることを特徴とする項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記少なくとも１種類のプローブが結合剤であることを特徴とする項目１７に記載の方
法。
（項目２２）
前記結合剤がマーカー・ポリペプチドに特異的に結合する項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記結合剤が、抗体、抗体フラグメント、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含むペ
プチド模倣物であることを特徴とする項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記少なくとも１種類のプローブが、炭水化物結合部位を含むレクチン、またはレクチン
によって特異的に認識される炭水化物であることを特徴とする項目１７に記載の方法。
（項目２５）
前記少なくとも１種類のプローブは、マーカー核酸に対して相補的または逆相補的である
核酸分子であり、前記プローブが前記マーカー核酸に対して特異的にハイブリダイズして
いることを特徴とする項目１７に記載の方法。
（項目２６）
前記検出が、定量的または半定量的増幅反応を含むことを特徴とする項目２５に記載の
方法。
（項目２７）
医学的に関連した状態を診断するための試験キットであって、
（ａ）医学的に関連した状態に対して特徴的な少なくとも１種類のマーカー分子を検出
するための少なくとも１種類の試薬と、
（ｂ）以下のパラメータ、すなわち、
特定の細胞種類または分化の有無、
前記試料溶液中に示される前記細胞の様式、および
前記試料溶液中に示される前記細胞に特有な増殖特性の有無、
の少なくとも１つに対して特徴的な少なくとも１種類の標準化マーカーを検出するための
少なくとも１種類の試薬と、
（ｃ）試料を溶解するための緩衝液と、
を含むことを特徴とする試験キット。
（項目２８）
少なくとも１種類の試薬が固相に固定されていることを特徴とする項目２７に記載の試
験キット。
（項目２９）
以下の成分、すなわち、
（ａ）（ｉ）医学的に関連した状態に対して特徴的な関連マーカー分子、ならびに
（ｉｉ）以下のパラメータ、すなわち、
前記試料溶液中に示される前記細胞の特定の分化様式の有無、
前記試料溶液中に示される前記細胞の特定の増殖特性の有無、
の少なくとも１つに対して特徴的な標準化マーカー分子、
からなる群から選択される、正のコントロール反応を行うための少なくとも１種類のマ
ーカー分子と、
（ｂ）前記検出反応を実行するために一般に用いられる試薬および緩衝液と、
の少なくとも１つを、さらに含むことを特徴とする項目２７に記載の試験キット。
（項目３０）
マーカー分子を検出するための前記試薬は、前記マーカー分子および／または前記マーカ
ー分子をコードする核酸とハイブリダイズする核酸プローブに特異的な結合剤を含むこと
を特徴とする項目２７に記載の試験キット。
（項目３１）
前記結合剤が抗体、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含むペプチド模倣物であるこ
とを特徴とする項目３０に記載の試験キット。
（項目３２）
前記試験キットは、診断用試験キット、研究キット、または分析キットであることを特徴
とする項目２７に記載の試験キット。
（項目３３）
子宮頚部異形成、頚部癌、およびヒト子宮頚部試料でのそれらの各々の前駆体段階を診断
するための方法であって、
（ａ）ヒト子宮頚部試料から試料溶液を調製するステップと、
（ｂ）子宮頚部異形成の存在に対して特徴的な少なくとも１種類の関連マーカーのレベ
ルを検出するステップと、
（ｃ）上皮細胞の存在に対して特徴的な少なくとも１種類の標準化マーカーのレベルを
検出するステップと、
（ｄ）前記試料溶液中に検出される標準化マーカーのレベルに対して前記関連マーカー
のレベルを標準化するステップと、
（ｅ）前記標準化マーカーに対する前記関連マーカーの標準化レベルにもとづいて、子
宮頚部異形成を診断するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
（項目３４）
子宮頚部異形成の存在に対して特徴的な前記少なくとも１種類の関連マーカーは、ｐ１６
ＩＮＫ４ａ、ＨＰＶ関連マーカー、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐＲｂ、ｐ
５３、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、ＭＮ、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｍｄｍ−
２、ｂｃ１−２、ＥＧＦ−受容体、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６
、ＭＣＭ７、ＣＤＣ２、ＣＤＣ６、ＣＤＣ７プロテインキナーゼ、ＣＤＣ１４プロテイン
ホスファターゼ、Ｄｂｆ４、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７、ＫｉＳ１、Ｉｄ１、オステオポンチン
、クローデイン−１、ＧＲＰ、腎性ジペプチダーゼ、およびＴＧＦβＩＩ受容体からなる
群から選択されることを特徴とする項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上皮細胞の存在に対して特徴的な前記少なくとも一種類の標準化マーカーは、ガンマ・カ
テニン、Ｅｐ−Ｃａｍ、Ｅ−カドヘリン、アルファ・カテニン、ベータ・カテニン、デス
モプラキン、ｈＫＬＫ１３、ＳＣＣＡ、ｕＰＡ１、インボルクリン、ＣＫ８、ＣＫ１８、
ＣＫ１０、ＣＤＫ１３、ビメンチン、コンカナバリンＡ受容体、およびレクチンからなる
群から選択されることを特徴とする項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記方法が、子宮頚部病変の早期検出または一次スクリーニング試験で使用されることを
特徴とする項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記ヒト子宮頚部試料が、スワブ、分泌物、吸引液、洗浄液、細胞、組織、生検採取物、
または体液であることを特徴とする項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記上皮細胞が、子宮腟部または子宮頸管内の細胞であることを特徴とする項目３３に
記載の方法。
（項目３９）
子宮頸管内の細胞の存在を示す標準化マーカーは、Ｅｐ−Ｃａｍ、ＣＫ８、およびＣＫ１
８からなる群から選択されることを特徴とする項目３８に記載の方法。
（項目４０）
子宮頸管内の細胞の存在を示す標準化マーカーは、ガンマ・カテニン、Ｅ−カドヘリン、
アルファ・カテニン、ベータ・カテニン、ＣＫ１３、ｐ１２０、およびインボルクリンか
らなる群から選択されることを特徴とする項目３８に記載の方法。
（項目４１）
子宮頚部異形成を診断するための試験キットであって、
（ａ）ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ
、ＭＮ、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｍｄｍ−２、ｂｃ１−２、ＥＧＦ−受容体、ｍｃｍ−２、ｍ
ｃｍ−５、クローデイン−１、ヒト・パピローマ・ウイルス感染を示すマーカー、ｐＲｂ
、およびｐ５３からなる群から選択される子宮頚部異形成に対して特徴的な少なくとも１
種類のマーカー分子を検出するための、少なくとも１種類の試薬と、
（ｂ）ＣＫ８、Ｅｐ−Ｃａｍ、ＣＫ１３、ＣＫ８、ＣＫ１８、Ｅ−カドヘリン、アルフ
ァ・カテニン、ベータ・カテニン、ガンマ・カテニン、およびインボルクリンからなる群
から選択される、上皮細胞の有無に対して特徴的な少なくとも１種類の標準化マーカーを
検出するための、少なくとも１種類の試薬と、
を含むことを特徴とする試験キット。
（項目４２）
少なくとも１種類の試薬が固相に固定されていることを特徴とする項目４１に記載の試
験キット。
（項目４３）
以下の成分：
（ａ）以下
（ｉ）子宮頚部異形成に対して特徴的な関連マーカー分子、ならびに
（ｉｉ）以下のパラメータ、すなわち、
円柱上皮細胞の有無、
扁平上皮細胞の有無、
の少なくとも１つに対して特徴的な標準化マーカー分子、
からなる群から選択される、正のコントロール反応をおこなうための少なくとも１種類
のマーカー分子と、
（ｂ）前記検出反応を実行するために一般に用いられる試薬および緩衝液と、
の少なくとも１つを、さらに含むことを特徴とする項目４１に記載の試験キット。
（項目４４）
マーカー分子を検出するための前記試薬が、前記マーカー分子および／または前記マーカ
ー分子をコードする核酸にハイブリダイズしている核酸プローブに特異的な結合剤を含む
ことを特徴とする項目４１に記載の試験キット。
（項目４５）
前記結合剤が、抗体、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含むペプチド模倣物である
ことを特徴とする項目４４に記載の試験キット。
（項目４６）
前記試験キットが、診断用試験キット、インビトロ診断装置、研究キット、または分析キ
ットであることを特徴とする項目４１に記載の試験キット。
（項目４７）
試験キットであって、
（ａ）ｐ１６ＩＮＫ４ａを検出するための試薬と、
（ｂ）ガンマ・カテニンを検出するための試薬と、
を含むことを特徴とする試験キット。
（項目４８）
Ｅｐ−Ｃａｍを検出するための試薬を、さらに含むことを特徴とする項目４７に記載の
試験キット。
（項目４９）
試料溶解のための緩衝液を、さらに含むことを特徴とする項目４７に記載の試験キット
。
（項目５０）
ｐ１６ＩＮＫ４ａを検出するための試薬とガンマ・カテニンを検出するための試薬とが固
相に固定されていることを特徴とする項目４７に記載の試験キット。
（項目５１）
インビトロ診断装置であることを特徴とする項目４７に記載の試験キット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本特許出願は、少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面が添付されたこの特許
または特許出願公報の写しは、申請および必要な料金の支払いをおこなうことで、特許庁
から提供される。
【図１】図１は、子宮頚部切片での子宮頸管内膜および子宮膣部上皮細胞の特異的免疫化学的染色を示す。図１Ａは、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）に対する抗体を用いて、子宮頚部の円柱上皮に検出された陽性反応を示す。図１Ｂは、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）に対する抗体を用いて、子宮頚膣部の円柱上皮で特異的染色が見られないことを示す。図１Ｃは、サイトケラチン１０／１３（ＣＫ１０／１３）に対する抗体を用いて、子宮頚部の円柱上皮で特異的染色が見られないことを示す。図１Ｄは、サイトケラチン１０／１３（ＣＫ１０／１３）に対する抗体を用いて、強く染色された子宮頸膣部の扁平上皮を示す。
【図２】図２は、子宮頚部スワブから得た可溶化試料のウエスタン・ブロット分析を示す。番号１ないし４は、個々の患者から得た試料（子宮頚部スワブ）を示す。
【図３】図３は、試料の妥当性を実証するウエスタン・ブロットおよびＥＬＩＳＡ分析を示す。高度子宮頚部上皮異形成（診断を参照のこと）の４人の患者の試料を、ウエスタン・ブロット分析（図の上側パネル）を用いて分析した。この図の下側パネルは、ＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、患者の医学的に関連した状態を診断するための方法に関する。この方法は、
細胞または細胞破片を含む原試料を患者から得る工程と、試料から試料溶液を調製する工
程と、試料溶液内で、上記医学的に関連した状態に対して特有の１種類以上の関連マーカ
ーのレベルを検出する工程と、１種類以上の標準化マーカーのレベルを決定する工程と、
上記標準化パラメータに関して関連マーカーの検出されたレベルを標準化する工程と、試
料溶液中の上記関連マーカーの標準化レベルから医学的に関連した状態を診断する工程と
、を含む。標準化マーカーは、以下の標準化パラメータの少なくとも１つに対して特有で
ある。すなわち、前記試料中に示される細胞のうちの特定の細胞種類の有無、前記試料溶
液中に示される前記細胞での特有な分化様式の有無、および前記試料溶液中に示される前
記細胞に特有な増殖特性の有無である。
【００１４】
本発明の一実施形態では、医学的に関連した状態は、細胞増殖性障害、癌、または前駆
的病変である。
【００１５】
本発明は、医学的に関連した状態を診断するための試験キットにも関する。
【００１６】
本発明は、試験試料の溶液中でおこなわれる溶液ベースの生化学的試験手順によって、
医学的に関連した状態の診断を改善する方法を提供する。本発明は、溶液から得た分子情
報によって、試験試料の細胞学的および／または組織化学的データに含まれる細胞ベース
の形態学的な情報を置換する方法であって、原試験試料を溶解させることで、溶解した試
験試料から、医学的に関連した診断の正確かつ再現可能な評価を可能にする方法を提供す
る。本発明にもとづく方法は、診断すべき状態に関連した１種類以上のマーカーのレベル
を決定する工程と、細胞ベースの試験系で診断を可能に、またはサポートする試料の形態
学的局面に関連した情報の置換に適当な一組の標準化マーカーのレベルを決定する工程と
、上記マーカーのレベルに関するデータの比較および／または結合をおこなう工程と、医
学的に関連した状態の診断を評価する工程と、を含む。
【００１７】
本発明は、組織学的および／または組織学的検査手順によって、通常は（細胞ベースの
診断系で）可能に、および／またはサポートする状態の診断が、異なる特性の種々の細胞
種類を含む原試料から得た溶液で、原料を得る工程と、試料を適当な溶媒に溶解する工程
と、試料溶液内で、診断すべき状態に関連した１種類以上のマーカー、さらに加えて１種
類以上の標準化マーカーのレベルを決定する工程と、標準化マーカーと相関関係のあるデ
ータに関連した上記状態に関連したマーカーと相関関係を示すデータを標準化する工程お
よび試料にかかる状態の存在または非存在を診断する工程とを含む方法によって、おこな
うことが可能である。
【００１８】
本発明にもとづく方法は、例えば、細胞学的、組織学的、または病理学的検査が正常に
おこなわれるケースでの一次スクリーニング試験として適用可能である。本発明を用いる
ことで、診断すべき状態が試料に存在する場合、区別可能である。もし溶液ベースの診断
が特定の状態について負の結果を与えるならば、さらなる検査が省略可能である。結果が
陽性である場合、続けて古典的に適用できる方法によって確認することが可能である。し
たがって、高価で時間がかかる顕微鏡的検査または他の検査を、安価な一次スクリーニン
グ試験によって回避することができた。
【００１９】
本発明の一局面は、医学的に関連した状態の診断を向上させる方法であって、診断の評
価が、溶解した原組織試料または原細胞試料の溶液を用いて実施される方法を提供する。
本発明にもとづいて開示された診断の方法は、形態学的パラメータに依存するものではな
く、生化学的分析による診断を可能とする。
【００２０】
本発明の第２の局面は、目的とするパラメータに対して特有の分子マーカーによって、
溶液中の複合試料を特徴づけ、さもなければ細胞学的または組織化学的検査から得ること
が可能な、情報が置換される方法である。
【００２１】
本発明の第３の局面は、複合試料で医学的に関連した特定の状態の診断用に適した組み
合わせを提供する。標準化のためのマーカーは、試料を原試料に溶解することで喪失され
る診断を可能またはサポートする原試料に含まれるパラメータが置換可能である。
【００２２】
本発明の第４の局面は、本発明にもとづく診断または研究をおこなうための試験キット
である。
【００２３】
本発明は、体液、スワブ、洗浄液（例えば気管支肺胞性ラビッジ、胸部管洗浄液、その
他）、吸引液（針吸引液、細針吸引液）または複合細胞もしくは組織試料等の原試料で、
状態の診断を急速かつ簡単におこなうことを可能とする。一般に、原料に関する問題は、
いくつかの異なる細胞種類が試料に存在すること、ならびに特定の微生物および細胞外物
質が存在することである。したがって、結果としてアーチファクトを与える傾向になる細
胞と組成物との混合物を含む。原試料内の物質および生物体の増殖特性が異なる種々の細
胞種類の存在によって、マーカー分子の特定のレベルの一因となりうる多数の因子が生ず
る。１つの単一分子マーカーのレベルを単に検出するだけでは、もし原試料に関するさら
なる（形態学的な）パラメータが与えられた場合、診断に有用な情報のみが提供されるに
すぎないと思われる。原試料から得ることが可能なすべての形態学的データが、溶液に溶
解することで失われる。それにもかかわらず、組織化学的、細胞学的方法によって得るこ
とが可能な特定の形態学的または他のパラメータに対応する適当な分子マーカーがある。
【００２４】
例えば、原試料内の単一構成要素に関する情報を、顕微鏡的検査によって、古典的に得
ることが可能である。形態学的な検査によって、分化、細胞の移動、さらには細胞が出現
する環境についてのヒントが得られる。子宮頚部−スワブの細胞学的調製では、例えば、
特定の細胞が上皮細胞として同定可能であり、さらに子宮頸管内膜または子宮膣部の上皮
細胞として同定されることもある。子宮内膜細胞等の非子宮頚部細胞の存在さえも、顕微
鏡的検査によって容易に解明することが可能である。
【００２５】
本発明によれば、試料材料の同種的または異種的特徴とは独立したさらなる調製または
特徴付けをおこなうことなく、原料を適当な溶媒に直接溶解してもよい。材料溶解の過程
で失われたデータを、一連のマーカー分子のレベルによってコードされた試料溶液に加え
られ、それによって、各々の形態学的特性に対する標準化のための上記分子データを使用
して、再構成することも可能である。このことは、明確な診断に必要とされる特性パラメ
ータの各々についての適当な分子マーカーを用いることで達成される。適当なマーカー・
アレイを検出することで、原試料を特徴づける関連パラメータを評価することが可能であ
り、さらに試料の溶解を介して情報の喪失という欠点が克服される。
【００２６】
本発明にもとづく試験手順として、問題になっている細胞状態に対して特有のマーカー
特性のレベルおよび試験試料内の特定環境を特徴づけるパラメータに関してデータを標準
化するためのマーカーのレベルの検出を含む。本発明にふさわしいマーカーは、さまざま
なものに由来するものであってもよい。問題となっている状態の検出にとって適当なマー
カーの発現様式は、細胞の増殖状態、分化状態、細胞種類、または生物体に依存する。適
当なマーカーの例を以下に示す。
【００２７】
本明細書で使用される「診断」という用語には、一般に、医学的に関連した状態の有無
についてのあらゆる種類の評価が含まれる。したがって、診断は、したがって、医学的に
関連した状態の傾向（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）をスクリーニングするプロセス、
医学的に関連した状態の前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）をスクリーニングするプロセス、
医学的に関連した状態の臨床的または病理学的診断プロセス等が診断に含まれる。本明細
書で使用されるように、医学的に関連した状態の診断とは、任意の状態の検査を含むもの
であってもよく、該状態は、ヒトの健康および／または身体に関して有用と思われる細胞
学的、組織化学的、生化学的、または分子生物学的レベルで検出可能である。そのような
検査には、例えば、医学的診断法および生命化学分野での研究を含むことができる。本発
明の一実施形態では、上記方法は、疾患等の医学的に関連した状態の診断に用いられる。
そのような疾患として、細胞または組織の非野生型増殖によって特徴づけられる疾患を挙
げることができる。
【００２８】
一実施形態では、癌およびその前駆段階の診断、癌の疾病経過のモニタリング、癌の予
後評価、および微小残存病変診断の過程での播種性腫瘍細胞等の検出に関する。本発明に
もとづく方法は、例えば、癌およびその前駆段階を臨床もしくは病理学的に診断する過程
で、または癌の臨床学的診断およびその前駆段階、またはスワブの検査等、特定の癌に対
して実施されるルーチン・スクリーニング試験、例えば頚部病変のスクリーニング試験、
肺癌に関する気管支洗浄液のスクリーニング試験、または結腸直腸病変等の消化管病変に
関する便のスクリーニング試験で使用することが可能である。
【００２９】
本発明にもとづく方法は、すべての種類の医学的に関連した状態に適用可能である。
【００３０】
本発明にもとづいて用いられるように、医学的に関連した状態は、例えば、組織の組成
物、体液、分泌物、洗浄液、またはスワブであってもよい。そのような状態は、体液の細
胞性組成物、例えば血液組成物、分泌液組成物、または精液組成物であってもよい。この
文脈では、これらの組成物は、例えば、特定の細胞種類（例えば、ウイルス等の病原体、
前新生物、新生物、および／または形成異常細胞他）の有無、特定の細胞種類の分化様式
の有無、特定の細胞種類（例えば、赤血球、白血球、精子、その他）の総数、試料中に存
在または不在の任意の細胞型の全細胞または特定の他の特徴を持つ細胞分画とする。
【００３１】
さらに、医学的に関連した状態は、細胞または組織に関連した疾患も含むものであって
もよい。診断すべき上記状態は、細胞学的および組織学的組織試料に関連するパラメータ
を含むものであってもよい。上記状態は、例えば外科的切除試料、生検、スワブ、洗浄液
等の組織試料中での細胞の分化様式を含むものであってもよい。そのような状態は、例え
ば先天性疾患、炎症性疾患、機械的障害、外傷障害、血管障害、変性障害、成長障害、良
性新生生物、悪性新物を含むものであってもよい。本発明にもとづく状態の別の局面は、
増殖特性の有無によって特徴づけられる状態であってもよい。増殖特性の有無によって特
徴づけられる状態が、例えば、細胞増殖性疾患であってもよい。
【００３２】
本発明にもとづく細胞増殖性疾患は、正常制御細胞または組織の増殖特性と比較して、
細胞または組織の異常増殖によって特徴づけられた疾患を含む。細胞または組織の増殖は
、例えば、異常に加速、減速するか、もしくは異常に制御されるものが考えられる。上記
で用いたように、異常制御は、天然に生ずる増殖制御の影響に対する細胞または組織の非
野生型応答の有無の任意に形態を含むものであってもよい。細胞または組織の増殖におけ
る異常として、例えば、新生物または過形成のものが考えられる。
【００３３】
一実施形態では、細胞増殖性疾患は腫瘍である。腫瘍として、頭部および頚部の腫瘍、
呼吸器官の腫瘍、肛門性器動の腫瘍、消化管の腫瘍、泌尿器系の腫瘍、生殖器系の腫瘍、
内分泌系の腫瘍、中枢および末梢神経系の腫瘍、皮膚およびその付属器の腫瘍、軟組織お
よび骨の腫瘍、リンパ球および造血系の腫瘍、その他を挙げることができる。腫瘍は、例
えば良性および悪性腫瘍、癌種、肉腫、白血病、リンパ腫、または異形成を含むものであ
ってもよい。特定の実施形態では、腫瘍は、例えば頭部および頚部の癌、呼吸器官の癌、
肛門性器道の癌、消化管の癌、皮膚およびその付属器の癌、中枢および末梢神経系の癌、
泌尿器系の癌、生殖器系の癌、内分泌系の癌、軟組織および骨の癌、造血系およびリンパ
球生成系の癌である。
【００３４】
上記肛門性器道の癌として、会陰癌、肛門周囲癌、および陰嚢皮膚癌、子宮頚癌、陰門
癌、膣癌、陰茎癌、肛門癌等が含まれる。子宮頸癌として、鱗状病変、腺病変または他の
上皮性腫瘍が含まれる。鱗状病変として、例えば子宮頚部上皮内異常増殖（軽度、中等度
、および高度の異形成）、癌種インサイチュ、扁平上皮細胞癌（例えば、角質化、非角質
化、疣状、いぼ状、乳頭状、リンパ上皮腫様）が含まれる。腺病変として、非定型増殖、
腺癌インサイチュ、腺癌（例えば、ムチン、類子宮内膜、澄明細胞、悪性腺種、乳頭状、
漿液性、または中腎性の腺癌）が含まれる。他の上皮性腫瘍として、腺扁平上皮癌、硝子
細胞癌、腺様嚢胞癌、腺様基底癌、カルチノイド腫瘍、小細胞癌、および未分化癌腫が含
まれる。さらに詳しい情報については、「Ｋｕｒｍａｎ，Ｒ．，Ｎｏｒｒｉｓ，Ｈ．，ら
．， Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｒｖｉｘ， Ｖａｇｉｎａ，ａｎｄ Ｖｕｌｖ
ａ， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９２，ＡＦＩＰ」を参
照すること。この文献の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【００３５】
消化管の癌として、大腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ字結腸癌、直腸
癌、小腸癌、空腸癌、十二指腸癌、胃ガン、食道癌、肝臓癌、胆汁癌、胆管系癌、脾臓癌
等が含まれる。胃腸病変についての総合的な概要は、「Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｒ， Ａａ
ｌｔｏｎｅｎ ＬＡ （Ｅｄｓ．）： Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ， Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ
Ｓｙｓｔｅｍ， ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ： Ｌｙｏｎ ２０００」から得られ、本明細
書中で参考として援用される。
【００３６】
呼吸器官の腫瘍として、呼吸器官のなんらかの悪性状態が含まれ、該悪性状態として、
例えば肺、肺胞、細気管支、気管支樹および気管支、鼻咽頭空間、口腔、咽頭、鼻腔およ
び副鼻腔等の癌が挙げられる。小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌、小細胞肺
癌、肺の腺癌、大きい細胞肺癌、アデノ鱗状肺癌、肺のカルチノイド腫瘍、気管支腺腫瘍
または（悪性）または中皮腫等の肺癌。呼吸器官の腫瘍についての概要は、「Ｃｏｌｂｙ
ＴＶ，ら．：Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｏｗｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔ
ｒａｃｔ， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｔｈｉｒｄ Ｓｅ
ｒｉｅｓ， Ｆａｓｃｉｃｌｅ １３， ＡＦＩＰ： Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ １９９５
」に見いだすことができ、本明細書ではこの文献は参考として援用される。
【００３７】
泌尿器系の腫瘍として、膀胱癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、および尿道癌を挙げること
ができる。生殖器系の腫瘍として、卵巣、子宮、精巣、前立腺、精巣上体副睾丸等の癌も
しくはそれらの前駆段階を挙げることができる。
【００３８】
すべてのケースで、本発明にもとづく方法は、病変、腫瘍、または癌の前駆対段階に対
しても適用される。
【００３９】
一実施形態では、本発明にもとづく方法は、播種性腫瘍細胞または転移の検出に関する
。
【００４０】
本発明の一実施形態では、癌は、例えば子宮頚癌、大腸癌、胃癌、胸部癌、膀胱癌、肺
癌、口腔癌等である。
【００４１】
試料の分子特性を保存する強力で迅速かつ容易ないくつかの方法を提供するもので、そ
れによって試料の形態学的情報が失われる。試料は、例えば、該試料を得た後、または該
試料を得ているあいだでも、適当な溶媒に対して急激に試料の細胞性成分を溶解すること
で、再生可能かつ容易に保存および運搬できる形態に調製することができる。体液を、個
人の体から適当な界面活性剤と保存剤物質とを含む溶液へ直接移すことも可能である。さ
らに、組織試料を変性溶解状態に素早く移して（最終的には、物理的力による）保存する
ことが可能である。溶媒の適当な成分を用いて、原試料の分子構成要素を保存することが
でき、分解が生ずるようなことはないと思われる。酵素活性の低下は、例えば酵素阻害剤
を用いることで、最小限にすることが可能である。したがって、試験試料の溶液は、保存
上の予防策をさらに必要とすることなく、溶解時に試験試料の分子的特性を容易に示すこ
とが可能である。
【００４２】
原試料は、臨床試料、例えば分泌物、スワブ、洗浄液、体液、血液、尿、精液、大便、
胆汁、分泌液、骨髄、生検、細胞試料、および組織試料を含むのであってもよい。生検は
、本発明の文脈で用いられるように、腫瘍切除試料、内視鏡的手段または器官のパンチも
しくは針による生検によって調製された試料を含むものであってもよい。さらに、検出す
べきマーカー分子が含まれている可能性がある任意の試料が、本発明の試料であってもよ
い。本発明の一実施形態では、上記試料として、子宮頚部スワブ、気管支洗浄液、便等が
含まれる。本発明の文脈で使用される原試料は、固定または保存された細胞または組織試
料を含むものであってもよい。例えば、適当な溶液（アルコール等）に保存された細胞、
または固定組織試料を、本発明にもとづく方法で原試料として用いることもできる。
【００４３】
本発明の方法にもとづく原試料として、細胞または細胞破片を含む任意の試料が挙げら
れる。細胞は、例えば原核細胞または真核細胞である。
【００４４】
本発明が感染性の疾患に適用される場合、決定すべき細胞として、クラミジア、大腸菌
（Ｅ． ｃｏｌｉ）、カンジダ等の微生物が考えられる。
【００４５】
本発明によれば、原試料の分子構成要素の全部または一部は、例えば溶媒を含んでいる
適切な溶解緩衝液で可溶化される。そのような溶媒として、例えばカオトロピック剤（例
えば例えば尿素、ＧｕａＳＣＮ、ホルムアミド）、陰イオン洗浄剤（例えば、ＳＤＳ、Ｎ
−ラウリル・サルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、アルキル・アリール・スルホン
酸塩、長鎖（脂肪）アルコール硫酸塩、オレフィン硫酸塩およびスルホン酸塩、アルファ
・オレフィン硫酸塩およびスルホン酸塩、硫酸化モノグリセリド、硫酸化エーテル、スル
ホコハク酸塩、アルカン・スルホン酸塩、リン酸塩エステル、アルキル・イセチオン酸塩
、ショ糖エステル）、陽イオン性界面活性剤（例えば、セチル・トリメチルアンモニウム
塩）、非イオン性界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＮＰ−４０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、Ｎ−オクチル・グ
ルコシド）または両性界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、３−ドデシル−ジメチルアンモ
ニオ−プロパン−１−スルホネート、ラウリルジメチルアミン・オキシド）、および／ま
たはＮａＯＨもしくはＫＯＨ等のアルカリ水酸化物が挙げられる。上記溶媒は、細胞、細
胞破片、核酸、ポリペプチド、脂質、さらに原試料に存在する可能性のある他の生体分子
が溶解されるように、設計される。本発明にもとづいて原試料を溶解するための溶液は、
原試料に含まれる構成要素の分解を防ぐ１種類以上の試薬をさらに含むものであってもよ
い。そのような構成要素は、例えば酵素阻害剤（例えばタンパク質分解酵素阻害剤、ＲＮ
Ａアーゼ阻害剤、ＤＮＡアーゼ阻害剤等）から構成されるものであってもよい。本発明の
一実施形態では、試料を、被験者から得ることが可能な形態に直接溶解する。本発明の別
の実施形態では、溶解前に上記試料をさらに精製してもよい。そのような精製手順は、例
えば、粘液等の汚染物質を洗い流し、細胞性構成要素の分離または濃縮化をおこない、細
胞を保存および輸送することが可能である。したがって、原試料の細胞性構成要素が単一
の試料溶媒に含まれる。
【００４６】
本明細書に開示されたように、一方法で用いられる試料の調製もまた、該試料をさらに
調製するためのいくつかの工程を含む場合もある。例えば、不溶性成分の分離、ポリペプ
チドもしくは核酸の単離、ペプチドもしくは核酸を固定した固相の調製あるいはビーズの
調製、決定すべき分子が共有または非共有結合する膜もしくはスライド等がある。
【００４７】
本発明によれば、マーカー分子の検出は、この溶液から直接実行される。検出は、溶液
でおこなうことも可能であり、あるいは固相に固定した試薬を用いておこなうことも可能
である。本発明の特定の実施形態では、マーカー分子の検出は、溶解させた身体試料の溶
液からおこなわれる。したがって、検出は溶液でおこなうことが可能であり、あるいは固
相に固定した試薬を用いておこなうことが可能である。本発明の文脈で使用される固相は
、平面、粒子（マイクロ粒子、ナノ粒子、またはさらに小さい粒子さえも包含される）の
さまざまな実施形態を含むことが可能である。ある実施形態では、粒子をビーズ、コロイ
ド等として提供してもよい。試験キットまたはインビトロ診断装置の固相に対する試薬の
固定は、直接的固定または間接的固定を介して作用するものであってもよい。直接的固定
を、例えば表面に対する共有または非共有結合もしくは会合によっておこなうことが可能
である。間接的固定は、それ自体が固相に直接固定される試薬に対する試薬（例えば抗体
、プローブ等）の結合を介しておこなうことが可能である。そのような試薬として、抗体
、またはソトレプトアビジン、ビオチン等のような他の結合剤を含むものであってもよい
。一種類以上の分子マーカーの検出は、単一反応混合物または２つ以上の異なる反応混合
物でおこなうことが可能である。いくつかのマーカー分子に対する検出反応は、例えば、
マルチ・ウェル反応容器で、あるいは場合により単一もしくは２つ以上の異なる試験片で
、同時に実施することが可能である。細胞増殖性疾患に対して特有のマーカーは、これら
の分子を特異的に認識する試薬を用いて検出することが可能である。同時に、標準化マー
カーは該標準化マーカーを特異的に認識する試薬を用いて検出するこが可能である。各々
のクラスのマーカーに対する検出反応は、最初のマーカー分子の認識または好ましくは最
初のマーカーを認識するために用いられる一次分子の認識のいずれかをおこなう試薬を検
出する一種類以上のさらなる反応を含むものであてもよい。検出反応は、さらに、細胞増
殖性疾患または標準マーカーに対して特有のマーカーのレベルを示すレポーター反応を含
むものであってもよい。
【００４８】
用語「マーカー」または「マーカー分子」は、本発明の文脈のなかで用いられるその文
法的形態の全てにおいて、ポリペプチド分子と同様に核酸分子のことをいう。したがって
、マーカーまたはマーカー分子は、例えば、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等）、ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等）、タンパク質、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タン
パク質、およびそれらの分子の各々のフラグメントを含む。用語「関連マーカー」は、医
学的に関連した状態に対して特有のマーカー分子のことをいう。標準化マーカーという用
語は、標準化目的のために用いられるマーカーのことをいう。
【００４９】
本明細書で使用されるマーカー分子のレベルは、試料に存在する各々のマーカーの量に
関して、定量値と同様に準定量値をいう。定量値を、例えば、濃度に換算して表してもよ
い。準定量値は、複数のレベルからなる等級に換算して表すことが可能である。例えば、
検出不可能なレベル、低レベル、中間レベル、高レベル、または任意の他の適当なモード
であってもよい。マーカーのレベルを従属的パラメータに換算して表してもよい。該パラ
メータとして、例えばマーカー分子の存在に応答してアッセイ・フォーマットで発生する
信号の強度が挙げられる。
【００５０】
本発明の文脈で使用されるマーカー分子の検出のためのプローブは、該マーカー分子に
特異的に結合する任意の分子であってもよい。プローブは、抗体（モノクローン性もしく
はポリクローン性）、抗体フラグメントまたはエピトープを含む人工的分子、タンパク質
または核酸等のＤＮＡまたはＲＮＡ結合分子である。他の核酸に結合する核酸もまた、例
えば検出目的またはプライマーに関して、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはオリゴヌクレオ
チド（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、人工的核酸等）とすることができる。
【００５１】
分子が他の分子と特異的に相互作用する場合、その分子がその他の分子を認識するとい
う。特異的相互作用を、例えば、他の分子に対する特異的結合もしくは他の分子の特異的
結合とすることができる。
【００５２】
レポーター反応は、例えば着色した化合物を生ずる反応であってもよい。本発明の一実
施形態では、特定のマーカーと相関しているレポーター物質によって異なる色が生ずる。
別の実施形態では、標準化マーカー特異的レポーターは、試料に存在する標準マーカーの
レベルに依存して、医学的に関連した状態に対して特有の、マーカーに対して特異的なレ
ポーター分子によって生成されるシグナルを消す分子であってもよい。さらに別の実施形
態では、レポーター反応は、異なった波長特性を持つ蛍光色素を生ずるものであってもよ
い。本発明のさらなる実施形態では、レポーター反応は、検出すべきいずれかのマーカー
に対して特異的なレポーター物質に対して特有の異なる波長を持つ発光反応を含むもので
あってもよい。本発明の別の実施形態では、レポーター反応は、放射線の放出と、該放射
線を視覚化または定量化する追加的な方法とを含むものであってもよい。一実施形態では
、複数の異なるマーカー分子が、異なるエネルギー的特性を示す放射性核種放出放射線を
持つ複数の試薬を認識するものであってもよく、それによってマーカー分子に関するシグ
ナルが区別されるかもしれない。
【００５３】
本発明にもとづく検出反応に対して適応可能なフォーマットには、ブロッティング技術
、例えばウエスタン・ブロット、サザン・ブロット、およびノーザン・ブロットが挙げら
れる。これらのブロッティング技術は、当業者に知られており、例えば電子ブロット、半
乾燥ブロット、真空ブロット、またはドット・ブロットとして実行することが可能である
。さらに、分子を検出するための免疫学的方法は、例えば免疫沈降法または免役アッセイ
、例えばＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、側方流動アッセイ、フロー・スルー・アッセイ、
免疫クロマトグラフィー・ストリップ等を適用することが可能である。本発明で用いられ
る免疫アッセイは、サンドイッチ・アッセイ等の非競合的免疫アッセイと同様に競合的免
疫アッセイから構成されるものであってもよい。
【００５４】
本発明の特定の実施形態では、臨床検査室用の試験装置を用いて免疫化学的または核酸
ベースの試験を行うことも可能である。そのような試験装置には、免疫化学的または核酸
をベースとした試験に適した任意の装置が含まれる。例えば、任意のフォーマット、ベン
チ・トップもしくは実験装置と同様に診療現場（ポイント・オブ・ケア）検査装置が挙げ
られる。これらの装置は、例えば、オープンまたはクローズド・プラットフォーム・シス
テムとして提供される。このシステムは、任意の適当な方法論、例えばマイクロタイター
・プレート、マルチウェル・プレート、フロー・スルーもしくは側方流動システム、マイ
クロチップもしくはアレイをベースとしたシステム、またはビーズもしくは膜をベースと
したシステム等を用いる方法論に基づいたものであってもよい。使用される検出方法は、
免疫化学的または核酸ベースの検出反応にとって有用な当業者に公知の任意の方法を含む
ものであってもよい。そのような検出システムとして、例えば、発光（ルミネセンス）シ
ステム（電気発光、生物発光、光発光、放射線発光、化学発光、電気化学発光）、蛍光ベ
ースのシステム、導電性ベースの検出システム、放射線（光、ＵＶ、Ｘ線、ガンマ等）ま
たは任意の他の公知方法が可能である。
【００５５】
本発明の一実施形態でのマーカー分子レベルの検出方法は、生物学的試料中のわずかな
量の特異的分子でさえも検出するのに適した任意の方法である。さらに、感度に関係なく
マーカー分子を検出する任意の方法も適用可能である。本発明にもとづく検出反応は、例
えば、核酸のレベルでの検出反応および／またはポリペプチドのレベルでの検出反応を含
むものであってもよい。一実施形態では、マーカー分子の検出は、特定のスプライシング
変異体の検出を含むものであってもよい。本発明の別の実施形態では、検出方法は、試料
中のポリペプチドのリン酸化もしくはグリコシル化等または核酸のメチル化等、マーカー
分子の修飾を検出することを含むものであってもよい。
【００５６】
本発明の一実施形態では、マーカー分子のレベルの検出は、試料中に存在する該マーカ
ー分子またはそのフラグメントのレベルを検出することによって、おこなわれる。核酸分
子の検出手段は、当業者に知られている。核酸検出のための手順は、例えば、検出すべき
分子を相補的核酸プローブ、該核酸に対する特異的結合性を持つタンパク質、または該核
酸に対して特異的に認識および結合する任意の他の実体との結合反応によって、おこなう
ことができる。この方法は、インビトロで、例えば検出染色反応のあいだの、直接的イン
サイチュと同様に、実行することができる。本発明にもとづく方法でおこなわれる核酸の
レベル上での試料内のマーカー分子を検出する別の方法は、核酸の増幅反応であり、例え
ばポリメラーゼ鎖反応のように、定量的におこなうことができる。本発明の一実施形態で
は、例えば、リアル・タイムＲＴ・ＰＣＲを用いて、細胞増殖性疾患の試料に含まれるマ
ーカーＲＮＡのレベルを定量することが可能である。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、マーカー分子のレベルの検出は、タンパク質の発現レベル
を決定することによっておこなわれる。タンパク質レベル上でのマーカー分子の決定は、
例えば、該マーカー分子レベルの検出に対して特異的な結合剤を含む反応でおこなうこと
が可能である。これらの結合材は、例えば、抗体および抗原結合フラグメント、二官能性
ハイブリッド抗体、最小抗原結合エピトープを含むペプチド模倣薬等を含むものであって
もよい。上記結合剤は、ウエスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、フロー・
スルー・アッセイ、側方流動アッセイ、ラテックス凝集、免疫クロマトグラフィ・ストリ
ップ、または免疫沈降等における多くの異なる検出技術で用いることが可能である。通常
、結合剤ベースの検出は、インビトロと同様に直接インサイチュで、例えば免疫細胞化学
的染色反応の間、おこなうことが可能である。生物学的試料の溶液中の特定のポリペプチ
ドの量を決定するのに適した任意の他の方法を、本発明にもとづいて用いることができる
。
【００５８】
核酸分子および／またはポリペプチドの修飾状態を検出する方法は、当業者に公知であ
る。
【００５９】
核酸のメチル化を検出するための方法は当業者に公知であり、該方法は、例えば、重亜
硫酸ナトリウム、過マンガン酸塩、またはヒドラジン等による核酸の化学的前処理と、特
異的制限エンドヌクレアーゼによる、または（例えば増幅反応の過程での）特異的プロー
ブによる修飾のその後の検出とを用いる方法を含むことが可能である。メチル化の検出は
、さらに、メチル化特異的制限エンドヌクレアーゼを用いておこなうことができる。核酸
内のメチル化の状態を検出する方法は、特許出願ＥＰ０２０１０２７２．９、米国特許第
５，８５６，０９４号、ＷＯ００３１２９４、米国特許第６，３３１，３９３号等に開示
されている。これらの引用文献を本明細書で参考として援用する。
【００６０】
ポリペプチドの修飾された状態の検出は、例えば、ポリペプチドの修飾または非修飾状
態を特異的に認識する結合剤を含むものであってもよい。あるいは、ホスファターゼまた
はグリコシラーゼ等の酵素は、分子内の修飾を取り除くことに用いることが可能である。
したがって、修飾の有無は、電気泳動、クロマトグラフィ、質量スペクトロメトリ等を用
いて、各々の酵素とのインキュベーションに先だってまたはその後に、分子の質量または
電荷を決定することによって検出することができる。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態では、一連のマーカー分子の検出は、ポリペプチドのレベル
でおこなうことができ、同時にさらなる一連のマーカー分子および／または同一マーカー
分子の全てもしくは一部分の検出が核酸分子のレベルでおこなうことができる。
【００６２】
医学的に関連した細胞状態に関係するマーカーは、例えば細胞および／または組織の増
殖および／または分化に影響および／または反映する分子であってもよい。そのような分
子として、例えば細胞周期調節タンパク質、ＤＮＡ複製に関係するタンパク質、膜貫通タ
ンパク質、受容体タンパク質、シグナル伝達タンパク質、カルシウム結合タンパク質、Ｄ
ＮＡ結合ドメイン含有タンパク質、メタロプロテイナーゼ、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、
シャペロン、胚形成タンパク質、熱ショック・タンパク質、または他のタンパク質を翻訳
後修飾することで該タンパク質の活性を制御する酵素、または指定されたタンパク質をコ
ードする核酸を含むことができる。また、指定されたタンパク質をコードするｍＲＮＡも
本発明にもとづく有用なマーカー分子となり得る。一実施形態では、細胞増殖性疾患に関
係するマーカーは、例えば、疾患にかかった細胞内で独特の発現をするか、該細胞で発現
しないか、もしくは該細胞で過剰に発現するものであってもよい。
【００６３】
本発明にもとづく用途のためのマーカー分子は、ｐ１３．５、ｐ１４、ｐ１５、ｐ１６
（ｐ１６ＩＮＫ４ａともいう）、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐＲｂ、ｐ１４ＡＲ
Ｆ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＥ、ＭＤＭ−２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ５、Ｍ
ＣＭ６、ＣＤＣ２、ＣＤＣ６、Ｉｄ１、オステオポンチン、ＧＲＰ、腎性ジペプチダーゼ
、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＴＧＦＦβＩＩ受容体、例えばＨＰＶ遺伝子Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ
２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６またはＥ７から誘導されたＨＰＶ関連マーカー等から選択される１
つ以上のマーカーを含む。医学的に関連した状態の検出のための本発明の一実施形態で有
用なマーカーの選択を以下の表１に示す。
【００６４】
一実施形態において、医学的に関連する状態に対するマーカーは、腫瘍に対するマーカ
ー（腫瘍マーカー）であり得る。腫瘍に対して特有のマーカー分子は、例えば、正常制御
組織と比較して腫瘍で非野生型のかたちで発現するタンパク質であってもよい。本明細書
で用いられるように、非野生型発現とは、各々の分子の発現レベルの増減、発現の欠如、
または非野生型形態の発現が含まれると考えられる。タンパク質の非野生型形態の発現は
、挿入、欠失、置換、もしくはフレームシフト突然変異により生じるタンパク質の突然変
異形態の発現か、またはタンパク質もしくは核酸における任意の他の公知の種類の突然変
異を含む。非野生型タンパク質の発現またはタンパク質の非野生型レベルのすべての場合
において、タンパク質、ポリペプチド、もしくはそれらのフラグメント、またはそれらの
タンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸、もしくは該核酸のフラグメントを、
腫瘍に関連する分子マーカーとして使用することが可能であり、そのため本発明の文脈で
使用されるように「腫瘍マーカー（ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ）」という用語で理解する
こともできる。腫瘍に関連して非野生型発現を示すタンパク質は、例えばＷＯ９９０４２
６５Ａ２、ＷＯ０１４９７１６Ａ２、ＷＯ００５５６３３Ａ２、およびＷＯ０１４２７９
２Ａ２の文献に開示されており、本明細書ではこれらを参考として援用する。
【００６５】
本発明の一実施形態では、医学的に関連した状態に対して特有のマーカーは、細胞周期
調節蛋白質、例えばサイクリン、サイクリン依存性キナーゼまたはサイクリン依存性キナ
ーゼ阻害剤であってもよい。本発明のさらに別の実施形態では、医学的に関連した状態に
対して特有のマーカーは、一時的または持続的ウイルス感染に関係するマーカーであって
もよい。上記ウイルス感染は、ヒト・パピローマ・ウイルス（ＨＰＶ）、例えばハイリス
クまたは低リスクＨＰＶによる感染を含むものであってもよい。ハイリスクＨＰＶは、例
えばＨＰＶ １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、および５
８のようなＨＰＶサブタイプを含むものであってもよい。ＨＰＶ感染のマーカーは、例え
ばＨＰＶ遺伝子Ｌ１、Ｌ２、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、またはＥ７のＨＰＶ発現産物を含
むものであってもよい。本発明の第３の実施形態では、ウイルス感染に対して特有のマー
カーは、医学的に関連した状態の任意の他のマーカーと組み合わせて、例えば細胞周期制
御タンパク質と組み合わせて使用することが可能である。ＨＰＶ関連に関して特に興味深
いＨＰマーカー分子の組み合わせについては、例えばＷＯ０２０８７６４に開示されてお
り、本明細書ではこの文献を援用する。
【００６６】
一実施形態では、ＨＰＶマーカーと組み合わせて使用するための細胞周期調節タンパク
質は、例えば、ｐＲｂ、ｐ５３、ｐ１４ＡＲＦ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む
群から選択することができる。特定の一実施形態では、ｐ１６ＩＮＫ４ａをＨＰＶ感染の
マーカー（例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、またはＥ７）と組み合わせて
使用することが可能である。
【００６７】
状況に応じて、特定の実施形態での医学的に関連した状態に対するマーカーとして有効
なマーカーが、特定の他の実施形態での標準化のためのマーカーとして用いられ得る（逆
もまたしかり）ことを、理解しなければならない。しかし、各々の単一実施形態で、マー
カーは医学的に関連した状態のためのマーカーとして、または標準化のためのマーカーと
してのみ、用いられることができる。例えば、細胞増殖のためのマーカーとしてのＫｉ６
７は、特定の実施形態（例えばｐ１６、ｐ１４ＡＲＦ、クローデイン−１、または医学的
に関連した状態のためのマーカーとしての他のものと組み合わせたかたちで）、標準化マ
ーカーとして有効であると考えられる。別の実施形態では、Ｋｉ６７は、適当な標準化マ
ーカー（例えばサイトケラチンまたはカテニン等）と組み合わせて、医学的に関連した状
態（例えば子宮頚部上皮異形成または他の形成異常疾患のマーカーとして）のマーカーと
して用いられることが可能である。他の種々のマーカーは、同様に医学的に関連した状態
のマーカーとして用いることが可能であり、または用途の特定の実施形態に応じた標準化
のために役に立つことが可能である。
【００６８】
本発明にもとづく標準化マーカーは、例えばハウスキーピング遺伝子（例えばアクチン
、ｇａｐｄｈ、ヒストン・タンパク質、ホスホリパーゼ、β２ミクログロブリン、ｋｉ６
７、ＰＣＮＡまたはスタチン等の細胞増殖活性に関係するタンパク質、または上皮細胞の
ＣＫ２０等の特定細胞種類もしくは任意の細胞特異的細胞表面抗原に対して特有のタンパ
ク質）を含むものであってもよい。また、糖タンパク質に存在する炭水化物構造、プロテ
オグリカン、コンカナバリンＡ受容体等のレクチン受容体、ムチン、さらにＧａｌＮａｃ
トランスフェラーゼおよびオリゴサッカリルトランスフェラーゼ等のようなこれらの分子
の生合成に関わる酵素もまた、標準化マーカーとして用いることが可能である。マーカー
・タンパク質の種類は、マーカーによって提供されるべき情報にもとづいて選択されなけ
ればならない。特に、特定の医学的に関連した状態に有効なマーカーは、特定の状況下で
、標準化マーカーとして有用であると考えられる。本発明にもとづく方法を実行するのに
有用なマーカーの選択を表１に示す。
【００６９】
医学的に関連した状態に対するマーカーに関してと同様、標準化マーカーに関すること
に関して、分子（例えば、ポリペプチドおよび核酸）の修飾状態を本発明にもとづく方法
でマーカーとして用いることが可能である。例えば、リン酸化、グリコシル化、もしくは
それ以外の修正されたポリペプチドまたはメチル化された核酸は、本発明にもとづく方法
でマーカーとして対処可能である。
【００７０】
本発明にもとづいて使用されるように、標準化は、検出されたマーカーのレベルを、診
断評価に役立つパラメータに対して、関連づけることに適した任意の方法を含むものとす
る。この標準化の一局面は、試料溶液で検出可能な適当な分子マーカーによって、原試料
に含まれる関連した細胞学的および組織学的情報を再構築することが可能である。標準化
は、例えば試料に存在する細胞の合計数、試料での特定の細胞種類の有無、試料に含まれ
る生物体または生物体の細胞の有無、試料に含まれる特定の細胞種類の細胞数もしくは生
物体の数、試料に存在する細胞の増殖特性、または試料に存在する細胞の分化様式を検出
することを含むことが可能である。
【００７１】
特定の実施形態では、標準化はまた、試験の適性を証明することを含むものであっても
よく、場合によって、不適当な試験結果を破棄または無効なものとして分類することがで
きる。したがって、本発明の文脈で用いられるように、標準化は、標準化のための定量的
または半定量的方法を含むことが可能である。いくつかの実施形態では、準定量的標準化
は、標準化マーカーの閾値を決定することを含むことが可能である。一実施形態では、準
定量的標準化は、例えば以下のようにして適用してもよい。例えば、標準化マーカーのレ
ベルが所定の閾値を上回る場合だけ、関連したマーカーのために測定されるレベルは有効
な試験結果と考えられる。閾値に達しない場合、関連したマーカーの試験結果は無効と見
なされる。診断は、検査を基礎として評価される可能性はない。他の実施形態で、閾値は
、上回られる可能性がないように設定してもよい。特定の実施形態では、定量的な標準化
は、標準化マーカーの有無に関して実行することが可能である。それらのケースでは、例
えば、関連したマーカーのために測定される値は、標準化マーカーの有無と比較される。
あらかじめ定義されたように、標準化パラメータ（標準化マーカーの検出可能なレベルの
有無）が満たされる場合、値は有効である。
【００７２】
【表１−１】
【００７３】
【表１−２】
【００７４】
【表１−３】
【００７５】
本発明によれば、標準化は試料中の問題となっているいくつかの（ヒト）細胞の存在を
決定することを含むものであってもよい。このことは、本発明の重要な局面である。特に
、試験手順が検証する場合、試験の実施形態の誤った（特に偽陰性）結果のみを避けるこ
とができる。試験試料は、特定の検査を実行するために必要な材料（例えば細胞、組織生
物体等）を含む。種々の試験では、このことは、試料が細胞を含むことを確実にすること
から構成される。本発明の広範囲にわたる実施形態では、試料の適性の確認は、細胞の存
在を確かめることだけではなく、異なる起源の細胞または特定の細胞種類の存在を検出す
ることが含まれる。
【００７６】
このように、標準化はまた、例えば、特定の器官由来の細胞または特定の組織学的位置
に由来する細胞等、特定起源の細胞の決定、例えば上皮の異なった領域の細胞、または結
合組織の細胞、異質起源（例えば転移細胞）の細胞または組織の基底膜に由来する細胞の
検出、を含むことも可能である。このことは、特定の場合に必要となる可能性がある。な
ぜなら、特定の正常状態での新形成または異形成等、医学的に関連した状態の検出に用い
られるかもしれないマーカーを特定の環境下で発現する細胞が存在するかもしれないから
である。本発明にもとづいて使用されるように、標準化は、医学的に関連した状態の診断
に対して選択された特定のマーカーの全レベルの一因となる可能性がある任意の細胞種類
の有無および／またはレベルの検出を含むものであってもよい。
【００７７】
一実施形態では、方法は頚部病変の検出のために適用される可能性がある。子宮頚部病
変は、上記に定義した子宮頸癌とその前駆段階等、いかなる子宮頚部上皮異形成も含むも
のと考えられる。この検出目的に有用なマーカーおよび該マーカーの組み合わせは、例え
ば、ＷＯ０２０８７６４およびＥＰ１２１７３７７に開示されており、本明細書ではこれ
らの文献を参考として援用する。この実施形態では、試験は子宮頚部由来の任意の適当な
試料を用いて実施してもよい。試料は、例えば、子宮頚部の生検もしくは微小生検または
子宮頚部領域から得たスワブを含むことが可能である。本明細書で用いられるように、子
宮頚部スワブは、サンプリング手順の間、子宮頚部と接触する、例えば、ブラシ、タンポ
ン、またはスパーテル等の適当な手段を用いて得ることが可能な試料である。サンプリン
グ装置は、内科医によって実行される従来の試験装置またはセルフ・サンプリング装置で
用いられる任意の適当な装置を用いてもよい。
【００７８】
子宮頚部スワブの評価を向上させる見込みのある分子マーカーとして、ｐ１６ＩＮＫ４
ａ、ｐ１４ＡＲＦ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、ＭＮ、ｈｅｒ２／ｎｅ
ｕ、ｍｄｍ−２、ｂｃ１−２、ＥＧＦ−受容体、ｍｃｍ−２、ｍｃｍ−５、クローデイン
−１、ヒト・パピローマ・ウイルス感染を示すマーカー、ｐＲｂ、およびｐ５３が挙げら
れ、これらは異形性および新生物細胞の検出に用いられるかもしれない。子宮頚部スワブ
を分析する目的での本発明にもとづく標準化は、少しでもヒト細胞が存在することの検出
、子宮頚部上皮の細胞の検出、子宮膣部細胞と同様に子宮頸管内膜の存在の検出、および
子宮内膜由来の細胞の検出とを含むものであってもよい。子宮頸管内膜の上皮は、腺円柱
上皮である。したがって、円柱の上皮細胞によってまたは腺上皮の中の細胞によって選択
的に発現されるマーカーにより、子宮頚部から生じている細胞が同定可能である。子宮膣
部上皮は、扁平上皮である。子宮膣部細胞の同定は、このように扁平上皮細胞に対して特
有のマーカー特性の検出によって達成可能である。特定の実施形態では、上皮細胞（円柱
であるのと同様に扁平上皮を含む）の検出が十分である。他の実施形態では、特に子宮頸
管内の細胞の分化が重要と思われる。大部分の異形成と異常増殖が起こる子宮頚部変換帯
でとられた試料であることを確証する試料中の子宮頸管内外の細胞の存在を確かめること
は、重要なステップである。そのような細胞がない場合、試料は試験手順に適切でない。
なぜならば、それは偽陰性結果を与えやすいからである。ｐ１６ＩＮＫ４ａがｐ１６ＩＮ
Ｋ４ａの正常子宮内膜細胞標準化で発現される可能性があることから、子宮内膜細胞の数
に関する発現レベルは、必要であると考えられる。
【００７９】
信頼性のある診断を可能とするために、標準化は、さらに、試料内の指定された細胞性
構成要素の有無の検出、さらに特定の細胞種類の総レベルの検出、または特定の細胞種類
が試料中の全細胞数に関与する分画の検出を含むことが可能である。
【００８０】
したがって、一実施形態では、ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の検出されたレベルは、特
定の試料に見受けられる細胞学的状態に標準化される可能性がある。ｐ１６ＩＮＫ４ａタ
ンパク質の検出レベルがｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現している子宮頚部細胞を示す場合、
または試料に子宮内膜細胞が過剰に存在する場に、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現を模倣す
ること言われている。この点で、標準化は分子マーカーを基礎として子宮頚部試料内で子
宮内膜細胞の量の決定することを含むものであってもよい。例えば分子マーカーによって
評価される子宮内膜細胞量に対して、子宮頚部試料で決定される医学的に関連した状態の
マーカーとしてのｐ１６ＩＮＫ４ａのレベルを比較することで、ｐ１６の総量が試料溶液
内に存在する子宮内膜細胞のみから生ずるかどうかを述べることが可能である。したがっ
て、子宮内膜細胞の高レベルの存在に起因しているｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する子宮
頚部上皮異形成の診断での偽陽性結果は、除外される可能性がある。本発明の文脈で使用
されるように、量は定量的または半定量的評価のことを言及することができる。このこと
は、例えば、細胞の総数の評価または細胞総数に対する分画の評価を含むものであっても
よい。本発明の特定の実施形態では、量の決定は、特定種類の細胞に起因する全体的なマ
ーカー・レベルの分画の評価に言及することが可能である。
【００８１】
子宮頚部標本評価のための標準化マーカーを提供するために、いくつかの標準化マーカ
ーが有用であると思われ、また、例えば以下から選択してもよい。すなわち、サイトケラ
チン、Ｅ−カドヘリン、インボルクリン、ウロキナーゼ様プラスミノーゲン−アクチベー
ター、ＳＣＣＡ（扁平上皮細胞癌抗原）、カテニン（例えばアルファ・カテニン、ベータ
・カテニン、ガンマ・カテニン（プラコグロビン））、Ｅｐ−Ｃａｍ。
【００８２】
標準化マーカーのいくつかの候補を、子宮頚部標本の特徴づけでの該標準化マーカーの
特性について、調べた。その結果を表２および表３に示す。
【００８３】
【表２−１】
【００８４】
【表２−２】
【００８５】
【表３】
【００８６】
標準化のためのマーカーを、例えば特異的細胞分化パターン、例えば特異的な上皮細胞
としての分化もしくは最終分化を表すマーカーとして、適用することが可能である。特定
の実施形態では、標準化マーカーは、例えば子宮頚部試料での子宮膣部細胞の存在を示す
扁平上皮細胞に対して特有のマーカー分子であってもよい。適当なマーカーとして、例え
ばＣＫ１３、Ｅカドヘリン、ガンマ・カテニン、またはインボルクリンを挙げることが可
能である。別の実施形態では、マーカーは、標本内での子宮頸管内細胞の存在を示す円柱
上皮細胞の存在に対して特異的なものであってもよい。適当なマーカーとして、Ｅｐ−Ｃ
ａｍ、ＣＫ１８、およびＣＫ８が挙げられる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、標準化は一般に上皮細胞の検出を含むものであってもよい。
これらのケースでは、上皮細胞の検出に適した任意のマーカーを使用することが可能であ
る。マーカーとして、例えば、図２および図３に示したものを用いることが可能である。
【００８８】
本発明のさらに別の実施形態では、本明細書に開示した方法は、呼吸器官の疾患を検出
するために使用することが可能である。小細胞肺癌の診断で、ニューロン特異的エノラー
ゼ（ＮＳＥ）の検出は、用いたマーカーのうちの１つである。腫瘍標本の試料は、ブラシ
または気管支肺胞性ラビッジによる細胞を集める気管支鏡検査法によって与えられる。Ｎ
ＳＥが肺内のわずかな正常細胞でも発現されることから、溶解した試料で検出されるＮＳ
Ｅ発現のレベルは、該試料内に存在する細胞の量を検出するための標準化マーカー（例え
ば、アクチン）と関連づけられなければならない。
【００８９】
本発明の第３の実施形態は、消化管（例えば大便試料からの結腸直腸病変）の病変の発
見である。この場合、指標核酸の起源および／または大便試料で検出可能なポリペプチド
は、診断の評価のために重要であると思われる。本発明によれば、使用されたマーカー分
子の起源（細胞種類／生物体）を決定することが可能である。このように、例えば、消化
管の粘膜の病変から生ずるマーカー分子よりもむしろ、個人によって摂取される食品から
生じているマーカー分子の検出にもとづく結果を、除去することが可能である。さらに、
血液循環からマーカーの痕跡の存在によって生じたアーチファクト、あるいは嚥下された
痰から生じるアーチファクト等は、本明細書に開示した方法を用いて取り除くことが可能
である。
【００９０】
本発明の別の態様は、本発明にもとづく方法を実施するための試験キットである。この
キットは、例えば診断キット、分析キット、または研究キットとすることができる。
【００９１】
本発明にもとづいて使用されるように、キットという用語は、診断装置と同様にキット
を含むものであってもよい。キットまたは装置は、例えばＥＬＩＳＡ（例えば、サンドイ
ッチ、競合、非競合等）、ＥＩＡ（競合、非競合他）、ＲＩＡ試験、ビーズをベースとす
る試験系、ラテラルフローアッセイ、フロー・スルー・アッセイ、ストリップ試験アッセ
イ、ディップ・スティック・アッセイ、またはラボラトリー、ベンチ・トップ、もしくは
ポイント・オブ・ケア試験フォーマット用に設計されたものであってもよい。本発明にも
とづくキットは、いくつかの実施形態では、診断試験を実施するためのインビトロ診断装
置を含むものであってもよい。インビトロ診断装置は、例えば当業者に公知のいずれかの
ＥＬＩＳＡ装置であってもよい。これらの装置は、サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマット
、競合的ＥＬＩＳＡフォーマット、および他のいずれかのＥＬＩＳＡフォーマットのため
の装置を含む。別の実施形態では、インビトロ診断装置はラテラルフローアッセイ装置、
またはフロー・スルー・アッセイ装置であってもよく、例えば、医学的に関連した状態に
対して特有のマーカーに結合する少なくとも１種類の試薬と、標準化マーカーに結合する
１種類の試薬とを用いるもので、これらの試薬は両方とも固相に固定される。そのような
装置は、試験結果を視覚化するために種々のメカニズムを用いることができる。特定の実
施形態では、上記試験は検出可能な部分に結合したマーカー分子に対する二次検出試薬を
用いることが可能である。検出可能な部分とは、金コロイド、（着色）ラテックス・ビー
ズ等を用いることが可能である。
【００９２】
さらに別の実施形態では、インビトロ診断検査装置は、毛細管または多孔性部材（例え
ば膜、ビーズまたは多孔性物質からなる他の三次元配列）にもとづいたフロー・スルー・
アッセイ装置であってもよい。実施形態にもとづくと、孔または毛細管のサイズは、最適
なフロー状態を確保するように調整される必要がある。
【００９３】
本発明にもとづくキットは、
（ａ）マーカー分子を検出するための試薬と、
（ｂ）検出反応を実施するために一般に用いられる試薬および緩衝液、例えば緩衝液、
検出マーカー、担体物質、およびその他と、
（ｃ）１種類以上のマーカーならびに／またはポジティブおよび／もしくはコントロー
ル反応を実行するための、診断すべき医学的に関連した状態を代表する試料と、
（ｄ）ポジティブおよび／またはコントロール反応を実行するための１種類以上の標準
化マーカー試料と、
を含むものであってもよい。
【００９４】
試験キットは、原試料を可溶化するために、任意に溶解緩衝液を含むものであってもよ
い。通常、溶解緩衝液は当業者に公知の適当な溶媒のいずれであってもよい。上記キット
で使用する溶解緩衝液は、例えばカオトロピック剤（例えば、尿素、ＧｕａＳＣＮ、ホル
ムアミド）、陰イオン洗浄剤（例えば、ＳＤＳ、Ｎ−ラウリル・サルコシン、デオキシコ
ール酸ナトリウム、アルキル・アリール・スルホン酸塩、長鎖（脂肪）アルコール硫酸塩
、オレフィン硫酸塩およびスルホン酸塩、アルファ・オレフィン硫酸塩およびスルホン酸
塩、硫酸化モノグリセリド、硫酸化エーテル、スルホコハク酸塩、アルカン・スルホン酸
塩、リン酸塩エステル、アルキル・イセチオン酸塩、ショ糖エステル）、陽イオン性界面
活性剤（例えば、セチル・トリメチルアンモニウム塩）、非イオン性界面活性剤（例えば
Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＮＰ−４０
、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、Ｎ−オクチル・グルコシド）または両性界面活性剤（例
えば、ＣＨＡＰＳ、３−ドデシル−ジメチルアンモニア−プロパン−１−スルホネート、
ラウリルジメチルアミン・オキシド）、および／またはＮａＯＨもしくはＫＯＨ等のアル
カリ水酸化物が考えられる。溶解緩衝液の例を表４に示す。
【００９５】
（表４）
溶解緩衝液 ウエスタン・ブロットでの ELISAとの適合性
ｐ１６１ＮＫ４ａの可溶化
界面活性剤：
0.1-1% SDS ＋ ＋／−
0.2-3% SDS ＋ ＜０．５％
0.2-3% DOC ＋＋ ＋／−
0.1-1% n-オクチルグリコシド ＋ あり
0.1-3% Triton X-100 ＋ あり
0.1-1% CHAPS ＋ ｎｄ。
【００９６】
界面活性剤−混合物：
RIPA(1%NP40、0.5%DOC、 ＋＋ あり
0.1%SDS、PBS)40-100%
SOX(0.5%DOC、0.5% ＋ あり
n-オクチルグリコシド)40-100%
mtm溶解緩衝液 ＋＋ あり
(3%TritonX-100,0.4%SDS,PBS)。
【００９７】
市販の溶解緩衝液：
Dynal(Dynal,Oslo,Norway) ＋＋ あり
M-PER/B-PER ＋＋ あり
(Pierce,Rockford,IL)
その他：
０．５〜８Ｍ尿素含有ＰＢＳ ＋＋＋ 適合性＜２M
Ｌａｍｍｌｉ試料緩衝液 ＋＋＋ なし
１０〜８０％ DMSO ＋＋＋ なし
１０〜８０％ホルムアミド ｎｄ なし
５０〜７０％ギ酸 ＋＋ なし
ＰＢＳ ＋／− あり
クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０） ＋／− あり
50mMNaCl含有リン酸緩衝液 ＋／− あり
ｎｄ：決定されず ＋／−：劣、＋：良好、＋＋：非常に良好、＋＋＋：優。
【００９８】
いくつかの実施形態では、溶解緩衝液は、原試料に含まれる構成要素の分解を妨げる１
種類以上の試薬をさらに含むものであってもよい。そのような構成要素は、例えば、酵素
阻害剤であり、例えばプロテアーゼ阻害剤、ＲＮＡアーゼ阻害剤、ＤＮアーゼ阻害剤等を
挙げることが可能である。阻害剤は、例えば、表５に挙げた組成物から選択されたプロテ
アーゼ阻害剤を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、分解の阻害剤を提供
する目的で溶解緩衝液は、試料中でのｐ１６の検出を可能とする。いくつかの実施形態で
は、サイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６が可溶化試料で分解されることで、そ
れが検出されなくなる可能性がある。もし試料が溶解媒体に直接送られて一定の期間そこ
で保存される場合、このことは、特にあてはまる。
【００９９】
（表５）
インヒビター 阻害された 濃度 水への溶解度 水中安定性
プロテアーゼ
のクラス
アプロチニン セリン 0.6-2μg/ml 非常に良好 良好
ベンズアミジン セリン 0.5-4mM 良好 良好
ベスタチン アミノペプチダーゼ 1-10μM 良好 良好
カルペプチン システイン 0.3-1μM 良好 良好
シスタチン システイン 1μM 良好 良好
Ｅ−６４ システイン 1-10μM 良好 良好
ＥＤＴＡ 金属 0.5-5mM 良好 良好
(Metallo)
エラスタチナル セリン 0.5-2μg/ml 劣 良好
ＥＳＴ システイン 20-50μg/ml 不良 劣
胎児血清 子牛全クラス 10％ 良好 良好
ロイペプチン セリン/システイン 10-100μM 良好 良好
ａ２− 全クラス 1μM 良好 良好
マクログロブリン
NCO-700 システイン 0.5-100mM 劣 劣
ペファブロク セリン 0.2-10μM 良好 非常に劣る
(Pefabloc=)
ＡＥＢＳＦ
ペプスタチンA アスパラギン 1μM 不良 劣
ＰＭＳＦ セリン 0.2-10μM 不良 非常に劣る
ｏ−フェナンスロリン 金属 1-10mM 不良 劣。
【０１００】
安定化を目的として、溶解緩衝液はまた、試料タンパク質と分解で競合するために、バ
ルク・タンパク質（例えばウシ血清アルブミンまたは仔牛血清アルブミンのようなアルブ
ミン、さもなければ他のバルク・タンパク質）を含むものであってもよい。バルク・タン
パク質を、例えば、プロテアーゼ阻害剤と組み合わせて、またはプロテアーゼ阻害剤の代
わりに添加してもよい。一実施形態では、試験のパフォーマンス（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、
またはストリップ試験パフォーマンス）と適合し、その結果、可溶性試料が直接試験に供
されるように、溶媒を選択することが可能である。上記文脈で用いられるように、試験は
マーカー分子の有無および／またはレベルを検出するための任意の手順を含むことが可能
である。
【０１０１】
マーカー分子を検出するための試薬は、マーカー分子と結合することが可能な任意の薬
剤を含むことが可能である。そのような試薬として、タンパク質、（ポリ）ペプチド、核
酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、糖タンパク質、プロテオグリカン、多糖類、または脂質が
挙げられる。
【０１０２】
医学的に関連した状態に対して特有のマーカーおよび／または正のコントロールおよび
／または負のコントロールをおこなう標準化マーカー試料は、例えば、溶液または塩等の
適用可能な形態にある核酸、適用可能な形態にあるペプチド、組織切片試料、微生物、ま
たはポジティブもしくはネガティブ細胞系統を含むものであってもよい。
【０１０３】
本発明の一実施形態では、マーカー分子の検出はポリペプチドのレベル上でおこなわれ
る。この実施形態では、結合剤は、例えば、マーカー分子またはそのフラグメントに対し
て特異的な抗体であってもよい。さらに、結合剤はＦａｂフラグメント等の抗原結合フラ
グメント、単一鎖抗体、二完能性ハイブリッド抗体、最小の抗原結合エピトープを含むペ
プチド模倣薬等を含むものであってもよい。さらに、上記結合剤は、マーカー分子上の特
異的炭化水素構造に対して結合するレクチンであるかもしれない。
【０１０４】
試験キットの別の実施形態では、マーカー分子の検出は、核酸レベル上でおこなわれる
。発明のこの実施形態で、検出のための試薬は、例えば上記マーカー核酸に対する核酸プ
ローブまたは逆相補性のプライマーであってもよい。
【０１０５】
以下の実施例は、説明することのみを目的としたものであり、本明細書に開示された発
明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１）子宮頚部切片での子宮頸管内上皮細胞および子宮膣部上皮細胞の特異的免
疫組織化学的検出
子宮頚部スワブの妥当性を示しているマーカーを評価するために、子宮頚部切片（４％
のホルムアルデヒド溶液で固定して、パラフィン包埋した）を、サイトケラチン１８（子
宮頸管内膜の円柱上皮のマーカー）およびサイトケラチン１０／１３（子宮膣部扁平上皮
のマーカー）とに対する抗体で染色した。図１は、抗サイトケラチン１８抗体による子宮
頸管内膜の上皮の特異的染色と、抗サイトケラチン１０／１３抗体による子宮膣部の特異
的染色を示す。実験は以下のように実施した。すなわち、
ホルマリン固定およびパラフィン包埋した切片を、キシレン浴５分間浸すことで脱パラ
フィン化し（ステップを１回繰り返した）、過剰の液体を取り除き、スライドを９５〜９
６％エタノールに３（±１）分間、７０％エタノールに３（±１）分間置き（ステップを
１回繰り返した）、最後に蒸留水に３０秒置いた。エピトープを回収するために、スライ
ドをコプリン・ジャーに置いて、１０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ ６．０で９５〜９９℃
、４０分間沸騰させた。この緩衝液中で、スライドを室温（ＲＴ）で２０分間（±１分）
冷やした。スライドをペルオキダーゼ遮断薬（３％Ｈ２Ｏ２；ＮａＮ３１５ｍＭ）で覆い
、室温で５（±１）分間インキュベートした。洗浄緩衝液で５分間洗浄した後、スライド
を一次抗体（ＣＫ１０／１３：ＤＥ−Ｋ１３、１：５０、ＤＡＫＯ；ＣＫ１８：Ｋ１８．
７、１μｇ／ｍｌ、ｄｉａｎｏｖａ）で３０分間インキュベートした。その後、スライド
を洗浄緩衝液ですすぎ、洗浄緩衝液で室温、５分間にわたって洗浄した。その後、ＥｎＶ
ｉｓｉｏｎ（抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ複合体；ＤＡＫＯを使用する用意がで
きている）で３０分間インキュベートし、スライドを３回、５分間洗浄し、さらにＤＡＢ
基質で１０分間インキュベートし、ヘマトキシリンによる対比染色をおこない、さらにフ
ァラマウント・マウンティング媒体によりマウントした。
【０１０７】
免疫組織化学的染色手順でサイトケラチン１８（ＣＫ１８）に対する抗体を用いること
で、子宮頚管内の円柱上皮で陽性反応が検出され（図１Ａ），その一方で子宮頸膣部の扁
平上皮では特異的染色が見られなかった（図１Ｂ）。サイトケラチン１０／１３（ＣＫ１
０／１３）に対する抗体による免疫組織化学的染色は、子宮頚管内の円柱上皮では何ら染
色がみられなかった（図１Ｃ）。その一方で、子宮頸膣部の扁平上皮が強く染色された（
図１Ｄ）。したがって、ＣＫ１８は、子宮頚管内の円柱上皮細胞検出のための特異的マー
カーとして、ＣＫ１０／１３は、子宮頚膣部の扁平上皮細胞検出のための特異的マーカー
として、用いることが可能である。
【０１０８】
（実施例２）子宮頚部スワブ由来の可溶化試料のウエスタン・ブロット分析
可溶化試料のウエスタン・ブロット分析が頚部病変の診断を評価することを可能にする
かどうかの評価をおこなうために、既知の診断による臨床試料を、試料材料の溶解の後、
マーカー分子に基づいて免疫化学的分析にかけた。
【０１０９】
臨床材料（子宮頚部スワブ）試料を標準的なウェスタン分析によって、以下のようにし
て分析をおこなった。
【０１１０】
要するに、超音波処理前に、臨床材料を第１ステップでＬａｒｍｉｌｉタンパク質試料
緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ．６．８，２％ ＳＤＳ，２００ ｍＭ ＤＴＴ，
０．０５％ ＢｐＢ）で沸騰（５分、９５℃）することで、該臨床材料を可溶化させた。
第２のステップでは、タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）に再
び溶解させ、その後、タンク・ブロッティングによって、ニトロセルロース膜に移した（
Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ：７６：４３５０−
４３５４）。さらなるステップでは、上記膜をブロックさせて非特異的抗体結合（１０％
脱脂乾燥乳含有ＰＢＳ）を防ぎ、続いて特異的モノクローナル・マウス抗体（ＣＫ８：３
５βＨ１１、１：１００、ＤＡＫＯ；ｐ１６ＩＮＫ４ａ；Ｄ７Ｄ７、１：１４０、ＭＴＭ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートした。特異的抗体の結合を光子放出基質
を触媒する西洋わさびペルオキシダーゼ共役二次試薬（マーカー特異的抗体に対して結合
）によって視覚化した。
【０１１１】
サイトケラチン８（ＣＫ８）を子宮頸管内膜の細胞特異的マーカーとして使用すること
で、本実験での試料回収の妥当性を示した。特異的疾患に関連したマーカーとして、サイ
クリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６ＩＮＫ４ａを用いた。
【０１１２】
本実験の結果を図２に示す。番号１ないし４は、個々の患者から得た試料（子宮頚部ス
ワブ）を示す。免疫ブロット検出は、サイトケラチン８（ＣＫ８）に対する特異的抗体と
ｐ１６ＩＮＫ４ａ（ｐ１６）に対する特異的結合とを用いて、おこなった。患者１、２、
および３の試料ではｐ１６ＩＮＫ４ａのシグナルが見られない。このことは、これらの試
料に異形成子宮頚部細胞が存在しないことを示している。患者４の試料は、ｐ１６ＩＮＫ
４ａの強いシグナルが見られる。このことは、試料に異形性子宮頚部細胞が存在すること
を示している。上側のバンドは、サイトケラチン８の特異的シグナルを示す。試料１、３
、および４では、サイトケラチン８を検出することができ、その一方で試料２ではシグナ
ルを見ることができない。このことは、子宮頸管内膜円柱細胞が試料１、３、および４に
存在し、試料２では存在しないことを示している。子宮頸管内膜円柱上皮細胞の存在が子
宮頚部スワブの妥当性に関するパラメータの１つであることから、試料２は不適当である
と考えられ、ｐ１６ＩＮＫ４ａの負の結果からはなんら診断結果を引き出すことはできな
い。試料１、３、４は、十分であるとみなされる。そのため、ｐＫ１６ＩＮＫ４ａについ
ての試料１および３のネガティブ・シグナルに基づいて、これらの患者は子宮頚部異形形
成を持たないことがわかった。試料４は、ｐＫ１６ＩＮＫ４ａに対する正のシグナルを示
し、この患者の異形子宮部病変の存在が示されている。
【０１１３】
複数のスワブの並行細胞学的分析をおこなうことで、女性１および３について通常の細
胞組成が示される。女性２では、細胞材料が乏しいため、なんら診断を得ることができな
かった。女性４では、高度の異形成が診断された。注目すべきことに、上側バンド（ＣＫ
８）が子宮頸管内膜の細胞特異的標準化マーカーであるサイトケラチン８を意味してお
り、試料収集の妥当性が示されている。下側バンドは、特異的疾患関連マーカーｐ１６Ｉ
ＮＫ４ａを示している。ブロットは、患者４について、高度子宮頚部異形成と整合したｐ
１６ＩＮＫ４ａの陽性シグナルを示す。患者１および３の試料は、ＣＫ８特異的バンドの
みを示し、適当な試料収集が示されているが、正常かつ健康な子宮頚部上皮と整合した疾
患関連したマーカー（ｐ１６ＩＮＫ４ａ）を示さない。患者２の試料は、この試料の低細
胞数と整合したＣＫ８シグナルを示さないことから、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対する負のシグ
ナルから診断結論を出すことはできない。
【０１１４】
（実施例３） 試料の妥当性を示すためのウエスタン・ブロットおよびＥＬＩＳＡ分析
試料の診断とは異なる溶液ベースの分析の結果が試料の妥当性によるものかどうかを評
価するために、診断（ＰａｐＩＶａおよびＰａｐＩＶｂの細胞学的診断にもとづいた高度
子宮頚部上皮内異常増殖）が確かめられた４人の異なる患者の子宮頚部スワブのウエスタ
ン・ブロット分析をおこなった。異形成細胞の存在を示すために、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対
する抗体を用いて、一方、試料の妥当性を示すためにＣＫ１８およびＣＫ１０／１３に対
する抗体を用いた。
【０１１５】
ウエスタン・ブロット分析を以下のようにおこなった。すなわち、患者試料を子宮頚部
ブラシで収集し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（２％ ＳＤＳ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
．６．８、０．０１％、１００ｍＭ ＤＴＴ）に、５分間、９５℃で直接溶解（１ｘ１０
７細胞／ｍｌ）、続いて超音波処理をおこなった（５ｘ５秒パルス、最大強度）。溶解物
を微小遠心器で遠心（１６，６００ｘｇ、１２分間）し、上清を新しい試験管に移した。
プレキャスト４〜２０％線形勾配アクリルアミド・ゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｓｙｓｔ
ｅｍ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に１０μｌ（１０５細胞）の全細胞抽出物を充填し、２５ｍＡの
定常電流を４５分間かけることでタンパク質を分離した。バイオ・ラッド・クライテリオ
ン・ブロッター（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｂｌｏｔｔｅｒ）を用いて標準
タンク・ブロッティングによりタンパク質をゲルからＨｙｂｏｎｄＥＣＬニトロセルロー
ス膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した（定常１００ボルトで１５分間、続いて定常５０ボル
トで４５分間）。ニトロセルロース膜をポンソーＳ溶液で５分間染色し、タンパク質の転
移を確認した。ＰＢＳによる２ｘ１０分間の洗浄によりポンソーＳ溶液を除去した。免疫
検出のために、ブロットをブロッキング緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含む１０％粉
ミルク含有ＰＢＳ）で一晩ブロックした。一次抗体は、攪拌しながら室温で１時間にわた
りブロッキング緩衝液中で製造元にしたがって希釈してインキュベートした（ＣＫ１８：
ＭＡＢ ３２３６），１：１０００，ＣＨＥＭＩＣＯＮ；ＣＫ１０／１３：ＤＥ−Ｋ１３
，１：５００，ＤＡＫＯ，ｐ１６ＩＮＫ４ａ：Ｄ７Ｄ７，１：１４０，ＭＴＭ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）。ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１０分間にわたり６回洗浄
した後、ブロットをウサギ抗マウスＨＲＰ（ＤＡＫＯ，ブロッキング緩衝液で１：５，０
００に希釈）により室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−
２０で１０分間にわたり６回洗浄した後、膜を基質溶液で５分間インキュベートし（Ｓｕ
ｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，
Ｐｉｅｒｃｅ）、プラスチック・エンベロープで包み、さらにＸ線フィルムに１〜５分
露出した。最後に、画像形成システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、Ｘ線フィルムを現像
、固定、乾燥、および記録した。同一の試料を用いてｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＣＫ １０／１
３、およびＣＫ１８についてＥＬＩＳＡ分析をおこなった。検出されたシグナルおよび結
果はウエスタン・ブロット分析に類似しており、同じ結論が導き出された。
【０１１６】
ＥＬＩＳＡ分析を以下のようにおこなった。すなわち、平底の９６穴（ウエル）プレー
ト（ＭａｘｉＳｏｒｂ； Ｎｕｎｃ）を一晩４℃で、捕捉抗体で被覆した（ｐ１６ＩＮＫ
４ａ： ＭＴＭ−Ｅ６Ｈ４，ＰＢＳ中 ２μｇ／ｍｌ，ＭＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ；ＣＫ１０：ＭＳ４８１Ｐ１ＡＢＸ，２μｇ／ｍｌ，ｄｉａｎｏｖａ；ＣＫ１８：Ｋ１
８．７，２μｇ／ｍｌ，ｄｉａｎｏｖａ；５０μｇｌ／ウエル）。プレートをＰＢＳ／０
．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）
でブロックした。子宮頚部スワブから得られた可溶化タンパク質抽出物をインキュベーシ
ョン緩衝液（ＰＢＳ，３％ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解
し、３連で各々のウエルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢ
Ｓ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、ビオチニル化検出抗体（ｐ１６ＩＮＫ４ａ
： ＭＴＭ−Ｄ７Ｄ７ （０．２ μｇ／ｍｌ， ＭＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
ＣＫ１０： ＭＳ４８１−ＢＯ， ２００ μｇ／ｍｌ， ｄｉａｎｏｖａ； ＣＫ１
８： ＭＳ１４２−ＢＯ， ２００ μｇ／ｍｌ， ｄｉａｎｏｖａ；インキュベーショ
ン緩衝液中）と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０Ｔ
ＭＢによる洗浄を６回行った後、５０μｌのストレプトアビジン被覆アルカリ・ホスファ
ターゼ（１：１０００希釈；Ｄｉａｎｏｖａ）を３０分間にわたり加えた。その後、プレ
ートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、１００μｌのｐ−ニトロフェニ
ル・ホスファターゼ基質（ＰｎＰＰ；ジエタノール・アミン緩衝液に溶解）を各々のウェ
ルに加えた。３０分後、１時間後、および２時間後に、ＥＬＩＳＡ読取装置（Ｔｅｃａｎ
）でＯＤ４０５ｎｍ（６２０ｎｍ参照波長）を測定した。本実施例は、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡフォーマットが、本発明にもとづいた方法での使用に適している感度を示すことを
示した。本明細書に開示された方法で使用するために、この実施例で述べたように、サン
ドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを複数のマーカー分子、例えば標準化／妥当性のマーカ
ーおよび医学的に関連した状態に対して特有のマーカーに対して適用可能である。
【０１１７】
高度子宮頚部異形成（「診断」を参照のこと）にかかっている４人の患者の試料を、ウ
エスタン・ブロット分析（図面の上側パネル）を用いて分析した。免疫ブロット検出が、
左側のブロットに対してはβアクチンおよびｐ１６ＩＮＫ４ａに対して特異的な抗体を用
いておこなわれ、中間のブロットに対しては、サイトケラチン１０／１３に対して特異的
な抗体を用いておこなわれ、さらに右側のブロットに対しては、サイトケラチン１８に特
異的な抗体が用いられた。βアクチン、ＣＫ１８、およびＣＫ１０／１３を、試料の妥当
性を実証するマーカとして使用した。βアクチンは任意の細胞の存在を示し、ＣＫ１０／
１３は子宮膣部扁平上皮細胞の存在を示し、またＣＫ１８は子宮頸管内膜円柱細胞の存在
を示す。
【０１１８】
図３に示すように、患者１および２の試料について、免疫ブロット検出は、全ての適用
された妥当性マーカー（ＣＫ１０／１３、ＣＫ１８、β−アクチン）に対して、また異形
成細胞を示すマーカー（ｐ１６ＩＮＫ４ａ）に対して、正のシグナルを示す。試料３およ
び４は、ウエスタン・ブロットでのｐ１６ＩＮＫ４ａバンドに関してネガティブ（負）で
あった。しかし、これらのケースでは、βアクチンおよび２種類のサイトケラチン・マー
カーは非常に弱い（患者３、βアクチン）または負の（患者４、すべてのマーカー；患者
３、ＣＫマーカー）シグナルをウェスタンブロットにおいて示す。したがって、ｐ１６Ｉ
ＮＫ４ａに対する負のシグナルから導き出される診断結果はない。
【０１１９】
この図の下側のパネルは、ＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。妥当性マーカー（ＣＫ１０／
１３，ＣＫ１８）の正のシグナルが患者１および２の試料について検出され、一方患者３
および４の試料についてはＣＫ１０／１３およびＣＫ１８に対する信号が検出されない。
したがって、ＥＬＩＳＡ分析結果は、ウエスタン・ブロット分析結果と類似しており、同
一の結論を導き出すことができる。
【０１２０】
（実施例４）肺起源の異なる試料のウエスタン・ブロット分析
可溶化試料のウエスタン・ブロット分析が肺病変の診断を可能とするかどうかを評価す
るために、既知の診断による臨床試料を可溶化し、マーカーおよび標準化分子に基づいた
免疫化学的分析にかけた。
【０１２１】
臨床試料（ブラッシングまたは気管支肺胞洗浄液によって集められる細胞）を、次のよ
うに標準的ウエスタン・ブロットによって分析した。気管支肺胞洗浄液から得た細胞を遠
心（１０００ｒｐｍ、５分）によってペレットにし、該ペレットをＬａｍｍｌｉタンパク
質試料緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ．６．８、２％ＳＤＳ、２００ｍＭのＤＴＴ
、０．０５％のＢｐＢ）に溶かした。ブラッシングによって得られる細胞を、直接Ｌａｍ
ｍｌｉタンパク質試料緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ．６．８、２％のＳＤＳ、２
００ｍＭのＤＴＴ、０．０５％のＢｐＢ）に溶かした。材料を、超音波処理に先立って沸
騰させた５分、９５℃）。第２のステップでは、タンパク質試料のアリコートをＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）で二連に分析し、続いてタンク・ブロッティングによ
りニトロセルロース膜に移した（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ；７６：４３５０−４３５４）。さらに別のステップでは、膜をブロックし
て非特異的な抗体結合（１０％無脂肪乾燥乳 PBS中）を防ぎ、続いて１枚の膜をＮＳＥ
に対する特異的モノクローナル・マウス抗体とインキュベートした（ＤＡＫＯ Ｇｅｒｍ
ａｎｙ，クローンＢＳＳ／ＮＣ／ＶＩ−Ｈ１４，マウス・モノクローナル抗体，希釈 １
：１０００；）。さらに、一枚の膜を標準化マーカー・アクチンとインキュベートした（
ＩＣＮ，ＵＳＡ，クローンＣ４，マウス・モノクローナル，希釈１：４００）。特異的抗
体の結合は、光子放出基質を触媒する第二の試薬（マーカー特異的抗体と結合）と共役し
た西洋わさびペルオキシダーゼによって、可視化された。
【０１２２】
既知の小細胞肺癌を持つ患者の気管支肺胞内洗浄液では、アクチンの発現レベルと比較
して高いレベルのＮＳＥが検出され、一方、腫瘍のない患者ではわずかなＮＳＥも見つけ
られることができなかったが、アクチン・レベルは癌患者のレベルと同等だった（データ
示さず）。
【０１２３】
結果は、本明細書に示した方法にもとづく溶液ベースの試験手順の標準化によって、形
態学的な情報に頼ることなく、疾患の診断を評価することが可能となることを示している
。
【０１２４】
（実施例５）ＥＬＩＳＡ試験フォーマットでの子宮頚部上皮内異常増殖の検出
溶解緩衝液内で得られる３４種類の子宮頚部スワブに対して、該スワブ内に含有される
細胞から調製した溶液中の、サイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６ＩＮＫ４ａの
過剰発現のＥＬＩＳＡベースの検出をおこなった。ＥＬＩＳＡ試験は以下のように実行し
た。
【０１２５】
（Ａ）細胞溶解
・子宮頚部スワブ・ブラシを、ｍｔｍ溶解緩衝液２ｍｌを含有する１５ｍｌ容器に入れる
。該ブラシに存在する子宮頚部細胞を少なくとも２０時間溶解する。その後、子宮頚部ス
ワブ試料の溶解物を２ｍｌ管に移し、４℃で遠心する（２８，０００ｘｇ（１６，６００
ｒｐｍ Ｈｉｇｈｓｐｅｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＪＥＣ Ｍｕｌｔｉ ＲＦ）で１
５分）。上清を新たな管に移す。場合に応じて、上清を−２０℃で保存することが可能で
ある。
【０１２６】
（Ｂ）ＥＬＩＳＡの実行
（ＥＬＩＳＡプレートのコーティング）
・ｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的抗体クローンｍｔｍ Ｅ６Ｈ４、Ｅｐ−Ｃａｍ特異的抗体Ｂｅ
ｒ−Ｅｐ４、およびガンマ・カテニン特異的抗体クローン１５の原液をＰＢＳで希釈し、
即時使用可能なコーティング溶液とする。
・即時使用可能な捕捉抗体コーティング溶液をそれぞれ５０μｌずつＥＬＩＳＡプレート
に添加する。
・コーティングのために、該プレートを４℃で一晩インキュベートする。
・コーティング溶液をＥＬＩＳＡプレートから除去し、該プレートを、自動ＥＬＩＳＡ洗
浄器を用いて以下のように洗浄する。すなわち、
洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）含有ＰＢＳ）２５０μｌを用いて７回。
・洗浄緩衝液の残りを除去した後、３００μｌブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ含有ＰＢ
Ｓ）を各ウェルに添加する。振動装置上で、プレートを外界温度で１時間インキュベート
する。
【０１２７】
（試料を用いたインキュベーション）
・ブロッキング緩衝液を除去した後、溶解した細胞試料１００μｌを各ウェルに添加する
。ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびガンマ・カテニンを特異的に検出する抗体に対するポジティブ
・コントロールとしてＨｅＬａ細胞の溶解物を、Ｅｐ−Ｃａｍを特異的に検出する抗体に
対するポジティブ・コントロールとしてＨＴ２９細胞の溶解物を用いる。
・試験のキャリブレーションのために、異なる濃度の組み換え型ｐ１６タンパク質、組み
換え型ガンマ・カテニン、およびＥｐ−Ｃａｍ（０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、１００
ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ）を該試験に包含
する。
・試料を室温で１時間インキュベートする。
・その後、自動ＥＬＩＳＡ洗浄器で以下のように洗浄を実行する。すなわち、
洗浄緩衝液２５０μｌを用いて７回。残存する緩衝液を除去する。
【０１２８】
（検出用抗体を用いたインキュベーション）
・ビオチン標識２次抗体（ｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的クローンｍｔｍ Ｄ７Ｄ７、Ｅｐ−Ｃ
ａｍ特異的クローンＡ５Ｂ４、およびガンマ・カテニン特異的クローンＭＡＢ２０８３）
のワーキング溶液を原液の希釈によって調製する。
・ビオチン標識２次抗体ワーキング溶液１００μｌを、対応する抗原および捕捉抗体でイ
ンキュベートしたウェルに添加する。ＲＴでの１時間のインキュベーション後、抗体溶液
を除去して、ＥＬＩＳＡプレートを自動ＥＬＩＳＡ洗浄器によって洗浄する。
・すなわち、洗浄緩衝液２５０μｌを用いて７回。
【０１２９】
（検出）
・ストレプトアビジン・ＨＲＰ・高分子（１ｍｇ／ｍｌ）を１：１０で前希釈（４μｌ＋
３６μｌインキュベーション緩衝液）する。インキュベーション緩衝液（０．１％ＢＳＡ
含有ＰＢＳ）で１：３００の希釈によって、最終インキュベーション溶液を調製し、最終
濃度０．３３μｇ／ｍｌにする。
・この溶液の１００μｌを各ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートする。
・その後、該緩衝液を除去し、１ウェル当たり２００μｌの洗浄緩衝液を用いて、該プレ
ートを手動で５回洗浄する。
【０１３０】
（基質のインキュベーション）
・暗所で、ＴＭＢ基質を１時間２５℃に平衡させる。
・基質溶液１００μｌを各ウェルに添加する。
・暗所で、ＥＬＩＳＡプレートを２５℃で厳密に１５分間インキュベートする。２．５Ｍ
Ｈ２ＳＯ４を８０μｌ添加して、反応を停止させる。
・反応を停止して５分以内に、ＯＤ４５０ｎｍを測定する。結果を評価した後、各試料の
該ＯＤに対する値を得る。
【０１３１】
（結果の評価）
・試料の妥当性としては、最小限の細胞の適切なサンプリングを証明するために、ガンマ
・カテニン用の全ての試料のＯＤ値が所定の閾値を超えていなければならない。適切なサ
ンプリングをさらに確実にするためには、子宮頸管内膜の細胞の存在を示すＥｐ−Ｃａｍ
のＯＤ値に対する閾値を超えていなければならない。
・異形成細胞の検出のために、最小限のｐ１６陽性異形成細胞の存在を証明するために、
ｐ１６ＩＮＫ４に対するＯＤ値が所定の閾値を超えていなければならない。
・この実験結果を表６に示す。
【０１３２】
（表６）
試料数 ｐ１６ＩＮＫ４ａ ガンマ・カテニン 結論
３ ＋ ＋ 試料は妥当である
ｐ１６ＩＮＫ４ａは、異形成細胞の存在を
示す
３０ − ＋ 試料は妥当である
検出可能なｐ１６ＩＮＫ４ａの不在は、
異形成細胞の不在を示す
１ − − 試料は妥当ではない
再サンプリングが必要である。
【０１３３】
３４種類の試料のｐ１６ＩＮＫ４ａおよびガンマ・カテニンに対するＯＤ値と対応する
閾値との比較によって、３３種類の試料が妥当であり、さらに評価されうることが明らか
になった。これらの３３種類の試料のうち、３０種類の試料がｐ１６ＩＮＫ４ａに対して
陰性であり、３種類が陽性であった。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡの結果を、同患者から得たパパニコラウ試験（ＰＡＰ試験、子宮頚部細胞学
）の診断結果と比較した。Ｍｕｎｉｃｈ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＩＩ （１９
９０）に準じて、子宮頚部細胞学を評価した。イン・サイチュで、ＰａｐＩＩは、良性細
胞、子宮頸管炎、および化生を包含し、ＰａｐＩＶは、重度異形成および癌腫を包含する
。ＥＬＩＳＡで０．９より大きいｐ１６ＩＮＫ４ａに対するＯＤを得た試料は、従来の細
胞学的ＰＡＰ試験によって異型性として分類される試料に対応することが判明した。
【０１３５】
試料の評価のために、ＯＤ０．９を閾値として適用すると、ＥＬＩＳＡの結果を以下の
ように報告することが可能である。
【０１３６】
（表７）
診断／ELISA結果 ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性ELISA ｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性ELISA
ＰａｐＩＩ ０ ３０
ＰａｐＩＶ ３ ０
不十分な細胞 ０ １。
【０１３７】
ＥＬＩＳＡ試験は、重度の異形成を有する女性由来の３種類の試料全てで陽性（１００
％）であり、異形成ではない女性の３０種類の試料全てで陰性（１００％）である。１つ
の試料のみが非常に少ない細胞を含有していたため、サンプリングが妥当ではないので評
価から除外した。
【０１３８】
上皮細胞の存在に特有の標準化マーカーに対する、可溶化した患者試料内のｐ１６ＩＮ
Ｋ４ａタンパク質レベルの標準化によって、該試料由来の異形成の診断を評価することが
可能になる。この場合の標準化によって、特に、妥当ではないサンプリング（例えば、分
析を実行するために十分ではない患者材料の総量、または正しい解剖学的位置で採取され
ていない患者材料）による偽陰性結果を避けることが可能になる。ＥＬＩＳＡで測定され
たガンマ・カテニン標準化マーカーに対するＯＤの閾値を適用することによって、試験フ
ォーマットで標準化を実行する。該試料は、該閾値を超えると妥当であるとして分類され
る。特定の閾値（２００，０００個の扁平上皮子宮膣部細胞に対応）未満では、該試料は
、患者材料の妥当量を含有していない。子宮頸管内膜の細胞の存在を示す第２の標準化マ
ーカーを用いることによって、該試料の妥当性について更なる情報がもたらされる。ＥＬ
ＩＳＡで測定されたＥｐ−Ｃａｍ標準化マーカーに対するＯＤの閾値を適用することによ
って、試験フォーマットで標準化を実行する。該試料は、該閾値を超えると妥当であると
して分類される。特定の閾値（２０００個の円柱子宮頸管内膜の細胞に対応）未満では、
該試料は、子宮頸管内膜の細胞の妥当量を含有していない。（この実施例で適用する閾値
は特定の反応条件に合わせていないことが理解されなければならない。ＯＤと同様に細胞
に対する値も、反応条件によって変わり得る。したがって、本明細書での値は、条件を例
示することを意図しており、本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、特定の試
験フォーマットに対する適切な閾値をどのように確立するかについて知っている）。子宮
頸管内膜の細胞の存在によって、スワブまたはブラシが子宮頚内膜の円柱上皮と接触して
いたという情報が与えられ、したがって、子宮頚部上皮異形成が通常発生する変性地帯と
スワブまたはブラシの接触を示唆する。具体的には、特定量の子宮頸管内の細胞（Ｅｐ−
Ｃａｍ）と合わせて特定量の子宮膣部細胞（ガンマ・カテニン）を検出することによって
、患者材料が正しい解剖学的位置（子宮頚部変性地帯）で採取されたという情報が高い確
率で得られる。
【０１３９】
これらの実験で評価された閾値を用いて、３００人の患者の細胞学的標本を、提示した
ＥＬＩＳＡ試験フォーマットで試験した。この実験では、細胞学的検査によって異形成で
あると示された標本は、ＥＬＩＳＡ試験フォーマットでもまた、異形成であると示されう
る。
【０１４０】
（実施例６）ＥＬＩＳＡ試験フォーマットでの子宮頚部上皮内異常増殖の検出
溶解緩衝液内で得られる実施例５ですでに用いた３４種類の子宮頚部スワブに対して、該
スワブ内に含有される細胞から調製した溶液内で、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質および１種類
の妥当性用マーカーの過剰増殖のＥＬＩＳＡベースの検出をおこなった。ＥＬＩＳＡ試験
は以下のように実行した。
【０１４１】
（Ａ）細胞溶解
子宮頚部スワブ・ブラシを、ｍｔｍ溶解緩衝液２ｍｌを含有する１５ｍｌ容器に入れる
。該ブラシに存在する子宮頚部細胞を少なくとも２０時間溶解する。その後、子宮頚部ス
ワブ試料の溶解物を２ｍｌ管に移し、４℃で遠心する（２８，０００ｘｇ（１６，６００
ｒｐｍ Ｈｉｇｈｓｐｅｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＪＥＣ Ｍｕｌｔｉ ＲＦ）で１
５分）。上清を新たな管に移す。場合に応じて、上清を−２０℃で保存することが可能で
ある。
【０１４２】
（Ｂ）ＥＬＩＳＡの実行
・ＥＬＩＳＡプレートのコーティング
・Ｅ７特異的抗体クローンＮＭ２およびガンマ・カテニン特異的抗体クローン１５の原液
をＰＢＳで希釈し、即時使用可能なコーティング溶液とする。
・即時使用可能な捕捉抗体コーティング溶液をそれぞれ５０μｌずつＥＬＩＳＡプレート
に添加する。
・コーティングのために、該プレートを４℃で一晩インキュベートする。
・コーティング溶液をＥＬＩＳＡプレートから除去し、該プレートを、自動ＥＬＩＳＡ洗
浄器を用いて以下のように洗浄する。すなわち、
洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）含有ＰＢＳ）２５０μｌを用いて７回
。
・洗浄緩衝液の残りを除去した後、ブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）３００
μｌを各ウェルに添加する。振動装置上で、プレートを外界温度で１時間インキュベート
する。
【０１４３】
（試料とのインキュベーション）
・ブロッキング緩衝液を除去した後、溶解した細胞試料１００μｌを各ウェルに添加する
。ガンマ・カテニンを特異的に検出する抗体に対するポジティブ・コントロールとしてＨ
ｅＬａ細胞の溶解物を用いる。試験のキャリブレーションのために、異なる濃度の組み換
え型ＨＰＶ １６ Ｅ７タンパク質および組み換え型ガンマ・カテニン（０ｐｇ／ｍｌ、
５０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、８００ｐｇ
／ｍｌ）を該試験に包含する。
・試料を室温で１時間インキュベートする。
・その後、自動ＥＬＩＳＡ洗浄器で以下のように洗浄を実行する。すなわち、
・洗浄緩衝液２５０μｌを用いて７回。残存する緩衝液を除去する。
【０１４４】
（検出用抗体とのインキュベーション）
・ビオチン標識２次抗体（ＨＰＶ １６ Ｅ７タンパク質特異的クローンＮＭ１３および
ガンマ・カテニン特異的クローンＭＡＢ２０８３）のワーキング溶液を原液の希釈によっ
て調製する。
・ビオチン標識２次抗体ワーキング溶液１００μｌをウェルに添加して、対応する抗原お
よび捕捉抗体とインキュベートする。ＲＴでの１時間のインキュベーション後、抗体溶液
を除去して、ＥＬＩＳＡプレートを自動ＥＬＩＳＡ洗浄器によって洗浄する。
・すなわち、洗浄緩衝液２５０μｌを用いて７回。
【０１４５】
（検出）
・ストレプトアビジン・ＨＲＰ・高分子（１ｍｇ／ｍｌ）を１：１０で前希釈（４μｌ＋
３６μｌインキュベーション緩衝液）する。インキュベーション緩衝液（０．１％ＢＳＡ
含有ＰＢＳ）中の１：３００の希釈によって、最終インキュベーション溶液を調製し、最
終濃度０．３３μｇ／ｍｌにする。
・この溶液の１００μｌを各ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートする。
・その後、該緩衝液を除去し、１ウェル当たり２００μｌの洗浄緩衝液を用いて、該プレ
ートを手動で５回洗浄する。
【０１４６】
（基質のインキュベーション）
・暗所で、ＴＭＢ基質を１時間２５℃に平衡させる。
・基質溶液１００μｌを各ウェルに添加する。
・暗所で、ＥＬＩＳＡプレートを２５℃で厳密に１５分間インキュベートする。２．５Ｍ
Ｈ２ＳＯ４を８０μｌ添加して、反応を停止させる。
・反応を停止して５分以内に、ＯＤ４５０ｎｍを測定する。結果を評価した後、各試料の
該ＯＤに対する値を得る。
【０１４７】
（結果の評価）
・試料の妥当性としては、最小限の上皮細胞の存在を証明するために、ガンマ・カテニン
用の全ての試料のＯＤ値が所定の閾値を超えていなければならない（実施例５参照）。
・異形成細胞の検出のために、最小限の変性細胞の存在を証明するために、ＨＰＶ １６
Ｅ７に対するＯＤ値が所定の閾値を超えていなければならない。閾値は、使用したＥＬ
ＩＳＡ条件に依存し、当試験フォーマットでは、ＯＤ０．７として設定した。
・３４種類の試料のＨＰＶ １６ Ｅ７およびガンマ・カテニンに対するＯＤ値と閾値と
の比較によって、３３種類の試料が、ガンマ・カテニンの検出によって、上皮細胞を含有
することが明らかになった。
【０１４８】
ここで、好ましい実施形態によって本発明を説明してきたが、本発明の範囲から逸脱せ
ずに、様々な変更が可能であることが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の方法。
【請求項１】
明細書に記載の方法。
【図２】
【図１】
【図３】
【図１】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２６６４６０（Ｐ２０１０−２６６４６０Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５７２８８（Ｐ２０１０−１５７２８８）
【出願日】平成２２年７月９日（２０１０．７．９）
【分割の表示】特願２００４−５２５４３３（Ｐ２００４−５２５４３３）の分割
【原出願日】平成１５年７月３１日（２００３．７．３１）
【出願人】（５０４３４１７９３）エムティーエム ラボラトリーズ アクチェンゲゼルシャフト (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月９日（２０１０．７．９）
【分割の表示】特願２００４−５２５４３３（Ｐ２００４−５２５４３３）の分割
【原出願日】平成１５年７月３１日（２００３．７．３１）
【出願人】（５０４３４１７９３）エムティーエム ラボラトリーズ アクチェンゲゼルシャフト (9)
【Ｆターム（参考）】
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