炎症状態の検出方法
【課題】ＩＬ−６阻害薬による治療を受けている患者における炎症状態を正確に判定又は診断する方法を提供する。
【解決手段】ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とするＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態の検出方法である。ＰＴＸ３濃度は炎症症状が改善している場合は低値を示し、炎症症状が悪化した場合や感染症に罹患した場合には明確な上昇を示すことから炎症状態を判定する。
【解決手段】ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とするＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態の検出方法である。ＰＴＸ３濃度は炎症症状が改善している場合は低値を示し、炎症症状が悪化した場合や感染症に罹患した場合には明確な上昇を示すことから炎症状態を判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＴＸ３は、Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ、Ｐｅｎｔａｘｉｎ、ＴＳＧ−１４、ＭＰＴＸ３とも呼ばれ、インターロイキン１(ＩＬ−１)刺激を受けたヒト臍帯内皮細胞に発現しているものとして発見されたペントラキシン（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ）ファミリーに属する分泌タンパク質である（非特許文献１）。
ペントラキシンファミリーはＬｏｎｇ ＰｅｎｔｒａｘｉｎとＳｈｏｒｔ Ｐｅｎｔｒａｘｉｎに大別される。炎症性タンパクとして知られているＣ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）やｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ＳＡＰ）はＳｈｏｒｔ Ｐｅｎｔｒａｘｉｎに属し、構造の点で非常に類似している（非特許文献２）。ＣＲＰは特に炎症マーカーとして広く使用されている。
【０００３】
関節リウマチ患者では、ＣＲＰ値の変動は関節リウマチによる炎症を反映するのみならず、感染症等による炎症状態を反映して上昇する。近年、関節リウマチ等の画期的な治療薬としてＩＬ−６の作用を阻害する働きを持つ抗ＩＬ−６受容体抗体であるトシリズマブが上市された。ＣＲＰは炎症時に産生されるＩＬ−６により正の調節を受けて肝臓で合成され血中に分泌される。したがって、トシリズマブ投与患者ではＣＲＰの合成経路がトシリズマブにより阻害されるためＣＲＰが産生されず、ＣＲＰを炎症マーカーとして使用することができないことが問題となっている。また、トシリズマブはＩＬ−６の作用を抑えるという作用機序から、発熱などの症状や血中ＣＲＰ濃度の上昇をマスクしてしまうという性質を持つ。その結果、トシリズマブ投与患者は感染症に罹患や憎悪し易く、患者自身や医師が感染症の罹患に気づかないままに重篤な状態に陥ることが重大な問題となっている。トシリズマブ投与患者の炎症状態を知るためには、ＣＲＰや白血球数のわずかな変動や微細な症状の観察に頼らざるをえず、トシリズマブ投与患者においても使用可能な炎症マーカーが求められている。
【０００４】
他方、ＣＲＰと類似する構造を持つＰＴＸ３もまたＣＲＰと同様に炎症マーカーとなることが知られている（非特許文献３）。関節リウマチについては、関節リウマチ患者の滑液で正常コントロールと比較してＰＴＸ３タンパク質の発現が高いこと、関節リウマチ患者より採取した滑膜組織にはＰＴＸ３タンパク質が強く発現していることが報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Arthritis and Rheumatism,44/12(2841-50),2001
【非特許文献２】Breviario et al.: J. Biol. Chem., 267(31), 22190-7 (1992)
【非特許文献３】Bottazzi et al.:J.Leucoc.Biol.,79(5),909-12,(2006)
【非特許文献４】Luchetti et al.: Clin Exp Immunol.,119:196-202(2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＩＬ−６阻害薬による治療を受けている患者における炎症状態を正確に判定又は診断する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者の炎症状態を正確に把握すべく、ＣＲＰ濃度に加えてＰＴＸ３濃度を測定し、それらの血中濃度と、炎症状態、例えば炎症性疾患の炎症症状の改善又は増化、感染症による炎症の発生等との相関性を検討したところ、ＣＲＰ濃度は炎症症状の悪化、感染症の発生にもかかわらず低値となるにもかかわらず、ＰＴＸ３濃度は炎症症状が改善している場合は低値を示し、炎症症状が悪化した場合や感染症に罹患した場合には明確な上昇を示すことから、ＰＴＸ３濃度はＩＬ−６阻害薬投与患者における炎症状態を正確に把握するためのマーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とするＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態の検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記炎症状態が、ＩＬ−６阻害薬の対象疾患の炎症状態又は感染症による炎症状態である上記の検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ＰＴＸ３濃度及び、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている炎症性疾患患者由来の試料中のＣＲＰ濃度を組み合わせて検出する上記の検出方法を提供するものである。
また、本発明は、抗ＰＴＸ３抗体を含有する、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者の炎症状態診断薬を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来ＩＬ−６阻害薬による治療を受けている患者特有の問題、すなわち発熱などの炎症症状の悪化、感染症の発生を発見できないという問題を、的確に発見でき、ＩＬ−６阻害薬投与に加えて、適切な治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】トシリズマブ治療を受けている関節リウマチ患者２６症例のＤＡＳ２８−ＥＳＲ値の平均値の推移を示す図である。
【図２】トシリズマブ治療を受けている関節リウマチ患者２６症例の血中ＣＲＰ濃度及び血中ＲＴＸ３濃度の推移を示す図である。「ベースライン」は、治療開始前のＣＲＰ濃度の数値を示す。
【図３】トシリズマブ治療中に感染症に罹患した患者のＤＡＳ２８−ＥＳＲ値、血中ＣＲＰ濃度、及び血中ＰＴＸ３濃度の推移を示す図である。
【図４】トシリズマブ治療中に感染症に罹患した患者のＤＡＳ２８−ＥＳＲ値、血中ＣＲＰ濃度、及び血中ＰＴＸ３濃度の推移を示す図である。
【図５】トシリズマブ治療中に関節疼痛、腫脹の憎悪が認められた患者のＤＡＳ２８−ＥＳＲ、血中ＣＲＰ濃度及び血中ＰＴＸ３濃度の推移を示す図である。
【図６】実施例３の患者のＰＴＸ３／ＣＲＰ比の推移を示す図である。
【図７】実施例４の患者のＰＴＸ３／ＣＲＰ比の推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態を診断するものである。ここでＩＬ−６阻害薬は、ＩＬ−６の生物学的活性を抑制する薬剤をいう。例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体またはｇｐ１３０（ｇｐ１３０は分子量約１３０ｋＤの糖タンパク質であり、ＩＬ−６受容体と会合して細胞内にシグナルを伝達するタンパク質である）の作用を阻害する薬剤であるが、ＩＬ−６の生物学的活性を抑制する薬剤であればこれらの例に限られない。具体的には、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ｇｐ１３０抗体、またはＩＬ−６、ＩＬ−６受容体若しくはｇｐ１３０を阻害するペプチド、タンパク質若しくは低分子化合物を例示することができる。抗ＩＬ−６抗体としてＣＮＴＯ３２８、抗ＩＬ−６受容体拮抗薬としてトシリズマブが挙げられる。このうち、抗ＩＬ−６受容体抗体が好ましく、特にトシリズマブが好ましい。ＩＬ−６阻害薬は、望ましくないＩＬ−６の増加を伴う疾患の治療に用いることができる。関節リウマチ、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、クローン病、潰瘍性大腸炎、心臓粘液腫、骨髄腫、成人スチル病、多発性軟骨炎、高安動脈炎、反応性関節炎、ＲＳ３ＰＥ症候群で治療例が存在する。本発明は、ＩＬ−６阻害薬治療の適用疾患に限らず、ＩＬ−６阻害薬投与患者を対象とすることができるが、関節リウマチ患者を対象とするのが特に好ましい。また、ＩＬ−６阻害薬投与患者のうち、ＩＬ−６阻害薬の効果が現れＣＲＰ値が、炎症状態を判断するための基準値以下に低下した患者を対象にするのが好ましい。
【００１２】
本発明においては、前記患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度を測定する。試料は、ＰＴＸ３タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、ヒトから採取された試料が好ましい。試料の具体的な例としては、例えば、血液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。
【００１３】
本発明において測定するＰＴＸ３は、特に限定されず、全長ＰＴＸ３でも、その断片でもよい。
試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＰＴＸ３抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００１４】
抗ＰＴＸ３抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
【００１５】
本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＰＴＸ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
【００１６】
抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
【００１７】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法においては、ＰＴＸ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。
【００１８】
抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質の測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＰＴＸ３抗体を用いる方法を挙げることができる。
【００１９】
例えば、支持体に固定された抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
【００２０】
抗ＰＴＸ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、131Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＰＴＸ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
【００２１】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＰＰＴＸ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＥ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
【００２２】
ＰＴＸ３タンパク質測定方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＰＴＸ３抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。
【００２３】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＰＴＸ３タンパク質を検出する。
【００２４】
ＰＴＸ３タンパク質測定方法の他の態様として、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
【００２５】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＰＴＸ３タンパク質を、一次抗ＰＴＸ３抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
【００２６】
ＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＰＴＸ３抗体を感作した担体を用いてＰＴＸ３を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗ＰＴＸ３抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＰＴＸ３を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
【００２７】
ＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等のバイオセンサーを用いることによりＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＰＴＸ３抗体に結合するＰＴＸ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
【００２８】
本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
【００２９】
本発明は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者の炎症状態診断薬の提供をも目的とするが、該診断薬は少なくとも抗ＰＴＸ３抗体を含む。ここで診断薬には、キットも含まれる。該診断薬がＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【００３０】
ＩＬ−６阻害薬投与を受けている炎症性疾患患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度は、当該患者の炎症状態を正確に反映している。すなわち、ＩＬ−６阻害薬投与により炎症が抑制されている場合は、ＰＴＸ３濃度は低値を示すが、症状が悪化（例えば、発熱、疼痛、腫脹の悪化）した場合は上昇し、また感染症により炎症が生じている場合も上昇する。これに対し、炎症マーカーとして広く用いられているＣＲＰ濃度は、ＩＬ−６阻害薬投与により低下し、症状が悪化しても感染症が生じても低値を示す。
このように前記患者のＰＴＸ３濃度は、炎症状態を正確に反映するので、健常者のＰＴＸ３濃度又は炎症性疾患患者がＩＬ−６阻害薬投与により炎症が抑制された状態のＰＴＸ３濃度の比べてＰＴＸ３濃度が高い場合には、当該患者は炎症が生じていると診断することができる。このようなＰＴＸ３濃度が高くなっているか否かは、予め準備しておいた健常者のＰＴＸ３濃度又はＩＬ−６阻害薬投与により炎症が抑制された状態のＰＴＸ３濃度との統計学的な差があるか否かにより判定できる。ここで、炎症が生じている場合には、前記のように炎症症状の悪化、感染症による炎症の発生が含まれる。
また、個々の患者の経時的なＰＴＸ３値の推移を観察することによってもＩＬ−６阻害剤の投与を受けている患者の炎症状態を判定することが可能である。例えば、ある時期のＰＴＸ３濃度に比べて、次の測定時期のＰＴＸ３濃度が高ければ、炎症が増悪したと判断することができる。
【００３１】
また、前記患者のＣＲＰ濃度は、ＩＬ−６阻害薬投与により速やかに低下し、その後の炎症発生にもかかわらず上昇しない。従って、ＰＴＸ３濃度とＣＲＰ濃度を組み合わせることにより、ＩＬ−６阻害薬投与患者の炎症状態を診断することができる。例えばＰＴＸ３／ＣＲＰ比を測定すれば、当該患者の炎症状態を効率良く診断することができる。ＩＬ−６阻害薬の投与を受けていない患者では、炎症状態の存在によりＰＴＸ−３、ＣＲＰの両方が上昇するため、ＰＴＸ３／ＣＲＰ比は炎症状態の程度に依存して大きな変動を示さない。しかし、ＩＬ−６阻害薬の投与を受けている患者では、ＰＴＸ３／ＣＲＰ比は炎症状態の存在により顕著に上昇する。ＩＬ−６阻害薬の投与を受けている患者のＰＴＸ３（ｎｇ／ｍＬ）／ＣＲＰ（ｍｇ／ｄＬ）比が、１００以上であれば炎症状態の存在が疑われる。ＰＴＸ３／ＣＲＰ比の炎症状態の判定のための基準値は、９０から１６０に設定するのが好ましく、特に好ましくは９５から１４０、さらに好ましくは１００から１２０である。ここで、ＰＴＸ３／ＣＲＰ比の算出に使用する数値はＰＴＸ３はｎｇ／ｍＬ、ＣＲＰはｍｇ／ｄＬ単位を使用したが、他の単位を使用する場合には前記基準値と換算することが可能である。なお、使用した測定系のＣＲＰ値が０であった場合には、その測定系の最低検出感度の数値をＣＲＰ値として代入することによりＰＴＸ３／ＣＲＰ比を算出することができる。
また、個々の患者の経時的なＰＴＸ３／ＣＲＰ比の推移を観察することによってもＩＬ−６阻害薬の投与を受けている患者の炎症状態を判定することが可能である。例えば、ある時期のＰＴＸ３／ＣＲＰに比べて、次の測定時期のＰＴＸ３／ＣＲＰ比が大きければ、炎症が増悪したと判断することができる。
【００３２】
なおＣＲＰ濃度は、公知の方法によって測定できる。ＥＬＩＳＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法等を用いた測定キットが市販されている。
【実施例】
【００３３】
実施例１
＜対象＞
関節リウマチ患者２６名を対象とした。トシリズマブ８ｍｇ／ｋｇを４週間間隔で点滴静脈注射により投与し、４週間毎に最大６０週間の観察を行った。患者背景は表１の通りである。
トシリズマブ投与開始前及びトシリズマブの投与の際に、ＤＡＳ２８−ＥＳＲスコア、ＣＲＰ及びＰＴＸ３値の測定を行った。１回目の投与時に１回目の測定、４週間後の２回目の投与時に２回目の測定、というように最大６０週間まで（１５回）測定を行った。血清ＣＲＰ値は、エルピアエースＣＲＰ−ＬII（三菱化学メディエンス社製）、血漿ＰＴＸ３値は加ＥＤＴＡ血漿を用いてＰＴＸ３−ＥＬＩＳＡキット（ペルセウスプロテオミクス社製）により測定した。また、感染症が疑われたときには白血球数（ＷＢＣ）を測定した。なお、ＰＴＸ３−ＥＬＩＳＡキットは、ＷＯ ２００５／０８０９８１の実施例８と同様にして得られたものである。
【００３４】
【表１】
【００３５】
ＤＡＳ２８−ＥＳＲスコアは次の通りに算出した。
（１）疼痛・圧痛関節（Ｒｉｔｃｈｉｅ関節指数）（Ｔ２８）
（２）腫脹関節数（Ｓ２８）
（３）患者の全般健康状態（ＶＡＳ １００ｍｍによる）
（４）赤沈値（ＥＳＲ）、単位：ｍｍ/時
【００３６】
（１）〜（４）を次の計算式にあてはめてＤＡＳ２８−ＥＳＲスコアを算出した。
【００３７】
【数１】
【００３８】
（１）（２）は２８箇所の関節について評価した結果を用いるが、当該２８関節及びＶＡＳの評価を含むＤＡＳ２８−ＥＳＲの具体的算出方法については当業者に公知の方法により行うことができる（Prevoo MLL, et al:Modified disease activity scores that include twenty-eight-joint counts. Development and validation in a prospective longitudinal study of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum38:44-48,1995）。
【００３９】
実施例２
＜全症例の結果＞
２６症例のＤＡＳ−ＥＳＲ値の平均値の推移を図１、ＣＲＰ値又はＰＴＸ３値の平均値の推移を図２に示した。ＣＲＰ値はトシリズマブ投与開始４週間後より、治療開始前のＣＲＰ値に対して有意な低下を示した。ＰＴＸ３値はトシリズマブ投与開始４４週以降に治療開始前のＣＲＰ値に対して有意な低下を示した（図２）。
【００４０】
実施例３
＜感染症とＣＲＰ値、ＰＴＸ３値＞
トシリズマブ治療中に感染症に罹患した患者２名のＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＣＲＰ値、ＰＴＸ３値の推移を図３（症例２）及び図４(症例２８)に示す。感染症の診断は、病歴、患者の主訴及び観察される症状、理学所見、画像診断等に基づいて医師により行われた。
感染症罹患時に、一般的に炎症マーカーとして用いられるＣＲＰ値は上昇しなかった。また、白血球数（ＷＢＣ、個/μL）は顕著な上昇を示さなかった。しかし、ＰＴＸ３値は、感染症の臨床症状の発現に伴い上昇が認められた。
【００４１】
実施例４
＜関節疼痛・腫脹の憎悪とＰＴＸ３＞
トシリズマブ治療中に関節疼痛・腫脹の憎悪が認められた患者１名のＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＣＲＰ値、ＰＴＸ３値の推移を図５に示す（症例２７）。関節疼痛・腫脹は医師により理学所見として有無が判断された。ＣＲＰ値、ＤＡＳ２８−ＥＳＲが関節疼痛・腫脹の憎悪に伴いほとんど変動しなかったのに対して、ＰＴＸ３値は鋭敏に上昇した。
【００４２】
実施例５
＜ＰＴＸ３/ＣＲＰ比と炎症症状＞
実施例３に記載の患者２名のＰＴＸ３／ＣＲＰ比を求め、その推移を図６、実施例４に記載の患者１名のＰＴＸ３／ＣＲＰ比の推移を図７に示した。ＰＴＸ３濃度はｎｇ／ｍＬ単位、ＣＲＰ濃度はｍｇ／ｄＬ単位での数値をＰＴＸ３／ＣＲＰ比の算出に使用した。また、ＣＲＰの測定値が０であった場合には、ＣＲＰ濃度を使用した測定系の最低検出感度である０．１ｍｇ／ｍＬと擬制して計算を行った。
その結果、感染症および関節リウマチの増悪による炎症の発生時(図６、７に矢印で示
す)にＰＴＸ３/ＣＲＰ比が上昇することが明らかになった。ＰＴＸ３/ＣＲＰ比が概ね１
００以上になった場合には、何らかの炎症状態の発生が疑うことができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＴＸ３は、Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ、Ｐｅｎｔａｘｉｎ、ＴＳＧ−１４、ＭＰＴＸ３とも呼ばれ、インターロイキン１(ＩＬ−１)刺激を受けたヒト臍帯内皮細胞に発現しているものとして発見されたペントラキシン（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ）ファミリーに属する分泌タンパク質である（非特許文献１）。
ペントラキシンファミリーはＬｏｎｇ ＰｅｎｔｒａｘｉｎとＳｈｏｒｔ Ｐｅｎｔｒａｘｉｎに大別される。炎症性タンパクとして知られているＣ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）やｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ＳＡＰ）はＳｈｏｒｔ Ｐｅｎｔｒａｘｉｎに属し、構造の点で非常に類似している（非特許文献２）。ＣＲＰは特に炎症マーカーとして広く使用されている。
【０００３】
関節リウマチ患者では、ＣＲＰ値の変動は関節リウマチによる炎症を反映するのみならず、感染症等による炎症状態を反映して上昇する。近年、関節リウマチ等の画期的な治療薬としてＩＬ−６の作用を阻害する働きを持つ抗ＩＬ−６受容体抗体であるトシリズマブが上市された。ＣＲＰは炎症時に産生されるＩＬ−６により正の調節を受けて肝臓で合成され血中に分泌される。したがって、トシリズマブ投与患者ではＣＲＰの合成経路がトシリズマブにより阻害されるためＣＲＰが産生されず、ＣＲＰを炎症マーカーとして使用することができないことが問題となっている。また、トシリズマブはＩＬ−６の作用を抑えるという作用機序から、発熱などの症状や血中ＣＲＰ濃度の上昇をマスクしてしまうという性質を持つ。その結果、トシリズマブ投与患者は感染症に罹患や憎悪し易く、患者自身や医師が感染症の罹患に気づかないままに重篤な状態に陥ることが重大な問題となっている。トシリズマブ投与患者の炎症状態を知るためには、ＣＲＰや白血球数のわずかな変動や微細な症状の観察に頼らざるをえず、トシリズマブ投与患者においても使用可能な炎症マーカーが求められている。
【０００４】
他方、ＣＲＰと類似する構造を持つＰＴＸ３もまたＣＲＰと同様に炎症マーカーとなることが知られている（非特許文献３）。関節リウマチについては、関節リウマチ患者の滑液で正常コントロールと比較してＰＴＸ３タンパク質の発現が高いこと、関節リウマチ患者より採取した滑膜組織にはＰＴＸ３タンパク質が強く発現していることが報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Arthritis and Rheumatism,44/12(2841-50),2001
【非特許文献２】Breviario et al.: J. Biol. Chem., 267(31), 22190-7 (1992)
【非特許文献３】Bottazzi et al.:J.Leucoc.Biol.,79(5),909-12,(2006)
【非特許文献４】Luchetti et al.: Clin Exp Immunol.,119:196-202(2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＩＬ−６阻害薬による治療を受けている患者における炎症状態を正確に判定又は診断する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者の炎症状態を正確に把握すべく、ＣＲＰ濃度に加えてＰＴＸ３濃度を測定し、それらの血中濃度と、炎症状態、例えば炎症性疾患の炎症症状の改善又は増化、感染症による炎症の発生等との相関性を検討したところ、ＣＲＰ濃度は炎症症状の悪化、感染症の発生にもかかわらず低値となるにもかかわらず、ＰＴＸ３濃度は炎症症状が改善している場合は低値を示し、炎症症状が悪化した場合や感染症に罹患した場合には明確な上昇を示すことから、ＰＴＸ３濃度はＩＬ−６阻害薬投与患者における炎症状態を正確に把握するためのマーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とするＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態の検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記炎症状態が、ＩＬ−６阻害薬の対象疾患の炎症状態又は感染症による炎症状態である上記の検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ＰＴＸ３濃度及び、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている炎症性疾患患者由来の試料中のＣＲＰ濃度を組み合わせて検出する上記の検出方法を提供するものである。
また、本発明は、抗ＰＴＸ３抗体を含有する、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者の炎症状態診断薬を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来ＩＬ−６阻害薬による治療を受けている患者特有の問題、すなわち発熱などの炎症症状の悪化、感染症の発生を発見できないという問題を、的確に発見でき、ＩＬ−６阻害薬投与に加えて、適切な治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】トシリズマブ治療を受けている関節リウマチ患者２６症例のＤＡＳ２８−ＥＳＲ値の平均値の推移を示す図である。
【図２】トシリズマブ治療を受けている関節リウマチ患者２６症例の血中ＣＲＰ濃度及び血中ＲＴＸ３濃度の推移を示す図である。「ベースライン」は、治療開始前のＣＲＰ濃度の数値を示す。
【図３】トシリズマブ治療中に感染症に罹患した患者のＤＡＳ２８−ＥＳＲ値、血中ＣＲＰ濃度、及び血中ＰＴＸ３濃度の推移を示す図である。
【図４】トシリズマブ治療中に感染症に罹患した患者のＤＡＳ２８−ＥＳＲ値、血中ＣＲＰ濃度、及び血中ＰＴＸ３濃度の推移を示す図である。
【図５】トシリズマブ治療中に関節疼痛、腫脹の憎悪が認められた患者のＤＡＳ２８−ＥＳＲ、血中ＣＲＰ濃度及び血中ＰＴＸ３濃度の推移を示す図である。
【図６】実施例３の患者のＰＴＸ３／ＣＲＰ比の推移を示す図である。
【図７】実施例４の患者のＰＴＸ３／ＣＲＰ比の推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態を診断するものである。ここでＩＬ−６阻害薬は、ＩＬ−６の生物学的活性を抑制する薬剤をいう。例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体またはｇｐ１３０（ｇｐ１３０は分子量約１３０ｋＤの糖タンパク質であり、ＩＬ−６受容体と会合して細胞内にシグナルを伝達するタンパク質である）の作用を阻害する薬剤であるが、ＩＬ−６の生物学的活性を抑制する薬剤であればこれらの例に限られない。具体的には、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ｇｐ１３０抗体、またはＩＬ−６、ＩＬ−６受容体若しくはｇｐ１３０を阻害するペプチド、タンパク質若しくは低分子化合物を例示することができる。抗ＩＬ−６抗体としてＣＮＴＯ３２８、抗ＩＬ−６受容体拮抗薬としてトシリズマブが挙げられる。このうち、抗ＩＬ−６受容体抗体が好ましく、特にトシリズマブが好ましい。ＩＬ−６阻害薬は、望ましくないＩＬ−６の増加を伴う疾患の治療に用いることができる。関節リウマチ、若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、クローン病、潰瘍性大腸炎、心臓粘液腫、骨髄腫、成人スチル病、多発性軟骨炎、高安動脈炎、反応性関節炎、ＲＳ３ＰＥ症候群で治療例が存在する。本発明は、ＩＬ−６阻害薬治療の適用疾患に限らず、ＩＬ−６阻害薬投与患者を対象とすることができるが、関節リウマチ患者を対象とするのが特に好ましい。また、ＩＬ−６阻害薬投与患者のうち、ＩＬ−６阻害薬の効果が現れＣＲＰ値が、炎症状態を判断するための基準値以下に低下した患者を対象にするのが好ましい。
【００１２】
本発明においては、前記患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度を測定する。試料は、ＰＴＸ３タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、ヒトから採取された試料が好ましい。試料の具体的な例としては、例えば、血液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。
【００１３】
本発明において測定するＰＴＸ３は、特に限定されず、全長ＰＴＸ３でも、その断片でもよい。
試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＰＴＸ３抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００１４】
抗ＰＴＸ３抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
【００１５】
本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＰＴＸ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
【００１６】
抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
【００１７】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法においては、ＰＴＸ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。
【００１８】
抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質の測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＰＴＸ３抗体を用いる方法を挙げることができる。
【００１９】
例えば、支持体に固定された抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
【００２０】
抗ＰＴＸ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、131Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＰＴＸ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
【００２１】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＰＰＴＸ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＥ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
【００２２】
ＰＴＸ３タンパク質測定方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＰＴＸ３抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。
【００２３】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＰＴＸ３タンパク質を検出する。
【００２４】
ＰＴＸ３タンパク質測定方法の他の態様として、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
【００２５】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＰＴＸ３タンパク質を、一次抗ＰＴＸ３抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
【００２６】
ＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＰＴＸ３抗体を感作した担体を用いてＰＴＸ３を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗ＰＴＸ３抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＰＴＸ３を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
【００２７】
ＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等のバイオセンサーを用いることによりＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＰＴＸ３抗体に結合するＰＴＸ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
【００２８】
本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
【００２９】
本発明は、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者の炎症状態診断薬の提供をも目的とするが、該診断薬は少なくとも抗ＰＴＸ３抗体を含む。ここで診断薬には、キットも含まれる。該診断薬がＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【００３０】
ＩＬ−６阻害薬投与を受けている炎症性疾患患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度は、当該患者の炎症状態を正確に反映している。すなわち、ＩＬ−６阻害薬投与により炎症が抑制されている場合は、ＰＴＸ３濃度は低値を示すが、症状が悪化（例えば、発熱、疼痛、腫脹の悪化）した場合は上昇し、また感染症により炎症が生じている場合も上昇する。これに対し、炎症マーカーとして広く用いられているＣＲＰ濃度は、ＩＬ−６阻害薬投与により低下し、症状が悪化しても感染症が生じても低値を示す。
このように前記患者のＰＴＸ３濃度は、炎症状態を正確に反映するので、健常者のＰＴＸ３濃度又は炎症性疾患患者がＩＬ−６阻害薬投与により炎症が抑制された状態のＰＴＸ３濃度の比べてＰＴＸ３濃度が高い場合には、当該患者は炎症が生じていると診断することができる。このようなＰＴＸ３濃度が高くなっているか否かは、予め準備しておいた健常者のＰＴＸ３濃度又はＩＬ−６阻害薬投与により炎症が抑制された状態のＰＴＸ３濃度との統計学的な差があるか否かにより判定できる。ここで、炎症が生じている場合には、前記のように炎症症状の悪化、感染症による炎症の発生が含まれる。
また、個々の患者の経時的なＰＴＸ３値の推移を観察することによってもＩＬ−６阻害剤の投与を受けている患者の炎症状態を判定することが可能である。例えば、ある時期のＰＴＸ３濃度に比べて、次の測定時期のＰＴＸ３濃度が高ければ、炎症が増悪したと判断することができる。
【００３１】
また、前記患者のＣＲＰ濃度は、ＩＬ−６阻害薬投与により速やかに低下し、その後の炎症発生にもかかわらず上昇しない。従って、ＰＴＸ３濃度とＣＲＰ濃度を組み合わせることにより、ＩＬ−６阻害薬投与患者の炎症状態を診断することができる。例えばＰＴＸ３／ＣＲＰ比を測定すれば、当該患者の炎症状態を効率良く診断することができる。ＩＬ−６阻害薬の投与を受けていない患者では、炎症状態の存在によりＰＴＸ−３、ＣＲＰの両方が上昇するため、ＰＴＸ３／ＣＲＰ比は炎症状態の程度に依存して大きな変動を示さない。しかし、ＩＬ−６阻害薬の投与を受けている患者では、ＰＴＸ３／ＣＲＰ比は炎症状態の存在により顕著に上昇する。ＩＬ−６阻害薬の投与を受けている患者のＰＴＸ３（ｎｇ／ｍＬ）／ＣＲＰ（ｍｇ／ｄＬ）比が、１００以上であれば炎症状態の存在が疑われる。ＰＴＸ３／ＣＲＰ比の炎症状態の判定のための基準値は、９０から１６０に設定するのが好ましく、特に好ましくは９５から１４０、さらに好ましくは１００から１２０である。ここで、ＰＴＸ３／ＣＲＰ比の算出に使用する数値はＰＴＸ３はｎｇ／ｍＬ、ＣＲＰはｍｇ／ｄＬ単位を使用したが、他の単位を使用する場合には前記基準値と換算することが可能である。なお、使用した測定系のＣＲＰ値が０であった場合には、その測定系の最低検出感度の数値をＣＲＰ値として代入することによりＰＴＸ３／ＣＲＰ比を算出することができる。
また、個々の患者の経時的なＰＴＸ３／ＣＲＰ比の推移を観察することによってもＩＬ−６阻害薬の投与を受けている患者の炎症状態を判定することが可能である。例えば、ある時期のＰＴＸ３／ＣＲＰに比べて、次の測定時期のＰＴＸ３／ＣＲＰ比が大きければ、炎症が増悪したと判断することができる。
【００３２】
なおＣＲＰ濃度は、公知の方法によって測定できる。ＥＬＩＳＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法等を用いた測定キットが市販されている。
【実施例】
【００３３】
実施例１
＜対象＞
関節リウマチ患者２６名を対象とした。トシリズマブ８ｍｇ／ｋｇを４週間間隔で点滴静脈注射により投与し、４週間毎に最大６０週間の観察を行った。患者背景は表１の通りである。
トシリズマブ投与開始前及びトシリズマブの投与の際に、ＤＡＳ２８−ＥＳＲスコア、ＣＲＰ及びＰＴＸ３値の測定を行った。１回目の投与時に１回目の測定、４週間後の２回目の投与時に２回目の測定、というように最大６０週間まで（１５回）測定を行った。血清ＣＲＰ値は、エルピアエースＣＲＰ−ＬII（三菱化学メディエンス社製）、血漿ＰＴＸ３値は加ＥＤＴＡ血漿を用いてＰＴＸ３−ＥＬＩＳＡキット（ペルセウスプロテオミクス社製）により測定した。また、感染症が疑われたときには白血球数（ＷＢＣ）を測定した。なお、ＰＴＸ３−ＥＬＩＳＡキットは、ＷＯ ２００５／０８０９８１の実施例８と同様にして得られたものである。
【００３４】
【表１】
【００３５】
ＤＡＳ２８−ＥＳＲスコアは次の通りに算出した。
（１）疼痛・圧痛関節（Ｒｉｔｃｈｉｅ関節指数）（Ｔ２８）
（２）腫脹関節数（Ｓ２８）
（３）患者の全般健康状態（ＶＡＳ １００ｍｍによる）
（４）赤沈値（ＥＳＲ）、単位：ｍｍ/時
【００３６】
（１）〜（４）を次の計算式にあてはめてＤＡＳ２８−ＥＳＲスコアを算出した。
【００３７】
【数１】
【００３８】
（１）（２）は２８箇所の関節について評価した結果を用いるが、当該２８関節及びＶＡＳの評価を含むＤＡＳ２８−ＥＳＲの具体的算出方法については当業者に公知の方法により行うことができる（Prevoo MLL, et al:Modified disease activity scores that include twenty-eight-joint counts. Development and validation in a prospective longitudinal study of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum38:44-48,1995）。
【００３９】
実施例２
＜全症例の結果＞
２６症例のＤＡＳ−ＥＳＲ値の平均値の推移を図１、ＣＲＰ値又はＰＴＸ３値の平均値の推移を図２に示した。ＣＲＰ値はトシリズマブ投与開始４週間後より、治療開始前のＣＲＰ値に対して有意な低下を示した。ＰＴＸ３値はトシリズマブ投与開始４４週以降に治療開始前のＣＲＰ値に対して有意な低下を示した（図２）。
【００４０】
実施例３
＜感染症とＣＲＰ値、ＰＴＸ３値＞
トシリズマブ治療中に感染症に罹患した患者２名のＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＣＲＰ値、ＰＴＸ３値の推移を図３（症例２）及び図４(症例２８)に示す。感染症の診断は、病歴、患者の主訴及び観察される症状、理学所見、画像診断等に基づいて医師により行われた。
感染症罹患時に、一般的に炎症マーカーとして用いられるＣＲＰ値は上昇しなかった。また、白血球数（ＷＢＣ、個/μL）は顕著な上昇を示さなかった。しかし、ＰＴＸ３値は、感染症の臨床症状の発現に伴い上昇が認められた。
【００４１】
実施例４
＜関節疼痛・腫脹の憎悪とＰＴＸ３＞
トシリズマブ治療中に関節疼痛・腫脹の憎悪が認められた患者１名のＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＣＲＰ値、ＰＴＸ３値の推移を図５に示す（症例２７）。関節疼痛・腫脹は医師により理学所見として有無が判断された。ＣＲＰ値、ＤＡＳ２８−ＥＳＲが関節疼痛・腫脹の憎悪に伴いほとんど変動しなかったのに対して、ＰＴＸ３値は鋭敏に上昇した。
【００４２】
実施例５
＜ＰＴＸ３/ＣＲＰ比と炎症症状＞
実施例３に記載の患者２名のＰＴＸ３／ＣＲＰ比を求め、その推移を図６、実施例４に記載の患者１名のＰＴＸ３／ＣＲＰ比の推移を図７に示した。ＰＴＸ３濃度はｎｇ／ｍＬ単位、ＣＲＰ濃度はｍｇ／ｄＬ単位での数値をＰＴＸ３／ＣＲＰ比の算出に使用した。また、ＣＲＰの測定値が０であった場合には、ＣＲＰ濃度を使用した測定系の最低検出感度である０．１ｍｇ／ｍＬと擬制して計算を行った。
その結果、感染症および関節リウマチの増悪による炎症の発生時(図６、７に矢印で示
す)にＰＴＸ３/ＣＲＰ比が上昇することが明らかになった。ＰＴＸ３/ＣＲＰ比が概ね１
００以上になった場合には、何らかの炎症状態の発生が疑うことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とするＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態の検出方法。
【請求項２】
前記炎症状態が、ＩＬ−６阻害薬の対象疾患の炎症状態又は感染症による炎症状態である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記ＰＴＸ３濃度及び、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者由来の試料中のＣＲＰ濃度を組み合わせて検出する請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
試料が、血液、血漿又は血清である請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項５】
ＰＴＸ３濃度の測定が、抗ＰＴＸ３抗体を用いて試料中のＰＴＸ３濃度を測定する免疫学的測定である請求項１〜４のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項６】
免疫学的測定が、ＥＬＩＳＡである請求項５記載の検出方法。
【請求項７】
抗ＰＴＸ３抗体を含有する、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者の炎症状態診断薬。
【請求項１】
ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者由来の試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とするＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者における炎症状態の検出方法。
【請求項２】
前記炎症状態が、ＩＬ−６阻害薬の対象疾患の炎症状態又は感染症による炎症状態である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記ＰＴＸ３濃度及び、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者由来の試料中のＣＲＰ濃度を組み合わせて検出する請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
試料が、血液、血漿又は血清である請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項５】
ＰＴＸ３濃度の測定が、抗ＰＴＸ３抗体を用いて試料中のＰＴＸ３濃度を測定する免疫学的測定である請求項１〜４のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項６】
免疫学的測定が、ＥＬＩＳＡである請求項５記載の検出方法。
【請求項７】
抗ＰＴＸ３抗体を含有する、ＩＬ−６阻害薬投与を受けている患者の炎症状態診断薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−５３０３４（Ｐ２０１２−５３０３４Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６３８４０（Ｐ２０１１−１６３８４０）
【出願日】平成２３年７月２７日（２０１１．７．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）２０１０年２月８日 九州リウマチ学会事務局「第３９回九州リウマチ学会プログラム抄録集」に発表 （２）２０１０年３月７日 一般社団法人日本リウマチ学会「第３９回九州リウマチ学会」に発表 （３）２０１０年３月１９日一般社団法人日本リウマチ学会「第５４回日本リウマチ学会総会・学術集会プログラム抄録集」に発表 （４）２０１０年４月２４日 一般社団法人日本リウマチ学会総会・学術集会に発表
【出願人】（５０３１９６７７６）株式会社ペルセウスプロテオミクス (25)
【出願人】（５１０２１５４５５）医療法人財団白十字会 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２７日（２０１１．７．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）２０１０年２月８日 九州リウマチ学会事務局「第３９回九州リウマチ学会プログラム抄録集」に発表 （２）２０１０年３月７日 一般社団法人日本リウマチ学会「第３９回九州リウマチ学会」に発表 （３）２０１０年３月１９日一般社団法人日本リウマチ学会「第５４回日本リウマチ学会総会・学術集会プログラム抄録集」に発表 （４）２０１０年４月２４日 一般社団法人日本リウマチ学会総会・学術集会に発表
【出願人】（５０３１９６７７６）株式会社ペルセウスプロテオミクス (25)
【出願人】（５１０２１５４５５）医療法人財団白十字会 (1)
【Ｆターム（参考）】
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