炭疽菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
【解決手段】 配列番号５から得られる核酸配列を持ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る部位を１つ以上含むオリゴヌクレオチド。配列番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を持っていない該オリゴヌクレオチド。バチラスセレウス又はバチラスチュウリンジェンシスに由来する核酸配列を増幅し得る部位を持っていない該オリゴヌクレオチド。配列ＡＡＴＣＧＴＡＡＴＡＴＴＡＡＡＣＴＧＡＣＧ又は配列ＣＣＴＴＣＡＴＡＣＧＴＧＴＧＡＡＴＧＴＴＧである該オリゴヌクレオチド。上記のいずれかを２種類組み合わせたプライマーセットを用いて、検体中に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在するか否かを決定して炭疽菌の検出を行う方法。
【効果】 炭疽菌のｇｙｒＢ遺伝子を特異的に増幅して、他のバチラス属およびバチラス属以外の菌株から区別、同定できる。
【効果】 炭疽菌のｇｙｒＢ遺伝子を特異的に増幅して、他のバチラス属およびバチラス属以外の菌株から区別、同定できる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、炭疸菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に特徴的な核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーに関する。本発明は、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）特異的プライマーを用いたポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）による炭疽菌の検出に関する。本発明は、検体中のバチラスセレウスをバチラスセレウスをバチラスチュウリンジエンシスおよび炭疽菌と遺伝子レベルで区別して検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】炭疸菌はグラム陽性桿菌で胞子を形成するため耐熱性を示す。また、炭疸菌は人畜共通感染症である炭疸の病原体であり、臨床的に重要である。
【０００３】炭疸菌を単離、同定するには、通常、Ｍａｎｎｉｔｏｌ Ｅｇｇ−ｙｏｌｋＰｏｌｙｍｙｘｉｎ（ＭＹＰ）寒天培地やＮａＣｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｋｉｍａｎｄ Ｇｏｅｐｆｅｒｔ（ＮＧＫＧ）寒天培地に卵黄液を加えた選択培地を用い、卵黄反応を生じた集落を陽性とする。さらに、硝酸塩還元、クエン酸塩利用、ゼラチン分解性、ＶＰ反応、ブドウ糖分解は陽性で、マンニット、アラビノース、キシロース分解は陰性であることを確認しなければいけない。
【０００４】上記確認試験での性状は、炭疸菌と類縁菌であるバチラスチュウリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチラスチュウセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチラスマイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）でも同じである。バチラスセレウスと炭疸菌の区別は、前者が運動性を示すのが多いのに対し、後者は非運動性でガンマファージによる溶菌が起こる。前者が羊血球に対する溶血性、チロシン分解を示すのに対し、後者は示さない。
【０００５】バチラスセレウスとバチラスマイコイデスは、バチラスマイコイデスが非運動性で溶血性、チロシン分解陰性で足根状集落を形成することで区別できる。これら確認試験は判定までに時間がかかり、多くの労力を要する。
【０００６】類縁菌であるバチラスチュウリンジェンシスは、殺虫性タンパク質を産生する点でバチラスセレウスと区別されているが、その他の生化学的性状はバチラスセレウスと同一である。現在の分類では、この殺虫性タンパク質が顕微鏡で確認されたものをバチラスチュウリンジェンシスとすることとしているが、血清型での両者の区別も明確でない。また、バチラスチュウリンジェンシスの中には、バチルスセレウス様のエンテロトキシンを産生するという報告もある〔ＷｏｒｌｄＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（１９９４）ｐ４０６−４０９〕。バチラスセレウスとバチルスチュウリンジェンシスの間では、プラスミドの受け渡しが行われるという報告があることから〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９（１９８２）ｐ６９５１−６９５５〕、恐らく、もともとバチラスセレウスであったものに、殺虫性タンパク質をコードするプラスミドがなんらかの影響を受けて導入されたものと推測される。従って、殺虫性タンパク質の有無による現在の分類でバチラスチュウリンジェンシスとされているものの中にも、食中毒を起こす可能性のある菌が存在することが考えられる。また、バチラスチュウリンジェンシスは生物農薬として土壌に散布されており、上記の理由からも安全性が危惧される。このような背景のもと、殺虫性タンパク質とは別の観点から、バチラスセレウスとバチルスチュウリンジェンシスを区別する必要がでてきた。
【０００７】一方、バチラスセレウスの毒素については、下痢性のエンテロトキシンはクローン化され塩基配列が決定されている〔Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｉｇｙ，１４１（１９９５），ｐ９８３−９８８〕。しかし、下痢性のエンテロトキシンはこれだけかどうかは明らかでない。このエンテロトキシンに対応するキットも市販されているが、バチラスセレウスのエンテロトキシンが全て明らかにされていないため、十分な評価は受けていない〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０（１９９４），ｐ４６１４−４６１６〕。一方、嘔吐型毒素はサイクリックペプチドという報告がある〔Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２８（１９９５），ｐ１２９−１４４〕。また、バチラスセレウスの中には毒素を産生しないものもあり、毒素のみを指標としたバチラスセレウスの検出は確実でない。
【０００８】また、遺伝子レベルでの解析に用いられている１６Ｓ ｒＲＮＡでは、バチラスセレウスと炭疸菌は９９％以上の相同性を示すため、これは同定の指標となり得ない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】いわゆるバチラスセレウスグループにはバチラスセレウスはじめバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマイコイデスが含まれている。その際、人畜に対する危険性を考慮すると、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌は毒素を産出する好ましくない菌である。一方バチラスマイコイデスはそのような毒素を産出しないため、前述の３種とは安全性の面から区別してもよいと考えられ、上記のようにバチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな意義があると思われる。例えば、セレウスグループの食中毒関連菌を食品から検出する場合、危険性を考慮してセレウス特異的なプライマーだけでなく、チュウリンジェンシスおよび炭疽菌特異的プライマーを用いて検出することにより、安全性を確実に確認できる。本発明は、炭疽菌を他の微生物と区別できる検査法の提供を目的とする。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出操作をしなくても、菌から炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法により検出する方法の提供を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。また本発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持ち、配列番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を持っていない、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。さらにまた本発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持ち、配列番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を持っていない、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むが、バチラスセレウスまたはバチラスチュウリンジェンシスに由来する核酸配列を増幅し得る部位を持っていないことを特徴とするオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。好ましくは本発明は、配列番号１１または配列番号１２で示される核酸配列を持っているオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。配列番号２のアミノ酸配列は、上記配列番号１の核酸配列がコードするアミノ酸配列であり、配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号３の核酸配列がコードするアミノ酸配列であり、配列番号６のアミノ酸配列は、配列番号５の核酸配列がコードするアミノ酸配列である。
【００１１】本発明は、上記のいずれかのオリゴヌクレオチドを２種類組合せたプライマーセットを用いて、検体中のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子配列を標的とし、当該標的遺伝子を選択的に増幅させ、検体中に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在するか否かを決定することで、炭疽菌の検出を行う方法であることを要旨としている。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、炭疽菌に特異的な核酸標的配列の在否を決定するために有用なオリゴヌクレオチドプライマーを基礎とするが、そのような決定を行うための方法は、ＰＣＲを用いた遺伝子増幅法にとどまらず、従来技術であるサザンハイブリダイゼーション法等のプローブとしての使用も含む。
【００１３】本発明において、「プライマー」は、標的核酸配列へのハイブリダイズを許す特異的ヌクレオチド配列をデザインまたは生物学的に生産されたオリゴヌクレオチドである。プライマーは、ポリメラーゼまたは同様な酵素により、伸長合成されて完全な標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。プライマーは、核酸配列増幅法、例えばＰＣＲ法及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）において利用される。特定のプライマーに、特にＳＤＡ技術において有用なものは、標的核酸にハイブリダイズ可能な配列に加えて、制限エンドヌクレアーゼの認識配列、及びポリメラーゼまたはポリメラーゼ様活性を継続する他の酵素がそれ自身その鋳型特異的オリゴヌクレオチド合成の開始を指示するための任意の配列を含む。
【００１４】本発明において、「ハイブリダイゼーション」は、予め決定された反応条件下にて、部分的または完全に相補的な核酸鎖が、逆平行（アンチパラレル）様式にて向かい合うようにして、特異的かつ安定な水素結合により、二本鎖の核酸を形成する工程である。
【００１５】本発明の炭疽菌に特徴的な核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは配列番号１１および配列番号１２を含み、そしてこれらはプライマーセットとして、炭疽菌に特徴的な核酸標的配列の在否の決定に関する方法に使用する。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出等の操作なしで、菌からの炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片が、ＰＣＲ法により検出できる。本発明のプライマーは、バチラスセレウスのｇｙｒＢ遺伝子配列に特異的である。プローブは、プライマー増幅産物内の内部コンセンサス配列に特異的である。
【００１６】上記配列番号１１または配列番号１２で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを組み合わせたプライマーセットの製造方法について説明する。高特異性プローブとして、ＤＮＡジャイレース（トポイソメラーゼＩＩ）のＢサブユニットタンパク質をコードするｇｙｒＢ遺伝子を用いる。ｇｙｒＢ遺伝子を直接塩基配列を決定したユニバーサルプライマーでＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａを検出、分類する方法が報告されている〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４−１１０９〕。これらのユニバーサルプライマーは、種々のグラム陽性菌、陰性菌に共通であり、ｇｙｒＢ遺伝子の一部がＰＣＲ法により増幅された。
【００１７】これら既存のプライマーを用いて、バチラスセレウスＪＣＭ２１５２、バチラスチュリンジエンシスＩＡＭ１２０７７、炭疸菌Ｐａｓｔｅｕｒ ｎｏ．２−Ｈ〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３１（１９８５），ｐ３６３〕の塩基配列を示した。
【００１８】更に、バチラスセレウスのｇｙｒＢ遺伝子のみを増幅し、同定できるＰＣＲプライマーを作製した。これらバチスルセレウス特異的プライマーの感度を調べるため、１５株のバチラスセレウスとバチラスチュウリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイデス、枯草菌、バチラスブレビス、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオについて検討した。
【００１９】山本、原山〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４−１１０９〕らは、ＤＮＡジャイレースＢサブユニットの保存された部位２箇所から、ｇｙｒＢ遺伝子の一部を増幅させるＰＣＲプライマーを作製した。これらのプライマーを用いて、種々の細菌から約１．２ｋｂのｇｙｒＢ遺伝子部分が増幅された。
【００２０】バチラスセレウスＪＣＭ２１５２、バチラスチュウリンジエンシスＩＡＭ１２０７７と炭疸菌Ｐａｓｔｅｕｒ ｎｏ．２−Ｈから増幅された１．２ｋｂのｇｙｒＢ遺伝子を、遺伝子組換えの常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８９）に従って、適当なベクターにクローン化した。
【００２１】好ましいベクターとしてｐＧＥＭｚｆ（＋）があげられるが、一般的なベクターであれば適宜選択して用いることができる。
【００２２】有効なプライマーを作製するため、ＰＣＲ法により増幅した１．２ｋｂのバチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシスと炭疸菌のｇｙｒＢ遺伝子を、ｐＧＥＭｚｆ（＋）にクローン化し、ｇｙｒＢ遺伝子領域をＤＮＡシーケンサーを用いて、常法に従って決定した。
【００２３】ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を決定するため、増幅断片の５′、３′部分をＵＰ−１Ｓ、ＵＰ−２Ｓｒプライマー〔山本、原山Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４−１１０９〕を用いて、決定した。この場合、これらプライマーから決定できる塩基配列の領域は限られているため、得られた配列をもとに新たなプライマーを作製し、更に別の領域の塩基配列を決定した。配列番号１にバチラスセレウスＪＣＭ２１５２を、配列番号３にバチラスチュウリンジエンシスを、配列番号５に炭疸菌Ｐａｓｔｅｕｒｎｏ．２−ＨのｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を示す。
【００２４】この塩基配列の情報を用いて、バチラスセレウスを他の細菌から検出、同定する２１ｍｅｒのプライマーを作製した。このプライマーは配列番号７及び配列番号８で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドであり、プライマーセットとして利用可能である。
【００２５】これらの新規のプライマーは、既存のＰＣＲを用いたアッセイ法〔Ｓａｉｋｉｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９（１９８８），ｐ４８７−４９１〕において有用である。このプライマーは、サンプル中の目的とするＤＮＡを増幅するのに用いる。増幅段階に続いて検出段階は、ＤＮＡ検出に有効な方法であればどんな方法でもよい。例えばアガロースゲル電気泳動し、エチジュウムブロマイド染色する方法もある。
【００２６】目的とするＤＮＡはテンペレートとして機能する。サンプル中のテンペレートＤＮＡの増幅は、プライマーがテンペレートの相補的な領域に結合し、そこからテンペレートを鋳型にＤＮＡ伸長が起こる。この伸長したＤＮＡは、さらにプライマーのテンペレートとして機能する。このプロセスはＤＮＡの変性、プライマーとテンペレートとのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼ（例、Ｔａｑポリメラーゼ）によるプライマーからの伸長のサイクルを繰り返し、２組のプライマーを用いることで最終的には、ある一定の長さの２本鎖のＤＮＡが検出に必要な量まで増幅される。
【００２７】しかしながら、プライマーに相補的な配列をテンペレートＤＮＡが持っていない場合は、この一定の長さの２本鎖のＤＮＡが生成されず、サンプル中に目的とするテンペレートがないと判定できる。すなわち、サンプル中に対象とする微生物の存在を否定できる。プライマーセット＜ＢＣ１（配列番号７）、ＢＣ２（配列番号８）＞はｇｙｒＢ遺伝子の一部３６５ｂｐの配列を増幅する。ＪＣＭ、ＩＡＭ、ＩＦＯ、ＡＴＣＣのコレクションから得たバチラスセレウス１５株に３６５ｂｐの増幅断片が確認された。
【００２８】一方、炭疽菌と生化学的性状が極めて類似している、バチラスセレウス、バチラスチュリンジエンシス、バチラスマイコイデスでは増幅断片が確認されなかった。これらの知見から、本発明のプライマーは、炭疽菌に特異的であり、この食中毒菌を検出するのに用いることができる。
【００２９】同様に、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオの標準株についても、ｇｙｒＢの存在は認められたが、バチラスセレウス特異的３６５ｂｐの増幅断片は確認されなかった。
【００３０】バチラスセレウス株の中にはバチラスセレウス特異的プライマーを用いても、ＰＣＲ後の電気泳動で３６５ｂｐのバンドは検出されないものもあった。
【００３１】それらの株について、ｇｒｙＢ遺伝子を指標として、新たにバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌にそれぞれ特異的な２１〜２４ｍｅｒのプライマーを作成した。バチラスチュウリンジエンシス特異的プライマーは配列番号９及び配列番号１０で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドであり、炭疽菌特異的プライマーは配列番号１１及び配列番号１２で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲ後、ゲル電気泳動しエチジウムブロマイド染色すると、バチラスチュウリンジエンシスは３６８ｂｐ、炭疽菌は２４５ｂｐのバンドが検出できる。
【００３２】バチラスセレウス特異的プライマーで検出できなかったバチラスセレウス株について、バチラスチュウリンジエンシスないし炭疽菌特異的プライマーでＰＣＲを行ったところ、いずれかのプライマーで検出できた。つまりはｇｒｙＢ遺伝子を指標に、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を遺伝子レベルで区別できた。バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな意義があると思われる。
【００３３】
【実施例】本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３４】実施例１プライマーセット＜ＢＣ１（配列番号７）、ＢＣ２（配列番号８）＞はｇｙｒＢ遺伝子の一部３６５ｂｐの配列を増幅する。このプライマーセットの感度を調べるため、表１に示したＪＣＭ、ＩＡＭ、ＩＦＯ、ＡＴＣＣのコレクションから得た１５株のバチラスセレウスとバチラスチュウリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイデス、枯草菌、バチラスブレビス、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオについて検討した。
【００３５】《ＰＣＲ法によるアッセイ》
サンプル調製ＤＮＡを抽出しない、菌をテンペレートに用いた場合を試験した。この場合ＮａＣｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｋｉｍ ａｎｄ Ｇｏｅｐｆｅｒｔ（ＮＧＫＧ）寒天培地（日水製薬製）に卵黄液を加えた選択培地か、トリプトソイブイヨン寒天培地（栄研化学製）で、３５℃１晩培養した新鮮な菌を試験に供した。液体培地で生育した菌を用いる場合には、遠心分離等により菌を分離し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に一度洗浄し、適当な菌数を用いた。滅菌水５０μｌに菌量１コロニー程度懸濁し、９５℃で１０分間熱処理を行う。
【００３６】ＰＣＲの増幅条件ＰＣＲアッセイは、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で行った。上記熱処理菌液５μｌに、反応液１０μｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １００ｍＭ，ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ，ＫＣｌ ５００ｍＭ，ｐＨ ８．３、濃度は最終濃度を示す。）を加える。この液はゲノムＤＮＡ１００ｎｇ以上、２００μＭのｄＮＴＰ、１μＭのプライマーを含む。ＤＮＡ変性は９４℃、６０秒、アニーリングは５８℃、６０秒、ＤＮＡ伸長反応は７２℃、１２０秒間で３０サイクル繰り返した。
【００３７】ＰＣＲ産物の検出増幅に次いで、検出はゲル電気泳動によって行った。ＰＣＲサンプル１２μｌをアガロースゲル（３％アガロース、Ｎｕｓｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に供した。ＤＮＡのバンドは、エチジウムブロマイド溶液で１０分間染色後、紫外線照射して観察し、確認した。結果を表１に示す。表１中、菌株番号（Ｓｔｒａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ）の寄託機関の略称は以下の通りである。
ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＪＣＭ：Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＭｉｃｒｏｒｇａｎｉｓｍｓＩＦＯ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ＯｓａｋａＩＡＭ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
【００３８】
【表１】
【００３９】表１に示すとおり、これらバチラスセレウスの１５株全てに、３６５ｂｐの増幅断片が確認された。一方、バチラスセレウスと生化学的性状が極めて類似している、バチラスチュリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイデスでは増幅断片が確認されなかった。同じバチラス属の枯草菌、バチラスブレビスについても増幅断片が確認されなかった。これらの知見から、本発明のプライマーは、バチラスセレウスに特異的であり、この食中毒菌を検出するのに用いることができる。同様に、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオの標準株についても、ｇｙｒＢとバチラスセレウス特異的な３６５ｂｐの検出を行った。結果を表１に示した。表１に示したように、いずれの株においても、ｇｙｒＢの存在は認められたが、バチラスセレウス特異的３６５ｂｐの増幅断片は確認されなかった。
【００４０】実施例２バチラスセレウス株の中にはバチラスセレウス特異的プライマーを用いても、ＰＣＲ後の電気泳動で３６５ｂｐのバンドは検出されないものもあった。
【００４１】それらの株について、ｇｒｙＢ遺伝子を指標として、新たにバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌にそれぞれ特異的な２１〜２４ｍｅｒのプライマーを作成した。バチラスチュウリンジエンシス特異的プライマーは配列番号９及び配列番号１０で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドであり、炭疽菌特異的プライマーは配列番号１１及び配列番号１２で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲ後、ゲル電気泳動しエチジウムブロマイド染色すると、バチラスチュウリンジエンシスは３６８ｂｐ、炭疽菌は２４５ｂｐのバンドが検出できる。
【００４２】バチラスセレウス特異的プライマーで検出できなかったバチラスセレウス株について、バチラスチュウリンジエンシスないし炭疽菌特異的プライマーでＰＣＲを行ったところ、いずれかのプライマーで検出できた。つまりはｇｒｙＢ遺伝子を指標に、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を遺伝子レベルで区別できた。表２に、ｇｒｙＢを指標としたバチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌特異的プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。供試株は、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマイコイデスの標準株およびバチラスセレウス特異的プライマーで検出できなかった株を含むバチラスセレウス血清型、野生株である。
【００４３】
【表２】
【００４４】ただし、この遺伝子レベルでの分類は、現状の生化学分類と必ずしも一致しない。生化学分類では、バチラスセレウスとバチラスチュウリンジエンシスとの相違点は、殺菌性タンパク質生産の有無のみであり、バチラスチュウリンジエンシスが殺菌性タンパク質を生産する。炭疽菌のみが、γファージによって溶菌するのが特徴である。今回の試験のように、遺伝子レベルでの結果と生化学レベルでの結果が必ずしも一致しない場合は、現状では、生化学的指標の方が優先され、遺伝子レベルで炭疽菌になったからといって、その株が即病原菌性の非常に強い炭疽菌になるとは限らない。いわゆるバチラスセレウスグループにはバチラスセレウスはじめバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマイコイデスが含まれている。その際、人畜に対する危険性を考慮すると、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌は毒素を産出する好ましくない菌である。一方バチラスマイコイデスはそのような毒素を産出しないため、前述の３種とは安全性の面から区別してもよいと考えられ、上記のようにバチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな意義があると思われる。
【００４５】
【発明の効果】炭疽菌のｇｙｒＢ遺伝子に特異的に反応して、他のバチラス属やバチラス属以外の菌株から区別、同定できるようなプライマーを提供することができた。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出等の操作なしに、菌から炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法により検出できる。検体中の炭疽菌をバチラスセレウスおよびバチラスチュウリンジエンシスと遺伝子レベルで区別して検出することができる。
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：１２１２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 CATGCAGGAG GCAAATTTGA CGGTGGCGGT TATAAAGTTT CTGGTGGTTT ACATGGTGTT 60 GGGGCATCGG TTGTAAATGC TCTATCAACA GAATTAGAAG TATTTGTACA TCGTGAAGGT 120 AAAATCCATT ACCAAAAATA CGAAAGAGGT ATTCCGGTTG CGGATTTAAA AGTCATTGGT 180 GACACCGATC AAACAGGAAC AATAACTCGA TTTAAACCAG ATCCGGAAAT TTTCCAAGAA 240 ACAACAGTAT ACGATTTTGA TACGCTAGCA ACTCGTATGC GTGAATTAGC GTTTTTAAAT 300 CGTAATATTA AATTAACAAT TGAAGATAAA CGTGAACGTA AGCAAAAGAA AGAATTCCAT 360 TACGAAGGTG GAATTAAATC ATACGTTGAG CATTTAAATC GCTCAAAACA ACCGATTCAT 420 GAAGAGCCTG TGTACGTAGA AGGTTCAAAA GATGGTATTC AGGTTGAGGT TTCTCTTCAA 480 TATAACGAAG GATACACAAA TAATATTTAC TCATTTACGA ATAACATCCA TACGTATGAA 540 GGTGGTACAC ATGAGGTAGG TTTTAAAACA GCTTTAACTC GTGTAATCAA CGACTATGGT 600 CGTAAAAATA GCATTTTAAA AGATGCGGAC AGTAATTTAA CTGGTGAGGA TGTTCGTGAA 660 GGTTTAACAG CAATTGTATC AATCAAGCAT CCAAATCCAC AATTTGAAGG ACAAACGAAG 720 ACAAAACTTG GGAATAGTGA AGCGAGAACA ATTACAGAGT CTGTATTCTC AGAGGCATTT 780 GAAAAGTTCT TACTAGAAAA TCCTAATGTA GCGCGAAAAA TTGTAGAAAA AGGTACGATG 840 GCTGCACGTG CACGTGTAGC TGCGAAAAAA GCGCGTGAAT TGACACGTCG AAAGAGTGCG 900 TTAGAAGTTT CAAGTTTACC TGGTAAATTA GCTGATTGCT CTTCGAAAGA TCCAGCAATT 960 AGTGAAATTT ACATCGTAGA GGGTGACTCT GCGGGTGGAT CTGCAAAACA AGGACGCGAT 1020 CGTCATTTCC AAGCAATTTT ACCGCTGAAG GGTAAAATTA TTAATGTGGA AAAGGCGCGC 1080 TTAGATAAGA TTTTATCAAA TGATGAAGTT CGTACAATTA TTACGGCAAT CGGTACAAAT 1140 ATTGGTGGAG ACTTCGATAT TGAAAAAGCA CGCTATCATA AAGTTATTAT CATGACAGAT 1200 GCAGACGTGG AC 1212配列番号：２配列の長さ：４０４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：配列 HAGGKFDGGG YKVSGGLHGV GASVVNALST ELEVFVHREG KIHYQKYERG IPVADLKVIG 60 DTDQTGTITR FKPDPEIFQE TTVYDFDTLA TRMRELAFLN RNIKLTIEDK RERKQKKEFH 120 YEGGIKSYVE HLNRSKQPIH EEPVYVEGSK DGIQVEVSLQ YNEGYTNNIY SFTNNIHTYE 180 GGTHEVGFKT ALTRVINDYG RKNSILKDAD SNLTGEDVRE GLTAIVSIKH PNPQFEGQTK 240 TKLGNSEART ITESVFSEAF EKFLLENPNV ARKIVEKGTM AARARVAAKK ARELTRRKSA 300 LEVSSLPGKL ADCSSKDPAI SEIYIVEGDS AGGSAKQGRD RHFQAILPLK GKIINVEKAR 360 LDKILSNDEV RTIITAIGTN IGGDFDIEKA RYHKVIIMTD ADVD 404配列番号：３配列の長さ：１２１２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 CATGCTGGTG GGAAATTCGA CGGTGGCGGT TATAAAGTTT CTGGTGGTTT GCACGGTGTT 60 GGTGCATCTG TTGTAAATGC CTTATCAACA GAATTAGAAG TATTTGTACA TCGTGATGGC 120 AAAATCCATT ACCAAAAATA CCAAAGAGGT ATTCCGGTTG CAGATTTAAA AGTCATCGGT 180 GATACAGATA AGACTGGAAC AATAACTCGC TTTAAACCGG ATCCAGAAAT TTTTAAAGAG 240 ACGACAGAAT ATGAATTCGA TACGCTCGCG ACTCGTGTGC GTGAGTTGGC GTTTTTAAAT 300 CGTAATATTA AATTAACAAT TGAAGATAAA CGTGAACATA AGCAAAAGAA AGAGTTCCAC 360 TATGAAGGTG GAATTAAATC ATATGTTGAA CATTTAAATC GTTCAAAACA ACCAATTCAT 420 GAAGAGCCTG TATATGTAGA AGGTTCAAAA GATGGTATTC AAGTTGAAGT TGCGCTTCAA 480 TATAACGAAG GATATACAAA TCATATTTAC TCATTTACAA ATAATATTCA TACGTATGAA 540 GGTGGTACAC ATGAGGTAGG ATTTAAAACT GCCTTAACAC GTGTTATTAA CGATTATGGT 600 CGTAAAAATA ACATTTTAAA AGATGCGGAT AGTAATTTGA CTGGTGAAGA TGTTCGTGAA 660 GGTTTAACAG CAATCGTGTC AATTAAACAT CCAAATCCAC AATTTGAAGG GCAAACGAAG 720 ACGAAACTTG GAAATAGTGA AGCGAGAACG ATTACGGAGT CAGTATTCTC TGAGGCTTTT 780 GAAAAATTCT TACTGGAAAA TCCCAATGTT GCACGTAAGG TTGTAGATAA AGGGACGATG 840 GCAGCACGTG CGCGTGTAGC AGCTAAAAAG GCTCGTGAGC TAACTCGCCG AAAGAGTGCT 900 TTAGAAGTTT CAAGTTTACC AGGGAAATTG GCAGATTGTT CTTCTAAAGA TCCAGCAATT 960 AGTGAAATTT ATATCGTAGA GGGTGACTCT GCGGGTGGAT CTGCAAAACA AGGACGCGAT 1020 CGTCATTTTC AAGCAATTTT ACCGCTGAAG GGTAAAATTA TTAATGTTGA AAAGGCACGC 1080 TTAGATAAGA TTTTATCAAA TGATGAAGTT CGTACAATTA TTACGGCGAT TGGTACAAAT 1140 ATTGGTGGGG ACTTCGATAT CGAAAAAGCA CGCTATCATA AAGTTATTAT TATGACCGAC 1200 GCCGACGTTG AT 1212配列番号：４配列の長さ：４０４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：配列 HAGGKFDGGG YKVSGGLHGV GASVVNALST ELEVFVHRDG KIHYQKYQRG IPVADLKVIG 60 DTDKTGTITR FKPDPEIFKE TTEYEFDTLA TRVRELAFLN RNIKLTIEDK REHKQKKEFH 120 YEGGIKSYVE HLNRSKQPIH EEPVYVEGSK DGIQVEVALQ YNEGYTNHIY SFTNNIHTYE 180 GGTHEVGFKT ALTRVINDYG RKNNILKDAD SNLTGEDVRE GLTAIVSIKH PNPQFEGQTK 240 TKLGNSEART ITESVFSEAF EKFLLENPNV ARKVVDKGTM AARARVAAKK ARELTRRKSA 300 LEVSSLPGKL ADCSSKDPAI SEIYIVEGDS AGGSAKQGRD RHFQAILPLK GKIINVEKAR 360 LDKILSNDEV RTIITAIGTN IGGDFDIEKA RYHKVIIMTD ADVD 404配列番号：５配列の長さ：１２１２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 CATGCTGGGG GAAAATTTGA CGGCGGCGGT TATAAAGTTT CTGGTGGTTT GCATGGTGTT 60 GGGGCATCTG TAGTAAATGC TCTATCAACA GAACTAGAGG TATTTGTACA TCGTGAAGGT 120 AAAATCCATT ATCAAAAATA CGAAAGAGGT ATTCCGGTTG CGGATTTAAA AGTCATTGGT 180 GATACAGATC AAACGGGAAC GATAACTCGA TTTAAACCAG ATCCAGAAAT TTTTCAGGAA 240 ACAACAGTAT ACGAATTTGA TACACTAGCA ACTCGTATGC GTGAATTAGC ATTTTTAAAT 300 CGTAATATTA AACTGACGAT TGAAGATAAA CGTGAACATA AGCAAAAAAA AGAATTCCAT 360 TGTGAAGGTG GAATTAAATC ATATGTTGAG CATTTAAACC GCTCAAAACA ACCAATCCAT 420 GAAGAGCCTG TATATGTAGA AGGATCAAAA GATGGTATTC AAGTTGAAGT TTCCTTACAG 480 TATAACGAAG GATATACAAA TAATATTTAC TCATTTACGA ACAACATTCA CACGTATGAA 540 GGTGGAACAC ATGAAGTAGG GTTTAAAACA GCTTTAACTC GTGTGATTAA CGATTATGGG 600 CGTAAAAATA GTATTCTAAA AGATGCAGAC AGTAATTTAA CTGGTGAGGA CGTTCGTGAA 660 GGTTTAACTG CAATTGTATC AATTAAACAT CCAGATCCAC AATTTGAAGG ACAAACGAAG 720 ACGAAACTTG GGAATAGTGA AGCGAGAACG ATTACAGAGT CTGTGTTTTC AGAGGCATTT 780 GAAAAGTTCT TACTAGAAAA CCCGAACGTT GCACGAAAAA TCGTAGAAAA AGGTACGATG 840 GCAGCGCGTG CACGTGTTGC AGCGAAAAAA GCACGTGAAT TGACACGTCG TAAGAGCGCG 900 TTAGAAGTTT CAAGTTTACC TGGTAGATTA GCAGATTGCT CTTCAAAAGA TCCAGCAATT 960 AGTGAAATTT ACATTGTAGA GGGTGACTCT GCCGGTGGAT CAGCAAAGCA AGGGCGTGAT 1020 CGTCACTTCC AAGCGATTTT ACCACTGAAA GGTAAAATTA TTAACGTTGA AAAGGCAAGA 1080 TTAGATAAAA TCTTATCTAA CGATGAAGTG CGTACAATTA TTACTGCAAT TGGTACGAAC 1140 ATTGGCGGAG ATTTTGATAT TGAGAAAGCT CGTTATCATA AAGTTATTAT TATGACGGAT 1200 GCCGACGTCG AC 1212配列番号：６配列の長さ：４０４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：配列 HAGGKFDGGG YKVSGGLHGV GASVVNALST ELEVFVHREG KIHYQKYERG IPVADLKVIG 60 DTDQTGTITR FKPDPEIFQE TTVYEFDTLA TRMRELAFLN RNIKLTIEDK REHKQKKEFH 120 CEGGIKSYVE HLNRSKQPIH EEPVYVEGSK DGIQVEVSLQ YNEGYTNNIY SFTNNIHTYE 180 GGTHEVGFKT ALTRVINDYG RKNSILKDAD SNLTGEDVRE GLTAIVSIKH PDPQFEGQTK 240 TKLGNSEART ITESVFSEAF EKFLLENPNV ARKIVEKGTM AARARVAAKK ARELTRRKSA 300 LEVSSLPGRL ADCSSKDPAI SEIYIVEGDS AGGSAKQGRD RHFQAILPLK GKIINVEKAR 360 LDKILSNDEV RTIITAIGTN IGGDFDIEKA RYHKVIIMTD ADVD 404配列番号：７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 ATTGGTGACA CCGATCAAAC A 21配列番号：８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 TCATACGTAT GGATGTTATT C 21配列番号：９配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列ATCGGTGATA CAGATAAGAC T 21配列番号：１０配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列CCTTCATACG TATGAATATT ATTT 24配列番号：１１配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列AATCGTAATA TTAAACTGAC G 21配列番号：１２配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列CCTTCATACG TGTGAATGTT G 21
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、炭疸菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に特徴的な核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーに関する。本発明は、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）特異的プライマーを用いたポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）による炭疽菌の検出に関する。本発明は、検体中のバチラスセレウスをバチラスセレウスをバチラスチュウリンジエンシスおよび炭疽菌と遺伝子レベルで区別して検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】炭疸菌はグラム陽性桿菌で胞子を形成するため耐熱性を示す。また、炭疸菌は人畜共通感染症である炭疸の病原体であり、臨床的に重要である。
【０００３】炭疸菌を単離、同定するには、通常、Ｍａｎｎｉｔｏｌ Ｅｇｇ−ｙｏｌｋＰｏｌｙｍｙｘｉｎ（ＭＹＰ）寒天培地やＮａＣｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｋｉｍａｎｄ Ｇｏｅｐｆｅｒｔ（ＮＧＫＧ）寒天培地に卵黄液を加えた選択培地を用い、卵黄反応を生じた集落を陽性とする。さらに、硝酸塩還元、クエン酸塩利用、ゼラチン分解性、ＶＰ反応、ブドウ糖分解は陽性で、マンニット、アラビノース、キシロース分解は陰性であることを確認しなければいけない。
【０００４】上記確認試験での性状は、炭疸菌と類縁菌であるバチラスチュウリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチラスチュウセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチラスマイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）でも同じである。バチラスセレウスと炭疸菌の区別は、前者が運動性を示すのが多いのに対し、後者は非運動性でガンマファージによる溶菌が起こる。前者が羊血球に対する溶血性、チロシン分解を示すのに対し、後者は示さない。
【０００５】バチラスセレウスとバチラスマイコイデスは、バチラスマイコイデスが非運動性で溶血性、チロシン分解陰性で足根状集落を形成することで区別できる。これら確認試験は判定までに時間がかかり、多くの労力を要する。
【０００６】類縁菌であるバチラスチュウリンジェンシスは、殺虫性タンパク質を産生する点でバチラスセレウスと区別されているが、その他の生化学的性状はバチラスセレウスと同一である。現在の分類では、この殺虫性タンパク質が顕微鏡で確認されたものをバチラスチュウリンジェンシスとすることとしているが、血清型での両者の区別も明確でない。また、バチラスチュウリンジェンシスの中には、バチルスセレウス様のエンテロトキシンを産生するという報告もある〔ＷｏｒｌｄＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（１９９４）ｐ４０６−４０９〕。バチラスセレウスとバチルスチュウリンジェンシスの間では、プラスミドの受け渡しが行われるという報告があることから〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９（１９８２）ｐ６９５１−６９５５〕、恐らく、もともとバチラスセレウスであったものに、殺虫性タンパク質をコードするプラスミドがなんらかの影響を受けて導入されたものと推測される。従って、殺虫性タンパク質の有無による現在の分類でバチラスチュウリンジェンシスとされているものの中にも、食中毒を起こす可能性のある菌が存在することが考えられる。また、バチラスチュウリンジェンシスは生物農薬として土壌に散布されており、上記の理由からも安全性が危惧される。このような背景のもと、殺虫性タンパク質とは別の観点から、バチラスセレウスとバチルスチュウリンジェンシスを区別する必要がでてきた。
【０００７】一方、バチラスセレウスの毒素については、下痢性のエンテロトキシンはクローン化され塩基配列が決定されている〔Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｉｇｙ，１４１（１９９５），ｐ９８３−９８８〕。しかし、下痢性のエンテロトキシンはこれだけかどうかは明らかでない。このエンテロトキシンに対応するキットも市販されているが、バチラスセレウスのエンテロトキシンが全て明らかにされていないため、十分な評価は受けていない〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０（１９９４），ｐ４６１４−４６１６〕。一方、嘔吐型毒素はサイクリックペプチドという報告がある〔Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２８（１９９５），ｐ１２９−１４４〕。また、バチラスセレウスの中には毒素を産生しないものもあり、毒素のみを指標としたバチラスセレウスの検出は確実でない。
【０００８】また、遺伝子レベルでの解析に用いられている１６Ｓ ｒＲＮＡでは、バチラスセレウスと炭疸菌は９９％以上の相同性を示すため、これは同定の指標となり得ない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】いわゆるバチラスセレウスグループにはバチラスセレウスはじめバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマイコイデスが含まれている。その際、人畜に対する危険性を考慮すると、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌は毒素を産出する好ましくない菌である。一方バチラスマイコイデスはそのような毒素を産出しないため、前述の３種とは安全性の面から区別してもよいと考えられ、上記のようにバチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな意義があると思われる。例えば、セレウスグループの食中毒関連菌を食品から検出する場合、危険性を考慮してセレウス特異的なプライマーだけでなく、チュウリンジェンシスおよび炭疽菌特異的プライマーを用いて検出することにより、安全性を確実に確認できる。本発明は、炭疽菌を他の微生物と区別できる検査法の提供を目的とする。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出操作をしなくても、菌から炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法により検出する方法の提供を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。また本発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持ち、配列番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を持っていない、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。さらにまた本発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持ち、配列番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を持っていない、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むが、バチラスセレウスまたはバチラスチュウリンジェンシスに由来する核酸配列を増幅し得る部位を持っていないことを特徴とするオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。好ましくは本発明は、配列番号１１または配列番号１２で示される核酸配列を持っているオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。配列番号２のアミノ酸配列は、上記配列番号１の核酸配列がコードするアミノ酸配列であり、配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号３の核酸配列がコードするアミノ酸配列であり、配列番号６のアミノ酸配列は、配列番号５の核酸配列がコードするアミノ酸配列である。
【００１１】本発明は、上記のいずれかのオリゴヌクレオチドを２種類組合せたプライマーセットを用いて、検体中のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子配列を標的とし、当該標的遺伝子を選択的に増幅させ、検体中に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在するか否かを決定することで、炭疽菌の検出を行う方法であることを要旨としている。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、炭疽菌に特異的な核酸標的配列の在否を決定するために有用なオリゴヌクレオチドプライマーを基礎とするが、そのような決定を行うための方法は、ＰＣＲを用いた遺伝子増幅法にとどまらず、従来技術であるサザンハイブリダイゼーション法等のプローブとしての使用も含む。
【００１３】本発明において、「プライマー」は、標的核酸配列へのハイブリダイズを許す特異的ヌクレオチド配列をデザインまたは生物学的に生産されたオリゴヌクレオチドである。プライマーは、ポリメラーゼまたは同様な酵素により、伸長合成されて完全な標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。プライマーは、核酸配列増幅法、例えばＰＣＲ法及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）において利用される。特定のプライマーに、特にＳＤＡ技術において有用なものは、標的核酸にハイブリダイズ可能な配列に加えて、制限エンドヌクレアーゼの認識配列、及びポリメラーゼまたはポリメラーゼ様活性を継続する他の酵素がそれ自身その鋳型特異的オリゴヌクレオチド合成の開始を指示するための任意の配列を含む。
【００１４】本発明において、「ハイブリダイゼーション」は、予め決定された反応条件下にて、部分的または完全に相補的な核酸鎖が、逆平行（アンチパラレル）様式にて向かい合うようにして、特異的かつ安定な水素結合により、二本鎖の核酸を形成する工程である。
【００１５】本発明の炭疽菌に特徴的な核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは配列番号１１および配列番号１２を含み、そしてこれらはプライマーセットとして、炭疽菌に特徴的な核酸標的配列の在否の決定に関する方法に使用する。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出等の操作なしで、菌からの炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片が、ＰＣＲ法により検出できる。本発明のプライマーは、バチラスセレウスのｇｙｒＢ遺伝子配列に特異的である。プローブは、プライマー増幅産物内の内部コンセンサス配列に特異的である。
【００１６】上記配列番号１１または配列番号１２で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを組み合わせたプライマーセットの製造方法について説明する。高特異性プローブとして、ＤＮＡジャイレース（トポイソメラーゼＩＩ）のＢサブユニットタンパク質をコードするｇｙｒＢ遺伝子を用いる。ｇｙｒＢ遺伝子を直接塩基配列を決定したユニバーサルプライマーでＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａを検出、分類する方法が報告されている〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４−１１０９〕。これらのユニバーサルプライマーは、種々のグラム陽性菌、陰性菌に共通であり、ｇｙｒＢ遺伝子の一部がＰＣＲ法により増幅された。
【００１７】これら既存のプライマーを用いて、バチラスセレウスＪＣＭ２１５２、バチラスチュリンジエンシスＩＡＭ１２０７７、炭疸菌Ｐａｓｔｅｕｒ ｎｏ．２−Ｈ〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３１（１９８５），ｐ３６３〕の塩基配列を示した。
【００１８】更に、バチラスセレウスのｇｙｒＢ遺伝子のみを増幅し、同定できるＰＣＲプライマーを作製した。これらバチスルセレウス特異的プライマーの感度を調べるため、１５株のバチラスセレウスとバチラスチュウリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイデス、枯草菌、バチラスブレビス、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオについて検討した。
【００１９】山本、原山〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４−１１０９〕らは、ＤＮＡジャイレースＢサブユニットの保存された部位２箇所から、ｇｙｒＢ遺伝子の一部を増幅させるＰＣＲプライマーを作製した。これらのプライマーを用いて、種々の細菌から約１．２ｋｂのｇｙｒＢ遺伝子部分が増幅された。
【００２０】バチラスセレウスＪＣＭ２１５２、バチラスチュウリンジエンシスＩＡＭ１２０７７と炭疸菌Ｐａｓｔｅｕｒ ｎｏ．２−Ｈから増幅された１．２ｋｂのｇｙｒＢ遺伝子を、遺伝子組換えの常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８９）に従って、適当なベクターにクローン化した。
【００２１】好ましいベクターとしてｐＧＥＭｚｆ（＋）があげられるが、一般的なベクターであれば適宜選択して用いることができる。
【００２２】有効なプライマーを作製するため、ＰＣＲ法により増幅した１．２ｋｂのバチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシスと炭疸菌のｇｙｒＢ遺伝子を、ｐＧＥＭｚｆ（＋）にクローン化し、ｇｙｒＢ遺伝子領域をＤＮＡシーケンサーを用いて、常法に従って決定した。
【００２３】ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を決定するため、増幅断片の５′、３′部分をＵＰ−１Ｓ、ＵＰ−２Ｓｒプライマー〔山本、原山Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４−１１０９〕を用いて、決定した。この場合、これらプライマーから決定できる塩基配列の領域は限られているため、得られた配列をもとに新たなプライマーを作製し、更に別の領域の塩基配列を決定した。配列番号１にバチラスセレウスＪＣＭ２１５２を、配列番号３にバチラスチュウリンジエンシスを、配列番号５に炭疸菌Ｐａｓｔｅｕｒｎｏ．２−ＨのｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を示す。
【００２４】この塩基配列の情報を用いて、バチラスセレウスを他の細菌から検出、同定する２１ｍｅｒのプライマーを作製した。このプライマーは配列番号７及び配列番号８で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドであり、プライマーセットとして利用可能である。
【００２５】これらの新規のプライマーは、既存のＰＣＲを用いたアッセイ法〔Ｓａｉｋｉｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９（１９８８），ｐ４８７−４９１〕において有用である。このプライマーは、サンプル中の目的とするＤＮＡを増幅するのに用いる。増幅段階に続いて検出段階は、ＤＮＡ検出に有効な方法であればどんな方法でもよい。例えばアガロースゲル電気泳動し、エチジュウムブロマイド染色する方法もある。
【００２６】目的とするＤＮＡはテンペレートとして機能する。サンプル中のテンペレートＤＮＡの増幅は、プライマーがテンペレートの相補的な領域に結合し、そこからテンペレートを鋳型にＤＮＡ伸長が起こる。この伸長したＤＮＡは、さらにプライマーのテンペレートとして機能する。このプロセスはＤＮＡの変性、プライマーとテンペレートとのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼ（例、Ｔａｑポリメラーゼ）によるプライマーからの伸長のサイクルを繰り返し、２組のプライマーを用いることで最終的には、ある一定の長さの２本鎖のＤＮＡが検出に必要な量まで増幅される。
【００２７】しかしながら、プライマーに相補的な配列をテンペレートＤＮＡが持っていない場合は、この一定の長さの２本鎖のＤＮＡが生成されず、サンプル中に目的とするテンペレートがないと判定できる。すなわち、サンプル中に対象とする微生物の存在を否定できる。プライマーセット＜ＢＣ１（配列番号７）、ＢＣ２（配列番号８）＞はｇｙｒＢ遺伝子の一部３６５ｂｐの配列を増幅する。ＪＣＭ、ＩＡＭ、ＩＦＯ、ＡＴＣＣのコレクションから得たバチラスセレウス１５株に３６５ｂｐの増幅断片が確認された。
【００２８】一方、炭疽菌と生化学的性状が極めて類似している、バチラスセレウス、バチラスチュリンジエンシス、バチラスマイコイデスでは増幅断片が確認されなかった。これらの知見から、本発明のプライマーは、炭疽菌に特異的であり、この食中毒菌を検出するのに用いることができる。
【００２９】同様に、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオの標準株についても、ｇｙｒＢの存在は認められたが、バチラスセレウス特異的３６５ｂｐの増幅断片は確認されなかった。
【００３０】バチラスセレウス株の中にはバチラスセレウス特異的プライマーを用いても、ＰＣＲ後の電気泳動で３６５ｂｐのバンドは検出されないものもあった。
【００３１】それらの株について、ｇｒｙＢ遺伝子を指標として、新たにバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌にそれぞれ特異的な２１〜２４ｍｅｒのプライマーを作成した。バチラスチュウリンジエンシス特異的プライマーは配列番号９及び配列番号１０で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドであり、炭疽菌特異的プライマーは配列番号１１及び配列番号１２で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲ後、ゲル電気泳動しエチジウムブロマイド染色すると、バチラスチュウリンジエンシスは３６８ｂｐ、炭疽菌は２４５ｂｐのバンドが検出できる。
【００３２】バチラスセレウス特異的プライマーで検出できなかったバチラスセレウス株について、バチラスチュウリンジエンシスないし炭疽菌特異的プライマーでＰＣＲを行ったところ、いずれかのプライマーで検出できた。つまりはｇｒｙＢ遺伝子を指標に、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を遺伝子レベルで区別できた。バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな意義があると思われる。
【００３３】
【実施例】本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３４】実施例１プライマーセット＜ＢＣ１（配列番号７）、ＢＣ２（配列番号８）＞はｇｙｒＢ遺伝子の一部３６５ｂｐの配列を増幅する。このプライマーセットの感度を調べるため、表１に示したＪＣＭ、ＩＡＭ、ＩＦＯ、ＡＴＣＣのコレクションから得た１５株のバチラスセレウスとバチラスチュウリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイデス、枯草菌、バチラスブレビス、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオについて検討した。
【００３５】《ＰＣＲ法によるアッセイ》
サンプル調製ＤＮＡを抽出しない、菌をテンペレートに用いた場合を試験した。この場合ＮａＣｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｋｉｍ ａｎｄ Ｇｏｅｐｆｅｒｔ（ＮＧＫＧ）寒天培地（日水製薬製）に卵黄液を加えた選択培地か、トリプトソイブイヨン寒天培地（栄研化学製）で、３５℃１晩培養した新鮮な菌を試験に供した。液体培地で生育した菌を用いる場合には、遠心分離等により菌を分離し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に一度洗浄し、適当な菌数を用いた。滅菌水５０μｌに菌量１コロニー程度懸濁し、９５℃で１０分間熱処理を行う。
【００３６】ＰＣＲの増幅条件ＰＣＲアッセイは、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で行った。上記熱処理菌液５μｌに、反応液１０μｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １００ｍＭ，ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ，ＫＣｌ ５００ｍＭ，ｐＨ ８．３、濃度は最終濃度を示す。）を加える。この液はゲノムＤＮＡ１００ｎｇ以上、２００μＭのｄＮＴＰ、１μＭのプライマーを含む。ＤＮＡ変性は９４℃、６０秒、アニーリングは５８℃、６０秒、ＤＮＡ伸長反応は７２℃、１２０秒間で３０サイクル繰り返した。
【００３７】ＰＣＲ産物の検出増幅に次いで、検出はゲル電気泳動によって行った。ＰＣＲサンプル１２μｌをアガロースゲル（３％アガロース、Ｎｕｓｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に供した。ＤＮＡのバンドは、エチジウムブロマイド溶液で１０分間染色後、紫外線照射して観察し、確認した。結果を表１に示す。表１中、菌株番号（Ｓｔｒａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ）の寄託機関の略称は以下の通りである。
ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＪＣＭ：Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＭｉｃｒｏｒｇａｎｉｓｍｓＩＦＯ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ＯｓａｋａＩＡＭ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
【００３８】
【表１】
【００３９】表１に示すとおり、これらバチラスセレウスの１５株全てに、３６５ｂｐの増幅断片が確認された。一方、バチラスセレウスと生化学的性状が極めて類似している、バチラスチュリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイデスでは増幅断片が確認されなかった。同じバチラス属の枯草菌、バチラスブレビスについても増幅断片が確認されなかった。これらの知見から、本発明のプライマーは、バチラスセレウスに特異的であり、この食中毒菌を検出するのに用いることができる。同様に、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオの標準株についても、ｇｙｒＢとバチラスセレウス特異的な３６５ｂｐの検出を行った。結果を表１に示した。表１に示したように、いずれの株においても、ｇｙｒＢの存在は認められたが、バチラスセレウス特異的３６５ｂｐの増幅断片は確認されなかった。
【００４０】実施例２バチラスセレウス株の中にはバチラスセレウス特異的プライマーを用いても、ＰＣＲ後の電気泳動で３６５ｂｐのバンドは検出されないものもあった。
【００４１】それらの株について、ｇｒｙＢ遺伝子を指標として、新たにバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌にそれぞれ特異的な２１〜２４ｍｅｒのプライマーを作成した。バチラスチュウリンジエンシス特異的プライマーは配列番号９及び配列番号１０で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドであり、炭疽菌特異的プライマーは配列番号１１及び配列番号１２で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲ後、ゲル電気泳動しエチジウムブロマイド染色すると、バチラスチュウリンジエンシスは３６８ｂｐ、炭疽菌は２４５ｂｐのバンドが検出できる。
【００４２】バチラスセレウス特異的プライマーで検出できなかったバチラスセレウス株について、バチラスチュウリンジエンシスないし炭疽菌特異的プライマーでＰＣＲを行ったところ、いずれかのプライマーで検出できた。つまりはｇｒｙＢ遺伝子を指標に、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を遺伝子レベルで区別できた。表２に、ｇｒｙＢを指標としたバチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌特異的プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。供試株は、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマイコイデスの標準株およびバチラスセレウス特異的プライマーで検出できなかった株を含むバチラスセレウス血清型、野生株である。
【００４３】
【表２】
【００４４】ただし、この遺伝子レベルでの分類は、現状の生化学分類と必ずしも一致しない。生化学分類では、バチラスセレウスとバチラスチュウリンジエンシスとの相違点は、殺菌性タンパク質生産の有無のみであり、バチラスチュウリンジエンシスが殺菌性タンパク質を生産する。炭疽菌のみが、γファージによって溶菌するのが特徴である。今回の試験のように、遺伝子レベルでの結果と生化学レベルでの結果が必ずしも一致しない場合は、現状では、生化学的指標の方が優先され、遺伝子レベルで炭疽菌になったからといって、その株が即病原菌性の非常に強い炭疽菌になるとは限らない。いわゆるバチラスセレウスグループにはバチラスセレウスはじめバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマイコイデスが含まれている。その際、人畜に対する危険性を考慮すると、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌は毒素を産出する好ましくない菌である。一方バチラスマイコイデスはそのような毒素を産出しないため、前述の３種とは安全性の面から区別してもよいと考えられ、上記のようにバチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな意義があると思われる。
【００４５】
【発明の効果】炭疽菌のｇｙｒＢ遺伝子に特異的に反応して、他のバチラス属やバチラス属以外の菌株から区別、同定できるようなプライマーを提供することができた。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出等の操作なしに、菌から炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法により検出できる。検体中の炭疽菌をバチラスセレウスおよびバチラスチュウリンジエンシスと遺伝子レベルで区別して検出することができる。
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：１２１２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 CATGCAGGAG GCAAATTTGA CGGTGGCGGT TATAAAGTTT CTGGTGGTTT ACATGGTGTT 60 GGGGCATCGG TTGTAAATGC TCTATCAACA GAATTAGAAG TATTTGTACA TCGTGAAGGT 120 AAAATCCATT ACCAAAAATA CGAAAGAGGT ATTCCGGTTG CGGATTTAAA AGTCATTGGT 180 GACACCGATC AAACAGGAAC AATAACTCGA TTTAAACCAG ATCCGGAAAT TTTCCAAGAA 240 ACAACAGTAT ACGATTTTGA TACGCTAGCA ACTCGTATGC GTGAATTAGC GTTTTTAAAT 300 CGTAATATTA AATTAACAAT TGAAGATAAA CGTGAACGTA AGCAAAAGAA AGAATTCCAT 360 TACGAAGGTG GAATTAAATC ATACGTTGAG CATTTAAATC GCTCAAAACA ACCGATTCAT 420 GAAGAGCCTG TGTACGTAGA AGGTTCAAAA GATGGTATTC AGGTTGAGGT TTCTCTTCAA 480 TATAACGAAG GATACACAAA TAATATTTAC TCATTTACGA ATAACATCCA TACGTATGAA 540 GGTGGTACAC ATGAGGTAGG TTTTAAAACA GCTTTAACTC GTGTAATCAA CGACTATGGT 600 CGTAAAAATA GCATTTTAAA AGATGCGGAC AGTAATTTAA CTGGTGAGGA TGTTCGTGAA 660 GGTTTAACAG CAATTGTATC AATCAAGCAT CCAAATCCAC AATTTGAAGG ACAAACGAAG 720 ACAAAACTTG GGAATAGTGA AGCGAGAACA ATTACAGAGT CTGTATTCTC AGAGGCATTT 780 GAAAAGTTCT TACTAGAAAA TCCTAATGTA GCGCGAAAAA TTGTAGAAAA AGGTACGATG 840 GCTGCACGTG CACGTGTAGC TGCGAAAAAA GCGCGTGAAT TGACACGTCG AAAGAGTGCG 900 TTAGAAGTTT CAAGTTTACC TGGTAAATTA GCTGATTGCT CTTCGAAAGA TCCAGCAATT 960 AGTGAAATTT ACATCGTAGA GGGTGACTCT GCGGGTGGAT CTGCAAAACA AGGACGCGAT 1020 CGTCATTTCC AAGCAATTTT ACCGCTGAAG GGTAAAATTA TTAATGTGGA AAAGGCGCGC 1080 TTAGATAAGA TTTTATCAAA TGATGAAGTT CGTACAATTA TTACGGCAAT CGGTACAAAT 1140 ATTGGTGGAG ACTTCGATAT TGAAAAAGCA CGCTATCATA AAGTTATTAT CATGACAGAT 1200 GCAGACGTGG AC 1212配列番号：２配列の長さ：４０４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：配列 HAGGKFDGGG YKVSGGLHGV GASVVNALST ELEVFVHREG KIHYQKYERG IPVADLKVIG 60 DTDQTGTITR FKPDPEIFQE TTVYDFDTLA TRMRELAFLN RNIKLTIEDK RERKQKKEFH 120 YEGGIKSYVE HLNRSKQPIH EEPVYVEGSK DGIQVEVSLQ YNEGYTNNIY SFTNNIHTYE 180 GGTHEVGFKT ALTRVINDYG RKNSILKDAD SNLTGEDVRE GLTAIVSIKH PNPQFEGQTK 240 TKLGNSEART ITESVFSEAF EKFLLENPNV ARKIVEKGTM AARARVAAKK ARELTRRKSA 300 LEVSSLPGKL ADCSSKDPAI SEIYIVEGDS AGGSAKQGRD RHFQAILPLK GKIINVEKAR 360 LDKILSNDEV RTIITAIGTN IGGDFDIEKA RYHKVIIMTD ADVD 404配列番号：３配列の長さ：１２１２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 CATGCTGGTG GGAAATTCGA CGGTGGCGGT TATAAAGTTT CTGGTGGTTT GCACGGTGTT 60 GGTGCATCTG TTGTAAATGC CTTATCAACA GAATTAGAAG TATTTGTACA TCGTGATGGC 120 AAAATCCATT ACCAAAAATA CCAAAGAGGT ATTCCGGTTG CAGATTTAAA AGTCATCGGT 180 GATACAGATA AGACTGGAAC AATAACTCGC TTTAAACCGG ATCCAGAAAT TTTTAAAGAG 240 ACGACAGAAT ATGAATTCGA TACGCTCGCG ACTCGTGTGC GTGAGTTGGC GTTTTTAAAT 300 CGTAATATTA AATTAACAAT TGAAGATAAA CGTGAACATA AGCAAAAGAA AGAGTTCCAC 360 TATGAAGGTG GAATTAAATC ATATGTTGAA CATTTAAATC GTTCAAAACA ACCAATTCAT 420 GAAGAGCCTG TATATGTAGA AGGTTCAAAA GATGGTATTC AAGTTGAAGT TGCGCTTCAA 480 TATAACGAAG GATATACAAA TCATATTTAC TCATTTACAA ATAATATTCA TACGTATGAA 540 GGTGGTACAC ATGAGGTAGG ATTTAAAACT GCCTTAACAC GTGTTATTAA CGATTATGGT 600 CGTAAAAATA ACATTTTAAA AGATGCGGAT AGTAATTTGA CTGGTGAAGA TGTTCGTGAA 660 GGTTTAACAG CAATCGTGTC AATTAAACAT CCAAATCCAC AATTTGAAGG GCAAACGAAG 720 ACGAAACTTG GAAATAGTGA AGCGAGAACG ATTACGGAGT CAGTATTCTC TGAGGCTTTT 780 GAAAAATTCT TACTGGAAAA TCCCAATGTT GCACGTAAGG TTGTAGATAA AGGGACGATG 840 GCAGCACGTG CGCGTGTAGC AGCTAAAAAG GCTCGTGAGC TAACTCGCCG AAAGAGTGCT 900 TTAGAAGTTT CAAGTTTACC AGGGAAATTG GCAGATTGTT CTTCTAAAGA TCCAGCAATT 960 AGTGAAATTT ATATCGTAGA GGGTGACTCT GCGGGTGGAT CTGCAAAACA AGGACGCGAT 1020 CGTCATTTTC AAGCAATTTT ACCGCTGAAG GGTAAAATTA TTAATGTTGA AAAGGCACGC 1080 TTAGATAAGA TTTTATCAAA TGATGAAGTT CGTACAATTA TTACGGCGAT TGGTACAAAT 1140 ATTGGTGGGG ACTTCGATAT CGAAAAAGCA CGCTATCATA AAGTTATTAT TATGACCGAC 1200 GCCGACGTTG AT 1212配列番号：４配列の長さ：４０４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：配列 HAGGKFDGGG YKVSGGLHGV GASVVNALST ELEVFVHRDG KIHYQKYQRG IPVADLKVIG 60 DTDKTGTITR FKPDPEIFKE TTEYEFDTLA TRVRELAFLN RNIKLTIEDK REHKQKKEFH 120 YEGGIKSYVE HLNRSKQPIH EEPVYVEGSK DGIQVEVALQ YNEGYTNHIY SFTNNIHTYE 180 GGTHEVGFKT ALTRVINDYG RKNNILKDAD SNLTGEDVRE GLTAIVSIKH PNPQFEGQTK 240 TKLGNSEART ITESVFSEAF EKFLLENPNV ARKVVDKGTM AARARVAAKK ARELTRRKSA 300 LEVSSLPGKL ADCSSKDPAI SEIYIVEGDS AGGSAKQGRD RHFQAILPLK GKIINVEKAR 360 LDKILSNDEV RTIITAIGTN IGGDFDIEKA RYHKVIIMTD ADVD 404配列番号：５配列の長さ：１２１２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 CATGCTGGGG GAAAATTTGA CGGCGGCGGT TATAAAGTTT CTGGTGGTTT GCATGGTGTT 60 GGGGCATCTG TAGTAAATGC TCTATCAACA GAACTAGAGG TATTTGTACA TCGTGAAGGT 120 AAAATCCATT ATCAAAAATA CGAAAGAGGT ATTCCGGTTG CGGATTTAAA AGTCATTGGT 180 GATACAGATC AAACGGGAAC GATAACTCGA TTTAAACCAG ATCCAGAAAT TTTTCAGGAA 240 ACAACAGTAT ACGAATTTGA TACACTAGCA ACTCGTATGC GTGAATTAGC ATTTTTAAAT 300 CGTAATATTA AACTGACGAT TGAAGATAAA CGTGAACATA AGCAAAAAAA AGAATTCCAT 360 TGTGAAGGTG GAATTAAATC ATATGTTGAG CATTTAAACC GCTCAAAACA ACCAATCCAT 420 GAAGAGCCTG TATATGTAGA AGGATCAAAA GATGGTATTC AAGTTGAAGT TTCCTTACAG 480 TATAACGAAG GATATACAAA TAATATTTAC TCATTTACGA ACAACATTCA CACGTATGAA 540 GGTGGAACAC ATGAAGTAGG GTTTAAAACA GCTTTAACTC GTGTGATTAA CGATTATGGG 600 CGTAAAAATA GTATTCTAAA AGATGCAGAC AGTAATTTAA CTGGTGAGGA CGTTCGTGAA 660 GGTTTAACTG CAATTGTATC AATTAAACAT CCAGATCCAC AATTTGAAGG ACAAACGAAG 720 ACGAAACTTG GGAATAGTGA AGCGAGAACG ATTACAGAGT CTGTGTTTTC AGAGGCATTT 780 GAAAAGTTCT TACTAGAAAA CCCGAACGTT GCACGAAAAA TCGTAGAAAA AGGTACGATG 840 GCAGCGCGTG CACGTGTTGC AGCGAAAAAA GCACGTGAAT TGACACGTCG TAAGAGCGCG 900 TTAGAAGTTT CAAGTTTACC TGGTAGATTA GCAGATTGCT CTTCAAAAGA TCCAGCAATT 960 AGTGAAATTT ACATTGTAGA GGGTGACTCT GCCGGTGGAT CAGCAAAGCA AGGGCGTGAT 1020 CGTCACTTCC AAGCGATTTT ACCACTGAAA GGTAAAATTA TTAACGTTGA AAAGGCAAGA 1080 TTAGATAAAA TCTTATCTAA CGATGAAGTG CGTACAATTA TTACTGCAAT TGGTACGAAC 1140 ATTGGCGGAG ATTTTGATAT TGAGAAAGCT CGTTATCATA AAGTTATTAT TATGACGGAT 1200 GCCGACGTCG AC 1212配列番号：６配列の長さ：４０４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：配列 HAGGKFDGGG YKVSGGLHGV GASVVNALST ELEVFVHREG KIHYQKYERG IPVADLKVIG 60 DTDQTGTITR FKPDPEIFQE TTVYEFDTLA TRMRELAFLN RNIKLTIEDK REHKQKKEFH 120 CEGGIKSYVE HLNRSKQPIH EEPVYVEGSK DGIQVEVSLQ YNEGYTNNIY SFTNNIHTYE 180 GGTHEVGFKT ALTRVINDYG RKNSILKDAD SNLTGEDVRE GLTAIVSIKH PDPQFEGQTK 240 TKLGNSEART ITESVFSEAF EKFLLENPNV ARKIVEKGTM AARARVAAKK ARELTRRKSA 300 LEVSSLPGRL ADCSSKDPAI SEIYIVEGDS AGGSAKQGRD RHFQAILPLK GKIINVEKAR 360 LDKILSNDEV RTIITAIGTN IGGDFDIEKA RYHKVIIMTD ADVD 404配列番号：７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 ATTGGTGACA CCGATCAAAC A 21配列番号：８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列 TCATACGTAT GGATGTTATT C 21配列番号：９配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列ATCGGTGATA CAGATAAGAC T 21配列番号：１０配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列CCTTCATACG TATGAATATT ATTT 24配列番号：１１配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列AATCGTAATA TTAAACTGAC G 21配列番号：１２配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ゲノミックＤＮＡ配列CCTTCATACG TGTGAATGTT G 21
【特許請求の範囲】
【請求項１】 配列番号５から得られる核酸配列を持ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】 配列番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を持っていない請求項１のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】 バチラスセレウスまたはバチラスチュウリンジェンシスに由来する核酸配列を増幅し得る部位を持っていない請求項１または２のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】 配列番号１１または配列番号１２で示される核酸配列を持っている請求項１、２または３のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】 請求項１ないし４のいずれかのオリゴヌクレオチドを２種類組合せたプライマーセットを用いて、検体中のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子配列を標的とし、当該標的遺伝子を選択的に増幅させ検体中に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在するか否かを決定することで炭疽菌の検出を行う方法。
【請求項１】 配列番号５から得られる核酸配列を持ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】 配列番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を持っていない請求項１のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】 バチラスセレウスまたはバチラスチュウリンジェンシスに由来する核酸配列を増幅し得る部位を持っていない請求項１または２のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】 配列番号１１または配列番号１２で示される核酸配列を持っている請求項１、２または３のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】 請求項１ないし４のいずれかのオリゴヌクレオチドを２種類組合せたプライマーセットを用いて、検体中のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子配列を標的とし、当該標的遺伝子を選択的に増幅させ検体中に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在するか否かを決定することで炭疽菌の検出を行う方法。
【公開番号】特開平１１−４６９３
【公開日】平成１１年（１９９９）１月１２日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平９−２６４０５９
【出願日】平成９年（１９９７）９月２９日
【出願人】（０００００４１８９）日本水産株式会社 (119)
【公開日】平成１１年（１９９９）１月１２日
【国際特許分類】
【出願日】平成９年（１９９７）９月２９日
【出願人】（０００００４１８９）日本水産株式会社 (119)
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