炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患におけるエオタキシン−２（ＣＣＬ２４）阻害剤
本発明は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体によるエオタキシン−２の阻害が、たとえば、関節リウマチ、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、大腸炎、糖尿病、及びアテローム性動脈硬化症のような炎症性疾患の動物モデルで有意な予防効果を有するという知見に基づく。従って、本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患の治療において単独で使用する、又はそのほかの治療剤との併用で使用するための特異的抗エオタキシン−２抗体を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、特異的抗エオタキシン−２モノクローナル抗体及び本発明の抗体を利用した治療方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患の治療におけるエオタキシン−２（ＣＣＬ２４）の阻害剤の使用、特に抗エオタキシン−２ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、白血球の化学誘引物質として作用し、これら細胞の恒常的な輸送と共に、炎症部位への特異的な細胞集団の動員の双方を調節する小型サイトカインである。ケモカインの調節不全は、炎症及び自己免疫を含む免疫系に関与する広範なヒトの疾患で役割を担うと考えられる（１）。
【０００３】
ヒトのエオタキシンファミリーには、ＣＣケモカインファミリーに属する３つの既知のサイトカインが含まれる。
【０００４】
エオタキシン１（好酸球走化性タンパク質１；エオタキシン又はケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）とも呼ばれる）は、その走化性を誘導することによって好酸球を選択的に動員することが知られているので、アレルギー反応に関係するとみなされている。
【０００５】
エオタキシン２（好酸球走化性タンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、骨髄性前駆細胞阻害因子２（ＭＰＩＦ−２）とも呼ばれる）は、好酸球（２〜４）、好塩基球（４）、Ｔｈ２型リンパ球（５）及び好中球を含む炎症性細胞の強力な化学誘引物質である。エオタキシン−２は、種々の型の内皮細胞で発現され（５〜９）、内皮細胞（１０）及び平滑筋細胞（１１）において血管新生反応及び遊走性反応を誘導する。
【０００６】
エオタキシン３（好酸球走化性タンパク質３；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６（ＣＣＬ２６）、マクロファージ炎症性タンパク質−４α（ＭＩＰ−４α）、胸腺間質ケモカイン−１（ＴＳＣ−１）及びＩＭＡＣ）は、好酸球と好塩基球に対して走化性である。
【０００７】
エオタキシン−２はエオタキシンとたった３９％相同であるにすぎず、２つのポリペプチドはＮＨ２−末端領域にてほぼ完全に異なる（１２）。エオタキシン−２は染色体７ｑ１１．２３に局在し、エオタキシンは染色体１７ｑ２１．１に局在する。エオタキシン−３の遺伝子は、第７染色体上でエオタキシン−２の近くにあるが、それとは３３％の相同性を共有するにすぎない。これらのケモカインはＣＣＲ３受容体に特異的に結合する。エオタキシンの受容体であるＣＣＲ３は、好酸球を始めとして、マクロファージや内皮細胞を含む多種多様な細胞で発現される、７回膜貫通型のＧタンパク質共役受容体である（１３）。
【０００８】
ＷＯ９７／００９６０は、ヒトのエオタキシン（ＣＣＬ１１）をコードする核酸、並びに単離された又は組換えのヒトのエオタキシンタンパク質を開示している。ＷＯ９７／００９６０はまた、特定部位への好酸球の動員又はアレルギー状態の治療におけるエオタキシンタンパク質の使用方法も開示している。
【０００９】
ＣＣＲ３の発現は元々、喘息及びアレルギーの発病機序で検討され、それは治療目標として役立ち続けている（１４）。しかしながら、さらに最近、この経路の役割は、炎症性大腸炎（１５）、多発性硬化症（１６）及び関節リウマチ（ＲＡ）を含むさらなる炎症性疾患及び自己免疫性疾患の研究にて明らかになっている。
【００１０】
関節リウマチ（ＲＡ）は、広範な炎症性細胞による滑膜組織への激しい破壊的な浸潤を特徴とする一般的な慢性の炎症性疾患である（１７）。マクロファージ及び線維芽細胞に由来する複数のサイトカインが（ＲＡ）(18) におけるサイトカイン及びケモカイン双方の分泌に関与する。関節腔における白血球の蓄積は、サイトカイン及びマトリクス分解酵素を含む組織分解因子の分泌をもたらす。
【００１１】
ケモカインの阻害は、一般に使用されるＲＡの動物モデルであるアジュバント誘発の関節炎における治療の選択肢として以前検討された（１９）。同じモデルを用いて、ＣＣＲ３は、滑膜組織への白血球の動員で役割を担うことが示された（２０）。多数のケモカイン及びサイトカインの受容体の差次的発現もＲＡ患者の血清や滑膜組織で実証された（２１）。
【００１２】
サイトカインやケモカインが関与する炎症は、アテローム性動脈硬化症のプラーク増殖、及び脱安定化し、その後破裂させる傾向を促進することにおいて極めて重要な役割を担うと考えられている（２２，２３）。エオタキシン／ＣＣＬ２４の受容体（ＣＣＲ３）はプラークのマクロファージで発現されている（２４）。臨床試験によって、健常人のコホートにてエオタキシン遺伝子の非保存的多型が心筋梗塞の高いリスクを関連していることが明らかにされた（２５）。その後の試験で、高いレベルの循環エオタキシンは冠状動脈のアテローム性動脈硬化症と虚血の存在に関連することが見い出された（２６，２７）。
【００１３】
アテローム性動脈硬化症は、脂肪沈着が動脈壁で進行し、管腔の進行性の狭窄をもたらす過程である。成熟したプラークは、２つの基本構造：脂質のコアと線維性のキャップから構成される。脂質のコアが小さければ小さいほど、線維性のキャップは厚く、さらに安定なプラークとなるということは、破裂し、心筋梗塞又は不安定狭心症を起こす傾向が低下することを意味する。急性の冠状動脈症候群（たとえば、心筋梗塞及び不安定狭心症）の原因となるプラークのほとんどが、＜７０％の狭窄を有することが血管造影で示されることは今や明らかである（２８、２９にて概説された）。これらの病変のおよそ６０％は、大きな血栓形成性の脂質コアと壊死性の残渣（マクロファージ、Ｔ細胞、古い出血、血管形成及びカルシウムの病巣を含む）を伴ったプラークの破裂が原因で生じる。おそらく、マクロファージがプラークを移動するにつれてそれを消化するマトリクスメタロプロテイナーゼを分泌し、平滑筋（プラークの要素を支えている）が、たとえば、炎症性サイトカインのような幾つかの因子によって生じる老化又はアポトーシスのために激減するために、破裂したキャップは薄い。
【００１４】
ＷＯ０６／９３９３２は、個体の血清にてエオタキシンのレベルを測定することによってアテローム性動脈硬化症を検出する又は診断する方法を開示している。その出願はさらに、血清における高いレベルのエオタキシンが症状の発症前にアテローム性動脈硬化症を診断する手段を提供する可能性があることを示唆している。
【００１５】
上記の出版物はいずれも、炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患の治療のための治療的介入についての標的としてのエオタキシン−２を教示していないし、示唆もしていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体によるエオタキシン−２の阻害が、たとえば、関節リウマチ、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、大腸炎、糖尿病及びアテローム性動脈硬化症のような炎症性疾患の動物モデルにおいて十分な予防効果を有するという知見に基づく。理論によって束縛されることを望まないで、予防効果は、少なくとも部分的には、活性のある炎症性細胞（リンパ球及び単核細胞）の接着性及び遊走性の減衰が介在し得た。従って、本発明は、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患を治療するための治療剤を開発するための新規標的としてエオタキシン−２を導入する。本発明はまた、そのような疾患の治療において単独で使用するための又はほかの治療剤と併用するための特異的な抗エオタキシン−２抗体を提供する。
【００１７】
炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患には、たとえば、乾癬、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）、（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症及び天疱瘡が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、その態様の第１によって、本発明は、少なくとも１つのエオタキシン−２拮抗物質と薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤を含む、炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
【００１９】
一実施形態では、上記エオタキシン−２拮抗物質は、抗エオタキシン−２抗体又は該抗体の結合活性を保持するその断片である。
【００２０】
抗エオタキシン−２抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。特定の実施形態では、抗エオタキシン−２抗体は、ヒト型抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
【００２１】
特定の実施形態では、抗エオタキシン−２抗体は、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体又は該抗体の結合活性を保持するその断片である。
【００２２】
特定の特別な実施形態では、上記抗エオタキシン−２抗体は、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｃ）配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｄ）ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体の重鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体の軽鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；及び
（ｅ）該抗体の結合活性を保持する（ａ）〜（ｄ）の抗体の断片
から成る群から選択されるモノクローナル抗体である。
【００２３】
別の実施形態では、エオタキシン−２拮抗物質は、エオタキシン−２のｍＲＮＡに対して向けられたアンチセンス分子又はｓｉＲＮＡ分子である。
【００２４】
別の実施形態では、エオタキシン−２拮抗物質は、小分子化合物である。
【００２５】
特定の実施形態では、上記の炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患は、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、炎症性大腸疾患、多発性硬化症及び糖尿病から成る群から選択される。
【００２６】
別の態様によって、本発明は、治療上有効な量の本発明のエオタキシン−２拮抗物質又は医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【００２７】
本発明の特定の実施形態によれば、上記自己免疫疾患は、関節リウマチ、炎症性大腸疾患（たとえば、大腸炎）、多発性硬化症及び糖尿病から成る群から選択される。
【００２８】
さらに別の態様によって、本発明は、治療上有効な量の本発明のエオタキシン−２拮抗物質又は医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、アテローム硬化性プラーク形成を阻害する方法を提供する。
【００２９】
本発明は、治療上有効な量の本発明のエオタキシン−２拮抗物質又は医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、アテローム硬化性プラークを安定化させる方法を提供する。
【００３０】
本発明は、治療上有効な量の本発明のエオタキシン−２拮抗物質又は医薬組成物を上記患者に投与することを含む、急性冠状動脈症候群の患者において主要な心血管系事象を予防する方法を提供する。
【００３１】
本発明の方法はまた、少なくとも１つの追加の治療剤との併用で上記エオタキシン−２拮抗物質又は上記医薬組成物を投与することも包含する。
【００３２】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１つの追加の治療剤は、化学療法剤、サイトカイン、ペプチド、抗体及び抗生剤から成る群から選択される。
【００３３】
関節リウマチの治療については、上記追加の治療剤には、メソトレキセート、ステロイド、抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦ受容体抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体又は抗ＣＤ２０抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
ＩＢＤ（炎症性大腸疾患）の治療については、上記追加の治療剤には、シクロスポリン、ＮＳＡＩＤＳ（非ステロイド性抗炎症剤）、ステロイド又は抗ＴＮＦ抗体（たとえば、インフリキシマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
多発性硬化症の治療については、上記追加の治療剤には、コパキソン、インターフェロン−β、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）又はＶＬＡ−４に対するモノクローナル抗体（たとえば、チサブリ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、上記少なくとも１つの追加の治療剤は、エオタキシン−２拮抗物質又は上記医薬組成物と同時に投与される。
【００３７】
本発明の別の実施形態によれば、上記少なくとも１つの追加の治療剤と上記エオタキシン−２拮抗物質又は上記医薬組成物は順次投与される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を提供するが、上記ハイブリドーマは、Ｄ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）から成る群から選択される。
【００３９】
本発明はまた、エオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体又はエオタキシン−２への結合活性を保持するその断片も提供するが、上記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）から分泌される。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明は、エオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体を提供するが、上記抗体は、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｃ）配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｄ）ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）によって分泌される抗体の重鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）によって分泌される抗体の軽鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；及び
（ｅ）該抗体の結合活性を保持する（ａ）〜（ｄ）の抗体の断片
から成る群から選択されるモノクローナル抗体である。
【００４１】
本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子に関すると共に、核酸分子を含む発現ベクターと該発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００４２】
特定の実施形態では、発現ベクターは、原核細胞株又は真核細胞株にて複製することが可能である。
【００４３】
別の態様では、本発明はまた、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療におけるエオタキシン−２拮抗物質の使用を提供する。一実施形態では、上記エオタキシン−２拮抗物質は抗体である。
【００４４】
本発明はまた、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療のための医薬組成物の調製におけるエオタキシン−２拮抗物質の使用も包含する。一実施形態では、上記エオタキシン−２拮抗物質は抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
本発明を理解し、それがどのように実践的に実行されてもよいかを理解するために、貼付の図面を参照して、非限定の例示としてのみ、実施形態を説明する。
【図１】エオタキシンと対比したエオタキシン−２への抗エオタキシン−２ｍＡｂ（Ｄ８）の結合を示すグラフである。４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の読み取りとして結果を提示する。種々の抗体濃度（５μ／ｍＬ〜５０μ／ｍＬの間）を測定した。
【図２Ａ】Ｄ８で処理した細胞のフィブロネクチンに対する接着のレベルを示すグラフである。マウスＩｇＧで処理した対照細胞と比較した接着比率として結果を示す。３種の細胞、マウス脾細胞、ラット脾細胞及びヒトＰＢＭＣを調べた。
【図２Ｂ】Ｄ８で処理した細胞のＶＥＧＦに向かった遊走を示すグラフである。マウスＩｇＧ（５０μｇ）で処理した対照細胞と比較した遊走比率として結果を示す。グラフは、種々のＤ８の量（１２．５、２５及び５０μｇ）を用いて、ラット脾細胞及びヒトＰＢＭＣから得た結果を示す。
【図３Ａ】疾患の発症からの時間の関数としてのラットの関節炎スコア（ＡＳ）に対する抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）、ＩｇＧ及びＰＢＳによる処理の効果（±標準誤差）を示すグラフである。０日目は関節炎を誘発した日である。
【図３Ｂ】ラットの遊走スコアに対する抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）、ＩｇＧ及びＰＢＳによる処理の効果（±標準誤差）を示すグラフである。
【図３Ｃ】足首の直径（ｍｍ）に対する抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）、ＩｇＧ及びＰＢＳによる処理の効果（±標準誤差）を示すグラフである。
【図４Ａ】ＰＢＳ、ＩｇＧ、Ｄ８、Ｇ７及びＧ８の抗体で処理したラットの関節の組織学的スコアを示すグラフである。
【図４Ｂ】Ｄ８（図４Ｂ）又はＰＢＳ（図４Ｃ）で処理したラットの関節の代表的な所見を示す写真（ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）である。
【図４Ｃ】Ｄ８（図４Ｂ）又はＰＢＳ（図４Ｃ）で処理したラットの関節の代表的な所見を示す写真（ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）である。
【図５】アジュバントで誘発した関節炎のラットの体重（グラム）に対する、時間（日）の関数としての、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）、ＩｇＧ及びＰＢＳによる処理の効果（±標準誤差）を示すグラフである。
【図６Ａ】アジュバントで誘発した関節炎における関節炎スコア（ＡＳ；Ｙ軸）に対する、時間（日）の関数としての、３つの用量（２０μｇ、１００μｇ及び１０００μｇ）での予防モードにおける抗エオタキシン−２抗体による処理の効果（±標準誤差、比率）を示すグラフである。
【図６Ｂ】アジュバントで誘発した関節炎における関節炎スコア（ＡＳ；Ｙ軸）に対する、時間（日）の関数としての、３つの用量（２０μｇ、１００μｇ及び１０００μｇ）での治療モード（関節炎の出現と共に投与）における抗エオタキシン−２抗体による処理の効果（±標準誤差、比率）を示すグラフである。
【図７】時間（日）の関数としての予防モード（±標準誤差）におけるアジュバントで誘発した関節炎の関節炎スコアに対する、ＰＢＳで処理した対照と比較した、Ｄ８（１００μｇ）、メソトレキセート（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、及びＤ８（１００μｇ）と併用したメソトレキセートの予防効果を示すグラフである。
【図８】ＰＢＳ（図８Ａ）及びＤ８（図８Ｂ）で処理したラットの関節の死後Ｘ線解析の写真である。足首の脱灰と早期の骨侵食（矢印頭）と同様に、強度の関節周囲の軟組織の腫脹が、ＰＢＳで処理したラット（星印）で明らかである（代表的な図）。
【図９Ａ】時間（日）の関数としての、ＤＳＳで誘発した大腸炎のマウスにおける体重の増減比率を示すグラフである。５μｇ又は２５μｇの抗エオタキシン−２抗体Ｄ８でマウスを処理した。対照動物は、ＰＢＳ又はＩｇＧで処理した。
【図９Ｂ】ＤＳＳで誘発した大腸炎のマウスにおける％ＭＰＯ活性を示すグラフである。５μｇ、２５μｇ、１００μｇ又は２００μｇの抗エオタキシン−２抗体Ｄ８でマウスを処理した。対照動物は、ＰＢＳ又はＩｇＧで処理した。
【図９Ｃ】抗エオタキシン−２抗体Ｄ８（５μｇ）又は対照（ＰＢＳ）で処理した、ＤＳＳ誘導大腸炎のマウスの血清における種々のサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１（単球化学誘引タンパク質−１）、及びＴＮＦ）のレベルを示すグラフである。
【図９Ｄ】５μｇ、２５μｇ、１００μｇ又は２００μｇの抗エオタキシン−２抗体Ｄ８で処理したＤＳＳ誘発大腸炎のマウスの結腸の組織学的解析のグラフによる表示である。対照動物は、ＰＢＳ又はＩｇＧで処理した。［Ｉ］病変の程度（大きさ）を表し、［ＩＩ］炎症（炎症性細胞の浸潤）を表し、［ＩＩＩ］損傷（組織の破壊）を表す。
【図１０】ＰＢＳ、ＩｇＧ、抗エオタキシン−２抗体Ｄ８（２５μｇ）又は抗エオタキシン−２抗体Ｄ８（１００μｇ）のいずれかで処理した、誘発ＥＡＥマウスにおける時間の関数としての疾患の重症度の平均を示すグラフである。
【図１１Ａ】ＰＢＳ又は抗エオタキシン−２抗体（Ｄ８）のいずれかで処理したＮＯＤマウスにおける時間の関数としての疾患の発生率（糖尿病マウスの比率）を示すグラフである。
【図１１Ｂ】ＰＢＳ又は抗エオタキシン−２抗体（Ｄ８）のいずれかで処理したＮＯＤマウスの血清におけるエオタキシン−２のレベル（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図１２Ａ】不安定なプラークと対比した安定したプラークにおける炎症性因子の発現の定量的解析を示すグラフである。各群で４つのプラークを解析した。
【図１２Ｂ】代表的な例を提供する画像である。
【図１３】マウスのアテロームにおけるエオタキシン−２の免疫組織化学的な局在を示す画像である。図１３Ａは、特徴的な脂肪線条（ＡＨＡ、クラスＩ〜ＩＩ）を示し、図１３Ｂは、中間的なプラーク（ＡＨＡ、クラスＩＩ）を示し、図１３Ｃは、アテローム性病変（ＡＨＡ、クラスＩＩＩ〜ＩＶ）を示し、図１３Ｄは、無関係なＩｇＧで染色された陰性対照を示す。太い矢印はエオタキシン−２陽性の代表的な内皮細胞を示すが、細い矢印はプラークのマクロファージでの各染色を示す。
【図１４】図１４Ａは、若齢又は老齢のＫＯＡｐｏＥマウスの大動脈におけるエオタキシン−２とＴＧＦβのｍＲＮＡの発現を示すゲルの画像である。図１４Ｂは、ｏｘＬＤＬと共にインキュベートしたマウスＨ５Ｖの内皮細胞におけるエオタキシン−２とＴＧＦβのｍＲＮＡの発現を示すゲルの画像である。
【図１５】図１５Ａは、内皮への単核細胞（脾細胞）の接着に対するエオタキシン−２の阻止の効果を示すグラフである。図１５Ｂは、本質的に類似のプロトコールにて単球／マクロファージ細胞株で行った代表的な結果を示す。＊ｐ＜０．０５
【図１６】図１６Ａは、抗エオタキシン−２抗体による４週間の処理に反応した病変（プラーク）の大きさを示すグラフである。図１６Ｂは、抗エオタキシン−２抗体による１０週間の処理に反応した病変（プラーク）の大きさを示すグラフである。図１６Ｃは、抗エオタキシン−２抗体による１０週間の処理に反応した線維領域の比率を示すグラフである。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５．
【図１７】エオタキシン−２に対する阻止抗体で処理したａｐｏＥマウスの代表的な切片の画像である。図１７Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＰＢＳ、対照ＩｇＧ、エオタキシン−２抗体による処理の脂肪線条病変の代表的なオイルレッド染色を示す。図１７Ｄ〜Ｆは、類似のマウス群でのさらに長い処理試験におけるさらに進んだ病変の類似の評価を示す。図１７Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｌはそれぞれ、ＰＢＳ、対照ＩｇＧ、エオタキシン−２抗体による処理のＭａｓｓｏｎの三色組織化学試験及びｖｏｎ Ｇｉｅｓｓｏｎの組織化学試験（それぞれ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、エオタキシン−２（ＣＣＬ２４）に特異的に結合し、その機能を阻害する抗体に関する。さらに、本発明は、該抗体を含む医薬組成物、並びに炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患の治療のためのそれらの使用に関する。
【００４７】
本発明がさらに理解され易いように、詳細な説明の全体にわたって種々の定義が示される。
【００４８】
態様の１つに従って、本発明の治療方法は、エオタキシン−２の活性及び／又は発現を低減することができる治療上有効な量のエオタキシン−２拮抗物質をそれが必要な患者に提供することによって達成され、それによって患者において炎症性疾患、自己免疫疾患又はアテローム性動脈硬化症疾患を軽減する。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、哺乳類（たとえば、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、又はヒト）のような、本発明から恩恵を受けてもよい対象を指す。特定の一実施形態では、患者はヒトである。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「治療」は、エオタキシン−２が介在する疾患又は症状の有害な効果を軽減すること、予防すること、治癒させること、覆すこと、減衰すること、緩和すること、できるだけ抑えること、又は止めることを指す。
【００５１】
用語「エオタキシン−２」（好酸球走化性タンパク質２）、「ＣＣＬ２４」（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２４）、又は「ＭＰＩＦ−２」（骨髄性前駆細胞阻害因子２）は相互交換可能に使用され、ヒトＣＣＬ２４遺伝子によってコードされ、ヒト第７染色体上に局在し、当該技術で既知であるＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインを指す。
【００５２】
ＣＣＬ２４は、ケモカイン受容体ＣＣＲ３と相互作用する。ＣＣＬ２４の活性は、好酸球、好塩基球、Ｔ細胞及び好中球における走化性の誘導、並びに内皮細胞及び平滑筋細胞における血管新生反応及び遊走反応の誘導を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「炎症」は、たとえば、病原体や損傷細胞（たとえば、火傷、外傷、腫瘍が原因となる）のような有害な刺激、又は化学物質、熱若しくは寒冷のような刺激物に対する免疫系の複雑な生物反応を指す。用語「炎症性疾患」は、アテローム性動脈硬化症や種々の自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない炎症に関連した疾患を指す。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「アテローム性動脈硬化症」（アテローム硬化性血管疾患又はＡＳＶＤとしても知られる）は、コレステロールのような脂肪物質の蓄積の結果、動脈壁が厚くなる病態症状である。この過程は、動脈の壁における慢性の炎症反応の結果であり、大部分は、機能的な高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によるマクロファージからの脂肪やコレステロールの適当な除去かないままに、マクロファージの蓄積によるものであり、低密度のリポタンパク質によって助長される。動脈のこの硬化又は裏打ちは、動脈内での複数のプラークの形成によって引き起こされる。
【００５５】
「アテローム硬化性プラーク」又は「アテローム」は、脂質（コレステロールと脂肪酸）、カルシウム及び種々の量の線維性結合組織を含有する細胞（ほとんどマクロファージ細胞）又は細胞残渣から構成される動脈壁の蓄積及び腫脹である。アテローム及び動脈壁の変化は、管腔径の変化なしで余分な壁の厚さを補填するのにちょうど十分な大きさの小型の動脈瘤（拡張）を普通生じる。成熟プラークは２つの基本構造：脂質コアと線維性のキャップから構成される。脂質コアが小さければ小さいほど、線維性のキャップは厚く、プラークはさらに安定であるということは、破裂し、心筋梗塞や不安定狭心症を起こす傾向が低下することを意味する。急性の冠状動脈症候群（たとえば、心筋梗塞及び不安定狭心症）の原因となるプラークのほとんどが、＜７０％の狭窄を有することが血管造影で示されることは今や明らかである（２８、２９にて概説された）。これらの病変のおよそ６０％は、大きな血栓形成性の脂質コアと壊死性の残渣（マクロファージ、Ｔ細胞、古い出血、血管形成及びカルシウムの病巣を含む）を伴ったプラークの破裂が原因で生じる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「循環器疾患」（ＣＶＤ）は、心臓（心）及び／又は全身性の血管（血管系）を冒し得る疾患を指す。循環器疾患のほとんどは、慢性の症状−長い間にわたって進展している又は持続している症状を反映する。しかしながら、循環器疾患の転帰の一部は、たとえば、心臓又は脳に血液を供給する血管が遮断されるときに突然起きる心臓発作や卒中のような急性の事象であり得る。ＣＶＤはまた、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈心疾患（ＣＨＤ）及び冠状動脈疾患（ＣＡＤ）に関連する疾患−狭心症（不安定狭心症及び初発狭心症を含む）を招き得る心臓に供給する血管の疾患−強い胸部の痛み又は均一な心臓発作−心筋梗塞、及びＳＴ−又は非ＳＴ−上昇を包含する。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「自己免疫疾患」は、生体に正常に存在する物質や組織に対する生体の過剰な免疫応答の結果生じる病態を記載する。免疫系は生体の一部を病原体と誤解し、それを攻撃する。これは、特定の臓器に限定されてもよく、又は肺と腎臓の双方にて基底膜を冒し得る、異なった部位における特定の組織を含んでもよい。たとえば、関節リウマチ、多発性硬化症及び大腸炎のような例となる疾患の少なくともすべてを含む自己免疫疾患の例、並びに顕著な例には、とりわけ、セリアック病、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シューグレン症候群、チャーグ・ストラウス症候群、橋本病、グラーベ病、乾癬、炎症性大腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、強皮症及び天疱瘡が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、用語「エオタキシン−２拮抗物質」は、エオタキシン−２／ＣＣＬ２４と相互作用し、正常な活性又はサイトカインの発現を阻止する又は抑える分子を指す。本発明のこの態様に従って多数の剤を使用することができる。従って、たとえば、拮抗物質は、エオタキシン−２の活性を阻害する抗体、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡｚｙｅ、リボザイム、又はアンチセンスポリヌクレオチドであることができる。
【００５９】
本発明の文脈で、用語「抗エオタキシン−２抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含する。さらに、抗体は、たとえば、マウスの抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト型抗体であってもよい。用語は、抗体全分子、並びに、たとえば、単鎖（ＳＣ）抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ抗体断片のような、エオタキシン−２に結合することが可能であるその機能的断片、並びにそれらの組み合わせを指す。
【００６０】
血清免疫グロブリン（「ポリクローナル抗体」）又はその反応性部分の精製方法は、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムによる沈殿、その後の透析、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ及びゲル濾過を含めて当該技術で周知である。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ又はｍｏＡｂとも呼ばれる）は、単クローンの細胞から産生される同一の単一特異性の抗体を指す。モノクローナル抗体を生成し、単離する方法は、たとえば、以下の実施例の区分で示されるように、当該技術で周知である。本発明はまた、キメラ抗体又はヒト化抗体も包含する。本明細書で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」は、ヒトの主鎖を有し、非ヒト由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を持つ抗体又はその断片を指す。非ヒトＣＤＲは、たとえば、所望の特異性、親和性及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ又はヤギの抗体から得ることができる。特定の実施形態では、ヒト抗体の枠組みにて追加のアミノ酸が非ヒトの相方によって置き換えられて抗体の結合特性を改善する。本明細書で使用されるとき、「キメラ抗体」は、異なった種を起源とするポリペプチドを含有する抗体又はその断片であり、たとえば、マウス−ヒト抗体キメラは、抗体のマウスＦｃ領域をヒトのそれで置き換えることによって得られる。
【００６２】
ヒト化抗体を作製する方法は当該技術で周知である。ヒト化抗体は、ヒト抗体の「枠組み」に適当なＣＤＲをコードする断片（所望の結合特性に関与する）を挿入することによって調製することができる。適当なベクターと宿主細胞（たとえば、哺乳類細胞）における発現を用いた組換えＤＮＡ法を介してこれを達成する。すなわち、所望の特性を有するモノクローナル抗体をマウス（又はほかの非ヒト動物）で作出した後、その抗体をコードするＤＮＡを単離し、ベクターにクローニングして配列を決定する。次いで抗体のＣＤＲに相当するＤＮＡ配列を決定する。いったん、所望のＣＤＲの正確な配列が判明すれば、ヒト型抗体の変異体のためのＤＮＡを含有する構築物にこれらの配列を適宜挿入するために戦略を考案することができる。
【００６３】
本発明はさらに、エオタキシン−２への結合活性を保持する、抗エオタキシン−２抗体の断片を包含する。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆａｂ」は、抗体分子の単一の一価の抗原結合断片を含有する断片を指す。Ｆａｂは、一方の未処理の軽鎖と一部の重鎖を含み、抗体全体のパパインによる消化によって生成することができる。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「（Ｆａｂ）２」は、抗体全体のペプシンによる消化によって得られる抗体断片を指す。ペプシン消化によってＦｃ部分にて抗体の切断を生じ、その結果、２つのＦａｂ断片を含有する二価の断片と小さな部分のＦｃ断片を生じ、それらはＳ−Ｓ結合で接合される。「Ｆａｂ」は、Ｓ−Ｓ結合の開裂を生じる（Ｆａｂ）２の還元によって得られる。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｖ」は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片を指す。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「単鎖抗体」は、好適なリンカー（たとえば、ポリペプチド）によって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子を指す。単鎖抗体は通常、軽鎖と重鎖の可変領域とリンカーを含む融合ポリペプチドをコードする単一のポリヌクレオチドを発現させることによって調製される。単鎖抗体を調製する方法は、当該技術で周知であり、たとえば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと。
【００６８】
本発明に係る抗体断片は、好適なプロテアーゼ、たとえば、パパイン若しくはペプシンを用いた抗体のタンパク分解加水分解によって、又は細菌（たとえば、大腸菌）若しくは哺乳類細胞（たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞）のような宿主細胞における抗体断片をコードする核酸の組換え発現によって調製することができる。
【００６９】
本発明の抗体は、発現ベクターを用いて好適な宿主細胞にて抗体をコードする核酸を発現させることによって組換え的に製造されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、抗エオタキシン−２抗体の鎖をコードする遺伝情報を細胞に移すことが可能である核酸構築物を指す。挿入物は標的細胞で発現され、抗体が産生され、細胞の培地に分泌されるか、又は細胞から直接抽出される。ベクターは、たとえば、プラスミド、バクテリオファージ、及びそのほかのウイルス、コスミド、及び人工染色体に限定されない種々の起源のものであり得る。通常、操作されたベクターは、複製開始点、クローニング部位、選抜可能なマーカー及び本発明の抗体をコードする非相同の核酸を含む。ウイルスベクターは一般に、非感染性にしてあるが、ウイルスのプロモータと非相同の核酸を依然として含有するので、ウイルスのプロモータを用いて非相同の核酸を翻訳することができる、修飾されたウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡを運ぶ遺伝子操作されたウイルスである。ウイルスベクターの非限定例は、組換えレトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ＳＶ４０、単純性ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスである。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明はまた、免疫抱合体と、本発明の抗体を含む二重特異性分子も包含する。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「アンチセンス療法」は、特定の疾患に影響を及ぼすことが知られる遺伝子の発現の阻害を含む治療の形態を指す。本発明の文脈では、アンチセンス療法は、エオタキシン−２のｍＲＮＡの発現を阻害することを目的とする。従って、療法には、エオタキシン−２のｍＲＮＡ又はその断片の配列に相補的であり（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その遺伝子によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し、それを不活化し、その遺伝子のスイッチを効果的に「切る」核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は化学的類似体）の鎖の合成が関与する。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、用語「ｓｉＲＮＡ」（小型干渉ＲＮＡ）は、短鎖干渉ＲＮＡ又はスプライシングＲＮＡとしても知られ、生物学において様々な役割を担う通常、長さ２０〜２５ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子の部類である。最も顕著には、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の経路に関与し、特定の遺伝子の発現に干渉する。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、用語「小分子化合物」は、有機化合物を指す。小分子の分子量の上限はおよそ８００ダルトンである。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、用語「メソトレキセート」は、癌及び自己免疫疾患の治療に使用される代謝拮抗剤及び抗葉酸剤を指す。
【００７５】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下に、筋肉内に及び静脈内に投与するのに有用である。非経口投与用の組成物は一般に、許容可能なキャリア又は賦形剤、好ましくは水性キャリアに溶解された抗体を含む。種々の水性キャリア、たとえば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に粒子状物質を含まない。組成物は必要に応じて生理的条件に近づける薬学上許容可能な補助物質、たとえば、ｐＨ調整剤及び緩衝化剤、毒性調整剤など、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、ヒスチジン及びアルギニンを含有してもよい。
【００７６】
非経口投与用の組成物を調製する方法は、当業者に既知であり、又は明らかであり、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980）にさらに詳細に記載されている。
【００７７】
本発明の抗体は、保存用に凍結する又は凍結乾燥することができ、使用前に好適なキャリアで再構成することができる。この技法は従来の免疫グロブリンで有効であることが示され、技術で知られる凍結乾燥法及び再構成法を使用することができる。
【００７８】
治療目的で、症状及びその合併症を治療する又は少なくとも部分的に緩和するのに十分な量で組成物を投与する。これを達成するのに適切な量を「治療上有効な量」と定義する。この使用に効果的な量は、症状の重症度及び患者自身の免疫系の一般状態に左右されるが、一般に、１回当たり約０．０１〜約１５０ｍｇの抗体の範囲である。１日、１週間又は１ヵ月における単回又は複数回の投与の計画は、用量レベルで実施することができ、パターンは主治医によって選択される。
実施例
【００７９】
モノクローナル抗体の製造
標準のプロトコールに従って、幾つかのクローンのｍＡｂを製造した。手短には、２０μｇのエオタキシン−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ、米国）でＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫し、その後４回追加免疫した。血清中に抗エオタキシン−２ポリクローナルＡｂの存在を確認した後、マウスを屠殺し、脾臓から細胞を単離し、ＮＳ／０骨髄腫細胞とハイブリッドを形成させ、その後、エオタキシン−２への結合についてクローンをスクリーニングした。次いで、無血清培地にて２〜３週間、ハイブリドーマを増殖させ、培地を回収し、１００ｋＤａのセントリコン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）によって濃縮した。ｍＡｂの１つ（Ｄ８）のマウスのエオタキシン−２との交差反応性をＥＬＩＳＡによって確認した。
【００８０】
モノクローナル抗体Ｄ８、Ｇ８及びＧ７の核酸配列を決定するのに以下のプライマーを用いた：
重鎖（ＩｇＧγ−１）
正方向（配列番号７）
５’−ＣＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＡＧＣＴＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＧＴＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＣ−３’
逆方向（配列番号８）
５’−ＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣ−３’
軽鎖（κ）
正方向（配列番号９）
（変性）５’−ＲＲＨＲＹＹＢＷＤＭＴＶＡＣＨＡＲＷＣ−３’
又は（配列番号１０）
５’ＧＡＴＧＴＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＧＣＣＴＣＡＣ−３’
逆方向（配列番号１１）
５’−ＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣ−３’
【００８１】
結合アッセイ
１μｇ／ｍＬのエオタキシン又はエオタキシン−２（炭酸緩衝液中）のいずれかでプレートを４℃にて一晩被覆した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２％ＢＳＡによって３７℃にて４５分間ブロックした。ＰＢＳによって連続希釈した抗エオタキシン−２抗体（Ｄ８クローン）を３７℃にて１．５時間入れた。上記のように洗浄を繰り返し、ペルオキシダーゼ結合のヤギ抗マウス抗体と共にプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。上記のように洗浄を繰り返し、発色基質を用いて結合を検出した。
【００８２】
脾細胞接着アッセイ
接着アッセイでは、Ｃ５７ＢｌマウスとＬｅｗｉｓラットの脾細胞をファイコール勾配で分離し、一晩のインキュベート用に１０ｃｍのシャーレに入れた。翌日細胞を回収し、上昇濃度のＤ８又はマウスの総ＩｇＧ（５〜５０μｇ／ｍＬ）によって回転しながら２時間予備処理した。次いで、細胞を遠心し、フィブロネクチンで予備被覆した９６穴プレートに入れた。１時間のインキュベートの後、非付着細胞を洗い流し、付着細胞の量をＸＴＴキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を用いて分析した。健常な供与者から回収した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて同様の接着アッセイを行った。
【００８３】
遊走アッセイ
Ｄ８（３０μｇ／ｍＬ）で予備処理したラット脾細胞及びヒトＰＢＭＣと同様にＣ５７ＢＬ／６Ｊ由来の脾細胞をＴｒａｎｓ−Ｗｅｌｌ系の上部チャンバーに入れた。下部チャンバーは、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）（２０ｎｇ／ｍＬ）を補完した無血清培地を含有した。４時間後、下部チャンバーの培地を回収し、フローサイトメトリーを用いて細胞を計数した（１分当たりに回収される細胞数）。
【００８４】
プラーク及び心血管系の試験管内試験：
Ｉ．ヒトの頚動脈プラークの調製とタンパク質アレイ
ヒトのアテローム硬化性プラークを２群の患者から回収した。無症候性の重度アテローム性頚動脈硬化症の患者の動脈内膜切除検体から安定プラーク（ｎ＝４）を得た。不安定プラークの代表的なものは、急性心筋梗塞の患者の責任血管の経皮冠動脈形成の際得られた検体だった（ｎ＝４）。専用の吸引装置によって血栓切除を行った。得られた材料は、赤色血栓、白色血栓、及び責任動脈の不安定プラークの断片から成る。洗浄と溶解の後、残りの組織は、大部分、破裂したアテローム硬化性プラークの断片を含む。
安定及び不安定のヒトのプラークにて４０のサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子を検出するのにＲａｙＢｉｏ（商標）ヒト炎症抗体アレイ３．１（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）を用いた。手短には、ペレット乳棒を用いてキット内で提供された溶解緩衝液にてプラークをホモジナイズした。各試料の５００ｍｇのタンパク質と共にアレイをインキュベートし、製造元の指示書に従って進展させた。ＴＩＮＡ２．０プログラムを用いて結果を解析した。
【００８５】
ＩＩ．毛細管細胞
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１％のペニシリン／硫酸ストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を補完したＤＭＥＭＦ−１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）にてマウスの毛細管細胞（Ｈ５Ｖ）を培養した。８％ＣＯ２と共に多湿インキュベータにて３７℃で細胞を維持した。１％のＦＣＳと１％のペニシリン／硫酸ストレプトマイシンを含有する完全培地ＲＰＭＩ１６４０にて１０６個の細胞／ｍＬの濃度で単球様のＵ９３７細胞を培養した。５％ＣＯ２の多湿インキュベータにて３７℃で細胞を維持した。
【００８６】
ＩＩＩ．内皮細胞による接着アッセイ
接着アッセイにて、ｏｘＬＤＬ、１μｇ／ｍＬ（以前記載されたように調製した、３３）の存在下でＨ５Ｖマウス内皮細胞を７２時間インキュベートした。次いで、ｏｘＬＤＬ、１μｇ／ｍＬの存在下、４×１０３個／ウェルの濃度で９６穴プレートに細胞を一晩入れた。翌日、中和ヤギ抗マウスエオタキシン−２抗体（Ｃｙｔｏｌａｂ、米国）又はヤギＩｇＧで細胞を１時間予備処理した後、Ｕ９３７細胞又はＡｐｏＥマウスの脾臓由来の細胞を８×１０４個／ウェルの濃度で加えた。１時間のインキュベートの後、非付着細胞を洗い流し、付着細胞の量をＸＴＴキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を用いて分析した。
【００８７】
ＩＶ．大動脈とＨ５Ｖ内皮細胞のＰＣＲ解析
製造元のプロトコールに従ってＥＺ−ＲＮＡキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を用いてチオシアン酸グアニジニウムとフェノールクロロホルムの方法によって組織試料及びＨ５Ｖ内皮細胞からＲＮＡを単離した。従来の熱サイクラーにてＡＭＶ逆転写酵素（ＴａＫａＲａのＲＮＡＰＣＲキット、日本のタカラ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。ホットスタートＴａＫａＲａＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて特定の遺伝子の増幅を実施した。エオタキシン−２とＴＧＦβのマウスｍＲＮＡについて、イントロン配列を補う特定のプライマーを設計した（表１）。Ｇ３ＰＤＨとＴＧＦβについて以下のＰＣＲ条件：９５℃で２分間、次いで９５℃で２秒間と５５℃で４５秒間と７２℃で１分間を２７サイクル（Ｇ３ＰＤＨ）又は３５サイクル（ＴＧＦβ）での試料のインキュベートを用いた。出発温度７０℃と、３０サイクルの増幅と、６０℃でのアニーリング温度によって、エオタキシン−２ｍＲＮＡの発現の解析にタッチダウンＰＣＲ増幅プロトコールを用いた。ＰＣＲ試料を２％アガロースゲル上で泳動させ、Ｇｅｌｓｔａｒ核酸染色（Ｇａｍｂｒｅｘ、ＵＳＡ）で染色し、３００ｎｍのＵＶトランスイルミネータによってＰＣＲ産物を可視化し、ポラロイドカメラ方式によって撮影した。逆転写に先立って精製したＲＮＡ試料にてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）のＰＣＲ反応を行うことによって単離されたＲＮＡのゲノムの混入の非存在を確認した。ヌクレアーゼを含まない水の陰性対照は、試料の試行すべてに含めた。各ＲＮＡ試料は数回解析した。
【００８８】
Ｖ．大動脈洞の免疫組織化学的な解析
間接免疫ペルオキシダーゼ染色によって大動脈洞のクリオスタット切片（厚さ５μｍ）を評価した。その後、スライドをメイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、グリセロール（Ｄａｋｏ）で標本にした。親和性精製したヤギ抗マウスエオタキシン−２（Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル）を用いて免疫組織化学的な染色を行った。
【００８９】
統計的解析
一方向ＡＮＯＶＡ検定によって群間の比較を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。結果は平均値と標準誤差として表す。
【００９０】
実施例１：抗エオタキシン−２ｍＡｂ（Ｄ８）の特異性と抗炎症効果
上述のように抗エオタキシン−２マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の幾つかのクローンを調製した。
Ｄ８抗体の重鎖をコードする核酸配列は配列番号１として示される：
ＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＮＣＣＧＧＧＧＣＮＧＮＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＮＧＧＧＧＧＮＮＧＮＣＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡ
ＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＧＴＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＴＡＧＧＡ ＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＧ
ＴＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣ
ＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＣＣＧＴ
ＣＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴＴ
ＴＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＣ ＣＴＧＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＴＣ
ＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴ
ＴＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＮＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＮＧＣＴＡ
【００９１】
Ｄ８抗体の軽鎖（κ）をコードする核酸配列は配列番号２として示される：
ＧＧＧＣＣＡＡＴＧＧＮＮＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＮＮＧＴＧＣ
ＣＴＴＮＧＴＣＧＮＮＮＮＣＴＮＮＴＴＧＮＮＣＡＮＣＮＴＣＮＡＣＮＮＣＮＮＮＮＡＮＮＮＮＡＮＮＧＮＮＮＮＮＴＧＮＡＡＮＡ
ＮＮＧＡＴＧＧＮＮＮＴＮＮＮＣＮＡＣＡＮＮ
ＮＴＧＧＮＮＴＣＣＴＮＮＮＮＮＮＮＴＮＮＮＮＴＧＮＮＮＮＮＧＡＣＮＮＣＡＮＡＮＡＣＡＮＮＮＮＣＮＡＣＮＮＮＡＴＧＡＮＣ
ＮＮＣＮＮＮＣＮＮＮＮＮＴＴＧＡＮＮＮＮＮ
ＧＮＣＮＡＮＴＡＴＧＡＡＣＮＡＮＮＮＡＡＮＮＮＮＮＮＴＡＣＣＴＧＮＮＡＮＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡ
【００９２】
Ｇ８抗体の重鎖をコードする核酸配列は配列番号３として示される：
ＧＧＧＣＡＧＣＡＧＮＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＮＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＮＧＧＧＧＧＮＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧ
ＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＧＴＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＴＡＧＧ
ＡＡＴＧＡＣＴ
ＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴ
ＧＴＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴＴ ＣＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＣＣＧ
ＴＣＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴ
ＴＴＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧ
ＣＣＴＧＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＴ
ＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣ ＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＴＡＮＮ
【００９３】
Ｇ８抗体の軽鎖（κ）をコードする核酸配列は配列番号４として示される：
ＧＧＧＣＣＡＡＴＧＧＮＮＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＮＮＧＴＧＣＣＴ
ＴＮＧＴＣＧＮＧＴＧＣＴＴＮＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＮＮＡＮＡＣＮＴＮＡＮＮＧＴＮＮＮＮＴＧＧＡＡＮＡＴＴＧ ＡＴＧＧＣＮＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＴ
ＧＧＣＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＮＴＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣＡＮＧＡＣＡＧＣＡＡＡＮＡＣＡＮＣＮＣＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧ
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ＡＣＮＡＮＴＮＴＧＡＡＣＧＡＣＧＴＡＮＮＮＮＣＮＮＴＡＣＣＴＧＴＮＡＮＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡ
【００９４】
Ｇ７抗体の重鎖をコードする核酸配列は配列番号５として示される：
ＧＧＧＣＡＧＣＡＧＮＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＮＮＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＮＧＧＧＧＧＮＧＮＣＧＴＴＴＴＧＧＣＴ
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【００９５】
Ｇ７抗体の軽鎖（κ）をコードする核酸配列は配列番号６として示される：
ＧＧＧＣＣＴＴＴＧＧＮＮＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＮＮＧＴＧＣＣＴ
ＴＮＧＴＣＧＮＧＴＧＣＴＴＮＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＮＮＡＮＡＣＮＴＮＡＮＮＧＴＮＮＮＮＴＧＧＡＡＮＡＴＴＧ
ＡＴＧＧＣＮＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＴ
ＧＧＣＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＮＴＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣＡＮＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＡＣＡＮＣＮＣＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧ
ＣＡＣＣＣＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＮＮＮＮＧ
ＡＣＮＡＮＴＮＴＧＡＡＣＧＡＣＧＴＡＮＮＮＮＣＮＮＴＡＣＣＴＧＴＮＡＮＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡ
【００９６】
上記核酸配列における文字Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ又はＧのいずれかの存在を表す。
【００９７】
Ｄ８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、受入番号Ｄ８０９０８１７０２のもとで２００９年８月１７日、英国ウィルトシャー州、ソールズベリーのヨーロッパコレクションオブセルカルチャー（ＥＣＡＣＣ）に寄託された。
【００９８】
Ｇ８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、受入番号Ｇ８０９０８１７０１のもとで２００９年８月１７日、ＥＣＡＣＣに寄託された。
【００９９】
新規の抗エオタキシン−２抗体（Ｄ８）の特異性は、結合アッセイにて評価された。エオタキシン又はエオタキシン−２を被覆したプレートに、クローンＤ８にて産生されたｍＡｂの連続希釈を一晩のインキュベートのために加えた。洗浄の後、ペルオキシダーゼ結合のヤギ抗マウス抗体と共にプレートをインキュベートし、再び洗浄し、発色基質を用いて結合を検出した。
【０１００】
図１に示されるように、クローンＤ８のｍＡｂは調べた希釈の全範囲にて、エオタキシン−２への有意な結合を示したが、エオタキシンへの結合は示さなかった。
【０１０１】
ヒトのＰＢＭＣと同様にマウス若しくはラットの脾細胞のフィブロネクチンへの接着を阻害する能力、又はＶＥＧＦへの遊走を減衰する能力についても抗体を調べた。Ｄ８（５０μｇ）は、ヒトのＰＢＭＣと同様にマウス若しくはラットの脾細胞のフィブロネクチン（ＦＮ）への接着を３５〜５５％（図２Ａ）阻害することが見い出された。ＶＥＧＦへの遊走も用量依存性に減衰した（図２Ｂ）ということは、抗体の抗炎症性効果の可能性を裏付けている。
【０１０２】
実施例２：クローンＤ８ｍＡｂの抗炎症性の能力（生体内データ）
Ａ．関節リウマチのモデル
フロインド不完全アジュバントの注射によってＬｅｗｉｓラット（イスラエル、Ｈａｒｌａｎから得た６週齢オスＬｅｗｉｓラット）でアジュバント関節炎を誘発した。フロインド不完全アジュバントは、熱で殺したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを１０ｍｇ／ｍＬにて鉱物油に懸濁することによって調製した。尾の付け根の皮下で１０μＬのアジュバントをラットに注射した。
アジュバント誘発の関節炎に対する、対照としての非特異的ＩｇＧ及びＰＢＳと比べた抗エオタキシン−２抗体の効果の評価
【０１０３】
エオタキシン−２に対するモノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）による週３回の腹腔内（ＩＰ）注射によってラット（群当たり８匹）を処理した。対照は、マウスの総（非特異的）ＩｇＧ又はＰＢＳで処理した。注射はアジュバント投与後３日目に開始し、ラットを屠殺するまで週３回行った。
用量反応実験
【０１０４】
実験の第２の設定では、アジュバント誘発の関節炎モデルで最良の予防成績を示す抗エオタキシン−２抗体Ｄ８を用量反応モデルで調べた。上述のプロトコールに従ってアジュバント関節炎を誘発した。アジュバント注射の３日後に開始し、週３回、２０μｇ、１００μｇ又は１０００μｇの用量でのＤ８によって腹腔内でラット（群当たり６匹）を処理した。動物の別の設定（各群６匹）は、関節炎が発症した後、すなわち、関節炎がすでに明らかであるとき、同一用量で処理した（Ｄ８処理群）。
【０１０５】
既知の有効性の従来の抗炎症剤の有効性とＤ８の抗炎症性の有効性を比較するために、アジュバント注射の３日後に開始する０．２５ｍｇ／ｋｇ、週１回のメソトレキセート（ｉｐ）で一群を処理した（メソトレキセート予防群）。追加の群は、３日目に開始する週３回の１００μｇのＤ８（ｉｐ注射）と併用して週１回の０．２５ｍｇ／ｋｇのメソトレキセートで処理した（併用Ｄ８−メソトレキセート予防群）。対照群は実験全体を通してＰＢＳで処理した。
関節炎の重症度の評価
【０１０６】
体重、足の腫脹、関節炎スコア及び動物の全体的な動きを測定することによって関節炎の重症度を評価した。病理評価のために試料関節を得たが、足首関節の死後Ｘ線検査を実施して侵食を記録した。
【０１０７】
全身性の炎症の指標として２日に１回、グラムでの体重を測定した。
【０１０８】
（足腫脹の評価）キャリパを用いて、足首及び手首の径をｍｍ（小数点第１位まで）で週３回記録した。
【０１０９】
（関節炎スコアの測定）以下：０＝正常、１＝足首又は手首の軽い紅斑及び／又は腫脹、２＝足首又は手首の中程度の紅斑及び／又は腫脹、３＝足首又は手首の重度の紅斑及び／又は腫脹、４＝足指又は手指及び足首又は手首の完全な紅斑及び／又は腫脹及び足首又は手首を曲げることが不可能、のような腫脹、紅斑及び変形の程度（４つの手足すべてについて動物当たり、最大スコアは１６）について０〜４の尺度で手足をスコア化した。
【０１１０】
その部分的な寄与に従って手指及び足指の腫脹を記録した。足首（足）：各足指を０．２とスコア化した；手首：各手指を０．２５とスコア化した。関節の合計を算出した。
【０１１１】
（運動性スコア）以下の定義：０＝正常、１＝やや損傷、２＝主な損傷、３＝足を踏みつけない、４＝動かない；に従って０〜４の間で動物の全体的な運動性をスコア化した。
【０１１２】
（統計的解析）統計的解析には、ＱｕｉｃｋＣａｌｃｓソフトウエア（カリフォルニア州、サンディエゴのＧｒａｐｈ−Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた。スチューデントのｔ検定を実施して実験群間の有意差を特定した。
結果
Ａ．関節炎モデル
【０１１３】
免疫グロブリン（ＩｇＧ）又はＰＢＳで処理したものに比べて、抗エオタキシン−２抗体で処理したラットでは関節炎の有意な抑制が認められた。図３Ａ〜３Ｃで明らかにされるように、抗体による抑制は調べたパラメータすべて（関節炎スコア、運動性スコア及び足首径）で明らかだった。Ｄ８と記された抗体は最も有意な効果を示した。関節炎スコア試験（図３Ａ）では、ＰＢＳで処理したラット又はＩｇＧで処理したラットとＤ８で処理したラットを比べると、１３日目〜２１日目まですべての測定で統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が得られた。予防効果は、注射後１７日目で関節炎が出現すると即座に明らかになった。２１日目の実験終了まで、その程度は増大し続けた。
【０１１４】
運動性スコア試験では、１７日目から、ＰＢＳで処理したラットとＤ８で処理したラットを比べたとき、及び１８日目から、ＰＢＳで処理したラット又はＩｇＧで処理したラットとＤ８で処理したラットを比べたとき、あらゆる測定で統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が得られた。従って、２１日目では、ＰＢＳで処理した動物の２．４３に比べて、Ｄ８で処理した動物の運動性スコアの平均は１．３７だった（ｐ＝０．００５）。
【０１１５】
足首径試験では、１９日目時点でのＤ８とＰＢＳの間で統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が得られた。Ｄ８とＩｇＧの間の差異は統計的な有意性に達しなかった。
【０１１６】
上記で示されたように、Ｄ８で処理したラットは、ＰＢＳで処理したラットよりも低い、２．６〜３．０の範囲の関節炎スコアを有した（図４Ａ）。組織学的スコアについては、定義：０＝正常、１＝炎症性浸潤及び滑膜過形成、２＝パンヌス形成及び軟骨侵食、３＝重大な軟骨侵食と骨破壊、４＝関節の整合性の喪失の程度について０〜４のスコアで各手足をスコア化した。関節炎ラットの関節の組織学的分析は、Ｄ８で処理したラットの関節が滑膜の過形成と散発的な炎症性浸潤を有するが、ＰＢＳで処理したラット（対照群）のほとんどはパンヌス形成と強度の炎症性浸潤を伴う重度の滑膜炎を有する（図４Ｃ）ことを示した。
【０１１７】
全身性の炎症反応に対する抗エオタキシン−２抗体による処理の効果を評価するために、動物の平均体重を記録した。図５に示されるように、抗エオタキシン−２抗体処理は、アジュバント関節炎によって誘発される全身性の炎症反応が原因で起きる体重減少を有意に改善した。再び、最大の予防効果は、Ｄ８抗体で処理した動物で認められ、それは実験全体を通して体重を増やし続けた。Ｄ８とＰＢＳの間における体重の統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）は１７日目に得られた。
用量反応実験
【０１１８】
関節炎のＤ８による予防
一連の用量反応実験では、低用量（２０μｇ）群及び高用量（１０００μｇ）群に比べて、１００μｇでのＤ８が有意に優れた予防効果を有した（図６Ａ）。運動性スコア、足首径及び動物の体重についても同様の結果が得られた（データは示さず）。１００μｇのＤ８で処理したラットをＰＢＳで処理したラットと比較した場合、１７日目〜２４日目であらゆる測定にて統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が得られた。
【０１１９】
関節炎のＤ８による処理
関節炎の出現時に腹腔内で開始したＤ８抗体による処理も、ＰＢＳで処理した動物に比べて関節炎スコアの重症度で有意な軽減を生じた（図６Ｂ）。運動性スコア、体重及び足首径についても同様の結果が得られた。図６Ｂで示されるように、この実験設定では、１００μｇ〜１０００μｇの用量群で同様の結果が得られた。
関節炎のＤ８／メソトレキセート併用での予防
【０１２０】
メソトレキセートと１００μｇのＤ８が双方共、関節炎スコア（ＰＢＳ処理対照と比べた）によって測定したとき、関節炎の進展に対して有意な、匹敵する予防を生じた一方で、メソトレキセートとＤ８の併用は、図７に示すように向上した（相乗の）予防効果を生じた。
【０１２１】
１００μｇのＤ８とＭＴＸ双方の処理はＰＢＳに比べて１３日目時点で統計的に有意な効果（ｐ＜０．０５）を引き起こした。実験の終了まで、２４日目まで、ＭＴＸ単独で処理したラットとＭＴＸ＋１００μｇのＤ８で処理したラットの間で関節炎スコアの統計的に有意な差が認められた。有意差は、これらの群間で、２４日目の平均足首幅でも認められた（示さず）。
【０１２２】
Ｘ線検査の結果
死後Ｘ線検査は、Ｄ８で処理したラットの最少限の腫脹に比べて、ＰＢＳで処理したラットでは関節周囲軟組織の強度の腫脹を示した（図８）。加えて、対照ラットは、脱灰の兆候と早期の侵食を示したが、それは、Ｄ８で処理した動物では見られなかった。このことは、Ｄ８で処理した動物における炎症の有意な低下を示している。
【０１２３】
前肢のＸ線検査においても同様の結果が見られた（示さず）。
Ｂ．大腸炎モデル
【０１２４】
慢性の大腸炎を誘発するために、１０週齢のＣ５７ＢＬマウスに、飲料水中のデキストラン硫酸（ＤＳＳ）への５日間の暴露に続いて通常の水道水で１０日間の間隔を置くことを３サイクル経験させた。第１のサイクルの終了時に、マウスを無作為に６つの処理群：ビヒクル対照（ＰＢＳ）、マウスの総ＩｇＧ、並びに５μＭ、２５μＭ、１００μＭ及び２００μＭの上昇用量で与えたＤ８に分けた。処理は週３回の計画にて腹腔内（ｉｐ）注射で行った。週２回体重を測定した。最終サイクルの終了時までにマウスを屠殺し、誘導した炎症の程度を評価するために、結腸の近位部分は免疫組織化学解析に、遠位部分はミエロペルオキシダーゼ活性のアッセイ（標準のプロトコールに従って）に利用した。動物の血清における炎症性サイトカインのレベルはフローサイトメトリーによって検出した。
【０１２５】
ＩｇＧ又はＤ８による処理は、ビヒクル処理の動物に比べて体重低下を有意に減衰する。試験全体を通して、最高の体重は５μｇのＤ８処理群で認められた（図９Ａ）。３４日目のＭＰＯ活性は、ｍＩｇＧを含むその他すべての群に比べて５μｇのＤ８処理群で有意に低下した（図９Ｂ）。加えて、Ｄ８で処理した動物の血清における炎症性サイトカインのレベルは対照動物で検出されたものよりも低かった（図９Ｃ）。近位結腸の免疫組織化学解析は、炎症の範囲及び程度と同様に結腸組織への損傷のレベルでも抑制を裏付けた（図９Ｄ）。熟練病理医によって炎症性浸潤の範囲が評価された。
Ｃ．ＥＡＥ
【０１２６】
ＥＡＥは、ヒトの疾患である多発性硬化症の治療能を検討する典型的な動物モデルとして役立つ（３０）。
【０１２７】
１０週齢のＣ５７ＢＬマウスに、完全フロインドアジュバント中で懸濁した２００μｇのＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイトの糖タンパク質）ペプチドを皮下注射し、その後、１週間後に２回目の注射をした。疾患の誘発後１日目（すなわち、２回目の注射の１日後）、対照（ＰＢＳ）、マウス総ＩｇＧ、２５μｇのＤ８及び１００μｇのＤ８による処理（週３回、ｉｐ注射）を開始した。標準のＥＡＥスコア化方式（３１）に従って、週３回、疾患の重症度と進行を記録した。
【０１２８】
２５μｇ、さらに有意には１００μｇのＤ８による処理は、実験の全過程の間、ＥＡＥの兆候の進行を減衰した。高い方の用量（１００μｇ）でのＤ８は、約９０％（ほかの処理群すべて）の疾患の発生率をたった５５％（図１０）に下げたということは、ＥＡＥの治療にてＤ８の治療上の利点の可能性を説明している。
Ｄ．糖尿病
【０１２９】
非肥満型糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、自己免疫性糖尿病の動物モデルとして役立つ（３２）。
【０１３０】
６週齢のＮＯＤマウスをＤ８又はビヒクル対照（ＰＢＳ）で週３回処理した。４９〜１１２日目の間で、市販の尿テストを用いて糖尿病の発生を調べ、１１２日目の血清のエオタキシン−２のレベルをＥＬＩＳＡ（マウスＣＣＬ２４／エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、Ｄｕｏｓｅｔ、Ｒ＆Ｄ）を用いて測定した。
【０１３１】
糖尿病の発生率は、未処理の対照と比べてＤ８処理群では顕著に低下した（図１１Ａ）。臨床的な改善と一致して、対照と比べて抗エオタキシン−２で処理した動物の血清では、エオタキシン−２のレベルは大きく低下した（図１１Ｂ）。
Ｅ．アテローム硬化性プラーク形成の抑制
【０１３２】
種々の炎症性のサイトカイン及びケモカインの発現レベルをアテローム硬化性病変（プラーク）で測定した。急性心筋梗塞の患者の責任冠状動脈から回収した不安定プラークを動脈内膜切除試料から得た安定プラークと比較した。タンパク質アレイによるプラークの分析を図１２に示す。材料と方法の項で記載したとおりに処理を行った。
【０１３３】
様々に発現されたタンパク質の間で、有意な変化は、以下のタンパク質：ＶＣＡＭ−１、エオタキシン−２、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１及びＴＩＭＰ−２に見い出され、安定プラークに対比して不安定プラークではすべて２倍を超える発現の低下を示した（図１２Ａ）。
【０１３４】
アテローム性動脈硬化症の傾向にあるマウス（ａｐｏＥＫＯマウス）における免疫組織化学的な検討では、若齢マウスから老齢マウスまで脂肪線条と進行した病変が、材料と方法で記載したように抗エオタキシン−２抗体によって染色された。エオタキシン−２は、内皮細胞の中及びプラークのマクロファージの中に存在することが示された（図１３）。
【０１３５】
若齢（６週齢）のａｐｏＥＫＯマウスとアテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウスでｍＲＮＡの発現を測定した。マウスから大動脈を得て、材料と方法に記載したようにＲＴ−ＰＣＲに供した。エオタキシン−２とＴＧＦ−βのｍＲＮＡレベルを比較してアッセイした。エオタキシン−２のｍＲＮＡレベルは、老齢マウスに対比して若齢マウスで有意に高いことが見い出され、この発現パターンは動脈硬化防止剤であるＴＧＦ−βに関して認められたものと並行した。図１４Ａは、各群の代表的な試料を示す。
【０１３６】
酸化ＬＤＬはアテローム発生を促進するのに重要な役割を担うと考えられている。マウスのＨ５Ｖ内皮細胞を酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）（１μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｏｘＬＤＬは、マウスＨ５Ｖ内皮細胞にてエオタキシン−２のｍＲＮＡレベルを有意に上方調節した（図１４Ｂ）。
【０１３７】
プラークの炎症の細胞性成分の接着においてエオタキシン−２が役割を有するかどうかを判定するために、培養内皮細胞にて接着アッセイを行った。若齢又は老齢のアテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウスの脾細胞を脾臓から単離した。マウスの内皮細胞をｏｘＬＤＬ（１μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、エオタキシン−２抗体又は対照のＩｇＧ抗体の存在下で脾細胞の内皮細胞への接着を調べた（図１５Ａ）。エオタキシン−２に対する阻止抗体との内皮細胞の予備インキュベートは、脾細胞のこれら細胞への接着を減衰することが見い出された（図１５Ａ）。この効果は、若齢非アテローム硬化性マウス（６週齢）から得たものに比べて、アテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウス（６週齢）のリンパ球でさらに強力だった。単球／マクロファージ細胞株（Ｕ９３７細胞）を培養内皮細胞（Ｈ５Ｖマウス内皮細胞株）に接着させた場合、これらの知見も明らかだった（図１５Ｂ）。
【０１３８】
本発明のモノクローナル抗体と同様に、市販の抗エオタキシン−２抗体を用いて、初期の及び進行したアテローム硬化性プラークに対するエオタキシン遮断の効果を測定した。予備試験では、５μｇの週２回用量の抗エオタキシン−２阻止抗体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）は、マウスの大動脈でエオタキシン−２ｍＲＮＡのレベルを有意に下げるのに十分だった。次に、抗エオタキシン−２抗体の短期投与の効果を調べた。若齢ａｐｏＥＫＯマウスを週２回のエオタキシン−２抗体（５μｇのｉｐ注射）又は対照ＩｇＧ又はＰＢＳで４週間処理し、脂肪線条に対する効果を測定した。オイルレッドＯで染色した後、プラークの大きさを解析するためにマウスを屠殺した。抗エオタキシン−２はマウスＩｇＧに比べて脂肪線条の形成をおよそ７２パーセント劇的に低下させた（図１６Ａ）。双方の群で総コレステロール及びトリグリセリドは類似していたので、この効果は脂質特性の変化とは関連しなかった（データは示さず）。さらに、対照のマウスＩｇＧによる処理は、ＰＢＳ注射に比べてプラークの進行に影響しなかった。
【０１３９】
次に、プラークの構造がさらに複雑である長期モデルにてエオタキシン−２の遮断の効果を調べた。本明細書では、エオタキシン−２抗体（５μｇ／用量）の週２回の注射の１０週後、老齢のａｐｏＥＫＯマウスの心臓で測定したプラークの大きさに関して有意差は明らかではなかった（図１６Ｂ）。しかしながら、線維性領域によって測定されるプラークの安定性をアッセイした場合、エオタキシン−２に対する抗体は、より小さな脂質コアを犠牲にしたより大きな線維性領域によって明らかな有意にさらに安定したプラークの表現型を誘導した（図１６Ｃ）。再び、これらの知見は、群間に差異のない脂質レベルにかかわりなかった。代表的な、オイルレッドＯ染色した及びＭａｓｓｏｎの三色染色した切片を図１７に提供する。
【０１４０】
アテローム性動脈硬化症は、脂肪の沈着が動脈壁で進行し、内腔の進行性の狭窄をもたらす過程である。成熟プラークは２つの基本構造：脂質のコアと線維性のキャップで構成される。脂質のコアが小さければ小さいほど、線維性のキャップは厚く、さらに安定なプラークとなるということは、破裂し、心筋梗塞又は不安定狭心症を起こす傾向が低下することを意味する。急性の冠状動脈症候群（たとえば、心筋梗塞及び不安定狭心症）の原因となるプラークのほとんどが、＜７０％の狭窄を有することが血管造影で示されることは今や明らかである（２８、２９にて概説された）。これらの病変のおよそ６０％は、大きな血栓形成性の脂質コアと壊死性の残渣（マクロファージ、Ｔ細胞、古い出血、血管形成及びカルシウムの病巣を含む）を伴ったプラークの破裂が原因で生じる。おそらく、マクロファージがプラークを移動するにつれてそれを消化するマトリクスメタロプロテイナーゼを分泌し、平滑筋（プラークの要素を支えている）が、たとえば、炎症性サイトカインのような幾つかの因子によって生じる老化又はアポトーシスのために激減するために、破裂したキャップは薄い。
【０１４１】
態様の１つでは、本発明は、エオタキシン−２がヒトの安定した及び不安定なアテローム硬化性プラークで差次的に発現するという知見に基づく。ａｐｏＥノックアウト（ＫＯ）［２０］マウスモデルにてエオタキシン−２の経路を遮断することによって、本発明者らは、脂肪線条形成（初期動脈硬化病変を示す）の抑制とプラーク安定化の延長の双方を実証することができた。
【０１４２】
本発明の発明者らは、当該技術での以前の報告を支持している、アテローム硬化性と非アテローム硬化性のマウス動脈の内皮にエオタキシン−２が発現されていることを見い出した。しかしながら、本発明者らはまた、エオタキシン−２がプラークのマクロファージで発現されていることも見い出した。エオタキシン−２は、アテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウスに比べて若齢ａｐｏＥＫＯマウスの大動脈でさらに豊富に発現された。エオタキシン−２が、内皮への単球／マクロファージの細胞／細胞接着を含む、アテローム性動脈硬化症の最初の段階に関与することを示唆すること。実際、以下に記載される試験管内の試験は、エオタキシン−２を遮断することはｏｘＬＤＬで誘導した内皮細胞へのリンパ球の接着を低下させ、生体内でのプラーク形成におけるエオタキシン−２の役割を支持することを示している。
【０１４３】
徹底した研究にもかかわらず、安定なプラークから不安定なプラークへの移行を支配する因子は不明瞭なままである。ヒトの安定プラークと不安定プラークの炎症性タンパク質アレイ解析に基づいて、本発明は、安定型と不安定型の間のプラークの移行に関与する可能性のある標的タンパク質、エオタキシン−２を提供する。ＶＣＡＭ−１、ＩＬ−１０及びＭＣＰ−１とのアテローム性動脈硬化症の関係に関する揺るぎないデータが存在し、それらは、安定プラークと不安定プラークで差次的に発現されることが本発明者らによっても見い出されているが、そのようなデータはエオタキシン−２については存在しない。
【０１４４】
加えて、エオタキシン−２は、アテローム硬化性及び非アテローム硬化性のマウス動脈の内皮で発現されていることが本発明者らによって見い出されたので、以前の報告を支持している。しかしながら、それはプラークのマクロファージでも発現されていることが本発明者らによって見い出された。興味深いことに、内皮への単球／マクロファージの細胞／細胞接着を含む、アテローム性動脈硬化症の最初の段階に相当するアテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウスに対比して、エオタキシン−２は、若齢ａｐｏＥＫＯマウスでさらに豊富に発現された。実際、試験管内の試験は、生体内では上手く生じてもよいｏｘＬＤＬが介在する接着におけるエオタキシン−２の遮断の役割を支持している。マウスのアテローム性動脈硬化症の早期段階におけるエオタキシン−２のさらに強力な発現はまた、短期の脂肪線条モデルにおけるこの経路を阻害する印象的な効果も説明する。理論に束縛されることを望まないで、内皮への炎症性細胞の接着を阻止することは、この効果に一義的に関与するのかも知れない。
【０１４５】
線維性領域によって明らかなようなプラークの安定化に対するエオタキシン−２遮断の効果に関して、炎症性細胞の動員がエオタキシン−２遮断のために減衰されるとすると、サイトカイン環境が安定な表現型に対してさらに好都合であることが十分に理解されてもよい。これらの知見は、プラークの蓄積が、エオタキシン−２の遮断によって変化しなかった脂質特性によって影響を受ける可能性がさらに高いので、アテローム性動脈硬化症の程度の低下に必ずしも反映されなくてもよい。
文献
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【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患の治療におけるエオタキシン−２（ＣＣＬ２４）の阻害剤の使用、特に抗エオタキシン−２ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、白血球の化学誘引物質として作用し、これら細胞の恒常的な輸送と共に、炎症部位への特異的な細胞集団の動員の双方を調節する小型サイトカインである。ケモカインの調節不全は、炎症及び自己免疫を含む免疫系に関与する広範なヒトの疾患で役割を担うと考えられる（１）。
【０００３】
ヒトのエオタキシンファミリーには、ＣＣケモカインファミリーに属する３つの既知のサイトカインが含まれる。
【０００４】
エオタキシン１（好酸球走化性タンパク質１；エオタキシン又はケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＣＬ１１）とも呼ばれる）は、その走化性を誘導することによって好酸球を選択的に動員することが知られているので、アレルギー反応に関係するとみなされている。
【０００５】
エオタキシン２（好酸球走化性タンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）、骨髄性前駆細胞阻害因子２（ＭＰＩＦ−２）とも呼ばれる）は、好酸球（２〜４）、好塩基球（４）、Ｔｈ２型リンパ球（５）及び好中球を含む炎症性細胞の強力な化学誘引物質である。エオタキシン−２は、種々の型の内皮細胞で発現され（５〜９）、内皮細胞（１０）及び平滑筋細胞（１１）において血管新生反応及び遊走性反応を誘導する。
【０００６】
エオタキシン３（好酸球走化性タンパク質３；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６（ＣＣＬ２６）、マクロファージ炎症性タンパク質−４α（ＭＩＰ−４α）、胸腺間質ケモカイン−１（ＴＳＣ−１）及びＩＭＡＣ）は、好酸球と好塩基球に対して走化性である。
【０００７】
エオタキシン−２はエオタキシンとたった３９％相同であるにすぎず、２つのポリペプチドはＮＨ２−末端領域にてほぼ完全に異なる（１２）。エオタキシン−２は染色体７ｑ１１．２３に局在し、エオタキシンは染色体１７ｑ２１．１に局在する。エオタキシン−３の遺伝子は、第７染色体上でエオタキシン−２の近くにあるが、それとは３３％の相同性を共有するにすぎない。これらのケモカインはＣＣＲ３受容体に特異的に結合する。エオタキシンの受容体であるＣＣＲ３は、好酸球を始めとして、マクロファージや内皮細胞を含む多種多様な細胞で発現される、７回膜貫通型のＧタンパク質共役受容体である（１３）。
【０００８】
ＷＯ９７／００９６０は、ヒトのエオタキシン（ＣＣＬ１１）をコードする核酸、並びに単離された又は組換えのヒトのエオタキシンタンパク質を開示している。ＷＯ９７／００９６０はまた、特定部位への好酸球の動員又はアレルギー状態の治療におけるエオタキシンタンパク質の使用方法も開示している。
【０００９】
ＣＣＲ３の発現は元々、喘息及びアレルギーの発病機序で検討され、それは治療目標として役立ち続けている（１４）。しかしながら、さらに最近、この経路の役割は、炎症性大腸炎（１５）、多発性硬化症（１６）及び関節リウマチ（ＲＡ）を含むさらなる炎症性疾患及び自己免疫性疾患の研究にて明らかになっている。
【００１０】
関節リウマチ（ＲＡ）は、広範な炎症性細胞による滑膜組織への激しい破壊的な浸潤を特徴とする一般的な慢性の炎症性疾患である（１７）。マクロファージ及び線維芽細胞に由来する複数のサイトカインが（ＲＡ）(18) におけるサイトカイン及びケモカイン双方の分泌に関与する。関節腔における白血球の蓄積は、サイトカイン及びマトリクス分解酵素を含む組織分解因子の分泌をもたらす。
【００１１】
ケモカインの阻害は、一般に使用されるＲＡの動物モデルであるアジュバント誘発の関節炎における治療の選択肢として以前検討された（１９）。同じモデルを用いて、ＣＣＲ３は、滑膜組織への白血球の動員で役割を担うことが示された（２０）。多数のケモカイン及びサイトカインの受容体の差次的発現もＲＡ患者の血清や滑膜組織で実証された（２１）。
【００１２】
サイトカインやケモカインが関与する炎症は、アテローム性動脈硬化症のプラーク増殖、及び脱安定化し、その後破裂させる傾向を促進することにおいて極めて重要な役割を担うと考えられている（２２，２３）。エオタキシン／ＣＣＬ２４の受容体（ＣＣＲ３）はプラークのマクロファージで発現されている（２４）。臨床試験によって、健常人のコホートにてエオタキシン遺伝子の非保存的多型が心筋梗塞の高いリスクを関連していることが明らかにされた（２５）。その後の試験で、高いレベルの循環エオタキシンは冠状動脈のアテローム性動脈硬化症と虚血の存在に関連することが見い出された（２６，２７）。
【００１３】
アテローム性動脈硬化症は、脂肪沈着が動脈壁で進行し、管腔の進行性の狭窄をもたらす過程である。成熟したプラークは、２つの基本構造：脂質のコアと線維性のキャップから構成される。脂質のコアが小さければ小さいほど、線維性のキャップは厚く、さらに安定なプラークとなるということは、破裂し、心筋梗塞又は不安定狭心症を起こす傾向が低下することを意味する。急性の冠状動脈症候群（たとえば、心筋梗塞及び不安定狭心症）の原因となるプラークのほとんどが、＜７０％の狭窄を有することが血管造影で示されることは今や明らかである（２８、２９にて概説された）。これらの病変のおよそ６０％は、大きな血栓形成性の脂質コアと壊死性の残渣（マクロファージ、Ｔ細胞、古い出血、血管形成及びカルシウムの病巣を含む）を伴ったプラークの破裂が原因で生じる。おそらく、マクロファージがプラークを移動するにつれてそれを消化するマトリクスメタロプロテイナーゼを分泌し、平滑筋（プラークの要素を支えている）が、たとえば、炎症性サイトカインのような幾つかの因子によって生じる老化又はアポトーシスのために激減するために、破裂したキャップは薄い。
【００１４】
ＷＯ０６／９３９３２は、個体の血清にてエオタキシンのレベルを測定することによってアテローム性動脈硬化症を検出する又は診断する方法を開示している。その出願はさらに、血清における高いレベルのエオタキシンが症状の発症前にアテローム性動脈硬化症を診断する手段を提供する可能性があることを示唆している。
【００１５】
上記の出版物はいずれも、炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患の治療のための治療的介入についての標的としてのエオタキシン−２を教示していないし、示唆もしていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体によるエオタキシン−２の阻害が、たとえば、関節リウマチ、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、大腸炎、糖尿病及びアテローム性動脈硬化症のような炎症性疾患の動物モデルにおいて十分な予防効果を有するという知見に基づく。理論によって束縛されることを望まないで、予防効果は、少なくとも部分的には、活性のある炎症性細胞（リンパ球及び単核細胞）の接着性及び遊走性の減衰が介在し得た。従って、本発明は、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患を治療するための治療剤を開発するための新規標的としてエオタキシン−２を導入する。本発明はまた、そのような疾患の治療において単独で使用するための又はほかの治療剤と併用するための特異的な抗エオタキシン−２抗体を提供する。
【００１７】
炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患には、たとえば、乾癬、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）、（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症及び天疱瘡が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、その態様の第１によって、本発明は、少なくとも１つのエオタキシン−２拮抗物質と薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤を含む、炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
【００１９】
一実施形態では、上記エオタキシン−２拮抗物質は、抗エオタキシン−２抗体又は該抗体の結合活性を保持するその断片である。
【００２０】
抗エオタキシン−２抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。特定の実施形態では、抗エオタキシン−２抗体は、ヒト型抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
【００２１】
特定の実施形態では、抗エオタキシン−２抗体は、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体又は該抗体の結合活性を保持するその断片である。
【００２２】
特定の特別な実施形態では、上記抗エオタキシン−２抗体は、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｃ）配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｄ）ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体の重鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体の軽鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；及び
（ｅ）該抗体の結合活性を保持する（ａ）〜（ｄ）の抗体の断片
から成る群から選択されるモノクローナル抗体である。
【００２３】
別の実施形態では、エオタキシン−２拮抗物質は、エオタキシン−２のｍＲＮＡに対して向けられたアンチセンス分子又はｓｉＲＮＡ分子である。
【００２４】
別の実施形態では、エオタキシン−２拮抗物質は、小分子化合物である。
【００２５】
特定の実施形態では、上記の炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患は、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、炎症性大腸疾患、多発性硬化症及び糖尿病から成る群から選択される。
【００２６】
別の態様によって、本発明は、治療上有効な量の本発明のエオタキシン−２拮抗物質又は医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【００２７】
本発明の特定の実施形態によれば、上記自己免疫疾患は、関節リウマチ、炎症性大腸疾患（たとえば、大腸炎）、多発性硬化症及び糖尿病から成る群から選択される。
【００２８】
さらに別の態様によって、本発明は、治療上有効な量の本発明のエオタキシン−２拮抗物質又は医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、アテローム硬化性プラーク形成を阻害する方法を提供する。
【００２９】
本発明は、治療上有効な量の本発明のエオタキシン−２拮抗物質又は医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、アテローム硬化性プラークを安定化させる方法を提供する。
【００３０】
本発明は、治療上有効な量の本発明のエオタキシン−２拮抗物質又は医薬組成物を上記患者に投与することを含む、急性冠状動脈症候群の患者において主要な心血管系事象を予防する方法を提供する。
【００３１】
本発明の方法はまた、少なくとも１つの追加の治療剤との併用で上記エオタキシン−２拮抗物質又は上記医薬組成物を投与することも包含する。
【００３２】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１つの追加の治療剤は、化学療法剤、サイトカイン、ペプチド、抗体及び抗生剤から成る群から選択される。
【００３３】
関節リウマチの治療については、上記追加の治療剤には、メソトレキセート、ステロイド、抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦ受容体抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体又は抗ＣＤ２０抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
ＩＢＤ（炎症性大腸疾患）の治療については、上記追加の治療剤には、シクロスポリン、ＮＳＡＩＤＳ（非ステロイド性抗炎症剤）、ステロイド又は抗ＴＮＦ抗体（たとえば、インフリキシマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
多発性硬化症の治療については、上記追加の治療剤には、コパキソン、インターフェロン−β、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）又はＶＬＡ−４に対するモノクローナル抗体（たとえば、チサブリ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、上記少なくとも１つの追加の治療剤は、エオタキシン−２拮抗物質又は上記医薬組成物と同時に投与される。
【００３７】
本発明の別の実施形態によれば、上記少なくとも１つの追加の治療剤と上記エオタキシン−２拮抗物質又は上記医薬組成物は順次投与される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を提供するが、上記ハイブリドーマは、Ｄ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）から成る群から選択される。
【００３９】
本発明はまた、エオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体又はエオタキシン−２への結合活性を保持するその断片も提供するが、上記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）から分泌される。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明は、エオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体を提供するが、上記抗体は、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｃ）配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｄ）ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）によって分泌される抗体の重鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）によって分泌される抗体の軽鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；及び
（ｅ）該抗体の結合活性を保持する（ａ）〜（ｄ）の抗体の断片
から成る群から選択されるモノクローナル抗体である。
【００４１】
本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子に関すると共に、核酸分子を含む発現ベクターと該発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００４２】
特定の実施形態では、発現ベクターは、原核細胞株又は真核細胞株にて複製することが可能である。
【００４３】
別の態様では、本発明はまた、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療におけるエオタキシン−２拮抗物質の使用を提供する。一実施形態では、上記エオタキシン−２拮抗物質は抗体である。
【００４４】
本発明はまた、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療のための医薬組成物の調製におけるエオタキシン−２拮抗物質の使用も包含する。一実施形態では、上記エオタキシン−２拮抗物質は抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
本発明を理解し、それがどのように実践的に実行されてもよいかを理解するために、貼付の図面を参照して、非限定の例示としてのみ、実施形態を説明する。
【図１】エオタキシンと対比したエオタキシン−２への抗エオタキシン−２ｍＡｂ（Ｄ８）の結合を示すグラフである。４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の読み取りとして結果を提示する。種々の抗体濃度（５μ／ｍＬ〜５０μ／ｍＬの間）を測定した。
【図２Ａ】Ｄ８で処理した細胞のフィブロネクチンに対する接着のレベルを示すグラフである。マウスＩｇＧで処理した対照細胞と比較した接着比率として結果を示す。３種の細胞、マウス脾細胞、ラット脾細胞及びヒトＰＢＭＣを調べた。
【図２Ｂ】Ｄ８で処理した細胞のＶＥＧＦに向かった遊走を示すグラフである。マウスＩｇＧ（５０μｇ）で処理した対照細胞と比較した遊走比率として結果を示す。グラフは、種々のＤ８の量（１２．５、２５及び５０μｇ）を用いて、ラット脾細胞及びヒトＰＢＭＣから得た結果を示す。
【図３Ａ】疾患の発症からの時間の関数としてのラットの関節炎スコア（ＡＳ）に対する抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）、ＩｇＧ及びＰＢＳによる処理の効果（±標準誤差）を示すグラフである。０日目は関節炎を誘発した日である。
【図３Ｂ】ラットの遊走スコアに対する抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）、ＩｇＧ及びＰＢＳによる処理の効果（±標準誤差）を示すグラフである。
【図３Ｃ】足首の直径（ｍｍ）に対する抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）、ＩｇＧ及びＰＢＳによる処理の効果（±標準誤差）を示すグラフである。
【図４Ａ】ＰＢＳ、ＩｇＧ、Ｄ８、Ｇ７及びＧ８の抗体で処理したラットの関節の組織学的スコアを示すグラフである。
【図４Ｂ】Ｄ８（図４Ｂ）又はＰＢＳ（図４Ｃ）で処理したラットの関節の代表的な所見を示す写真（ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）である。
【図４Ｃ】Ｄ８（図４Ｂ）又はＰＢＳ（図４Ｃ）で処理したラットの関節の代表的な所見を示す写真（ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）である。
【図５】アジュバントで誘発した関節炎のラットの体重（グラム）に対する、時間（日）の関数としての、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）、ＩｇＧ及びＰＢＳによる処理の効果（±標準誤差）を示すグラフである。
【図６Ａ】アジュバントで誘発した関節炎における関節炎スコア（ＡＳ；Ｙ軸）に対する、時間（日）の関数としての、３つの用量（２０μｇ、１００μｇ及び１０００μｇ）での予防モードにおける抗エオタキシン−２抗体による処理の効果（±標準誤差、比率）を示すグラフである。
【図６Ｂ】アジュバントで誘発した関節炎における関節炎スコア（ＡＳ；Ｙ軸）に対する、時間（日）の関数としての、３つの用量（２０μｇ、１００μｇ及び１０００μｇ）での治療モード（関節炎の出現と共に投与）における抗エオタキシン−２抗体による処理の効果（±標準誤差、比率）を示すグラフである。
【図７】時間（日）の関数としての予防モード（±標準誤差）におけるアジュバントで誘発した関節炎の関節炎スコアに対する、ＰＢＳで処理した対照と比較した、Ｄ８（１００μｇ）、メソトレキセート（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、及びＤ８（１００μｇ）と併用したメソトレキセートの予防効果を示すグラフである。
【図８】ＰＢＳ（図８Ａ）及びＤ８（図８Ｂ）で処理したラットの関節の死後Ｘ線解析の写真である。足首の脱灰と早期の骨侵食（矢印頭）と同様に、強度の関節周囲の軟組織の腫脹が、ＰＢＳで処理したラット（星印）で明らかである（代表的な図）。
【図９Ａ】時間（日）の関数としての、ＤＳＳで誘発した大腸炎のマウスにおける体重の増減比率を示すグラフである。５μｇ又は２５μｇの抗エオタキシン−２抗体Ｄ８でマウスを処理した。対照動物は、ＰＢＳ又はＩｇＧで処理した。
【図９Ｂ】ＤＳＳで誘発した大腸炎のマウスにおける％ＭＰＯ活性を示すグラフである。５μｇ、２５μｇ、１００μｇ又は２００μｇの抗エオタキシン−２抗体Ｄ８でマウスを処理した。対照動物は、ＰＢＳ又はＩｇＧで処理した。
【図９Ｃ】抗エオタキシン−２抗体Ｄ８（５μｇ）又は対照（ＰＢＳ）で処理した、ＤＳＳ誘導大腸炎のマウスの血清における種々のサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１（単球化学誘引タンパク質−１）、及びＴＮＦ）のレベルを示すグラフである。
【図９Ｄ】５μｇ、２５μｇ、１００μｇ又は２００μｇの抗エオタキシン−２抗体Ｄ８で処理したＤＳＳ誘発大腸炎のマウスの結腸の組織学的解析のグラフによる表示である。対照動物は、ＰＢＳ又はＩｇＧで処理した。［Ｉ］病変の程度（大きさ）を表し、［ＩＩ］炎症（炎症性細胞の浸潤）を表し、［ＩＩＩ］損傷（組織の破壊）を表す。
【図１０】ＰＢＳ、ＩｇＧ、抗エオタキシン−２抗体Ｄ８（２５μｇ）又は抗エオタキシン−２抗体Ｄ８（１００μｇ）のいずれかで処理した、誘発ＥＡＥマウスにおける時間の関数としての疾患の重症度の平均を示すグラフである。
【図１１Ａ】ＰＢＳ又は抗エオタキシン−２抗体（Ｄ８）のいずれかで処理したＮＯＤマウスにおける時間の関数としての疾患の発生率（糖尿病マウスの比率）を示すグラフである。
【図１１Ｂ】ＰＢＳ又は抗エオタキシン−２抗体（Ｄ８）のいずれかで処理したＮＯＤマウスの血清におけるエオタキシン−２のレベル（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図１２Ａ】不安定なプラークと対比した安定したプラークにおける炎症性因子の発現の定量的解析を示すグラフである。各群で４つのプラークを解析した。
【図１２Ｂ】代表的な例を提供する画像である。
【図１３】マウスのアテロームにおけるエオタキシン−２の免疫組織化学的な局在を示す画像である。図１３Ａは、特徴的な脂肪線条（ＡＨＡ、クラスＩ〜ＩＩ）を示し、図１３Ｂは、中間的なプラーク（ＡＨＡ、クラスＩＩ）を示し、図１３Ｃは、アテローム性病変（ＡＨＡ、クラスＩＩＩ〜ＩＶ）を示し、図１３Ｄは、無関係なＩｇＧで染色された陰性対照を示す。太い矢印はエオタキシン−２陽性の代表的な内皮細胞を示すが、細い矢印はプラークのマクロファージでの各染色を示す。
【図１４】図１４Ａは、若齢又は老齢のＫＯＡｐｏＥマウスの大動脈におけるエオタキシン−２とＴＧＦβのｍＲＮＡの発現を示すゲルの画像である。図１４Ｂは、ｏｘＬＤＬと共にインキュベートしたマウスＨ５Ｖの内皮細胞におけるエオタキシン−２とＴＧＦβのｍＲＮＡの発現を示すゲルの画像である。
【図１５】図１５Ａは、内皮への単核細胞（脾細胞）の接着に対するエオタキシン−２の阻止の効果を示すグラフである。図１５Ｂは、本質的に類似のプロトコールにて単球／マクロファージ細胞株で行った代表的な結果を示す。＊ｐ＜０．０５
【図１６】図１６Ａは、抗エオタキシン−２抗体による４週間の処理に反応した病変（プラーク）の大きさを示すグラフである。図１６Ｂは、抗エオタキシン−２抗体による１０週間の処理に反応した病変（プラーク）の大きさを示すグラフである。図１６Ｃは、抗エオタキシン−２抗体による１０週間の処理に反応した線維領域の比率を示すグラフである。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５．
【図１７】エオタキシン−２に対する阻止抗体で処理したａｐｏＥマウスの代表的な切片の画像である。図１７Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＰＢＳ、対照ＩｇＧ、エオタキシン−２抗体による処理の脂肪線条病変の代表的なオイルレッド染色を示す。図１７Ｄ〜Ｆは、類似のマウス群でのさらに長い処理試験におけるさらに進んだ病変の類似の評価を示す。図１７Ｇ〜Ｉ及びＪ〜Ｌはそれぞれ、ＰＢＳ、対照ＩｇＧ、エオタキシン−２抗体による処理のＭａｓｓｏｎの三色組織化学試験及びｖｏｎ Ｇｉｅｓｓｏｎの組織化学試験（それぞれ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、エオタキシン−２（ＣＣＬ２４）に特異的に結合し、その機能を阻害する抗体に関する。さらに、本発明は、該抗体を含む医薬組成物、並びに炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患の治療のためのそれらの使用に関する。
【００４７】
本発明がさらに理解され易いように、詳細な説明の全体にわたって種々の定義が示される。
【００４８】
態様の１つに従って、本発明の治療方法は、エオタキシン−２の活性及び／又は発現を低減することができる治療上有効な量のエオタキシン−２拮抗物質をそれが必要な患者に提供することによって達成され、それによって患者において炎症性疾患、自己免疫疾患又はアテローム性動脈硬化症疾患を軽減する。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、哺乳類（たとえば、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、又はヒト）のような、本発明から恩恵を受けてもよい対象を指す。特定の一実施形態では、患者はヒトである。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「治療」は、エオタキシン−２が介在する疾患又は症状の有害な効果を軽減すること、予防すること、治癒させること、覆すこと、減衰すること、緩和すること、できるだけ抑えること、又は止めることを指す。
【００５１】
用語「エオタキシン−２」（好酸球走化性タンパク質２）、「ＣＣＬ２４」（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２４）、又は「ＭＰＩＦ−２」（骨髄性前駆細胞阻害因子２）は相互交換可能に使用され、ヒトＣＣＬ２４遺伝子によってコードされ、ヒト第７染色体上に局在し、当該技術で既知であるＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインを指す。
【００５２】
ＣＣＬ２４は、ケモカイン受容体ＣＣＲ３と相互作用する。ＣＣＬ２４の活性は、好酸球、好塩基球、Ｔ細胞及び好中球における走化性の誘導、並びに内皮細胞及び平滑筋細胞における血管新生反応及び遊走反応の誘導を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「炎症」は、たとえば、病原体や損傷細胞（たとえば、火傷、外傷、腫瘍が原因となる）のような有害な刺激、又は化学物質、熱若しくは寒冷のような刺激物に対する免疫系の複雑な生物反応を指す。用語「炎症性疾患」は、アテローム性動脈硬化症や種々の自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない炎症に関連した疾患を指す。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「アテローム性動脈硬化症」（アテローム硬化性血管疾患又はＡＳＶＤとしても知られる）は、コレステロールのような脂肪物質の蓄積の結果、動脈壁が厚くなる病態症状である。この過程は、動脈の壁における慢性の炎症反応の結果であり、大部分は、機能的な高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によるマクロファージからの脂肪やコレステロールの適当な除去かないままに、マクロファージの蓄積によるものであり、低密度のリポタンパク質によって助長される。動脈のこの硬化又は裏打ちは、動脈内での複数のプラークの形成によって引き起こされる。
【００５５】
「アテローム硬化性プラーク」又は「アテローム」は、脂質（コレステロールと脂肪酸）、カルシウム及び種々の量の線維性結合組織を含有する細胞（ほとんどマクロファージ細胞）又は細胞残渣から構成される動脈壁の蓄積及び腫脹である。アテローム及び動脈壁の変化は、管腔径の変化なしで余分な壁の厚さを補填するのにちょうど十分な大きさの小型の動脈瘤（拡張）を普通生じる。成熟プラークは２つの基本構造：脂質コアと線維性のキャップから構成される。脂質コアが小さければ小さいほど、線維性のキャップは厚く、プラークはさらに安定であるということは、破裂し、心筋梗塞や不安定狭心症を起こす傾向が低下することを意味する。急性の冠状動脈症候群（たとえば、心筋梗塞及び不安定狭心症）の原因となるプラークのほとんどが、＜７０％の狭窄を有することが血管造影で示されることは今や明らかである（２８、２９にて概説された）。これらの病変のおよそ６０％は、大きな血栓形成性の脂質コアと壊死性の残渣（マクロファージ、Ｔ細胞、古い出血、血管形成及びカルシウムの病巣を含む）を伴ったプラークの破裂が原因で生じる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「循環器疾患」（ＣＶＤ）は、心臓（心）及び／又は全身性の血管（血管系）を冒し得る疾患を指す。循環器疾患のほとんどは、慢性の症状−長い間にわたって進展している又は持続している症状を反映する。しかしながら、循環器疾患の転帰の一部は、たとえば、心臓又は脳に血液を供給する血管が遮断されるときに突然起きる心臓発作や卒中のような急性の事象であり得る。ＣＶＤはまた、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈心疾患（ＣＨＤ）及び冠状動脈疾患（ＣＡＤ）に関連する疾患−狭心症（不安定狭心症及び初発狭心症を含む）を招き得る心臓に供給する血管の疾患−強い胸部の痛み又は均一な心臓発作−心筋梗塞、及びＳＴ−又は非ＳＴ−上昇を包含する。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「自己免疫疾患」は、生体に正常に存在する物質や組織に対する生体の過剰な免疫応答の結果生じる病態を記載する。免疫系は生体の一部を病原体と誤解し、それを攻撃する。これは、特定の臓器に限定されてもよく、又は肺と腎臓の双方にて基底膜を冒し得る、異なった部位における特定の組織を含んでもよい。たとえば、関節リウマチ、多発性硬化症及び大腸炎のような例となる疾患の少なくともすべてを含む自己免疫疾患の例、並びに顕著な例には、とりわけ、セリアック病、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シューグレン症候群、チャーグ・ストラウス症候群、橋本病、グラーベ病、乾癬、炎症性大腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、強皮症及び天疱瘡が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、用語「エオタキシン−２拮抗物質」は、エオタキシン−２／ＣＣＬ２４と相互作用し、正常な活性又はサイトカインの発現を阻止する又は抑える分子を指す。本発明のこの態様に従って多数の剤を使用することができる。従って、たとえば、拮抗物質は、エオタキシン−２の活性を阻害する抗体、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡｚｙｅ、リボザイム、又はアンチセンスポリヌクレオチドであることができる。
【００５９】
本発明の文脈で、用語「抗エオタキシン−２抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含する。さらに、抗体は、たとえば、マウスの抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト型抗体であってもよい。用語は、抗体全分子、並びに、たとえば、単鎖（ＳＣ）抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ抗体断片のような、エオタキシン−２に結合することが可能であるその機能的断片、並びにそれらの組み合わせを指す。
【００６０】
血清免疫グロブリン（「ポリクローナル抗体」）又はその反応性部分の精製方法は、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムによる沈殿、その後の透析、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ及びゲル濾過を含めて当該技術で周知である。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ又はｍｏＡｂとも呼ばれる）は、単クローンの細胞から産生される同一の単一特異性の抗体を指す。モノクローナル抗体を生成し、単離する方法は、たとえば、以下の実施例の区分で示されるように、当該技術で周知である。本発明はまた、キメラ抗体又はヒト化抗体も包含する。本明細書で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」は、ヒトの主鎖を有し、非ヒト由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を持つ抗体又はその断片を指す。非ヒトＣＤＲは、たとえば、所望の特異性、親和性及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ又はヤギの抗体から得ることができる。特定の実施形態では、ヒト抗体の枠組みにて追加のアミノ酸が非ヒトの相方によって置き換えられて抗体の結合特性を改善する。本明細書で使用されるとき、「キメラ抗体」は、異なった種を起源とするポリペプチドを含有する抗体又はその断片であり、たとえば、マウス−ヒト抗体キメラは、抗体のマウスＦｃ領域をヒトのそれで置き換えることによって得られる。
【００６２】
ヒト化抗体を作製する方法は当該技術で周知である。ヒト化抗体は、ヒト抗体の「枠組み」に適当なＣＤＲをコードする断片（所望の結合特性に関与する）を挿入することによって調製することができる。適当なベクターと宿主細胞（たとえば、哺乳類細胞）における発現を用いた組換えＤＮＡ法を介してこれを達成する。すなわち、所望の特性を有するモノクローナル抗体をマウス（又はほかの非ヒト動物）で作出した後、その抗体をコードするＤＮＡを単離し、ベクターにクローニングして配列を決定する。次いで抗体のＣＤＲに相当するＤＮＡ配列を決定する。いったん、所望のＣＤＲの正確な配列が判明すれば、ヒト型抗体の変異体のためのＤＮＡを含有する構築物にこれらの配列を適宜挿入するために戦略を考案することができる。
【００６３】
本発明はさらに、エオタキシン−２への結合活性を保持する、抗エオタキシン−２抗体の断片を包含する。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆａｂ」は、抗体分子の単一の一価の抗原結合断片を含有する断片を指す。Ｆａｂは、一方の未処理の軽鎖と一部の重鎖を含み、抗体全体のパパインによる消化によって生成することができる。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「（Ｆａｂ）２」は、抗体全体のペプシンによる消化によって得られる抗体断片を指す。ペプシン消化によってＦｃ部分にて抗体の切断を生じ、その結果、２つのＦａｂ断片を含有する二価の断片と小さな部分のＦｃ断片を生じ、それらはＳ−Ｓ結合で接合される。「Ｆａｂ」は、Ｓ−Ｓ結合の開裂を生じる（Ｆａｂ）２の還元によって得られる。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｖ」は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片を指す。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「単鎖抗体」は、好適なリンカー（たとえば、ポリペプチド）によって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子を指す。単鎖抗体は通常、軽鎖と重鎖の可変領域とリンカーを含む融合ポリペプチドをコードする単一のポリヌクレオチドを発現させることによって調製される。単鎖抗体を調製する方法は、当該技術で周知であり、たとえば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと。
【００６８】
本発明に係る抗体断片は、好適なプロテアーゼ、たとえば、パパイン若しくはペプシンを用いた抗体のタンパク分解加水分解によって、又は細菌（たとえば、大腸菌）若しくは哺乳類細胞（たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞）のような宿主細胞における抗体断片をコードする核酸の組換え発現によって調製することができる。
【００６９】
本発明の抗体は、発現ベクターを用いて好適な宿主細胞にて抗体をコードする核酸を発現させることによって組換え的に製造されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、抗エオタキシン−２抗体の鎖をコードする遺伝情報を細胞に移すことが可能である核酸構築物を指す。挿入物は標的細胞で発現され、抗体が産生され、細胞の培地に分泌されるか、又は細胞から直接抽出される。ベクターは、たとえば、プラスミド、バクテリオファージ、及びそのほかのウイルス、コスミド、及び人工染色体に限定されない種々の起源のものであり得る。通常、操作されたベクターは、複製開始点、クローニング部位、選抜可能なマーカー及び本発明の抗体をコードする非相同の核酸を含む。ウイルスベクターは一般に、非感染性にしてあるが、ウイルスのプロモータと非相同の核酸を依然として含有するので、ウイルスのプロモータを用いて非相同の核酸を翻訳することができる、修飾されたウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡを運ぶ遺伝子操作されたウイルスである。ウイルスベクターの非限定例は、組換えレトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ＳＶ４０、単純性ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスである。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明はまた、免疫抱合体と、本発明の抗体を含む二重特異性分子も包含する。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「アンチセンス療法」は、特定の疾患に影響を及ぼすことが知られる遺伝子の発現の阻害を含む治療の形態を指す。本発明の文脈では、アンチセンス療法は、エオタキシン−２のｍＲＮＡの発現を阻害することを目的とする。従って、療法には、エオタキシン−２のｍＲＮＡ又はその断片の配列に相補的であり（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その遺伝子によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し、それを不活化し、その遺伝子のスイッチを効果的に「切る」核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は化学的類似体）の鎖の合成が関与する。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、用語「ｓｉＲＮＡ」（小型干渉ＲＮＡ）は、短鎖干渉ＲＮＡ又はスプライシングＲＮＡとしても知られ、生物学において様々な役割を担う通常、長さ２０〜２５ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子の部類である。最も顕著には、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の経路に関与し、特定の遺伝子の発現に干渉する。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、用語「小分子化合物」は、有機化合物を指す。小分子の分子量の上限はおよそ８００ダルトンである。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、用語「メソトレキセート」は、癌及び自己免疫疾患の治療に使用される代謝拮抗剤及び抗葉酸剤を指す。
【００７５】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下に、筋肉内に及び静脈内に投与するのに有用である。非経口投与用の組成物は一般に、許容可能なキャリア又は賦形剤、好ましくは水性キャリアに溶解された抗体を含む。種々の水性キャリア、たとえば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に粒子状物質を含まない。組成物は必要に応じて生理的条件に近づける薬学上許容可能な補助物質、たとえば、ｐＨ調整剤及び緩衝化剤、毒性調整剤など、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、ヒスチジン及びアルギニンを含有してもよい。
【００７６】
非経口投与用の組成物を調製する方法は、当業者に既知であり、又は明らかであり、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980）にさらに詳細に記載されている。
【００７７】
本発明の抗体は、保存用に凍結する又は凍結乾燥することができ、使用前に好適なキャリアで再構成することができる。この技法は従来の免疫グロブリンで有効であることが示され、技術で知られる凍結乾燥法及び再構成法を使用することができる。
【００７８】
治療目的で、症状及びその合併症を治療する又は少なくとも部分的に緩和するのに十分な量で組成物を投与する。これを達成するのに適切な量を「治療上有効な量」と定義する。この使用に効果的な量は、症状の重症度及び患者自身の免疫系の一般状態に左右されるが、一般に、１回当たり約０．０１〜約１５０ｍｇの抗体の範囲である。１日、１週間又は１ヵ月における単回又は複数回の投与の計画は、用量レベルで実施することができ、パターンは主治医によって選択される。
実施例
【００７９】
モノクローナル抗体の製造
標準のプロトコールに従って、幾つかのクローンのｍＡｂを製造した。手短には、２０μｇのエオタキシン−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ、米国）でＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫し、その後４回追加免疫した。血清中に抗エオタキシン−２ポリクローナルＡｂの存在を確認した後、マウスを屠殺し、脾臓から細胞を単離し、ＮＳ／０骨髄腫細胞とハイブリッドを形成させ、その後、エオタキシン−２への結合についてクローンをスクリーニングした。次いで、無血清培地にて２〜３週間、ハイブリドーマを増殖させ、培地を回収し、１００ｋＤａのセントリコン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）によって濃縮した。ｍＡｂの１つ（Ｄ８）のマウスのエオタキシン−２との交差反応性をＥＬＩＳＡによって確認した。
【００８０】
モノクローナル抗体Ｄ８、Ｇ８及びＧ７の核酸配列を決定するのに以下のプライマーを用いた：
重鎖（ＩｇＧγ−１）
正方向（配列番号７）
５’−ＣＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＡＧＣＴＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＧＴＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＣ−３’
逆方向（配列番号８）
５’−ＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣ−３’
軽鎖（κ）
正方向（配列番号９）
（変性）５’−ＲＲＨＲＹＹＢＷＤＭＴＶＡＣＨＡＲＷＣ−３’
又は（配列番号１０）
５’ＧＡＴＧＴＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＧＣＣＴＣＡＣ−３’
逆方向（配列番号１１）
５’−ＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣ−３’
【００８１】
結合アッセイ
１μｇ／ｍＬのエオタキシン又はエオタキシン−２（炭酸緩衝液中）のいずれかでプレートを４℃にて一晩被覆した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２％ＢＳＡによって３７℃にて４５分間ブロックした。ＰＢＳによって連続希釈した抗エオタキシン−２抗体（Ｄ８クローン）を３７℃にて１．５時間入れた。上記のように洗浄を繰り返し、ペルオキシダーゼ結合のヤギ抗マウス抗体と共にプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。上記のように洗浄を繰り返し、発色基質を用いて結合を検出した。
【００８２】
脾細胞接着アッセイ
接着アッセイでは、Ｃ５７ＢｌマウスとＬｅｗｉｓラットの脾細胞をファイコール勾配で分離し、一晩のインキュベート用に１０ｃｍのシャーレに入れた。翌日細胞を回収し、上昇濃度のＤ８又はマウスの総ＩｇＧ（５〜５０μｇ／ｍＬ）によって回転しながら２時間予備処理した。次いで、細胞を遠心し、フィブロネクチンで予備被覆した９６穴プレートに入れた。１時間のインキュベートの後、非付着細胞を洗い流し、付着細胞の量をＸＴＴキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を用いて分析した。健常な供与者から回収した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて同様の接着アッセイを行った。
【００８３】
遊走アッセイ
Ｄ８（３０μｇ／ｍＬ）で予備処理したラット脾細胞及びヒトＰＢＭＣと同様にＣ５７ＢＬ／６Ｊ由来の脾細胞をＴｒａｎｓ−Ｗｅｌｌ系の上部チャンバーに入れた。下部チャンバーは、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）（２０ｎｇ／ｍＬ）を補完した無血清培地を含有した。４時間後、下部チャンバーの培地を回収し、フローサイトメトリーを用いて細胞を計数した（１分当たりに回収される細胞数）。
【００８４】
プラーク及び心血管系の試験管内試験：
Ｉ．ヒトの頚動脈プラークの調製とタンパク質アレイ
ヒトのアテローム硬化性プラークを２群の患者から回収した。無症候性の重度アテローム性頚動脈硬化症の患者の動脈内膜切除検体から安定プラーク（ｎ＝４）を得た。不安定プラークの代表的なものは、急性心筋梗塞の患者の責任血管の経皮冠動脈形成の際得られた検体だった（ｎ＝４）。専用の吸引装置によって血栓切除を行った。得られた材料は、赤色血栓、白色血栓、及び責任動脈の不安定プラークの断片から成る。洗浄と溶解の後、残りの組織は、大部分、破裂したアテローム硬化性プラークの断片を含む。
安定及び不安定のヒトのプラークにて４０のサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子を検出するのにＲａｙＢｉｏ（商標）ヒト炎症抗体アレイ３．１（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）を用いた。手短には、ペレット乳棒を用いてキット内で提供された溶解緩衝液にてプラークをホモジナイズした。各試料の５００ｍｇのタンパク質と共にアレイをインキュベートし、製造元の指示書に従って進展させた。ＴＩＮＡ２．０プログラムを用いて結果を解析した。
【００８５】
ＩＩ．毛細管細胞
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１％のペニシリン／硫酸ストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を補完したＤＭＥＭＦ−１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）にてマウスの毛細管細胞（Ｈ５Ｖ）を培養した。８％ＣＯ２と共に多湿インキュベータにて３７℃で細胞を維持した。１％のＦＣＳと１％のペニシリン／硫酸ストレプトマイシンを含有する完全培地ＲＰＭＩ１６４０にて１０６個の細胞／ｍＬの濃度で単球様のＵ９３７細胞を培養した。５％ＣＯ２の多湿インキュベータにて３７℃で細胞を維持した。
【００８６】
ＩＩＩ．内皮細胞による接着アッセイ
接着アッセイにて、ｏｘＬＤＬ、１μｇ／ｍＬ（以前記載されたように調製した、３３）の存在下でＨ５Ｖマウス内皮細胞を７２時間インキュベートした。次いで、ｏｘＬＤＬ、１μｇ／ｍＬの存在下、４×１０３個／ウェルの濃度で９６穴プレートに細胞を一晩入れた。翌日、中和ヤギ抗マウスエオタキシン−２抗体（Ｃｙｔｏｌａｂ、米国）又はヤギＩｇＧで細胞を１時間予備処理した後、Ｕ９３７細胞又はＡｐｏＥマウスの脾臓由来の細胞を８×１０４個／ウェルの濃度で加えた。１時間のインキュベートの後、非付着細胞を洗い流し、付着細胞の量をＸＴＴキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を用いて分析した。
【００８７】
ＩＶ．大動脈とＨ５Ｖ内皮細胞のＰＣＲ解析
製造元のプロトコールに従ってＥＺ−ＲＮＡキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を用いてチオシアン酸グアニジニウムとフェノールクロロホルムの方法によって組織試料及びＨ５Ｖ内皮細胞からＲＮＡを単離した。従来の熱サイクラーにてＡＭＶ逆転写酵素（ＴａＫａＲａのＲＮＡＰＣＲキット、日本のタカラ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。ホットスタートＴａＫａＲａＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて特定の遺伝子の増幅を実施した。エオタキシン−２とＴＧＦβのマウスｍＲＮＡについて、イントロン配列を補う特定のプライマーを設計した（表１）。Ｇ３ＰＤＨとＴＧＦβについて以下のＰＣＲ条件：９５℃で２分間、次いで９５℃で２秒間と５５℃で４５秒間と７２℃で１分間を２７サイクル（Ｇ３ＰＤＨ）又は３５サイクル（ＴＧＦβ）での試料のインキュベートを用いた。出発温度７０℃と、３０サイクルの増幅と、６０℃でのアニーリング温度によって、エオタキシン−２ｍＲＮＡの発現の解析にタッチダウンＰＣＲ増幅プロトコールを用いた。ＰＣＲ試料を２％アガロースゲル上で泳動させ、Ｇｅｌｓｔａｒ核酸染色（Ｇａｍｂｒｅｘ、ＵＳＡ）で染色し、３００ｎｍのＵＶトランスイルミネータによってＰＣＲ産物を可視化し、ポラロイドカメラ方式によって撮影した。逆転写に先立って精製したＲＮＡ試料にてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）のＰＣＲ反応を行うことによって単離されたＲＮＡのゲノムの混入の非存在を確認した。ヌクレアーゼを含まない水の陰性対照は、試料の試行すべてに含めた。各ＲＮＡ試料は数回解析した。
【００８８】
Ｖ．大動脈洞の免疫組織化学的な解析
間接免疫ペルオキシダーゼ染色によって大動脈洞のクリオスタット切片（厚さ５μｍ）を評価した。その後、スライドをメイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、グリセロール（Ｄａｋｏ）で標本にした。親和性精製したヤギ抗マウスエオタキシン−２（Ｃｙｔｏｌａｂ、イスラエル）を用いて免疫組織化学的な染色を行った。
【００８９】
統計的解析
一方向ＡＮＯＶＡ検定によって群間の比較を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。結果は平均値と標準誤差として表す。
【００９０】
実施例１：抗エオタキシン−２ｍＡｂ（Ｄ８）の特異性と抗炎症効果
上述のように抗エオタキシン−２マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の幾つかのクローンを調製した。
Ｄ８抗体の重鎖をコードする核酸配列は配列番号１として示される：
ＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＮＣＣＧＧＧＧＣＮＧＮＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＮＧＧＧＧＧＮＮＧＮＣＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡ
ＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＧＴＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＴＡＧＧＡ ＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＧ
ＴＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣ
ＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＣＣＧＴ
ＣＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴＴ
ＴＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＣ ＣＴＧＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＴＣ
ＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴ
ＴＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＮＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＮＧＣＴＡ
【００９１】
Ｄ８抗体の軽鎖（κ）をコードする核酸配列は配列番号２として示される：
ＧＧＧＣＣＡＡＴＧＧＮＮＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＮＮＧＴＧＣ
ＣＴＴＮＧＴＣＧＮＮＮＮＣＴＮＮＴＴＧＮＮＣＡＮＣＮＴＣＮＡＣＮＮＣＮＮＮＮＡＮＮＮＮＡＮＮＧＮＮＮＮＮＴＧＮＡＡＮＡ
ＮＮＧＡＴＧＧＮＮＮＴＮＮＮＣＮＡＣＡＮＮ
ＮＴＧＧＮＮＴＣＣＴＮＮＮＮＮＮＮＴＮＮＮＮＴＧＮＮＮＮＮＧＡＣＮＮＣＡＮＡＮＡＣＡＮＮＮＮＣＮＡＣＮＮＮＡＴＧＡＮＣ
ＮＮＣＮＮＮＣＮＮＮＮＮＴＴＧＡＮＮＮＮＮ
ＧＮＣＮＡＮＴＡＴＧＡＡＣＮＡＮＮＮＡＡＮＮＮＮＮＮＴＡＣＣＴＧＮＮＡＮＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡ
【００９２】
Ｇ８抗体の重鎖をコードする核酸配列は配列番号３として示される：
ＧＧＧＣＡＧＣＡＧＮＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＮＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＮＧＧＧＧＧＮＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧ
ＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＧＴＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＴＡＧＧ
ＡＡＴＧＡＣＴ
ＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴ
ＧＴＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴＴ ＣＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＣＣＧ
ＴＣＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴ
ＴＴＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧ
ＣＣＴＧＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＴ
ＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣ ＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＴＡＮＮ
【００９３】
Ｇ８抗体の軽鎖（κ）をコードする核酸配列は配列番号４として示される：
ＧＧＧＣＣＡＡＴＧＧＮＮＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＮＮＧＴＧＣＣＴ
ＴＮＧＴＣＧＮＧＴＧＣＴＴＮＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＮＮＡＮＡＣＮＴＮＡＮＮＧＴＮＮＮＮＴＧＧＡＡＮＡＴＴＧ ＡＴＧＧＣＮＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＴ
ＧＧＣＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＮＴＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣＡＮＧＡＣＡＧＣＡＡＡＮＡＣＡＮＣＮＣＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧ
ＣＡＣＣＣＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＮＮＮＮＧ
ＡＣＮＡＮＴＮＴＧＡＡＣＧＡＣＧＴＡＮＮＮＮＣＮＮＴＡＣＣＴＧＴＮＡＮＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡ
【００９４】
Ｇ７抗体の重鎖をコードする核酸配列は配列番号５として示される：
ＧＧＧＣＡＧＣＡＧＮＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＮＮＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＮＧＧＧＧＧＮＧＮＣＧＴＴＴＴＧＧＣＴ
ＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＧＴＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＴＡＧ
ＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡ
ＴＧＴＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴ
ＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＣＣ
ＧＴＣＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡ
ＣＴＴＴＡＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＡ
ＧＣＣＴＧＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧ
ＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧ
ＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＴＡＮＮ
【００９５】
Ｇ７抗体の軽鎖（κ）をコードする核酸配列は配列番号６として示される：
ＧＧＧＣＣＴＴＴＧＧＮＮＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＮＮＧＴＧＣＣＴ
ＴＮＧＴＣＧＮＧＴＧＣＴＴＮＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＮＮＡＮＡＣＮＴＮＡＮＮＧＴＮＮＮＮＴＧＧＡＡＮＡＴＴＧ
ＡＴＧＧＣＮＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＴ
ＧＧＣＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＮＴＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣＡＮＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＡＣＡＮＣＮＣＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧ
ＣＡＣＣＣＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＮＮＮＮＧ
ＡＣＮＡＮＴＮＴＧＡＡＣＧＡＣＧＴＡＮＮＮＮＣＮＮＴＡＣＣＴＧＴＮＡＮＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡ
【００９６】
上記核酸配列における文字Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ又はＧのいずれかの存在を表す。
【００９７】
Ｄ８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、受入番号Ｄ８０９０８１７０２のもとで２００９年８月１７日、英国ウィルトシャー州、ソールズベリーのヨーロッパコレクションオブセルカルチャー（ＥＣＡＣＣ）に寄託された。
【００９８】
Ｇ８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、受入番号Ｇ８０９０８１７０１のもとで２００９年８月１７日、ＥＣＡＣＣに寄託された。
【００９９】
新規の抗エオタキシン−２抗体（Ｄ８）の特異性は、結合アッセイにて評価された。エオタキシン又はエオタキシン−２を被覆したプレートに、クローンＤ８にて産生されたｍＡｂの連続希釈を一晩のインキュベートのために加えた。洗浄の後、ペルオキシダーゼ結合のヤギ抗マウス抗体と共にプレートをインキュベートし、再び洗浄し、発色基質を用いて結合を検出した。
【０１００】
図１に示されるように、クローンＤ８のｍＡｂは調べた希釈の全範囲にて、エオタキシン−２への有意な結合を示したが、エオタキシンへの結合は示さなかった。
【０１０１】
ヒトのＰＢＭＣと同様にマウス若しくはラットの脾細胞のフィブロネクチンへの接着を阻害する能力、又はＶＥＧＦへの遊走を減衰する能力についても抗体を調べた。Ｄ８（５０μｇ）は、ヒトのＰＢＭＣと同様にマウス若しくはラットの脾細胞のフィブロネクチン（ＦＮ）への接着を３５〜５５％（図２Ａ）阻害することが見い出された。ＶＥＧＦへの遊走も用量依存性に減衰した（図２Ｂ）ということは、抗体の抗炎症性効果の可能性を裏付けている。
【０１０２】
実施例２：クローンＤ８ｍＡｂの抗炎症性の能力（生体内データ）
Ａ．関節リウマチのモデル
フロインド不完全アジュバントの注射によってＬｅｗｉｓラット（イスラエル、Ｈａｒｌａｎから得た６週齢オスＬｅｗｉｓラット）でアジュバント関節炎を誘発した。フロインド不完全アジュバントは、熱で殺したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを１０ｍｇ／ｍＬにて鉱物油に懸濁することによって調製した。尾の付け根の皮下で１０μＬのアジュバントをラットに注射した。
アジュバント誘発の関節炎に対する、対照としての非特異的ＩｇＧ及びＰＢＳと比べた抗エオタキシン−２抗体の効果の評価
【０１０３】
エオタキシン−２に対するモノクローナル抗体（Ｇ７、Ｇ８、Ｄ８）による週３回の腹腔内（ＩＰ）注射によってラット（群当たり８匹）を処理した。対照は、マウスの総（非特異的）ＩｇＧ又はＰＢＳで処理した。注射はアジュバント投与後３日目に開始し、ラットを屠殺するまで週３回行った。
用量反応実験
【０１０４】
実験の第２の設定では、アジュバント誘発の関節炎モデルで最良の予防成績を示す抗エオタキシン−２抗体Ｄ８を用量反応モデルで調べた。上述のプロトコールに従ってアジュバント関節炎を誘発した。アジュバント注射の３日後に開始し、週３回、２０μｇ、１００μｇ又は１０００μｇの用量でのＤ８によって腹腔内でラット（群当たり６匹）を処理した。動物の別の設定（各群６匹）は、関節炎が発症した後、すなわち、関節炎がすでに明らかであるとき、同一用量で処理した（Ｄ８処理群）。
【０１０５】
既知の有効性の従来の抗炎症剤の有効性とＤ８の抗炎症性の有効性を比較するために、アジュバント注射の３日後に開始する０．２５ｍｇ／ｋｇ、週１回のメソトレキセート（ｉｐ）で一群を処理した（メソトレキセート予防群）。追加の群は、３日目に開始する週３回の１００μｇのＤ８（ｉｐ注射）と併用して週１回の０．２５ｍｇ／ｋｇのメソトレキセートで処理した（併用Ｄ８−メソトレキセート予防群）。対照群は実験全体を通してＰＢＳで処理した。
関節炎の重症度の評価
【０１０６】
体重、足の腫脹、関節炎スコア及び動物の全体的な動きを測定することによって関節炎の重症度を評価した。病理評価のために試料関節を得たが、足首関節の死後Ｘ線検査を実施して侵食を記録した。
【０１０７】
全身性の炎症の指標として２日に１回、グラムでの体重を測定した。
【０１０８】
（足腫脹の評価）キャリパを用いて、足首及び手首の径をｍｍ（小数点第１位まで）で週３回記録した。
【０１０９】
（関節炎スコアの測定）以下：０＝正常、１＝足首又は手首の軽い紅斑及び／又は腫脹、２＝足首又は手首の中程度の紅斑及び／又は腫脹、３＝足首又は手首の重度の紅斑及び／又は腫脹、４＝足指又は手指及び足首又は手首の完全な紅斑及び／又は腫脹及び足首又は手首を曲げることが不可能、のような腫脹、紅斑及び変形の程度（４つの手足すべてについて動物当たり、最大スコアは１６）について０〜４の尺度で手足をスコア化した。
【０１１０】
その部分的な寄与に従って手指及び足指の腫脹を記録した。足首（足）：各足指を０．２とスコア化した；手首：各手指を０．２５とスコア化した。関節の合計を算出した。
【０１１１】
（運動性スコア）以下の定義：０＝正常、１＝やや損傷、２＝主な損傷、３＝足を踏みつけない、４＝動かない；に従って０〜４の間で動物の全体的な運動性をスコア化した。
【０１１２】
（統計的解析）統計的解析には、ＱｕｉｃｋＣａｌｃｓソフトウエア（カリフォルニア州、サンディエゴのＧｒａｐｈ−Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた。スチューデントのｔ検定を実施して実験群間の有意差を特定した。
結果
Ａ．関節炎モデル
【０１１３】
免疫グロブリン（ＩｇＧ）又はＰＢＳで処理したものに比べて、抗エオタキシン−２抗体で処理したラットでは関節炎の有意な抑制が認められた。図３Ａ〜３Ｃで明らかにされるように、抗体による抑制は調べたパラメータすべて（関節炎スコア、運動性スコア及び足首径）で明らかだった。Ｄ８と記された抗体は最も有意な効果を示した。関節炎スコア試験（図３Ａ）では、ＰＢＳで処理したラット又はＩｇＧで処理したラットとＤ８で処理したラットを比べると、１３日目〜２１日目まですべての測定で統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が得られた。予防効果は、注射後１７日目で関節炎が出現すると即座に明らかになった。２１日目の実験終了まで、その程度は増大し続けた。
【０１１４】
運動性スコア試験では、１７日目から、ＰＢＳで処理したラットとＤ８で処理したラットを比べたとき、及び１８日目から、ＰＢＳで処理したラット又はＩｇＧで処理したラットとＤ８で処理したラットを比べたとき、あらゆる測定で統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が得られた。従って、２１日目では、ＰＢＳで処理した動物の２．４３に比べて、Ｄ８で処理した動物の運動性スコアの平均は１．３７だった（ｐ＝０．００５）。
【０１１５】
足首径試験では、１９日目時点でのＤ８とＰＢＳの間で統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が得られた。Ｄ８とＩｇＧの間の差異は統計的な有意性に達しなかった。
【０１１６】
上記で示されたように、Ｄ８で処理したラットは、ＰＢＳで処理したラットよりも低い、２．６〜３．０の範囲の関節炎スコアを有した（図４Ａ）。組織学的スコアについては、定義：０＝正常、１＝炎症性浸潤及び滑膜過形成、２＝パンヌス形成及び軟骨侵食、３＝重大な軟骨侵食と骨破壊、４＝関節の整合性の喪失の程度について０〜４のスコアで各手足をスコア化した。関節炎ラットの関節の組織学的分析は、Ｄ８で処理したラットの関節が滑膜の過形成と散発的な炎症性浸潤を有するが、ＰＢＳで処理したラット（対照群）のほとんどはパンヌス形成と強度の炎症性浸潤を伴う重度の滑膜炎を有する（図４Ｃ）ことを示した。
【０１１７】
全身性の炎症反応に対する抗エオタキシン−２抗体による処理の効果を評価するために、動物の平均体重を記録した。図５に示されるように、抗エオタキシン−２抗体処理は、アジュバント関節炎によって誘発される全身性の炎症反応が原因で起きる体重減少を有意に改善した。再び、最大の予防効果は、Ｄ８抗体で処理した動物で認められ、それは実験全体を通して体重を増やし続けた。Ｄ８とＰＢＳの間における体重の統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）は１７日目に得られた。
用量反応実験
【０１１８】
関節炎のＤ８による予防
一連の用量反応実験では、低用量（２０μｇ）群及び高用量（１０００μｇ）群に比べて、１００μｇでのＤ８が有意に優れた予防効果を有した（図６Ａ）。運動性スコア、足首径及び動物の体重についても同様の結果が得られた（データは示さず）。１００μｇのＤ８で処理したラットをＰＢＳで処理したラットと比較した場合、１７日目〜２４日目であらゆる測定にて統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が得られた。
【０１１９】
関節炎のＤ８による処理
関節炎の出現時に腹腔内で開始したＤ８抗体による処理も、ＰＢＳで処理した動物に比べて関節炎スコアの重症度で有意な軽減を生じた（図６Ｂ）。運動性スコア、体重及び足首径についても同様の結果が得られた。図６Ｂで示されるように、この実験設定では、１００μｇ〜１０００μｇの用量群で同様の結果が得られた。
関節炎のＤ８／メソトレキセート併用での予防
【０１２０】
メソトレキセートと１００μｇのＤ８が双方共、関節炎スコア（ＰＢＳ処理対照と比べた）によって測定したとき、関節炎の進展に対して有意な、匹敵する予防を生じた一方で、メソトレキセートとＤ８の併用は、図７に示すように向上した（相乗の）予防効果を生じた。
【０１２１】
１００μｇのＤ８とＭＴＸ双方の処理はＰＢＳに比べて１３日目時点で統計的に有意な効果（ｐ＜０．０５）を引き起こした。実験の終了まで、２４日目まで、ＭＴＸ単独で処理したラットとＭＴＸ＋１００μｇのＤ８で処理したラットの間で関節炎スコアの統計的に有意な差が認められた。有意差は、これらの群間で、２４日目の平均足首幅でも認められた（示さず）。
【０１２２】
Ｘ線検査の結果
死後Ｘ線検査は、Ｄ８で処理したラットの最少限の腫脹に比べて、ＰＢＳで処理したラットでは関節周囲軟組織の強度の腫脹を示した（図８）。加えて、対照ラットは、脱灰の兆候と早期の侵食を示したが、それは、Ｄ８で処理した動物では見られなかった。このことは、Ｄ８で処理した動物における炎症の有意な低下を示している。
【０１２３】
前肢のＸ線検査においても同様の結果が見られた（示さず）。
Ｂ．大腸炎モデル
【０１２４】
慢性の大腸炎を誘発するために、１０週齢のＣ５７ＢＬマウスに、飲料水中のデキストラン硫酸（ＤＳＳ）への５日間の暴露に続いて通常の水道水で１０日間の間隔を置くことを３サイクル経験させた。第１のサイクルの終了時に、マウスを無作為に６つの処理群：ビヒクル対照（ＰＢＳ）、マウスの総ＩｇＧ、並びに５μＭ、２５μＭ、１００μＭ及び２００μＭの上昇用量で与えたＤ８に分けた。処理は週３回の計画にて腹腔内（ｉｐ）注射で行った。週２回体重を測定した。最終サイクルの終了時までにマウスを屠殺し、誘導した炎症の程度を評価するために、結腸の近位部分は免疫組織化学解析に、遠位部分はミエロペルオキシダーゼ活性のアッセイ（標準のプロトコールに従って）に利用した。動物の血清における炎症性サイトカインのレベルはフローサイトメトリーによって検出した。
【０１２５】
ＩｇＧ又はＤ８による処理は、ビヒクル処理の動物に比べて体重低下を有意に減衰する。試験全体を通して、最高の体重は５μｇのＤ８処理群で認められた（図９Ａ）。３４日目のＭＰＯ活性は、ｍＩｇＧを含むその他すべての群に比べて５μｇのＤ８処理群で有意に低下した（図９Ｂ）。加えて、Ｄ８で処理した動物の血清における炎症性サイトカインのレベルは対照動物で検出されたものよりも低かった（図９Ｃ）。近位結腸の免疫組織化学解析は、炎症の範囲及び程度と同様に結腸組織への損傷のレベルでも抑制を裏付けた（図９Ｄ）。熟練病理医によって炎症性浸潤の範囲が評価された。
Ｃ．ＥＡＥ
【０１２６】
ＥＡＥは、ヒトの疾患である多発性硬化症の治療能を検討する典型的な動物モデルとして役立つ（３０）。
【０１２７】
１０週齢のＣ５７ＢＬマウスに、完全フロインドアジュバント中で懸濁した２００μｇのＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイトの糖タンパク質）ペプチドを皮下注射し、その後、１週間後に２回目の注射をした。疾患の誘発後１日目（すなわち、２回目の注射の１日後）、対照（ＰＢＳ）、マウス総ＩｇＧ、２５μｇのＤ８及び１００μｇのＤ８による処理（週３回、ｉｐ注射）を開始した。標準のＥＡＥスコア化方式（３１）に従って、週３回、疾患の重症度と進行を記録した。
【０１２８】
２５μｇ、さらに有意には１００μｇのＤ８による処理は、実験の全過程の間、ＥＡＥの兆候の進行を減衰した。高い方の用量（１００μｇ）でのＤ８は、約９０％（ほかの処理群すべて）の疾患の発生率をたった５５％（図１０）に下げたということは、ＥＡＥの治療にてＤ８の治療上の利点の可能性を説明している。
Ｄ．糖尿病
【０１２９】
非肥満型糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、自己免疫性糖尿病の動物モデルとして役立つ（３２）。
【０１３０】
６週齢のＮＯＤマウスをＤ８又はビヒクル対照（ＰＢＳ）で週３回処理した。４９〜１１２日目の間で、市販の尿テストを用いて糖尿病の発生を調べ、１１２日目の血清のエオタキシン−２のレベルをＥＬＩＳＡ（マウスＣＣＬ２４／エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、Ｄｕｏｓｅｔ、Ｒ＆Ｄ）を用いて測定した。
【０１３１】
糖尿病の発生率は、未処理の対照と比べてＤ８処理群では顕著に低下した（図１１Ａ）。臨床的な改善と一致して、対照と比べて抗エオタキシン−２で処理した動物の血清では、エオタキシン−２のレベルは大きく低下した（図１１Ｂ）。
Ｅ．アテローム硬化性プラーク形成の抑制
【０１３２】
種々の炎症性のサイトカイン及びケモカインの発現レベルをアテローム硬化性病変（プラーク）で測定した。急性心筋梗塞の患者の責任冠状動脈から回収した不安定プラークを動脈内膜切除試料から得た安定プラークと比較した。タンパク質アレイによるプラークの分析を図１２に示す。材料と方法の項で記載したとおりに処理を行った。
【０１３３】
様々に発現されたタンパク質の間で、有意な変化は、以下のタンパク質：ＶＣＡＭ−１、エオタキシン−２、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１及びＴＩＭＰ−２に見い出され、安定プラークに対比して不安定プラークではすべて２倍を超える発現の低下を示した（図１２Ａ）。
【０１３４】
アテローム性動脈硬化症の傾向にあるマウス（ａｐｏＥＫＯマウス）における免疫組織化学的な検討では、若齢マウスから老齢マウスまで脂肪線条と進行した病変が、材料と方法で記載したように抗エオタキシン−２抗体によって染色された。エオタキシン−２は、内皮細胞の中及びプラークのマクロファージの中に存在することが示された（図１３）。
【０１３５】
若齢（６週齢）のａｐｏＥＫＯマウスとアテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウスでｍＲＮＡの発現を測定した。マウスから大動脈を得て、材料と方法に記載したようにＲＴ−ＰＣＲに供した。エオタキシン−２とＴＧＦ−βのｍＲＮＡレベルを比較してアッセイした。エオタキシン−２のｍＲＮＡレベルは、老齢マウスに対比して若齢マウスで有意に高いことが見い出され、この発現パターンは動脈硬化防止剤であるＴＧＦ−βに関して認められたものと並行した。図１４Ａは、各群の代表的な試料を示す。
【０１３６】
酸化ＬＤＬはアテローム発生を促進するのに重要な役割を担うと考えられている。マウスのＨ５Ｖ内皮細胞を酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）（１μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ｏｘＬＤＬは、マウスＨ５Ｖ内皮細胞にてエオタキシン−２のｍＲＮＡレベルを有意に上方調節した（図１４Ｂ）。
【０１３７】
プラークの炎症の細胞性成分の接着においてエオタキシン−２が役割を有するかどうかを判定するために、培養内皮細胞にて接着アッセイを行った。若齢又は老齢のアテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウスの脾細胞を脾臓から単離した。マウスの内皮細胞をｏｘＬＤＬ（１μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、エオタキシン−２抗体又は対照のＩｇＧ抗体の存在下で脾細胞の内皮細胞への接着を調べた（図１５Ａ）。エオタキシン−２に対する阻止抗体との内皮細胞の予備インキュベートは、脾細胞のこれら細胞への接着を減衰することが見い出された（図１５Ａ）。この効果は、若齢非アテローム硬化性マウス（６週齢）から得たものに比べて、アテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウス（６週齢）のリンパ球でさらに強力だった。単球／マクロファージ細胞株（Ｕ９３７細胞）を培養内皮細胞（Ｈ５Ｖマウス内皮細胞株）に接着させた場合、これらの知見も明らかだった（図１５Ｂ）。
【０１３８】
本発明のモノクローナル抗体と同様に、市販の抗エオタキシン−２抗体を用いて、初期の及び進行したアテローム硬化性プラークに対するエオタキシン遮断の効果を測定した。予備試験では、５μｇの週２回用量の抗エオタキシン−２阻止抗体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）は、マウスの大動脈でエオタキシン−２ｍＲＮＡのレベルを有意に下げるのに十分だった。次に、抗エオタキシン−２抗体の短期投与の効果を調べた。若齢ａｐｏＥＫＯマウスを週２回のエオタキシン−２抗体（５μｇのｉｐ注射）又は対照ＩｇＧ又はＰＢＳで４週間処理し、脂肪線条に対する効果を測定した。オイルレッドＯで染色した後、プラークの大きさを解析するためにマウスを屠殺した。抗エオタキシン−２はマウスＩｇＧに比べて脂肪線条の形成をおよそ７２パーセント劇的に低下させた（図１６Ａ）。双方の群で総コレステロール及びトリグリセリドは類似していたので、この効果は脂質特性の変化とは関連しなかった（データは示さず）。さらに、対照のマウスＩｇＧによる処理は、ＰＢＳ注射に比べてプラークの進行に影響しなかった。
【０１３９】
次に、プラークの構造がさらに複雑である長期モデルにてエオタキシン−２の遮断の効果を調べた。本明細書では、エオタキシン−２抗体（５μｇ／用量）の週２回の注射の１０週後、老齢のａｐｏＥＫＯマウスの心臓で測定したプラークの大きさに関して有意差は明らかではなかった（図１６Ｂ）。しかしながら、線維性領域によって測定されるプラークの安定性をアッセイした場合、エオタキシン−２に対する抗体は、より小さな脂質コアを犠牲にしたより大きな線維性領域によって明らかな有意にさらに安定したプラークの表現型を誘導した（図１６Ｃ）。再び、これらの知見は、群間に差異のない脂質レベルにかかわりなかった。代表的な、オイルレッドＯ染色した及びＭａｓｓｏｎの三色染色した切片を図１７に提供する。
【０１４０】
アテローム性動脈硬化症は、脂肪の沈着が動脈壁で進行し、内腔の進行性の狭窄をもたらす過程である。成熟プラークは２つの基本構造：脂質のコアと線維性のキャップで構成される。脂質のコアが小さければ小さいほど、線維性のキャップは厚く、さらに安定なプラークとなるということは、破裂し、心筋梗塞又は不安定狭心症を起こす傾向が低下することを意味する。急性の冠状動脈症候群（たとえば、心筋梗塞及び不安定狭心症）の原因となるプラークのほとんどが、＜７０％の狭窄を有することが血管造影で示されることは今や明らかである（２８、２９にて概説された）。これらの病変のおよそ６０％は、大きな血栓形成性の脂質コアと壊死性の残渣（マクロファージ、Ｔ細胞、古い出血、血管形成及びカルシウムの病巣を含む）を伴ったプラークの破裂が原因で生じる。おそらく、マクロファージがプラークを移動するにつれてそれを消化するマトリクスメタロプロテイナーゼを分泌し、平滑筋（プラークの要素を支えている）が、たとえば、炎症性サイトカインのような幾つかの因子によって生じる老化又はアポトーシスのために激減するために、破裂したキャップは薄い。
【０１４１】
態様の１つでは、本発明は、エオタキシン−２がヒトの安定した及び不安定なアテローム硬化性プラークで差次的に発現するという知見に基づく。ａｐｏＥノックアウト（ＫＯ）［２０］マウスモデルにてエオタキシン−２の経路を遮断することによって、本発明者らは、脂肪線条形成（初期動脈硬化病変を示す）の抑制とプラーク安定化の延長の双方を実証することができた。
【０１４２】
本発明の発明者らは、当該技術での以前の報告を支持している、アテローム硬化性と非アテローム硬化性のマウス動脈の内皮にエオタキシン−２が発現されていることを見い出した。しかしながら、本発明者らはまた、エオタキシン−２がプラークのマクロファージで発現されていることも見い出した。エオタキシン−２は、アテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウスに比べて若齢ａｐｏＥＫＯマウスの大動脈でさらに豊富に発現された。エオタキシン−２が、内皮への単球／マクロファージの細胞／細胞接着を含む、アテローム性動脈硬化症の最初の段階に関与することを示唆すること。実際、以下に記載される試験管内の試験は、エオタキシン−２を遮断することはｏｘＬＤＬで誘導した内皮細胞へのリンパ球の接着を低下させ、生体内でのプラーク形成におけるエオタキシン−２の役割を支持することを示している。
【０１４３】
徹底した研究にもかかわらず、安定なプラークから不安定なプラークへの移行を支配する因子は不明瞭なままである。ヒトの安定プラークと不安定プラークの炎症性タンパク質アレイ解析に基づいて、本発明は、安定型と不安定型の間のプラークの移行に関与する可能性のある標的タンパク質、エオタキシン−２を提供する。ＶＣＡＭ−１、ＩＬ−１０及びＭＣＰ−１とのアテローム性動脈硬化症の関係に関する揺るぎないデータが存在し、それらは、安定プラークと不安定プラークで差次的に発現されることが本発明者らによっても見い出されているが、そのようなデータはエオタキシン−２については存在しない。
【０１４４】
加えて、エオタキシン−２は、アテローム硬化性及び非アテローム硬化性のマウス動脈の内皮で発現されていることが本発明者らによって見い出されたので、以前の報告を支持している。しかしながら、それはプラークのマクロファージでも発現されていることが本発明者らによって見い出された。興味深いことに、内皮への単球／マクロファージの細胞／細胞接着を含む、アテローム性動脈硬化症の最初の段階に相当するアテローム硬化性ａｐｏＥＫＯマウスに対比して、エオタキシン−２は、若齢ａｐｏＥＫＯマウスでさらに豊富に発現された。実際、試験管内の試験は、生体内では上手く生じてもよいｏｘＬＤＬが介在する接着におけるエオタキシン−２の遮断の役割を支持している。マウスのアテローム性動脈硬化症の早期段階におけるエオタキシン−２のさらに強力な発現はまた、短期の脂肪線条モデルにおけるこの経路を阻害する印象的な効果も説明する。理論に束縛されることを望まないで、内皮への炎症性細胞の接着を阻止することは、この効果に一義的に関与するのかも知れない。
【０１４５】
線維性領域によって明らかなようなプラークの安定化に対するエオタキシン−２遮断の効果に関して、炎症性細胞の動員がエオタキシン−２遮断のために減衰されるとすると、サイトカイン環境が安定な表現型に対してさらに好都合であることが十分に理解されてもよい。これらの知見は、プラークの蓄積が、エオタキシン−２の遮断によって変化しなかった脂質特性によって影響を受ける可能性がさらに高いので、アテローム性動脈硬化症の程度の低下に必ずしも反映されなくてもよい。
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【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのエオタキシン−２拮抗物質と薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤を含む、炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのエオタキシン−２拮抗物質が、抗エオタキシン−２抗体又は前記抗体の結合活性を保持するその断片である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体又は前記抗体の結合活性を保持するその断片である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗エオタキシン−２抗体が、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｃ）配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｄ）ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体の重鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体の軽鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；及び
（ｅ）該抗体の結合活性を保持する（ａ）〜（ｄ）の抗体の断片
から成る群から選択されるモノクローナル抗体である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
エオタキシン−２拮抗物質が、エオタキシン−２ｍＲＮＡに向けられたアンチセンス又はｓｉＲＮＡ分子である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患が、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、炎症性大腸疾患、多発性硬化症及び糖尿病から成る群から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
治療上有効な用量のエオタキシン−２拮抗物質又は請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項８】
治療上有効な用量のエオタキシン−２拮抗物質又は請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、アテローム硬化性プラーク形成を阻害する又はアテローム硬化性プラークを安定化させる方法。
【請求項９】
治療上有効な用量のエオタキシン−２拮抗物質又は請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、急性冠状動脈症候群の患者における主要な心血管系事象を防ぐ方法。
【請求項１０】
前記エオタキシン−２拮抗物質又は前記医薬組成物が、少なくとも１つの追加の治療剤と併用で投与される請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、化学療法剤、サイトカイン、ペプチド、抗体及び抗生剤から成る群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、シクロスポリン、ステロイド、ＮＳＡＩＤＳ（非ステロイド性抗炎症剤）、抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦ受容体抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＶＬＡ−４抗体、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、コパキソン及びインターフェロン−βから成る群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、メソトレキセートである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの追加の治療剤と前記エオタキシン−２拮抗物質又は前記医薬組成物が順次又は同時に投与される請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ハイブリドーマが、Ｄ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）である抗エオタキシン−２モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
【請求項１６】
モノクローナル抗体が、Ｄ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）から分泌される、エオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体、又はエオタキシン−２に結合することが可能であるその断片。
【請求項１７】
エオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体であって、
前記抗体が、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｃ）配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｄ）請求項１６の抗体の重鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と、請求項１６の抗体の軽鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；及び
（ｅ）該抗体の結合活性を保持する（ａ）〜（ｄ）の抗体の断片
から成る群から選択されるモノクローナル抗体であるエオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項１６又は１７のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患を治療するのに使用するための請求項１６又は１７のモノクローナル抗体。
【請求項２２】
炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患を治療することにおけるエオタキシン−２拮抗物質の使用。
【請求項２３】
炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患を治療するための医薬組成物を調製することにおけるエオタキシン−２拮抗物質の使用。
【請求項２４】
前記エオタキシン−２拮抗物質が抗体である請求項２１又は２２のいずれかに記載の使用。
【請求項１】
少なくとも１つのエオタキシン−２拮抗物質と薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤を含む、炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのエオタキシン−２拮抗物質が、抗エオタキシン−２抗体又は前記抗体の結合活性を保持するその断片である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体又は前記抗体の結合活性を保持するその断片である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗エオタキシン−２抗体が、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｃ）配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｄ）ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体の重鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と、ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、ハイブリドーマＧ７又はハイブリドーマＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０）によって分泌されるモノクローナル抗体の軽鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；及び
（ｅ）該抗体の結合活性を保持する（ａ）〜（ｄ）の抗体の断片
から成る群から選択されるモノクローナル抗体である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
エオタキシン−２拮抗物質が、エオタキシン−２ｍＲＮＡに向けられたアンチセンス又はｓｉＲＮＡ分子である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記炎症性疾患、自己免疫疾患又は循環器疾患が、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、炎症性大腸疾患、多発性硬化症及び糖尿病から成る群から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
治療上有効な用量のエオタキシン−２拮抗物質又は請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項８】
治療上有効な用量のエオタキシン−２拮抗物質又は請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、アテローム硬化性プラーク形成を阻害する又はアテローム硬化性プラークを安定化させる方法。
【請求項９】
治療上有効な用量のエオタキシン−２拮抗物質又は請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、急性冠状動脈症候群の患者における主要な心血管系事象を防ぐ方法。
【請求項１０】
前記エオタキシン−２拮抗物質又は前記医薬組成物が、少なくとも１つの追加の治療剤と併用で投与される請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、化学療法剤、サイトカイン、ペプチド、抗体及び抗生剤から成る群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、シクロスポリン、ステロイド、ＮＳＡＩＤＳ（非ステロイド性抗炎症剤）、抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦ受容体抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＶＬＡ−４抗体、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、コパキソン及びインターフェロン−βから成る群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、メソトレキセートである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの追加の治療剤と前記エオタキシン−２拮抗物質又は前記医薬組成物が順次又は同時に投与される請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ハイブリドーマが、Ｄ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）である抗エオタキシン−２モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
【請求項１６】
モノクローナル抗体が、Ｄ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ８０９０８１７０２）、Ｇ７又はＧ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｇ８０９０８１７０１）から分泌される、エオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体、又はエオタキシン−２に結合することが可能であるその断片。
【請求項１７】
エオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体であって、
前記抗体が、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｃ）配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；
（ｄ）請求項１６の抗体の重鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる重鎖と、請求項１６の抗体の軽鎖をコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸によってコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体；及び
（ｅ）該抗体の結合活性を保持する（ａ）〜（ｄ）の抗体の断片
から成る群から選択されるモノクローナル抗体であるエオタキシン−２に向けられたモノクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項１６又は１７のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患を治療するのに使用するための請求項１６又は１７のモノクローナル抗体。
【請求項２２】
炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患を治療することにおけるエオタキシン−２拮抗物質の使用。
【請求項２３】
炎症性疾患、自己免疫疾患及び循環器疾患を治療するための医薬組成物を調製することにおけるエオタキシン−２拮抗物質の使用。
【請求項２４】
前記エオタキシン−２拮抗物質が抗体である請求項２１又は２２のいずれかに記載の使用。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１７Ｆ】
【図１７Ｇ】
【図１７Ｈ】
【図１７Ｉ】
【図１７Ｊ】
【図１７Ｋ】
【図１７Ｌ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１７Ｆ】
【図１７Ｇ】
【図１７Ｈ】
【図１７Ｉ】
【図１７Ｊ】
【図１７Ｋ】
【図１７Ｌ】
【公表番号】特表２０１２−５１６１５０（Ｐ２０１２−５１６１５０Ａ）
【公表日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４７０５７（Ｐ２０１１−５４７０５７）
【出願日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／００００７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８６８５４
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ポラロイド
【出願人】（５１１１７６１３７）ザ メディカル リサーチ，インフラストラクチュア，アンド ヘルス サービシーズ ファンド オブ ザ テル アビブ メディカル センター (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／００００７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８６８５４
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ポラロイド
【出願人】（５１１１７６１３７）ザ メディカル リサーチ，インフラストラクチュア，アンド ヘルス サービシーズ ファンド オブ ザ テル アビブ メディカル センター (1)
【Ｆターム（参考）】
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