炎症性及び血液循環疾患の治療及び予防活性を示す、竹抽出物並びにそれから分離された化合物を含有する組成物
本発明は炎症性疾患及び血液循環疾患の治療及びに予防のための竹抽出物を含む組成物に関する。竹抽出物はＮＯ生成の抑制による強力な抗炎症活性及び、エラスターゼ活性の抑制、血管内皮細胞創傷の治癒、ｕＰＡ発現の活性化及びＰＡＩ−１発現の抑制、コレステロール沈着の低減及びネオインチマ形成の抑制による血液循環改善活性を有する。従って、これは炎症性及び血液循環疾患の治療及び予防のための治療剤または健康機能食品として使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性及び血液循環疾患の治療及び予防活性を示す竹抽出物及びそれから分離された化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液循環障害は沈着されたコレステロール、血管上の増加された血栓、及び血管の弾性力減少に基因する血流障害によって現われる。血液循環障害の代表例は手又は足のしびれ、首と肩のひきつり、記憶喪失、無気力、集中力低下、眩暈及び慢性疲労などであり、これらはしばしば正常な生活に混乱を与える。血液循環障害の一例である、高脂血症は血液脂質パラメータが血液内に増加する状態である。この状態は血液内に非正常的に高濃度の脂肪が存在する。循環血液中の脂質成分は総コレステロール、低密度リポタンパク質、極低密度リポタンパク質又は中性脂肪（トリグリセリド）である。
【０００３】
炎症は、例えば、バクテリア、カビ、ウイルス、種々のアレルゲンのような外部汚染物質の侵入によって、これらに対する炎症性反応及び生物物理学的工程を含んで、生じる。炎症反応の特有の兆候は酵素活性の増大、炎症媒介物質の放出、体液浸潤、細胞移動、組織破壊の一連の複合的な生理的反応に加えて、紅斑、浮腫、発熱、痛みなどの外的症候である。
【０００４】
これら炎症性反応の因子である、ＮＯ（一酸化窒素）は、最終生成物（即ち、ＮＯ）を形成するためにＬ−アルギニン（L-arginine）に作用する、ＮＯＳ（一酸化窒素シンターゼ）とシトルリン（citrulline）によって、中間体（ヒドロキシアルギニン）を経て、形成される。この物質（ＮＯ）は小さな分子量を有しており、血管系に作用して血管拡張、血小板凝集及び接着、神経伝達、及び消化器官運動を誘発し、神経伝達、血液凝固、血圧調節及び癌細胞などに対する免疫などのような代謝経路及び生理的反応を調節する重要な役割を果たすことが見出されている。これは遊離基構造であるために毒性が強く、大気中で安定化された最終産物、即ち、ＮＯ３とＮＯ２に変換される傾向がある（Snyder S. H., et al, Scientific American, May pp28-35, 1992）。
【０００５】
ＮＯＳはカルシウムイオン又はカルモジュリン（calmodulin）依存性によってｃＮＯＳ（構成上のＮＯＳ）とｉＮＯＳ（誘導性のＮＯＳ）とに分類されるが、カルシウムイオン又はカルモジュリン依存性のｃＮＯＳは主に脳、上皮細胞、好酸球、胃腸粘膜細胞に存在し、カルシウムイオン又はカルモジュリン非依存性のｉＮＯＳは主にマクロファージ細胞、肝細胞、癌細胞などに存在し、幾つかの要因、例えば、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン、又は細菌性ＬＰＳのようなエンドトキシンによって誘発される（Dinerman, J. L., et al, Circ. Res., 73, pp217-222, 1993）。ｉＮＯＳの発現はＣＯＸ−２発現と密に関係しており、したがって、生成されたＮＯはＣＯＸ−２発現に影響を与えることもある（Robert C., et al., J. Immunol., 165, pp1582-1587, 2000; Daniela S., et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 90, pp7240-7244, 1993）。
【０００６】
さらに、ｉＮＯＳに基因するＮＯ生成と動脈硬化、関節炎、胃炎、大膓炎、腎臓炎、肝炎、癌又は退行性疾患のような種々の炎症性疾患との相互関係に対する数多くの報告がある（Gobert A. P. et al., J. Immunol. 168(12), pp6002-6006, 2002; Dijkstra G. et al., Scand. J. Gastroenterol., 37(5) pp546-554, 2002; Sakac V. and Sakac M. Med. Pregl., 53, pp463-474, 2000; Albrecht E. W. et al., Am. J. Transplant, 29(5), pp448-453, 2002; Ramachandran A. et al., Free Radical Biol. Med., 33(11), pp1465-1474, 2002; Sartor L. et al., Biochemical Pharmacol., 64, pp229-237, 2002; Sadowska Krowicka H. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 217(3), pp351-357 1998; Lo A. H. et al., Carcinogenesis, 23(6) pp983-991, 2002）。
【０００７】
したがって、ｉＮＯＳに起因するＮＯ生成を強力に阻害する抑制剤を見つけて、上記記載の種々の炎症性疾患の治療及び予防する医薬品、健康機能食品、食品添加剤を開発するための研究が行なわれてきた。
【０００８】
タケ科（Bambusaceae）又はイネ科（Poaceae）に属する竹は、韓国及び日本を含むアジア諸国に分布している。全世界に分布している竹の種類は約１２５９種に達している。その中でも、タケ科に属する代表的なものは、マダケ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ ＳＩＥＢ．Ｅｔ Ｚｕｃｃ）、クロチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ）、ハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）及びモウソウチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ ＭＡＺＥＬ ｅｘ Ｈ．ｄｅ ＬＥＨ）であり、イネ科に属する代表的なものは、ジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）、コウライザサ（Ｓａｓａ ｃｏｒｅａｎａ Ｎａｋａｉ）、ミヤコザサ（Ｓａｓａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｍａｋｉｎｏ）、チシマザサ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ ｖａｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、チマキザサ（Ｓａｓａ ｐａｌｍａｔａ Ｎａｋａｉ）、イノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＢＥＡＵＶ）及びアジアイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ）である。
【０００９】
竹抽出物の用途に対する幾つかの報告、例えば、ミヤコザサからの葉抽出物の製造方法及びその抗菌活性を用いた食品保存剤としての用途を開示する韓国公開特許第１０-２００１-６９１３０号；抗癌活性を持つ竹から分離された多糖体を開示する米国特許出願第３４１８３１１号、がある。
【００１０】
しかし、竹抽出物及びそこから分離された化合物の炎症性又は血液循環疾患の治療効果については、上で引用したどの文献にも報告又は開示されていない。この開示は参考のためにここに組み込まれている。
【００１１】
幾つかの生化学的実験を通じて、竹抽出物及びそれから分離された化合物の炎症又は血液循環疾患の治療又は予防効果を調べて、確認するために、 本発明者らは、幾つかの生化学的実験、即ち、生体内でＬＰＳ活性化されたマクロファージ細胞によって誘導されるＮＯ又はＰＬＡ２生成抑制、 血管内で血栓溶解活性、血流量の調節及び細胞の成長に重要な役割を果たすｕ−ＰＡ、ｅＮＯＳ及びＶＥＧＦのような幾つかの遺伝子の発現に対する効果に加えて、細胞毒性テスト、ＬＤＬ受容体欠損マウス及び正常マウスを用いた動物モデルテストを鋭意遂行し、最終的に、竹抽出物及びそこから分離された化合物が炎症性又は血液循環疾患に対する治療及び予防活性を有していることを確認し、本発明を完成した。
【００１２】
これら及び本発明の他の目的は以下に提供する本発明の詳細な開示から明らかになるだろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、 ＮＯの過剰生成によって引き起こされる炎症性疾患の治療又は予防のために有効な量の竹抽出物又はそこから分離された化合物を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、 血液循環疾患の治療又は予防のために有効な量の竹抽出物又はそこから分離された化合物を含有する医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明は炎症性疾患及び血液循環疾患を治療及び予防する医薬組成物の製造のための上記竹抽出物又はそこから分離された化合物の用途も提供する。
【００１６】
本発明は上記竹抽出物又はそこから分離された化合物を含有する、血液循環疾患及びＮＯ生成の抑制による炎症性疾患の予防及び緩和のための健康機能食品も提供する。
【００１７】
したがって、本発明の目的は竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物を有効成分として含有する、心血管疾患の治療及び予防用医薬組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の目的は竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を有効成分として含有する、エラスターゼ活性抑制、血管無い内皮細胞の創傷治癒、ｕ−ＰＡ発現活性、ＰＡＩ−１発現抑制、コレステロール沈着低減及びネオインチマ（neointima）形成抑制による血液循環疾患を治療又は予防用医薬組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物を有効成分として含有する、ＮＯ生成及びホスホリパーゼＡ２発現の抑制による炎症の治療及び予防用医薬組成物を提供することである。
【００２０】
ここに記載された「粗抽出物」は水、メタノール、エタノールのような低級アルコール、好ましくはメタノールなど、又はこれらの混合物で植物性素材を抽出することによって製造される抽出物を含む。
【００２１】
ここに記載された用語「極性溶媒可溶性抽出物」は極性溶媒、例えば、水、メタノール、エタノールのような低級アルコール、好ましくはブタノールなど、又はこれらの混合物で上記粗抽出物を抽出することによって製造することができる。
【００２２】
ここに記載された用語「非極性溶媒可溶性抽出物」は非極性溶媒、例えば、ヘキサン、酢酸エチル又はジクロロメタン、好ましくは酢酸エチルで上記粗抽出物を抽出することによって製造することができる。
【００２３】
したがって、本発明の他の目的は竹抽出物から分離されたトリシンとｐ−クマル酸を有効成分として含有する、心血管疾患の治療又は予防のための医薬組成物を提供することである。
【００２４】
本発明の目的は竹抽出物から分離されたトリシンとｐ−クマル酸を有効成分として含有する、エラスターゼ活性抑制、血管内皮細胞の創傷治癒及びＶＥＧＦ、ｕ−ＰＡ及びｅＮＯＳ遺伝子発現の増加による血液循環疾患の治療及び予防のための医薬組成物を提供することである。
【００２５】
本発明の他の目的は竹抽出物から分離トリシンとｐ−クマル酸を有効成分として含有する、ＮＯ生成抑制による炎症の治療又は予防のための医薬組成物を提供することである。
【００２６】
ここに記載された用語「竹（Bamboo Plant）」とはタケ科（Bambusaceae）又はイネ科（Poraceae）に属する竹の茎又は葉を含む。タケ科に属する好ましい竹は、マダケ、クロチク、ハチク及びモウソウチクであり、より好ましくは、ハチクである。イネ科に属する好ましい竹は、ジダケ、コウライザサ、ミヤコザサ、チシマザサ、チマキザサ、イノコログサ及びアジアイネであり、より好ましくは、ジダケである。
【００２７】
ここに記載された用語「ｕＰＡ」はウロキナーゼ型プラスミノゲン活性因子遺伝子（繊維素溶解因子）、「ＰＬＡ２」はホスホリパーゼＡ２遺伝子、「ＶＥＧＦ」は血管内皮増殖因子遺伝子（vascular endothelial growth factor gene）、「ｅＮＯＳ」は内皮窒素酸化シンターゼ遺伝子（endothelial nitrous oxide synthase gene）、「ＰＡＩ−１」は１型プラスミノゲン活性化阻害剤遺伝子（plasminogen activator inhibitor 1 gene）である。
【００２８】
本発明の目的はヒト又は哺乳類でＮＯ生成及びＰＬＡ２発現の抑制による炎症性疾患の治療及び予防のための治療薬製造用の、竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物の用途を提供することである。
【００２９】
本発明の目的はヒト又は哺乳類でエラスターゼ活性抑制、血管内皮細胞の創傷治癒、ｕＰＡ発現活性及びＰＡＩ−１発現抑制、コレステロール沈着低減及びネオインチマ（neointima）形成抑制による血液循環疾患の予防及び治療のための治療薬製造用の、竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物の用途を提供することである。
【００３０】
本発明の目的は哺乳類において、竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物の有効量を、薬学的に許容しうる担体と共に上記哺乳類に投与することを含む、ＮＯ生成抑制による炎症性疾患の治療及び予防方法を提供することである。
【００３１】
本発明の目的は哺乳類において、竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物の有効量を、薬学的に許容しうる担体と共に上記哺乳類に投与することを含む、エラスターゼ活性抑制及び血管内皮細胞の創傷治癒、コレステロール沈着低減及びネオインチマ（neointima）形成抑制による血液循環疾患の治療及び予防方法を提供することである。
【００３２】
本発明の他の目的は上記記載の抽出物又は化合物に加えて栄養学的に許容しうる添加剤を含有する、血液循環疾患及びＮＯ生成及びＰＬＡ発現抑制による炎症性疾患の予防及び緩和のための健康機能食品を提供することである。
【００３３】
ここに記載された用語「心血管疾患」とは高血圧、心臓病、脳卒中、末梢血管疾患、高脂血症、動脈硬化、狭窄症、血栓症又は心筋硬塞などのような種々の心血管疾患を含む。
【００３４】
ここに記載された用語「炎症性疾患」とは動脈硬化、関節炎、胃炎、大膓炎、腎炎、肝炎、癌又は多様な退行性疾患などのような種々の炎症性疾患を含む。
【００３５】
本発明の医薬組成物は組成物の全重量に対して上記抽出物又は化合物を約０．１〜７０重量％を含むことができる。
【００３６】
本発明の健康機能食品は組成物の全重量に対して上記抽出物又は化合物を０．０１〜８０重量％、好ましくは１〜６０重量％を含む。
【００３７】
上記健康機能食品は健康機能食品、健康飲料などに含有でき、粉末、顆粒、錠剤、そしゃく錠、カプセル、飲料などとして使用することができる。
【００３８】
本発明の竹から分離された抽出物及び化合物を下記好適な実施態様にしたがって製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４０】
本発明の竹抽出物は下記詳細な手順によって製造することができる。
【００４１】
本発明のハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）又はジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）抽出物は下記によって製造することができる；
ハチク又はジダケを乾燥し、切り、砕いて乾燥重量の５〜２５倍、好ましくはおよそ１０倍容量の蒸留水、メタノール、エタノール、ブタノール等のよな低級アルコール、又はその混合物、好ましくはメタノールと混合し；溶液は２０〜１００℃、好ましくは６０〜１００ の温度範囲で、１〜２４時間、熱水で処理し、熱水、冷水、還流抽出、又は超音波抽出の抽出方法で、１回〜５回、好ましくは２回〜３回、繰り返して処理し；残渣は濾過して上清を得、これをロータリー・エバポレータで２０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃の温度範囲で濃縮した後、真空凍結乾燥、熱風乾燥又は噴射乾燥で乾燥して水、低級アルコール又はその混合溶液に可溶性のハチク又はジダケの乾燥抽出粉末を得た。
【００４２】
さらに、本発明の極性溶媒可溶性抽出物と非極性溶媒可溶性抽出物は下記手順によって製造することが出来る；上記ステップによって製造された粗抽出物を水に懸濁した後、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサンなどのような非極性溶媒の１〜１００倍、 好ましくは１〜５倍容量と混合し；非極性溶媒可溶層を集めると、本発明の非極性溶媒可溶性抽出物が得られ、残りの極性溶媒可溶層を集めるとは水、低級アルコール又はその混合物に可溶性の本発明の極性溶媒可溶性抽出物が得られる。また、上記記載の方法は、より強力な分画物又は化合物を分別又は分離するために、当該技術分野で周知のような従来方法、例えば、文献（Harborne J. B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3ｒｄ Ed. pp6-7, 1998）に開示された方法によって、改変又は更なるステップを追加することができる 。
【００４３】
幾つかの生化学的実験を通じて、上記竹抽出物が炎症及び血液循環に対して効果があるかを調べて、抽出物と非極性溶媒可溶性抽出物が炎症の主要原因であるＮＯ生成を抑制、及び血液循環を改善する重要な役割を果たしているか否かを確認した。その結果、粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物及び非極性溶媒可溶性抽出物がＮＯの生成、ｉＮＯＳ遺伝子の発現、エラスターゼの活性及びＰＡＩ−１遺伝子の発現を抑制してｕＰＡ遺伝子発現を促進し、ｉｎ ｖｉｖｏで創傷治癒を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで血管形成の活性化及びコレステロール沈着及びネオインチマ形成の抑制を示すことが確認された。
【００４４】
本発明の他の態様によれば、上記製造法で製造されたハチク又はジダケの粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を含有する、ＮＯ生成抑制による炎症の治療及び予防のための医薬組成物が提供される。
【００４５】
本発明の他の態様は、上記製造法で製造された抽出物を含む医薬組成物を炎症又は血液循環疾患の治療のためにヒトを含む哺乳類に投与することを含む治療方法及び予防方法を提供することである。
【００４６】
ＮＯ生成の抑制による炎症の治療及び予防、血液循環の改善するための本発明の組成物は、組成物全重量に対して上記抽出物を０．１〜７０重量％を含むことができる。
【００４７】
本発明の組成物は、さらに、当該技術分野で周知の使用方法に従って通常の担体、賦形剤又は希釈剤を含むことができる。上記担体は使用法及び応用方法によって適当な物質として使用されることが好ましいが、それに限定されるものではない。適当な希釈剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Mack Publishing Co. Easton PA）に記載されている。
【００４８】
以下の製剤方法及び添加剤は単に例示的なものであり、本発明を制限するものではない。
【００４９】
本発明に係る組成物は薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤、例えば、乳糖、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム又は鉱物油を含む医薬組成物として提供することができる。剤形はさらに充填剤、抗凝集剤、平滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、保存剤などのを含むことができる。本発明の組成物は当該技術分野で周知の手順を採用して、患者に投与した後、有効成分の迅速、持続又は遅延された放出を提供できるように製剤化することができる。
【００５０】
例えば、本発明の組成物は注射剤を生産するために通常的に使用されるオイル、プロピレングリコール又は他の溶媒に溶解することができる。適した担体の例は、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピルなどを含むが、これらに制限されない。局所投与のために、本発明の抽出物を軟膏剤又はクリームの形態で製剤化することができる。
【００５１】
本組成物を含有する医薬製剤は経口投与形態（散剤、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、水性薬剤、シロップ剤、エリキシル丸剤、粉剤、香粉、顆粒）、又は局所製剤（クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、香膏、パッチ剤、糊剤、散布液、エーロゾル剤など）、又は注射可能な製剤（溶液剤、懸濁剤、乳剤）などのあらゆる形態で製造することができる。
【００５２】
薬学的投与形態で、本発明の組成物は薬学的に許溶しうる塩の形態で使用することができ、また、単独又は適当な組み合わせで、他の薬学的活性成分と併用するようにして、使用することができる。
【００５３】
本発明の抽出物又は化合物の好ましい投与量は投与対象の健康状態及び体重、重症度、薬剤形態、投与経路及び期間によって変わり、また、当業者によって選択することもできる。しかし、所望の効果を得るために、本発明の抽出物又は化合物を 一般に、１日に、１０ｇ／ｋｇ範囲内、好ましくは１〜３ｇ／ｋｇで投与することが推奨される。投与は１日当り、１度又は数回に分けて投与することができる。組成物の点から見て、本発明の抽出物の量は組成物の全重量に対して０．０１〜７０重量％、好ましくは０．５〜５０重量％で存在しなければならない。
【００５４】
本発明の医薬組成物は種々経路を介して哺乳類（ラット、マウス、家畜又はヒト）などの対象動物に投与することができる。投与のすべて方式は、例えば、経口、直腸内又は静脈、筋肉、皮下、皮内、鞘内、硬膜外、又は脳室内注射の投与によってなされ得ることが予想される。
【００５５】
ここに記載された用語「健康機能食品」とは栄養補助食品（dietary supplement）、機能性食品（nutraceuticals）、食品又は食品添加物を含む。
【００５６】
また、本発明は上記記載の抽出物 ０．０１〜８０重量％、アミノ酸 ０．００１〜５重量％、ビタミン ０．００１〜２重量％、糖 ０．００１〜２０重量％、有機酸 ０．００１〜１０重量％、適量の甘味料及び香辛料を加えて、炎症及び血液循環の予防及び改善用健康機能食品飲料の組成物を提供する。
【００５７】
上記記載の竹抽出物は炎症及び血液循環の予防及び改善用食品及び飲料に加えることができる。
【００５８】
健康機能食品の開発のために、例えば、本発明の上記抽出物を含む食品組成物の例は、種々の食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進食品などであり、パウダー、顆粒、錠剤、そしょく錠、カプセル又は飲料などのとして使用することができる。
【００５９】
また、本発明の抽出物は調整粉乳、 成長期用調整粉乳、成長期用調整食品などのように、幼児及び乳児食品に添加して、アレルギー性疾患及び非アレルギー性炎症性疾患の予防及び改善させることができる。
【００６０】
上記記載の組成物は食品、添加剤又は飲料に添加することができ、食品又は飲料内の上記記載の抽出物の量は一般に健康機能食品組成物用食品の全重量の約０．１〜８０ｗ／ｗ％、好ましくは１〜５０ｗ／ｗ％、及び健康飲料組成物１００ｍＬを基準にして、１〜３０ｇ、好ましくは３〜１０ｇでありうる。
【００６１】
本発明の健康飲料組成物が指示された割合で、必須成分として上記抽出物を含有する場合には、他の液体成分には特別な制限はなく、通常の飲料のような種々の香味剤（ｄｅｏｄｏｒａｎｔ）又は天然炭水化物などを他の組成物として含有することができる。上記天然炭水化物の例は、ブドウ糖、果糖などのような単糖類、マルトース、蔗糖などのような二糖類、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、エリトリトールなどのような糖アルコールである。上記されたもの以外の他の香味剤として、天然香味剤（例；タウマチン、ステビア抽出物、例えば、レバウディオサイドＡ（levaudioside A）、グリチルリチンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなどのような）を有利に使用することができる。上記天然炭水化物の量は一般に本発明の飲料組成物１００ｍｌ当たり、 約１〜２０ｇ、好ましくは５〜１２ｇの範囲である。
【００６２】
上記組成物以外の他の成分は、種々の営養剤、ビタミン、鉱物又は電解質、合成風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭化剤などがある。上記のもの以外の他の成分は、天然果汁製造用果汁、果汁飲料及び野菜飲料が挙げられ、このような成分は独立的に又は組み合わせで使用することができる。この成分の比率はそれほど重要ではないが、一般に、本発明の組成物１００ｗ／ｗ％当たり、約０〜２０ｗ／ｗ％の範囲である。上記説明された抽出物を含む食品の例は、種々の食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進用食品などである。
【００６３】
本発明の組成物は、さらに、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸のような有機酸；ホスフェート、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酸性ピロリン酸、ポリホスフェートのようなリン酸塩；ポリフェノール、カテキン、α−トコフェロール、ローズマリー抽出物、ビタミンＣ、緑茶抽出物、甘草抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸などのような天然抗酸化剤を一つ以上含んでいてもよい。。
【００６４】
上記竹抽出物は２０〜９０％の高濃縮液体、粉末、又は顆粒形態とすることができる。
【００６５】
同様に、上記竹抽出物は、さらに、乳糖、カゼイン、デキストロース、ブドウ糖、蔗糖及びソルビトールを１つ以上含むことができる。
【００６６】
本発明の抽出物は毒性及び副作用がなく、したがって、安全に使用することができる。
【００６７】
本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、用途及び製法において種々の様々な変更及び変形することができることは当業者にとって自明であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
本発明の上記及び他の目的、特性及び他の長所は添付図面とともに下記の詳細な記述からより明らかに理解することができる。
【００６９】
図１と及びは、トリシン及びｐ−クマル酸のＨＰＬＣ分析のデータを示す。図１は標準群、図２は本発明の竹抽出物である。
【００７０】
図３及び４は、竹粗抽出物及びそこから分離された分画物の各濃度のＮＯ抑制効果を示す。図３は５０μｇ／ｍＬ濃度処理群について、図４は１００μｇ／ｍＬ濃度処理群についてである。
Ａ：粗抽出物
Ｂ：ｎ−ヘキサン可溶性抽出物
Ｃ：ジクロロメタン可溶性抽出物
Ｄ：ｎ−ブタノール可溶性抽出物
Ｅ：酢酸エチル可溶性抽出物
Ｆ：水溶性抽出物
【００７１】
図５はＨＵＶＥＣにおける竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸の細胞毒性を示す。ここで、グラフ線上に記載された数字は処理サンプル濃度（μｇ／ｍＬ）を意味する。
【００７２】
図６はＨＵＶＥＣにおける竹抽出物の細胞増殖効果を示す。
【００７３】
図７〜９は、ＨＵＶＥＣの完全培地でのｍＲＮＡ発現に対する竹抽出物、トリシン及びｐ−クマルの効果を示す。図７はＶＥＧＦ遺伝子発現、図８はｕ−ＰＡ遺伝子発現、図９はｅＮＯＳ遺伝子発現に対する効果であり、ここで、グラフ線上に記載された数字は処理サンプル濃度（μｇ／ｍＬ）を意味する。
【００７４】
図１０〜１２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＵＶＥＣを用いる創傷治癒試験による本発明の竹抽出物の創傷治癒効果を示す。図１０は対照群、図１１は１０μｇ／ｍＬの竹抽出物処理群、図１２は５０μｇ／ｍＬの竹抽出物処理群である。
【００７５】
図１３〜１５は、 ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＵＶＥＣを用いる血管形成試験による本発明の竹抽出物の血管形成効果を示す。図１３は対照群、図１４は１０μｇ／ｍＬの竹抽出物処理群 、図１５は１００μｇ／ｍＬの竹抽出物処理群である。
【００７６】
図１６は、高農度のコレステロール食餌により誘導された動脈硬化ネズミにおける竹抽出物１６週間（５０及び１００ｍｇ／ｋｇ）及び２０週間（５００ｍｇ／ｋｇ）処理群及び非処理群の体重変化を示す。
【００７７】
図１７及び１８は、高農度のコレステロール食餌により誘導された動脈硬化マウスにおける竹抽出物１６週間（５０と１００ｍｇ／ｋｇ）及び２０週間（５００ｍｇ／ｋｇ）処理群と非処理群の、オイルレッドＯ染色された（ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｅｄ）大動脈弁損傷部位（aortic valve lesion areas）のコンピュータ関連画像分析による形態計測を示す。
【００７８】
図１７は、大動脈弁損傷の凍結切片のオイルレッドＯ染色された写真を示し、ここで、左写真は対照群、中央写真はロバスタチン処理の陽性対対照群、右写真は竹抽出物処理の写真である。図１８は、コンピュータ関連画像分析による大動脈弁損傷部位の形態計測の結果を示す。
【実施例】
【００７９】
本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、用途及び製法において種々の様々な変更及び変形することができることは当業者にとって自明であろう。
【００８０】
本発明は下記実施例によってさらに詳しく説明される。しかし、本発明はいかなる方法によってもこれら実施例に制限されるものではないと理解できるだろう。
【００８１】
下記参照例、実施例及び実験例はその範囲を制限することなく、本発明をさらに説明するために示されている。
【００８２】
［実施例１］ 竹粗抽出物の製造
ジダケ、コウライザサ、ミヤコザサ、チシマザサ、チマキザサ（Ｓａｓａ ｐａｌｍａｔａ Ｎａｋａｉ）、ハチク、マダケ、クロチク及びモウソウチクの竹を洗浄し、室温で１０日間乾燥した。
【００８３】
乾燥した竹の葉及び茎１０ｋｇを小さく切り、７０％エタノール１００ｍＬと混合し、その混合物を８０℃で７時間、３度繰り返して加熱した。そして、抽出物を濾紙（ワットマン社製、米国）で濾過した。濾液を集め、５５〜６５℃で、ロータリー・エバポレータ（Ｎ−１０００、Ｅｙｅｌａ社、日本）によって減圧濃縮し、凍結乾燥器（速度仕様 ３０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）で乾燥して、それぞれ竹の乾燥粗抽出物出を得た（表１参照）。
【００８４】
【表１】
【００８５】
［実施例２］ Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの極性溶媒及び非極性溶媒可溶性抽出物の製造
２−１．ｎ−ヘキサン可溶性抽出物の製造
実施例１で製造したＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの粗抽出物５０ｇを１リットルの蒸留水に懸濁し、その懸濁液をｎ−ヘキサン１リットルと激しく混合してｎ−ヘキサン可溶性分画と水−可溶性分画とに分けた。ｎ−ヘキサン可溶性分画を集め、残余溶液はｎ−ヘキサン抽出を再び遂行した。上記過程を３度繰り返した。
ｎ−ヘキサン可溶性分画を真空内で蒸発してＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａのｎ−ヘキサン可溶性抽出物９．１ｇを得た。
【００８６】
２−２．ジクロロメタン可溶性抽出物の製造
実施例２−１で製造されたＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの水−可溶性分画を同一量のジクロロメタンと激しく混合してジクロロメタン可溶性分画と水−可溶性分画とに分けた。ジクロロメタン可溶性分画を集め、残余溶液はジクロロメタン抽出を再び遂行した。上記過程を３度繰り返した。
ジクロロメタン可溶性分画を真空内で蒸発してＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａのジクロロメタン可溶性抽出物４．６gを得た。
【００８７】
２−３．酢酸エチル可溶性抽出物の製造
実施例２−２で製造したＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの水−可溶性分画を同一量の酢酸エチルと激しく混合して酢酸エチル可溶性分画と水−可溶性分画とに分けた。酢酸エチル可溶性分画を集め、残余溶液は酢酸エチル抽出を再び遂行した。上記過程を３度繰り返した。
酢酸エチル可溶性分画を真空内で蒸発してＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの酢酸エチル可溶性抽出物４．３gを得た。
【００８８】
２−４．ｎ−ブタノール及び水−可溶性抽出物の製造
実施例２−３で製造したＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの水−可溶性分画を同一量のｎ−ブタノールと激しく混合してｎ−ブタノール可溶性分画と水−可溶性分画とに分けた。ｎ−ブタノール可溶性分画を集め、残余溶液はｎ−ブタノール抽出を再び遂行した。上記過程を３度繰り返した。
ｎ−ブタノール可溶性分画及び水−可溶性分画をそれぞれ真空内で蒸発してＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａのｎ−ブタノール可溶性抽出物７．１ｇ及び水−可溶性抽出物２５．１ｇを得た。
【００８９】
［実施例３］ Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓの極性溶媒及び非極性溶媒可溶性抽出物の製造（１）
表２に示されるように、上記実施例２に開示された同一の方法によって、極性溶媒可溶性抽出物及び非極性可溶性抽出物を製造した。
【００９０】
【表２】
【００９１】
［実施例４］ Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ の極性溶媒及び非極性溶媒可溶性抽出物の製造（２）
実施例１で製造したジダケの茎からの乾燥抽出物を下記のように分画した。
実施例１で得た粗抽出物１００ｇを精製水１０００ｍＬに懸濁した。クロロホルム１０００ｍｌを分液漏斗中でこれに加え、混合物を激しく振ってクロロホルム可溶性層と水可溶性層とに分けた。クロロホルム可溶性分画を集め、残余溶液はクロロホルム抽出を再び遂行した。
上記過程を３度繰り返してクロロホルム可溶性構成要素を分離し、クロロホルム可溶性分画を集め、減圧下で乾燥してクロロホルム可溶性分画１７．８ｇを得た。
上記水可溶性分画を同一量の酢酸エチルと混合した後、酢酸エチル可溶性層と水−可溶性層とに分けた。上記分画工程を３度繰り返した。
上記酢酸エチル可溶性層をロータリー・エバポレータにより濃縮し、減圧下で乾燥して酢酸エチル可溶性抽出物 １５．４ｇを得た。
最終的に、さらに、水−可溶性層を下記実験のサンプルとして使用するために得た。
【００９２】
［実施例５］ トリシンとｐ−クマル酸の分離
実施例４で製造した酢酸エチル可溶性分画１０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付してトリシンとｐ−クマル酸とを分離した。
１０ｇの酢酸エチル分画をシリカゲルカラムに載せ、カラムを直線濃度勾配を含む混合溶媒クロロホルム：アセトン（１００：１〜１：１）で溶出して７個のサブ−分画を得た。７個の分画中、４番目の分画をメタノールを用いて再結晶し、２６ｍｇの黄色の結晶を分離した。
上記で得た黄色の結晶をＴＬＣプレート（シリカゲル６０ Ｆ２５４プレート、層の厚さ０．２ｍｍ、２０×２０、Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）と展開溶媒としてクロロホルム：メタノール混合物（２０：１）を使用して薄層クロマトグフィーを遂行した。ＴＬＣ結果、Ｒｆは０．４（溶媒系；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）であり、結晶はアニスアルデヒド− Ｈ２ＳＯ４で黄斑として、３６５ｎｍＵＶ光（Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ−ＸＳ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社製、米国）で暗褐斑として検出されることが示された。
ＮＭＲ分光法（１Ｈ：３００ＭＨｚ、１３Ｃ：７５ＭＨｚ、ＤＲＸ３００、Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）による１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲデータの結果、黄色結晶がトリシン化合物であることが確認でき、トリシンの分光学的データは下記のように示された。
【００９３】
トリシン：Ｃ１７Ｈ１４Ｏ７
１H-NMR (300MHz, d6-DMSO): δ 12.96 (5-OH, 1H, s), 7.33(H-2',H-6', 2H, s), 6.97(H-3, 1H, s), 6.56(H-8, 1H, d, J=2.0Hz), 6.21(H-6, 1H, d, J=2.0Hz), 3.89(-OCH３, 6H, s).
１３C-NMR (75MHz, d6-DMSO): δ 182.66(C-4), 164.96(C-2), 164.53(C-7), 162.26(C-5), 158.21(C-9), 149.07(C-3',5'), 140.74(C-4'), 121.30(C-1'), 105.32(C-3), 104.61(C-2',6'), 104.46(C-10), 99.69(C-6), 95.04(C-8), 57.26(-OCH３)
【００９４】
７個の分画中、７番目の分画は分取ＨＰＬＣを遂行してフェニルプロパノイド化合物 ４．２ｍｇを得て、分離されたフェニルプロパノイド化合物がｐ−クマル酸誘導体であることを下記に示されるＮＭＲ分光法（１Ｈ：３００ＭＨｚ、ＤＲＸ ３００、Ｂｒｕｋｅｒ社製、ドイツ）による１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって確認し、ＨＰＬＣ分析の保持時間をシグマ社から購入した標準品であるｐ−クマル酸と比較した（図１及び２参照）。
【００９５】
ｐ−クマル酸：Ｃ９Ｈ８Ｏ３
１H-NMR (300MHz, d6-DMSO): δ 7.5 (H-2, H-6, 2H, d., J=8.4Hz), 7.48(H-γ, 1H, d., J=16.2Hz, 6.79(H-3, H-5, 2H, d., J=8.4Hz), 6.285(H-β, 1H, d., J=16.2Hz).
【００９６】
［実施例６］ トリシン及びｐ−クマル酸の含量分析
ジダケ、コウライザサ、ミヤコザサ、チシマザサ、チマキザサ、ハチク、マダケ、クロチク又はモウソウチクの葉及び茎抽出物１０ｇを用いてＨＰＬＣ（Ｈｉｔａｃｈｉ社製、Ｌ−７０００モデル）を利用して植物の異なる部分のトリシン及びｐ−クマル酸の含量を分析した。ＨＰＬＣ分析は表３に示される条件下で遂行した。
【００９７】
【表３】
【００９８】
種々の竹葉抽出物及び竹茎抽出物中のトリシンとｐ−クマル酸の含量を表４と５にそれぞれ示した。
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
［参照例１］ 細胞培養及び試薬
１−１．細胞培養
ネズミのマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を２．０ｍＭのＬ−アルギニン、１００μｇ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補給されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、米国）培地を用いて、３７ 、５％ ＣＯ２及び９５％空気条件の加湿インキュベーターで培養した。
培地は１週につき４回、１０ｍＬの新しいＤＭＥＭに交換し、継代培養は一週につき２回行った。
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を２０％ＦＢＳ、１００倍の抗生物質及び２００倍ＥＣＧＦが補給されたＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｃｔｉｃｓ社）中で０．２％ゼラチン被覆プレート（ＭＴＴ社）上で培養し、３〜５回継代培養した細胞を下記実験に使用した。
【０１０２】
１−２．試薬及び機器
本実験に使用した遠心分離機(Ｈａｎｉｌ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ社製、韓国)、核磁気共鳴分光器（ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｓｃｏｐｙ)（１Ｈ；３００ＭＨｚ、１３Ｃ；７５ＭＨｚ、ＤＲＸ ３００、Ｂｒｕｋｅｒ社製、ドイツ）及びＵＶ分光器（ｍｏｄｅｌ；Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ−ＸＳ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社製、米国）は韓国基礎科学研究院（韓国）保有の装備を使用し、カラムクロマトグラフィー用吸着剤としてはシリカゲル６０Ｈ（２３０〜４００メッシュ、Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）を使用し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用プレートとしてはシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（層の厚さ０．２ｍｍ、２０×２０ｃｍ、Ａｒｔ．５５５４、Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）を使用した。展開剤としてアニスアルデヒド−硫酸試薬を使用し、すべての有機溶媒はＤｕｋｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（韓国）から購入した。
【０１０３】
［実験例１］ 動物モデル試験
１−１．実験動物
血管保護及び血液循環改善に対する竹抽出物の効能を評価するために動脈硬化モデルマウスを実験に用いた。
Ｊａｃｋｓｏｎ社（米国）から手に入れた６週令の雄性ＬＤＬ受容体欠損マウス（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｌｄｌｒｔｍ１Ｈｅｒ）を１週間前から次第に増加する脂質飼料を与えることによって実験環境に順応させた。即ち、正常飼料対高脂質飼料の比率は次第に増加された（７：３（２日）、５：５（４日）、３：７（６日））。実験中、ケージ環境は温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％を保持し、１２時間人工照明下に、５匹未満のマウスを各マウス用ケージで飲水（消毒精製水）と正常脂質飼料（Ｈａｒｌａｎ ２０１８Ｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ社製、米国）を自由に供給しながら飼育した。８週後、高脂質飼料（Ｈａｒｌａｎ ＴＤ８８０５１、アテローム硬化性食餌、全脂質含量約１５．８％；コレステロールレベル１．２５％、及びコール酸ナトリウム０．５％、約４ｋｃａｌ／ｇ、及びｋｃａｌの３５％は脂肪からで、およその脂質の半分はカカオバターから由来し、半分は固形飼料から由来した）のみを供給した。
【０１０４】
１−２．分類及び投与期間
高脂質飼料に適応された８週令の雄性ＬＤＬ受容体欠損マウスを各群が６匹のマウスよりなる、２つの用量投与群及び１つの高用量群に分けた。陰性対照群として注射用蒸留水を用い、陽性対対照群として動脈硬化治療剤として広く使われているロバスタチンを４ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。竹抽出物を２つの容量群にそれぞれ５０及び１００ｍｇ／ｋｇ体重を投与し、１つの高容量群に５００ｍｇ／ｋｇ体重を２０週間投与した。投与は、毎日２回、体重測定後に、強制経口投与した（表６参照）。
【０１０５】
【表６】
【０１０６】
１−３．実験動物
血管保護及び血液循環改善に対する竹抽出物の効能を評価するために動脈硬化モデルマウスを実験に用いた。
Ｊａｃｋｓｏｎ社（米国）から手に入れた６週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスを１週間前から次第に増加する脂質飼料を投与することによって実験環境に順応させた。即ち、正常飼料対高脂質飼料の比率は次第に増加された（７：３（２日）、５：５（４日）、３：７（６日））。実験中、ケージ環境は温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％を保持し、１２時間人工照明下に、５匹未満のマウスを各マウス用ケージで飲水（消毒精製水）と正常脂質飼料（Ｈａｒｌａｎ ＴＤ８８０５１、アテローム硬化性食餌、全脂質含量約１５．８％；コレステロールレベル１．２５％、及びコール酸ナトリウム０．５％、約４ｋｃａｌ／ｇ、及びｋｃａｌの３５％は脂肪からで、およその脂質の半分はカカオバターから由来し、半分は固形飼料から由来した）のみを供給した。
【０１０７】
１−４．分類及び投与期間
高脂質飼料に適応された８週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスを各群が６匹のマウスよりなる、２つの用量投与群に分けた陰性対照群として注射用蒸留水をい、竹抽出物を２つの容量群にそれぞれ５０及び１００ｍｇ／ｋｇ体重を６ヶ月投与した。投与は毎日２回、体重測定後に強制経口投与した（表７参照）。
【０１０８】
【表７】
【０１０９】
［実験例２］ ＮＯ生産に関する竹抽出物及びそこから分離された化合物の効果
炎症因子中の一つである一酸化窒素（ＮＯ）に対する、竹抽出物及びそこから分離された化合物の抑制効果をテストするために、本発明の抽出物又は化合物で処理した細胞におけるＮＯの増加を測定した。
ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）の２００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地で３時間培養した。新しいＤＭＥＭ培地に交換して、１μｇ／ｍｌ濃度のＬＰＳ、及び実施例１〜５で製造した竹抽出物又はトリシンの５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌで処理した。これを５％ＣＯ２培養器中で、３７℃で２０時間培養した。
各ウェルの細胞培養上清１００μｌを新しい９６ウェルプレートに移し、グリース試薬（０．１％のＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミン二塩酸、５％Ｈ３ＰＯ４水溶液中の１％スルファニルアミド）１００μＬずつを加えて１０分間室温で培養した。これをＥＬＩＳＡリーダ（Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ−ＸＳ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社製、米国）を使用して５４０又は５５０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果は、下記の表８及び図２に示すように、竹抽出物１００μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬで処理した群は、それぞれ９０％及び５０％の割合でＮＯ生成を抑制した。即ち、竹抽出物処理群は対照群に比べて濃度依存的に効果的に抑制した。そして、非極性可溶性溶媒抽出物は極性可溶性溶媒抽出物より高いＮＯ抑制率を示した。
【０１１０】
【表８】
【０１１１】
非極性有機溶媒から活性成分を探索中に、我々は実施例５から製造されたトリシンが、無毒性の濃度である２５、１２．５及び６．５μｇ／ｍＬで濃度で強力なＮＯ抑制率を示すことを見出した（表９参照）。
【０１１２】
【表９】
【０１１３】
［実験例２］ エラスターゼ活性に関する竹抽出物の効果
血管における竹抽出物の効果を確認するために、本発明の竹抽出物を、血管の張力及び弾力の保持を管理するエラスチン蛋白質を分解するエラスターゼ酵素で処理した。
実施例１〜５で製造した竹抽出物及び分画を各２０、２及び０．２ｍｇ／ｍｌに希釈して９６ウェルプレートに５０μｌずつ添加した。市販のエラスターゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｐｒｏｂｅｓ社）を０．１５Ｕ／ｍｌの濃度でそこに添加し、エラスチン蛋白質も５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。酵素活性を測定するために、ＥＬＩＳＡリーダで吸光度を検出した。
表１０に示すように、Ｐ．ｎｉｇｒａ及びＳ．ｂｏｒｅａｌｉｓの竹抽出物は２ｍｇ／ｍｌの濃度でエラスターゼ活性を抑制し、竹抽出物のジクロロメタン、酢酸エチル及びｎ−ブタノール分画がより強力なエラスターゼ−抑制活性を示した。
【０１１４】
【表１０】
【０１１５】
［実験例３］ 血管内皮壁の創傷治癒に関する竹抽出物の効果
３−１．生体内での創傷治癒試験
血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を０．２％ゼラチン被覆１２−ウェルプレート上で密集成長させ、原創傷縁（original wound edge）を作るために細胞摩擦片（cell scraper）を使用してスクラッチングした。細胞を竹抽出物１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌで処理した後、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。細胞の移動程度を写真で
観察した。
その結果、図１０〜１２からわかるように、竹抽出物１０〜５０μｇ／ｍＬで処理したＨＵＶＥＣの移動が対照群に比べて顕著に増加しており、竹抽出物が血管内皮細胞の創傷回復効果を示したことが確認された。
【０１１６】
３−２．生体内での管形成試験
２４ウェルプレートのそれぞれのウェルに培地で１：２希釈されたマトリゲル（matrigel）２００μＬを塗布して３７℃で少なくても３０分間培養して、重合化し、１００細胞／ウェルのＨＵＶＥＣを播種した。
細胞を竹粗抽出物１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌで処理し、５％Ｃｏ２インキュベーターで培養した。ＨＵＶＥＣの形態学的変化を顕微鏡で定期的に観察した後、写真を撮った。
図１３〜１５に示すように、竹抽出物１０〜５０μｇ／ｍＬで処理したＨＵＶＥＣの管形成が対照群に比べて顕著に増加しているが観察され、竹抽出物が強力な血液循環を改善する潜在能力を有していることが確認された。
【０１１７】
［実験例４］ 遺伝子発現に関する竹抽出物及びトリシン化合物の効果
遺伝子発現に対する抑制効果を調べるために、本発明の抽出物又は化合物を細胞に処理して、そこから抽出したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに用いて遺伝子発現量を評価した。
【０１１８】
４−１．ｉＮＯＳ遺伝子発現に関する竹抽出物の効果
竹抽出物のｉＮＯＳ遺伝子発現に対する効果を観察するために、１×１０６個のＲＡＷ２６４．７細胞株をＬＰＳ及び種々濃度（０．０３２〜６５μｇ／ｍＬ）の本発明のＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ又はＳａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓの粗抽出物、又はクルクミンで処理し、２４時間培養した。下記逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に使用するために、トリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を利用して通常的な抽出方法でＲＮＡを抽出した。
ＲＴ−ＰＣＲはこの分野でよく知られている、ＲＴ反応（２５℃で１０分、４８℃で３０分、９５℃で５分、４℃で１０分；１サイクル）と二次的ＰＣＲ（５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６０℃で１分；４０サイクル）方法によって遂行した。
内部対照群として、１８ＳリボゾームＲＮＡを用いた。
表１１に示すように、リアルタイム遺伝子発現分析を通じて、ｉＮＯＳ遺伝子の発現を９０％抑制する濃度がクルクミン ４μｇ／ｍＬ、 Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ６２．５μｇ／ｍＬ、 Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ ６５μｇ／ｍＬであることが知られた。
【０１１９】
【表１１】
【０１２０】
上記表１１の結果を基にｉＮＯＳ遺伝子発現に対する各試料のＩＣ５０を計算して表１２に示した。
【０１２１】
【表１２】
【０１２２】
４−２．ＰＬＡ２遺伝子発現に関する竹抽出物の効果
炎症反応に関与する炎症性因子であるＰＬＡ２酵素に対する竹抽出物の効果を観察するために、１×１０６個のＲＡＷ２６４．７細胞株をＬＰＳと本発明の竹抽出物の種々濃度（０．０３２μｇ／ｍＬ〜６５μｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間培養した。下記逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に使用するために、トリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を利用して通常的な方法でＲＮＡを抽出した。
分光分析器で測定された抽出されたＲＮＡのＯＤ２６０／ＯＤ２８０値は１．７以上であり、変性アガロースゲル電気泳動を遂行してＲＮＡの純度を確認した。ＲＴ−ＰＣＲはこの分野でよく知られている、ＲＴ反応（２５℃で１０分、４８℃で３０分、９５℃で５分、４℃で１０分；１サイクル）と二次的ＰＣＲ（５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６０℃で１分；４０サイクル）方法によって遂行した。
内部対照群として、１８ＳリボゾームＲＮＡを用いた。
表１３からわかるように、竹抽出物が対照群と比較したとき、ＰＬＡ２遺伝子の発現を濃度依存的に抑制することが確認された。
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
４−３．ｕ−ＰＡ、ＰＡＩ−１遺伝子発現に関する竹抽出物の効果
上記実験例４−１に記載された方法によってＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲを遂行した。
表１４及び１５はその結果であり、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ及びＳａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ抽出物が血栓溶解に関係しているｕ−ＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子）遺伝子の発現を増加し、一方プラスミノゲン活性化因子の活性を抑制するＰＡＩ−１遺伝子の発現を低減していることが確認された。
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
４−４．ＶＥＧＦ、ｕ−ＰＡ及びｅＮＯＳ遺伝子発現に関するトリシンの効果
ＲＮＡをＲｎｅａｓｙミニキット（ｃａｔ＃７４１０３、Ｑｉａｇｅｎ社）により製造会社の使用説明書に従い、ＨＵＶＥＣ細胞から分離した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は定量的ＰＣＲ方法（ＳＤＳ７７００、Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、米国）を用いることで遂行した。
逆転写（ＲＴ）で得た５μＬのｃＤＮＡを９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに分注した後、５．６ｍＭ のＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭのｄＮＴＰ、０．０５％ゼラチン、１μＭの標的遺伝子プライマー１対又は０．１６μＭの管理遺伝子プライマー、０．５μＭの標的遺伝子プローブ又は０．０２５μＭの管理遺伝子プローブ、１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６０℃で１分；４０サイクル）のためにそこに加えた。
結果として、最終ｃＴ値を読んで計算した。
表１６及び図７〜９の結果、ＨＵＶＥＣに対するトリシン化合物処理がＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ｕ−ＰＡ遺伝子の発現を増加し、萎縮状態の血管の拡張に影響を与えるＮＯＳの発現を増加した。
【０１２８】
【表１６】
【０１２９】
［実験例５］ ＬＤＬ欠損マウスにおける一般症状及び体重変化に関する竹抽出物の効果
ＬＤＬ欠損マウスにおける一般症状及び体重の変化に対する効果を調べるために、一般症状の変化は治療期間中に１日１回以上毎日観察し、体重変化は群分け時、試験物質投与直前及び実験終了後、マウス屠殺直前に測定した。その結果、死亡したマウスもなく、特異な外観変化及び異状行動などのような臨床症状も観察できなかった（図１６参照）。さらに、試験期間中に体重の変化は観察されず、各群でマウス体重の平均値が約２．００±０．６ｇずつ増加した。
【０１３０】
［実験例６］ ＬＤＬ欠損マウスにおける血中脂質変化に関する竹抽出物の効果
ＬＤＬ欠損マウスおける血中脂質の変化に対する竹抽出物の効果を評価するために、下記方法を遂行した。
実験の終わりに、全てのマウスを０．１２％のアバーティン（ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔し、眼窩下静脈叢からへパリーン処理済みの毛細管を利用して採血した。それから、遠心分離（１１，０００ｇ、１０分間）して血漿を分離し、使用前に、−７０℃に保管した。血中脂質値はＴＣ（総コレステロール）、ＨＤＬ−Ｃ（高密度リポプロテインコレステロール ）、及びＴＧ（トリグリセリド）などの３つのカテゴリに分けて分析した（生命工学研究院実験動物室）。
表１７で見られるように、その結果は、５０、１００及び５００μｇ／ｍＬの竹抽出物で処理されたサンプル処理群でＴＣ（総コレステロール）、ＨＤＬ−Ｃ（高密度リポプロテインコレステロール ）及びＴＧ（トリグリセリド）の全ての値が対照群に比べて濃度依存的に減少することを示した。
【０１３１】
【表１７】
【０１３２】
［実験例７］ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血中脂質変化に関する竹抽出物の効果
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血中脂質の変化に対する竹抽出物の効果を観察するために、下記の方法を遂行した。
実験の終わりに、全てのマウスを０．１２％のアバーティンで麻酔し、眼窩下静脈叢からへパリーン処理済み毛細管を利用して採血した。それから、遠心分離（１１，０００ｇ、１０分間）して血漿を分離し、使用前に、−７０℃に保管した。 血中脂質値はＴＣ（総コレステロール）、ＨＤＬ−Ｃ（高密度リポプロテインコレステロール）、及びＴＧ（トリグリセリド）などの３つのカテゴリに分けて分析した（生命工学研究院実験動物室）。
表１７で見られるように、その結果は、５０、１００μｇ／ｍＬの竹抽出物の処理群でＴＣ、ＨＤＬ−Ｃ及びＴＧの全ての値が対照群に比べて濃度依存的に減少することを示した。
【０１３３】
【表１８】
【０１３４】
［実験例８］ ＬＤＬ欠損マウスにおける動脈硬化症に対する竹抽出物の抑制効果
ＬＤＬ欠損マウスにおける血管壁動脈硬症の発生及び病変進行を観察するために、下記の方法を遂行した。
実験の終わりに、採血した心臓を０．１Ｍ のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かした４％パラ−ホルムアルデヒドで固定し、残余の血液を除去して、１０％中性ホルマリンで固定した。それから、ＯＣＴ化合物に包埋して０．６μｍの厚さに切り、オイルレッドＯで染色し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンで染色程度を数えて病変を観察した。
病変領域の算出は３番目頚椎血管と大動脈弁膜と間に形成された病変染色を遂行し、病変の写真を撮った後、コンピュータによる形態計測（ＴＤＩ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、米国）で算出して、各対照群との比較を遂行した。
その結果、処理群が対照群に比べて動脈硬化症の形成を約１７％抑制する効果を示し、さらに、陽性対照群として使用したロバスタチンは約４７％の抑制効果を示して、新生内膜（neointima）の形成を抑制した（図１７及び１８参照）。
【０１３５】
［実験例９］ 細胞毒性試験及び細胞増殖試験
実施例５のトリシン化合物の細胞毒性は改変したＭＴＴ方法（J. Immunological Methods, 119, pp203-210, 1989）を用いて試験した。
平底９６−ウェルマイクロタイタータプレート（Ｎｕｎｃ，スウェーデン）に２００μｌのＨＵＶＥＣ（２×１０５細胞／ｍｌ）を入れて、製造されたトリシンを種々濃度で処理し、３７ で、２４時間、培養した。
各ウェルに５０μＬのＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を加えて、３７ で、４時間、培養した後、上清を除去した。
ホルマザン結晶を検出するために、１００μＬのＤＭＳＯをさらに、各ウェルに加えて、マイクロプレートリーダ（Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ−ＸＳ， Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、米国）を使用して５５０ｎｍの吸光度で発色程度を測定した。
その結果、本発明のトリシン化合物は５μｇ／ｍｌで５１％の強い細胞毒性を示した。しかし、竹抽出物又はｐ−クマル酸は細胞毒性がなかった（図５参照）。
竹抽出物の細胞増殖試験は、細胞増殖 ＥＬＩＳＡ ＢｒｄＵ 比色キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて遂行した。 ＨＵＶＥＣ細胞を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで接種した。細胞の三つ揃いプレートをＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｅｒを利用して測定した。
その結果として、竹抽出物は濃度依存的に強い細胞増殖を高めた。
【０１３６】
［実験例１０］ 動物毒性試験
方法（１）
ＩＣＲマウス（平均体重 ２５±５ｇ）及びＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２３５±１０ｇ、Ｊｕｎｇ−Ａｎｇ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ社）での急性毒性実験は実施例１の抽出物を用いて遂行した。１０匹のマウス又はラットからなる４つの群に、試験飼料又は溶媒（０．２ｍＬ、腹腔内）をそれぞれ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ及び５０００ｍｇ／ｋｇで腹膜組織内に経口投与し、２週間観察した。
【０１３７】
方法（２）
ＩＣＲマウス及びＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットでの急性毒性実験は実施例１の抽出物を用いて遂行した。１０匹のマウス又はラットからなる４つの群に、試験飼料又は溶媒（０．２ｍＬ、腹腔内）をそれぞれ、２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ及び７２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与し、２４時間観察した。
【０１３８】
結果
各群間又はどちらの性間において、死亡、臨床徴候、体重の変化、総体の発見物に対する上記処理関連結果はなかった。これらの結果は、本発明で製造された抽出物が強力、且つに安全な物質であることを示唆する。
【０１３９】
以下に、製剤方法及び成分の種類やを説明するが、それらは本発明を制限するものではない。代表的な製剤例を下記のように説明する。
【０１４０】
散剤の製造
実施例１の乾燥粉末 ５０ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
上記成分を混合して散剤を製剤し、シール・パッケージに充填した。
【０１４１】
錠剤の製造
実施例１の乾燥粉末 ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記成分を混合して錠剤を製剤し、打錠した。
【０１４２】
カプセルの製造
実施例１の乾燥粉末 ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
通常のゼラチン製剤方法によって、上記成分を混合して錠剤を製剤し、ゼラチンカプセルに充填した。
【０１４３】
注射剤の製造
実施例１の乾燥粉末 ５０ｍｇ
注射用蒸留水 適量
ＰＨコントローラー 適量
通常の注射剤製剤方法によって、上記活性成分を溶解し、ｐＨ７．５に調節した。全ての成分を２ｍｌアンプルに充填し、滅菌して注射剤を製剤した。
【０１４４】
液剤の製造
実施例１の抽出物 ０．１〜８０ｇ
白糖 ５〜１０ｇ
クエン酸 ０．０５〜０．３％
カラメル ０．００５〜０．０２％
ビタミンＣ ０．１〜１％
蒸留水 ７９〜９４％
ＣＯ２ガス ０．５〜０．８２％
上記活性成分を 常法の液剤製剤法によって溶かし、全ての成分を充填し、滅菌して液剤を製剤した。
【０１４５】
健康機能食品の製造
実施例１の抽出物 １０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０ｍｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５mg
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２ｍｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０ｍｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０ｍｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
ミネラル混合物 適量
硫酸鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
リン酸カリウム １５ｍｇ
リン酸二カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
上記のビタミン及びミネラル混合物の組成比は種々の方式で混合可能である。このような多様性は本発明の精神と範囲から逸脱しない。
【０１４６】
健康飲料の製造
実施例１の抽出物 １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
アプリコット濃度 ２ｇ
タウリン １ｇ
蒸留水 ９００ｍＬ
通常の健康飲料製造方法によって、上記活性成分を溶かし、混合し、８５℃で１時間攪拌し、濾過した後、全ての成分を１０００ｍｌアンプルに充填し、滅菌して健康飲料組成物を製造した。
【０１４７】
発明がこのように記載され、同様のことが様々な形で変えられることは自明であろう。このような改変は本発明の精神及び範囲から逸脱しなく、この技術分野で熟練した者にとって自明であるはずの全ての改変は、下記クレーム内に含まれることを意図している。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明に記述されたように、竹抽出物及びそれから得られるトリシン化合物はＮＯ生成及びＰＬＡ発現の抑制による強力な抗炎症活性を有し、エラスターゼ活性の抑制及び血管内皮細胞の創傷治癒、ｕＰＡ発現の活性化及びＰＡＩ−１発現抑制、そして、コレステロール沈着の低減及びネオインチマ形成の抑制による血液循環改善活性を有する。したがって、これは炎症及び血液循環疾患の治療及び予防のための治療剤又は健康機能食品として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は標準ｐ−クマル酸及びトリシンのＨＰＬＣ分析データを示す。
【図２】図２は本発明のｐ−クマル酸及びトリシンのＨＰＬＣ分析データを示す。
【図３】図３はの竹粗抽出物及びそこから分離された分画物（５０μｇ／ｍｌ濃度で処理）のＮＯ抑制効果を示す。
【図４】図３４の竹粗抽出物及びそこから分離された分画物（１００μｇ／ｍｌ濃度で処理）のＮＯ抑制効果を示す。
【図５】図５はＨＵＶＥＣにおける竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸の細胞毒性を示す。
【図６】図６はＨＵＶＥＣにおける竹抽出物の細胞増殖効果を示す。
【図７】図７は竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸のＶＥＧＦ遺伝子発現に対する効果を示す。
【図８】図８は竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸のｕ−ＰＡ遺伝子発現に対する効果を示す。
【図９】図９は竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸のｅＮＯＳ遺伝子発現に対する効果を示す。
【図１０】図１０は血管内皮壁の創傷治癒に対する対照の効果を示す。
【図１１】図１１は血管内皮壁の創傷治癒に対する竹抽出物（１０μｇ／ｍｌ）の効果を示す。
【図１２】図１２は血管内皮壁の創傷治癒に対する竹抽出物（５０μｇ／ｍｌ）の効果を示す。
【図１３】図１３は血管形成に対する対照の効果を示す。
【図１４】図１４は血管形成に対する竹抽出物（１０μｇ／ｍｌ）の効果を示す。
【図１５】図１５は血管形成に対する竹抽出物（１００μｇ／ｍｌ）の効果を示す。
【図１６】図１６は動脈硬化マウスにおける竹抽出物処理群及び非処理群の体重変化を示す。
【図１７】図１７は動脈硬化マウスにおける竹抽出物処理群及び非処理群のオイルレッドＯ染色された大動脈弁損傷部位の写真を示す。
【図１８】図１８は動脈硬化マウスにおける竹抽出物処理群及び非処理群のオイルレッドＯ染色された大動脈弁損傷部位のコンピュータ関連画像分析による形態計測の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性及び血液循環疾患の治療及び予防活性を示す竹抽出物及びそれから分離された化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液循環障害は沈着されたコレステロール、血管上の増加された血栓、及び血管の弾性力減少に基因する血流障害によって現われる。血液循環障害の代表例は手又は足のしびれ、首と肩のひきつり、記憶喪失、無気力、集中力低下、眩暈及び慢性疲労などであり、これらはしばしば正常な生活に混乱を与える。血液循環障害の一例である、高脂血症は血液脂質パラメータが血液内に増加する状態である。この状態は血液内に非正常的に高濃度の脂肪が存在する。循環血液中の脂質成分は総コレステロール、低密度リポタンパク質、極低密度リポタンパク質又は中性脂肪（トリグリセリド）である。
【０００３】
炎症は、例えば、バクテリア、カビ、ウイルス、種々のアレルゲンのような外部汚染物質の侵入によって、これらに対する炎症性反応及び生物物理学的工程を含んで、生じる。炎症反応の特有の兆候は酵素活性の増大、炎症媒介物質の放出、体液浸潤、細胞移動、組織破壊の一連の複合的な生理的反応に加えて、紅斑、浮腫、発熱、痛みなどの外的症候である。
【０００４】
これら炎症性反応の因子である、ＮＯ（一酸化窒素）は、最終生成物（即ち、ＮＯ）を形成するためにＬ−アルギニン（L-arginine）に作用する、ＮＯＳ（一酸化窒素シンターゼ）とシトルリン（citrulline）によって、中間体（ヒドロキシアルギニン）を経て、形成される。この物質（ＮＯ）は小さな分子量を有しており、血管系に作用して血管拡張、血小板凝集及び接着、神経伝達、及び消化器官運動を誘発し、神経伝達、血液凝固、血圧調節及び癌細胞などに対する免疫などのような代謝経路及び生理的反応を調節する重要な役割を果たすことが見出されている。これは遊離基構造であるために毒性が強く、大気中で安定化された最終産物、即ち、ＮＯ３とＮＯ２に変換される傾向がある（Snyder S. H., et al, Scientific American, May pp28-35, 1992）。
【０００５】
ＮＯＳはカルシウムイオン又はカルモジュリン（calmodulin）依存性によってｃＮＯＳ（構成上のＮＯＳ）とｉＮＯＳ（誘導性のＮＯＳ）とに分類されるが、カルシウムイオン又はカルモジュリン依存性のｃＮＯＳは主に脳、上皮細胞、好酸球、胃腸粘膜細胞に存在し、カルシウムイオン又はカルモジュリン非依存性のｉＮＯＳは主にマクロファージ細胞、肝細胞、癌細胞などに存在し、幾つかの要因、例えば、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン、又は細菌性ＬＰＳのようなエンドトキシンによって誘発される（Dinerman, J. L., et al, Circ. Res., 73, pp217-222, 1993）。ｉＮＯＳの発現はＣＯＸ−２発現と密に関係しており、したがって、生成されたＮＯはＣＯＸ−２発現に影響を与えることもある（Robert C., et al., J. Immunol., 165, pp1582-1587, 2000; Daniela S., et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 90, pp7240-7244, 1993）。
【０００６】
さらに、ｉＮＯＳに基因するＮＯ生成と動脈硬化、関節炎、胃炎、大膓炎、腎臓炎、肝炎、癌又は退行性疾患のような種々の炎症性疾患との相互関係に対する数多くの報告がある（Gobert A. P. et al., J. Immunol. 168(12), pp6002-6006, 2002; Dijkstra G. et al., Scand. J. Gastroenterol., 37(5) pp546-554, 2002; Sakac V. and Sakac M. Med. Pregl., 53, pp463-474, 2000; Albrecht E. W. et al., Am. J. Transplant, 29(5), pp448-453, 2002; Ramachandran A. et al., Free Radical Biol. Med., 33(11), pp1465-1474, 2002; Sartor L. et al., Biochemical Pharmacol., 64, pp229-237, 2002; Sadowska Krowicka H. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 217(3), pp351-357 1998; Lo A. H. et al., Carcinogenesis, 23(6) pp983-991, 2002）。
【０００７】
したがって、ｉＮＯＳに起因するＮＯ生成を強力に阻害する抑制剤を見つけて、上記記載の種々の炎症性疾患の治療及び予防する医薬品、健康機能食品、食品添加剤を開発するための研究が行なわれてきた。
【０００８】
タケ科（Bambusaceae）又はイネ科（Poaceae）に属する竹は、韓国及び日本を含むアジア諸国に分布している。全世界に分布している竹の種類は約１２５９種に達している。その中でも、タケ科に属する代表的なものは、マダケ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ ＳＩＥＢ．Ｅｔ Ｚｕｃｃ）、クロチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ）、ハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）及びモウソウチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ ＭＡＺＥＬ ｅｘ Ｈ．ｄｅ ＬＥＨ）であり、イネ科に属する代表的なものは、ジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）、コウライザサ（Ｓａｓａ ｃｏｒｅａｎａ Ｎａｋａｉ）、ミヤコザサ（Ｓａｓａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｍａｋｉｎｏ）、チシマザサ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ ｖａｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、チマキザサ（Ｓａｓａ ｐａｌｍａｔａ Ｎａｋａｉ）、イノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＢＥＡＵＶ）及びアジアイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ）である。
【０００９】
竹抽出物の用途に対する幾つかの報告、例えば、ミヤコザサからの葉抽出物の製造方法及びその抗菌活性を用いた食品保存剤としての用途を開示する韓国公開特許第１０-２００１-６９１３０号；抗癌活性を持つ竹から分離された多糖体を開示する米国特許出願第３４１８３１１号、がある。
【００１０】
しかし、竹抽出物及びそこから分離された化合物の炎症性又は血液循環疾患の治療効果については、上で引用したどの文献にも報告又は開示されていない。この開示は参考のためにここに組み込まれている。
【００１１】
幾つかの生化学的実験を通じて、竹抽出物及びそれから分離された化合物の炎症又は血液循環疾患の治療又は予防効果を調べて、確認するために、 本発明者らは、幾つかの生化学的実験、即ち、生体内でＬＰＳ活性化されたマクロファージ細胞によって誘導されるＮＯ又はＰＬＡ２生成抑制、 血管内で血栓溶解活性、血流量の調節及び細胞の成長に重要な役割を果たすｕ−ＰＡ、ｅＮＯＳ及びＶＥＧＦのような幾つかの遺伝子の発現に対する効果に加えて、細胞毒性テスト、ＬＤＬ受容体欠損マウス及び正常マウスを用いた動物モデルテストを鋭意遂行し、最終的に、竹抽出物及びそこから分離された化合物が炎症性又は血液循環疾患に対する治療及び予防活性を有していることを確認し、本発明を完成した。
【００１２】
これら及び本発明の他の目的は以下に提供する本発明の詳細な開示から明らかになるだろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、 ＮＯの過剰生成によって引き起こされる炎症性疾患の治療又は予防のために有効な量の竹抽出物又はそこから分離された化合物を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、 血液循環疾患の治療又は予防のために有効な量の竹抽出物又はそこから分離された化合物を含有する医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明は炎症性疾患及び血液循環疾患を治療及び予防する医薬組成物の製造のための上記竹抽出物又はそこから分離された化合物の用途も提供する。
【００１６】
本発明は上記竹抽出物又はそこから分離された化合物を含有する、血液循環疾患及びＮＯ生成の抑制による炎症性疾患の予防及び緩和のための健康機能食品も提供する。
【００１７】
したがって、本発明の目的は竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物を有効成分として含有する、心血管疾患の治療及び予防用医薬組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の目的は竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を有効成分として含有する、エラスターゼ活性抑制、血管無い内皮細胞の創傷治癒、ｕ−ＰＡ発現活性、ＰＡＩ−１発現抑制、コレステロール沈着低減及びネオインチマ（neointima）形成抑制による血液循環疾患を治療又は予防用医薬組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物を有効成分として含有する、ＮＯ生成及びホスホリパーゼＡ２発現の抑制による炎症の治療及び予防用医薬組成物を提供することである。
【００２０】
ここに記載された「粗抽出物」は水、メタノール、エタノールのような低級アルコール、好ましくはメタノールなど、又はこれらの混合物で植物性素材を抽出することによって製造される抽出物を含む。
【００２１】
ここに記載された用語「極性溶媒可溶性抽出物」は極性溶媒、例えば、水、メタノール、エタノールのような低級アルコール、好ましくはブタノールなど、又はこれらの混合物で上記粗抽出物を抽出することによって製造することができる。
【００２２】
ここに記載された用語「非極性溶媒可溶性抽出物」は非極性溶媒、例えば、ヘキサン、酢酸エチル又はジクロロメタン、好ましくは酢酸エチルで上記粗抽出物を抽出することによって製造することができる。
【００２３】
したがって、本発明の他の目的は竹抽出物から分離されたトリシンとｐ−クマル酸を有効成分として含有する、心血管疾患の治療又は予防のための医薬組成物を提供することである。
【００２４】
本発明の目的は竹抽出物から分離されたトリシンとｐ−クマル酸を有効成分として含有する、エラスターゼ活性抑制、血管内皮細胞の創傷治癒及びＶＥＧＦ、ｕ−ＰＡ及びｅＮＯＳ遺伝子発現の増加による血液循環疾患の治療及び予防のための医薬組成物を提供することである。
【００２５】
本発明の他の目的は竹抽出物から分離トリシンとｐ−クマル酸を有効成分として含有する、ＮＯ生成抑制による炎症の治療又は予防のための医薬組成物を提供することである。
【００２６】
ここに記載された用語「竹（Bamboo Plant）」とはタケ科（Bambusaceae）又はイネ科（Poraceae）に属する竹の茎又は葉を含む。タケ科に属する好ましい竹は、マダケ、クロチク、ハチク及びモウソウチクであり、より好ましくは、ハチクである。イネ科に属する好ましい竹は、ジダケ、コウライザサ、ミヤコザサ、チシマザサ、チマキザサ、イノコログサ及びアジアイネであり、より好ましくは、ジダケである。
【００２７】
ここに記載された用語「ｕＰＡ」はウロキナーゼ型プラスミノゲン活性因子遺伝子（繊維素溶解因子）、「ＰＬＡ２」はホスホリパーゼＡ２遺伝子、「ＶＥＧＦ」は血管内皮増殖因子遺伝子（vascular endothelial growth factor gene）、「ｅＮＯＳ」は内皮窒素酸化シンターゼ遺伝子（endothelial nitrous oxide synthase gene）、「ＰＡＩ−１」は１型プラスミノゲン活性化阻害剤遺伝子（plasminogen activator inhibitor 1 gene）である。
【００２８】
本発明の目的はヒト又は哺乳類でＮＯ生成及びＰＬＡ２発現の抑制による炎症性疾患の治療及び予防のための治療薬製造用の、竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物の用途を提供することである。
【００２９】
本発明の目的はヒト又は哺乳類でエラスターゼ活性抑制、血管内皮細胞の創傷治癒、ｕＰＡ発現活性及びＰＡＩ−１発現抑制、コレステロール沈着低減及びネオインチマ（neointima）形成抑制による血液循環疾患の予防及び治療のための治療薬製造用の、竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物の用途を提供することである。
【００３０】
本発明の目的は哺乳類において、竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物の有効量を、薬学的に許容しうる担体と共に上記哺乳類に投与することを含む、ＮＯ生成抑制による炎症性疾患の治療及び予防方法を提供することである。
【００３１】
本発明の目的は哺乳類において、竹の粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶竹抽出物の有効量を、薬学的に許容しうる担体と共に上記哺乳類に投与することを含む、エラスターゼ活性抑制及び血管内皮細胞の創傷治癒、コレステロール沈着低減及びネオインチマ（neointima）形成抑制による血液循環疾患の治療及び予防方法を提供することである。
【００３２】
本発明の他の目的は上記記載の抽出物又は化合物に加えて栄養学的に許容しうる添加剤を含有する、血液循環疾患及びＮＯ生成及びＰＬＡ発現抑制による炎症性疾患の予防及び緩和のための健康機能食品を提供することである。
【００３３】
ここに記載された用語「心血管疾患」とは高血圧、心臓病、脳卒中、末梢血管疾患、高脂血症、動脈硬化、狭窄症、血栓症又は心筋硬塞などのような種々の心血管疾患を含む。
【００３４】
ここに記載された用語「炎症性疾患」とは動脈硬化、関節炎、胃炎、大膓炎、腎炎、肝炎、癌又は多様な退行性疾患などのような種々の炎症性疾患を含む。
【００３５】
本発明の医薬組成物は組成物の全重量に対して上記抽出物又は化合物を約０．１〜７０重量％を含むことができる。
【００３６】
本発明の健康機能食品は組成物の全重量に対して上記抽出物又は化合物を０．０１〜８０重量％、好ましくは１〜６０重量％を含む。
【００３７】
上記健康機能食品は健康機能食品、健康飲料などに含有でき、粉末、顆粒、錠剤、そしゃく錠、カプセル、飲料などとして使用することができる。
【００３８】
本発明の竹から分離された抽出物及び化合物を下記好適な実施態様にしたがって製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４０】
本発明の竹抽出物は下記詳細な手順によって製造することができる。
【００４１】
本発明のハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）又はジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）抽出物は下記によって製造することができる；
ハチク又はジダケを乾燥し、切り、砕いて乾燥重量の５〜２５倍、好ましくはおよそ１０倍容量の蒸留水、メタノール、エタノール、ブタノール等のよな低級アルコール、又はその混合物、好ましくはメタノールと混合し；溶液は２０〜１００℃、好ましくは６０〜１００ の温度範囲で、１〜２４時間、熱水で処理し、熱水、冷水、還流抽出、又は超音波抽出の抽出方法で、１回〜５回、好ましくは２回〜３回、繰り返して処理し；残渣は濾過して上清を得、これをロータリー・エバポレータで２０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃の温度範囲で濃縮した後、真空凍結乾燥、熱風乾燥又は噴射乾燥で乾燥して水、低級アルコール又はその混合溶液に可溶性のハチク又はジダケの乾燥抽出粉末を得た。
【００４２】
さらに、本発明の極性溶媒可溶性抽出物と非極性溶媒可溶性抽出物は下記手順によって製造することが出来る；上記ステップによって製造された粗抽出物を水に懸濁した後、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサンなどのような非極性溶媒の１〜１００倍、 好ましくは１〜５倍容量と混合し；非極性溶媒可溶層を集めると、本発明の非極性溶媒可溶性抽出物が得られ、残りの極性溶媒可溶層を集めるとは水、低級アルコール又はその混合物に可溶性の本発明の極性溶媒可溶性抽出物が得られる。また、上記記載の方法は、より強力な分画物又は化合物を分別又は分離するために、当該技術分野で周知のような従来方法、例えば、文献（Harborne J. B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3ｒｄ Ed. pp6-7, 1998）に開示された方法によって、改変又は更なるステップを追加することができる 。
【００４３】
幾つかの生化学的実験を通じて、上記竹抽出物が炎症及び血液循環に対して効果があるかを調べて、抽出物と非極性溶媒可溶性抽出物が炎症の主要原因であるＮＯ生成を抑制、及び血液循環を改善する重要な役割を果たしているか否かを確認した。その結果、粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物及び非極性溶媒可溶性抽出物がＮＯの生成、ｉＮＯＳ遺伝子の発現、エラスターゼの活性及びＰＡＩ−１遺伝子の発現を抑制してｕＰＡ遺伝子発現を促進し、ｉｎ ｖｉｖｏで創傷治癒を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで血管形成の活性化及びコレステロール沈着及びネオインチマ形成の抑制を示すことが確認された。
【００４４】
本発明の他の態様によれば、上記製造法で製造されたハチク又はジダケの粗抽出物、極性溶媒可溶性抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を含有する、ＮＯ生成抑制による炎症の治療及び予防のための医薬組成物が提供される。
【００４５】
本発明の他の態様は、上記製造法で製造された抽出物を含む医薬組成物を炎症又は血液循環疾患の治療のためにヒトを含む哺乳類に投与することを含む治療方法及び予防方法を提供することである。
【００４６】
ＮＯ生成の抑制による炎症の治療及び予防、血液循環の改善するための本発明の組成物は、組成物全重量に対して上記抽出物を０．１〜７０重量％を含むことができる。
【００４７】
本発明の組成物は、さらに、当該技術分野で周知の使用方法に従って通常の担体、賦形剤又は希釈剤を含むことができる。上記担体は使用法及び応用方法によって適当な物質として使用されることが好ましいが、それに限定されるものではない。適当な希釈剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Mack Publishing Co. Easton PA）に記載されている。
【００４８】
以下の製剤方法及び添加剤は単に例示的なものであり、本発明を制限するものではない。
【００４９】
本発明に係る組成物は薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤、例えば、乳糖、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム又は鉱物油を含む医薬組成物として提供することができる。剤形はさらに充填剤、抗凝集剤、平滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、保存剤などのを含むことができる。本発明の組成物は当該技術分野で周知の手順を採用して、患者に投与した後、有効成分の迅速、持続又は遅延された放出を提供できるように製剤化することができる。
【００５０】
例えば、本発明の組成物は注射剤を生産するために通常的に使用されるオイル、プロピレングリコール又は他の溶媒に溶解することができる。適した担体の例は、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピルなどを含むが、これらに制限されない。局所投与のために、本発明の抽出物を軟膏剤又はクリームの形態で製剤化することができる。
【００５１】
本組成物を含有する医薬製剤は経口投与形態（散剤、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、水性薬剤、シロップ剤、エリキシル丸剤、粉剤、香粉、顆粒）、又は局所製剤（クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、香膏、パッチ剤、糊剤、散布液、エーロゾル剤など）、又は注射可能な製剤（溶液剤、懸濁剤、乳剤）などのあらゆる形態で製造することができる。
【００５２】
薬学的投与形態で、本発明の組成物は薬学的に許溶しうる塩の形態で使用することができ、また、単独又は適当な組み合わせで、他の薬学的活性成分と併用するようにして、使用することができる。
【００５３】
本発明の抽出物又は化合物の好ましい投与量は投与対象の健康状態及び体重、重症度、薬剤形態、投与経路及び期間によって変わり、また、当業者によって選択することもできる。しかし、所望の効果を得るために、本発明の抽出物又は化合物を 一般に、１日に、１０ｇ／ｋｇ範囲内、好ましくは１〜３ｇ／ｋｇで投与することが推奨される。投与は１日当り、１度又は数回に分けて投与することができる。組成物の点から見て、本発明の抽出物の量は組成物の全重量に対して０．０１〜７０重量％、好ましくは０．５〜５０重量％で存在しなければならない。
【００５４】
本発明の医薬組成物は種々経路を介して哺乳類（ラット、マウス、家畜又はヒト）などの対象動物に投与することができる。投与のすべて方式は、例えば、経口、直腸内又は静脈、筋肉、皮下、皮内、鞘内、硬膜外、又は脳室内注射の投与によってなされ得ることが予想される。
【００５５】
ここに記載された用語「健康機能食品」とは栄養補助食品（dietary supplement）、機能性食品（nutraceuticals）、食品又は食品添加物を含む。
【００５６】
また、本発明は上記記載の抽出物 ０．０１〜８０重量％、アミノ酸 ０．００１〜５重量％、ビタミン ０．００１〜２重量％、糖 ０．００１〜２０重量％、有機酸 ０．００１〜１０重量％、適量の甘味料及び香辛料を加えて、炎症及び血液循環の予防及び改善用健康機能食品飲料の組成物を提供する。
【００５７】
上記記載の竹抽出物は炎症及び血液循環の予防及び改善用食品及び飲料に加えることができる。
【００５８】
健康機能食品の開発のために、例えば、本発明の上記抽出物を含む食品組成物の例は、種々の食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進食品などであり、パウダー、顆粒、錠剤、そしょく錠、カプセル又は飲料などのとして使用することができる。
【００５９】
また、本発明の抽出物は調整粉乳、 成長期用調整粉乳、成長期用調整食品などのように、幼児及び乳児食品に添加して、アレルギー性疾患及び非アレルギー性炎症性疾患の予防及び改善させることができる。
【００６０】
上記記載の組成物は食品、添加剤又は飲料に添加することができ、食品又は飲料内の上記記載の抽出物の量は一般に健康機能食品組成物用食品の全重量の約０．１〜８０ｗ／ｗ％、好ましくは１〜５０ｗ／ｗ％、及び健康飲料組成物１００ｍＬを基準にして、１〜３０ｇ、好ましくは３〜１０ｇでありうる。
【００６１】
本発明の健康飲料組成物が指示された割合で、必須成分として上記抽出物を含有する場合には、他の液体成分には特別な制限はなく、通常の飲料のような種々の香味剤（ｄｅｏｄｏｒａｎｔ）又は天然炭水化物などを他の組成物として含有することができる。上記天然炭水化物の例は、ブドウ糖、果糖などのような単糖類、マルトース、蔗糖などのような二糖類、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、エリトリトールなどのような糖アルコールである。上記されたもの以外の他の香味剤として、天然香味剤（例；タウマチン、ステビア抽出物、例えば、レバウディオサイドＡ（levaudioside A）、グリチルリチンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなどのような）を有利に使用することができる。上記天然炭水化物の量は一般に本発明の飲料組成物１００ｍｌ当たり、 約１〜２０ｇ、好ましくは５〜１２ｇの範囲である。
【００６２】
上記組成物以外の他の成分は、種々の営養剤、ビタミン、鉱物又は電解質、合成風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭化剤などがある。上記のもの以外の他の成分は、天然果汁製造用果汁、果汁飲料及び野菜飲料が挙げられ、このような成分は独立的に又は組み合わせで使用することができる。この成分の比率はそれほど重要ではないが、一般に、本発明の組成物１００ｗ／ｗ％当たり、約０〜２０ｗ／ｗ％の範囲である。上記説明された抽出物を含む食品の例は、種々の食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進用食品などである。
【００６３】
本発明の組成物は、さらに、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸のような有機酸；ホスフェート、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酸性ピロリン酸、ポリホスフェートのようなリン酸塩；ポリフェノール、カテキン、α−トコフェロール、ローズマリー抽出物、ビタミンＣ、緑茶抽出物、甘草抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸などのような天然抗酸化剤を一つ以上含んでいてもよい。。
【００６４】
上記竹抽出物は２０〜９０％の高濃縮液体、粉末、又は顆粒形態とすることができる。
【００６５】
同様に、上記竹抽出物は、さらに、乳糖、カゼイン、デキストロース、ブドウ糖、蔗糖及びソルビトールを１つ以上含むことができる。
【００６６】
本発明の抽出物は毒性及び副作用がなく、したがって、安全に使用することができる。
【００６７】
本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、用途及び製法において種々の様々な変更及び変形することができることは当業者にとって自明であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
本発明の上記及び他の目的、特性及び他の長所は添付図面とともに下記の詳細な記述からより明らかに理解することができる。
【００６９】
図１と及びは、トリシン及びｐ−クマル酸のＨＰＬＣ分析のデータを示す。図１は標準群、図２は本発明の竹抽出物である。
【００７０】
図３及び４は、竹粗抽出物及びそこから分離された分画物の各濃度のＮＯ抑制効果を示す。図３は５０μｇ／ｍＬ濃度処理群について、図４は１００μｇ／ｍＬ濃度処理群についてである。
Ａ：粗抽出物
Ｂ：ｎ−ヘキサン可溶性抽出物
Ｃ：ジクロロメタン可溶性抽出物
Ｄ：ｎ−ブタノール可溶性抽出物
Ｅ：酢酸エチル可溶性抽出物
Ｆ：水溶性抽出物
【００７１】
図５はＨＵＶＥＣにおける竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸の細胞毒性を示す。ここで、グラフ線上に記載された数字は処理サンプル濃度（μｇ／ｍＬ）を意味する。
【００７２】
図６はＨＵＶＥＣにおける竹抽出物の細胞増殖効果を示す。
【００７３】
図７〜９は、ＨＵＶＥＣの完全培地でのｍＲＮＡ発現に対する竹抽出物、トリシン及びｐ−クマルの効果を示す。図７はＶＥＧＦ遺伝子発現、図８はｕ−ＰＡ遺伝子発現、図９はｅＮＯＳ遺伝子発現に対する効果であり、ここで、グラフ線上に記載された数字は処理サンプル濃度（μｇ／ｍＬ）を意味する。
【００７４】
図１０〜１２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＵＶＥＣを用いる創傷治癒試験による本発明の竹抽出物の創傷治癒効果を示す。図１０は対照群、図１１は１０μｇ／ｍＬの竹抽出物処理群、図１２は５０μｇ／ｍＬの竹抽出物処理群である。
【００７５】
図１３〜１５は、 ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＵＶＥＣを用いる血管形成試験による本発明の竹抽出物の血管形成効果を示す。図１３は対照群、図１４は１０μｇ／ｍＬの竹抽出物処理群 、図１５は１００μｇ／ｍＬの竹抽出物処理群である。
【００７６】
図１６は、高農度のコレステロール食餌により誘導された動脈硬化ネズミにおける竹抽出物１６週間（５０及び１００ｍｇ／ｋｇ）及び２０週間（５００ｍｇ／ｋｇ）処理群及び非処理群の体重変化を示す。
【００７７】
図１７及び１８は、高農度のコレステロール食餌により誘導された動脈硬化マウスにおける竹抽出物１６週間（５０と１００ｍｇ／ｋｇ）及び２０週間（５００ｍｇ／ｋｇ）処理群と非処理群の、オイルレッドＯ染色された（ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｅｄ）大動脈弁損傷部位（aortic valve lesion areas）のコンピュータ関連画像分析による形態計測を示す。
【００７８】
図１７は、大動脈弁損傷の凍結切片のオイルレッドＯ染色された写真を示し、ここで、左写真は対照群、中央写真はロバスタチン処理の陽性対対照群、右写真は竹抽出物処理の写真である。図１８は、コンピュータ関連画像分析による大動脈弁損傷部位の形態計測の結果を示す。
【実施例】
【００７９】
本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、用途及び製法において種々の様々な変更及び変形することができることは当業者にとって自明であろう。
【００８０】
本発明は下記実施例によってさらに詳しく説明される。しかし、本発明はいかなる方法によってもこれら実施例に制限されるものではないと理解できるだろう。
【００８１】
下記参照例、実施例及び実験例はその範囲を制限することなく、本発明をさらに説明するために示されている。
【００８２】
［実施例１］ 竹粗抽出物の製造
ジダケ、コウライザサ、ミヤコザサ、チシマザサ、チマキザサ（Ｓａｓａ ｐａｌｍａｔａ Ｎａｋａｉ）、ハチク、マダケ、クロチク及びモウソウチクの竹を洗浄し、室温で１０日間乾燥した。
【００８３】
乾燥した竹の葉及び茎１０ｋｇを小さく切り、７０％エタノール１００ｍＬと混合し、その混合物を８０℃で７時間、３度繰り返して加熱した。そして、抽出物を濾紙（ワットマン社製、米国）で濾過した。濾液を集め、５５〜６５℃で、ロータリー・エバポレータ（Ｎ−１０００、Ｅｙｅｌａ社、日本）によって減圧濃縮し、凍結乾燥器（速度仕様 ３０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）で乾燥して、それぞれ竹の乾燥粗抽出物出を得た（表１参照）。
【００８４】
【表１】
【００８５】
［実施例２］ Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの極性溶媒及び非極性溶媒可溶性抽出物の製造
２−１．ｎ−ヘキサン可溶性抽出物の製造
実施例１で製造したＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの粗抽出物５０ｇを１リットルの蒸留水に懸濁し、その懸濁液をｎ−ヘキサン１リットルと激しく混合してｎ−ヘキサン可溶性分画と水−可溶性分画とに分けた。ｎ−ヘキサン可溶性分画を集め、残余溶液はｎ−ヘキサン抽出を再び遂行した。上記過程を３度繰り返した。
ｎ−ヘキサン可溶性分画を真空内で蒸発してＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａのｎ−ヘキサン可溶性抽出物９．１ｇを得た。
【００８６】
２−２．ジクロロメタン可溶性抽出物の製造
実施例２−１で製造されたＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの水−可溶性分画を同一量のジクロロメタンと激しく混合してジクロロメタン可溶性分画と水−可溶性分画とに分けた。ジクロロメタン可溶性分画を集め、残余溶液はジクロロメタン抽出を再び遂行した。上記過程を３度繰り返した。
ジクロロメタン可溶性分画を真空内で蒸発してＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａのジクロロメタン可溶性抽出物４．６gを得た。
【００８７】
２−３．酢酸エチル可溶性抽出物の製造
実施例２−２で製造したＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの水−可溶性分画を同一量の酢酸エチルと激しく混合して酢酸エチル可溶性分画と水−可溶性分画とに分けた。酢酸エチル可溶性分画を集め、残余溶液は酢酸エチル抽出を再び遂行した。上記過程を３度繰り返した。
酢酸エチル可溶性分画を真空内で蒸発してＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの酢酸エチル可溶性抽出物４．３gを得た。
【００８８】
２−４．ｎ−ブタノール及び水−可溶性抽出物の製造
実施例２−３で製造したＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａの水−可溶性分画を同一量のｎ−ブタノールと激しく混合してｎ−ブタノール可溶性分画と水−可溶性分画とに分けた。ｎ−ブタノール可溶性分画を集め、残余溶液はｎ−ブタノール抽出を再び遂行した。上記過程を３度繰り返した。
ｎ−ブタノール可溶性分画及び水−可溶性分画をそれぞれ真空内で蒸発してＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａのｎ−ブタノール可溶性抽出物７．１ｇ及び水−可溶性抽出物２５．１ｇを得た。
【００８９】
［実施例３］ Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓの極性溶媒及び非極性溶媒可溶性抽出物の製造（１）
表２に示されるように、上記実施例２に開示された同一の方法によって、極性溶媒可溶性抽出物及び非極性可溶性抽出物を製造した。
【００９０】
【表２】
【００９１】
［実施例４］ Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ の極性溶媒及び非極性溶媒可溶性抽出物の製造（２）
実施例１で製造したジダケの茎からの乾燥抽出物を下記のように分画した。
実施例１で得た粗抽出物１００ｇを精製水１０００ｍＬに懸濁した。クロロホルム１０００ｍｌを分液漏斗中でこれに加え、混合物を激しく振ってクロロホルム可溶性層と水可溶性層とに分けた。クロロホルム可溶性分画を集め、残余溶液はクロロホルム抽出を再び遂行した。
上記過程を３度繰り返してクロロホルム可溶性構成要素を分離し、クロロホルム可溶性分画を集め、減圧下で乾燥してクロロホルム可溶性分画１７．８ｇを得た。
上記水可溶性分画を同一量の酢酸エチルと混合した後、酢酸エチル可溶性層と水−可溶性層とに分けた。上記分画工程を３度繰り返した。
上記酢酸エチル可溶性層をロータリー・エバポレータにより濃縮し、減圧下で乾燥して酢酸エチル可溶性抽出物 １５．４ｇを得た。
最終的に、さらに、水−可溶性層を下記実験のサンプルとして使用するために得た。
【００９２】
［実施例５］ トリシンとｐ−クマル酸の分離
実施例４で製造した酢酸エチル可溶性分画１０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付してトリシンとｐ−クマル酸とを分離した。
１０ｇの酢酸エチル分画をシリカゲルカラムに載せ、カラムを直線濃度勾配を含む混合溶媒クロロホルム：アセトン（１００：１〜１：１）で溶出して７個のサブ−分画を得た。７個の分画中、４番目の分画をメタノールを用いて再結晶し、２６ｍｇの黄色の結晶を分離した。
上記で得た黄色の結晶をＴＬＣプレート（シリカゲル６０ Ｆ２５４プレート、層の厚さ０．２ｍｍ、２０×２０、Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）と展開溶媒としてクロロホルム：メタノール混合物（２０：１）を使用して薄層クロマトグフィーを遂行した。ＴＬＣ結果、Ｒｆは０．４（溶媒系；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）であり、結晶はアニスアルデヒド− Ｈ２ＳＯ４で黄斑として、３６５ｎｍＵＶ光（Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ−ＸＳ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社製、米国）で暗褐斑として検出されることが示された。
ＮＭＲ分光法（１Ｈ：３００ＭＨｚ、１３Ｃ：７５ＭＨｚ、ＤＲＸ３００、Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）による１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲデータの結果、黄色結晶がトリシン化合物であることが確認でき、トリシンの分光学的データは下記のように示された。
【００９３】
トリシン：Ｃ１７Ｈ１４Ｏ７
１H-NMR (300MHz, d6-DMSO): δ 12.96 (5-OH, 1H, s), 7.33(H-2',H-6', 2H, s), 6.97(H-3, 1H, s), 6.56(H-8, 1H, d, J=2.0Hz), 6.21(H-6, 1H, d, J=2.0Hz), 3.89(-OCH３, 6H, s).
１３C-NMR (75MHz, d6-DMSO): δ 182.66(C-4), 164.96(C-2), 164.53(C-7), 162.26(C-5), 158.21(C-9), 149.07(C-3',5'), 140.74(C-4'), 121.30(C-1'), 105.32(C-3), 104.61(C-2',6'), 104.46(C-10), 99.69(C-6), 95.04(C-8), 57.26(-OCH３)
【００９４】
７個の分画中、７番目の分画は分取ＨＰＬＣを遂行してフェニルプロパノイド化合物 ４．２ｍｇを得て、分離されたフェニルプロパノイド化合物がｐ−クマル酸誘導体であることを下記に示されるＮＭＲ分光法（１Ｈ：３００ＭＨｚ、ＤＲＸ ３００、Ｂｒｕｋｅｒ社製、ドイツ）による１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって確認し、ＨＰＬＣ分析の保持時間をシグマ社から購入した標準品であるｐ−クマル酸と比較した（図１及び２参照）。
【００９５】
ｐ−クマル酸：Ｃ９Ｈ８Ｏ３
１H-NMR (300MHz, d6-DMSO): δ 7.5 (H-2, H-6, 2H, d., J=8.4Hz), 7.48(H-γ, 1H, d., J=16.2Hz, 6.79(H-3, H-5, 2H, d., J=8.4Hz), 6.285(H-β, 1H, d., J=16.2Hz).
【００９６】
［実施例６］ トリシン及びｐ−クマル酸の含量分析
ジダケ、コウライザサ、ミヤコザサ、チシマザサ、チマキザサ、ハチク、マダケ、クロチク又はモウソウチクの葉及び茎抽出物１０ｇを用いてＨＰＬＣ（Ｈｉｔａｃｈｉ社製、Ｌ−７０００モデル）を利用して植物の異なる部分のトリシン及びｐ−クマル酸の含量を分析した。ＨＰＬＣ分析は表３に示される条件下で遂行した。
【００９７】
【表３】
【００９８】
種々の竹葉抽出物及び竹茎抽出物中のトリシンとｐ−クマル酸の含量を表４と５にそれぞれ示した。
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
［参照例１］ 細胞培養及び試薬
１−１．細胞培養
ネズミのマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を２．０ｍＭのＬ−アルギニン、１００μｇ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補給されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、米国）培地を用いて、３７ 、５％ ＣＯ２及び９５％空気条件の加湿インキュベーターで培養した。
培地は１週につき４回、１０ｍＬの新しいＤＭＥＭに交換し、継代培養は一週につき２回行った。
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を２０％ＦＢＳ、１００倍の抗生物質及び２００倍ＥＣＧＦが補給されたＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｃｔｉｃｓ社）中で０．２％ゼラチン被覆プレート（ＭＴＴ社）上で培養し、３〜５回継代培養した細胞を下記実験に使用した。
【０１０２】
１−２．試薬及び機器
本実験に使用した遠心分離機(Ｈａｎｉｌ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ社製、韓国)、核磁気共鳴分光器（ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｓｃｏｐｙ)（１Ｈ；３００ＭＨｚ、１３Ｃ；７５ＭＨｚ、ＤＲＸ ３００、Ｂｒｕｋｅｒ社製、ドイツ）及びＵＶ分光器（ｍｏｄｅｌ；Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ−ＸＳ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社製、米国）は韓国基礎科学研究院（韓国）保有の装備を使用し、カラムクロマトグラフィー用吸着剤としてはシリカゲル６０Ｈ（２３０〜４００メッシュ、Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）を使用し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用プレートとしてはシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（層の厚さ０．２ｍｍ、２０×２０ｃｍ、Ａｒｔ．５５５４、Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）を使用した。展開剤としてアニスアルデヒド−硫酸試薬を使用し、すべての有機溶媒はＤｕｋｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（韓国）から購入した。
【０１０３】
［実験例１］ 動物モデル試験
１−１．実験動物
血管保護及び血液循環改善に対する竹抽出物の効能を評価するために動脈硬化モデルマウスを実験に用いた。
Ｊａｃｋｓｏｎ社（米国）から手に入れた６週令の雄性ＬＤＬ受容体欠損マウス（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｌｄｌｒｔｍ１Ｈｅｒ）を１週間前から次第に増加する脂質飼料を与えることによって実験環境に順応させた。即ち、正常飼料対高脂質飼料の比率は次第に増加された（７：３（２日）、５：５（４日）、３：７（６日））。実験中、ケージ環境は温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％を保持し、１２時間人工照明下に、５匹未満のマウスを各マウス用ケージで飲水（消毒精製水）と正常脂質飼料（Ｈａｒｌａｎ ２０１８Ｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ社製、米国）を自由に供給しながら飼育した。８週後、高脂質飼料（Ｈａｒｌａｎ ＴＤ８８０５１、アテローム硬化性食餌、全脂質含量約１５．８％；コレステロールレベル１．２５％、及びコール酸ナトリウム０．５％、約４ｋｃａｌ／ｇ、及びｋｃａｌの３５％は脂肪からで、およその脂質の半分はカカオバターから由来し、半分は固形飼料から由来した）のみを供給した。
【０１０４】
１−２．分類及び投与期間
高脂質飼料に適応された８週令の雄性ＬＤＬ受容体欠損マウスを各群が６匹のマウスよりなる、２つの用量投与群及び１つの高用量群に分けた。陰性対照群として注射用蒸留水を用い、陽性対対照群として動脈硬化治療剤として広く使われているロバスタチンを４ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。竹抽出物を２つの容量群にそれぞれ５０及び１００ｍｇ／ｋｇ体重を投与し、１つの高容量群に５００ｍｇ／ｋｇ体重を２０週間投与した。投与は、毎日２回、体重測定後に、強制経口投与した（表６参照）。
【０１０５】
【表６】
【０１０６】
１−３．実験動物
血管保護及び血液循環改善に対する竹抽出物の効能を評価するために動脈硬化モデルマウスを実験に用いた。
Ｊａｃｋｓｏｎ社（米国）から手に入れた６週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスを１週間前から次第に増加する脂質飼料を投与することによって実験環境に順応させた。即ち、正常飼料対高脂質飼料の比率は次第に増加された（７：３（２日）、５：５（４日）、３：７（６日））。実験中、ケージ環境は温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％を保持し、１２時間人工照明下に、５匹未満のマウスを各マウス用ケージで飲水（消毒精製水）と正常脂質飼料（Ｈａｒｌａｎ ＴＤ８８０５１、アテローム硬化性食餌、全脂質含量約１５．８％；コレステロールレベル１．２５％、及びコール酸ナトリウム０．５％、約４ｋｃａｌ／ｇ、及びｋｃａｌの３５％は脂肪からで、およその脂質の半分はカカオバターから由来し、半分は固形飼料から由来した）のみを供給した。
【０１０７】
１−４．分類及び投与期間
高脂質飼料に適応された８週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスを各群が６匹のマウスよりなる、２つの用量投与群に分けた陰性対照群として注射用蒸留水をい、竹抽出物を２つの容量群にそれぞれ５０及び１００ｍｇ／ｋｇ体重を６ヶ月投与した。投与は毎日２回、体重測定後に強制経口投与した（表７参照）。
【０１０８】
【表７】
【０１０９】
［実験例２］ ＮＯ生産に関する竹抽出物及びそこから分離された化合物の効果
炎症因子中の一つである一酸化窒素（ＮＯ）に対する、竹抽出物及びそこから分離された化合物の抑制効果をテストするために、本発明の抽出物又は化合物で処理した細胞におけるＮＯの増加を測定した。
ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）の２００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地で３時間培養した。新しいＤＭＥＭ培地に交換して、１μｇ／ｍｌ濃度のＬＰＳ、及び実施例１〜５で製造した竹抽出物又はトリシンの５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌで処理した。これを５％ＣＯ２培養器中で、３７℃で２０時間培養した。
各ウェルの細胞培養上清１００μｌを新しい９６ウェルプレートに移し、グリース試薬（０．１％のＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミン二塩酸、５％Ｈ３ＰＯ４水溶液中の１％スルファニルアミド）１００μＬずつを加えて１０分間室温で培養した。これをＥＬＩＳＡリーダ（Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ−ＸＳ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社製、米国）を使用して５４０又は５５０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果は、下記の表８及び図２に示すように、竹抽出物１００μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬで処理した群は、それぞれ９０％及び５０％の割合でＮＯ生成を抑制した。即ち、竹抽出物処理群は対照群に比べて濃度依存的に効果的に抑制した。そして、非極性可溶性溶媒抽出物は極性可溶性溶媒抽出物より高いＮＯ抑制率を示した。
【０１１０】
【表８】
【０１１１】
非極性有機溶媒から活性成分を探索中に、我々は実施例５から製造されたトリシンが、無毒性の濃度である２５、１２．５及び６．５μｇ／ｍＬで濃度で強力なＮＯ抑制率を示すことを見出した（表９参照）。
【０１１２】
【表９】
【０１１３】
［実験例２］ エラスターゼ活性に関する竹抽出物の効果
血管における竹抽出物の効果を確認するために、本発明の竹抽出物を、血管の張力及び弾力の保持を管理するエラスチン蛋白質を分解するエラスターゼ酵素で処理した。
実施例１〜５で製造した竹抽出物及び分画を各２０、２及び０．２ｍｇ／ｍｌに希釈して９６ウェルプレートに５０μｌずつ添加した。市販のエラスターゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｐｒｏｂｅｓ社）を０．１５Ｕ／ｍｌの濃度でそこに添加し、エラスチン蛋白質も５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。酵素活性を測定するために、ＥＬＩＳＡリーダで吸光度を検出した。
表１０に示すように、Ｐ．ｎｉｇｒａ及びＳ．ｂｏｒｅａｌｉｓの竹抽出物は２ｍｇ／ｍｌの濃度でエラスターゼ活性を抑制し、竹抽出物のジクロロメタン、酢酸エチル及びｎ−ブタノール分画がより強力なエラスターゼ−抑制活性を示した。
【０１１４】
【表１０】
【０１１５】
［実験例３］ 血管内皮壁の創傷治癒に関する竹抽出物の効果
３−１．生体内での創傷治癒試験
血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を０．２％ゼラチン被覆１２−ウェルプレート上で密集成長させ、原創傷縁（original wound edge）を作るために細胞摩擦片（cell scraper）を使用してスクラッチングした。細胞を竹抽出物１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌで処理した後、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。細胞の移動程度を写真で
観察した。
その結果、図１０〜１２からわかるように、竹抽出物１０〜５０μｇ／ｍＬで処理したＨＵＶＥＣの移動が対照群に比べて顕著に増加しており、竹抽出物が血管内皮細胞の創傷回復効果を示したことが確認された。
【０１１６】
３−２．生体内での管形成試験
２４ウェルプレートのそれぞれのウェルに培地で１：２希釈されたマトリゲル（matrigel）２００μＬを塗布して３７℃で少なくても３０分間培養して、重合化し、１００細胞／ウェルのＨＵＶＥＣを播種した。
細胞を竹粗抽出物１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌで処理し、５％Ｃｏ２インキュベーターで培養した。ＨＵＶＥＣの形態学的変化を顕微鏡で定期的に観察した後、写真を撮った。
図１３〜１５に示すように、竹抽出物１０〜５０μｇ／ｍＬで処理したＨＵＶＥＣの管形成が対照群に比べて顕著に増加しているが観察され、竹抽出物が強力な血液循環を改善する潜在能力を有していることが確認された。
【０１１７】
［実験例４］ 遺伝子発現に関する竹抽出物及びトリシン化合物の効果
遺伝子発現に対する抑制効果を調べるために、本発明の抽出物又は化合物を細胞に処理して、そこから抽出したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに用いて遺伝子発現量を評価した。
【０１１８】
４−１．ｉＮＯＳ遺伝子発現に関する竹抽出物の効果
竹抽出物のｉＮＯＳ遺伝子発現に対する効果を観察するために、１×１０６個のＲＡＷ２６４．７細胞株をＬＰＳ及び種々濃度（０．０３２〜６５μｇ／ｍＬ）の本発明のＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ又はＳａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓの粗抽出物、又はクルクミンで処理し、２４時間培養した。下記逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に使用するために、トリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を利用して通常的な抽出方法でＲＮＡを抽出した。
ＲＴ−ＰＣＲはこの分野でよく知られている、ＲＴ反応（２５℃で１０分、４８℃で３０分、９５℃で５分、４℃で１０分；１サイクル）と二次的ＰＣＲ（５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６０℃で１分；４０サイクル）方法によって遂行した。
内部対照群として、１８ＳリボゾームＲＮＡを用いた。
表１１に示すように、リアルタイム遺伝子発現分析を通じて、ｉＮＯＳ遺伝子の発現を９０％抑制する濃度がクルクミン ４μｇ／ｍＬ、 Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ６２．５μｇ／ｍＬ、 Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ ６５μｇ／ｍＬであることが知られた。
【０１１９】
【表１１】
【０１２０】
上記表１１の結果を基にｉＮＯＳ遺伝子発現に対する各試料のＩＣ５０を計算して表１２に示した。
【０１２１】
【表１２】
【０１２２】
４−２．ＰＬＡ２遺伝子発現に関する竹抽出物の効果
炎症反応に関与する炎症性因子であるＰＬＡ２酵素に対する竹抽出物の効果を観察するために、１×１０６個のＲＡＷ２６４．７細胞株をＬＰＳと本発明の竹抽出物の種々濃度（０．０３２μｇ／ｍＬ〜６５μｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間培養した。下記逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に使用するために、トリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を利用して通常的な方法でＲＮＡを抽出した。
分光分析器で測定された抽出されたＲＮＡのＯＤ２６０／ＯＤ２８０値は１．７以上であり、変性アガロースゲル電気泳動を遂行してＲＮＡの純度を確認した。ＲＴ−ＰＣＲはこの分野でよく知られている、ＲＴ反応（２５℃で１０分、４８℃で３０分、９５℃で５分、４℃で１０分；１サイクル）と二次的ＰＣＲ（５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６０℃で１分；４０サイクル）方法によって遂行した。
内部対照群として、１８ＳリボゾームＲＮＡを用いた。
表１３からわかるように、竹抽出物が対照群と比較したとき、ＰＬＡ２遺伝子の発現を濃度依存的に抑制することが確認された。
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
４−３．ｕ−ＰＡ、ＰＡＩ−１遺伝子発現に関する竹抽出物の効果
上記実験例４−１に記載された方法によってＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲを遂行した。
表１４及び１５はその結果であり、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ及びＳａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ抽出物が血栓溶解に関係しているｕ−ＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子）遺伝子の発現を増加し、一方プラスミノゲン活性化因子の活性を抑制するＰＡＩ−１遺伝子の発現を低減していることが確認された。
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
４−４．ＶＥＧＦ、ｕ−ＰＡ及びｅＮＯＳ遺伝子発現に関するトリシンの効果
ＲＮＡをＲｎｅａｓｙミニキット（ｃａｔ＃７４１０３、Ｑｉａｇｅｎ社）により製造会社の使用説明書に従い、ＨＵＶＥＣ細胞から分離した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は定量的ＰＣＲ方法（ＳＤＳ７７００、Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、米国）を用いることで遂行した。
逆転写（ＲＴ）で得た５μＬのｃＤＮＡを９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに分注した後、５．６ｍＭ のＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭのｄＮＴＰ、０．０５％ゼラチン、１μＭの標的遺伝子プライマー１対又は０．１６μＭの管理遺伝子プライマー、０．５μＭの標的遺伝子プローブ又は０．０２５μＭの管理遺伝子プローブ、１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６０℃で１分；４０サイクル）のためにそこに加えた。
結果として、最終ｃＴ値を読んで計算した。
表１６及び図７〜９の結果、ＨＵＶＥＣに対するトリシン化合物処理がＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ｕ−ＰＡ遺伝子の発現を増加し、萎縮状態の血管の拡張に影響を与えるＮＯＳの発現を増加した。
【０１２８】
【表１６】
【０１２９】
［実験例５］ ＬＤＬ欠損マウスにおける一般症状及び体重変化に関する竹抽出物の効果
ＬＤＬ欠損マウスにおける一般症状及び体重の変化に対する効果を調べるために、一般症状の変化は治療期間中に１日１回以上毎日観察し、体重変化は群分け時、試験物質投与直前及び実験終了後、マウス屠殺直前に測定した。その結果、死亡したマウスもなく、特異な外観変化及び異状行動などのような臨床症状も観察できなかった（図１６参照）。さらに、試験期間中に体重の変化は観察されず、各群でマウス体重の平均値が約２．００±０．６ｇずつ増加した。
【０１３０】
［実験例６］ ＬＤＬ欠損マウスにおける血中脂質変化に関する竹抽出物の効果
ＬＤＬ欠損マウスおける血中脂質の変化に対する竹抽出物の効果を評価するために、下記方法を遂行した。
実験の終わりに、全てのマウスを０．１２％のアバーティン（ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔し、眼窩下静脈叢からへパリーン処理済みの毛細管を利用して採血した。それから、遠心分離（１１，０００ｇ、１０分間）して血漿を分離し、使用前に、−７０℃に保管した。血中脂質値はＴＣ（総コレステロール）、ＨＤＬ−Ｃ（高密度リポプロテインコレステロール ）、及びＴＧ（トリグリセリド）などの３つのカテゴリに分けて分析した（生命工学研究院実験動物室）。
表１７で見られるように、その結果は、５０、１００及び５００μｇ／ｍＬの竹抽出物で処理されたサンプル処理群でＴＣ（総コレステロール）、ＨＤＬ−Ｃ（高密度リポプロテインコレステロール ）及びＴＧ（トリグリセリド）の全ての値が対照群に比べて濃度依存的に減少することを示した。
【０１３１】
【表１７】
【０１３２】
［実験例７］ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血中脂質変化に関する竹抽出物の効果
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血中脂質の変化に対する竹抽出物の効果を観察するために、下記の方法を遂行した。
実験の終わりに、全てのマウスを０．１２％のアバーティンで麻酔し、眼窩下静脈叢からへパリーン処理済み毛細管を利用して採血した。それから、遠心分離（１１，０００ｇ、１０分間）して血漿を分離し、使用前に、−７０℃に保管した。 血中脂質値はＴＣ（総コレステロール）、ＨＤＬ−Ｃ（高密度リポプロテインコレステロール）、及びＴＧ（トリグリセリド）などの３つのカテゴリに分けて分析した（生命工学研究院実験動物室）。
表１７で見られるように、その結果は、５０、１００μｇ／ｍＬの竹抽出物の処理群でＴＣ、ＨＤＬ−Ｃ及びＴＧの全ての値が対照群に比べて濃度依存的に減少することを示した。
【０１３３】
【表１８】
【０１３４】
［実験例８］ ＬＤＬ欠損マウスにおける動脈硬化症に対する竹抽出物の抑制効果
ＬＤＬ欠損マウスにおける血管壁動脈硬症の発生及び病変進行を観察するために、下記の方法を遂行した。
実験の終わりに、採血した心臓を０．１Ｍ のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かした４％パラ−ホルムアルデヒドで固定し、残余の血液を除去して、１０％中性ホルマリンで固定した。それから、ＯＣＴ化合物に包埋して０．６μｍの厚さに切り、オイルレッドＯで染色し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンで染色程度を数えて病変を観察した。
病変領域の算出は３番目頚椎血管と大動脈弁膜と間に形成された病変染色を遂行し、病変の写真を撮った後、コンピュータによる形態計測（ＴＤＩ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、米国）で算出して、各対照群との比較を遂行した。
その結果、処理群が対照群に比べて動脈硬化症の形成を約１７％抑制する効果を示し、さらに、陽性対照群として使用したロバスタチンは約４７％の抑制効果を示して、新生内膜（neointima）の形成を抑制した（図１７及び１８参照）。
【０１３５】
［実験例９］ 細胞毒性試験及び細胞増殖試験
実施例５のトリシン化合物の細胞毒性は改変したＭＴＴ方法（J. Immunological Methods, 119, pp203-210, 1989）を用いて試験した。
平底９６−ウェルマイクロタイタータプレート（Ｎｕｎｃ，スウェーデン）に２００μｌのＨＵＶＥＣ（２×１０５細胞／ｍｌ）を入れて、製造されたトリシンを種々濃度で処理し、３７ で、２４時間、培養した。
各ウェルに５０μＬのＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を加えて、３７ で、４時間、培養した後、上清を除去した。
ホルマザン結晶を検出するために、１００μＬのＤＭＳＯをさらに、各ウェルに加えて、マイクロプレートリーダ（Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ−ＸＳ， Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、米国）を使用して５５０ｎｍの吸光度で発色程度を測定した。
その結果、本発明のトリシン化合物は５μｇ／ｍｌで５１％の強い細胞毒性を示した。しかし、竹抽出物又はｐ−クマル酸は細胞毒性がなかった（図５参照）。
竹抽出物の細胞増殖試験は、細胞増殖 ＥＬＩＳＡ ＢｒｄＵ 比色キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて遂行した。 ＨＵＶＥＣ細胞を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで接種した。細胞の三つ揃いプレートをＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｅｒを利用して測定した。
その結果として、竹抽出物は濃度依存的に強い細胞増殖を高めた。
【０１３６】
［実験例１０］ 動物毒性試験
方法（１）
ＩＣＲマウス（平均体重 ２５±５ｇ）及びＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２３５±１０ｇ、Ｊｕｎｇ−Ａｎｇ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ社）での急性毒性実験は実施例１の抽出物を用いて遂行した。１０匹のマウス又はラットからなる４つの群に、試験飼料又は溶媒（０．２ｍＬ、腹腔内）をそれぞれ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ及び５０００ｍｇ／ｋｇで腹膜組織内に経口投与し、２週間観察した。
【０１３７】
方法（２）
ＩＣＲマウス及びＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットでの急性毒性実験は実施例１の抽出物を用いて遂行した。１０匹のマウス又はラットからなる４つの群に、試験飼料又は溶媒（０．２ｍＬ、腹腔内）をそれぞれ、２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ及び７２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与し、２４時間観察した。
【０１３８】
結果
各群間又はどちらの性間において、死亡、臨床徴候、体重の変化、総体の発見物に対する上記処理関連結果はなかった。これらの結果は、本発明で製造された抽出物が強力、且つに安全な物質であることを示唆する。
【０１３９】
以下に、製剤方法及び成分の種類やを説明するが、それらは本発明を制限するものではない。代表的な製剤例を下記のように説明する。
【０１４０】
散剤の製造
実施例１の乾燥粉末 ５０ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
上記成分を混合して散剤を製剤し、シール・パッケージに充填した。
【０１４１】
錠剤の製造
実施例１の乾燥粉末 ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記成分を混合して錠剤を製剤し、打錠した。
【０１４２】
カプセルの製造
実施例１の乾燥粉末 ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
通常のゼラチン製剤方法によって、上記成分を混合して錠剤を製剤し、ゼラチンカプセルに充填した。
【０１４３】
注射剤の製造
実施例１の乾燥粉末 ５０ｍｇ
注射用蒸留水 適量
ＰＨコントローラー 適量
通常の注射剤製剤方法によって、上記活性成分を溶解し、ｐＨ７．５に調節した。全ての成分を２ｍｌアンプルに充填し、滅菌して注射剤を製剤した。
【０１４４】
液剤の製造
実施例１の抽出物 ０．１〜８０ｇ
白糖 ５〜１０ｇ
クエン酸 ０．０５〜０．３％
カラメル ０．００５〜０．０２％
ビタミンＣ ０．１〜１％
蒸留水 ７９〜９４％
ＣＯ２ガス ０．５〜０．８２％
上記活性成分を 常法の液剤製剤法によって溶かし、全ての成分を充填し、滅菌して液剤を製剤した。
【０１４５】
健康機能食品の製造
実施例１の抽出物 １０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０ｍｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５mg
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２ｍｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０ｍｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０ｍｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
ミネラル混合物 適量
硫酸鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
リン酸カリウム １５ｍｇ
リン酸二カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
上記のビタミン及びミネラル混合物の組成比は種々の方式で混合可能である。このような多様性は本発明の精神と範囲から逸脱しない。
【０１４６】
健康飲料の製造
実施例１の抽出物 １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
アプリコット濃度 ２ｇ
タウリン １ｇ
蒸留水 ９００ｍＬ
通常の健康飲料製造方法によって、上記活性成分を溶かし、混合し、８５℃で１時間攪拌し、濾過した後、全ての成分を１０００ｍｌアンプルに充填し、滅菌して健康飲料組成物を製造した。
【０１４７】
発明がこのように記載され、同様のことが様々な形で変えられることは自明であろう。このような改変は本発明の精神及び範囲から逸脱しなく、この技術分野で熟練した者にとって自明であるはずの全ての改変は、下記クレーム内に含まれることを意図している。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明に記述されたように、竹抽出物及びそれから得られるトリシン化合物はＮＯ生成及びＰＬＡ発現の抑制による強力な抗炎症活性を有し、エラスターゼ活性の抑制及び血管内皮細胞の創傷治癒、ｕＰＡ発現の活性化及びＰＡＩ−１発現抑制、そして、コレステロール沈着の低減及びネオインチマ形成の抑制による血液循環改善活性を有する。したがって、これは炎症及び血液循環疾患の治療及び予防のための治療剤又は健康機能食品として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は標準ｐ−クマル酸及びトリシンのＨＰＬＣ分析データを示す。
【図２】図２は本発明のｐ−クマル酸及びトリシンのＨＰＬＣ分析データを示す。
【図３】図３はの竹粗抽出物及びそこから分離された分画物（５０μｇ／ｍｌ濃度で処理）のＮＯ抑制効果を示す。
【図４】図３４の竹粗抽出物及びそこから分離された分画物（１００μｇ／ｍｌ濃度で処理）のＮＯ抑制効果を示す。
【図５】図５はＨＵＶＥＣにおける竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸の細胞毒性を示す。
【図６】図６はＨＵＶＥＣにおける竹抽出物の細胞増殖効果を示す。
【図７】図７は竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸のＶＥＧＦ遺伝子発現に対する効果を示す。
【図８】図８は竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸のｕ−ＰＡ遺伝子発現に対する効果を示す。
【図９】図９は竹抽出物、トリシン及びｐ−クマル酸のｅＮＯＳ遺伝子発現に対する効果を示す。
【図１０】図１０は血管内皮壁の創傷治癒に対する対照の効果を示す。
【図１１】図１１は血管内皮壁の創傷治癒に対する竹抽出物（１０μｇ／ｍｌ）の効果を示す。
【図１２】図１２は血管内皮壁の創傷治癒に対する竹抽出物（５０μｇ／ｍｌ）の効果を示す。
【図１３】図１３は血管形成に対する対照の効果を示す。
【図１４】図１４は血管形成に対する竹抽出物（１０μｇ／ｍｌ）の効果を示す。
【図１５】図１５は血管形成に対する竹抽出物（１００μｇ／ｍｌ）の効果を示す。
【図１６】図１６は動脈硬化マウスにおける竹抽出物処理群及び非処理群の体重変化を示す。
【図１７】図１７は動脈硬化マウスにおける竹抽出物処理群及び非処理群のオイルレッドＯ染色された大動脈弁損傷部位の写真を示す。
【図１８】図１８は動脈硬化マウスにおける竹抽出物処理群及び非処理群のオイルレッドＯ染色された大動脈弁損傷部位のコンピュータ関連画像分析による形態計測の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を有効性分として含有する心血管系疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項２】
竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を有効性分として含有する血液循環疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項３】
竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を有効性分として含有する炎症性疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項４】
上記粗抽出物が水、低級アルコール及びこれらの混合物からなる群より選択される溶媒で抽出される、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記非極性溶媒可溶性抽出物がヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム及びジクロロメタンからなる群より選択される非極性溶媒で抽出される、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
上記竹がササ属（Ｓａｓａ ｇｅｎｕｓ）又はマダケ属（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｇｅｎｕｓ）に属する、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
上記竹が、ジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）、コウライザサ（Ｓａｓａ ｃｏｒｅａｎａ Ｎａｋａｉ）、ミヤコザサ（Ｓａｓａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｍａｋｉｎｏ）、チシマザサ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ ｖａｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）及びチマキザサ（Ｓａｓａ ｐａｌｍａｔａ Ｎａｋａｉ）からなる群より選択されるものである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
上記竹が、マダケ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ ＳＩＥＢ．Ｅｔ Ｚｕｃｃ）、クロチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ）、ハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）及びモウソウチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ ＭＡＺＥＬ ｅｘ Ｈ．ｄｅ ＬＥＨ）からなる群より選択されるものである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
竹から分離されたトリシン又はｐ−クマル酸及びその薬学的に許容しうる塩を有効性分として含有する心血管系疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項１０】
竹から分離されたトリシン又はｐ−クマル酸及びその薬学的に許容しうる塩を有効性分として含有する血液循環疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項１１】
竹から分離されたトリシン又はｐ−クマル酸及びその薬学的に許容しうる塩を有効性分として含有する炎症性疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項１２】
上記竹が、マダケ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ ＳＩＥＢ．Ｅｔ Ｚｕｃｃ）、クロチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ）、ハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）、モウソウチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ ＭＡＺＥＬ ｅｘ Ｈ．ｄｅ ＬＥＨ）又はジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）、コウライザサ（Ｓａｓａ ｃｏｒｅａｎａ Ｎａｋａｉ）、ミヤコザサ（Ｓａｓａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｍａｋｉｎｏ）、チシマザサ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ ｖａｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、チマキザサ（Ｓａｓａ ｐａｌｍａｔａ Ｎａｋａｉ）、イノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＢＥＡＵＶ）及びアジアイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項９〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
上記竹が、ハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）又はジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
心血管系疾患が、高血圧、心臓病、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、狭窄症、高脂血症、動脈硬化、又は心筋梗塞などの種々心血管系疾患を含有している、請求項１又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
炎症性疾患が、関節炎、動脈硬化、胃炎、大腸炎、腎臓炎、肝炎、癌又は退行性疾患を含有している、請求項３又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の竹粗抽出物又は非極性可溶性抽出物、又は請求項９に記載のトリシン又はｐ−クマル酸化合物を、食品学的に許容しうる添加物と共に含有する、心血管系疾患の予防及び治療のための健康機能食品。
【請求項１７】
請求項２に記載の竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物、又は請求項１０に記載のトリシン又はｐ−クマル酸を、食品学的に許容しる添加物と共に含有する、血液循環疾患の予防及び治療のための健康機能食品。
【請求項１８】
請求項３に記載の竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物、又は請求項１１に記載のトリシン又はｐ−クマル酸を、食品学的に許容しうる添加物と共に含有する、炎症性疾患の予防及び治療のための健康機能食品。
【請求項１】
竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を有効性分として含有する心血管系疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項２】
竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を有効性分として含有する血液循環疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項３】
竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物を有効性分として含有する炎症性疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項４】
上記粗抽出物が水、低級アルコール及びこれらの混合物からなる群より選択される溶媒で抽出される、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記非極性溶媒可溶性抽出物がヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム及びジクロロメタンからなる群より選択される非極性溶媒で抽出される、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
上記竹がササ属（Ｓａｓａ ｇｅｎｕｓ）又はマダケ属（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｇｅｎｕｓ）に属する、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
上記竹が、ジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）、コウライザサ（Ｓａｓａ ｃｏｒｅａｎａ Ｎａｋａｉ）、ミヤコザサ（Ｓａｓａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｍａｋｉｎｏ）、チシマザサ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ ｖａｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）及びチマキザサ（Ｓａｓａ ｐａｌｍａｔａ Ｎａｋａｉ）からなる群より選択されるものである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
上記竹が、マダケ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ ＳＩＥＢ．Ｅｔ Ｚｕｃｃ）、クロチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ）、ハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）及びモウソウチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ ＭＡＺＥＬ ｅｘ Ｈ．ｄｅ ＬＥＨ）からなる群より選択されるものである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
竹から分離されたトリシン又はｐ−クマル酸及びその薬学的に許容しうる塩を有効性分として含有する心血管系疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項１０】
竹から分離されたトリシン又はｐ−クマル酸及びその薬学的に許容しうる塩を有効性分として含有する血液循環疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項１１】
竹から分離されたトリシン又はｐ−クマル酸及びその薬学的に許容しうる塩を有効性分として含有する炎症性疾患の治療及び予防のための医薬組成物。
【請求項１２】
上記竹が、マダケ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ ＳＩＥＢ．Ｅｔ Ｚｕｃｃ）、クロチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ）、ハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）、モウソウチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ ＭＡＺＥＬ ｅｘ Ｈ．ｄｅ ＬＥＨ）又はジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）、コウライザサ（Ｓａｓａ ｃｏｒｅａｎａ Ｎａｋａｉ）、ミヤコザサ（Ｓａｓａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｍａｋｉｎｏ）、チシマザサ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ ｖａｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、チマキザサ（Ｓａｓａ ｐａｌｍａｔａ Ｎａｋａｉ）、イノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＢＥＡＵＶ）及びアジアイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項９〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
上記竹が、ハチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ＭＵＮＲＯ ｖａｒ．ｈｅｎｏｎｉｓ ＳＴＡＰＦ）又はジダケ（Ｓａｓａ ｂｏｒｅａｌｉｓ Ｍａｋｉｎｏ）である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
心血管系疾患が、高血圧、心臓病、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、狭窄症、高脂血症、動脈硬化、又は心筋梗塞などの種々心血管系疾患を含有している、請求項１又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
炎症性疾患が、関節炎、動脈硬化、胃炎、大腸炎、腎臓炎、肝炎、癌又は退行性疾患を含有している、請求項３又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の竹粗抽出物又は非極性可溶性抽出物、又は請求項９に記載のトリシン又はｐ−クマル酸化合物を、食品学的に許容しうる添加物と共に含有する、心血管系疾患の予防及び治療のための健康機能食品。
【請求項１７】
請求項２に記載の竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物、又は請求項１０に記載のトリシン又はｐ−クマル酸を、食品学的に許容しる添加物と共に含有する、血液循環疾患の予防及び治療のための健康機能食品。
【請求項１８】
請求項３に記載の竹の粗抽出物又は非極性溶媒可溶性抽出物、又は請求項１１に記載のトリシン又はｐ−クマル酸を、食品学的に許容しうる添加物と共に含有する、炎症性疾患の予防及び治療のための健康機能食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１６】
【図１８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１６】
【図１８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【公表番号】特表２００６−５１５００７（Ｐ２００６−５１５００７Ａ）
【公表日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１８４５９（Ｐ２００５−５１８４５９）
【出願日】平成１６年３月２７日（２００４．３．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／０００７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９８６２４
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０５２１９７９４）ユニジェン インク． (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２７日（２００４．３．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／０００７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９８６２４
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０５２１９７９４）ユニジェン インク． (8)
【Ｆターム（参考）】
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