溶菌剤
【課題】 病原性細菌の溶菌作用に優れ、安全性の高く、食中毒防止、食品・化粧品の細菌汚染防止やヒト、動物、養殖魚介類、植物の病気予防法を提供する。
【解決手段】 病原性細菌を乳酸菌処理物で溶菌することで、経口摂取により食中毒を防止し、食品および化粧品に配合することで微生物汚染を防止し、飼料に配合することで、細菌性に起因する疾病を防止、若しくは予防する。さらに植物に散布することで細菌性の病気を防止・予防し、前記課題を解決する。
【解決手段】 病原性細菌を乳酸菌処理物で溶菌することで、経口摂取により食中毒を防止し、食品および化粧品に配合することで微生物汚染を防止し、飼料に配合することで、細菌性に起因する疾病を防止、若しくは予防する。さらに植物に散布することで細菌性の病気を防止・予防し、前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌性食中毒、食品の保存、化粧品の微生物汚染防止、家畜・家禽・養殖魚の疾病予防、衣服・物品の消毒、身体消毒・洗浄、植物疾病予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品・化粧品等の微生物汚染や増殖による弊害は、不十分な衛生状態・防腐対策を怠ることで、生じている。その対策は素材や調理の衛生状態の改善や微生物の一次汚染をなくすことが第一であるが、食品・化粧品の微生物増殖・汚染防止として、従来ソルビン酸、安息香酸及びその塩類、パラベン類の合成保存料、リゾチーム、リモネン、プロタミン、キトサン、ペクチン分解物、茶抽出物の天然系保存料が使用されている（特許文献１、２、３参照）。しかしながら、これらは安全性、刺激性、その効果、さらにその素材の色調、味覚において十分に満足させるものではない。
【０００３】
またヒトや動植物の微生物汚染防止または治療として、抗生物質が多量に使用され、人類史上それまで有効な治療方法のなかった多くの感染症が制圧され人類に大きな福音をもたらした。抗生物質はこのような特性からヒトばかりでなく家畜、家禽、養殖魚の細菌性の疾病に広く使用され、日本国内では年間約２０００トンも使用されるようになり、このような抗生物質の乱用により耐性菌が増加し、ヒトの死亡率の増加、食への安全性の問題が生じている（非特許文献１）
【０００４】
乳酸菌は古来、食品保存、食品として長年使用され、最近では免疫賦活作用、整腸作用、コレステロール低減作用、抗腫瘍作用が注目され、健康維持のため幅広く飲用されるようになってきた（非特許文献２参照）。
そこで、微生物汚染を防ぐために、安全性の高く、健康に良いと言われている乳酸菌が検討されている（非特許文献３参照）。
【０００５】
しかしながら、これらの乳酸菌は直接、微生物に対して作用を示すものではなく、乳酸菌を服用し、免疫機能を高め、ＩｇＡの作用により間接的に抗菌作用を示すものである。従ってその効果は軽微で食品添加物や直接微生物に対して作用もないことから用途は限定される。また、ストレプトコッカスの酵素前駆体組成物がグラム陽性菌の阻止および溶菌作用を示すことが報告されているが、これは菌体そのものではなく、菌体細胞質からの抽出成分である（非特許文献４）。
【０００６】
以上の事項から、細菌に対して耐性菌が生じることなく安全で使用感に影響を与えず、病原性微生物に対する抗菌作用を有する添加物の開発が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】特許公報 昭６２−５３１４１号公報
【特許文献２】特許公報 平４−３５１５１号公報
【特許文献３】特許公報 平５−５８７０２号公報
【非特許文献１】日本子孫基金・編 「食べ物から広がる耐性菌」発行所：株式会社三五館（２００３）
【非特許文献２】細野明義・編 「発酵乳の科学」アイ・ケイコーポレーション社（２００２)
【非特許文献３】小崎道雄・佐藤英一・編著「乳酸発酵の新しい系譜」中央法規出版株式会社（２００４）
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒ Ｗ．Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｙｍｏｇｅｎｅｓ Ｌｙｓｉｎ、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｊａｎ．Ｐ１５６−１５９ （１９７１ ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、ヒト、家畜、家禽、魚介類、植物に対して安全性が高く、微生物汚染、細菌性疾病に対処する溶菌作用を有する添加剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記目的を達成するために、すでに食経験からも安全性が確認されている乳酸菌に着目し、鋭意研究を重ねた結果、乳酸菌を培養し、菌体を超音波処理、ホモジナイザー粉砕もしくは凍結・融解のいずれの方法にて処理し、水、または生理食塩水で洗浄し、遠心分離後、細胞質を除いた細胞膜のみを凍結乾燥、もしくは低温乾燥して得られる乳酸菌処理物が病原性細菌を溶菌させるとの新知見を得、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に乳酸菌処理物は顕著に病原性細菌の増殖を抑制した。本発明品は、食品・化粧料の防腐剤、家畜、家禽、養殖魚・海老飼料、植物病気予防剤、医薬品において上記目的のあらゆる分野に応用可能で、乳酸菌処理物を有効成分として食品、化粧品に配合すると微生物の増殖が抑制され、微生物の二次汚染や食中毒を予防・防止することが可能となった。また、家畜・家禽・魚介類の飼料として経口投与すると病原性細菌による疾患を予防・防止することが可能となり、その効果を発揮することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に用いられる乳酸菌はラクトバチルス（Lactobacillus）属、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ラクトコッカス（Lacococcus）属、ロイコノストックス（Lueconostoc）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属及びワイセラ（Weissella）属等に属する乳酸菌を培養して得られる菌体の処理物からなる群より選ばれた１種又は２種以上である。
【００１２】
上記の本発明の乳酸菌の処理物調製法は、菌体を破砕し、細胞質を除去し、細胞膜を得るものである。従って菌の増殖能はない。その処理方法および乳酸菌の種類は特に制限されるものではないが、その例としては、先ずラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストックス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス及びワイセラ属等に属する乳酸菌をその乳酸菌に適した培地を用いて培養する。その後、培地と菌体を遠心分離器にて分離し、水、または生理食塩水にて洗浄し、菌体を得る。さらに菌体を水、または生理食塩水に懸濁し、超音波、ホモジナイザー、凍結・融解法にて菌体膜を破壊する。その後遠心分離・洗浄工程を経て、乳酸菌の細胞菌のみを得る。これを凍結乾燥および低温乾燥にて乳酸菌処理物を得る。必要ならば工程中に溶菌効果低下に影響を及ぼさない範囲で更に、細胞膜の純度を向上させるために活性炭、シリカゲル、イオン交換樹脂等を使用し、脱臭、脱色等の精製処理をしても良い。
【００１３】
本発明で使用する乳酸菌にはラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストックス属、ストレプトコッカス属及びエンテロコッカス属等があるが、これらの属および種に限定されるものではない。ラクトバチルス属としては、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチル・プランタム、スラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ペントーサス等がある。ラクトコッカス属としては、ラクトコッカスおよびラクチスクレモリス等がある。ペディオコッカス属としては、ペディオコッカス・ペントサセウス、ペディオコッカス・アシディラクティシ、ペディオコッカス・ヘパリナス等がある。 ロイコノストックス属としては、ロイコノストックス・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ロイコノストックス・メセンテロイデス等がある。ストレプトコッカス属としてはストレプトコッカス・ サーモフィラスがある。エンテロコッカス属にはエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ワイセラ属としては、ワイセラ・シバリア、ワイセラ・コンフューサ、ワイセラ・ヘレニカ、ワイセラ・カンドレリ、ワイセラ・マイナー、ワイセラ・パラメセンテロイデスまたは／およびワイセラ・タイランデンシス等を挙げることができる。
【００１４】
これらの種に属する乳酸菌の中でも、ラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ１Ｒ株、ペディオコッカス ペントサセウス キリシマ１Ｃ株、ラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ３Ｒ株、ペディオコッカス・アシディラクティシ キリシマ２Ｃ株などがグラム陽性菌およびグラム陰性菌の病原菌に対して溶菌作用が強く好適である。なお、これらの菌株は下記の受託番号によりセンターに寄託されている。
【００１５】
ラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ１Ｒ (ＮＩＴＥ Ｐ−７８４)
ペディオコッカス・ペントサセウス キリシマ１Ｃ (ＮＩＴＥ Ｐ-７８７)
ラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ３Ｒ (ＮＩＴＥ Ｐ-７８６)
ペディオコッカス・アシディラクティシ キリシマ２Ｃ (ＮＩＴＥ Ｐ-７８８)
【００１６】
好ましい乳酸菌の培養方法の例としては、本発明に用いる培地は天然培地、合成培地、半合成培地などの培地がある。培地の窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等が使用できる。炭素源としてはグルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、デンプン、バガス、フスマ、糖蜜、グルセリン等が使用できる。この他に窒素源と炭素源を含むスキムミルク、またはその分解物、コーンスティープリカー、焼酎粕、大豆粕とその分解物も培地の成分の一成分として配合可能である。この他にミネラルやイオン化成分として鉄、マンガン、モリブデン、塩化マグネシウム、食塩、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム等の成分の配合が可能である。さらに適宜乳酸菌の特性に応じて各種のビタミン、界面活性剤、有機酸、トマトジュースを添加できる。
【００１７】
培養温度は２５℃〜４５℃であるが、好ましくは約３０〜３７℃で、培養時間は約１２〜４８時で静置もしくは振とう培養でもよい。培地のｐＨは３〜７で、このましくはｐＨ４〜６である。培養終了後、菌体を採取し、上記で示した方法にて処理し、溶菌作用を有する乳酸菌処理物を得る。
【００１８】
本発明の溶菌作用を有する乳酸菌処理物のその形態については、この有効成分を含む限り特に制限はなく、液状、ペースト状、ゲル状等のいずれの形態で用いることもできる。さらにデキストリン、乳糖、コーンスターチ、セルロース等の賦形薬で媒散して用いることもできる。
【００１９】
以下、本発明の有効成分である溶菌作用を有する乳酸菌処理物の応用例について説明する。
（食中毒防止剤）
本発明の応用例の食中毒防止剤は、前記乳酸菌処理物を含有することを特徴とする。本発明の乳酸菌処理物を１日に１０ｍｇ〜１ｇを摂取することでご飯、弁当の食材、飲料水、生菓子、玉子、サラダ、サンドイッチ、おにぎり等による食品による細菌性食中毒を防止、または軽微にすることができる。
【００２０】
（食品保存剤）
本発明の応用例の食品保存剤は、前記乳酸菌処理物を含有することを特徴とする。本発明の乳酸菌処理物の食品における上記乳酸菌処理物の含有量は、食品中、乾燥固形分として０．０１〜５．０質量％が好ましく、より好ましくは０．１〜１．０質量％である。この範囲であれば、食品の防腐効果により微生物の増殖を抑制し、賞味期限の延長効果に優れ、食中毒抑制効果や賞味期限の延長が可能で経時安定性の面からも良好なものが得られる。
【００２１】
本発明の乳酸菌処理物含有の食品は、食中毒、細菌による腐敗・変質防止成分として、常法に従い、通常の食品に使用され、配合することができる。例えば、ご飯、弁当の食材、飲料水、生菓子、玉子、サラダ、サンドイッチ、おにぎり、漬物等である。
【００２２】
また、本発明の乳酸菌処理物含有の食品には、天然の防腐剤であるプロタミン分解物、グリシン、ポリリジン、グレープ・フルーツシード・エキス等を本発明の効果を損なわない範囲で目的に応じて適宜加えることができる。
【００２３】
（化粧品防腐剤）
本発明の応用例の化粧品防腐剤は、前記乳酸菌処理物を含有することを特徴とする。本発明の乳酸菌処理物の食品における上記乳酸菌処理物の含有量は、化粧品中、乾燥固形分として０．０１〜５．０質量％（以下、単に「％」と記す）が好ましく、より好ましくは０．０５〜１．０質量％である。この範囲であれば、化粧品の防腐効果により一次汚染および二次汚染による微生物増殖を抑制し、経時変化による化粧品の臭い、色調の変質を防止し、経時安定性の面からも良好なものが得られる。
【００２４】
本発明の乳酸菌処理物含有の化粧品は、配合形態の例としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、化粧水、美容液、パック、洗浄料、メーキャップ化粧料、分散液、軟膏、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤等のいずれの形態の化粧料であっても外用医薬品等であっても良い。
【００２５】
また、本発明の乳酸菌処理物含有の化粧品には、天然の防腐剤であるプロタミン分解物、グリシン、ポリリジン、グレープ・フルーツシード・エキス等を本発明の効果を損なわない範囲で目的に応じて適宜加えることがで きる。
【００２６】
（家畜、家禽、養殖魚飼料）
本発明の応用例の家畜、家禽、養殖魚飼料は、前記乳酸菌処理物を含有することを特徴とする。本発明の乳酸菌処理物の食品における上記乳酸菌処理物の含有量は、飼料中、乾燥固形分として０．０１〜２．０質量％（以下、単に「％」と記す）が好ましく、より好ましくは０．１〜１．０質量％である。この範囲であれば、飼料の溶菌効果により牛、豚においては下痢の一因となっている大腸菌Ｏ１５７菌の増殖を抑制し、抗生物質投与量を大幅に減少可能な良好な飼料が得られる。
【実施例】
【００２７】
次に製造例及び実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制約されるものではない。
【００２８】
［溶菌作用を有する乳酸菌処理物の製造］
[製造例１]
ＭＲＳ培地にラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ１Ｒをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１０質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００２９】
[製造例２]
ＭＲＳ培地にラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ３Ｒをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３５℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１２質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３０】
[製造例３]
ＭＲＳ培地にラクトバチルス・ファーメンタム ＮＢＲＣ３０７１をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０８質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３１】
[製造例４]
ＭＲＳ培地にペディオコッカス・ペントサセウス キリシマ１Ｃをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０９質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３２】
[製造例５]
ＭＲＳ培地にペディオコッカス・アシディラクティシ キリシマ２Ｃをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、凍結・融解法にて処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１１質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３３】
[製造例６]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これに製造例ＭＲＳ培地にラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ１Ｒをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０９質量％の収率で白色の乳酸菌処理物を得た。
【００３４】
[製造例７]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにペディオコッカス・ペントサセウス キリシマ１Ｃ おおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３５℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１０質量％の収率で白色の乳酸菌処理物を得た。
【００３５】
[製造例８]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにラクトバチルス・ファーメンタム ＮＢＲＣ３０７１をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０１１質量％の収率で白黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３６】
[製造例９]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにペディオコッカス・アシディラクティシ キリシマ２Ｃをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０８質量％の収率で白黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３７】
[製造例１０]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ３Ｒをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、凍結・融解法にて処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１０質量％の収率で白色の乳酸菌処理物を得た。
【００３８】
[製造例１１]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにエンテロコッカス・フェカリス ＮＢＲＣ ３９８９をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０９質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３９】
[製造例１２]
ＭＲＳ培地にペディオコッカス・ペントサセウス ＮＢＲＣ ３１８２をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３５℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、凍結・融解法にて処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１２質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００４０】
[製造例１３]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにラクトバチルス・ラクティス 亜種 ラクティス ＮＢＲＣ１２００７をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、凍結・融解法にて処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０８質量％の収率で白色の乳酸菌処理物を得た。
【００４１】
１．溶菌乳酸菌処理物に使用した乳酸菌の特性
前記の製造例で使用した寄託乳酸菌株の菌学的特性を細菌検査用キットＡｐｉ ５０ ＣＨ（ｂｉｏ Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）を使用して調べた。結果を表１〜４に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
【００４６】
２．乳酸菌の遺伝学的特性
前記の製造例で使用した寄託乳酸菌株について常法に従い１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、既存のデータベースから既存菌種との相同性検索を行った。その結果、乳酸菌キリシマ１Ｒ株および乳酸菌キリシマ３Ｒ株はラクトバチルス・ファーメンタム、乳酸菌キリシマ１Ｃ株および乳酸菌キリシマ２Ｃ株はペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）とペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）であると同定された。
【００４７】
３．乳酸菌処理物による黄色ブドウ球菌および大腸菌の溶菌作用
下記方法により乳酸菌処理物の溶菌作用を評価した。
（溶菌試験方法）
黄色ブドウ球菌および大腸菌の乳酸菌処理物の溶菌作用試験は次の順序で行った。先ず培地に２％トリプトソイブイヨン培地（ベクトンディキンソン社）を用い、黄色ブドウ球菌および大腸菌を１０６〜１０７ｃｆｕ／ｍＬに調製し、乳酸菌処理物を波長６２０ｎｍにて吸光値０．０１なるように添加した。調製した試料をマイクロプレートの９６ウェルに分注し、３０℃で培養し、プレートリーダーで経時的に吸光値：濁度（６２０ｎｍ）を測定した。０時間の濁度を基準として６２０ｎｍの吸光値で溶菌作用を表した。
【００４８】
実施例１：製造例１、２、３、４、５で示す乳酸菌処理物を培地に０．０１Ｗ／ｖ％添加し、黄色ブドウ球菌を播種し、溶菌作用試験を行った。
（グラム陽性菌の溶菌作用）
５，１０、２０時間後の吸光値の結果について表５に示した。
【００４９】
実施例２：製造例１（本発明品）、２（本発明品）、３（本発明品）、４（本発明品）、５（本発明品）で示す乳酸菌処理物を培地に０．０１Ｗ／ｖ％添加し、大腸菌を播種し、溶菌作用試験を行った。
（グラム陰性菌の溶菌作用）
５，１０、２０時間後の吸光値の結果について表６に示した。
【００５０】
（結果）
黄色ブドウ球菌では１時間経過すると乳酸菌処理物による溶菌作用が認められ、５時間経過すると各試料とも培地が澄明になり、顕著な溶菌作用が認められた。２０時間経過するとほぼ溶菌は完了した。乳酸菌の超音波処理と凍結・融解処理には大きな違い認められなく、双方とも同様な効果が認められた。さらにグラム陰性菌である大腸菌においても同様に溶菌作用が認められた。
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
表５および表６から明らかなように、乳酸菌無添加のコントロールは病原性細菌が増殖し、吸光値が増加した。一方、本発明に用いられる乳酸菌処理物添加の培養試料は経時的に吸光値の低下が認められいずれも顕著な溶菌作用を示した。これらの乳酸菌処理物の溶菌効果は極めて優れたものであった。
【００５４】
本発明は安全性の高い乳酸菌処理物で、病原性細菌を溶菌することができる。その結果、細菌性疾患を予防若しくは防止及び食品や化粧品等への微生物の二次汚染を防止する可能性があり、食品、医療、化粧品、家畜飼料関係業界などにおいて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌性食中毒、食品の保存、化粧品の微生物汚染防止、家畜・家禽・養殖魚の疾病予防、衣服・物品の消毒、身体消毒・洗浄、植物疾病予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品・化粧品等の微生物汚染や増殖による弊害は、不十分な衛生状態・防腐対策を怠ることで、生じている。その対策は素材や調理の衛生状態の改善や微生物の一次汚染をなくすことが第一であるが、食品・化粧品の微生物増殖・汚染防止として、従来ソルビン酸、安息香酸及びその塩類、パラベン類の合成保存料、リゾチーム、リモネン、プロタミン、キトサン、ペクチン分解物、茶抽出物の天然系保存料が使用されている（特許文献１、２、３参照）。しかしながら、これらは安全性、刺激性、その効果、さらにその素材の色調、味覚において十分に満足させるものではない。
【０００３】
またヒトや動植物の微生物汚染防止または治療として、抗生物質が多量に使用され、人類史上それまで有効な治療方法のなかった多くの感染症が制圧され人類に大きな福音をもたらした。抗生物質はこのような特性からヒトばかりでなく家畜、家禽、養殖魚の細菌性の疾病に広く使用され、日本国内では年間約２０００トンも使用されるようになり、このような抗生物質の乱用により耐性菌が増加し、ヒトの死亡率の増加、食への安全性の問題が生じている（非特許文献１）
【０００４】
乳酸菌は古来、食品保存、食品として長年使用され、最近では免疫賦活作用、整腸作用、コレステロール低減作用、抗腫瘍作用が注目され、健康維持のため幅広く飲用されるようになってきた（非特許文献２参照）。
そこで、微生物汚染を防ぐために、安全性の高く、健康に良いと言われている乳酸菌が検討されている（非特許文献３参照）。
【０００５】
しかしながら、これらの乳酸菌は直接、微生物に対して作用を示すものではなく、乳酸菌を服用し、免疫機能を高め、ＩｇＡの作用により間接的に抗菌作用を示すものである。従ってその効果は軽微で食品添加物や直接微生物に対して作用もないことから用途は限定される。また、ストレプトコッカスの酵素前駆体組成物がグラム陽性菌の阻止および溶菌作用を示すことが報告されているが、これは菌体そのものではなく、菌体細胞質からの抽出成分である（非特許文献４）。
【０００６】
以上の事項から、細菌に対して耐性菌が生じることなく安全で使用感に影響を与えず、病原性微生物に対する抗菌作用を有する添加物の開発が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】特許公報 昭６２−５３１４１号公報
【特許文献２】特許公報 平４−３５１５１号公報
【特許文献３】特許公報 平５−５８７０２号公報
【非特許文献１】日本子孫基金・編 「食べ物から広がる耐性菌」発行所：株式会社三五館（２００３）
【非特許文献２】細野明義・編 「発酵乳の科学」アイ・ケイコーポレーション社（２００２)
【非特許文献３】小崎道雄・佐藤英一・編著「乳酸発酵の新しい系譜」中央法規出版株式会社（２００４）
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒ Ｗ．Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｙｍｏｇｅｎｅｓ Ｌｙｓｉｎ、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｊａｎ．Ｐ１５６−１５９ （１９７１ ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、ヒト、家畜、家禽、魚介類、植物に対して安全性が高く、微生物汚染、細菌性疾病に対処する溶菌作用を有する添加剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記目的を達成するために、すでに食経験からも安全性が確認されている乳酸菌に着目し、鋭意研究を重ねた結果、乳酸菌を培養し、菌体を超音波処理、ホモジナイザー粉砕もしくは凍結・融解のいずれの方法にて処理し、水、または生理食塩水で洗浄し、遠心分離後、細胞質を除いた細胞膜のみを凍結乾燥、もしくは低温乾燥して得られる乳酸菌処理物が病原性細菌を溶菌させるとの新知見を得、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に乳酸菌処理物は顕著に病原性細菌の増殖を抑制した。本発明品は、食品・化粧料の防腐剤、家畜、家禽、養殖魚・海老飼料、植物病気予防剤、医薬品において上記目的のあらゆる分野に応用可能で、乳酸菌処理物を有効成分として食品、化粧品に配合すると微生物の増殖が抑制され、微生物の二次汚染や食中毒を予防・防止することが可能となった。また、家畜・家禽・魚介類の飼料として経口投与すると病原性細菌による疾患を予防・防止することが可能となり、その効果を発揮することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に用いられる乳酸菌はラクトバチルス（Lactobacillus）属、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ラクトコッカス（Lacococcus）属、ロイコノストックス（Lueconostoc）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属及びワイセラ（Weissella）属等に属する乳酸菌を培養して得られる菌体の処理物からなる群より選ばれた１種又は２種以上である。
【００１２】
上記の本発明の乳酸菌の処理物調製法は、菌体を破砕し、細胞質を除去し、細胞膜を得るものである。従って菌の増殖能はない。その処理方法および乳酸菌の種類は特に制限されるものではないが、その例としては、先ずラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストックス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス及びワイセラ属等に属する乳酸菌をその乳酸菌に適した培地を用いて培養する。その後、培地と菌体を遠心分離器にて分離し、水、または生理食塩水にて洗浄し、菌体を得る。さらに菌体を水、または生理食塩水に懸濁し、超音波、ホモジナイザー、凍結・融解法にて菌体膜を破壊する。その後遠心分離・洗浄工程を経て、乳酸菌の細胞菌のみを得る。これを凍結乾燥および低温乾燥にて乳酸菌処理物を得る。必要ならば工程中に溶菌効果低下に影響を及ぼさない範囲で更に、細胞膜の純度を向上させるために活性炭、シリカゲル、イオン交換樹脂等を使用し、脱臭、脱色等の精製処理をしても良い。
【００１３】
本発明で使用する乳酸菌にはラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストックス属、ストレプトコッカス属及びエンテロコッカス属等があるが、これらの属および種に限定されるものではない。ラクトバチルス属としては、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチル・プランタム、スラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ペントーサス等がある。ラクトコッカス属としては、ラクトコッカスおよびラクチスクレモリス等がある。ペディオコッカス属としては、ペディオコッカス・ペントサセウス、ペディオコッカス・アシディラクティシ、ペディオコッカス・ヘパリナス等がある。 ロイコノストックス属としては、ロイコノストックス・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ロイコノストックス・メセンテロイデス等がある。ストレプトコッカス属としてはストレプトコッカス・ サーモフィラスがある。エンテロコッカス属にはエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ワイセラ属としては、ワイセラ・シバリア、ワイセラ・コンフューサ、ワイセラ・ヘレニカ、ワイセラ・カンドレリ、ワイセラ・マイナー、ワイセラ・パラメセンテロイデスまたは／およびワイセラ・タイランデンシス等を挙げることができる。
【００１４】
これらの種に属する乳酸菌の中でも、ラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ１Ｒ株、ペディオコッカス ペントサセウス キリシマ１Ｃ株、ラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ３Ｒ株、ペディオコッカス・アシディラクティシ キリシマ２Ｃ株などがグラム陽性菌およびグラム陰性菌の病原菌に対して溶菌作用が強く好適である。なお、これらの菌株は下記の受託番号によりセンターに寄託されている。
【００１５】
ラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ１Ｒ (ＮＩＴＥ Ｐ−７８４)
ペディオコッカス・ペントサセウス キリシマ１Ｃ (ＮＩＴＥ Ｐ-７８７)
ラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ３Ｒ (ＮＩＴＥ Ｐ-７８６)
ペディオコッカス・アシディラクティシ キリシマ２Ｃ (ＮＩＴＥ Ｐ-７８８)
【００１６】
好ましい乳酸菌の培養方法の例としては、本発明に用いる培地は天然培地、合成培地、半合成培地などの培地がある。培地の窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等が使用できる。炭素源としてはグルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、デンプン、バガス、フスマ、糖蜜、グルセリン等が使用できる。この他に窒素源と炭素源を含むスキムミルク、またはその分解物、コーンスティープリカー、焼酎粕、大豆粕とその分解物も培地の成分の一成分として配合可能である。この他にミネラルやイオン化成分として鉄、マンガン、モリブデン、塩化マグネシウム、食塩、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム等の成分の配合が可能である。さらに適宜乳酸菌の特性に応じて各種のビタミン、界面活性剤、有機酸、トマトジュースを添加できる。
【００１７】
培養温度は２５℃〜４５℃であるが、好ましくは約３０〜３７℃で、培養時間は約１２〜４８時で静置もしくは振とう培養でもよい。培地のｐＨは３〜７で、このましくはｐＨ４〜６である。培養終了後、菌体を採取し、上記で示した方法にて処理し、溶菌作用を有する乳酸菌処理物を得る。
【００１８】
本発明の溶菌作用を有する乳酸菌処理物のその形態については、この有効成分を含む限り特に制限はなく、液状、ペースト状、ゲル状等のいずれの形態で用いることもできる。さらにデキストリン、乳糖、コーンスターチ、セルロース等の賦形薬で媒散して用いることもできる。
【００１９】
以下、本発明の有効成分である溶菌作用を有する乳酸菌処理物の応用例について説明する。
（食中毒防止剤）
本発明の応用例の食中毒防止剤は、前記乳酸菌処理物を含有することを特徴とする。本発明の乳酸菌処理物を１日に１０ｍｇ〜１ｇを摂取することでご飯、弁当の食材、飲料水、生菓子、玉子、サラダ、サンドイッチ、おにぎり等による食品による細菌性食中毒を防止、または軽微にすることができる。
【００２０】
（食品保存剤）
本発明の応用例の食品保存剤は、前記乳酸菌処理物を含有することを特徴とする。本発明の乳酸菌処理物の食品における上記乳酸菌処理物の含有量は、食品中、乾燥固形分として０．０１〜５．０質量％が好ましく、より好ましくは０．１〜１．０質量％である。この範囲であれば、食品の防腐効果により微生物の増殖を抑制し、賞味期限の延長効果に優れ、食中毒抑制効果や賞味期限の延長が可能で経時安定性の面からも良好なものが得られる。
【００２１】
本発明の乳酸菌処理物含有の食品は、食中毒、細菌による腐敗・変質防止成分として、常法に従い、通常の食品に使用され、配合することができる。例えば、ご飯、弁当の食材、飲料水、生菓子、玉子、サラダ、サンドイッチ、おにぎり、漬物等である。
【００２２】
また、本発明の乳酸菌処理物含有の食品には、天然の防腐剤であるプロタミン分解物、グリシン、ポリリジン、グレープ・フルーツシード・エキス等を本発明の効果を損なわない範囲で目的に応じて適宜加えることができる。
【００２３】
（化粧品防腐剤）
本発明の応用例の化粧品防腐剤は、前記乳酸菌処理物を含有することを特徴とする。本発明の乳酸菌処理物の食品における上記乳酸菌処理物の含有量は、化粧品中、乾燥固形分として０．０１〜５．０質量％（以下、単に「％」と記す）が好ましく、より好ましくは０．０５〜１．０質量％である。この範囲であれば、化粧品の防腐効果により一次汚染および二次汚染による微生物増殖を抑制し、経時変化による化粧品の臭い、色調の変質を防止し、経時安定性の面からも良好なものが得られる。
【００２４】
本発明の乳酸菌処理物含有の化粧品は、配合形態の例としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、化粧水、美容液、パック、洗浄料、メーキャップ化粧料、分散液、軟膏、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤等のいずれの形態の化粧料であっても外用医薬品等であっても良い。
【００２５】
また、本発明の乳酸菌処理物含有の化粧品には、天然の防腐剤であるプロタミン分解物、グリシン、ポリリジン、グレープ・フルーツシード・エキス等を本発明の効果を損なわない範囲で目的に応じて適宜加えることがで きる。
【００２６】
（家畜、家禽、養殖魚飼料）
本発明の応用例の家畜、家禽、養殖魚飼料は、前記乳酸菌処理物を含有することを特徴とする。本発明の乳酸菌処理物の食品における上記乳酸菌処理物の含有量は、飼料中、乾燥固形分として０．０１〜２．０質量％（以下、単に「％」と記す）が好ましく、より好ましくは０．１〜１．０質量％である。この範囲であれば、飼料の溶菌効果により牛、豚においては下痢の一因となっている大腸菌Ｏ１５７菌の増殖を抑制し、抗生物質投与量を大幅に減少可能な良好な飼料が得られる。
【実施例】
【００２７】
次に製造例及び実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制約されるものではない。
【００２８】
［溶菌作用を有する乳酸菌処理物の製造］
[製造例１]
ＭＲＳ培地にラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ１Ｒをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１０質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００２９】
[製造例２]
ＭＲＳ培地にラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ３Ｒをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３５℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１２質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３０】
[製造例３]
ＭＲＳ培地にラクトバチルス・ファーメンタム ＮＢＲＣ３０７１をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０８質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３１】
[製造例４]
ＭＲＳ培地にペディオコッカス・ペントサセウス キリシマ１Ｃをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０９質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３２】
[製造例５]
ＭＲＳ培地にペディオコッカス・アシディラクティシ キリシマ２Ｃをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、凍結・融解法にて処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１１質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３３】
[製造例６]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これに製造例ＭＲＳ培地にラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ１Ｒをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０９質量％の収率で白色の乳酸菌処理物を得た。
【００３４】
[製造例７]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにペディオコッカス・ペントサセウス キリシマ１Ｃ おおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３５℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１０質量％の収率で白色の乳酸菌処理物を得た。
【００３５】
[製造例８]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにラクトバチルス・ファーメンタム ＮＢＲＣ３０７１をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０１１質量％の収率で白黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３６】
[製造例９]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにペディオコッカス・アシディラクティシ キリシマ２Ｃをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０８質量％の収率で白黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３７】
[製造例１０]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにラクトバチルス・ファーメンタム キリシマ３Ｒをおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、凍結・融解法にて処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１０質量％の収率で白色の乳酸菌処理物を得た。
【００３８】
[製造例１１]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにエンテロコッカス・フェカリス ＮＢＲＣ ３９８９をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、超音波処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０９質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００３９】
[製造例１２]
ＭＲＳ培地にペディオコッカス・ペントサセウス ＮＢＲＣ ３１８２をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３５℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、凍結・融解法にて処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．１２質量％の収率で淡黄色の乳酸菌処理物を得た。
【００４０】
[製造例１３]
５ｗ／ｖ％スキムミルクをプロテアーゼで酵素分解し、オートクレーブ後、沈殿物を除去したものを培地とし、これにラクトバチルス・ラクティス 亜種 ラクティス ＮＢＲＣ１２００７をおおよそ１０８ｃｆｕ／ｍＬの前培養液を１．０ｖ／ｖ％になるように接種し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を１万Ｇにて遠心分離し、菌体を分離した。さらに精製水洗浄と遠心分離を繰り返し、菌体を十分に洗浄した後、凍結・融解法にて処理し、細胞膜を破砕した。その後精製水で洗浄し、遠心分離後沈殿物を凍結乾燥し、乳酸菌処理物を得た。おおよそ培養液から０．０８質量％の収率で白色の乳酸菌処理物を得た。
【００４１】
１．溶菌乳酸菌処理物に使用した乳酸菌の特性
前記の製造例で使用した寄託乳酸菌株の菌学的特性を細菌検査用キットＡｐｉ ５０ ＣＨ（ｂｉｏ Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）を使用して調べた。結果を表１〜４に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
【００４６】
２．乳酸菌の遺伝学的特性
前記の製造例で使用した寄託乳酸菌株について常法に従い１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、既存のデータベースから既存菌種との相同性検索を行った。その結果、乳酸菌キリシマ１Ｒ株および乳酸菌キリシマ３Ｒ株はラクトバチルス・ファーメンタム、乳酸菌キリシマ１Ｃ株および乳酸菌キリシマ２Ｃ株はペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）とペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）であると同定された。
【００４７】
３．乳酸菌処理物による黄色ブドウ球菌および大腸菌の溶菌作用
下記方法により乳酸菌処理物の溶菌作用を評価した。
（溶菌試験方法）
黄色ブドウ球菌および大腸菌の乳酸菌処理物の溶菌作用試験は次の順序で行った。先ず培地に２％トリプトソイブイヨン培地（ベクトンディキンソン社）を用い、黄色ブドウ球菌および大腸菌を１０６〜１０７ｃｆｕ／ｍＬに調製し、乳酸菌処理物を波長６２０ｎｍにて吸光値０．０１なるように添加した。調製した試料をマイクロプレートの９６ウェルに分注し、３０℃で培養し、プレートリーダーで経時的に吸光値：濁度（６２０ｎｍ）を測定した。０時間の濁度を基準として６２０ｎｍの吸光値で溶菌作用を表した。
【００４８】
実施例１：製造例１、２、３、４、５で示す乳酸菌処理物を培地に０．０１Ｗ／ｖ％添加し、黄色ブドウ球菌を播種し、溶菌作用試験を行った。
（グラム陽性菌の溶菌作用）
５，１０、２０時間後の吸光値の結果について表５に示した。
【００４９】
実施例２：製造例１（本発明品）、２（本発明品）、３（本発明品）、４（本発明品）、５（本発明品）で示す乳酸菌処理物を培地に０．０１Ｗ／ｖ％添加し、大腸菌を播種し、溶菌作用試験を行った。
（グラム陰性菌の溶菌作用）
５，１０、２０時間後の吸光値の結果について表６に示した。
【００５０】
（結果）
黄色ブドウ球菌では１時間経過すると乳酸菌処理物による溶菌作用が認められ、５時間経過すると各試料とも培地が澄明になり、顕著な溶菌作用が認められた。２０時間経過するとほぼ溶菌は完了した。乳酸菌の超音波処理と凍結・融解処理には大きな違い認められなく、双方とも同様な効果が認められた。さらにグラム陰性菌である大腸菌においても同様に溶菌作用が認められた。
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
表５および表６から明らかなように、乳酸菌無添加のコントロールは病原性細菌が増殖し、吸光値が増加した。一方、本発明に用いられる乳酸菌処理物添加の培養試料は経時的に吸光値の低下が認められいずれも顕著な溶菌作用を示した。これらの乳酸菌処理物の溶菌効果は極めて優れたものであった。
【００５４】
本発明は安全性の高い乳酸菌処理物で、病原性細菌を溶菌することができる。その結果、細菌性疾患を予防若しくは防止及び食品や化粧品等への微生物の二次汚染を防止する可能性があり、食品、医療、化粧品、家畜飼料関係業界などにおいて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性細菌に対して溶菌作用を有することを特徴とする乳酸菌処理物。
【請求項２】
前記乳酸菌処理物はラクトバチルス（Lactobacillus）属およびペディオコッカス（Pediococcus）属に属する乳酸菌を処理して得られることを特徴とする。
【請求項３】
乳酸菌処理物は乳酸菌を超音波処理、凍結・融解処理、ホモジナイズ処理して得られる細胞質を除いた細胞膜であって、請求項１又は請求項２記載の乳酸菌処理物を含むことを特徴とする溶菌剤。
【請求項４】
前記乳酸菌処理物を０．０１質量％以上含む請求項３記載の溶菌剤。
【請求項１】
病原性細菌に対して溶菌作用を有することを特徴とする乳酸菌処理物。
【請求項２】
前記乳酸菌処理物はラクトバチルス（Lactobacillus）属およびペディオコッカス（Pediococcus）属に属する乳酸菌を処理して得られることを特徴とする。
【請求項３】
乳酸菌処理物は乳酸菌を超音波処理、凍結・融解処理、ホモジナイズ処理して得られる細胞質を除いた細胞膜であって、請求項１又は請求項２記載の乳酸菌処理物を含むことを特徴とする溶菌剤。
【請求項４】
前記乳酸菌処理物を０．０１質量％以上含む請求項３記載の溶菌剤。
【公開番号】特開２０１１−５７５６３（Ｐ２０１１−５７５６３Ａ）
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０５４５６（Ｐ２００９−２０５４５６）
【出願日】平成２１年９月７日（２００９．９．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名：日本農芸化学会２００９年度大会 主催者：社団法人日本農芸化学会 開催日：平成２１年３月２８日発表
【出願人】（５０２１２８４４２）株式会社鎌田工業 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月７日（２００９．９．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名：日本農芸化学会２００９年度大会 主催者：社団法人日本農芸化学会 開催日：平成２１年３月２８日発表
【出願人】（５０２１２８４４２）株式会社鎌田工業 (8)
【Ｆターム（参考）】
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