潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤
本発明の課題は、潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤、ＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法、またはＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬を提供することである。本発明は、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を含有する、潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤およびＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬、ならびにビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を評価することを特徴とするＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潜在型トランスフォーミング・グロース・ファクター−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β、以下「ＴＧＦ−β」という。）の活性化抑制剤、ＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法、およびＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−βは、細胞増殖・分化、細胞外マトリックス合成、アポトーシス、免疫機能などの制御等、多彩な生理活性を有するサイトカインとして知られており、その機能不全は、ヒトの病態、例えば癌、組織の線維化、自己免疫疾患等に関連していることが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
ＴＧＦ−βは不活性の潜在型分子として分泌されるため、生理作用を発揮するためには細胞から分泌された後に活性化を受ける必要がある（非特許文献２参照）。潜在型ＴＧＦ−βの活性化段階を制御することはＴＧＦ−βの活性を制御することにつながることから、その活性化機構が精力的に研究されている。これまでに、プロテアーゼによる潜在型ＴＧＦ−βの限定分解を介した機構、細胞表面分子への結合に伴う構造変化を介した機構、またはその両者を組み合わせた機構等が報告されている。例えば、潜在型ＴＧＦ−βを限定分解するプロテアーゼとして、プラスミン（非特許文献３参照）、マトリックスメタロプロテアーゼ（非特許文献４参照）等が報告されている。潜在型ＴＧＦ−βが結合し、その構造を変化させる細胞表面分子として、トロンボスポンジン−１（非特許文献５参照）、インテグリンαｖβ６（非特許文献６参照）等が報告されている。インテグリンαｖβ８への結合とそれに伴う構造変化により、マトリックスメタロプロテアーゼによる限定分解が生じるという機構も報告されている（非特許文献７参照）。
【０００４】
一方、潜在型ＴＧＦ−βを構成するタンパク質であるラテンシー・アソシエイテッド・ペプチド（Ｌａｔｅｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下「ＬＡＰ」という。）の部分断片が、潜在型ＴＧＦ−βの活性化を促進すること、該部分断片が血管内皮細胞の表面に結合することが報告されている（非特許文献８参照）。
【０００５】
ビメンチンは、多くの種類の細胞に存在する中間径フィラメントのサブユニットタンパク質であり、ビメンチン繊維として細胞質に網目状構造で存在する。ビメンチンに結合する物質としては、抗ビメンチンモノクローナル抗体が知られている。抗ビメンチンモノクローナル抗体ＶＩＭ３Ｂ４は、げっ歯類以外の哺乳動物のビメンチンに結合し、その認識部位はビメンチンの第二ロッド領域であることが報告されている（非特許文献９参照）。また、抗ビメンチンモノクローナル抗体Ｖ９（非特許文献９参照）は、ヒトマクロファージの活性化に伴い細胞表面または細胞外に分泌されるビメンチンに結合し得ることが報告されている（非特許文献１０参照）。
【０００６】
【非特許文献１】「ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２０００年、第３４２巻、ｐ．１３５０−１３５８
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００３年、第１１６巻、ｐ．２１７−２２４
【非特許文献３】「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９８９年、第１０９巻、ｐ．３０９−３１５
【非特許文献４】「ジーンズ・アンド・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２０００年、第１４巻、ｐ．１６３−１７６
【非特許文献５】「サイトカイン・アンド・グロース・ファクター・レビュー（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗ）１１，５９−６９（２０００）」、２０００年、第１１巻、ｐ．５９−６９
【非特許文献６】「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９９年、第９６巻、ｐ．３１９−３２８
【非特許文献７】「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第１５７巻、ｐ．４９３−５０７
【非特許文献８】「エンドセリウム（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」、２００２年、第９巻、ｐ．２５−３６
【非特許文献９】「エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９２年、第２０１巻、ｐ．１−７
【非特許文献１０】「ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第５巻、ｐ．５９−６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤、ＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法、またはＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤。
（２）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質が、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する活性を有する抗ビメンチン抗体または該抗体断片である、上記（１）のＴＧＦ−β活性化抑制剤。
（３）ＬＡＰの部分断片が配列番号１〜１６のいずれかで表されろアミノ酸配列を有するペプチドである、上記（１）または（２）のいずれか１つのＴＧＦ−β活性化抑制剤。
（４）（ｉ）ＬＡＰの部分断片を、ビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞に添加して、該細胞に結合する該部分断片量を測定すること、
（ｉｉ）ＬＡＰの部分断片およびスクリーニングの対象となる物質を、ビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞に添加して、該細胞に結合する該部分断片量を測定すること、
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の測定量から、該物質の、ＬＡＰの部分断片とＴＧＦ−βを発現する細胞との結合阻害活性を評価すること、
（ｉｖ）該結合阻害活性を有する物質をＴＧＦ−β活性化抑制物質として選択すること、
からなるＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法。
（５）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬。
（６）ＴＧＦ−βが関与する疾患が動脈硬化症、癌、炎症、線維症である、上記（５）の治療薬。
（７）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を被験体に投与する工程を包含するＴＧＦ−β活性化抑制方法。
（８）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を被験体に投与する工程を包含するＴＧＦ−βが関与する疾患の治療方法。
（９）ＴＧＦ−β活性化抑制剤の製造のための、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質の使用。
（１０）ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬の製造のための、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤、またはＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法が提供される。本発明のＴＧＦ−βの活性化抑制剤は、ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＢＡＥＣに対する潜在型ＴＧＦ−β活性化ペプチドの結合度（ＲＬＵ／ウェル）を示す図である。「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋Ａｂ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体ＶＩＭ３Ｂ４、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ＋Ａｂ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎおよび５μｇ／ｍｌのＶＩＭ３Ｂ４をそれぞれ添加した場合の結合度を示す。＊＊は、スチューデントのｔ検定において、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図２】図２は、ＢＡＥＣを剃刀で剥離した後、剥離部分に遊走してきた観察視野当たりの細胞数（個／ＨＰＦ）を示す図である。「Ｃｏｎｔｒｏｌ＋ＮＩ」のカラムは５μｇ／ｍｌの非免疫マウスＩｇＧ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２１＋ＮＩ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２１および５μｇ／ｍｌのＩｇＧ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２１＋Ａｂ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２１および５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体Ｖ９、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋ＮＩ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌのＩｇＧ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋Ａｂ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌのＶ９をそれぞれ添加した場合の細胞数を示す。＊および＊＊は、スチューデントのｔ検定において、それぞれ危険率５％および１％未満で有意差があることを示す。
【図３】図３は、ＢＡＥＣに対する潜在型ＴＧＦ−β活性化ペプチドの結合度（ＲＬＵ／ｗｅｌｌ）を示す図である。「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋ＫＭ５１１」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌの抗Ｇ−ＣＳＦ変異体抗体ＫＭ５１１、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋ＫＭ３５６５」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体ＫＭ３５６５、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ＋ＫＭ５１１」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎおよび５μｇ／ｍｌのＫＭ５１１、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ＋ＫＭ３５６５」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎおよび５μｇ／ｍｌのＫＭ３５６５をそれぞれ添加した場合の結合度を示す。＊＊は、スチューデントのｔ検定において、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図４】図４は、酵素免疫測定法により測定した、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン部分ペプチドに対する反応性を示す図である。上段が化合物１を、下段が化合物２を、それぞれ固層化したプレートを用いた測定結果を示す。Ｘ軸は添加したＫＭ３５６５の濃度を、Ｙ軸は抗体の結合度を表す吸光度をそれぞれ示す。
【図５】図５は、酵素免疫測定法により測定した、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン蛋白に対する反応性を示す図である。上段がビメンチン蛋白を、下段が大腸菌由来夾雑蛋白を、それぞれ固層化したプレートを用いた測定結果を示す。Ｘ軸は添加したＫＭ３５６５の濃度を、Ｙ軸は抗体の結合度を表す吸光度をそれぞれ示す。
【図６】図６は、酵素免疫測定法により測定した、市販抗ビメンチン抗体（▲；ＶＩＭ３Ｂ４、■；Ｖ９）の化合物１およびビメンチン蛋白に対する反応性を示す図である。上段が化合物１を、下段がビメンチン蛋白を、それぞれ固層化したプレートを用いた測定結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質としては、該阻害活性を有する物質であれば、合成化合物でも天然物質でも特に制限なく用いることができるが、好ましくは、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する活性を有する抗ビメンチン抗体もしくは該抗体断片またはそれらの誘導体が用いられる。
抗ビメンチン抗体もしくは該抗体断片またはそれらの誘導体のうち、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する活性を有するものの選択方法としては、後述の、本発明のＴＧＦ−βの活性化を抑制する物質のスクリーニング方法を用いることができる。
本発明に用いる抗ビメンチン抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。
【００１２】
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体等があげられる。
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞である。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下「ＣＤＲ」という。）移植抗体等があげられる。
【００１３】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域として「ＨＶ」または「ＶＨ」ともいう。）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖として「ＬＶ」または「ＶＬ」ともいう。）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域として「ＣＨ」ともいう。）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下「ＣＬ」ともいう。）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００１４】
本発明に用いるヒト型キメラ抗体は、ビメンチンに特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下「ｈＩｇ」という。）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００１５】
ヒト型キメラＬ鎖とは、ヒト以外の動物のＶＬとヒト抗体のＣＬとからなる抗体Ｌ鎖を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明に用いるヒト型キメラＬ鎖は、ビメンチンに特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型キメラＬ鎖発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラＬ鎖のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００１６】
ヒト型キメラＨ鎖とは、ヒト以外の動物のＶＨとヒト抗体のＣＨとからなる抗体Ｈ鎖を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００１７】
本発明に用いるヒト型キメラＨ鎖は、ビメンチンに特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型キメラＨ鎖発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラＨ鎖のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
【００１８】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
本発明に用いるヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ビメンチンに特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００１９】
本発明に用いるヒト型ＣＤＲ移植キメラＬ鎖は、ビメンチンに特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型ＣＤＲ移植キメラＬ鎖発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植キメラＬ鎖を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植キメラＬ鎖のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００２０】
本発明に用いるヒト型ＣＤＲ移植キメラＨ鎖は、ビメンチンに特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨのＣＤＲ配列に移植したＨ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型ＣＤＲ移植キメラＨ鎖発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植キメラＨ鎖を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
【００２１】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
【００２２】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇの略）、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００２３】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
【００２４】
本発明に用いる抗体または抗体のＬ鎖もしくはＨ鎖の部分断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ、以下「ｓｃＦｖ」という。）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ、以下「ｄｓＦｖ」という。）、ＣＤＲを含むペプチド等があげられる。
【００２５】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分のアミノ酸とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明に用いるＦａｂは、ビメンチンに特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物もしくは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
【００２６】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明に用いるＦ（ａｂ’）２は、ビメンチンに特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合もしくはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明に用いるＦａｂ’は、ビメンチンに特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物もしくは真核生物へ導入することによりＦａｂ’を発現させ、製造することができる。
【００２７】
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下「Ｐ」という。）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明に用いるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
本発明に用いるｓｃＦｖは、ビメンチンに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００２８】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明に用いるｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００２９】
本発明に用いるｄｓＦｖは、ビメンチンに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００３０】
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明に用いるＣＤＲを含むペプチドは、ビメンチンに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００３１】
本発明に用いる抗体の誘導体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらの抗体断片に放射性同位元素、蛋白質または低分子の化合物等を結合させた抗体の誘導体等があげられる。
本発明に用いる抗体の誘導体は、ビメンチンに特異的に反応する抗体または抗体断片のＨ鎖もしくはＬ鎖のＮ末端側もしくはＣ末端側、抗体または抗体断片中の適当な置換基もしくは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、蛋白質もしくは低分子の化合物等を化学的手法［抗体工学入門（金光修著１９９４年（株）地人書館）］により結合させることにより製造することができる。
【００３２】
または、ビメンチンに特異的に反応する抗体もしくは抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入する、遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
放射性同位元素としては、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ等があげられ、例えば、クロラミンＴ法等により、抗体に結合させることができる。
【００３３】
低分子の薬剤としては、ハイドロコーチゾン、プレドニゾン等のステロイド剤、アスピリン、インドメタシン等の非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミン等の免疫調節剤、アドリアマイシン、ダウノマイシン等の免疫抑制作用を有する抗癌剤、サイクロスポリン、ＦＫ５０６、サイクロフォスファミド、アザチオプリン等の免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤［炎症と抗炎症療法昭和５７年 医歯薬出版株式会社］等があげられる。
【００３４】
例えば、ダウノマイシンと抗体とを結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
【００３５】
蛋白質としては、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等があげられる。
蛋白質と抗体とを結合させる方法としては、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより蛋白質と抗体が融合した融合抗体を発現させる方法等があげられる。
【００３６】
以下、ビメンチンに反応するポリクローナル抗体の作製方法について記す。
ビメンチンをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して形質転換株を作製し、該形質転換株を培養・精製することにより、リコンビナントビメンチンを得る。または、ヒト血管内皮細胞、例えば臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ社製）等を培養・精製することによりビメンチンを得る。これらのビメンチン、ビメンチンの部分断片ポリペプチドの精製標品、またはビメンチンの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原に用いる。
【００３７】
これら抗原はそのまま、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、メチル化牛血清アルブミン（メチル化ＢＳＡ）、牛チログロブリン（ＴＨＹ）等の分子量の大きいキャリアタンパク質と結合させて投与する。
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよい。下記に、マウスおよびラットを用いる例について説明する。
【００３８】
３〜２０週令のマウスまたはラットに、上記方法で調製した抗原を免疫し、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバンドとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。各投与後３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢または尾静脈より採血し、免疫に用いた抗原に対しての反応性について、酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
【００３９】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清よりポリクローナル抗体を分離、精製する。
ポリクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕｍｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡもしくはＧ−カラム、ゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
【００４０】
以下、ビメンチンに反応するモノクローナル抗体の作製方法について記す。
１．抗ビメンチンモノクローナル抗体の作製
（１）抗体産生細胞の調製
免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウスまたはラットより公知の方法［アンティボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリングハーバー・ラボラトリー（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、以下「アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル」という。］に準じて脾臓を摘出し、脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
【００４１】
（２）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］等、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【００４２】
（３）細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁させる。細胞の洗浄にはＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、塩化ナトリウム７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）等を用いる。また、融合細胞を懸濁させる培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地｛正常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地］にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／ｌ）を加えた培地｝を用いる。
培養後、培養上清の一部をとり、酵素免疫測定法により、抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００４３】
（４）抗ビメンチンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの選択
抗ビメンチンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアルに述べられている方法等に従い、以下に述べる測定法により行う。これらの方法により、後述する抗ビメンチンヒト化抗体、該抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗ビメンチン抗体またはすべての精製抗ビメンチン抗体の結合活性を測定することができる。
【００４４】
酵素免疫測定法
抗原または抗原を発現した細胞等を９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清または上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、第一抗体のイムノグロブリンを認識できる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【００４５】
（５）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、１（３）で得られた抗ビメンチンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０７〜５×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムまたはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラムなどを用いて、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキット等を用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられる。
【００４６】
（６）抗ビメンチンモノクローナル抗体の反応性
抗ビメンチンモノクローナル抗体の反応性を調べる方法として、インヒビションＥＬＩＳＡがあげられる。
まず、１（４）に記したように抗原を固相化したプレートを準備し、第一抗体として抗ビメンチンモノクローナル抗体を反応させる。同時に適当に希釈したビメンチンを加えプレートに固相化したビメンチンと競合させる。その後は１（４）に示した方法と同様に検出することができる。抗ビメンチンモノクローナル抗体がビメンチンと反応する場合には、液相系で加えたビメンチン濃度依存的に固相化ビメンチンへの結合が阻害され、ＯＤ値が低下する。
【００４７】
２．ヒト化抗体の作製方法（Ｉ）−抗ビメンチンヒト化抗体の作製方法
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発現用ベクターを構築する。ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣ領域であるＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれ挿入することにより構築されたものである。
【００４８】
ヒト抗体のＣ領域としては、例えば、ヒト抗体Ｈ鎖ではＣγ１やＣγ４、ヒト抗体Ｌ鎖ではＣκ等の任意のヒト抗体のＣ領域を用いることができる。ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンより成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。
【００４９】
例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ β ｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）］、および免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
【００５０】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖が別々のベクター上に存在するタイプまたは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築のしやすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］。
【００５１】
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗ビメンチンモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。
抗ビメンチンモノクローナル抗体を産生する細胞、例えば、マウスビメンチン抗体産生ハイブリドーマ等よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを、ファージまたはプラスミドなどのベクターに挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミド、およびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とする抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
【００５２】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
前記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、キメラ抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にあらかじめヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングするための制限酵素の認識配列を設けておき、このクローニングサイトにヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡを下記に述べる合成ＤＮＡを介して挿入することにより、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを製造することができる。合成ＤＮＡは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣ領域の５’末端側の塩基配列とからなるものであり、両端に適当な制限酵素部位を有するようにＤＮＡ合成機を用いて製造する。
【００５３】
（４）ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲ配列の同定
抗体の抗原結合部位を形成するＶＨおよびＶＬは、配列の比較的保存された４個のフレームワーク領域（以下、ＦＲ領域と称す）とそれらを連結する配列の変化に富んだ３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）から成っている［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９９１）、以下「シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト」という。］。そして各ＣＤＲアミノ酸配列（ＣＤＲ配列）は、既知の抗体のＶ領域のアミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより同定することができる。
【００５４】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のＣＤＲを移植するためのヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列をＶＨ、ＶＬそれぞれについて選択する。ヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列であればいかなるものでも用いることができる。
【００５５】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに登録されているヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）があげられるが、充分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を創製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列と高い相同性、好ましくは６０％以上の相同性を有することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を連結させて、ＶＨ、ＶＬそれぞれのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。ＣＤＲ移植抗体可変領域遺伝子を構築するために設計したＤＮＡ配列を得るためには、全ＤＮＡ配列をカバーするように各鎖について数本の合成ＤＮＡを設計し、それらを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下「ＰＣＲ」という。）を行う。ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから各鎖について、好ましくは、６本の合成ＤＮＡを設計する。反応後、増幅断片を適当なベクターにサブクローニングし、その塩基配列を決定し、目的のヒト型ＣＤＲ移植抗体の各鎖のＶ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを取得する。また、約１００塩基よりなる合成ＤＮＡを用いてセンス、アンチセンスともに全配列を合成し、それらをアニーリング、連結することで、目的のヒト型ＣＤＲ移植抗体の各鎖のＶ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築することもできる。
【００５６】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のＣＤＲのみをヒト抗体のＶ領域のＦＲ間に、単純に移植しただけでは、その活性はもとのヒト以外の動物の抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。そこでヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列のうち、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用をしているアミノ酸残基、または抗体の立体構造の維持に関与している等の可能性を有するアミノ酸残基をもとのヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、活性を上昇させることが行われている。そして、それらのアミノ酸残基を効率よく同定するため、Ｘ線結晶解析あるいはコンピューターモデリング等を用いた抗体の立体構造の構築および解析を行っている。しかし、いかなる抗体にも適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の製造法は未だ確立されておらず、現状では個々の抗体によって種々の試行錯誤が必要である。
【００５７】
選択したヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列の改変は各種の変異導入プライマーを用いて前記２（５）に記載のＰＣＲを行うことにより達成できる。ＰＣＲ後の増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたｃＤＮＡを含むベクター（以下「アミノ酸配列改変ベクター」という。）を取得する。
また、狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、２０〜３５塩基からなる変異導入プライマーを用いたＰＣＲ変異導入法により行うことができる。具体的には、改変後のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を含む２０〜３５塩基からなるセンス変異プライマーおよびアンチセンス変異プライマーを合成し、改変すべきＶ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として２段階のＰＣＲを行う。最終増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたｃＤＮＡを含むアミノ酸配列改変ベクターを取得する。
【００５８】
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
前記２（１）のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子の上流に、前記２（５）および２（６）で取得したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築するためのＰＣＲの際に５’末端および３’末端の合成ＤＮＡの末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、所望のヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入することができる。
【００５９】
（８）ヒト化抗体の一過性（トランジェント）発現および活性評価
多種類のヒト化抗体の活性を効率的に評価するために、前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクター、および前記２（７）のヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターまたはそれらの改変ベクターをＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）に導入してヒト化抗体の一過性発現［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ２８３（１９９１）］を行い、その活性を測定することができる。
ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ２８３（１９９１）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等があげられる。
ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の活性は前記１（５）に記載の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等により測定することができる。
【００６０】
（９）ヒト化抗体の安定（ステーブル）発現および活性評価
前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクターおよび前記２（７）のヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
【００６１】
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下「ＤＨＦＲ遺伝子」という。）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下「ＹＢ２／０細胞」という。）等があげられる。
【００６２】
ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８およびＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により選択する。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養液中のヒト化抗体の活性は前記１（５）に記載の方法等により測定する。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
【００６３】
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル第８章）。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組合せて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル第１２章）等で測定する。
精製したヒト化抗体の反応性、また、ヒト化抗体のビメンチンに対する結合活性の測定は前記１（４）に記載の方法などにより測定することができる。
【００６４】
３．抗体断片の作製
抗体断片は、上記２に記載のヒト化抗体を元に遺伝子工学的手法または蛋白質化学的手法により、作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチド等があげられる。
【００６５】
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。また、Ｆａｂは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、上記２の（２）および（３）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１，（１９８８）］等があげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体またはペリプラズマ層にＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後または培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
【００６６】
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、上記２（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサン等のようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢで処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
【００６７】
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することができる。例えば、上記２（２）および（３）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６３，（１９９２）］等があげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体またはペリプラズマ層にＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後または菌の破砕液からは、プロテインＧカラム等を用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
【００６８】
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、上記２（２）および（３）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、１２残基以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡを介して連結し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製する。作製したＤＮＡをｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、Ｐｈｆａ［Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，５，４８（１９９４）］等があげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体またはペリプラズマ層にｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後または菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
【００６９】
（５）Ｄｉａｂｏｄｙの作製
Ｄｉａｂｏｄｙは、上記のｓｃＦｖを作製する際のポリペプチドリンカーを３〜１０残基程度にすることで、作製することができる。１種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合には、２価のＤｉａｂｏｄｙを、２種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合は、２特異性を有するＤｉａｂｏｄｙを作製することができる［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５３，１６４（１９９９）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７，７６３（１９９８）］。
【００７０】
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することができる。まず、上記２（２）および（３）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］等があげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体またはペリプラズマ層にＶＨおよびＶＬを生成蓄積させることができる。封入体またはペリプラズマ層からＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、さらに精製することができる［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］。
【００７１】
（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等があげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体またはペリプラズマ層にＣＤＲを含むペプチドを生成蓄積させることができる。封入体またはペリプラズマ層からＣＤＲを含むペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、精製することができる［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］。
【００７２】
４．融合抗体および融合ペプチドの作製方法
本発明で使用される抗体またはペプチドに、放射性同位元素、毒素、サイトカインまたは酵素等の蛋白質、低分子の薬剤等を、化学的または遺伝子工学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドも抗体の誘導体として使用することができる。
【００７３】
抗体またはペプチドと毒素蛋白質とを化学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドは、文献［Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，２００３（１９９１）；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３，３５０（１９９６）］記載の方法等に従って作製することができる。
抗体またはペプチドと、毒素、サイトカインまたは酵素等の蛋白質とを遺伝子工学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドは、文献［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９７４（１９９６）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，７８２６（１９９６）］記載の方法等に従って作製することができる。
【００７４】
抗体またはペプチドと低分子抗癌剤を化学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドは、文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，２１２（１９９３）］記載の方法等に従って作製することができる。
抗体またはペプチドと放射性同位元素を化学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドは、文献［Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，３，６０（１９９０）；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，２００３（１９９１）］記載の方法等に従って作製することができる。
【００７５】
これらの誘導体は、抗体分子の特異性に従って放射性同位元素、毒素、サイトカインまたは酵素等の蛋白質、低分子の薬剤等を標的組織周辺に集積させることで、より効果的で副作用の少ない診断または治療を可能にすることが期待されている。
【００７６】
５．ヒト化抗体または抗体断片の活性評価
精製したヒト化抗体の抗原との結合性、ビメンチンに対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ等を用いた表面プラズモン共鳴等により測定できる。
【００７７】
６．本発明に用いる抗体を用いたビメンチンの定量および検出方法
本発明に用いる抗ビメンチン抗体またはその抗体断片を用いる、ビメンチンを免疫学的に定量または検出する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、上記に記した酵素免疫測定法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法［単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７年）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人、１９８６年）］等を用いることができる。
【００７８】
蛍光抗体法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６），単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７）］等に記載された方法を用いて行うことができる。具体的には、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等に、本発明に用いられるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリンなどの蛍光物質でラベルした抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
【００７９】
免疫細胞染色法、免疫組織染色法等の免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６），単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック，１９８７）］等に記載された方法を用いて行うことができる。
免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）は、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等に、本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識等を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【００８０】
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）は、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等に、本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンター等で測定する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法は、生体内から分離された細胞または組織等に、本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
【００８１】
ウェスタンブロッティング法は、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８］で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣ等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、確認する。
【００８２】
免疫沈降法とは、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等を本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等のイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させるものである。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片で、抗原認識部位の異なる２種類のモノクローナル抗体のうち、あらかじめ一方のモノクローナル抗体または抗体断片はプレートに吸着させ、もう一方のモノクローナル抗体または抗体断片はＦＩＴＣ等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素で標識しておく。抗体吸着プレートに、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等を反応後、標識したモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である。
【００８３】
本発明でいうＬＡＰの部分断片としては、細胞表面または細胞外に分泌されるビメンチンに結合し得るＬＡＰの部分断片であればいずれのものも用いることができ、例えば、国際公開第９８／５１７０４号の第２表に記載された化合物１〜１６等を使用することができるが、化合物１５が好ましく使用される。化合物１〜１６のアミノ酸配列を配列番号１〜１６に示す。
【００８４】
以下、本発明のＴＧＦ−βの活性化抑制物質のスクリーニング方法について記す。
本発明のスクリーニング方法の対象となる物質は、合成化合物でも天然物質でも特に制限なく用いることができる。
本発明の方法に使用するＬＡＰの部分断片としては、上記のＬＡＰの部分断片を用いることができる。
【００８５】
本発明の方法に使用するビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞としては、例えば、血管内皮細胞、マクロファージ等があげられる。細胞は、ヒト、ウシ、ブタ、ネズミ等の動物から、単離・精製したもの、またはそれら細胞由来の培養細胞を用いることができる。単離・精製方法としては、例えば、オカダ（Ｏｋａｄａ）らの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０６，３０４（１９８９）］等があげられる。
【００８６】
細胞へのＬＡＰの部分断片の結合は、例えば細胞を培地で培養し該部分断片を添加しインキュベートした後、細胞を洗浄し、細胞に結合している該部分断片を測定することにより行うことができる。
ＬＡＰの部分断片は、例えばクロラミンＴ法［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２，５９９（１９８２）］により１２５Ｉ標識したもの、フルオレセインイソチオシアネート、ＡＭＣＡ、ローダミン６Ｇ、ローダミンレッド−Ｘ、Ｃｙ３、テキサスレッド等の蛍光色素で標識をしたもの等を用いるのが好ましい。これにより、細胞に結合したＬＡＰの部分断片は、それぞれ、放射活性、発光強度等を測定することにより検出および定量することができる。
【００８７】
また、細胞表面上に発現するビメンチンにＬＡＰの部分断片が結合することにより潜在型ＴＧＦ−βが活性化されるので、細胞に結合するＬＡＰの部分断片量の測定は、活性型ＴＧＦ−β量を測定することにより行うこともできる。活性型ＴＧＦ−βの定量法は特に限定されないが、直接抗ＴＧＦ−β抗体を用いた酵素免疫測定方法［メソッヅ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９８，３０３（１９９１）］または安部らのルシフェラーゼ・アッセイ・システム［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２１６，２７６（１９９４）］等で測定することができる。また、血管内皮細胞の遊走度［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２３，１２４９（１９９３）］、血管平滑筋細胞の増殖［トウホク・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｔｏｈｏｋｕ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１７９，２３（１９９６）］、各種癌細胞の増殖阻害［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ），８７，２７７（１９９１），エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ），１２８，１９８１（１９９１）］、ミンク肺上皮細胞の増殖阻害［メソッヅ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９８，３１７（１９９１）］等の方法で測定することができる。
【００８８】
スクリーニングの対象となる物質を添加しないときの、細胞に結合するＬＡＰの部分断片量または活性型ＴＧＦ−β量と、該物質を添加したときの、細胞に結合するＬＡＰの部分断片量または活性型ＴＧＦ−β量とを比較し、その差異から、該化合物の、ＬＡＰの部分断片とＴＧＦ−βを発現する細胞との結合阻害活性を評価することができる。該結合阻害活性を有する物質をＴＧＦ−βの活性化を抑制する目的物質として選択する。目的物質の選択は、例えば、添加濃度１ｍｍｏｌ／ｌで、対象となる化合物を添加しない場合の活性型ＴＧＦ−β量に対し、添加した場合の活性型ＴＧＦ−β量が１０％以上減少の認められる物質を選択することにより行うことができる。
【００８９】
本発明のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質は潜在型ＴＧＦ−βの活性化を抑制することから、潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤として用いることができ、ＴＧＦ−βが関与する各種疾患の治療薬として用いることができる。
ＴＧＦ−βが関与する疾患としては、例えば、癌、ＩｇＡ腎症、巣状および分節性糸球体腎炎、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＨＩＶ腎症、Ｃ型肝炎、アルコール性および自己免疫性肝線維症、ブレオマイシン誘発性および突発性肺線維症、全身性硬化症、骨髄線維症、増殖性硝子体網膜症、クローン病、好酸球増多筋肉痛症候群、肝硬変、梗塞後心線維症、手術後腹内癒着、血行再建術後再狭窄、高血圧性血管障害、移植腎拒絶、ケロイド、肥厚性火傷瘢痕、眼内線維症、リウマチ性関節炎、鼻ポリープ等があげられる。本発明のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質は、上記のＴＧＦ−βが関与するいずれの疾患の治療にも用いることができるが、好ましくは、動脈硬化症、癌、炎症、線維症の治療に用いることができる。
【００９０】
本発明のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【００９１】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【００９２】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【００９３】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は本発明のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【００９４】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療の効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質が抗ビメンチン抗体もしくは該抗体断片またはそれらの誘導体である場合、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
以下に本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【００９５】
抗ビメンチン抗体によるビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合阻害（１）
本試験は安部（Ａｂｅ）らの方法［エンドセリウム（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）９，２５−３６（２００２）］に従って行った。また、本実験で使用したペプチドのビオチン化は国際公開第９８／５１７０４号に記載の方法に従った。
すなわち、１０％ＦＢＳ、４ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン、１０μｇ／ｍｌのカナマイシン（明治製菓社製）を含むＤＭＥＭ培地に懸濁したウシ血管内皮細胞（以下、ＢＡＥＣという。）を９６穴黒色プレート（コーニング・コースター社製）に、１穴あたり２．０×１０４個ずつ播種し、５％ＣＯ２条件下３７℃で１日間培養した後に、以下の実験に供した。
【００９６】
細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体（ＶＩＭ３Ｂ４、ＰＲＯＧＥＮ社製）で３７℃３０分間インキュベートし、その後、配列番号１５で表されるペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５）または配列番号１７で表されるビオチン化ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ）および０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地を、各ペプチドの最終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。次にＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで５００倍希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（アマシャム社製）を１穴あたり１００μｌ加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。その後ＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌのＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（アマシャム社製）を加えて、ルミネセンサーＪＮＲ（アトー社製）により各ウェルの発光強度を測定した。
【００９７】
結果を図１に示す。図１から明らかなように、Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎは細胞表面に結合し、その結合は抗ビメンチン抗体により抑制された。
【実施例２】
【００９８】
抗ビメンチン抗体によるＴＧＦ−β活性化抑制
本試験は安部（Ａｂｅ）らの方法［エンドセリウム（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）９，２５−３６（２００２）］に従って行った。
すなわち、ＢＡＥＣを３５ｍｍディッシュに播種し、コンフルエントになるまで培養した。配列番号１５で表されるペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５）または配列番号１８で表されるペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２１）を０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地中に最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように調製し、細胞に添加して３７℃で６時間プレインキュベートした。その後、剃刀で一部の細胞を剥ぎ取り、ＰＢＳで洗浄してからプレインキュベート時と同組成の培地で２４時間インキュベートした。プレインキュベート時および剥ぎ取り後のインキュベート時には、各ペプチドに加えて５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体（Ｖ９、Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒｓ社製）またはマウスＩｇＧ１抗体（Ａｎｃｅｌｌ社製）をそれぞれ添加し、剥ぎ取った領域に遊走してくる細胞数に対する各抗体の影響を調べた。該細胞数は、剥ぎ取り後２４時間に位相差顕微鏡下で計数した。
【００９９】
結果を図２に示す。図２から明らかなように、Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５を添加することにより遊走細胞数が減少した。これはＰｅｐｔｉｄｅ−２５が潜在型ＴＧＦ−βの活性化を促進したことにより、ＴＧＦ−βによる細胞遊走阻害作用が増強されたためである。一方、Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５に加えて抗ビメンチン抗体を添加した場合、遊走細胞数が有意に増加したことから、抗ビメンチン抗体がＰｅｐｔｉｄｅ−２５の潜在型ＴＧＦ−βの活性化を抑制することが明らかとなった。なお、潜在型ＴＧＦ−β活性化能を有さないＰｅｐｔｉｄｅ−２１を添加した場合は、細胞遊走数に変化は見られず、そこに抗ビメンチン抗体を添加しても何ら変化は見られなかった。
【実施例３】
【０１００】
抗ビメンチン抗体によるビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合阻害（２）
実施例１と同様の方法で、参考例で作製した抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体ＫＭ３５６５のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合阻害活性を評価した。本実施例においては、実施例１におけるＶＩＭ３Ｂ４の代りに、５μｇ／ｍｌのＫＭ３５６５または陰性対照として同濃度の抗Ｇ−ＣＳＦ変異体抗体ＫＭ５１１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（４），１０９５−１１０１，１９８９）のいずれかを添加した。
結果を図３に示す。図３から明らかなように、ＫＭ３５６５はＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎの細胞表面への結合を抑制した。
【０１０１】
参考例
抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体の作製
（１）抗原ペプチドの調製
（１−１）化合物１（ヒトビメンチン部分ペプチド：配列番号１９）の合成
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１３８巻，９頁（１９８４年）〕に従った。
【０１０２】
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸
Ａｓｘ：Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−アスパラギン
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｘ：Ｌ−グルタミン酸またはＬ−グルタミン
Ｇｌｙ：グリシン
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン
Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン
【０１０３】
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基または側鎖保護アミノ酸を表す。
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｔ−Ｂｕ：ｔ−ブチル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎγ−トリチル−Ｌ−アスパラギン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｇ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル−Ｌ−アルギニン
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−チロシン
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン
【０１０４】
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
【０１０５】
アミドリンカー１６．５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）３０ｍｇを自動合成機（島津製作所ＰＳＳＭ−８）の反応容器に入れ、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
（ａ）担体樹脂を５００μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出した
（ｂ）３０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液８５８μｌを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｃ）担体樹脂を５００μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
（ｄ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ（１６５μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１６５μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ １水和物（１６５μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３３０μｍｏｌ）をＤＭＦ（８５８μｌ）中で３分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を３０分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｅ）担体樹脂を８５８μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、これを５回繰り返した。こうして、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−アミドを担体上に合成した。
【０１０６】
次に（ｂ）、（ｃ）のＦｍｏｃ基脱保護工程および洗浄工程を行い、Ｆｍｏｃ基を除去したＨ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−アミドの結合した担体樹脂を得た。
次に、（ｄ）の工程でＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｅ）の洗浄工程、次いで（ｂ）、（ｃ）の脱保護、洗浄工程を経て、Ｈ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−アミドを担体上に合成した。以下、工程（ｄ）において、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを順次用いて、（ｄ）、（ｅ）、（ｂ）、（ｃ）の順に工程を繰り返した。最後にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いて（ｄ）、（ｅ）の操作を２度繰り返した後に、（ａ）、（ｂ）の操作を行った。
【０１０７】
得られた樹脂をメタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、ＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、エチルメチルスルフィド（３％）、１，２−エタンジチオール（２．５％）およびチオフェノール（２％）からなる混合溶液６００μｌを加えて室温で８時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約１０ｍｌを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチド４２．７ｍｇを取得した。この粗ペプチドを酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ３０ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ２５ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。０．１％ＴＦＡ水溶液に、ＴＦＡ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を８．４ｍｇ得た。化合物１の物理化学的性質は以下の通りである。
質量分析［ＴＯＦ−ＭＳ］；ｍ／ｚ＝２４９７．２５（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ｇｌｘ ６．０（６），Ａｓｘ ３．７（４），Ａｒｇ １．１（１），Ｔｈｒ １．０（１），Ａｌａ １．０（１），Ｉｌｅ １．９（２），Ｌｅｕ １．１（１），Ｌｙｓ ０．９（１），Ｔｙｒ ０．９（１），Ｍｅｔ ０．９（１），Ｇｌｙ １．３（１），Ｃｙｓ １．４（１）
【０１０８】
（１−２）化合物２（対照ペプチド：配列番号２０）の合成
アミドリンカー１６．５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）３０ｍｇを出発物質とし、（１−１）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。（１−１）と同様にして側鎖保護基の切断および樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド３８．７ｍｇを取得した。これを（１−１）と同様に精製し、化合物２を４．７ｍｇ得た。化合物２の物理化学的性質は以下の通りである。
質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）；ｍ／ｚ＝２２０３．１９（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析：アミノ酸分析；Ｇｌｘ ３．１（３），Ａｒｇ １．９（２），Ｔｈｒ ０．９（１），Ｓｅｒ １．９（２），Ｉｌｅ １．０（１），Ｌｅｕ ４．１（４），Ｌｙｓ ０．９（１），Ｔｙｒ ０．９（１），Ｇｌｙ １．１（１），Ｐｒｏ ２．２（２），Ｃｙｓ １．１（１）
【０１０９】
（２）免疫原の調製
上記（１）で得られたヒトビメンチン部分ペプチドは、免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（カルビオケム社）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌに調整し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ ＭＢＳ（ナカライテスク社）を滴下して３０分間撹拌反応させた。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢＳ ２．５ｍｇを０．１Ｍりん酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、反応物をＰＢＳで透析し、ヒトビメンチン部分ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを得た。
【０１１０】
（３）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（２）で調製したヒトビメンチン部分ペプチド−ＫＬＨコンジュゲート１００μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに５週令雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に投与し、２週間後より１００μｇの該コンジュゲートを１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、血清抗体価を下記（４）に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄したものを細胞融合に用いた。
【０１１１】
（４）酵素免疫測定法
アッセイ用の抗原には上記（１）で得られたヒトビメンチン部分ペプチドとサイログロブリン（以下、ＴＨＹと略す）とのコンジュゲートを用いた。該コンジュゲートは、架橋剤としてＭＢＳの代わりにＳＭＣＣ（シグマ社）を用いた以外、上記（２）と同様の方法により作製した。
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上記コンジュゲートを１０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）−ＰＢＳを１００μｌ／穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。
１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、被免疫マウス抗血清、抗ビメンチンモノクローナル抗体の培養上清または精製モノクローナル抗体を５０μｌ／穴で分注し２時間反応させた。
０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社）を５０μｌ／穴で加えて室温、１時間反応させ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後ＡＢＴＳ基質液［２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させ、ＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）にて測定した。
【０１１２】
（５）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（６）ハイブリドーマの作製
上記（３）で得られたマウス脾細胞と上記（５）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液を０．２〜１ｍｌ／１０８マウス脾細胞となるように加えて３７℃で攪拌した。１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。９００ｒｐｍで５分遠心分離した後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み・吸出しを繰り返し、細胞をＨＡＴ培地１００ｍｌ中に懸濁した。
【０１１３】
この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間、ＣＯ２５％条件下で培養した。この培養上清を上記（４）に記載した酵素免疫測定法で調べ、ヒトビメンチン部分ペプチド（化合物１）に反応して対照ペプチド（化合物２）に反応しない穴を選び、ＨＡＴ培地を正常培地に換えて２回クローニングを繰り返し、抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
以上の結果、化合物１に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体ＫＭ３５６５を産生するハイブリドーマ株ＫＭ３５６５を取得した。なお、ハイブリドーマ株ＫＭ３５６５はＫＭ３５６５の株名で、平成１７年４月１９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０３２４として寄託されている。
また、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５の抗体クラスは抗体クラス特異的な標識化抗体を用いた酵素免疫測定法によりＩｇＧ３と決定された。
【０１１４】
（７）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に上記（６）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹で腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、３，０００ｒｐｍで５分遠心分離して固形分を除去した。得られた上清をカプリル酸沈殿法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕により精製し、精製モノクローナル抗体を得た。
【０１１５】
（８）モノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン部分ペプチドとの反応性（酵素免疫測定法）
上記（６）で選択された抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン部分ペプチドとの反応性を、上記（４）の酵素免疫測定法にて調べた。図４に示すように、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５は化合物１特異的に抗体濃度依存的な反応性を示した。
（９）モノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン蛋白との反応性（酵素免疫測定法）
上記（６）で選択された抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン蛋白との反応性を上記（４）の酵素免疫測定法にて調べた。大腸菌で発現させたヒトビメンチン蛋白（ＰＲＯＧＥＮ社）を添付のデータシート記載の方法に従って蒸留水にて溶解後、ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈してプレートに固層化した。陰性対照抗原として大腸菌由来夾雑蛋白をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈してプレートに固層化したものを用いた。図５に示すように、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５はビメンチン特異的に抗体濃度依存的な反応性を示した。
【０１１６】
（１０）ウェスタンブロッティング
上記（６）で選択された抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン蛋白との反応性をウエスタンブロッティングにて調べた。
大腸菌で発現させたヒトビメンチン蛋白、または大腸菌由来夾雑蛋白を０．１μｇ／レーンでＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕にて分画後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、１次抗体としてＫＭ３５６５のハイブリドーマ培養上清原液、市販の抗ビメンチン抗体２種（ＰＲＯＧＥＮ社製ＶＩＭ３Ｂ４およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製Ｖ９、いずれも精製抗体５μｇ／ｍｌ）、および陰性対照抗体としてＫＭ５１１（抗Ｇ−ＣＳＦ変異体抗体、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（４），１０９５−１１０１，１９８９、５μｇ／ｍｌ）を室温で２時間反応させた。０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ社製）を室温で１時間反応させた。
０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、ＥＣＬ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャム社）による反応を行った。
その結果、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５は、市販抗体と同様、ビメンチン蛋白に特異的な反応性を示した。
【０１１７】
（１１）モノクローナル抗体ＫＭ３５６５と市販抗ビメンチン抗体との認識エピトープの異同
市販抗ビメンチン抗体２種（ＰＲＯＧＥＮ社製ＶＩＭ３Ｂ４およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製Ｖ９）とモノクローナル抗体ＫＭ３５６５の認識エピトープの異同を検討する目的で、該市販抗体の化合物１に対する反応性を上記（４）の酵素免疫測定法にて調べた。その結果、図６に示すように該市販抗体はいずれもビメンチン蛋白に反応性を有するが、化合物１に対する反応性を示さなかったことから、これらの抗体はビメンチン蛋白上のモノクローナル抗体ＫＭ３５６５とは異なる別のエピトープを認識していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明により、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤、またはＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法が提供される。本発明のＴＧＦ−βの活性化抑制剤は、ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬として利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１９】
配列番号１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号３−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号４−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号５−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号６−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号７−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号８−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号９−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１０−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１３−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１４−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１５−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１６−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１７−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１８−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１９−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２０−人工配列の説明：合成ペプチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潜在型トランスフォーミング・グロース・ファクター−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β、以下「ＴＧＦ−β」という。）の活性化抑制剤、ＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法、およびＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−βは、細胞増殖・分化、細胞外マトリックス合成、アポトーシス、免疫機能などの制御等、多彩な生理活性を有するサイトカインとして知られており、その機能不全は、ヒトの病態、例えば癌、組織の線維化、自己免疫疾患等に関連していることが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
ＴＧＦ−βは不活性の潜在型分子として分泌されるため、生理作用を発揮するためには細胞から分泌された後に活性化を受ける必要がある（非特許文献２参照）。潜在型ＴＧＦ−βの活性化段階を制御することはＴＧＦ−βの活性を制御することにつながることから、その活性化機構が精力的に研究されている。これまでに、プロテアーゼによる潜在型ＴＧＦ−βの限定分解を介した機構、細胞表面分子への結合に伴う構造変化を介した機構、またはその両者を組み合わせた機構等が報告されている。例えば、潜在型ＴＧＦ−βを限定分解するプロテアーゼとして、プラスミン（非特許文献３参照）、マトリックスメタロプロテアーゼ（非特許文献４参照）等が報告されている。潜在型ＴＧＦ−βが結合し、その構造を変化させる細胞表面分子として、トロンボスポンジン−１（非特許文献５参照）、インテグリンαｖβ６（非特許文献６参照）等が報告されている。インテグリンαｖβ８への結合とそれに伴う構造変化により、マトリックスメタロプロテアーゼによる限定分解が生じるという機構も報告されている（非特許文献７参照）。
【０００４】
一方、潜在型ＴＧＦ−βを構成するタンパク質であるラテンシー・アソシエイテッド・ペプチド（Ｌａｔｅｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下「ＬＡＰ」という。）の部分断片が、潜在型ＴＧＦ−βの活性化を促進すること、該部分断片が血管内皮細胞の表面に結合することが報告されている（非特許文献８参照）。
【０００５】
ビメンチンは、多くの種類の細胞に存在する中間径フィラメントのサブユニットタンパク質であり、ビメンチン繊維として細胞質に網目状構造で存在する。ビメンチンに結合する物質としては、抗ビメンチンモノクローナル抗体が知られている。抗ビメンチンモノクローナル抗体ＶＩＭ３Ｂ４は、げっ歯類以外の哺乳動物のビメンチンに結合し、その認識部位はビメンチンの第二ロッド領域であることが報告されている（非特許文献９参照）。また、抗ビメンチンモノクローナル抗体Ｖ９（非特許文献９参照）は、ヒトマクロファージの活性化に伴い細胞表面または細胞外に分泌されるビメンチンに結合し得ることが報告されている（非特許文献１０参照）。
【０００６】
【非特許文献１】「ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２０００年、第３４２巻、ｐ．１３５０−１３５８
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００３年、第１１６巻、ｐ．２１７−２２４
【非特許文献３】「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９８９年、第１０９巻、ｐ．３０９−３１５
【非特許文献４】「ジーンズ・アンド・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２０００年、第１４巻、ｐ．１６３−１７６
【非特許文献５】「サイトカイン・アンド・グロース・ファクター・レビュー（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗ）１１，５９−６９（２０００）」、２０００年、第１１巻、ｐ．５９−６９
【非特許文献６】「セル（Ｃｅｌｌ）」、１９９９年、第９６巻、ｐ．３１９−３２８
【非特許文献７】「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第１５７巻、ｐ．４９３−５０７
【非特許文献８】「エンドセリウム（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」、２００２年、第９巻、ｐ．２５−３６
【非特許文献９】「エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９２年、第２０１巻、ｐ．１−７
【非特許文献１０】「ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第５巻、ｐ．５９−６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤、ＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法、またはＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤。
（２）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質が、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する活性を有する抗ビメンチン抗体または該抗体断片である、上記（１）のＴＧＦ−β活性化抑制剤。
（３）ＬＡＰの部分断片が配列番号１〜１６のいずれかで表されろアミノ酸配列を有するペプチドである、上記（１）または（２）のいずれか１つのＴＧＦ−β活性化抑制剤。
（４）（ｉ）ＬＡＰの部分断片を、ビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞に添加して、該細胞に結合する該部分断片量を測定すること、
（ｉｉ）ＬＡＰの部分断片およびスクリーニングの対象となる物質を、ビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞に添加して、該細胞に結合する該部分断片量を測定すること、
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の測定量から、該物質の、ＬＡＰの部分断片とＴＧＦ−βを発現する細胞との結合阻害活性を評価すること、
（ｉｖ）該結合阻害活性を有する物質をＴＧＦ−β活性化抑制物質として選択すること、
からなるＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法。
（５）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬。
（６）ＴＧＦ−βが関与する疾患が動脈硬化症、癌、炎症、線維症である、上記（５）の治療薬。
（７）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を被験体に投与する工程を包含するＴＧＦ−β活性化抑制方法。
（８）ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を被験体に投与する工程を包含するＴＧＦ−βが関与する疾患の治療方法。
（９）ＴＧＦ−β活性化抑制剤の製造のための、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質の使用。
（１０）ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬の製造のための、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤、またはＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法が提供される。本発明のＴＧＦ−βの活性化抑制剤は、ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＢＡＥＣに対する潜在型ＴＧＦ−β活性化ペプチドの結合度（ＲＬＵ／ウェル）を示す図である。「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋Ａｂ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体ＶＩＭ３Ｂ４、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ＋Ａｂ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎおよび５μｇ／ｍｌのＶＩＭ３Ｂ４をそれぞれ添加した場合の結合度を示す。＊＊は、スチューデントのｔ検定において、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図２】図２は、ＢＡＥＣを剃刀で剥離した後、剥離部分に遊走してきた観察視野当たりの細胞数（個／ＨＰＦ）を示す図である。「Ｃｏｎｔｒｏｌ＋ＮＩ」のカラムは５μｇ／ｍｌの非免疫マウスＩｇＧ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２１＋ＮＩ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２１および５μｇ／ｍｌのＩｇＧ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２１＋Ａｂ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２１および５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体Ｖ９、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋ＮＩ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌのＩｇＧ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋Ａｂ」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌのＶ９をそれぞれ添加した場合の細胞数を示す。＊および＊＊は、スチューデントのｔ検定において、それぞれ危険率５％および１％未満で有意差があることを示す。
【図３】図３は、ＢＡＥＣに対する潜在型ＴＧＦ−β活性化ペプチドの結合度（ＲＬＵ／ｗｅｌｌ）を示す図である。「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋ＫＭ５１１」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌの抗Ｇ−ＣＳＦ変異体抗体ＫＭ５１１、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５＋ＫＭ３５６５」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５および５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体ＫＭ３５６５、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ＋ＫＭ５１１」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎおよび５μｇ／ｍｌのＫＭ５１１、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ＋ＫＭ３５６５」のカラムは１００μｇ／ｍｌのＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎおよび５μｇ／ｍｌのＫＭ３５６５をそれぞれ添加した場合の結合度を示す。＊＊は、スチューデントのｔ検定において、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図４】図４は、酵素免疫測定法により測定した、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン部分ペプチドに対する反応性を示す図である。上段が化合物１を、下段が化合物２を、それぞれ固層化したプレートを用いた測定結果を示す。Ｘ軸は添加したＫＭ３５６５の濃度を、Ｙ軸は抗体の結合度を表す吸光度をそれぞれ示す。
【図５】図５は、酵素免疫測定法により測定した、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン蛋白に対する反応性を示す図である。上段がビメンチン蛋白を、下段が大腸菌由来夾雑蛋白を、それぞれ固層化したプレートを用いた測定結果を示す。Ｘ軸は添加したＫＭ３５６５の濃度を、Ｙ軸は抗体の結合度を表す吸光度をそれぞれ示す。
【図６】図６は、酵素免疫測定法により測定した、市販抗ビメンチン抗体（▲；ＶＩＭ３Ｂ４、■；Ｖ９）の化合物１およびビメンチン蛋白に対する反応性を示す図である。上段が化合物１を、下段がビメンチン蛋白を、それぞれ固層化したプレートを用いた測定結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質としては、該阻害活性を有する物質であれば、合成化合物でも天然物質でも特に制限なく用いることができるが、好ましくは、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する活性を有する抗ビメンチン抗体もしくは該抗体断片またはそれらの誘導体が用いられる。
抗ビメンチン抗体もしくは該抗体断片またはそれらの誘導体のうち、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する活性を有するものの選択方法としては、後述の、本発明のＴＧＦ−βの活性化を抑制する物質のスクリーニング方法を用いることができる。
本発明に用いる抗ビメンチン抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。
【００１２】
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体等があげられる。
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞である。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下「ＣＤＲ」という。）移植抗体等があげられる。
【００１３】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域として「ＨＶ」または「ＶＨ」ともいう。）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖として「ＬＶ」または「ＶＬ」ともいう。）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域として「ＣＨ」ともいう。）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下「ＣＬ」ともいう。）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００１４】
本発明に用いるヒト型キメラ抗体は、ビメンチンに特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下「ｈＩｇ」という。）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００１５】
ヒト型キメラＬ鎖とは、ヒト以外の動物のＶＬとヒト抗体のＣＬとからなる抗体Ｌ鎖を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明に用いるヒト型キメラＬ鎖は、ビメンチンに特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型キメラＬ鎖発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラＬ鎖のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００１６】
ヒト型キメラＨ鎖とは、ヒト以外の動物のＶＨとヒト抗体のＣＨとからなる抗体Ｈ鎖を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００１７】
本発明に用いるヒト型キメラＨ鎖は、ビメンチンに特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型キメラＨ鎖発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラＨ鎖のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
【００１８】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
本発明に用いるヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ビメンチンに特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００１９】
本発明に用いるヒト型ＣＤＲ移植キメラＬ鎖は、ビメンチンに特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型ＣＤＲ移植キメラＬ鎖発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植キメラＬ鎖を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植キメラＬ鎖のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００２０】
本発明に用いるヒト型ＣＤＲ移植キメラＨ鎖は、ビメンチンに特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨのＣＤＲ配列に移植したＨ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型ＣＤＲ移植キメラＨ鎖発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植キメラＨ鎖を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
【００２１】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
【００２２】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇの略）、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００２３】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
【００２４】
本発明に用いる抗体または抗体のＬ鎖もしくはＨ鎖の部分断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ、以下「ｓｃＦｖ」という。）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ、以下「ｄｓＦｖ」という。）、ＣＤＲを含むペプチド等があげられる。
【００２５】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分のアミノ酸とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明に用いるＦａｂは、ビメンチンに特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物もしくは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
【００２６】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明に用いるＦ（ａｂ’）２は、ビメンチンに特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合もしくはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明に用いるＦａｂ’は、ビメンチンに特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物もしくは真核生物へ導入することによりＦａｂ’を発現させ、製造することができる。
【００２７】
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下「Ｐ」という。）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明に用いるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
本発明に用いるｓｃＦｖは、ビメンチンに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００２８】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明に用いるｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００２９】
本発明に用いるｄｓＦｖは、ビメンチンに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００３０】
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明に用いるＣＤＲを含むペプチドは、ビメンチンに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００３１】
本発明に用いる抗体の誘導体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらの抗体断片に放射性同位元素、蛋白質または低分子の化合物等を結合させた抗体の誘導体等があげられる。
本発明に用いる抗体の誘導体は、ビメンチンに特異的に反応する抗体または抗体断片のＨ鎖もしくはＬ鎖のＮ末端側もしくはＣ末端側、抗体または抗体断片中の適当な置換基もしくは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、蛋白質もしくは低分子の化合物等を化学的手法［抗体工学入門（金光修著１９９４年（株）地人書館）］により結合させることにより製造することができる。
【００３２】
または、ビメンチンに特異的に反応する抗体もしくは抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入する、遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
放射性同位元素としては、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ等があげられ、例えば、クロラミンＴ法等により、抗体に結合させることができる。
【００３３】
低分子の薬剤としては、ハイドロコーチゾン、プレドニゾン等のステロイド剤、アスピリン、インドメタシン等の非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミン等の免疫調節剤、アドリアマイシン、ダウノマイシン等の免疫抑制作用を有する抗癌剤、サイクロスポリン、ＦＫ５０６、サイクロフォスファミド、アザチオプリン等の免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤［炎症と抗炎症療法昭和５７年 医歯薬出版株式会社］等があげられる。
【００３４】
例えば、ダウノマイシンと抗体とを結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
【００３５】
蛋白質としては、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等があげられる。
蛋白質と抗体とを結合させる方法としては、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより蛋白質と抗体が融合した融合抗体を発現させる方法等があげられる。
【００３６】
以下、ビメンチンに反応するポリクローナル抗体の作製方法について記す。
ビメンチンをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して形質転換株を作製し、該形質転換株を培養・精製することにより、リコンビナントビメンチンを得る。または、ヒト血管内皮細胞、例えば臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ社製）等を培養・精製することによりビメンチンを得る。これらのビメンチン、ビメンチンの部分断片ポリペプチドの精製標品、またはビメンチンの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原に用いる。
【００３７】
これら抗原はそのまま、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、メチル化牛血清アルブミン（メチル化ＢＳＡ）、牛チログロブリン（ＴＨＹ）等の分子量の大きいキャリアタンパク質と結合させて投与する。
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよい。下記に、マウスおよびラットを用いる例について説明する。
【００３８】
３〜２０週令のマウスまたはラットに、上記方法で調製した抗原を免疫し、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバンドとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。各投与後３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢または尾静脈より採血し、免疫に用いた抗原に対しての反応性について、酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
【００３９】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清よりポリクローナル抗体を分離、精製する。
ポリクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕｍｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡもしくはＧ−カラム、ゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
【００４０】
以下、ビメンチンに反応するモノクローナル抗体の作製方法について記す。
１．抗ビメンチンモノクローナル抗体の作製
（１）抗体産生細胞の調製
免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウスまたはラットより公知の方法［アンティボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリングハーバー・ラボラトリー（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、以下「アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル」という。］に準じて脾臓を摘出し、脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
【００４１】
（２）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］等、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【００４２】
（３）細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁させる。細胞の洗浄にはＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、塩化ナトリウム７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）等を用いる。また、融合細胞を懸濁させる培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地｛正常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地］にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／ｌ）を加えた培地｝を用いる。
培養後、培養上清の一部をとり、酵素免疫測定法により、抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００４３】
（４）抗ビメンチンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの選択
抗ビメンチンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアルに述べられている方法等に従い、以下に述べる測定法により行う。これらの方法により、後述する抗ビメンチンヒト化抗体、該抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗ビメンチン抗体またはすべての精製抗ビメンチン抗体の結合活性を測定することができる。
【００４４】
酵素免疫測定法
抗原または抗原を発現した細胞等を９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清または上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、第一抗体のイムノグロブリンを認識できる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【００４５】
（５）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、１（３）で得られた抗ビメンチンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０７〜５×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムまたはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラムなどを用いて、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキット等を用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられる。
【００４６】
（６）抗ビメンチンモノクローナル抗体の反応性
抗ビメンチンモノクローナル抗体の反応性を調べる方法として、インヒビションＥＬＩＳＡがあげられる。
まず、１（４）に記したように抗原を固相化したプレートを準備し、第一抗体として抗ビメンチンモノクローナル抗体を反応させる。同時に適当に希釈したビメンチンを加えプレートに固相化したビメンチンと競合させる。その後は１（４）に示した方法と同様に検出することができる。抗ビメンチンモノクローナル抗体がビメンチンと反応する場合には、液相系で加えたビメンチン濃度依存的に固相化ビメンチンへの結合が阻害され、ＯＤ値が低下する。
【００４７】
２．ヒト化抗体の作製方法（Ｉ）−抗ビメンチンヒト化抗体の作製方法
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発現用ベクターを構築する。ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣ領域であるＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれ挿入することにより構築されたものである。
【００４８】
ヒト抗体のＣ領域としては、例えば、ヒト抗体Ｈ鎖ではＣγ１やＣγ４、ヒト抗体Ｌ鎖ではＣκ等の任意のヒト抗体のＣ領域を用いることができる。ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンより成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。
【００４９】
例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ β ｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）］、および免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
【００５０】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖が別々のベクター上に存在するタイプまたは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築のしやすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］。
【００５１】
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗ビメンチンモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。
抗ビメンチンモノクローナル抗体を産生する細胞、例えば、マウスビメンチン抗体産生ハイブリドーマ等よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを、ファージまたはプラスミドなどのベクターに挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミド、およびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とする抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
【００５２】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
前記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、キメラ抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にあらかじめヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングするための制限酵素の認識配列を設けておき、このクローニングサイトにヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡを下記に述べる合成ＤＮＡを介して挿入することにより、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを製造することができる。合成ＤＮＡは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣ領域の５’末端側の塩基配列とからなるものであり、両端に適当な制限酵素部位を有するようにＤＮＡ合成機を用いて製造する。
【００５３】
（４）ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲ配列の同定
抗体の抗原結合部位を形成するＶＨおよびＶＬは、配列の比較的保存された４個のフレームワーク領域（以下、ＦＲ領域と称す）とそれらを連結する配列の変化に富んだ３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）から成っている［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９９１）、以下「シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト」という。］。そして各ＣＤＲアミノ酸配列（ＣＤＲ配列）は、既知の抗体のＶ領域のアミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより同定することができる。
【００５４】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のＣＤＲを移植するためのヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列をＶＨ、ＶＬそれぞれについて選択する。ヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列であればいかなるものでも用いることができる。
【００５５】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに登録されているヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）があげられるが、充分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を創製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列と高い相同性、好ましくは６０％以上の相同性を有することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を連結させて、ＶＨ、ＶＬそれぞれのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。ＣＤＲ移植抗体可変領域遺伝子を構築するために設計したＤＮＡ配列を得るためには、全ＤＮＡ配列をカバーするように各鎖について数本の合成ＤＮＡを設計し、それらを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下「ＰＣＲ」という。）を行う。ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから各鎖について、好ましくは、６本の合成ＤＮＡを設計する。反応後、増幅断片を適当なベクターにサブクローニングし、その塩基配列を決定し、目的のヒト型ＣＤＲ移植抗体の各鎖のＶ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを取得する。また、約１００塩基よりなる合成ＤＮＡを用いてセンス、アンチセンスともに全配列を合成し、それらをアニーリング、連結することで、目的のヒト型ＣＤＲ移植抗体の各鎖のＶ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築することもできる。
【００５６】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のＣＤＲのみをヒト抗体のＶ領域のＦＲ間に、単純に移植しただけでは、その活性はもとのヒト以外の動物の抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。そこでヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列のうち、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用をしているアミノ酸残基、または抗体の立体構造の維持に関与している等の可能性を有するアミノ酸残基をもとのヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、活性を上昇させることが行われている。そして、それらのアミノ酸残基を効率よく同定するため、Ｘ線結晶解析あるいはコンピューターモデリング等を用いた抗体の立体構造の構築および解析を行っている。しかし、いかなる抗体にも適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の製造法は未だ確立されておらず、現状では個々の抗体によって種々の試行錯誤が必要である。
【００５７】
選択したヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列の改変は各種の変異導入プライマーを用いて前記２（５）に記載のＰＣＲを行うことにより達成できる。ＰＣＲ後の増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたｃＤＮＡを含むベクター（以下「アミノ酸配列改変ベクター」という。）を取得する。
また、狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、２０〜３５塩基からなる変異導入プライマーを用いたＰＣＲ変異導入法により行うことができる。具体的には、改変後のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を含む２０〜３５塩基からなるセンス変異プライマーおよびアンチセンス変異プライマーを合成し、改変すべきＶ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として２段階のＰＣＲを行う。最終増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたｃＤＮＡを含むアミノ酸配列改変ベクターを取得する。
【００５８】
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
前記２（１）のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子の上流に、前記２（５）および２（６）で取得したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築するためのＰＣＲの際に５’末端および３’末端の合成ＤＮＡの末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、所望のヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入することができる。
【００５９】
（８）ヒト化抗体の一過性（トランジェント）発現および活性評価
多種類のヒト化抗体の活性を効率的に評価するために、前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクター、および前記２（７）のヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターまたはそれらの改変ベクターをＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）に導入してヒト化抗体の一過性発現［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ２８３（１９９１）］を行い、その活性を測定することができる。
ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ２８３（１９９１）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等があげられる。
ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の活性は前記１（５）に記載の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等により測定することができる。
【００６０】
（９）ヒト化抗体の安定（ステーブル）発現および活性評価
前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクターおよび前記２（７）のヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
【００６１】
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下「ＤＨＦＲ遺伝子」という。）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下「ＹＢ２／０細胞」という。）等があげられる。
【００６２】
ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８およびＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により選択する。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養液中のヒト化抗体の活性は前記１（５）に記載の方法等により測定する。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
【００６３】
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル第８章）。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組合せて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル第１２章）等で測定する。
精製したヒト化抗体の反応性、また、ヒト化抗体のビメンチンに対する結合活性の測定は前記１（４）に記載の方法などにより測定することができる。
【００６４】
３．抗体断片の作製
抗体断片は、上記２に記載のヒト化抗体を元に遺伝子工学的手法または蛋白質化学的手法により、作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチド等があげられる。
【００６５】
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。また、Ｆａｂは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、上記２の（２）および（３）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１，（１９８８）］等があげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体またはペリプラズマ層にＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後または培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
【００６６】
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、上記２（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサン等のようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢで処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
【００６７】
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することができる。例えば、上記２（２）および（３）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６３，（１９９２）］等があげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体またはペリプラズマ層にＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後または菌の破砕液からは、プロテインＧカラム等を用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
【００６８】
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、上記２（２）および（３）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、１２残基以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡを介して連結し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製する。作製したＤＮＡをｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、Ｐｈｆａ［Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，５，４８（１９９４）］等があげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体またはペリプラズマ層にｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後または菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
【００６９】
（５）Ｄｉａｂｏｄｙの作製
Ｄｉａｂｏｄｙは、上記のｓｃＦｖを作製する際のポリペプチドリンカーを３〜１０残基程度にすることで、作製することができる。１種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合には、２価のＤｉａｂｏｄｙを、２種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合は、２特異性を有するＤｉａｂｏｄｙを作製することができる［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５３，１６４（１９９９）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７，７６３（１９９８）］。
【００７０】
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することができる。まず、上記２（２）および（３）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］等があげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体またはペリプラズマ層にＶＨおよびＶＬを生成蓄積させることができる。封入体またはペリプラズマ層からＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、さらに精製することができる［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］。
【００７１】
（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等があげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体またはペリプラズマ層にＣＤＲを含むペプチドを生成蓄積させることができる。封入体またはペリプラズマ層からＣＤＲを含むペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、精製することができる［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］。
【００７２】
４．融合抗体および融合ペプチドの作製方法
本発明で使用される抗体またはペプチドに、放射性同位元素、毒素、サイトカインまたは酵素等の蛋白質、低分子の薬剤等を、化学的または遺伝子工学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドも抗体の誘導体として使用することができる。
【００７３】
抗体またはペプチドと毒素蛋白質とを化学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドは、文献［Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，２００３（１９９１）；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３，３５０（１９９６）］記載の方法等に従って作製することができる。
抗体またはペプチドと、毒素、サイトカインまたは酵素等の蛋白質とを遺伝子工学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドは、文献［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９７４（１９９６）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，７８２６（１９９６）］記載の方法等に従って作製することができる。
【００７４】
抗体またはペプチドと低分子抗癌剤を化学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドは、文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，２１２（１９９３）］記載の方法等に従って作製することができる。
抗体またはペプチドと放射性同位元素を化学的に結合させた融合抗体または融合ペプチドは、文献［Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，３，６０（１９９０）；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，２００３（１９９１）］記載の方法等に従って作製することができる。
【００７５】
これらの誘導体は、抗体分子の特異性に従って放射性同位元素、毒素、サイトカインまたは酵素等の蛋白質、低分子の薬剤等を標的組織周辺に集積させることで、より効果的で副作用の少ない診断または治療を可能にすることが期待されている。
【００７６】
５．ヒト化抗体または抗体断片の活性評価
精製したヒト化抗体の抗原との結合性、ビメンチンに対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ等を用いた表面プラズモン共鳴等により測定できる。
【００７７】
６．本発明に用いる抗体を用いたビメンチンの定量および検出方法
本発明に用いる抗ビメンチン抗体またはその抗体断片を用いる、ビメンチンを免疫学的に定量または検出する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、上記に記した酵素免疫測定法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法［単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７年）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人、１９８６年）］等を用いることができる。
【００７８】
蛍光抗体法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６），単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７）］等に記載された方法を用いて行うことができる。具体的には、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等に、本発明に用いられるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリンなどの蛍光物質でラベルした抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
【００７９】
免疫細胞染色法、免疫組織染色法等の免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６），単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック，１９８７）］等に記載された方法を用いて行うことができる。
免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）は、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等に、本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識等を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【００８０】
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）は、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等に、本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンター等で測定する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法は、生体内から分離された細胞または組織等に、本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
【００８１】
ウェスタンブロッティング法は、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８］で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣ等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、確認する。
【００８２】
免疫沈降法とは、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等を本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等のイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させるものである。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、本発明に用いるモノクローナル抗体またはその抗体断片で、抗原認識部位の異なる２種類のモノクローナル抗体のうち、あらかじめ一方のモノクローナル抗体または抗体断片はプレートに吸着させ、もう一方のモノクローナル抗体または抗体断片はＦＩＴＣ等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素で標識しておく。抗体吸着プレートに、生体内から分離された細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清等を反応後、標識したモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である。
【００８３】
本発明でいうＬＡＰの部分断片としては、細胞表面または細胞外に分泌されるビメンチンに結合し得るＬＡＰの部分断片であればいずれのものも用いることができ、例えば、国際公開第９８／５１７０４号の第２表に記載された化合物１〜１６等を使用することができるが、化合物１５が好ましく使用される。化合物１〜１６のアミノ酸配列を配列番号１〜１６に示す。
【００８４】
以下、本発明のＴＧＦ−βの活性化抑制物質のスクリーニング方法について記す。
本発明のスクリーニング方法の対象となる物質は、合成化合物でも天然物質でも特に制限なく用いることができる。
本発明の方法に使用するＬＡＰの部分断片としては、上記のＬＡＰの部分断片を用いることができる。
【００８５】
本発明の方法に使用するビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞としては、例えば、血管内皮細胞、マクロファージ等があげられる。細胞は、ヒト、ウシ、ブタ、ネズミ等の動物から、単離・精製したもの、またはそれら細胞由来の培養細胞を用いることができる。単離・精製方法としては、例えば、オカダ（Ｏｋａｄａ）らの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０６，３０４（１９８９）］等があげられる。
【００８６】
細胞へのＬＡＰの部分断片の結合は、例えば細胞を培地で培養し該部分断片を添加しインキュベートした後、細胞を洗浄し、細胞に結合している該部分断片を測定することにより行うことができる。
ＬＡＰの部分断片は、例えばクロラミンＴ法［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２，５９９（１９８２）］により１２５Ｉ標識したもの、フルオレセインイソチオシアネート、ＡＭＣＡ、ローダミン６Ｇ、ローダミンレッド−Ｘ、Ｃｙ３、テキサスレッド等の蛍光色素で標識をしたもの等を用いるのが好ましい。これにより、細胞に結合したＬＡＰの部分断片は、それぞれ、放射活性、発光強度等を測定することにより検出および定量することができる。
【００８７】
また、細胞表面上に発現するビメンチンにＬＡＰの部分断片が結合することにより潜在型ＴＧＦ−βが活性化されるので、細胞に結合するＬＡＰの部分断片量の測定は、活性型ＴＧＦ−β量を測定することにより行うこともできる。活性型ＴＧＦ−βの定量法は特に限定されないが、直接抗ＴＧＦ−β抗体を用いた酵素免疫測定方法［メソッヅ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９８，３０３（１９９１）］または安部らのルシフェラーゼ・アッセイ・システム［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２１６，２７６（１９９４）］等で測定することができる。また、血管内皮細胞の遊走度［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２３，１２４９（１９９３）］、血管平滑筋細胞の増殖［トウホク・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｔｏｈｏｋｕ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１７９，２３（１９９６）］、各種癌細胞の増殖阻害［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ），８７，２７７（１９９１），エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ），１２８，１９８１（１９９１）］、ミンク肺上皮細胞の増殖阻害［メソッヅ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９８，３１７（１９９１）］等の方法で測定することができる。
【００８８】
スクリーニングの対象となる物質を添加しないときの、細胞に結合するＬＡＰの部分断片量または活性型ＴＧＦ−β量と、該物質を添加したときの、細胞に結合するＬＡＰの部分断片量または活性型ＴＧＦ−β量とを比較し、その差異から、該化合物の、ＬＡＰの部分断片とＴＧＦ−βを発現する細胞との結合阻害活性を評価することができる。該結合阻害活性を有する物質をＴＧＦ−βの活性化を抑制する目的物質として選択する。目的物質の選択は、例えば、添加濃度１ｍｍｏｌ／ｌで、対象となる化合物を添加しない場合の活性型ＴＧＦ−β量に対し、添加した場合の活性型ＴＧＦ−β量が１０％以上減少の認められる物質を選択することにより行うことができる。
【００８９】
本発明のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質は潜在型ＴＧＦ−βの活性化を抑制することから、潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤として用いることができ、ＴＧＦ−βが関与する各種疾患の治療薬として用いることができる。
ＴＧＦ−βが関与する疾患としては、例えば、癌、ＩｇＡ腎症、巣状および分節性糸球体腎炎、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＨＩＶ腎症、Ｃ型肝炎、アルコール性および自己免疫性肝線維症、ブレオマイシン誘発性および突発性肺線維症、全身性硬化症、骨髄線維症、増殖性硝子体網膜症、クローン病、好酸球増多筋肉痛症候群、肝硬変、梗塞後心線維症、手術後腹内癒着、血行再建術後再狭窄、高血圧性血管障害、移植腎拒絶、ケロイド、肥厚性火傷瘢痕、眼内線維症、リウマチ性関節炎、鼻ポリープ等があげられる。本発明のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質は、上記のＴＧＦ−βが関与するいずれの疾患の治療にも用いることができるが、好ましくは、動脈硬化症、癌、炎症、線維症の治療に用いることができる。
【００９０】
本発明のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【００９１】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【００９２】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【００９３】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は本発明のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【００９４】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療の効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質が抗ビメンチン抗体もしくは該抗体断片またはそれらの誘導体である場合、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
以下に本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【００９５】
抗ビメンチン抗体によるビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合阻害（１）
本試験は安部（Ａｂｅ）らの方法［エンドセリウム（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）９，２５−３６（２００２）］に従って行った。また、本実験で使用したペプチドのビオチン化は国際公開第９８／５１７０４号に記載の方法に従った。
すなわち、１０％ＦＢＳ、４ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン、１０μｇ／ｍｌのカナマイシン（明治製菓社製）を含むＤＭＥＭ培地に懸濁したウシ血管内皮細胞（以下、ＢＡＥＣという。）を９６穴黒色プレート（コーニング・コースター社製）に、１穴あたり２．０×１０４個ずつ播種し、５％ＣＯ２条件下３７℃で１日間培養した後に、以下の実験に供した。
【００９６】
細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体（ＶＩＭ３Ｂ４、ＰＲＯＧＥＮ社製）で３７℃３０分間インキュベートし、その後、配列番号１５で表されるペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５）または配列番号１７で表されるビオチン化ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎ）および０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地を、各ペプチドの最終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。次にＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで５００倍希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（アマシャム社製）を１穴あたり１００μｌ加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。その後ＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌのＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（アマシャム社製）を加えて、ルミネセンサーＪＮＲ（アトー社製）により各ウェルの発光強度を測定した。
【００９７】
結果を図１に示す。図１から明らかなように、Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎは細胞表面に結合し、その結合は抗ビメンチン抗体により抑制された。
【実施例２】
【００９８】
抗ビメンチン抗体によるＴＧＦ−β活性化抑制
本試験は安部（Ａｂｅ）らの方法［エンドセリウム（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）９，２５−３６（２００２）］に従って行った。
すなわち、ＢＡＥＣを３５ｍｍディッシュに播種し、コンフルエントになるまで培養した。配列番号１５で表されるペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５）または配列番号１８で表されるペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−２１）を０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地中に最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように調製し、細胞に添加して３７℃で６時間プレインキュベートした。その後、剃刀で一部の細胞を剥ぎ取り、ＰＢＳで洗浄してからプレインキュベート時と同組成の培地で２４時間インキュベートした。プレインキュベート時および剥ぎ取り後のインキュベート時には、各ペプチドに加えて５μｇ／ｍｌの抗ビメンチン抗体（Ｖ９、Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒｓ社製）またはマウスＩｇＧ１抗体（Ａｎｃｅｌｌ社製）をそれぞれ添加し、剥ぎ取った領域に遊走してくる細胞数に対する各抗体の影響を調べた。該細胞数は、剥ぎ取り後２４時間に位相差顕微鏡下で計数した。
【００９９】
結果を図２に示す。図２から明らかなように、Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５を添加することにより遊走細胞数が減少した。これはＰｅｐｔｉｄｅ−２５が潜在型ＴＧＦ−βの活性化を促進したことにより、ＴＧＦ−βによる細胞遊走阻害作用が増強されたためである。一方、Ｐｅｐｔｉｄｅ−２５に加えて抗ビメンチン抗体を添加した場合、遊走細胞数が有意に増加したことから、抗ビメンチン抗体がＰｅｐｔｉｄｅ−２５の潜在型ＴＧＦ−βの活性化を抑制することが明らかとなった。なお、潜在型ＴＧＦ−β活性化能を有さないＰｅｐｔｉｄｅ−２１を添加した場合は、細胞遊走数に変化は見られず、そこに抗ビメンチン抗体を添加しても何ら変化は見られなかった。
【実施例３】
【０１００】
抗ビメンチン抗体によるビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合阻害（２）
実施例１と同様の方法で、参考例で作製した抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体ＫＭ３５６５のビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合阻害活性を評価した。本実施例においては、実施例１におけるＶＩＭ３Ｂ４の代りに、５μｇ／ｍｌのＫＭ３５６５または陰性対照として同濃度の抗Ｇ−ＣＳＦ変異体抗体ＫＭ５１１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（４），１０９５−１１０１，１９８９）のいずれかを添加した。
結果を図３に示す。図３から明らかなように、ＫＭ３５６５はＰｅｐｔｉｄｅ−２５Ｎの細胞表面への結合を抑制した。
【０１０１】
参考例
抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体の作製
（１）抗原ペプチドの調製
（１−１）化合物１（ヒトビメンチン部分ペプチド：配列番号１９）の合成
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１３８巻，９頁（１９８４年）〕に従った。
【０１０２】
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸
Ａｓｘ：Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−アスパラギン
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｘ：Ｌ−グルタミン酸またはＬ−グルタミン
Ｇｌｙ：グリシン
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン
Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン
【０１０３】
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基または側鎖保護アミノ酸を表す。
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｔ−Ｂｕ：ｔ−ブチル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎγ−トリチル−Ｌ−アスパラギン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｇ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル−Ｌ−アルギニン
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−チロシン
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン
【０１０４】
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
【０１０５】
アミドリンカー１６．５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）３０ｍｇを自動合成機（島津製作所ＰＳＳＭ−８）の反応容器に入れ、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
（ａ）担体樹脂を５００μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出した
（ｂ）３０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液８５８μｌを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｃ）担体樹脂を５００μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
（ｄ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ（１６５μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１６５μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ １水和物（１６５μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３３０μｍｏｌ）をＤＭＦ（８５８μｌ）中で３分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を３０分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｅ）担体樹脂を８５８μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、これを５回繰り返した。こうして、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−アミドを担体上に合成した。
【０１０６】
次に（ｂ）、（ｃ）のＦｍｏｃ基脱保護工程および洗浄工程を行い、Ｆｍｏｃ基を除去したＨ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−アミドの結合した担体樹脂を得た。
次に、（ｄ）の工程でＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｅ）の洗浄工程、次いで（ｂ）、（ｃ）の脱保護、洗浄工程を経て、Ｈ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−アミドを担体上に合成した。以下、工程（ｄ）において、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを順次用いて、（ｄ）、（ｅ）、（ｂ）、（ｃ）の順に工程を繰り返した。最後にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いて（ｄ）、（ｅ）の操作を２度繰り返した後に、（ａ）、（ｂ）の操作を行った。
【０１０７】
得られた樹脂をメタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、ＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、エチルメチルスルフィド（３％）、１，２−エタンジチオール（２．５％）およびチオフェノール（２％）からなる混合溶液６００μｌを加えて室温で８時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約１０ｍｌを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチド４２．７ｍｇを取得した。この粗ペプチドを酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ３０ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ２５ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。０．１％ＴＦＡ水溶液に、ＴＦＡ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を８．４ｍｇ得た。化合物１の物理化学的性質は以下の通りである。
質量分析［ＴＯＦ−ＭＳ］；ｍ／ｚ＝２４９７．２５（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ｇｌｘ ６．０（６），Ａｓｘ ３．７（４），Ａｒｇ １．１（１），Ｔｈｒ １．０（１），Ａｌａ １．０（１），Ｉｌｅ １．９（２），Ｌｅｕ １．１（１），Ｌｙｓ ０．９（１），Ｔｙｒ ０．９（１），Ｍｅｔ ０．９（１），Ｇｌｙ １．３（１），Ｃｙｓ １．４（１）
【０１０８】
（１−２）化合物２（対照ペプチド：配列番号２０）の合成
アミドリンカー１６．５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）３０ｍｇを出発物質とし、（１−１）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。（１−１）と同様にして側鎖保護基の切断および樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド３８．７ｍｇを取得した。これを（１−１）と同様に精製し、化合物２を４．７ｍｇ得た。化合物２の物理化学的性質は以下の通りである。
質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）；ｍ／ｚ＝２２０３．１９（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析：アミノ酸分析；Ｇｌｘ ３．１（３），Ａｒｇ １．９（２），Ｔｈｒ ０．９（１），Ｓｅｒ １．９（２），Ｉｌｅ １．０（１），Ｌｅｕ ４．１（４），Ｌｙｓ ０．９（１），Ｔｙｒ ０．９（１），Ｇｌｙ １．１（１），Ｐｒｏ ２．２（２），Ｃｙｓ １．１（１）
【０１０９】
（２）免疫原の調製
上記（１）で得られたヒトビメンチン部分ペプチドは、免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（カルビオケム社）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌに調整し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ ＭＢＳ（ナカライテスク社）を滴下して３０分間撹拌反応させた。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢＳ ２．５ｍｇを０．１Ｍりん酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、反応物をＰＢＳで透析し、ヒトビメンチン部分ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを得た。
【０１１０】
（３）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（２）で調製したヒトビメンチン部分ペプチド−ＫＬＨコンジュゲート１００μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに５週令雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に投与し、２週間後より１００μｇの該コンジュゲートを１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、血清抗体価を下記（４）に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄したものを細胞融合に用いた。
【０１１１】
（４）酵素免疫測定法
アッセイ用の抗原には上記（１）で得られたヒトビメンチン部分ペプチドとサイログロブリン（以下、ＴＨＹと略す）とのコンジュゲートを用いた。該コンジュゲートは、架橋剤としてＭＢＳの代わりにＳＭＣＣ（シグマ社）を用いた以外、上記（２）と同様の方法により作製した。
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上記コンジュゲートを１０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）−ＰＢＳを１００μｌ／穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。
１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、被免疫マウス抗血清、抗ビメンチンモノクローナル抗体の培養上清または精製モノクローナル抗体を５０μｌ／穴で分注し２時間反応させた。
０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社）を５０μｌ／穴で加えて室温、１時間反応させ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後ＡＢＴＳ基質液［２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させ、ＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）にて測定した。
【０１１２】
（５）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（６）ハイブリドーマの作製
上記（３）で得られたマウス脾細胞と上記（５）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液を０．２〜１ｍｌ／１０８マウス脾細胞となるように加えて３７℃で攪拌した。１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。９００ｒｐｍで５分遠心分離した後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み・吸出しを繰り返し、細胞をＨＡＴ培地１００ｍｌ中に懸濁した。
【０１１３】
この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間、ＣＯ２５％条件下で培養した。この培養上清を上記（４）に記載した酵素免疫測定法で調べ、ヒトビメンチン部分ペプチド（化合物１）に反応して対照ペプチド（化合物２）に反応しない穴を選び、ＨＡＴ培地を正常培地に換えて２回クローニングを繰り返し、抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
以上の結果、化合物１に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体ＫＭ３５６５を産生するハイブリドーマ株ＫＭ３５６５を取得した。なお、ハイブリドーマ株ＫＭ３５６５はＫＭ３５６５の株名で、平成１７年４月１９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０３２４として寄託されている。
また、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５の抗体クラスは抗体クラス特異的な標識化抗体を用いた酵素免疫測定法によりＩｇＧ３と決定された。
【０１１４】
（７）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に上記（６）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹で腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、３，０００ｒｐｍで５分遠心分離して固形分を除去した。得られた上清をカプリル酸沈殿法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕により精製し、精製モノクローナル抗体を得た。
【０１１５】
（８）モノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン部分ペプチドとの反応性（酵素免疫測定法）
上記（６）で選択された抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン部分ペプチドとの反応性を、上記（４）の酵素免疫測定法にて調べた。図４に示すように、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５は化合物１特異的に抗体濃度依存的な反応性を示した。
（９）モノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン蛋白との反応性（酵素免疫測定法）
上記（６）で選択された抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン蛋白との反応性を上記（４）の酵素免疫測定法にて調べた。大腸菌で発現させたヒトビメンチン蛋白（ＰＲＯＧＥＮ社）を添付のデータシート記載の方法に従って蒸留水にて溶解後、ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈してプレートに固層化した。陰性対照抗原として大腸菌由来夾雑蛋白をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈してプレートに固層化したものを用いた。図５に示すように、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５はビメンチン特異的に抗体濃度依存的な反応性を示した。
【０１１６】
（１０）ウェスタンブロッティング
上記（６）で選択された抗ヒトビメンチンモノクローナル抗体ＫＭ３５６５のヒトビメンチン蛋白との反応性をウエスタンブロッティングにて調べた。
大腸菌で発現させたヒトビメンチン蛋白、または大腸菌由来夾雑蛋白を０．１μｇ／レーンでＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕にて分画後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、１次抗体としてＫＭ３５６５のハイブリドーマ培養上清原液、市販の抗ビメンチン抗体２種（ＰＲＯＧＥＮ社製ＶＩＭ３Ｂ４およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製Ｖ９、いずれも精製抗体５μｇ／ｍｌ）、および陰性対照抗体としてＫＭ５１１（抗Ｇ−ＣＳＦ変異体抗体、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（４），１０９５−１１０１，１９８９、５μｇ／ｍｌ）を室温で２時間反応させた。０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ社製）を室温で１時間反応させた。
０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、ＥＣＬ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャム社）による反応を行った。
その結果、モノクローナル抗体ＫＭ３５６５は、市販抗体と同様、ビメンチン蛋白に特異的な反応性を示した。
【０１１７】
（１１）モノクローナル抗体ＫＭ３５６５と市販抗ビメンチン抗体との認識エピトープの異同
市販抗ビメンチン抗体２種（ＰＲＯＧＥＮ社製ＶＩＭ３Ｂ４およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製Ｖ９）とモノクローナル抗体ＫＭ３５６５の認識エピトープの異同を検討する目的で、該市販抗体の化合物１に対する反応性を上記（４）の酵素免疫測定法にて調べた。その結果、図６に示すように該市販抗体はいずれもビメンチン蛋白に反応性を有するが、化合物１に対する反応性を示さなかったことから、これらの抗体はビメンチン蛋白上のモノクローナル抗体ＫＭ３５６５とは異なる別のエピトープを認識していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明により、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤、またはＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法が提供される。本発明のＴＧＦ−βの活性化抑制剤は、ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬として利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１９】
配列番号１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号３−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号４−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号５−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号６−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号７−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号８−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号９−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１０−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１３−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１４−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１５−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１６−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１７−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１８−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１９−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２０−人工配列の説明：合成ペプチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）とラテンシー・アソシエイテッド・ペプチド（Ｌａｔｅｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下「ＬＡＰ」という。）の部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する潜在型トランスフォーミング・グロース・ファクター−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β、以下「ＴＧＦ−β」という。）の活性化抑制剤。
【請求項２】
ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質が、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する活性を有する抗ビメンチン抗体または該抗体断片である、請求項１に記載のＴＧＦ−β活性化抑制剤。
【請求項３】
ＬＡＰの部分断片が配列番号１〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１または２のいずれか１項に記載のＴＧＦ−β活性化抑制剤。
【請求項４】
（ｉ）ＬＡＰの部分断片を、ビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞に添加して、該細胞に結合する該部分断片量を測定すること、
（ｉｉ）ＬＡＰの部分断片およびスクリーニングの対象となる物質を、ビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞に添加して、該細胞に結合する該部分断片量を測定すること、
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉ）の測定量から、該物質の、ＬＡＰの部分断片とＴＧＦ−βを発現する細胞との結合阻害活性を評価すること、
（ｉｖ）該結合阻害活性を有する物質をＴＧＦ−β活性化抑制物質として選択すること、
からなるＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬。
【請求項６】
ＴＧＦ−βが関与する疾患が動脈硬化症、癌、炎症、線維症である、請求項５記載の治療薬。
【請求項７】
ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を被験体に投与する工程を包含するＴＧＦ−β活性化抑制方法。
【請求項８】
ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を被験体に投与する工程を包含するＴＧＦ−βが関与する疾患の治療方法。
【請求項９】
ＴＧＦ−β活性化抑制剤の製造のための、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質の使用。
【請求項１０】
ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬の製造のための、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質の使用。
【請求項１】
ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）とラテンシー・アソシエイテッド・ペプチド（Ｌａｔｅｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下「ＬＡＰ」という。）の部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する潜在型トランスフォーミング・グロース・ファクター−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β、以下「ＴＧＦ−β」という。）の活性化抑制剤。
【請求項２】
ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質が、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する活性を有する抗ビメンチン抗体または該抗体断片である、請求項１に記載のＴＧＦ−β活性化抑制剤。
【請求項３】
ＬＡＰの部分断片が配列番号１〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１または２のいずれか１項に記載のＴＧＦ−β活性化抑制剤。
【請求項４】
（ｉ）ＬＡＰの部分断片を、ビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞に添加して、該細胞に結合する該部分断片量を測定すること、
（ｉｉ）ＬＡＰの部分断片およびスクリーニングの対象となる物質を、ビメンチンおよびＴＧＦ−βを発現する細胞に添加して、該細胞に結合する該部分断片量を測定すること、
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉ）の測定量から、該物質の、ＬＡＰの部分断片とＴＧＦ−βを発現する細胞との結合阻害活性を評価すること、
（ｉｖ）該結合阻害活性を有する物質をＴＧＦ−β活性化抑制物質として選択すること、
からなるＴＧＦ−β活性化抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬。
【請求項６】
ＴＧＦ−βが関与する疾患が動脈硬化症、癌、炎症、線維症である、請求項５記載の治療薬。
【請求項７】
ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を被験体に投与する工程を包含するＴＧＦ−β活性化抑制方法。
【請求項８】
ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質を被験体に投与する工程を包含するＴＧＦ−βが関与する疾患の治療方法。
【請求項９】
ＴＧＦ−β活性化抑制剤の製造のための、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質の使用。
【請求項１０】
ＴＧＦ−βが関与する疾患の治療薬の製造のための、ビメンチンとＬＡＰの部分断片との結合を阻害する物質の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０５１４４
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【発行日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１２８３１（Ｐ２００６−５１２８３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００８１２５
【国際出願日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【発行日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００８１２５
【国際出願日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]