炎症性腸疾患の診断、病期分類、及び監視
胃腸粘膜試料又は胃腸粘膜を排出するセンチネルリンパ節由来の試料において活動性と不活動性のＩＢＤを識別する方法であって、試料から単一細胞の懸濁液を調製するステップと；懸濁液を、直接標識された蛍光ＤＣ６９抗体を用いてＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の炎症活性化マーカーＣＤ６９の発現について分析するステップと；試料中のＤＣ６９を発現しているヘルパーＴ細胞の数を、対応する健常個体の試料から得られる数と比較するステップとを含み、ＣＤＤ６９を発現しているヘルパーＴ細胞のレベルの有意な増大が活動性ＩＢＤの存在を表し、ヘルパーＴ細胞の有意な増大レベルが低いことが不活動性ＩＢＤの存在を表す方法。また、潰瘍性大腸（ＵＣ）とクローン病（ＣＤ）を識別する方法、ＵＣ及びＣＤを検出する方法、並びにＩＢＤ患者のステロイド治療に対する感受性を決定する方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、炎症性腸疾患の診断、病期分類、及び監視に関する。
【０００２】
［発明の背景］
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含み、両方とも腸に長期にわたる損傷を引き起こす。近年、ＩＢＤには、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、及びリンパ球性大腸炎も含まれている。外来抗原、免疫反応障害、及び遺伝要因の組合せがＩＢＤの病因となっているようであるが、腸炎の発生機序には不明な点が残っている（１）。今までのところ、例えば、腸へのＣＭＶ感染（２）及び持続性麻疹ウイルス感染（３）に由来する抗原等の、多くの可能性のある抗原が提唱されている。
【０００３】
腸間膜リンパ節は、腸の内容物を排出するものであるが、これがＩＢＤにおける炎症の発生及び維持にとって重要な部位である可能性が最も高い。炎症を誘発する抗原は、免疫系への提示のために、腸壁からリンパ節に能動的に輸送される（１、４）。腸の排出病理領域である、第１リンパ節を同定する技術、及び手術中にこれらの節を回収する技術が開発されてきた（５）。本発明は、細胞表面のマーカー発現及びｍＲＮＡ発現アレイプロファイリングに基づいて、様々なＩＢＤの診断及び病期分類を表すために構築されたアッセイを開示する。これらのパターンは、腸炎の種類及び活動性に関連し、それ故、療法に対する応答を含む、疾患活動性の診断、病期分類、及び監視に有用である。
【０００４】
スウェーデンでは、毎年１４００人が新たにＩＢＤであると診断される。新たに診断される人の数は、近年増加している。ＩＢＤ発生率のピークは、２０歳である（６、７）。腸は、免疫担当細胞が広範な内因性及び外因性因子と出会う複雑な微環境である。これらの相互作用は、固有層におけるＴ細胞の豊富さが反映される、連続的で悪性度の低い炎症を生じる（８）。Ｔ細胞は、常時、有害な病原体に対しては作用することができるが、無害な食餌性抗原又は正常な常在性細菌叢のメンバーは無視する。腸免疫系の耐性と反応との間の平衡が崩れたとき、結果的にＩＢＤになることがある。
【０００５】
ＣＤ及びＵＣはＩＢＤの２つの主要な形である。ＣＤでは、腸のいずれの部分が罹患する場合もあるが、最も一般的なのは回盲領域（５０％）及び結腸（３０％）の罹患である。患者の約３分の１が、随伴性肛門周囲疾患も有している。小腸のいくつかの小区画が罹患する場合もあり、しばしば区域性病変として知られている。組織病理学的に、炎症は貫壁性であり、肉芽腫のリンパ球及びマクロファージの密度の濃い浸潤が、患者の最大６０％に見られる。ＵＣは通常直腸が関与し、近位方向に伸長し、この伸長は個々の患者間で変動するが、疾患は常に結腸に限定されたままである。全結腸炎という用語は、炎症に右結腸曲が関与するときにも用いられる。微視的には、粘膜炎症は表在性であり、リンパ球及び顆粒球が豊富である。潰瘍形成及び陰窩膿瘍が一般的である（１）。下痢（多くの場合、血液を含む）、栄養失調、発熱及び痛みのような長期の炎症に起因する症状とともに、患者はまた上皮異形成及び最終的には腸癌が発生する長期的なリスクを有する（９）。ＩＢＤ患者の約１５％が病型不定型大腸炎を有し、それ故ＣＤ又はＵＣの確定診断をすることができない。更により重要なことに、劇症大腸炎の患者の中には、診断に関して不確実性が存在する場合が多い。正確な診断は、早急に必要な内科治療、及び長期的展望では、最良の外科治療について決定するときに重要である。ＣＤの外科治療としては、炎症区画の切除、狭窄形成術による狭窄の治療、罹患区画の大腸切除、又は重篤な大腸炎の場合は結腸全摘及び回腸造瘻が挙げられる。ＣＤにおける再建手術は、腸の連続性を回復させるための回腸直腸吻合であることが多い。骨盤内パウチは、回腸直腸吻合領域における瘻孔形成に関連する合併症のリスクが高いため、ほとんど選択されない。一部の患者は、最後に永続的回腸造瘻を行う。ＵＣのため重篤な大腸炎の患者は、緊急処置として結腸切除及び回腸造瘻により治療される場合が多い。約６カ月後、回腸直腸吻合又は骨盤内パウチのいずれかを、確定した外科治療として選択することができるが、一部の例では永続的回腸造瘻のみが選択し得る解決法となることもある。
【０００６】
いくつかの証拠から、ＣＤは正常な腸管細菌叢に対する耐性の崩壊の結果であることが暗示されている。ヒトでは、患者の固有層の単核細胞は自己糞便抽出物に応答することが示されているが、これは正常にコントロールされている場合には当てはまらない（１０）。Ｔ細胞の刺激に対する抗原への依存性は、自己腸内細菌の超音波処理に対してＣＤ患者由来のリンパ球がインビトロで増殖したことが観察されたことから明らかであり、この場合増殖は抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体により阻害された（１１）。ＵＣに関して、微環境の役割はそれほど明確にはなっておらず、炎症は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）に依存すると考えられる自己免疫様病因、硬化性胆管炎のような自己免疫疾患との関連、自己抗体の発生頻度、及び大腸粘膜の特異性に基づくと思われる（１２）。仮説上、腸に対する免疫反応は、制御性Ｔ細胞の不十分な阻害作用の結果である可能性がある（１、４、１０）。
【０００７】
活動性ＵＣは、結腸粘膜内の活性化顆粒球、及び単球／マクロファージの湿潤を特徴とする。これらの浸潤細胞は、炎症促進性サイトカインの主な供給源である。ＩＢＤ患者は、内科治療に対して耐性が生じる場合がある。可能性のある原因は、顆粒球、サイトカイン、又はステロイド受容体の発現を含む免疫細胞の機能特性の分布変化である。
【０００８】
今日、ＩＢＤの診断及び病期分類は、内視鏡的基準及び組織病理学に加えて、臨床的パラメータ（アルブミン、ＳＲ、ＣＲＰ、発熱、便の数）の組合せに基づく。炎症活動性は、顕微鏡により評価されるが、生検に存在する一般的な型及び数の細胞しか考慮されない。活動特性は決定されない。
【０００９】
［発明の目的］
本発明の目的は、活動性と不活動性腸疾患（ＩＢＤ）を識別できる方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ＩＢＤ患者においてクローン病（ＣＤ）と潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を識別できる診断方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、病型不定型大腸炎の患者においてクローン病と潰瘍性大腸炎を識別できる方法を提供することである。
【００１２】
本発明の追加の目的は、発明の概要における研究、図面及び添付する「特許請求の範囲」に例示されるその好ましい実施形態から明らかとなる。
【００１３】
［発明の概要］
本発明は、腸抗原が、粘膜樹状細胞により局所領域腸間膜リンパ節に連続的に輸送されるという洞察に基づいている。このプロセスでは、制御性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞の調節、ひいては正常抗原に対する応答の阻止において極めて重要な役割を担うことができる。
【００１４】
動物モデルでは、エフェクターＴ細胞応答の２つの異なる経路を識別することができる。最初の種類の免疫開始は、活性化ヘルパーＴ細胞タイプ１（Ｔｈ１）によって駆動され、これはＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ及びＴＮＦ−アルファのようなサイトカインの産生を特徴とする。炎症部位は、マクロファージ及び細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋）の細胞介在浸潤により支配される。この種の炎症は、ＣＤ病変に類似している。ヘルパーＴ細胞タイプ２（ＴＨ２）の免疫活性化では、体液性の免疫防御系（免疫グロブリン）が、炎症部位で見られる細胞傷害性Ｔ細胞並びにＩＬ−４及びＩＬ−５のようなサイトカイン、並びにＩｇＧ１と併せて、重要な役割を果たしている。動物モデルでは、Ｔｈ２型炎症はヒトＵＣと共通した特性を有する。
【００１５】
本発明によれば、炎症組織の生検試料から単離される単一細胞を多色フローサイトメトリーにかけることにより、ＩＢＤ患者においてクローン病及び潰瘍性大腸炎を識別する方法を開示する。活性化マーカー及びサイトカイン産物の定量により、局部的免疫反応の状態を高精度で決定することが可能になる。本発明の方法はまた、ＩＢＤ患者における病期分類及び療法の評価にも有用である。
【００１６】
本発明の第１の好ましい態様によれば、ヒトにおいてＩＢＤの存在を決定する方法であって、疾患が疑われる遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜由来、又は前記遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜を排出するセンチネルリンパ節由来の生検試料を提供するステップと、ＣＤ６９活性化マーカーを発現しているＣＤ４ Ｔ細胞の数を定量するステップと、前記ＣＤ４ Ｔ細胞の数を、健常個体及び活動性若しくは不活動性状態のＩＢＤを有するヒトから得られる対応するＴ細胞の数と比較するステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の第２の好ましい態様によれば、ＩＢＤ患者において潰瘍性大腸炎とクローン病を識別する方法を提供する。この方法は、罹患した腸粘膜又はこのような粘膜を排出するセンチネルリンパ節由来の生検試料を提供するステップと、ＣＤの指標である活性化ヘルパーＴ細胞タイプ１（Ｔｈ１）によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインの１種又は複数、及びＵＣの指標である活性化ヘルパーＴ細胞タイプ２（Ｔｈ２）によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインの１種又は複数を定量するステップと、Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカインの量を、顕在化しているＣＤ及び／又はＵＣの患者で通常見出されるＴｈ１並びにＴｈ２の量と比較するステップとを含む。好ましいＴｈ１サイトカインはＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α、特にＩＦＮ−γを含む。好ましいＴｈ２サイトカインは、ＩＬ−４及びＩＬ−５、特にＩＬ−４を含む。この方法では、独立して又は追加して、クローン病のマーカーとしてＩｇＧ１を定量することも好ましい。
【００１８】
本発明の好ましい態様によれば、ＩＢＤ生検由来の免疫細胞のｍＲＮＡ発現プロファイリング（１３）をＩＢＤの診断、病期分類、療法及び療法の監視に用いる。
【００１９】
本発明の更に好ましい態様によれば、ステロイド治療に対するＩＢＤ患者の感受性を決定する方法であって、前記患者から得られるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞におけるグルココルチコイド受容体発現量を決定するステップを含む方法を開示する。
【００２０】
本出願では、「病期分類」は、ＩＢＤにおける活性化段階、炎症の重篤度、炎症の種類等の決定に関連し、一方「監視」は患者におけるＩＢＤの発達を監視することに関連する。
【００２１】
本発明の更に好ましい態様は、多数の図を含む図面、及び添付する特許請求の範囲に例示する、以下のその好ましい実施形態の記述に開示する。
【００２２】
本発明は、ここで、図面に例示される多数の好ましい実施形態を参照することにより、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】フローサイトメトリー並びにＣＤ４及び活性化マーカーＣＤ６９に対する抗体を用いた、活動性又は不活動性ＵＣの患者由来、及び健常対照由来の生検の単一細胞懸濁液の調査を示すグラフであり、ＣＤ４＋細胞の平均蛍光強度をｙ軸にとる。
【図２】健常対照、活動性又は不活動性ＵＣの患者、及び不活動性ＣＤの患者からの生検を調査したフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で見られる活性化ＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率の相互関係を示すグラフである。
【図３】異なる病期段階の疾患の患者のＩＢＤスコアの、生検を調査したＦＡＣＳにおける活性化ＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率との相互関係を示すグラフである。
【図４】ＣＤ患者の炎症領域を排出する、非センチネル節、センチネル節１、及びセンチネル節２由来の培養上清中のＩＦＮ−γの産生を示すグラフである。
【図５】ＵＣ患者の炎症領域を排出する、非センチネル節（ＮＳＬＮ）及びセンチネル節（ＳＬＮ）由来の培養上清中のＩＬ−４の産生を示すグラフである。
【図６】グルココルチコイド治療に応答しないＩＢＤ患者由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞中のグルココルチコイド受容体の細胞内発現レベルの低下を示すグラフである。
【図７】活動性ＣＤの患者の腸管由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞においてＴｂｅｔ発現は上昇するが、一方不活動性相におけるＴｂｅｔ発現は低いことを示すグラフである。
【図８】活動性ＣＤの患者の腸管由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞においてＴｂｅｔ発現は上昇するが、一方不活動性相におけるＴｂｅｔ発現は低いことを示すグラフである。更に、ＵＣの患者由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞におけるＴｂｅｔ発現は、活動性ＣＤに見られるＴｂｅｔ発現に比べて低い。
【図９】活動性ＵＣの患者の腸管由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞においてＧＡＴＡ−３発現は上昇するが、一方不活動性相におけるＧＡＴＡ−３発現は低いことを示すグラフである。
【００２４】
［発明の詳細な説明］
材料及び方法
単一細胞懸濁液を新鮮な生検から作製した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）は、４つを組み合わせたＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣｐ、ＡＰＣコンジュゲートを用いて、直接標識された蛍光抗体ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１４、ＣＤ９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１９を用いて実施した。アイソタイプ抗体を対照として用いた。ＣＤ及びＵＣでは、炎症を起こした腸及び罹患していない正常腸を排出するセンチネル節を、比較分析のために炎症領域の周りに注入した、トレーサー物質であるパテントブルー（Ｐａｔｅｎｔ Ｂｌｕｅ）を用いて同定した。また、各患者から静脈血試料を採取した。
【００２５】
サイトカインＩＬ−４及びＩＦＮ−γの分析は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて生検又はセンチネル節由来の単一細胞培養上清で実施した。
【００２６】
グルココルチコイド受容体の発現の分析は、マウス抗ヒトグルココルチコイド受容体抗体を用い、続いてサポニン透過化単一細胞の抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣのコンジュゲートした検出抗体を用いて実施した。
【００２７】
単一細胞懸濁液からのＲＮＡ単離は、トリゾール（ＴＲＩＺＯＬ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６−０２６）を用いて実施した。サンプルあたり１００ｎｇのＲＮＡを加え、製造業者のプロトコルにしたがって、アイスクリプト（ｉＳｃｒｉｐｔ）（商標）ｃＤＮＡ合成キットを用いた逆転写酵素反応を行った。定量ＰＣＲは、２×ＩＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンスーパーミックス（Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）を用いてアイサイクラー（ｉＣｙｃｌｅｒ）ＩＱで実施した。サイクル閾値は、ＢＩＯ−ＲＡＤ製のアイサイクラーＩＱ（商標）光学系ソフトウェアバージョン３．１を用いて得た。発現レベルは、２−ΔΔＣｔ法を用いてＲＰＩＩに正規化した。或いは、単離したＲＮＡをｃＤＮＡ合成、ＦＡＭ標識に供し、その後Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトアレイチップを用いて分析した。
【００２８】
プライマー配列 ＱＴ−ＰＣＲ：
ＩＦＮγ ＱＴ Ｆｗｒｄ ＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＴＡＧＣＧＧ
ＩＦＮγ ＱＴ Ｒｅｖ ＴＧＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣＣＡＣＡＣ
ＩＬ−４ ＱＴ Ｆｗｒｄ ＣＡＣＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧ
ＩＬ−４ ＱＴ Ｒｅｖ ＣＴＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＴＴＣ
Ｔ−ｂｅｔ ＱＴ Ｆｗｒｄ ＣＡＣＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＧＴＧ
Ｔ−ｂｅｔ ＱＴ Ｒｅｖ ＣＣＣＣＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＡＧ
ＧＡＴＡ３ ＱＴ Ｆｗｒｄ ＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＣ
ＧＡＴＡ３ ＱＴ Ｒｅｖ ＧＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＡＧＧ
【００２９】
実施例１
粘膜又はＩＢＤに罹患している領域を排出するセンチネルリンパ節内の免疫細胞の調査。粘膜又はＩＢＤに罹患している領域を排出するセンチネルリンパ節内の免疫細胞のフローサイトメトリーによる調査は、健常対照と比較して、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞における活性化マーカーＣＤ６９の発現（図１）及び活動性ＩＢＤの患者のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の発現の有意な増大（ｐ＜０．００９）を示す。不活動性ＩＢＤの患者（有能な病理学者の判断において）は、それにもかかわらず、活性化マーカーＣＤ６９の発現上昇に加えて、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化の有意な増大（ｐ＜０．０３）を示す（図１）。ＣＤ４＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞の数はまた、健常対照及び報告された不活動性ＩＢＤの患者と比較して、潰瘍性大腸炎及びクローン病の両方において活動性ＩＢＤの患者で増加する（図２）。
【００３０】
実施例２
患者のＩＢＤスコアとフローサイトメトリープロファイルとの相互関係。フローサイトメトリープロファイルによる、Ｓ−アルブミン、ＣＲＰ、及び１日あたりの血液を含む便の数を含む患者のＩＢＤスコアを図３に示す。ＣＤ６９活性化マーカーを発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、ＩＢＤスコア（ＳＥＯ指数）とよく相関していた。
【００３１】
ＳＥＯ指数を利用して、結果と疾患の活動性との相互関係を示した。この指数は、臨床的（便の頻度及び血便）及び検査パラメータ（Ｈｂ、アルブミン、及び赤血球沈降速度）を用いる。本発明者らの材料では、赤血球沈降速度はＣＲＰ（Ｃ−反応性タンパク質）により置き換えられた。
【００３２】
実施例３
ＣＤ及びＵＣの両方における、腸の病変領域を排出するセンチネル節、並びに罹患していないセグメントを排出する節での免疫反応。現在、ＣＤにおける免疫反応は、Ｔｈ１応答と見なされており、一方ＵＣは非定型Ｔｈ２活性化に類似している場合がある。この見解は、主に、人工的な手段により大腸炎を刺激する動物モデルに基づいているように思われる。ヒトでは、ＩＢＤの炎症経路の特徴付けは限られている；結腸のかん流検査に加えて末梢血液細胞の分析は、動物モデルの観察結果の一部を支持するが、病態生理の概要は不完全である。本発明によるＣＤ及びＵＣの両方における、腸の病変領域を排出するセンチネル節、及び罹患していないセグメントを排出する節における免疫反応及びサイトカインパターンの判定は、サイトカインの放出をＣＤ及びＵＣ診断で用い得ることを示唆する。
【００３３】
普及している基準により、ＩＢＤ患者の１５％は、病型不定型大腸炎を有すると考えられる、すなわち、確定診断することができない。しかしながら、正確な診断は、それにもかかわらず、更なる治療時の判断において重要である。また、劇症大腸炎においてＣＤ及びＵＣを識別する（ｄｉｆｆｅｒ）ことは不可能である場合が多く、これは適切な内科治療を遅延させ、結腸切除による早期外科的介入を必要とすることがある。多量のＩＦＮ−γが、現在、ＣＤ患者の胃腸炎症部位で同定されている（図４）。対照的に、ＵＣ患者の胃腸炎症部位は、大量のＴｈ２サイトカインＩＬ−４を含有することが見出されている（図５）。これらの所見により、胃腸生検試料中の高ＩＦＮ−γ含量とＣＤとを関係づけること、ＩＬ−４の大量産生とＵＣとを関係づけることが可能になる。これらのマーカーにより、正確な診断が困難である場合が多い、劇症大腸炎においてもＣＤ及びＵＣを識別することが可能になる。腸生検から得られる情報を用いて、より正確なテーラーメイド医療のため、かつ一部の患者における結腸全摘及び回腸造瘻による外科的介入を防ぐために、早期に正確な診断をすることができる。
【００３４】
同様の方式で、好中球、好酸球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及びＢ細胞のような他の免疫細胞の活性化マーカーの多色フローサイトメトリー分析は、ＩＢＤの診断、病期分類、及び監視に有用であり得る。
【００３５】
実施例４
ステロイド受容体の発現プロファイルの決定。一部のＩＢＤ患者がステロイド治療に対して耐性になる場合があることは、周知の問題である。本発明によれば、これらの細胞がステロイド治療に対して感受性であるかどうかを決定するための、ウエスタンブロット又は生検由来の単一細胞の細胞内フローサイトメトリーを用いる、ＩＢＤ患者のステロイド受容体発現プロファイルの調査を開示する。ステロイドに感受性応答する患者又はステロイド治療に感受性を有しない患者由来の腸生検又は単一細胞懸濁液を、細胞内フローサイトメトリーにより、ステロイド受容体発現の程度について調査した。ステロイド不応性ＩＢＤの患者は全て、グルココルチコイド受容体の発現レベルが低いが、一方ステロイド治療により腸治癒し及び低いＳＥＯ指数を示す患者はより高いレベルで発現した（図６）。したがって、腸リンパ球におけるステロイド受容体の発現レベルは、治療に対する感受性と相関する。
【００３６】
実施例５
サイトカイン発現アレイプロファイリング。本発明によれば、ＩＢＤ患者由来の生検中の免疫細胞のサイトカイン発現パターンのより詳細な像が、発現アレイプロファイリングにより得られる。この種のプロファイリングは、２０ｋのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを用いて実施した。ＣＤ患者で見られるＴｈ１活性化パターンは、ＣＤ６９及びＴｂｅｔ、ＩＦＮ−γ及びＴＩＭ−３のｍＲＮＡの発現増加により引き起こされると思われる。対照的に、Ｔｈ２の発現パターンは、ＵＣ患者で見られ、ＣＤ６９に加えて、ＧＡＴＡ−３及びＩＬ−４、ＩＬ−５の発現増加が注目される。アレイでの所見は、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＱＴ−ＰＣＲ）により確認された。したがって、ＣＤ患者由来の細胞は、高いＴｂｅｔ転写産物の発現レベルを示し（図８）、一方ＧＡＴＡ−３転写産物はＵＣ患者由来の細胞で増加した（図９）。Ｔｂｅｔの発現は、更に、活動性相のＣＤ患者において実質的に増加することが見出された（図７）。それ故、発現プロファイルのパネルに基づいて、ＣＤにおけるＴｈ１の優位性は、Ｔｂｅｔ、ＩＦＮ−γ及びＴＩＭ−３の発現増加により予測できる。結果として、Ｔｈ２の優位性及びＵＣは、ＧＡＴＡ−３及びＩＬ−４、ＩＬ−５転写産物の発現増加により予測できる。
【００３７】
参考文献
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【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、炎症性腸疾患の診断、病期分類、及び監視に関する。
【０００２】
［発明の背景］
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含み、両方とも腸に長期にわたる損傷を引き起こす。近年、ＩＢＤには、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、及びリンパ球性大腸炎も含まれている。外来抗原、免疫反応障害、及び遺伝要因の組合せがＩＢＤの病因となっているようであるが、腸炎の発生機序には不明な点が残っている（１）。今までのところ、例えば、腸へのＣＭＶ感染（２）及び持続性麻疹ウイルス感染（３）に由来する抗原等の、多くの可能性のある抗原が提唱されている。
【０００３】
腸間膜リンパ節は、腸の内容物を排出するものであるが、これがＩＢＤにおける炎症の発生及び維持にとって重要な部位である可能性が最も高い。炎症を誘発する抗原は、免疫系への提示のために、腸壁からリンパ節に能動的に輸送される（１、４）。腸の排出病理領域である、第１リンパ節を同定する技術、及び手術中にこれらの節を回収する技術が開発されてきた（５）。本発明は、細胞表面のマーカー発現及びｍＲＮＡ発現アレイプロファイリングに基づいて、様々なＩＢＤの診断及び病期分類を表すために構築されたアッセイを開示する。これらのパターンは、腸炎の種類及び活動性に関連し、それ故、療法に対する応答を含む、疾患活動性の診断、病期分類、及び監視に有用である。
【０００４】
スウェーデンでは、毎年１４００人が新たにＩＢＤであると診断される。新たに診断される人の数は、近年増加している。ＩＢＤ発生率のピークは、２０歳である（６、７）。腸は、免疫担当細胞が広範な内因性及び外因性因子と出会う複雑な微環境である。これらの相互作用は、固有層におけるＴ細胞の豊富さが反映される、連続的で悪性度の低い炎症を生じる（８）。Ｔ細胞は、常時、有害な病原体に対しては作用することができるが、無害な食餌性抗原又は正常な常在性細菌叢のメンバーは無視する。腸免疫系の耐性と反応との間の平衡が崩れたとき、結果的にＩＢＤになることがある。
【０００５】
ＣＤ及びＵＣはＩＢＤの２つの主要な形である。ＣＤでは、腸のいずれの部分が罹患する場合もあるが、最も一般的なのは回盲領域（５０％）及び結腸（３０％）の罹患である。患者の約３分の１が、随伴性肛門周囲疾患も有している。小腸のいくつかの小区画が罹患する場合もあり、しばしば区域性病変として知られている。組織病理学的に、炎症は貫壁性であり、肉芽腫のリンパ球及びマクロファージの密度の濃い浸潤が、患者の最大６０％に見られる。ＵＣは通常直腸が関与し、近位方向に伸長し、この伸長は個々の患者間で変動するが、疾患は常に結腸に限定されたままである。全結腸炎という用語は、炎症に右結腸曲が関与するときにも用いられる。微視的には、粘膜炎症は表在性であり、リンパ球及び顆粒球が豊富である。潰瘍形成及び陰窩膿瘍が一般的である（１）。下痢（多くの場合、血液を含む）、栄養失調、発熱及び痛みのような長期の炎症に起因する症状とともに、患者はまた上皮異形成及び最終的には腸癌が発生する長期的なリスクを有する（９）。ＩＢＤ患者の約１５％が病型不定型大腸炎を有し、それ故ＣＤ又はＵＣの確定診断をすることができない。更により重要なことに、劇症大腸炎の患者の中には、診断に関して不確実性が存在する場合が多い。正確な診断は、早急に必要な内科治療、及び長期的展望では、最良の外科治療について決定するときに重要である。ＣＤの外科治療としては、炎症区画の切除、狭窄形成術による狭窄の治療、罹患区画の大腸切除、又は重篤な大腸炎の場合は結腸全摘及び回腸造瘻が挙げられる。ＣＤにおける再建手術は、腸の連続性を回復させるための回腸直腸吻合であることが多い。骨盤内パウチは、回腸直腸吻合領域における瘻孔形成に関連する合併症のリスクが高いため、ほとんど選択されない。一部の患者は、最後に永続的回腸造瘻を行う。ＵＣのため重篤な大腸炎の患者は、緊急処置として結腸切除及び回腸造瘻により治療される場合が多い。約６カ月後、回腸直腸吻合又は骨盤内パウチのいずれかを、確定した外科治療として選択することができるが、一部の例では永続的回腸造瘻のみが選択し得る解決法となることもある。
【０００６】
いくつかの証拠から、ＣＤは正常な腸管細菌叢に対する耐性の崩壊の結果であることが暗示されている。ヒトでは、患者の固有層の単核細胞は自己糞便抽出物に応答することが示されているが、これは正常にコントロールされている場合には当てはまらない（１０）。Ｔ細胞の刺激に対する抗原への依存性は、自己腸内細菌の超音波処理に対してＣＤ患者由来のリンパ球がインビトロで増殖したことが観察されたことから明らかであり、この場合増殖は抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体により阻害された（１１）。ＵＣに関して、微環境の役割はそれほど明確にはなっておらず、炎症は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）に依存すると考えられる自己免疫様病因、硬化性胆管炎のような自己免疫疾患との関連、自己抗体の発生頻度、及び大腸粘膜の特異性に基づくと思われる（１２）。仮説上、腸に対する免疫反応は、制御性Ｔ細胞の不十分な阻害作用の結果である可能性がある（１、４、１０）。
【０００７】
活動性ＵＣは、結腸粘膜内の活性化顆粒球、及び単球／マクロファージの湿潤を特徴とする。これらの浸潤細胞は、炎症促進性サイトカインの主な供給源である。ＩＢＤ患者は、内科治療に対して耐性が生じる場合がある。可能性のある原因は、顆粒球、サイトカイン、又はステロイド受容体の発現を含む免疫細胞の機能特性の分布変化である。
【０００８】
今日、ＩＢＤの診断及び病期分類は、内視鏡的基準及び組織病理学に加えて、臨床的パラメータ（アルブミン、ＳＲ、ＣＲＰ、発熱、便の数）の組合せに基づく。炎症活動性は、顕微鏡により評価されるが、生検に存在する一般的な型及び数の細胞しか考慮されない。活動特性は決定されない。
【０００９】
［発明の目的］
本発明の目的は、活動性と不活動性腸疾患（ＩＢＤ）を識別できる方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ＩＢＤ患者においてクローン病（ＣＤ）と潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を識別できる診断方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、病型不定型大腸炎の患者においてクローン病と潰瘍性大腸炎を識別できる方法を提供することである。
【００１２】
本発明の追加の目的は、発明の概要における研究、図面及び添付する「特許請求の範囲」に例示されるその好ましい実施形態から明らかとなる。
【００１３】
［発明の概要］
本発明は、腸抗原が、粘膜樹状細胞により局所領域腸間膜リンパ節に連続的に輸送されるという洞察に基づいている。このプロセスでは、制御性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞の調節、ひいては正常抗原に対する応答の阻止において極めて重要な役割を担うことができる。
【００１４】
動物モデルでは、エフェクターＴ細胞応答の２つの異なる経路を識別することができる。最初の種類の免疫開始は、活性化ヘルパーＴ細胞タイプ１（Ｔｈ１）によって駆動され、これはＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ及びＴＮＦ−アルファのようなサイトカインの産生を特徴とする。炎症部位は、マクロファージ及び細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋）の細胞介在浸潤により支配される。この種の炎症は、ＣＤ病変に類似している。ヘルパーＴ細胞タイプ２（ＴＨ２）の免疫活性化では、体液性の免疫防御系（免疫グロブリン）が、炎症部位で見られる細胞傷害性Ｔ細胞並びにＩＬ−４及びＩＬ−５のようなサイトカイン、並びにＩｇＧ１と併せて、重要な役割を果たしている。動物モデルでは、Ｔｈ２型炎症はヒトＵＣと共通した特性を有する。
【００１５】
本発明によれば、炎症組織の生検試料から単離される単一細胞を多色フローサイトメトリーにかけることにより、ＩＢＤ患者においてクローン病及び潰瘍性大腸炎を識別する方法を開示する。活性化マーカー及びサイトカイン産物の定量により、局部的免疫反応の状態を高精度で決定することが可能になる。本発明の方法はまた、ＩＢＤ患者における病期分類及び療法の評価にも有用である。
【００１６】
本発明の第１の好ましい態様によれば、ヒトにおいてＩＢＤの存在を決定する方法であって、疾患が疑われる遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜由来、又は前記遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜を排出するセンチネルリンパ節由来の生検試料を提供するステップと、ＣＤ６９活性化マーカーを発現しているＣＤ４ Ｔ細胞の数を定量するステップと、前記ＣＤ４ Ｔ細胞の数を、健常個体及び活動性若しくは不活動性状態のＩＢＤを有するヒトから得られる対応するＴ細胞の数と比較するステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の第２の好ましい態様によれば、ＩＢＤ患者において潰瘍性大腸炎とクローン病を識別する方法を提供する。この方法は、罹患した腸粘膜又はこのような粘膜を排出するセンチネルリンパ節由来の生検試料を提供するステップと、ＣＤの指標である活性化ヘルパーＴ細胞タイプ１（Ｔｈ１）によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインの１種又は複数、及びＵＣの指標である活性化ヘルパーＴ細胞タイプ２（Ｔｈ２）によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインの１種又は複数を定量するステップと、Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカインの量を、顕在化しているＣＤ及び／又はＵＣの患者で通常見出されるＴｈ１並びにＴｈ２の量と比較するステップとを含む。好ましいＴｈ１サイトカインはＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α、特にＩＦＮ−γを含む。好ましいＴｈ２サイトカインは、ＩＬ−４及びＩＬ−５、特にＩＬ−４を含む。この方法では、独立して又は追加して、クローン病のマーカーとしてＩｇＧ１を定量することも好ましい。
【００１８】
本発明の好ましい態様によれば、ＩＢＤ生検由来の免疫細胞のｍＲＮＡ発現プロファイリング（１３）をＩＢＤの診断、病期分類、療法及び療法の監視に用いる。
【００１９】
本発明の更に好ましい態様によれば、ステロイド治療に対するＩＢＤ患者の感受性を決定する方法であって、前記患者から得られるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞におけるグルココルチコイド受容体発現量を決定するステップを含む方法を開示する。
【００２０】
本出願では、「病期分類」は、ＩＢＤにおける活性化段階、炎症の重篤度、炎症の種類等の決定に関連し、一方「監視」は患者におけるＩＢＤの発達を監視することに関連する。
【００２１】
本発明の更に好ましい態様は、多数の図を含む図面、及び添付する特許請求の範囲に例示する、以下のその好ましい実施形態の記述に開示する。
【００２２】
本発明は、ここで、図面に例示される多数の好ましい実施形態を参照することにより、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】フローサイトメトリー並びにＣＤ４及び活性化マーカーＣＤ６９に対する抗体を用いた、活動性又は不活動性ＵＣの患者由来、及び健常対照由来の生検の単一細胞懸濁液の調査を示すグラフであり、ＣＤ４＋細胞の平均蛍光強度をｙ軸にとる。
【図２】健常対照、活動性又は不活動性ＵＣの患者、及び不活動性ＣＤの患者からの生検を調査したフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で見られる活性化ＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率の相互関係を示すグラフである。
【図３】異なる病期段階の疾患の患者のＩＢＤスコアの、生検を調査したＦＡＣＳにおける活性化ＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率との相互関係を示すグラフである。
【図４】ＣＤ患者の炎症領域を排出する、非センチネル節、センチネル節１、及びセンチネル節２由来の培養上清中のＩＦＮ−γの産生を示すグラフである。
【図５】ＵＣ患者の炎症領域を排出する、非センチネル節（ＮＳＬＮ）及びセンチネル節（ＳＬＮ）由来の培養上清中のＩＬ−４の産生を示すグラフである。
【図６】グルココルチコイド治療に応答しないＩＢＤ患者由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞中のグルココルチコイド受容体の細胞内発現レベルの低下を示すグラフである。
【図７】活動性ＣＤの患者の腸管由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞においてＴｂｅｔ発現は上昇するが、一方不活動性相におけるＴｂｅｔ発現は低いことを示すグラフである。
【図８】活動性ＣＤの患者の腸管由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞においてＴｂｅｔ発現は上昇するが、一方不活動性相におけるＴｂｅｔ発現は低いことを示すグラフである。更に、ＵＣの患者由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞におけるＴｂｅｔ発現は、活動性ＣＤに見られるＴｂｅｔ発現に比べて低い。
【図９】活動性ＵＣの患者の腸管由来のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞においてＧＡＴＡ−３発現は上昇するが、一方不活動性相におけるＧＡＴＡ−３発現は低いことを示すグラフである。
【００２４】
［発明の詳細な説明］
材料及び方法
単一細胞懸濁液を新鮮な生検から作製した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）は、４つを組み合わせたＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣｐ、ＡＰＣコンジュゲートを用いて、直接標識された蛍光抗体ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１４、ＣＤ９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１９を用いて実施した。アイソタイプ抗体を対照として用いた。ＣＤ及びＵＣでは、炎症を起こした腸及び罹患していない正常腸を排出するセンチネル節を、比較分析のために炎症領域の周りに注入した、トレーサー物質であるパテントブルー（Ｐａｔｅｎｔ Ｂｌｕｅ）を用いて同定した。また、各患者から静脈血試料を採取した。
【００２５】
サイトカインＩＬ−４及びＩＦＮ−γの分析は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて生検又はセンチネル節由来の単一細胞培養上清で実施した。
【００２６】
グルココルチコイド受容体の発現の分析は、マウス抗ヒトグルココルチコイド受容体抗体を用い、続いてサポニン透過化単一細胞の抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣのコンジュゲートした検出抗体を用いて実施した。
【００２７】
単一細胞懸濁液からのＲＮＡ単離は、トリゾール（ＴＲＩＺＯＬ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６−０２６）を用いて実施した。サンプルあたり１００ｎｇのＲＮＡを加え、製造業者のプロトコルにしたがって、アイスクリプト（ｉＳｃｒｉｐｔ）（商標）ｃＤＮＡ合成キットを用いた逆転写酵素反応を行った。定量ＰＣＲは、２×ＩＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンスーパーミックス（Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）を用いてアイサイクラー（ｉＣｙｃｌｅｒ）ＩＱで実施した。サイクル閾値は、ＢＩＯ−ＲＡＤ製のアイサイクラーＩＱ（商標）光学系ソフトウェアバージョン３．１を用いて得た。発現レベルは、２−ΔΔＣｔ法を用いてＲＰＩＩに正規化した。或いは、単離したＲＮＡをｃＤＮＡ合成、ＦＡＭ標識に供し、その後Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトアレイチップを用いて分析した。
【００２８】
プライマー配列 ＱＴ−ＰＣＲ：
ＩＦＮγ ＱＴ Ｆｗｒｄ ＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＴＡＧＣＧＧ
ＩＦＮγ ＱＴ Ｒｅｖ ＴＧＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣＣＡＣＡＣ
ＩＬ−４ ＱＴ Ｆｗｒｄ ＣＡＣＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧ
ＩＬ−４ ＱＴ Ｒｅｖ ＣＴＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＴＴＣ
Ｔ−ｂｅｔ ＱＴ Ｆｗｒｄ ＣＡＣＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＧＴＧ
Ｔ−ｂｅｔ ＱＴ Ｒｅｖ ＣＣＣＣＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＡＧ
ＧＡＴＡ３ ＱＴ Ｆｗｒｄ ＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＣ
ＧＡＴＡ３ ＱＴ Ｒｅｖ ＧＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＡＧＧ
【００２９】
実施例１
粘膜又はＩＢＤに罹患している領域を排出するセンチネルリンパ節内の免疫細胞の調査。粘膜又はＩＢＤに罹患している領域を排出するセンチネルリンパ節内の免疫細胞のフローサイトメトリーによる調査は、健常対照と比較して、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞における活性化マーカーＣＤ６９の発現（図１）及び活動性ＩＢＤの患者のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の発現の有意な増大（ｐ＜０．００９）を示す。不活動性ＩＢＤの患者（有能な病理学者の判断において）は、それにもかかわらず、活性化マーカーＣＤ６９の発現上昇に加えて、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化の有意な増大（ｐ＜０．０３）を示す（図１）。ＣＤ４＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞の数はまた、健常対照及び報告された不活動性ＩＢＤの患者と比較して、潰瘍性大腸炎及びクローン病の両方において活動性ＩＢＤの患者で増加する（図２）。
【００３０】
実施例２
患者のＩＢＤスコアとフローサイトメトリープロファイルとの相互関係。フローサイトメトリープロファイルによる、Ｓ−アルブミン、ＣＲＰ、及び１日あたりの血液を含む便の数を含む患者のＩＢＤスコアを図３に示す。ＣＤ６９活性化マーカーを発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、ＩＢＤスコア（ＳＥＯ指数）とよく相関していた。
【００３１】
ＳＥＯ指数を利用して、結果と疾患の活動性との相互関係を示した。この指数は、臨床的（便の頻度及び血便）及び検査パラメータ（Ｈｂ、アルブミン、及び赤血球沈降速度）を用いる。本発明者らの材料では、赤血球沈降速度はＣＲＰ（Ｃ−反応性タンパク質）により置き換えられた。
【００３２】
実施例３
ＣＤ及びＵＣの両方における、腸の病変領域を排出するセンチネル節、並びに罹患していないセグメントを排出する節での免疫反応。現在、ＣＤにおける免疫反応は、Ｔｈ１応答と見なされており、一方ＵＣは非定型Ｔｈ２活性化に類似している場合がある。この見解は、主に、人工的な手段により大腸炎を刺激する動物モデルに基づいているように思われる。ヒトでは、ＩＢＤの炎症経路の特徴付けは限られている；結腸のかん流検査に加えて末梢血液細胞の分析は、動物モデルの観察結果の一部を支持するが、病態生理の概要は不完全である。本発明によるＣＤ及びＵＣの両方における、腸の病変領域を排出するセンチネル節、及び罹患していないセグメントを排出する節における免疫反応及びサイトカインパターンの判定は、サイトカインの放出をＣＤ及びＵＣ診断で用い得ることを示唆する。
【００３３】
普及している基準により、ＩＢＤ患者の１５％は、病型不定型大腸炎を有すると考えられる、すなわち、確定診断することができない。しかしながら、正確な診断は、それにもかかわらず、更なる治療時の判断において重要である。また、劇症大腸炎においてＣＤ及びＵＣを識別する（ｄｉｆｆｅｒ）ことは不可能である場合が多く、これは適切な内科治療を遅延させ、結腸切除による早期外科的介入を必要とすることがある。多量のＩＦＮ−γが、現在、ＣＤ患者の胃腸炎症部位で同定されている（図４）。対照的に、ＵＣ患者の胃腸炎症部位は、大量のＴｈ２サイトカインＩＬ−４を含有することが見出されている（図５）。これらの所見により、胃腸生検試料中の高ＩＦＮ−γ含量とＣＤとを関係づけること、ＩＬ−４の大量産生とＵＣとを関係づけることが可能になる。これらのマーカーにより、正確な診断が困難である場合が多い、劇症大腸炎においてもＣＤ及びＵＣを識別することが可能になる。腸生検から得られる情報を用いて、より正確なテーラーメイド医療のため、かつ一部の患者における結腸全摘及び回腸造瘻による外科的介入を防ぐために、早期に正確な診断をすることができる。
【００３４】
同様の方式で、好中球、好酸球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及びＢ細胞のような他の免疫細胞の活性化マーカーの多色フローサイトメトリー分析は、ＩＢＤの診断、病期分類、及び監視に有用であり得る。
【００３５】
実施例４
ステロイド受容体の発現プロファイルの決定。一部のＩＢＤ患者がステロイド治療に対して耐性になる場合があることは、周知の問題である。本発明によれば、これらの細胞がステロイド治療に対して感受性であるかどうかを決定するための、ウエスタンブロット又は生検由来の単一細胞の細胞内フローサイトメトリーを用いる、ＩＢＤ患者のステロイド受容体発現プロファイルの調査を開示する。ステロイドに感受性応答する患者又はステロイド治療に感受性を有しない患者由来の腸生検又は単一細胞懸濁液を、細胞内フローサイトメトリーにより、ステロイド受容体発現の程度について調査した。ステロイド不応性ＩＢＤの患者は全て、グルココルチコイド受容体の発現レベルが低いが、一方ステロイド治療により腸治癒し及び低いＳＥＯ指数を示す患者はより高いレベルで発現した（図６）。したがって、腸リンパ球におけるステロイド受容体の発現レベルは、治療に対する感受性と相関する。
【００３６】
実施例５
サイトカイン発現アレイプロファイリング。本発明によれば、ＩＢＤ患者由来の生検中の免疫細胞のサイトカイン発現パターンのより詳細な像が、発現アレイプロファイリングにより得られる。この種のプロファイリングは、２０ｋのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを用いて実施した。ＣＤ患者で見られるＴｈ１活性化パターンは、ＣＤ６９及びＴｂｅｔ、ＩＦＮ−γ及びＴＩＭ−３のｍＲＮＡの発現増加により引き起こされると思われる。対照的に、Ｔｈ２の発現パターンは、ＵＣ患者で見られ、ＣＤ６９に加えて、ＧＡＴＡ−３及びＩＬ−４、ＩＬ−５の発現増加が注目される。アレイでの所見は、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＱＴ−ＰＣＲ）により確認された。したがって、ＣＤ患者由来の細胞は、高いＴｂｅｔ転写産物の発現レベルを示し（図８）、一方ＧＡＴＡ−３転写産物はＵＣ患者由来の細胞で増加した（図９）。Ｔｂｅｔの発現は、更に、活動性相のＣＤ患者において実質的に増加することが見出された（図７）。それ故、発現プロファイルのパネルに基づいて、ＣＤにおけるＴｈ１の優位性は、Ｔｂｅｔ、ＩＦＮ−γ及びＴＩＭ−３の発現増加により予測できる。結果として、Ｔｈ２の優位性及びＵＣは、ＧＡＴＡ−３及びＩＬ−４、ＩＬ−５転写産物の発現増加により予測できる。
【００３７】
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５． Ｔｈｏｒｎ Ｍ． Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｎｔｉｎｅｌ ｎｏｄｅ ｂｉｏｐｓｙ： ｉｓ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｎｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ？ Ｅｕｒ Ｊ Ｓｕｒｇ． ２０００； １６６： ７５５−７５８．
６． Ｌａｐｉｄｕｓ Ａ， Ｂｅｒｎｅｌｌ Ｏ， Ｈｅｌｌｅｒｓ Ｇ， Ｐｅｒｓｓｏｎ ＰＧ， Ｌｏｆｂｅｒｇ Ｒ． Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ Ｃｏｕｎｔｙ １９５５−１９８９． Ｇｕｔ． １９９７； ４１： ４８０−４８６．
７． Ｔｙｓｋ Ｃ， Ｊａｒｎｅｒｏｔ Ｇ． Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｃｔｏｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｏｒｅｂｒｏ， Ｓｗｅｄｅｎ． Ａ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｙ， １９６３−１９８７． Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １９９２； ２７： ９４５−５０．
８． Ｗｉｔｔｉｇ ＢＭ， Ｚｅｉｔｚ Ｍ． Ｔｈｅ ｇｕｔ ａｓ ａｎ ｏｒｇａｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ． ２００２： ｅ−ｊｏｕｒｎａｌ．
９． Ｅｋｂｏｍ Ａ， Ｈｅｌｍｉｃｋ Ｃ， Ｚａｃｋ Ｍ， Ａｄａｍｉ ＨＯ． Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９０； ３２３： １２２８−３３．
１０． Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ， Ｋｅｌｓａｌｌ， Ｂ． Ｔｏ ｂｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｏｒ ｎｏｔ ｔｏ ｂｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ， ｔｈａｔ ｉｓ ｔｈｅ ｍｕｃｏｓａｌ ｑｕｅｓｔｉｏｎ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９８； １１４： ２１４−２１７．
１１． Ｄｕｃｈｍａｎｎ Ｒ， Ｋａｉｓｅｒ Ｉ， Ｈｅｒｍａｎｎ Ｅ， Ｍａｙｅｔ Ｗ， Ｅｗｅ Ｋ， Ｍｅｙｅｒ−ｚｕｍ−Ｂｕｓｃｈｅｎｆｅｌｄｅ ＫＨ． Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｅｘｉｓｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｆｌｏｒａ ｂｕｔ ｉｓ ｂｒｏｋｅｎ ｉｎ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９５； １０２： ４４８−４５５．
１２． Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ＴＴ， Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ Ｇ， Ｐｅｎｄｅｒ ＳＬＦ． Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｓｃａｎ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０００； ５１： ２−９．
１３． ＤｅＲｉｓｉ Ｊ， Ｐｅｎｌａｎｄ Ｌ， Ｂｒｏｗｎ ＰＯ， Ｂｉｔｔｎｅｒ ＭＬ， Ｍｅｌｔｚｅｒ ＰＳ， Ｒａｙ Ｍ， Ｃｈｅｎ Ｙ， Ｓｕ ＹＡ， Ｔｒｅｎｔ ＪＭ． Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｏ ａｎａｌｙｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １９９６ １４（４）：４５７−６０．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において活動性ＩＢＤと不活動性ＩＢＤとを識別する方法であって、
疾患が疑われる胃腸粘膜、特に遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜、の生検試料又は前記胃腸粘膜を排出するセンチネルリンパ節に由来する生検試料を提供するステップと、
前記試料から単一細胞の懸濁液を調製するステップと、
前記単一細胞の懸濁液を、直接標識された蛍光ＣＤ６９抗体を用いてＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の炎症活性化マーカーＣＤ６９の発現について分析するステップと、
そのように測定されたＣＤ６９を発現しているヘルパーＴ細胞の数を、対応する健常個体の腸組織から得られた単一細胞の懸濁液で測定されたＣＤ６９を発現しているヘルパーＴ細胞の数と比較するステップと、を含み、
ＣＤ６９を発現しているヘルパーＴ細胞の増加度合いが著しい場合に活動性ＩＢＤが存在することを示し、一方Ｔの増加度合いがそれほど著しくない場合に不活動性ＩＢＤが存在することを示す方法。
【請求項２】
分析がフローサイトメトリーによるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が直接標識された抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が蛍光抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記増加度合いが著しい場合が、ｐ＜０．００９によって特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増加度合いがそれほど著しくない場合が、０．０３＜Ｐ＞０．００９によって特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＩＢＤ患者において潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別する方法であって、
罹患した腸粘膜又はこのような粘膜を排出するセンチネルリンパ節から得られる患者の生検試料を提供するステップと、
前記試料から単一細胞の懸濁液を調製するステップと、
前記懸濁液又はその上清中の、クローン病の指標である活性化ヘルパーＴ細胞タイプ１（Ｔｈ１）によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインの１種又は複数、及び潰瘍性大腸炎の指標である活性化ヘルパーＴ細胞タイプ２（Ｔｈ２）によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインの１種又は複数を定量するステップと、
前記定量したＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの量を、対応する顕在化しているクローン病及び／又は潰瘍性大腸炎の患者で見出される量と比較するステップと、を含む方法。
【請求項８】
活性化ヘルパーＴ細胞タイプ１によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
活性化ヘルパーＴ細胞タイプ２によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインが、ＩＬ−４及びＩＬ−５から選択される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
クローン病のマーカーとして、試料中のＩｇＧ１を定量するステップを更に含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記上清中でＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのいずれかが定量される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記上清中でＩＬ−４及びＩＬ−５のいずれかが定量される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
患者においてクローン病の存在を決定する方法であって、
疾患が疑われる胃腸粘膜、特に遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜、の生検試料又は前記胃腸粘膜を排出するセンチネルリンパ節に由来する生検試料を提供するステップと、
前記試料から単一細胞の懸濁液を調製するステップと、
前記単一細胞の懸濁液からｍＲＮＡを単離するステップと、
前記単離したｍＲＮＡを、ＣＤ６９、Ｔｂｅｔ、ＩＦＮ−γ、ＴＩＭ−３のうち２種以上のｍＲＮＡについて分析するステップと、
前記分析結果を、健常個体から同様にして得られたｍＲＮＡ中の対応するＣＤ６９、Ｔｂｅｔ、ＩＦＮ−γ、ＴＩＭ−３のうち２種以上のｍＲＮＡの分析結果と比較するステップと、を含み、
前記患者のｍＲＮＡ試料中のＣＤ６９、Ｔｂｅｔ、ＩＦＮ−γ、ＴＩＭ−３のうち２種以上のｍＲＮＡの発現増加が、クローン病の指標である方法。
【請求項１４】
クローン病の病期分類又はクローン病の療法の監視における、請求項１３に記載の方法の使用。
【請求項１５】
患者において潰瘍性大腸炎の存在を決定する方法であって、
疾患が疑われる胃腸粘膜、特に遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜、の生検試料又は前記胃腸粘膜を排出するセンチネルリンパ節に由来する生検試料を提供するステップと、
前記試料から単一細胞の懸濁液を調製するステップと、
前記単一細胞の懸濁液からｍＲＮＡを単離するステップと、
前記単離したｍＲＮＡを、ＣＤ６９、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５のうち２種以上のｍＲＮＡについて分析するステップと、
前記分析結果を、健常個体から同様にして得られたｍＲＮＡ中の対応するＣＤ６９、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５のうち２種以上のｍＲＮＡの分析結果と比較するステップと、を含み、
前記患者のｍＲＮＡ試料中のＣＤ６９、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５のうち２種以上のｍＲＮＡの発現増加が、潰瘍性大腸炎の指標である方法。
【請求項１６】
潰瘍性大腸炎の病期分類又は潰瘍性大腸炎の療法の監視における、請求項１５に記載の方法の使用。
【請求項１７】
生検試料中のＴｂｅｔ発現量の、前記生検試料を採取した患者のクローン病の病期分類のマーカーとしての使用。
【請求項１８】
生検試料中のＴｂｅｔ発現量の、前記生検試料を採取した患者のクローン病の活動性相と不活動性相を識別するためのマーカーとしての使用。
【請求項１９】
生検試料中のＧＡＴＡ−３発現量の、前記生検試料を採取した患者における潰瘍性大腸炎の活動性相と不活動性相を識別するためのマーカーとしての使用。
【請求項２０】
ＩＢＤ患者のステロイド治療に対する感受性を決定する方法であって、
前記患者から得られるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞におけるグルココルチコイド受容体の発現量を決定するステップを含む方法。
【請求項２１】
前記決定された発現量を、ステロイド治療に応答するＩＢＤ患者若しくはＩＢＤ患者群における対応する発現量及び／又はステロイド治療に応答しないＩＢＤ患者若しくはＩＢＤ患者群における対応する発現量と比較する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＢＤ患者における前記決定された発現量が、非応答ＩＢＤ患者群における平均発現量に対して５０％増加することが、前記患者がステロイド治療に感受性であることを８０％以上示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記非応答ＩＢＤ患者群を選択するための唯一の基準が、ステロイド治療に対して非応答性であることである、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
患者において活動性ＩＢＤと不活動性ＩＢＤとを識別する方法であって、
疾患が疑われる胃腸粘膜、特に遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜、の生検試料又は前記胃腸粘膜を排出するセンチネルリンパ節に由来する生検試料を提供するステップと、
前記試料から単一細胞の懸濁液を調製するステップと、
前記単一細胞の懸濁液を、直接標識された蛍光ＣＤ６９抗体を用いてＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の炎症活性化マーカーＣＤ６９の発現について分析するステップと、
そのように測定されたＣＤ６９を発現しているヘルパーＴ細胞の数を、対応する健常個体の腸組織から得られた単一細胞の懸濁液で測定されたＣＤ６９を発現しているヘルパーＴ細胞の数と比較するステップと、を含み、
ＣＤ６９を発現しているヘルパーＴ細胞の増加度合いが著しい場合に活動性ＩＢＤが存在することを示し、一方Ｔの増加度合いがそれほど著しくない場合に不活動性ＩＢＤが存在することを示す方法。
【請求項２】
分析がフローサイトメトリーによるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が直接標識された抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が蛍光抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記増加度合いが著しい場合が、ｐ＜０．００９によって特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増加度合いがそれほど著しくない場合が、０．０３＜Ｐ＞０．００９によって特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＩＢＤ患者において潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別する方法であって、
罹患した腸粘膜又はこのような粘膜を排出するセンチネルリンパ節から得られる患者の生検試料を提供するステップと、
前記試料から単一細胞の懸濁液を調製するステップと、
前記懸濁液又はその上清中の、クローン病の指標である活性化ヘルパーＴ細胞タイプ１（Ｔｈ１）によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインの１種又は複数、及び潰瘍性大腸炎の指標である活性化ヘルパーＴ細胞タイプ２（Ｔｈ２）によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインの１種又は複数を定量するステップと、
前記定量したＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの量を、対応する顕在化しているクローン病及び／又は潰瘍性大腸炎の患者で見出される量と比較するステップと、を含む方法。
【請求項８】
活性化ヘルパーＴ細胞タイプ１によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
活性化ヘルパーＴ細胞タイプ２によって駆動される免疫活性化で産生されるサイトカインが、ＩＬ−４及びＩＬ−５から選択される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
クローン病のマーカーとして、試料中のＩｇＧ１を定量するステップを更に含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記上清中でＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのいずれかが定量される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記上清中でＩＬ−４及びＩＬ−５のいずれかが定量される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
患者においてクローン病の存在を決定する方法であって、
疾患が疑われる胃腸粘膜、特に遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜、の生検試料又は前記胃腸粘膜を排出するセンチネルリンパ節に由来する生検試料を提供するステップと、
前記試料から単一細胞の懸濁液を調製するステップと、
前記単一細胞の懸濁液からｍＲＮＡを単離するステップと、
前記単離したｍＲＮＡを、ＣＤ６９、Ｔｂｅｔ、ＩＦＮ−γ、ＴＩＭ−３のうち２種以上のｍＲＮＡについて分析するステップと、
前記分析結果を、健常個体から同様にして得られたｍＲＮＡ中の対応するＣＤ６９、Ｔｂｅｔ、ＩＦＮ−γ、ＴＩＭ−３のうち２種以上のｍＲＮＡの分析結果と比較するステップと、を含み、
前記患者のｍＲＮＡ試料中のＣＤ６９、Ｔｂｅｔ、ＩＦＮ−γ、ＴＩＭ−３のうち２種以上のｍＲＮＡの発現増加が、クローン病の指標である方法。
【請求項１４】
クローン病の病期分類又はクローン病の療法の監視における、請求項１３に記載の方法の使用。
【請求項１５】
患者において潰瘍性大腸炎の存在を決定する方法であって、
疾患が疑われる胃腸粘膜、特に遠位回腸粘膜若しくは結腸粘膜、の生検試料又は前記胃腸粘膜を排出するセンチネルリンパ節に由来する生検試料を提供するステップと、
前記試料から単一細胞の懸濁液を調製するステップと、
前記単一細胞の懸濁液からｍＲＮＡを単離するステップと、
前記単離したｍＲＮＡを、ＣＤ６９、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５のうち２種以上のｍＲＮＡについて分析するステップと、
前記分析結果を、健常個体から同様にして得られたｍＲＮＡ中の対応するＣＤ６９、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５のうち２種以上のｍＲＮＡの分析結果と比較するステップと、を含み、
前記患者のｍＲＮＡ試料中のＣＤ６９、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５のうち２種以上のｍＲＮＡの発現増加が、潰瘍性大腸炎の指標である方法。
【請求項１６】
潰瘍性大腸炎の病期分類又は潰瘍性大腸炎の療法の監視における、請求項１５に記載の方法の使用。
【請求項１７】
生検試料中のＴｂｅｔ発現量の、前記生検試料を採取した患者のクローン病の病期分類のマーカーとしての使用。
【請求項１８】
生検試料中のＴｂｅｔ発現量の、前記生検試料を採取した患者のクローン病の活動性相と不活動性相を識別するためのマーカーとしての使用。
【請求項１９】
生検試料中のＧＡＴＡ−３発現量の、前記生検試料を採取した患者における潰瘍性大腸炎の活動性相と不活動性相を識別するためのマーカーとしての使用。
【請求項２０】
ＩＢＤ患者のステロイド治療に対する感受性を決定する方法であって、
前記患者から得られるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞におけるグルココルチコイド受容体の発現量を決定するステップを含む方法。
【請求項２１】
前記決定された発現量を、ステロイド治療に応答するＩＢＤ患者若しくはＩＢＤ患者群における対応する発現量及び／又はステロイド治療に応答しないＩＢＤ患者若しくはＩＢＤ患者群における対応する発現量と比較する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＢＤ患者における前記決定された発現量が、非応答ＩＢＤ患者群における平均発現量に対して５０％増加することが、前記患者がステロイド治療に感受性であることを８０％以上示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記非応答ＩＢＤ患者群を選択するための唯一の基準が、ステロイド治療に対して非応答性であることである、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５３５３３６（Ｐ２０１０−５３５３３６Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１９１７１（Ｐ２０１０−５１９１７１）
【出願日】平成２０年７月２９日（２００８．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０００４６４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１７４４４
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（５１００２１７１９）アイエスエス イミューン システム スティミュレーション アーベー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２９日（２００８．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０００４６４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１７４４４
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（５１００２１７１９）アイエスエス イミューン システム スティミュレーション アーベー (2)
【Ｆターム（参考）】
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