炎症性腸疾患の診断方法
本明細書では、ヒトの腸内ミクロビオームに少なくとも１つの遺伝子が不存在であるという判定に基づく新規の炎症性腸疾患診断方法が記載されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
炎症性腸疾患は、胃腸管の異なるレベルにおける持続的な粘膜炎症を特徴とする原因不明の慢性障害である。潰瘍性大腸炎およびクローン病が、炎症性腸疾患の２つの主要なタイプである。潰瘍性大腸炎は、結腸に限定された連続的な粘膜炎症をひき起こし、一方、クローン病は、胃腸管全体を通してあらゆるところに不連続的な貫壁性炎症をひき起こすが、回腸終端部に影響を及ぼすことが最も多い。最も一般的な腸内病変は、粘膜潰瘍形成、腸壁膨張、および腸内腔狭窄からなる。これらの慢性炎症性病変は、下痢、便意切迫、腹痛、および発熱、ならびに出血、腸閉塞、敗血症、および栄養失調を含む、さまざまな重症度の合併症などの症候をひき起こす場合がある。
【背景技術】
【０００２】
疫学的研究により、１９５０年以降前世紀の間に西欧および北米におけるこのような疾病の発症率が確実に増大していることが実証された。南欧および日本では、発症率の上昇は、２０年遅れて到来したが、今日では発症率は北欧や北米と同じように高い。最近のデータは、東欧諸国ならびに東南アジアにおける発症率の増加を示唆している。発症率の変化は、食習慣の変化ならびに公衆衛生の改善および工業化などの環境の変化を含むライフスタイルの西欧化に関係していると思われる。今日、複合有病率（潰瘍性大腸炎とクローン病）の数字は、先進諸国の人口の０．５％に至るまでが炎症性腸疾患に侵されていることを示唆している。
【０００３】
炎症性腸疾患は多くの場合若齢で発症し、生涯を通じた健康障害をひき起こす潜在性を有することから、炎症性腸疾患が社会に及ぼす影響は過度に高い。現在のところ、炎症性腸疾患に対する治療法または根絶療法は全く存在しない。典型的に、潰瘍性大腸炎およびクローン病の両方とも、無制御の慢性的な粘膜炎症の発作と、その後の、寛解期中に起こる再形成プロセスとを伴う、起伏状の活性を示す。初期治療アプローチは通常、炎症性活性の発作を軽減し、寛解状態にある場合には将来の再発を防止するための薬物療法である。患者は、５−ＡＳＡ（例えばメサラジン）、ステロイド（例えばプレドニゾロン）、および免疫抑制剤（例えばアザチオプリン）を含むさまざまな薬物により治療することができる。さらに、標準的な薬物治療が機能しない場合には、患者は、新しい生物学的薬物、例えばモノクローナル抗体（例えば抗ＴＮＦ−α抗体インフリキシマブ）の投与を受ける場合もある。その全体的な効能にも関わらず、このような薬物には大きな負担が伴う可能性がある。これらの薬物は高価であるばかりでなく、副作用が一般的であり、免疫抑制剤ではその発生率は２８％、ステロイドに至っては５０％にのぼる。一部の患者は、全身感染症または新生組織形成などの重度の副作用を示す場合があり、したがって、現行の療法には密な監視が求められる。さらに、潰瘍性大腸炎患者のおよそ３０％、そしてクローン病患者の５０％が、その生涯のいずれかの時点で外科手術を必要とすることになる。
【０００４】
利用可能な薬物療法は、このような疾病の根絶または根治を達成することができず、これは主として潰瘍性大腸炎とクローン病の精確な病因がなおも解明されていないという事実に起因している。しかしながら、過去数年間で、粘膜炎症性病変を導く病態生理学的機序は少なくとも一部分が明らかにされている。炎症性腸疾患において見られる炎症が、腸内微生物叢と粘膜免疫系との間の伝達異常によりひき起こされることの、有力な証拠が存在している。病原体に対する粘膜免疫系のヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ）の防衛反応は、病原体の除去を目的とした炎症プロセスを伴うが、同時にこれらのプロセスは、宿主組織にも損傷を与える。正常な状況下では、一部の片利共生的腸内微生物は、腸内リンパ濾泡内の調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の誘発のために主要な役割を果たすと思われる。調節性Ｔリンパ球は、非病原性として認識される微生物抗原に応答して炎症を誘発しないことから、「免疫寛容」と呼ばれる現象の中心的存在である。調節性Ｔリンパ球により媒介される免疫寛容は、宿主が炎症を通して応答することなく腸内部または他の体表面上の無害の抗原の巨大な負担を寛容し得るようにする、不可欠なホメオスタシス機構である。一連の証拠により、遺伝的感受性を有する個体において、内腔細菌に対するＴｈリンパ球媒介型免疫が、腸内病変を生成しかつ／または病変の消散を妨害する炎症性プロセスの駆動における重要な事象であることが示唆される。腸内微生物叢と粘膜免疫コンパートメントとの相互作用不良は、慢性腸炎を導く異常をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
複数の研究から、炎症性腸疾患を患う対象と健康な対照の間では糞便微生物叢の組成が異なるということがわかっている。報告された差異は可変的であり、さまざまな研究の間でつねに一貫性があるわけではない。したがって、炎症性腸疾患患者と健康な人を区別するために、公開されている差異を使用することは不可能である。しかしながら、以上で説明した通り、常在腸内微生物は、一定の状況下で、炎症性腸疾患、特にクローン病の発症および維持における決定因子である。したがって、炎症性腸疾患の一貫性ある診断を可能にする新規で信頼性の高い方法に対するニーズがなおも存在する。
【０００６】
大部分の腸内片利共生生物は、培養不可能である。この制限を克服するために、ゲノム戦略が開発されてきた（ＨａｍａｄｙおよびＫｎｉｇｈｔ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、１９：１１４１−ｌｌ５２、２００９）。これらの戦略は、微生物叢のゲノム中に含まれる遺伝子の集合体としてミクロビオームを定義づけすることを可能にした（Ｔｕｒｎｂａｕｇｈら、Ｎａｔｕｒｅ、４４９：８０４−８０１０、２００７；ＨａｍａｄｙおよびＫｎｉｇｈｔ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９：１１４１−１１５２、２００９）。ヒトの腸内微生物叢の系統発生学上の核を構成する全ての個体が共有する少数の種の存在が、実証されている（Ｔａｐら、Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１（１０）：２５７４−２５８４、２００９）。近年、メタゲノム解析は、５７６．７ギガベースの配列に対応するヒトの腸の３３０万の非冗長性微生物遺伝子の広範なカタログを同定するに至った（Ｑｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８８２１）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、異なる個体におけるヒト糞便由来のＤＮＡ断片の単離および配列決定に基づく方法を使用した。腸由来の微生物遺伝子の広範なカタログが現在入手可能であることから（Ｑｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８８２１）、特定の個体群（例えば、炎症性腸疾患を患う患者群）における特定の配列のコピー数および頻度を計算することができる。こうして特定の遺伝子の存在および不存在と特定の病状の存在または不存在との間のあらゆる相関関係を同定することが可能である。さらに、個体内の特定の遺伝子のコピー数を決定することが可能である。
【０００８】
クローン病および潰瘍性大腸炎は、集合的に炎症性腸疾患と呼ばれる、消化管の慢性免疫炎症状態である。本発明者らは、クローン病または潰瘍性大腸炎を患う患者の一群と健康な人の対照群との間で著しく異なっている遺伝子を同定することができた。これらの遺伝子は表１（クローン病）および表２（潰瘍性大腸炎）に列挙されている。前記遺伝子は、患者の場合よりも健康な個体の場合の方が多い。この所見は、微生物遺伝子の総数が両方の個体群において異ならないため、統計学的に有意である。したがって、炎症性腸疾患を患う個体においては特定のヒト腸内微生物遺伝子の喪失が存在する。
【０００９】
本発明の第１の態様は、少なくとも１つの遺伝子が個体の腸内ミクロビオームにおいて不存在であるか否かを判定するステップを含む、炎症性腸疾患の診断方法である。「個体の腸内ミクロビオーム」とは、本明細書において、前記個体の微生物叢を構成する全ての遺伝子のことである。したがって、「個体の腸内ミクロビオーム」という用語は、前記個体の腸内に存在する全ての細菌の全ての遺伝子に対応する。
【００１０】
遺伝子は、ミクロビオーム中のそのコピー数が一定の閾値よりも低い場合、不存在である。本発明によると、「閾値」とは、問題の遺伝子のコピー数が個体のミクロビオーム中のコピー数の高低に対応している試料の判別を可能にする値を意味することが意図されている。詳細には、コピー数が閾値以下である場合には、ミクロビオーム中のこの遺伝子のコピー数は低いとみなされ、一方コピー数が閾値を超える場合には、ミクロビオーム中のこの遺伝子のコピー数は高いとみなされる。低いコピー数とは、遺伝子がミクロビオームに不存在であることを意味し、一方、高いコピー数は、遺伝子がミクロビオーム中に存在することを意味する。各々の遺伝子で、そして遺伝子のコピー数の測定に用いられる方法に応じて、最適な閾値は変動する場合がある。しかしながら、当業者であれば、コピー数（高低）がこの特定の遺伝子について公知である複数の個体のミクロビオームの解析に基づいて、かつ対照遺伝子のコピー数との比較に基づいて、それを容易に判定できる。
【００１１】
本発明の方法はこうして、当業者が個体の腸内ミクロビオーム由来の遺伝子の存在または不存在のみに基づいて病状を診断することを可能にする。特定の遺伝子のコピー数とこの遺伝子を担持する細菌細胞数との間には直接的相関関係が存在する。本発明の方法はこうして、当業者がミクロビオームの解析によって腸内毒素症、すなわち微生物の平衡失調を検出することを可能にする。腸内の種は、大部分が培養不能であるため、その全てが同定されているわけではなく、また同定は困難である。さらに、所与の個体の腸内に発見される大部分の種は希有であり、そのため、それらの検出は困難になっている（ＨａｍａｄｙおよびＫｎｉｇｈｔ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９：１１４１−１１５２、２００９）。本発明のこの第１の態様において、前記遺伝子が帰属する細菌種の事前の同定は全く必要とされない。したがって、本発明の診断方法は、公知の腸内細菌種の個体群における変化を判定することに制限されず、分類学的にまだ特徴づけされていない細菌をも包含する。
【００１２】
前記個体の腸内微生物ＤＮＡの試料を得るための方法はいくつか存在する（Ｓｏｋｏｌら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．、１４（６）：８５８−８６７、２００８）。例えば、結腸鏡検査によって得られる粘膜標本または生検材料を調製することが可能である。しかしながら、結腸鏡検査は、研究毎に収集手順が明確に定義されていない侵襲的処置である。同様にして、外科的処置を通して生検材料を得ることもまた可能である。しかしながら、結腸鏡検査よりもさらに増して、外科的処置は侵襲的処置であり、微生物個体群に対するその影響は未知である。好適であるのは、糞便分析であり、これは当該技術分野において高い信頼性で使用されてきた手順である（Ｂｕｌｌｏｃｋら、Ｃｕｒｒ Ｉｓｓｕｅｓ Ｉｎｔｅｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；５（２）：５９−６４、２００４；Ｍａｎｉｃｈａｎｈら、Ｇｕｔ、５５：２０５−２１１、２００６；Ｂａｋｉｒら、Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５６（５）：９３１−９３５、２００６；Ｍａｎｉｃｈａｎｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６（１６）：５１８０−５１８８、２００８；Ｓｏｋｏｌら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．、１４（６）：８５８−８６７、２００８）。この手順の一例は、実験例の方法の節で記載されている。糞便は、１グラム（湿重量）あたり約１０１１個の細菌細胞を含み、細菌細胞は糞塊の約５０％を構成する。糞便の微生物叢は、遠位大腸の微生物学を主に代表するものである。したがって、個体の糞便由来の微生物ＤＮＡを大量に単離し解析することが可能である。「微生物ＤＮＡ」とは、本明細書において、ヒトの腸の常在細菌集団のいずれかに由来するＤＮＡとして理解される。「微生物ＤＮＡ」という用語は、コード配列と非コード配列の両方を包含する。詳細には、それは、完全な遺伝子に限定されず、コード配列のフラグメントをも含む。したがって、糞便の分析は非侵襲的な手順であり、患者毎に、直接比較可能で一貫性のある結果を提供する。
【００１３】
したがって、好ましい実施形態においては、本発明の方法は、前記個体の糞便に由来する微生物ＤＮＡを得るステップを含む。さらに好ましい実施形態においては、前記個体由来の糞便が収集され、ＤＮＡが抽出され、個体の腸内ミクロビオームにおける少なくとも１つの遺伝子の存在または不存在が判定される。遺伝子の存在または不存在は、当業者にとって公知のあらゆる方法によって判定されてよい。例えば、前記個体のミクロビオーム全体の配列を決定し、前記遺伝子の存在または不存在を、バイオインフォマティクス方法を用いて検索してよい。このような戦略の一例は、実験例の方法の節で記載されている。代替的には、問題の遺伝子を、特異的プローブでのハイブリダイゼーション、例えばサザンハイブリダイゼーションによってミクロビオーム中で探してもよい。この特定の実施形態においてはサザンハイブリダイゼーションが完璧に適してはいるものの、それでもマイクロアレイを使用する方がさらに便利でかつ高感度であるということは、当業者には直ちに明らかである。さらに別の実施形態において、問題の遺伝子の存在は、増幅、詳細には定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって検出されてよい。これらの技術（サザン、マイクロアレイ、ｑＰＣＲなど）は現在、当業者が日常的に使用しているものであり、したがってここで詳述する必要はない。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、炎症性腸疾患はクローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態において、前記疾患はクローン病である。別のさらなる実施形態において、前記疾患は潰瘍性大腸炎である。
【００１５】
さらに別の好ましい実施形態において、個体の腸内ミクロビオームでの不存在または存在が判定される遺伝子は、表１および２に列挙されている遺伝子の群から選択される。さらに好ましい実施形態において、遺伝子は表１に列挙されている遺伝子の群から選択される。別のさらに好ましい実施形態において、遺伝子は表２に列挙されている遺伝子の群から選択される。当業者であれば、テストされる遺伝子の数が多くなればなるほど結果の信頼度は高くなるということを難なく理解するものである。別のさらに好ましい実施形態によると、本発明の方法は、表１に列挙される遺伝子の少なくとも５０％、より好ましくは表１の遺伝子の少なくとも７５％、さらに一層好ましくは表１の遺伝子の少なくとも９０％の存在または不存在を決定するステップを含む。別のさらに好ましい実施形態によると、本発明の方法は、表２に列挙されている遺伝子の少なくとも５０％、より好ましくは、表２の遺伝子の少なくとも７５％、さらに一層好ましくは表２の遺伝子の少なくとも９０％の存在または不存在を決定するステップを含む。
【００１６】
微生物叢内に見出される多数の細菌種が同定されていないものの、大部分の細菌がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属することがわかっている。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓなどの他の属は、より少ない程度で存在する。これらの属に帰属する個別の種の中には同定されているものもあり、これらの種の遺伝子の一部は公知である。３３０万個の非冗長微生物遺伝子の同定を導いた広範なメタゲノム研究から、大部分の新しい配列の割当ても同様に可能になった。所与の種に属する遺伝子は、前記種の他の全ての遺伝子と同じ頻度で一個体内に存在する。こうして、本発明の方法を通して同定された遺伝子の各々について、前記遺伝子の存在または不存在と、さまざまな個体内で特定の細菌種に属することが公知である一組の遺伝子の存在または不存在との間に相関関係が存在するか否かを判定することが可能である。このような相関関係は、未知の遺伝子が前記特定の細菌種に属することを示す。したがって、本発明者らは、一部の細菌種が炎症性腸疾患の表現型と連関し、一方、他の細菌種は健康な表現型と連関するということを示した。炎症性腸疾患の表現型は、前記種の線形的な組合せによって予測され得る。すなわち、一個体の腸内に炎症性腸疾患の表現型と連関する細菌種が多く存在すればするほど、また前記個体の腸内に健康な表現型と連関する種が少なければ少ないほど、前記個体が炎症性疾患を患う確率が高くなる。例えば、一人の人間の腸内のＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉおよびＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓの不存在、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍおよびＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓの存在は、この人がクローン病を患っていることを示す。同様にして、一個体の腸内のＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの不存在、ならびにＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍの存在は、この人間が潰瘍性大腸炎を患っていることを示す。
【００１７】
当業者にとっては、本発明の遺伝子を、例えば炎症性腸疾患を患う患者の治療中に、バイオマーカーとして使用できるということは明白である。したがって、別の実施形態においては、本発明は、炎症性腸疾患治療の有効性をモニタリングするための方法を含む。治療が炎症性腸疾患に有効である場合、当初観察された腸内毒素症は徐々に消失する。前記個体が病気である場合、この個体の腸には一部の特異的遺伝子（例えば疾患がクローン病である場合は表１の遺伝子、または個体が潰瘍性大腸炎を患っている場合は表２の遺伝子）が不存在であるが、これらの遺伝子は治療中に再度出現する。したがって、この実施形態において、本発明の方法は、前記患者のミクロビオームに少なくとも１つの遺伝子が不存在であるか否かをまず判定するステップと、治療を施すステップと、前記少なくとも１つの遺伝子が患者のミクロビオーム中に存在するか否かを判定するステップとを含んでいる。好ましい一実施形態において、本発明の方法は、治療の前と後に前記個体の糞便から微生物ＤＮＡを得るステップをも含んでいる。さらに好ましい実施形態においては、前記個体由来の糞便は、治療の前と後に収集され、ＤＮＡが抽出され、個体の腸内ミクロビオームにおける少なくとも１つの遺伝子の存在または不存在が判定される。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、炎症性腸疾患はクローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態において、前記疾患はクローン病であり、別のさらに好ましい実施形態において、前記疾患は潰瘍性大腸炎である。
【００１９】
さらに別の好ましい実施形態において、個体の腸内ミクロビオームでの不存在または存在が判定される遺伝子は、表１および２に列挙されている遺伝子の群から選択される。さらに好ましい実施形態において、遺伝子は表１に列挙されている遺伝子の群から選択される。別のさらに好ましい実施形態において、遺伝子は表２に列挙されている遺伝子の群から選択される。本発明の方法の特定の実施形態において、表１および／または表２の遺伝子の少なくとも５０％、７５％または９０％が、治療前の前記個体の腸内ミクロビオームに不存在である。したがって、好ましい実施形態によると、本発明の方法は、表１に列挙されている遺伝子の少なくとも５０％、より好ましくは表１に列挙されている遺伝子の少なくとも７５％、さらに一層好ましくは表１の遺伝子の少なくとも９０％の存在または不存在を判定するステップを含む。別の好ましい実施形態によると、本発明の方法は、表２に列挙されている遺伝子の少なくとも５０％、より好ましくは表２の遺伝子の少なくとも７５％、さらに一層好ましくは表２の遺伝子の少なくとも９０％の存在または不存在を判定するステップを含む。
【００２０】
本発明は同様に、炎症性腸疾患を患う患者の体内には不存在であり健康な人の体内には存在する全ての遺伝子を含む、本発明の方法の実施に専用のキットをも含んでいる。詳細には、本発明は、炎症性腸疾患を患う患者の体内には不存在であり健康な人の体内には存在する全ての遺伝子に結合するプローブを含む、本発明に係る方法の実施に専用のマイクロアレイに関する。好ましい実施形態において、前記マイクロアレイは、核酸マイクロアレイである。本発明によると、「核マイクロアレイ」は、マイクロチップ、スライドガラスまたはミクロスフェアサイズのビーズであり得る基材に付着された異なる核酸プローブで構成されている。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカもしくはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースで構成されていてよい。プローブは、核酸、例えばｃＤＮＡ（「ｃＤＮＡマイクロアレイ」）またはオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチドマイクロアレイ」、なおオリゴヌクレオチドの長さは約２５〜約６０塩基対以下である）であり得る。核酸技術の代替として、定量的ＰＣＲも使用してよく、したがって試験すべき遺伝子に特異的な増幅プライマーも本発明に係る方法を実施するために非常に有用である。したがって、本発明はさらに、上述の通りの専用マイクロアレイ、または炎症性腸疾患を患う患者の体内では不存在であり健康な人の体内には存在する遺伝子に特異的な増幅プライマーを含む、患者の炎症性腸疾患を診断するためのキットに関する。これらのキットは、当業者が前記遺伝子の１０％、２５％、５０％または７５％を検出することを可能にし得るが、前記遺伝子の９０％、９５％、９７．５％、またはさらには９９％の検出を可能にする場合に最も有用である。したがって、本発明に係るマイクロアレイは、前記遺伝子の少なくとも１０％、２５％、５０％または７５％、好ましくは９０％、９５％、９７．５％そしてさらに一層好ましくは少なくとも９９％に結合するプローブを含む。同様にして、定量的ＰＣＲ用のキットは、前記遺伝子の少なくとも１０％、２５％、５０％または７５％、好ましくは９０％、９５％、９７．５％そしてさらに一層好ましくは少なくとも９９％の増幅を可能にするプライマーを含むものである。
【００２１】
好ましい実施形態において、炎症性腸疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態において、前記疾患はクローン病であり、別のさらに好ましい実施形態において、前記疾患は潰瘍性大腸炎である。別の実施形態において、クローン病を患う患者の体内に不存在であり健康な人の体内には存在する遺伝子は、表１に列挙されている遺伝子であり、さらに別の実施形態において、これらの遺伝子は表２に列挙されている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＣＤ関連遺伝子とＵＣ関連遺伝子の包括的解析。Ａ）健康な個体の体内にはより多くのＣＤ関連遺伝子が存在する。ＣＤ関連遺伝子に応じた一個体あたりの遺伝子の数のプロットは、患者に比べて健康な個体において遺伝子が多いことを示している。Ｂ）健康な個体の体内にはより多くのＵＣ関連遺伝子が存在する。ＵＣ関連遺伝子の関数としての一個体あたりの遺伝子の数のプロットは、患者に比べて健康な個体において遺伝子が多いことを示している。
【図２】Ａ）５つの種の線形的な組合せが、規定されたレベル（遺伝子の少なくとも５０％）でそれらを有するコホートの部分について、クローン病の表現型を充分に判別している。Ｂ）３つの種が潰瘍性大腸炎について判別している。
【００２３】
方法
ヒト糞便試料の収集。スペイン人の個体は、健康な対照または、臨床的寛解期の慢性炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）を患う患者であった。患者および健康な対照には、凍結させた排泄物試料の提供を求めた。新鮮な排泄物試料を自宅で採取し、試料を自宅の冷凍庫に保管することによって直ちに凍結させた。凍結した試料を、断熱発泡スチロールのコンテナを用いて病院まで運び、その後、分析まで−８０℃で保管した。
【００２４】
ＤＮＡ抽出。各糞便試料の凍結したアリコート（２００ｍｇ）を、２５０μｌのチオシアン酸グアニジン、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）および４０μｌの１０％Ｎ−ラウロイルサルコシン中に懸濁させた。その後、以前に記述された通りに（Ｍａｎｉｃｈａｎｈら、Ｇｕｔ、５５：２０５−２１１、２００６）、ＤＮＡ抽出を行った。ＤＮＡ濃度およびその分子サイズを、ナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびアガロースゲル電気泳動によって推定した。
【００２５】
ＤＮＡライブラリーの構築および配列決定。ＤＮＡライブラリーを、メーカーの指示（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にしたがって調製した。クラスタ生成、鋳型ハイブリダイゼーション、等温増幅、線形化、遮断および変性、ならびに配列決定用プライマーのハイブリダイゼーションを実施するために、他の箇所で記載されたものと同じワークフローを使用した。蛍光原画像を処理し配列を呼び出すために、塩基呼び出しパイプライン（ＩｌｌｕｍｉｎａＰｉｐｅｌｉｎｅ−０．３バージョン）を使用した。実験再現性の検証のために、最初の１５の試料の各々について１つのライブラリー（クローンインサートサイズ２００ｂｐ）を構築し、そして残りの１０９の試料の各々について、異なるクローンインサートサイズ（１３５ｂｐおよび４００ｂｐ）を有する２つのライブラリーを構築した。新規な配列の生成と配列決定深度との間の最適なリターンを推定するため、本発明者らは、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＳＯＡＰ）（Ｌｉら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２５：１９６６−１９６７、２００９）、および９５％の配列同一性というマッチ要件を用いて、試料ＭＨ０００６およびＭＨ００１２から得られたＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡリードを、同じ２つの試料（それぞれ１５６．９および１５４．７Ｍｂ）から生成された合計３１１．７Ｍｂの４６８，３３５Ｓａｎｇｅｒリードに対してアラインした。約４ＧｂのＩｌｌｕｍｉｎａ配列で、Ｓａｎｇｅｒリードの９４％および８９％（それぞれＭＨ０００６およびＭＨ００１２について）がカバーされた。それぞれＭＨ０００６およびＭＨ００１２について１２．６および１６．６Ｇｂまでのさらなる広範な配列決定は、約９５％までの中程度のカバー率の増加しかもたらさなかった。Ｓａｎｇｅｒリードの９０％超が、非常に高く均一なレベルまで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列によってカバーされ、これは、ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡ配列にはほとんどまたは全く偏りが存在しないことを示す。予期した通り、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列の大部分（それぞれＭ０００６およびＭ００１２について５７％と７４％）は新規のものであり、Ｓａｎｇｅｒリード上にマッピングできなかった。この割合は、４および１２〜１６Ｇｂの配列決定レベルで類似しており、これにより、新規のものの大部分が４Ｇｂですでに捕捉されていることが裏付けられた。
【００２６】
本発明者らは、残りの１２２の試料について、３５４０万〜９７６０万のリードを生成し、平均は６２５０万リードであった。１５個の試料の最初のバッチの配列決定リード長は４４ｂｐであり、第２のバッチは７５ｂｐであった。
【００２７】
使用された公開データ。ＧｅｎＢａｎｋに寄託されていた配列決定済みの細菌ゲノム（合計８０６ゲノム）を、２００９年１月１０日にＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からダウンロードした。公知のヒト腸内細菌ゲノム配列を、ＨＭＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｍｐｄａｃｃ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｍｐ＿ｃａｔａｌｏｇ／ｍａｉｎ．ｃｇｉ）、ＧｅｎＢａｎｋ（６７ゲノム）、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓのワシントン大学（８５ゲノム、２００９年４月バージョン、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｏｒｇａｎｉｓｍ／Ｍｉｃｒｏｂｅｓ／Ｈｕｍａｎ＿Ｇｕｔ＿Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ／）からダウンロードし、ＭｅｔａＨＩＴプロジェクト（１７ゲノム、２００９年９月バージョン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐａｔｈｏｇｅｎｓ／ｍｅｔａｈｉｔ／）によって配列決定した。このプロジェクトで使用された他の腸内メタゲノムデータには、以下のものが含まれる：（１）登録番号ＳＲＡ００２７７５でＮＣＢＩからダウンロードされた、米国人個体から配列決定されたヒト腸メタゲノムデータ（Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０６：２３６５−２３７０、２００９）；（２）ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｏｒｋ．ｅｍｂｌ．ｄｅ）でＰ．Ｂｏｒｋのグループからダウンロードされた、日本人個体に由来するヒト腸内メタゲノムデータ（Ｋｕｒｏｋａｗａら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．１４：１６９−１８１、２００７）。本研究において本発明者らが構築した統合ＮＲデータベースは、ＮＣＢＩ−ＮＲデータベース（２００９年４月バージョン）および公知のヒト腸内細菌ゲノムに由来する全ての遺伝子を含んでいた。
【００２８】
ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡショートリードのデノボアセンブリ。各ＤＮＡ試料の高品質ショートリードを、ＳＯＡＰデノボアセンブラ（Ｌｉ．＆ Ｚｈｕ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、２０（２）：２６５−２７２、２０１０）によりアセンブルした。要するに、本発明者らはまず１７ｍｅｒの頻度にしたがってアセンブリから存在度の低い配列をフィルタリングした。５未満の深度の１７ｍｅｒを、アセンブリの前にスクリーニングしたが、これは、これらの低頻度配列がアセンブルされる可能性がきわめて低く、一方、それらを除去することで所要メモリーが著しく削減され、アセンブリは通常のスーパーコンピュータ（我々の研究機関では５１２ＧＢメモリー）で実現可能なものとなると考えられるからである。次に、配列を１つずつ処理し、Ｂｒｕｉｊｉｎグラフデータフォーマットを用いて、配列間のオーバーラップ情報を記憶した。単一のリードにより裏付けされたオーバーラップパスは信頼性が低く、除去された。配列決定のエラーまたは微生物株間の遺伝的ばらつきを原因とする短い低深度チップおよびバブルは、それぞれトリムおよびマージされた。リードパスを用いて、極小さい反復を解決した。最終的に、反復境界において連結を破断し、明確な連結をもつ連続配列をコンティグとして出力した。メタゲノム特殊モデルを選択し、パラメータ「−Ｋ２１」および「−Ｋ２３」をそれぞれ４４ｂｐと７５ｂｐのリードについて使用して、求められる最小の配列オーバーラップを示した。独立して各試料についてデノボアセンブリを行った後、アセンブルされていない全てのリードを共にマージし、それらについてアセンブリを実施して、データの使用を最大限にし、各リードセット内での頻度は低いものの全ての試料のデータを合わせることによるアセンブリには充分な配列深度を有する微生物ゲノムをアセンブルした。
【００２９】
Ｓａｎｇｅｒリードを用いたＩｌｌｕｍｉｎａコンティグの検証。ＢＬＡＳＴＮ（ＷＵＢＬＡＳＴ２．０）を用いて、試料ＭＨ０００６およびＭＨ００１２に由来するＳａｎｇｅｒリード（それぞれ１５６．９Ｍｂおよび１５４．７Ｍｂ）を、同じ試料に由来するＩｌｌｕｍｉｎａコンティグ（長さが７５ｂｐ超で同一性が９５％超の単一の最良ヒット）に対してマッピングした。アライメントの片端においてアラインされていなまま残された少なくとも５０個の塩基を両方の配列が有しているコリアリニティの崩壊について、各アライメントをスキャンした。このような崩壊は各々、コリアリニティが崩壊している場所におけるＩｌｌｕｍｉｎａコンティグ内のアセンブリエラーとみなされた。互いから３０ｂｐ以内のエラーは、マージされた。エラーの両側の６０ｂｐについてのコンティグ構造と一致するＳａｎｇｅｒリードが存在する場合、エラーは廃棄された。比較のため、本発明者らは、ＭＨ０００６由来の４５４Ｔｉｔａｎｉｕｍリード（５５０Ｍｂのリード）のＮｅｗｂｌｅｒ２アセンブリに対してこれを反復した。本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアセンブリについてコンティグの１Ｍｂあたり１４．１２個のエラーを推定し、これは、４５４アセンブリのもの（１Ｍｂあたり２０．７３）に匹敵している。少なくとも１つのＳａｎｇｅｒリードをマッピングするＩｌｌｕｍｉｎａコンティグの９８．７％は、マッピングされた領域の９９．５５％にわたりコリニアであったが、これは、このような４５４のコンティグの９７．８６％が、マッピングされた領域の９９．４８％にわたりコリニアであることに匹敵する。
【００３０】
ヒト腸内ミクロビオームのカバー率の評価。最初の３５ｂｐの領域内の多くとも２つのミスマッチおよびリード配列全体にわたる９０％の同一性を許容することにより、ＳＯＡＰを用いて、アセンブルされたコンティグおよび公知の細菌ゲノムに対して、ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡリードをアラインした。１×１０−８、１００ｂｐ超のアラインメント長、および最低９０％の同一性カットオフでＢＬＡＳＴＮを用いて、同じ基準に対して、Ｒｏｃｈｅ／４５４およびＳａｎｇｅｒ配列決定リードをアラインした。ＳＯＡＰにより、ＭＨ０００６およびＭＨ００１２のＧＡリード、同じ試料からのＳａｎｇｅｒリードに対してアラインした場合、二つのミスマッチが許容され、同一性はリード配列全体にわたり９５％に設定された。
【００３１】
非冗長遺伝子セットの遺伝子予測および構築。所与の配列のＧＣ含有量により推定されたジコドン頻度を使用し、かつ匿名ゲノム配列に基づきＯＲＦの全範囲を予測する、Ｍｅｔａ Ｇｅｎｅ（Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３４、５６２３−５６３０、２００６）を用いて、１２４の試料各々のコンティグから、ならびにマージされたアセンブリのコンティグから、ＯＲＦを見出す。その後、予測されたＯＲＦをＢＬＡＴ（Ｋｅｎｔら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１２：６５６−６６４、２００２）を用いて互いにアラインした。９５％超の同一性、およびより短い遺伝子の９０％にわたりカバーされたアライン長を有する遺伝子対を、グループにまとめた。次に遺伝子を共有するグループをマージし、マージされたグループの各々の中の最長のＯＲＦを用いてそのグループの代表とし、グループの他のメンバーを冗長性とみなした。したがって、本発明者らは、冗長性を排除することにより、予測された遺伝子の全てから非冗長性遺伝子セットを組織した。最後に、１００ｂｐ未満の長さを有するＯＲＦがフィルタリングされた。ＮＣＢＩ遺伝子コードを用いてＯＲＦをタンパク質配列に翻訳した（Ｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、．６：７７６−７８８、２００８）。
【００３２】
遺伝子の同定。存在度の低い遺伝子を同定することと同定のエラー率を削減することとの間のバランスを保つため、本発明者らは、個別のミクロビオーム中の遺伝子を同定するために必要とされるリードカバー率について設定された閾値の影響を調査した。同定に必要とされるリードの数が２から６に増加した時点で、遺伝子数は約２分の１に減少し、その後はゆっくりと変化した。それでも、希少な遺伝子を解析に含み入れるために、本発明者らは、２回のリードの閾値を選択した。
【００３３】
遺伝子の分類学的割当て。予測された遺伝子の分類学的割当ては、統合ＮＲデータベースに対するＢＬＡＳＴＰアライメントを用いて実施された。１×１０−５より大きいｅ値でＢＬＡＳＴＰアライメントのヒットをフィルタリングし、各々の遺伝子について、ｅ値≦１０×トップヒットのｅ値により定義づけされた有意なマッチを、分類学的グループを区別するために保持した。その後、ＭＥＧＡＮ（Ｈｕｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１７：３７７−３８６、２００７）で実行された最近共通祖先（ＬＣＡ）ベースのアルゴリズムにより、各遺伝子の分類学的レベルを判定した。ＬＣＡベースのアルゴリズムは、割当てられた分類群の分類学的レベルが遺伝子の保存レベルを反映するような形で、遺伝子を分類群に割当てる。例えば、遺伝子が数多くの種に保存されていた場合、それは、種ではなくむしろＬＣＡに割当てられた。
【００３４】
遺伝子の機能的分類。ＢＬＡＳＴＰを用いて、ｅ値≦１×１０−５で、ｅｇｇＮＯＧデータベース（Ｊｅｎｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６：Ｄ２５０−Ｄ２５４、２００８）とＫＥＧＧデータベース（Ｋａｎｅｈｉｓａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３２：Ｄ２７７−Ｄ２８０、２００４）内で予測された遺伝子のタンパク質配列を検索した。最低のｅ値を有するＮＯＧホモログまたはＫＥＧＧホモログに応じて、遺伝子に注釈付けした。ｅｇｇＮＯＧデータベースは、ＣＯＧおよびＫＯＧデータベースの統合である。ＣＯＧで注釈付けされた遺伝子は、２５のＣＯＧカテゴリーに分類され、ＫＥＧＧにより注釈付けされた遺伝子は、ＫＥＧＧパスウェイ内に割当てられた。
【００３５】
最小腸内細菌ゲノムの決定。ｅｇｇＮＯＧクラスタに割当てられた非冗長遺伝子の数は、遺伝子の長さとクラスタコピー数で正規化された。クラスタを、正規化された遺伝子数によりランキングし、不可欠のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子をコードするクラスタを含んでいた範囲を決定し、１００個のクラスタの連続的グループ内のこれらのクラスタの割合を計算した。遺伝子クラスタの範囲の解析には、ｉＰａｔｈ画像以外に、ＫＥＧＧの使用ならびにパスウェイの完全性およびそれらがコードするタンパク質機構の手動の確認を用いた。
【００３６】
全機能的補体と最小メタゲノムの決定。本発明者らは、ｎ個の個体（ｎ＝５２〜１２４、１ビンあたり１００の複製）のランダムな組合せ中に存在するオルソロググループおよび／または遺伝子ファミリーの合計数および共有数を計算した。この解析は、遺伝子クラスタの次の３つのグループについて実施された：（１）公知のｅｇｇＮＯＧオルソロググループ（すなわち、［Ｕｕ］ｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉ［ｓｚ］ｅｄ、［Ｕｕ］ｎｋｎｏｗｎ、［Ｐｐ］ｒｅｄｉｃｔｅｄまたは［Ｐｐ］ｕｔａｔｉｖｅという用語が存在するものを除く、機能的注釈付けを伴うグループ）；（２）全てのｅｇｇＮＯＧオルソロググループ；（３）以上の２つのカテゴリーに割当てされなかった残りの遺伝子から構築された遺伝子ファミリーを加えた、全てのオルソロググループ。ファミリーは、１．１の拡大要因と６０というビットスコアカットオフでＭＣＬ（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ、Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖ．Ｕｔｒｅｃｈｔ、２０００）を用いて、総当りＢＬＡＳＴＰの結果からクラスタ化された。
【００３７】
希薄化解析。メモリーによる制限のため１００個の無作為にピックアップした試料について、ＥｓｔｉｍａｔｅＳを用いて、全遺伝子豊富度の推定を行った。ＣＶ値は０．５超であったことから、Ｃｈａｏ２豊富度推定量（従来のもの）およびＩＣＥ豊富度推定量を計算し、２つのうちの大きい方の推定値（ＩＣＥ）を使用した。この試料サイズについての推定値は、３，６２１，６４６個の遺伝子（ＩＣＥ）であり、一方Ｓｏｂｓ（Ｍａｏ Ｔａｕ）は３，０９０，５７５個の遺伝子、つまり８５．３％であった。ＩＣＥの推定量曲線は、完全には飽和せず、このことは、最終的な決定的推定値を達成するためには、追加の試料を加える必要があることを示していた。
【００３８】
共通の細菌核。非常に類似した株の影響を除去し、コホートの個体中の公知の微生物種の存在を評価するために、本発明者らは基準セットとして６５０の配列決定された細菌ゲノムおよび古細菌ゲノムを使用した。このセットは、９３２個の公的に入手可能なゲノムで構成され、これらのゲノムは、９０％の同一性カットオフと少なくとも８０％の長さにわたる類似性とを用いて、類似性によってグループ分けされた。各グループから最大のゲノムのみが使用された。１２４の個体に由来するＩｌｌｕｍｉｎａリードを、種プロファイリング解析のためにセットにマッピングし、同じ種に由来するゲノム（サイズを２０％超異なるようにすることによる）を、手作業での検査によって、かつ配列が入手可能である場合には１６Ｓベースのクラスタ化を用いることによって、キュレートした。
【００３９】
個体間の微生物ゲノムの相対的存在度。本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリードを一意的にマッピングすることによりゲノムカバー率を計算し、それを１Ｇｂの配列に正規化して、異なる個体における異なる配列決定レベルについて矯正した。カバー率を、各個体についての非冗長細菌ゲノムセットの全ての種にわたって合計し、この合計に対するそれぞれの種の割合を計算した。
【００４０】
種の共存ネットワーク。少なくとも１つの個体内で１％以上のＩｌｌｕｍｉｎａリードによるゲノムカバー率を有していた１５５の種について、本発明者らは、１２４の個体のコホート全体を通した配列決定深度（存在度）間のペアワイズ種間ピアソン相関を計算した。結果として得た１１，１７５の種間相関から、グラフ内のノードサイズとして各々の種の平均ゲノムカバー率を表示するＣｙｔｏｓｃａｐｅ（Ｓｈａｎｎｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：２４９８−２５０４、２００３）を用いて、グラフの形で、−０．４未満または０．４超（ｎ＝３４２）の相関を視覚化した。
【００４１】
結果
使用されたコホートおよび方法の要約説明。コホートのサイズは、クローン病については患者８名と健康な対照１３名であり、潰瘍性大腸炎については患者１２名と健康な対照１２名であった。各々の疾患について、遺伝子３３０万個の遺伝子カタログ全体を、２つのグループ間で有意に異なっているものについて、順位和検索によって検索した。遺伝子サイズ（より大きな遺伝子はより大きい標的であり、より多く見られる）および異なる個体についての配列決定範囲の差によって、遺伝子頻度を正規化した。有意に異なる遺伝子の数は、閾値およびグループ分割により影響される。手短かに言うと、ｐ＜３×１０−４で３８０２の「ＣＤ（クローン病）関連遺伝子」が発見され、Ｐ＜１０−３で４８４１の「ＵＣ（潰瘍性大腸炎）関連遺伝子」が発見された。
【００４２】
ＢＭＩ遺伝子の包括的解析。個体別に、有意に異なる遺伝子、すなわちＣＤ関連遺伝子（図１Ａ）またはＵＣ関連遺伝子（図１Ｂ）のいずれかをプロットした。健康な個体におけるＣＤ関連遺伝子数の中央値は３０３８であり、クローン病患者においてはわずか６４３であった。遺伝子数の中央値は、２つのグループ間で非常に有意に異なっている（ｐ＜２×１０−１３、片側ｔ検定）。同様にして、ＵＣ関連遺伝子数の中央値は、健康な個体において３４０２であり、潰瘍性大腸炎を患う患者においては１２１２であった。差異は統計学的に異なるものである（Ｐ＜６．７×１０−５、片側ｔ検定）。
【００４３】
全ての遺伝子およびＣＤ関連遺伝子またはＵＣ関連遺伝子の分布比較。ミクロビオームの全ての遺伝子およびＣＤ関連遺伝子またはＵＣ関連遺伝子の分布を比較した。ＣＤ関連遺伝子またはＵＣ関連遺伝子に比べて、２つのグループの間で全遺伝子の数および頻度の差ははるかに小さいものである。ＣＤ関連遺伝子の分布は、全遺伝子分布を単純には反映していない。同様に、ＵＣ関連遺伝子の分布も、遺伝子分布の一般的傾向を単純には反映していない。したがって、クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者における遺伝子の喪失は、有意である。
【００４４】
ＣＤ関連種およびＵＣ関連種。３３０万のカタログ中の遺伝子に帰属する分類学的割当てを用いて、ＣＤ関連遺伝子およびＵＣ関連遺伝子を種に割当てた（Ｑｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、ｉｎ ｐｒｅｓｓ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８８２１）。ＣＤ関連遺伝子の６８％、ただし全遺伝子のわずか３２．８％だけが、ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ由来であることが発見された。一方で、ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの頻度は、ＣＤ関連遺伝子について２２％、ミクロビオームの全遺伝子については１８．４％であった。同様にして、ＵＣ関連遺伝子の７０％がｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ由来であり、わずか１５％がｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ由来であった。したがって、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎はｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓにおける変化と連関される。種は、まず、ＣＤ関連遺伝子およびＵＣ関連遺伝子のうちでそれらの種に割当てられた遺伝子の数によって同定された。その後、同じ種に由来する他の遺伝子をカタログから引き出し、異なる個体内で各々の種についての５０の代表的な遺伝子の存在を査定した（これは、種を同定するために現在行われている単一の１６Ｓ遺伝子の使用と比較して全く遜色がなかった）。種は、マーカー遺伝子の少なくとも半分が一個体中に発見された場合に、存在するものとみなされた。健康な人と患者との間の分布の有意性は、カイ二乗検定を用いて、全コホート分布（クローン病については１３対８、潰瘍性大腸炎については１２対１２）と比較することによって推定された。クローン病についてはＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉおよびＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓが、健康な個体群と連関された（それぞれ、ｐ＝２．４×１０−２およびｐ＝９．３×１０−３）。すなわちこれらは、患者には不存在である傾向にあった。一方で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍおよびＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓが患者コホートと連関された（ｐ＝４×１０−３、ｐ＝１．８×１０−３およびｐ＝６．４×１０−３）。種の同定に基づいて、これら５つの種の線形組合せが、クローン病表現型を完全に予測することが実証された（図２Ａ）。健康な個体および患者は、それぞれ青色および赤色の点として示されている。種の存在（縦座標）は、遺伝子の合計、すなわち（クローン病と逆連関された）「優良な種」の遺伝子から（クローン病と連関された）「不良種」の遺伝子を差し引いたものに対応する。個体は、種の存在によってランキングされる（横座標）。個体は、「優良種」遺伝子が上回っている場合、ランクの最上部にあり、健康である傾向をもち、一方、「不良種」が上回っている場合、その個体は右側にあり、病気を患う傾向をもつ。潰瘍性大腸炎については、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが健康な表現型と連関され、一方Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍが患者個体群と連関された。図２Ｂに示されている通り、３つの種の線形組合せが、潰瘍性大腸炎表現型を予測している。
【００４５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
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【表４５】
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【表４９】
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【表５１】
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【表５７】
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【表６０】
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【表９０】
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【表２１７】
【表２１８】
【表２１９】
【表２２０】
【表２２１】
【表２２２】
【表２２３】
【表２２４】
【表２２５】
【表２２６】
【表２２７】
【表２２８】
【表２２９】
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【表２３１】
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【表２９１】
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【表５２５】
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【表５７８】
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【表５９２】
【表５９３】
【表５９４】
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【表５９８】
【表５９９】
【表６００】
【表６０１】
【表６０２】
【表６０３】
【表６０４】
【表６０５】
【表６０６】
【表６０７】
【表６０８】
【表６０９】
【表６１０】
【表６１１】
【表６１２】
【表６１３】
【表６１４】
【表６１５】
【表６１６】
【表６１７】
【表６１８】
【表６１９】
【表６２０】
【表６２１】
【表６２２】
【表６２３】
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４６】
【非特許文献１】Ｑｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８８２１
【非特許文献２】Ｓｏｋｏｌら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．、１４（６）：８５８−８６７、２００８
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
炎症性腸疾患は、胃腸管の異なるレベルにおける持続的な粘膜炎症を特徴とする原因不明の慢性障害である。潰瘍性大腸炎およびクローン病が、炎症性腸疾患の２つの主要なタイプである。潰瘍性大腸炎は、結腸に限定された連続的な粘膜炎症をひき起こし、一方、クローン病は、胃腸管全体を通してあらゆるところに不連続的な貫壁性炎症をひき起こすが、回腸終端部に影響を及ぼすことが最も多い。最も一般的な腸内病変は、粘膜潰瘍形成、腸壁膨張、および腸内腔狭窄からなる。これらの慢性炎症性病変は、下痢、便意切迫、腹痛、および発熱、ならびに出血、腸閉塞、敗血症、および栄養失調を含む、さまざまな重症度の合併症などの症候をひき起こす場合がある。
【背景技術】
【０００２】
疫学的研究により、１９５０年以降前世紀の間に西欧および北米におけるこのような疾病の発症率が確実に増大していることが実証された。南欧および日本では、発症率の上昇は、２０年遅れて到来したが、今日では発症率は北欧や北米と同じように高い。最近のデータは、東欧諸国ならびに東南アジアにおける発症率の増加を示唆している。発症率の変化は、食習慣の変化ならびに公衆衛生の改善および工業化などの環境の変化を含むライフスタイルの西欧化に関係していると思われる。今日、複合有病率（潰瘍性大腸炎とクローン病）の数字は、先進諸国の人口の０．５％に至るまでが炎症性腸疾患に侵されていることを示唆している。
【０００３】
炎症性腸疾患は多くの場合若齢で発症し、生涯を通じた健康障害をひき起こす潜在性を有することから、炎症性腸疾患が社会に及ぼす影響は過度に高い。現在のところ、炎症性腸疾患に対する治療法または根絶療法は全く存在しない。典型的に、潰瘍性大腸炎およびクローン病の両方とも、無制御の慢性的な粘膜炎症の発作と、その後の、寛解期中に起こる再形成プロセスとを伴う、起伏状の活性を示す。初期治療アプローチは通常、炎症性活性の発作を軽減し、寛解状態にある場合には将来の再発を防止するための薬物療法である。患者は、５−ＡＳＡ（例えばメサラジン）、ステロイド（例えばプレドニゾロン）、および免疫抑制剤（例えばアザチオプリン）を含むさまざまな薬物により治療することができる。さらに、標準的な薬物治療が機能しない場合には、患者は、新しい生物学的薬物、例えばモノクローナル抗体（例えば抗ＴＮＦ−α抗体インフリキシマブ）の投与を受ける場合もある。その全体的な効能にも関わらず、このような薬物には大きな負担が伴う可能性がある。これらの薬物は高価であるばかりでなく、副作用が一般的であり、免疫抑制剤ではその発生率は２８％、ステロイドに至っては５０％にのぼる。一部の患者は、全身感染症または新生組織形成などの重度の副作用を示す場合があり、したがって、現行の療法には密な監視が求められる。さらに、潰瘍性大腸炎患者のおよそ３０％、そしてクローン病患者の５０％が、その生涯のいずれかの時点で外科手術を必要とすることになる。
【０００４】
利用可能な薬物療法は、このような疾病の根絶または根治を達成することができず、これは主として潰瘍性大腸炎とクローン病の精確な病因がなおも解明されていないという事実に起因している。しかしながら、過去数年間で、粘膜炎症性病変を導く病態生理学的機序は少なくとも一部分が明らかにされている。炎症性腸疾患において見られる炎症が、腸内微生物叢と粘膜免疫系との間の伝達異常によりひき起こされることの、有力な証拠が存在している。病原体に対する粘膜免疫系のヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ）の防衛反応は、病原体の除去を目的とした炎症プロセスを伴うが、同時にこれらのプロセスは、宿主組織にも損傷を与える。正常な状況下では、一部の片利共生的腸内微生物は、腸内リンパ濾泡内の調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の誘発のために主要な役割を果たすと思われる。調節性Ｔリンパ球は、非病原性として認識される微生物抗原に応答して炎症を誘発しないことから、「免疫寛容」と呼ばれる現象の中心的存在である。調節性Ｔリンパ球により媒介される免疫寛容は、宿主が炎症を通して応答することなく腸内部または他の体表面上の無害の抗原の巨大な負担を寛容し得るようにする、不可欠なホメオスタシス機構である。一連の証拠により、遺伝的感受性を有する個体において、内腔細菌に対するＴｈリンパ球媒介型免疫が、腸内病変を生成しかつ／または病変の消散を妨害する炎症性プロセスの駆動における重要な事象であることが示唆される。腸内微生物叢と粘膜免疫コンパートメントとの相互作用不良は、慢性腸炎を導く異常をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
複数の研究から、炎症性腸疾患を患う対象と健康な対照の間では糞便微生物叢の組成が異なるということがわかっている。報告された差異は可変的であり、さまざまな研究の間でつねに一貫性があるわけではない。したがって、炎症性腸疾患患者と健康な人を区別するために、公開されている差異を使用することは不可能である。しかしながら、以上で説明した通り、常在腸内微生物は、一定の状況下で、炎症性腸疾患、特にクローン病の発症および維持における決定因子である。したがって、炎症性腸疾患の一貫性ある診断を可能にする新規で信頼性の高い方法に対するニーズがなおも存在する。
【０００６】
大部分の腸内片利共生生物は、培養不可能である。この制限を克服するために、ゲノム戦略が開発されてきた（ＨａｍａｄｙおよびＫｎｉｇｈｔ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、１９：１１４１−ｌｌ５２、２００９）。これらの戦略は、微生物叢のゲノム中に含まれる遺伝子の集合体としてミクロビオームを定義づけすることを可能にした（Ｔｕｒｎｂａｕｇｈら、Ｎａｔｕｒｅ、４４９：８０４−８０１０、２００７；ＨａｍａｄｙおよびＫｎｉｇｈｔ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９：１１４１−１１５２、２００９）。ヒトの腸内微生物叢の系統発生学上の核を構成する全ての個体が共有する少数の種の存在が、実証されている（Ｔａｐら、Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１（１０）：２５７４−２５８４、２００９）。近年、メタゲノム解析は、５７６．７ギガベースの配列に対応するヒトの腸の３３０万の非冗長性微生物遺伝子の広範なカタログを同定するに至った（Ｑｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８８２１）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、異なる個体におけるヒト糞便由来のＤＮＡ断片の単離および配列決定に基づく方法を使用した。腸由来の微生物遺伝子の広範なカタログが現在入手可能であることから（Ｑｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８８２１）、特定の個体群（例えば、炎症性腸疾患を患う患者群）における特定の配列のコピー数および頻度を計算することができる。こうして特定の遺伝子の存在および不存在と特定の病状の存在または不存在との間のあらゆる相関関係を同定することが可能である。さらに、個体内の特定の遺伝子のコピー数を決定することが可能である。
【０００８】
クローン病および潰瘍性大腸炎は、集合的に炎症性腸疾患と呼ばれる、消化管の慢性免疫炎症状態である。本発明者らは、クローン病または潰瘍性大腸炎を患う患者の一群と健康な人の対照群との間で著しく異なっている遺伝子を同定することができた。これらの遺伝子は表１（クローン病）および表２（潰瘍性大腸炎）に列挙されている。前記遺伝子は、患者の場合よりも健康な個体の場合の方が多い。この所見は、微生物遺伝子の総数が両方の個体群において異ならないため、統計学的に有意である。したがって、炎症性腸疾患を患う個体においては特定のヒト腸内微生物遺伝子の喪失が存在する。
【０００９】
本発明の第１の態様は、少なくとも１つの遺伝子が個体の腸内ミクロビオームにおいて不存在であるか否かを判定するステップを含む、炎症性腸疾患の診断方法である。「個体の腸内ミクロビオーム」とは、本明細書において、前記個体の微生物叢を構成する全ての遺伝子のことである。したがって、「個体の腸内ミクロビオーム」という用語は、前記個体の腸内に存在する全ての細菌の全ての遺伝子に対応する。
【００１０】
遺伝子は、ミクロビオーム中のそのコピー数が一定の閾値よりも低い場合、不存在である。本発明によると、「閾値」とは、問題の遺伝子のコピー数が個体のミクロビオーム中のコピー数の高低に対応している試料の判別を可能にする値を意味することが意図されている。詳細には、コピー数が閾値以下である場合には、ミクロビオーム中のこの遺伝子のコピー数は低いとみなされ、一方コピー数が閾値を超える場合には、ミクロビオーム中のこの遺伝子のコピー数は高いとみなされる。低いコピー数とは、遺伝子がミクロビオームに不存在であることを意味し、一方、高いコピー数は、遺伝子がミクロビオーム中に存在することを意味する。各々の遺伝子で、そして遺伝子のコピー数の測定に用いられる方法に応じて、最適な閾値は変動する場合がある。しかしながら、当業者であれば、コピー数（高低）がこの特定の遺伝子について公知である複数の個体のミクロビオームの解析に基づいて、かつ対照遺伝子のコピー数との比較に基づいて、それを容易に判定できる。
【００１１】
本発明の方法はこうして、当業者が個体の腸内ミクロビオーム由来の遺伝子の存在または不存在のみに基づいて病状を診断することを可能にする。特定の遺伝子のコピー数とこの遺伝子を担持する細菌細胞数との間には直接的相関関係が存在する。本発明の方法はこうして、当業者がミクロビオームの解析によって腸内毒素症、すなわち微生物の平衡失調を検出することを可能にする。腸内の種は、大部分が培養不能であるため、その全てが同定されているわけではなく、また同定は困難である。さらに、所与の個体の腸内に発見される大部分の種は希有であり、そのため、それらの検出は困難になっている（ＨａｍａｄｙおよびＫｎｉｇｈｔ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９：１１４１−１１５２、２００９）。本発明のこの第１の態様において、前記遺伝子が帰属する細菌種の事前の同定は全く必要とされない。したがって、本発明の診断方法は、公知の腸内細菌種の個体群における変化を判定することに制限されず、分類学的にまだ特徴づけされていない細菌をも包含する。
【００１２】
前記個体の腸内微生物ＤＮＡの試料を得るための方法はいくつか存在する（Ｓｏｋｏｌら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．、１４（６）：８５８−８６７、２００８）。例えば、結腸鏡検査によって得られる粘膜標本または生検材料を調製することが可能である。しかしながら、結腸鏡検査は、研究毎に収集手順が明確に定義されていない侵襲的処置である。同様にして、外科的処置を通して生検材料を得ることもまた可能である。しかしながら、結腸鏡検査よりもさらに増して、外科的処置は侵襲的処置であり、微生物個体群に対するその影響は未知である。好適であるのは、糞便分析であり、これは当該技術分野において高い信頼性で使用されてきた手順である（Ｂｕｌｌｏｃｋら、Ｃｕｒｒ Ｉｓｓｕｅｓ Ｉｎｔｅｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；５（２）：５９−６４、２００４；Ｍａｎｉｃｈａｎｈら、Ｇｕｔ、５５：２０５−２１１、２００６；Ｂａｋｉｒら、Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５６（５）：９３１−９３５、２００６；Ｍａｎｉｃｈａｎｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６（１６）：５１８０−５１８８、２００８；Ｓｏｋｏｌら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．、１４（６）：８５８−８６７、２００８）。この手順の一例は、実験例の方法の節で記載されている。糞便は、１グラム（湿重量）あたり約１０１１個の細菌細胞を含み、細菌細胞は糞塊の約５０％を構成する。糞便の微生物叢は、遠位大腸の微生物学を主に代表するものである。したがって、個体の糞便由来の微生物ＤＮＡを大量に単離し解析することが可能である。「微生物ＤＮＡ」とは、本明細書において、ヒトの腸の常在細菌集団のいずれかに由来するＤＮＡとして理解される。「微生物ＤＮＡ」という用語は、コード配列と非コード配列の両方を包含する。詳細には、それは、完全な遺伝子に限定されず、コード配列のフラグメントをも含む。したがって、糞便の分析は非侵襲的な手順であり、患者毎に、直接比較可能で一貫性のある結果を提供する。
【００１３】
したがって、好ましい実施形態においては、本発明の方法は、前記個体の糞便に由来する微生物ＤＮＡを得るステップを含む。さらに好ましい実施形態においては、前記個体由来の糞便が収集され、ＤＮＡが抽出され、個体の腸内ミクロビオームにおける少なくとも１つの遺伝子の存在または不存在が判定される。遺伝子の存在または不存在は、当業者にとって公知のあらゆる方法によって判定されてよい。例えば、前記個体のミクロビオーム全体の配列を決定し、前記遺伝子の存在または不存在を、バイオインフォマティクス方法を用いて検索してよい。このような戦略の一例は、実験例の方法の節で記載されている。代替的には、問題の遺伝子を、特異的プローブでのハイブリダイゼーション、例えばサザンハイブリダイゼーションによってミクロビオーム中で探してもよい。この特定の実施形態においてはサザンハイブリダイゼーションが完璧に適してはいるものの、それでもマイクロアレイを使用する方がさらに便利でかつ高感度であるということは、当業者には直ちに明らかである。さらに別の実施形態において、問題の遺伝子の存在は、増幅、詳細には定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって検出されてよい。これらの技術（サザン、マイクロアレイ、ｑＰＣＲなど）は現在、当業者が日常的に使用しているものであり、したがってここで詳述する必要はない。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、炎症性腸疾患はクローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態において、前記疾患はクローン病である。別のさらなる実施形態において、前記疾患は潰瘍性大腸炎である。
【００１５】
さらに別の好ましい実施形態において、個体の腸内ミクロビオームでの不存在または存在が判定される遺伝子は、表１および２に列挙されている遺伝子の群から選択される。さらに好ましい実施形態において、遺伝子は表１に列挙されている遺伝子の群から選択される。別のさらに好ましい実施形態において、遺伝子は表２に列挙されている遺伝子の群から選択される。当業者であれば、テストされる遺伝子の数が多くなればなるほど結果の信頼度は高くなるということを難なく理解するものである。別のさらに好ましい実施形態によると、本発明の方法は、表１に列挙される遺伝子の少なくとも５０％、より好ましくは表１の遺伝子の少なくとも７５％、さらに一層好ましくは表１の遺伝子の少なくとも９０％の存在または不存在を決定するステップを含む。別のさらに好ましい実施形態によると、本発明の方法は、表２に列挙されている遺伝子の少なくとも５０％、より好ましくは、表２の遺伝子の少なくとも７５％、さらに一層好ましくは表２の遺伝子の少なくとも９０％の存在または不存在を決定するステップを含む。
【００１６】
微生物叢内に見出される多数の細菌種が同定されていないものの、大部分の細菌がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属することがわかっている。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓなどの他の属は、より少ない程度で存在する。これらの属に帰属する個別の種の中には同定されているものもあり、これらの種の遺伝子の一部は公知である。３３０万個の非冗長微生物遺伝子の同定を導いた広範なメタゲノム研究から、大部分の新しい配列の割当ても同様に可能になった。所与の種に属する遺伝子は、前記種の他の全ての遺伝子と同じ頻度で一個体内に存在する。こうして、本発明の方法を通して同定された遺伝子の各々について、前記遺伝子の存在または不存在と、さまざまな個体内で特定の細菌種に属することが公知である一組の遺伝子の存在または不存在との間に相関関係が存在するか否かを判定することが可能である。このような相関関係は、未知の遺伝子が前記特定の細菌種に属することを示す。したがって、本発明者らは、一部の細菌種が炎症性腸疾患の表現型と連関し、一方、他の細菌種は健康な表現型と連関するということを示した。炎症性腸疾患の表現型は、前記種の線形的な組合せによって予測され得る。すなわち、一個体の腸内に炎症性腸疾患の表現型と連関する細菌種が多く存在すればするほど、また前記個体の腸内に健康な表現型と連関する種が少なければ少ないほど、前記個体が炎症性疾患を患う確率が高くなる。例えば、一人の人間の腸内のＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉおよびＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓの不存在、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍおよびＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓの存在は、この人がクローン病を患っていることを示す。同様にして、一個体の腸内のＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの不存在、ならびにＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍの存在は、この人間が潰瘍性大腸炎を患っていることを示す。
【００１７】
当業者にとっては、本発明の遺伝子を、例えば炎症性腸疾患を患う患者の治療中に、バイオマーカーとして使用できるということは明白である。したがって、別の実施形態においては、本発明は、炎症性腸疾患治療の有効性をモニタリングするための方法を含む。治療が炎症性腸疾患に有効である場合、当初観察された腸内毒素症は徐々に消失する。前記個体が病気である場合、この個体の腸には一部の特異的遺伝子（例えば疾患がクローン病である場合は表１の遺伝子、または個体が潰瘍性大腸炎を患っている場合は表２の遺伝子）が不存在であるが、これらの遺伝子は治療中に再度出現する。したがって、この実施形態において、本発明の方法は、前記患者のミクロビオームに少なくとも１つの遺伝子が不存在であるか否かをまず判定するステップと、治療を施すステップと、前記少なくとも１つの遺伝子が患者のミクロビオーム中に存在するか否かを判定するステップとを含んでいる。好ましい一実施形態において、本発明の方法は、治療の前と後に前記個体の糞便から微生物ＤＮＡを得るステップをも含んでいる。さらに好ましい実施形態においては、前記個体由来の糞便は、治療の前と後に収集され、ＤＮＡが抽出され、個体の腸内ミクロビオームにおける少なくとも１つの遺伝子の存在または不存在が判定される。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、炎症性腸疾患はクローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態において、前記疾患はクローン病であり、別のさらに好ましい実施形態において、前記疾患は潰瘍性大腸炎である。
【００１９】
さらに別の好ましい実施形態において、個体の腸内ミクロビオームでの不存在または存在が判定される遺伝子は、表１および２に列挙されている遺伝子の群から選択される。さらに好ましい実施形態において、遺伝子は表１に列挙されている遺伝子の群から選択される。別のさらに好ましい実施形態において、遺伝子は表２に列挙されている遺伝子の群から選択される。本発明の方法の特定の実施形態において、表１および／または表２の遺伝子の少なくとも５０％、７５％または９０％が、治療前の前記個体の腸内ミクロビオームに不存在である。したがって、好ましい実施形態によると、本発明の方法は、表１に列挙されている遺伝子の少なくとも５０％、より好ましくは表１に列挙されている遺伝子の少なくとも７５％、さらに一層好ましくは表１の遺伝子の少なくとも９０％の存在または不存在を判定するステップを含む。別の好ましい実施形態によると、本発明の方法は、表２に列挙されている遺伝子の少なくとも５０％、より好ましくは表２の遺伝子の少なくとも７５％、さらに一層好ましくは表２の遺伝子の少なくとも９０％の存在または不存在を判定するステップを含む。
【００２０】
本発明は同様に、炎症性腸疾患を患う患者の体内には不存在であり健康な人の体内には存在する全ての遺伝子を含む、本発明の方法の実施に専用のキットをも含んでいる。詳細には、本発明は、炎症性腸疾患を患う患者の体内には不存在であり健康な人の体内には存在する全ての遺伝子に結合するプローブを含む、本発明に係る方法の実施に専用のマイクロアレイに関する。好ましい実施形態において、前記マイクロアレイは、核酸マイクロアレイである。本発明によると、「核マイクロアレイ」は、マイクロチップ、スライドガラスまたはミクロスフェアサイズのビーズであり得る基材に付着された異なる核酸プローブで構成されている。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカもしくはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースで構成されていてよい。プローブは、核酸、例えばｃＤＮＡ（「ｃＤＮＡマイクロアレイ」）またはオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチドマイクロアレイ」、なおオリゴヌクレオチドの長さは約２５〜約６０塩基対以下である）であり得る。核酸技術の代替として、定量的ＰＣＲも使用してよく、したがって試験すべき遺伝子に特異的な増幅プライマーも本発明に係る方法を実施するために非常に有用である。したがって、本発明はさらに、上述の通りの専用マイクロアレイ、または炎症性腸疾患を患う患者の体内では不存在であり健康な人の体内には存在する遺伝子に特異的な増幅プライマーを含む、患者の炎症性腸疾患を診断するためのキットに関する。これらのキットは、当業者が前記遺伝子の１０％、２５％、５０％または７５％を検出することを可能にし得るが、前記遺伝子の９０％、９５％、９７．５％、またはさらには９９％の検出を可能にする場合に最も有用である。したがって、本発明に係るマイクロアレイは、前記遺伝子の少なくとも１０％、２５％、５０％または７５％、好ましくは９０％、９５％、９７．５％そしてさらに一層好ましくは少なくとも９９％に結合するプローブを含む。同様にして、定量的ＰＣＲ用のキットは、前記遺伝子の少なくとも１０％、２５％、５０％または７５％、好ましくは９０％、９５％、９７．５％そしてさらに一層好ましくは少なくとも９９％の増幅を可能にするプライマーを含むものである。
【００２１】
好ましい実施形態において、炎症性腸疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態において、前記疾患はクローン病であり、別のさらに好ましい実施形態において、前記疾患は潰瘍性大腸炎である。別の実施形態において、クローン病を患う患者の体内に不存在であり健康な人の体内には存在する遺伝子は、表１に列挙されている遺伝子であり、さらに別の実施形態において、これらの遺伝子は表２に列挙されている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＣＤ関連遺伝子とＵＣ関連遺伝子の包括的解析。Ａ）健康な個体の体内にはより多くのＣＤ関連遺伝子が存在する。ＣＤ関連遺伝子に応じた一個体あたりの遺伝子の数のプロットは、患者に比べて健康な個体において遺伝子が多いことを示している。Ｂ）健康な個体の体内にはより多くのＵＣ関連遺伝子が存在する。ＵＣ関連遺伝子の関数としての一個体あたりの遺伝子の数のプロットは、患者に比べて健康な個体において遺伝子が多いことを示している。
【図２】Ａ）５つの種の線形的な組合せが、規定されたレベル（遺伝子の少なくとも５０％）でそれらを有するコホートの部分について、クローン病の表現型を充分に判別している。Ｂ）３つの種が潰瘍性大腸炎について判別している。
【００２３】
方法
ヒト糞便試料の収集。スペイン人の個体は、健康な対照または、臨床的寛解期の慢性炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）を患う患者であった。患者および健康な対照には、凍結させた排泄物試料の提供を求めた。新鮮な排泄物試料を自宅で採取し、試料を自宅の冷凍庫に保管することによって直ちに凍結させた。凍結した試料を、断熱発泡スチロールのコンテナを用いて病院まで運び、その後、分析まで−８０℃で保管した。
【００２４】
ＤＮＡ抽出。各糞便試料の凍結したアリコート（２００ｍｇ）を、２５０μｌのチオシアン酸グアニジン、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）および４０μｌの１０％Ｎ−ラウロイルサルコシン中に懸濁させた。その後、以前に記述された通りに（Ｍａｎｉｃｈａｎｈら、Ｇｕｔ、５５：２０５−２１１、２００６）、ＤＮＡ抽出を行った。ＤＮＡ濃度およびその分子サイズを、ナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびアガロースゲル電気泳動によって推定した。
【００２５】
ＤＮＡライブラリーの構築および配列決定。ＤＮＡライブラリーを、メーカーの指示（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にしたがって調製した。クラスタ生成、鋳型ハイブリダイゼーション、等温増幅、線形化、遮断および変性、ならびに配列決定用プライマーのハイブリダイゼーションを実施するために、他の箇所で記載されたものと同じワークフローを使用した。蛍光原画像を処理し配列を呼び出すために、塩基呼び出しパイプライン（ＩｌｌｕｍｉｎａＰｉｐｅｌｉｎｅ−０．３バージョン）を使用した。実験再現性の検証のために、最初の１５の試料の各々について１つのライブラリー（クローンインサートサイズ２００ｂｐ）を構築し、そして残りの１０９の試料の各々について、異なるクローンインサートサイズ（１３５ｂｐおよび４００ｂｐ）を有する２つのライブラリーを構築した。新規な配列の生成と配列決定深度との間の最適なリターンを推定するため、本発明者らは、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＳＯＡＰ）（Ｌｉら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２５：１９６６−１９６７、２００９）、および９５％の配列同一性というマッチ要件を用いて、試料ＭＨ０００６およびＭＨ００１２から得られたＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡリードを、同じ２つの試料（それぞれ１５６．９および１５４．７Ｍｂ）から生成された合計３１１．７Ｍｂの４６８，３３５Ｓａｎｇｅｒリードに対してアラインした。約４ＧｂのＩｌｌｕｍｉｎａ配列で、Ｓａｎｇｅｒリードの９４％および８９％（それぞれＭＨ０００６およびＭＨ００１２について）がカバーされた。それぞれＭＨ０００６およびＭＨ００１２について１２．６および１６．６Ｇｂまでのさらなる広範な配列決定は、約９５％までの中程度のカバー率の増加しかもたらさなかった。Ｓａｎｇｅｒリードの９０％超が、非常に高く均一なレベルまで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列によってカバーされ、これは、ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡ配列にはほとんどまたは全く偏りが存在しないことを示す。予期した通り、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列の大部分（それぞれＭ０００６およびＭ００１２について５７％と７４％）は新規のものであり、Ｓａｎｇｅｒリード上にマッピングできなかった。この割合は、４および１２〜１６Ｇｂの配列決定レベルで類似しており、これにより、新規のものの大部分が４Ｇｂですでに捕捉されていることが裏付けられた。
【００２６】
本発明者らは、残りの１２２の試料について、３５４０万〜９７６０万のリードを生成し、平均は６２５０万リードであった。１５個の試料の最初のバッチの配列決定リード長は４４ｂｐであり、第２のバッチは７５ｂｐであった。
【００２７】
使用された公開データ。ＧｅｎＢａｎｋに寄託されていた配列決定済みの細菌ゲノム（合計８０６ゲノム）を、２００９年１月１０日にＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からダウンロードした。公知のヒト腸内細菌ゲノム配列を、ＨＭＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｍｐｄａｃｃ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｍｐ＿ｃａｔａｌｏｇ／ｍａｉｎ．ｃｇｉ）、ＧｅｎＢａｎｋ（６７ゲノム）、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓのワシントン大学（８５ゲノム、２００９年４月バージョン、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｏｒｇａｎｉｓｍ／Ｍｉｃｒｏｂｅｓ／Ｈｕｍａｎ＿Ｇｕｔ＿Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ／）からダウンロードし、ＭｅｔａＨＩＴプロジェクト（１７ゲノム、２００９年９月バージョン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐａｔｈｏｇｅｎｓ／ｍｅｔａｈｉｔ／）によって配列決定した。このプロジェクトで使用された他の腸内メタゲノムデータには、以下のものが含まれる：（１）登録番号ＳＲＡ００２７７５でＮＣＢＩからダウンロードされた、米国人個体から配列決定されたヒト腸メタゲノムデータ（Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０６：２３６５−２３７０、２００９）；（２）ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｏｒｋ．ｅｍｂｌ．ｄｅ）でＰ．Ｂｏｒｋのグループからダウンロードされた、日本人個体に由来するヒト腸内メタゲノムデータ（Ｋｕｒｏｋａｗａら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．１４：１６９−１８１、２００７）。本研究において本発明者らが構築した統合ＮＲデータベースは、ＮＣＢＩ−ＮＲデータベース（２００９年４月バージョン）および公知のヒト腸内細菌ゲノムに由来する全ての遺伝子を含んでいた。
【００２８】
ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡショートリードのデノボアセンブリ。各ＤＮＡ試料の高品質ショートリードを、ＳＯＡＰデノボアセンブラ（Ｌｉ．＆ Ｚｈｕ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、２０（２）：２６５−２７２、２０１０）によりアセンブルした。要するに、本発明者らはまず１７ｍｅｒの頻度にしたがってアセンブリから存在度の低い配列をフィルタリングした。５未満の深度の１７ｍｅｒを、アセンブリの前にスクリーニングしたが、これは、これらの低頻度配列がアセンブルされる可能性がきわめて低く、一方、それらを除去することで所要メモリーが著しく削減され、アセンブリは通常のスーパーコンピュータ（我々の研究機関では５１２ＧＢメモリー）で実現可能なものとなると考えられるからである。次に、配列を１つずつ処理し、Ｂｒｕｉｊｉｎグラフデータフォーマットを用いて、配列間のオーバーラップ情報を記憶した。単一のリードにより裏付けされたオーバーラップパスは信頼性が低く、除去された。配列決定のエラーまたは微生物株間の遺伝的ばらつきを原因とする短い低深度チップおよびバブルは、それぞれトリムおよびマージされた。リードパスを用いて、極小さい反復を解決した。最終的に、反復境界において連結を破断し、明確な連結をもつ連続配列をコンティグとして出力した。メタゲノム特殊モデルを選択し、パラメータ「−Ｋ２１」および「−Ｋ２３」をそれぞれ４４ｂｐと７５ｂｐのリードについて使用して、求められる最小の配列オーバーラップを示した。独立して各試料についてデノボアセンブリを行った後、アセンブルされていない全てのリードを共にマージし、それらについてアセンブリを実施して、データの使用を最大限にし、各リードセット内での頻度は低いものの全ての試料のデータを合わせることによるアセンブリには充分な配列深度を有する微生物ゲノムをアセンブルした。
【００２９】
Ｓａｎｇｅｒリードを用いたＩｌｌｕｍｉｎａコンティグの検証。ＢＬＡＳＴＮ（ＷＵＢＬＡＳＴ２．０）を用いて、試料ＭＨ０００６およびＭＨ００１２に由来するＳａｎｇｅｒリード（それぞれ１５６．９Ｍｂおよび１５４．７Ｍｂ）を、同じ試料に由来するＩｌｌｕｍｉｎａコンティグ（長さが７５ｂｐ超で同一性が９５％超の単一の最良ヒット）に対してマッピングした。アライメントの片端においてアラインされていなまま残された少なくとも５０個の塩基を両方の配列が有しているコリアリニティの崩壊について、各アライメントをスキャンした。このような崩壊は各々、コリアリニティが崩壊している場所におけるＩｌｌｕｍｉｎａコンティグ内のアセンブリエラーとみなされた。互いから３０ｂｐ以内のエラーは、マージされた。エラーの両側の６０ｂｐについてのコンティグ構造と一致するＳａｎｇｅｒリードが存在する場合、エラーは廃棄された。比較のため、本発明者らは、ＭＨ０００６由来の４５４Ｔｉｔａｎｉｕｍリード（５５０Ｍｂのリード）のＮｅｗｂｌｅｒ２アセンブリに対してこれを反復した。本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアセンブリについてコンティグの１Ｍｂあたり１４．１２個のエラーを推定し、これは、４５４アセンブリのもの（１Ｍｂあたり２０．７３）に匹敵している。少なくとも１つのＳａｎｇｅｒリードをマッピングするＩｌｌｕｍｉｎａコンティグの９８．７％は、マッピングされた領域の９９．５５％にわたりコリニアであったが、これは、このような４５４のコンティグの９７．８６％が、マッピングされた領域の９９．４８％にわたりコリニアであることに匹敵する。
【００３０】
ヒト腸内ミクロビオームのカバー率の評価。最初の３５ｂｐの領域内の多くとも２つのミスマッチおよびリード配列全体にわたる９０％の同一性を許容することにより、ＳＯＡＰを用いて、アセンブルされたコンティグおよび公知の細菌ゲノムに対して、ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡリードをアラインした。１×１０−８、１００ｂｐ超のアラインメント長、および最低９０％の同一性カットオフでＢＬＡＳＴＮを用いて、同じ基準に対して、Ｒｏｃｈｅ／４５４およびＳａｎｇｅｒ配列決定リードをアラインした。ＳＯＡＰにより、ＭＨ０００６およびＭＨ００１２のＧＡリード、同じ試料からのＳａｎｇｅｒリードに対してアラインした場合、二つのミスマッチが許容され、同一性はリード配列全体にわたり９５％に設定された。
【００３１】
非冗長遺伝子セットの遺伝子予測および構築。所与の配列のＧＣ含有量により推定されたジコドン頻度を使用し、かつ匿名ゲノム配列に基づきＯＲＦの全範囲を予測する、Ｍｅｔａ Ｇｅｎｅ（Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３４、５６２３−５６３０、２００６）を用いて、１２４の試料各々のコンティグから、ならびにマージされたアセンブリのコンティグから、ＯＲＦを見出す。その後、予測されたＯＲＦをＢＬＡＴ（Ｋｅｎｔら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１２：６５６−６６４、２００２）を用いて互いにアラインした。９５％超の同一性、およびより短い遺伝子の９０％にわたりカバーされたアライン長を有する遺伝子対を、グループにまとめた。次に遺伝子を共有するグループをマージし、マージされたグループの各々の中の最長のＯＲＦを用いてそのグループの代表とし、グループの他のメンバーを冗長性とみなした。したがって、本発明者らは、冗長性を排除することにより、予測された遺伝子の全てから非冗長性遺伝子セットを組織した。最後に、１００ｂｐ未満の長さを有するＯＲＦがフィルタリングされた。ＮＣＢＩ遺伝子コードを用いてＯＲＦをタンパク質配列に翻訳した（Ｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、．６：７７６−７８８、２００８）。
【００３２】
遺伝子の同定。存在度の低い遺伝子を同定することと同定のエラー率を削減することとの間のバランスを保つため、本発明者らは、個別のミクロビオーム中の遺伝子を同定するために必要とされるリードカバー率について設定された閾値の影響を調査した。同定に必要とされるリードの数が２から６に増加した時点で、遺伝子数は約２分の１に減少し、その後はゆっくりと変化した。それでも、希少な遺伝子を解析に含み入れるために、本発明者らは、２回のリードの閾値を選択した。
【００３３】
遺伝子の分類学的割当て。予測された遺伝子の分類学的割当ては、統合ＮＲデータベースに対するＢＬＡＳＴＰアライメントを用いて実施された。１×１０−５より大きいｅ値でＢＬＡＳＴＰアライメントのヒットをフィルタリングし、各々の遺伝子について、ｅ値≦１０×トップヒットのｅ値により定義づけされた有意なマッチを、分類学的グループを区別するために保持した。その後、ＭＥＧＡＮ（Ｈｕｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１７：３７７−３８６、２００７）で実行された最近共通祖先（ＬＣＡ）ベースのアルゴリズムにより、各遺伝子の分類学的レベルを判定した。ＬＣＡベースのアルゴリズムは、割当てられた分類群の分類学的レベルが遺伝子の保存レベルを反映するような形で、遺伝子を分類群に割当てる。例えば、遺伝子が数多くの種に保存されていた場合、それは、種ではなくむしろＬＣＡに割当てられた。
【００３４】
遺伝子の機能的分類。ＢＬＡＳＴＰを用いて、ｅ値≦１×１０−５で、ｅｇｇＮＯＧデータベース（Ｊｅｎｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６：Ｄ２５０−Ｄ２５４、２００８）とＫＥＧＧデータベース（Ｋａｎｅｈｉｓａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３２：Ｄ２７７−Ｄ２８０、２００４）内で予測された遺伝子のタンパク質配列を検索した。最低のｅ値を有するＮＯＧホモログまたはＫＥＧＧホモログに応じて、遺伝子に注釈付けした。ｅｇｇＮＯＧデータベースは、ＣＯＧおよびＫＯＧデータベースの統合である。ＣＯＧで注釈付けされた遺伝子は、２５のＣＯＧカテゴリーに分類され、ＫＥＧＧにより注釈付けされた遺伝子は、ＫＥＧＧパスウェイ内に割当てられた。
【００３５】
最小腸内細菌ゲノムの決定。ｅｇｇＮＯＧクラスタに割当てられた非冗長遺伝子の数は、遺伝子の長さとクラスタコピー数で正規化された。クラスタを、正規化された遺伝子数によりランキングし、不可欠のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子をコードするクラスタを含んでいた範囲を決定し、１００個のクラスタの連続的グループ内のこれらのクラスタの割合を計算した。遺伝子クラスタの範囲の解析には、ｉＰａｔｈ画像以外に、ＫＥＧＧの使用ならびにパスウェイの完全性およびそれらがコードするタンパク質機構の手動の確認を用いた。
【００３６】
全機能的補体と最小メタゲノムの決定。本発明者らは、ｎ個の個体（ｎ＝５２〜１２４、１ビンあたり１００の複製）のランダムな組合せ中に存在するオルソロググループおよび／または遺伝子ファミリーの合計数および共有数を計算した。この解析は、遺伝子クラスタの次の３つのグループについて実施された：（１）公知のｅｇｇＮＯＧオルソロググループ（すなわち、［Ｕｕ］ｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉ［ｓｚ］ｅｄ、［Ｕｕ］ｎｋｎｏｗｎ、［Ｐｐ］ｒｅｄｉｃｔｅｄまたは［Ｐｐ］ｕｔａｔｉｖｅという用語が存在するものを除く、機能的注釈付けを伴うグループ）；（２）全てのｅｇｇＮＯＧオルソロググループ；（３）以上の２つのカテゴリーに割当てされなかった残りの遺伝子から構築された遺伝子ファミリーを加えた、全てのオルソロググループ。ファミリーは、１．１の拡大要因と６０というビットスコアカットオフでＭＣＬ（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ、Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖ．Ｕｔｒｅｃｈｔ、２０００）を用いて、総当りＢＬＡＳＴＰの結果からクラスタ化された。
【００３７】
希薄化解析。メモリーによる制限のため１００個の無作為にピックアップした試料について、ＥｓｔｉｍａｔｅＳを用いて、全遺伝子豊富度の推定を行った。ＣＶ値は０．５超であったことから、Ｃｈａｏ２豊富度推定量（従来のもの）およびＩＣＥ豊富度推定量を計算し、２つのうちの大きい方の推定値（ＩＣＥ）を使用した。この試料サイズについての推定値は、３，６２１，６４６個の遺伝子（ＩＣＥ）であり、一方Ｓｏｂｓ（Ｍａｏ Ｔａｕ）は３，０９０，５７５個の遺伝子、つまり８５．３％であった。ＩＣＥの推定量曲線は、完全には飽和せず、このことは、最終的な決定的推定値を達成するためには、追加の試料を加える必要があることを示していた。
【００３８】
共通の細菌核。非常に類似した株の影響を除去し、コホートの個体中の公知の微生物種の存在を評価するために、本発明者らは基準セットとして６５０の配列決定された細菌ゲノムおよび古細菌ゲノムを使用した。このセットは、９３２個の公的に入手可能なゲノムで構成され、これらのゲノムは、９０％の同一性カットオフと少なくとも８０％の長さにわたる類似性とを用いて、類似性によってグループ分けされた。各グループから最大のゲノムのみが使用された。１２４の個体に由来するＩｌｌｕｍｉｎａリードを、種プロファイリング解析のためにセットにマッピングし、同じ種に由来するゲノム（サイズを２０％超異なるようにすることによる）を、手作業での検査によって、かつ配列が入手可能である場合には１６Ｓベースのクラスタ化を用いることによって、キュレートした。
【００３９】
個体間の微生物ゲノムの相対的存在度。本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリードを一意的にマッピングすることによりゲノムカバー率を計算し、それを１Ｇｂの配列に正規化して、異なる個体における異なる配列決定レベルについて矯正した。カバー率を、各個体についての非冗長細菌ゲノムセットの全ての種にわたって合計し、この合計に対するそれぞれの種の割合を計算した。
【００４０】
種の共存ネットワーク。少なくとも１つの個体内で１％以上のＩｌｌｕｍｉｎａリードによるゲノムカバー率を有していた１５５の種について、本発明者らは、１２４の個体のコホート全体を通した配列決定深度（存在度）間のペアワイズ種間ピアソン相関を計算した。結果として得た１１，１７５の種間相関から、グラフ内のノードサイズとして各々の種の平均ゲノムカバー率を表示するＣｙｔｏｓｃａｐｅ（Ｓｈａｎｎｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：２４９８−２５０４、２００３）を用いて、グラフの形で、−０．４未満または０．４超（ｎ＝３４２）の相関を視覚化した。
【００４１】
結果
使用されたコホートおよび方法の要約説明。コホートのサイズは、クローン病については患者８名と健康な対照１３名であり、潰瘍性大腸炎については患者１２名と健康な対照１２名であった。各々の疾患について、遺伝子３３０万個の遺伝子カタログ全体を、２つのグループ間で有意に異なっているものについて、順位和検索によって検索した。遺伝子サイズ（より大きな遺伝子はより大きい標的であり、より多く見られる）および異なる個体についての配列決定範囲の差によって、遺伝子頻度を正規化した。有意に異なる遺伝子の数は、閾値およびグループ分割により影響される。手短かに言うと、ｐ＜３×１０−４で３８０２の「ＣＤ（クローン病）関連遺伝子」が発見され、Ｐ＜１０−３で４８４１の「ＵＣ（潰瘍性大腸炎）関連遺伝子」が発見された。
【００４２】
ＢＭＩ遺伝子の包括的解析。個体別に、有意に異なる遺伝子、すなわちＣＤ関連遺伝子（図１Ａ）またはＵＣ関連遺伝子（図１Ｂ）のいずれかをプロットした。健康な個体におけるＣＤ関連遺伝子数の中央値は３０３８であり、クローン病患者においてはわずか６４３であった。遺伝子数の中央値は、２つのグループ間で非常に有意に異なっている（ｐ＜２×１０−１３、片側ｔ検定）。同様にして、ＵＣ関連遺伝子数の中央値は、健康な個体において３４０２であり、潰瘍性大腸炎を患う患者においては１２１２であった。差異は統計学的に異なるものである（Ｐ＜６．７×１０−５、片側ｔ検定）。
【００４３】
全ての遺伝子およびＣＤ関連遺伝子またはＵＣ関連遺伝子の分布比較。ミクロビオームの全ての遺伝子およびＣＤ関連遺伝子またはＵＣ関連遺伝子の分布を比較した。ＣＤ関連遺伝子またはＵＣ関連遺伝子に比べて、２つのグループの間で全遺伝子の数および頻度の差ははるかに小さいものである。ＣＤ関連遺伝子の分布は、全遺伝子分布を単純には反映していない。同様に、ＵＣ関連遺伝子の分布も、遺伝子分布の一般的傾向を単純には反映していない。したがって、クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者における遺伝子の喪失は、有意である。
【００４４】
ＣＤ関連種およびＵＣ関連種。３３０万のカタログ中の遺伝子に帰属する分類学的割当てを用いて、ＣＤ関連遺伝子およびＵＣ関連遺伝子を種に割当てた（Ｑｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、ｉｎ ｐｒｅｓｓ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８８２１）。ＣＤ関連遺伝子の６８％、ただし全遺伝子のわずか３２．８％だけが、ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ由来であることが発見された。一方で、ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの頻度は、ＣＤ関連遺伝子について２２％、ミクロビオームの全遺伝子については１８．４％であった。同様にして、ＵＣ関連遺伝子の７０％がｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ由来であり、わずか１５％がｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ由来であった。したがって、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎はｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓにおける変化と連関される。種は、まず、ＣＤ関連遺伝子およびＵＣ関連遺伝子のうちでそれらの種に割当てられた遺伝子の数によって同定された。その後、同じ種に由来する他の遺伝子をカタログから引き出し、異なる個体内で各々の種についての５０の代表的な遺伝子の存在を査定した（これは、種を同定するために現在行われている単一の１６Ｓ遺伝子の使用と比較して全く遜色がなかった）。種は、マーカー遺伝子の少なくとも半分が一個体中に発見された場合に、存在するものとみなされた。健康な人と患者との間の分布の有意性は、カイ二乗検定を用いて、全コホート分布（クローン病については１３対８、潰瘍性大腸炎については１２対１２）と比較することによって推定された。クローン病についてはＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉおよびＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓが、健康な個体群と連関された（それぞれ、ｐ＝２．４×１０−２およびｐ＝９．３×１０−３）。すなわちこれらは、患者には不存在である傾向にあった。一方で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍおよびＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓが患者コホートと連関された（ｐ＝４×１０−３、ｐ＝１．８×１０−３およびｐ＝６．４×１０−３）。種の同定に基づいて、これら５つの種の線形組合せが、クローン病表現型を完全に予測することが実証された（図２Ａ）。健康な個体および患者は、それぞれ青色および赤色の点として示されている。種の存在（縦座標）は、遺伝子の合計、すなわち（クローン病と逆連関された）「優良な種」の遺伝子から（クローン病と連関された）「不良種」の遺伝子を差し引いたものに対応する。個体は、種の存在によってランキングされる（横座標）。個体は、「優良種」遺伝子が上回っている場合、ランクの最上部にあり、健康である傾向をもち、一方、「不良種」が上回っている場合、その個体は右側にあり、病気を患う傾向をもつ。潰瘍性大腸炎については、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが健康な表現型と連関され、一方Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍが患者個体群と連関された。図２Ｂに示されている通り、３つの種の線形組合せが、潰瘍性大腸炎表現型を予測している。
【００４５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【表５５】
【表５６】
【表５７】
【表５８】
【表５９】
【表６０】
【表６１】
【表６２】
【表６３】
【表６４】
【表６５】
【表６６】
【表６７】
【表６８】
【表６９】
【表７０】
【表７１】
【表７２】
【表７３】
【表７４】
【表７５】
【表７６】
【表７７】
【表７８】
【表７９】
【表８０】
【表８１】
【表８２】
【表８３】
【表８４】
【表８５】
【表８６】
【表８７】
【表８８】
【表８９】
【表９０】
【表９１】
【表９２】
【表９３】
【表９４】
【表９５】
【表９６】
【表９７】
【表９８】
【表９９】
【表１００】
【表１０１】
【表１０２】
【表１０３】
【表１０４】
【表１０５】
【表１０６】
【表１０７】
【表１０８】
【表１０９】
【表１１０】
【表１１１】
【表１１２】
【表１１３】
【表１１４】
【表１１５】
【表１１６】
【表１１７】
【表１１８】
【表１１９】
【表１２０】
【表１２１】
【表１２２】
【表１２３】
【表１２４】
【表１２５】
【表１２６】
【表１２７】
【表１２８】
【表１２９】
【表１３０】
【表１３１】
【表１３２】
【表１３３】
【表１３４】
【表１３５】
【表１３６】
【表１３７】
【表１３８】
【表１３９】
【表１４０】
【表１４１】
【表１４２】
【表１４３】
【表１４４】
【表１４５】
【表１４６】
【表１４７】
【表１４８】
【表１４９】
【表１５０】
【表１５１】
【表１５２】
【表１５３】
【表１５４】
【表１５５】
【表１５６】
【表１５７】
【表１５８】
【表１５９】
【表１６０】
【表１６１】
【表１６２】
【表１６３】
【表１６４】
【表１６５】
【表１６６】
【表１６７】
【表１６８】
【表１６９】
【表１７０】
【表１７１】
【表１７２】
【表１７３】
【表１７４】
【表１７５】
【表１７６】
【表１７７】
【表１７８】
【表１７９】
【表１８０】
【表１８１】
【表１８２】
【表１８３】
【表１８４】
【表１８５】
【表１８６】
【表１８７】
【表１８８】
【表１８９】
【表１９０】
【表１９１】
【表１９２】
【表１９３】
【表１９４】
【表１９５】
【表１９６】
【表１９７】
【表１９８】
【表１９９】
【表２００】
【表２０１】
【表２０２】
【表２０３】
【表２０４】
【表２０５】
【表２０６】
【表２０７】
【表２０８】
【表２０９】
【表２１０】
【表２１１】
【表２１２】
【表２１３】
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【表２１７】
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【表２１９】
【表２２０】
【表２２１】
【表２２２】
【表２２３】
【表２２４】
【表２２５】
【表２２６】
【表２２７】
【表２２８】
【表２２９】
【表２３０】
【表２３１】
【表２３２】
【表２３３】
【表２３４】
【表２３５】
【表２３６】
【表２３７】
【表２３８】
【表２３９】
【表２４０】
【表２４１】
【表２４２】
【表２４３】
【表２４４】
【表２４５】
【表２４６】
【表２４７】
【表２４８】
【表２４９】
【表２５０】
【表２５１】
【表２５２】
【表２５３】
【表２５４】
【表２５５】
【表２５６】
【表２５７】
【表２５８】
【表２５９】
【表２６０】
【表２６１】
【表２６２】
【表２６３】
【表２６４】
【表２６５】
【表２６６】
【表２６７】
【表２６８】
【表２６９】
【表２７０】
【表２７１】
【表２７２】
【表２７３】
【表２７４】
【表２７５】
【表２７６】
【表２７７】
【表２７８】
【表２７９】
【表２８０】
【表２８１】
【表２８２】
【表２８３】
【表２８４】
【表２８５】
【表２８６】
【表２８７】
【表２８８】
【表２８９】
【表２９０】
【表２９１】
【表２９２】
【表２９３】
【表２９４】
【表２９５】
【表２９６】
【表２９７】
【表２９８】
【表２９９】
【表３００】
【表３０１】
【表３０２】
【表３０３】
【表３０４】
【表３０５】
【表３０６】
【表３０７】
【表３０８】
【表３０９】
【表３１０】
【表３１１】
【表３１２】
【表３１３】
【表３１４】
【表３１５】
【表３１６】
【表３１７】
【表３１８】
【表３１９】
【表３２０】
【表３２１】
【表３２２】
【表３２３】
【表３２４】
【表３２５】
【表３２６】
【表３２７】
【表３２８】
【表３２９】
【表３３０】
【表３３１】
【表３３２】
【表３３３】
【表３３４】
【表３３５】
【表３３６】
【表３３７】
【表３３８】
【表３３９】
【表３４０】
【表３４１】
【表３４２】
【表３４３】
【表３４４】
【表３４５】
【表３４６】
【表３４７】
【表３４８】
【表３４９】
【表３５０】
【表３５１】
【表３５２】
【表３５３】
【表３５４】
【表３５５】
【表３５６】
【表３５７】
【表３５８】
【表３５９】
【表３６０】
【表３６１】
【表３６２】
【表３６３】
【表３６４】
【表３６５】
【表３６６】
【表３６７】
【表３６８】
【表３６９】
【表３７０】
【表３７１】
【表３７２】
【表３７３】
【表３７４】
【表３７５】
【表３７６】
【表３７７】
【表３７８】
【表３７９】
【表３８０】
【表３８１】
【表３８２】
【表３８３】
【表３８４】
【表３８５】
【表３８６】
【表３８７】
【表３８８】
【表３８９】
【表３９０】
【表３９１】
【表３９２】
【表３９３】
【表３９４】
【表３９５】
【表３９６】
【表３９７】
【表３９８】
【表３９９】
【表４００】
【表４０１】
【表４０２】
【表４０３】
【表４０４】
【表４０５】
【表４０６】
【表４０７】
【表４０８】
【表４０９】
【表４１０】
【表４１１】
【表４１２】
【表４１３】
【表４１４】
【表４１５】
【表４１６】
【表４１７】
【表４１８】
【表４１９】
【表４２０】
【表４２１】
【表４２２】
【表４２３】
【表４２４】
【表４２５】
【表４２６】
【表４２７】
【表４２８】
【表４２９】
【表４３０】
【表４３１】
【表４３２】
【表４３３】
【表４３４】
【表４３５】
【表４３６】
【表４３７】
【表４３８】
【表４３９】
【表４４０】
【表４４１】
【表４４２】
【表４４３】
【表４４４】
【表４４５】
【表４４６】
【表４４７】
【表４４８】
【表４４９】
【表４５０】
【表４５１】
【表４５２】
【表４５３】
【表４５４】
【表４５５】
【表４５６】
【表４５７】
【表４５８】
【表４５９】
【表４６０】
【表４６１】
【表４６２】
【表４６３】
【表４６４】
【表４６５】
【表４６６】
【表４６７】
【表４６８】
【表４６９】
【表４７０】
【表４７１】
【表４７２】
【表４７３】
【表４７４】
【表４７５】
【表４７６】
【表４７７】
【表４７８】
【表４７９】
【表４８０】
【表４８１】
【表４８２】
【表４８３】
【表４８４】
【表４８５】
【表４８６】
【表４８７】
【表４８８】
【表４８９】
【表４９０】
【表４９１】
【表４９２】
【表４９３】
【表４９４】
【表４９５】
【表４９６】
【表４９７】
【表４９８】
【表４９９】
【表５００】
【表５０１】
【表５０２】
【表５０３】
【表５０４】
【表５０５】
【表５０６】
【表５０７】
【表５０８】
【表５０９】
【表５１０】
【表５１１】
【表５１２】
【表５１３】
【表５１４】
【表５１５】
【表５１６】
【表５１７】
【表５１８】
【表５１９】
【表５２０】
【表５２１】
【表５２２】
【表５２３】
【表５２４】
【表５２５】
【表５２６】
【表５２７】
【表５２８】
【表５２９】
【表５３０】
【表５３１】
【表５３２】
【表５３３】
【表５３４】
【表５３５】
【表５３６】
【表５３７】
【表５３８】
【表５３９】
【表５４０】
【表５４１】
【表５４２】
【表５４３】
【表５４４】
【表５４５】
【表５４６】
【表５４７】
【表５４８】
【表５４９】
【表５５０】
【表５５１】
【表５５２】
【表５５３】
【表５５４】
【表５５５】
【表５５６】
【表５５７】
【表５５８】
【表５５９】
【表５６０】
【表５６１】
【表５６２】
【表５６３】
【表５６４】
【表５６５】
【表５６６】
【表５６７】
【表５６８】
【表５６９】
【表５７０】
【表５７１】
【表５７２】
【表５７３】
【表５７４】
【表５７５】
【表５７６】
【表５７７】
【表５７８】
【表５７９】
【表５８０】
【表５８１】
【表５８２】
【表５８３】
【表５８４】
【表５８５】
【表５８６】
【表５８７】
【表５８８】
【表５８９】
【表５９０】
【表５９１】
【表５９２】
【表５９３】
【表５９４】
【表５９５】
【表５９６】
【表５９７】
【表５９８】
【表５９９】
【表６００】
【表６０１】
【表６０２】
【表６０３】
【表６０４】
【表６０５】
【表６０６】
【表６０７】
【表６０８】
【表６０９】
【表６１０】
【表６１１】
【表６１２】
【表６１３】
【表６１４】
【表６１５】
【表６１６】
【表６１７】
【表６１８】
【表６１９】
【表６２０】
【表６２１】
【表６２２】
【表６２３】
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４６】
【非特許文献１】Ｑｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８８２１
【非特許文献２】Ｓｏｋｏｌら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．、１４（６）：８５８−８６７、２００８
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患を診断する方法において、表１および／または表２に由来する少なくとも１つの遺伝子が個体の腸内ミクロビオームに不存在であるか否かを判定するステップを含む方法。
【請求項２】
炎症性腸疾患がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
表１および／または表２の遺伝子の少なくとも５０％、７５％または９０％が、前記個体の腸内ミクロビオームに不存在である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個体の糞便から微生物ＤＮＡを得るステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
炎症性腸疾患の治療の有効性をモニタリングする方法において、前記患者のミクロビオームに少なくとも１つの遺伝子が不存在であるか否かを最初に判定するステップと、治療を施すステップと、前記少なくとも１つの遺伝子が患者のミクロビオーム中に存在するか否かを判定するステップとを含む方法。
【請求項６】
炎症性腸疾患がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
表１および／または表２の遺伝子の少なくとも５０％、７５％または９０％が、治療前に前記個体の腸内ミクロビオームに不存在である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記個体の糞便から微生物ＤＮＡを得る少なくとも１つのステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
表１および／または表２の遺伝子の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９７．５％または９９％に対しハイブリダイズするプローブを含むマイクロアレイ。
【請求項１０】
請求項９に記載のマイクロアレイまたは、表１および／もしくは表２の遺伝子の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９７．５％もしくは９９％に特異的な増幅プライマーを含む、炎症性腸疾患の診断用キット。
【請求項１】
炎症性腸疾患を診断する方法において、表１および／または表２に由来する少なくとも１つの遺伝子が個体の腸内ミクロビオームに不存在であるか否かを判定するステップを含む方法。
【請求項２】
炎症性腸疾患がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
表１および／または表２の遺伝子の少なくとも５０％、７５％または９０％が、前記個体の腸内ミクロビオームに不存在である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個体の糞便から微生物ＤＮＡを得るステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
炎症性腸疾患の治療の有効性をモニタリングする方法において、前記患者のミクロビオームに少なくとも１つの遺伝子が不存在であるか否かを最初に判定するステップと、治療を施すステップと、前記少なくとも１つの遺伝子が患者のミクロビオーム中に存在するか否かを判定するステップとを含む方法。
【請求項６】
炎症性腸疾患がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
表１および／または表２の遺伝子の少なくとも５０％、７５％または９０％が、治療前に前記個体の腸内ミクロビオームに不存在である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記個体の糞便から微生物ＤＮＡを得る少なくとも１つのステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
表１および／または表２の遺伝子の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９７．５％または９９％に対しハイブリダイズするプローブを含むマイクロアレイ。
【請求項１０】
請求項９に記載のマイクロアレイまたは、表１および／もしくは表２の遺伝子の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９７．５％もしくは９９％に特異的な増幅プライマーを含む、炎症性腸疾患の診断用キット。
【公表番号】特表２０１３−５２０９７２（Ｐ２０１３−５２０９７２Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５５４０４（Ｐ２０１２−５５５４０４）
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５３０３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７４８１
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０５１２９０７９）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック (15)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５３０３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７４８１
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０５１２９０７９）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック (15)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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