炎症性腸疾患の動物モデル
本発明は、炎症性腸疾患の動物モデルに関する。このモデルは、機能的なｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していないか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が阻害されている哺乳動物に基づいており、例えば塩素処理した飲料水を与えられるなど高塩素濃度に曝される場合に炎症性腸疾患を発現する。より具体的に言えば、該哺乳動物は、ｍｄｒ１ａ欠損トランスジェニックマウスである。また本発明には、炎症性腸疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法、ならびに、例えば、炎症性腸疾患を治療するための新たな化合物に対する新たな標的を同定するための方法が、含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、炎症性腸疾患の動物モデルに関する。このモデルは、機能的なｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していないか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が阻害されている哺乳動物に基づいており、高塩素濃度に曝される場合に炎症性腸疾患を発現する。より具体的に言えば、該哺乳動物は、ｍｄｒ１ａ欠損トランスジェニックマウスである。
【０００２】
このモデルは、炎症性腸疾患の発病メカニズムの特徴付け、ならびに診断、療法及び療法化合物の開発を促進する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、慢性的な、再燃及び緩解する、原因不明の炎症状態であり、生涯を通じて両性の個体を苦しめる。疾患は、二つの重複する状態である、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）によって、臨床的に特徴付けられる。ＩＢＤを有するヒトにおける臨床試験及び実験室での試験によって、遺伝的及び環境的因子が、これらの障害の病因において相互に関連した役割を果たすことが示唆された。より最近の免疫学的試験によって、ＩＢＤが、正常な腸管内細菌叢に存在する１またはそれより多くの未知の抗原に対する粘膜免疫応答の調節障害による可能性があることが示唆されている。
【０００４】
炎症性腸疾患の病因は、長年の多くの研究にもかかわらず、依然として不明である。しかしながら、潜在的な疾患メカニズムへのいくらかの洞察が、種々の動物モデルから得られた。例えば、ＩＬ−２（Ｓａｄｌａｃｋ Ｂ．ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７５，２５３−２６１）、ＩＬ−１０（Ｋｕｈｎ Ｒ．ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７５，２６３−２７４）及びＴＧＦ−β（Ｓｈｕｌｌ ＭＭ．ら（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ ３５９，６９３−６９９）を含むいくつかのサイトカインをコードする遺伝子が欠損したげっ歯類は、自然発症的な腸炎を発現する。Ｇαｉ２（Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｕら（１９９５年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １０，１４３−１５０）、ＴＣＲα（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ Ｐ．ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７５，２７４−２８２）及びＴＣＲβなどの、Ｔ細胞の機能に関与するタンパク質の選択的遺伝子欠失もまた、結果として自然発症的な腸炎を生じる。これらの試験は、ＩＢＤにおいて見られる持続的な炎症が、腸管内腔の正常な構成物への免疫学的応答性の増強または異常、あるいは全体的な自己免疫の調節障害及び不均衡の結果であるとの仮説に寄与した。
【０００５】
腸内菌叢もまた、腸炎の病因における重要な共同因子である可能性がある。例えば、いくつかのげっ歯類モデルにおいて、動物が無菌環境中に維持されるならば、自然発症的な大腸炎を予防することは可能である（Ｄｉａｎｄａ Ｌら（１９９７年）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５０，９１−９７，Ｔａｕｒｏｇ ＪＤら（１９９４年）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０，２３５９−２３６４）。他の試験は、腸炎が経口抗生物質での治療に成功することが可能なことを示した（Ｐａｎｗａｌａ ＣＭら（１９９８年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１，５７３３−５７４４）。加えて、ＩＢＤを有する患者は、自身の自己常在菌叢に対して有害かつ増強された反応性を有する（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＴＴ．（１９９５年）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０２，４４５−４４７）。腸内菌叢が腸炎の病因において重要であるとの仮説に対する支持は、トレフォイル因子（Ｍａｓｈｉｍｏ Ｈら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，２６２−２６５）またはＮ−カドヘリン（Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ ＭＬ及びＧｏｒｄｏｎ ＪＩ．（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，１２０３−１２０７）の遺伝子を欠失させることによって誘導された、上皮性関門細胞機能の欠損したマウスを用いた試験から、さらに導かれた。これらのマウスもまた、胃腸管における炎症の証拠を有する。腸内菌叢に加えて、食物の構成物が、上皮細胞関門の欠損したげっ歯類において認められる炎症応答に寄与するとの仮説を立てることは、妥当であるが、これは、食物の構成物が、無傷の上皮関門を有する動物においては到達できないであろう腸管内腔の区域に到達可能であるだろうとの理由による。
【０００６】
腸管上皮細胞（Ｃｒｏｏｐ ＪＭら（１９８９年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９（３），１３４６−１３５０；Ｇｏｔｔｅｓｓｍａｎ ＭＭ及びＰａｓｔａｎ Ｉ．（１９９３年）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２，３８５−４２７）、及びいくつかのリンパ球サブセット（Ｂｏｍｍｈａｒｄｔ Ｕら（１９９４年）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４，２９７４−２９８１）もまた、多剤耐性（ｍｄｒ）遺伝子を発現する。ｍｄｒ遺伝子は、薬物排出ポンプであるＰ−糖タンパク質をコードする。このポンプは多くの組織の形質膜中に局在し、そして宿主を潜在的に有害な化合物から保護するのに果たす本来の役割を有する。げっ歯類において三つのｍｄｒ１遺伝子（ｍｄｒ１ａ、ｍｄｒ１ｂ及びｍｄｒ２）、そしてヒトにおいては二つ（ｍｄｒ１及びｍｄｒ２）が、同定された。マウスにおいて、ｍｄｒ１ａ Ｐ−糖タンパク質は血液−脳及び血液−精巣関門にも発現し、そしてｍｄｒ１ｂ Ｐ−糖タンパク質は副腎、妊娠子宮及び卵巣に発現する（Ｂｏｍｍｈａｒｄｔ Ｕら（１９９４年）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４，２９７４−２９８１）。ｍｄｒ１ａ及びｍｄｒ１ｂ Ｐ−糖タンパク質はともに、肝臓、腎臓、脾臓及び心臓に発現する。
【０００７】
１９９４年に、ｍｄｒ１ａ遺伝子を標的として欠失させたマウスが作出された。このマウスは特定の薬物に対する感受性が増加したが、しかしいかなる構成的な異常も有するようには見えなかった（Ｓｃｈｉｎｋｅｌ ＡＨら（１９９４年）Ｃｅｌｌ ７７，４９１−５０２）。ｍｄｒ１ａ−／−マウスは、化合物の吸収におけるＰ−糖タンパク質の関与、化合物の脳透過性、及び潜在的にＰ−糖タンパク質の基質である化合物の肝胆汁排泄を評価するための試験に、日常的に用いられる。興味深いことに、最近の試験によって、ｍｄｒ１ａ−／−マウスのおよそ２５％が、組織学的にヒトＩＢＤと同様の慢性炎症を自然発症的に発現したことが報告された（Ｐａｎｗａｌａ ＣＭら（１９９８年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１，５７３３−５７４４）。我々は、薬物代謝試験において用いられているｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、同様な臨床症状及び病変を観察し、そして予備データを報告した（Ｂａｎｎｅｒ ＫＨら（２００１年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０，Ａ６９３）。具体的に言えば、臨床症状には急性体重減少及び軟「粘性」便が含まれ、組織病理学的解析によって著しく広汎性の大腸炎が示された。しかしながら、炎症性腸疾患の症状を発現している動物が非常に少なかったため、これは、この疾患に対して日常的に用いることが可能な信頼できるモデルではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
薬物代謝試験に対してこのトランスジェニックマウス系統を用いた我々の仕事において、我々は、飲料水における細菌数を塩素の添加を介して低下させることによって、このマウス系統における炎症性腸疾患様症状の発生率を低下させることを試みた。しかしながら、驚くべきことに、我々は、塩素処理した水を飲んでいた動物の１００％が、ヒトにおける炎症性腸疾患の症状と非常に似た炎症性疾患様症状を発現したことから、ｍｄｒ１ａ−／−マウスの飲料水への塩素添加が、疾患の発生率の有意な増加をもたらすことを見いだした。このことは極めて予期せぬことであったが、しかし、本発明である、組織学的にヒト疾患に非常に似た炎症性腸疾患の、最初の信頼でき再現可能な動物モデルをもたらした。
【０００９】
炎症性腸疾患を患う患者において認められるような疾患と非常に同様な特徴を示す、強固でそして信頼できる動物モデルが、この疾患について開発されたからには、疾患の病因及び進行を研究し、そして、疾患の原因を除去するにせよ、または疾患の進行を少なくとも止めるかもしくは遅らせるにせよ、または現在利用可能な治療よりも効果的に症状を治療するにせよ、疾患の治療に有益であろう化合物を開発するための新たな標的を同定するために、該モデルを用いることが可能となる。
発明の側面
本発明は、非常に高発生率の大腸炎（ヒトＩＢＤと非常に似た症状及び組織像を伴う）が、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、塩素処理した飲料水を供給される場合に認められるという、驚くべき知見に基づく。この知見は、ＩＢＤの強固な動物モデルの開発をもたらし、このことは、化合物をＩＢＤの治療、治癒または予防におけるその有効性について試験するほかに、ＩＢＤの病因に関与している可能性のある候補遺伝子を同定するのにも有用である。
【００１０】
したがって、本発明の一つの側面は、哺乳動物においてＩＢＤ様症状を誘導する方法であって、ここで哺乳動物は、（ｉ）機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない非ヒト哺乳動物であり、そして（ｉｉ）高塩素濃度に曝される。本発明の別の側面は、哺乳動物を、ｍｄｒ１ａ遺伝子産物の阻害剤または腸管におけるｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現を阻害する化合物で処理し、そして高塩素濃度に曝す、哺乳動物においてＩＢＤ様症状を誘導する方法である。好ましくは、高塩素濃度は、塩素処理した飲料水の供給によって哺乳動物に与えられる。塩素処理した飲料水は、１ｐｐｍを超える、好ましくは３ｐｐｍを超える、最も好ましくは５ｐｐｍまたはそれを超える塩素濃度を有する。哺乳動物を高塩素濃度に曝す他の方法には、食糧供給に塩素を加えること、動物に塩素の錠剤を与えること、あるいは、塩素漂白した哺乳動物用の床敷きを用いること、動物を漂白剤に曝露すること等が含まれてもよい。好ましい側面において、哺乳動物は、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子を発現していない、トランスジェニックげっ歯類であり、好ましくはトランスジェニックマウスである。本発明の好ましい側面は、５０％を超える、好ましくは７０％を超える、さらに好ましくは８０％を超える、さらにいっそう好ましくは９０％を超える、そして最も好ましくは１００％の動物がＩＢＤ様症状を示す、上記のような方法である。
【００１１】
該方法にて用いられる好ましい哺乳動物は、トランスジェニックｍｄｒ１ａ−／−ノックアウトマウスであり、さらにいっそう好ましくはトランスジェニックマウス系統ＦＶＢ．１２９Ｐ２−Ｐｇｙ３ｔｍ１Ｎ７である。しかしながら、ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない任意の哺乳動物を用いてもよい。これには、ｍｄｒ１ａ遺伝子の両方の対立遺伝子またはそのプロモーターにおける自然発生的な変異を伴う哺乳動物が含まれてもよい。これにはまた、哺乳動物においてｍｄｒ１ａ遺伝子の発現を阻害する化合物で処理された野生型哺乳動物も含まれてよく、該化合物とは、例えば、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ阻害剤、療法量以下の用量のマイトマイシンＣ、あるいは、選択した哺乳動物におけるｍｄｒ１ａオルソログに特異的な、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、または、ｍｄｒ１ａ遺伝子もしくはｍＲＮＡの転写または翻訳に干渉する他の分子である。あるいは、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している選択した哺乳動物は、例えば、哺乳動物においてｍｄｒ１ａ遺伝子産物を効果的に阻害する化合物で処理することによって、例えば、ＭＤＲ阻害剤として同定された化合物（単数または複数）で処理することによって、あるいは、ｍｄｒ１ａに特異的な遮断抗体によって、ｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されるならば、モデルにおいて用いてもよい。ＭＤＲを阻害するための種々の化合物及びメカニズムについて、最近概説された（Ｃ．Ａｖｅｎｄａｎｏ及びＪ．Ｃ．Ｍｅｎｅｎｄｅｚ（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９，１５９−１９３）。
【００１２】
本発明の別の側面は、候補化合物を、ＩＢＤの症状の改善におけるその有効性についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） ビヒクル中の候補化合物を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に投与すること；
（ｂ） 候補化合物を含まないビヒクルを、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に投与すること；及び、
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状を比較すること、ここで、（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）と比較した、（ａ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の減少は、化合物の有効性を示す；
を含む、前記方法である。
【００１３】
本発明のさらなる側面は、候補化合物を、ＩＢＤの発現の予防または遅延におけるその有効性についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） ビヒクル中の候補化合物を、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｂ） 候補化合物を含まないビヒクルを、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝すこと；及び、
（ｄ） 動物におけるＩＢＤの任意の症状の発症を比較すること、ここで、候補化合物を含まないビヒクルで治療された哺乳動物（単数または複数）と比較した、ビヒクル中の候補化合物で治療された哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の発症の遅延または予防は、化合物の有効性を示す；
を含む、前記方法である。
【００１４】
本発明のさらなる別の側面は、ＩＢＤの病因に関与する可能性があり、それゆえにＩＢＤの治療用薬物開発に対する新規の標的である可能性のある、遺伝子についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝すこと；
（ｂ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理していない飲料水のみを供給し、かつ他に高塩素濃度を供給しないことによって、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｃ） ＲＮＡ調製物を、（ａ）及び（ｂ）の双方の哺乳動物から得た腸より、所望の時間間隔の後に作ること；及び、
（ｄ） ＲＮＡ試料を比較すること、ここで、これらの試料において差を示すＲＮＡは、ＩＢＤの病因に関わる可能性のある遺伝子を示す；
を含む、前記方法である。
【００１５】
本発明のさらなる側面は、ＩＢＤの病因に関与する可能性のある遺伝子についてスクリーニングする方法であって、以下の工程；
（ａ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝すこと；
（ｂ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している第二の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝すこと；
（ｃ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第三の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理していない飲料水のみを供給し、かつ他に高塩素濃度を供給しないことによって、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｄ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している第四の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理していない飲料水のみを供給し、かつ他に高塩素濃度を供給しないことによって、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｅ） ＲＮＡ調製物を、（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの哺乳動物から得た腸より、所望の時間間隔の後に作ること；及び、
（ｆ） ＲＮＡ試料を比較すること、ここで、（ａ）と（ｃ）の試料間で差を示すが、しかし（ｂ）と（ｄ）の試料間では同様な差を示さないＲＮＡは、ＩＢＤの病因に関わる可能性のある遺伝子を示す；
を含む、前記方法である。
【００１６】
上記のＲＮＡ試料の比較は、発現プロファイリングによって、好ましくはディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲまたはサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション法によって、さらにいっそう好ましくはマイクロアレイ解析によって、実施することが可能である。
【００１７】
上記の方法において用いられる好ましい哺乳動物は、トランスジェニックｍｄｒ１ａ−／−ノックアウトマウスであり、さらにいっそう好ましくはトランスジェニックマウス系統ＦＶＢ．１２９Ｐ２−Ｐｇｙ３ｔｍ１Ｎ７である。
【００１８】
本発明の別の側面は、上記のように同定された任意の候補遺伝子のヒトホモログを同定することである。これは、哺乳動物の候補遺伝子をプローブとして用いて、適切なヒト腸管組織由来のヒトｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした後に、陽性クローンの配列解析を行うことによって、実施することが可能であり；また、例えばＮＣＢＩウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html）上で利用可能なＧｅｎｂａｎｋ（Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０，１７−２０（２００２年））などのデータベースを、哺乳動物の候補遺伝子の配列を用いて検索することによっても行うことが可能である。他の有用なデータベースは、同様に国際ヌクレオチド配列データベース協力の一部であるＥＭＢＬ及びＤＤＢＪである。これらの方法及びデータベースは、当業者に周知である。データベースを検索するための好ましい方法は、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２）であろうが、しかし、Ｆａｓｔａなどの当業者に周知の他の方法を用いることも可能である。検索に用いられる哺乳動物配列に最も類似したヒト配列は、たいていの場合は候補遺伝子のヒトホモログであろう。次いで、当業者は、候補遺伝子のヒトホモログの全長ｃＤＮＡを、例えばｃＤＮＡライブラリのスクリーニングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によってクローニングし、そして、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編集（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバー研究所プレス、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国、またはＡｕｓｕｂｅｌら編集（１９９０年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ジョンワイリー・アンド・サンズ・Ｉｎｃ．、またはその改訂版、あるいは他の同様な一般的な教科書において記載されているような方法に従って、適切な発現系にてそれを発現させることが、可能であろう。
【００１９】
本発明のさらなる側面は、組成物を調製する方法であって、以下；
（ａ） 以下の工程：
（ｉ） ビヒクル中の候補化合物を、好ましくは塩素処理した飲料水を供給することによって高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に投与すること；
（ｉｉ） 候補化合物を含まないビヒクルを、好ましくは塩素処理した飲料水を供給することによって高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与すること；及び、
（ｉｉｉ） （ｉ）及び（ｉｉ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状を比較すること、ここで、（ｉｉ）の哺乳動物（単数または複数）と比較した、（ｉ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の減少は、化合物の有効性を示す；
を含む方法によって、ＩＢＤの症状を改善することが可能な化合物を同定すること；ならびに、
（ｂ） 前記化合物をキャリアーと混合すること；
を含む、前記方法である。
【００２０】
さらに、本発明のさらなる側面は、組成物を調製する方法であって、以下：
（ａ） 以下の工程：
（ｉ） ビヒクル中の候補化合物を、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｉｉ） 候補化合物を含まないビヒクルを、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｉｉｉ） （ｉ）及び（ｉｉ）の哺乳動物（単数または複数）を、好ましくは塩素処理した飲料水を供給することによって、高塩素濃度に曝すこと；及び、
（ｉｖ） 動物におけるＩＢＤの任意の症状の発症を比較すること、ここで、候補化合物を含まないビヒクルで治療された哺乳動物（単数または複数）と比較した、ビヒクル中の候補化合物で治療された哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の発症の遅延または予防は、化合物の有効性を示す；
を含む方法によって、ＩＢＤの発現を予防または遅延することが可能な化合物を同定すること；ならびに、
（ｂ） 前記化合物をキャリアーと混合すること；
を含む、前記方法である。
【実施例】
【００２１】
実施例は、例示を目的として含まれており、かつ本発明の範囲を限定することを目的としない。参照したがしかし本明細書にて明確に記載されていない一般的な方法は、科学文献にて報告されており、そして当業者に周知である。
（実施例１：ＩＢＤの動物モデルとしてのｍｄｒ１ａ−／−マウス）
材料及び方法
動物
４０例の雄性ｍｄｒ１ａ−／−マウス（ＦＶＢ．１２９Ｐ２−Ｐｇｙ３ｔｍ１Ｎ７系統）及び、同じ遺伝的背景（ＦＶＢ；ＦＶＢ／ＮＴａｃ系統）の６例の雄性対照マウス（ｍｄｒ１ａ＋／＋）（６〜８週齢）を、タコニック・ファームズ社（米国）より入手した。マウスを、加圧滅菌したバンティン・アンド・キングマン社（英国）のビー・ケイ床敷きを含有する硬い底のケージに、１例ずつ入れ、Ｅｎｖｉｒｏｄｒｉ社の、脱臭化学物質を含まない白紙でできている巣作り用の紙を、質の向上を提供するために加えた。マウスには、ラット及びマウス用第１番維持食餌（ＲＭＩ（Ｅ）ＳＱＣ）（スペシャル・ダイエット・サービスイズ社、ウィザム、エセックス州、英国）を、ファイザー社に到着次第、食べさせた。本試験のために、我々は、容器入りの水及びＫｌｏｒｔａｂ（５ｐｐｍ）（アローマイト・バイオサイエンスイズ社、英国）を、水に病原菌の拡散を生じる可能性を除去するために、そして一定レベルの塩素を伴う水の供給を提供するために、用いた。水は週２回替えた。本試験は、英国の法律にしたがって実施され、そしてファイザー社の内部倫理審査過程によって承認された。
試験デザイン及び投薬
試験の開始に先立ち、すべてのマウス（ｍｄｒ１ａ−／− ４０例及びｍｄｒ１ａ＋／＋ ６例）を１４日間馴化させた。パイロット試験（Ｂａｎｎｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（２００１年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０，Ａ６９３）より、体重及び軟便スコアは、胃腸炎を最も予測するものであることが見いだされ、それゆえに、本試験においてこれらの臨床徴候をモニターした。異なる臨床徴候に対して異なる重みづけをしたスコアリングシステムを考案した（表１）。その意図は、スコアに大腸炎の重症度を反映させことであった。
【００２２】
【表１】
【００２３】
馴化期間の後に、軽度〜中等度（軽度の疾患（０〜３）を、体重増加なしまたは軽度の体重減少（＜０．５ｇ）かつ他の症状なしと定義し、一方、中等度の疾患（４〜１０）を、前群と同様な症状であるがしかし軟便またはより大きな体重減少（＞２０％）を伴うものと定義した）の疾患スコアのｍｄｒ１ａ−／−マウスを４群に無作為化し、そしてビヒクル（水、ｎ＝８）またはデキサメタゾン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９；０．３ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８、または２ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）を１日１回７日間皮下（ｓ．ｃ．）投与した。６例のｍｄｒ１ａ＋／＋マウスには、ビヒクル（水）を投与した。試験期間中、０．３ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン治療群のマウス１例が死亡して発見され、そして２例を屠殺した（ビヒクル治療群１例、及び０．０５ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン治療群１例）。試験終了時に、すべてのマウスを屠殺した。各マウスの結腸及び盲腸を取り出し、そして秤量した。次いで、各結腸を、一方の切片を組織学的解析用に、そして他方の切片をサイトカイン測定用に処理可能なように、縦方向に分割した（以下を参照されたい）。
サイトカイン及びタンパク質の測定
各個々の結腸試料を、氷冷クレブス液（シグマ・ケミカル・Ｃｏ．、英国）３ｍｌ中で、４℃にて３０秒間、３回ホモジナイズした。試料を３５，０００ｇ（４℃）にて１５分間遠心分離し、そして上清を除去した。次いで、ＩＬ−８及びＩＦＮ−γレベルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社、英国）で測定した。これらのキットの検出限界は、３１．２〜２０００ｐｇ／ｍｌであった。上清中のタンパク質レベルを、Ｂｒａｄｆｏｒｄによって記載された方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６年）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４）を用いて、ブラッドフォード試薬（シグマ社）を利用して定量した。
組織学的解析
動物を剖検した。結腸／直腸及び盲腸を秤量し、そして結腸／直腸、盲腸、回腸、空腸、十二指腸、胃、腸間膜リンパ節、胸腺、腎臓、脾臓を採取し、そして１０％緩衝ホルマリン溶液中で固定化した。結腸／直腸及び回腸を、その縦方向の切片全体を１つのスライドで評価するために、「スイスロール」技術（Ｍｏｏｌｅｎｂｅｅｋ，Ｃ．及びＲｕｉｔｅｎｂｅｒｇ Ｅ．Ｊ．（１９８１年）Ｌａｂ Ａｎｉｍ １５（１）：５７−９）にて調製した。組織を、自動組織処理装置にて所定の手順で処理し、パラフィン中に埋め込み、４〜６μｍに切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）で染色し、そして組織学的検査を行った。大腸炎は、盲検化された観察者によって、所見の程度及び粘膜変化の重症度に応じて、０（有意な所見なし）〜４（重度の増殖性及び潰瘍性炎症）（表２）に、類別された。加えて、全結腸／直腸の粘膜の高さを、標準的な相互マイクロコンピュータ支援の画像解析システムを用いて、１００μｍ毎に評価した。
【００２４】
【表２】
【００２５】
大腸炎は、結腸の近位領域内で始まるように思われたが、ここがスコア１及び２において影響を受ける主な領域であったためである。変化の重症度が増加した場合（スコア３及び４）、病変は、結腸の中位及び遠位領域ならびに直腸においてより顕著であった。大腸炎は、固有層内の炎症細胞である、主にマクロファージ、リンパ球及び多核好中球の浸潤、ならびに粘膜肥厚によって、組織学的に特徴付けられた。腺窩の長さの増加、好塩基球増加及び腸上皮細胞の有糸分裂数の増加、杯細胞の減少、ならびに腸浮腫が認められた。スコア２ではほんの僅かの侵食がみられたが、一方、スコア３からは、正常構造の閉塞、表在性貫壁性潰瘍及び腺窩膿瘍がみられた。
病原体の解析
ヘリコバクター・ヘパティカス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）、ヘリコバクター・ビリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｂｉｌｉｓ）及びヘリコバクター・ローデンティウム（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）などの多くの病原体が、げっ歯類における胃腸炎の発現に関連している。したがって、三つの別個の技術を、糞便及び結腸試料におけるすべての公知のネズミ病原菌の有無を確認するのに用いた。二名の独立した共同研究者が、ＰＣＲを用いて糞便試料を解析した。結腸試料を、Ｗａｒｔｈｉｎ Ｓｔａｒｒｙ及びＦｉｔｅ Ｆａｒａｃｏ染色を用いた、電子顕微鏡観察及び組織学によって解析した。血清学的及び細菌学的試験もまた、ＦＥＬＡＳＡ推奨（ＦＥＬＡＳＡ作業部会の報告書（１９９６年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ３０，１９３−２０８、及び（１９９４年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ２８；１−１２）にしたがって実施した。
統計学的解析
データを、試験を完了した２９例のｍｄｒ１ａ−／−及び６例のｍｄｒ１ａ＋／＋マウスについて解析した。ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスとｍｄｒ１ａ＋／＋マウスとの差を、二標本ｔ−検定（ＩＦＮ−γ、馴化期間中の成長率及び最終体重に関しては等分散とみなし、そして、ＩＬ−８、結腸重量、盲腸重量、体重に対する結腸重量の割合、体重に対する盲腸重量の割合及び試験期間中の成長率に関しては不等分散とみなす）を用いて解析した。デキサメタゾン治療の影響を、処分群を考慮した分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて解析した。治療効果が有意であることが見いだされた場合には、次いで９５％信頼区間を算出した。
【００２６】
大腸炎重症度スコアは、０〜４のスケールに類別された順序カテゴリー指標である。この種類のデータは、一般に比例オッズモデルを用いて解析するが、しかし標本の大きさが小さいためこれは適切でなく、そしてＡＮＯＶＡを用いた。これは正規分散データを有するとの仮定を作るが、このことは、我々がカテゴリーデータを有しているにもかかわらず、およそ当てはまるようであった。すべての解析を、ウィンドウズ用Ｇｅｎｓｔａｔ ５ リリース４．２を用いて実施した。
結果
大腸炎の臨床徴候
成長率
馴化期間中の成長率に、ｍｄｒ１ａ−／−マウスとｍｄｒ１ａ＋／＋マウスとの間で統計学的に有意な差はなかった（０．２６５ｇ／日 ｖｓ．０．２９４ｇ／日）。しかしながら、試験期間中は、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスとｍｄｒ１ａ＋／＋マウスとの間で統計学的に有意な差があった。ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスの体重は増え続けたが、一方、ｍｄｒ１ａ−／−マウスの体重は減少した（表３）。加えて、試験終了時に、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスは、ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスよりも有意に軽かった（表３）。デキサメタゾン治療は、用いたいずれの用量においても、成長率にも最終体重にも有意な影響がなかった（表３）。
【００２７】
【表３】
【００２８】
臨床スコア
デキサメタゾンは、全体的な大腸炎の臨床スコアに影響しなかった（上記の表３を参照されたい）。
大腸炎の肉眼的証拠
結腸及び盲腸重量
結腸重量（６９１±６９ ｖｓ．３２５±２６ｍｇ）及び盲腸重量（２１１±１２ ｖｓ．１６５±６ｍｇ）の有意な増加が、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスと対比して認められた。体重に対する結腸重量の割合（図１、平均±標準誤差を示す。白抜きのバーはｍｄｒ１ａ＋／＋マウスを表し、そして黒塗りのバーはｍｄｒ１ａ−／−マウスを表す。＊０ｍｇ／ｋｇ ｍｄｒ１ａ−／−群と比較して、統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５））及び体重に対する盲腸重量の割合（図２；平均±標準誤差を示す。白抜きのバーはｍｄｒ１ａ＋／＋マウスを表し、そして黒塗りのバーはｍｄｒ１ａ−／−マウスを表す。＊０ｍｇ／ｋｇ ｍｄｒ１ａ−／−群と比較して、統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）。＊＊０ｍｇ／ｋｇ ｍｄｒ１ａ−／−群と比較して、統計学的に有意な差（ｐ＜０．０１）。）もまた、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスと対比して有意に高く、それぞれ、３．０±０．３１ ｖｓ．１．２±０．０８及び０．９±０．０５ ｖｓ．０．６±０．０２であった。デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ、皮下、１日１回７日間）は、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスと対比して、結腸絶対重量（４５６±４８ ｖｓ．６９１±５２ｍｇ；Ｐ＜０．０１）及び体重に対する結腸重量の割合（２．１±０．２６ ｖｓ．３．０±０．２８、Ｐ＝０．０１７）を低下させたが、一方、低用量のデキサメタゾンでは、有意な影響がなかった（図２）。検定したすべての用量のデキサメタゾンは、盲腸絶対重量（ｐ＜０．０１）及び体重に対する盲腸重量の割合（ｐ＜０．０１５）を、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスと比べて低下させた。
３．大腸炎の顕微鏡的証拠
サイトカインレベル
ＩＬ−８（ｐ＝０．０２８）及びＩＦＮ−γ（ｐ＜０．０１）レベルは、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスから得た、ホモジナイズした結腸において、ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスと対比して有意に高かった。しかしながら、デキサメタゾンでの治療は、いずれのサイトカインレベルにも、用いたいずれの用量においても影響がなかった（表４）。
【００２９】
【表４】
【００３０】
組織学的な類別
ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスから得た結腸は、正常なようにみえた。対照的に、ｍｄｒ１ａ−／−マウスから得た結腸は、ヒトＩＢＤにおいて認められるものと同様な病変によって特徴付けられた。特に、粘膜の有意な肥厚を伴う重度の自然発症的な結腸の炎症は、時折の腺窩膿瘍、腺窩の長さの増加、及び粘膜を介して筋肉（筋層）へと広がる潰瘍とともに、みられた。加えて、上皮細胞の増殖調節異常が、炎症細胞の固有層への浸潤とともに認められた。デキサメタゾンの用量が増加するにつれて、大腸炎の重症度スコアが減少する傾向にあった。治療群の平均値間に、統計学的に有意な全体的な差（ｐ＞０．１０）はなかったが、しかしデキサメタゾンの最高用量（２ｍｇ／ｋｇ）では、ビヒクル群と比べて大腸炎の重症度スコアが有意に減少するとの証拠がいくらかあった（表５）。
【００３１】
【表５】
【００３２】
形態計測による評価
粘膜の高さの形態計測による評価は、組織学的な評価に一致した。スコア０と比較した場合、粘膜の高さの変化は、スコア１及び２（最小限〜軽度で、主に結腸の近位領域にみられた）で、ならびに、スコア３及び４（顕著〜重度で、結腸の中位及び遠位領域ならびに直腸においてより顕著（図３；凡例は、０〜４の大腸炎重症度スコアを示す（詳しくは表２を参照されたい））で、近接していた。また注目すべきは、大腸炎重症度スコアの増加に応じた結腸／直腸の長さの減少であり、これは大腸炎の古典的な所見である。
病理
ヘリコバクター属（ヘリコバクター・ビリス、ヘパティカス、及び全種）が存在しないことを、ＰＣＲ、電子顕微鏡及び組織染色によって確認した。シトロバクター・ローデンティウム（ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）（大腸過形成に関連する細菌）を含む他の公知の病原菌が存在しないことを、細菌学的及び血清学的解析によって確認した。要約すると、マウスには、ＦＥＬＡＳＡ推奨（ＦＥＬＡＳＡ作業部会の報告書（１９９６年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ３０，１９３−２０８、及び（１９９４年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ２８；１−１２）において特定されるような、病原性であることが公知のウイルス、細菌及び寄生虫は存在しなかった。
（実施例２：対照試験）
他の点では同一の遺伝的背景である１６例のｍｄｒ１ａ−／−マウス及び１６例のｍｄｒ１ａ＋／＋マウスを、塩素処理していない飲料水で馴化させる。次いで、動物を以下の表（表６）：
【００３３】
【表６】
【００３４】
に示すような群に分ける。
次いで、マウスを軟便及び体重増加なしに関して５週間までモニターする。
重度のＩＢＤ様症状が、第４群のみに認められる。
（実施例３：ＩＢＤ治療用の化合物）
４０例のｍｄｒ１ａ−／−マウスを馴化させ、次いで、５ｐｐｍの塩素処理した飲料水を２日間与える。次いで、それらを４群：
１０例の動物：ビヒクルのみを投与
１０例の動物：試験化合物０．０５ｍｇ／ｋｇを投与
１０例の動物：試験化合物０．５ｍｇ／ｋｇを投与
１０例の動物：試験化合物５ｍｇ／ｋｇを投与
に分ける。
【００３５】
ＩＢＤの症状を、実施例１において記載した方法の一つを用いて、３〜４週間モニターする。用量相関性の有意な改善が、試験化合物で治療される動物において、ビヒクルのみを与えられる動物と比べて認められるならば、試験化合物は、ＩＢＤの治療に有望であると考えられる。
（実施例４：ＩＢＤの予防）
４０例のｍｄｒ１ａ−／−マウスを２日間馴化させ、その間塩素処理していない飲料水を与える。次いで、それらを４群：
１０例の動物：ビヒクルのみを投与
１０例の動物：試験化合物０．０５ｍｇ／ｋｇを投与
１０例の動物：試験化合物０．５ｍｇ／ｋｇを投与
１０例の動物：試験化合物５ｍｇ／ｋｇを投与
に分ける。
【００３６】
次の日に、動物に塩素処理した（５ｐｐｍ）飲料水を供給する。次いで、動物を、ＩＢＤ様症状の発症に関してモニターする。
症状の発症の用量相関性の有意な減少または遅延が、試験化合物で治療される動物において、ビヒクルのみを与えられる動物と比べて認められるならば、試験化合物は、ＩＢＤの予防に有望であると考えられる。
（実施例５：ｍｄｒ１ａ−／−マウス及び野生型（ＦＶＢ）マウスから得た結腸における遺伝子発現の変化の比較、ならびにこれらの変化に対するデキサメタゾンの影響）
本試験の目的は、野生型（ＦＶＢ）マウス及びｍｄｒ１ａ−／−マウスから得た結腸における遺伝子発現の変化を比較し、そしてこれらの変化に対するデキサメタゾンの影響を検討することである。
【００３７】
雄性ＦＶＢ野生型及びｍｄｒ１ａ−／−マウス（９〜１０週齢）に、デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）またはビヒクル（水）を１日１回７日間投与した。マウスを処分し、そして結腸を組織学的評価のために取り出した。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ及びＲＮｅａｓｙの修正プロトコールを用いて各群のドナー１例より精製し、１．９を超えるＡ２６０／Ａ２８０純度で、５０μｇ ＲＮＡ／試料を超えて得た。
【００３８】
手順は、アフィメトリクス社マニュアルにしたがって行った。各試料につき１０μｇの総ＲＮＡを、二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡに逆転写した。ｄｓｃＤＮＡの半分を、ビオチン化ヌクレオチドの存在下でＩｎ Ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）した。２５μｇのＩＶＴ産物を断片化し、そして約１５μｇをハイブリダイゼーションカクテル中で用い、テスト２チップに、次いでＵ７４Ａチップにハイブリダイズさせた（アフィメトリクス社マニュアルａ．ｆ．１，７３０７−１を参照されたい）。
【００３９】
ＲＮＡの品質及びハイブリダイゼーションシグナルは、すべての試料において良好であった。マウスＵ７４Ａデータを、３００に正規化した。プローブ（〜遺伝子）の総数は、１２，６３９である。
【００４０】
データの解析によって、ｍｄｒ１ａ−／−マウスが、例えば、補体成分、ＭＨＣ分子、白血球マーカー（白血球の組織への浸潤を示す）、サイトカイン、ケモカイン、インテグリン、シクロオキシゲナーゼ−２、ならびにＴＮＦファミリー分子及びリガンドなどの炎症マーカーの亢進によって示されるような炎症の増加の明らかな証拠を示すほかに、例えば、メタロプロテイナーゼ発現の亢進によって示されるような組織破壊の証拠を示すことが、示された。また、ホスホリパーゼＡ２（約１２ｘ 亢進）、または誘導性一酸化窒素合成酵素（約５ｘ 亢進）などの、ＩＢＤに対する公知の薬物の標的が、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて明らかに亢進することも、対照動物と比較して示された。このことは、ＩＢＤに対する効果的な治療の同定を助けるであろう新たな薬物の標的を同定するための方法が適当であることを、明らかに示す。
【００４１】
候補となる薬物の標的は、例えば、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて亢進し、そしてデキサメタゾン治療によって正常レベル近くまで低下する遺伝子である。
診断、ならびに疾患状態、進行及び療法の成功の評価に有用な、候補のバイオマーカーもまた、このような実験によって同定することが可能であり；例えば、我々は、インターロイキン−１β（６１倍亢進）、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ−３；２９倍亢進）またはグランザイムＢ（６倍亢進）などのＩＢＤに対する公知のマーカーが、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、対照動物と比較して亢進することを見いだした。それゆえ、この実験において同じ制御パターンを示す他の遺伝子もまた、ＩＢＤに対する候補のバイオマーカーまたは診断ツールである。
（実施例６：塩素処理した飲料水に切り替えた後の、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおける遺伝子発現の、野生型マウスと比較した経時変化）
ＩＢＤの病因に関与する遺伝子を同定するために、ＦＶＢ野生型マウスと比較した、ｍｄｒ１ａ−／−マウスの結腸における遺伝子発現の変化を、マウスを塩素処理した飲料水に切り替えた後に、経時的に試験する。
【００４２】
雄性マウス（９〜１０週齢）（野生型及びｍｄｒ１ａ−／−マウスで同数）を馴化させ、２日間、塩素処理していない飲料水を与える。次いで、水を、塩素処理した飲料水（５ｐｐｍ）に替え、そして、塩素処理した水を飲み始める直前及び飲み始めた後の種々の時点において、各群のマウスを並行して処分し、そして結腸を組織学的評価及びＲＮＡ単離のために取り出す。適切な時点は、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間であろう。
【００４３】
発現プロファイリングを、先の実施例に記載したように実施する。
ＩＢＤの病因に関与する候補である遺伝子は、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおける発現は変わるがしかし野生型マウスにおいては変わらない（かまたは同程度ではない）ものである。水の供給を切り替えた後すぐに変化する遺伝子は、これらが疾患の発症に関与している可能性があり、そして、これらを阻害することで疾患の発症を予防する可能性があるため、特に興味深い。
【００４４】
あるいは、疾患の進行または治療の成功を評価するのに有用な、ＩＢＤに対するバイオマーカーの候補である遺伝子もまた、本実験によって同定することが可能である。例えば、このような遺伝子は、血清中に見つけられるタンパク質をコードする可能性があり、そして有用なバイオマーカーは、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、野生型マウスと比較して亢進または低下する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおける、体重に対する結腸重量の割合に及ぼすデキサメタゾンの影響（平均±標準誤差）。
【図２】ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおける、体重に対する盲腸重量の割合に及ぼすデキサメタゾンの影響（平均±標準誤差）。
【図３】全結腸／直腸にわたった、結腸／直腸の粘膜の高さ。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、炎症性腸疾患の動物モデルに関する。このモデルは、機能的なｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していないか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が阻害されている哺乳動物に基づいており、高塩素濃度に曝される場合に炎症性腸疾患を発現する。より具体的に言えば、該哺乳動物は、ｍｄｒ１ａ欠損トランスジェニックマウスである。
【０００２】
このモデルは、炎症性腸疾患の発病メカニズムの特徴付け、ならびに診断、療法及び療法化合物の開発を促進する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、慢性的な、再燃及び緩解する、原因不明の炎症状態であり、生涯を通じて両性の個体を苦しめる。疾患は、二つの重複する状態である、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）によって、臨床的に特徴付けられる。ＩＢＤを有するヒトにおける臨床試験及び実験室での試験によって、遺伝的及び環境的因子が、これらの障害の病因において相互に関連した役割を果たすことが示唆された。より最近の免疫学的試験によって、ＩＢＤが、正常な腸管内細菌叢に存在する１またはそれより多くの未知の抗原に対する粘膜免疫応答の調節障害による可能性があることが示唆されている。
【０００４】
炎症性腸疾患の病因は、長年の多くの研究にもかかわらず、依然として不明である。しかしながら、潜在的な疾患メカニズムへのいくらかの洞察が、種々の動物モデルから得られた。例えば、ＩＬ−２（Ｓａｄｌａｃｋ Ｂ．ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７５，２５３−２６１）、ＩＬ−１０（Ｋｕｈｎ Ｒ．ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７５，２６３−２７４）及びＴＧＦ−β（Ｓｈｕｌｌ ＭＭ．ら（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ ３５９，６９３−６９９）を含むいくつかのサイトカインをコードする遺伝子が欠損したげっ歯類は、自然発症的な腸炎を発現する。Ｇαｉ２（Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｕら（１９９５年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １０，１４３−１５０）、ＴＣＲα（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ Ｐ．ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７５，２７４−２８２）及びＴＣＲβなどの、Ｔ細胞の機能に関与するタンパク質の選択的遺伝子欠失もまた、結果として自然発症的な腸炎を生じる。これらの試験は、ＩＢＤにおいて見られる持続的な炎症が、腸管内腔の正常な構成物への免疫学的応答性の増強または異常、あるいは全体的な自己免疫の調節障害及び不均衡の結果であるとの仮説に寄与した。
【０００５】
腸内菌叢もまた、腸炎の病因における重要な共同因子である可能性がある。例えば、いくつかのげっ歯類モデルにおいて、動物が無菌環境中に維持されるならば、自然発症的な大腸炎を予防することは可能である（Ｄｉａｎｄａ Ｌら（１９９７年）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５０，９１−９７，Ｔａｕｒｏｇ ＪＤら（１９９４年）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０，２３５９−２３６４）。他の試験は、腸炎が経口抗生物質での治療に成功することが可能なことを示した（Ｐａｎｗａｌａ ＣＭら（１９９８年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１，５７３３−５７４４）。加えて、ＩＢＤを有する患者は、自身の自己常在菌叢に対して有害かつ増強された反応性を有する（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＴＴ．（１９９５年）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０２，４４５−４４７）。腸内菌叢が腸炎の病因において重要であるとの仮説に対する支持は、トレフォイル因子（Ｍａｓｈｉｍｏ Ｈら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，２６２−２６５）またはＮ−カドヘリン（Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ ＭＬ及びＧｏｒｄｏｎ ＪＩ．（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，１２０３−１２０７）の遺伝子を欠失させることによって誘導された、上皮性関門細胞機能の欠損したマウスを用いた試験から、さらに導かれた。これらのマウスもまた、胃腸管における炎症の証拠を有する。腸内菌叢に加えて、食物の構成物が、上皮細胞関門の欠損したげっ歯類において認められる炎症応答に寄与するとの仮説を立てることは、妥当であるが、これは、食物の構成物が、無傷の上皮関門を有する動物においては到達できないであろう腸管内腔の区域に到達可能であるだろうとの理由による。
【０００６】
腸管上皮細胞（Ｃｒｏｏｐ ＪＭら（１９８９年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９（３），１３４６−１３５０；Ｇｏｔｔｅｓｓｍａｎ ＭＭ及びＰａｓｔａｎ Ｉ．（１９９３年）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２，３８５−４２７）、及びいくつかのリンパ球サブセット（Ｂｏｍｍｈａｒｄｔ Ｕら（１９９４年）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４，２９７４−２９８１）もまた、多剤耐性（ｍｄｒ）遺伝子を発現する。ｍｄｒ遺伝子は、薬物排出ポンプであるＰ−糖タンパク質をコードする。このポンプは多くの組織の形質膜中に局在し、そして宿主を潜在的に有害な化合物から保護するのに果たす本来の役割を有する。げっ歯類において三つのｍｄｒ１遺伝子（ｍｄｒ１ａ、ｍｄｒ１ｂ及びｍｄｒ２）、そしてヒトにおいては二つ（ｍｄｒ１及びｍｄｒ２）が、同定された。マウスにおいて、ｍｄｒ１ａ Ｐ−糖タンパク質は血液−脳及び血液−精巣関門にも発現し、そしてｍｄｒ１ｂ Ｐ−糖タンパク質は副腎、妊娠子宮及び卵巣に発現する（Ｂｏｍｍｈａｒｄｔ Ｕら（１９９４年）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４，２９７４−２９８１）。ｍｄｒ１ａ及びｍｄｒ１ｂ Ｐ−糖タンパク質はともに、肝臓、腎臓、脾臓及び心臓に発現する。
【０００７】
１９９４年に、ｍｄｒ１ａ遺伝子を標的として欠失させたマウスが作出された。このマウスは特定の薬物に対する感受性が増加したが、しかしいかなる構成的な異常も有するようには見えなかった（Ｓｃｈｉｎｋｅｌ ＡＨら（１９９４年）Ｃｅｌｌ ７７，４９１−５０２）。ｍｄｒ１ａ−／−マウスは、化合物の吸収におけるＰ−糖タンパク質の関与、化合物の脳透過性、及び潜在的にＰ−糖タンパク質の基質である化合物の肝胆汁排泄を評価するための試験に、日常的に用いられる。興味深いことに、最近の試験によって、ｍｄｒ１ａ−／−マウスのおよそ２５％が、組織学的にヒトＩＢＤと同様の慢性炎症を自然発症的に発現したことが報告された（Ｐａｎｗａｌａ ＣＭら（１９９８年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１，５７３３−５７４４）。我々は、薬物代謝試験において用いられているｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、同様な臨床症状及び病変を観察し、そして予備データを報告した（Ｂａｎｎｅｒ ＫＨら（２００１年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０，Ａ６９３）。具体的に言えば、臨床症状には急性体重減少及び軟「粘性」便が含まれ、組織病理学的解析によって著しく広汎性の大腸炎が示された。しかしながら、炎症性腸疾患の症状を発現している動物が非常に少なかったため、これは、この疾患に対して日常的に用いることが可能な信頼できるモデルではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
薬物代謝試験に対してこのトランスジェニックマウス系統を用いた我々の仕事において、我々は、飲料水における細菌数を塩素の添加を介して低下させることによって、このマウス系統における炎症性腸疾患様症状の発生率を低下させることを試みた。しかしながら、驚くべきことに、我々は、塩素処理した水を飲んでいた動物の１００％が、ヒトにおける炎症性腸疾患の症状と非常に似た炎症性疾患様症状を発現したことから、ｍｄｒ１ａ−／−マウスの飲料水への塩素添加が、疾患の発生率の有意な増加をもたらすことを見いだした。このことは極めて予期せぬことであったが、しかし、本発明である、組織学的にヒト疾患に非常に似た炎症性腸疾患の、最初の信頼でき再現可能な動物モデルをもたらした。
【０００９】
炎症性腸疾患を患う患者において認められるような疾患と非常に同様な特徴を示す、強固でそして信頼できる動物モデルが、この疾患について開発されたからには、疾患の病因及び進行を研究し、そして、疾患の原因を除去するにせよ、または疾患の進行を少なくとも止めるかもしくは遅らせるにせよ、または現在利用可能な治療よりも効果的に症状を治療するにせよ、疾患の治療に有益であろう化合物を開発するための新たな標的を同定するために、該モデルを用いることが可能となる。
発明の側面
本発明は、非常に高発生率の大腸炎（ヒトＩＢＤと非常に似た症状及び組織像を伴う）が、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、塩素処理した飲料水を供給される場合に認められるという、驚くべき知見に基づく。この知見は、ＩＢＤの強固な動物モデルの開発をもたらし、このことは、化合物をＩＢＤの治療、治癒または予防におけるその有効性について試験するほかに、ＩＢＤの病因に関与している可能性のある候補遺伝子を同定するのにも有用である。
【００１０】
したがって、本発明の一つの側面は、哺乳動物においてＩＢＤ様症状を誘導する方法であって、ここで哺乳動物は、（ｉ）機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない非ヒト哺乳動物であり、そして（ｉｉ）高塩素濃度に曝される。本発明の別の側面は、哺乳動物を、ｍｄｒ１ａ遺伝子産物の阻害剤または腸管におけるｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現を阻害する化合物で処理し、そして高塩素濃度に曝す、哺乳動物においてＩＢＤ様症状を誘導する方法である。好ましくは、高塩素濃度は、塩素処理した飲料水の供給によって哺乳動物に与えられる。塩素処理した飲料水は、１ｐｐｍを超える、好ましくは３ｐｐｍを超える、最も好ましくは５ｐｐｍまたはそれを超える塩素濃度を有する。哺乳動物を高塩素濃度に曝す他の方法には、食糧供給に塩素を加えること、動物に塩素の錠剤を与えること、あるいは、塩素漂白した哺乳動物用の床敷きを用いること、動物を漂白剤に曝露すること等が含まれてもよい。好ましい側面において、哺乳動物は、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子を発現していない、トランスジェニックげっ歯類であり、好ましくはトランスジェニックマウスである。本発明の好ましい側面は、５０％を超える、好ましくは７０％を超える、さらに好ましくは８０％を超える、さらにいっそう好ましくは９０％を超える、そして最も好ましくは１００％の動物がＩＢＤ様症状を示す、上記のような方法である。
【００１１】
該方法にて用いられる好ましい哺乳動物は、トランスジェニックｍｄｒ１ａ−／−ノックアウトマウスであり、さらにいっそう好ましくはトランスジェニックマウス系統ＦＶＢ．１２９Ｐ２−Ｐｇｙ３ｔｍ１Ｎ７である。しかしながら、ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない任意の哺乳動物を用いてもよい。これには、ｍｄｒ１ａ遺伝子の両方の対立遺伝子またはそのプロモーターにおける自然発生的な変異を伴う哺乳動物が含まれてもよい。これにはまた、哺乳動物においてｍｄｒ１ａ遺伝子の発現を阻害する化合物で処理された野生型哺乳動物も含まれてよく、該化合物とは、例えば、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ阻害剤、療法量以下の用量のマイトマイシンＣ、あるいは、選択した哺乳動物におけるｍｄｒ１ａオルソログに特異的な、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、または、ｍｄｒ１ａ遺伝子もしくはｍＲＮＡの転写または翻訳に干渉する他の分子である。あるいは、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している選択した哺乳動物は、例えば、哺乳動物においてｍｄｒ１ａ遺伝子産物を効果的に阻害する化合物で処理することによって、例えば、ＭＤＲ阻害剤として同定された化合物（単数または複数）で処理することによって、あるいは、ｍｄｒ１ａに特異的な遮断抗体によって、ｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されるならば、モデルにおいて用いてもよい。ＭＤＲを阻害するための種々の化合物及びメカニズムについて、最近概説された（Ｃ．Ａｖｅｎｄａｎｏ及びＪ．Ｃ．Ｍｅｎｅｎｄｅｚ（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９，１５９−１９３）。
【００１２】
本発明の別の側面は、候補化合物を、ＩＢＤの症状の改善におけるその有効性についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） ビヒクル中の候補化合物を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に投与すること；
（ｂ） 候補化合物を含まないビヒクルを、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に投与すること；及び、
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状を比較すること、ここで、（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）と比較した、（ａ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の減少は、化合物の有効性を示す；
を含む、前記方法である。
【００１３】
本発明のさらなる側面は、候補化合物を、ＩＢＤの発現の予防または遅延におけるその有効性についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） ビヒクル中の候補化合物を、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｂ） 候補化合物を含まないビヒクルを、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝すこと；及び、
（ｄ） 動物におけるＩＢＤの任意の症状の発症を比較すること、ここで、候補化合物を含まないビヒクルで治療された哺乳動物（単数または複数）と比較した、ビヒクル中の候補化合物で治療された哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の発症の遅延または予防は、化合物の有効性を示す；
を含む、前記方法である。
【００１４】
本発明のさらなる別の側面は、ＩＢＤの病因に関与する可能性があり、それゆえにＩＢＤの治療用薬物開発に対する新規の標的である可能性のある、遺伝子についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝すこと；
（ｂ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理していない飲料水のみを供給し、かつ他に高塩素濃度を供給しないことによって、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｃ） ＲＮＡ調製物を、（ａ）及び（ｂ）の双方の哺乳動物から得た腸より、所望の時間間隔の後に作ること；及び、
（ｄ） ＲＮＡ試料を比較すること、ここで、これらの試料において差を示すＲＮＡは、ＩＢＤの病因に関わる可能性のある遺伝子を示す；
を含む、前記方法である。
【００１５】
本発明のさらなる側面は、ＩＢＤの病因に関与する可能性のある遺伝子についてスクリーニングする方法であって、以下の工程；
（ａ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝すこと；
（ｂ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している第二の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理した飲料水として供給される、高塩素濃度に曝すこと；
（ｃ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第三の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理していない飲料水のみを供給し、かつ他に高塩素濃度を供給しないことによって、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｄ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している第四の非ヒト哺乳動物を、好ましくは塩素処理していない飲料水のみを供給し、かつ他に高塩素濃度を供給しないことによって、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｅ） ＲＮＡ調製物を、（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの哺乳動物から得た腸より、所望の時間間隔の後に作ること；及び、
（ｆ） ＲＮＡ試料を比較すること、ここで、（ａ）と（ｃ）の試料間で差を示すが、しかし（ｂ）と（ｄ）の試料間では同様な差を示さないＲＮＡは、ＩＢＤの病因に関わる可能性のある遺伝子を示す；
を含む、前記方法である。
【００１６】
上記のＲＮＡ試料の比較は、発現プロファイリングによって、好ましくはディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲまたはサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション法によって、さらにいっそう好ましくはマイクロアレイ解析によって、実施することが可能である。
【００１７】
上記の方法において用いられる好ましい哺乳動物は、トランスジェニックｍｄｒ１ａ−／−ノックアウトマウスであり、さらにいっそう好ましくはトランスジェニックマウス系統ＦＶＢ．１２９Ｐ２−Ｐｇｙ３ｔｍ１Ｎ７である。
【００１８】
本発明の別の側面は、上記のように同定された任意の候補遺伝子のヒトホモログを同定することである。これは、哺乳動物の候補遺伝子をプローブとして用いて、適切なヒト腸管組織由来のヒトｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした後に、陽性クローンの配列解析を行うことによって、実施することが可能であり；また、例えばＮＣＢＩウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html）上で利用可能なＧｅｎｂａｎｋ（Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０，１７−２０（２００２年））などのデータベースを、哺乳動物の候補遺伝子の配列を用いて検索することによっても行うことが可能である。他の有用なデータベースは、同様に国際ヌクレオチド配列データベース協力の一部であるＥＭＢＬ及びＤＤＢＪである。これらの方法及びデータベースは、当業者に周知である。データベースを検索するための好ましい方法は、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２）であろうが、しかし、Ｆａｓｔａなどの当業者に周知の他の方法を用いることも可能である。検索に用いられる哺乳動物配列に最も類似したヒト配列は、たいていの場合は候補遺伝子のヒトホモログであろう。次いで、当業者は、候補遺伝子のヒトホモログの全長ｃＤＮＡを、例えばｃＤＮＡライブラリのスクリーニングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によってクローニングし、そして、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編集（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバー研究所プレス、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国、またはＡｕｓｕｂｅｌら編集（１９９０年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ジョンワイリー・アンド・サンズ・Ｉｎｃ．、またはその改訂版、あるいは他の同様な一般的な教科書において記載されているような方法に従って、適切な発現系にてそれを発現させることが、可能であろう。
【００１９】
本発明のさらなる側面は、組成物を調製する方法であって、以下；
（ａ） 以下の工程：
（ｉ） ビヒクル中の候補化合物を、好ましくは塩素処理した飲料水を供給することによって高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に投与すること；
（ｉｉ） 候補化合物を含まないビヒクルを、好ましくは塩素処理した飲料水を供給することによって高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与すること；及び、
（ｉｉｉ） （ｉ）及び（ｉｉ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状を比較すること、ここで、（ｉｉ）の哺乳動物（単数または複数）と比較した、（ｉ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の減少は、化合物の有効性を示す；
を含む方法によって、ＩＢＤの症状を改善することが可能な化合物を同定すること；ならびに、
（ｂ） 前記化合物をキャリアーと混合すること；
を含む、前記方法である。
【００２０】
さらに、本発明のさらなる側面は、組成物を調製する方法であって、以下：
（ａ） 以下の工程：
（ｉ） ビヒクル中の候補化合物を、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｉｉ） 候補化合物を含まないビヒクルを、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｉｉｉ） （ｉ）及び（ｉｉ）の哺乳動物（単数または複数）を、好ましくは塩素処理した飲料水を供給することによって、高塩素濃度に曝すこと；及び、
（ｉｖ） 動物におけるＩＢＤの任意の症状の発症を比較すること、ここで、候補化合物を含まないビヒクルで治療された哺乳動物（単数または複数）と比較した、ビヒクル中の候補化合物で治療された哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の発症の遅延または予防は、化合物の有効性を示す；
を含む方法によって、ＩＢＤの発現を予防または遅延することが可能な化合物を同定すること；ならびに、
（ｂ） 前記化合物をキャリアーと混合すること；
を含む、前記方法である。
【実施例】
【００２１】
実施例は、例示を目的として含まれており、かつ本発明の範囲を限定することを目的としない。参照したがしかし本明細書にて明確に記載されていない一般的な方法は、科学文献にて報告されており、そして当業者に周知である。
（実施例１：ＩＢＤの動物モデルとしてのｍｄｒ１ａ−／−マウス）
材料及び方法
動物
４０例の雄性ｍｄｒ１ａ−／−マウス（ＦＶＢ．１２９Ｐ２−Ｐｇｙ３ｔｍ１Ｎ７系統）及び、同じ遺伝的背景（ＦＶＢ；ＦＶＢ／ＮＴａｃ系統）の６例の雄性対照マウス（ｍｄｒ１ａ＋／＋）（６〜８週齢）を、タコニック・ファームズ社（米国）より入手した。マウスを、加圧滅菌したバンティン・アンド・キングマン社（英国）のビー・ケイ床敷きを含有する硬い底のケージに、１例ずつ入れ、Ｅｎｖｉｒｏｄｒｉ社の、脱臭化学物質を含まない白紙でできている巣作り用の紙を、質の向上を提供するために加えた。マウスには、ラット及びマウス用第１番維持食餌（ＲＭＩ（Ｅ）ＳＱＣ）（スペシャル・ダイエット・サービスイズ社、ウィザム、エセックス州、英国）を、ファイザー社に到着次第、食べさせた。本試験のために、我々は、容器入りの水及びＫｌｏｒｔａｂ（５ｐｐｍ）（アローマイト・バイオサイエンスイズ社、英国）を、水に病原菌の拡散を生じる可能性を除去するために、そして一定レベルの塩素を伴う水の供給を提供するために、用いた。水は週２回替えた。本試験は、英国の法律にしたがって実施され、そしてファイザー社の内部倫理審査過程によって承認された。
試験デザイン及び投薬
試験の開始に先立ち、すべてのマウス（ｍｄｒ１ａ−／− ４０例及びｍｄｒ１ａ＋／＋ ６例）を１４日間馴化させた。パイロット試験（Ｂａｎｎｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（２００１年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０，Ａ６９３）より、体重及び軟便スコアは、胃腸炎を最も予測するものであることが見いだされ、それゆえに、本試験においてこれらの臨床徴候をモニターした。異なる臨床徴候に対して異なる重みづけをしたスコアリングシステムを考案した（表１）。その意図は、スコアに大腸炎の重症度を反映させことであった。
【００２２】
【表１】
【００２３】
馴化期間の後に、軽度〜中等度（軽度の疾患（０〜３）を、体重増加なしまたは軽度の体重減少（＜０．５ｇ）かつ他の症状なしと定義し、一方、中等度の疾患（４〜１０）を、前群と同様な症状であるがしかし軟便またはより大きな体重減少（＞２０％）を伴うものと定義した）の疾患スコアのｍｄｒ１ａ−／−マウスを４群に無作為化し、そしてビヒクル（水、ｎ＝８）またはデキサメタゾン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９；０．３ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８、または２ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）を１日１回７日間皮下（ｓ．ｃ．）投与した。６例のｍｄｒ１ａ＋／＋マウスには、ビヒクル（水）を投与した。試験期間中、０．３ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン治療群のマウス１例が死亡して発見され、そして２例を屠殺した（ビヒクル治療群１例、及び０．０５ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン治療群１例）。試験終了時に、すべてのマウスを屠殺した。各マウスの結腸及び盲腸を取り出し、そして秤量した。次いで、各結腸を、一方の切片を組織学的解析用に、そして他方の切片をサイトカイン測定用に処理可能なように、縦方向に分割した（以下を参照されたい）。
サイトカイン及びタンパク質の測定
各個々の結腸試料を、氷冷クレブス液（シグマ・ケミカル・Ｃｏ．、英国）３ｍｌ中で、４℃にて３０秒間、３回ホモジナイズした。試料を３５，０００ｇ（４℃）にて１５分間遠心分離し、そして上清を除去した。次いで、ＩＬ−８及びＩＦＮ−γレベルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社、英国）で測定した。これらのキットの検出限界は、３１．２〜２０００ｐｇ／ｍｌであった。上清中のタンパク質レベルを、Ｂｒａｄｆｏｒｄによって記載された方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６年）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４）を用いて、ブラッドフォード試薬（シグマ社）を利用して定量した。
組織学的解析
動物を剖検した。結腸／直腸及び盲腸を秤量し、そして結腸／直腸、盲腸、回腸、空腸、十二指腸、胃、腸間膜リンパ節、胸腺、腎臓、脾臓を採取し、そして１０％緩衝ホルマリン溶液中で固定化した。結腸／直腸及び回腸を、その縦方向の切片全体を１つのスライドで評価するために、「スイスロール」技術（Ｍｏｏｌｅｎｂｅｅｋ，Ｃ．及びＲｕｉｔｅｎｂｅｒｇ Ｅ．Ｊ．（１９８１年）Ｌａｂ Ａｎｉｍ １５（１）：５７−９）にて調製した。組織を、自動組織処理装置にて所定の手順で処理し、パラフィン中に埋め込み、４〜６μｍに切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）で染色し、そして組織学的検査を行った。大腸炎は、盲検化された観察者によって、所見の程度及び粘膜変化の重症度に応じて、０（有意な所見なし）〜４（重度の増殖性及び潰瘍性炎症）（表２）に、類別された。加えて、全結腸／直腸の粘膜の高さを、標準的な相互マイクロコンピュータ支援の画像解析システムを用いて、１００μｍ毎に評価した。
【００２４】
【表２】
【００２５】
大腸炎は、結腸の近位領域内で始まるように思われたが、ここがスコア１及び２において影響を受ける主な領域であったためである。変化の重症度が増加した場合（スコア３及び４）、病変は、結腸の中位及び遠位領域ならびに直腸においてより顕著であった。大腸炎は、固有層内の炎症細胞である、主にマクロファージ、リンパ球及び多核好中球の浸潤、ならびに粘膜肥厚によって、組織学的に特徴付けられた。腺窩の長さの増加、好塩基球増加及び腸上皮細胞の有糸分裂数の増加、杯細胞の減少、ならびに腸浮腫が認められた。スコア２ではほんの僅かの侵食がみられたが、一方、スコア３からは、正常構造の閉塞、表在性貫壁性潰瘍及び腺窩膿瘍がみられた。
病原体の解析
ヘリコバクター・ヘパティカス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）、ヘリコバクター・ビリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｂｉｌｉｓ）及びヘリコバクター・ローデンティウム（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）などの多くの病原体が、げっ歯類における胃腸炎の発現に関連している。したがって、三つの別個の技術を、糞便及び結腸試料におけるすべての公知のネズミ病原菌の有無を確認するのに用いた。二名の独立した共同研究者が、ＰＣＲを用いて糞便試料を解析した。結腸試料を、Ｗａｒｔｈｉｎ Ｓｔａｒｒｙ及びＦｉｔｅ Ｆａｒａｃｏ染色を用いた、電子顕微鏡観察及び組織学によって解析した。血清学的及び細菌学的試験もまた、ＦＥＬＡＳＡ推奨（ＦＥＬＡＳＡ作業部会の報告書（１９９６年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ３０，１９３−２０８、及び（１９９４年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ２８；１−１２）にしたがって実施した。
統計学的解析
データを、試験を完了した２９例のｍｄｒ１ａ−／−及び６例のｍｄｒ１ａ＋／＋マウスについて解析した。ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスとｍｄｒ１ａ＋／＋マウスとの差を、二標本ｔ−検定（ＩＦＮ−γ、馴化期間中の成長率及び最終体重に関しては等分散とみなし、そして、ＩＬ−８、結腸重量、盲腸重量、体重に対する結腸重量の割合、体重に対する盲腸重量の割合及び試験期間中の成長率に関しては不等分散とみなす）を用いて解析した。デキサメタゾン治療の影響を、処分群を考慮した分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて解析した。治療効果が有意であることが見いだされた場合には、次いで９５％信頼区間を算出した。
【００２６】
大腸炎重症度スコアは、０〜４のスケールに類別された順序カテゴリー指標である。この種類のデータは、一般に比例オッズモデルを用いて解析するが、しかし標本の大きさが小さいためこれは適切でなく、そしてＡＮＯＶＡを用いた。これは正規分散データを有するとの仮定を作るが、このことは、我々がカテゴリーデータを有しているにもかかわらず、およそ当てはまるようであった。すべての解析を、ウィンドウズ用Ｇｅｎｓｔａｔ ５ リリース４．２を用いて実施した。
結果
大腸炎の臨床徴候
成長率
馴化期間中の成長率に、ｍｄｒ１ａ−／−マウスとｍｄｒ１ａ＋／＋マウスとの間で統計学的に有意な差はなかった（０．２６５ｇ／日 ｖｓ．０．２９４ｇ／日）。しかしながら、試験期間中は、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスとｍｄｒ１ａ＋／＋マウスとの間で統計学的に有意な差があった。ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスの体重は増え続けたが、一方、ｍｄｒ１ａ−／−マウスの体重は減少した（表３）。加えて、試験終了時に、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスは、ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスよりも有意に軽かった（表３）。デキサメタゾン治療は、用いたいずれの用量においても、成長率にも最終体重にも有意な影響がなかった（表３）。
【００２７】
【表３】
【００２８】
臨床スコア
デキサメタゾンは、全体的な大腸炎の臨床スコアに影響しなかった（上記の表３を参照されたい）。
大腸炎の肉眼的証拠
結腸及び盲腸重量
結腸重量（６９１±６９ ｖｓ．３２５±２６ｍｇ）及び盲腸重量（２１１±１２ ｖｓ．１６５±６ｍｇ）の有意な増加が、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスと対比して認められた。体重に対する結腸重量の割合（図１、平均±標準誤差を示す。白抜きのバーはｍｄｒ１ａ＋／＋マウスを表し、そして黒塗りのバーはｍｄｒ１ａ−／−マウスを表す。＊０ｍｇ／ｋｇ ｍｄｒ１ａ−／−群と比較して、統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５））及び体重に対する盲腸重量の割合（図２；平均±標準誤差を示す。白抜きのバーはｍｄｒ１ａ＋／＋マウスを表し、そして黒塗りのバーはｍｄｒ１ａ−／−マウスを表す。＊０ｍｇ／ｋｇ ｍｄｒ１ａ−／−群と比較して、統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）。＊＊０ｍｇ／ｋｇ ｍｄｒ１ａ−／−群と比較して、統計学的に有意な差（ｐ＜０．０１）。）もまた、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスと対比して有意に高く、それぞれ、３．０±０．３１ ｖｓ．１．２±０．０８及び０．９±０．０５ ｖｓ．０．６±０．０２であった。デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ、皮下、１日１回７日間）は、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスと対比して、結腸絶対重量（４５６±４８ ｖｓ．６９１±５２ｍｇ；Ｐ＜０．０１）及び体重に対する結腸重量の割合（２．１±０．２６ ｖｓ．３．０±０．２８、Ｐ＝０．０１７）を低下させたが、一方、低用量のデキサメタゾンでは、有意な影響がなかった（図２）。検定したすべての用量のデキサメタゾンは、盲腸絶対重量（ｐ＜０．０１）及び体重に対する盲腸重量の割合（ｐ＜０．０１５）を、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスと比べて低下させた。
３．大腸炎の顕微鏡的証拠
サイトカインレベル
ＩＬ−８（ｐ＝０．０２８）及びＩＦＮ−γ（ｐ＜０．０１）レベルは、ビヒクル治療ｍｄｒ１ａ−／−マウスから得た、ホモジナイズした結腸において、ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスと対比して有意に高かった。しかしながら、デキサメタゾンでの治療は、いずれのサイトカインレベルにも、用いたいずれの用量においても影響がなかった（表４）。
【００２９】
【表４】
【００３０】
組織学的な類別
ｍｄｒ１ａ＋／＋マウスから得た結腸は、正常なようにみえた。対照的に、ｍｄｒ１ａ−／−マウスから得た結腸は、ヒトＩＢＤにおいて認められるものと同様な病変によって特徴付けられた。特に、粘膜の有意な肥厚を伴う重度の自然発症的な結腸の炎症は、時折の腺窩膿瘍、腺窩の長さの増加、及び粘膜を介して筋肉（筋層）へと広がる潰瘍とともに、みられた。加えて、上皮細胞の増殖調節異常が、炎症細胞の固有層への浸潤とともに認められた。デキサメタゾンの用量が増加するにつれて、大腸炎の重症度スコアが減少する傾向にあった。治療群の平均値間に、統計学的に有意な全体的な差（ｐ＞０．１０）はなかったが、しかしデキサメタゾンの最高用量（２ｍｇ／ｋｇ）では、ビヒクル群と比べて大腸炎の重症度スコアが有意に減少するとの証拠がいくらかあった（表５）。
【００３１】
【表５】
【００３２】
形態計測による評価
粘膜の高さの形態計測による評価は、組織学的な評価に一致した。スコア０と比較した場合、粘膜の高さの変化は、スコア１及び２（最小限〜軽度で、主に結腸の近位領域にみられた）で、ならびに、スコア３及び４（顕著〜重度で、結腸の中位及び遠位領域ならびに直腸においてより顕著（図３；凡例は、０〜４の大腸炎重症度スコアを示す（詳しくは表２を参照されたい））で、近接していた。また注目すべきは、大腸炎重症度スコアの増加に応じた結腸／直腸の長さの減少であり、これは大腸炎の古典的な所見である。
病理
ヘリコバクター属（ヘリコバクター・ビリス、ヘパティカス、及び全種）が存在しないことを、ＰＣＲ、電子顕微鏡及び組織染色によって確認した。シトロバクター・ローデンティウム（ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）（大腸過形成に関連する細菌）を含む他の公知の病原菌が存在しないことを、細菌学的及び血清学的解析によって確認した。要約すると、マウスには、ＦＥＬＡＳＡ推奨（ＦＥＬＡＳＡ作業部会の報告書（１９９６年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ３０，１９３−２０８、及び（１９９４年）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ２８；１−１２）において特定されるような、病原性であることが公知のウイルス、細菌及び寄生虫は存在しなかった。
（実施例２：対照試験）
他の点では同一の遺伝的背景である１６例のｍｄｒ１ａ−／−マウス及び１６例のｍｄｒ１ａ＋／＋マウスを、塩素処理していない飲料水で馴化させる。次いで、動物を以下の表（表６）：
【００３３】
【表６】
【００３４】
に示すような群に分ける。
次いで、マウスを軟便及び体重増加なしに関して５週間までモニターする。
重度のＩＢＤ様症状が、第４群のみに認められる。
（実施例３：ＩＢＤ治療用の化合物）
４０例のｍｄｒ１ａ−／−マウスを馴化させ、次いで、５ｐｐｍの塩素処理した飲料水を２日間与える。次いで、それらを４群：
１０例の動物：ビヒクルのみを投与
１０例の動物：試験化合物０．０５ｍｇ／ｋｇを投与
１０例の動物：試験化合物０．５ｍｇ／ｋｇを投与
１０例の動物：試験化合物５ｍｇ／ｋｇを投与
に分ける。
【００３５】
ＩＢＤの症状を、実施例１において記載した方法の一つを用いて、３〜４週間モニターする。用量相関性の有意な改善が、試験化合物で治療される動物において、ビヒクルのみを与えられる動物と比べて認められるならば、試験化合物は、ＩＢＤの治療に有望であると考えられる。
（実施例４：ＩＢＤの予防）
４０例のｍｄｒ１ａ−／−マウスを２日間馴化させ、その間塩素処理していない飲料水を与える。次いで、それらを４群：
１０例の動物：ビヒクルのみを投与
１０例の動物：試験化合物０．０５ｍｇ／ｋｇを投与
１０例の動物：試験化合物０．５ｍｇ／ｋｇを投与
１０例の動物：試験化合物５ｍｇ／ｋｇを投与
に分ける。
【００３６】
次の日に、動物に塩素処理した（５ｐｐｍ）飲料水を供給する。次いで、動物を、ＩＢＤ様症状の発症に関してモニターする。
症状の発症の用量相関性の有意な減少または遅延が、試験化合物で治療される動物において、ビヒクルのみを与えられる動物と比べて認められるならば、試験化合物は、ＩＢＤの予防に有望であると考えられる。
（実施例５：ｍｄｒ１ａ−／−マウス及び野生型（ＦＶＢ）マウスから得た結腸における遺伝子発現の変化の比較、ならびにこれらの変化に対するデキサメタゾンの影響）
本試験の目的は、野生型（ＦＶＢ）マウス及びｍｄｒ１ａ−／−マウスから得た結腸における遺伝子発現の変化を比較し、そしてこれらの変化に対するデキサメタゾンの影響を検討することである。
【００３７】
雄性ＦＶＢ野生型及びｍｄｒ１ａ−／−マウス（９〜１０週齢）に、デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）またはビヒクル（水）を１日１回７日間投与した。マウスを処分し、そして結腸を組織学的評価のために取り出した。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ及びＲＮｅａｓｙの修正プロトコールを用いて各群のドナー１例より精製し、１．９を超えるＡ２６０／Ａ２８０純度で、５０μｇ ＲＮＡ／試料を超えて得た。
【００３８】
手順は、アフィメトリクス社マニュアルにしたがって行った。各試料につき１０μｇの総ＲＮＡを、二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡに逆転写した。ｄｓｃＤＮＡの半分を、ビオチン化ヌクレオチドの存在下でＩｎ Ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）した。２５μｇのＩＶＴ産物を断片化し、そして約１５μｇをハイブリダイゼーションカクテル中で用い、テスト２チップに、次いでＵ７４Ａチップにハイブリダイズさせた（アフィメトリクス社マニュアルａ．ｆ．１，７３０７−１を参照されたい）。
【００３９】
ＲＮＡの品質及びハイブリダイゼーションシグナルは、すべての試料において良好であった。マウスＵ７４Ａデータを、３００に正規化した。プローブ（〜遺伝子）の総数は、１２，６３９である。
【００４０】
データの解析によって、ｍｄｒ１ａ−／−マウスが、例えば、補体成分、ＭＨＣ分子、白血球マーカー（白血球の組織への浸潤を示す）、サイトカイン、ケモカイン、インテグリン、シクロオキシゲナーゼ−２、ならびにＴＮＦファミリー分子及びリガンドなどの炎症マーカーの亢進によって示されるような炎症の増加の明らかな証拠を示すほかに、例えば、メタロプロテイナーゼ発現の亢進によって示されるような組織破壊の証拠を示すことが、示された。また、ホスホリパーゼＡ２（約１２ｘ 亢進）、または誘導性一酸化窒素合成酵素（約５ｘ 亢進）などの、ＩＢＤに対する公知の薬物の標的が、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて明らかに亢進することも、対照動物と比較して示された。このことは、ＩＢＤに対する効果的な治療の同定を助けるであろう新たな薬物の標的を同定するための方法が適当であることを、明らかに示す。
【００４１】
候補となる薬物の標的は、例えば、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて亢進し、そしてデキサメタゾン治療によって正常レベル近くまで低下する遺伝子である。
診断、ならびに疾患状態、進行及び療法の成功の評価に有用な、候補のバイオマーカーもまた、このような実験によって同定することが可能であり；例えば、我々は、インターロイキン−１β（６１倍亢進）、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ−３；２９倍亢進）またはグランザイムＢ（６倍亢進）などのＩＢＤに対する公知のマーカーが、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、対照動物と比較して亢進することを見いだした。それゆえ、この実験において同じ制御パターンを示す他の遺伝子もまた、ＩＢＤに対する候補のバイオマーカーまたは診断ツールである。
（実施例６：塩素処理した飲料水に切り替えた後の、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおける遺伝子発現の、野生型マウスと比較した経時変化）
ＩＢＤの病因に関与する遺伝子を同定するために、ＦＶＢ野生型マウスと比較した、ｍｄｒ１ａ−／−マウスの結腸における遺伝子発現の変化を、マウスを塩素処理した飲料水に切り替えた後に、経時的に試験する。
【００４２】
雄性マウス（９〜１０週齢）（野生型及びｍｄｒ１ａ−／−マウスで同数）を馴化させ、２日間、塩素処理していない飲料水を与える。次いで、水を、塩素処理した飲料水（５ｐｐｍ）に替え、そして、塩素処理した水を飲み始める直前及び飲み始めた後の種々の時点において、各群のマウスを並行して処分し、そして結腸を組織学的評価及びＲＮＡ単離のために取り出す。適切な時点は、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間であろう。
【００４３】
発現プロファイリングを、先の実施例に記載したように実施する。
ＩＢＤの病因に関与する候補である遺伝子は、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおける発現は変わるがしかし野生型マウスにおいては変わらない（かまたは同程度ではない）ものである。水の供給を切り替えた後すぐに変化する遺伝子は、これらが疾患の発症に関与している可能性があり、そして、これらを阻害することで疾患の発症を予防する可能性があるため、特に興味深い。
【００４４】
あるいは、疾患の進行または治療の成功を評価するのに有用な、ＩＢＤに対するバイオマーカーの候補である遺伝子もまた、本実験によって同定することが可能である。例えば、このような遺伝子は、血清中に見つけられるタンパク質をコードする可能性があり、そして有用なバイオマーカーは、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、野生型マウスと比較して亢進または低下する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおける、体重に対する結腸重量の割合に及ぼすデキサメタゾンの影響（平均±標準誤差）。
【図２】ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおける、体重に対する盲腸重量の割合に及ぼすデキサメタゾンの影響（平均±標準誤差）。
【図３】全結腸／直腸にわたった、結腸／直腸の粘膜の高さ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてＩＢＤ様症状を誘導する方法であって、ここで哺乳動物は、（ｉ）機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない非ヒト哺乳動物であり、そして（ｉｉ）高塩素濃度に曝される、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物を、ｍｄｒ１ａ遺伝子産物の阻害剤で処理し、そして高塩素濃度に曝す、哺乳動物においてＩＢＤ様症状を誘導する方法。
【請求項３】
高塩素濃度を、塩素処理した飲料水を供給することによって哺乳動物に投与する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
飲料水中の塩素濃度が１ｐｐｍを超える、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
飲料水中の塩素濃度が３ｐｐｍを超える、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
飲料水中の塩素濃度が５ｐｐｍまたはそれを超える、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物がトランスジェニックｍｄｒ１ａ−／−ノックアウトマウスである、請求項１、請求項３、請求項４、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＩＢＤ様症状が１００％近くの哺乳動物に生じる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
候補化合物を、ＩＢＤの症状の改善におけるその有効性についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） ビヒクル中の候補化合物を、高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に投与すること；
（ｂ） 候補化合物を含まないビヒクルを、高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に投与すること；及び、
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状を比較すること、ここで、（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）と比較した、（ａ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の減少は、化合物の有効性を示す；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
候補化合物を、ＩＢＤの発現の予防または遅延におけるその有効性についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） ビヒクル中の候補化合物を、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｂ） 候補化合物を含まないビヒクルを、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）を、高塩素濃度に曝すこと；及び、
（ｄ） 動物におけるＩＢＤの任意の症状の発症を比較すること、ここで、候補化合物を含まないビヒクルで治療された哺乳動物（単数または複数）と比較した、ビヒクル中の候補化合物で治療された哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の発症の遅延または予防は、化合物の有効性を示す；
を含む、前記方法。
【請求項１１】
ＩＢＤの病因に関与する可能性のある遺伝子についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝すこと；
（ｂ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｃ） ＲＮＡ調製物を、（ａ）及び（ｂ）の双方の哺乳動物から得た腸より、所望の時間間隔の後に作ること；及び、
（ｄ） ＲＮＡ試料を比較すること、ここで、これらの試料において差を示すＲＮＡは、ＩＢＤの病因に関わる可能性のある遺伝子を示す；
を含む、前記方法。
【請求項１２】
ＩＢＤの病因に関与する可能性のある遺伝子についてスクリーニングする方法であって、以下の工程；
（ａ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝すこと；
（ｂ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している第二の非ヒト哺乳動物を、塩素濃度に曝すこと；
（ｃ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第三の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｄ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している第四の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｅ） ＲＮＡ調製物を、（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの哺乳動物から得た腸より、所望の時間間隔の後に作ること；及び、
（ｆ） ＲＮＡ試料を比較すること、ここで、（ａ）と（ｃ）の試料間で差を示すが、しかし（ｂ）と（ｄ）の試料間では同様な差を示さないＲＮＡは、ＩＢＤの病因に関わる可能性のある遺伝子を示す；
を含む、前記方法。
【請求項１３】
ＲＮＡ試料を発現プロファイリングによって比較する、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
発現プロファイリングをマイクロアレイ解析によって行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
同定された遺伝子のヒトホモログを同定する工程をさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
組成物の調製方法であって、
（ａ） 請求項９に記載の方法によって、ＩＢＤ症状を改善することが可能な化合物を同定すること；及び、
（ｂ） 前記化合物をキャリアーと混合すること；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
組成物の調製方法であって、
（ａ） 請求項１０に記載の方法によって、ＩＢＤの発現を予防または遅延させることが可能な化合物を同定すること；及び、
（ｂ） 前記化合物をキャリアーと混合すること；
を含む、前記方法。
【請求項１８】
高塩素濃度を、請求項３〜６に記載の塩素処理した飲料水を介して供給する、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物を高塩素濃度に曝さないことを、塩素処理していない飲料水のみを哺乳動物に供給し、かつ他に高塩素濃度を哺乳動物に供給しないことによって実施する、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
哺乳動物においてＩＢＤ様症状を誘導する方法であって、ここで哺乳動物は、（ｉ）機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない非ヒト哺乳動物であり、そして（ｉｉ）高塩素濃度に曝される、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物を、ｍｄｒ１ａ遺伝子産物の阻害剤で処理し、そして高塩素濃度に曝す、哺乳動物においてＩＢＤ様症状を誘導する方法。
【請求項３】
高塩素濃度を、塩素処理した飲料水を供給することによって哺乳動物に投与する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
飲料水中の塩素濃度が１ｐｐｍを超える、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
飲料水中の塩素濃度が３ｐｐｍを超える、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
飲料水中の塩素濃度が５ｐｐｍまたはそれを超える、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物がトランスジェニックｍｄｒ１ａ−／−ノックアウトマウスである、請求項１、請求項３、請求項４、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＩＢＤ様症状が１００％近くの哺乳動物に生じる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
候補化合物を、ＩＢＤの症状の改善におけるその有効性についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） ビヒクル中の候補化合物を、高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に投与すること；
（ｂ） 候補化合物を含まないビヒクルを、高塩素濃度に曝された、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に投与すること；及び、
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状を比較すること、ここで、（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）と比較した、（ａ）の哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の減少は、化合物の有効性を示す；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
候補化合物を、ＩＢＤの発現の予防または遅延におけるその有効性についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） ビヒクル中の候補化合物を、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｂ） 候補化合物を含まないビヒクルを、機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物に、前記哺乳動物において疾患が発症する前に投与すること；
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の哺乳動物（単数または複数）を、高塩素濃度に曝すこと；及び、
（ｄ） 動物におけるＩＢＤの任意の症状の発症を比較すること、ここで、候補化合物を含まないビヒクルで治療された哺乳動物（単数または複数）と比較した、ビヒクル中の候補化合物で治療された哺乳動物（単数または複数）におけるＩＢＤの症状の発症の遅延または予防は、化合物の有効性を示す；
を含む、前記方法。
【請求項１１】
ＩＢＤの病因に関与する可能性のある遺伝子についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝すこと；
（ｂ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第二の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｃ） ＲＮＡ調製物を、（ａ）及び（ｂ）の双方の哺乳動物から得た腸より、所望の時間間隔の後に作ること；及び、
（ｄ） ＲＮＡ試料を比較すること、ここで、これらの試料において差を示すＲＮＡは、ＩＢＤの病因に関わる可能性のある遺伝子を示す；
を含む、前記方法。
【請求項１２】
ＩＢＤの病因に関与する可能性のある遺伝子についてスクリーニングする方法であって、以下の工程；
（ａ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第一の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝すこと；
（ｂ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している第二の非ヒト哺乳動物を、塩素濃度に曝すこと；
（ｃ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現していない（またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物が効果的に阻害されているか、またはｍｄｒ１ａ遺伝子産物の発現が効果的に阻害されている）第三の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｄ） 機能的ｍｄｒ１ａ遺伝子産物を発現している第四の非ヒト哺乳動物を、高塩素濃度に曝さないこと；
（ｅ） ＲＮＡ調製物を、（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの哺乳動物から得た腸より、所望の時間間隔の後に作ること；及び、
（ｆ） ＲＮＡ試料を比較すること、ここで、（ａ）と（ｃ）の試料間で差を示すが、しかし（ｂ）と（ｄ）の試料間では同様な差を示さないＲＮＡは、ＩＢＤの病因に関わる可能性のある遺伝子を示す；
を含む、前記方法。
【請求項１３】
ＲＮＡ試料を発現プロファイリングによって比較する、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
発現プロファイリングをマイクロアレイ解析によって行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
同定された遺伝子のヒトホモログを同定する工程をさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
組成物の調製方法であって、
（ａ） 請求項９に記載の方法によって、ＩＢＤ症状を改善することが可能な化合物を同定すること；及び、
（ｂ） 前記化合物をキャリアーと混合すること；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
組成物の調製方法であって、
（ａ） 請求項１０に記載の方法によって、ＩＢＤの発現を予防または遅延させることが可能な化合物を同定すること；及び、
（ｂ） 前記化合物をキャリアーと混合すること；
を含む、前記方法。
【請求項１８】
高塩素濃度を、請求項３〜６に記載の塩素処理した飲料水を介して供給する、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物を高塩素濃度に曝さないことを、塩素処理していない飲料水のみを哺乳動物に供給し、かつ他に高塩素濃度を哺乳動物に供給しないことによって実施する、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５２０１９２（Ｐ２００６−５２０１９２Ａ）
【公表日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２４１０（Ｐ２００６−５０２４１０）
【出願日】平成１６年２月３日（２００４．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００３１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７１１８６
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
ウィンドウズ
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月３日（２００４．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００３１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７１１８６
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
ウィンドウズ
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]