溶血方法および溶血試薬
【課題】迅速に完全溶血することができ、且つ酵素活性への阻害もない、界面活性剤を使用する溶血方法および溶血試薬を提供する。
【解決手段】糖化タンパク質を検出するための、界面活性剤を用いる溶血方法において、該界面活性剤がＨＬＢ値１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤を用いる。
【解決手段】糖化タンパク質を検出するための、界面活性剤を用いる溶血方法において、該界面活性剤がＨＬＢ値１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床検査分野において、ヒトやその他の動物の血球を破壊し、特定な成分に対し分析を行うための溶血方法および溶血試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野おける血液検査において、例えば、検体が全血であり、かつ、分析対象となる物質が血球中に含まれる成分の場合、血球の破壊、つまり溶血する工程が必要となる。例えば、測定対象がグリコヘモグロビンＨｂＡ１ｃである場合、検体中の赤血球を十分溶血させて、赤血球中のヘモグロビンが溶液中を可溶化させる必要がある。
【０００３】
従来から、操作が簡便である等の理由から、赤血球を溶血するために界面活性剤が溶血剤として用いられている。例えば、界面活性剤ＣＴＡＢを用いて、赤血球を細胞破壊して血液から核酸を分離する技術が提案されている（特許文献１）。
【０００４】
界面活性剤を溶血剤として使用する際に、最も懸念される問題は、界面活性剤には、生体に対し毒性が強いものもあり、酵素活性の失活をもたらすことである。特に陰、陽イオン性界面活性剤分子は電荷をもつため、特定の成分を検出するための酵素（例えば標識酵素）と相互作用して、酵素の活性を低下させる。
【０００５】
特許文献２には、血液試料を、ｐＨ５．０〜９．５を有するイオン性洗剤（イオン性界面活性剤）を含む溶血試薬で処理し、全ヘモグロビン含量を溶血試料中で比色測定する一方、グリコヘモグロビンＨｂＡ１ｃ（以下、単に「ＨｂＡ１ｃ」とも言う。）を溶血試料中で免疫学的に測定する技術が提案されている。イオン性洗剤、例えばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）などのアニオン性洗剤や、ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）などのカチオン性洗剤は、溶血試薬として既によく知られているものである。しかしながら、このようなイオン性洗剤は蛋白変性作用もあるので、同じく蛋白質である標識酵素にも悪影響を与え、その酵素活性を抑制することになる。Ｂ／Ｆ分離を行わない均一系エンザイムイムノアッセイでは、イオン性洗剤が酵素活性を抑制するので実用上の感度を得ることができなかった。
【０００６】
特許文献３には、エンザイムイムノアッセイ法でＨｂＡ１ｃの濃度を測定する際、２−ブタノールとともに併用される溶血試薬として界面活性剤が挙げられ、通常用いられる多くの標識酵素（例えば、アミラーゼ）の酵素活性を低下させないため、ノニオン性界面活性剤が好ましいことが開示されている。
【特許文献１】特表平８−５０１２０８号公報
【特許文献２】特開平６−１１５１０号公報
【特許文献３】特開平９−１６６５９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一方、近年、検査の緊急性、救急医療、在宅検査などに対応できる迅速・簡便（且つ正確）な検査：ポイント・オブ・ケア検査（ＰＯＣＴ）のニーズが高まっており、特に検査のスピードが要求されている。そのため、検査ための検体前処理として、溶血工程の時間も短縮する必要性がますます高まっている。
【０００８】
しかしながら、特許文献１〜３のいずれも、イオン性界面活性剤もしくはノニオン性界面活性剤を用いて溶血処理を行うことが開示されているものの、どの界面活性剤が短時間
で完全溶血できるのか明確ではなく、通常の溶血工程は数分間の時間がかかっていた。
【０００９】
本発明の目的は、迅速に完全溶血することができ、且つ酵素活性への阻害もない、界面活性剤を使用する溶血方法および溶血試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
特許文献３に記載されているノニオン性界面活性剤は、非常に広範囲のものが挙げられており、これらのノニオン性界面活性剤には、（イ）溶血できるが酵素活性に阻害があるもの、（ロ）酵素活性に阻害がないが溶血できないもの、（ハ）迅速に完全溶血できず、かつ酵素活性に阻害があるもの、（ニ）迅速に完全溶血でき、かつ酵素活性に阻害がないものが含まれているものと考えられる。本発明者らは、どのようなノニオン性界面活性剤が、（a）迅速完全溶血、（ｂ）酵素への阻害がないという、（ａ）および（ｂ）の二つの条件を同時に満足するのか、鋭意検討を行った結果、以下の構成によって、上記課題を達成することができることを見出し、本発明を完成したものである。
【００１１】
本発明に係る溶血方法は、糖化タンパク質を検出するための、界面活性剤を用いる溶血方法であって、該界面活性剤がＨＬＢ値１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤であることを特徴とするものである。
【００１２】
より好ましくは、糖化タンパク質を検出するに際し、酵素活性により糖化タンパク質を検出し、該酵素が、タンパク質を分解する酵素、酸化酵素、脱水素酵素、または多糖を分解する酵素である。
【００１３】
更に好ましくは、前記ノニオン性界面活性剤が、下記一般式（１）で表わされるポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤である。
一般式（１）
Ｒ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ
上記一般式（１）中、Ｒは、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよい脂肪族炭化水素基、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい脂環式炭化水素基、または、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい芳香族炭化水素基であり、ｎは５〜２０の整数である。
【００１４】
特に好ましくは、前記ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンイソセチルエーテル、ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル及び、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよいポリオキシエチレンフェニルエーテルよりなる群から選ばれる。
【００１５】
本発明に係る溶血試薬は、ＨＬＢ値が１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤であって、該界面活性剤を含有し、糖化タンパク質を検出するための酵素が有する活性を阻害しないことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る溶血方法および溶血試薬によれば、迅速に赤血球を完全溶血することができ、且つ酵素への活性阻害もない。
また、本発明に係る溶血方法および溶血試薬は、糖尿病用のＨｂＡ１ｃ測定マイクロチップに使用するのに特に好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
「細胞破壊」は、細胞の表面膜を化学或いは物理的な方法で崩壊させ、細胞内容物を水中に分散或いは溶解させることを言う。細胞破壊は、細胞内部の特定の成分を分析するために行なわれる。
「溶血」は、血液（例えば全血）に含まれる細胞（例えば赤血球）の表面膜を化学或いは物理的な方法で崩壊させ、細胞内容物を水中に分散或いは溶解させることを言う。溶血は、血液に含まれる細胞内部の特定の成分を分析するために行なわれる。
【００１８】
「特定の成分」とは、本明細書においては、本発明で検出対象とされる、糖化タンパク質を指す。糖化タンパク質としては、グリコアルブミン、グリコヘモグロビン（例えば、ＨｂＡ１ｃ等）が好ましいものとして挙げられる。
「（特定の成分を）検出するための酵素」は、糖化タンパク質を分析するために使用される検出用酵素である。糖化タンパク質を検出するための酵素としては、タンパク質を分解する酵素、酸化酵素、脱水素酵素および多糖を分解する酵素が好ましいものとして挙げられる。タンパク質を分解する酵素としてはプロテアーゼが好ましく、酸化酵素としてはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）が好ましく、脱水素酵素としてはグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が好ましく、多糖を分解する酵素としてはアミラーゼおよびグリコアミラーゼが好ましいものとして挙げられる。例えば、特開平９−１６６５９４号公報に記載のα−アミラーゼは、本発明においても乾式エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）でＨｂＡ１ｃを測定する場合には、標識酵素として該検出用酵素を用いることが好適である。また、例えば特開２００１−５４３９８号公報、特開平１１−１５５５９６号公報に記載されているプロテアーゼも、検体中の検出対象となる糖化タンパク質を、プロテアーゼ等により分解したのち、プロテアーゼ処理物中の糖化アミノ酸を、糖化アミノ酸酸化酵素等により、生成した過酸化水素を検出することにより、該糖化タンパク質を検出することができる。
【００１９】
「完全溶血」とは、血液試料中の細胞（例えば、血球）が部分的にではなく、全部が破壊される状態と定義される。本発明の場合、血球数の計測によって、溶血の程度を評価する方法を採用したため、計測した血球数から求めた溶血率が１００％の場合は完全溶血という。血球数の計測には、血球カンウターＦ−５２０（シスメックス社）を用いた。
【００２０】
「迅速溶血」とは短時間で血液試料中の細胞（例えば、血球）が破壊されることである。本発明では１分以内をいい、好ましくは１０秒以内の完全溶血である。
【００２１】
ノニオン性界面活性剤は親水基としてイオン化する原子団を有しない界面活性剤の一群で、疎水基を水に可溶にするために、いずれも−ＯＨ基を有し且つ比較的親水基は少ないが、分子内の主要なる結合の仕方によって、エステル型、エーテル型、エステル・エーテル型、及びその他に分類される。代表的な非イオン性界面活性剤には下記のものがある。
１）エステル型
グリセリン、ソルビトール、蔗糖などの多価アルコールと脂肪酸がエステル結合でつながっている構造をもつ。なお、このタイプの非イオン界面活性剤は「多価アルコール型」と呼ばれることもある。例えば、Ｔｗｅｅｎ２０が挙げられる。
２）エーテル型
高級アルコールやアルキルフェノールなど水酸基を持つアルコール系原料に、主として酸化エチレン(エチレンオキサイド)を付加して製造されるタイプで、非イオン性界面活性剤の中では最も代表的な界面活性剤である。
２−１）ポリオキシエチレンアルキルエーテル
ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、ＡＥ、アルキル（またはアルコール）エトキシレート、アルキル（またはアルコール）ポリエトキシレートともいう。例えば、ポリオ
キシエチレンラウリルエーテルが挙げられる。
２−２）ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルは、ＡＰＥ、アルキルフェニル(またはフェノール)エトキシレート、アルキルフェニル(またはフェノール)ポリエトキシレートともいう。例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が挙げられる。
２−３）その他のエーテル型
疎水基としてポリプロピレングリコールを用いたポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレングリコールなどが挙げられる。これらの非イオン性界面活性剤は泡立ちが少ない為、低起泡性界面活性剤として各種用途に利用されているものである。
３）エステル・エーテル型
脂肪酸や多価アルコール脂肪酸エステルに酸化エチレンを付加したタイプである。また、「エーテル型」や「エステル・エーテル型」はともに酸化エチレンを付加したタイプなので「ポリエチレングリコール型」とも呼ぶことがある。
４）その他
疎水基と親水基がアミド結合で結合しているタイプの脂肪酸アルカノールアミド型が挙げられる。また、最近登場した糖類(ブドウ糖等)を原料とするアルキルポリグリコシドもある。
【００２２】
本発明者らは、前記特定の成分を検出するための酵素の活性を低下させることがなく、同時に迅速に完全溶血の能力を持つ溶血試薬を探索するために、数多くのノニオン性界面活性剤について検討した結果、ＨＬＢ値が１1〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤が迅速に完全溶血でき、且つ酵素の活性に阻害がないことを見出すに至った。
また、上記特性値を満たすノニオン性界面活性剤は、さらにエーテル型ノニオン性界面活性剤であることにより、完全溶血するまでの時間をさらに短くすることができた。
ＨＬＢ値とは界面活性剤の水と油(水に不溶性の有機化合物)への親和性の程度を表す値であり、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ-Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅの頭文字を取ったものである。親水親油バランスともいう。この概念は１９４９年にＡｔｌａｓ Ｐｏｗｄｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙのウィリアム・グリフィンによって提唱された。計算によって決定する方法がいくつか提案されている。
（１）アトラス法:
エステル系の界面活性剤について、鹸化価をＳ、界面活性剤を構成する脂肪酸の酸価をＡとし、ＨＬＢ値を２０（１−Ｓ／Ａ)で定義する。
（２）グリフィン法：
ＨＬＢ値＝２０×親水部の式量の総和／分子量で定義する。
（３）デイビス法:
官能基によって決まる基数を定め(例えばメチル基やメチレン鎖は親油基で０．４７５、水酸基は親水基で１．９など)、ＨＬＢ値＝７＋親水基の基数の総和−親油基の基数の総和で定義する。界面活性剤の混合物のＨＬＢ値は各成分のＨＬＢ値の加重平均となる。
（４）標準試料にＨＬＢ値を決定したい界面活性剤を添加して乳化し、実験的に決定する方法もあるが煩雑であるためあまり行われない。
（５）高速液体クロマトグラフィーでの保持時間から決定する方法もある。
本発明には、有機概念図（甲田善生，「有機概念図 −基礎と応用−」，ｐ．２２７(１９８４）三共出版）に基づくＩＯＢ方法で求めたＨＬＢ値を用いた。ＩＯＢ値は界面活性剤の無機性値と有機性値の比で、ＨＬＢ値はＩＯＢ値×１０の値である。
【００２３】
本発明においては、下記一般式（１）で表わされるポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤を用いることが好ましい。
一般式（１）
Ｒ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ
上記一般式（１）中、Ｒは、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよい脂肪族炭化
水素基、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい脂環式炭化水素基、または、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい芳香族炭化水素基であり、ｎは５〜２０の整数である。
上記脂環式炭化水素基としては、１つの環の炭素数が５〜６であり、脂環式炭化水素環の数が１〜４であるものが好ましく挙げられる。
上記芳香属炭化水素基としては、１つの環の炭素数が５〜６であり、芳香属炭化水素環の数が１〜４であるものが好ましく挙げられる。
【００２４】
ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤として好ましくは、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンイソセチルエーテル、ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル及び、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよいポリオキシエチレンフェニルエーテルが挙げられる。
【００２５】
本発明においてさらに好ましく使用されるノニオン性界面活性剤としては、
ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン単位１０〜１７のもの）、
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（オキシエチレン単位１２〜２０のもの）、
ポリオキシエチレンステアリルエーテル（オキシエチレン単位１１〜２０のもの）、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン単位7〜１２のもの）、
ポリオキシエチレンイソセチルエーテル（オキシエチレン単位１０〜１５のもの）、
ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル（オキシエチレン単位１０〜２０のもの）、
ポリオキシエチレンコレステリルエーテル、
ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（オキシエチレン単位１６〜２０のもの）及び
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（該アルキル基は、炭素数が８〜２０であり、直鎖でも分岐していてもよい。例えば、オキシエチレン単位平均９〜１０含有 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）が挙げられる。
【００２６】
本発明において溶血剤に用いられる上記界面活性剤の使用濃度は、０．０５％〜５％（質量濃度）が好ましく、好ましくは０．０５％〜１％、より好ましくは０．１％〜１％、さらに好ましくは０．１％〜０．２％である。この濃度範囲であれば、迅速な溶血能力を持つと同時に、エンザイムイムノアッセイで通常用いられる多くの標識酵素の酵素活性に悪影響を与えることもない。
【００２７】
本発明の溶血試薬は水系溶液で使用する。この水系溶液には、必要に応じてｐＨ緩衝剤、安定化剤などの成分を添加してもよい。
緩衝液としては、免疫反応及びその後の酵素反応を抑制しない緩衝液であればよく、従来のものを広く使用できる。好ましくは１０〜２００ｍＭの濃度のＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液を使用する。使用する酵素標識抗体の酵素反応の最適ｐＨに一致するｐＨ値とするのが好ましい。一般に、ｐＨ約５．５〜約８．５の範囲で選択するのが好ましい。
また酵素標識抗体の安定化剤としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＭＰＣ（２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマーなどを含有させてもよい。
【００２８】
本発明の溶血試薬を用いて、血液試料を処理する時、超音波処理と併用すると赤血球膜を破壊する工程は速くなる。５秒以内で完全溶血が確認された。
【００２９】
本発明の溶血試薬は酵素活性を低下させることがなく、かつ迅速に完全溶血する能力を持つため、エンザイムイムノアッセイ（酵素免疫測定法）、特に免疫反応後にＢ／Ｆ分離を行わない均一系エンザイムイムノアッセイに好適に用いることができる。また、微量で、迅速検出するためのマイクロ一体化診断チップ（特願２００４−０７８２１０号）に使用するのは最も効果的であり、好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳しく説明する。使用した溶血剤として用いた化合物とその特性は表１に示す。本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００３１】
［酵素活性の評価法］
以下の実施例では、乾式多層分析要素（標識酵素としてアミラーゼを含有）を用いて、一定使用濃度の溶血剤の存在下で、発色ＯＤへの影響を調べることによって、アミラーゼへの阻害性を評価した。
評価用の乾式多層分析要素は以下のように作製した。
下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
【００３２】
アルカリ処理ゼラチン １４．５ｇ／ｍ2
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール
（オキシエチレン単位平均９〜１０含有） ０．２ｇ／ｍ2
グルコースオキシダーゼ ５０００ｕ／ｍ2
ペルオキシダーゼ １５０００ｕ／ｍ2
グルコアミラーゼ ５０００ｕ／ｍ2
２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル−４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−フェネチルイミダゾール（ロイコ色素）酢酸塩
０．３８ｇ／ｍ2
ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン
０．１ｇ／ｍ2
【００３３】
この試薬層の上に下記の被覆量になるように接着層を、塗布、乾燥することにより設けた。
【００３４】
アルカリ処理ゼラチン １４．５ｇ／ｍ2
ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン
０．１ｇ／ｍ2
【００３５】
ついで接着層の表面に下記の被覆量になるように下記試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その上に５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）紡績糸３６ゲージ編みした厚さ約２５０μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層（編物層）を設けた。
【００３６】
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール
（オキシエチレン単位平均９〜１０含有） ０．１５ｇ／ｍ2
ビス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノ］メタン
０．４ｇ／ｍ2
【００３７】
次に、下記の被覆量になるように基質を塗布、乾燥することにより、ＣＲＰ分析用多層分析要素を調製した。
【００３８】
カルボキシメチル化澱粉 ５ｇ／ｍ2
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール
（オキシエチレン単位平均９〜１０含有） ０．２ｇ／ｍ2
【００３９】
さらに、展開層兼秤量層であるトリコット編物層にアミラーゼ−抗ＣＲＰ・ＩｇＧ結合物を３ｍｇ／ｍ2の被覆量となるようにしてエタノール溶液を塗布し、含浸させ乾燥させてＣＲＰ分析用多層乾式分析要素を得た。
【００４０】
次いで上記の乾式多層分析要素を１２ｍｍ(１３ｍｍ四方のチップに裁断し、特開昭５７−６３４５２号公報に記載のスライドの枠に収めて、酵素活性評価用多層乾式スライドとした。
【００４１】
このスライドに、０．１％（質量濃度）溶血剤を含有するｐＨ７の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０μＬを点着し、３７℃に保って、分光光度計（ＭＣＰＤ−２０００（大塚電子））でＰＥＴ支持体側から中心波長６５０ｎｍの可視光で反射光学濃度を測定した。点着から３分後および５分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ5-3）を求めて、ΔＯＤ値の変動が許容範囲（ΔＯＤ値の平均値±２ＳＤ：０．３７４５±０．０４９）外にはみ出したら、酵素に対して阻害性があると判断する。
【００４２】
実施例化合物と比較化合物の酵素活性に対する影響の評価結果を表１にまとめて示す。上記許容範囲内を○とし、外れるものを×とした。
【００４３】
［迅速溶血評価法］
０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％および１％の各濃度の溶血剤をそれぞれ１．５ｍＬチューブに９８０μＬづつ分注する。全血を２０μＬチューブに添加して、ミキサーでよく混ぜる。一定時間（１０秒）後、直ちに食塩水で高倍率（一般的には５００倍以上、本実施例では１０００倍を希釈することによって、溶血剤の作用を停止させた。希釈した直後、溶液中の血球数を血球カンウターＦ−５２０（シスメックス社）で、時間の経過による血球数の減少を計測する。血液サンプルの溶血剤処理と未処理の場合の血球数の変化から溶血率に換算する。
【００４４】
表１に、使用濃度０．１％における各化合物の特性と迅速溶血評価結果、酵素阻害評価結果をまとめて示す。完全溶血を○とし、それ以外を×とした。また、０．０５％、０．２％、０．５％および１％の各濃度においても同様の結果を得た。
【００４５】
上記のノニオン性界面活性剤の溶血性能と酵素への阻害評価の結果から、本願発明のノニオン性界面活性剤（化合物１〜化合物６）、すなわち、１１〜１３という特定のＨＬＢ値範囲内のポリオキシエチレンエーテルが優れた溶血能力を有し、且つ酵素活性の阻害性も無いことがわかった。比較化合物１〜比較化合物３はイオン性界面活性剤であり、強力な溶血力を有するが、酵素活性を阻害性した。比較化合物４はノニオン性界面活性剤のポリオキシエチレンラウリルエーテルであるが、ＨＬＢ値が１０であり、酵素活性を阻害し、弱い溶血力が確認された。また、比較化合物５、６はエステル系のノニオン性界面活性剤であり、酵素活性の阻害を示さなかったが、強力な溶血力を持っていなかった。
【００４６】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床検査分野において、ヒトやその他の動物の血球を破壊し、特定な成分に対し分析を行うための溶血方法および溶血試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野おける血液検査において、例えば、検体が全血であり、かつ、分析対象となる物質が血球中に含まれる成分の場合、血球の破壊、つまり溶血する工程が必要となる。例えば、測定対象がグリコヘモグロビンＨｂＡ１ｃである場合、検体中の赤血球を十分溶血させて、赤血球中のヘモグロビンが溶液中を可溶化させる必要がある。
【０００３】
従来から、操作が簡便である等の理由から、赤血球を溶血するために界面活性剤が溶血剤として用いられている。例えば、界面活性剤ＣＴＡＢを用いて、赤血球を細胞破壊して血液から核酸を分離する技術が提案されている（特許文献１）。
【０００４】
界面活性剤を溶血剤として使用する際に、最も懸念される問題は、界面活性剤には、生体に対し毒性が強いものもあり、酵素活性の失活をもたらすことである。特に陰、陽イオン性界面活性剤分子は電荷をもつため、特定の成分を検出するための酵素（例えば標識酵素）と相互作用して、酵素の活性を低下させる。
【０００５】
特許文献２には、血液試料を、ｐＨ５．０〜９．５を有するイオン性洗剤（イオン性界面活性剤）を含む溶血試薬で処理し、全ヘモグロビン含量を溶血試料中で比色測定する一方、グリコヘモグロビンＨｂＡ１ｃ（以下、単に「ＨｂＡ１ｃ」とも言う。）を溶血試料中で免疫学的に測定する技術が提案されている。イオン性洗剤、例えばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）などのアニオン性洗剤や、ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）などのカチオン性洗剤は、溶血試薬として既によく知られているものである。しかしながら、このようなイオン性洗剤は蛋白変性作用もあるので、同じく蛋白質である標識酵素にも悪影響を与え、その酵素活性を抑制することになる。Ｂ／Ｆ分離を行わない均一系エンザイムイムノアッセイでは、イオン性洗剤が酵素活性を抑制するので実用上の感度を得ることができなかった。
【０００６】
特許文献３には、エンザイムイムノアッセイ法でＨｂＡ１ｃの濃度を測定する際、２−ブタノールとともに併用される溶血試薬として界面活性剤が挙げられ、通常用いられる多くの標識酵素（例えば、アミラーゼ）の酵素活性を低下させないため、ノニオン性界面活性剤が好ましいことが開示されている。
【特許文献１】特表平８−５０１２０８号公報
【特許文献２】特開平６−１１５１０号公報
【特許文献３】特開平９−１６６５９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一方、近年、検査の緊急性、救急医療、在宅検査などに対応できる迅速・簡便（且つ正確）な検査：ポイント・オブ・ケア検査（ＰＯＣＴ）のニーズが高まっており、特に検査のスピードが要求されている。そのため、検査ための検体前処理として、溶血工程の時間も短縮する必要性がますます高まっている。
【０００８】
しかしながら、特許文献１〜３のいずれも、イオン性界面活性剤もしくはノニオン性界面活性剤を用いて溶血処理を行うことが開示されているものの、どの界面活性剤が短時間
で完全溶血できるのか明確ではなく、通常の溶血工程は数分間の時間がかかっていた。
【０００９】
本発明の目的は、迅速に完全溶血することができ、且つ酵素活性への阻害もない、界面活性剤を使用する溶血方法および溶血試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
特許文献３に記載されているノニオン性界面活性剤は、非常に広範囲のものが挙げられており、これらのノニオン性界面活性剤には、（イ）溶血できるが酵素活性に阻害があるもの、（ロ）酵素活性に阻害がないが溶血できないもの、（ハ）迅速に完全溶血できず、かつ酵素活性に阻害があるもの、（ニ）迅速に完全溶血でき、かつ酵素活性に阻害がないものが含まれているものと考えられる。本発明者らは、どのようなノニオン性界面活性剤が、（a）迅速完全溶血、（ｂ）酵素への阻害がないという、（ａ）および（ｂ）の二つの条件を同時に満足するのか、鋭意検討を行った結果、以下の構成によって、上記課題を達成することができることを見出し、本発明を完成したものである。
【００１１】
本発明に係る溶血方法は、糖化タンパク質を検出するための、界面活性剤を用いる溶血方法であって、該界面活性剤がＨＬＢ値１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤であることを特徴とするものである。
【００１２】
より好ましくは、糖化タンパク質を検出するに際し、酵素活性により糖化タンパク質を検出し、該酵素が、タンパク質を分解する酵素、酸化酵素、脱水素酵素、または多糖を分解する酵素である。
【００１３】
更に好ましくは、前記ノニオン性界面活性剤が、下記一般式（１）で表わされるポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤である。
一般式（１）
Ｒ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ
上記一般式（１）中、Ｒは、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよい脂肪族炭化水素基、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい脂環式炭化水素基、または、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい芳香族炭化水素基であり、ｎは５〜２０の整数である。
【００１４】
特に好ましくは、前記ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンイソセチルエーテル、ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル及び、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよいポリオキシエチレンフェニルエーテルよりなる群から選ばれる。
【００１５】
本発明に係る溶血試薬は、ＨＬＢ値が１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤であって、該界面活性剤を含有し、糖化タンパク質を検出するための酵素が有する活性を阻害しないことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る溶血方法および溶血試薬によれば、迅速に赤血球を完全溶血することができ、且つ酵素への活性阻害もない。
また、本発明に係る溶血方法および溶血試薬は、糖尿病用のＨｂＡ１ｃ測定マイクロチップに使用するのに特に好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
「細胞破壊」は、細胞の表面膜を化学或いは物理的な方法で崩壊させ、細胞内容物を水中に分散或いは溶解させることを言う。細胞破壊は、細胞内部の特定の成分を分析するために行なわれる。
「溶血」は、血液（例えば全血）に含まれる細胞（例えば赤血球）の表面膜を化学或いは物理的な方法で崩壊させ、細胞内容物を水中に分散或いは溶解させることを言う。溶血は、血液に含まれる細胞内部の特定の成分を分析するために行なわれる。
【００１８】
「特定の成分」とは、本明細書においては、本発明で検出対象とされる、糖化タンパク質を指す。糖化タンパク質としては、グリコアルブミン、グリコヘモグロビン（例えば、ＨｂＡ１ｃ等）が好ましいものとして挙げられる。
「（特定の成分を）検出するための酵素」は、糖化タンパク質を分析するために使用される検出用酵素である。糖化タンパク質を検出するための酵素としては、タンパク質を分解する酵素、酸化酵素、脱水素酵素および多糖を分解する酵素が好ましいものとして挙げられる。タンパク質を分解する酵素としてはプロテアーゼが好ましく、酸化酵素としてはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）が好ましく、脱水素酵素としてはグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が好ましく、多糖を分解する酵素としてはアミラーゼおよびグリコアミラーゼが好ましいものとして挙げられる。例えば、特開平９−１６６５９４号公報に記載のα−アミラーゼは、本発明においても乾式エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）でＨｂＡ１ｃを測定する場合には、標識酵素として該検出用酵素を用いることが好適である。また、例えば特開２００１−５４３９８号公報、特開平１１−１５５５９６号公報に記載されているプロテアーゼも、検体中の検出対象となる糖化タンパク質を、プロテアーゼ等により分解したのち、プロテアーゼ処理物中の糖化アミノ酸を、糖化アミノ酸酸化酵素等により、生成した過酸化水素を検出することにより、該糖化タンパク質を検出することができる。
【００１９】
「完全溶血」とは、血液試料中の細胞（例えば、血球）が部分的にではなく、全部が破壊される状態と定義される。本発明の場合、血球数の計測によって、溶血の程度を評価する方法を採用したため、計測した血球数から求めた溶血率が１００％の場合は完全溶血という。血球数の計測には、血球カンウターＦ−５２０（シスメックス社）を用いた。
【００２０】
「迅速溶血」とは短時間で血液試料中の細胞（例えば、血球）が破壊されることである。本発明では１分以内をいい、好ましくは１０秒以内の完全溶血である。
【００２１】
ノニオン性界面活性剤は親水基としてイオン化する原子団を有しない界面活性剤の一群で、疎水基を水に可溶にするために、いずれも−ＯＨ基を有し且つ比較的親水基は少ないが、分子内の主要なる結合の仕方によって、エステル型、エーテル型、エステル・エーテル型、及びその他に分類される。代表的な非イオン性界面活性剤には下記のものがある。
１）エステル型
グリセリン、ソルビトール、蔗糖などの多価アルコールと脂肪酸がエステル結合でつながっている構造をもつ。なお、このタイプの非イオン界面活性剤は「多価アルコール型」と呼ばれることもある。例えば、Ｔｗｅｅｎ２０が挙げられる。
２）エーテル型
高級アルコールやアルキルフェノールなど水酸基を持つアルコール系原料に、主として酸化エチレン(エチレンオキサイド)を付加して製造されるタイプで、非イオン性界面活性剤の中では最も代表的な界面活性剤である。
２−１）ポリオキシエチレンアルキルエーテル
ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、ＡＥ、アルキル（またはアルコール）エトキシレート、アルキル（またはアルコール）ポリエトキシレートともいう。例えば、ポリオ
キシエチレンラウリルエーテルが挙げられる。
２−２）ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルは、ＡＰＥ、アルキルフェニル(またはフェノール)エトキシレート、アルキルフェニル(またはフェノール)ポリエトキシレートともいう。例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が挙げられる。
２−３）その他のエーテル型
疎水基としてポリプロピレングリコールを用いたポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレングリコールなどが挙げられる。これらの非イオン性界面活性剤は泡立ちが少ない為、低起泡性界面活性剤として各種用途に利用されているものである。
３）エステル・エーテル型
脂肪酸や多価アルコール脂肪酸エステルに酸化エチレンを付加したタイプである。また、「エーテル型」や「エステル・エーテル型」はともに酸化エチレンを付加したタイプなので「ポリエチレングリコール型」とも呼ぶことがある。
４）その他
疎水基と親水基がアミド結合で結合しているタイプの脂肪酸アルカノールアミド型が挙げられる。また、最近登場した糖類(ブドウ糖等)を原料とするアルキルポリグリコシドもある。
【００２２】
本発明者らは、前記特定の成分を検出するための酵素の活性を低下させることがなく、同時に迅速に完全溶血の能力を持つ溶血試薬を探索するために、数多くのノニオン性界面活性剤について検討した結果、ＨＬＢ値が１1〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤が迅速に完全溶血でき、且つ酵素の活性に阻害がないことを見出すに至った。
また、上記特性値を満たすノニオン性界面活性剤は、さらにエーテル型ノニオン性界面活性剤であることにより、完全溶血するまでの時間をさらに短くすることができた。
ＨＬＢ値とは界面活性剤の水と油(水に不溶性の有機化合物)への親和性の程度を表す値であり、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ-Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅの頭文字を取ったものである。親水親油バランスともいう。この概念は１９４９年にＡｔｌａｓ Ｐｏｗｄｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙのウィリアム・グリフィンによって提唱された。計算によって決定する方法がいくつか提案されている。
（１）アトラス法:
エステル系の界面活性剤について、鹸化価をＳ、界面活性剤を構成する脂肪酸の酸価をＡとし、ＨＬＢ値を２０（１−Ｓ／Ａ)で定義する。
（２）グリフィン法：
ＨＬＢ値＝２０×親水部の式量の総和／分子量で定義する。
（３）デイビス法:
官能基によって決まる基数を定め(例えばメチル基やメチレン鎖は親油基で０．４７５、水酸基は親水基で１．９など)、ＨＬＢ値＝７＋親水基の基数の総和−親油基の基数の総和で定義する。界面活性剤の混合物のＨＬＢ値は各成分のＨＬＢ値の加重平均となる。
（４）標準試料にＨＬＢ値を決定したい界面活性剤を添加して乳化し、実験的に決定する方法もあるが煩雑であるためあまり行われない。
（５）高速液体クロマトグラフィーでの保持時間から決定する方法もある。
本発明には、有機概念図（甲田善生，「有機概念図 −基礎と応用−」，ｐ．２２７(１９８４）三共出版）に基づくＩＯＢ方法で求めたＨＬＢ値を用いた。ＩＯＢ値は界面活性剤の無機性値と有機性値の比で、ＨＬＢ値はＩＯＢ値×１０の値である。
【００２３】
本発明においては、下記一般式（１）で表わされるポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤を用いることが好ましい。
一般式（１）
Ｒ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ
上記一般式（１）中、Ｒは、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよい脂肪族炭化
水素基、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい脂環式炭化水素基、または、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい芳香族炭化水素基であり、ｎは５〜２０の整数である。
上記脂環式炭化水素基としては、１つの環の炭素数が５〜６であり、脂環式炭化水素環の数が１〜４であるものが好ましく挙げられる。
上記芳香属炭化水素基としては、１つの環の炭素数が５〜６であり、芳香属炭化水素環の数が１〜４であるものが好ましく挙げられる。
【００２４】
ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤として好ましくは、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンイソセチルエーテル、ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル及び、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよいポリオキシエチレンフェニルエーテルが挙げられる。
【００２５】
本発明においてさらに好ましく使用されるノニオン性界面活性剤としては、
ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン単位１０〜１７のもの）、
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（オキシエチレン単位１２〜２０のもの）、
ポリオキシエチレンステアリルエーテル（オキシエチレン単位１１〜２０のもの）、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン単位7〜１２のもの）、
ポリオキシエチレンイソセチルエーテル（オキシエチレン単位１０〜１５のもの）、
ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル（オキシエチレン単位１０〜２０のもの）、
ポリオキシエチレンコレステリルエーテル、
ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（オキシエチレン単位１６〜２０のもの）及び
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（該アルキル基は、炭素数が８〜２０であり、直鎖でも分岐していてもよい。例えば、オキシエチレン単位平均９〜１０含有 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）が挙げられる。
【００２６】
本発明において溶血剤に用いられる上記界面活性剤の使用濃度は、０．０５％〜５％（質量濃度）が好ましく、好ましくは０．０５％〜１％、より好ましくは０．１％〜１％、さらに好ましくは０．１％〜０．２％である。この濃度範囲であれば、迅速な溶血能力を持つと同時に、エンザイムイムノアッセイで通常用いられる多くの標識酵素の酵素活性に悪影響を与えることもない。
【００２７】
本発明の溶血試薬は水系溶液で使用する。この水系溶液には、必要に応じてｐＨ緩衝剤、安定化剤などの成分を添加してもよい。
緩衝液としては、免疫反応及びその後の酵素反応を抑制しない緩衝液であればよく、従来のものを広く使用できる。好ましくは１０〜２００ｍＭの濃度のＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液を使用する。使用する酵素標識抗体の酵素反応の最適ｐＨに一致するｐＨ値とするのが好ましい。一般に、ｐＨ約５．５〜約８．５の範囲で選択するのが好ましい。
また酵素標識抗体の安定化剤としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＭＰＣ（２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマーなどを含有させてもよい。
【００２８】
本発明の溶血試薬を用いて、血液試料を処理する時、超音波処理と併用すると赤血球膜を破壊する工程は速くなる。５秒以内で完全溶血が確認された。
【００２９】
本発明の溶血試薬は酵素活性を低下させることがなく、かつ迅速に完全溶血する能力を持つため、エンザイムイムノアッセイ（酵素免疫測定法）、特に免疫反応後にＢ／Ｆ分離を行わない均一系エンザイムイムノアッセイに好適に用いることができる。また、微量で、迅速検出するためのマイクロ一体化診断チップ（特願２００４−０７８２１０号）に使用するのは最も効果的であり、好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳しく説明する。使用した溶血剤として用いた化合物とその特性は表１に示す。本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００３１】
［酵素活性の評価法］
以下の実施例では、乾式多層分析要素（標識酵素としてアミラーゼを含有）を用いて、一定使用濃度の溶血剤の存在下で、発色ＯＤへの影響を調べることによって、アミラーゼへの阻害性を評価した。
評価用の乾式多層分析要素は以下のように作製した。
下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
【００３２】
アルカリ処理ゼラチン １４．５ｇ／ｍ2
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール
（オキシエチレン単位平均９〜１０含有） ０．２ｇ／ｍ2
グルコースオキシダーゼ ５０００ｕ／ｍ2
ペルオキシダーゼ １５０００ｕ／ｍ2
グルコアミラーゼ ５０００ｕ／ｍ2
２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル−４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−フェネチルイミダゾール（ロイコ色素）酢酸塩
０．３８ｇ／ｍ2
ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン
０．１ｇ／ｍ2
【００３３】
この試薬層の上に下記の被覆量になるように接着層を、塗布、乾燥することにより設けた。
【００３４】
アルカリ処理ゼラチン １４．５ｇ／ｍ2
ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン
０．１ｇ／ｍ2
【００３５】
ついで接着層の表面に下記の被覆量になるように下記試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その上に５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）紡績糸３６ゲージ編みした厚さ約２５０μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層（編物層）を設けた。
【００３６】
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール
（オキシエチレン単位平均９〜１０含有） ０．１５ｇ／ｍ2
ビス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノ］メタン
０．４ｇ／ｍ2
【００３７】
次に、下記の被覆量になるように基質を塗布、乾燥することにより、ＣＲＰ分析用多層分析要素を調製した。
【００３８】
カルボキシメチル化澱粉 ５ｇ／ｍ2
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール
（オキシエチレン単位平均９〜１０含有） ０．２ｇ／ｍ2
【００３９】
さらに、展開層兼秤量層であるトリコット編物層にアミラーゼ−抗ＣＲＰ・ＩｇＧ結合物を３ｍｇ／ｍ2の被覆量となるようにしてエタノール溶液を塗布し、含浸させ乾燥させてＣＲＰ分析用多層乾式分析要素を得た。
【００４０】
次いで上記の乾式多層分析要素を１２ｍｍ(１３ｍｍ四方のチップに裁断し、特開昭５７−６３４５２号公報に記載のスライドの枠に収めて、酵素活性評価用多層乾式スライドとした。
【００４１】
このスライドに、０．１％（質量濃度）溶血剤を含有するｐＨ７の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０μＬを点着し、３７℃に保って、分光光度計（ＭＣＰＤ−２０００（大塚電子））でＰＥＴ支持体側から中心波長６５０ｎｍの可視光で反射光学濃度を測定した。点着から３分後および５分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ5-3）を求めて、ΔＯＤ値の変動が許容範囲（ΔＯＤ値の平均値±２ＳＤ：０．３７４５±０．０４９）外にはみ出したら、酵素に対して阻害性があると判断する。
【００４２】
実施例化合物と比較化合物の酵素活性に対する影響の評価結果を表１にまとめて示す。上記許容範囲内を○とし、外れるものを×とした。
【００４３】
［迅速溶血評価法］
０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％および１％の各濃度の溶血剤をそれぞれ１．５ｍＬチューブに９８０μＬづつ分注する。全血を２０μＬチューブに添加して、ミキサーでよく混ぜる。一定時間（１０秒）後、直ちに食塩水で高倍率（一般的には５００倍以上、本実施例では１０００倍を希釈することによって、溶血剤の作用を停止させた。希釈した直後、溶液中の血球数を血球カンウターＦ−５２０（シスメックス社）で、時間の経過による血球数の減少を計測する。血液サンプルの溶血剤処理と未処理の場合の血球数の変化から溶血率に換算する。
【００４４】
表１に、使用濃度０．１％における各化合物の特性と迅速溶血評価結果、酵素阻害評価結果をまとめて示す。完全溶血を○とし、それ以外を×とした。また、０．０５％、０．２％、０．５％および１％の各濃度においても同様の結果を得た。
【００４５】
上記のノニオン性界面活性剤の溶血性能と酵素への阻害評価の結果から、本願発明のノニオン性界面活性剤（化合物１〜化合物６）、すなわち、１１〜１３という特定のＨＬＢ値範囲内のポリオキシエチレンエーテルが優れた溶血能力を有し、且つ酵素活性の阻害性も無いことがわかった。比較化合物１〜比較化合物３はイオン性界面活性剤であり、強力な溶血力を有するが、酵素活性を阻害性した。比較化合物４はノニオン性界面活性剤のポリオキシエチレンラウリルエーテルであるが、ＨＬＢ値が１０であり、酵素活性を阻害し、弱い溶血力が確認された。また、比較化合物５、６はエステル系のノニオン性界面活性剤であり、酵素活性の阻害を示さなかったが、強力な溶血力を持っていなかった。
【００４６】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化タンパク質を検出するための、界面活性剤を用いる溶血方法であって、該界面活性剤がＨＬＢ値１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤であることを特徴とする溶血方法。
【請求項２】
酵素活性により糖化タンパク質を検出し、該酵素が、タンパク質を分解する酵素、酸化酵素、脱水素酵素または多糖を分解する酵素である請求項１記載の溶血方法。
【請求項３】
ノニオン性界面活性剤が、下記一般式（１）で表わされるポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤である請求項１または２記載の溶血方法。
一般式（１）
Ｒ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ
上記一般式（１）中、Ｒは、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよい脂肪族炭化水素基、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい脂環式炭化水素基、または炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい芳香族炭化水素基であり、ｎは５〜２０の整数である。
【請求項４】
ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンイソセチルエーテル、ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル及び、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよいポリオキシエチレンフェニルエーテルよりなる群から選ばれる請求項３記載の溶血方法。
【請求項５】
ＨＬＢ値が１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤であって、該界面活性剤を含有し、糖化タンパク質を検出するための酵素が有する活性を阻害しないことを特徴とする溶血試薬。
【請求項１】
糖化タンパク質を検出するための、界面活性剤を用いる溶血方法であって、該界面活性剤がＨＬＢ値１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤であることを特徴とする溶血方法。
【請求項２】
酵素活性により糖化タンパク質を検出し、該酵素が、タンパク質を分解する酵素、酸化酵素、脱水素酵素または多糖を分解する酵素である請求項１記載の溶血方法。
【請求項３】
ノニオン性界面活性剤が、下記一般式（１）で表わされるポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤である請求項１または２記載の溶血方法。
一般式（１）
Ｒ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ
上記一般式（１）中、Ｒは、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよい脂肪族炭化水素基、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい脂環式炭化水素基、または炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい芳香族炭化水素基であり、ｎは５〜２０の整数である。
【請求項４】
ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンイソセチルエーテル、ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル及び、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよいポリオキシエチレンフェニルエーテルよりなる群から選ばれる請求項３記載の溶血方法。
【請求項５】
ＨＬＢ値が１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤であって、該界面活性剤を含有し、糖化タンパク質を検出するための酵素が有する活性を阻害しないことを特徴とする溶血試薬。
【公開番号】特開２００７−１６３１８２（Ｐ２００７−１６３１８２Ａ）
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３５６７３８（Ｐ２００５−３５６７３８）
【出願日】平成１７年１２月９日（２００５．１２．９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月９日（２００５．１２．９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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