漿膜下筋膜を含む分離された細胞外マトリクス材料
動物の腹壁から分離され腹壁の漿膜下筋膜層を含む純化させた細胞外マトリクス材料が記載される。このような医療用材料は、損傷を受けた組織の治療に使用でき、ある側面においてはヘルニアの修復における組織の支持を提供する際に使用できる。関連する製造方法および使用方法についても記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には医療用材料の分野に属し、特に組織移植に有用な医療用材料の局面に関する。
【背景技術】
【０００２】
さらに、背景として、さまざまな細胞外マトリクス（ＥＣＭ）材料が、医療用移植、細胞培養、およびその他の関連する用途において使用するために提案されてきた。たとえば、小腸、胃または膀胱組織から得た粘膜下組織を含む医療用移植片および細胞培養材料が提案されてきた。例として、米国特許第４，９０２，５０８号、第４，９５６，１７８号、第５，２８１，４２２号、第５，５５４，３８９号、第６，０９９，５６７号、および第６，２０６，９３１号参照。加えて、インディアナ州ウェストラファイエットのクックバイオテック社（Cook Biotech Incorporated）は現在、小腸の粘膜下組織に基づくさまざまな医療用材料を、ＳＵＲＧＩＳＩＳ（登録商標）、ＳＴＲＡＴＡＳＩＳ（登録商標）、およびＯＡＳＩＳ（登録商標）という登録商標の下で製造している。
【０００３】
肝臓の基底膜から得た医療用材料も、たとえば米国特許第６，３７９，７１０号において提案されている。加えて、羊膜から得たＥＣＭ材料（例として米国特許第４，３６１，５５２号および第６，５７６，６１８号参照）および腎被膜から得たＥＣＭ材料（２００３年１月９日に公開された国際ＰＣＴ特許出願ＷＯ０３／００２１６５参照）が、医療用途および／または細胞培養用途のために提案されている。しかしながら、これらの材料の多くは、その大きさおよび強度が限られている。用途によっては、これらの材料からなる複数のストリップまたはシートは、所望の領域を覆うのに十分大きな移植片となるように結合または接合し、かつ、十分な強度を保ち再移植が必要とならないようにしなればならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記に関し、広範囲にわたる医療用途、特に大型および／または比較的伸張性のある移植片を要する医療用途において使用可能な代替医療用材料が必要であることは明らかである。本発明は、このような医療用材料ならびにその調製方法および使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
ある局面において、本発明は、組織移植片を提供する際に使用するのに適した材料を提供する。この材料は、動物、特にブタ（porcine animal）の腹壁から得られ、この動物の腹壁由来の漿膜下筋膜を含んでいる細胞外マトリクス材料の、分離されたシートを含む。この細胞外マトリクス材料は、コラーゲンおよびエラスチンを含み、天然細胞を実質的に含まないようにすることができる。この細胞外マトリクス材料は、望ましくは生体吸収性であり、いくつかの実施の形態では動物由来の天然の硫酸化グリコサミノグリカンを保持することができる。この細胞外マトリクス材料は、少なくとも１ポンドの引張破断強度および／または少なくとも約５０％の破断伸びを有することができる。
【０００６】
別の局面において、本発明は、細胞外マトリクス移植材料の調製方法であって、この方法は、動物、特にブタの腹壁から分離された組織のセグメントを提供することを含み、この組織のセグメントは、漿膜下筋膜と付着した漿膜下脂肪とを含む、方法を提供する。この漿膜下脂肪のうち少なくとも一部は、たとえば機械的に除去され、漿膜下筋膜を含む組織のコラーゲンの層を作る。このコラーゲンの層は、細胞を除去され、その脂質の含有量を減じるように処理することもできる。ある有益な形態では、処理後、この組織のコラーゲンの層は、天然の硫酸化グリコサミノグリカンを保持し、少なくとも１ポンドの引張破断強度を有し、および／または少なくとも約５０％の破断伸びを有する。
【０００７】
別の局面において、本発明は患者を治療するための方法を提供する。この方法は、患者に、本明細書に記載の細胞外マトリクス材料を移植することを含む。好ましい形態では、この移植は、たとえばヘルニア修復治療を施す際に、患者の軟組織を支持するために行なわれる。
【０００８】
本発明のさらに他の実施の形態ならびに特徴および利点は、本明細書における以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、移植材料を調製するためにブタの腹壁の層から切片を採取する際に使用される、ブタの腹壁の層を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
次に、本発明の原理の理解を促すために、図面に示される実施の形態を参照し、具体的な表現を用いてそれを説明する。しかしながら、これは本発明の範囲を限定することを意図しているのではなく、示された医療用材料における変形および変更、ならびに、本明細書に示される本発明の原理のさらなる用途は、本発明に関連する技術の当業者が通常想到するものであることが、理解されるであろう。
【００１１】
先に開示したように、本発明は、医療処置用の組織移植片を提供する際に使用可能な、分離され、細胞を除去された細胞外マトリクス（ＥＣＭ）材料を提供する。次に図面を参照すると、図１は、豚の腹壁１０の層の図である。図１は、たとえばウシ科、ヒツジ、およびウマ科の動物を含む、ＥＣＭ材料を得ることができる他の動物の腹壁も表わしている。これらの層は、壁側腹膜１１、漿膜下筋膜１２、漿膜下脂肪１３、後部筋膜１４、腹筋１５、前部筋膜１６、皮下脂肪１７、および真皮１８を含む。本明細書に記載の細胞外マトリクス移植材料は、漿膜下筋膜１２を含み、任意に、腹壁の残りの構造層から剥がされた壁側腹膜１１も含む。このように、本発明の好ましい細胞外マトリクス移植材料には、後部筋膜１４、腹筋１５、前部筋膜１６、漿膜下脂肪１７、および真皮１８はないまたは本質的にない。本明細書で使用する「本質的にない」は、除外された構成要素が、たとえば移植材料の０．５重量％以下を構成する、わずかな残渣として検出される可能性があるものを除いて存在しないことを意味する。
【００１２】
この移植材料の漿膜下筋膜は、動物、好ましくは温血脊椎動物、より好ましくは、ブタ、ヒツジ、ウシまたはウマ等の非ヒト温血脊椎動物の腹壁から得られる。供給源としてブタが特に好ましい。ある好ましい実施の形態では、本発明において有用な腹膜および筋膜は、腹壁を採取し、この壁から組織切片を剥がすことによって得ることができ、この壁は、壁側腹膜、漿膜下筋膜、およびこの組織供給源にある筋肉層および／またはその他の層を含む隣接する組織由来のその他の組織（たとえば脂肪組織）の少なくとも一部を含む。望ましくは、次に壁側腹膜および漿膜下筋膜を含むこの組織切片をさらに処理することによって、移植材料として使用するのに適した、コラーゲン含有（「コラーゲン性の」）およびエラスチン含有（「エラスチン性の」）シートを調製する。さらに壁側腹膜を除去するようにまたは壁側腹膜を保持するように処理を行なうことができる。このように、いくつかの実施の形態では、調製した移植材料には壁側腹膜がないまたは本質的になく、他のいくつかの実施の形態では、調製した移植材料は壁側腹膜を含む。
【００１３】
壁側腹膜１１、漿膜下筋膜１２、および漿膜下脂肪１３各々の少なくとも一部分を含む採取された組織切片を、任意の適切な手段を用いて処理することによって、漿膜下脂肪１３を除去することができる。例として、適切な除去手段は、たとえば尖っていない刃を用いて脂肪組織を機械的に削り取ることを含むことができる。必要に応じて、さらなる漿膜下脂肪１３またはそれ以外の脂肪組織を、この多層材料を、イソプロピルアルコールまたは脂肪組織を除去するのに適切なそれ以外の任意の液状媒体に、さらなる脂肪を除去するのに必要な期間、浸漬することによって除去することができる。ある好ましい実施の形態では、分離した材料をまず擦ることによって漿膜下脂肪１３の部分を除去する。擦った後の材料を有機溶媒で処理、たとえばイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（１０体積部のＩＰＡに対して１重量部の材料）に３０分間浸漬させることによって、脂肪を除去する。この脂肪を除去するための処理ステップは、典型的には少なくとも１回行なうが、複数回行なってもよい（たとえば２、３、４または５回以上）。好ましい処理された本発明のＥＣＭ移植材料は、天然脂肪含有量が１５重量％未満、より好ましくは１０重量％未満であり、いくつかの実施の形態では５重量％未満である。
【００１４】
本明細書に記載の細胞外マトリクス材料の１つの利点は、腹壁組織から採取した一部分から大きなサイズの細胞外マトリクス材料を調製することができ、その一方で医療用途に十分な強度特性を保つ点にある。組織供給源から分離した多くの他の材料（たとえば他のＥＣＭ材料）は、個々のシートのいずれよりも大きなシート移植片を調製するために材料の複数のシートを接合することを必要とし、これにより、１つのシート全体が、ヘルニア移植片といったいくつかの医療用途に十分な大きさおよび強度を有する。このように接合した構造物を必要に応じて形成できるが、本明細書に記載の細胞外マトリクス移植材料は、横方向に接合した複数の部分の使用の必要性を避けるために、十分に成長した大きな動物から採取することもできる。いくつかの実施の形態では、漿膜下筋膜のみを含むまたは壁側腹膜に隣接する処理された細胞外マトリクス移植片は、少なくとも２０ｃｍ幅、少なくとも２０ｃｍ長を有する。
【００１５】
本発明の細胞外マトリクス材料を用いて、患者の組織損傷を含む医学的症状を含めさまざまな医学的症状を、患者にこの材料を移植することによって、治療できる。この点に関し、本発明の医療用材料を用いて、損傷を受けた組織を治療することができ、患者の外部構造（たとえば皮膚）に適用するか、またはたとえばヘルニア修復または骨盤底復元の場合のように組織を支持するために患者の中に移植することができる。このように、本発明の医療用材料は、使用の対象となる所望の部位に適したさまざまな形で構成できる。本発明の医療用材料は、１つ以上の薬剤またはそれ以外の医薬品を組込むことができ、患者への適用後にこういった物質を溶出することによって、その物質の全身投与の必要性を無くしまたは減じ、かつ全身毒性および副作用の危険性を最小にすることができる。
【００１６】
一般的に、この医療用材料は、組織に適用するように構成される場合は、切断されるかさもなければ最終用途に応じた所望の大きさとなるように構成される。いくつかの実施の形態では、この材料の大きさを、適用する組織欠陥より大きくすることができる。材料の大きさをこのようにして定めることによって、周囲の組織に容易に取付けることができる。たとえば、適切な大きさに定めた医療用材料を、治療を要する領域の上、中または周囲に配置すれば、この医療用材料を、いくつかの周知の適切な装着手段のうちいずれかを用いて、周囲の組織またはその他の構造によりしっかりと取付けることができる。適切な装着手段は、たとえば、ステープリング、縫合、接着などを含む。好ましくは、この医療用材料を、縫合糸によって周囲の組織またはその他の構造によりしっかりと取付けることができる。現在、当該技術において縫合糸として利用できるさまざまな合成材料がある。例として、プロレン（Prolene）（登録商標）、バイクリル（Vicryl）（登録商標）、マーシレン（Mersilene）（登録商標）、パナクリル（Panacryl）（登録商標）、およびモノクリル（Monocryl）（登録商標）を含む縫合糸は、本発明で使用することが意図されている。これ以外の縫合材料は当業者には周知であろう。当該技術で一般的に知られている医療用接着剤も、本発明の医療用材料とともに使用することによって、この材料を組織またはその他の構造によりしっかりと取付けることができる。
【００１７】
好ましい実施の形態では、腹膜とその下にある漿膜下筋膜とを含む細胞外マトリクス材料は、生体吸収性材料であることが可能であり、望ましくは患者に移植されたときに組織のリモデリングを助け、時間が経過すると患者の組織と入れ替わる。多くの場合、この医療用材料は、リモデリング可能な特性を示し、この特性により、リモデリング過程が数日または数週間で生じる。好ましい実施の形態では、このリモデリング過程は約５日から約１２週間以内に生じ、その間に、移植された材料は、患者の組織によって再吸収され置き換えられる。この際、本発明の好ましいＥＣＭ材料は、この材料への血管新生を助けまたは引起して新たな患者の組織の成長を容易にすることができる。これらの目的のために、本発明のいくつかの好ましいＥＣＭ材料は、この材料が移植部分に永続することが無いように、グルタルアルデヒド等の化学的架橋剤では処理しない。
【００１８】
しかしながら、ある状況において必要であれば、他の実施の形態では、この発明のＥＣＭ材料は、導入された天然でない架橋を含んでもよい。たとえば、ＥＣＭ材料を、元々存在していた部分から分離した後に任意の時点で架橋剤で処理することができる。この医療用材料内の架橋および／または２つ以上の医療用材料の重なり合う層の間の架橋の量（または数）を増やすことによって、その強度を高めることができる。しかしながら、医療用材料内に導入された架橋は、この材料が再吸収されて患者の組織にリモデリングされる機能に影響を及ぼす可能性もある。結果として、架橋が導入されたいくつかの実施の形態では、ＥＣＭ材料のリモデリング可能な特性を保つように、ＥＣＭ材料内に追加された架橋のレベルを、適切な判断によって制御することができる。
【００１９】
ＥＣＭ材料の導入された架橋を使用する場合、これは、光架橋技術によって、または、化学的架橋剤等の架橋剤を適用することによって、または、脱水もしくはそれ以外の手段によって生じるタンパク質の架橋によって、得ることができる。使用できる化学的架橋剤は、たとえば、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類、カルボジイミド、たとえば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のジイミド類、リボースまたはそれ以外の糖、アシルアジ化物、スルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド、またはポリエポキシド化合物を含み、これは、たとえばナガセケムテックス株式会社（日本、大阪）のデナコール（DENACOL）ＥＸ８１０の商標名で入手可能なエチレングリコールジグリシジルエーテル等のポリグリシジルエーテル類、およびこれもナガセケムテックス株式会社から入手可能なデナコールＥＸ３１３の商標名で入手可能なグリセロールポリグリセロールエーテルを含む。典型的には、ポリグリセロールエーテル類またはその他のポリエポキシド化合物は、使用される場合、１分子当たり２から約１０のエポキシド基を有するであろう。
【００２０】
２つ以上のＥＣＭ材料の層を含む積層構造を意図する場合、この積層物の層をさらに架橋して、多数のＥＣＭ材料の層をお互いに結合することができる。マトリクスを紫外線に晒し、コラーゲン系マトリクスをトランスグルタミナーゼおよびリシルオキシダーゼ等の酵素で処理し、光架橋を行なうことによって、ＥＣＭ材料の架橋を触媒することもできる。よって、さらなる架橋を、個々の層に対して、そのお互いの結合の前に、お互いの結合の間に、および／またはお互いの結合の後に、追加してもよい。
【００２１】
これに代えて、２つ以上の多層医療用材料セグメントを巻いてもしくは積重ねて、または、１つの材料セグメントを少なくとも一度折り畳み、次に、材料を、真空プレス、凍結乾燥、もしくはその他の脱水熱結合条件等の、化学的架橋以外の結合技術を用いて、および／または接着剤、糊もしくはその他の結合剤の使用によって、融着させるまたは結合させることができる。適切な結合剤は、たとえば、コラーゲンゲルもしくはペースト、ゼラチン、フィブリン接着剤、または、反応性モノマーもしくはポリマー、たとえばシアノアクリレート接着剤を含むそれ以外の材料を含み得る。同様に、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、エポキシド、ゲンピン、またはその誘導体、カルボジイミド化合物、ポリエポキシド化合物、または上記の説明で特定されたそれ以外のものを含む他の同様の物質等の化学的架橋剤を用いることによって、結合させまたは結合を促進させることができる。これらのうち１つ以上を、脱水で引起す結合と組合せることもできる。
【００２２】
さまざまな脱水で引起す結合方法を用いて、この発明のＥＣＭ材料の部分同士を融着できる。ある好ましい実施の形態では、多数のＥＣＭ材料の層を脱水条件下で圧縮する。「脱水条件」という用語は、多層医療用材料からの水分の除去を促進しまたは引起す機械的条件または環境条件を含み得る。圧縮された材料の脱水を促進するために、マトリクス構造を圧縮する２つの表面のうち少なくとも１つを透水性にすることができる。任意として、この材料の脱水を、圧縮する表面の外側において、吸取り材料を与え、マトリクス構造を加熱し、または空気もしくはそれ以外の不活性ガスを吹付けることによって、高めることができる。ＥＣＭ層同士を脱水結合する場合に特に有用な方法は、たとえばフリーズドライ等の凍結乾燥または気化冷却条件を含む。
【００２３】
脱水結合のもう１つの方法は、真空プレスである。真空プレスの間、強制的に接触させた多層医療用材料を脱水することによって、これらの材料同士は、結合させるための他の薬剤がなくても効果的に結合する。ただし、脱水で引起す結合の少なくとも一部を利用しながら、このような薬剤を用いることもできる。十分な圧縮および脱水によって、この多層医療用材料は、全体的に一体化された積層構造を形成することができる。
【００２４】
本発明のいくつかの局面においては、本発明のＥＣＭ材料に対する潜在的な有害効果、たとえば天然コラーゲン構造および潜在的に存在する生物活性物質を最小にする、比較的温和な温度暴露条件下で、乾燥作業を行なうことが好都合である。このように、本発明のいくつかの形態において、人間の体温を超えるまたは人間の体温よりも少し高い温度に晒すことなく、または実質的に晒すことなく、すなわち約３８℃以下で、行われる乾燥作業を使用することは好ましいであろう。これらは、たとえば、約３８℃未満での真空プレス作業、約３８℃未満での強制空気乾燥、またはほぼ室温（約２５℃）で、積極的な加熱をせずにまたは冷却とともに、これらのプロセスのうちいずれかを行なうことを含む。当然ながら比較的低い温度条件は凍結乾燥条件も含む。
【００２５】
調製したＥＣＭ材料は、任意に、組織供給源に本来存在する生物活性成分を含んでいてもよい。たとえば、腹膜および／または筋膜は、フィブロブラスト成長因子２（ＦＧＦ−２）、脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）またはその組合せ等の天然成長因子を１つ以上、含み得る。加えて、この発明のＥＣＭ材料は、ヘパリン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧｓ）の１つ以上、ヒアルロン酸等の非硫酸化グリコサミノグリカンの１つ以上、および／またはフィブロネクチン等の糖タンパク質の１つ以上など、その他の生体物質を含み得る。このように、一般的に言えば、この発明のＥＣＭは任意に、細胞の形態、増殖、成長、タンパク質または遺伝子発現等の細胞性応答を直接的または間接的に誘発する、天然の生物活性成分の１つ以上を保持するように処理してもよい。
【００２６】
本発明の処理されたＥＣＭ材料は典型的に十分なコラーゲンを含むであろう。このような天然由来ＥＣＭ材料は、大部分、配向がランダムではないコラーゲン線維を含むであろう。処理されたＥＣＭ材料は典型的にエラスチンも含むであろう。上記の天然生物活性成分を保持するように処理されると、ＥＣＭ材料は、これらの成分を、コラーゲン線維の間に、上におよび／または中に散在する固体として保持することができる。本発明に使用するのに特に望ましい材料は、光学顕微鏡検査において適切に染色することによって容易に識別可能な、このように散在した非コラーゲン性および非エラスチン性の固体を大量に含むであろう。このような非コラーゲン性および非エラスチン性の固体は、本発明のいくつかの実施の形態において、この材料の乾燥重量のうち相当の割合、たとえば本発明のさまざまな実施の形態において少なくとも約１重量％、少なくとも約３重量％、および少なくとも約５重量％を、構成することが可能である。
【００２７】
本発明のＥＣＭ材料は、血管新生特性を示すこともあり、したがって、この材料を移植された受容者に血管新生を誘発するのに有効である。この点に関し、血管新生とは、身体が新たな血管を作り、より多くの血液の組織への供給を行なうプロセスである。よって、血管新生材料は、受容者の組織と接触すると、新たな血管の形成を促進または高める。生体材料の移植による血管新生のin vivo測定方法が最近開発された。たとえば、このような方法の１つは、皮下移植モデルを使用して材料の血管新生特性を求める。Ｃ．ヒーシェン（C.Heeschen）他、Nature Medicine 7(2001), No.7, 833-839参照。このモデルは、蛍光ミクロ血管造影技術と組合されて、生体材料への血管新生の定量的尺度および定性的尺度双方を提供することができる。Ｃ．ジョンソン（C.Johnson）他、Circulation Research 94(2004), No.2, 262-268。
【００２８】
さらに、天然生体活性成分の包含に加えてまたはこれに代えて、組換技術またはその他の方法で合成によって製造されたもの等の非天然生体活性成分を、本発明のＥＣＭ材料に組込んでもよい。こういった非天然生体活性成分は、組織内で自然に存在するがおそらく異なる種のものに相当する、天然由来のまたは組換技術で製造されるタンパク質（たとえばブタ等の他の動物に由来する組織に適用されるヒトタンパク質）であってもよい。いくつかの形態では、ＦＧＦ−２、血小板に由来する成長因子（ＰＤＧＦ）および／またはＶＥＧＦ等のといった非天然成長因子を１つ以上、ＥＣＭ材料に追加することができる。この非天然生体活性成分は、薬物であってもよい。本発明に使用される材料の中におよび／またはその上に取込むことができる薬物の例には、たとえば、抗生物質、血液凝固因子等の血栓促進物質が含まれ、たとえば、トロンビン、フィブリノゲン、抗炎症剤、抗増殖剤、鎮痛剤、その他が挙げられる。これらの物質は、多層医療用材料に、製造前段階として、処置の直前に（たとえばこの材料をセファゾリン等の適切な抗生物質を含む溶液の中に浸漬させることによって）、または、材料が患者の中に生着している間またはその後に、適用してもよい。
【００２９】
非天然生体活性成分を、任意の適切な手段によって、この発明のＥＣＭ材料に適用することができる。適切な手段は、たとえば、吹付け、含浸、浸漬などを含むことができる。他の化学的または生物学的成分がＥＣＭ材料に含まれる場合、非天然生体活性成分は、これらの他の成分の前に、これらとともに、またはこれらの後に適用できる。ある実施の形態では、非天然生体活性成分のコーティングを、ＥＣＭ材料の片面または両面に形成できる。「コーティング」は、この非天然生体活性成分を適用してＥＣＭ材料の表面の指定された部分を覆うことを意味する。いくつかの実施の形態では、非天然生体活性成分を適用し、この発明のＥＣＭ材料の少なくとも片面の表面領域全体を実質的に覆うコーティングを形成できる。他の実施の形態では、本明細書に記載のもの等の非天然生体活性成分を、この発明のＥＣＭ材料全体において実質的に均一的に組込むことができる。
【００３０】
本発明のＥＣＭ材料は、好ましくは、たとえばクック（Cook）他の米国特許第６，２０６，９３１号に記載のように高度に純化されたものである。したがって、好ましいＥＣＭ材料は、１グラム当たり約１２エンドトキシンユニット（ＥＵ）未満の、より好ましくは１グラム当たり約５ＥＵ未満の、最も好ましくは１グラム当たり約１ＥＵ未満のエンドトキシンレベルを示すであろう。さらに好ましくは、この発明のＥＣＭ材料は、１グラム当たり約１コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満の、より好ましくは１グラム当たり約０．５ＣＦＵ未満のバイオバーデンを有していてもよい。望ましくは、真菌レベルは同様に低く、たとえば１グラム当たり約１ＣＦＵ未満、より好ましくは１グラム当たり約０．５ＣＦＵ未満である。核酸レベルは、好ましくは約５μｇ／ｍｇ未満、より好ましくは約２μｇ／ｍｇ未満であり、ウイルスレベルは、好ましくは１グラム当たり約５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）未満、より好ましくは１グラム当たり約５ＰＦＵ未満である。米国特許第６，２０６，９３１号で教示されているＥＣＭ組織のこれらおよびさらなる特性は、この発明のＥＣＭ材料の特徴であろう。
【００３１】
さらに他の実施の形態では、本発明のＥＣＭ材料に対して、この材料を拡張させる処理を施すことができる。いくつかの形態では、このように拡張させた材料は、ＥＣＭ材料を、この材料が拡張するまで１つまたはそれ以上のアルカリ性物質と接触させることによって形成できる。例として、この接触は、ＥＣＭ材料を、当初の体積の少なくとも１２０％（すなわち１．２倍）に、または、形態によっては当初の体積の少なくとも約２倍に拡張させるのに十分でありうる。その後、拡張させた材料を、任意で、たとえば中和および／または濯ぎ落しによってアルカリ性媒体から分離することができる。この収集された拡張させた材料は、任意の適切なやり方で使用することができる。例として、拡張させた材料に対し、所望の形状または構成の移植片構造体の形成において、生体活性成分の富化、乾燥、および／または成形などを行なうことができる。いくつかの実施の形態では、拡張させたＥＣＭ材料構造体は、高い圧縮性および拡張性を有することができるので、たとえばカニューレを挿入した送達装置の内腔の中から送達するために圧縮し、その後装置から取出した際に拡張させて患者の体内に固定し、患者の体内の経路を閉塞する、および／または止血することができる。
【００３２】
拡張させた材料は、この発明のＥＣＭ材料を、水酸化ナトリウムを含む水溶液またはその他の媒体に、制御した状態で接触させることによって形成できる。この材料をアルカリ処理することによって、この材料の物理的構造を変化させて拡張させることができる。このような変化は、材料の中のコラーゲンの変性を含み得る。いくつかの実施の形態では、この材料を、元の体積の少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、またはそれ以上に拡張させることが好ましい。拡張の大きさは、たとえば、材料を拡張させる処理で使用される、アルカリ性媒体の濃度またはｐＨ、暴露時間、および温度を含む、いくつかの要因に関連する。
【００３３】
ＥＣＭ材料は、典型的には、自然に存在する分子内架橋および自然に存在する分子間架橋を有するコラーゲン原線維の網状組織を含むであろう。本発明に記載の拡張処理を行なうと、この自然に存在する分子内架橋および自然に存在する分子間架橋は、処理されたコラーゲン性のマトリクス材料内で、コラーゲン性のマトリクス材料を完全なコラーゲン性のシート材料として保つのに十分な状態で保持することができる。しかしながら、コラーゲン性のシート材料内のコラーゲン原線維は、変性する可能性があり、コラーゲン性のシート材料は、出発材料の厚みよりも大きい、たとえば最初の厚みの少なくとも１２０％または最初の厚みの少なくとも２倍の、アルカリ処理された厚みを有する可能性がある。
【００３４】
例として、ＥＣＭ材料の処理のためのアルカリ性物質の濃度は、約０．５から約２Ｍの範囲にすることができ、より好ましい濃度は約１Ｍである。加えて、アルカリ性物質のｐＨは、いくつかの実施の形態では約８から約１４の範囲にすることができる。好ましい局面において、アルカリ性物質は、約１０から約１４、最も好ましくは約１２から約１４のｐＨを有するであろう。
【００３５】
濃度およびｐＨに加え、温度および暴露時間等のその他の要素が、上記の拡張の程度に影響するであろう。この点に関し、いくつかの変形例では、ＥＣＭ材料のアルカリ性物質への暴露を、約４から約４５℃の温度で実施する。好ましい実施の形態では、この暴露は、約２５から約４０℃の温度で、最も好ましくは３７℃で行なわれる。さらに、暴露時間の範囲は少なくとも約１分から約５時間以上までとすることができる。いくつかの実施の形態では、この暴露時間は約１から約２時間である。特に好ましい実施の形態では、ＥＣＭ材料を、ｐＨが１４であるＮａＯＨの１Ｍ溶液に、約３７℃の温度で約１．５から２時間暴露させる。このような処理によって、コラーゲンが変性し材料が実質的に拡張する。この材料のコラーゲンマトリクスの変性は、この材料のコラーゲン充填特性の変化、たとえば出発材料の密に結合したコラーゲン網の実質的な崩壊として、観察することができる。拡張していない材料は、裸眼で見たときまたは適度の倍率たとえば１００倍の倍率で見たときに実質的に均一的で連続した表面を示す、密に結合したコラーゲン網を有することができる。逆に、拡張したコラーゲン性の材料は、同じ倍率たとえば約１００倍の倍率で見たときに、この表面は連続しておらず、多くの領域において材料中の鎖または束の間の実質的な隙間によって分離されているコラーゲンの鎖および束を示している点で、全く異なる表面を有することができる。結果として、拡張したＥＣＭ材料は典型的に、対応する拡張していないＥＣＭ材料よりも多孔性の程度が高いように見える。さらに、多くの場合、拡張したＥＣＭ材料は、たとえば水またはその他の流体通路に対する透過性の増加を測定することによって、処理していない出発材料と比較して多孔率が増したものとして、示されうる。拡張したＥＣＭ材料をより泡状で多孔である構造にすることで、この材料を、医療用材料および装置の調製に使用するために、さまざまなスポンジまたは発泡形状に成型、さもなければ調製することができる。
【００３６】
このようなアルカリ処理の後、ＥＣＭ材料を、アルカリ性媒体から分離し、さらなる用途のために処理することができる。例として、収集した材料を、中和しておよび／または水で濯ぎ落してこの材料のアルカリ性を除去した後に、ＥＣＭ材料をさらに処理して本発明の構造体またはそれ以外の組成物を形成することができる。
【００３７】
出発材料（すなわちアルカリ性物質で処理する前）は、任意に、コラーゲンおよびエラスチン以外の天然成分を含むことができる。この材料をアルカリ性物質で処理することにより、このような天然成分のうちの１つ、いくつか、またはすべての量が減少することがある。いくつかの実施の形態では、この材料に対し、アルカリ性物質で、制御された処理を行なうことは、実質的に核酸および脂質がなく、かつ、潜在的に成長因子、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、およびプロテオグリカンもない材料を作るのに十分であろう。
【００３８】
いくつかの実施の形態では、たとえば拡張処理の間にＥＣＭ材料から除去されたものに類似する、外因性または内因性の生体活性成分を１つ以上、材料に戻すことができる。たとえば、拡張したＥＣＭ材料に、成長因子、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、および／またはプロテオグリカンを補充することができる。これらの生体活性成分は、任意の適切な方法で材料に戻すことができる。たとえば、いくつかの形態では、これらの成分を含む米国特許第６，３７５，９８９号に記載の組織抽出物を調製し、これらを除去したＥＣＭ材料に与えることができる。ある実施の形態では、ＥＣＭ材料を組織抽出物の中で十分な時間にわたってインキュベートすることにより、その中に含まれる生体活性成分を材料に結合させることができる。この組織抽出物は、たとえば補充されることになる拡張したＥＣＭ材料の調製で使用されたものと同一種類の拡張していないＥＣＭ組織から得てもよい。生体活性成分を多層医療用材料に戻すまたは導入するための他の手段は、当該技術において周知の吹付け、含浸、浸漬などを含む。
【００３９】
本明細書に記載のＥＣＭ材料を使用して、適切な形状の組成物または装置を製造することができる。適切な形状は、たとえばシート、多孔性固体発泡体、粉体、プラグ、管、固体円柱、液状媒体内の懸濁物質、ゲル、または溶媒和されたＥＣＭ成分を含む溶液を含む。
【００４０】
本発明の分離され細胞を除去された単一ＥＣＭ層の厚みは、動物の種類、年齢または大きさなどに基づく相違を含め、これを分離した動物によって異なる。好ましいこのような単一層は、厚み（水和された）が、約５００から約１０００ミクロン、より好ましくは約６００から９００ミクロン、最も好ましくは約７５０から約８５０ミクロンの範囲にある。単一ＥＣＭ層は、望ましくは、水和されたときの引張破断強度が少なくとも約１ポンドでありいくつかの形態では約１から５ポンドの範囲にある。この単一ＥＣＭ層は、望ましくは伸張性が高く、水和されたときの破断伸びが少なくとも約５０％であり典型的には約５０％から約８０％の範囲にある。この点に関し、本明細書に記載の引張破断強度および破断伸びは、ＡＳＴＭ Ｄ８８２（２００２）またはこれと等価の方法で求めることができる。この単一ＥＣＭ層は、望ましくは、５−０プロレン縫合糸サイズおよび深さ２ｍｍに基づけば、約０．５から約２ポンドの範囲の、水和されたときの縫合保持強度を示すであろう。同様に、単一ＥＣＭ層は、望ましくは、約２００から約１０００ｋＰａの範囲の、水和されたときの破裂強度を示すであろう。このような厚み、引張破断強度、破断伸び、縫合保持強度、および／または破裂強度を有する、この発明のブタ由来のＥＣＭ層は特に好ましい。
【００４１】
機械的またはその他の物理的性質を向上させるために必要であれば、ＥＣＭ材料の多数の層は、加熱、非加熱または凍結乾燥条件下における脱水熱結合を含む任意の適切なやり方で、本明細書に記載の接着剤、糊、またはその他の結合剤、化学薬品との架橋、または放射（紫外線放射を含む）、またはこれらの任意の組合せ、または上記の他の適切な方法を用いて、相互に結合できる。たとえば、相互に結合された２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のＥＣＭ層の構造体を調製できる。このような構造体の中で、ＥＣＭ層を相互に直接積重ねて完全に重なり合うようにすることができ、または一部のみが重なり合うように配置して個々に見たときのＥＣＭ層のいずれよりも大きな表面積を有する総体的なシートを作ることができる。本発明の構造体の形成において、完全に重なり合うＥＣＭ層と一部のみが重なり合うＥＣＭ層との組合せを使用することもできる。本発明の腹膜／漿膜下筋膜ＥＣＭ層の１つの利点は、比較的大きな表面積の大きさで分離することができるので、別々のＥＣＭ層を部分的に重ね合わせて比較的大きなシート構造物を得る必要性がなくなるまたは減少することである。常に、本発明のいくつかの好ましい実施の形態では、多数の層からなるシート構造物は、互いに結合され重なり合う領域を形成し、この重なり合う領域の表面積は少なくとも４００ｃｍ2である、少なくとも２つの腹膜／漿膜下筋膜ＥＣＭ層を含む。このような構造体において、この少なくとも２つのＥＣＭ層を完全に重ね合わせた４００ｃｍ2以上の表面積の構造体を提供でき、または、一部のみを重ね合わせているが重ね合わせた材料が少なくとも４００ｃｍ2の重なり合う表面積を形成するのに十分である構造体を提供できる。各々の場合において、４００ｃｍ2の重なり合う領域は、少なくとも２０ｃｍの長さおよび少なくとも２０ｃｍの幅（長さに垂直に測定）を含み得る。このような構造体は、たとえばヘルニア修復または骨盤床再生におけるように軟組織サポートを提供する際に使用するための、強化され安定した大きな材料領域を有するＥＣＭシート装置を提供できる。
【００４２】
本明細書に記載のＥＣＭ材料を用いて製造された滅菌医療用製品は、合成高分子材料等の合成材料を含まないようにすることができ、または、たとえば多層積層構造において１つ以上の合成材料（たとえば合成高分子材料）と組合されたＥＣＭ材料を含むことができる。たとえば、多層医療用材料は、たとえば縫合糸、接着剤などで細胞外マトリクス組織に付着させた、合成によって製造された層を含むことができる。このように合成によって製造された材料は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、たとえばゴアテックス（GORE-TEX）（登録商標）材料）、ナイロン、ポリプロピレン、ポリウレタン、シリコーン、ダクロン（DACRON）（登録商標）ポリマー、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、グリコール酸と乳酸の共重合体（ＰＬＧＡ共重合体）、ポリカプロラクトン、または当該技術で周知の他の物質等の、非生体吸収性または生体吸収性の合成高分子材料を含むことができる。
【００４３】
本発明のＥＣＭ材料を含む医療用製品は、殺菌した形で医療用包装して提供できる。包装された製品の最終殺菌は、たとえば、照射、エチレンオキシドガス、または他の任意の適切な殺菌技術によって行なってもよく、これに応じて医療用包装の材料およびその他の特性を選択できる。
【００４４】
本発明のＥＣＭ材料を、脱水または水和状態で包装できる。ＥＣＭ材料の脱水は、上記のものを含め当該技術で周知の任意の手段によって行なうことができる。好ましくは、包装されたＥＣＭ材料は、凍結乾燥または真空プレスされた材料である。必要に応じて、滅菌水または滅菌水性緩衝液等の適切な液体を用いて、患者の治療に使用する前に、脱水したＥＣＭ材料を再水和することができる。これに代えて、ＥＣＭ材料を、脱水した形で患者に適用することができる。
【００４５】
本発明の局面、その特徴および利点のさらなる理解を促すために以下の具体的な実施例を提供する。これらの実施例は例示であり本発明の局面を限定しないことが理解されるであろう。
【実施例１】
【００４６】
細胞外マトリクス移植材料の調製
包装工場において、完全なブタの体腔を正中切開で開き前肋骨およびすべての器官を除去した処理ラインの時点で、組織切片を採取した。切開は、体の各側面上の体壁組織片の後端上で行ない、組織切片を体壁の各側面から剥がし取り、ほぼ同一の大きさ（１ｆｔ×１．５ｆｔ）の２つの組織切片を作った。これらの切片は、腹膜、漿膜下筋膜および漿膜下脂肪を含んでいた。後部の筋膜がこの組織切片の一部でないことを確認した。漿膜下脂肪の厚みはこの切片に沿った場所によって異なり約０．５から約１ｃｍであった。腹膜の場所が特定され、腹膜は臓側腹膜および壁側腹膜双方を含んでいた。白く厚みのある血管網を有する薄く透明な膜として同定された臓側腹膜は処分した。
【００４７】
脂肪を除去するために、この組織切片の両側を、テフロン（Teflon）（登録商標）シート（厚み１／８インチ）を用いて手で擦った。この作業の間、この組織切片に引裂き抵抗があることが観察された。擦った後の各組織切片の重量は約１４３ｇであった。
【００４８】
重量を計測した後、各組織切片を、１００ｍＬのエタノール（２００プルーフ）、１２ｍＬの過酢酸（ＰＡＡ）、および１９９０ｍＬの高純度水を含む溶液の中で殺菌した。これらの切片をこの溶液の中で約２時間振り、その後高純度水の中で１回につき５分間５回濯いだ。これらの切片を次に高純度水の中で保存した。観察は、ここに記載の処理の間に、これらの切片から壁側腹膜がなくなったまたは実質的になくなったことを示唆した。
【００４９】
結果として得られた上記組織切片を、ピン留めされたデルリン（delrin）（登録商標）パネル上に置き凍結乾燥させた。これによって、明らかに滑らかな側面および粗い側面を有する白く厚みのある凍結乾燥したシートが得られた。これらのシートを純イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）の中で（１０重量部のＩＰＡに対し１重量部のシート）１回につき３０分間２回濯いで脂質を除去した。ＩＰＡ処理の後、これらのシートを高純度水の中で１回につき５分間２回濯いだ。次にこれらのシートを高純度水において保存した。水和させた１枚のシートの厚みおよびプローブ破裂（probe burst）について検査した。厚みの値は０．７３４ｍｍ、０．７５５ｍｍ、０．８１１ｍｍ、０．８０４ｍｍ、０．７９６ｍｍ、および０．８１８ｍｍであり、厚みの平均値は０．７８６ｍｍ、標準偏差は０．０３４ｍｍであった。観察されたプローブ破裂力（probe burst force）は１２５Ｎ、８９．２Ｎ、および９８Ｎであり、平均は１０４．１Ｎ、標準偏差は１８．６Ｎであった。
【実施例２】
【００５０】
天然脂質含有量の検査
２ロットの材料をほぼ実施例１に記載の通りにして得た。腹壁組織切片を、機械的に擦り、１００％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（１：１０ 重量：体積）を用いた３回の処理によって化学的に脱脂し、過酢酸（ＰＡＡ）溶液を用いて殺菌し、高純度水を用いて４回洗浄することによって、処理した。各ロットは２枚のシートからなり、合計４枚のシートを検査した。各シートから４×７ｃｍのサンプルを４つ切出し、１ロットにつき８サンプル、合計１６サンプルを得た。各サンプルの重量（初期重量）を計測し、各サンプルを巻き、１０ｍＬの１００％エタノールを含む１．５ｍＬの遠心分離管の中に入れた。管を管ホルダの中に置き、このホルダを横にして、室温でおよそ２４時間回転攪拌器の上に置いた。２４時間後、エタノールを排出し、１０ｍＬの１００％アセトンを各管の中に入れた。次にホルダを攪拌器の上に戻し室温でほぼ２４時間置いた。２４時間後、アセトンを排出し、サンプルを換気フードの中でおよそ２４時間空気乾燥した。その後サンプルをおよそ４８時間乾燥し、重量（最終重量）を計測した。脂質含有量を、初期重量から最終重量を減算し、これを初期重量で除算することによって計算した。
【００５１】
測定したこの材料内の平均脂質含有量は８．４％±６．４％であることがわかった。
【実施例３】
【００５２】
天然ヒアルロン酸含有量の検査
２ロットの材料を、ほぼ実施例１に記載の通りにして得た。腹壁組織切片を、機械的に擦り、１００％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（１：１０ 重量：体積）を用いた３回の処理によって化学的に脱脂し、過酢酸（ＰＡＡ）溶液を用いて殺菌し、高純度水を用いて４回洗浄することによって、処理した。各ロットは２枚のシートからなり、合計４枚のシートを検査した。各シートから１２ｍｍの円板状のサンプルを４つ切出し、１ロットにつき８サンプル、合計１６サンプルを得た。各サンプルの重量（初期重量）を計測し、各サンプルを巻き、４５０μｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および５０μｌのプロテナーゼＫを含む１．５ｍＬの遠心分離管の中に５６℃で４５分間置いた。サンプルを次に１サンプル当たり９０秒間組織粉砕機で粉砕した。サンプルを含む管を５分間４℃で１２０００ｇで遠心分離し、未分解の材料をペレットにした。上澄みの１：４０の希釈液を、１０μｌの分解されたサンプルを３９０μｌのＰＢＳに添加することによって作り、次にボルテックスを行なった。ヒアルロン酸含有量は、コルゲニクス（Corgenix）ＨＡ ＥＬＩＳＡキットを用いて製造者の指示に従って測定した。ヒアルロン酸の重量含有量を、サンプルのヒアルロン酸含有量をこのサンプルの初期重量で除算することによって計算した。
【００５３】
測定したこの材料内の平均ヒアルロン酸含有量は１３±２４．５μｇ／ｇであることがわかった。
【実施例４】
【００５４】
天然硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）含有量の検査
２ロットの材料を、ほぼ実施例１に記載の通りにして得た。腹壁組織切片を、機械的に擦り、１００％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（１：１０ 重量：体積）を用いた３回の処理によって化学的に脱脂し、過酢酸（ＰＡＡ）溶液を用いて殺菌し、高純度水を用いて４回洗浄することによって、処理した。各ロットは２枚のシートからなり、合計４枚のシートを検査した。各シートから１２ｍｍの円板状のサンプルを８つ切出し、１ロットにつき１６サンプル、合計３２サンプルを得た。各サンプルの重量（初期重量）を計測し、各サンプルを巻き、４５０μｌの無菌ＰＢＳおよび５０μｌのプロテナーゼＫを含む１．５ｍＬの遠心分離管に５６℃で４５分間置いた。次にサンプルを組織粉砕機を用いて１サンプル当たり９０秒間粉砕した。次にサンプルを含む管を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、未分解の材料をペレットにした。
【００５５】
ブリスカン（Blyscan）ｓＧＡＧ分析を用いて３２サンプルのうち１６のサンプルのｓＧＡＧ含有量を分析した。各検査サンプルは、９０μｌの高純度水と１０μｌのサンプル分解物とで構成される。すべての管を５秒間ボルテックスした後、１．０ｍＬのブリスカン染料試薬を加えた。これらの管を、３０分間室温でインキュベートし、１サンプル当たり５秒間４回ボルテックスした。次に、各サンプルを１５０００ｒｐｍで１０分間回転させ、その結果生じた上澄みを取除いた。各ペレットを、ブリスカン分析キットからの１．０ｍＬの解離試薬に再び懸濁させた。すべてのサンプルを攪拌によって１時間３７℃でインキュベートし、１つの管につき５秒間３回ボルテックスした。こうして得られた溶液の１００μｌのアリコートを３つ作り、９６ウェルプレートの２つのウェルにピペットで移した。６５６ｎｍでの吸収度を測定した。ブリスカンｓＧＡＧ分析に使用されるＧＡＧ基準のための標準曲線を作製した。
【００５６】
残りの１６のサンプルのｓＧＡＧ含有量をＤＭＭＢ法を用いて分析した。個々のサンプルを、１．５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離管の中に置き、１８０μｌの無菌ＰＢＳおよび２０μｌのプロテナーゼＫ溶液を各管に加えた。サンプルを、間欠ボルテックスにより１５分間５６℃で分解した。２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの高純度水内の純化させたヘパリンを用いてヘパリン標準曲線を作製した。
【００５７】
ＤＭＭＢサンプルの１００μｌのアリコートを３つ作り、１５ｍＬの遠心分離管に入れた。ブランク（高純度水）の３つの１００μｌのアリコートおよびヘパリン標準も１５ｍＬの遠心分離管の中に入れた。各管に、２．５ｍＬのＤＭＭＢ溶液を加えた。溶液をボルテックスし、各管の１００μｌのアリコートを等分して９６ウェルプレートの１つのウェルに入れた。６００ｎｍでの吸収度を測定した。ヘパリン標準濃度のための標準曲線を作製した。
【００５８】
ｓＧＡＧ濃度を、ヘパリン標準曲線またはＧＡＧ標準曲線から計算した。ｓＧＡＧの重量含有量は、ｓＧＡＧ含有量をサンプルの重量で除算することによって求めた。ブリスカン分析を用いて測定した平均ｓＧＡＧ含有量は、１６５６μｇ／ｇ±３１６４μｇ／ｇであった。ＤＭＭＢ法を用いて測定した平均ｓＧＡＧ含有量は、１０７０μｇ／ｇ±４６０μｇ／ｇであった。
【実施例５】
【００５９】
さまざまな方法で処理した材料内の天然可視核および天然脂質含有量の検査
４ロットの材料をほぼ実施例１に記載の通りにして得た。腹壁組織切片を機械的に擦って処理することによって、高密度の脂肪組織層を除去した。各ロットは２枚のシートからなり合計８枚のシートを検査した。各シートを切断して９つの７×１０ｃｍのサンプルにした。各ロットからの１つのサンプルを、５体積％のエタノール水溶液中、０．２体積％の過酢酸で、２時間、攪拌によって化学的に処理した（「ＰＡＡグループ」）。また、各ロットからの１つのサンプルを、２００７年１０月２３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８２２３８であり、２００８年６月５日に公開された国際公開公報ＷＯ２００８０６７０８５（クックバイオテック）の実施例１３におおむね記載されているように化学的に処理した（「‘０８５グループ」）。残りの２８のサンプルをランダムに２つのグループに分けた。表１に示すように、第１のグループをイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトン溶液で処理し、第２のグループをクロロホルムおよびメタノール溶液で処理した。その結果、天然脂質レベルが低下した。
【００６０】
【表１】
【００６１】
この処理の後、各アルコール処理グループからの２つのサンプルを、非コラーゲン成分の大部分の筋膜を剥がすように設計された７つの処理グループのうち１つに適用した。６つの処理グループが表２に要約されている。
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
すべての処理の完了後、これらのサンプルを、０．２％ＰＡＡに加えて、２時間、オービタルシェーカー（orbital shaker）に置いた。湿組織の２×２ｃｍのサンプルを、核の評価のために取出した。残りのサンプルを凍結乾燥させ、２×７ｃｍのサンプルを脂質分析のために切出した。各テストについて合計３２のサンプルを使用した。
【００６５】
脂質分析のために、各サンプルの重量を計測し、開始重量を記録した。次に、各サンプルを巻き１０ｍＬの１００％エタノールを含む１５ｍＬの遠心分離管の中に入れた。この管を管ホルダの中に置き、ホルダを横向きにして回転攪拌器の上に室温でほぼ２４時間置いた。２４時間後、エタノールを排出し、１０ｍＬの１００％アセトンを各管の中に入れ、ホルダを攪拌器に戻し、その上に室温で約２４時間置いた。２４時間後、アセトンを排出し、サンプルを換気フードの中で約４８時間空気乾燥させた。乾燥時間の最後に、各サンプルの重量を計測し、最終重量を記録した。抽出した脂質の量を、開始重量から最終重量を減算することによって計算した。次にこの量を開始重量で除算することによって材料が含有する脂質の重量％を計算した。
【００６６】
各グループの平均全脂質含有量（重量％）は、ＰＡＡグループは１６％、‘０８５グループは９％、ＩＰＡ／アセトングループは３％、クロロホルム／メタノールグループは７％であった。
【００６７】
可視核の評価のために、ヘキスト（Hoechst）３３５２８染料の溶液を、サンプルを染色するために作製した。合計２５０ｍＬの染色溶液を、１ｍｇ／ｍＬのヘキストのメタノール保存溶液をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して１μｇ／ｍＬにする（２５０μｌのヘキスト保存溶液を２５０ｍＬのＰＢＳに加える）ことによって作製した。各サンプルを、５ｍＬのヘキスト染色溶液の中で１５分間室温で振動させてインキュベートした。染色後、各サンプルを振動させて３回ＰＢＳで５分間室温で濯いだ。染色した各サンプルをガラスの顕微鏡スライドの上に置き、２２ｍｍ×２２ｍｍのガラスのカバースリップを、サンプルの最上部の上に置き、軽く押して気泡を抜いた。次にこのスライドを顕微鏡の試料台の上に置いた。試料台を調整してサンプルを対物レンズの下のそのサンプルにとってランダムな位置に置いた。焦点を調整してその位置で可能な最大数の核に焦点が合った画像を得た。次にこの画像をＳｐｏｔＲＴソフトウェアを用いて撮影した。その後、この画像をグレースケールおよびネガを選択することによって調整し、明るい背景上の暗いドットとして核染色が現れるようにした。輝度、コントラストおよびガンマを時折調整し、確実に核が容易に判断できるようにした。画像を紙の上に印刷した後、各画像上の可視核を一度数えた。数は、フィールド当たりの核の数として表示された。
【００６８】
各サンプルの０．２６３ｍｍ2の代表的なフィールドの核の数を数えた。これらのサンプルは、可視フィールド内で約３００よりも多い核を有しており、多すぎて数えられないと思われた。なぜなら、この処置は、核の決定的な定量化ではなく処理プロトコルの有効性のためのスクリーニング手段として使用されていたためである。
【００６９】
ＩＰＡおよびアセトンによる処理の後は、処理のほとんどが、核を除去するのにより効果的であった。これは、ＩＰＡ／アセトン処理が細胞を溶解しやすくするか、または、クロロホルム／メタノール処理が細胞を溶解しにくくすることを、示唆しているであろう。全体としては、ＮａＯＨで処理した組織は、残っている核の数が最も少ないが、処理後は幾分ゼリー状で拡張していた。この効果は、アルカリ溶液で処理したコラーゲンに典型的でなものであり、コラーゲン線維の組織に対する効果ゆえに材料の強度に影響を及ぼす可能性が高い。トリプシンで処理した組織も、核の除去という点では良好に機能したが、組織は簡単に引裂かれ、その液状の性質のために扱い難かった。これらの特徴は、潜在的ヘルニア修復材料には望ましくないので、この処理は除外された。ＳＤＳおよびＴＢＥで処理した組織には可視核がほとんどなく、材料強度の変化の影響を受けないと思われた。
【実施例６】
【００７０】
移植材料の機械的特性評価
各々が腹壁筋膜の組織の２つのスラブからなる６つのロットを得た。これら１２の組織スラブを、高密度の脂肪組織層を機械的に除去することによって処理した。６枚のシート（各ロットから１枚）を、０．２％過酢酸（ＰＡＡ）溶液に加えて、２時間、オービタルシェーカーに置いた。残りの６枚のシートを、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトン溶液の中で処理し、その後２つの処理グループに分割した。第１のグループは、１時間、１ＭのＮａＯＨの中で処理した。第２のグループは、３７℃の０．１％ＳＤＳの中に１時間、３７℃の１ｘＴＢＥの中に一時間置いた。両グループは、処理が完了した後、高純度水の中で４回濯ぎ、０．２％ＰＡＡの中で２時間殺菌した。高純度水の中で４回濯いだ後、すべての組織サンプルを高純度水の中で４℃で保存した。冷蔵保存で最低２４時間の後に、すべてのシートを凍結乾燥させた。すべての処理および洗浄は、１：１０の重量：体積比で行なった。
【００７１】
引張強度の検査では、各凍結乾燥シートから、４つのイヌの骨の形状のサンプルを切出し、合計４８のサンプルにした。これらのサンプルの長さは６５ｍｍ、中央部の幅は５ｍｍ、末端部分の幅は１２ｍｍであった。各検査サンプルの引張破断強度を、その検査サンプルのデータファイルにおいて発見された最大荷重として計算した。インストロン(Instron）テーブルトップ油圧サーボ試験システム（８８４０シリーズ）を使用した。電力駆動グリップの移動速度は一定で１００ｍｍ／分であった。負荷セル分解能は０．００２５Ｎであった。較正において記録された最大誤差（張力：１−１００Ｎ）は０．４４％であった。各検査サンプルの引張破断強度を、検査サンプルの最大負荷を、その検査サンプルの最大負荷をその検査サンプルの幅および厚みで割ったものとして計算した。ＰＡＡで処理した材料サンプルの平均引張破断力は２．３２Ｎであった。ＮａＯＨで処理した材料サンプルの平均引張破断力は３．４１Ｎであった。ＳＤＳで処理した材料サンプルの平均引張破断力は３．０３Ｎであった、検査したグループのうちいずれの間にも統計的差異はなく、これは、処理が材料の引張強度にほとんど影響しないことを示唆している。
【００７２】
縫合保持強度の検査では、各凍結乾燥シートから４つの部分を切出し、合計４８のサンプルにした。各検査品は、長さ２ｃｍ、幅１ｃｍであった。５−０プロレン縫合糸と直径が同一の鋼線を、深さ２ｍｍでサンプルに通した。検査サンプルの縫合保持強度を、個々の検査中にインストロン張力試験装置上で測定したピーク負荷として記録した。ステンレス鋼線が材料を通して引張ったので、検査されたすべてのサンプルは機能しなかった。検査したグループのうちいずれの間にも統計的差異はなく、このことは、この処理が材料の構造および強度にほとんど影響しないことを裏付けている。
【００７３】
破裂強度の検査では、各凍結乾燥シートから４つの検査品を切出して合計４８のサンプルにした。ムレン（Mullen）の破裂検査機、「ＣＡ」モデルを使用した。各サンプルは３インチ×３インチの正方形であった。検査サンプルの破裂圧力を、個々の検査について、自重圧力としてディジバースト（Digiburst）表示部の上に記録した。破裂圧力および自重圧力はいずれも、各検査サンプルに対して記録した。検査したグループのうちいずれの間にも統計的差異はなく、このことは、この処理が材料の構造および強度にほとんど影響しないことをさらに裏付けている。
【００７４】
ＮａＯＨまたはＳＤＳ／ＴＢＥによる材料の処理は、材料の機械的特性のいずれに対しても重要な影響を及ぼさない。概して、この材料の極限荷重は２．７７±０．７７ポンド、平均縫合保持強度は１．２８±０．４６ポンド、平均破裂圧力は５２０±１９３ｋＰａである。
【実施例７】
【００７５】
移植材料の生化学的特性評価
腹壁筋膜の６つのロット（各々２つの組織スラブからなる）を、実施例１に記載したものと同様にして取得した。簡単に言えば、最初に１２の組織スラブを、高密度の脂肪組織層を機械的に除去することによって処理した。続いて、６枚のシート（各ロットから１枚）を、０．２％過酢酸（ＰＡＡ）に加えて、２時間、オービタルシェーカーに置いた。残りの６枚のシートを、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトン溶液の中で処理し、その後さらに２つの処理グループに分割した。第１のグループは、１時間、１ＭのＮａＯＨの中で室温で処理した。第２のグループは、０．１％ＳＤＳ（３７℃）の中に１時間置いた後、さらに１ｘＴＢＥ（３７℃）の中にさらに１時間置いた。両グループは、処理が完了した後、高純度水の中で４回濯ぎ、０．２％ＰＡＡの中で２時間殺菌した。高純度水の中で４回濯いだ後、すべての組織サンプルを高純度水の中で４℃で保存した。冷蔵保存で最低２４時間の後に、すべてのシートを凍結乾燥させた。すべての処理および洗浄は、１：１０の比率で行なった。
【００７６】
脂質分析のために、冷蔵保存した各シートから４つの検査品を切出した。各サンプルの大きさは２ｃｍ×７ｃｍであった。他のすべての検査については、各検査グループは冷蔵保存した各シートから切出した４つの１２ｍｍの円板からなる。合計２８８のサンプル（各検査に４８、６つの検査）を検査した。
【００７７】
脂質分析では、合計４８の２ｃｍ×７ｃｍの検査サンプルを評価した。抽出した脂質の量を、最終重量を初期重量から減算することによって計算した。次にこの量を初期重量で除算することによって、材料に含まれる脂質の重量パーセントを計算した。ＥＣＭ製品内の脂質含有量は、基材からの細胞成分およびリポ多糖類の抽出を妨げることによって、生体内の炎症反応または免疫反応に寄与する可能性がある。したがって、ＥＣＭ製品内の脂質含有量を減じる手段を備えることが有利である。機械的に擦り落とすことのみで脂質の低減を行なうと、結果として材料の平均脂質含有量は１９．８％±２．８％であった。同じようにして処理された材料の脂質含有量を分析した先の研究は、平均８．４％±６．４％であることを示した（実施例３参照）。この材料をさらにイソプロピルアルコールおよびアセトンの中で処理すると、脂質含有量は効果的に平均２％に減少した（実施例６参照）。さらなる脂質の低減は１ＭのＮａＯＨにおける三次処理によって生じる可能性があり、その結果組織の平均脂質含有量は０．６％となり、これはロットを揃えて比較すると９５％の脂質の減少を表わす。
【００７８】
ＦＧＦ−２含有量について、合計４８の１２ｍｍの円板状の検査サンプルを評価した。サンプルの重量を計測し記録した。個々のサンプルを１．５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離管の中に置き、５００μｌの無菌の１０ｘＰＢＳを各管に加えた。サンプルを、１サンプル当たり９０秒間組織粉砕機で粉砕した。実施例２に記載したように１グラム当たりのＦＧＦ−２の含有量を計算した。ＦＧＦ−２は、ＮａＯＨで基材から完全に除去されたことがわかった。ＳＤＳおよびＴＢＥ処理は、材料のＦＧＦ−２含有量に影響しなかった。
【００７９】
ｓＧＡＧ含有量の検査では、合計４８の１２ｍｍの円板状の検査サンプルを評価した。各サンプルの重量を計測し開始重量を記録した。個々のサンプルを１．５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離管の中に置き、４５０μｌの無菌の１ｘＰＢＳおよび５０μｌのプロテナーゼＫ溶液を各管に加えた。サンプルを、４５分間５６℃で分解し、次に１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して未分解の材料をペレットにした。各検査サンプルは、８０μｌの高純度水と２０μｌのサンプル分解物とで構成され、１．５ｍＬの遠心分離管に置かれた。すべての管を５秒間ボルテックスした後、１．０ｍＬのブリスカン染料試薬を加えた。これらの管を、１サンプル当たり４回の５秒間のボルテックスしつつ、３０分間室温でインキュベートした。次に各サンプルを１５０００ｒｐｍで１０分間回転させ、その結果生じた上澄みを取除いた。その後各ペレットをブリスカン分析キットからの１．０ｍＬの解離試薬に再び懸濁させた。こうして得られた溶液の２つの１００μｌのアリコートを、９６ウェルプレートの２つのウェルの中にピペットで移し、６５６ｎｍの吸収度を測定した。実施例５に記載したように、サンプル濃度を、サンプル吸収度を標準曲線と比較することによって計算した。１グラム当たりのｓＧＡＧの含有量を、サンプルのｓＧＡＧ含有量をサンプルの総重量で除算することによって計算した。基材におけるｓＧＡＧ含有量に大きな相違はなかった。さらに、ＮａＯＨまたはＳＤＳ／ＴＢＥのいずれによっても、ｓＧＡＧは大幅に減少しなかった。このことは、ＳＤＳ／ＴＢＥもＮａＯＨもＧＡＧｓに影響しないことを示唆している。
【００８０】
フィブロネクチンの含有量について、合計４８の１２ｍｍの円板状の検査サンプルを評価した。サンプルの重量を計測し記録した。個々のサンプルを１．５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離管の中に置き、５００μｌの無菌の１０ｘＰＢＳを各管に加えた。サンプルを、組織粉砕機を用いて１サンプル当たり９０秒間粉砕した。２つにしたサンプルを、ベンダーメドシステム（Bender Medsystems）のＨｕｍｅｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ＥＬＩＳＡキットを用い、製造者の指示に従って検査した。１グラム当たりのフィブロネクチン含有量を、サンプルフィブロネクチン含有量をサンプルの総重量で除算することによって計算した。基材に最初に含まれていたフィブロネクチンの量は、ＳＤＳ／ＴＢＥおよびＮａＯＨを用いることによって除去できる。
【００８１】
ヒアルロン酸の検査では、合計４８の１２ｍｍの円板状の検査サンプルを実施例４に記載したように評価した。ヒアルロン酸の含有量を、サンプルヒアルロン酸含有量をサンプルの総重量で除算することによって計算した。検査したグループのうちいずれの間にも統計的差異はなかった。これはｓＧＡＧｓの結果と一致する。
【実施例８】
【００８２】
移植材料の可視核含有量
腹壁筋膜の６つのロット（各々２つの組織スラブからなる）を得て実施例１に記載したものと同様に調製した。要約すると、最初に１２の組織スラブを、高密度の脂肪組織層を機械的に除去することによって処理した、続いて、６枚のシート（各ロットから１つ）を、０．２％過酢酸（ＰＡＡ）に加えて、２時間、オービタルシェーカーに置いた。残りの６枚のシートを、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトン溶液で処理し、その後さらに２つの処理グループに分割した。第１のグループは１時間１ＭのＮａＯＨにおいて室温で処理した。第２のグループを、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（３７℃）の中に１時間置き、次に１ｘＴＢＥ（３７℃）の中にさらに１時間置いた（ＴＢＥ＝８９ｍＭのトリス、ホウ酸、エチレンジアミン四酢酸溶液）。両グループを、処理の完了後、高純度水の中で４回濯ぎ、０．２％ＰＡＡの中で２時間殺菌した。高純度水の中で４回濯いだ後、すべての組織サンプルを４℃で保存した。
【００８３】
材料の上で１つの２ｃｍ×２ｃｍのサンプルを検査処置のために切出した。ヘキスト３３５２８の溶液を、サンプルを染色するために作製した。合計９０ｍＬの染色溶液を、１ｍｇ／ｍＬのヘキストのメタノール保存溶液をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して１μｇ／ｍＬにする（９０μｌのヘキスト保存溶液を９０ｍＬのＰＢＳに加える）ことによって作製した。各サンプルを、５ｍＬのヘキスト染色溶液の中で１５分間室温で振動させてインキュベートした。染色後、各サンプルを振動させて３回ＰＢＳで５分間室温で濯いだ。染色したサンプルをガラスの顕微鏡スライド上に置いた。２２ｍｍ×２２ｍｍのガラスのカバースリップを、サンプルの最上部の上に置き、軽く押して気泡を抜いた。次に染色したサンプルのあるこのスライドを顕微鏡の試料台の上に置いた。試料台を調整してサンプルを対物レンズの下のそのサンプルにとってランダムな位置に置いた。焦点を調整してその位置で可能な最大数の核に焦点が合った画像を得た。次にこの画像をＳｐｏｔＲＴソフトウェアを用いて撮影した。この画像をグレースケールおよびネガを選択することによって調整し、明るい背景上の暗いドットとして核染色が現れるようにした。輝度、コントラストおよびガンマを調整し、確実に核が容易に判断できるようにした。４つの画像を各サンプル上のランダムな位置で撮影した。これらの画像をシートの上に印刷し、存在する核の数を数えた。画像が、２００を超える核を含む場合、多すぎて数えられないと思われた。すべての計数が終了すると、各ロットの平均および標準偏差を求めた。数は、フィールド当たりの核の数として表示された。
【００８４】
２０ｘのフィールド（大きさ０．２６３ｍｍ2）についての基材上の核の平均数は、この実施例におけるＳＤＳ／ＴＢＥ処理では、多すぎて数えられないと思われた。ＮａＯＨを用いたプロセスはすべての可視核を除去した。
【実施例９】
【００８５】
追加の生体力学試験
化学的に処理して脂質を除去し殺菌した後凍結乾燥した追加の漿膜下筋膜ＥＣＭ材料を、おおむね上記実施例７に記載したように、機械的特性について検査した。その結果を以下の表３に示し、クックバイオテック社（インディアナ州ウェストラファイエット）から入手可能な単一層ブタ小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）のものと比較した。
【００８６】
【表４】
【００８７】
腹壁筋膜ＥＣＭは、ＳＩＳと比較して、優れた強度特性を有し、破断伸びの値によって立証されるように伸張性が非常に高いことがわかる。
【実施例１０】
【００８８】
ラット腹壁試験
追加の漿膜下筋膜ＥＣＭ材料を、以下の表４に従い、ブタの腹壁組織切片から調製した。これらの材料を、ラット腹部モデルにおいて検査した。
【００８９】
【表５】
【００９０】
上記筋膜材料に加え、クックバイオテック社（インディアナ州ウェストラファイエット）から入手可能な４層ブタ小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）材料を用いて対照試料を準備した。
【００９１】
筋膜およびＳＩＳ材料を用いて、ラットの腹壁に生じさせた２ｃｍ×２ｃｍの欠陥の修復に使用する、２ｃｍ×２ｃｍのサンプルを調製した。合計６０匹のラットを使用した。各ラットに対して腹部皮膚および皮下切開を行ない腹壁を露出させた。各ラットの腹部に、約２ｃｍ×２ｃｍの全層腹部／筋膜壁欠陥を生じさせた。筋膜サンプルまたはＳＩＳサンプルいずれかを使用して欠陥を修復した。移植したサンプルを、次のように異なる３つの時点で評価した。ＳＩＳ移植した１０匹のラットを２週間で、筋膜移植した８匹のラットを２週間で（２匹のラットは盲腸癒着のために死亡）、ＳＩＳ移植した１０匹のラットを４週間で、筋膜移植した１０匹のラットを４週間で、ＳＩＳの１０匹のラットを８週間で、筋膜移植した１０匹のラットを８週間で、評価した。外植時に、イヌの骨の形状の検査品を、移植した各サンプルの中心から切出した。検査品を、サンプルの極限張力として測定される破壊時の力について機械的に検査した。
【００９２】
一般的に、材料双方について、修復の強度は時間の経過に伴って増す。加えて、どの時点でも筋膜とＳＩＳとの間に統計的差異はなかった。極限張力データは以下の表５にまとめられている。このデータは、これら２つの材料の間に時間の経過に伴う修復強度の差はないこと、および、どちらのサンプルについても材料の強度は時間の経過に伴って増すことを、示唆している。
【００９３】
【表６】
【００９４】
サンプルに対して極限張力の検査を行なった後、残りの移植サンプル各々の切片を収集しホルマリンに固定した。その後、固定したサンプルを埋込み、切開し、Ｈ＆Ｅで染色した。２つの材料の間に、各時点における細胞浸潤およびリモデリングの相違はほとんどないという点で、組織学は機械的結果を裏付けた。２週間で、サンプル双方に何らかの細胞内部成長が見られた。４週間で、双方の材料は細胞浸潤およびリモデリングが進んでいることを示した。８週間で、双方のサンプルは通常の線維性血管性組織を示し、材料はほとんど残っていなかった。
【００９５】
この実施例は、本明細書に記載のブタの腹壁から分離した移植材料が、ＳＩＳ材料と比較して、時間の経過に伴い同様の強度を有することを示す。組織学はこの発見を裏付けており、本明細書に記載の腹壁筋膜ＥＣＭ材料は、ＳＩＳと同様のリモデリング特性を示す。
【００９６】
本発明の記載の文脈において（特に以下の請求項の文脈において）使用される「１つの（“a”と“an”)」および「この（“the”）」ならびに類似する指示語は、本明細書で特に明記しない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、単一のものおよび複数のもの双方を含むと解釈されねばならない。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で特に明記しない限り、その範囲に含まれる個々の値を個別に示すための簡略方法を意図しているに過ぎず、個々の値は、本明細書において個別に記載された場合と同じように明細書に含まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で特に明記しない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行できる。本明細書で使用されるすべての例または例示を示す表現（たとえば「等（“such as”)」）は、本発明をより明らかにすることを意図しているに過ぎず、特に請求項に記載しない限り本発明の範囲を限定しない。本明細書の表現は請求項に記載されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものではないと理解されねばならない。
【００９７】
この発明の好ましい実施の形態は、発明者が認識しているこの発明を実施するためのベストモードを含めて、本明細書に記載されている。当然ながら、こういった好ましい実施の形態の変形は、当業者にとっては上記の記載を読めば明らかになるであろう。発明者らは当業者がこのような変形を適宜採用すると予測し、発明者らは本発明がこの明細書に具体的に記載されるのとは異なるやり方で実施されることを意図している。したがって、この発明は、適用法によって認められる以下の請求項に記載の主題のすべての変形および均等物を含む。さらに、その可能な変形すべてにおける上記の要素のいずれの組合せも、本明細書で特に明記しない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、本発明に含まれる。加えて、本明細書で引用されたすべての刊行物は、当業者の能力を示し、引用により個別に援用され全体が記載された場合と同じくその全体が本明細書に引用により援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には医療用材料の分野に属し、特に組織移植に有用な医療用材料の局面に関する。
【背景技術】
【０００２】
さらに、背景として、さまざまな細胞外マトリクス（ＥＣＭ）材料が、医療用移植、細胞培養、およびその他の関連する用途において使用するために提案されてきた。たとえば、小腸、胃または膀胱組織から得た粘膜下組織を含む医療用移植片および細胞培養材料が提案されてきた。例として、米国特許第４，９０２，５０８号、第４，９５６，１７８号、第５，２８１，４２２号、第５，５５４，３８９号、第６，０９９，５６７号、および第６，２０６，９３１号参照。加えて、インディアナ州ウェストラファイエットのクックバイオテック社（Cook Biotech Incorporated）は現在、小腸の粘膜下組織に基づくさまざまな医療用材料を、ＳＵＲＧＩＳＩＳ（登録商標）、ＳＴＲＡＴＡＳＩＳ（登録商標）、およびＯＡＳＩＳ（登録商標）という登録商標の下で製造している。
【０００３】
肝臓の基底膜から得た医療用材料も、たとえば米国特許第６，３７９，７１０号において提案されている。加えて、羊膜から得たＥＣＭ材料（例として米国特許第４，３６１，５５２号および第６，５７６，６１８号参照）および腎被膜から得たＥＣＭ材料（２００３年１月９日に公開された国際ＰＣＴ特許出願ＷＯ０３／００２１６５参照）が、医療用途および／または細胞培養用途のために提案されている。しかしながら、これらの材料の多くは、その大きさおよび強度が限られている。用途によっては、これらの材料からなる複数のストリップまたはシートは、所望の領域を覆うのに十分大きな移植片となるように結合または接合し、かつ、十分な強度を保ち再移植が必要とならないようにしなればならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記に関し、広範囲にわたる医療用途、特に大型および／または比較的伸張性のある移植片を要する医療用途において使用可能な代替医療用材料が必要であることは明らかである。本発明は、このような医療用材料ならびにその調製方法および使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
ある局面において、本発明は、組織移植片を提供する際に使用するのに適した材料を提供する。この材料は、動物、特にブタ（porcine animal）の腹壁から得られ、この動物の腹壁由来の漿膜下筋膜を含んでいる細胞外マトリクス材料の、分離されたシートを含む。この細胞外マトリクス材料は、コラーゲンおよびエラスチンを含み、天然細胞を実質的に含まないようにすることができる。この細胞外マトリクス材料は、望ましくは生体吸収性であり、いくつかの実施の形態では動物由来の天然の硫酸化グリコサミノグリカンを保持することができる。この細胞外マトリクス材料は、少なくとも１ポンドの引張破断強度および／または少なくとも約５０％の破断伸びを有することができる。
【０００６】
別の局面において、本発明は、細胞外マトリクス移植材料の調製方法であって、この方法は、動物、特にブタの腹壁から分離された組織のセグメントを提供することを含み、この組織のセグメントは、漿膜下筋膜と付着した漿膜下脂肪とを含む、方法を提供する。この漿膜下脂肪のうち少なくとも一部は、たとえば機械的に除去され、漿膜下筋膜を含む組織のコラーゲンの層を作る。このコラーゲンの層は、細胞を除去され、その脂質の含有量を減じるように処理することもできる。ある有益な形態では、処理後、この組織のコラーゲンの層は、天然の硫酸化グリコサミノグリカンを保持し、少なくとも１ポンドの引張破断強度を有し、および／または少なくとも約５０％の破断伸びを有する。
【０００７】
別の局面において、本発明は患者を治療するための方法を提供する。この方法は、患者に、本明細書に記載の細胞外マトリクス材料を移植することを含む。好ましい形態では、この移植は、たとえばヘルニア修復治療を施す際に、患者の軟組織を支持するために行なわれる。
【０００８】
本発明のさらに他の実施の形態ならびに特徴および利点は、本明細書における以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、移植材料を調製するためにブタの腹壁の層から切片を採取する際に使用される、ブタの腹壁の層を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
次に、本発明の原理の理解を促すために、図面に示される実施の形態を参照し、具体的な表現を用いてそれを説明する。しかしながら、これは本発明の範囲を限定することを意図しているのではなく、示された医療用材料における変形および変更、ならびに、本明細書に示される本発明の原理のさらなる用途は、本発明に関連する技術の当業者が通常想到するものであることが、理解されるであろう。
【００１１】
先に開示したように、本発明は、医療処置用の組織移植片を提供する際に使用可能な、分離され、細胞を除去された細胞外マトリクス（ＥＣＭ）材料を提供する。次に図面を参照すると、図１は、豚の腹壁１０の層の図である。図１は、たとえばウシ科、ヒツジ、およびウマ科の動物を含む、ＥＣＭ材料を得ることができる他の動物の腹壁も表わしている。これらの層は、壁側腹膜１１、漿膜下筋膜１２、漿膜下脂肪１３、後部筋膜１４、腹筋１５、前部筋膜１６、皮下脂肪１７、および真皮１８を含む。本明細書に記載の細胞外マトリクス移植材料は、漿膜下筋膜１２を含み、任意に、腹壁の残りの構造層から剥がされた壁側腹膜１１も含む。このように、本発明の好ましい細胞外マトリクス移植材料には、後部筋膜１４、腹筋１５、前部筋膜１６、漿膜下脂肪１７、および真皮１８はないまたは本質的にない。本明細書で使用する「本質的にない」は、除外された構成要素が、たとえば移植材料の０．５重量％以下を構成する、わずかな残渣として検出される可能性があるものを除いて存在しないことを意味する。
【００１２】
この移植材料の漿膜下筋膜は、動物、好ましくは温血脊椎動物、より好ましくは、ブタ、ヒツジ、ウシまたはウマ等の非ヒト温血脊椎動物の腹壁から得られる。供給源としてブタが特に好ましい。ある好ましい実施の形態では、本発明において有用な腹膜および筋膜は、腹壁を採取し、この壁から組織切片を剥がすことによって得ることができ、この壁は、壁側腹膜、漿膜下筋膜、およびこの組織供給源にある筋肉層および／またはその他の層を含む隣接する組織由来のその他の組織（たとえば脂肪組織）の少なくとも一部を含む。望ましくは、次に壁側腹膜および漿膜下筋膜を含むこの組織切片をさらに処理することによって、移植材料として使用するのに適した、コラーゲン含有（「コラーゲン性の」）およびエラスチン含有（「エラスチン性の」）シートを調製する。さらに壁側腹膜を除去するようにまたは壁側腹膜を保持するように処理を行なうことができる。このように、いくつかの実施の形態では、調製した移植材料には壁側腹膜がないまたは本質的になく、他のいくつかの実施の形態では、調製した移植材料は壁側腹膜を含む。
【００１３】
壁側腹膜１１、漿膜下筋膜１２、および漿膜下脂肪１３各々の少なくとも一部分を含む採取された組織切片を、任意の適切な手段を用いて処理することによって、漿膜下脂肪１３を除去することができる。例として、適切な除去手段は、たとえば尖っていない刃を用いて脂肪組織を機械的に削り取ることを含むことができる。必要に応じて、さらなる漿膜下脂肪１３またはそれ以外の脂肪組織を、この多層材料を、イソプロピルアルコールまたは脂肪組織を除去するのに適切なそれ以外の任意の液状媒体に、さらなる脂肪を除去するのに必要な期間、浸漬することによって除去することができる。ある好ましい実施の形態では、分離した材料をまず擦ることによって漿膜下脂肪１３の部分を除去する。擦った後の材料を有機溶媒で処理、たとえばイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（１０体積部のＩＰＡに対して１重量部の材料）に３０分間浸漬させることによって、脂肪を除去する。この脂肪を除去するための処理ステップは、典型的には少なくとも１回行なうが、複数回行なってもよい（たとえば２、３、４または５回以上）。好ましい処理された本発明のＥＣＭ移植材料は、天然脂肪含有量が１５重量％未満、より好ましくは１０重量％未満であり、いくつかの実施の形態では５重量％未満である。
【００１４】
本明細書に記載の細胞外マトリクス材料の１つの利点は、腹壁組織から採取した一部分から大きなサイズの細胞外マトリクス材料を調製することができ、その一方で医療用途に十分な強度特性を保つ点にある。組織供給源から分離した多くの他の材料（たとえば他のＥＣＭ材料）は、個々のシートのいずれよりも大きなシート移植片を調製するために材料の複数のシートを接合することを必要とし、これにより、１つのシート全体が、ヘルニア移植片といったいくつかの医療用途に十分な大きさおよび強度を有する。このように接合した構造物を必要に応じて形成できるが、本明細書に記載の細胞外マトリクス移植材料は、横方向に接合した複数の部分の使用の必要性を避けるために、十分に成長した大きな動物から採取することもできる。いくつかの実施の形態では、漿膜下筋膜のみを含むまたは壁側腹膜に隣接する処理された細胞外マトリクス移植片は、少なくとも２０ｃｍ幅、少なくとも２０ｃｍ長を有する。
【００１５】
本発明の細胞外マトリクス材料を用いて、患者の組織損傷を含む医学的症状を含めさまざまな医学的症状を、患者にこの材料を移植することによって、治療できる。この点に関し、本発明の医療用材料を用いて、損傷を受けた組織を治療することができ、患者の外部構造（たとえば皮膚）に適用するか、またはたとえばヘルニア修復または骨盤底復元の場合のように組織を支持するために患者の中に移植することができる。このように、本発明の医療用材料は、使用の対象となる所望の部位に適したさまざまな形で構成できる。本発明の医療用材料は、１つ以上の薬剤またはそれ以外の医薬品を組込むことができ、患者への適用後にこういった物質を溶出することによって、その物質の全身投与の必要性を無くしまたは減じ、かつ全身毒性および副作用の危険性を最小にすることができる。
【００１６】
一般的に、この医療用材料は、組織に適用するように構成される場合は、切断されるかさもなければ最終用途に応じた所望の大きさとなるように構成される。いくつかの実施の形態では、この材料の大きさを、適用する組織欠陥より大きくすることができる。材料の大きさをこのようにして定めることによって、周囲の組織に容易に取付けることができる。たとえば、適切な大きさに定めた医療用材料を、治療を要する領域の上、中または周囲に配置すれば、この医療用材料を、いくつかの周知の適切な装着手段のうちいずれかを用いて、周囲の組織またはその他の構造によりしっかりと取付けることができる。適切な装着手段は、たとえば、ステープリング、縫合、接着などを含む。好ましくは、この医療用材料を、縫合糸によって周囲の組織またはその他の構造によりしっかりと取付けることができる。現在、当該技術において縫合糸として利用できるさまざまな合成材料がある。例として、プロレン（Prolene）（登録商標）、バイクリル（Vicryl）（登録商標）、マーシレン（Mersilene）（登録商標）、パナクリル（Panacryl）（登録商標）、およびモノクリル（Monocryl）（登録商標）を含む縫合糸は、本発明で使用することが意図されている。これ以外の縫合材料は当業者には周知であろう。当該技術で一般的に知られている医療用接着剤も、本発明の医療用材料とともに使用することによって、この材料を組織またはその他の構造によりしっかりと取付けることができる。
【００１７】
好ましい実施の形態では、腹膜とその下にある漿膜下筋膜とを含む細胞外マトリクス材料は、生体吸収性材料であることが可能であり、望ましくは患者に移植されたときに組織のリモデリングを助け、時間が経過すると患者の組織と入れ替わる。多くの場合、この医療用材料は、リモデリング可能な特性を示し、この特性により、リモデリング過程が数日または数週間で生じる。好ましい実施の形態では、このリモデリング過程は約５日から約１２週間以内に生じ、その間に、移植された材料は、患者の組織によって再吸収され置き換えられる。この際、本発明の好ましいＥＣＭ材料は、この材料への血管新生を助けまたは引起して新たな患者の組織の成長を容易にすることができる。これらの目的のために、本発明のいくつかの好ましいＥＣＭ材料は、この材料が移植部分に永続することが無いように、グルタルアルデヒド等の化学的架橋剤では処理しない。
【００１８】
しかしながら、ある状況において必要であれば、他の実施の形態では、この発明のＥＣＭ材料は、導入された天然でない架橋を含んでもよい。たとえば、ＥＣＭ材料を、元々存在していた部分から分離した後に任意の時点で架橋剤で処理することができる。この医療用材料内の架橋および／または２つ以上の医療用材料の重なり合う層の間の架橋の量（または数）を増やすことによって、その強度を高めることができる。しかしながら、医療用材料内に導入された架橋は、この材料が再吸収されて患者の組織にリモデリングされる機能に影響を及ぼす可能性もある。結果として、架橋が導入されたいくつかの実施の形態では、ＥＣＭ材料のリモデリング可能な特性を保つように、ＥＣＭ材料内に追加された架橋のレベルを、適切な判断によって制御することができる。
【００１９】
ＥＣＭ材料の導入された架橋を使用する場合、これは、光架橋技術によって、または、化学的架橋剤等の架橋剤を適用することによって、または、脱水もしくはそれ以外の手段によって生じるタンパク質の架橋によって、得ることができる。使用できる化学的架橋剤は、たとえば、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類、カルボジイミド、たとえば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のジイミド類、リボースまたはそれ以外の糖、アシルアジ化物、スルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド、またはポリエポキシド化合物を含み、これは、たとえばナガセケムテックス株式会社（日本、大阪）のデナコール（DENACOL）ＥＸ８１０の商標名で入手可能なエチレングリコールジグリシジルエーテル等のポリグリシジルエーテル類、およびこれもナガセケムテックス株式会社から入手可能なデナコールＥＸ３１３の商標名で入手可能なグリセロールポリグリセロールエーテルを含む。典型的には、ポリグリセロールエーテル類またはその他のポリエポキシド化合物は、使用される場合、１分子当たり２から約１０のエポキシド基を有するであろう。
【００２０】
２つ以上のＥＣＭ材料の層を含む積層構造を意図する場合、この積層物の層をさらに架橋して、多数のＥＣＭ材料の層をお互いに結合することができる。マトリクスを紫外線に晒し、コラーゲン系マトリクスをトランスグルタミナーゼおよびリシルオキシダーゼ等の酵素で処理し、光架橋を行なうことによって、ＥＣＭ材料の架橋を触媒することもできる。よって、さらなる架橋を、個々の層に対して、そのお互いの結合の前に、お互いの結合の間に、および／またはお互いの結合の後に、追加してもよい。
【００２１】
これに代えて、２つ以上の多層医療用材料セグメントを巻いてもしくは積重ねて、または、１つの材料セグメントを少なくとも一度折り畳み、次に、材料を、真空プレス、凍結乾燥、もしくはその他の脱水熱結合条件等の、化学的架橋以外の結合技術を用いて、および／または接着剤、糊もしくはその他の結合剤の使用によって、融着させるまたは結合させることができる。適切な結合剤は、たとえば、コラーゲンゲルもしくはペースト、ゼラチン、フィブリン接着剤、または、反応性モノマーもしくはポリマー、たとえばシアノアクリレート接着剤を含むそれ以外の材料を含み得る。同様に、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、エポキシド、ゲンピン、またはその誘導体、カルボジイミド化合物、ポリエポキシド化合物、または上記の説明で特定されたそれ以外のものを含む他の同様の物質等の化学的架橋剤を用いることによって、結合させまたは結合を促進させることができる。これらのうち１つ以上を、脱水で引起す結合と組合せることもできる。
【００２２】
さまざまな脱水で引起す結合方法を用いて、この発明のＥＣＭ材料の部分同士を融着できる。ある好ましい実施の形態では、多数のＥＣＭ材料の層を脱水条件下で圧縮する。「脱水条件」という用語は、多層医療用材料からの水分の除去を促進しまたは引起す機械的条件または環境条件を含み得る。圧縮された材料の脱水を促進するために、マトリクス構造を圧縮する２つの表面のうち少なくとも１つを透水性にすることができる。任意として、この材料の脱水を、圧縮する表面の外側において、吸取り材料を与え、マトリクス構造を加熱し、または空気もしくはそれ以外の不活性ガスを吹付けることによって、高めることができる。ＥＣＭ層同士を脱水結合する場合に特に有用な方法は、たとえばフリーズドライ等の凍結乾燥または気化冷却条件を含む。
【００２３】
脱水結合のもう１つの方法は、真空プレスである。真空プレスの間、強制的に接触させた多層医療用材料を脱水することによって、これらの材料同士は、結合させるための他の薬剤がなくても効果的に結合する。ただし、脱水で引起す結合の少なくとも一部を利用しながら、このような薬剤を用いることもできる。十分な圧縮および脱水によって、この多層医療用材料は、全体的に一体化された積層構造を形成することができる。
【００２４】
本発明のいくつかの局面においては、本発明のＥＣＭ材料に対する潜在的な有害効果、たとえば天然コラーゲン構造および潜在的に存在する生物活性物質を最小にする、比較的温和な温度暴露条件下で、乾燥作業を行なうことが好都合である。このように、本発明のいくつかの形態において、人間の体温を超えるまたは人間の体温よりも少し高い温度に晒すことなく、または実質的に晒すことなく、すなわち約３８℃以下で、行われる乾燥作業を使用することは好ましいであろう。これらは、たとえば、約３８℃未満での真空プレス作業、約３８℃未満での強制空気乾燥、またはほぼ室温（約２５℃）で、積極的な加熱をせずにまたは冷却とともに、これらのプロセスのうちいずれかを行なうことを含む。当然ながら比較的低い温度条件は凍結乾燥条件も含む。
【００２５】
調製したＥＣＭ材料は、任意に、組織供給源に本来存在する生物活性成分を含んでいてもよい。たとえば、腹膜および／または筋膜は、フィブロブラスト成長因子２（ＦＧＦ−２）、脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）またはその組合せ等の天然成長因子を１つ以上、含み得る。加えて、この発明のＥＣＭ材料は、ヘパリン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧｓ）の１つ以上、ヒアルロン酸等の非硫酸化グリコサミノグリカンの１つ以上、および／またはフィブロネクチン等の糖タンパク質の１つ以上など、その他の生体物質を含み得る。このように、一般的に言えば、この発明のＥＣＭは任意に、細胞の形態、増殖、成長、タンパク質または遺伝子発現等の細胞性応答を直接的または間接的に誘発する、天然の生物活性成分の１つ以上を保持するように処理してもよい。
【００２６】
本発明の処理されたＥＣＭ材料は典型的に十分なコラーゲンを含むであろう。このような天然由来ＥＣＭ材料は、大部分、配向がランダムではないコラーゲン線維を含むであろう。処理されたＥＣＭ材料は典型的にエラスチンも含むであろう。上記の天然生物活性成分を保持するように処理されると、ＥＣＭ材料は、これらの成分を、コラーゲン線維の間に、上におよび／または中に散在する固体として保持することができる。本発明に使用するのに特に望ましい材料は、光学顕微鏡検査において適切に染色することによって容易に識別可能な、このように散在した非コラーゲン性および非エラスチン性の固体を大量に含むであろう。このような非コラーゲン性および非エラスチン性の固体は、本発明のいくつかの実施の形態において、この材料の乾燥重量のうち相当の割合、たとえば本発明のさまざまな実施の形態において少なくとも約１重量％、少なくとも約３重量％、および少なくとも約５重量％を、構成することが可能である。
【００２７】
本発明のＥＣＭ材料は、血管新生特性を示すこともあり、したがって、この材料を移植された受容者に血管新生を誘発するのに有効である。この点に関し、血管新生とは、身体が新たな血管を作り、より多くの血液の組織への供給を行なうプロセスである。よって、血管新生材料は、受容者の組織と接触すると、新たな血管の形成を促進または高める。生体材料の移植による血管新生のin vivo測定方法が最近開発された。たとえば、このような方法の１つは、皮下移植モデルを使用して材料の血管新生特性を求める。Ｃ．ヒーシェン（C.Heeschen）他、Nature Medicine 7(2001), No.7, 833-839参照。このモデルは、蛍光ミクロ血管造影技術と組合されて、生体材料への血管新生の定量的尺度および定性的尺度双方を提供することができる。Ｃ．ジョンソン（C.Johnson）他、Circulation Research 94(2004), No.2, 262-268。
【００２８】
さらに、天然生体活性成分の包含に加えてまたはこれに代えて、組換技術またはその他の方法で合成によって製造されたもの等の非天然生体活性成分を、本発明のＥＣＭ材料に組込んでもよい。こういった非天然生体活性成分は、組織内で自然に存在するがおそらく異なる種のものに相当する、天然由来のまたは組換技術で製造されるタンパク質（たとえばブタ等の他の動物に由来する組織に適用されるヒトタンパク質）であってもよい。いくつかの形態では、ＦＧＦ−２、血小板に由来する成長因子（ＰＤＧＦ）および／またはＶＥＧＦ等のといった非天然成長因子を１つ以上、ＥＣＭ材料に追加することができる。この非天然生体活性成分は、薬物であってもよい。本発明に使用される材料の中におよび／またはその上に取込むことができる薬物の例には、たとえば、抗生物質、血液凝固因子等の血栓促進物質が含まれ、たとえば、トロンビン、フィブリノゲン、抗炎症剤、抗増殖剤、鎮痛剤、その他が挙げられる。これらの物質は、多層医療用材料に、製造前段階として、処置の直前に（たとえばこの材料をセファゾリン等の適切な抗生物質を含む溶液の中に浸漬させることによって）、または、材料が患者の中に生着している間またはその後に、適用してもよい。
【００２９】
非天然生体活性成分を、任意の適切な手段によって、この発明のＥＣＭ材料に適用することができる。適切な手段は、たとえば、吹付け、含浸、浸漬などを含むことができる。他の化学的または生物学的成分がＥＣＭ材料に含まれる場合、非天然生体活性成分は、これらの他の成分の前に、これらとともに、またはこれらの後に適用できる。ある実施の形態では、非天然生体活性成分のコーティングを、ＥＣＭ材料の片面または両面に形成できる。「コーティング」は、この非天然生体活性成分を適用してＥＣＭ材料の表面の指定された部分を覆うことを意味する。いくつかの実施の形態では、非天然生体活性成分を適用し、この発明のＥＣＭ材料の少なくとも片面の表面領域全体を実質的に覆うコーティングを形成できる。他の実施の形態では、本明細書に記載のもの等の非天然生体活性成分を、この発明のＥＣＭ材料全体において実質的に均一的に組込むことができる。
【００３０】
本発明のＥＣＭ材料は、好ましくは、たとえばクック（Cook）他の米国特許第６，２０６，９３１号に記載のように高度に純化されたものである。したがって、好ましいＥＣＭ材料は、１グラム当たり約１２エンドトキシンユニット（ＥＵ）未満の、より好ましくは１グラム当たり約５ＥＵ未満の、最も好ましくは１グラム当たり約１ＥＵ未満のエンドトキシンレベルを示すであろう。さらに好ましくは、この発明のＥＣＭ材料は、１グラム当たり約１コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満の、より好ましくは１グラム当たり約０．５ＣＦＵ未満のバイオバーデンを有していてもよい。望ましくは、真菌レベルは同様に低く、たとえば１グラム当たり約１ＣＦＵ未満、より好ましくは１グラム当たり約０．５ＣＦＵ未満である。核酸レベルは、好ましくは約５μｇ／ｍｇ未満、より好ましくは約２μｇ／ｍｇ未満であり、ウイルスレベルは、好ましくは１グラム当たり約５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）未満、より好ましくは１グラム当たり約５ＰＦＵ未満である。米国特許第６，２０６，９３１号で教示されているＥＣＭ組織のこれらおよびさらなる特性は、この発明のＥＣＭ材料の特徴であろう。
【００３１】
さらに他の実施の形態では、本発明のＥＣＭ材料に対して、この材料を拡張させる処理を施すことができる。いくつかの形態では、このように拡張させた材料は、ＥＣＭ材料を、この材料が拡張するまで１つまたはそれ以上のアルカリ性物質と接触させることによって形成できる。例として、この接触は、ＥＣＭ材料を、当初の体積の少なくとも１２０％（すなわち１．２倍）に、または、形態によっては当初の体積の少なくとも約２倍に拡張させるのに十分でありうる。その後、拡張させた材料を、任意で、たとえば中和および／または濯ぎ落しによってアルカリ性媒体から分離することができる。この収集された拡張させた材料は、任意の適切なやり方で使用することができる。例として、拡張させた材料に対し、所望の形状または構成の移植片構造体の形成において、生体活性成分の富化、乾燥、および／または成形などを行なうことができる。いくつかの実施の形態では、拡張させたＥＣＭ材料構造体は、高い圧縮性および拡張性を有することができるので、たとえばカニューレを挿入した送達装置の内腔の中から送達するために圧縮し、その後装置から取出した際に拡張させて患者の体内に固定し、患者の体内の経路を閉塞する、および／または止血することができる。
【００３２】
拡張させた材料は、この発明のＥＣＭ材料を、水酸化ナトリウムを含む水溶液またはその他の媒体に、制御した状態で接触させることによって形成できる。この材料をアルカリ処理することによって、この材料の物理的構造を変化させて拡張させることができる。このような変化は、材料の中のコラーゲンの変性を含み得る。いくつかの実施の形態では、この材料を、元の体積の少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、またはそれ以上に拡張させることが好ましい。拡張の大きさは、たとえば、材料を拡張させる処理で使用される、アルカリ性媒体の濃度またはｐＨ、暴露時間、および温度を含む、いくつかの要因に関連する。
【００３３】
ＥＣＭ材料は、典型的には、自然に存在する分子内架橋および自然に存在する分子間架橋を有するコラーゲン原線維の網状組織を含むであろう。本発明に記載の拡張処理を行なうと、この自然に存在する分子内架橋および自然に存在する分子間架橋は、処理されたコラーゲン性のマトリクス材料内で、コラーゲン性のマトリクス材料を完全なコラーゲン性のシート材料として保つのに十分な状態で保持することができる。しかしながら、コラーゲン性のシート材料内のコラーゲン原線維は、変性する可能性があり、コラーゲン性のシート材料は、出発材料の厚みよりも大きい、たとえば最初の厚みの少なくとも１２０％または最初の厚みの少なくとも２倍の、アルカリ処理された厚みを有する可能性がある。
【００３４】
例として、ＥＣＭ材料の処理のためのアルカリ性物質の濃度は、約０．５から約２Ｍの範囲にすることができ、より好ましい濃度は約１Ｍである。加えて、アルカリ性物質のｐＨは、いくつかの実施の形態では約８から約１４の範囲にすることができる。好ましい局面において、アルカリ性物質は、約１０から約１４、最も好ましくは約１２から約１４のｐＨを有するであろう。
【００３５】
濃度およびｐＨに加え、温度および暴露時間等のその他の要素が、上記の拡張の程度に影響するであろう。この点に関し、いくつかの変形例では、ＥＣＭ材料のアルカリ性物質への暴露を、約４から約４５℃の温度で実施する。好ましい実施の形態では、この暴露は、約２５から約４０℃の温度で、最も好ましくは３７℃で行なわれる。さらに、暴露時間の範囲は少なくとも約１分から約５時間以上までとすることができる。いくつかの実施の形態では、この暴露時間は約１から約２時間である。特に好ましい実施の形態では、ＥＣＭ材料を、ｐＨが１４であるＮａＯＨの１Ｍ溶液に、約３７℃の温度で約１．５から２時間暴露させる。このような処理によって、コラーゲンが変性し材料が実質的に拡張する。この材料のコラーゲンマトリクスの変性は、この材料のコラーゲン充填特性の変化、たとえば出発材料の密に結合したコラーゲン網の実質的な崩壊として、観察することができる。拡張していない材料は、裸眼で見たときまたは適度の倍率たとえば１００倍の倍率で見たときに実質的に均一的で連続した表面を示す、密に結合したコラーゲン網を有することができる。逆に、拡張したコラーゲン性の材料は、同じ倍率たとえば約１００倍の倍率で見たときに、この表面は連続しておらず、多くの領域において材料中の鎖または束の間の実質的な隙間によって分離されているコラーゲンの鎖および束を示している点で、全く異なる表面を有することができる。結果として、拡張したＥＣＭ材料は典型的に、対応する拡張していないＥＣＭ材料よりも多孔性の程度が高いように見える。さらに、多くの場合、拡張したＥＣＭ材料は、たとえば水またはその他の流体通路に対する透過性の増加を測定することによって、処理していない出発材料と比較して多孔率が増したものとして、示されうる。拡張したＥＣＭ材料をより泡状で多孔である構造にすることで、この材料を、医療用材料および装置の調製に使用するために、さまざまなスポンジまたは発泡形状に成型、さもなければ調製することができる。
【００３６】
このようなアルカリ処理の後、ＥＣＭ材料を、アルカリ性媒体から分離し、さらなる用途のために処理することができる。例として、収集した材料を、中和しておよび／または水で濯ぎ落してこの材料のアルカリ性を除去した後に、ＥＣＭ材料をさらに処理して本発明の構造体またはそれ以外の組成物を形成することができる。
【００３７】
出発材料（すなわちアルカリ性物質で処理する前）は、任意に、コラーゲンおよびエラスチン以外の天然成分を含むことができる。この材料をアルカリ性物質で処理することにより、このような天然成分のうちの１つ、いくつか、またはすべての量が減少することがある。いくつかの実施の形態では、この材料に対し、アルカリ性物質で、制御された処理を行なうことは、実質的に核酸および脂質がなく、かつ、潜在的に成長因子、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、およびプロテオグリカンもない材料を作るのに十分であろう。
【００３８】
いくつかの実施の形態では、たとえば拡張処理の間にＥＣＭ材料から除去されたものに類似する、外因性または内因性の生体活性成分を１つ以上、材料に戻すことができる。たとえば、拡張したＥＣＭ材料に、成長因子、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、および／またはプロテオグリカンを補充することができる。これらの生体活性成分は、任意の適切な方法で材料に戻すことができる。たとえば、いくつかの形態では、これらの成分を含む米国特許第６，３７５，９８９号に記載の組織抽出物を調製し、これらを除去したＥＣＭ材料に与えることができる。ある実施の形態では、ＥＣＭ材料を組織抽出物の中で十分な時間にわたってインキュベートすることにより、その中に含まれる生体活性成分を材料に結合させることができる。この組織抽出物は、たとえば補充されることになる拡張したＥＣＭ材料の調製で使用されたものと同一種類の拡張していないＥＣＭ組織から得てもよい。生体活性成分を多層医療用材料に戻すまたは導入するための他の手段は、当該技術において周知の吹付け、含浸、浸漬などを含む。
【００３９】
本明細書に記載のＥＣＭ材料を使用して、適切な形状の組成物または装置を製造することができる。適切な形状は、たとえばシート、多孔性固体発泡体、粉体、プラグ、管、固体円柱、液状媒体内の懸濁物質、ゲル、または溶媒和されたＥＣＭ成分を含む溶液を含む。
【００４０】
本発明の分離され細胞を除去された単一ＥＣＭ層の厚みは、動物の種類、年齢または大きさなどに基づく相違を含め、これを分離した動物によって異なる。好ましいこのような単一層は、厚み（水和された）が、約５００から約１０００ミクロン、より好ましくは約６００から９００ミクロン、最も好ましくは約７５０から約８５０ミクロンの範囲にある。単一ＥＣＭ層は、望ましくは、水和されたときの引張破断強度が少なくとも約１ポンドでありいくつかの形態では約１から５ポンドの範囲にある。この単一ＥＣＭ層は、望ましくは伸張性が高く、水和されたときの破断伸びが少なくとも約５０％であり典型的には約５０％から約８０％の範囲にある。この点に関し、本明細書に記載の引張破断強度および破断伸びは、ＡＳＴＭ Ｄ８８２（２００２）またはこれと等価の方法で求めることができる。この単一ＥＣＭ層は、望ましくは、５−０プロレン縫合糸サイズおよび深さ２ｍｍに基づけば、約０．５から約２ポンドの範囲の、水和されたときの縫合保持強度を示すであろう。同様に、単一ＥＣＭ層は、望ましくは、約２００から約１０００ｋＰａの範囲の、水和されたときの破裂強度を示すであろう。このような厚み、引張破断強度、破断伸び、縫合保持強度、および／または破裂強度を有する、この発明のブタ由来のＥＣＭ層は特に好ましい。
【００４１】
機械的またはその他の物理的性質を向上させるために必要であれば、ＥＣＭ材料の多数の層は、加熱、非加熱または凍結乾燥条件下における脱水熱結合を含む任意の適切なやり方で、本明細書に記載の接着剤、糊、またはその他の結合剤、化学薬品との架橋、または放射（紫外線放射を含む）、またはこれらの任意の組合せ、または上記の他の適切な方法を用いて、相互に結合できる。たとえば、相互に結合された２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のＥＣＭ層の構造体を調製できる。このような構造体の中で、ＥＣＭ層を相互に直接積重ねて完全に重なり合うようにすることができ、または一部のみが重なり合うように配置して個々に見たときのＥＣＭ層のいずれよりも大きな表面積を有する総体的なシートを作ることができる。本発明の構造体の形成において、完全に重なり合うＥＣＭ層と一部のみが重なり合うＥＣＭ層との組合せを使用することもできる。本発明の腹膜／漿膜下筋膜ＥＣＭ層の１つの利点は、比較的大きな表面積の大きさで分離することができるので、別々のＥＣＭ層を部分的に重ね合わせて比較的大きなシート構造物を得る必要性がなくなるまたは減少することである。常に、本発明のいくつかの好ましい実施の形態では、多数の層からなるシート構造物は、互いに結合され重なり合う領域を形成し、この重なり合う領域の表面積は少なくとも４００ｃｍ2である、少なくとも２つの腹膜／漿膜下筋膜ＥＣＭ層を含む。このような構造体において、この少なくとも２つのＥＣＭ層を完全に重ね合わせた４００ｃｍ2以上の表面積の構造体を提供でき、または、一部のみを重ね合わせているが重ね合わせた材料が少なくとも４００ｃｍ2の重なり合う表面積を形成するのに十分である構造体を提供できる。各々の場合において、４００ｃｍ2の重なり合う領域は、少なくとも２０ｃｍの長さおよび少なくとも２０ｃｍの幅（長さに垂直に測定）を含み得る。このような構造体は、たとえばヘルニア修復または骨盤床再生におけるように軟組織サポートを提供する際に使用するための、強化され安定した大きな材料領域を有するＥＣＭシート装置を提供できる。
【００４２】
本明細書に記載のＥＣＭ材料を用いて製造された滅菌医療用製品は、合成高分子材料等の合成材料を含まないようにすることができ、または、たとえば多層積層構造において１つ以上の合成材料（たとえば合成高分子材料）と組合されたＥＣＭ材料を含むことができる。たとえば、多層医療用材料は、たとえば縫合糸、接着剤などで細胞外マトリクス組織に付着させた、合成によって製造された層を含むことができる。このように合成によって製造された材料は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、たとえばゴアテックス（GORE-TEX）（登録商標）材料）、ナイロン、ポリプロピレン、ポリウレタン、シリコーン、ダクロン（DACRON）（登録商標）ポリマー、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、グリコール酸と乳酸の共重合体（ＰＬＧＡ共重合体）、ポリカプロラクトン、または当該技術で周知の他の物質等の、非生体吸収性または生体吸収性の合成高分子材料を含むことができる。
【００４３】
本発明のＥＣＭ材料を含む医療用製品は、殺菌した形で医療用包装して提供できる。包装された製品の最終殺菌は、たとえば、照射、エチレンオキシドガス、または他の任意の適切な殺菌技術によって行なってもよく、これに応じて医療用包装の材料およびその他の特性を選択できる。
【００４４】
本発明のＥＣＭ材料を、脱水または水和状態で包装できる。ＥＣＭ材料の脱水は、上記のものを含め当該技術で周知の任意の手段によって行なうことができる。好ましくは、包装されたＥＣＭ材料は、凍結乾燥または真空プレスされた材料である。必要に応じて、滅菌水または滅菌水性緩衝液等の適切な液体を用いて、患者の治療に使用する前に、脱水したＥＣＭ材料を再水和することができる。これに代えて、ＥＣＭ材料を、脱水した形で患者に適用することができる。
【００４５】
本発明の局面、その特徴および利点のさらなる理解を促すために以下の具体的な実施例を提供する。これらの実施例は例示であり本発明の局面を限定しないことが理解されるであろう。
【実施例１】
【００４６】
細胞外マトリクス移植材料の調製
包装工場において、完全なブタの体腔を正中切開で開き前肋骨およびすべての器官を除去した処理ラインの時点で、組織切片を採取した。切開は、体の各側面上の体壁組織片の後端上で行ない、組織切片を体壁の各側面から剥がし取り、ほぼ同一の大きさ（１ｆｔ×１．５ｆｔ）の２つの組織切片を作った。これらの切片は、腹膜、漿膜下筋膜および漿膜下脂肪を含んでいた。後部の筋膜がこの組織切片の一部でないことを確認した。漿膜下脂肪の厚みはこの切片に沿った場所によって異なり約０．５から約１ｃｍであった。腹膜の場所が特定され、腹膜は臓側腹膜および壁側腹膜双方を含んでいた。白く厚みのある血管網を有する薄く透明な膜として同定された臓側腹膜は処分した。
【００４７】
脂肪を除去するために、この組織切片の両側を、テフロン（Teflon）（登録商標）シート（厚み１／８インチ）を用いて手で擦った。この作業の間、この組織切片に引裂き抵抗があることが観察された。擦った後の各組織切片の重量は約１４３ｇであった。
【００４８】
重量を計測した後、各組織切片を、１００ｍＬのエタノール（２００プルーフ）、１２ｍＬの過酢酸（ＰＡＡ）、および１９９０ｍＬの高純度水を含む溶液の中で殺菌した。これらの切片をこの溶液の中で約２時間振り、その後高純度水の中で１回につき５分間５回濯いだ。これらの切片を次に高純度水の中で保存した。観察は、ここに記載の処理の間に、これらの切片から壁側腹膜がなくなったまたは実質的になくなったことを示唆した。
【００４９】
結果として得られた上記組織切片を、ピン留めされたデルリン（delrin）（登録商標）パネル上に置き凍結乾燥させた。これによって、明らかに滑らかな側面および粗い側面を有する白く厚みのある凍結乾燥したシートが得られた。これらのシートを純イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）の中で（１０重量部のＩＰＡに対し１重量部のシート）１回につき３０分間２回濯いで脂質を除去した。ＩＰＡ処理の後、これらのシートを高純度水の中で１回につき５分間２回濯いだ。次にこれらのシートを高純度水において保存した。水和させた１枚のシートの厚みおよびプローブ破裂（probe burst）について検査した。厚みの値は０．７３４ｍｍ、０．７５５ｍｍ、０．８１１ｍｍ、０．８０４ｍｍ、０．７９６ｍｍ、および０．８１８ｍｍであり、厚みの平均値は０．７８６ｍｍ、標準偏差は０．０３４ｍｍであった。観察されたプローブ破裂力（probe burst force）は１２５Ｎ、８９．２Ｎ、および９８Ｎであり、平均は１０４．１Ｎ、標準偏差は１８．６Ｎであった。
【実施例２】
【００５０】
天然脂質含有量の検査
２ロットの材料をほぼ実施例１に記載の通りにして得た。腹壁組織切片を、機械的に擦り、１００％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（１：１０ 重量：体積）を用いた３回の処理によって化学的に脱脂し、過酢酸（ＰＡＡ）溶液を用いて殺菌し、高純度水を用いて４回洗浄することによって、処理した。各ロットは２枚のシートからなり、合計４枚のシートを検査した。各シートから４×７ｃｍのサンプルを４つ切出し、１ロットにつき８サンプル、合計１６サンプルを得た。各サンプルの重量（初期重量）を計測し、各サンプルを巻き、１０ｍＬの１００％エタノールを含む１．５ｍＬの遠心分離管の中に入れた。管を管ホルダの中に置き、このホルダを横にして、室温でおよそ２４時間回転攪拌器の上に置いた。２４時間後、エタノールを排出し、１０ｍＬの１００％アセトンを各管の中に入れた。次にホルダを攪拌器の上に戻し室温でほぼ２４時間置いた。２４時間後、アセトンを排出し、サンプルを換気フードの中でおよそ２４時間空気乾燥した。その後サンプルをおよそ４８時間乾燥し、重量（最終重量）を計測した。脂質含有量を、初期重量から最終重量を減算し、これを初期重量で除算することによって計算した。
【００５１】
測定したこの材料内の平均脂質含有量は８．４％±６．４％であることがわかった。
【実施例３】
【００５２】
天然ヒアルロン酸含有量の検査
２ロットの材料を、ほぼ実施例１に記載の通りにして得た。腹壁組織切片を、機械的に擦り、１００％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（１：１０ 重量：体積）を用いた３回の処理によって化学的に脱脂し、過酢酸（ＰＡＡ）溶液を用いて殺菌し、高純度水を用いて４回洗浄することによって、処理した。各ロットは２枚のシートからなり、合計４枚のシートを検査した。各シートから１２ｍｍの円板状のサンプルを４つ切出し、１ロットにつき８サンプル、合計１６サンプルを得た。各サンプルの重量（初期重量）を計測し、各サンプルを巻き、４５０μｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および５０μｌのプロテナーゼＫを含む１．５ｍＬの遠心分離管の中に５６℃で４５分間置いた。サンプルを次に１サンプル当たり９０秒間組織粉砕機で粉砕した。サンプルを含む管を５分間４℃で１２０００ｇで遠心分離し、未分解の材料をペレットにした。上澄みの１：４０の希釈液を、１０μｌの分解されたサンプルを３９０μｌのＰＢＳに添加することによって作り、次にボルテックスを行なった。ヒアルロン酸含有量は、コルゲニクス（Corgenix）ＨＡ ＥＬＩＳＡキットを用いて製造者の指示に従って測定した。ヒアルロン酸の重量含有量を、サンプルのヒアルロン酸含有量をこのサンプルの初期重量で除算することによって計算した。
【００５３】
測定したこの材料内の平均ヒアルロン酸含有量は１３±２４．５μｇ／ｇであることがわかった。
【実施例４】
【００５４】
天然硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）含有量の検査
２ロットの材料を、ほぼ実施例１に記載の通りにして得た。腹壁組織切片を、機械的に擦り、１００％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（１：１０ 重量：体積）を用いた３回の処理によって化学的に脱脂し、過酢酸（ＰＡＡ）溶液を用いて殺菌し、高純度水を用いて４回洗浄することによって、処理した。各ロットは２枚のシートからなり、合計４枚のシートを検査した。各シートから１２ｍｍの円板状のサンプルを８つ切出し、１ロットにつき１６サンプル、合計３２サンプルを得た。各サンプルの重量（初期重量）を計測し、各サンプルを巻き、４５０μｌの無菌ＰＢＳおよび５０μｌのプロテナーゼＫを含む１．５ｍＬの遠心分離管に５６℃で４５分間置いた。次にサンプルを組織粉砕機を用いて１サンプル当たり９０秒間粉砕した。次にサンプルを含む管を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、未分解の材料をペレットにした。
【００５５】
ブリスカン（Blyscan）ｓＧＡＧ分析を用いて３２サンプルのうち１６のサンプルのｓＧＡＧ含有量を分析した。各検査サンプルは、９０μｌの高純度水と１０μｌのサンプル分解物とで構成される。すべての管を５秒間ボルテックスした後、１．０ｍＬのブリスカン染料試薬を加えた。これらの管を、３０分間室温でインキュベートし、１サンプル当たり５秒間４回ボルテックスした。次に、各サンプルを１５０００ｒｐｍで１０分間回転させ、その結果生じた上澄みを取除いた。各ペレットを、ブリスカン分析キットからの１．０ｍＬの解離試薬に再び懸濁させた。すべてのサンプルを攪拌によって１時間３７℃でインキュベートし、１つの管につき５秒間３回ボルテックスした。こうして得られた溶液の１００μｌのアリコートを３つ作り、９６ウェルプレートの２つのウェルにピペットで移した。６５６ｎｍでの吸収度を測定した。ブリスカンｓＧＡＧ分析に使用されるＧＡＧ基準のための標準曲線を作製した。
【００５６】
残りの１６のサンプルのｓＧＡＧ含有量をＤＭＭＢ法を用いて分析した。個々のサンプルを、１．５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離管の中に置き、１８０μｌの無菌ＰＢＳおよび２０μｌのプロテナーゼＫ溶液を各管に加えた。サンプルを、間欠ボルテックスにより１５分間５６℃で分解した。２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの高純度水内の純化させたヘパリンを用いてヘパリン標準曲線を作製した。
【００５７】
ＤＭＭＢサンプルの１００μｌのアリコートを３つ作り、１５ｍＬの遠心分離管に入れた。ブランク（高純度水）の３つの１００μｌのアリコートおよびヘパリン標準も１５ｍＬの遠心分離管の中に入れた。各管に、２．５ｍＬのＤＭＭＢ溶液を加えた。溶液をボルテックスし、各管の１００μｌのアリコートを等分して９６ウェルプレートの１つのウェルに入れた。６００ｎｍでの吸収度を測定した。ヘパリン標準濃度のための標準曲線を作製した。
【００５８】
ｓＧＡＧ濃度を、ヘパリン標準曲線またはＧＡＧ標準曲線から計算した。ｓＧＡＧの重量含有量は、ｓＧＡＧ含有量をサンプルの重量で除算することによって求めた。ブリスカン分析を用いて測定した平均ｓＧＡＧ含有量は、１６５６μｇ／ｇ±３１６４μｇ／ｇであった。ＤＭＭＢ法を用いて測定した平均ｓＧＡＧ含有量は、１０７０μｇ／ｇ±４６０μｇ／ｇであった。
【実施例５】
【００５９】
さまざまな方法で処理した材料内の天然可視核および天然脂質含有量の検査
４ロットの材料をほぼ実施例１に記載の通りにして得た。腹壁組織切片を機械的に擦って処理することによって、高密度の脂肪組織層を除去した。各ロットは２枚のシートからなり合計８枚のシートを検査した。各シートを切断して９つの７×１０ｃｍのサンプルにした。各ロットからの１つのサンプルを、５体積％のエタノール水溶液中、０．２体積％の過酢酸で、２時間、攪拌によって化学的に処理した（「ＰＡＡグループ」）。また、各ロットからの１つのサンプルを、２００７年１０月２３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８２２３８であり、２００８年６月５日に公開された国際公開公報ＷＯ２００８０６７０８５（クックバイオテック）の実施例１３におおむね記載されているように化学的に処理した（「‘０８５グループ」）。残りの２８のサンプルをランダムに２つのグループに分けた。表１に示すように、第１のグループをイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトン溶液で処理し、第２のグループをクロロホルムおよびメタノール溶液で処理した。その結果、天然脂質レベルが低下した。
【００６０】
【表１】
【００６１】
この処理の後、各アルコール処理グループからの２つのサンプルを、非コラーゲン成分の大部分の筋膜を剥がすように設計された７つの処理グループのうち１つに適用した。６つの処理グループが表２に要約されている。
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
すべての処理の完了後、これらのサンプルを、０．２％ＰＡＡに加えて、２時間、オービタルシェーカー（orbital shaker）に置いた。湿組織の２×２ｃｍのサンプルを、核の評価のために取出した。残りのサンプルを凍結乾燥させ、２×７ｃｍのサンプルを脂質分析のために切出した。各テストについて合計３２のサンプルを使用した。
【００６５】
脂質分析のために、各サンプルの重量を計測し、開始重量を記録した。次に、各サンプルを巻き１０ｍＬの１００％エタノールを含む１５ｍＬの遠心分離管の中に入れた。この管を管ホルダの中に置き、ホルダを横向きにして回転攪拌器の上に室温でほぼ２４時間置いた。２４時間後、エタノールを排出し、１０ｍＬの１００％アセトンを各管の中に入れ、ホルダを攪拌器に戻し、その上に室温で約２４時間置いた。２４時間後、アセトンを排出し、サンプルを換気フードの中で約４８時間空気乾燥させた。乾燥時間の最後に、各サンプルの重量を計測し、最終重量を記録した。抽出した脂質の量を、開始重量から最終重量を減算することによって計算した。次にこの量を開始重量で除算することによって材料が含有する脂質の重量％を計算した。
【００６６】
各グループの平均全脂質含有量（重量％）は、ＰＡＡグループは１６％、‘０８５グループは９％、ＩＰＡ／アセトングループは３％、クロロホルム／メタノールグループは７％であった。
【００６７】
可視核の評価のために、ヘキスト（Hoechst）３３５２８染料の溶液を、サンプルを染色するために作製した。合計２５０ｍＬの染色溶液を、１ｍｇ／ｍＬのヘキストのメタノール保存溶液をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して１μｇ／ｍＬにする（２５０μｌのヘキスト保存溶液を２５０ｍＬのＰＢＳに加える）ことによって作製した。各サンプルを、５ｍＬのヘキスト染色溶液の中で１５分間室温で振動させてインキュベートした。染色後、各サンプルを振動させて３回ＰＢＳで５分間室温で濯いだ。染色した各サンプルをガラスの顕微鏡スライドの上に置き、２２ｍｍ×２２ｍｍのガラスのカバースリップを、サンプルの最上部の上に置き、軽く押して気泡を抜いた。次にこのスライドを顕微鏡の試料台の上に置いた。試料台を調整してサンプルを対物レンズの下のそのサンプルにとってランダムな位置に置いた。焦点を調整してその位置で可能な最大数の核に焦点が合った画像を得た。次にこの画像をＳｐｏｔＲＴソフトウェアを用いて撮影した。その後、この画像をグレースケールおよびネガを選択することによって調整し、明るい背景上の暗いドットとして核染色が現れるようにした。輝度、コントラストおよびガンマを時折調整し、確実に核が容易に判断できるようにした。画像を紙の上に印刷した後、各画像上の可視核を一度数えた。数は、フィールド当たりの核の数として表示された。
【００６８】
各サンプルの０．２６３ｍｍ2の代表的なフィールドの核の数を数えた。これらのサンプルは、可視フィールド内で約３００よりも多い核を有しており、多すぎて数えられないと思われた。なぜなら、この処置は、核の決定的な定量化ではなく処理プロトコルの有効性のためのスクリーニング手段として使用されていたためである。
【００６９】
ＩＰＡおよびアセトンによる処理の後は、処理のほとんどが、核を除去するのにより効果的であった。これは、ＩＰＡ／アセトン処理が細胞を溶解しやすくするか、または、クロロホルム／メタノール処理が細胞を溶解しにくくすることを、示唆しているであろう。全体としては、ＮａＯＨで処理した組織は、残っている核の数が最も少ないが、処理後は幾分ゼリー状で拡張していた。この効果は、アルカリ溶液で処理したコラーゲンに典型的でなものであり、コラーゲン線維の組織に対する効果ゆえに材料の強度に影響を及ぼす可能性が高い。トリプシンで処理した組織も、核の除去という点では良好に機能したが、組織は簡単に引裂かれ、その液状の性質のために扱い難かった。これらの特徴は、潜在的ヘルニア修復材料には望ましくないので、この処理は除外された。ＳＤＳおよびＴＢＥで処理した組織には可視核がほとんどなく、材料強度の変化の影響を受けないと思われた。
【実施例６】
【００７０】
移植材料の機械的特性評価
各々が腹壁筋膜の組織の２つのスラブからなる６つのロットを得た。これら１２の組織スラブを、高密度の脂肪組織層を機械的に除去することによって処理した。６枚のシート（各ロットから１枚）を、０．２％過酢酸（ＰＡＡ）溶液に加えて、２時間、オービタルシェーカーに置いた。残りの６枚のシートを、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトン溶液の中で処理し、その後２つの処理グループに分割した。第１のグループは、１時間、１ＭのＮａＯＨの中で処理した。第２のグループは、３７℃の０．１％ＳＤＳの中に１時間、３７℃の１ｘＴＢＥの中に一時間置いた。両グループは、処理が完了した後、高純度水の中で４回濯ぎ、０．２％ＰＡＡの中で２時間殺菌した。高純度水の中で４回濯いだ後、すべての組織サンプルを高純度水の中で４℃で保存した。冷蔵保存で最低２４時間の後に、すべてのシートを凍結乾燥させた。すべての処理および洗浄は、１：１０の重量：体積比で行なった。
【００７１】
引張強度の検査では、各凍結乾燥シートから、４つのイヌの骨の形状のサンプルを切出し、合計４８のサンプルにした。これらのサンプルの長さは６５ｍｍ、中央部の幅は５ｍｍ、末端部分の幅は１２ｍｍであった。各検査サンプルの引張破断強度を、その検査サンプルのデータファイルにおいて発見された最大荷重として計算した。インストロン(Instron）テーブルトップ油圧サーボ試験システム（８８４０シリーズ）を使用した。電力駆動グリップの移動速度は一定で１００ｍｍ／分であった。負荷セル分解能は０．００２５Ｎであった。較正において記録された最大誤差（張力：１−１００Ｎ）は０．４４％であった。各検査サンプルの引張破断強度を、検査サンプルの最大負荷を、その検査サンプルの最大負荷をその検査サンプルの幅および厚みで割ったものとして計算した。ＰＡＡで処理した材料サンプルの平均引張破断力は２．３２Ｎであった。ＮａＯＨで処理した材料サンプルの平均引張破断力は３．４１Ｎであった。ＳＤＳで処理した材料サンプルの平均引張破断力は３．０３Ｎであった、検査したグループのうちいずれの間にも統計的差異はなく、これは、処理が材料の引張強度にほとんど影響しないことを示唆している。
【００７２】
縫合保持強度の検査では、各凍結乾燥シートから４つの部分を切出し、合計４８のサンプルにした。各検査品は、長さ２ｃｍ、幅１ｃｍであった。５−０プロレン縫合糸と直径が同一の鋼線を、深さ２ｍｍでサンプルに通した。検査サンプルの縫合保持強度を、個々の検査中にインストロン張力試験装置上で測定したピーク負荷として記録した。ステンレス鋼線が材料を通して引張ったので、検査されたすべてのサンプルは機能しなかった。検査したグループのうちいずれの間にも統計的差異はなく、このことは、この処理が材料の構造および強度にほとんど影響しないことを裏付けている。
【００７３】
破裂強度の検査では、各凍結乾燥シートから４つの検査品を切出して合計４８のサンプルにした。ムレン（Mullen）の破裂検査機、「ＣＡ」モデルを使用した。各サンプルは３インチ×３インチの正方形であった。検査サンプルの破裂圧力を、個々の検査について、自重圧力としてディジバースト（Digiburst）表示部の上に記録した。破裂圧力および自重圧力はいずれも、各検査サンプルに対して記録した。検査したグループのうちいずれの間にも統計的差異はなく、このことは、この処理が材料の構造および強度にほとんど影響しないことをさらに裏付けている。
【００７４】
ＮａＯＨまたはＳＤＳ／ＴＢＥによる材料の処理は、材料の機械的特性のいずれに対しても重要な影響を及ぼさない。概して、この材料の極限荷重は２．７７±０．７７ポンド、平均縫合保持強度は１．２８±０．４６ポンド、平均破裂圧力は５２０±１９３ｋＰａである。
【実施例７】
【００７５】
移植材料の生化学的特性評価
腹壁筋膜の６つのロット（各々２つの組織スラブからなる）を、実施例１に記載したものと同様にして取得した。簡単に言えば、最初に１２の組織スラブを、高密度の脂肪組織層を機械的に除去することによって処理した。続いて、６枚のシート（各ロットから１枚）を、０．２％過酢酸（ＰＡＡ）に加えて、２時間、オービタルシェーカーに置いた。残りの６枚のシートを、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトン溶液の中で処理し、その後さらに２つの処理グループに分割した。第１のグループは、１時間、１ＭのＮａＯＨの中で室温で処理した。第２のグループは、０．１％ＳＤＳ（３７℃）の中に１時間置いた後、さらに１ｘＴＢＥ（３７℃）の中にさらに１時間置いた。両グループは、処理が完了した後、高純度水の中で４回濯ぎ、０．２％ＰＡＡの中で２時間殺菌した。高純度水の中で４回濯いだ後、すべての組織サンプルを高純度水の中で４℃で保存した。冷蔵保存で最低２４時間の後に、すべてのシートを凍結乾燥させた。すべての処理および洗浄は、１：１０の比率で行なった。
【００７６】
脂質分析のために、冷蔵保存した各シートから４つの検査品を切出した。各サンプルの大きさは２ｃｍ×７ｃｍであった。他のすべての検査については、各検査グループは冷蔵保存した各シートから切出した４つの１２ｍｍの円板からなる。合計２８８のサンプル（各検査に４８、６つの検査）を検査した。
【００７７】
脂質分析では、合計４８の２ｃｍ×７ｃｍの検査サンプルを評価した。抽出した脂質の量を、最終重量を初期重量から減算することによって計算した。次にこの量を初期重量で除算することによって、材料に含まれる脂質の重量パーセントを計算した。ＥＣＭ製品内の脂質含有量は、基材からの細胞成分およびリポ多糖類の抽出を妨げることによって、生体内の炎症反応または免疫反応に寄与する可能性がある。したがって、ＥＣＭ製品内の脂質含有量を減じる手段を備えることが有利である。機械的に擦り落とすことのみで脂質の低減を行なうと、結果として材料の平均脂質含有量は１９．８％±２．８％であった。同じようにして処理された材料の脂質含有量を分析した先の研究は、平均８．４％±６．４％であることを示した（実施例３参照）。この材料をさらにイソプロピルアルコールおよびアセトンの中で処理すると、脂質含有量は効果的に平均２％に減少した（実施例６参照）。さらなる脂質の低減は１ＭのＮａＯＨにおける三次処理によって生じる可能性があり、その結果組織の平均脂質含有量は０．６％となり、これはロットを揃えて比較すると９５％の脂質の減少を表わす。
【００７８】
ＦＧＦ−２含有量について、合計４８の１２ｍｍの円板状の検査サンプルを評価した。サンプルの重量を計測し記録した。個々のサンプルを１．５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離管の中に置き、５００μｌの無菌の１０ｘＰＢＳを各管に加えた。サンプルを、１サンプル当たり９０秒間組織粉砕機で粉砕した。実施例２に記載したように１グラム当たりのＦＧＦ−２の含有量を計算した。ＦＧＦ−２は、ＮａＯＨで基材から完全に除去されたことがわかった。ＳＤＳおよびＴＢＥ処理は、材料のＦＧＦ−２含有量に影響しなかった。
【００７９】
ｓＧＡＧ含有量の検査では、合計４８の１２ｍｍの円板状の検査サンプルを評価した。各サンプルの重量を計測し開始重量を記録した。個々のサンプルを１．５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離管の中に置き、４５０μｌの無菌の１ｘＰＢＳおよび５０μｌのプロテナーゼＫ溶液を各管に加えた。サンプルを、４５分間５６℃で分解し、次に１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して未分解の材料をペレットにした。各検査サンプルは、８０μｌの高純度水と２０μｌのサンプル分解物とで構成され、１．５ｍＬの遠心分離管に置かれた。すべての管を５秒間ボルテックスした後、１．０ｍＬのブリスカン染料試薬を加えた。これらの管を、１サンプル当たり４回の５秒間のボルテックスしつつ、３０分間室温でインキュベートした。次に各サンプルを１５０００ｒｐｍで１０分間回転させ、その結果生じた上澄みを取除いた。その後各ペレットをブリスカン分析キットからの１．０ｍＬの解離試薬に再び懸濁させた。こうして得られた溶液の２つの１００μｌのアリコートを、９６ウェルプレートの２つのウェルの中にピペットで移し、６５６ｎｍの吸収度を測定した。実施例５に記載したように、サンプル濃度を、サンプル吸収度を標準曲線と比較することによって計算した。１グラム当たりのｓＧＡＧの含有量を、サンプルのｓＧＡＧ含有量をサンプルの総重量で除算することによって計算した。基材におけるｓＧＡＧ含有量に大きな相違はなかった。さらに、ＮａＯＨまたはＳＤＳ／ＴＢＥのいずれによっても、ｓＧＡＧは大幅に減少しなかった。このことは、ＳＤＳ／ＴＢＥもＮａＯＨもＧＡＧｓに影響しないことを示唆している。
【００８０】
フィブロネクチンの含有量について、合計４８の１２ｍｍの円板状の検査サンプルを評価した。サンプルの重量を計測し記録した。個々のサンプルを１．５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離管の中に置き、５００μｌの無菌の１０ｘＰＢＳを各管に加えた。サンプルを、組織粉砕機を用いて１サンプル当たり９０秒間粉砕した。２つにしたサンプルを、ベンダーメドシステム（Bender Medsystems）のＨｕｍｅｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ＥＬＩＳＡキットを用い、製造者の指示に従って検査した。１グラム当たりのフィブロネクチン含有量を、サンプルフィブロネクチン含有量をサンプルの総重量で除算することによって計算した。基材に最初に含まれていたフィブロネクチンの量は、ＳＤＳ／ＴＢＥおよびＮａＯＨを用いることによって除去できる。
【００８１】
ヒアルロン酸の検査では、合計４８の１２ｍｍの円板状の検査サンプルを実施例４に記載したように評価した。ヒアルロン酸の含有量を、サンプルヒアルロン酸含有量をサンプルの総重量で除算することによって計算した。検査したグループのうちいずれの間にも統計的差異はなかった。これはｓＧＡＧｓの結果と一致する。
【実施例８】
【００８２】
移植材料の可視核含有量
腹壁筋膜の６つのロット（各々２つの組織スラブからなる）を得て実施例１に記載したものと同様に調製した。要約すると、最初に１２の組織スラブを、高密度の脂肪組織層を機械的に除去することによって処理した、続いて、６枚のシート（各ロットから１つ）を、０．２％過酢酸（ＰＡＡ）に加えて、２時間、オービタルシェーカーに置いた。残りの６枚のシートを、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトン溶液で処理し、その後さらに２つの処理グループに分割した。第１のグループは１時間１ＭのＮａＯＨにおいて室温で処理した。第２のグループを、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（３７℃）の中に１時間置き、次に１ｘＴＢＥ（３７℃）の中にさらに１時間置いた（ＴＢＥ＝８９ｍＭのトリス、ホウ酸、エチレンジアミン四酢酸溶液）。両グループを、処理の完了後、高純度水の中で４回濯ぎ、０．２％ＰＡＡの中で２時間殺菌した。高純度水の中で４回濯いだ後、すべての組織サンプルを４℃で保存した。
【００８３】
材料の上で１つの２ｃｍ×２ｃｍのサンプルを検査処置のために切出した。ヘキスト３３５２８の溶液を、サンプルを染色するために作製した。合計９０ｍＬの染色溶液を、１ｍｇ／ｍＬのヘキストのメタノール保存溶液をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して１μｇ／ｍＬにする（９０μｌのヘキスト保存溶液を９０ｍＬのＰＢＳに加える）ことによって作製した。各サンプルを、５ｍＬのヘキスト染色溶液の中で１５分間室温で振動させてインキュベートした。染色後、各サンプルを振動させて３回ＰＢＳで５分間室温で濯いだ。染色したサンプルをガラスの顕微鏡スライド上に置いた。２２ｍｍ×２２ｍｍのガラスのカバースリップを、サンプルの最上部の上に置き、軽く押して気泡を抜いた。次に染色したサンプルのあるこのスライドを顕微鏡の試料台の上に置いた。試料台を調整してサンプルを対物レンズの下のそのサンプルにとってランダムな位置に置いた。焦点を調整してその位置で可能な最大数の核に焦点が合った画像を得た。次にこの画像をＳｐｏｔＲＴソフトウェアを用いて撮影した。この画像をグレースケールおよびネガを選択することによって調整し、明るい背景上の暗いドットとして核染色が現れるようにした。輝度、コントラストおよびガンマを調整し、確実に核が容易に判断できるようにした。４つの画像を各サンプル上のランダムな位置で撮影した。これらの画像をシートの上に印刷し、存在する核の数を数えた。画像が、２００を超える核を含む場合、多すぎて数えられないと思われた。すべての計数が終了すると、各ロットの平均および標準偏差を求めた。数は、フィールド当たりの核の数として表示された。
【００８４】
２０ｘのフィールド（大きさ０．２６３ｍｍ2）についての基材上の核の平均数は、この実施例におけるＳＤＳ／ＴＢＥ処理では、多すぎて数えられないと思われた。ＮａＯＨを用いたプロセスはすべての可視核を除去した。
【実施例９】
【００８５】
追加の生体力学試験
化学的に処理して脂質を除去し殺菌した後凍結乾燥した追加の漿膜下筋膜ＥＣＭ材料を、おおむね上記実施例７に記載したように、機械的特性について検査した。その結果を以下の表３に示し、クックバイオテック社（インディアナ州ウェストラファイエット）から入手可能な単一層ブタ小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）のものと比較した。
【００８６】
【表４】
【００８７】
腹壁筋膜ＥＣＭは、ＳＩＳと比較して、優れた強度特性を有し、破断伸びの値によって立証されるように伸張性が非常に高いことがわかる。
【実施例１０】
【００８８】
ラット腹壁試験
追加の漿膜下筋膜ＥＣＭ材料を、以下の表４に従い、ブタの腹壁組織切片から調製した。これらの材料を、ラット腹部モデルにおいて検査した。
【００８９】
【表５】
【００９０】
上記筋膜材料に加え、クックバイオテック社（インディアナ州ウェストラファイエット）から入手可能な４層ブタ小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）材料を用いて対照試料を準備した。
【００９１】
筋膜およびＳＩＳ材料を用いて、ラットの腹壁に生じさせた２ｃｍ×２ｃｍの欠陥の修復に使用する、２ｃｍ×２ｃｍのサンプルを調製した。合計６０匹のラットを使用した。各ラットに対して腹部皮膚および皮下切開を行ない腹壁を露出させた。各ラットの腹部に、約２ｃｍ×２ｃｍの全層腹部／筋膜壁欠陥を生じさせた。筋膜サンプルまたはＳＩＳサンプルいずれかを使用して欠陥を修復した。移植したサンプルを、次のように異なる３つの時点で評価した。ＳＩＳ移植した１０匹のラットを２週間で、筋膜移植した８匹のラットを２週間で（２匹のラットは盲腸癒着のために死亡）、ＳＩＳ移植した１０匹のラットを４週間で、筋膜移植した１０匹のラットを４週間で、ＳＩＳの１０匹のラットを８週間で、筋膜移植した１０匹のラットを８週間で、評価した。外植時に、イヌの骨の形状の検査品を、移植した各サンプルの中心から切出した。検査品を、サンプルの極限張力として測定される破壊時の力について機械的に検査した。
【００９２】
一般的に、材料双方について、修復の強度は時間の経過に伴って増す。加えて、どの時点でも筋膜とＳＩＳとの間に統計的差異はなかった。極限張力データは以下の表５にまとめられている。このデータは、これら２つの材料の間に時間の経過に伴う修復強度の差はないこと、および、どちらのサンプルについても材料の強度は時間の経過に伴って増すことを、示唆している。
【００９３】
【表６】
【００９４】
サンプルに対して極限張力の検査を行なった後、残りの移植サンプル各々の切片を収集しホルマリンに固定した。その後、固定したサンプルを埋込み、切開し、Ｈ＆Ｅで染色した。２つの材料の間に、各時点における細胞浸潤およびリモデリングの相違はほとんどないという点で、組織学は機械的結果を裏付けた。２週間で、サンプル双方に何らかの細胞内部成長が見られた。４週間で、双方の材料は細胞浸潤およびリモデリングが進んでいることを示した。８週間で、双方のサンプルは通常の線維性血管性組織を示し、材料はほとんど残っていなかった。
【００９５】
この実施例は、本明細書に記載のブタの腹壁から分離した移植材料が、ＳＩＳ材料と比較して、時間の経過に伴い同様の強度を有することを示す。組織学はこの発見を裏付けており、本明細書に記載の腹壁筋膜ＥＣＭ材料は、ＳＩＳと同様のリモデリング特性を示す。
【００９６】
本発明の記載の文脈において（特に以下の請求項の文脈において）使用される「１つの（“a”と“an”)」および「この（“the”）」ならびに類似する指示語は、本明細書で特に明記しない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、単一のものおよび複数のもの双方を含むと解釈されねばならない。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で特に明記しない限り、その範囲に含まれる個々の値を個別に示すための簡略方法を意図しているに過ぎず、個々の値は、本明細書において個別に記載された場合と同じように明細書に含まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で特に明記しない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行できる。本明細書で使用されるすべての例または例示を示す表現（たとえば「等（“such as”)」）は、本発明をより明らかにすることを意図しているに過ぎず、特に請求項に記載しない限り本発明の範囲を限定しない。本明細書の表現は請求項に記載されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものではないと理解されねばならない。
【００９７】
この発明の好ましい実施の形態は、発明者が認識しているこの発明を実施するためのベストモードを含めて、本明細書に記載されている。当然ながら、こういった好ましい実施の形態の変形は、当業者にとっては上記の記載を読めば明らかになるであろう。発明者らは当業者がこのような変形を適宜採用すると予測し、発明者らは本発明がこの明細書に具体的に記載されるのとは異なるやり方で実施されることを意図している。したがって、この発明は、適用法によって認められる以下の請求項に記載の主題のすべての変形および均等物を含む。さらに、その可能な変形すべてにおける上記の要素のいずれの組合せも、本明細書で特に明記しない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、本発明に含まれる。加えて、本明細書で引用されたすべての刊行物は、当業者の能力を示し、引用により個別に援用され全体が記載された場合と同じくその全体が本明細書に引用により援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高弾性および高強度を有する、生体吸収性のコラーゲン性およびエラスチン性の細胞外マトリクス移植材料であって、
ブタの腹壁から分離した高伸縮性の細胞外マトリクス材料の分離した生体吸収性層を含み、
前記細胞外マトリクス材料は、コラーゲンおよびエラスチンを含み、前記腹壁に由来する漿膜下筋膜を含む天然層構造を有し、
前記細胞外マトリクス材料には本質的に天然細胞がなく、
さらに、前記細胞外マトリクス材料の引張破断強度は少なくとも１ポンドであり破断伸びは少なくとも約５０％である、移植材料。
【請求項２】
前記細胞外マトリクス材料の脂質含有量は１５重量パーセント未満である、請求項１の移植材料。
【請求項３】
前記天然層構造は、腹壁に由来する壁側腹膜も含む、請求項１の移植材料。
【請求項４】
前記材料は酸化殺菌剤で殺菌されている、請求項１の移植材料。
【請求項５】
前記酸化殺菌剤はパーオキシ化合物を含む、請求項４の移植材料。
【請求項６】
前記パーオキシ化合物は過酸である、請求項５の移植材料。
【請求項７】
前記パーオキシ化合物は過酢酸である、請求項６の移植材料。
【請求項８】
前記層の長さは少なくとも２０ｃｍであり、幅は少なくとも２０ｃｍである、請求項１の移植材料。
【請求項９】
前記細胞外マトリクス材料にＦＧＦ−２がない、請求項１の移植材料。
【請求項１０】
前記細胞外マトリクス材料はヒアルロン酸を含む、請求項９の移植材料。
【請求項１１】
互いに結合された少なくとも２つの前記層を含む、請求項１の移植材料。
【請求項１２】
前記移植材料を通して流体を通過させる穿孔をさらに含む、請求項１１の移植材料。
【請求項１３】
前記シートは脱水熱的に互いに結合されている、請求項１１の移植材料。
【請求項１４】
脱水形態でパッケージ内に無菌状態で封止されている、請求項１から１３のいずれかの移植材料。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれかに記載の移植材料を患者に移植することを含む、患者の治療方法。
【請求項１６】
前記移植は患者の軟組織を支持するために行なわれる、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記移植はヘルニア修復のために行なわれる、請求項１５の方法。
【請求項１８】
高弾性を有する細胞外マトリクス移植材料の調製方法であって、
ブタの腹壁から分離した組織の切片を提供するステップであって、前記組織の切片は、前記腹壁に由来する少なくとも漿膜下筋膜と付着する漿膜下脂肪とを含む天然層構造を含む、ステップと、
前記漿膜下脂肪を前記組織の切片から機械的に除去することにより、前記漿膜下筋膜を含む組織のコラーゲン性の層を生成させるステップと、
前記組織のコラーゲン性の層を液状媒体で処理することにより天然脂質を除去するステップと、
前記組織のコラーゲン性の層に対して細胞を除去するステップとを含み、
前記処理および細胞除去の後、前記組織の層の引張破断強度は少なくとも１ポンドであり、破断伸びは少なくとも５０％である、方法。
【請求項１９】
酸化殺菌剤を含む溶液の中に組織のコラーゲン性のシートを浸漬させるステップをさらに含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記殺菌剤は過酢酸を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記溶液はさらにエタノールを含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記方法はさらに組織のコラーゲン性のシートを殺菌するステップを含む、請求項１８の方法。
【請求項２３】
前記液状媒体は有機溶媒を含む、請求項１８の方法。
【請求項２４】
前記有機溶媒はイソプロピルアルコールである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記処理および細胞除去の後、組織のコラーゲン性のシートを乾燥するステップをさらに含む、請求項１８から２４のいずれかの方法。
【請求項１】
高弾性および高強度を有する、生体吸収性のコラーゲン性およびエラスチン性の細胞外マトリクス移植材料であって、
ブタの腹壁から分離した高伸縮性の細胞外マトリクス材料の分離した生体吸収性層を含み、
前記細胞外マトリクス材料は、コラーゲンおよびエラスチンを含み、前記腹壁に由来する漿膜下筋膜を含む天然層構造を有し、
前記細胞外マトリクス材料には本質的に天然細胞がなく、
さらに、前記細胞外マトリクス材料の引張破断強度は少なくとも１ポンドであり破断伸びは少なくとも約５０％である、移植材料。
【請求項２】
前記細胞外マトリクス材料の脂質含有量は１５重量パーセント未満である、請求項１の移植材料。
【請求項３】
前記天然層構造は、腹壁に由来する壁側腹膜も含む、請求項１の移植材料。
【請求項４】
前記材料は酸化殺菌剤で殺菌されている、請求項１の移植材料。
【請求項５】
前記酸化殺菌剤はパーオキシ化合物を含む、請求項４の移植材料。
【請求項６】
前記パーオキシ化合物は過酸である、請求項５の移植材料。
【請求項７】
前記パーオキシ化合物は過酢酸である、請求項６の移植材料。
【請求項８】
前記層の長さは少なくとも２０ｃｍであり、幅は少なくとも２０ｃｍである、請求項１の移植材料。
【請求項９】
前記細胞外マトリクス材料にＦＧＦ−２がない、請求項１の移植材料。
【請求項１０】
前記細胞外マトリクス材料はヒアルロン酸を含む、請求項９の移植材料。
【請求項１１】
互いに結合された少なくとも２つの前記層を含む、請求項１の移植材料。
【請求項１２】
前記移植材料を通して流体を通過させる穿孔をさらに含む、請求項１１の移植材料。
【請求項１３】
前記シートは脱水熱的に互いに結合されている、請求項１１の移植材料。
【請求項１４】
脱水形態でパッケージ内に無菌状態で封止されている、請求項１から１３のいずれかの移植材料。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれかに記載の移植材料を患者に移植することを含む、患者の治療方法。
【請求項１６】
前記移植は患者の軟組織を支持するために行なわれる、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記移植はヘルニア修復のために行なわれる、請求項１５の方法。
【請求項１８】
高弾性を有する細胞外マトリクス移植材料の調製方法であって、
ブタの腹壁から分離した組織の切片を提供するステップであって、前記組織の切片は、前記腹壁に由来する少なくとも漿膜下筋膜と付着する漿膜下脂肪とを含む天然層構造を含む、ステップと、
前記漿膜下脂肪を前記組織の切片から機械的に除去することにより、前記漿膜下筋膜を含む組織のコラーゲン性の層を生成させるステップと、
前記組織のコラーゲン性の層を液状媒体で処理することにより天然脂質を除去するステップと、
前記組織のコラーゲン性の層に対して細胞を除去するステップとを含み、
前記処理および細胞除去の後、前記組織の層の引張破断強度は少なくとも１ポンドであり、破断伸びは少なくとも５０％である、方法。
【請求項１９】
酸化殺菌剤を含む溶液の中に組織のコラーゲン性のシートを浸漬させるステップをさらに含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記殺菌剤は過酢酸を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記溶液はさらにエタノールを含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記方法はさらに組織のコラーゲン性のシートを殺菌するステップを含む、請求項１８の方法。
【請求項２３】
前記液状媒体は有機溶媒を含む、請求項１８の方法。
【請求項２４】
前記有機溶媒はイソプロピルアルコールである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記処理および細胞除去の後、組織のコラーゲン性のシートを乾燥するステップをさらに含む、請求項１８から２４のいずれかの方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１１−５２６８１１（Ｐ２０１１−５２６８１１Ａ）
【公表日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１６７７２（Ｐ２０１１−５１６７７２）
【出願日】平成２１年６月２９日（２００９．６．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４９０７９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００２７９９
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０６２７０５９２）クック・バイオテック・インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＯＫ ＢＩＯＴＥＣＨ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２９日（２００９．６．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４９０７９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００２７９９
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０６２７０５９２）クック・バイオテック・インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＯＫ ＢＩＯＴＥＣＨ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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